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特表2022-511345ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいた細胞の遺伝子編集の方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-31
(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいた細胞の遺伝子編集の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220124BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220124BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220124BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220124BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220124BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N5/10 ZNA
C12N5/0783
C12N15/12
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021516699
(86)(22)【出願日】2019-09-23
(85)【翻訳文提出日】2021-05-21
(86)【国際出願番号】 CN2019107374
(87)【国際公開番号】W WO2020057668
(87)【国際公開日】2020-03-26
(31)【優先権主張番号】201910809475.8
(32)【優先日】2019-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910809598.1
(32)【優先日】2019-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201811117875.4
(32)【優先日】2018-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201811140870.3
(32)【優先日】2018-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521095307
【氏名又は名称】カファ セラピューティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＦＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】２／３ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｐｌａｃｅ，ＩＦＳＣ，Ｄｕｂｌｉｎ Ｄ０１ ＡＥ２７，Ｉｒｅｌａｎｄ
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際特許業務法人
(74)【代理人】
【識別番号】100120293
【弁理士】
【氏名又は名称】中谷 智子
(72)【発明者】
【氏名】李宗海
(72)【発明者】
【氏名】廖朝▲フイ▼
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいた細胞の遺伝子編集の方法を提供する。ここで、Ｃａｓ酵素は酵素活性が０．１～１ｎｍｏｌであるＣａｓ９酵素である。また、遺伝子編集技術によりＴ細胞におけるＴＣＲ遺伝子およびＭＨＣ遺伝子を編集する、ユニバーサルＴ細胞の構築方法、構築されたＴ細胞およびその使用を提供する。さらに、ｇＲＮＡ構築体を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいた細胞の遺伝子編集の方法であって、Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの複合体を細胞に導入して遺伝子編集を行い、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ９酵素であり、前記Ｃａｓ９酵素の酵素活性は０．１～１ｎｍｏｌ、好ましくは０．２～０．７ｎｍｏｌ、より好ましくは０．３～０．５ｎｍｏｌであり；さらに好ましくは、前記複合体において、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である、ことを特徴とする、方法。
【請求項2】
Ｃａｓ９酵素と第１のｇＲＮＡの複合体１、及びＣａｓ９酵素と第２のｇＲＮＡの複合体２を前記細胞に導入して遺伝子編集を行い、好ましくはＣａｓ９酵素、第１のｇＲＮＡ、及び第２のｇＲＮＡの複合体３を同時に前記細胞に導入して遺伝子編集を行い、
前記複合体１または複合体２または複合体３において、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は、１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である、
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のｇＲＮＡと第２のｇＲＮＡのモル比は、約１：５～５：１、好ましくは１：２～２：１、より好ましくは約１：１である、ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡによって形成される複合体または複合体１または複合体２または複合体３において、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～３μＭ、好ましくは約０．１２５μＭ～３μＭ、より好ましくは約０．２μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．２５μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．５μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約１μＭ～３μＭである、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞は真核細胞であり、好ましくは、前記真核細胞は免疫エフェクター細胞であり、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞である、ことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞はＴ細胞であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞の遺伝子を編集することは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、前記Ｔ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行い、好ましくはＴＲＡＣに対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号４５に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行い、及び／または
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＴ細胞のＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、好ましくはＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＢ２Ｍ遺伝子中の配列番号３８に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行うことを含む、ことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ｇＲＮＡは約１５～５０ｂｐ、好ましくは約１５～３０ｂｐ、より好ましくは約１７～２１ｂｐ、さらに好ましくは２０ｂｐである、ことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３２または３３に示される配列を含む、ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む、ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｔ細胞はまた、キメラ受容体、外因性サイトカイン、阻害／活性化受容体またはリガンド、共刺激因子を発現し、好ましくは、前記Ｔ細胞はまたキメラ抗原受容体を発現する、ことを特徴とする、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ユニバーサルＴ細胞を構築する方法であって、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子とＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集技術によって遺伝子編集を行うことを含み、
Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子に対する遺伝子編集は、好ましくはＴ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行い、好ましくはＴＲＡＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号４５に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行い、及び／または
Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対する遺伝子編集は、好ましくはＴ細胞のＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＢ２Ｍ遺伝子中の配列番号３８に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行う、方法。
【請求項12】
前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するように配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列からなる群より選ばれる配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入し、好ましくは、前記Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するように配列番号２、３２または３３に示される配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するように配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列からなる群より選ばれる配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入し、好ましくは、前記Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するように配列番号１２に示される配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
遺伝子編集技術によってＴ細胞のＴＣＲ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡの第１の複合体１を前記細胞に導入して遺伝子編集を行い、遺伝子編集技術によってＴ細胞のＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡの第２の複合体を前記細胞に導入して遺伝子編集を行い、
好ましくは、複合体１と複合体２を同時に複合体３の形で前記細胞に導入して遺伝子編集を行う、
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記複合体１または複合体２におけるＣａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は、１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は１：４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記複合体１または複合体２または複合体３において、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～３μＭ、好ましくは約０．１２５μＭ～３μＭ、より好ましくは約０．２μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．２５μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．５μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約１μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．１２５μＭ～０．５μＭ、さらに好ましくは約０．２５μＭ～０．５μＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
ＴＣＲ遺伝子の遺伝子編集用のｇＲＮＡと、ＭＨＣ遺伝子の遺伝子編集用のｇＲＮＡとのモル比は、約１：５～５：１、好ましくは１：２～２：１、より好ましくは約１：１である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記Ｔ細胞はまた、キメラ抗原受容体を発現し、好ましくは、前記Ｔ細胞はまた、腫瘍抗原または病原体抗原を認識するキメラ受容体を発現し、当該キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識し、好ましくは、前記標的抗原は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１；ガングリオシドＧＤ３；Ｔｎ抗原；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ７０；ＣＤ１２３；ＣＤ１３８；ＣＤ３３；ＣＤ４４；ＣＤ４４ｖ７／８；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ６；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットα（ＩＬ－１３Ｒα）；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒα）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ＮＹ－ＥＳＯ－１；ＨＩＶ－１ Ｇａｇ；ＭＡＲＴ－１；ｇｐ１００；チロシナーゼ；メソテリン；ＥｐＣＡＭ；プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ６；上皮細胞増殖因子２０受容体ファミリーとその変異体（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）；ＬＭＰ２；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；Ｏ－アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；ガングリオシドＧＭ３；ＴＧＳ５；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；葉酸受容体；腫瘍血管内皮マーカー２５ １（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１；ＡＳＧＰＲ１；ＣＤＨ１６；５Ｔ４；８Ｈ９；αｖβ６インテグリン；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；ＣＡ９；κ軽鎖（カッパ軽鎖）；ＣＳＰＧ４；ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０；ＦＡＰ；ＦＡＲ；ＦＢＰ；胚性ＡｃｈＲ；ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２；ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ３；ＫＤＲ；ＭＣＳＰ；ＮＫＧ２Ｄリガンド；ＰＳＣ１；ＲＯＲ１；Ｓｐ１７；ＳＵＲＶＩＶＩＮ；ＴＡＧ７２；ＴＥＭ１；フィブロネクチン；テネイシン；腫瘍壊死ゾーンの癌胎児性変異体；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体５β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；Ｐ５３変異体１０；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；Ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）； ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ）；Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；免疫グロブリンλ様ペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群より選ばれる腫瘍抗原であり、
好ましくは、前記標的抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原から選ばれる病原体抗原であり、一実施形態では、前記ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス抗原、エプスタインバーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原またはインフルエンザウイルス抗原から選ばれる、ことを特徴とする、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記キメラ受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、ことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記キメラ抗原受容体は、（ｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ
を含む、ことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
腫瘍抗原に特異的に結合する前記キメラ抗原受容体の抗体は、完全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）、または単一ドメイン抗体である、ことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
キメラ受容体を発現するＴ細胞を調製するための、請求項１１～２２のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＴ細胞の使用であって、前記キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、前記細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識する、使用。
【請求項24】
請求項１１～２２のいずれか一項に記載の方法によって構築されたユニバーサルＴ細胞。
【請求項25】
ＴＲＡＣおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子がサイレンシングされている、ユニバーサルＴ細胞。
【請求項26】
ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む配列の遺伝子編集によってサイレンシングされ、より好ましくは、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む配列のうち、配列番号４５に示される配列の遺伝子編集によってサイレンシングされ、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列の遺伝子編集によってサイレンシングされ、より好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列のうち、配列番号３８に示される配列の遺伝子編集によってサイレンシングされる、
請求項２５に記載のＴ細胞。
【請求項27】
ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２、３２または３３に示される配列のｇＲＮＡを使用してＴＲＡＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことによってサイレンシングされ、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１２に示される配列のｇＲＮＡを使用してＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことによってサイレンシングされる、
請求項２５に記載のＴ細胞。
【請求項28】
前記Ｔ細胞はまた、キメラ抗原受容体を発現し、好ましくは、前記Ｔ細胞はまた、腫瘍抗原または病原体抗原を認識するキメラ受容体を発現し、当該キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、前記細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項29】
配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９、４０、１１、１２、１３または１４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ構築体。
【請求項30】
配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、及び配列番号１１、１２、１３または１４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載のｇＲＮＡ構築体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子編集の方法に関する。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる細胞の遺伝子編集の方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子編集は、特定の核酸配列を削除、挿入、変異、または置換することによってゲノムを変更することを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）と、関連されたＣａｓタンパク質とからなる。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列依存的にＤＮＡを特異的に標的とし、切断し（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９，” Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２（２０１４））、様々な生物およびモデルシステムでの遺伝子編集に広く使用されている。
【0003】
しかしながら、遺伝子編集の過程で遺伝子編集効率が低いという問題がある。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってＴ細胞を編集する場合、Ｔ細胞は最終分化した初代細胞であるため、インビトロ増殖の時間枠は限られており、遺伝子トランスフェクションの効率は低い。例えば、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２３（９） Ｍａｙ １， ２０１７により開示されたＴＣＲ受容体をコードする遺伝子またはＨＬＡタンパク質をコードする遺伝子のみに対するノックアウト効率は、高くとも約８０％に達せたが、両方を同時にノックアウトした効率はわずか約６０％であった。
【0004】
そのため、細胞に対して遺伝子を如何に迅速かつ効率的にノックアウトするか、または、如何に一度に複数の遺伝子を迅速かつ効率的にノックアウトするかは、この分野の難点となっている。
【発明の概要】
【0005】
本発明の目的は、細胞に対して遺伝子を迅速かつ効率的にノックアウトする方法、特に一度に複数の遺伝子を迅速かつ効率的にノックアウトすることができる方法を提供することである。
【0006】
本発明の第一局面では、遺伝子編集のためにＣａｓ酵素とｇＲＮＡの複合体を細胞に導入する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいた細胞の遺伝子編集の方法が提供され、ここで、前記複合体におけるＣａｓ酵素とｇＲＮＡの比率は１：３～１：５である。
【0007】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ９酵素である。
【0008】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素の酵素活性は０．１～１ｎｍｏｌ、好ましくは０．２～０．７ｎｍｏｌ、より好ましくは０．３～０．５ｎｍｏｌであり、最も好ましくは０．３７ｎｍｏｌである。
【0009】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ９酵素であり、前記複合体において、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である。
【0010】
本発明では、例えば、ＮＥＢ社からのＣａｓ９酵素を使用することができる。勿論、当業者は、同じまたは類似した機能を有する他のＣａｓ９酵素を選択してもよい。
【0011】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素が実現できる機能は、３０μｌ反応のＣａｓ９酵素反応システム（この反応システムは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、２５℃でのｐＨが６．５である）において、１ｎＭ ＰｖｕＩＩ線形化ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（標的部位ＣＧＣＴＴＧＴＴＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＴＡ）、４０ｎＭ ｓｇＲＮＡ、及び２０ｎＭ Ｃａｓ９酵素が含まれている場合、３７℃で１時間インキュベーションすると、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡの９０％が分解されていることが、アガロースゲル電気泳動により確認された。この反応システムでは、１分間で１ｎｍｏｌの基質（ＰｖｕＩＩ線形化ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ）を触媒させて完全に生成物に変換されたＣａｓ９酵素の量は０．３７ｎｍｏｌであり、Ｃａｓ９酵素のグラム数は５９．５７ｎｇである。前記Ｃａｓ９酵素の酵素活性は０．３７ｎｍоｌである（１分間で１ｎｍｏｌの基質を触媒させて生成物に変換された酵素の量）。本発明において、ＮＥＢの酵素を例にとると、酵素の酵素活性は０．３７ｎｍｏｌである。
【0012】
当業者が理解できるように、本明細書では、上記のＣａｓ９酵素の酵素活性に基づいてＣａｓ９酵素と導入されるｇＲＮＡのモル比が算出され、導入した複合体中のＣａｓ９酵素の濃度が確認される。Ｃａｓ９酵素の活性が変化すると、当業者は、異なる酵素の説明書における活性の説明および本明細書で規定された比率に基づいて換算してＣａｓ９酵素の使用濃度、及びｇＲＮＡとのモル比を選択することができる。
【0013】
また、酵素活性が０．３７ｎｍｏｌである上記酵素のＣａｓ酵素が単なる例に過ぎないことも当業者は理解できる。他のＣａｓ９酵素について、酵素の酵素活性が前記Ｃａｓ酵素と異なる場合、当業者は、酵素の酵素活性で計算してＣａｓ９酵素の使用量、及びｇＲＮＡとのモル比を確定することができる。
【0014】
具体的な一実施形態では、本発明は、２つの遺伝子を編集する方法に係り、具体的には、Ｃａｓ９酵素と第１のｇＲＮＡの複合体１、及びＣａｓ９酵素と第２のｇＲＮＡの複合体２を前記細胞に導入して遺伝子編集を行う。
【0015】
具体的な一実施形態では、Ｃａｓ９酵素、第１のｇＲＮＡ、及び第２のｇＲＮＡの複合体３を同時に前記細胞に導入して遺伝子編集を行う。
【0016】
具体的な一実施形態では、複合体１と複合体２を相次いで前記細胞に導入して遺伝子編集を行う。
【0017】
前記複合体１または複合体２または複合体３において、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は、１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である。
【0018】
例えば、複合体１中のＣａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である。複合体２中のＣａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である。複合体３中のＣａｓ９酵素と、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡの合計とのモル比は１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である。
【0019】
本明細書では、前記モル比とは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡ物質の量との比率を指す。Ｃａｓ９酵素の量または酵素活性は、製造元から提供されたＣａｓ９酵素の説明書に基づいて算出されたものであり、対応するｇＲＮＡの量は、ＲＮＡ塩基組成およびインビトロ転写の濃度によって算出されたものである。
【0020】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡの比率は１：４である。
【0021】
具体的な一実施形態では、前記細胞は真核細胞である。具体的な実施形態では、前記真核細胞は免疫エフェクター細胞である。具体的な実施形態では、前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。
【0022】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡによって形成された複合体において、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～３μＭ、好ましくは約０．１２５μＭ～３μＭ、より好ましくは約０．２μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．２５μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．５μＭ～３μＭである。
【0023】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡによって形成された複合体または複合体１または複合体２または複合体３において、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～３μＭ、好ましくは約０．１２５μＭ～３μＭ、より好ましくは約０．２μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．２５μＭ～３μＭ、さらに好ましくは約０．５μＭ～３μＭである。
【0024】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡによって形成された複合体において、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～２μＭ、好ましくは約０．１２５μＭ～２μＭ、より好ましくは約０．５μＭ～２μＭ、さらに好ましくは約０．５μＭ～２μＭ、さらに好ましくは約０．５μＭ～２μＭである。
【0025】
具体的な実施形態では、前記細胞はＴ細胞であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞の遺伝子を編集する。具体的な一実施形態では、前記Ｔ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣに対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行う。
【0026】
具体的な実施形態では、前記細胞はＴ細胞であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞の遺伝子を編集することは、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、前記Ｔ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行い、好ましくはＴＲＡＣに対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号４５に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行い、及び／または
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、好ましくはＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＢ２Ｍ遺伝子中の配列番号３８に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行うことを含む。
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、前記Ｔ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行い、好ましくはＴＲＡＣに対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号４５に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、ＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行い、及び／または
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、好ましくはＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、より好ましくはＢ２Ｍ遺伝子中の配列番号３８に示される配列に対して遺伝子編集を行い、さらに好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行うことを含む。
【0027】
具体的な一実施形態では、配列番号１に示される配列中のＰＡＭ配列に従ってｇＲＮＡを設計する。
【0028】
具体的な一実施形態では、前記ｇＲＮＡは約１５～５０ｂｐ、好ましくは約１５～３０ｂｐ、より好ましくは約１７～２１ｂｐ、さらに好ましくは２０ｂｐである。
【0029】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４または５に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号２に示される配列を含む。
【0030】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３２または３３に示される配列を含む。
【0031】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列であり、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３２または３３に示される配列である。
【0032】
具体的には、前記第１のｇＲＮＡは、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列を含んでもよい。
【0033】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～０．５μＭ、好ましくは約０．１２５μＭ～０．５μＭ、より好ましくは約０．２５μＭ～０．５μＭである。
【0034】
具体的な実施形態では、前記細胞はＴ細胞であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞のＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、配列番号１０に示される配列中のＰＡＭ配列に従ってｇＲＮＡを設計する。
【0035】
具体的な一実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む。
【0036】
具体的な一実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列であり、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列である。
【0037】
具体的には、第２のｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列を含んでもよい。
【0038】
以下において、複合体１、複合体２、または複合体３についての説明は上記と一致し、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡについての説明も上記と一致する。複合体１、複合体２、または複合体３は、異なる複合体を表すためであり、番号付けの優先順位はなく、第１のｇＲＮＡと第２のｇＲＮＡも同様であり、２つの異なるｇＲＮＡを表すためであり、１つのｇＲＮＡともう１つのｇＲＮＡで表してもよく、すなわち、１つのｇＲＮＡは、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列を含んでもよく、もう１つのｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３、または１４に示される配列を含んでもよいことを理解すべきである。
【0039】
具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．２５μＭ～３μＭ、好ましくは約０．５μＭ～３μＭ、より好ましくは約１μＭ～３μＭである。
【0040】
具体的な実施形態では、前記細胞はＴ細胞であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞のＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子の第１のエキソンに対して遺伝子編集を行う。
【0041】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行い、ＴＲＡＣおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子はサイレンシング（沈黙）される。
【0042】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４または５に示される配列を含み、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列を含む。好ましくは、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２に示される配列を含み、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む。
【0043】
具体的な実施形態では、前記ｇＲＮＡは約１５～５０ｂｐ、好ましくは約１５～３０ｂｐ、より好ましくは約２０ｂｐである。具体的な一実施形態では、２０ｂｐである。
【0044】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行う時、Ｂ２Ｍの編集に使用されるｇＲＮＡと、ＴＲＡＣの編集に使用されるｇＲＮＡとの比率は約１．５：１～０．５：１、好ましくは約１：１である。具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ酵素の濃度は約１μＭ～３μＭである。
【0045】
具体的な実施形態では、前記Ｔ細胞はまた、キメラ受容体、外因性サイトカイン、阻害／活性化受容体またはリガンド、共刺激因子を発現している。具体的な実施形態では、前記Ｔ細胞はまたキメラ抗原受容体を発現している。
【0046】
本発明の第二局面では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいてＴ細胞のＴＲＡＣ遺伝子の遺伝子編集の方法であって、Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの複合体を前記細胞に導入して遺伝子編集を行う、方法が提供され、ここで、Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの比率は１：３～１：５である。具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ９酵素である。
【0047】
具体的な実施形態では、前記Ｔ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、前記Ｔ細胞のＴＲＡＣに対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、前記Ｔ細胞のＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、前記Ｔ細胞のＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、配列番号１に示される配列中のＰＡＭ配列に従ってｇＲＮＡを設計する。
【0048】
具体的な実施形態では、前記Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの比率は１：４である。
【0049】
具体的な実施形態では、前記Ｃａｓ酵素の濃度は約０．１μＭ～０．５μＭ、好ましくは約０．１２５μＭ～０．５μＭ、より好ましくは約０．２５μＭ～０．５μＭである。
【0050】
具体的な実施形態では、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４または５に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号２に示される配列を含む。
【0051】
具体的な実施形態では、ＴＲＡＣを編集する時、前記Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの比率は１：４であり、Ｃａｓ酵素の濃度は０．２５μＭ～０．５μＭであり、使用されるｇＲＮＡは、配列番号２に示される配列を含む。
【0052】
本発明の第三局面では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいてＴ細胞のＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子編集の方法であって、Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの複合体を前記細胞に導入して遺伝子編集を行う方法が提供され、ここで、Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの比率は１：３～１：５である。具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ９酵素である。
【0053】
具体的な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行う。
【0054】
具体的な実施形態では、配列番号１０に示される配列中のＰＡＭ配列に従ってｇＲＮＡを設計する。具体的な実施形態では、前記Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの比率は１：４である。
【0055】
具体的な実施形態では、前記Ｃａｓ酵素の濃度は約０．２５μＭ～３μＭ、好ましくは約０．５μＭ～３μＭ、より好ましくは約１μＭ～３μＭである。
【0056】
具体的な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む。
【0057】
具体的な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を編集する時、前記Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの比率は１：４であり、前記Ｃａｓ酵素の濃度は１μＭ～３μＭであり、使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む。
【0058】
本発明の第四局面では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいてＴ細胞のＴＲＡＣ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子編集の方法であって、Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの複合体を前記細胞に導入する方法が提供され、ここで、Ｃａｓ酵素と総ｇＲＮＡの比率は１：３～１：５である。具体的な一実施形態では、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ９酵素である。
【0059】
具体的な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、配列番号１０に示される配列中のＰＡＭ配列に従ってｇＲＮＡを設計する。
【0060】
具体的な実施形態では、ＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣに対して遺伝子編集を行う。
【0061】
具体的な実施形態では、ＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行う。
【0062】
具体的な実施形態では、ＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行う。具体的な実施形態では、配列番号１に示される配列中のＰＡＭ配列に従ってｇＲＮＡを設計する。
【0063】
具体的な実施形態では、前記Ｃａｓ酵素と総ｇＲＮＡの比率は１：４である。具体的な実施形態では、前記Ｃａｓ酵素の濃度は約１μＭ～３μＭである。
【0064】
具体的な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集およびＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡの比率は０．５：１～１．５：１、好ましくは１：１である。
【0065】
具体的な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４または５に示される配列を含み、好ましくは、使用されるｇＲＮＡは、配列番号２に示される配列を含む。
【0066】
具体的な実施形態では、前記Ｃａｓ酵素と総ｇＲＮＡの比率は１：４であり、前記Ｃａｓ酵素の濃度は１μＭ～３μＭであり、使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む配列と配列番号２に示される配列を含む配列である。
【0067】
具体的な実施形態では、上記第二局面、第三局面、第四局面のＴ細胞はまた、腫瘍抗原または病原体抗原を認識するキメラ受容体を発現し、このキメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、前記細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識する。
【0068】
具体的な実施形態では、前記標的抗原は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１；ガングリオシドＧＤ３；Ｔｎ抗原；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ７０；ＣＤ１２３；ＣＤ１３８；ＣＤ３３；ＣＤ４４；ＣＤ４４ｖ７／８；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ６；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットα（ＩＬ－１３Ｒα）；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒα）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ＮＹ－ＥＳＯ－１；ＨＩＶ－１ Ｇａｇ；ＭＡＲＴ－１；ｇｐ１００；チロシナーゼ；メソテリン；ＥｐＣＡＭ；プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ６；上皮細胞増殖因子２０受容体ファミリーとその変異体（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）；ＬＭＰ２；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；Ｏ－アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ；ＴＧＳ５；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；葉酸受容体；腫瘍血管内皮マーカー２５ １（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１；ＡＳＧＰＲ１；ＣＤＨ１６；５Ｔ４；８Ｈ９；αｖβ６インテグリン；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；ＣＡ９；κ軽鎖（カッパ軽鎖）；ＣＳＰＧ４；ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０；ＦＡＰ；ＦＡＲ；ＦＢＰ；胚性ＡｃｈＲ；ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２；ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ３；ＫＤＲ；ＭＣＳＰ；ＮＫＧ２Ｄリガンド；ＰＳＣ１；ＲＯＲ１；Ｓｐ１７；ＳＵＲＶＩＶＩＮ；ＴＡＧ７２；ＴＥＭ１；フィブロネクチン；テネイシン；腫瘍壊死ゾーンの癌胚性変異体；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体５β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ選択的リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；Ｐ５３変異体１０；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；Ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ）；Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；免疫グロブリンλ様ペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群より選ばれる腫瘍抗原である。
【0069】
具体的な実施形態では、前記標的抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原から選ばれる病原体抗原である。一実施形態では、前記ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス抗原、エプスタインバーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原またはインフルエンザウイルス抗原から選ばれる。
【0070】
具体的な実施形態では、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）から選択される。
【0071】
具体的な実施形態では、前記キラメ受容体はキメラ抗原受容体である。具体的な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、
（ｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζを含む。
（ｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζを含む。
【0072】
具体的な実施形態では、前記キメラ受容体はＴＡＣであり、
（ａ）抗原結合ドメインを有する抗体ドメインと、ＣＤ３に結合する単鎖抗体とを含む、細胞外構造領域；
（ｂ）膜貫通領域；
（ｃ）プロテインキナーゼＬＣＫに連結する細胞内構造領域を含む。
（ａ）抗原結合ドメインを有する抗体ドメインと、ＣＤ３に結合する単鎖抗体とを含む、細胞外構造領域；
（ｂ）膜貫通領域；
（ｃ）プロテインキナーゼＬＣＫに連結する細胞内構造領域を含む。
【0073】
具体的な実施形態では、腫瘍抗原に特異的に結合する、前記キメラ抗原受容体の抗体は、完全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）、または単一ドメイン抗体である。
【0074】
本発明の第五局面では、上記第二局面、第三局面、第四局面のＴ細胞の、キメラ受容体を発現するＴ細胞を調製するための使用が提供され、前記キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、前記細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識する。
【0075】
具体的な実施形態では、前記標的抗原は、腫瘍抗原または病原体抗原である。
【0076】
具体的な実施形態では、前記標的抗原は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１；ガングリオシドＧＤ３；Ｔｎ抗原；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ７０；ＣＤ１２３；ＣＤ１３８；ＣＤ３３；ＣＤ４４；ＣＤ４４ｖ７／８；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ６；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットα（ＩＬ－１３Ｒα）；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒα）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ＮＹ－ＥＳＯ－１；ＨＩＶ－１ Ｇａｇ；ＭＡＲＴ－１；ｇｐ１００；チロシナーゼ；メソテリン；ＥｐＣＡＭ；プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ６；上皮細胞増殖因子２０受容体ファミリーとその変異体（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）；ＬＭＰ２；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；Ｏ－アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ；ＴＧＳ５；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；葉酸受容体；腫瘍血管内皮マーカー２５ １（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１；ＡＳＧＰＲ１；ＣＤＨ１６；５Ｔ４；８Ｈ９；αｖβ６インテグリン；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；ＣＡ９；κ軽鎖（カッパ軽鎖）；ＣＳＰＧ４；ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０；ＦＡＰ；ＦＡＲ；ＦＢＰ；胚性ＡｃｈＲ；ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２；ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ３；ＫＤＲ；ＭＣＳＰ；ＮＫＧ２Ｄリガンド；ＰＳＣ１；ＲＯＲ１；Ｓｐ１７；ＳＵＲＶＩＶＩＮ；ＴＡＧ７２；ＴＥＭ１；フィブロネクチン；テネイシン；腫瘍壊死ゾーンの癌胎児性変異体；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体５β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；Ｐ５３変異体１０；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；Ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ）；Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；免疫グロブリンλ様ペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群より選ばれる腫瘍抗原である。
【0077】
具体的な実施形態では、前記標的抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原から選ばれる病原体抗原である。一実施形態では、前記ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス抗原、エプスタインバーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原またはインフルエンザウイルス抗原から選ばれる。
【0078】
具体的な実施形態では、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）から選択される。
【0079】
具体的な実施形態では、前記キラメ受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【0080】
具体的な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、
（ｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζを含む。
（ｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζを含む。
【0081】
具体的な実施形態では、前記キメラ受容体はＴＡＣであり、
（ａ）抗原結合ドメインを有する抗体ドメインと、ＣＤ３に結合する単鎖抗体とを含む、細胞外構造領域；
（ｂ）膜貫通領域；
（ｃ）プロテインキナーゼＬＣＫに連結する細胞内構造領域を含む。
（ａ）抗原結合ドメインを有する抗体ドメインと、ＣＤ３に結合する単鎖抗体とを含む、細胞外構造領域；
（ｂ）膜貫通領域；
（ｃ）プロテインキナーゼＬＣＫに連結する細胞内構造領域を含む。
【0082】
具体的な実施形態では、腫瘍抗原に特異的に結合する、前記キメラ抗原受容体の抗体は、完全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）、または単一ドメイン抗体である。
【0083】
本発明では、エレクトロポレーション条件には具体的な制限はなく、例えば、前記エレクトロポレーション条件は、１５０～６００Ｖ、０．５ｍｓ～２０ｍｓであってもよく、例えば、好ましくは１５０Ｖ～３００Ｖ、２ｍｓ～１５ｍｓであってもよい。
【0084】
具体的な一実施形態では、ＴＣＲ遺伝子に対する遺伝子編集に使用されるｇＲＮＡと、ＭＨＣ遺伝子に対する遺伝子編集に使用されるｇＲＮＡとのモル比の比率は約１：５～５：１、好ましくは１：２～２：１、より好ましくは約１：１である。
【0085】
具体的な一実施形態では、前記Ｔ細胞は上記の局面に示された通りである。
【0086】
具体的な一実施形態では、前記キメラ受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、前記キメラ抗原受容体は上記の局面に示された通りである。
【0087】
本発明の第七局面は、本発明の上記方法によって構築されたユニバーサルＴ細胞に係る。
【0088】
本発明の第八局面は、ＴＲＡＣおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子がサイレンシングされている、ユニバーサルＴ細胞に係る。
【0089】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む配列の遺伝子編集によってサイレンシングされ、より好ましくは、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む配列のうち、配列番号４５に示される配列の遺伝子編集によってサイレンシングされる；
Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列の遺伝子編集によってサイレンシングされ、より好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列のうち、配列番号３８に示される配列の遺伝子編集によってサイレンシングされる。
Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列の遺伝子編集によってサイレンシングされ、より好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列のうち、配列番号３８に示される配列の遺伝子編集によってサイレンシングされる。
【0090】
具体的な一実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２、３２または３３に示される配列のｇＲＮＡを使用してＴＲＡＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことによってサイレンシングされ、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１２に示される配列のｇＲＮＡを使用してＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことによってサイレンシングされる。
【0091】
具体的な一実施形態では、前記Ｔ細胞はまた、キメラ抗原受容体を発現し、好ましくは、前記Ｔ細胞はまた、腫瘍抗原または病原体抗原を認識するキメラ受容体を発現し、キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、前記細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識する。
【0092】
前記Ｔ細胞は、上記局面に示された通りである。キメラ抗原受容体は、上記局面に示された通りである。
【0093】
本発明の第九局面は、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９、４０、１１、１２、１３または１４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ構築体に係る。
【0094】
具体的な一実施形態では、本発明のｇＲＮＡ構築体は、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、及び配列番号１１、１２、１３または１４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0095】
具体的な一実施形態では、本発明のｇＲＮＡ構築体は、配列番号２、３２または３３に示される配列、及び／または配列番号１２に示される配列から選択される配列を含む。
【0096】
本発明は、遺伝子編集技術を使用してＴ細胞を修飾することに係り、複数の遺伝子をノックアウトすることにより、Ｔ細胞におけるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の機能を効果的に阻害することができる。ＴＣＲをコードする遺伝子はＴＲＡＣであり、ＭＨＣ Ｉをコードする遺伝子はＢ２Ｍである。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ遺伝子技術、およびＲＮＰ（ＲＮＡ核酸およびタンパク質複合体）エレクトロポレーションに対する改善と最適化に基づいて、短時間でＴＲＡＣとＢ２Ｍのダブル遺伝子を一度に効率的にノックアウトすることが実現され、ノックアウトの効率は９０％にも達している。
【図面の簡単な説明】
【0097】
【図1】ｓｇＲＮＡとＴＲＡＣ遺伝子の結合部位を示す模式図である。
【図2】ＴＲＡＣのノックアウト効果に対する、異なる組成比率を有するＲＮＰの影響を示す図である。
【図3A】ＴＲＡＣのノックアウト効果に対する、異なるｇＲＮＡ配列の影響を示す図である。
【図3B】ＴＲＡＣのノックアウト効果に対する、異なるｇＲＮＡ配列の影響を示す図である。
【図4】ＴＲＡＣのノックアウト効果に対する、異なる濃度のＣａｓ９酵素の影響を示す図である。
【図5】ｇＲＮＡとＢ２Ｍ遺伝子の結合部位を示す模式図である。
【図6】Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウト効果に対する、異なるｇＲＮＡの影響を示す図である。
【図7】Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウト効果に対する、異なる濃度のＣａｓ９酵素の影響を示す図である。
【図8】ＴＲＡＣとＢ２Ｍを同時にノックアウトする場合の、ＴＲＡＣとＢ２Ｍのダブルノックアウトに対する異なるｇＲＮＡ組成成分の影響を示す図である。
【図9】標的ＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子からなるｇＲＮＡ混合物と、Ｃａｓ９酵素との間に形成されたＲＮＰ複合体の濃度がノックアウト効率に対する影響を示す図である。
【図10A】Ｔｉｄｅオンラインソフトウェアで予測されたＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の突然変異の効率を示す図である。
【図10B】Ｔｉｄｅオンラインソフトウェアで予測されたＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の突然変異の効率を示す図である。
【図10C】Ｔｉｄｅオンラインソフトウェアで予測されたＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の突然変異の効率を示す図である。
【図10D】Ｔｉｄｅオンラインソフトウェアで予測されたＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の突然変異の効率を示す図である。
【図11】クローンシーケンシングで検証されたＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の突然変異の結果を示す図である。
【図12】ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト効率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0098】
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して遺伝子編集を行う時、ｇＲＮＡの選択やＣａｓ９酵素とｇＲＮＡの比率などが編集の効率に大きな影響を与えることを発見し、これに基づいて本発明を完成した。
【0099】
定義
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等のすべての方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができ、その中で適切な方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書に準ずる。また、特に明記しない限り、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等のすべての方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができ、その中で適切な方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書に準ずる。また、特に明記しない限り、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【0100】
特に明記しない限り、本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の伝統的な技術を採用し、これらはすべて本分野の技術的範囲に属する。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡＵＳＵＢＥＬ，２０００，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎ Ｉｎｃ，Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．， １９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． Ｈａｒｒｉｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ． １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ． １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ （Ｊ． Ａｂｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｍ． Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．－ｉｎ－ｃｈｉｅｆ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、特にＶｏｌｓ．１５４と１５５ （Ｗｕｅｔａｌ． ｅｄｓ．）およびＶｏｌ．１８５，“Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” （Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｐ． Ｃａｌｏｓｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄ ｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ－ＩＶ （Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；およびＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照できる。本開示では、保護を求める主題の各方面はいずれも範囲の形で表される。範囲の形での説明は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、保護を求める主題の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。よって、範囲の説明は、あらゆる可能なサブ範囲および当該範囲内の個々の値を具体的に開示していると見なすべきである。例えば、値の範囲が提供されている場合、当該範囲の上限と下限の間の全ての中間値、および当該範囲内の任意の他の、または中間値は、いずれも保護を求める主題の範囲に含まれ、その範囲の上下限も保護を求める主題の範囲に含まれる。それらのより小さい範囲の上下限は、そのより小さい範囲に独立して含まれてもよく、範囲の上下限が明確に除外されない限り、それらはまた、保護を求める主題の範囲に属す。設定範囲に１つまたは２つの制限値が含まれる場合、保護を求める主題も、制限値の１つまたは２つが除外された範囲を含む。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
【0101】
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者に容易に知られている各値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」で修飾されている値またはパラメータは、当該値またはパラメータ自体を指す実施形態を含む（しかも説明する）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」に関する説明を含む。例えば、「約」または「含む」は、当該分野での実際の標準偏差に従って、１以内または１を超えることを意味することができる。あるいは、「約」または「含む」は、最大１０％（すなわち、±１０％）の範囲を意味することができる。例えば、約５μＭは、４．５μＭから５．５μＭまでの任意の数を含むことができる。特定の値または組成が出願および特許出願の範囲で提供される場合、特に明記しない限り、「約」または「含む」は、当該特定の値または組成の許容誤差範囲内にあるべきである。
【0102】
本明細書に記載の任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、特に明記しない限り、当該範囲内の任意の整数、および適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）の数値を含むと理解されるべきである。
【0103】
本発明をよりよく理解するために、関連する用語について以下のように定義する。
【0104】
「遺伝子編集」という用語は、特定のＤＮＡフラグメントのノックアウトや付加などを実現するために、ヒトが標的遺伝子を「編集」できることを指す。
【0105】
「分子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシング」という用語は、元のＤＮＡに損傷を与えることなく、さまざまな理由で遺伝子を発現しないまたは過少発現する現象を指す。遺伝子サイレンシングは２つのレベルで発生する。１つはＤＮＡメチル化、ヘテロクロマチン化、および位置効果などによって引き起こされる転写レベルでの遺伝子サイレンシングであり、もう１つは転写後の遺伝子サイレンシング、つまり遺伝子転写後のレベルで、アンチセンスＲＮＡ、共阻害、遺伝子阻害、ＲＮＡ干渉、ｍｉｃｒｏＲＮＡを介した翻訳阻害などの標的ＲＮＡの特異的阻害によって遺伝子を不活化することである。ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ）は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートである。Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）はＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼであり、ＣＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して標的遺伝子を編集する、ＲＮＡによってガイドされる最新の技術である。
【0106】
「ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９システム」は、転写物、およびＣａｓ９酵素遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指導する他の要素の総称であり、これには、Ｃａｓ９遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＣＲＩＳＰＲ）配列（ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡなど）、ｔｒａｃｒペアリング配列（「ダイレクトリピート」、及び内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストでのｔｒａｃｒＲＮＡ処理の部分的なダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストで「スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）」とも呼ばれ、すなわちｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列と転写物が含まれる。一般的に言えば、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストでは前部領域とも呼ばれる）の形成を促進することを特徴とする要素である。
【0107】
「標的配列」という用語は、ガイド配列と相補性を有する配列を指し、標的配列とガイド配列との間の相補ペアリングは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必須なものではない。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
【0108】
一般的に言えば、ガイド配列（ｇＲＮＡ）は、標的配列にハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体と該標的配列との配列特異的結合をガイドするように標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれに対応する標的配列間の相補程度は約５０％以上、６０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７．５％以上、９９％以上またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、その非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｉ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅｔ．ｎｅｔで入手可能）などが挙げられる。
【0109】
一部の実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素以外の約１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のほかのタンパク質配列、および選択されてもよい、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素と融合できるタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写阻害活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性からなる群より選ばれる１つまたは複数の活性を有するタンパク質ドメインが含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラティッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、融合体、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ分子または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする遺伝子配列に融合することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成することができる別のドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００５９５０２に記載されている。
【0110】
「Ｃａｓ９酵素」という用語は、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９の任意の修正バージョンであってもよく、任意の天然に存在する細菌Ｃａｓ９および任意のキメラ、変異体、相同体またはオルソログを含む。Ｃａｓ９酵素は、１つまたは複数の変異を含むことができ、機能ドメインへの融合の有無にかかわらず、ユニバーサルＤＮＡ結合タンパク質として使用できる。これらの突然変異は、人為的に導入された突然変異、または獲得的および喪失的機能的突然変異であってもよい。これらの変異には、それぞれ、ＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメインの触媒ドメイン（Ｄ１０およびＨ８４０）の１つの変異が含まれてもよいが、これに限定されない。
【0111】
本発明では、例えば、ＮＥＢ社からのＣａｓ９酵素を使用することができる。勿論、当業者は、同じまたは類似した機能を有する他のＣａｓ９酵素を選択してもよい。本明細書では、Ｃａｓ９酵素が実現できる機能は、３０μｌ反応のＣａｓ９酵素反応システム（この反応システムは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、２５℃でのｐＨが６．５である）において、１ｎＭ ＰｖｕＩＩ線形化ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（標的部位ＣＧＣＴＴＧＴＴＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＴＡ）、４０ｎＭ ｓｇＲＮＡ、及び２０ｎＭ Ｃａｓ９酵素が含まれている場合、３７℃で１時間インキュベーションすると、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡの９０％が分解されていることが、アガロースゲル電気泳動により確認された。この反応システムでは、１分間で１ｎｍｏｌの基質（ＰｖｕＩＩ線形化ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ）を触媒させて完全に生成物に変換されたＣａｓ９酵素の量は０．３７ｎｍｏｌであり、Ｃａｓ９酵素のグラム数は５９．５７ｎｇである。前記Ｃａｓ９酵素の酵素活性は０．３７ｎｍоｌである（１分間で１ｎｍｏｌの基質を触媒させて生成物に変換された酵素の量）。
【0112】
当業者が理解できるように、本明細書では、上記のＣａｓ９酵素の酵素活性を有することに基づいてＣａｓ９酵素と導入されるｇＲＮＡのモル比の比率が算出され、導入した複合体中のＣａｓ９酵素の濃度が確認される。Ｃａｓ９酵素の活性が変化すると、当業者は、異なる酵素の説明書における活性の説明および本明細書で確定された比率に基づいて換算してＣａｓ９酵素の使用濃度、及びｇＲＮＡとのモル比を選択することができる。
【0113】
一態様において、Ｃａｓ酵素はニッキング酵素である。好ましい一実施形態では、該Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡの形で細胞に送達される。これは、酵素の一過性の発現を可能にし、それによって毒性を減らす。Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９酵素をコードおよび発現するヌクレオチド構築体において細胞に送達されることもできる。さらに、誘導性プロモーターの制御下でＣａｓ９を発現させることもできる。
【0114】
ＣＲＩＳＰＲとＣａｓ酵素という用語は、特に明記しない限り、一般的に本明細書では置き換えて使用できる。上記のように、本明細書で使用される残基番号の多くは、化膿レンサ球菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９などの他の微生物種からのより多くのＣａｓ９を含むことを理解されたい。当業者は、関連するアミノ酸配列を比較することにより、ＳｐＣａｓ９以外のＣａｓ９酵素における適切な対応する残基を決定することができるであろう。ｓｇＲＮＡという用語は短いｇＲＮＡを指す。遺伝子編集を行う場合、与えるｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒペアリング配列、およびｔｒａｃｒ配列を個別に提供することもできるし、一つの完全なＲＮＡ配列で提供することもできる。Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡへの結合により、特定の部位でＤＮＡを切断することができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム認識配列は２３ｂｐであり、２０ｂｐを標的とすることができ、認識部位の最後の３つのＮＧＧ配列は、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列と呼ばれる。
【0115】
特に明記しない限り、Ｃａｓ酵素、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃａｓタンパク質、およびＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓという用語は一般的に置き換えて使用できる。
【0116】
Ｃａｓ導入遺伝子は、ベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）、および／または粒子および／またはナノ粒子、および／またはエレクトロポレーションによって送達することができる。
【0117】
一実施形態では、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の一方または両方の定常領域における対応するコーディング遺伝子のエキソンは、内因性ＴＣＲを不活性にするために、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ技術を使用してノックアウトされる。好ましくは、内因性ＴＣＲα鎖の定常領域の第１のエキソンを標的としてノックアウトする。
【0118】
Ｂ２ＭまたはＴＣＲの発現を「阻害する」または「抑制する」とは、細胞におけるＢ２ＭまたはＴＣＲの発現が、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少することを意味する。より具体的には、Ｂ２Ｍの発現を「阻害する」または「抑制する」とは、細胞中のＢ２Ｍの含有量が少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％減少することを意味する。細胞内のタンパク質の発現または含有量は、Ｂ２ＭまたはＴＣＲの特異的抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはフローサイトメトリーなどの本分野で知られている任意の適切な方法によって測定することができる。
【0119】
本発明で使用される「修飾」という用語は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの状態または構造の変化を指す。修飾方法は、化学的、構造的、および機能的であり得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。ＴＣＲは通常、αとβの２つの鎖で構成されており、これらは組み合わせてヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３形質導入サブユニットと結合して細胞表面に存在するＴ細胞受容体複合体を形成することができる。ＴＣＲのα鎖とβ鎖は、免疫グロブリン様のＮ末端可変領域（Ｖ）と定常領域（Ｃ）、疎水性膜貫通ドメイン、および短い細胞質領域で構成されている。免疫グロブリン分子の場合、α鎖とβ鎖の可変領域はＶ（Ｄ）Ｊ組換えによって生成されるため、Ｔ細胞の集団で大量の多様な抗原特異性が生成される。しかしながら、完全な抗原を認識する免疫グロブリンとは相反に、Ｔ細胞はＭＨＣ分子に関連する処理されたペプチドフラグメントによって活性化され、ＭＨＣ制限と呼ばれるＴ細胞による抗原認識に追加の次元が導入される。Ｔ細胞受容体を介してドナーと受容体の間のＭＨＣの違いを認識することは、細胞増殖とＧＶＨＤの潜在的な発達を引き起こす。ＴＣＲの通常の表面発現は、複合体の７つの成分すべての相乗的な合成と組みたてに依存することが示されている（Ａｓｈｗｅｌｌ ａｎｄ Ｋｌｕｓｎｅｒ １９９０）。ＴＣＲαまたはＴＣＲβの不活化は、Ｔ細胞の表面からのＴＣＲの排除を引き起こすことができ、それによって同種異系抗原およびその結果として生じるＧＶＨＤの認識を防ぐ。
【0120】
「ＭＨＣ」という用語は、生体適合性複合体の抗原をコードするすべての遺伝子グループの総称である組織適合性複合体である。ＭＨＣ抗原は、すべての高等脊椎動物の組織で発現され、ヒト細胞ではＨＬＡ抗原と呼ばれ、移植反応において重要な役割を果たし、拒絶反応は、移植された組織の表面にある組織適合性抗原に応答するＴ細胞によって媒介される。ＭＨＣタンパク質はＴ細胞刺激において重要な役割を果たし、抗原提示細胞（通常は樹状細胞）は、ＭＨＣの細胞表面に外来タンパク質の分解産物に属するペプチドをディスプレイし、共刺激シグナルの存在下で、Ｔ細胞が活性化され、同じペプチド／ＭＨＣ複合体をディスプレイする標的細胞に作用する。たとえば、刺激されたＴヘルパー細胞は、ＭＨＣに結合した抗原をディスプレイするマクロファージを標的にするか、または、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、外来ウイルスペプチドをディスプレイするウイルス感染細胞に作用する。ＭＨＣ抗原は、ＮＨＣクラスＩ抗原とＭＨＣクラスＩＩ抗原に分けられる。ヒトには、クラスＩ ＨＬＡ遺伝子クラスターには、３つの主要な遺伝子座ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃと、いくつかのマイナーな遺伝子座が含まれる。クラスＩＩ ＨＬＡクラスターには、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲの３つの主要な遺伝子座も含まれる。
【0121】
「ヒト白血球抗原」（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）という用語は、染色体６（６ｐ２１．３１）に位置する、一連の緊密に関連した遺伝子座を含むヒト主要組織適合遺伝子複合体のコード遺伝子であり、ヒト免疫系の機能に密接に関連している。ＨＬＡには、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩの遺伝子部分が含まれる。ＨＬＡのクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子によって発現される抗原は細胞膜上にあり、ＭＨＣ－Ｉ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ部位コーディング）およびＭＨＣ－ＩＩ（ＨＬＡ－Ｄ領域コーディング）である。クラスＩは、体のほぼすべての細胞の表面に分布し、重鎖（α鎖）とβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）で構成されるヘテロダイマーであり、タイプＩＩは、主にマクロファージとＢリンパ球の表面にある糖タンパク質である。
【0122】
「Ｂ２Ｍ」という用語は、ＭＨＣクラスＩ分子の軽鎖である、Ｂ２Ｍとも呼ばれるβ－２ミクログロブリンを指す。ヒトでは、Ｂ２Ｍは染色体１５にあるｂ２ｍ遺伝子によってコードされ、染色体６に遺伝子クラスターとして位置付ける他のＭＨＣ遺伝子と相対する。β－２ミクログロブリン欠損症のマウスモデルは、Ｂ２ＭがＭＨＣクラスＩの細胞表面発現とペプチド結合溝の安定性に必要であることを示している。さらに、β－２ミクログロブリン遺伝子の標的変異により、正常な細胞表面のＭＨＣ Ｉ発現を欠くマウスからの造血移植片は、正常なマウスのＮＫ１．１＋細胞によって拒絶され、これは、ＭＨＣ Ｉ分子の発現不良により、骨髄細胞が宿主の免疫系によって拒絶されやすくなることを示している（Ｂｉｘ ｅｔ ａｌ．１９９１）。
【0123】
よって、より低い同種異系反応活性を有するＴ細胞を提供するために、本発明によって提供されるＴ細胞は、１つのＴＣＲ遺伝子および１つのＨＬＡ遺伝子を不活性化または変異させたＴ細胞を含む。
【0124】
「ＴＣＲが不活性である」ことは、内因性ＴＣＲが少なくとも１つのサブユニット遺伝子、特にＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子が不活性化され、より好ましくはＴＣＲα遺伝子が不活性化されることを意味する。
【0125】
「ＭＨＣが不活性である」ことは、内因性ＭＨＣが少なくとも１つのサブユニット遺伝子、特にＭＨＣ Ｉ遺伝子、より好ましくはＢ２Ｍ遺伝子を不活性化することを意味する。
【0126】
「Ｔ細胞抗原カプラー（Ｔ ＣＥＬＬ ＡＮＴＩＧＥＮ ＣＯＵＰＬＥＲ、ＴＡＣ）」という用語には、一本鎖抗体、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤＡＲＰｉｎ）またはその他のターゲティンググループ２を含む腫瘍ターゲティングドメイン；ＣＤ３に結合する一本鎖抗体により、ＴＡＣ受容体が他のＴＣＲ受容体に近くなる、細胞外領域ドメイン；膜貫通領域とＣＤ４共受容体の細胞内領域の、３つの機能ドメインが含まれる。ここで、細胞内領域は、プロテインキナーゼＬＣＫに接続されており、Ｔ細胞活性化の最初ステップとしてＴＣＲ複合体の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭｓ）のリン酸化を触媒する。
【0127】
本明細書で使用される場合、「活性化する」および「活性化させる」という用語は置き換えて使用でき、それらおよび文法上の他の形式は、細胞が休止状態から活性状態に変化するプロセスを指すことができる。このプロセスは、抗原、移行、および／または機能的活性状態の表現型または遺伝的変化への応答を含むことができる。例えば、「活性化」という用語は、Ｔ細胞の段階的な活性化のプロセスを指すことができる。たとえば、Ｔ細胞は完全に活性化するために少なくとも２つのシグナルを必要とする場合がある。第１のシグナルは、ＴＣＲが抗原－ＭＨＣ複合体によって結合された後に発生することができ、第２のシグナルは、共刺激分子（表１にリストされている共刺激分子を参照）の結合によって発生することができる。インビトロでは、抗ＣＤ３は前記第１のシグナルをシミュレートでき、抗ＣＤ２８は前記第２のシグナルをシミュレートできる。例えば、操作されたＴ細胞は、発現されたＣＡＲによって活性化され得る。本明細書で使用されるＴ細胞活性化またはＴ細胞トリガーは、検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生、および／または検出可能なエフェクター機能を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指し得る。
【0128】
「キメラ受容体」という用語は、すなわち、異なる供給源からのＤＮＡ断片またはタンパク質対応ｃＤＮＡを遺伝子組換え技術によって接続して形成される融合分子であり、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域を含む。キメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、修飾されたＴ細胞（抗原）受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞融合タンパク質（ＴＦＰ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）を含むが、これらに限定されない。
【0129】
「共刺激リガンド」という用語は、Ｔ細胞上の同一性共刺激分子に特異的に結合し、それによってシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を含み、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドをロードしたＭＨＣ分子との組み合わせによって提供される第１のシグナルと一緒に、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介する。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７－Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。共刺激リガンドは特にさらに、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体を含む。
【0130】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによりＴ細胞の共刺激反応を媒介する、Ｔ細胞上の相同結合パートナーを指し、前記Ｔ細胞の共刺激反応として、増殖が挙げられるが、これに限定されない。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これらに限定されない。
【0131】
「共刺激シグナル」という用語は、ＴＣＲ／ＣＤ３などの細胞刺激シグナル分子に結合して組み合わせて、Ｔ細胞増殖および／または重要な分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。
【0132】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞を含むがこれに限定されない免疫細胞によって発現され得る操作された分子を指す。ＣＡＲはＴ細胞で発現し、Ｔ細胞をリダイレクトして、人工受容体によって決定される特異性を誘導して標的細胞を殺すことができる。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウス、ヒト化、または完全ヒトモノクローナル抗体に由来することができる。それが免疫エフェクター細胞にあるとき、それは細胞に標的細胞（通常は癌細胞）に対する特異性を提供し、細胞内シグナルを生成する。ＣＡＲは通常、少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含み、以下に定義される刺激分子及び／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む。一部の態様では、ポリペプチド群は互いに隣接している。ポリペプチド群は、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いにカップリングすることのできる二量体化スイッチを含み、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることのできるスイッチを含む。一態様では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に結合するζ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様では、共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８などの、本明細書に記載される共刺激分子から選択される。一態様では、ＣＡＲはキメラ融合タンパク質を含み、この融合タンパク質は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一態様では、ＣＡＲはキメラ融合タンパク質を含み、この融合タンパク質は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインと刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一態様では、ＣＡＲはキメラ融合タンパク質を含み、この融合タンパク質は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【0133】
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内で情報を伝達することによって機能するタンパク質の機能部分を指し、セカンドメッセンジャーを生成するか、そのようなメッセンジャーに応答してエフェクターとして作用することにより、確定されたシグナル伝達経路を介して細胞の活性を調節するためである。
【0134】
「細胞」という用語および他の文法的形態は、ヒトまたは非ヒト動物由来の細胞を指すことができる。遺伝子操作された細胞も、ＣＡＲを発現する細胞を指すことができる。
【0135】
「トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外因性核酸の導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、当技術分野で知られている様々な手段によって達成することができる。
【0136】
「安定したトランスフェクション」または「安定してトランスフェクションする」という用語は、外因性の核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを、トランスフェクトされる細胞のゲノムへ導入するおよび組み込むことを指す。「安定したトランスフェクタント（ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）」という用語は、外来ＤＮＡをゲノムＤＮＡに安定して組み込んだ細胞を指す。
【0137】
「核酸分子コーディング」、「ＤＮＡ配列をコードする」および「ＤＮＡをコードする」という用語は、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または順序を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、核酸配列はアミノ酸配列をコードする。
【0138】
「個体」という用語は、哺乳類または有袋類などの任意の動物を指す。本発明の個体には、ヒト、ヒト以外の霊長類（アカゲザルまたは他の種類のマカクなど）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット、および任意の種類の家禽が含まれるが、これらに限定されない。
【0139】
「末梢血単核球」（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）という用語は、リンパ球、単球などを含む、末梢血中に単核を有する細胞を指す。
【0140】
「Ｔ細胞活性化する」または「Ｔ細胞活性化させる」という用語および文法上の他の形は、検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生、および／または検出可能なエフェクター機能を誘導するのに十分に刺激されるＴ細胞の状態を指すことができる。場合によっては、「完全なＴ細胞の活性化」はＴ細胞の細胞毒性の誘発に類似してもよい。当技術分野で知られている様々なアッセイを使用して、Ｔ細胞の活性化を測定することができる。前記アッセイは、サイトカイン分泌を測定するためのＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン発現を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ（ＣＤ１０７）、増殖を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ、および標的細胞の排除を確定するための細胞毒性アッセイ（５１Ｃｒ放出アッセイ）であってもよい。前記アッセイは通常、対照（非操作細胞）を使用して操作細胞（ＣＡＲ Ｔ）と比較し、対照と比較した操作細胞の相対的活性化を確定する。さらに、このアッセイは、標的抗原を発現していない標的細胞とインキュベートまたは接触させた操作細胞と比較することができる。例えば、前記比較は、ＧＰＣ３を発現しない標的細胞とインキュベートされたＧＰＣ３－ＣＡＲＴ細胞との比較であってもよい。
【0141】
ヌクレオチド配列を指すために使用される場合、本明細書に使用される「配列」という用語および文法上の他の形式は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、一本鎖または二本鎖であってもよい。核酸配列を変異させることができる。核酸配列は任意の長さを有することができる。
【0142】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、治療的または予防的利益を提供する量を指す。
【0143】
本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に有効的に連結された発現制御配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシスエレメント（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはインビトロ発現システムによって提供されることができる。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば、露出されるまたはリポソームに含まれるもの）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）などの当技術分野で知られているすべてのものが含まれる。
【0144】
本明細書で使用される「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レトロウイルスは、非分裂細胞に感染可能な面においてレトロウイルスの中で独特である。それらは、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効果的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶはいずれもレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移動を達成する手段を提供する。
【0145】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多くのベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自発的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移動を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0146】
本明細書で使用される配列「同一性」という用語は、比較ウィンドウ（例えば、少なくとも２０位置）で２つの最適にマッチした配列を比較することによって同一性パーセンテージを決定し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、付加または欠失（すなわちスペース）を含んでもよく、例えば、最適にマッチした２つの配列にとって参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％以下のスペース（たとえば、５～１５％、または１０～１２％）を含んでもよい。通常、２つの配列で同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を確定してパーセンテージを計算し、これによって正しいペアリング位置の数を生成し、正しいペアリング位置の数を参照配列内の位置の総数（つまり、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを生成する。
【0147】
本明細書で使用される「外因性」という用語は、細胞内で内因性発現を有さないか、または過剰発現されたときの機能を達成するには発現レベルが不十分である核酸分子またはポリペプチドを指す。したがって、「外因性」には、細胞内で発現される組換え核酸分子またはポリペプチド、例えば、外因性、異種および過剰発現された核酸分子およびポリペプチドが含まれる。
【0148】
「内因性」という用語は、生物自身のゲノム内の遺伝子に由来する核酸分子またはポリペプチドを指す。一部の実施形態において、本発明のキメラ受容体は、キメラ抗原受容体である。本明細書で使用される「キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）」という用語は、Ｔ細胞を活性化することができる、細胞内シグナル伝達領域に融合された腫瘍抗原結合ドメインを指す。多くの場合、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化またはヒトモノクローナル抗体に由来する。
【0149】
キメラ抗原受容体は通常、（細）胞外抗原結合領域を含む。一部の実施形態において、細胞外抗原結合領域は、完全にヒトであってもよい。他の場合には、細胞外抗原結合領域をヒト化することができる。他の場合には、細胞外抗原結合領域はマウスに由来するか、または前記細胞外抗原結合領域のキメラは、少なくとも２つの異なる動物からのアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、前記細胞外抗原結合領域は、非ヒトであってもよい。さまざまな抗原結合領域を設計することができる。非限定的な例には、抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ライブラリーから選択されるフラグメントの抗原結合領域（Ｆａｂ）、単一ドメインフラグメント、またはそれらの相同受容体に接合する天然リガンドが含まれる。一部の実施形態において、細胞外抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または天然リガンド、およびそれらの任意の誘導体を含むことができる。細胞外抗原結合領域は、完全抗体の一部を含み、完全抗体が結合する抗原に結合することができる、完全抗体以外の分子を指すことができる。抗体フラグメントの実例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二機能性抗体、線形抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または天然リガンドなどの細胞外抗原結合領域は、抗原特異性を決定するＣＡＲの一部であってもよい。細胞外抗原結合領域は、任意の相補的標的に結合することができる。細胞外抗原結合領域は、既知の可変領域配列を有する抗体から誘導することができる。細胞外抗原結合領域は、入手可能なマウスハイブリドーマから得られた抗体配列から得ることができる。あるいは、細胞外抗原結合領域は、腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの初代細胞の全エクソームシーケンシングから得ることができる。
【0150】
場合によっては、細胞外抗原結合領域の結合特異性は、相補性決定領域、または軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＣＤＲなどのＣＤＲによって確定することができる。多くの場合、結合特異性は軽鎖ＣＤＲと重鎖ＣＤＲによって確定できる。他の参照抗原と比較して、所定の重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲの組み合わせは、所定の結合ポケットを提供することができ、これは、抗原（例えば、ＧＰＣ３）に対してより大きな親和性および／または特異性を与えることができる。例えば、グリピカン－３に特異的なＣＤＲはＣＡＲの細胞外結合領域で発現できるため、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲは、Ｔ細胞をＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞に標的化することができる。
【0151】
本明細書に開示される実施形態のいずれかの特定の局面において、ｓｃＦｖなどの細胞外抗原結合領域は、抗原に特異的な軽鎖ＣＤＲを含むことができる。軽鎖ＣＤＲは、ＣＡＲなどの抗原結合ユニットのｓｃＦｖ軽鎖の相補性決定領域であってもよい。軽鎖ＣＤＲは、連続するアミノ酸残基の配列、または非相補性決定領域（例えば、フレームワーク領域）によって隔てられた２つ以上の連続するアミノ酸残基の配列を含むことができる。場合によっては、軽鎖ＣＤＲは、２つ以上の軽鎖ＣＤＲを含んでもよく、軽鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２などと呼ばれることができる。場合によっては、軽鎖ＣＤＲは３つの軽鎖ＣＤＲを含んでもよく、それぞれ軽鎖ＣＤＲ－１、軽鎖ＣＤＲ－２、および軽鎖ＣＤＲ－３と呼ばれることができる。一部の例では、軽鎖上に存在する一組のＣＤＲは、まとめて軽鎖ＣＤＲと呼ばれることができる。
【0152】
本明細書に開示される実施形態のいずれかの特定の局面において、ｓｃＦｖなどの細胞外抗原結合領域は、抗原に特異的な重鎖ＣＤＲを含んでもよい。重鎖ＣＤＲは、ｓｃＦｖなどの抗原結合ユニットの重鎖相補性決定領域であってもよい。重鎖ＣＤＲは、アミノ酸残基の連続配列、または非相補性決定領域（フレームワーク領域など）によって隔てられた２つ以上のアミノ酸残基の連続配列を含んでもよい。場合によっては、重鎖ＣＤＲは、２つ以上の重鎖ＣＤＲを含んでもよく、重鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２などと呼ばれることができる。場合によっては、重鎖ＣＤＲは、３つの重鎖ＣＤＲを含んでもよく、それぞれ、重鎖ＣＤＲ－１、重鎖ＣＤＲ－２、および重鎖ＣＤＲ－３と呼ばれることができる。場合によっては、共通の重鎖に存在する一組のＣＤＲをまとめて重鎖ＣＤＲと呼ぶことができる。
【0153】
遺伝子工学を使用することにより、細胞外抗原結合領域をさまざまな方法で修飾することができる。場合によっては、細胞外抗原結合領域を変異させて、細胞外抗原結合領域をその標的に対してより高い親和性を有するように選択することができる。場合によっては、細胞外抗原結合領域の標的に対する親和性を、正常組織で低レベルで発現できる標的に最適化することができる。潜在的な毒性をなるべく抑えるためにこの最適化を行うことができる。他の場合には、標的の膜結合型に対してより高い親和性を有する細胞外抗原結合領域のクローンは、それらの可溶性形態の対応物よりも優れている可能性がある。可溶性形態の異なるレベルの標的も検出することができ、それらの標的が望ましくない毒性を引き起こす可能性があるため、この修飾を行うことができる。
【0154】
場合によっては、細胞外抗原結合領域はヒンジまたはスペーサーを含む。ヒンジとスペーサーという用語は置き換えて使用することができる。ヒンジは、細胞外抗原結合領域に柔軟性を提供するために使用されるＣＡＲの一部と見なすことができる。場合によっては、特に細胞外抗原結合領域を検出する抗体が機能しないまたは利用可能である場合、細胞の細胞表面上のＣＡＲの検出にヒンジを使用することができる。例えば、免疫グロブリンに由来するヒンジの長さは、細胞外抗原結合領域によって標的とされる標的上のエピトープの位置に応じて、最適化される必要があるかもしれない。
【0155】
場合によっては、ヒンジは免疫グロブリンに属さず、ＣＤ８α分子の天然のヒンジなどの別の分子に属している可能性がある。ＣＤ８αヒンジは、ＣＤ８補助受容体とＭＨＣ分子の相互作用に役立つことが知られているシステインおよびプロリン残基を含むことができる。前記システインとプロリンの残基は、前記ＣＡＲの性能に影響を与える可能性がある。ＣＡＲヒンジは、そのサイズが調整可能であってもよい。Ｔ細胞と標的細胞の間の免疫シナプスのこの形態はまた、細胞表面標的分子上の膜遠位エピトープのためにＣＡＲによって機能的にブリッジングできない距離を限定し、短いヒンジＣＡＲを使用しても、シナプス距離は、シグナルの伝達可能な近似値に達することができない。同様に、膜近位端にあるＣＡＲ標的エピトープは、長いヒンジＣＡＲのバックグラウンドでのみシグナル出力を観察できる。使用する細胞外抗原結合領域に応じてヒンジを調節できる。ヒンジは任意の長さを有することができる。膜貫通領域は、ＣＡＲを細胞の原形質膜にアンカーすることができる。ＣＤ２８の天然の膜貫通部分はＣＡＲに使用できる。その他の場合、ＣＤ８αの天然の膜貫通部分もＣＡＲで使用できる。「ＣＤ８」は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１７５９または刺激活性を有するそのフラグメントと少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の同一性を有するタンパク質であってもよい。「ＣＤ８核酸分子」は、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。場合によっては、膜貫通領域は、ＣＤ２８の天然の膜貫通部分であってもよい。「ＣＤ２８」は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００６１３０またはその刺激活性を有するそのフラグメントと少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の同一性を有するタンパク質であってもよい。「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。場合によっては、膜貫通部分はＣＤ８α領域を含んでもよい。ＣＡＲの細胞内シグナル領域は、ＣＡＲが配置されているＴ細胞のエフェクター機能の少なくとも１つを活性化することを担当することができる。ＣＡＲはＴ細胞のエフェクター機能を誘導することができる。例えば、前記エフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性または補助活性である。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特異的な機能を実行するようにガイドするタンパク質の部分を指す。通常は、完全な細胞内シグナル伝達ドメインを使用することができるが、多くの場合、シグナルドメインの完全鎖を使用する必要はない。場合によっては、細胞内シグナル伝達領域の短縮された部分を使用する。したがって、場合によっては、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含もうとする。
【0156】
ＣＡＲで使用されるシグナルドメインの好ましい例には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列および標的－受容体結合後にシグナル伝達を開始するために相乗的に作用する共同受容体、ならびにそれらの任意の誘導体または変異体配列およびそれらの配列と同じ機能を持つ任意の合成配列が含まれてもよい。
【0157】
場合によっては、前記細胞内シグナルドメインは、既知の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のシグナルモチーフを含んでもよい。細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例には、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ６６ｄのＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２のタンパク質に由来する機能的シグナル伝達ドメインが含まれる。しかしながら、好ましい実施形態では、細胞内シグナルドメインは、ＣＤ３ζ鎖に由来する。１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフを含むＴ細胞シグナルドメインの例は、Ｔ細胞受容体Ｔ３ζ鎖またはＣＤ２４７としても呼ばれるＣＤ３ζドメインである。このドメインはＴ細胞受容体－ＣＤ３複合体の一部であり、いくつかの細胞内シグナル伝達経路の抗原認識とＴ細胞の主な効果の活性化を組み合わせる上で重要な役割を果たす。本明細書で使用されるように、ＣＤ３ζは主に、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリーＰ２０９６３から知られているように、実質的に同じ配列を有するタンパク質を含む、ヒトＣＤ３ζおよびそのアイソフォームを指す。キメラ抗原受容体の一部として、完全なＴ細胞受容体Ｔ３ζ鎖は必要ではなく、Ｔ細胞受容体Ｔ３ζ鎖のシグナルドメインを含む任意の誘導体が適切であり、その機能的同等物を含むことをここでもう一度強調する。
【0158】
細胞内シグナル伝達ドメインは、表１のドメインのいずれかから選択できる。場合によっては、参照ドメインとの同一性が約５０％から約１００％になるようにドメインを修飾することができる。表１のドメインのいずれか１つを修飾して、修飾されたものに約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または最大約１００％の同一性を含めることができる。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達領域は、１つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含むことができる。細胞内シグナル伝達領域は、ζ鎖（第１世代のＣＡＲ）またはそれとＣＤ２８または４－１ＢＢ（第２世代のＣＡＲ）などの単一の共刺激ドメインを含むことができる。他の例では、細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８／ＯＸ４０またはＣＤ２８／４－１ＢＢ（第３世代）などの２つの共刺激ドメインを含むことができる。
【0159】
ＣＤ８などの細胞内シグナルドメインとともに、これらの共刺激ドメインはキナーゼ経路の下流の活性化を引き起こし、それによって遺伝子転写と機能的な細胞応答をサポートすることができる。ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスホスフェート３－キナーゼ）または４－１ＢＢ／ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体関連因子アダプタータンパク質）経路、ならびにＭＡＰＫおよびＡｋｔ活性化に関連する近位シグナルタンパク質を活性化することができる。
【0160】
場合によっては、ＣＡＲによって生成されたシグナルは、補助シグナルまたは共刺激シグナルと組み合わされることがある。共刺激シグナルドメインの場合、キメラ抗原受容体様複合体は、いくつかの可能な共刺激シグナルドメインを含むように設計されることができる。当技術分野でよく知られているように、ナイーブＴ細胞では、Ｔ細胞受容体の接合だけでは、Ｔ細胞の細胞傷害性Ｔ細胞への完全な活性化を誘導するのに十分ではない。完全な生産的Ｔ細胞の活性化には、第２の共刺激シグナルが必要である。ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢＬ、ＭｙＤ８８、４－１ＢＢなどを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞活性化の共刺激を提供するいくつかの受容体が報告されている。これらの共刺激分子によって使用されるシグナル伝達経路はいずれも、Ｔ細胞受容体活性化の主なシグナルと相乗的に作用することができる。これらの共刺激シグナル伝達領域によって提供されるシグナルは、１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフ（たとえば、ＣＤ３ｚｅｔａシグナル伝達ドメイン）に由来する主効果活性化シグナルと相乗的に作用し、Ｔ細胞活性化の要件を完了することができる。
【0161】
場合によっては、キメラ抗原受容体様複合体に共刺激ドメインを付加すると、操作された細胞の有効性と耐久性を高めることができる。別の実施形態では、Ｔ細胞シグナルドメインおよび共刺激ドメインは、互いに融合して、シグナル伝達領域を形成する。
【0162】
【表1】
【0163】
本明細書で使用される「調節」という用語は、正または負の変更を指す。調節の例には、１％、２％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の変更が含まれる。
【0164】
本明細書で使用される「治療」という用語は、ヒトを変えようとするまたは細胞によって引き起こされる疾患を処置する過程における臨床的介入を指し、予防もできると共に、臨床病理学的過程において介入することもできる。治療効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患の進行の遅延、状態の改善または緩和、予後の緩和または改善などが含まれるが、これらに限定されない。
【0165】
Ｔ細胞
本明細書に記載のＴ細胞は、本発明の方法によって改変されたＴ細胞を指し、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ遺伝子および／またはＭＨＣ遺伝子はサイレンシングされる。
本明細書に記載のＴ細胞は、本発明の方法によって改変されたＴ細胞を指し、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ遺伝子および／またはＭＨＣ遺伝子はサイレンシングされる。
【0166】
場合によっては、Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋および／またはＩＬ－７Ｒα＋で構成される幹細胞様メモリーＴＳＣＭ細胞であってもよく、その幹細胞様メモリー細胞はまた、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＸＣＲ３および／またはＬＦＡ－１を発現でき、幹細胞様メモリー細胞とは異なる多くの機能特性を示すことができる。あるいは、免疫反応性細胞はまた、Ｌ－セレクチンおよびＣＣＲ７を含む中央記憶ＴＣＭ細胞であってもよく、ここで、中央記憶細胞は、例えば、ＩＬ－２を分泌することができるが、ＩＦＮγまたはＩＬ－４を分泌しない。免疫反応性細胞はまた、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクターメモリーＴＥＭ細胞であってもよく、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ－４などのエフェクターサイトカインを産生する。
【0167】
通常、以下に記載されるように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）または局所適用により、ベクターをインビボで個々の患者への投与によって送達する。あるいは、ベクターは、個々の患者から取り出された細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、骨髄吸引物、組織生検）などのエクスビボでの細胞に送達することができ、その後、通常、ベクターを組み込んだ細胞を選択した後、細胞を患者の体内に再移植する。選択の前または後に、細胞を増殖させることができる。
【0168】
Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、及び、感染部位、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍に由来する組織などの多くの供給源から入手できる。場合によっては、ＦｉｃｏｌｌＴＭ単離などの当業者に知られている任意の数の技術を使用して、個体から収集された血液からＴ細胞を取得することができる。一実施形態では、アフェレーシスにより、個体の循環血液からの細胞が得られる。アフェレーシス製品は通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核血液白血球、赤血球、および血小板を含む。一実施形態では、アフェレーシス収集によって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。あるいは、細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者から由来することができる。
【0169】
一部の実施形態では、細胞は、異なる表現型の特徴を有する混合細胞集団の一部であってもよい。前述の方法に従って、形質転換されたＴ細胞から細胞株を取得することもできる。細胞は、細胞治療バンクから入手することもできる。
【0170】
場合によっては、適切な初代細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞または非多能性幹細胞などの他の血液細胞亜集団が含まれる。場合によっては、細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、または他の任意のタイプのＴ細胞などの腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）であってもよい。Ｔ細胞はまた、記憶Ｔ細胞、幹細胞様記憶Ｔ細胞、またはエフェクターＴ細胞を含んでもよい。全血などの大集団からＴ細胞を選択することもできる。Ｔ細胞を大集団から増殖させることもできる。Ｔ細胞はまた、特定の集団および表現型に傾く可能性もある。たとえば、Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒα（＋）を含む表現型に傾く可能性がある。適切な細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒα（＋）からの１つまたは複数のマーカーから選択できる。適切な細胞には、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞も含まれる。適切な細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、および／またはマウス細胞などの任意の数の初代細胞を含んでもよい。適切な細胞は、前駆細胞であってもよい。適切な細胞は、治療される被験者（例えば、患者）に由来することができる。
【0171】
患者に必要な治療上有効な細胞の量は、細胞の生存率および細胞が遺伝子修飾される効率に応じて変化できる（例えば、導入遺伝子が１つまたは複数の細胞に組み込まれる効率、または導入遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベル）。場合によっては、遺伝子修飾後の細胞生存率の産物（例えば、倍加）と導入遺伝子組み込みの効率は、被験者へ投与可能な細胞の治療量に対応することができる。場合によっては、遺伝子修飾後の細胞生存率の増加は、治療が行われたときに患者に有効な必要な細胞の量の減少に対応する可能性がある。場合によっては、導入遺伝子の１つまたは複数の細胞への組み込みの効率の増加は、患者に治療的に有効なものを与えるために必要な細胞の数の減少に対応し得る。場合によっては、必要な治療上有効な細胞の量を決定することは、経時的な細胞の変化に関連する機能を決定することを含み得る。場合によっては、治療上有効である必要な細胞の量を決定することは、時間関連の変数に基づいて導入遺伝子を１つ以上の細胞に組み込む効率の変化に対応する機能（例えば、細胞培養時間、エレクトロポレーション時間、細胞培養時間）を決定することを含み得る。場合によっては、治療上有効な細胞は、細胞表面上にキメラ受容体の約３０％から約１００％の発現を含む細胞集団であってもよい。場合によっては、フローサイトメトリーで測定すると、治療上有効な細胞は、細胞表面に前記キメラ受容体を約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または約９９．９％超発現することができる。
【0172】
医薬組成物
本発明のＴ細胞は、医薬組成物を調製するために使用することができる。有効量のＴ細胞に加えて、前記医薬組成物はまた、薬学上許容される担体を含んでもよい。「薬学上許容される」という用語は、分子本体および組成物が動物またはヒトに適切に投与された場合、それらが有害、アレルギーまたは他の有害反応を引き起こさないことを意味する。
本発明のＴ細胞は、医薬組成物を調製するために使用することができる。有効量のＴ細胞に加えて、前記医薬組成物はまた、薬学上許容される担体を含んでもよい。「薬学上許容される」という用語は、分子本体および組成物が動物またはヒトに適切に投与された場合、それらが有害、アレルギーまたは他の有害反応を引き起こさないことを意味する。
【0173】
薬学上許容される担体またはその成分として使用できるいくつかの物質の特定の例は、抗酸化剤、防腐剤、パイロジェンフリー水、等張塩溶液、およびリン酸塩緩衝液などである。
【0174】
本発明の組成物は、必要に応じて様々な剤形にすることができ、医師は、患者のタイプ、年齢、体重、一般的な病状、および投与方法などの要因に従って確定した、患者にとって有益な剤量に従って投与することができる。投与方式は、例えば、非経口投与（注射など）または他の治療方式が使用できる。
【0175】
組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または胸骨内注射または注入技術が含まれる。
【0176】
個体に投与されるＴ細胞集団含有試薬は、特定の適応症または疾患を治療および／または予防するのに有効な複数のＴ細胞を含む。したがって、治療上有効な免疫反応性細胞の集団を個体に投与することができる。一般に、約１×１０４から約１×１０１０の免疫反応性細胞を含む試薬が投与される。ほとんどの場合、試薬は、約１×１０５から約１×１０９の免疫反応性細胞、約５×１０５から約５×１０８の免疫反応性細胞、または約１×１０６から約１×１０７の免疫反応性細胞を含む。しかしながら、癌の場所、発生源、アイデンティティ、程度および重症度、治療される個体の年齢および体調などに応じて、個体に投与されるＣＡＲ免疫反応性細胞の数は広範囲内で変化する。医師は最終的に使用する適切な用量を決定する。
【0177】
一部の実施形態において、キメラ抗原受容体を使用して免疫細胞媒介性免疫応答を刺激する。たとえば、Ｔ細胞を介した免疫応答は、Ｔ細胞の活性化に係る免疫応答である。活性化された抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞は、腫瘍抗原をディスプレイする癌細胞など、表面に外来抗原エピトープをディスプレイする標的細胞にアポトーシスを誘導することができる。別の実施形態において、キメラ抗原受容体を使用して哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供する。Ｔ細胞を介した免疫応答により、被験者は抗腫瘍免疫を産生する。
【0178】
場合によっては、癌を有する被験者を治療する方法は、治療を必要とする被験者に本発明の１つまたは複数のＴ細胞を投与することに係ることができる。前記Ｔ細胞は腫瘍標的分子に結合し、癌細胞の死を誘発することができる。
【0179】
上記のように、本発明はまた、個体における病原体感染を治療する方法を提供し、これは、治療有効量の本発明のＴ細胞を前記個体に投与することを含む。
【0180】
抗腫瘍薬との併用
一部の実施形態において、本発明のＴ細胞は、他の治療薬と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態において、他の治療薬は、化学療法剤である。本発明のＴ細胞と組み合わせて使用することができる化学療法剤には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびノビビン（ＴＭ）（ビノレルビン、５’－硫化脱水素）を含む有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）；ＣａｍｐｔｏｓａｒＴＭ（イリノテカンＨＣＬ）、ＨｙｃａｍｔｉｎＴＭ（トポテカンＨＣＬ）を含むカンプトテシン化合物、及びカンプトテシンおよびその類似体に由来する他の化合物などのトポイソメラーゼＩ阻害剤；エトポシド、テニポシド、及びミドキシゾズなどのポドフィロトキシン誘導体；アルキル化剤、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ブリキアジン、ウラシルマスタード、クロプロフェンおよびダカルバジン；シタラビン、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびプロカルバジンを含む代謝拮抗剤；ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、マイシノマイシン、マイトマイシン、サルコマイシンＣおよびダウノルビシンを含むがこれらに限定されない抗生物質；および、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサカム、メルファラン、イフォスファミドおよびミトキサントロンを含むがこれらに限定されない他の化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、本発明のＴ細胞は、他の治療薬と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態において、他の治療薬は、化学療法剤である。本発明のＴ細胞と組み合わせて使用することができる化学療法剤には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびノビビン（ＴＭ）（ビノレルビン、５’－硫化脱水素）を含む有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）；ＣａｍｐｔｏｓａｒＴＭ（イリノテカンＨＣＬ）、ＨｙｃａｍｔｉｎＴＭ（トポテカンＨＣＬ）を含むカンプトテシン化合物、及びカンプトテシンおよびその類似体に由来する他の化合物などのトポイソメラーゼＩ阻害剤；エトポシド、テニポシド、及びミドキシゾズなどのポドフィロトキシン誘導体；アルキル化剤、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ブリキアジン、ウラシルマスタード、クロプロフェンおよびダカルバジン；シタラビン、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびプロカルバジンを含む代謝拮抗剤；ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、マイシノマイシン、マイトマイシン、サルコマイシンＣおよびダウノルビシンを含むがこれらに限定されない抗生物質；および、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサカム、メルファラン、イフォスファミドおよびミトキサントロンを含むがこれらに限定されない他の化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0181】
一部の実施形態において、本発明のＴ細胞と組み合わせて使用することができる化学療法剤は、抗ＶＥＧＦ抗体（ヒト化およびキメラ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）および他の血管新生阻害剤、例えば血管アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、レチノイン酸、およびメタロプロテイナーゼ－１および－２の組織阻害剤を含む、抗血管新生剤を含むが、これらに限定されない。
【0182】
キット
本発明はまた、本発明のＴ細胞を含むキットを提供する。このキットは、癌、病原体感染、免疫障害、または同種移植の治療または予防に使用できる。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の単位剤形で有効量のＴ細胞を含む治療的または予防的組成物を含むことができる。
本発明はまた、本発明のＴ細胞を含むキットを提供する。このキットは、癌、病原体感染、免疫障害、または同種移植の治療または予防に使用できる。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の単位剤形で有効量のＴ細胞を含む治療的または予防的組成物を含むことができる。
【0183】
一部の実施形態では、キットは、治療的または予防的組成物を含むことができる無菌容器を含む。
【0184】
場合によっては、キットは、約１×１０４の細胞から約１×１０６の細胞を含むことができる。場合によっては、キットは、少なくとも約１×１０５の細胞、少なくとも約１×１０６の細胞、少なくとも約１×１０７の細胞、少なくとも約４×１０７の細胞、少なくとも約５×１０７の細胞、少なくとも約６×１０７の細胞、少なくとも約６×１０７の細胞、少なくとも約８×１０７の細胞、少なくとも約９×１０７の細胞、少なくとも約１×１０８の細胞、少なくとも約２×１０８の細胞、少なくとも約３×１０８の細胞、少なくとも約４×１０８の細胞、少なくとも約５×１０８の細胞、少なくとも約６×１０８の細胞、少なくとも約６×１０８の細胞、少なくとも約８×１０８の細胞、少なくとも約９×１０８の細胞、少なくとも約１×１０９の細胞、少なくとも約２×１０９の細胞、少なくとも約３×１０９の細胞、少なくとも約４×１０９の細胞、少なくとも約５×１０９の細胞、少なくとも約６×１０９の細胞、少なくとも約８×１０９の細胞、少なくとも約９×１０９の細胞、少なくとも約１×１０１０の細胞、少なくとも約２×１０１０の細胞、少なくとも約３×１０１０の細胞、少なくとも約４×１０１０の細胞、少なくとも約５×１０１０の細胞、少なくとも約６×１０１０の細胞、少なくとも約９×１０１０の細胞、少なくとも約９×１０１０の細胞、少なくとも約１×１０１１の細胞、少なくとも約２×１０１１の細胞、少なくとも約３×１０１１の細胞、少なくとも約４×１０１１の細胞、少なくとも約５×１０１１の細胞、少なくとも約８×１０１１の細胞、少なくとも約９×１０１１の細胞、または少なくとも約１×１０１２の細胞を含むことができる。例えば、キットには、約５×１０１０の細胞が含まれることができる。
【0185】
場合によっては、キットに同種異系細胞が含まれることができる。場合によっては、キットにはゲノム修飾を含むことができる細胞が含まれることができる。場合によっては、キットに「既成の」細胞が含まれることができる。場合によっては、キットには、臨床使用までに拡張できる細胞が含まれることができる。場合によっては、キットには研究目的の内容が含まれることがある。
【0186】
本発明の利点：
本発明の方法による遺伝子編集は、編集効率が高いだけでなく、細胞生存率も良好である。
本発明の方法による遺伝子編集は、編集効率が高いだけでなく、細胞生存率も良好である。
【0187】
本発明は、具体的な実施形態と併せて以下でさらに説明される。これらの実施形態は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。下記の実施形態では、具体的な条件を示していない実験方法は、通常、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、科学出版社、２００２に記載されている条件などの通常の条件に従うか、製造元に勧められた条件に従う。
【0188】
例示的に、以下の実施例では、本発明の方法を説明するためにＴ細胞が選択される。
【0189】
Ｔ細胞の取得：健康なドナーから採取した末梢血から分離してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得て、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体結合ビーズ（ｂｅａｄｓ）を添加して活性化し、培養および増殖させてＴ細胞を取得した。
【0190】
実施例１：ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの設計と合成
図１に示すように、ＴＲＡＣ（ＴＣＲαＣ、Ｔ細胞受容体α定常遺伝子座）遺伝子の最初のエキソン（ヌクレオチド配列は配列番号１に示されている）に対して、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする８つのｓｇＲＮＡ配列、すなわち、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２（配列番号３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３（配列番号４）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－４（配列番号５）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－５（配列番号３２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－６（配列番号３３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－７（配列番号３９）及びｓｇ－ＴＲＡＣ－８（配列番号４０）を設計して得た。
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２（配列番号３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３（配列番号４）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－５（配列番号３２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－６（配列番号３３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－７（配列番号３９）及びｓｇ－ＴＲＡＣ－８（配列番号４０）を実験のために選択した。配列番号２０および２１に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１を転写および増幅した；配列番号２２および２３に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２を転写および増幅した；配列番号２４および２５に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３を転写および増幅した；配列番号３４および３５に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－５を転写および増幅した；配列番号３６および３７に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－６を転写および増幅した；配列番号４１および４２に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－７を転写および増幅した；配列番号４３および４４に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－８を転写および増幅した。
ＴＲＡＣ－ｅｘｏｎ １配列（配列番号１）：
ＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡ ＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡ ＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）：ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－２（配列番号３）：ＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＣ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－３（配列番号４）：ＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－４（配列番号５）：ＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－５（配列番号３２）：ＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－６（配列番号３３）：ＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－７（配列番号３９）：ＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－８（配列番号４０）：ＴＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
図１に示すように、ＴＲＡＣ（ＴＣＲαＣ、Ｔ細胞受容体α定常遺伝子座）遺伝子の最初のエキソン（ヌクレオチド配列は配列番号１に示されている）に対して、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする８つのｓｇＲＮＡ配列、すなわち、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２（配列番号３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３（配列番号４）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－４（配列番号５）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－５（配列番号３２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－６（配列番号３３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－７（配列番号３９）及びｓｇ－ＴＲＡＣ－８（配列番号４０）を設計して得た。
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２（配列番号３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３（配列番号４）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－５（配列番号３２）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－６（配列番号３３）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－７（配列番号３９）及びｓｇ－ＴＲＡＣ－８（配列番号４０）を実験のために選択した。配列番号２０および２１に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１を転写および増幅した；配列番号２２および２３に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２を転写および増幅した；配列番号２４および２５に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３を転写および増幅した；配列番号３４および３５に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－５を転写および増幅した；配列番号３６および３７に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－６を転写および増幅した；配列番号４１および４２に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－７を転写および増幅した；配列番号４３および４４に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－８を転写および増幅した。
ＴＲＡＣ－ｅｘｏｎ １配列（配列番号１）：
ＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡ ＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡ ＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）：ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－２（配列番号３）：ＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＣ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－３（配列番号４）：ＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－４（配列番号５）：ＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－５（配列番号３２）：ＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－６（配列番号３３）：ＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－７（配列番号３９）：ＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ｓｇ－ＴＲＡＣ－８（配列番号４０）：ＴＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
【0191】
実施例２：ノックアウト効率に対するＣａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣの異なる比率の影響
活性化Ｔ細胞を取って細胞をカウントし、２＊１０＾７／ｍｌの細胞密度に調整した。ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択した。
Ｃａｓ９酵素（ＮＥＢから購入）とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比をそれぞれ１：２、１：３、１：４、および１：５の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。室温で１０分間インキュベートした後、１＊１０＾６Ｔ細胞に添加した（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は０．３μＭであった）。その中で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル数は、ｇＲＮＡの塩基組成と４．０３μｇ／μｌの濃度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．９８）に基づいて計算された。
ＲＮＰ複合体は、ＢＴＸエレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）を使用してＴ細胞に導入され、エレクトロポレーションパラメーターは、２５０Ｖ、５ｍｓであった。ＴＣＲノックアウトの効率を検証するために、トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図２と表１に示す。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：３から１：５の場合、ノックアウト効率は７０％以上であった。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、ノックアウト効率が最も高く、８７．２％に達した。これは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比が１：４である時、遺伝子ノックアウト効果が最もよいことを示している。
活性化Ｔ細胞を取って細胞をカウントし、２＊１０＾７／ｍｌの細胞密度に調整した。ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択した。
Ｃａｓ９酵素（ＮＥＢから購入）とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比をそれぞれ１：２、１：３、１：４、および１：５の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。室温で１０分間インキュベートした後、１＊１０＾６Ｔ細胞に添加した（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は０．３μＭであった）。その中で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル数は、ｇＲＮＡの塩基組成と４．０３μｇ／μｌの濃度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．９８）に基づいて計算された。
ＲＮＰ複合体は、ＢＴＸエレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）を使用してＴ細胞に導入され、エレクトロポレーションパラメーターは、２５０Ｖ、５ｍｓであった。ＴＣＲノックアウトの効率を検証するために、トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図２と表１に示す。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：３から１：５の場合、ノックアウト効率は７０％以上であった。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、ノックアウト効率が最も高く、８７．２％に達した。これは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比が１：４である時、遺伝子ノックアウト効果が最もよいことを示している。
【表2】
【0192】
実施例３：ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトに対する異なるｓｇＲＮＡの影響
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする３つの異なるｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３を選択した。
ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。実施例１で合成されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３の３つのｓｇＲＮＡをそれぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたパラメーターに基づいてエレクトロポレーションを行い、ＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図３と表２に示す。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のノックアウト効果はｓｇ－ＴＲＡＣ－２およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３のノックアウト効果よりも有意に優れており、これは、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１が最高のノックアウト効果を有することを示している。それと同時に、異なる長さのｓｇ－ＴＲＡＣ－１がノックアウト効率に対する影響をテストし、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－５）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－６）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－７）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－８）の４つのｓｇＲＮＡをそれぞれ合成し、それぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１のモル比で混合してＲＮＰ複合体を形成し、上記の条件下でＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をＣＤ３抗体フローサイトメトリーに使用して、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。実験結果を図３Ｂに示す。２つまたは３つの塩基が短縮されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１はＴＣＲノックアウト効率に対する影響が小さいが、２つまたは３つの塩基を追加するとＴＣＲノックアウト効率が低下する。これは、この部位のｓｇＲＮＡの設計された長さをある程度変更することができ、特に３つ以内の塩基を短縮すると、同じく比較的に高いノックアウト効果を得ることができることを示している。
なお、公開された文献では、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１でもＴＣＲノックアウト効率を９０％に到達させることができるが、この文献では２回のエレクトロポレーションを使用した最適化されたノックアウト方法が使用されており、そのプロセスは比較的に複雑である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６を参照、図１Ａは、ＴＣＲノックアウト率が９５．７％であることを示している）。これに対して、本発明は、１回のエレクトロポレーションで９０％以上のノックアウト率を達成でき、有意なメリットがある。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする３つの異なるｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３を選択した。
ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。実施例１で合成されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３の３つのｓｇＲＮＡをそれぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたパラメーターに基づいてエレクトロポレーションを行い、ＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図３と表２に示す。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のノックアウト効果はｓｇ－ＴＲＡＣ－２およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３のノックアウト効果よりも有意に優れており、これは、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１が最高のノックアウト効果を有することを示している。それと同時に、異なる長さのｓｇ－ＴＲＡＣ－１がノックアウト効率に対する影響をテストし、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－５）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－６）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－７）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－８）の４つのｓｇＲＮＡをそれぞれ合成し、それぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１のモル比で混合してＲＮＰ複合体を形成し、上記の条件下でＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をＣＤ３抗体フローサイトメトリーに使用して、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。実験結果を図３Ｂに示す。２つまたは３つの塩基が短縮されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１はＴＣＲノックアウト効率に対する影響が小さいが、２つまたは３つの塩基を追加するとＴＣＲノックアウト効率が低下する。これは、この部位のｓｇＲＮＡの設計された長さをある程度変更することができ、特に３つ以内の塩基を短縮すると、同じく比較的に高いノックアウト効果を得ることができることを示している。
【表3】
なお、公開された文献では、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１でもＴＣＲノックアウト効率を９０％に到達させることができるが、この文献では２回のエレクトロポレーションを使用した最適化されたノックアウト方法が使用されており、そのプロセスは比較的に複雑である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６を参照、図１Ａは、ＴＣＲノックアウト率が９５．７％であることを示している）。これに対して、本発明は、１回のエレクトロポレーションで９０％以上のノックアウト率を達成でき、有意なメリットがある。
【0193】
実施例４：ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトに対するＣａｓ９酵素濃度の影響
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．０６２５μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ）、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。
ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。
フローサイトメトリーの結果を図４と表３に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．１μＭを超えると、ＴＣＲのノックアウト効率は７０％以上に達することができる。たとえば、０．１２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は７５％以上に達することができ、特に０．２μＭを超える場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９４．５％以上に達することができ、Ｃａｓ９酵素の濃度が０．３～０．５μＭの場合、９５％以上に達することができる。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９７．４％に達することができ、細胞の生存率はいずれも９０％以上である。
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．０６２５μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ）、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。
ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。
フローサイトメトリーの結果を図４と表３に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．１μＭを超えると、ＴＣＲのノックアウト効率は７０％以上に達することができる。たとえば、０．１２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は７５％以上に達することができ、特に０．２μＭを超える場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９４．５％以上に達することができ、Ｃａｓ９酵素の濃度が０．３～０．５μＭの場合、９５％以上に達することができる。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９７．４％に達することができ、細胞の生存率はいずれも９０％以上である。
【表4】
【0194】
実施例５：Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの設計と合成
図５に示すように、Ｂ２Ｍ遺伝子の最初のエキソンＢ２Ｍ－ｅｘｏｎ １（ヌクレオチド配列は配列番号１０に示す）に対して、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする４つのｓｇＲＮＡ配列、すなわち、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１（配列番号１１）、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２（配列番号１２）、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３（配列番号１３）、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－４（配列番号１４）を得た。
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、およびｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を実験のために選択した。配列番号２６および２７に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１を転写および増幅した；配列番号２８および２９に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２を転写および増幅した；配列番号３０および３１に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を転写および増幅した。
Ｂ２Ｍ－ｅｘｏｎ １配列（配列番号１０）：
ＡＡＴＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣ
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１（配列番号１１）：ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴ
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２（配列番号１２）：ＧＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡ
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３（配列番号１３）：ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡ
図５に示すように、Ｂ２Ｍ遺伝子の最初のエキソンＢ２Ｍ－ｅｘｏｎ １（ヌクレオチド配列は配列番号１０に示す）に対して、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする４つのｓｇＲＮＡ配列、すなわち、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１（配列番号１１）、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２（配列番号１２）、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３（配列番号１３）、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－４（配列番号１４）を得た。
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、およびｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を実験のために選択した。配列番号２６および２７に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１を転写および増幅した；配列番号２８および２９に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２を転写および増幅した；配列番号３０および３１に示すプライマーをインビトロで合成し、インビトロでｇＲＮＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を転写および増幅した。
Ｂ２Ｍ－ｅｘｏｎ １配列（配列番号１０）：
ＡＡＴＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣ
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１（配列番号１１）：ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴ
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２（配列番号１２）：ＧＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡ
ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３（配列番号１３）：ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡ
【0195】
実施例６：Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトに対する異なるｓｇＲＮＡ配列の影響
実施例５で得られた、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を使用してＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を比較した。
Ｃａｓ９酵素（０．５μＭ）とｇＲＮＡを１：４の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｂ２Ｍノックアウトの効率を検証するために、β－ミクログロブリン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色のためにＴ細胞を採取した。フローサイトメトリーの結果を図６と表４に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２のノックアウト効果は９０％以上に達しており、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３より有意に優れている。これは、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２がいずれもよいノックアウト効果を有することを示している。
同じｓｇ－Ｂ２Ｍ－１配列を使用し、報告されたノックアウト率は５０～６０％しか達していないが（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｍａｒ ２；５４３（７６４３）：１１３－１１７、図３ｃは、Ｂ２Ｍノックアウト率が５５％であることを示している）、本発明の方法で最適化された後、Ｂ２Ｍのノックアウト率は大幅に高められ、９５％に達することができる。
実施例５で得られた、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を使用してＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を比較した。
Ｃａｓ９酵素（０．５μＭ）とｇＲＮＡを１：４の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｂ２Ｍノックアウトの効率を検証するために、β－ミクログロブリン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色のためにＴ細胞を採取した。フローサイトメトリーの結果を図６と表４に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２のノックアウト効果は９０％以上に達しており、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３より有意に優れている。これは、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２がいずれもよいノックアウト効果を有することを示している。
【表5】
同じｓｇ－Ｂ２Ｍ－１配列を使用し、報告されたノックアウト率は５０～６０％しか達していないが（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｍａｒ ２；５４３（７６４３）：１１３－１１７、図３ｃは、Ｂ２Ｍノックアウト率が５５％であることを示している）、本発明の方法で最適化された後、Ｂ２Ｍのノックアウト率は大幅に高められ、９５％に達することができる。
【0196】
実施例７：ノックアウト効率に対するＣａｓ９酵素濃度の影響
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－Ｂ２Ｍ－２を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇＲＮＡのモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたエレクトロポレーション条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をとりＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図７と表５に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．２μＭを超えると、ノックアウト効率は７０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ノックアウト効率は７２．２％であり、Ｃａｓ９酵素の濃度が１μＭ以上の場合、ノックアウト効率は９０％以上に達することができる。１μＭ～３μＭの場合、よいノックアウト効率を示し、特に１μＭ～２μＭの場合、ノックアウト効率はいずれも９３％くらいである。
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－Ｂ２Ｍ－２を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇＲＮＡのモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたエレクトロポレーション条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をとりＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図７と表５に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．２μＭを超えると、ノックアウト効率は７０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ノックアウト効率は７２．２％であり、Ｃａｓ９酵素の濃度が１μＭ以上の場合、ノックアウト効率は９０％以上に達することができる。１μＭ～３μＭの場合、よいノックアウト効率を示し、特に１μＭ～２μＭの場合、ノックアウト効率はいずれも９３％くらいである。
【表6】
【0197】
実施例８：Ｔ細胞においてＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子を同時に効率的にノックアウトすること
１、ｇＲＮＡ組成成分の比率の影響
既存の報告によると、ＴＣＲとＢ２Ｍのダブルノックアウト効率は高くともわずか約６０％である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６の図３ｂ、及びＯｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，Ｖｏｌ． ８，（Ｎｏ． １０），ｐｐ：１７００７－１７０１１の図３ａを参照）。したがって、この実施例では、上記の最適化された方法をさらに使用して、Ｂ２ＭおよびＴＣＲの効率的なダブルノックアウトの組み合わせをスクリーニングすることが望まれている。
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の比率がＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトに対する影響を検出するために、Ｃａｓ９酵素と総ｇＲＮＡのモル比が１：４である場合に、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率をそれぞれ１．５：１、１：１、及び０．５：１に設定して、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目にＣＤ３抗体及びＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図８と表６に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率が１：１である時、ＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトの効果が最も良い。
２、ＲＮＰ濃度の最適化
標的ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子で構成されるｇＲＮＡ混合物とＣａｓ９酵素の間で形成されるＲＮＰ複合体の濃度を調べるために、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡの最適化されたモル比１：４に従って、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目に、ＣＤ３抗体およびＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図９と表７に示す。Ｃａｓ９酵素の最終濃度が１μＭ以上の場合、ＴＲＡＣとＢ２Ｍのダブルノックアウト効果はいずれも９０％以上に達すことができ、３μＭでは９３．４％に達すことができる。
１、ｇＲＮＡ組成成分の比率の影響
既存の報告によると、ＴＣＲとＢ２Ｍのダブルノックアウト効率は高くともわずか約６０％である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６の図３ｂ、及びＯｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，Ｖｏｌ． ８，（Ｎｏ． １０），ｐｐ：１７００７－１７０１１の図３ａを参照）。したがって、この実施例では、上記の最適化された方法をさらに使用して、Ｂ２ＭおよびＴＣＲの効率的なダブルノックアウトの組み合わせをスクリーニングすることが望まれている。
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の比率がＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトに対する影響を検出するために、Ｃａｓ９酵素と総ｇＲＮＡのモル比が１：４である場合に、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率をそれぞれ１．５：１、１：１、及び０．５：１に設定して、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目にＣＤ３抗体及びＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図８と表６に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率が１：１である時、ＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトの効果が最も良い。
【表7】
２、ＲＮＰ濃度の最適化
標的ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子で構成されるｇＲＮＡ混合物とＣａｓ９酵素の間で形成されるＲＮＰ複合体の濃度を調べるために、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡの最適化されたモル比１：４に従って、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目に、ＣＤ３抗体およびＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図９と表７に示す。Ｃａｓ９酵素の最終濃度が１μＭ以上の場合、ＴＲＡＣとＢ２Ｍのダブルノックアウト効果はいずれも９０％以上に達すことができ、３μＭでは９３．４％に達すことができる。
【表8】
【0198】
実施例９：Ｔ細胞におけるＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の同時ノックアウトの分子レベルの検証
１、Ｔｉｄｅ方法によるＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトの検証
Ｔ細胞からＴＲＡＣとＢ２Ｍの単一遺伝子および２つの遺伝子がノックアウトされたゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、ノックアウト部位フラグメントを含む遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動後に精製および回収され、シーケンシングされた。対照群ＰＣＲ産物におけるＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のシーケンシング結果は単一のピークであったが、ノックアウト群では、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のシーケンシング結果は、対応する複数のピークセットが現れ、これは、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子が変異したことを示している。
シーケンシング結果をhttps://tide.deskgen.com/に送信して分析し、予測される変異効率を取得した。結果を図１０に示す。これは、ＴＣＲとＢ２Ｍが効果的にノックアウトされたことを示している。
２、クローニングシーケンシングによるＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトの検証
Ｔ細胞からＴＲＡＣとＢ２Ｍの単一遺伝子および２つの遺伝子がノックアウトされたゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、ノックアウト部位フラグメントを含む遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動後に精製および回収され、Ｔベクターに接続され、形質転換され、シーケンシング同定のためにモノクローナルコロニーをランダムに選択した。図１１に示すように、選択されたクローンをシーケンシングでアライメントした後、ＴＲＡＣとＢ２Ｍの元の配列と比較して、ノックアウト群の配列にはいずれも塩基の欠失または挿入があり、これは、ＴＣＲ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の両方も変異したことを示している。
１、Ｔｉｄｅ方法によるＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトの検証
Ｔ細胞からＴＲＡＣとＢ２Ｍの単一遺伝子および２つの遺伝子がノックアウトされたゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、ノックアウト部位フラグメントを含む遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動後に精製および回収され、シーケンシングされた。対照群ＰＣＲ産物におけるＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のシーケンシング結果は単一のピークであったが、ノックアウト群では、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のシーケンシング結果は、対応する複数のピークセットが現れ、これは、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子が変異したことを示している。
シーケンシング結果をhttps://tide.deskgen.com/に送信して分析し、予測される変異効率を取得した。結果を図１０に示す。これは、ＴＣＲとＢ２Ｍが効果的にノックアウトされたことを示している。
２、クローニングシーケンシングによるＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトの検証
Ｔ細胞からＴＲＡＣとＢ２Ｍの単一遺伝子および２つの遺伝子がノックアウトされたゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、ノックアウト部位フラグメントを含む遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動後に精製および回収され、Ｔベクターに接続され、形質転換され、シーケンシング同定のためにモノクローナルコロニーをランダムに選択した。図１１に示すように、選択されたクローンをシーケンシングでアライメントした後、ＴＲＡＣとＢ２Ｍの元の配列と比較して、ノックアウト群の配列にはいずれも塩基の欠失または挿入があり、これは、ＴＣＲ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の両方も変異したことを示している。
【0199】
実施例１０：ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の効率的なノックアウト
さらに、調製したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ二重遺伝子ノックアウトの効果をテストした。
１、標的ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製。中国発明特許２０１８１００６５５２５．１を参照して、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体、Ｔ細胞共刺激因子４１－ＢＢ、Ｔ細胞活性化因子ＣＤ３ζを含むＣＡＲベクターを設計および構築し、ＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）と命名されたレンチウイルスをパッケージした。Ｔ細胞の活性化と増殖の４８時間後、細胞密度を２＊１０＾６／ｍＬに調整し、ＭＯＩ＝４の比率でＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）レンチウイルスを添加し、２４時間後に培地を交換して標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。
２、標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト。ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで４８時間増殖させた後、細胞密度を２＊１０＾７／ｍＬに調整した。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－１／ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の混合物をそれぞれ、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡが１：４の比率で室温で１０分間インキュベートし、１＊１０＾６の細胞とＲＮＰを混合し（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は３μＭ）、ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーターを使用してＲＮＰ複合体をＣＡＲ－Ｔ細胞に導入した。細胞の生存率を２４時間、４８時間、７２時間でテストし（表８）、ＣＡＲ－Ｔ細胞はエレクトロポレーション後によく回復した。エレクトロポレーション後５日目に、フローサイトメトリーを使用してＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトを検出した。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍの単一遺伝子および二重遺伝子のノックアウトはいずれも９０％以上に達し、これは、ＴＣＲおよびＢ２Ｍのダブルノックアウトが効率的に達成されたことを示している（図１２を参照）。
さらに、調製したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ二重遺伝子ノックアウトの効果をテストした。
１、標的ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製。中国発明特許２０１８１００６５５２５．１を参照して、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体、Ｔ細胞共刺激因子４１－ＢＢ、Ｔ細胞活性化因子ＣＤ３ζを含むＣＡＲベクターを設計および構築し、ＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）と命名されたレンチウイルスをパッケージした。Ｔ細胞の活性化と増殖の４８時間後、細胞密度を２＊１０＾６／ｍＬに調整し、ＭＯＩ＝４の比率でＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）レンチウイルスを添加し、２４時間後に培地を交換して標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。
２、標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト。ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで４８時間増殖させた後、細胞密度を２＊１０＾７／ｍＬに調整した。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－１／ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の混合物をそれぞれ、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡが１：４の比率で室温で１０分間インキュベートし、１＊１０＾６の細胞とＲＮＰを混合し（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は３μＭ）、ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーターを使用してＲＮＰ複合体をＣＡＲ－Ｔ細胞に導入した。細胞の生存率を２４時間、４８時間、７２時間でテストし（表８）、ＣＡＲ－Ｔ細胞はエレクトロポレーション後によく回復した。エレクトロポレーション後５日目に、フローサイトメトリーを使用してＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトを検出した。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍの単一遺伝子および二重遺伝子のノックアウトはいずれも９０％以上に達し、これは、ＴＣＲおよびＢ２Ｍのダブルノックアウトが効率的に達成されたことを示している（図１２を参照）。
【表9】
【0200】
本明細書で使用された配列は下記通りである：
【表10】
【表11】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-09-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいた細胞の遺伝子編集の方法であって、Ｃａｓ酵素とｇＲＮＡの複合体を細胞に導入して遺伝子編集を行い、前記Ｃａｓ酵素はＣａｓ９酵素であり、前記Ｃａｓ９酵素の酵素活性は０．１～１ｎｍｏｌであるか、０．２～０．７ｎｍｏｌであるか、０．３～０．５ｎｍｏｌであり；ここで、前記複合体において、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は１：１～１：１０であるか、１：３～１：５であるか、１：４であってもよい、ことを特徴とする、方法。
【請求項2】
Ｃａｓ９酵素と第１のｇＲＮＡの複合体１、及びＣａｓ９酵素と第２のｇＲＮＡの複合体２を前記細胞に導入して遺伝子編集を行うか、あるいは、Ｃａｓ９酵素、前記第１のｇＲＮＡ、及び前記第２のｇＲＮＡの複合体３を同時に前記細胞に導入して遺伝子編集を行い、
前記複合体１、前記複合体２または前記複合体３において、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は、１：１～１：１０、好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である、
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のｇＲＮＡと前記第２のｇＲＮＡのモル比は、約１：５～５：１であるか、１：２～２：１であるか、約１：１である、ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡによって形成される複合体、複合体１、複合体２または複合体３において、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～３μＭであるか、約０．１２５μＭ～３μＭであるか、約０．２μＭ～３μＭであるか、約０．２５μＭ～３μＭであるか、約０．５μＭ～３μＭであるか、約１μＭ～３μＭである、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞は真核細胞であるか、免疫エフェクター細胞であるか、Ｔ細胞である、ことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞はＴ細胞であり、かつ、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用した前記Ｔ細胞の遺伝子編集が、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、前記Ｔ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行うこと、ＴＲＡＣに対して遺伝子編集を行うこと、ＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行うこと、ＴＲＡＣ中の配列番号４５に示される配列に対して遺伝子編集を行うこと、または、ＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行うことを含み、かつ／あるいは、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して前記Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行うこと、Ｂ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行うこと、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号３８に示される配列に対して遺伝子編集を行うこと、または、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行うことを含む、ことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ｇＲＮＡは約１５～５０ｂｐであるか、約１５～３０ｂｐであるか、約１７～２１ｂｐであるか、２０ｂｐである、ことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列を含むか、ＴＲＡＣに対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号２、３２または３３に示される配列を含み、かつ、
Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列を含むか、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集に使用されるｇＲＮＡは、配列番号１２に示される配列を含む、ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｔ細胞は、キメラ受容体、外因性サイトカイン、阻害／活性化受容体若しくはリガンド、または、共刺激因子を発現しているか、前記Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現している、ことを特徴とする、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ユニバーサルＴ細胞を構築する方法であって、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子とＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集技術によって遺伝子編集を行うことを含み、
ここで、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子に対する遺伝子編集は、Ｔ細胞のＴＣＲのα鎖とβ鎖のいずれか一方または両方の遺伝子に対して遺伝子編集を行うこと、ＴＲＡＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行うこと、ＴＲＡＣの定常領域に対して遺伝子編集を行うこと、ＴＲＡＣ中の配列番号４５に示される配列に対して遺伝子編集を行うこと、または、Ｔ細胞のＴＲＡＣ中の配列番号１に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行うことを含んでいてもよく、かつ／あるいは、
ここで、Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対する遺伝子編集は、Ｔ細胞のＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行うこと、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号３８に示される配列に対して遺伝子編集を行うこと、または、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列番号１０に示される配列を含む配列に対して遺伝子編集を行うことを含んでいてもよく、
ここで、前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術であってもよい、方法。
【請求項11】
Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するために配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０に示される配列からなる群より選ばれる配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入するか、あるいは、前記Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するために配列番号２、３２または３３に示される配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するために配列番号１１、１２、１３または１４に示される配列からなる群より選ばれる配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入するか、あるいは、前記Ｔ細胞のＭＨＣ遺伝子に対する遺伝子編集を実現するために配列番号１２に示される配列を含むｇＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入することを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記遺伝子編集技術によってＴ細胞のＴＣＲ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことは、Ｃａｓ９酵素と第１のｇＲＮＡの複合体１を前記Ｔ細胞に導入して遺伝子編集を行うことにより行われ、前記遺伝子編集技術によってＴ細胞のＭＨＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことは、Ｃａｓ９酵素と第２のｇＲＮＡの複合体２を前記Ｔ細胞に導入して遺伝子編集を行うことにより行われ、
ここで、前記複合体１と前記複合体２を同時に複合体３の形で前記Ｔ細胞に導入して遺伝子編集を行ってもよい、
請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記複合体１または前記複合体２におけるＣａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は、１：１～１：１０であるか、１：３～１：５であるか、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比は１：４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記複合体１、前記複合体２または前記複合体３において、前記Ｃａｓ９酵素の濃度は約０．１μＭ～３μＭであるか、約０．１２５μＭ～３μＭであるか、約０．２μＭ～３μＭであるか、約０．２５μＭ～３μＭであるか、約０．５μＭ～３μＭであるか、約１μＭ～３μＭであるか、約０．１２５μＭ～０．５μＭであるか、約０．２５μＭ～０．５μＭである、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
ＴＣＲ遺伝子の遺伝子編集用のｇＲＮＡと、ＭＨＣ遺伝子の遺伝子編集用のｇＲＮＡとのモル比は、約１：５～５：１であるか、１：２～２：１であるか、約１：１である、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するか、または前記Ｔ細胞は、腫瘍抗原若しくは病原体抗原を認識するキメラ受容体を発現し、当該キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識し、ここで、前記標的抗原は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１；ガングリオシドＧＤ３；Ｔｎ抗原；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ７０；ＣＤ１２３；ＣＤ１３８；ＣＤ３３；ＣＤ４４；ＣＤ４４ｖ７／８；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ６；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットα（ＩＬ－１３Ｒα）；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒα）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ＮＹ－ＥＳＯ－１；ＨＩＶ－１ Ｇａｇ；ＭＡＲＴ－１；ｇｐ１００；チロシナーゼ；メソテリン；ＥｐＣＡＭ；プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ６；上皮細胞増殖因子２０受容体ファミリーとその変異体（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）；ＬＭＰ２；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；Ｏ－アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；ガングリオシドＧＭ３；ＴＧＳ５；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；葉酸受容体；腫瘍血管内皮マーカー２５ １（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１；ＡＳＧＰＲ１；ＣＤＨ１６；５Ｔ４；８Ｈ９；αｖβ６インテグリン；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；ＣＡ９；κ軽鎖（カッパ軽鎖）；ＣＳＰＧ４；ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０；ＦＡＰ；ＦＡＲ；ＦＢＰ；胚性ＡｃｈＲ；ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２；ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ３；ＫＤＲ；ＭＣＳＰ；ＮＫＧ２Ｄリガンド；ＰＳＣ１；ＲＯＲ１；Ｓｐ１７；ＳＵＲＶＩＶＩＮ；ＴＡＧ７２；ＴＥＭ１；フィブロネクチン；テネイシン；腫瘍壊死ゾーンの癌胎児性変異体；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体５β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；Ｐ５３変異体１０；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；Ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）； ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ）；Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；免疫グロブリンλ様ペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群より選ばれる腫瘍抗原であってもよく、
あるいは、前記標的抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原から選ばれる病原体抗原であってもよく、ここで、前記ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス抗原、エプスタインバーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原またはインフルエンザウイルス抗原から選ばれてもよい、ことを特徴とする、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記キメラ受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、
好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、
（ｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ；または
（ｉｉｉ）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激シグナルドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ
を含み、
腫瘍抗原に特異的に結合する前記キメラ抗原受容体の抗体は、完全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）、または単一ドメイン抗体である、ことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
キメラ受容体を発現するＴ細胞を調製するための、請求項１０～１８のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＴ細胞の使用であって、前記キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、前記細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識する、使用。
【請求項20】
請求項１０～１８のいずれか一項に記載の方法によって構築されたユニバーサルＴ細胞。
【請求項21】
ＴＲＡＣおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子がサイレンシングされている、ユニバーサルＴ細胞であって、
ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む配列の遺伝子編集によってサイレンシングされているか、または、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む配列のうち、配列番号４５に示される配列の遺伝子編集によってサイレンシングされており、
Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列の遺伝子編集によってサイレンシングされているか、または、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１０に示される配列を含む配列のうち、配列番号３８に示される配列の遺伝子編集によってサイレンシングされている、
ユニバーサルＴ細胞。
【請求項22】
ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２、３２または３３に示される配列のｇＲＮＡを使用してＴＲＡＣ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことによってサイレンシングされており、Ｂ２Ｍ遺伝子は、配列番号１２に示される配列のｇＲＮＡを使用してＢ２Ｍ遺伝子に対して遺伝子編集を行うことによってサイレンシングされている、
請求項２１に記載のユニバーサルＴ細胞。
【請求項23】
前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現しているか、または、前記Ｔ細胞は、腫瘍抗原または病原体抗原を認識するキメラ受容体を発現しており、当該キメラ受容体は、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有し、前記細胞外抗原結合領域は、標的抗原を特異的に認識する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のユニバーサルＴ細胞。
【請求項24】
配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９、４０、１１、１２、１３または１４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ構築体。
【請求項25】
配列番号２、３、４、５、３２、３３、３９または４０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、及び配列番号１１、１２、１３または１４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載のｇＲＮＡ構築体。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0191】
実施例２：ノックアウト効率に対するＣａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣの異なる比率の影響
活性化Ｔ細胞を取って細胞をカウントし、２＊１０＾７／ｍｌの細胞密度に調整した。ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択した。
Ｃａｓ９酵素（ＮＥＢから購入）とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比をそれぞれ１：２、１：３、１：４、および１：５の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。室温で１０分間インキュベートした後、１＊１０＾６Ｔ細胞に添加した（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は０．３μＭであった）。その中で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル数は、ｇＲＮＡの塩基組成と４．０３μｇ／μｌの濃度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．９８）に基づいて計算された。
ＲＮＰ複合体は、ＢＴＸエレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）を使用してＴ細胞に導入され、エレクトロポレーションパラメーターは、２５０Ｖ、５ｍｓであった。ＴＣＲノックアウトの効率を検証するために、トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図２と表２に示す。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：３から１：５の場合、ノックアウト効率は７０％以上であった。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、ノックアウト効率が最も高く、８７．２％に達した。これは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比が１：４である時、遺伝子ノックアウト効果が最もよいことを示している。
活性化Ｔ細胞を取って細胞をカウントし、２＊１０＾７／ｍｌの細胞密度に調整した。ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択した。
Ｃａｓ９酵素（ＮＥＢから購入）とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比をそれぞれ１：２、１：３、１：４、および１：５の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。室温で１０分間インキュベートした後、１＊１０＾６Ｔ細胞に添加した（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は０．３μＭであった）。その中で、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル数は、ｇＲＮＡの塩基組成と４．０３μｇ／μｌの濃度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．９８）に基づいて計算された。
ＲＮＰ複合体は、ＢＴＸエレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）を使用してＴ細胞に導入され、エレクトロポレーションパラメーターは、２５０Ｖ、５ｍｓであった。ＴＣＲノックアウトの効率を検証するために、トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図２と表２に示す。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：３から１：５の場合、ノックアウト効率は７０％以上であった。Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、ノックアウト効率が最も高く、８７．２％に達した。これは、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡのモル比が１：４である時、遺伝子ノックアウト効果が最もよいことを示している。
【表2】
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0192】
実施例３：ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトに対する異なるｓｇＲＮＡの影響
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする３つの異なるｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３を選択した。
ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。実施例１で合成されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３の３つのｓｇＲＮＡをそれぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたパラメーターに基づいてエレクトロポレーションを行い、ＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図３と表３に示す。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のノックアウト効果はｓｇ－ＴＲＡＣ－２およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３のノックアウト効果よりも有意に優れており、これは、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１が最高のノックアウト効果を有することを示している。それと同時に、異なる長さのｓｇ－ＴＲＡＣ－１がノックアウト効率に対する影響をテストし、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－５）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－６）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－７）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－８）の４つのｓｇＲＮＡをそれぞれ合成し、それぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１のモル比で混合してＲＮＰ複合体を形成し、上記の条件下でＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をＣＤ３抗体フローサイトメトリーに使用して、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。実験結果を図３Ｂに示す。２つまたは３つの塩基が短縮されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１はＴＣＲノックアウト効率に対する影響が小さいが、２つまたは３つの塩基を追加するとＴＣＲノックアウト効率が低下する。これは、この部位のｓｇＲＮＡの設計された長さをある程度変更することができ、特に３つ以内の塩基を短縮すると、同じく比較的に高いノックアウト効果を得ることができることを示している。
なお、公開された文献では、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１でもＴＣＲノックアウト効率を９０％に到達させることができるが、この文献では２回のエレクトロポレーションを使用した最適化されたノックアウト方法が使用されており、そのプロセスは比較的に複雑である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６を参照、図１Ａは、ＴＣＲノックアウト率が９５．７％であることを示している）。これに対して、本発明は、１回のエレクトロポレーションで９０％以上のノックアウト率を達成でき、有意なメリットがある。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする３つの異なるｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、ｓｇ－ＴＲＡＣ－３を選択した。
ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。実施例１で合成されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－ＴＲＡＣ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３の３つのｓｇＲＮＡをそれぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたパラメーターに基づいてエレクトロポレーションを行い、ＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図３と表３に示す。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１のノックアウト効果はｓｇ－ＴＲＡＣ－２およびｓｇ－ＴＲＡＣ－３のノックアウト効果よりも有意に優れており、これは、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１が最高のノックアウト効果を有することを示している。それと同時に、異なる長さのｓｇ－ＴＲＡＣ－１がノックアウト効率に対する影響をテストし、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－５）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（－２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－６）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋３ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－７）、ｓｇ－ＴＲＡＣ－１（＋２ｂｐ）（ｓｇ－ＴＲＡＣ－８）の４つのｓｇＲＮＡをそれぞれ合成し、それぞれＣａｓ９酵素（０．５μＭ）と４：１のモル比で混合してＲＮＰ複合体を形成し、上記の条件下でＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をＣＤ３抗体フローサイトメトリーに使用して、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。実験結果を図３Ｂに示す。２つまたは３つの塩基が短縮されたｓｇ－ＴＲＡＣ－１はＴＣＲノックアウト効率に対する影響が小さいが、２つまたは３つの塩基を追加するとＴＣＲノックアウト効率が低下する。これは、この部位のｓｇＲＮＡの設計された長さをある程度変更することができ、特に３つ以内の塩基を短縮すると、同じく比較的に高いノックアウト効果を得ることができることを示している。
【表3】
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0193】
実施例４：ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトに対するＣａｓ９酵素濃度の影響
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．０６２５μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ）、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。
ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。
フローサイトメトリーの結果を図４と表４に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．１μＭを超えると、ＴＣＲのノックアウト効率は７０％以上に達することができる。たとえば、０．１２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は７５％以上に達することができ、特に０．２μＭを超える場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９４．５％以上に達することができ、Ｃａｓ９酵素の濃度が０．３～０．５μＭの場合、９５％以上に達することができる。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９７．４％に達することができ、細胞の生存率はいずれも９０％以上である。
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－ＴＲＡＣ－１（配列番号２）を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇ－ＴＲＡＣ－１のモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．０６２５μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ）、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。
ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞を取りＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。
フローサイトメトリーの結果を図４と表４に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．１μＭを超えると、ＴＣＲのノックアウト効率は７０％以上に達することができる。たとえば、０．１２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は７５％以上に達することができ、特に０．２μＭを超える場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９４．５％以上に達することができ、Ｃａｓ９酵素の濃度が０．３～０．５μＭの場合、９５％以上に達することができる。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．５μＭの場合、ＴＣＲのノックアウト効率は９７．４％に達することができ、細胞の生存率はいずれも９０％以上である。
【表4】
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0195】
実施例６：Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトに対する異なるｓｇＲＮＡ配列の影響
実施例５で得られた、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を使用してＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を比較した。
Ｃａｓ９酵素（０．５μＭ）とｇＲＮＡを１：４の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｂ２Ｍノックアウトの効率を検証するために、β－ミクログロブリン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色のためにＴ細胞を採取した。フローサイトメトリーの結果を図６と表５に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２のノックアウト効果は９０％以上に達しており、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３より有意に優れている。これは、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２がいずれもよいノックアウト効果を有することを示している。
同じｓｇ－Ｂ２Ｍ－１配列を使用し、報告されたノックアウト率は５０～６０％しか達していないが（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｍａｒ ２；５４３（７６４３）：１１３－１１７、図３ｃは、Ｂ２Ｍノックアウト率が５５％であることを示している）、本発明の方法で最適化された後、Ｂ２Ｍのノックアウト率は大幅に高められ、９５％に達することができる。
実施例５で得られた、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３を使用してＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を比較した。
Ｃａｓ９酵素（０．５μＭ）とｇＲＮＡを１：４の比率で混合して、ＲＮＰ複合体を形成した後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定された条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｂ２Ｍノックアウトの効率を検証するために、β－ミクログロブリン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色のためにＴ細胞を採取した。フローサイトメトリーの結果を図６と表５に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２のノックアウト効果は９０％以上に達しており、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－３より有意に優れている。これは、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２がいずれもよいノックアウト効果を有することを示している。
【表5】
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0196】
実施例７：ノックアウト効率に対するＣａｓ９酵素濃度の影響
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－Ｂ２Ｍ－２を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇＲＮＡのモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたエレクトロポレーション条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をとりＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図７と表６に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．２μＭを超えると、ノックアウト効率は７０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ノックアウト効率は７２．２％であり、Ｃａｓ９酵素の濃度が１μＭ以上の場合、ノックアウト効率は９０％以上に達することができる。１μＭ～３μＭの場合、よいノックアウト効率を示し、特に１μＭ～２μＭの場合、ノックアウト効率はいずれも９３％くらいである。
ｓｇＲＮＡとしてｓｇ－Ｂ２Ｍ－２を選択し、Ｃａｓ９酵素とｓｇＲＮＡのモル比が１：４の場合、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。ＲＮＰ複合体を室温で１０分間インキュベートした後、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用し、機器に設定されたエレクトロポレーション条件に基づいてＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した。トランスフェクションの５日後、Ｔ細胞をとりＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行い、ＴＣＲノックアウトの効率を検証した。フローサイトメトリーの結果を図７と表６に示す。Ｃａｓ９酵素の濃度が０．２μＭを超えると、ノックアウト効率は７０％以上に達することができる。０．２５μＭの場合、ノックアウト効率は７２．２％であり、Ｃａｓ９酵素の濃度が１μＭ以上の場合、ノックアウト効率は９０％以上に達することができる。１μＭ～３μＭの場合、よいノックアウト効率を示し、特に１μＭ～２μＭの場合、ノックアウト効率はいずれも９３％くらいである。
【表6】
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0197】
実施例８：Ｔ細胞においてＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子を同時に効率的にノックアウトすること
１、ｇＲＮＡ組成成分の比率の影響
既存の報告によると、ＴＣＲとＢ２Ｍのダブルノックアウト効率は高くともわずか約６０％である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６の図３ｂ、及びＯｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，Ｖｏｌ． ８，（Ｎｏ． １０），ｐｐ：１７００７－１７０１１の図３ａを参照）。したがって、この実施例では、上記の最適化された方法をさらに使用して、Ｂ２ＭおよびＴＣＲの効率的なダブルノックアウトの組み合わせをスクリーニングすることが望まれている。
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の比率がＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトに対する影響を検出するために、Ｃａｓ９酵素と総ｇＲＮＡのモル比が１：４である場合に、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率をそれぞれ１．５：１、１：１、及び０．５：１に設定して、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目にＣＤ３抗体及びＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図８と表７に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率が１：１である時、ＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトの効果が最も良い。
２、ＲＮＰ濃度の最適化
標的ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子で構成されるｇＲＮＡ混合物とＣａｓ９酵素の間で形成されるＲＮＰ複合体の濃度を調べるために、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡの最適化されたモル比１：４に従って、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目に、ＣＤ３抗体およびＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図９と表８に示す。Ｃａｓ９酵素の最終濃度が１μＭ以上の場合、ＴＲＡＣとＢ２Ｍのダブルノックアウト効果はいずれも９０％以上に達すことができ、３μＭでは９３．４％に達すことができる。
１、ｇＲＮＡ組成成分の比率の影響
既存の報告によると、ＴＣＲとＢ２Ｍのダブルノックアウト効率は高くともわずか約６０％である（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６の図３ｂ、及びＯｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，Ｖｏｌ． ８，（Ｎｏ． １０），ｐｐ：１７００７－１７０１１の図３ａを参照）。したがって、この実施例では、上記の最適化された方法をさらに使用して、Ｂ２ＭおよびＴＣＲの効率的なダブルノックアウトの組み合わせをスクリーニングすることが望まれている。
ｓｇ－ＴＲＡＣ－１とｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の比率がＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトに対する影響を検出するために、Ｃａｓ９酵素と総ｇＲＮＡのモル比が１：４である場合に、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率をそれぞれ１．５：１、１：１、及び０．５：１に設定して、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目にＣＤ３抗体及びＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図８と表７に示す。ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２とｓｇ－ＴＲＡＣ－１の比率が１：１である時、ＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウトの効果が最も良い。
【表7】
標的ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子で構成されるｇＲＮＡ混合物とＣａｓ９酵素の間で形成されるＲＮＰ複合体の濃度を調べるために、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡの最適化されたモル比１：４に従って、Ｃａｓ９酵素の濃度をそれぞれ変えて（０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭ）、遺伝子ノックアウトへの影響を検出した。Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ社）を使用してＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入した後、５日目に、ＣＤ３抗体およびＢ２Ｍ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリー染色を行った。フローサイトメトリーの結果を図９と表８に示す。Ｃａｓ９酵素の最終濃度が１μＭ以上の場合、ＴＲＡＣとＢ２Ｍのダブルノックアウト効果はいずれも９０％以上に達すことができ、３μＭでは９３．４％に達すことができる。
【表8】
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0199】
実施例１０：ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＴＲＡＣとＢ２Ｍ遺伝子の効率的なノックアウト
さらに、調製したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ二重遺伝子ノックアウトの効果をテストした。
１、標的ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製。中国発明特許２０１８１００６５５２５．１を参照して、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体、Ｔ細胞共刺激因子４１－ＢＢ、Ｔ細胞活性化因子ＣＤ３ζを含むＣＡＲベクターを設計および構築し、ＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）と命名されたレンチウイルスをパッケージした。Ｔ細胞の活性化と増殖の４８時間後、細胞密度を２＊１０＾６／ｍＬに調整し、ＭＯＩ＝４の比率でＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）レンチウイルスを添加し、２４時間後に培地を交換して標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。
２、標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト。ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで４８時間増殖させた後、細胞密度を２＊１０＾７／ｍＬに調整した。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－１／ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の混合物をそれぞれ、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡが１：４の比率で室温で１０分間インキュベートし、１＊１０＾６の細胞とＲＮＰを混合し（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は３μＭ）、ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーターを使用してＲＮＰ複合体をＣＡＲ－Ｔ細胞に導入した。細胞の生存率を２４時間、４８時間、７２時間でテストし（表９）、ＣＡＲ－Ｔ細胞はエレクトロポレーション後によく回復した。エレクトロポレーション後５日目に、フローサイトメトリーを使用してＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトを検出した。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍの単一遺伝子および二重遺伝子のノックアウトはいずれも９０％以上に達し、これは、ＴＣＲおよびＢ２Ｍのダブルノックアウトが効率的に達成されたことを示している（図１２を参照）。
さらに、調製したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ二重遺伝子ノックアウトの効果をテストした。
１、標的ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製。中国発明特許２０１８１００６５５２５．１を参照して、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体、Ｔ細胞共刺激因子４１－ＢＢ、Ｔ細胞活性化因子ＣＤ３ζを含むＣＡＲベクターを設計および構築し、ＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）と命名されたレンチウイルスをパッケージした。Ｔ細胞の活性化と増殖の４８時間後、細胞密度を２＊１０＾６／ｍＬに調整し、ＭＯＩ＝４の比率でＰＲＲＬ－ＢＣＭＡ－ＢＢＺ（ＴＭ）レンチウイルスを添加し、２４時間後に培地を交換して標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。
２、標的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト。ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで４８時間増殖させた後、細胞密度を２＊１０＾７／ｍＬに調整した。ｓｇ－ＴＲＡＣ－１、ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２、およびｓｇ－ＴＲＡＣ－１／ｓｇ－Ｂ２Ｍ－２の混合物をそれぞれ、Ｃａｓ９酵素とｇＲＮＡが１：４の比率で室温で１０分間インキュベートし、１＊１０＾６の細胞とＲＮＰを混合し（Ｃａｓ９酵素の最終濃度は３μＭ）、ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーターを使用してＲＮＰ複合体をＣＡＲ－Ｔ細胞に導入した。細胞の生存率を２４時間、４８時間、７２時間でテストし（表９）、ＣＡＲ－Ｔ細胞はエレクトロポレーション後によく回復した。エレクトロポレーション後５日目に、フローサイトメトリーを使用してＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトを検出した。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍの単一遺伝子および二重遺伝子のノックアウトはいずれも９０％以上に達し、これは、ＴＣＲおよびＢ２Ｍのダブルノックアウトが効率的に達成されたことを示している（図１２を参照）。
【表9】
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】