(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-31
(54)【発明の名称】高品質の培養肉、組成物およびその生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20220124BHJP
A23L 13/00 20160101ALI20220124BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
A23L13/00 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021525007
(86)(22)【出願日】2019-11-14
(85)【翻訳文提出日】2021-06-09
(86)【国際出願番号】 IL2019051243
(87)【国際公開番号】W WO2020100143
(87)【国際公開日】2020-05-22
(31)【優先権主張番号】62/767,525
(32)【優先日】2018-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521193290
【氏名又は名称】アレフ ファームス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ラボン，ネタ
(72)【発明者】
【氏名】コーレン，イローナ
【テーマコード（参考）】
4B042
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B042AC10
4B042AH01
4B042AK02
4B042AK20
4B042AP30
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BB03
4B065BB10
4B065BB20
4B065BB22
4B065BB29
4B065BB40
4B065BD22
4B065BD41
4B065BD42
4B065BD43
4B065BD50
4B065CA41
(57)【要約】
本発明は、クリーンミートまたは細胞ベースの肉とも呼ばれる培養肉の分野、特に、完全な動物由来の肉と少なくとも類似した知覚特性（色、味および芳香）と、向上した栄養価とを有する培養肉を生産するための細胞培養物に関する。本発明は、細胞培養物および高品質の培養肉を生産するための培養培地をさらに提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の非ヒト動物由来細胞を含む非ヒト動物由来細胞培養物であって、前記細胞の少なくとも６０％が、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含み、前記細胞培養物が、肉のような色を特徴とする、非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項2】
前記細胞培養物の前記色が、ミオグロビンの色に類似している、請求項１に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項3】
前記非ヒト動物由来細胞が、約３００ｎｍ～約７００ｎｍの１つの波長または複数の波長で吸光度を有する少なくとも１つの化合物を含む、請求項１または２に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項4】
前記少なくとも１つの天然着色剤が、少なくとも１つの非哺乳類生物から得られる抽出物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項5】
前記少なくとも１つの天然着色剤が、カルテノイド、アントシアニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項6】
前記カルテノイドが、リコペン、カンタキサンチン、ベータ－カロテン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項7】
前記複数の細胞が、約０．１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞の量の前記少なくとも１つのカルテノイドを提供する、請求項５または６に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項8】
前記複数の細胞が、約１ｍｇ／１００ｇの細胞～約５００ｍｇ／１００ｇの細胞の量のビタミンＢ１２を提供する、請求項１～７のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項9】
前記非ヒト動物由来細胞が、外因性鉄および／またはその塩をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項10】
前記鉄が、第１鉄イオン、第２鉄イオン、それらの塩、およびヘムからなる群から選択される形態である、請求項８に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項11】
前記複数の細胞が、約０．０１ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の量の鉄またはその塩を提供する、請求項１０に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項12】
前記非ヒト動物由来細胞が、酵母抽出物、細菌抽出物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の外因性サプリメントをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項13】
前記非ヒト動物由来細胞が、葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の外因性サプリメントをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項14】
前記ビタミンＤが、ビタミンＤ３およびビタミンＤ２からなる群から選択される、請求項１３に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項15】
前記脂肪酸が、オメガ－３脂肪酸、オメガ－６脂肪酸、オメガ－９脂肪酸、ステアリン酸（１８：０）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項16】
前記外因性サプリメントが、細胞内空間、膜内腔、膜上、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される部位に存在する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項17】
前記非ヒト動物由来細胞が、前記少なくとも１つの天然着色剤およびビタミンＢ１２の組み合わせを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項18】
前記非ヒト動物由来細胞が、前記少なくとも１つの天然着色剤、ビタミンＢ１２、ならびに鉄および／またはその塩の組み合わせを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項19】
前記少なくとも１つの外因性サプリメントが、食品グレードのものである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項20】
前記非ヒト動物由来細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）および／またはそれから分化した細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項21】
前記非ヒト動物由来細胞が、非ヒト動物体細胞および／またはそれから分化した細胞から再プログラムされた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項22】
前記非ヒト動物由来細胞が、非胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項23】
前記非ヒト動物由来細胞が、衛星細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項24】
前記非ヒト動物由来細胞が、筋肉細胞およびその前駆細胞、脂肪細胞およびその前駆細胞、間質細胞およびその前駆細胞、内皮細胞およびその前駆細胞、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項25】
前記非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽、甲殻類、および魚からなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物。
【請求項26】
請求項１～２５のいずれか一項に記載の非ヒト動物由来細胞培養物を含む、培養肉。
【請求項27】
前記培養肉が、食用スキャフォルドをさらに含む、請求項２６に記載の培養肉。
【請求項28】
前記培養肉が、畜殺肉と類似した知覚特性を有する、請求項２６または２７に記載の培養肉。
【請求項29】
複数の非ヒト動物由来細胞を含む培養肉であって、前記細胞の少なくとも６０％が、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される外因性サプリメントを含み、前記培養肉が、畜殺肉のような色を特徴とする、培養肉。
【請求項30】
少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサプリメントを含む、非ヒト動物由来細胞を増殖させるための強化細胞培養培地であって、前記サプリメントが、前記培地中で培養される細胞に肉のような色を与えるのに十分な量である、強化細胞培養培地。
【請求項31】
前記強化培地が、約３００ｎｍ～約７００ｎｍの複数の波長で吸光度を有することを特徴とする、請求項３０に記載の強化培地。
【請求項32】
前記培地が、少なくとも１つの天然着色剤およびコバラミン（ビタミンＢ１２）からなるサプリメント組成物を含む、請求項３０または３１に記載の強化培地。
【請求項33】
前記強化培地が、鉄および／またはその塩をさらに含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の強化培地。
【請求項34】
前記強化培地が、葉酸、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加のサプリメントをさらに含む、請求項３３に記載の強化培地。
【請求項35】
前記ビタミンＤが、ビタミンＤ３およびビタミンＤ２からなる群から選択される、請求項３４に記載の強化培地。
【請求項36】
前記少なくとも１つの脂肪酸が、オメガ－３脂肪酸、オメガ－６脂肪酸、オメガ－９脂肪酸、ステアリン酸（１８：０）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の強化培地。
【請求項37】
前記強化培地が、酵母抽出物、細菌抽出物、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の強化培地。
【請求項38】
培養肉を生産するための方法であって、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の強化培地中で非ヒト動物由来細胞を培養することと、肉のような色を特徴とする培養肉を生産することと、を含む、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クリーンミートまたは細胞ベースの肉または培養肉（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｅａｔ）とも呼ばれる培養肉（ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｅａｔ）の分野、特に、完全な動物由来の肉と少なくとも類似した知覚特性（色、味および芳香）と、向上した栄養価とを有する培養肉を生産するための細胞培養物に関する。本発明は細胞培養物および高品質の培養肉を生産するための培養培地をさらに提供する。
【背景技術】
【0002】
家畜、特に肉生産のためのウシの成長を維持するために、水、穀物、土地、エネルギーを含む多くの消費可能な資源が利用されている。世界の急速に増加する人口は、前述の貴重な資産の使用のさらなる増加につながるであろう。したがって、全人口を養うために必要な非ヒト動物の成長を縮小する方法で肉および肉製品を生産することが非常に望ましい。主な肉源としてのウシおよび家禽を置き換えることは、ウシおよび家禽対象を苦しませる混雑した居住環境および時には残酷な状態を防ぐので、倫理的にも有益である。これらの理由から、培養肉製品は、人道上の理由で肉を控える人々によって消費される可能性もある。培養肉は、消費される食物含有量を制御する方法でもあり、今日、飼育されている動物の多くは、成長ホルモンと抗生物質を投与されており、最終的には消費者の食卓に行き着く。また、インビトロで肉を生産することにより、タンパク質含有量、脂肪量および組成、ならびに鉄、ビタミンＢ１２、亜鉛などを含む必要な微量元素やビタミンを制御することで、肉の栄養価を改善し、より健康的にすることができる。さらに、厳格な規制と管理された条件下で生産された肉を消費すると、汚染が伝染する可能性が低くなるため、より安全に消費できる。培養細胞の特性を視覚的、栄養的、風味と香りで肉製品の特性に少なくとも類似させ、潜在的に改善すると同時に、製品の安全性を高めることは困難な作業である。
【0003】
カロテノイドファミリーのサプリメントは、橙色／赤色／茶色で知られている。カロテノイドは、植物、藻類、および光合成細菌によって合成される天然に存在する有機色素の６００を超えるメンバーのファミリーである。カロテノイドは、これらすべての生物によって脂肪やその他の基本的な有機代謝ビルディングブロックから生成される。ヒトはカロテノイドを生成することはできないが、食事からカロテノイドを蓄積することはできる。
【0004】
カロテノイドは、キサントフィル（酸素を含む）とカロテン（純粋な炭化水素であり、酸素を含まない）の２つのクラスに分けられる。すべてのカロテノイドはテトラテルペノイドであり、８つのイソプレン分子から生成され、４０個の炭素原子を含んでいることを意味する。非置換のベータイオノン環を含むカロテノイド（ベータ－カロテン、アルファカロテン、ベータクリプトキサンチン、およびガンマカロテンを含む）は、ビタミンＡ活性を有する（つまり、レチノールに変換できる）。
【0005】
カロテンクラスのフィトエンおよびフィトフルエンカロテノイドを含む非プロビタミンＡカロテノイドは、例えばリコペンなどの視覚的に着色されたカロテノイドの生合成経路における前駆体カロテノイドである。カロテノイドは、その健康増進特性で長い間認識されており、通常、それらの抗酸化作用および抗炎症作用に起因する。リコペンは、幹細胞を増殖させる細胞ための組成物中の抗酸化剤として使用されている（例えば、米国特許出願第ＵＳ２０１６／００８１９１７号および同第２００５／０２６０７４８号）。リコペンは、食品の外因性着色剤としても使用される。
【0006】
コバラミンとしても知られているビタミンＢ１２は、シアノ－、メチル－、デオキシアデノシル－およびヒドロキシ－コバラミンを含む多くの形態を含む。コバルトは、この水溶性ビタミンに独特の赤い色を与える。コバラミンは、ウシやヒツジのルーメン内の嫌気性微生物から合成され、ヒトは通常、食事中のＢ１２の主な供給源である動物性食品から予め形成されたコバラミンを消費する。コバラミンは、通常、神経系の機能、ホモシステイン代謝およびＤＮＡ合成に必須である（Ｔｒｕｓｗｅｌｌ ＡＳ．Ｎｕｔｒ Ｄｉｅｔ．２００７．６４（ｓ４）：Ｓ１２０－Ｓ１２５）。コバラミンが不足すると、血球の形態学的変化ならびに血液学的および神経学的な有害な症状の発症につながる可能性がある。
【0007】
鉄は哺乳類の食事に欠かせない微量栄養素の１つである。鉄は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））のヘモグロビンの成分であり、ミオグロビンの形で体中の酸素を輸送するために必要であり、筋肉内の酸素の貯蔵と使用に必要である（Ｇｅｉｓｓｌｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．－２０１１．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．３（３）：２８３－３１６）。赤身の肉に含まれる種類の鉄（ヘム鉄）は、ナッツ、種子、葉物野菜（非ヘム鉄）などの植物性食品に含まれる鉄よりも、体に吸収されやすく使用される。
【0008】
鉄分サプリメントは、体内の鉄分が低レベルであることに対する解決策である。サプリメントで頻繁に使用される鉄の形態には、硫酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、および硫酸第二鉄などの第一鉄および第二鉄塩が含まれる。溶解性が高いため、栄養補助食品中の第一鉄は第二鉄よりも生物学的に利用可能である（Ｍｕｒｒａｙ－Ｋｏｌｂｅ ＬＥ，Ｂｅａｒｄ Ｊ．Ｉｎ：Ｃｏａｔｅｓ ＰＭ，Ｂｅｔｚ ＪＭ，Ｂｌａｃｋｍａｎ ＭＲ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ．２ｎｄ ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２０１０：４３２－４３８）。
【0009】
ビスグリシン酸第一鉄は鉄アミノ酸キレートである。これは、キレート化と呼ばれるプロセスで共有結合した第一鉄とアミノ酸グリシンの２つの分子との反応によって形成される。ビスグリシン酸第一鉄は、鉄の吸収、貯蔵を改善し、従来使用されている鉄塩よりもヘモグロビンレベルを高めると主張されている。（Ｂｏｖｅｌｌ－Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ａ Ｃ ｅｔ ａｌ．２０００．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．７１：１５６３－１５６９；Ｌａｙｒｉｓｓｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２０００．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０（９）：２１９５－２１９９＆Ｅｒｒａｔｕｍ，１２，３１０６）。ビスグリシン酸第一鉄は、副作用の報告なしに２～２３ｍｇ／日の補助的な食事性鉄を提供する食品の鉄強化のために、発展途上国での多くの野外試験で使用されてきた。さらに、鉄ビスグリシネートを使用した食事性鉄補給は、１日あたり約１５～１２０ｍｇの鉄を提供し、鉄欠乏の幼児、成人男性、妊娠中の女性、および正常な鉄の状態の非妊娠中の女性によって十分に許容されている。（Ｔｈｅ ＥＦＳＡ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００６）２９９，１－１７）。ビスグリシン酸第一鉄による治療は、ヘモグロビンとフェリチンの血清レベル、ならびに強化または補給試験の開始時に鉄が不足していた個人の総鉄結合能（ＴＩＢＣ）と鉄貯蔵に実質的な改善をもたらしたが、鉄豊富個体において鉄過剰の証拠はなかった（Ｓｚａｒｆａｒｃ Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ａｒｃｈ．Ｌａｔｉｎｏａｍ．Ｎｕｔｒ．５１：４２－４７）。
【0010】
酵母抽出物は、酵母細胞からの天然成分で構成されている：タンパク質、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、およびミネラル。酵母抽出物を作るために、酵母細胞の内容物が酵素によって分解され、細胞壁が取り除かれる。酵母抽出物は、グルタメートとその誘導体をはじめとする多くの味覚成分を含む食品成分である。酵母抽出物は、複数の味覚増強特性を提供する。酵母抽出物は様々な風味のある食品、特に肉のような香りが必要な場合に人気のあるフレーバー源である（Ａｍｅｓ ＪＭ ａｎｄ Ｅｌｍｏｒｅ ＪＳ．１９９２．Ｆｌａｖｏｕｒ Ｆｒａｇｒ Ｊ７：８９－１０３）。
【0011】
ルーメンフローラ抽出物は、ウシルーメンのフローラを構成する定義済みまたは未定義の微生物に由来する抽出物の多様なグループである。それらは酵素反応によって分解される。ウシでは、ルーメンが、飼料を小さな栄養素に消化してウシの血流にさらに吸収される原因となる多くの種類のバクテリアによって充填される。バクテリアの高い代謝回転は、それらの分解された残り物を消化された飼料の一部にする。群れのルーメンを培養する特定のフローラは、その肉製品の独特の味に貢献する。
【0012】
天然肉の有益な特性を損なうことなく肉の消費に取って代わり実際に肉を食べることに近い食事体験を提供できる、培養肉製品に対する大きな需要がある。
【発明の概要】
【0013】
本発明は、培養された非ヒト動物由来細胞を提供し、細胞は、細胞を構成する培養肉に「肉のような」色および官能特性を提供し、培養肉の栄養価を改善する外因性サプリメントで高められる。本発明は、培養された非ヒト動物由来細胞、培養された非ヒト動物由来細胞を含む培養肉、および培養肉を含む製品を生産するための培養培地をさらに提供する。
【0014】
本発明は、外因性サプリメントであるカロテノイド（ベータ（β）－カロテン、リコペン、カンタキサンチンを含む）およびコバラミン（ビタミンＢ１２を含む）の少なくとも１つを含む培地でウシ由来細胞を培養すると、細胞内または細胞上でのサプリメントの取り込みならびに蓄積および／または付着し、それにより細胞の着色をもたらすという予想外の発見に部分的に基づく。また、少なくとも１つのカロテノイドとビタミンＢ１２を含む外因性サプリメントの特定の組み合わせをウシ由来細胞の培地に添加すると、畜殺された肉に似た外観の培養肉製品が得られる。培地に鉄および／またはその塩、酵母抽出物およびミネラル（例えば、セレンおよび亜鉛およびそれらの塩）の少なくとも１つをさらに補充すると、肉のような風味および芳香、ならびに濃縮された栄養価がさらに提供される。
【0015】
非ヒト動物由来細胞を含む培養肉の基礎含有量は、完全な動物に由来する肉の含有量とは異なることを明確に理解されたい。本発明の教示は、少なくとも同等の、好ましくは完全な生物由来の肉よりも優れた栄養価を有する培養肉を提供する。
【0016】
発明の培養肉および培養肉を含む製品は、現在使用されている肉よりも有利であり、培養肉は、制御可能な含有量の外因性サプリメントを有する非ヒト動物由来細胞を含む。本発明の製品は、細胞の培養中に必要な量のサプリメントを投与することによって達成され、それにより、細胞内および／または細胞上へのサプリメントの取り込みを効率的に制御する。さらに、本発明の教示は、肉を模倣する既知の製品よりも有利であり、非ヒト動物由来細胞を含む培養肉に、外因性サプリメントを含む多くの細胞を提供し、培養肉ならびにそれを含む製品は、最終細胞含有製品に最小限の食品グレードのサプリメントが追加され、「クリーンラベル」要件に対応し得る。
【0017】
一態様によれば、本発明は、複数の非ヒト動物由来細胞を含む非ヒト動物由来細胞培養物を提供し、細胞の少なくとも６０％は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含み、細胞培養物は、肉のような色を特徴とする。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0018】
天然着色剤とビタミンＢ１２のそれぞれが、細胞の肉のような色に寄与することができることは明確に理解されるべきである。
【0019】
特定の例示的な実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、少なくとも１つの天然着色剤とビタミンＢ１２との組み合わせを含む。
【0020】
特定の実施形態によれば、細胞培養物の色は、ミオグロブリンの色に類似している。ミオグロビンの色は、その酸化還元状態に依存する（ＡＭＳＡ Ｍｅａｔ Ｃｏｌｏｒ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２）。
【0021】
特定の実施形態によれば、細胞培養物の色は茶色である。特定の実施形態によれば、細胞培養物の色は赤から明るい赤である。特定の実施形態によれば、細胞培養物の色はピンク紫がかった色である。
【0022】
特定の例示的な実施形態によれば、細胞培養物の色は、茶色から赤色の範囲で変化する。これらの実施形態によれば、細胞培養物の細胞は、約３００ｎｍ～約７００ｎｍの複数の波長で吸光度を有する少なくとも１つの化合物を含む。
【0023】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、鉄および／またはその塩をさらに含む。
【0024】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の外因性サプリメントをさらに含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0025】
特定の例示的な実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、少なくとも１つの着色剤、ビタミンＢ１２、ならびに鉄および／またはその塩の組み合わせを含む。
【0026】
特定の実施形態によれば、ビタミンＤは、ビタミンＤ３およびビタミンＤ２からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0027】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約１ｍｇ／１００ｇの細胞～約５００ｍｇ／１００ｇの細胞の量のビタミンＢ１２を提供する複数の細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ビタミンＢ１２は、５ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0028】
特定の例示的な実施形態によれば、オメガ３［ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アルファ－リノレン酸（ＡＬＡ）］、オメガ６［リノール酸（ＬＡ）、ガンマ－リノレン酸（ＧＬＡ）、カレンジン酸、アラキドン酸］、オメガ９［エルカ酸／ｃｉｓ－１３－ドコセン酸、オレイン酸、エライジン酸］からなる群から選択される不飽和脂肪酸中の脂肪酸およびそれらの任意の組み合わせ。特定の実施形態によれば、脂肪酸は飽和脂肪酸である。特定の例示的な実施形態によれば、飽和脂肪酸はステアリン酸（１８：０）である。
【0029】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、少なくとも２つ、または少なくとも３つの不飽和脂肪酸をさらに含む。
【0030】
特定の実施形態によれば、天然着色剤は、少なくとも１つの非哺乳類生物から得られる抽出物である。特定の実施形態によれば、非哺乳類生物は、植物、真菌、および藻類からなる群から選択される。
【0031】
特定の例示的な実施形態によれば、天然着色剤はカロテノイドである。特定の実施形態によれば、カロテノイドは、カロテンおよびキサントフィルからなる群から選択される。追加の実施形態によれば、天然着色剤はアントシアニンである。
【0032】
いくつかの実施形態によれば、カロテノイドは、α－カロテン、β－カロテン、リコペン、カンタキサンチン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0033】
いくつかの実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞の量の少なくとも１つのカロテノイドを提供する複数の細胞を含む。
【0034】
特定の実施形態によれば、カロテノイドは、リコペン、ベータ－カロテン、カンタキサンチン、ビキシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の例示的な実施形態によれば、カロテノイドはリコペンである。特定の追加の例示的な実施形態によれば、カロテノイドはベータ－カロテンである。さらに特定の例示的な実施形態によれば、カロテノイドはカンタキサンチンである。追加の例示的な実施形態によれば、カロテノイドはビキシンである。さらなる例示的な実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、リコペンとカンタキサンチンの組み合わせを含む。
【0035】
特定の実施形態によれば、培養物の非ヒト動物由来細胞は、少なくとも１つの天然着色剤とビタミンＢ１２の組み合わせを含む。特定の例示的な実施形態によれば、培養物の非ヒト動物由来細胞は、少なくとも１つのカロテノイドおよびビタミンＢ１２の組み合わせを含む。特定の現在の例示的な実施形態によれば、カロテノイドは、ベータ－カロテン、リコペン、およびカンタキサンチンからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0036】
さらなる例示的な実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、ビタミンＢ１２、カンタキサンチン、およびリコペンの組み合わせを含む。
【0037】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞のベータ－カロテンの量を提供する複数の細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ベータ－カロテンは、１０ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0038】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．１ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞のリコペンの量を提供する複数の細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、リコペンは、１ｍｇ／１００ｇの細胞～約２０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0039】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞のカンタキサンチンの量を提供する複数の細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、カンタキサンチンは、１０ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0040】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．０１ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の鉄および／またはその塩の量を提供する複数の細胞を含む。特定の実施形態によれば、鉄は、約０．１ｍｇ／１００ｇの細胞～約４０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。特定の実施形態によれば、鉄の量は、約０．５ｍｇ／１００ｇの細胞～約５ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0041】
特定の実施形態によれば、鉄は、第一鉄イオン、第二鉄イオン、それらの塩およびヘムからなる群から選択される形態である。特定の例示的な実施形態によれば、鉄は、ビスグリシン酸第一鉄の形態である。さらなる例示的な実施形態によれば、鉄はヘムの形態である。
【0042】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、亜鉛および／またはその塩をさらに含む。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１０ｍｇ／１００ｇの細胞の亜鉛の量を提供する複数の細胞を含む。特定の例示的な実施形態によれば、複数の細胞は、約０．５ｍｇ／１００ｇの細胞～約５ｍｇ／１００ｇの細胞の亜鉛の量を提供する。
【0043】
非ヒト動物由来細胞における外因性サプリメントの量を測定するための当技術分野で知られている任意の方法を、本発明の教示に従って使用することができる。本発明の特定の例示的な実施形態によれば、外因性サプリメントは着色され、それにより、その培養培地から細胞内および／または細胞上への取り込み、および／または細胞内または細胞上の量は、各サプリメントに固有の波長で分光光度計によって測定できる。
【0044】
本発明のある量のサプリメントを含む細胞または複数の細胞は、サプリメントを細胞内に含む、細胞膜内に含む、細胞膜または他の細胞部分に付着した、およびそれらの任意の組み合わせを指すことが明確に理解されるべきである。
【0045】
特定の実施形態によれば、本発明の外因性サプリメントは、食品グレードのサプリメントである。外因性サプリメントは、天然資源から単離することも、合成することもできる。特定の現在の例示的な実施形態によれば、外因性サプリメントは、ヒトの消費に適した食品グレードのものである。
【0046】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）および／またはそれから分化した細胞である。
【0047】
さらなる実施形態によれば、ＰＳＣは、非ヒト動物体細胞から再プログラムされた人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）および／またはそれから分化した細胞である。
【0048】
他の実施形態によれば、ＰＳＣは非胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。
【0049】
他の実施形態によれば、ＰＳＣは胚性幹細胞である。
【0050】
いくつかの実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、筋肉細胞に分化した多能性幹細胞である。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、脂肪細胞（脂肪細胞）および／またはその前駆細胞に分化した多能性幹細胞である。いくつかの実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、間質細胞（結合組織）および／またはその前駆細胞に分化した多能性幹細胞である。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、内皮細胞（血管）および／またはその前駆細胞に分化した多能性幹細胞である。
【0051】
いくつかの実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、筋肉細胞および／またはその前駆細胞に分化した衛星細胞である。
【0052】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、筋肉細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞、およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される。
【0053】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽、甲殻類および魚からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0054】
特定の例示的な実施形態によれば、非ヒト動物はウシである。いくつかの例示的な実施形態によれば、ウシは、Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ種のものである。
【0055】
特定の実施形態によれば、上記の実施形態のいずれか１つの細胞培養物は、培養肉を形成する。培養肉は、本発明の細胞培養物からなり得るか、またはスキャフォルドを含むがこれらに限定されない追加の化合物を含み得る。培養肉で使用するために当技術分野で知られている任意の食用スキャフォルドは、食用タンパク質スキャフォルド、食用ヒドロゲルスキャフォルド、食用多糖スキャフォルドなどを含み、本発明の細胞培養物で使用することができる。いくつかの実施形態によれば、スキャフォルドは、植物、藻類、または微生物に由来する。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0056】
特定の実施形態によれば、細胞培養物は、少なくとも１つの追加の食品グレードのサプリメントをさらに含む。適切な追加のサプリメントには、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂質、香料、着色剤、テクスチャラント、食用繊維などが含まれるが、これらに限定されない。
【0057】
特定の例示的な実施形態によれば、培養肉は、筋肉細胞およびその前駆細胞、脂肪細胞およびその前駆細胞、間質細胞およびその前駆細胞、内皮細胞およびその前駆細胞を含む非ヒト動物由来細胞の組み合わせを含む。
【0058】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含む非ヒト動物由来細胞を提供し、ここで、ウシ由来細胞は、肉のような色を特徴とする。
【0059】
さらなる態様によれば、本発明は、複数の非ヒト動物由来細胞を含む培養肉を提供し、細胞の少なくとも６０％は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含み、培養肉は、肉のような色を特徴とする。特定の例示的な実施形態によれば、細胞培養物は培養肉を形成する。
【0060】
特定の実施形態によれば、外因性サプリメントは該細胞の細胞内空間、膜内腔、細胞膜上、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される部位に存在する。
【0061】
細胞の色とサプリメントの濃度は、上記のとおりである。
【0062】
さらに別の態様によれば、本発明は、非ヒト動物由来細胞を増殖させるための濃縮細胞培養液体培地を提供し、培地は、少なくとも１つの天然着色剤、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサプリメントを含み、サプリメントは、非ヒト動物由来細胞に肉のような色を与えるのに十分な量である。
【0063】
特定の実施形態によれば、細胞培養培地は、少なくとも１つの着色剤およびビタミンＢ１２を含むサプリメントの組み合わせを含む。
【0064】
特定の実施形態によれば、細胞培養培地は、少なくとも１つの着色剤およびビタミンＢ１２からなるサプリメントの組み合わせを含む。
【0065】
特定の実施形態によれば、濃縮細胞培養液体培地は、約３００ｎｍ～約７００ｎｍの間の複数の波長での吸光度を有することを特徴とする。
【0066】
さらに別の態様によれば、本発明は、非ヒト動物由来細胞を増殖させるための濃縮細胞培養液体培地であって、少なくとも１つの天然着色剤と少なくとも１つのコバラミン（ビタミンＢ１２）の組み合わせを含む濃縮細胞培養液体培地を提供する。
【0067】
特定の実施形態によれば、本発明の強化培地は、鉄および／またはその塩、酵母抽出物、細菌抽出物、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるサプリメントをさらに含む。
【0068】
少なくとも１つの天然着色剤は、上記のとおりである。
【0069】
いくつかの実施形態によれば、葉酸、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの不飽和脂肪酸、少なくとも１つの飽和脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加のサプリメントをさらに含む濃縮細胞培養液体培地。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0070】
特定の実施形態によれば、ビタミンＤは、ビタミンＤ３およびビタミンＤ２からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0071】
特定の例示的な実施形態によれば、不飽和脂肪酸は、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸、オメガ９脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態によれば、濃縮細胞培養液体培地は、少なくとも２つの不飽和脂肪酸を含む。特定の追加または代替の実施形態によれば、飽和脂肪酸はステアリン酸である。
【0072】
上記の培地のサプリメントは、酵母または細菌抽出物に存在するサプリメントに追加されることを明確に理解されたい。
【0073】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約０．１μｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌの濃度の少なくとも１つのカロテノイドを含む。
【0074】
特定の実施形態によれば、培地中のカロテノイド濃度は、約１μｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌである。特定の例示的な実施形態によれば、強化培地は、約１μｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌの濃度の少なくとも１つのカロテノイドを含む。特定のさらなる例示的な実施形態によれば、強化培地は、約１μｇ／ｍｌ～約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度の少なくとも１つのカロテノイドを含む。
【0075】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約０．５ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＢ１２を含む。特定の例示的な実施形態によれば、強化培地は、約１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＢ１２を含む。他の例示的な実施形態によれば、強化培地は、約１ｍｇ／ｍｌから約１５ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＢ１２を含む。
【0076】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約１０μｇ／ｍｌ～約５ｇ／ｍｌの濃度の酵母抽出物を含む。特定の例示的な実施形態によれば、強化培地は、約５０μｇ／ｍｌ～約１ｇ／ｍｌの濃度の酵母抽出物を含む。特定の例示的な実施形態によれば、強化培地は、約５００μｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で酵母抽出物を含む。
【0077】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約１００μｇ／ｍｌ～約１，２５０μｇ／ｍｌの濃度の鉄および／またはその塩を含む。特定の例示的な実施形態によれば、強化培地は、約１００μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌの濃度で鉄塩を含む。
【0078】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約０．１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの濃度の亜鉛またはその塩を含む。いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約０．１μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度の亜鉛またはその塩を含む。
【0079】
さらに追加の態様によれば、本発明は、肉のような色を特徴とする培養肉を生産するための方法を提供し、この方法は、本発明の強化培地中で非ヒト動物由来細胞を培養することを含む。
【0080】
特定の実施形態によれば、強化培地は、少なくとも１つの天然着色剤、ビタミンＢ１２、鉄および／またはその塩、酵母抽出物、細菌抽出物、またはそれらの組み合わせを含む。これらの実施形態によれば、培養肉は、非ヒト動物由来の肉と類似した知覚特性によってさらに特徴づけられる。
【0081】
本明細書に開示される態様および実施形態のそれぞれの任意の組み合わせは、本発明の開示内に明示的に包含されることを理解されたい。
【0082】
本発明の他の目的、特性および利点は、以下の記載および図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0083】
【図1】培地からウシ細胞へのベータ－カロテンの取り込みを示す。図１Ａ：１ｍｇの増殖培地あたり１００μｇの初期濃度のベータ－カロテン。図１Ｂ：１ｍｇの増殖培地あたり１０μｇの初期濃度のベータ－カロテン。
【図2】１ｍｇの増殖培地あたり７５０μｇのビスグリシン酸第一鉄を含む培地で２４時間インキュベートしたウシ細胞内のビスグリシン酸第一鉄の蓄積を示す。
【図3】１ｍｇの増殖培地あたり１０００μｇのシアノコバラミン（Ｃｂｌ）を含む培地で２４時間インキュベートしたウシ細胞内のシアノコバラミン（Ｃｂｌ）の蓄積を示す。
【図4】エライジン酸とＤＨＡの組み合わせに６日間曝露されたＢＥＦ細胞の写真を示す。脂肪滴（オイルレッドＯを含む）は、細胞内に濃い灰色のポットとして見える。
【発明を実施するための形態】
【0084】
最近の１０年間で、培養肉とその製品の必要性が認識されてきたが、高品質で手頃な価格の製品は入手できない。本発明は、培養肉を形成する非ヒト動物由来細胞培養物の増殖速度、味、芳香、色および栄養価を改善し、そのような製品を一歩先に得る努力をする組成物および方法を提供する。
【0085】
便宜上および明確にするために、明細書、実施例、および特許請求の範囲で使用される特定の用語が本明細書に記載される。
【0086】
定義
「クリーンミート」または「培養肉（ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｅａｔ）」または「インビトロ肉」という用語は、本明細書では、畜殺された動物からではなく、インビトロの非ヒト動物細胞培養から増殖した肉を説明するために交換可能に使用される。インビトロ動物細胞培養から増殖した肉を説明するために当技術分野で使用できる追加の用語には、実験室で増殖した肉、試験管肉、管ステーキ、合成肉、細胞培養肉、組織操作された肉、操作された肉、人工肉、肉アナログおよび人工肉を含む。
「クリーンミート」または「培養肉（ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｅａｔ）」または「インビトロ肉」という用語は、本明細書では、畜殺された動物からではなく、インビトロの非ヒト動物細胞培養から増殖した肉を説明するために交換可能に使用される。インビトロ動物細胞培養から増殖した肉を説明するために当技術分野で使用できる追加の用語には、実験室で増殖した肉、試験管肉、管ステーキ、合成肉、細胞培養肉、組織操作された肉、操作された肉、人工肉、肉アナログおよび人工肉を含む。
【0087】
本明細書で使用される場合、サプリメントに関する「外因性」という用語は、培養培地から細胞によって取り込まれる物質／化合物を指す。外因性サプリメントは、細胞内に天然に存在する化合物（内因性化合物）または非ヒト動物由来細胞に天然に見られない化合物（異種化合物）であり得る。
【0088】
本明細書で使用される場合、「天然着色剤」という用語は、植物、藻類、真菌などを含む天然源に見出され得る色素を指す。本発明の天然着色剤は、天然源に由来することができるか、または化学的に合成することができることを明確に理解されたい。
【0089】
単独で使用される場合の「肉」、「肉のような」、「非ヒト動物由来の肉」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽、甲殻類および魚を含む非ヒト動物由来の肉を指す。
【0090】
本明細書で使用される場合、肉および／または培養肉に関する「知覚特性」という用語は、真の肉／培養肉の外観、味、香り、食感を指す。
【0091】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、無制限に増殖することができ、体内にすべての他の細胞を生じさせることができる細胞を指す。
【0092】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、再プログラミングプロセスによって分化した細胞から直接生成されるタイプの多能性幹細胞を指す。
【0093】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、胚盤胞に由来するタイプの多能性幹細胞を指す。
【0094】
「再プログラミング」という用語は、ある特定の細胞型から別の細胞型への変換を指す。本発明の特定の実施形態によれば、再プログラミングは、体細胞型の、人工多能性幹細胞、またはｉＰＳＣとして知られる多能性幹細胞型への変換である。
【0095】
一態様によれば、本発明は、複数の非ヒト動物由来細胞を含む細胞培養物を提供し、細胞の少なくとも６０％は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含み、細胞培養物は、肉のような色を特徴とする。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0096】
特定の実施形態によれば、細胞の少なくとも６０％は、外因性の鉄またはその塩をさらに含む。
【0097】
特定の実施形態によれば、細胞培養物の非ヒト動物由来細胞は、少なくとも１つの天然着色剤およびビタミンＢ１２の組み合わせを含む。特定の例示的な実施形態によれば、細胞培養物の非ヒト動物由来細胞は、少なくとも１つの天然着色剤、ビタミンＢ１２、および鉄またはその塩の組み合わせを含む。
【0098】
特定の実施形態によれば、複数の非ヒト動物由来細胞の少なくとも６０％は、少なくとも１つの外因性サプリメントを含む。特定の実施形態によれば、複数の非ヒト動物由来細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％は、少なくとも１つの外因性サプリメントを含む。他の実施形態によれば、複数の非ヒト動物由来細胞の少なくとも８５％は、少なくとも１つの外因性サプリメントを含む。さらに追加の実施形態によれば、複数の非ヒト動物由来細胞の６０～１００％が、少なくとも１つの外因性サプリメントを含む。他の実施形態によれば、複数の非ヒト動物由来細胞の６０～９０％、または６０～８０％または６０～７０％は、少なくとも１つの外因性サプリメントを含む。
【0099】
特定の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される外因性サプリメントを含む非ヒト動物由来細胞を提供し、非ヒト動物由来細胞は、肉のような色を特徴とする。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0100】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、鉄またはその塩をさらに含む。
【0101】
特定の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、鉄またはその塩、酵母抽出物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される外因性サプリメントを含む非ヒト動物由来細胞を提供し、非ヒト動物由来細胞は、肉のような色を特徴とする。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0102】
特定の実施形態によれば、本発明は、複数の非ヒト動物由来細胞を含む培養肉を提供し、細胞は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含み、培養肉は、肉のような色を特徴とする。いくつかの実施形態によれば、培養肉は、複数の非ヒト動物由来細胞を含み、細胞は、鉄またはその塩をさらに含む。さらに別の実施形態によれば、培養肉は、複数の非ヒト動物由来細胞を含み、細胞は、少なくとも１つの天然着色剤、コバラミン（ビタミンＢ１２）、鉄またはその塩、酵母抽出物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含み、培養肉は、肉のような色を特徴とする。特定の例示的な実施形態によれば、複数の非ヒト動物由来細胞が培養肉を形成する。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0103】
特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の色は、ミオグロビンの色に類似している。特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の色は、赤身の肉の切り身に似ている。特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の色は、畜殺された肉に似ている。特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の色は茶色である。特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の色は、赤から明るい赤である。特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の色はピンク紫がかった色である。
【0104】
特定の例示的な実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の色は、茶色から赤色の範囲で変化する。
【0105】
特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の非ヒト動物由来細胞は、葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される外因性サプリメントをさらに含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0106】
特定の実施形態によると、ビタミンＤは、ビタミンＤ３およびビタミンＤ２からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0107】
反芻動物の腸に到達する脂肪酸のプロファイルは、動物が消費したものとは大きく異なる。これは、細菌活動の結果としてルーメン内で発生する広範なバイオ水素化によるものである（Ｄｒａｃｋｌｅｙ，Ｊ．Ｋ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｆａｔ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｄａｉｒｙ Ｃｏｗｓ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ：Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＵＳＡ，２００７；ｐｐ．１－９）。有利なことに、本発明の教示は、非ヒト動物由来細胞によって取り込まれる脂肪酸プロファイルを制御することを可能にし、したがって、予め設定された所望の脂肪酸プロファイルを有する培養肉およびその製品を提供する。
【0108】
特定の実施形態によれば、脂肪酸は、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびＡＬＡを含むがこれらに限定されないオメガ３脂肪酸、ＬＡ、ＧＬＡ、カレンジン酸、およびアラキドン酸を含むがこれらに限定されないオメガ６脂肪酸、エルカ酸／シス－１３－ドコセン酸、オレイン酸およびエライジン酸を含むがこれらに限定されないオメガ９脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される不飽和脂肪酸である。特定の実施形態によれば、脂肪酸は飽和酸である。いくつかの実施形態によれば、飽和酸はステアリン酸である。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0109】
ステアリン酸は独特の飽和脂肪酸であり、食品に見出される他の飽和脂肪酸とは対照的に、血中のコレステロール濃度を上昇させるが、効果が異なり、血中脂肪の増加を引き起こさない。
【0110】
特定の実施形態によれば、細胞培養物および／または培養肉の非ヒト動物由来細胞は、少なくとも２つの脂肪酸をさらに含む。
【0111】
培養肉製品を市場に投入する上での障害の１つは、顧客が見慣れた肉の外観を求めているため、その外観である。本発明の培養された非ヒト動物由来細胞は、天然着色剤およびビタミンＢ１２のうちの少なくとも１つを含み、これらは、完全な動物由来の肉を模倣する色を細胞に提供する。さらに、これらの特定の着色化合物は、色に加えて消費者にとって有益な価値があるために選択される。
【0112】
肉の色はいくつかの方法で測定できる。新鮮な動物由来の肉の色は、主に３つの肉色素の相対的な比率によって決まる：紫色の還元ミオグロビン（Ｍｂ）、赤色のオキシミオグロビン（ＭｂＯ２）、茶色のメトミオグロビン（ＭｅｔＭｂ）。特定の方法によれば、５８０ｎｍ：６３０ｎｍでの吸光度の比が決定され、１．０を超える比はより多くの赤みを示す（Ｓｔｒａｎｇｅ，Ｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．１９７４．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．３９：９８８－９９２）。２番目の方法は、６５０／５７０ｎｍの比率を決定することである。
１．１の値は硬化した色がないことを示し、
１．６は中程度のフェードを示し、
１．７～２．０は硬化した色が目立つことを示し、
２．２～２．６は優れた硬化色を示す（Ｈｕｎｔ，Ｍ．Ｃ．，およびＤ．Ｈ．Ｋｒｏｐｆ．１９８８．未公開データ）。
【数1】
【数2】
【数3】
【数4】
【0113】
別の方法は、特定の波長での吸光度に基づくのではなく、ＣＩＥシステムとも呼ばれる三刺激値の測定に基づいている。これは、ヒトの目と脳の知覚を模倣することによって、一種の精神物理学的サンプル分析を実行するように設計された比色法である。この方法は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊の座標値に定量化されたヒトの目の３つの原色受容体に基づいている。ａ＊／ｂ＊の比率が大きい（またはｂ＊／ａ＊が減少している）場合は、赤みが多く、変色が少ないことを示す（Ｓｅｔｓｅｒ，Ｃ Ｓ．１９８４．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌ．６：１８３－１９７）。Ｌ＊：明るい対暗いであり、低い数値（０～５０）は暗いことを示し、高い数値（５１～１００）は明るいことを示す。
【0114】
ａ＊：赤色対緑色であり、正の数は赤を示し、負の数は緑を示す。
【0115】
ｂ＊：黄色対青色であり正の数は黄色を示し、負の数は青色を示す。
【0116】
Ｌ＊Ｃ＊ｈ色空間はＬ＊ａ＊ｂ＊に似ているが、直交座標の代わりに円筒座標を使用して、色の記述が異なる。
【0117】
この色空間では、Ｌ＊は明度を表し、Ｃ＊は彩度（彩度（ｃｏｌｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ））を表し、ｈは色相角（０～３６０°）を表す。
【0118】
Ｃ＊：彩度－スケール０～１００。値が大きいほど、試料中の色素量が多いことを表す。
【0119】
ｈスケール：色相角（０－３６０°）。０ｏ（＝３６０°）付近のｈ値は赤色を示す。１８０°付近のｈ値は青色を示す。
【0120】
彩度と色相は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊のａ＊座標とｂ＊座標から計算される。明度（ΔＬ＊）、彩度（ΔＣ＊）、および色相（ΔＨ＊）のデルタは、正（＋）または負（－）の場合がある。これらは次のように表される。
ΔＬ＊（Ｌ＊試料からＬ＊標準を引いたもの）＝明度と暗さの差：
（＋）＝より明るい、（－）＝より暗い；
ΔＣ＊（Ｃ＊試料からＣ＊標準を引いたもの）＝彩度の差：
（＋）＝より明るい、（－）＝より鈍い；
ΔＨ＊（Ｈ＊試料からＨ＊標準を引いたもの）＝色相の差。
ΔＬ＊（Ｌ＊試料からＬ＊標準を引いたもの）＝明度と暗さの差：
（＋）＝より明るい、（－）＝より暗い；
ΔＣ＊（Ｃ＊試料からＣ＊標準を引いたもの）＝彩度の差：
（＋）＝より明るい、（－）＝より鈍い；
ΔＨ＊（Ｈ＊試料からＨ＊標準を引いたもの）＝色相の差。
【0121】
当技術分野で知られている、本発明の非ヒト動物由来細胞培養物および／または培養肉の色を測定するための任意の方法を、本発明の教示に従って使用することができる。
【0122】
特定の実施形態によれば、細胞培養物は、約３００ｎｍから約７００ｎｍの波長または複数の波長での吸光度を有する少なくとも１つの化合物を含む。コバラミン（ビタミンＢ１２）の吸光度のピークは３６１ｎｍにあり、ベータカロテンの吸光度のピークは４５０ｎｍ、４８０ｎｍ、および５２０ｎｍにあり、リコペンの吸光度のピークは３６０ｎｍ、４４３ｎｍ、４７１ｎｍ、５０２ｎｍにあり、カンタキサンチンのピークは４８０ｎｍにある。
【0123】
天然着色剤色素または色付与化合物のスペクトル吸光度を測定するための当技術分野で知られている任意の方法を、本発明の教示に従って使用することができる。
【0124】
いくつかの実施形態によれば、着色化合物の含有量は、当技術分野で知られているように、化学反応および／またはＨＰＬＣおよび／またはＵＰＬＣによって測定される。
【0125】
いくつかの実施形態によれば、色素は最初に細胞から抽出され、色素抽出物の吸光度は分光光度計によって測定される。他の実施形態によれば、色素抽出物の吸光度は比色計によって測定される。
【0126】
特定の例示的な実施形態によれば、天然着色剤はカロテノイドである。
【0127】
特定の例示的な実施形態によれば、本発明の教示による非ヒト動物由来細胞培養物および／または培養肉に色を提供するカロテノイドは、α－カロテン、β－カロテン、リコペン、クリプトモナキサンチン、アロキサンチン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、α－ゼアキサンチン、リコペルセン、ヘキサヒドロリコペン、トルレン、シンシアキサンチン、ペクテノキサンチン、クラスタキサンチン、ガザニアキサンチン、ＯＨ－クロロバクテリア、ロロキサンチン、ルテイン、リコキサンチン（ｗａｒｍｉｎｇｏｌ）、サプロキサンチン、オシラキサンチン、フレキサントフィル、ロドビブリン、スフェロイデン、ジアジノキサンチン、ルテオキサンチン、ムタトキサンチン、シトロキサンチン、ゼアキサンチンフラノキシド、ネオクロム、フォリアクロム、トロリクロム、クロレラキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、クリプトカプシン、２，２’－ジケトスピリロキサンチン、エキネノン、３’－ヒドロキシエキネノン、フレキシキサンチン、３－ＯＨ－カンタキサンチン（アドニルビン、フェニコキサンチン）、ヒドロキシスフェリオデノン、オケノン、ペクテノロン、フェニコンスポナキサンチン、アスタキサンチン、フコキサンチン、イソフコキサンチン、フィサリアン、シフォニン、β－アポ－２’－カロテナール、アポ－２－リコペナール、アポ－６’－リコペナール、アザフリンアルデヒド、ビキシン、シトラナキサンチン、クロセチン、クロセチンセミアルデヒド、クロアポ－６’－リコペノエート、パラセントロン、シンタキサンチン、アクチニオエリトリン、ペリジニン、ピロキサンチニノール、セミα－カロテノン、セミ－３－カロテノン、トリファシアキサンチン、レトロカロテノイドおよびレトロアポカロテノイド、エシュショルツキサンチン、エシュショルツキサントン、ロドキサンチン、タンゲラキサンチン、ノナプレノキサンチン、デカプレノキサンチン、Ｃ．ｐ．４５０２－［４－ヒドロキシ－３－（ヒドロキシメチル）－２－ブテニル］－２’－（３－メチル－２－ブテニル）－ｂ、ｂ－カロテン、Ｃ．ｐ．４７３２’－（４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル）－２－（３－メチル－２－ブテニル）－３’，４’－ジデヒドロ－１’，２’－ジヒドロ－ｂ，ｙ－カロテン－１’－オール、およびバクテルベリンからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0128】
特定の実施形態によれば、カロテノイドは、ベータ－カロテン、リコペン、カンタキサンチン、ビキシン、ベタレイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0129】
特定の実施形態によれば、カロテノイドは、カロテンリコペンである。
【0130】
リコペンは、確立された抗酸化特性を持つ天然の赤色色素分子である。合成リコペンおよび天然由来のリコペンは、様々な食品の栄養補助食品として０．５～７％の範囲のレベルで使用された場合、Ｕ．Ｓ．ＦＤＡによって安全であると報告されている（一般に安全と認められている、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ））。安全性試験では、３ｇ／（ｋｇ＊ｄ）までの食事性または配合リコペン（Ｔｒｕｍｂｏ，Ｐ．Ｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００５，１３５，２０６０Ｓ－２０６１Ｓ）の摂取レベルで有害作用は観察されなかった。
【0131】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．１ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の量のリコペンを提供する複数の細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、リコペンは、１ｍｇ／１００ｇの細胞～約２０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0132】
特定の実施形態によれば、カロテノイドはキサントフィルカンタキサンチンである。
【0133】
カンタキサンチンは、キサントフィルグループに属する赤橙色のカロテノイドである。この天然に存在する色素は、バクテリア、藻類、およびいくつかの真菌に存在する。カンタキサンチンは、フラミンゴの羽、鯉の皮、甲殻類の殻の色にも関与する。カンタキサンチンは、飼料添加物として家禽（ブロイラー、産卵鶏）で広く使用されている。カンタキサンチンは、鶏の皮、卵黄、鮭、鱒の色を改善するために動物飼料に添加される。合成カンタキサンチンは、自然と同一の化合物である。合成化合物は、動物由来の食品に特徴的な赤橙の色相を与える。カロテノイドのサイズ、形状、または形態も、それらの着色特性において重要な役割を果たす。さらに、カロテノイドとタンパク質の相互作用は、カンタキサンチンの様々な赤色の原因である。（Ｅｓａｔｂｅｙｏｇｌｕ，Ｔ．，＆Ｒｉｍｂａｃｈ，Ｇ．２０１６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１（６），１６００４６９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｎｆｒ．２０１６００４６９）。米国食品医薬品局によると、カンタキサンチンの推奨される上限用量は、固形または半固形食品１ポンドあたりまたは液体食品１パイントあたり３０ミリグラムである。
【0134】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞の量のカンタキサンチンを提供する複数の細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、カンタキサンチンは、１０ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0135】
特定の実施形態によれば、カロテノイドは、カロテンベータ－カロテンである。
【0136】
ベータ－カロテン（またはβカロテン）は、動物では合成されないが、植物や微生物によって生合成されるイソプレノイド化合物である。ベータ－カロテンは、ヒトのカロテノイドの主要な既知の機能であるビタミンＡの重要な供給源として機能する。２０１２年４月２０日に公開されたＦＤＡ情報によると、β－カロテンはＧＲＡＳとして確認されている。栄養補助食品や着色料として使用できる。抗酸化栄養素としてのβ－カロテンの使用も許可されている。
【0137】
ビタミンＡの方程式は次のとおりである。１μｇのレチノール＝６μｇのベータ－カロテン。ビタミンＡの推奨上限は３ｍｇ／日であり、これは１８ｍｇ／日のベータ－カロテンを意味する。
【0138】
さらに、毎日３０ｍｇを超えるベータ－カロテンを摂取すると、皮膚（足の裏や手のひらを含む）の黄色がかった色を特徴とする高カロテン血症を引き起こす可能性がある。これは無害で可逆的である（Ｍａｓｏｎ，Ｐ．２００１．Ｄｉｅｔａｒｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【0139】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞の量のベータ－カロテンを提供する複数の細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ベータ－カロテンは、１０ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。
【0140】
以下の実施例のセクションに例示されるように、細胞は、細胞の色および栄養価の両方に影響を与える、ベータ－カロテン、リコペン、カンタキサンチン、および／またはビタミンＢ１２からなる群から選択される外因性サプリメントで強化された培地でロードされた。濃縮された細胞は、有益な量の前記栄養素を提供する。
【0141】
いくつかの実施形態によれば、カロテノイドはビキシンである。
【0142】
アナトーに含まれるカロテノイドファミリーのもう１つのメンバーであるビキシンは、熱帯植物のベニノキ（Ｂｉｘａ ｏｒｅｌｌａｎａ）の種子から得られる天然の食用色素である。ベニノキの種子およびそれらから得られた抽出物は、ヨーロッパおよび北米で食品着色料として２００年以上使用されており、食品に赤橙黄色の着色を与える（Ｓｍｉｔｈ，ＪおよびＷａｌｌｉｎ，Ｈ．２００６．Ａｎｎａｔｔｏ Ｅｘｔｒａｃｔｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）。今日、ビキシンは世界中で使用されている主な自然色の中で２番目に位置する（Ｇｉｒｉｄｈａｒ Ｐ．およびＰａｒｉｍａｌａｎ ＲＡ．Ａｓｉａ Ｐａｃ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０．１８：７７～７９；Ｃｈｕｙｅｎ Ｈ Ｖ ａｎｄ Ｈｏｉ Ｎ Ｔ．Ｅｕｎ ＪＢ．Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ．２０１２．４７：１３３３－１３３８）。両方の色サプリメントは、ＦＤＡと欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）の両方による使用が承認されている。
【0143】
追加の特定の例示的な実施形態によれば、天然着色剤は、少なくとも１つのベタレインである。いくつかの実施形態によれば、ベタレインは、ベタシアニンおよびベタキサンチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ベタシアニンは、ベタニン、イソベタニン、プロベタニン、およびネオベタニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ベタキサンチンは、ブルガキサンチン、ミラキサンチン、ポルチュラキサンチン、およびインジカキサンチンからなる群から選択される。
【0144】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、少なくとも１つのベタレインの約０．１ｍｇ／１００ｇｒの細胞～約６００ｍｇ／１００ｇｒの細胞の量のベタレインを提供する複数の細胞を含む。
【0145】
ベタレインは、ナデシコ目の植物に見られる赤色と黄色のインドール由来色素のクラスであり、アントシアニン色素に取って代わる。ベタレインには２つのカテゴリーがある。ベタニン、イソベタニン、プロベタニン、ネオベタニンを含む、赤みがかった色から紫色のベタシアニンと、ブルガキサンチン、ミラキサンチン、ポルチュラキサンチン、およびインジカキサンチンを含む、黄色から橙色のベタキサンチンとである。ベタレインは、食品着色料、特にビート由来のベタニンとして一般的に使用されている。最近、ベタニンには抗酸化剤としての健康上の利点もあることが示唆されている。
【0146】
上記のように、ビタミンＢ１２は必須ビタミンであり、カロテノイドとして人体によって合成されず、動物由来の製品を摂取することによって得られる。ビタミンＢ１２構造の一部を形成するコバルトは、その明確な赤色を与え、したがって、ビタミンＢ１２は、本発明の教示によれば、着色剤および必須ビタミンとしての二重の機能を有する。
【0147】
米国医学研究所（ＩＯＭ、現在は保健医療課（ＨＭＤ））は、１９９８年にビタミンＢ１２の推定平均必要量（ＥＡＲ）と推奨栄養所要量（ＲＤＡ）を更新した。１４歳以上の女性と男性のビタミンＢ１２の現在のＥＡＲは２．０μｇ／日である。ＲＤＡは２．４μｇ／日である。
【0148】
ＥＦＳＡは、情報の集合的なセットを食事基準値と呼ぶ。１８歳以上の女性と男性の場合、ビタミンＢ１２の適切な摂取量（ＡＩ）は４．０μｇ／日に設定されている。妊娠中の女性のＡＩは４．５μｇ／日、授乳中の女性のＡＩは５．０μｇ／日である。１～１７歳の子供では、ＡＩは１．５から３．５μｇ／日まで年齢とともに増加する。
【0149】
しかし、ＥＦＳＡとＩＯＭは、ビタミンＢ１２の許容上限摂取量（ＵＬ）の設定を必要とする十分な証拠がないことを読み解いた。
【0150】
本発明はここで、ウシ胚性線維芽細胞および筋芽細胞を１ｍｌあたり１ｍｇのシアノコバラミンを含む増殖培地中でインキュベートすると、細胞に明確な赤ピンク色を与える量のビタミンをもたらしたことを示す。
【0151】
さらに、本発明は、ウシ由来細胞が、調べた濃度で培地からビタミンＢ１２を直線的に取り込むことができ、約１０ｍｇ／１００ｇの細胞～約１００ｍｇ／１００ｇの細胞の量に達することを示す。
【0152】
鉄は、正常な赤血球の発達と健康な免疫機能を確保するために不可欠な微量栄養素である。鉄欠乏症は貧血を引き起こす可能性があり、子供の発達に悪影響を与えることが示されている。食事性鉄の吸収は、変動する動的なプロセスである。摂取された量と比較して吸収された鉄の量は通常少ないが、状況や鉄の種類に応じて、５％から最大３５％の範囲になる場合がある。鉄の最も吸収された形は、動物性食品からのものである。動物性食品や一部の植物性食品からの鉄の吸収はヘム鉄の形であり、摂取量の１５％から３５％の吸収を可能にし、より効率的である。動物のヘム鉄は、血液と筋肉、そして肉とミトコンドリアのヘム含有タンパク質に由来する。本発明の培養肉は、培養肉の栄養価を向上させる鉄で強化された細胞を含む。
【0153】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．０１ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞の量の鉄またはその塩を提供する複数の細胞を含む。特定の実施形態によれば、鉄は、約０．１ｍｇ／１００ｇの細胞～約４０ｍｇ／１００ｇの細胞の量である。特定の実施形態によれば、鉄の量は、約０．５ｍｇ／１００ｇの細胞～約５ｍｇ／１００ｇの細胞である。
【0154】
特定の実施形態によれば、培養肉の非ヒト動物由来細胞は、葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの不飽和脂肪酸、少なくとも１つの飽和脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される外因性サプリメントをさらに含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0155】
コエンザイムＱ１０は、ユビキノン、ユビデカレノン、コエンザイムＱとしても知られ、ＣｏＱ１０、ＣｏＱ、またはＱ１０と略されることもある。ビタミンに似ているこの脂溶性物質は、すべての呼吸する真核細胞、主にミトコンドリアに存在する。これは電子伝達系の構成要素であり、ＡＴＰの形でエネルギーを生成する好気性細胞呼吸に関与する。ＣｏＱ１０は栄養補助食品として販売されている。ＣｏＱ１０の確立された理想的な投与量はない。典型的な１日量は１００～２００ミリグラムである。ＣｏＱ１０は水に溶けない結晶性粉末である。ＣｏＱ１０は、水への溶解度を高めることによって吸収を高めるために、いくつかの方法で変更することができる。
【0156】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、コエンザイムＱ１０をさらに含む。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．５ｍｇ／１００ｇの細胞～約２０ｍｇ／１００ｇの細胞の量でコエンザイムＱ１０を提供する複数の細胞を含む。
【0157】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、葉酸をさらに含む。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約５０μｇ／１００ｇの細胞～約５００μｇ／１００ｇの細胞の間の量の葉酸を提供する複数の細胞を含む。
【0158】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、ビタミンＥをさらに含む。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．５ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞のビタミンＥの量を提供する複数の細胞を含む。特定の実施形態によれば、複数の細胞は、約１ｍｇ／１００ｇの細胞～約１０ｍｇ／１００ｇの細胞のビタミンＥの量を提供する。
【0159】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、セレンおよび／またはその塩をさらに含む。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約５．０μｇ／１００ｇの細胞～約６０μｇ／１００ｇの細胞の量のセレンを提供する複数の細胞を含む。
【0160】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、ビタミンＤをさらに含む。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約０．０１μｇ／１００ｇの細胞～約１５０μｇ／１００ｇの細胞の量のビタミンＤを提供する複数の細胞を含む。特定の実施形態によれば、ビタミンＤの量は、約０．１μｇ／１００ｇの細胞～約１００μｇ／１００ｇの細胞である。特定の実施形態によれば、ビタミンＤの量は、約０．１μｇ／１００ｇの細胞～約１５μｇ／１００ｇの細胞である。
【0161】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞は、少なくとも１つの不飽和脂肪酸をさらに含む。特定の実施形態によれば、非ヒト動物由来細胞培養物は、約５ｍｇ／１００ｇの細胞～約２５００ｍｇ／１００ｇの細胞の量の不飽和脂肪酸を提供する複数の細胞を含む。特定の実施形態によれば、少なくとも１つの不飽和脂肪酸の量は、約５ｍｇ／１００ｇの細胞～約１５００ｍｇ／１００ｇの細胞である。特定の実施形態によれば、少なくとも１つの不飽和脂肪酸の量は、約５ｍｇ／１００ｇの細胞～約５００ｍｇ／１００ｇの細胞である。特定の実施形態によれば、少なくとも１つの不飽和脂肪酸の量は、約５ｍｇ／１００ｇの細胞～約５０ｍｇ／１００ｇの細胞である。
【0162】
特定の実施形態によれば、培養肉の非ヒト動物由来細胞は、リコペン、カンタキサンチン、およびそれらの組み合わせ、ビタミンＢ１２、鉄またはその塩、少なくとも２つの脂肪酸、セレンおよび／またはその塩、亜鉛および／またはその塩、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、ならびにビタミンＤからなる群から選択される少なくとも１つの天然着色剤を含む。
【0163】
さらに別の態様によれば、本発明は、非ヒト動物由来細胞を増殖させるための濃縮細胞培養液体培地を提供し、培地は、少なくとも１つの天然着色剤、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサプリメントを含み、サプリメントは、非ヒト動物由来細胞に肉のような色を与えるのに十分な量である。
【0164】
特定の実施形態によれば、濃縮細胞培養液体培地は、約３００～約７００ｎｍの間の複数の波長での吸光度を有することを特徴とする。シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）のピーク吸光度は３６１ｎｍであり、カロテンのピーク吸光度は、ベータカロテンは４５０、４８０、５２０ｎｍであり、リコペンのピークは３６０、４４３、４７１、５０２ｎｍである。ビキシンは３６０、４７０～４７６、５０１～５０７ｎｍであり、ベタニンのピーク吸光度は５３５ｎｍ、カンタキサンチンのピークは４８０ｎｍである。
【0165】
さらに別の態様によれば、本発明は、肉のような色を有する培養肉を生産するための濃縮細胞培養液体培地を提供し、培地は、少なくとも１つの天然着色剤およびシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）を含む外因性サプリメントの組み合わせを含む。
【0166】
特定の実施形態によれば、本発明は、肉のような色を有する培養肉を生産するための濃縮細胞培養液体培地を提供し、培地は、少なくとも１つの天然着色剤、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、および鉄またはその塩を含む外因性サプリメントの組み合わせを含む。特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２および鉄またはその塩からなる外因性サプリメントの組み合わせを含む。
【0167】
培養肉製品の魅力的な外観の必要性に加えて、味は非常に重要である。培養肉の味は、天然または合成のフレーバーを加えることによって改善される可能性がある。酵母抽出物は食品業界ではフレーバー前駆体として知られており、通常、肉以外の料理に肉ブイヨンの味を与えるために添加される。本発明はここで、予期せぬことに、酵母抽出物を含む培地で非ヒト動物由来細胞を培養すると、改善された肉のような味を有する食品を形成する培養細胞が得られることを開示する。
【0168】
特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２および酵母抽出物を含むサプリメント組成物を含む。特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２および酵母抽出物からなるサプリメント組成物を含む。
【0169】
特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、鉄またはその塩、および酵母抽出物を含むサプリメント組成物を含む。特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、鉄またはその塩、および酵母抽出物からなるサプリメント組成物を含む。
【0170】
さらに別の態様によれば、本発明は、肉のような色を有する培養肉を生産するための濃縮液体細胞培養培地を提供し、培地は、少なくとも１つの天然着色剤、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、鉄またはその塩、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサプリメントを含み、サプリメントは、培養肉に肉のような色を与えるのに十分な量である。
【0171】
さらに別の態様によれば、本発明は、肉のような色を有する培養肉を生産するための濃縮細胞培養液体培地を提供し、培地は、少なくとも１つの天然着色剤、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、鉄またはその塩、酵母抽出物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサプリメントを含み、サプリメントは、培養肉に肉のような色を与えるのに十分な量である。
【0172】
いくつかの実施形態によれば、葉酸、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの不飽和脂肪酸、少なくとも１つの飽和脂肪酸、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサプリメントをさらに含む強化培地。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0173】
特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／または塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含むサプリメント組成物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントからなるサプリメント組成物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0174】
特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、鉄またはその塩、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含むサプリメント組成物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、鉄またはその塩からなるサプリメント組成物、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0175】
特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、酵母抽出物、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含むサプリメント組成物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、酵母抽出物、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントからなるサプリメント組成物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0176】
特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、鉄またはその塩、酵母抽出物、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／またはその塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントを含むサプリメント組成物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、培地は、少なくとも１つの着色剤、Ｂ１２、鉄またはその塩、酵母抽出物、ならびに葉酸（ビタミンＢ９）、亜鉛および／その塩、セレンおよび／またはその塩、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの外因性サプリメントからなるサプリメント組成物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【0177】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約１００μｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌの濃度の葉酸を含む。
【0178】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度のセレンおよび／またはその塩を含む。
【0179】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約０．１ｐＭ～約１００μＭの濃度のビタミンＤを含む。特定の例示的な実施形態によれば、強化培地は、約０．１ｎＭ～約１μＭの濃度のビタミンＤを含む。
【0180】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約１０ｎＭ～約２５０μＭの濃度のビタミンＥを含む。
【0181】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約１０μＭ～約３５０μＭの濃度の少なくとも１つの不飽和脂肪酸を含む。
【0182】
いくつかの実施形態によれば、強化培地は、約５μｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌの濃度のコエンザイムＱ１０を含む。
【0183】
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は、動物、植物、昆虫、細菌に存在する天然タンパク質の多様なグループである。これらのペプチドは、病原性生物からの宿主の防御機構の一部であり、化学防腐剤の代替物であることがわかっている。
【0184】
特定の実施形態によれば、本発明の培地は、培養細胞の汚染を防止するＡＭＰをさらに含む。上記のように、これらのペプチドは天然の防腐剤である。ＡＭＰは、チーズ、ヨーグルト、ポルトガルの発酵肉など、古くから多くの種類の食品に存在するバクテリアによって生成され、ヒトが消費しても安全であることが示されているため、食品業界での使用が承認されている。
【0185】
一般的に使用されるＡＭＰは、分子量３．５ＫＤａ、３４アミノ酸、正電荷、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｒｕｓ ａｕｒｅｕｓｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓを含むグラム陽性菌に対する抗菌活性、およびグラム陰性菌に対する抗菌活性が低いペプチドであるナイシンである。ナイシンは、低温殺菌チーズ、乳製品デザート、缶詰、塩漬け肉、およびシーフードの保護と保存期間の延長のために使用される。（Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｖ．およびＤｅｌｖｅｓ－Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ，Ｊ．２００５．Ｉｎ：Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｍ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎ ｆｏｏｄｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２３７－２７４）。ナイシンは数十年にわたって食品産業で使用されているが、耐性のある食品腐敗菌の発生は検出されていない。
【0186】
アントシアニンは、フェノールのグループに属する着色された水溶性色素である。ｐＨ３未満では、アントシアニン溶液は最も強い赤色を示す。このような溶液のｐＨ上げると、通常、赤色は４～５のｐＨ範囲で無色に見えるまで退色する。ｐＨがさらに上昇すると、紫色および青色のアントシアニン溶液が生じ、貯蔵または熱処理すると、色素沈着が青色から黄色に変化することが観察されている。アクリル化および共色素沈着したアントシアニジンは熱安定性が高いため、様々なｐＨ条件でも構造を維持する。アントシアニンは、心血管疾患、がん、糖尿病、一部の代謝性疾患、微生物感染症など、いくつかの病気の予防に使用できる付加価値のある着色剤である。これらの化合物はまた、視覚能力を改善し、神経保護効果がある。（Ｋｈｏｏ，Ｈ Ｅ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．６１：１３６１７７９）。
【0187】
さらに追加の態様によれば、本発明は、肉のような色を特徴とする培養肉を生産するための方法を提供し、この方法は、本発明の濃縮細胞培養培地中で非ヒト動物由来細胞を培養することを含む。
【0188】
本発明の培地中での非ヒト動物由来細胞の培養は、培養肉生産の任意の段階で実施することができる。特定の実施形態によれば、より強い、畜殺された肉のような色を得るために、低い細胞分裂率の時に本発明の強化培地を添加することが好ましい場合がある。特定の実施形態によれば、本発明の強化培地は、増殖の終わりに向けて肉培養物を形成する非ヒト動物由来細胞に添加される。特定の例示的な実施形態によれば、培地は、実質的に一定のグルコース取り込み速度（ＧＵＲ）を有する細胞に添加される。いくつかの実施形態によれば、強化培地は、培養が完了する約１日から約３日前まで細胞に添加される。
【0189】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに詳しく示すために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
【実施例】
【0190】
材料および方法
ＵＰＬＡ－ＵＶ／Ｖｉｓカロテン分析
ＵＰＬＡ－ＵＶ／Ｖｉｓカロテン分析
【0191】
ベータ－カロテン、リコペン、およびカンタキサンチンは、以下の条件下でＡｎａｌｙｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＵＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ装置によって分析された。
機器：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｐｍ Ｃｉｓ １００ｘ２．１ｍｍ；部品番号ＯＯＤ－４４６２－ＡＮ
カラム温度：５０℃
オートサンプラー温度：５℃
検出器：フォトダイオードアレイ波長範囲２５０～４９９ｎｍ
解像度：３．６ｎｍ
サンプルレート：１０ポイント／秒
移動相Ａ：アセトニトリル：メタノール：酢酸アンモニウム緩衝液 ２５：２５：５０
移動相Ｂ：アセトニトリル：メタノール：ジクロロメタン：ヘキサン ７０：２５：２．５：２．５
流量：０．５ｍＬ／分
注入量：ニードルオーバーフィル付きの１７ｐＬの部分ループ
弱い洗浄体積：６００μＬ
強い溶媒体積：２００μＬ
シールウォッシュ：１分
実行時間：８分
次の注入遅延：５分
勾配条件を以下の表１に示す。
機器：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｐｍ Ｃｉｓ １００ｘ２．１ｍｍ；部品番号ＯＯＤ－４４６２－ＡＮ
カラム温度：５０℃
オートサンプラー温度：５℃
検出器：フォトダイオードアレイ波長範囲２５０～４９９ｎｍ
解像度：３．６ｎｍ
サンプルレート：１０ポイント／秒
移動相Ａ：アセトニトリル：メタノール：酢酸アンモニウム緩衝液 ２５：２５：５０
移動相Ｂ：アセトニトリル：メタノール：ジクロロメタン：ヘキサン ７０：２５：２．５：２．５
流量：０．５ｍＬ／分
注入量：ニードルオーバーフィル付きの１７ｐＬの部分ループ
弱い洗浄体積：６００μＬ
強い溶媒体積：２００μＬ
シールウォッシュ：１分
実行時間：８分
次の注入遅延：５分
勾配条件を以下の表１に示す。
【表1】
【0192】
試料および対照試料溶液の準備
ベータ－カロテン、リコペン、またはカンタキサンチンは、次のように１回の複製で調製された。
ベータ－カロテン、リコペン、またはカンタキサンチンは、次のように１回の複製で調製された。
【0193】
１００ｍｇの試料／対照試料をホモジナイズに適したポリプロピレンバイアルに移した。１００ｍｇ／１ｍｍのガラスビーズを加え、続いて２ｍＬの再構成溶液を加えた。試料を３０秒間ホモジナイズして、細胞を破壊した。ＵＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓを使用してバイアルを遠心分離した後、分析のために上清をＵＰＬＣバイアルに移した。
【0194】
スパイク対照試料溶液の調製
試料は、次のように１回の複製で準備された。
１００ｍｇの対照試料をホモジナイズに適したポリプロピレンバイアルに移した。１００ｍｇ／１ｍｍのガラスビーズを加え、続いて２ｍＬの標準溶液を加えた。試料を３０秒間ホモジナイズして、細胞を破壊した。バイアルを遠心分離した後、分析のために上清をＵＰＬＣバイアルに移した。
試料は、次のように１回の複製で準備された。
１００ｍｇの対照試料をホモジナイズに適したポリプロピレンバイアルに移した。１００ｍｇ／１ｍｍのガラスビーズを加え、続いて２ｍＬの標準溶液を加えた。試料を３０秒間ホモジナイズして、細胞を破壊した。バイアルを遠心分離した後、分析のために上清をＵＰＬＣバイアルに移した。
【0195】
試料中のカロテノイドの定量
ベータ－カロテン、リコペン、カンタキサンチンの試料中のカロテノイド含有量は、各カロテノイドから別々に調製された「標準」溶液に対するシングルポイントキャリブレーションによって決定された。各カロテノイドのピーク面積は、ピーク最大値の波長で決定された。
ベータ－カロテン、リコペン、カンタキサンチンの試料中のカロテノイド含有量は、各カロテノイドから別々に調製された「標準」溶液に対するシングルポイントキャリブレーションによって決定された。各カロテノイドのピーク面積は、ピーク最大値の波長で決定された。
【0196】
ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ
ＢＥＦ細胞は、２４時間異なる濃度のビタミンＢ１２に曝された。細胞ペレットをＨＰＬＣで分析した。
ＢＥＦ細胞は、２４時間異なる濃度のビタミンＢ１２に曝された。細胞ペレットをＨＰＬＣで分析した。
【0197】
分析方法：
分析は、以下の条件を使用してＨＰＬＣによって実行された。
ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ操作条件
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システム
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ５μｍ Ｃ１８ １５０ｘ４．６ｍｍ
カラム温度：３０℃
オートサンプラー温度：５℃
検出器：３６１ｎｍのＵＶ
移動相Ａ：水中の０．０２５％ＴＦＡ
移動相Ｂ：アセトニトリル
流量：１．０ｍＬ／分
注入体積：１００μｌ
実行時間：３０分
勾配条件を以下の表２に示す。
分析は、以下の条件を使用してＨＰＬＣによって実行された。
ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ操作条件
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システム
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ５μｍ Ｃ１８ １５０ｘ４．６ｍｍ
カラム温度：３０℃
オートサンプラー温度：５℃
検出器：３６１ｎｍのＵＶ
移動相Ａ：水中の０．０２５％ＴＦＡ
移動相Ｂ：アセトニトリル
流量：１．０ｍＬ／分
注入体積：１００μｌ
実行時間：３０分
勾配条件を以下の表２に示す。
【表2】
【0198】
標準ストック溶液の調製
標準ストック溶液は、次のように二重に調製した。
１０ｍｇのビタミンＢ１２ Ｖ２８７６標準物質を２０ｍＬの琥珀色のメスフラスコに移し、ＨＰＬＣ水で体積を調整して混合した。
標準ストック溶液は、次のように二重に調製した。
１０ｍｇのビタミンＢ１２ Ｖ２８７６標準物質を２０ｍＬの琥珀色のメスフラスコに移し、ＨＰＬＣ水で体積を調整して混合した。
【0199】
作業標準溶液の準備：
作業標準は、次のように二重に調製された。
１ｍＬの標準ストック溶液を５０ｍＬの琥珀色のメスフラスコに移し、ＨＰＬＣ水で体積を調整して混合した。
作業標準は、次のように二重に調製された。
１ｍＬの標準ストック溶液を５０ｍＬの琥珀色のメスフラスコに移し、ＨＰＬＣ水で体積を調整して混合した。
【0200】
試料および対照試料溶液の調製
試料は、次のように１回の複製で準備された。
５０ｍｇの試料／対照を、ホモジナイザーに適したポリプロピレンバイアルに移した。５０ｍｇの１ｍｍガラスビーズを加え、続いて２ｍＬの希釈剤（水）を加えた。
試料は、次のように１回の複製で準備された。
５０ｍｇの試料／対照を、ホモジナイザーに適したポリプロピレンバイアルに移した。５０ｍｇの１ｍｍガラスビーズを加え、続いて２ｍＬの希釈剤（水）を加えた。
【0201】
試料を３０秒間ホモジナイズして、細胞を破壊した。バイアルを遠心分離した後、分析のために上清をＨＰＬＣバイアルに移した。
【0202】
スパイク対照試料溶液の調製
試料は、次のように１回の複製で準備された。
５０ｍｇの対照試料をホモジナイザーに適したポリプロピレンバイアルに移した。
試料は、次のように１回の複製で準備された。
５０ｍｇの対照試料をホモジナイザーに適したポリプロピレンバイアルに移した。
【0203】
５０ｍｇの１ｍｍガラスビーズを加え、続いて２ｍＬの作業用標準溶液を加えた。
【0204】
試料を３０秒間ホモジナイズして、細胞を破壊した。バイアルの遠心分離後、分析のために上清をＨＰＬＣバイアルに移した。
【0205】
試料中のビタミンＢ１２の定量
試料中のビタミンＢ１２含有量は、作業標準溶液に対するシングルポイントキャリブレーションによって決定された。
試料中のビタミンＢ１２含有量は、作業標準溶液に対するシングルポイントキャリブレーションによって決定された。
【0206】
ビタミンＢ１２でスパイクした対照試料のスパイク回復
【表3】
【0207】
細胞
ＢＥＦ－胚の骨格筋組織に由来するウシ胚性線維芽細胞の培養物。培養中の細胞の９０％－１００％はＢＥＦである。
ＢＥＭ－胚の骨格筋組織に由来するウシ胚性筋芽細胞の培養物。
ＢＣＬ－ウシの臍帯の裏打ちに由来する線維芽細胞の培養物。
ＢＥＦ－胚の骨格筋組織に由来するウシ胚性線維芽細胞の培養物。培養中の細胞の９０％－１００％はＢＥＦである。
ＢＥＭ－胚の骨格筋組織に由来するウシ胚性筋芽細胞の培養物。
ＢＣＬ－ウシの臍帯の裏打ちに由来する線維芽細胞の培養物。
【0208】
実施例１：ウシ由来細胞を着色するためのベータ－カロテンの使用
ウシ胚性線維芽細胞（ＢＥＦ）を、着色化合物の取り込みについて試験した。ウシの細胞の自然な色は白から黄色である。ベータ－カロテンは、人体によってビタミンＡに変換できるプロビタミンＡである。ベータカロテンは黄橙赤色である。
ウシ胚性線維芽細胞（ＢＥＦ）を、着色化合物の取り込みについて試験した。ウシの細胞の自然な色は白から黄色である。ベータ－カロテンは、人体によってビタミンＡに変換できるプロビタミンＡである。ベータカロテンは黄橙赤色である。
【0209】
１つの実験において、水溶性ベータカロテンは、標準培地中１．２×１０６個の細胞（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に加えた。ウシ細胞は、３つの濃度の水溶性ベータ－カロテン（１、１０、および１００μｇ／ｍｌ）とともに、３８．５℃、５％ＣＯ２下で、インキュベートされた。ベータ－カロテン添加の２４時間後、細胞（２４時間後の細胞濃度が１．４×１０６細胞／ｍｌであった）をトリプシン処理によって回収した。細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。ベータ－カロテン含有量は、細胞が除去された培地および収集された細胞の吸収スペクトル（３００～７００ｎｍ）を分光光度計によって分析することによって評価された。図１は、培地からウシ細胞へのベータ－カロテンの取り込みを示す。ウシ細胞の存在の結果としての増殖培地中のベータカロテンの光学密度は、２４時間のインキュベーションで変化した。４５０、４８０、および５２０ｎｍのピークは、２４時間後にそれぞれ２．７、２．３、および２．４倍減少した。培地中のベータカロテンの減少は、強い橙色をしているように見えた細胞内または細胞に付着したその量の増加を反映す。１００μｇのベータカロテンを１．４×１０６細胞に適用すると、細胞による合計４０μｇのベータカロテンの取り込みが起こる。
【0210】
追加の実験では、ＢＥＦ細胞を標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中のベータ－カロテン１０％エマルジョンレッド（ＤＳＭ、カタログ番号５０１２５３８００４）とともに、１１０μｇ／ｍｌのベータ－カロテンの最終濃度で３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。
【0211】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットの色は橙色であった。６３×１０６個の細胞（重量３１６ｍｇ）を上記のＵＰＬＣ法で分析した。細胞内のカロテノイドの量の定量は、前記試料を参照ベータ－カロテン１０％エマルジョンレッドと比較することによって実行された。
【0212】
以下の表４に見られるように、０．１１ｍｇ／ｍｌのベータ－カロテンを細胞に適用すると、２００μｇのベータ－カロテン／ｇｒの細胞が取り込まれた。エマルジョン形態のベータ－カロテンは、水溶性ベータ－カロテンの取り込みから生じる細胞の橙色と比較して、細胞に赤橙色をもたらすことに留意されたい。したがって、エマルジョン形態でのベータ－カロテンの使用は、本発明の教示によれば有利である。
【0213】
実施例２：鉄の摂取
ウシ由来細胞の着色のためのビスグリシン酸第一鉄の使用
ビスグリシン酸第一鉄は、暗褐色の水溶性化合物である。ＢＣＬ細胞に由来するウシ線維芽細胞によるビスグリシン酸第一鉄の取り込みを、上記のように、１５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、および３７５μｇ／ｍｌの３つの濃度のベータ－カロテンについて調べた。
ウシ由来細胞の着色のためのビスグリシン酸第一鉄の使用
ビスグリシン酸第一鉄は、暗褐色の水溶性化合物である。ＢＣＬ細胞に由来するウシ線維芽細胞によるビスグリシン酸第一鉄の取り込みを、上記のように、１５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、および３７５μｇ／ｍｌの３つの濃度のベータ－カロテンについて調べた。
【0214】
１５００μｇ／ｍｌの濃度のビスグリシン酸第一鉄は、ウシ細胞に対して毒性があることがわかった。７５０μｇ／ｍｌの濃度で、細胞は薄茶色に着色された（図２）。３７５μｇ／ｍｌは細胞を着色しなかった。
【0215】
ウシ由来細胞の濃縮のための鉄の使用
完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中に溶解した硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ８６３３）とともに、最終濃度が０．５ｍＭとなるように、３８℃で２４時間、５％のＣＯ２下でインキュベートした。
完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中に溶解した硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ８６３３）とともに、最終濃度が０．５ｍＭとなるように、３８℃で２４時間、５％のＣＯ２下でインキュベートした。
【0216】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。ＩＣＰ－ＭＳ法を使用して、１１０７ｍｇの重量の細胞を分析した。
【0217】
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）は、環境試料中の微量金属を分析するための強力なツールである。これは、水試料中の多数の元素のサブμｇ／Ｌ濃度の測定に適用できる。この方法では、高周波誘導結合プラズマによって生成されたイオンを測定する。液体中の分析対象種は噴霧され、結果として生じるエアロゾルはアルゴンガスによってプラズマトーチに輸送される。高温で生成されたイオンはプラズマガスに同伴され、インターフェースを介して質量分析計に導入される。プラズマで生成されたイオンは、質量電荷比（ｍ／ｚ）に従ってソートされ、チャネル電子増倍管で定量化される（ＵＳ ＥＰＡが発行した６０２０ｂ誘導結合プラズマ質量分析法）。
【0218】
標準培地でインキュベートしたＢＥＦ細胞は８．３６μｇ鉄／ｇの細胞しか含まなかったが、上記のように硫酸鉄七水和物を含む培地サプリメントで細胞をインキュベートすると、２５．１１μｇ鉄／ｇの細胞をもたらし、約３倍増加した。
【0219】
実施例３：シアノコバラミンの摂取
ウシ由来細胞の着色のためのシアノコバラミンの使用
シアノコバラミン（Ｃｂｌ）は水溶性ビタミンＢ１２で、赤色を有する。ＢＥＦ細胞によるシアノコバラミンの取り込みを、ベータ－カロテンについて上記のように、１０００、１００、および１０μｇ／ｍｌの３つの濃度、および２４時間のインキュベーション時間で調べた。
ウシ由来細胞の着色のためのシアノコバラミンの使用
シアノコバラミン（Ｃｂｌ）は水溶性ビタミンＢ１２で、赤色を有する。ＢＥＦ細胞によるシアノコバラミンの取り込みを、ベータ－カロテンについて上記のように、１０００、１００、および１０μｇ／ｍｌの３つの濃度、および２４時間のインキュベーション時間で調べた。
【0220】
１０００μｇ／ｍｌの高濃度に曝されると、細胞は赤ピンクに着色した（図３）。１００μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌでは、ウシ細胞の色に視覚的な変化はありないであった。
【0221】
ウシ由来細胞の濃縮のためのシアノコバラミンの使用
【0222】
完全コンフルエントなＢＥＦ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中のビタミンＢ１２（シアノコバラミン、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｖ２８７６）とともに、最終濃度１３．３、６．６７、３．３３、および１．６７ｍｇ／ｍｌまで３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。
【0223】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットの色は、ビタミンＢ１２の濃度に応じて、様々な強度で赤ピンクであった。１２．８×１０７個の細胞（重量７６４ｍｇ）を、上記のようにＨＰＬＣ法で分析するために移した。細胞内のビタミンＢ１２の量の定量は、試料を参照ビタミンＢ１２と比較することによって実行した。
【0224】
表３に見られるように、１．６７、３．３３、６．６７、および１３．３ｍｇ／ｍｌのビタミンＢ１２を細胞に適用すると、直線的に取り込まれた。
【表4】
【0225】
実施例４：ウシ由来細胞の濃縮のための亜鉛の使用
完全コンフルエンスのＢＥＦおよびＢＥＭ細胞（大部分はＢＥＦ細胞）を含む混合物を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）に溶解した塩化亜鉛（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ０１５２）と１００μＭの最終濃度（１３μｇ／ｍｌ）まで３８℃で７２時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。１７．８×１０７個の細胞（重量１２００ｍｇ）は、ＩＰＣ－ＭＳメソッドを使用して分析した。
完全コンフルエンスのＢＥＦおよびＢＥＭ細胞（大部分はＢＥＦ細胞）を含む混合物を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）に溶解した塩化亜鉛（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ０１５２）と１００μＭの最終濃度（１３μｇ／ｍｌ）まで３８℃で７２時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。１７．８×１０７個の細胞（重量１２００ｍｇ）は、ＩＰＣ－ＭＳメソッドを使用して分析した。
【0226】
塩化亜鉛を添加していない標準培地で培養した細胞には、８．５μｇの亜鉛／ｇｒの細胞しか含まれなかった。１００μＭの塩化亜鉛を細胞に適用すると、３０．４４μｇの亜鉛／ｇｒの細胞の取り込み、すなわち約３．６倍の増加が生じた。
【0227】
例５：オメガ３およびオメガ９
Ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、またはＳｉｇｍａＤ２５３４）およびエライジン酸（Ｃａｙｍｅｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号９０２５０）を標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）に溶解し、最終濃度を５０μＭとした。
Ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、またはＳｉｇｍａＤ２５３４）およびエライジン酸（Ｃａｙｍｅｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号９０２５０）を標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）に溶解し、最終濃度を５０μＭとした。
【0228】
ＢＥＦ細胞を５０，０００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、３８℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。翌日、細胞がプレート表面に付着した後、エライジン酸とＤＨＡを含む培地を細胞に加えた。標準培地でインキュベートした細胞は、対照としてのみ用いた。培地は１日おきに６日間交換された。アッセイの最後に、細胞をＰＢＳ ｐＨ＝７．４で洗浄し、ホルムアルデヒド４％バッファーｐＨ＝７．４で２０分間固定した。ウェルを大量のＰＢＳ ｐＨ＝７．４で３回洗浄した。オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ Ｏ１３９１）作業溶液を各ウェルに１５分間加えた。ウェルは、大量のｄＨ２Ｏで３回洗浄した。
【0229】
図４に見られるように、エライジン酸とＤＨＡ（１：１の比率）を含む培地で処理された細胞は、細胞内に脂肪滴を蓄積し始めた。
【0230】
オイルレッドＯ染色を半定量的に測定した。オイルレッドＯ染色を１００％イソプロパノールで５分間抽出した。吸光度は、４９２ｎｍの波長で測定された。エライジン酸とＤＨＡの組み合わせで有意な染色が観察された（対照の０．０３５２と比較して０．１２０７のＯＤ４９２吸光度）。
【0231】
実施例６：リコペンの取り込み
１つの実験では、完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中のＲｅｄｉｖｉｖｏ（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ）１０％ＣＷＳ／Ｓ－ＴＧ（ＤＳＭ、カタログ番号５００３７９２００４）と０．１１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで３８℃で２４時間、５％ＣＯ２でインキュベートした。
１つの実験では、完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中のＲｅｄｉｖｉｖｏ（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ）１０％ＣＷＳ／Ｓ－ＴＧ（ＤＳＭ、カタログ番号５００３７９２００４）と０．１１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで３８℃で２４時間、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0232】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットの色は黄色であった。１３×１０６個の細胞（重量１４７ｍｇ）をＵＰＬＣ法で分析した。細胞内のカロテノイド量の定量は、試料を参照－Ｒｅｄｉｖｉｖｏ（リコペン）１０％ＣＷＳ／Ｓ－ＴＧと比較することにより実行した。
【0233】
以下の表４に示すように、０．１１ｍｇ／ｍｌのリコペンを細胞に適用すると、１０μｇのリコペン／ｇの細胞が取り込まれた。
【0234】
追加の実験では、完全コンフルエンスのＢＥＭ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、２０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中のＲｅｓｏｌｕｔｅ Ｒｕｂｙ Ａ Ｌｙｃｏｒｅｄ（カタログ番号４００２８０、水溶性リコペンの別の配合）と０．００２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。
【0235】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットの色は暗赤色であった。１３×１０６個の細胞（重量１６０ｍｇ）をＵＰＬＣ法で分析した。細胞内のカロテノイドの量の定量は、試料を参照物質であるＲｅｓｏｌｕｔｅ Ｒｕｂｙ Ａ Ｌｙｃｏｒｅｄと比較することによって実行された。
【0236】
表４に見られるように、０．００２ｍｇ／ｍｌのリコペンを細胞に適用すると、３０μｇのリコペン／ｇの細胞が取り込まれた。
【0237】
リコペンの食事摂取量は、調査対象の人口によって大きく異なる。平均的なイタリア人は総カロテノイドの１４．３ｍｇ／日を消費する（Ｌｕｃａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２００６）。米国では、リコペンの典型的な食事摂取量は１日あたり約２～５ミリグラム（ｍｇ）である（Ｋｒｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，２００５）。
【0238】
実施例７：カンタキサンチンの取り込み
完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞とＢＥＭ細胞の混合物を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中のカンタキサンチン１０％ＣＷＳ／Ｓ（カタログ番号５００５２５６００４）と、最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌまで３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。
完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞とＢＥＭ細胞の混合物を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中のカンタキサンチン１０％ＣＷＳ／Ｓ（カタログ番号５００５２５６００４）と、最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌまで３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。
【0239】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットの色は赤橙色であった。２０×１０７個の細胞（重量８５５ｍｇ）をＵＰＬＣ法で分析した。細胞内のカロテノイド量の定量は、試料を参照物質のカンタキサンチン１０％ ＣＷＳ／Ｓと比較することによって実行された。
【0240】
表４に示すように、１．１ｍｇ／ｍｌのカンタキサンチンを細胞に適用すると、４２０μｇのカンタキサンチン／ｇの細胞が取り込まれた。
【0241】
Ｃｏｌｏｒ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｆｏｏｄ ｐａｒｔ７３，Ｓｕｂｐａｒｔ Ａによると、固形または半固形食品１ｋｇあたりまたは液体食品１パイントあたり６６ｍｇを超えない着色添加剤は、ＦＤＡにより発行されるバッチ認証を免除される。
【表5】
【0242】
実施例８：ウシ由来細胞の味を濃縮するための酵母抽出物の使用
完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中に溶解した酵母抽出物とともに、最終濃度がそれぞれ０．５％または２％となるように、３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。３種類の酵母抽出物を調べる：高グルタミン酸酵母抽出物を含む酵母抽出物、例えば、Ｓｐｒｉｎｇｅｒカタログ番号４１０１／０－ＰＷ－Ｌおよびその同等物、塩基性酵母抽出物を含む酵母抽出物、例えばＳｐｒｉｎｇｅｒカタログ番号０４／０２／２０－ＭＧおよびその同等物、および高Ｉ＋Ｇ酵母抽出物を含む酵母抽出物、例えばＳｐｒｉｎｇｅｒカタログ番号２０１２／２０－ＭＧ－Ｌ ＡＦおよび同等物。
完全コンフルエンスのＢＥＦ細胞を、標準培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中に溶解した酵母抽出物とともに、最終濃度がそれぞれ０．５％または２％となるように、３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートした。３種類の酵母抽出物を調べる：高グルタミン酸酵母抽出物を含む酵母抽出物、例えば、Ｓｐｒｉｎｇｅｒカタログ番号４１０１／０－ＰＷ－Ｌおよびその同等物、塩基性酵母抽出物を含む酵母抽出物、例えばＳｐｒｉｎｇｅｒカタログ番号０４／０２／２０－ＭＧおよびその同等物、および高Ｉ＋Ｇ酵母抽出物を含む酵母抽出物、例えばＳｐｒｉｎｇｅｒカタログ番号２０１２／２０－ＭＧ－Ｌ ＡＦおよび同等物。
【0243】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄する。細胞ペレットを電子鼻と電子舌で分析し、対照（酵母抽出物なし）と比較する。
【0244】
人工舌は、標的分子が受容体と反応するによって引き起こされる電位または電流の変化を測定することに依存する場合が多い。したがって、これらのデバイスはしばしば電子舌またはｅ－舌と呼ばれ、自然の舌と同じように機能する。人工舌は、苦味、酸味、塩味、うま味（風味）、および甘味を感じることができる。例示的な味覚センサーは、商品化された味覚感知システムＳＡ４０２ＢおよびＴＳ－５０００Ｚ（Ｋｉｙｏｓｈｉ Ｔｏｋｏ．２０１２．Ｎａｔｕｒｅ ４８６：Ｓ１８－Ｓ１９ ｄｏｉ：１０．１０３８／４８６Ｓ１８ａ）である。
【0245】
電子鼻は、再現性のある測定値を取得するように設計された機器内の哺乳類の嗅覚システムを模倣するように設計されており、アロマ混合物の識別と分類を可能にする。電子鼻システムは通常、マルチセンサーアレイ、情報処理ユニット（人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、デジタルパターン認識アルゴリズムを備えたソフトウェア、および参照ライブラリデータベース）で構成される。人工鼻装置の何百もの異なるプロトタイプが開発された（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ Ａ Ｄ ａｎｄ Ｂａｉｅｔｔｏ Ｍ．２００９．Ｓｅｎｓｏｒｓ ９：５０９９－５１４８；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｓ９０７０５０９９を参照されたい）。
【0246】
実施例９：ビタミンＢ１２、カンタキサンチン、およびリコペンの組み合わせの摂取
１つの実験では、ビタミンＢ１２（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｖ２８７６）、カンタキサンチン１０％ ＣＷＳ／Ｓ（カタログ番号５００５２５６００４）、純水中のＬｙｃｏｐｅｎｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｅ Ｒｕｂｙ Ａ（Ｌｙｃｏｒｅｄ、カタログ番号４００２８０）の混合物を、以下の表５に示す最終濃度で調製した。サプリメント混合物の色は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎが発行したガイドラインに従って、比色計によってＬ＊ａ＊ｂ＊パラメータについて測定された。パラメータは、ミートカットからのＬ＊ａ＊ｂ＊の値と比較され、同等であることがわかった（表６）。
１つの実験では、ビタミンＢ１２（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｖ２８７６）、カンタキサンチン１０％ ＣＷＳ／Ｓ（カタログ番号５００５２５６００４）、純水中のＬｙｃｏｐｅｎｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｅ Ｒｕｂｙ Ａ（Ｌｙｃｏｒｅｄ、カタログ番号４００２８０）の混合物を、以下の表５に示す最終濃度で調製した。サプリメント混合物の色は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎが発行したガイドラインに従って、比色計によってＬ＊ａ＊ｂ＊パラメータについて測定された。パラメータは、ミートカットからのＬ＊ａ＊ｂ＊の値と比較され、同等であることがわかった（表６）。
【表6】
【表7】
【0247】
完全コンフルエントＢＥＦ細胞を、上記サプリメント混合物で３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートする。
【0248】
次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットの色は、比色計でＬ＊ａ＊ｂ＊またはＬ＊Ｃ＊ｈパラメータを設定することによって分析される。
【0249】
別の実験では、ビタミンＢ１２（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｖ２８７６）、カンタキサンチン１０％ ＣＷＳ／Ｓ（カタログ番号５００５２５６００４）、純水中のＲｅｄｉｖｉｖｏ Ｌｙｃｏｐｅｎ １０％ＣＷＳ／Ｓ－ＴＧ（カタログ番号５００３７９２００４）を含むサプリメント混合物を、それぞれ最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌに調製する。栄養素（ビタミンＢ１２、カンタキサンチン、リコペン）の混合物の色は、比色計によってＬ＊ａ＊ｂ＊パラメータについて測定される。パラメータは、赤身の肉のカットからのＬ＊ａ＊ｂ＊の値と比較される。
【0250】
完全コンフルエントＢＥＦ細胞を、上記サプリメント混合物で３８℃で２４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートする。次に、細胞をトリプシン処理によって収集し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄する。細胞ペレットの色は、ＵＰＬＣ法によって、および／または比色計によってＬ＊ａ＊ｂ＊またはＬ＊Ｃ＊ｈパラメータを設定することによって分析される。
【0251】
前述の特定の実施形態の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することによって、過度の実験なしに、および一般的な概念から逸脱することなく、かかる特定の実施形態の様々な用途に容易に修正および／または適合することができ、したがって、かかる適合および変更は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で用いられる表現または用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。様々な本開示の機能を実施するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】