特表 2022-511870 金銀花水抽出物を含むヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用薬学組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-01

(54)【発明の名称】金銀花水抽出物を含むヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用薬学組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/355 20060101AFI20220125BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220125BHJP

   A61K 31/7004 20060101ALI20220125BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20220125BHJP

【ＦＩ】

A61K36/355

A61P31/04

A61K31/7004

A23L33/105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021532295

(86)(22)【出願日】2019-11-29

(85)【翻訳文提出日】2021-06-07

(86)【国際出願番号】 KR2019016671

(87)【国際公開番号】W WO2020116862

(87)【国際公開日】2020-06-11

(31)【優先権主張番号】10-2018-0155638

(32)【優先日】2018-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ｗｉｔｅｐｓｏｌ

(71)【出願人】

【識別番号】520210398

【氏名又は名称】グリーン・クロス・ウェルビーイング・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ジョム・ヨン・キム

(72)【発明者】

【氏名】スン・キュ・パク

(72)【発明者】

【氏名】ミン・ジュン・ジャン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・フン・イ

(72)【発明者】

【氏名】ス・ファン・イム

【テーマコード（参考）】

4B018

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018LB08

4B018LB10

4B018LE01

4B018LE02

4B018LE05

4B018MD42

4B018MD48

4B018ME09

4B018ME11

4B018MF01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA11

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB35

4C088AB12

4C088AC01

4C088BA13

4C088CA05

4C088MA35

4C088MA37

4C088MA66

4C088NA14

4C088ZB35

(57)【要約】

本発明は、セコキシロガニンを有効成分で含む金銀花水抽出物のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用組成物に関する。上記抽出物はセコキシロガニンを特定含量含むことによって、ヘリコバクター・ピロリ菌に処理する時抗菌効果に優れ、ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスに処理する時血中ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体の発現減少、組職病理学的病変の好転、サイトカイン発現の減少効果が優秀であつた。よって、本発明の金銀花水抽出物は、ヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用組成物で有用に使用されることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

金銀花（Ｌｏｎｉｃｅｒａｅ Ｆｌｏｓ）水抽出物として、セコキシロガニン（Ｓｅｃｏｘｙｌｏｇａｎｉｎ）を有効成分で含むヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染症の予防または治療用薬学組成物。

【請求項2】

上記セコキシロガニンは、金銀花水抽出物に０．１ないし１０重量％で含むことを特徴とする請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用薬学組成物。

【請求項3】

上記セコキシロガニンは、金銀花水抽出物に０．５ないし５重量％で含むことを特徴とする請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用薬学組成物。

【請求項4】

上記組成物は薬剤学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を追加して薬剤学的投与型に剤形化されることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用薬学組成物。

【請求項5】

金銀花（Ｌｏｎｉｃｅｒａｅ Ｆｌｏｓ）水抽出物としてセコキシロガニン（Ｓｅｃｏｘｙｌｏｇａｎｉｎ）を有効成分で含むヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染症の予防または改善用健康機能食品。

【請求項6】

上記セコキシロガニンは、金銀花水抽出物に０．１ないし１０重量％で含むことを特徴とする請求項５に記載のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または改善用健康機能食品。

【請求項7】

上記セコキシロガニンは、金銀花水抽出物に０．５ないし５重量％で含むことを特徴とする請求項５に記載のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または改善用健康機能食品。

【請求項8】

上記健康機能食品の剤形は、錠剤、カプセル剤、丸剤または液剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項５ないし７のいずれか一項に記載のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または改善用健康機能食品。

【請求項9】

セコキシロガニン（Ｓｅｃｏｘｙｌｏｇａｎｉｎ）を有効成分で含むヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染症の予防または治療用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、金銀花水抽出物を含むヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用薬学組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は、１９８３年オーストラリアのマーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）とウォーレン（Ｗａｒｒｅｎ）によって最初発見された。４～６個の鞭毛を保有した螺旋形の微好気性、グラム陰性菌であって、全世界人口の半分以上が感染されていると報告され、韓国の場合、４０歳以上の成人では７０％以上の感染率が報告されている。ヘリコバクター・ピロリは主に上部消化器疾患と密接に係わって、慢性胃炎、胃腸及び十二指腸潰瘍、胃癌などを起こす原因菌として知られ、特に、１９９４年ＩＡＲＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）及び世界保健機関はヘリコバクター・ピロリを発癌因子（Ｃｌａｓｓ Ｉ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ）として定めた。胃癌の予防及び診断と係わって、ヘリコバクター・ピロリの感染可否は非常に重要な問題として受け入れられ、ヘリコバクター・ピロリの感染因子を糾明することは国民保健のために重要な問題として受け入れられている。

【0003】

ヘリコバクター・ピロリは、動物の尻尾に似ている鞭毛（Ｆｌａｇｅｌｌａ）という運動器官を５～６個持っていて、これを利用して胃腸壁の真上には粘っこい粘液を通過して胃粘膜表面に安着する。尿素分解酵素（Ｕｒｅａｓｅ）はヘリコバクター・ピロリの大概の菌株で発見される共通の特徴であって、個体間の遺伝学的によく保存されている。尿素分解酵素は細菌が生存できない低いｐＨの胃粘膜で生存するためにウレア（Ｕｒｅａ）をアンモニア（ＮＨ_３）と二酸化炭素（ＣＯ_２）に分解して周辺のｐＨを高め、胃酸を中和させて生存する。このように生成されたアンモニアの影響によって、胃粘膜の細胞破壊及び変異が誘発され、胃酸防御作用を失うことになって、胃酸が胃粘膜を攻撃する悪循環が発生して胃組織変形及び炎症反応が起きるようになる。このようにヘリコバクター・ピロリが分泌する様々な細胞毒性因子によって発生した胃粘膜炎症は、リンパ球、大食細胞など多様な炎症細胞の活性化を誘導する。このような炎症細胞は、組織損傷、細胞毒性など生体内で悪影響を示し、炎症誘発媒介体を誘導して炎症を悪化させると報告された。

【0004】

ヘリコバクター・ピロリは胃膓疾患で非常に危ない微生物であるが、適切な抗菌物質などの開発が足りない実情である。現在、ヘリコバクター・ピロリの治療法では、ビスマス（Ｂｉｓｍｕｔｈ）製剤、メトロニダゾール（Ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）とともにテトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）またはアモキシシリン（Ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）を併用処理する一般の３重療法と、ビスマス製剤、オメプラゾール（Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）、テトラサイクリン、メトロニダゾールを混合した４重療法などがあり、上記のような治療法はヘリコバクター・ピロリに対する治療効果に優れると報告されている。しかし、このような薬剤の反復使用は抗生剤への抵抗性増加及び様々な副作用を引き起こすと報告されていて、現在は多様な天産物素材を利用してヘリコバクター・ピロリを抑制することができる抽出物及び活性成分を見つけ出すための努力が続いている。

【0005】

金銀花（Ｌｏｎｉｃｅｒａｅ Ｆｌｏｓ）は、スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）に属するスイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ．）の花であって、漢方医学や民間では利尿、健胃、関節炎、化膿性皮膚炎、気管支炎に使われている。

【0006】

金銀花の成分では、タンニン（Ｔａｎｎｉｎ）、イノシトール（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、ステロール（Ｓｔｅｒｏｌ）、クロロゲン酸（Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、イソクロロゲン酸（Ｉｓｏｃｈｌｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などが報告され、フラボノイド（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）成分では、ルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、アピゲニン（Ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ルテオリン‐７‐ラムノグルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ‐７‐Ｏ‐ｒｈａｍｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、クェルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）などが報告され、金銀花のフラボノイド成分は、抗炎症作用及び抗突然変異作用などがあると知られている。

【0007】

金銀花水抽出物を含むヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用組成物と係る従来の先行文献として、先行論文 [Ｍａ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１６（４４）、５６２９‐５６３４、２０１０]、[Ｘｉａｏ、Ｚ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、６０（４２）、１０５７２‐１０５７７、２０１２] 及び [イ・ヒョナなど、Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ．、５３（２）、１１７‐１２３、２０１３]には、金銀花抽出物を含んで多様な種類の天産物抽出物に対する抗ヘリコバクター・ピロリ効果が開示され、先行文献 [Ｏｋｕ、Ｈ．ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３４（８）、１３３０‐１３３３、２０１１]には、セコキシロガニン（Ｓｅｃｏｘｙｌｏｇａｎｉｎ）を含む金銀花由来化合物及びこの抗アレルギー効果が開示され、先行文献 [Ｘｉｏｎｇ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３８、３２７‐３３３、２０１３]には、セコキシロガニンの大膓菌及び黄色ブドウ球菌に対する抗菌効果が開示されたことがある。

【0008】

本発明者らは金銀花水抽出物を研究する過程において、特に金銀花水抽出物の有効成分のうち、セコキシロガニンが同一条件で大膓菌及びブドウ球菌に比べてヘリコバクター・ピロリに対する抗菌効果が２０倍以上で選択的に抗菌効果を示すことを確認し、セコキシロガニンを特定含量以上含む金銀花水抽出物がヘリコバクター・ピロリ菌に対する感染抑制及び治療効果に優れることを確認して本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、金銀花水抽出物を含むヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用薬学組成物または健康機能食品を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、金銀花（Ｌｏｎｉｃｅｒａｅ Ｆｌｏｓ）水抽出物であって、セコキシロガニン（Ｓｅｃｏｘｙｌｏｇａｎｉｎ）を有効成分で含むヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染症の予防または治療用薬学組成物に関する。

【0011】

上記金銀花水抽出物は、金銀花を金銀花１００重量部に対して水１５００～２５００重量部を混合した後、９０℃以上の温度条件で１時間以上抽出して得ることができるし、抽出用機器は通常の抽出機器、超音波粉砕抽出機または分画機を利用することができる。好ましくは９０℃以上の温度条件で１ないし５時間抽出し、有効成分のセコキシロガニンを０．１ないし１０重量％で含むようにする。

【0012】

上記金銀花水抽出物に有効成分として含まれるセコキシロガニンは、金銀花水抽出物に０．１ないし１０重量％で含み、上記重量％を脱して０．１重量％未満であるか、または１０重量％を超える場合、ヘリコバクター・ピロリ菌に対する感染を阻害させる効果が低くて好ましくないか、またはヘリコバクター・ピロリ菌に対する感染を阻害させる効果の上昇幅が大きくないため経済的ではないので好ましくない。最も好ましくはヘリコバクター・ピロリ感染症に対する効果的な治療のために、上記金銀花水抽出物に有効成分として含まれるセコキシロガニンを金銀花水抽出物に０．５ないし５重量％で含むようにする。

【0013】

上記ヘリコバクター・ピロリ感染症は、ヘリコバクター・ピロリ菌に感染されて表れる疾患であって、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、非潰瘍消化不良症侯群、胃ＭＡＬＴリンパ腫、胃過形成ポリープ、胃癌、消化器癌、膵膓炎、炎症性腸疾患及び機能性消化障害（上腹部飽満感、上腹部痛み、おくび、腹部膨満感、初期飽満感、悪心、嘔吐、逆流、胃痛、食欲不振など）からなる群から選択されてもよく、本発明の金銀花水抽出物はヘリコバクター・ピロリ非感染性疾患に比べてヘリコバクター・ピロリ感染性疾患に特に選択的な治療効果を示す。

【0014】

本発明による薬学組成物は一般に使われる薬学的に許容可能な担体と共に適した形態で剤形化されてもよい。「薬学的に許容可能」とは、生理学的に許容されて人間に投与される時、通常胃腸障害、めまいなどのようなアレルギー反応またはこれと類似な反応を起こさない組成物をいう。また、上記組成物はそれぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われてもよい。

【0015】

上記組成物に含まれてもよい担体、賦形剤及び希釈剤では、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アラビアガム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、未結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を含むことができるが、これに限定されるものではない。製剤化する場合は、普通使う充填剤、安定化剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調剤される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は本発明の抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、未結晶セルロース、スクロースまたはラクトース、低置換度プロピルセルロース、ヒプロメルロースなどを交ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような活択剤も使われる。経口のための液状製剤では懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われてもよい。坐剤の基剤ではウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ－ル、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン油、グリセロール、ゼラチンなどが使われてもよい。非経口投与用剤形に製剤化するために、上記抽出物またはこの薬学的に許容される塩を滅菌され／されたり防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／または緩衝剤などの補助剤、及びその他治療的に有用な物質とともに水に混合して溶液または懸濁液で製造し、これをアンプルまたはバイアル単位投与型で製造することができる。

【0016】

本発明に開示された抽出物を有効成分で含む薬学組成物は、鼠、家畜、人間などの哺乳動物に様々な経路で投与されることができる。投与の全ての方式は予想されるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与されることができる。投与量は治療を受ける対象の年齢、性別、体重、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の重度、投与時間、投与経路、薬物の吸収、分布及び排泄率、使われる他の薬物の種類及び処方者の判断などによって変わる。このような因子に基づく投与量決定は当業者の水準内にあり、一般に投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日ないし約２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は１ｍｇ／ｋｇ／日ないし５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は一日一回投与することもでき、数回に分けて投与することができる。上記投与量は本発明の範囲を限定するものではない。

【0017】

また、他の一面において、本発明は金銀花（Ｌｏｎｉｃｅｒａｅ Ｆｌｏｓ）水抽出物であって、セコキシロガニン（Ｓｅｃｏｘｙｌｏｇａｎｉｎ）を有効成分で含むヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染症の予防または改善用健康機能食品に関する。

【0018】

上記健康機能食品は、有用な機能を持つ原料や成分を使って製造または加工した食品を称するもので、例えば、健康補助食品、機能性食品、栄養剤、補助剤などをいずれも含む。

【0019】

上記抽出物は健康機能食品の総重量に対して、好ましくは０．００１重量％ないし５０重量％、より好ましくは０．００１重量％ないし３０重量％、最も好ましくは０．００１重量％ないし１０重量％にして添加されることができる。本発明の健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤または液剤などの形態を含み、本発明の抽出物を添加できる食品では、例えば、各種食品類、飲み物、ガム、お茶、ビタミン複合剤などがある。

【0020】

本発明は、また、セコキシロガニン（Ｓｅｃｏｘｙｌｏｇａｎｉｎ）を有効成分で含むヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染症の予防または治療用薬学組成物に関する。

【発明の効果】

【0021】

本発明は、セコキシロガニンを有効成分で含む金銀花水抽出物のヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用組成物に関する。上記抽出物はセコキシロガニンを特定含量含むことによって、ヘリコバクター・ピロリ菌に処理する時抗菌効果に優れ、ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスに処理する時血中ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体の発現減少、組職病理学的病変の好転、サイトカイン発現の減少効果が優秀であった。よって、本発明の金銀花水抽出物はヘリコバクター・ピロリ感染症の予防または治療用組成物で有用に使われることができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスの製造過程を図式化したものである。

【図2】ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスにおいて、金銀花抽出物の投与による胃粘膜組職でのヘリコバクター・ピロリ有無をＰＣＲで確認した結果である。

【図3】ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスでの金銀花抽出物の投与による血中リコバクター・ピロリ ＩｇＧ抗体の発現を確認した結果である。

【図4】ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスでの金銀花抽出物の投与による胃組職内炎症細胞浸潤及び萎縮変形の点数化結果である。

【図5】ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスでの金銀花抽出物の投与による迅速尿素分解酵素検査結果である。

【図6】ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスでの金銀花抽出物の投与によるＣＬＯスコア確認結果である。

【図7】ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスでの金銀花抽出物の投与による胃粘膜組職内のＴＮＦ‐α及びＩＬ‐１βの発現量を測定した結果である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0023】

以下、本発明の好ましい実施例を詳しく説明する。しかし、本発明はここで説明する実施例に限定されず、他の形態で具体化されてもよい。返って、ここで紹介される内容が徹底的、かつ完全になり、当業者に本発明の思想を充分に伝えるために提供するものである。

【0024】

＜実施例１．金銀花水抽出物の製造（１）＞
金銀花１００ｇに水２０００ｍｌを入れて９０℃で３時間熱水抽出し、金銀花抽出液１４００ｍｌを得た。上記抽出液を５μｍのろ過紙でろ過した後、５０℃で３時間減圧濃縮した。以後、上記濃縮物を５０℃で一晩中減圧乾燥し、本発明の実施例１の金銀花水抽出物２５ｇを得た。

【0025】

＜実施例２．金銀花水抽出物の製造（２）＞
金銀花１００ｇに水２０００ｍｌを入れて９０℃で１時間熱水抽出し、金銀花抽出液１４００ｍｌを得た。上記抽出液を５μｍのろ過紙でろ過した後、５０℃で３時間減圧濃縮した。以後、上記濃縮物を５０℃で一晩中減圧乾燥し、本発明の実施例２の金銀花水抽出物２５ｇを得た。

【0026】

＜実施例３．金銀花水抽出物の製造（３）＞
金銀花１００ｇに水２０００ｍｌを入れて９０℃で５時間熱水抽出し、金銀花抽出液１４００ｍｌを得た。上記抽出液を５μｍのろ過紙でろ過した後、５０℃で３時間減圧濃縮した。以後、上記濃縮物を５０℃で一晩中減圧乾燥し、本発明の実施例３の金銀花水抽出物２５ｇを得た。

【0027】

＜比較例１．比較対象金銀花エタノール抽出物の製造＞
上記実施例１と同様に製造するが、抽出溶媒を水の代わりに７０％エタノール水溶液を利用して比較例１の金銀花エタノール抽出物を製造した。

【0028】

＜比較例２．比較対象金銀花水抽出物の製造（１）＞
上記実施例１と同様に製造するが、９０℃で３時間熱水抽出する代わりに６０℃で３時間抽出して比較例２の金銀花水抽出物を製造した。

【0029】

＜比較例３．比較対象金銀花水抽出物の製造（２）＞
上記実施例１と同様に製造するが、９０℃で３時間熱水抽出する代わりに３０℃で３時間抽出して比較例３の金銀花水抽出物を製造した。

【0030】

＜比較例４．比較対象金銀花水抽出物の製造（３）＞
上記実施例１と同様に製造するが、９０℃で３時間熱水抽出する代わりに９０℃で３０分間抽出して比較例４の金銀花水抽出物を製造した。

【0031】

＜実験例１．金銀花抽出物に含有された指標成分の含量確認＞
金銀花抽出物に含有された指標成分の含量を確認するために、先ず標準液を製造した。標準液はセコキシロガニン標準品約５ｍｇを５０ｍｌフラスコに入れ、水を加えて超音波分解（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して完全に溶かした後、フラスコを冷やして標線を合わせた液を高濃度（０．１ｍｇ／ｍｌ）セコキシロガニン溶液で使用した。

【0032】

次に、実施例及び比較例をそれぞれ約２００ｍｇずつ取って５０ｍｌフラスコに入れ、水を加えて超音波分解で完全に溶かした後、フラスコを冷やして標線を合わせた後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過した余液を検液（４ｍｇ／ｍｌ）で使用した。

【0033】

上記標準品、実施例及び比較例のＨＰＬＣ遂行条件は下記表１のとおりであり、実施例及び比較例に含有された指標成分の中でセコキシロガニンの含量は下記表２のとおりである。

【0034】

【表1】

【0035】

【表2】

【0036】

上記表２を見ると、本発明の実施例の金銀花水抽出物は抽出温度が９０℃以上の時、セコキシロガニンの含量が高いことが分かった。

【0037】

＜実験例２．ヘリコバクター・ピロリに対する抗菌活性確認＞
ヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）菌株を１０％馬血清が含まれたブルセラ寒天（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｇａｒ）培地に塗抹し、３７℃及び１０％ＣＯ_２条件のインキュベーターで３日間培養した。以後、培養されたヘリコバクター・ピロリ菌体を集めて滅菌されたブルセラ液体培地に懸濁し、６００ｎｍで吸光度１．０の菌体懸濁液を製造した。

【0038】

ブルセラ培地１４ｇを精製水４５０ｍｌに溶解した後、寒天６ｇを入れて懸濁し、１２１℃で１５分間滅菌した。約４０℃で滅菌された培地に馬血清５０ｍｌを混合して直径９０ｍｍのプレートに２５ｍｌずつ分株して寒天培地を固めた後、上記ヘリコバクター・ピロリ菌体懸濁液０．２ｍｌを塗抹した。

【0039】

上記実施例及び比較例を濃度別に水に溶解して０．２μｍ除菌ろ過した後、滅菌したペーパーディスク（Ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ、６ｍｍの直径）にそれぞれ２０μｌずつ処理し、菌株が塗抹されているプレートに載せた。３７℃及び１０％ＣＯ_２条件のインキュベーターで７２時間培養した後、生成された透明環（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）の直径を測定し、穿孔直径を除いた純粋環の直径を表３に示す。

【0040】

【表3】

【0041】

上記表３から分かるように、指標成分のセコキシロガニンが０．５重量％以上含有された実施例１ないし３の金銀花水抽出物をヘリコバクター・ピロリに処理する場合、１０ｍｍ以上の透明環を示して抗菌活性が優秀に表れることを確認することができた。

【0042】

特に、本発明者らはセコキシロガニンの含量による金銀花水抽出物を利用してそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ経口投与によるマウスでのヘリコバクター・ピロリ感染抑制効果を確認し、その結果、比較例１ないし４と違ってセコキシロガニンが０．５重量％以上含有された実施例１ないし３の金銀花水抽出物でのみヘリコバクター・ピロリ感染抑制効果が示されたことを確認することができた。ここで、以後動物実験では実施例１の組成物をヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスに１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ経口投与し、用量によるヘリコバクター・ピロリ感染抑制効果を確認した。

【0043】

＜実験例３．ヘリコバクター・ピロリ感染抑制効果確認＞
実験例３‐１．ヘリコバクター・ピロリ感染マウスの製造
先ず、ヘリコバクター・ピロリ菌株（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＳＳ１、韓国ヘリコバクター銀行）を５％ヒツジ血液（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ）が添加されたトリプチケースソイ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ）寒天培地に接種した後、１０％ＣＯ_２、３７℃及び好気性（ｍｉｃｒｏ‐ａｅｒｏｂｉｃ）条件で２～３日間培養した。

【0044】

ヘリコバクター・ピロリ感染率を高めるために、マウスにヘリコバクター・ピロリ感染２日前、及び感染当日に制酸剤を投与し、すべての群はマウス用ゾンデ（ｚｏｎｄｅ）を利用して５％ＮａＨＣＯ_３（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）をマウス１匹当たり０．２ｍｌずつ１回、総３日間経口投与した。

【0045】

ヘリコバクター・ピロリ感染前のマウスは１２時間節食させ、陰性対照群（Ｇ１）を除いたすべての群はヘリコバクター・ピロリ培養液を５．０×１０^９／ｍｌ ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ‐ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）の菌数で合わせてマウス用ゾンデで０．２ｍｌずつ２日間隔で３回経口投与して感染させた。

【0046】

ヘリコバクター・ピロリ感染を誘発した後、感染維持を確認するために、ヘリコバクター・ピロリ感染１週後全てのマウスの顔面静脈（ｆａｃｉａｌ ｖｅｉｎ）から血液を採取して血漿を分離した。ヘリコバクター・ピロリ抗体測定は、Ｍｏｕｓｅ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｕｓａｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．、ＵＳＡ）の感染によって抗体上昇が確認された個体のみ選抜して試験に使用した。

【0047】

全ての試験群は蒸溜水に懸濁し、マウス１ｋｇ当たり５ｍｌずつ毎日同じ時間に経口投与し、１日１回ずつ２８日間（陽性対照群１は１週目、３週目にそれぞれ１日１回、１４日）投与した。

【0048】

【表4】

【0049】

実験例３‐２．胃粘膜ヘリコバクター・ピロリＰＣＲ検査
無菌的に採取した胃粘膜組職からｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを採取し、下記表５の条件でヘリコバクター・ピロリ ＰＣＲ検査を行った。実験で使用したターゲット遺伝子はヘリコバクター・ピロリのみに特異的に存在する毒素型遺伝子であるＣａｇＡで、これは人間やマウスには存在しない遺伝子である。よって、ヘリコバクター・ピロリに感染されたマウスから、各試験群を処理することで生成された特異バンドを確認し、陽性個体を判定して図２に示す。

【0050】

【表5】

【0051】

図２は胃粘膜組職でヘリコバクター・ピロリ有無をＰＣＲで測定し、これによる各試験群の治療率を算定した結果であって、本発明の実施例１の金銀花抽出物（Ｇ５～Ｇ７）は各濃度別に感染群（Ｇ２）に比べて４０～６０％の治療率を示した。よって、本発明の金銀花抽出物はヘリコバクター・ピロリの感染によって増加した胃粘膜内で特異遺伝子の発現を減少させる組成物であることが分かった。

【0052】

実験例３‐３．血中ヘリコバクター・ピロリ抗体ＩｇＧの力価比較
上記実験例３‐１において、ヘリコバクター・ピロリの感染誘発１週間後、マウスの顔面静脈から分離した血漿と実験終了時点で腹大静脈から採血した後で分離された血漿をＭｏｕｓｅ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔで各血漿内のヘリコバクター・ピロリの抗体力価を測定して図３に示す。

【0053】

図３を見ると、剖検時血液でのヘリコバクター・ピロリ抗体を測定した結果、本発明の実施例１（Ｇ５～Ｇ７）は感染群（Ｇ２）に比べてヘリコバクター・ピロリ抗体が濃度依存的に減少することが分かった。

【0054】

これを通じて、セコキシロガニンを有効成分で含む本発明の金銀花水抽出物は、ヘリコバクター・ピロリによる感染を抑制する効果に優れる組成物であることが分かった。

【0055】

実験例３‐４．胃組職の肉眼病変観察及び組職病理学的分析比較
剖検当日摘出した胃組職は、食道（ｅｓｏｐｈａｇｕｓ）から大わん（ｇｒｅａｔ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）に沿って十二指腸（ｄｕｏｄｅｎｕｍ）の方へ縦方向に切開して広げ、内側の粘膜の特異的病変を観察した。肉眼で病変を観察した後、広げた胃組職を１０％中性ホルマリンに固定し、病理組職学的検査のための通常の方法を利用してパラフィン包埋した後、４μｍ厚さで切片してＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色した後、病理組職学的検査を行った。組職病理学的点数は、１個体あたりＣｏｒｐｕｓとＡｎｔｒｕｍの全般的部位で総合的に表れた炎症細胞（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ＆ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）の浸潤度合い（黄色い矢印表記）と萎縮性変形を伴う胃炎（ａｔｒｏｐｈｉｃ ｇａｓｔｒｉｔｉｓ）の度合いを表６の基準に従って観察し、各組職の等級を点数に換算してこれを図４に示す。

【0056】

【表6】

【0057】

図４を見ると、組職病理結果、胃組職で観察された所見は、先行文献 [Ｌｅｅ、Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．、１９（２）、１４４‐１５１、２０１４]の基準に従って炎症細胞浸潤（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ せｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、萎縮変形（ａｔｒｏｐｈｉｃ ｃｈａｎｇｅ）に対して点数化し、感染群（Ｇ２）は正常群に比べてヘリコバクター・ピロリ感染によって胃組職内で炎症及び萎縮変形が増加したが、実施例１（Ｇ５～Ｇ７）は濃度依存的に胃組職内の炎症及び萎縮変形が減少した。

【0058】

これを通じて、本発明の金銀花抽出物はヘリコバクター・ピロリ感染の時、炎症細胞の浸潤及び萎縮変形による胃炎症状を減少させることが分かった。

【0059】

実験例３‐５．迅速尿素分解酵素検査（ＣＬＯ検査）
胃粘膜にヘリコバクター・ピロリが存在する場合、検査試薬培地で菌が増殖しながら尿素分解酵素を分泌するようになり、検査試薬に存在する尿素を加水分解させてアンモニアを生成する。これによって、検査試薬の全ｐＨが上昇するが、このようなｐＨ指示薬の色相変化（赤色）から迅速尿素分解酵素検査を行い、検査結果を治療率とＣＬＯスコアで示す。

【0060】

迅速尿素分解酵素検査は剖検当日摘出した胃粘膜組職を無菌的に採取し、検査試薬のＣＬＯ（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ‐ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ、Ａｓａｎ Ｐｈａｒｍ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、韓国）を利用して試験した。培養器で３７℃、２時間培養した後、試薬の色が黄色から赤色に変わった場合は陽性と判断した。陽性と判定された個体数を百分率で求めて陽性率を求めるし、試料処置によるヘリコバクター・ピロリ除菌に対する治療率は下記数式で求めてこれを図５に示す。
［数式］
{（検体数‐陽性検体数）／検体数} ×１００

【0061】

また、ＣＬＯ検査後、培地の色に変化がない場合を０点、少し赤色を表す場合１点、淡い紫色を表す場合２点、濃い紫色を表す場合３点で測定し、各群の平均及び標準偏差を求めて群間値の差を比べたＣＬＯスコアを図６に示す。

【0062】

図５及び６の迅速尿素分解酵素検査による治療率及びＣＬＯスコア結果を見ると、本発明の実施例１の金銀花抽出物（Ｇ５～Ｇ７）は感染群（Ｇ２）に比べて４０～６０％の治療率を示し、また６０～９０％のＣＬＯスコア減少効果を示した。

【0063】

これによって、本発明の金銀花抽出物は、ヘリコバクター・ピロリ感染によって増加された胃粘膜内の迅速尿素分解酵素の発現を減少させる組成物であることが分かった。

【0064】

実験例３‐６．胃粘膜組職内のサイトカイン分析
胃粘膜組職内の炎症誘発性サイトカイン（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を測定するために、無菌的に採取した胃組職を液化窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）に細かく破砕し、細胞溶解緩衝液（ｓｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてタンパク質を抽出して分析に使用した。分離したタンパク質はＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を利用してＴＮＦ‐α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ‐α）及びＩＬ‐１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１β）を分析し、その結果は図７に示す。

【0065】

図７を見ると、本発明の実施例１の金銀花抽出物は、ヘリコバクター・ピロリ感染によって増加された胃粘膜組職内のＴＮＦ‐α及びＩＬ‐１βの発現を濃度依存的に減少させた。

【0066】

＜製剤例１．錠剤の製造＞
本発明の実施例１の金銀花抽出物２０ｇをラクトース１７５．９ｇ、ジャガイモ澱粉１８０ｇ及びコロイド性ケイ酸３２ｇと混合した。この混合物に１０％ゼラチン溶液を添加した後、粉砕して１４メッシュの篩を通過させた。これを乾燥させ、これにジャガイモ澱粉１６０ｇ、滑石５０ｇ及びステアリン酸マグネシウム５ｇを添加して得た混合物を錠剤に作った。

【0067】

＜製剤例２．カプセル剤の製造＞
本発明の実施例１の金銀花抽出物１００ｍｇ、とうもろこし澱粉１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがって上記成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

【0068】

＜製剤例３．注射剤の製造＞
本発明の実施例１の金銀花抽出物１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ及びアスコルビン酸０．１ｇを蒸溜水に溶解させて１００ｍｌを作った。この溶液を瓶に入れて２０℃で３０分間加熱して滅菌させた。

【0069】

＜製剤例４．健康機能食品の製造＞
本発明の実施例１の金銀花抽出物２０ｇ、ビタミン混合物を適量、ビタミンＡアセテート７０μｇ、ビタミンＥ １．０ｍｇ、ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ、ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ、ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０．２μｇ、ビタミンＣ １０ｍｇ、ビオチン１０μｇ、ニコチン酸アミド１．７ｍｇ、葉酸５０μｇ、パントテン酸カルシウム０．５ｍｇ、無機質混合物を適量、硫酸第１鉄１．７５ｍｇ、酸化亜鉛０．８２ｍｇ、炭酸マグネシウム２５．３ｍｇ、第１リン酸カリウム１５ｍｇ、第２リン酸カルシウム５５ｍｇ、クエン酸カリウム９０ｍｇ、炭酸カルシウム１００ｍｇ、塩化マグネシウム２４．８ｍｇを交ぜて顆粒に製造したが、用途によって多様な剤形に変形して製造することができる。また、上記ビタミン及びミネラル混合物の組成比を任意に変形して実施しても構わないし、通常の健康機能食品の製造方法にしたがって上記成分を混合して製造することができる。

【0070】

＜製剤例５．健康機能性飲料の製造＞
本発明の実施例１の金銀花抽出物１ｇ、クエン酸０．１ｇ、フラクトオリゴ糖１００ｇ、精製水９００ｇを交ぜて通常の飲料製造方法にしたがって撹拌、加熱、ろ過、殺菌、冷蔵して飲料を製造した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】