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特表2022-511931細胞および生体分子上へのオリゴヌクレオチドの直接合成
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-01
(54)【発明の名称】細胞および生体分子上へのオリゴヌクレオチドの直接合成
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20220125BHJP
C12Q 1/42 20060101ALI20220125BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20220125BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20220125BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220125BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
C12Q1/42
C12Q1/48 Z
C40B40/06
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021533202
(86)(22)【出願日】2019-12-10
(85)【翻訳文提出日】2021-07-26
(86)【国際出願番号】 EP2019084347
(87)【国際公開番号】W WO2020120442
(87)【国際公開日】2020-06-18
(31)【優先権主張番号】18306687.7
(32)【優先日】2018-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19305219.8
(32)【優先日】2019-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516304610
【氏名又は名称】ディーエヌエー スクリプト
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ゴドロン， シャビエル
(72)【発明者】
【氏名】ホルガン， アドリアン
(72)【発明者】
【氏名】ガリエル， シルヴァン
(72)【発明者】
【氏名】ジェドロー， ジェフリー
(72)【発明者】
【氏名】ニコル， ロベール
(72)【発明者】
【氏名】イベール， トマス
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
(57)【要約】
本発明は、生体分子または生細胞もしくは固定細胞上にオリゴヌクレオチドを直接（direction）合成する方法に関する。いくつかの実施形態では、テンプレートなしの酵素合成を、生物学的条件下で、（ｉ）３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の酵素的付加、および（ｉｉ）組み込まれたヌクレオチドを酵素的に脱ブロックして遊離３’ヒドロキシルを再生するという連続サイクルを用いて実施する。本発明は、単一細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築および解析で適用される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを生細胞において合成する方法であって、ａ）前記細胞の細胞表面分子に結合されているか、前記細胞の細胞表面膜中に係留されている遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを準備する工程；
ｂ）生物学的条件下で、（ｉ）遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは延長断片を３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、その結果、前記イニシエーターまたは延長断片が３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長断片を形成する、接触させる工程、および（ｉｉ）前記延長断片を脱ブロックする工程であって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長断片を形成する、脱ブロックする工程、の複数のサイクルを繰り返す工程であって、それにより、所定の配列の前記オリゴヌクレオチドを合成する、繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項2】
前記３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸が３’－リン酸－ヌクレオシド三リン酸であり、前記脱ブロックする工程が、前記３’－Ｏブロック延長断片を３’－ホスファターゼ活性で処理することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記３’－ホスファターゼ活性が、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ、または仔牛腸アルカリホスファターゼによって提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸が３’－エステルブロックヌクレオシド三リン酸であり、前記脱ブロックする工程が、前記３’－Ｏ－エステルブロック延長断片をエステラーゼ活性で処理することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記生物学的条件が、ｐＨ６．８～７．８のｐＨ範囲および１５℃～４１℃の温度範囲の生理学的塩類緩衝液を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記生細胞が哺乳動物細胞である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記イニシエーターが、５’末端に共有結合で付着した親油性アンカーを有するオリゴヌクレオチドを含み、前記親油性アンカーが前記生細胞の細胞表面膜中に安定に挿入する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを有するｃＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、（ａ）生物学的条件下で、固有のオリゴヌクレオチドバーコードを細胞集団中の各細胞の細胞表面膜上に合成して、バーコード付き細胞集団を形成する工程；
（ｂ）リアクター中で各バーコード付き細胞を単離する工程；
（ｃ）各リアクター中でバーコード付き細胞を溶解する工程；
（ｄ）各リアクター中で逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を行って、細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを有するｃＤＮＡライブラリーを産生する工程
を含む、方法。
【請求項9】
前記合成する工程は、（ａ）イニシエーターを前記集団の前記細胞の各々の前記細胞表面膜に結合させること、および（ｂ）（ｉ）生物学的条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは延長断片を、３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させることであって、その結果、前記イニシエーターまたは延長断片が３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長断片を形成する、接触させること、および（ｉｉ）前記延長断片を脱ブロックすることであって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長断片を形成する、脱ブロックすること、のサイクルを繰り返すことを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記サイクルの各々が、個別の反応混合物の間で前記細胞の前記集団を分割することをさらに含み、ここで、前記イニシエーターまたは延長断片が異なる種類のヌクレオシド三リン酸によって延長されて前記延長断片を形成し、その後に前記個別の反応混合物の前記細胞を合わせる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記リアクターが、油中水型乳濁液のミセルである、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ミセルがマイクロフルイディクスデバイスによって生成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記リアクター由来の前記ｃＤＮＡを組み合わせ、ハイスループットＤＮＡ配列決定によって解析する、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
所定のヌクレオチド配列を有する１またはそれを超えるネイティブポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、ＴｄＴ反応条件下で反応混合物中に１またはそれを超えるネイティブポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記ネイティブポリヌクレオチドが遊離３’－ヒドロキシルを有する工程；および
（ｉ）遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記ネイティブポリヌクレオチドまたは延長ネイティブポリヌクレオチドを３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびＴｄＴバリアントと接触させる工程であって、その結果、前記ネイティブポリヌクレオチドまたは延長ネイティブポリヌクレオチドが３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長ネイティブポリヌクレオチドを形成する、接触させる工程、および（ｉｉ）前記延長ネイティブポリヌクレオチドを脱ブロックする工程であって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長ネイティブポリヌクレオチドを形成する、脱ブロックする工程、のサイクルを繰り返すことによって、ヌクレオチドの所定の配列を有する１またはそれを超えるネイティブポリヌクレオチドを伸長させる工程であって、それにより、前記ネイティブポリヌクレオチド上に前記所定の配列のオリゴヌクレオチドを合成する、伸長させる工程
を含む、方法。
【請求項15】
前記所定のヌクレオチド配列が、少なくとも複数の異なる種類のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記所定のヌクレオチド配列が、各々のネイティブポリヌクレオチドについて固有のものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記サイクルの各々が、個別の反応混合物の間で前記ネイティブポリヌクレオチドまたは延長ネイティブポリヌクレオチドを分割することをさらに含み、ここで、前記ネイティブポリヌクレオチドまたは延長ネイティブポリヌクレオチドが異なる種類のヌクレオシド三リン酸によって延長されて前記延長ネイティブポリヌクレオチドを形成し、その後に前記個別の反応混合物の前記延長ネイティブポリヌクレオチドを合わせる、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
各々がオリゴヌクレオチド標識を有するｃＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡを１またはそれを超える固体支持体に結合した捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによって前記ｍＲＮＡを捕捉する工程であって、前記捕捉オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡのセグメントと相補的であり、前記捕捉オリゴヌクレオチドが、５末端によって前記１またはそれを超える固体支持体に結合し、かつ遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端を有する、捕捉する工程；
（ｂ）逆転写酵素を用い、テンプレートとして前記捕捉されたｍＲＮＡを使用して前記捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、前記１またはそれを超える固体支持体上にｃＤＮＡライブラリーを形成させる、伸長させる工程；
（ｃ）テンプレートなしの酵素合成によって前記１またはそれを超える固体支持体のｃＤＮＡ上にオリゴヌクレオチド標識を合成する工程
を含む、方法。
【請求項19】
前記捕捉する工程が、ビーズ上の単一細胞のｍＲＮＡを捕捉して、細胞特異的ｃＤＮＡライブラリーである前記ｃＤＮＡライブラリーを形成することを含み、ここで、前記オリゴヌクレオチド標識が固有の細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記固有の細胞特異的バーコードを前記合成する工程を、分割および混合合成法によって行う、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記１またはそれを超える固体支持体が、前記捕捉オリゴヌクレオチドが結合した固体表面であり、前記捕捉する工程が、前記固体表面上に配置された透過処理した組織スライスのｍＲＮＡを捕捉して、前記組織スライスのｃＤＮＡの空間分布を保存する空間的ｃＤＮＡライブラリーアレイを形成することを含む、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記合成する工程が、前記空間的ｃＤＮＡライブラリーアレイ上の複数の異なる所定の位置の各々に固有の位置タグを合成して、位置タグ－ｃＤＮＡコンジュゲートを形成することを含む、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記方法が、前記位置タグ－ｃＤＮＡコンジュゲートを放出および配列決定して、前記組織スライス中の前記ｍＲＮＡの空間分布を決定する、放出および配列決定する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記固体表面が、所定の非核酸リガンドを捕捉するための前記固体表面に結合した結合化合物を含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記結合化合物が、各々が前記所定の非核酸リガンドのうちの１つに対して所定の特異性を有する１またはそれを超える種類の抗体を含み、各々の異なる種類の抗体は、前記抗体を同定することができる放出可能なオリゴヌクレオチドバーコードが結合している、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
生物科学および医科学において、核酸タグ（すなわち、バーコード）を使用することによって生体分子または細胞の大規模解析を容易にすることができる例は多数ある（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５－１６７０（２０００）；Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第７５３７８９７号；Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第８４７６０１８号；ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２００７／００２０６４０号；Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８：９５３０－９５３５（２０１１）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８：９０２６－９０３１（２０１１）；Ｎｏｌａｎ，米国特許出願公開第２０１６／０２５１６９７号；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，８：１４０４９（２０１７））。
典型的には、かかるオリゴヌクレオチド標識は、（１）生物または生体分子の固有の標識とのコンジュゲート集団を得るために、様々なオリゴヌクレオチド標識セットを予め合成し、これらを使用して標的生物または標的生体分子の遥かに小さな集団とのコンジュゲートを形成する「試料採取による標識付け」（「確率的標識付け」とも呼ばれる）（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，５３７，８９７号；またはＦｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（上記で引用））；または（２）全てが実質的に固有の標識を有する生物または生体分子の集団を得るための複数の予め合成したオリゴヌクレオチドサブユニットの「分割および混合」ハイブリッド形成（例えば、Ｎｏｌａｎ（上記で引用）；またはＳｅｅｌｉｇ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１６／０１３８０８６号）のいずれかによって結合させる。オリゴヌクレオチド合成には主にホスホルアミダイト化学などの化学的方法が使用されているので、これらのプロセスにおいて予め合成したタグまたはタグサブユニットが使用されており、前記化学的方法には過酷な非水性条件を必要とし、生物有機体および生体分子には不適合である。
生物有機体または生体分子に追跡および選別のためのオリゴヌクレオチド標識（固有かつ耐久性のあるバーコードまたはタグなど）を提供するために生物有機体または生体分子上にオリゴヌクレオチドを直接合成することができることができれば、これは非常に望ましいことであろう。かかる標識は、特に次世代の配列決定技術と組み合わせる場合、多くの生物学的過程の細胞ベースの大規模解析のための有益なツールであろう。
典型的には、かかるオリゴヌクレオチド標識は、（１）生物または生体分子の固有の標識とのコンジュゲート集団を得るために、様々なオリゴヌクレオチド標識セットを予め合成し、これらを使用して標的生物または標的生体分子の遥かに小さな集団とのコンジュゲートを形成する「試料採取による標識付け」（「確率的標識付け」とも呼ばれる）（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，５３７，８９７号；またはＦｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（上記で引用））；または（２）全てが実質的に固有の標識を有する生物または生体分子の集団を得るための複数の予め合成したオリゴヌクレオチドサブユニットの「分割および混合」ハイブリッド形成（例えば、Ｎｏｌａｎ（上記で引用）；またはＳｅｅｌｉｇ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１６／０１３８０８６号）のいずれかによって結合させる。オリゴヌクレオチド合成には主にホスホルアミダイト化学などの化学的方法が使用されているので、これらのプロセスにおいて予め合成したタグまたはタグサブユニットが使用されており、前記化学的方法には過酷な非水性条件を必要とし、生物有機体および生体分子には不適合である。
生物有機体または生体分子に追跡および選別のためのオリゴヌクレオチド標識（固有かつ耐久性のあるバーコードまたはタグなど）を提供するために生物有機体または生体分子上にオリゴヌクレオチドを直接合成することができることができれば、これは非常に望ましいことであろう。かかる標識は、特に次世代の配列決定技術と組み合わせる場合、多くの生物学的過程の細胞ベースの大規模解析のための有益なツールであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0002】
【特許文献1】米国特許第７５３７８９７号明細書
【特許文献2】米国特許第８４７６０１８号明細書
【特許文献3】米国特許出願公開第２００７／００２０６４０号明細書
【特許文献4】米国特許出願公開第２０１６／０２５１６９７号明細書
【特許文献5】米国特許出願公開第２０１６／０１３８０８６号明細書
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５－１６７０（２０００）
【非特許文献2】Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８：９５３０－９５３５（２０１１）
【非特許文献3】Ｆｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８：９０２６－９０３１（２０１１）
【非特許文献4】Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，８：１４０４９（２０１７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は、生体分子および生体細胞上にオリゴヌクレオチドを直接合成する方法（単一細胞トランスクリプトーム解析などの単一細胞解析のためのかかる方法の適用が含まれる）に関する。
【0005】
いくつかの実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドを生体細胞または生体分子上に合成する方法であって、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを有する生体細胞または生体分子を準備する工程；（ｂ）（ｉ）延長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは延長断片を３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、その結果、前記イニシエーターまたは延長断片が３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長断片を形成する、接触させる工程、および（ｉｉ）前記延長断片を脱ブロックする工程であって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長断片を形成する、脱ブロックする工程、の複数のサイクルを繰り返す工程であって、それにより、生体細胞または生体分子上に所定の配列のオリゴヌクレオチドを合成する、繰り返す工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、かかる工程を、生体細胞、特に、哺乳動物細胞を生きている状態に維持する条件下で行う。いくつかの実施形態では、脱ブロックする工程を、生体細胞、特に、哺乳動物細胞を生きている状態に維持する条件下で酵素的に行う。
【0006】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを有する細胞特異的ｃＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、（ａ）固有のオリゴヌクレオチドバーコードを細胞集団中の各細胞の細胞表面膜上に合成して、バーコード付き細胞集団を形成する工程；（ｂ）リアクター中で各バーコード付き細胞を単離する工程；（ｃ）各リアクター中でバーコード付き細胞を溶解する工程；（ｄ）各リアクター中で逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を行って、細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを有するｃＤＮＡライブラリーを産生する工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、合成する工程を、本発明のテンプレートなしの酵素合成法によって行う。いくつかの実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼサイクリング増幅反応によってｃＤＮＡにバーコードを結合させることを含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、本発明は、各々が細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを有する細胞特異的ｃＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡをビーズに結合した捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによって単一細胞の前記ｍＲＮＡを捕捉する工程であって、前記捕捉オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡのセグメントと相補的であり、前記捕捉オリゴヌクレオチドが、５末端によって前記ビーズに結合し、かつ遊離３’－ヒドロキシルを有する、捕捉する工程；（ｂ）逆転写酵素を用い、テンプレートとして捕捉された前記ｍＲＮＡを使用して前記捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、細胞特異的ｃＤＮＡライブラリーを形成させる、伸長させる工程；（ｃ）テンプレートなしの酵素合成によってビーズの各ｃＤＮＡ上に固有の細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを合成する工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、固有の細胞またはビーズ特異的バーコードは、ランダム配列オリゴヌクレオチドであり、かかるバーコードを合成する工程を、テンプレートなしの酵素合成を用いた「分割および混合」手順によって実施する。
【0008】
いくつかの実施形態では、本発明は、所定のヌクレオチド配列を有する１またはそれを超えるネイティブポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、ＴｄＴ反応条件下で反応混合物中に１またはそれを超えるネイティブポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記ネイティブポリヌクレオチドが遊離３’－ヒドロキシルを有する、工程；および（ｉ）遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記ネイティブポリヌクレオチドまたは延長ネイティブポリヌクレオチドを３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびＴｄＴバリアントと接触させる工程であって、その結果、前記ネイティブポリヌクレオチドまたは延長ネイティブポリヌクレオチドが３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長ネイティブポリヌクレオチド（3’-O-blocked elongated native polynucleotide）を形成する、接触させる工程、および（ｉｉ）前記延長ネイティブポリヌクレオチドを脱ブロックする工程であって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長ネイティブポリヌクレオチドを形成する、脱ブロックする工程、の複数のサイクルを繰り返すことによって、ヌクレオチドの所定の配列を有する前記１またはそれを超えるネイティブポリヌクレオチドを伸長させる工程であって、それにより、前記ネイティブポリヌクレオチド上に前記所定の配列のオリゴヌクレオチドを合成する、伸長させる工程を含む、方法に関する。
【0009】
本発明のこれらの上記で特徴づけられた態様および他の態様は、示した実施および適用のいくつかを例示しており、これらのうちのいくつかは、図面に示され、以下の特許請求の範囲の節で特徴づけられている。しかしながら、上記の概要は、本発明の示した実施形態またはあらゆる実施の各々を説明していることを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明の一般的原理は、特に例（図面に示し、詳述した例など）によって本明細書中でより詳細に開示している。しかしながら、本発明が記載の特定の実施形態に制限されないことを意図していると理解すべきである。本発明は、種々の修正形態および変更形態が可能であり、いくつかの実施形態についてその詳細を示している。本発明は、本発明の原理および範囲に含まれる全ての修正形態、均等物、および変更形態を対象とするものとする。
【0026】
本発明の実施にあたり、別段の指示が無い限り、当業者の範囲内の有機化学、分子生物学（組換え技術が含まれる）、細胞生物学、および生化学の従来技術および説明を使用し得る。かかる従来の技術には、合成ペプチド、合成ポリヌクレオチド、モノクローナル抗体、核酸のクローニング、増幅、配列決定および解析、ならびに関連技術の準備および使用が含まれ得るが、これらに限定されない。かかる従来技術のためのプロトコールを、製造者による製品についての印刷物および標準的な実験マニュアル（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ）；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００９）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）；ならびに類似の参考文献など）に見出すことができる。
【0027】
本発明は、テンプレートなしの酵素的オリゴヌクレオチド合成技術を使用して細胞または生体分子上にオリゴヌクレオチドを直接合成する方法に関する。かかる技術を、天然環境から抽出した生体分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、イニシエーターの結合によって改変された生体分子（例えば、タンパク質）、または合成によって産生された生体分子（例えば、核酸、ポリサッカリド、ポリペプチドなど）に直接適用することができる。かかる技術は、酵素反応の穏やかな条件が必要であるか有用である任意の環境で適用され得る。特に、テンプレートなしの酵素合成技術は、ハイブリッド化学酵素ポリヌクレオチド合成で使用することができ、この技術において、前駆体ポリヌクレオチドが化学合成され、次いで、過酷な化学合成条件で変更されるか、生存し得ない前駆体は、標識されたヌクレオチドなどの構成成分の酵素的付加によってさらに改変される。かかるハイブリッド合成法は、ヌクレオチドまたはそのアナログの化学的付加と酵素的付加との間にいくつかの変更点を含み得る。かかるハイブリッド合成技術は、酵素合成を種々の異なる化学合成アプローチ（ホスホルアミダイト、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、亜リン酸トリエステル、Ｈ－ホスホン酸化学が含まれるが、これらに限定されない）と組み合わせることができる（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
【0028】
いくつかの実施形態では、テンプレートなしの酵素合成技術は、遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターオリゴヌクレオチド（ｃＤＮＡのポリヌクレオチドの場合、生体分子の一部であり得る）が存在する必要があるか、前記イニシエーターオリゴヌクレオチドは、細胞膜タンパク質または抗体などの場合、種々の化学技術によって（例えば、容易に利用可能なクリック化学反応を使用して）容易に付加され得る。イニシエーターが利用できると、（ｉ）３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の存在下でのテンプレートなしのポリメラーゼ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）など）を使用した単一のヌクレオチドによる遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーター（または事前に伸長された鎖）の伸長、および（ｉｉ）直近に組み込まれた３’－Ｏブロックヌクレオチドを脱ブロックして新規の伸長可能な３’－ヒドロキシルを再生するサイクルの繰り返しによって、酵素オリゴヌクレオチド合成が行われ得る。所望の配列を有するオリゴヌクレオチドが合成されるまで、サイクルを継続する。いくつかの実施形態では、固有のオリゴヌクレオチドバーコードは、「分割および混合」合成ストラテジーによって哺乳動物細胞などの生体細胞の集団上に直接合成され得る。いくつかの実施形態では、非伸長の遊離ヒドロキシルを、キャッピングされた鎖のいかなるさらなる伸長も防止する化合物と反応させるキャッピング工程が含まれ得る。いくつかの実施形態では、かかる化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する非伸長の鎖は、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）に記載のように、３’－エキソヌクレアーゼ活性（例えば、ＥｘｏＩ）で処理することによって分解され得る。
【0029】
いくつかの実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドを生体細胞または生体分子上に合成する方法であって、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを有する生体細胞または生体分子を準備する工程；（ｂ）（ｉ）延長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは延長断片を３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、その結果、前記イニシエーターまたは延長断片が３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長断片を形成する、接触させる工程、および（ｉｉ）前記延長断片を脱ブロックする工程であって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長断片を形成する、脱ブロックする工程、の複数のサイクルを繰り返す工程であって、それにより、前記生体細胞または生体分子上に所定の配列のオリゴヌクレオチドを合成する、繰り返す工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、生体細胞を提供し、脱ブロックを酵素的に行う。いくつかの実施形態では、３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸は３’－リン酸－ヌクレオシド三リン酸であり、脱ブロックする工程を前記３’－Ｏブロック延長断片を３’－ホスファターゼ活性で処理することによって行う。いくつかの実施形態では、３’－ホスファターゼ（ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）活性を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ、または仔牛腸アルカリホスファターゼによって提供する。いくつかの実施形態では、前記３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸は３’－エステル－ヌクレオシド三リン酸であり、脱ブロックする工程を、前記３’－Ｏブロック延長断片をエステラーゼ活性で処理することによって行う。いくつかの実施形態では、エステラーゼ活性は、リパーゼ活性（プロテイナーゼなど）である。いくつかの実施形態では、前記３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸は３’－アセチル－ヌクレオシド三リン酸であり、脱ブロックする工程を、前記３’－Ｏブロック延長断片をアセチルエステラーゼ活性で処理することによって行う。いくつかの実施形態では、テンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントであって、配列番号２～１５のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有し、配列番号２の２０７位または配列番号３～１５のアミノ酸配列中の機能的に等価な位置の第１のアルギニンおよび配列番号２の３２５位または配列番号３～１５のアミノ酸配列中の機能的に等価な位置の第２のアルギニンが置換されており、ここで、前記バリアントＴｄＴが、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－改変ヌクレオチドを核酸断片の遊離３’－ヒドロキシル上に組み込むことができる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントである。
【0030】
いくつかの実施形態では、生細胞においてオリゴヌクレオチドを合成するための本発明の方法は、以下の工程を用いて行われ得る：（ａ）前記細胞の細胞表面分子に結合されているか、前記細胞の細胞表面膜中に係留されている遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを準備する工程；（ｂ）生物学的条件下で、（ｉ）遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは延長断片を３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、その結果、前記イニシエーターまたは延長断片が３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長断片を形成する、接触させる工程、および（ｉｉ）前記延長断片を酵素的に脱ブロックする工程であって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長断片を形成する、脱ブロックする工程、の複数のサイクルを繰り返す工程であって、それにより、所定の配列の前記オリゴヌクレオチドを合成する、繰り返す工程。
【0031】
上記のプロセスは、図１Ｂ～１Ｃに示されており、前記図は、ｃＤＮＡがその３’末端上に合成されたオリゴヌクレオチドを有する実施形態を示す。かかるｃＤＮＡは、例えば、反応チャンバー中で単離された単一細胞から得ることができる。細胞特異的（またはチャンバー特異的）オリゴヌクレオチドは、かかるｃＤＮＡ上で合成され得る。その後、かかる反応チャンバーの内容物を組み合わせ、オリゴヌクレオチド－ｃＤＮＡコンジュゲートを大規模配列解析によって解析して、例えば、細胞集団の単一細胞トランスクリプトーム解析、または同一条件に曝露された同一リアクター由来の細胞群のトランスクリプトーム解析を行うことができる。従来のプロトコールを用いて３’－ｐｏｌｙＴ部分（１０４）を有するプライマー（１０２）を伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）（１００）のｐｏｌｙＡ領域にアニールし、逆転写酵素で伸長させて（１０８）、ｃＤＮＡ（１１３）（配列番号１６）を形成させる。また、プライマー（１０２）は、得られた伸長産物（すなわち、ｃＤＮＡ）を固体支持体に結合させるための手段を提供する部分（１０６）を有する。多種多様のかかる結合手段が利用可能であり、前記結合手段には、固体支持体に結合した相補鎖へのアニールであり得る５’オリゴヌクレオチドテール、共有結合を形成するための固体支持体に結合した相補メンバーと反応し得るクリック化学反応対のメンバー、非共有結合を形成するための固相支持体に結合した相補メンバーと複合体を形成し得る非核酸結合対のメンバー（後者の例は、ビオチンおよびストレプトアビジンである）が含まれるが、これらに限定されない。図１Ｂに戻って、上記の結合様式のうちの２つを、３’末端で結合した相補オリゴヌクレオチド（１１２）を有し、伸長したプライマー（１０２）の部分（１０６）とのハイブリッド形成によってｃＤＮＡ（１１３）を捕捉する固体支持体（１２０ａ）、および結合した結合対のメンバー（１１４ａ）（ストレプトアビジンなど）を有し、前記メンバーの相補メンバー（ビオチンなど）を捕捉する別の支持体（１２０ｂ）を用いて例示する。ｃＤＮＡに結合した結合対のメンバーは、オリゴヌクレオチドテール（１０６）が存在する必要はない；しかし、いくつかの実施形態では、かかるオリゴヌクレオチド（１０６）は、固体支持体から最終産物を切断するために使用され得るヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（例えば、ＵＳＥＲ処理による切断のためのウラシル、または制限エンドヌクレアーゼ（ニッカーゼなど）の認識配列の存在）を含み得る。
【0032】
ｃＤＮＡを３’－ヒドロキシルが遊離状態のままで固体支持体に切断可能または放出可能に結合させた後、酵素合成を進行させて遊離３’末端上に所定の配列のオリゴヌクレオチドを生成することができ、これを図１Ｃに図示する。鎖（１２３）（配列番号１６）を固体支持体（例えば、結合対を介した１２０ｂ）に結合させた後、鎖をテンプレートなしのポリメラーゼ（ＴｄＴなど）および３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸を含む反応混合物に、ＴｄＴがｃＤＮＡの３’－ヒドロキシルおよび生じる３’－Ｏブロックヌクレオチドの三リン酸由来のリン酸結合の形成を触媒することを可能にする条件下で曝露させ、それにより、所望のオリゴヌクレオチドの第１のヌクレオチドが組み込まれる。伸長反応の３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸を、図中で「３’－ＯブロックｄＹＴＰ」として示す。得られた産物の３’－Ｏブロックヒドロキシルを適切な脱ブロック剤を用いて脱ブロックして（１２２）、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長したｃＤＮＡ（１２５）を形成させる。以下でより十分に考察されるように、ブロック基およびその除去方法の選択は、実施形態によって大きく異なり得る。所望の合成速度、所望の合成収率、標識される標的生体分子または標的細胞の脆弱性、特に、生物学的に適合される酵素脱ブロックがより望ましいかどうか、またはより過酷な化学的脱ブロックが許容可能であるかどうかなどの要因を評価することによる特定の実施形態のかかる選択は、当業者の技術の範囲内にある。オリゴヌクレオチド合成が完了するまで、所望のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチドを使用して、サイクルを反復する（１２６）。いくつかの実施形態では、１回またはそれを超える洗浄工程、または３’－ＯブロックｄＹＴＰを除去する工程などのさらなる工程が含まれる。合成完了後、さらなる解析または使用のために、オリゴヌクレオチド標識したｃＤＮＡは固体支持体から除去され得る。いくつかの実施形態では、さらなる解析または使用のために、ｃＤＮＡは固体支持体上に保持され得る。
【0033】
いくつかの実施形態では、生体分子にイニシエーター配列が結合している場合、図１Ｃと類似の過程によって、オリゴヌクレオチドは他の生体分子（抗体など）上で合成され得る。
【0034】
図１Ｄ～１Ｅは、上記方法が固相ｃＤＮＡライブラリーを構築するための市販のｐｏｌｙＴビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）オリゴ（ｄＴ）磁性ビーズ，Ｂｏｓｎｅｓ ｅｔ ａｌ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ（２０１７））と併せて使用され得る方法を示す。ｐｏｌｙＴビーズ（１５０）を、ｐｏｌｙＡ ＲＮＡ（１５２）を含む細胞の抽出物またはライセートと、ビーズのｐｏｌｙＴセグメントとＲＮＡのｐｏｌｙＡセグメントがハイブリッド形成可能な条件下で組み合わせ、その後に、ハイブリッド形成したｐｏｌｙＴセグメントを逆転写反応で伸長させる。ＲＮＡテンプレート（１５６）の除去後、固相ｃＤＮＡライブラリー（１５８）が得られ、次いで、図１Ｂおよび１Ｃの方法（１６０）にしたがってプロセシングしてバーコードまたはプライマー結合部位など（１６２）を合成することができ、ｃＤＮＡをさらに解析することが可能である。かかるバーコードは、患者試料などの特定の試料を固有に指定することができるか、以下にさらに記載のように、かかるバーコードは、単一細胞を固有に指定することができる。
【0035】
いくつかの実施形態では、本発明は、各々がオリゴヌクレオチド標識を有するｃＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡを１またはそれを超える固体支持体に結合した捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによって前記ｍＲＮＡを捕捉する工程であって、前記捕捉オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡのセグメントと相補的であり、前記捕捉オリゴヌクレオチドが、５末端によって前記１またはそれを超える固体支持体に結合しており、かつ遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端を有する、捕捉する工程；（ｂ）逆転写酵素を用い、テンプレートとして捕捉された前記ｍＲＮＡを使用して前記捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、前記１またはそれを超える固体支持体上にｃＤＮＡライブラリーを形成させる、伸長させる工程；および（ｃ）テンプレートなしの酵素合成によって前記１またはそれを超える固体支持体上の各ｃＤＮＡ上にオリゴヌクレオチド標識を合成する工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、合成する工程は、（ｉ）延長条件下で、前記ｃＤＮＡを、３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させることであって、その結果、遊離３’－ヒドロキシルを有する前記ｃＤＮＡまたは延長ｃＤＮＡが３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長ｃＤＮＡを形成する、接触させること、および（ｉｉ）前記延長ｃＤＮＡを脱ブロックすることであって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長ｃＤＮＡを形成する、脱ブロックすること、のサイクルを繰り返すことを含む。いくつかの実施形態では、前記サイクルの各々が、個別の反応混合物の間で遊離３’－ヒドロキシルを有する前記ｃＤＮＡまたは延長ｃＤＮＡを分割することをさらに含み、ここで、遊離３’－ヒドロキシルを有する前記ｃＤＮＡまたは延長ｃＤＮＡが異なる種類のヌクレオシド三リン酸によって延長されて前記延長ｃＤＮＡを形成し、その後に前記個別の反応混合物の延長ｃＤＮＡを合わせる。いくつかの実施形態では、捕捉する工程は、ビーズ上の単一細胞のｍＲＮＡを捕捉して、細胞特異的ｃＤＮＡライブラリーであるｃＤＮＡライブラリーを形成することを含み、ここで、オリゴヌクレオチド標識は固有の細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードである。いくつかの実施形態では、固有の細胞特異的バーコードを合成する工程を、分割および混合合成法によって行う。
【0036】
オリゴヌクレオチドのテンプレートなしの酵素合成
一般に、テンプレートなしの（または、等価には「テンプレート非依存性」）酵素ＤＮＡ合成方法は、図１Ａなどに示すように、各サイクルで所定のヌクレオチドがイニシエーターにカップリングするか、その鎖を成長させる工程のサイクルの繰り返しを含む。テンプレートなしの酵素合成の一般的な要素は、以下の参考文献に記載されている：Ｙｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ／２０１５／１５９０２３号；Ｙｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ／２０１７／２１６４７２号；Ｈｙｍａｎ，米国特許第５４３６１４３号；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ，米国特許第５７６３５９４号；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）；Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）；Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９）。
一般に、テンプレートなしの（または、等価には「テンプレート非依存性」）酵素ＤＮＡ合成方法は、図１Ａなどに示すように、各サイクルで所定のヌクレオチドがイニシエーターにカップリングするか、その鎖を成長させる工程のサイクルの繰り返しを含む。テンプレートなしの酵素合成の一般的な要素は、以下の参考文献に記載されている：Ｙｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ／２０１５／１５９０２３号；Ｙｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ／２０１７／２１６４７２号；Ｈｙｍａｎ，米国特許第５４３６１４３号；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ，米国特許第５７６３５９４号；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）；Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）；Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９）。
【0037】
例えば、固体支持体（１０２０）に結合した、遊離３’－ヒドロキシル基（１０３０）を有するイニシエーターポリヌクレオチド（１０００）を提供する。イニシエーターポリヌクレオチド（１０００）（または延長イニシエーターポリヌクレオチド）の３’末端上への３’－Ｏ保護ｄＮＴＰの酵素的組み込みに有効な条件下（１０４０）で、イニシエーターポリヌクレオチド（１０００）（またはその後のサイクルにおける延長イニシエーターポリヌクレオチド）に、３’－Ｏ保護ｄＮＴＰおよびテンプレートなしのポリメラーゼ，（ＴｄＴまたはそのバリアントなど（例えば、Ｙｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，ＷＯ／２０１７／２１６４７２号；Ｃｈａｍｐｉｏｎ ｅｔ ａｌ，ＷＯ２０１９／１３５００７号））を付加する。この反応により、３’－ヒドロキシルが保護された延長イニシエーターポリヌクレオチド（１０６０）が産生される。延長配列が完全でない場合、別の付加サイクルを実施する（１０８０）。延長イニシエーターポリヌクレオチドが完了した配列を含む場合、３’－Ｏ－保護基を除去（すなわち、脱保護）することができ、所望の配列を、元のイニシエーターポリヌクレオチドから切断することができる（１１００）。かかる切断を、種々の一本鎖切断技術のいずれかを使用して（例えば、元のイニシエーターポリヌクレオチド内の所定の位置への切断可能なヌクレオチドの挿入によって）行うことができる。例示的な切断可能なヌクレオチドは、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチドであり得る。延長イニシエーターポリヌクレオチドが完了された配列を含まない場合、３’－Ｏ－保護基が除去されて遊離３’－ヒドロキシルが露出し（１０３０）、延長イニシエーターポリヌクレオチドがヌクレオチド付加および脱保護の別のサイクルに供される。
【0038】
本明細書中で使用される場合、「イニシエーター」（または「開始断片」、「イニシエーター核酸」、もしくは「イニシエーターオリゴヌクレオチド」などの等価な用語）は、通常、テンプレートなしのポリメラーゼ（ＴｄＴなど）によってさらに延長することができる、遊離３’末端を有する短いオリゴヌクレオチド配列を指す。１つの実施形態では、開始断片はＤＮＡ開始断片である。別の実施形態では、開始断片はＲＮＡ開始断片である。いくつかの実施形態では、開始断片は、３ヌクレオチドと１００ヌクレオチドとの間、特に、３ヌクレオチドと２０ヌクレオチドとの間を含む。いくつかの実施形態では、開始断片は一本鎖である。別の実施形態では、開始断片は二本鎖である。いくつかの実施形態では、イニシエーターは、ＴｄＴが３’－Ｏ保護ｄＮＴＰをカップリングすることができる遊離ヒドロキシルを有する非核酸化合物を含み得る（例えば、Ｂａｉｇａ，米国特許出願公開第２０１９／００７８０６５号および同第２０１９／００７８１２６号）。
【0039】
図１Ａに戻って、いくつかの実施形態では、各合成工程において３’－Ｏ保護ｄＮＴＰの存在下でテンプレートなしのポリメラーゼ（ＴｄＴなど）を用いて、整列したヌクレオチド配列をイニシエーター核酸にカップリングする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを準備する工程；（ｂ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターまたは伸長中間体をテンプレートなしのポリメラーゼと、３’－Ｏ保護ヌクレオシド三リン酸の存在下にて反応させて３’－Ｏ保護伸長中間体を産生する工程；（ｃ）伸長中間体を脱保護して遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を産生する工程；および（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程を含む。（時折、用語「伸長中間体」および「延長断片」は、互換的に使用される）。いくつかの実施形態では、イニシエーターは、例えば、その５’末端が固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとして提供される。また、上記の方法は、反応（すなわち、伸長）工程後、および脱保護工程後に洗浄工程を含み得る。例えば、反応させる工程は、所定のインキュベーション期間（すなわち、反応時間）後に、例えば洗浄によって非組み込みヌクレオシド三リン酸を除去する下位工程を含み得る。かかる所定のインキュベーション期間または反応時間は、数秒間（例えば、３０秒間）から数分間（例えば、３０分間）であり得る。
【0040】
合成支持体上のポリヌクレオチドの配列が逆相補サブシーケンスを含む場合、分子内二次構造または分子交差二次構造を、逆相補領域間の水素結合の形成によって作出することができる。いくつかの実施形態では、環外アミンのための塩基保護部分を、保護された窒素の水素が水素結合に関与できず、それにより、かかる二次構造の形成が防止されるように選択する。すなわち、塩基保護部分を使用して、例えば、ヌクレオシドＡとＴとの間およびＧとＣとの間の通常の塩基対合において形成される水素結合の形成を防止することができる。合成終了時に、塩基保護部分を除去することができ、ポリヌクレオチド産物を、例えば、そのイニシエーターからの切断によって固体支持体から切断することによって固体支持体から切断することができる。
【0041】
塩基が保護されていない３’－ＯブロックｄＮＴＰを、販売者から購入するか、公開された技術（例えば、米国特許第７０５７０２６号；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５（２７）：９１４５－９１５０（２００８）；Ｂｅｎｎｅｒ，米国特許第７５４４７９４号および同第８２１２０２０号；国際特許公開番号ＷＯ２００４／００５６６７号，ＷＯ９１／０６６７８号；Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ（本明細書中で引用）；Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９－４２６７（１９９４）；Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４：３２４８－３２５２（３００６）；米国特許出願公開第２００５／０３７９９１号）を使用して合成することができる。塩基が保護された３’－ＯブロックｄＮＴＰを、下記のように合成することができる。
【0042】
塩基保護されたｄＮＴＰを使用する場合、上記の図１Ａの方法は、（ｅ）塩基保護部分を除去する工程であって、アシルまたはアミジン保護基の場合、（例えば）濃縮アンモニアでの処理を含み得る、除去する工程をさらに含み得る。
【0043】
また、上記の方法は、反応工程（すなわち、伸長工程）後および脱保護工程後のキャッピング工程（複数可）および洗浄工程を含み得る。上記のとおり、いくつかの実施形態では、非伸長遊離３’－ヒドロキシルを、キャッピングされた鎖のいかなるさらなる伸長も防止する化合物と反応させるキャッピング工程が含まれ得る。いくつかの実施形態では、かかる化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する非伸長鎖は、３’－エキソヌクレアーゼ活性（例えば、ＥｘｏＩ）での処理によって分解され得る。例えば、Ｈｙｍａｎ，米国特許第５４３６１４３号を参照のこと。同様に、いくつかの実施形態では、脱ブロックされない鎖は、鎖を除去するか、さらなる伸長に不活性になるように処理され得る。
【0044】
いくつかの実施形態では、伸長工程または延長工程のための反応条件は、以下を含み得る：２．０μＭ 精製ＴｄＴ；１２５～６００μＭ ３’－ＯブロックｄＮＴＰ（例えば、３’－Ｏ－ＮＨ２ブロックｄＮＴＰ）；約１０～約５００ｍＭカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５と７．５との間）、および約０．０１～約１０ｍＭの二価カチオン（例えば、ＣｏＣ１２またはＭｎＣ１２）、ここで、延長反応は、反応体積５０μＬ、室温から４５℃までの範囲内の温度で３分間行い得る。３’－ＯブロックｄＮＴＰが３’－Ｏ－ＮＨ２ブロックｄＮＴＰである実施形態では、脱ブロック工程のための反応条件は、以下を含み得る：７００ｍＭ ＮａＮＯ２；１Ｍ酢酸ナトリウム（酢酸を用いてｐＨ４．８～６．５の範囲に調整）、ここで、脱ブロック反応は、体積５０μＬ、室温から４５℃までの範囲内の温度で３０秒間から数分間行い得る。
【0045】
特定の適用に応じて、脱ブロックおよび／または切断工程は、種々の化学的または物理的条件（例えば、光、熱、ｐＨ、指定の化学結合を切断することができる酵素などの特異的試薬の存在）を含み得る。３’－Ｏ－ブロック基および対応する脱ブロック条件の選択における指針は、以下の参考文献（参考として援用される）に見出され得る：Ｂｅｎｎｅｒ，米国特許第７５４４７９４号および同第８２１２０２０号；米国特許第５８０８０４５号；米国特許第８８０８９８８号；国際特許公開ＷＯ９１／０６６７８号；および以下に引用した参考文献。いくつかの実施形態では、切断剤（時折、脱ブロック試薬または脱ブロック剤とも呼ばれる）は、化学的切断剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）など）である。別の実施形態では、切断剤は、３’リン酸ブロック基を切断し得る酵素切断剤（例えば、ホスファターゼなど）であり得る。脱ブロック剤の選択が使用した３’－ヌクレオチドブロック基のタイプ、１つまたは複数のブロック基が使用されるかどうか、イニシエーターが生きている細胞もしくは生物または固体支持体などに結合されるかどうか（穏やかな処理に必要）に依存することが当業者に理解される。例えば、ホスフィン（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）など）を使用して３’Ｏ－アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して３’Ｏ－アリル基を切断することができ、あるいは、亜硝酸ナトリウムを使用して３’Ｏ－アミノ基を切断することができる。特定の実施形態では、切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体、または亜硝酸ナトリウムを含む。
【0046】
上述の通り、いくつかの実施形態では、直交性の脱ブロック条件を使用して除去され得る２またはそれを超えるブロック基を使用することが望ましい。以下の例示的なブロック基の対を、並行合成実施形態（表１）で使用してよい。他のブロック基の対または２種より多くを含む基が、本発明のこれらの実施形態で用いることができる場合があると理解される。
【表1】
【0047】
生細胞に対するオリゴヌクレオチドを合成するには、穏やかな脱ブロック条件または脱保護条件（細胞膜を破壊せず、タンパク質を変性させず、重要な細胞機能に干渉しない条件など）が必要である。いくつかの実施形態では、脱保護条件は、細胞生存に適合する生理学的条件の範囲内にある。かかる実施形態では、酵素的脱保護は、生理学的条件下で実施され得るので望ましい。いくつかの実施形態では、特異的な酵素的に除去可能なブロック基は、その除去に特異的な酵素に関連する。例えば、エステルまたはアシルベースのブロック基は、アセチルエステラーゼなどのエステラーゼまたは類似の酵素を用いて除去され得、リン酸ブロック基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの３’ホスファターゼを用いて除去され得る。例として、３’－Ｏ－リン酸は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１２、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、および１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの溶液での処理によって除去され得る。反応は、３７℃で１分間進行する。
【0048】
「３’－リン酸ブロック」または「３’－リン酸保護」ヌクレオチドは、３’位のヒドロキシル基がリン酸含有部分の存在によってブロックされているヌクレオチドを指す。本発明の３’－リン酸ブロックヌクレオチドの例は、ヌクレオチジル－３’－リン酸モノエステル／ヌクレオチジル－２’，３’－環状ホスファート、ヌクレオチジル（ｎｕｃｌｃｏｔｉｄｙｌ）－２’－リン酸モノエステルおよびヌクレオチジル－２’または３’－アルキルリン酸ジエステル、ならびにヌクレオチジル－２’または３’－ピロホスファートである。置換がホスファターゼによって遊離３’－ＯＨを生じる脱リン酸化を阻止しない場合、チオホスファートまたはかかる化合物の他のアナログも使用することができる。
【0049】
３’－Ｏ－エステル保護ｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－リン酸保護ｄＮＴＰの合成および酵素的脱保護のさらなる例は、以下の参考文献に記載されている：Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：１０８５９－１０８６３（１９９５）；Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１４８：１－６（１９９４）；Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６（２３）：５１２０－５１２６（１９７７）；Ｒａｓｏｌｏｎｊａｔｏｖｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８（４＆５）：１０２１－１０２２（１９９９）；Ｆｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆｕｒ Ｃｈｅｍｉｅ，１３１：５８５－６１６（２０００）；Ｔａｕｎｔｏｎ－Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３８（５）：９７７－９８５（１９７３）；Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３０（２９）：３８１９－３８２０（１９８９）；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２（５）：９３６－９５０（１９６７）；Ｔｓｉｅｎ，国際特許公開ＷＯ１９９１／００６６７８号。
【0050】
いくつかの実施形態では、改変ヌクレオチドは、プリン塩基またはピリミジン塩基および３’炭素原子が構造：
－Ｏ－Ｚ
の基に結合しているように、除去可能な３’－ＯＨブロック基が共有結合で付着したリボース糖部分またはデオキシリボース糖部分を含む改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、ここで、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｏ－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’’）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’、および－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆのうちのいずれかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるかまたはその一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、もしくはアミド基、または連結基を介して結合した検出可能な標識であり；但し、いくつかの実施形態では、かかる置換基は、１０個までの炭素原子および／または５個までの酸素もしくは窒素ヘテロ原子を有し；あるいは、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２の基を示し、ここで、各Ｒ’’’は、同一でも異なっていてもよく、水素原子およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、但し、いくつかの実施形態では、各Ｒ’’’のアルキルは、１～３個の炭素原子を有し；分子が反応して中間体を生成してよく、各Ｒ’’はＨと交換されるか、Ｚは－（Ｒ’）２－Ｆであり、ＦはＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換され、水性条件下で中間体が解離して遊離３’－ＯＨを有する分子が得られ；但し、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’である場合、両方のＲ’基がＨというわけではない。ある特定の実施形態では、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換アルキルであり、但し、かかるアルキルまたは置換アルキルは、１～１０個の炭素原子および０～４個の酸素または窒素ヘテロ原子を有する。ある特定の実施形態では、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｚはアジドメチル基である。
－Ｏ－Ｚ
の基に結合しているように、除去可能な３’－ＯＨブロック基が共有結合で付着したリボース糖部分またはデオキシリボース糖部分を含む改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、ここで、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｏ－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’’）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’、および－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆのうちのいずれかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるかまたはその一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、もしくはアミド基、または連結基を介して結合した検出可能な標識であり；但し、いくつかの実施形態では、かかる置換基は、１０個までの炭素原子および／または５個までの酸素もしくは窒素ヘテロ原子を有し；あるいは、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２の基を示し、ここで、各Ｒ’’’は、同一でも異なっていてもよく、水素原子およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、但し、いくつかの実施形態では、各Ｒ’’’のアルキルは、１～３個の炭素原子を有し；分子が反応して中間体を生成してよく、各Ｒ’’はＨと交換されるか、Ｚは－（Ｒ’）２－Ｆであり、ＦはＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換され、水性条件下で中間体が解離して遊離３’－ＯＨを有する分子が得られ；但し、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’である場合、両方のＲ’基がＨというわけではない。ある特定の実施形態では、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換アルキルであり、但し、かかるアルキルまたは置換アルキルは、１～１０個の炭素原子および０～４個の酸素または窒素ヘテロ原子を有する。ある特定の実施形態では、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｚはアジドメチル基である。
【0051】
いくつかの実施形態では、Ｚは、分子量が２００またはそれ未満のヘテロ原子を有するか有さない切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、分子量が１００またはそれ未満のヘテロ原子を有するか有さない切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、分子量が５０またはそれ未満のヘテロ原子を有するか有さない切断可能な有機部分である。いくつかの実施形態では、Ｚは、分子量が２００またはそれ未満のヘテロ原子を有するか有さない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、分子量が１００またはそれ未満のヘテロ原子を有するか有さない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、分子量が５０またはそれ未満のヘテロ原子を有するか有さない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、分子量が２００またはそれ未満の酵素的に切断可能なエステル基である。他の実施形態では、Ｚは、３’－ホスファターゼによって除去可能なリン酸基である。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える以下の３’－ホスファターゼを、製造者の推奨するプロトコールを用いて使用することができる：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔牛腸アルカリホスファターゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能）。
【0052】
さらなる実施形態では、３’ブロックされたヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル基、３’－Ｏ－ＮＨ２基、または３’－Ｏ－アリル基のいずれかによってブロックされる。
【0053】
さらに他の実施形態では、本発明の３’－Ｏ－ブロック基には、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、および３’－Ｏ－プロパルギルが含まれる。
【0054】
いくつかの実施形態では、３’－Ｏ－保護基は、電気化学的に不安定な基である。すなわち、保護基の脱保護または切断を、切断されるように保護基付近の電気化学的状態を変化させることによって行う。物理量（補助種を活性化するための電圧差または光など）を変化させるか印加し、それにより、保護基の部位の電気化学的状態を変化させる（ｐＨの上昇または低下など）ことによってかかる電気化学的状態の変化が生じ得る。いくつかの実施形態では、電気化学的に不安定な基には、例えば、ｐＨが所定の値に変化したときはいつでも切断されるｐＨ感受性保護基が含まれる。他の実施形態では、電気化学的に不安定な基には、例えば、保護基の部位の電圧差の増加または減少によって還元条件または酸化条件が変化したときはいつでも直接切断される保護基が含まれる。
【0055】
いくつかの実施形態では、酵素合成法は、３’－Ｏ－改変ヌクレオシド三リン酸に関する組み込み活性が増加するＴｄＴバリアントを使用する。例えば、かかるＴｄＴバリアントは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第１０４３５６７６号（本明細書中で参考として援用される）に記載の技術を使用して産生され得る。いくつかの実施形態では、ＴｄＴバリアントであって、配列番号２と少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有し、２０７位の第１のアルギニンおよび３２５位の第２のアルギニン、またはその機能的に等価な残基が置換されているＴｄＴバリアントを使用する。いくつかの実施形態では、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントであって、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を有し、配列番号２、３、４、６、７、９、１２、および１３に関する２０７位、配列番号５に関する２０６位、配列番号８および１０に関する２０８位、配列番号１１に関する２０５位、配列番号１４に関する２１６位、および配列番号１５に関する２１０位のアルギニン（「第１のアルギニン」）；ならびに配列番号２、９、および１３に関する３２５位、配列番号３および４に関する３２４位、配列番号３２０に関する３２０位、配列番号６および８に関する３３１位、配列番号１１に関する３２３位、配列番号１２および１５に関する３２８位、ならびに配列番号１４に関する３３８位のアルギニン（「第２のアルギニン」）；またはその機能的に等価な残基が置換されており；ここで、前記ＴｄＴバリアントが、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－改変ヌクレオチドを核酸断片の遊離３’－ヒドロキシル上に組み込むことができる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントを使用する。いくつかの実施形態では、上記同一性パーセント値は、示した配列番号と少なくとも８０パーセント同一であり；いくつかの実施形態では、上記同一性パーセント値は、示した配列番号と少なくとも９０パーセント同一であり；いくつかの実施形態では、上記同一性パーセント値は、示した配列番号と少なくとも９５パーセント同一であり；いくつかの実施形態では、上記同一性パーセント値は、少なくとも９７パーセント同一であり；いくつかの実施形態では、上記同一性パーセント値は、少なくとも９８パーセント同一であり；いくつかの実施形態では、上記同一性パーセント値は、少なくとも９９パーセント同一である。本明細書中で使用される場合、参照配列をバリアント配列と比較するために使用される同一性パーセント値は、バリアント配列の置換を含む明確に指定されたアミノ酸の位置を含まない；すなわち、同一性パーセントの関係は、参照タンパク質の配列と、バリアント中の置換を含む明確に指定された位置を除外したバリアントタンパク質の配列との間にある。したがって、例えば、参照配列およびバリアント配列の各々が１００個のアミノ酸を含み、かつバリアント配列が２５位および８１位に変異を有する場合、相同率は、１～２４位、２６～８０位、および８２～１００位の配列に関する。
【0056】
（ｉｉ）に関して、かかる３’－Ｏ－改変ヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、または３’－Ｏ－プロパルギル－ヌクレオシド三リン酸を含み得る。
【0057】
いくつかの実施形態では、上記のＴｄＴバリアントは、表２に示すように、第１および第２のアルギニンに置換を有する。
【表2】
【0058】
いくつかの実施形態では、本発明の方法と共に使用するためのさらなるＴｄＴバリアントは、表１に示すように、メチオニン、システイン、またはグルタミン酸のさらなる置換のうちの１つまたは複数を含む。
【0059】
本発明の方法で使用され得るさらに特異的なＴｄＴバリアントを、表３に示す。表２のＴｄＴバリアントＤＳ１００１からＤＳ１０１８の各々は、配列番号２と少なくとも６０パーセント同一のアミノ酸配列を含み、示した位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、ＤＳ１００１からＤＳ１０１８のＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも８０パーセント同一のアミノ酸配列を含み、示した位置に置換を含み；いくつかの実施形態では、ＤＳ１００１からＤＳ１０１８のＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも９０パーセント同一のアミノ酸配列を含み、示した位置に置換を含み；いくつかの実施形態では、ＤＳ１００１からＤＳ１０１８のＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも９５パーセント同一のアミノ酸配列を含み、示した位置に置換を含み；いくつかの実施形態では、ＤＳ１００１からＤＳ１０１８のＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも９７パーセント同一のアミノ酸配列を含み、示した位置に置換を含み；いくつかの実施形態では、ＤＳ１００１からＤＳ１０１８のＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも９８パーセント同一のアミノ酸配列を含み、示した位置に置換を含み；いくつかの実施形態では、ＤＳ１００１からＤＳ１０１８のＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも９９パーセント同一のアミノ酸配列を含み、示した位置に置換を含む。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【0060】
上記の本発明のＴｄＴバリアントは、各々、指定の配列番号と、示した置換の存在に応じた配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列の数および型は、この様式で記載の本発明のＴｄＴバリアントの間で異なり、指定の配列番号は、置換、欠失、および／または挿入に起因し得、欠失、置換、および／または挿入されたアミノ酸は、任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる置換、欠失、および／または挿入は、天然に存在するアミノ酸のみを含む。いくつかの実施形態では、置換は、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８５：８６２－８６４（１９７４）に記載のように、保存的な（すなわち、同義の）アミノ酸の変化のみを含む。すなわち、同義アミノ酸セットのメンバー間のみでアミノ酸を置換することができる。いくつかの実施形態では、使用され得る同義アミノ酸のセットを、表４Ａに示す。
いくつかの実施形態では、使用され得る同義アミノ酸のセットを、表４Ｂに記載する。
【表4A】
【表4B】
【0061】
生体分子上のオリゴヌクレオチドの合成
本発明にしたがってオリゴヌクレオチドが合成され得る生体分子には、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、グリカン、およびポリサッカリドなどが含まれるが、これらに限定されない。イニシエーターを結合することができる実質的に任意の生体分子または他の材料は、本発明の方法によって前記生体分子または他の材料上に合成されたオリゴヌクレオチドを有することができる。上述の通り、ｃＤＮＡまたはゲノム断片などのポリヌクレオチドについて、種々の異なるイニシエーター結合スキームを利用可能であり、前記スキームには、イニシエーターと生体分子または表面との間に共有結合が得られるスキームならびにイニシエーターと生体分子または表面との間に非共有結合が得られるスキーム（イニシエーターと表面もしくは生体分子に結合した別の相補オリゴヌクレオチドとの間の二重鎖の形成、または捕捉部分とその相補部分との間（ビオチンとストレプトアビジンとの間など）の複合体の形成など）が含まれる。
本発明にしたがってオリゴヌクレオチドが合成され得る生体分子には、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、グリカン、およびポリサッカリドなどが含まれるが、これらに限定されない。イニシエーターを結合することができる実質的に任意の生体分子または他の材料は、本発明の方法によって前記生体分子または他の材料上に合成されたオリゴヌクレオチドを有することができる。上述の通り、ｃＤＮＡまたはゲノム断片などのポリヌクレオチドについて、種々の異なるイニシエーター結合スキームを利用可能であり、前記スキームには、イニシエーターと生体分子または表面との間に共有結合が得られるスキームならびにイニシエーターと生体分子または表面との間に非共有結合が得られるスキーム（イニシエーターと表面もしくは生体分子に結合した別の相補オリゴヌクレオチドとの間の二重鎖の形成、または捕捉部分とその相補部分との間（ビオチンとストレプトアビジンとの間など）の複合体の形成など）が含まれる。
【0062】
オリゴヌクレオチドがそれに対して合成されているポリヌクレオチドは、種々の方法で固体支持体から引き離され得る。捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したイニシエーターは、簡単に融解され得るか、捕捉オリゴヌクレオチドから脱ハイブリッド形成され得るか、二重鎖は、制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼの認識部位を含むようにデザインされ得る。イニシエーターが表面に共有結合で付着される実施形態では、一本鎖を切断するためのいくつかの技術（例えば、イニシエーター中の所定の位置へのウラシルの挿入、Ｄｅｌｏｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：３１９－３３５（１９８５））が利用可能である。
【0063】
オリゴヌクレオチドイニシエーターは、以下の参考文献に記載の技術などの周知の技術を使用して、抗体などのタンパク質に結合され得る：Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（上記で引用）；Ｂａｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４（４３）：１６７９３－１６７９７（２００７）；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：２１７－２２５（２０１６）；Ｈｏｒｉｓａｗａ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５：１－６（２０１４）；Ｊｅｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，３９（４）：１２７２－１２７９（２０１０）；および米国特許第５６６５５３９号など。
【0064】
イニシエーターが結合されたら、イニシエーターを伸長するための酵素合成が行われ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質を、合成前に固体支持体に可逆的に結合させる。ポリヌクレオチドと同様に、かかる結合は、共有結合または非共有結合であり得る。タンパク質が組換えタンパク質である場合、ポリ－ヒスチジンタグなどのペプチドタグまたは類似の方法によって結合し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、固体支持体に結合した抗体への捕捉および結合によって固体支持体上に固定され得る。
【0065】
生体細胞上のオリゴヌクレオチドの合成
単一細胞の測定の価値は、本来ならばアンサンブル測定から検出不可能であり、多数の細胞由来の細胞パラメーターの平均のみが提供される稀な亜集団の評価において長きにわたって十分に理解されてきた（例えば、Ｄｉ Ｃａｒｌｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８５３：１－９（２０１２））。結果として、例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：６１８－６３０（２０１３）で概説されているハイスループット単一細胞解析のための一連のテクノロジーが開発されている。これらのテクノロジーの多くに共通するアプローチは、分析のために集団の細胞を小さな反応体積へと確率的に分布させることによる単一細胞含有リアクターの形成を含んでいる。かかる確率的方法では「バルク」混合物中で細胞を取り扱うことが可能であるが、前記方法は、最終的に小体積なる細胞の数を限定的に制御することのみが可能であり（例えば、Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，ＬａｂＣｈｉｐ，８：１１１０－１１１５（２００８））、その結果、典型的には、出発集団中の細胞の濃度が高いほど、２またはそれを超える細胞を含むに至る小体積の数が多くなる。単一細胞解析の成功は、各反応体積中に１個の細胞のみを有することに依存するため、細胞重複の発生が回避されるように出発集団の非常に低い細胞濃度が選択される。不運なことに、これは、かかる確率的単離工程の下流で行われる解析に重大な非効率性が生じる。この問題は、細胞を保有する液滴を、バーコード付きビーズ（これらも液滴中に確率的に分布する）を保有する液滴と合体させることによって細胞特異的バーコードが細胞に送達される場合に悪化する。したがって、細胞上に固有のバーコードを直接合成する技術が利用できると、単一のビーズを単一細胞に送達させる必要性がなくなるであろう。
単一細胞の測定の価値は、本来ならばアンサンブル測定から検出不可能であり、多数の細胞由来の細胞パラメーターの平均のみが提供される稀な亜集団の評価において長きにわたって十分に理解されてきた（例えば、Ｄｉ Ｃａｒｌｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８５３：１－９（２０１２））。結果として、例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：６１８－６３０（２０１３）で概説されているハイスループット単一細胞解析のための一連のテクノロジーが開発されている。これらのテクノロジーの多くに共通するアプローチは、分析のために集団の細胞を小さな反応体積へと確率的に分布させることによる単一細胞含有リアクターの形成を含んでいる。かかる確率的方法では「バルク」混合物中で細胞を取り扱うことが可能であるが、前記方法は、最終的に小体積なる細胞の数を限定的に制御することのみが可能であり（例えば、Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，ＬａｂＣｈｉｐ，８：１１１０－１１１５（２００８））、その結果、典型的には、出発集団中の細胞の濃度が高いほど、２またはそれを超える細胞を含むに至る小体積の数が多くなる。単一細胞解析の成功は、各反応体積中に１個の細胞のみを有することに依存するため、細胞重複の発生が回避されるように出発集団の非常に低い細胞濃度が選択される。不運なことに、これは、かかる確率的単離工程の下流で行われる解析に重大な非効率性が生じる。この問題は、細胞を保有する液滴を、バーコード付きビーズ（これらも液滴中に確率的に分布する）を保有する液滴と合体させることによって細胞特異的バーコードが細胞に送達される場合に悪化する。したがって、細胞上に固有のバーコードを直接合成する技術が利用できると、単一のビーズを単一細胞に送達させる必要性がなくなるであろう。
【0066】
本発明の方法は、広範な生体細胞（哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、原生動物細胞、真菌細胞、および植物細胞などが含まれるが、これらに限定されない）に適用され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、哺乳動物細胞に適用される。かかる哺乳動物細胞は、組織を含まない場合があり（例えば、白血球）、あるいは、かかる細胞は、脱凝集されている組織結合細胞であり得る。生細胞上でのオリゴヌクレオチドの合成中に、反応条件は、細胞を生きている状態に維持するように選択される。かかる条件（時折、本明細書中で「生物学的条件」または「生存可能条件」または「細胞生存可能条件」と呼ばれる）は、細胞膜全体の浸透圧の平衡を保つことが可能な生理的塩類溶液を含み、ｐＨ６．８～７．８の範囲のｐＨ、および１５℃～４１℃の範囲の温度の反応混合物中に細胞を配置し、維持することを含む。いくつかの実施形態では、２５℃～３８℃の範囲の温度を使用する。生理的塩類溶液は、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、および／またはカリウムイオンを、水性溶媒中に０．８～１．０パーセント（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で含み得る。例えば、０．９パーセント（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムを含む蒸留水は、一般的な生理的塩類溶液である。かかる生理学的条件は平均であり、本発明の特定の実施において、例えば、脱保護工程において細胞または生体分子に大きな悪影響を及ぼさずにかかる条件から少し逸脱し得ると理解される。同様に、上記の条件の範囲外の条件で生存可能であり得る生体細胞（例えば、好熱性生物）もあると理解される。
【0067】
細胞へのイニシエーターの結合。固有の細胞標識を生成するための第１の工程は、標的集団の細胞にイニシエーターを結合させることである。種々の従来技術（１またはそれを超える細胞表面マーカーに特異的な抗体へのイニシエーターの結合、細胞表面マーカーに特異的なアプタマーへのイニシエーターの取り込み、細胞表面タンパク質にイニシエーターを直接結合させるためのクリック化学技術の使用、標的細胞の膜に挿入する５’親油性テールを有するイニシエーターの生成が含まれるが、これらに限定されない）を使用してこれを行う。かかる標識技術の例は、以下の参考文献に記載されている：Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１５：４６２１－４６２６（２０１４）；Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３７（４）：ｅ２８（２００９）；Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１２０－１２２（１９９２）；Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９（１０）：３７３１－３７３６（２０１２）；Ｎｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１０：７８０－７９１（２０１５）；Ｂａｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４（４３）：１６７９３－１６７９７（２００７）；Ｊｅｗｉｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，３９（４）：１２７２－１２７９（２０１０）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，８：２１０７（２０１７）。
【0068】
細胞の「分割および混合」バーコード付け。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞（生細胞、固定された細胞、または固定および透過処理した細胞のいずれか）を固有にバーコード付けするための方法を提供する。例えば、生物学的効果（遺伝子発現の変化など）についての化合物の試験またはスクリーニングにおいて、細胞集団は、異なる作用物質または化合物に曝露されている。かかる細胞の試料は、生存中に、例えば、細胞表面分子の遺伝子発現の変化について試験され得るか、かかる細胞を固定および透過処理し、細胞のタンパク質およびｍＲＮＡの両方の発現の変化について試験され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は、本発明の酵素合成法を使用して伸長され得る個別のイニシエーターに各々が連結された１またはそれを超えるタンパク質特異的抗体を使用してモニタリングされ得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現は、図１Ｂ～１Ｃに記載のように伸長され得るｃＤＮＡを生成するためのｍＲＮＡ特異的プライマーを使用してモニタリングされ得る。バーコードの合成後（試験前または試験後にかかわらず）、バーコードは、例えば、抗体によって運ばれるバーコードについて図２Ｂに示すように増幅、単離、および配列決定することによって採取および表示され得る。かかる測定は、例えば、Ｎｏｌａｎ，米国特許出願公開第２０１６／０２５１６９７号に記載のバーコードサブユニットのハイブリッド形成に基づくより手間がかかるバーコード付けスキームに類似している。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、大きな細胞集団のうちの単一細胞上の複数のエピトープの分布を測定するために使用され得る。
【0069】
上記のビーズの場合の固有の細胞タグの付加に類似して、本発明は、また、図１Ｆに示すように、平面表面上に配置された組織スライスにおける遺伝子発現の空間パターンの場合に固有の位置タグを結合させるために使用され得る。オリゴヌクレオチドの平面アレイ上の組織スライスの配置、組織のフィーチャ（細胞の境界など）の同定および画像化、組織の細胞の透過処理、平面アレイに結合したｃＤＮＡライブラリーを産生するための逆転写酵素反応の実施のための手順は、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５３：７８－８２（２０１６）；およびＦｒｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第９５９３３６５号および同第１００３０２６１号；ならびに類似の参考文献（本明細書中で参考として援用される）に開示されている。簡潔に述べれば、図１Ｆを参照すると、密度が制御された５’末端で結合するオリゴヌクレオチド（１８０）で均一にコーティングされた平面アレイ（１６４）を提供し、ここで、前記オリゴヌクレオチド（拡大図（１６５）中に示す）は、その後にｃＤＮＡを増幅および操作するためのセグメント（１６６）（プライマー結合部位など）、増幅後でさえもｃＤＮＡ分子の定量を容易にする分子タグ（時折、「固有の分子識別子」またはＵＭＩと呼ばれる）を含む必要に応じたセグメント（１６７）、ならびに細胞から放出されたｍＲＮＡを捕捉可能なセグメント（１６８）（ｐｏｌｙＴセグメントなど）を含む。ＵＭＩ（１６７）は、ランダムヌクレオチドセグメントを含み得る。オリゴヌクレオチド（１８０）は、従来技術を使用して大量に作製され、単一工程で平面アレイ（１６４）の表面に適用され得る。異なる種類のオリゴヌクレオチド（例えば、異なる位置タグを有するオリゴヌクレオチド）は必要ない。また、セグメント（１６７）は、配列決定などによる解析のためのｃＤＮＡを放出させるための切断可能なリンカーまたは切断可能なヌクレオチドを含み得る。アレイ（１６４）上に組織のスライスまたは薄層（１８１）（例えば、厚さ１００～１０００μｍ）を配置し、次いで、（ｉ）目的のフィーチャ（細胞または組織片（sub-tissue）など）を同定し、かかる情報を平面アレイ（１６４）上の位置に記録および／または相関させるため、および（ｉｉ）ｍＲＮＡが放出され、オリゴヌクレオチド（１８０）に拡散されて、オリゴヌクレオチドによって捕捉されるように、組織中の細胞が透過処理されるように処理する（１６９）。画像情報は、アレイ（１６４）の中のｃＤＮＡ上で共通の位置タグが合成される該アレイにおける領域を定義するために使用される。処置は、組織特異的または生体分子特異的な化合物または色素を用いた染色を含み得る。位置タグにより、ｃＤＮＡを大量に採取および配列決定されるが、依然としてその位置タグによって特定の領域に関連付けることが可能である。上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の後に、空間的ｃＤＮＡライブラリーアレイを産生するためのテンプレートとして捕捉されたｍＲＮＡ（１７０）を使用してｃＤＮＡ（１７１）を合成するために逆転写酵素反応のための試薬を適用する。次いで、組織スライス（１８１）を除去してその表面に異なるｃＤＮＡのパターンが結合したアレイ（１６４）を残す。異なる位置にある異なるｃＤＮＡは、タグについての合成試薬のインクジェット送達によって複数の場所由来のｃＤＮＡの試料に位置タグを結合させることによって同定および定量され得、これは、ｃＤＮＡパターン（１７５）上に合成場所（１８２）を重ね合わせることによって図１Ｅに示される。いくつかの実施形態では、かかる複数とは、少なくとも１００個の位置、または少なくとも１０００個の位置、または少なくとも１０，０００個の位置であり得る；他の実施形態では、かかる複数とは、１０～５０，０００個の範囲の位置；または１０～１０，０００個の範囲の位置；または１０～１０００個の範囲の位置であり得る。インクジェット送達系のデザインおよび制御について指針は当業者に周知であり、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１７０６９８号および米国特許第６３０６５９９号；同第６３２３０４３号；同第７２７６３３６号；同第７５３４５６１号；ならびに類似の参考文献に見出され得る。あるいは、電極アレイを使用することができ、ここで、合成工程（電気化学的感受性保護基（例えば、３’－Ｏ－アジドメチル）の脱保護など）をアレイ内の電極の電位を変更することによって行うことができる（例えば、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，米国特許第６０９３３０２号，同第６４４４１１１号，および同第６２８０５９５号；Ｇｉｎｄｉｌｉｓ，米国特許第９３３９７８２号；Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第９２６７２１３号；Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏｓＯｎｅ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００６，ｉｓｓｕｅ １，ｅ３４；Ｆｏｍｉｎａ ｅｔ ａｌ，ＬａｂＣｈｉｐ，１６：２２３６－２２４４（２０１６）；Ｋａｖｕｓｉ ｅｔ ａｌ，米国特許第９０７５０４１号；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第９８７４５３８号および同第９９１０００８号；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第６２５１５９５号；およびＬｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ，ＩＥＥＥ Ｊ．Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ，４３：１８５９－１８７１（２００８）など）。
【0070】
位置タグ（１７３）は、各々の目的の場所または領域を固有に同定するために（例えば、十分な長さで）選択される。さらなるセグメント（１７４）は、ｃＤＮＡ（１７１）の操作および配列決定を容易にするために付加され得る。いくつかの実施形態では、本発明のこの適用は、以下の工程を用いて実施され得る：（ａ）各々が捕捉セグメントを含む捕捉プローブの均一なコーティングを含むアレイを準備する工程；（ｂ）組織試料をアレイと接触させ、組織試料の核酸を、前記核酸が捕捉されるように捕捉プローブの捕捉ドメインと相互作用させる工程；（ｃ）組織試料の異なる領域を同定するために組織試料を処理する工程；（ｄ）捕捉ドメインと相互作用する核酸から核酸分子を生成する工程；（ｅ）核酸分子上に位置タグを酵素的に合成する工程；（ｆ）捕捉ドメインと相互作用する核酸に関連する領域を決定する工程；および（ｅ）決定された領域をｃＤＮＡと相関させる工程。いくつかの実施形態では、組織試料由来の核酸分子は、ＲＮＡである。他の実施形態では、組織試料由来の核酸分子は、ゲノムＤＮＡであり得る。他の実施形態では、組織試料由来の核酸分子は、ｍＲＮＡであり得る。
【0071】
同様に、図１Ｇに示すように、組織試料中のタンパク質の空間分布は、ｐｏｌｙＡ領域および抗体同定領域を含む放出可能なオリゴヌクレオチドバーコードを有する抗体（すなわち、抗体が特異性を示すタンパク質を同定する抗体バーコード）を使用して同定され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の２つのタグを保有し得る；上記の抗体バーコードならびに、組織の光学的解析およびその後に抗体の位置と組織の構造または目的のタンパク質の分布との相関を補助する蛍光標識。上記のように、５’末端で結合するオリゴヌクレオチド（１１８０）で均一にコーティングされた平面アレイ（１１６４）を提供し、ここで、前記オリゴヌクレオチド（拡大図（１１６５）中に示す）は、必要に応じて、その後に抗体バーコードを増幅および操作するためのセグメント（１１６６）（プライマー結合部位など）、増幅後でさえも抗体分子の定量を容易にする分子タグ（時折、「固有の分子識別子」またはＵＭＩと呼ばれる）を含む必要に応じたセグメント（１１６７）、ならびに結合した抗体から放出された抗体バーコード（１１８３）（配列番号１８）を捕捉可能なセグメント（１１６８）（ｐｏｌｙＴセグメントなど）を含む。リンカー内の抗体バーコードと抗体との間の化学的に不安定な結合（ジスルフィド部分など）によって放出され得る。ＵＭＩ（１１６７）は、ランダムヌクレオチドセグメントを含み得る。オリゴヌクレオチドはその後に本発明の方法を使用して合成されるので、異なる種類のオリゴヌクレオチド（例えば、異なる位置タグを有するオリゴヌクレオチド）は必要ない。また、セグメント（１１６４）は、配列決定などによる解析のための抗体バーコードを放出させるための切断可能なリンカーまたは切断可能なヌクレオチドを含み得る。アレイ（１１６４）上に組織のスライスまたは薄層（１１８１）（例えば、厚さ１００～１０００μｍ）を配置し、次いで、（ｉ）目的のフィーチャ（細胞または組織片など）を同定し、かかる情報を平面アレイ（１１６４）上の場所に記録および／または相関させるため、および（ｉｉ）抗体が標的タンパク質に接近することができ、放出された抗体バーコードがオリゴヌクレオチド（１１８０）に拡散し、該オリゴヌクレオチドによって捕捉され得るように、組織中の細胞が透過処理されるように（to permeablized cells in the tissue）処理する（１１６９）。画像情報は、アレイ（１１６４）の中の抗体バーコード上で共通の位置タグが合成された該アレイにおける領域を定義するために使用される。上記のように、位置タグにより、抗体バーコードが大量に採取および配列決定されるが、依然としてその位置タグによって特定の領域に関連付けることが可能である。上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の後に、テンプレートとして捕捉された抗体バーコード（１１７０）を使用して、上記のｍＲＮＡと全く同じように抗体バーコードの相補物（１１７１）を合成するために逆転写酵素反応のための試薬を適用する。次いで、組織スライス（１１８１）を除去してその表面に異なるｃＤＮＡのパターンが結合したアレイ（１１６４）を残す。異なる位置にある異なるｃＤＮＡは、位置タグのための合成試薬のインクジェット送達によって規則的な場所由来の抗体バーコードの試料に位置タグを結合させることによって同定および定量され得る。ｃＤＮＡと同様に、抗体バーコード上の位置タグ（１１７３）は、各々の目的の場所または領域を固有に同定するために（例えば、十分な長さで）選択される。
【0072】
同様に、図１Ｈに示すように、組織スライスにおける遺伝子発現の空間パターンおよびタンパク質の分布は、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡが標識された抗体と識別子（すなわち、抗体が特異性を示すタンパク質を同定する抗体特異的ＤＮＡ配列）との組み合わせを含む平面アレイを使用して同定され得る。簡潔に述べれば、図１Ｈを参照すると、５’末端で結合するオリゴヌクレオチド（３１８０）で均一にコーティングされ、抗体（３１９１）の１またはそれを超えるアミノ酸に結合し得るＤＮＡ標識（３１９０）を含む抗体（３１９１）で均一にコーティングされた平面アレイ（３１６４）を提供する。平面アレイ（３１６４）上の各種類のオリゴヌクレオチド（３１８０）および抗体（３１９１）の密度は、オリゴヌクレオチドの密度が予め決定され、各種類の抗体（すなわち、異なる特異性を有する抗体）の密度が予め決定されるように制御される。上記のように、オリゴヌクレオチド（３１８０）（拡大図（３１６５）中に示す）は、その後にｃＤＮＡを増幅および操作するためのセグメント（３１６６）（プライマー結合部位など）、増幅後でさえもｃＤＮＡ分子の定量を容易にする分子タグ（時折、「固有の分子識別子」またはＵＭＩと呼ばれる）を含む必要に応じたセグメント（３１６７）、ならびに細胞から放出されたｍＲＮＡを捕捉可能なセグメント（３１６８）（ｐｏｌｙＴセグメントなど）を含む。ＵＭＩ（３１６７）は、ランダムヌクレオチドセグメントを含み得る。抗体（３１９１）（拡大図（３１６５）中に示す）は、ＤＮＡ標識（３１９０）（抗体の１またはそれを超えるアミノ酸に結合した）および抗体が特異性を示すタンパク質を同定する配列識別子を含むセグメント（３１９２）を含む。アレイ（３１６４）上に組織のスライスまたは薄層（３１８１）（例えば、厚さ１００～１０００μｍ）を配置し、次いで、（ｉ）目的のフィーチャ（細胞または組織片など）を同定し、かかる情報を平面アレイ（３１６４）上の位置に記録および／または相関させるため、および（ｉｉ）ｍＲＮＡおよびタンパク質が放出され、オリゴヌクレオチドおよび抗体（それぞれ、３１８０および３１９１）に拡散されて、これらによって捕捉されるように、組織中の細胞が透過処理されるように処理する（３１６９）。画像情報は、アレイ（３１６４）の中のｃＤＮＡまたは抗体ＤＮＡ上で共通の位置タグが合成された該アレイにおける領域を定義するために使用され得る。処置は、組織特異的または生体分子特異的な化合物または色素を用いた染色を含み得る。位置タグにより、ｃＤＮＡおよび抗体に結合したＤＮＡが大量に採取および配列決定されるが、依然としてその位置タグによって組織の特定の領域に関連付けることが可能である。上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の後に、テンプレートとして捕捉されたｍＲＮＡ（３１７０）を使用してｃＤＮＡ（３１７１）を合成するために逆転写酵素反応のための試薬を適用する。捕捉サンドイッチ（サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイと同様）を形成するために、固定された抗体（３１９２）と同一の分子（３１９３）に結合する二次抗体（３１９７）をアレイに適用する。二次抗体（３１９７）は、１またはそれを超えるアミノ酸に結合したＤＮＡ標識（３１９４）、および抗体が特異性を示すタンパク質を同定する配列識別子を含むセグメント（３１９５）を含む。固定された抗体（３１９１）の識別子セグメント（３１９２）および二次抗体の識別子セグメント（３１９５）は、同一でも異なっていてもよいが、同一のタンパク質（３１９３）を認識する抗体対に会合して、これを認識する。さらに、ポリメラーゼ延長工程中にＤＮＡ抗体鎖（３１９６）を合成するために、固定された抗体のＤＮＡ標識（３１９０）および二次抗体のＤＮＡ標識（３１９４）の３’領域は相補的である。次いで、組織スライス（３１８１）を除去してその表面に異なるｃＤＮＡおよび抗体ＤＮＡのパターンが結合したアレイ（３１６４）を残す。異なる位置にある異なるｃＤＮＡおよび抗体ＤＮＡは、合成試薬のインクジェット送達によって規則的な場所由来のｃＤＮＡおよび抗体ＤＮＡの試料に位置タグ（３１７３）および操作セグメント（３１７４）を結合させることによって同定および定量され得る。
【0073】
図１Ｉは、特に関心のあるアレイ（１６４）の特定の表面領域（すなわち、小領域）に注目した解析のための実施形態を示す。図１Ｆによって記載した手順にしたがった後に、初回の配列決定解析（４１６９）により、目的の特定の表面領域（４１７２）にはより高い空間的配列決定解像度が必要であることが明らかであり得る。同一のアレイを使用したが、オフセットピッチを有する合成試薬の２回目のインクジェット送達（４１７０）を使用して、最初の合成場所（４１８２）によってタグ化されないままの領域内にさらなる合成場所（４１８３）を生成する。このさらなるタグ化工程中に、最初の位置タグ（４１７３）と比較して、異なる位置タグ（４１７５）が合成される。ＤＮＡの操作および配列決定を容易にするために、さらなるセグメント（４１７４および４１７６）が付加され得る。興味深いことに、次の回の同一のアレイ上の合成試薬のインクジェット送達（４１７１）を、配列決定の空間的解像度を増大させることによって解析をさらに洗練させるために繰り返すことができる。さらに、この焦点解析法を、オリゴヌクレオチドアレイ（図１Ｆ）またはオリゴヌクレオチドおよび抗体アレイ（図１Ｈ）のいずれかまたは両方に十分に等しく適用することができる。
【0074】
図１Ｆ～１Ｉは固体表面に結合した捕捉オリゴヌクレオチドアレイを使用する必要があるが、本発明の方法は、目的の分析物（例えば、ｍＲＮＡまたは抗体バーコード）を、アレイに結合した捕捉プローブに分散させて捕捉する必要がなく、組織上に直接合成することが可能である。いくつかの実施形態では、事前の透過処理を行うか行わずに、組織切片上に位置タグが直接合成され得る。例として、かかる実施形態は、以下の工程において実施され得る：（ａ）組織切片上に、結合条件下で、複数のタンパク質のうちの異なる１つに特異的に各々が結合することができる複数の抗体を配置する工程であって、各々の異なる抗体が放出可能に結合された抗体バーコードを有し、抗体バーコードが遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを含む、配置する工程；（ｂ）（ｉ）遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは延長断片を３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、その結果、前記イニシエーターまたは延長断片が３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって延長されて、３’－Ｏブロック延長断片を形成する、接触させる工程、および（ｉｉ）前記延長断片を酵素的に脱ブロックする工程であって、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長断片を形成する、脱ブロックする工程を、前記組織切片上の所定の位置で複数サイクル繰り返す工程であって、それにより、各異なる位置で放出可能に結合した抗体バーコード上に異なる位置タグを合成して、位置タグ－抗体バーコードコンジュゲートを形成する、繰り返す工程；（ｃ）位置タグ－抗体バーコードコンジュゲートを放出させる工程；および（ｄ）放出された位置タグ－抗体バーコードコンジュゲートを配列決定して、組織切片中の複数のタンパク質の空間分布を決定する、配列決定する工程。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質標識を露出させるか、細胞内ｍＲＮＡ上に位置タグを直接合成するために組織切片の細胞を透過処理する工程を含めてよい。
【0075】
図１Ｆ～１Ｉに記載の実施形態は、以下の工程によって実施され得る：（ａ）固体表面上に配置された組織スライスから生体分子を捕捉する工程であって、各生体分子が、捕捉された前記生体分子を同定し、かつ遊離３’－ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドを含むか、含むように改変され得る、捕捉する工程；（ｂ）テンプレートなしの酵素合成によって前記固体表面上の複数の異なる位置のオリゴヌクレオチドの遊離３’－ヒドロキシル上に位置タグを合成する工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドを配列決定して、前記組織スライス中の生体分子の空間分布を決定する、配列決定する工程。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを放出するさらなる工程を、例えば、上記で引用した参考文献に記載の従来の連結化学およびプロトコールを使用して実施する。いくつかの実施形態では、生体分子は、ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、抗体バーコード、またはタンパク質など）である。生体分子は、固体表面に結合した相補オリゴヌクレオチドまたは固体表面に結合した抗体によって捕捉され得る。後者の場合、タンパク質生体分子の捕捉後に、抗体結合対（ＥＬＩＳＡで使用されるものなど）が固体表面に適用され得る。いくつかの実施形態では、結合対の抗体のうちのいずれか１つまたは両方は、位置タグが合成され得るオリゴヌクレオチドバーコードを有し得る。
【0076】
図２Ａ～２Ｄは、選択されたタンパク質（またはエピトープ）の発現が特異的な抗体結合化合物を使用して測定され、全ての遺伝子または選択された遺伝子のいずれかの発現が全てのｍＲＮＡまたは選択されたｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用して測定される実施形態についての上記の概念を示す。両方のプローブのクラスにおいて、結合したオリゴヌクレオチド標識は、前記標識が特異的に結合する化合物を同定し、酵素合成のためのイニシエーターとしての機能も果たし得る。図２Ａは、「分割および混合」タグ合成の過程を実施するための実施形態を示す。生細胞の集団（２００）を、抗体（したがって、さらにその標的タンパク質）を同定し、かつイニシエーターとしての機能も果たすオリゴヌクレオチド（２０２）で各々が標識された抗体セット（２０４）と組み合わせる。細胞（２００）を、共通の容器（２０６）中で合わせ、次いで、マルチウェルアレイ（２１２）の４つのウェル２１０ａ～２１０ｄのうちの１つに分配し（通常は等量で）、このウェルにおいて１つの酵素延長サイクルを行う（例えば、２１０ａ中で１つのＡ伸長、２１０ｂ中で１つのＧ伸長、２１０ｃ中で１つのＣ伸長、および２１０ｄ中で１つのＴ伸長）。付加したヌクレオチドの脱ブロック後、細胞（２００）を採取し、共通の容器（２０６）中で再度合わせる。各ヌクレオチドの付加で伸長されたランダムヌクレオチドタグが生成され、その結果、ｎ回の付加で４ｎ個のタグが生成される。操作および細胞へのダメージの可能性を最小にするために、集団（２００）のサイズが既知の場合、サイクル数は、細胞が固有のタグを有する確率が高いことが保証されるが、細胞のダメージまたは喪失を最小にする数に制限され得る。例えば、集団（２００）が１０６個の細胞からなる場合、１０～１１サイクルで１～４×１０６個の固有のタグが生成される。いくつかの実施形態では、各細胞が９９パーセントまたはそれを超える確率で固有のオリゴヌクレオチドタグを保有することが保証されるようなサイクル数で実施する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての細胞に固有のオリゴヌクレオチドタグが与えられるようなサイクル数を実施した時点で（２１８）、次いで、タグは、採取され、大規模配列決定によって解析され得る（さらに、例えば、各細胞中の各タンパク質および各遺伝子の発現を表示することができる）。図２Ｂに示すように、抗体またはプライマーに結合した最初のオリゴヌクレオチドは、分子操作のための他のセグメントを含み得る。例えば、抗体（２３０）上のオリゴヌクレオチド（２３２）は、抗体（２３０）の特異性を同定するためのコードを含み得るセグメント（２３４）およびその後の操作（ＰＣＲ増幅など）のためのさらなる配列を含み得る。また、オリゴヌクレオチド（２３２）は、最初のヌクレオチド付加サイクルのためのイニシエーターとしての機能を果たす遊離３’－ヒドロキシルを有するセグメント（２３６）を含む。結合したタグヌクレオチドに対する数回のサイクル後（２３８および２３９）、タグおよびタンパク質または遺伝子の同定配列を操作および解析できるように共通セグメント（２３５）（例えば、プライマー配列）を結合させるために、さらなるヌクレオチドが分割も混合も行わずに付加され得る。いくつかの実施形態では、結合したオリゴヌクレオチドを増幅してアンプリコン（２３３）を形成することによってこれを行うことができ、次いで、ハイスループットＤＮＡ配列決定によって解析され得る（２３１）。
【0077】
上記のとおり、細胞は、ヌクレオチドのランダム配列からなる代わりに、ホモポリマーセグメントのランダム配列からなる類似のランダムバーコードで標識され得、ここで、各ホモポリマーセグメントは、最近傍のホモポリマーセグメントのヌクレオチドと異なる種類のヌクレオチドを含む。かかるバーコード付けスキームの利点は、３’ブロックｄＮＴＰを使用する必要がなく；したがって、脱ブロック工程を必要とせず、それにより、合成過程がより簡潔になり、潜在的に細胞の生存度へのダメージが少なくなる。かかるバーコードで使用されるホモポリマーセグメントの長さは、大きく異なり得る。いくつかの実施形態では、反応時間を含む条件は、ホモポリマーセグメントの平均長が１～１００ヌクレオチドの範囲となるように選択され；他の実施形態では、ホモポリマーセグメントの平均長は、１～２５ヌクレオチドの範囲であり；さらに他の実施形態では、ホモポリマーセグメントの平均長は、１～１０ヌクレオチドの範囲である。
【0078】
本発明と共に使用した結合化合物には、所定の細胞構成要素に特異的に結合し、同定オリゴヌクレオチドを生成するためにイニシエーターが結合され得る多種多様の組成物が含まれ得る。図２Ｃおよび２Ｄは、生細胞（図２Ｃ）および細胞内構成要素に接近するために固定および透過処理されている細胞（図２Ｄ）と共に使用され得る異なるタイプの結合化合物の範囲を示す。通常は細胞外環境に露出した細胞抗原および／または構成要素のみが生細胞（２４０）中に接近可能である。したがって、いくつかの実施形態では、結合化合物は、上記のイニシエーターオリゴヌクレオチド（２４２）で標識された抗体結合化合物を含み、ここで、抗体は、所定の細胞表面タンパク質（例えば、２４３ａ、２４３ｂ、２４３ｃ）、または細胞表面膜（２４５）に挿入する膜特異的構成成分（２４８）（親油性部分など）およびイニシエーター（ｉｉｎｉｔｉａｔｏｒ）オリゴヌクレオチド（２４６）を含む膜プローブ（２４４）に特異的である。図２Ｄに示すように、固定および透過処理された細胞（２８０）では、透過処理工程で作出された細孔（２８１）を介して、細胞内ＲＮＡ（２８６）および細胞内タンパク質（２８４）に接近でき、これらに対するハイブリッド形成プローブを含む結合化合物（例えば、２８５）および抗体結合化合物（２８７）にそれぞれ標的にされ得る。いくつかの実施形態では、結合化合物は、ゲノムＤＮＡのハイブリッド形成プローブを含み得る。
【0079】
いくつかの実施形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の参考文献に開示の従来技術を使用して親油性部分を有するイニシエーターオリゴヌクレオチドの５’末端を誘導することによって、標的細胞の細胞表面膜に安定に挿入される：Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１５：４６２１－４６２６（２０１４）；Ｂｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２３（８）：４４５５－４４６４（２００７）；Ｂｏｒｊｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１（８）：２８３１－２８３９（２００９）；Ｂｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１１３（５１）：１６４２５－１６４３４（２００９）；および類似の参考文献。Ｗｅｂｅｒ（上記で引用）によって開示された技術が特に興味深く、この技術は、各々が親油性部分を有するように誘導されたオリゴヌクレオチドの相補対（そのオリゴヌクレオチド対の一方は５’末端上にあり（長い方のイニシエーターオリゴヌクレオチド）および他方はその３’末端上にある（短い方の支持体オリゴヌクレオチド））を必要とする。ハイブリッド形成された対は細胞膜内で非常に安定であり、合成中の喪失が最小になる。
【0080】
図３Ａに示すように、いくつかの実施形態では、イニシエーターオリゴヌクレオチド（３００）は、遊離３’ヒドロキシルおよび５’末端の親油性部分（３０４）を有するオリゴヌクレオチド（３０２）を含む。かかるイニシエーターは、伸長のために利用可能な遊離３’－ヒドロキシルを有する細胞表面膜の脂質二重層に安定に挿入することができる。イニシエーターオリゴヌクレオチド（３００）は、イニシエーターオリゴヌクレオチド（３００）が、その親油性部分によって細胞表面膜（３１２）に挿入すること（３１０）が可能な条件下（３０８）で、標的細胞（３０６）と組み合わせられ、その結果、前記オリゴヌクレオチドの遊離３’－ヒドロキシルが合成のために接近可能となる。次いで、細胞（３１４）は、本発明の方法によるイニシエーターの酵素伸長（３１０）に供され得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、図３Ｂに示す「分割および混合」合成ストラテジーによって、イニシエーターの酵素伸長（３１０）を用いて、細胞（３１４）上に固有の細胞特異的バーコードを生成することができる。イニシエーターを有する細胞を容器（３２２）にプールし、その後にヌクレオチド付加の連続サイクルを実施する。容器（３２２）中の細胞は、４つの反応チャンバー（３２４ａ～３２４ｄ）に分配され（３２３）、前記チャンバー中で、結合したイニシエーター（それぞれ、３’－ＯブロックｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）の遊離３’－ヒドロキシルに付加され、その後にかかる付加したヌクレオチドを脱ブロックして次の付加サイクルの準備をする。いくつかの実施形態では、容器（３２２）の細胞は、反応チャンバー間で等しく分配される；しかしながら、別の実施形態では、容器（３２２）の細胞は、特定の位置でのヌクレオチドの出現を偏らせるために、反応容器（２３４ａ～３２４ｄ）間で不均等に分配され得る。他の実施形態では、１回を超える付加サイクルを反応チャンバー（３２４ａ～３２４ｄ）中で実施することができ、それにより、例えば、２またはそれを超えるヌクレオチドが付加され得る。固体構造（３２６）の反応チャンバー（３２４ａ～３２４ｄ）も示すが、これらのチャンバーは個別の反応容器（個別の反応管など）を含み得る。いくつかの実施形態では、反応チャンバー（３２４ａ～３２４ｄ）は、従来の２４、４８、９６、３８４、または１５３６ウェルのマイクロウェルプレート中のウェルを含み得る。より大容量のマイクロウェルプレート（例えば、９６ウェル）では、例えば、複数の試料のバーコード付けおよび解析を同時に行うために、複数の合成が並行して行われ得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの付加および脱保護のサイクル後、チャンバー（３２４ａ～３２４ｄ）中の細胞は、次のヌクレオチド付加工程で混合物の各細胞がＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴを等しい確率で付加されるように混合される（３２８）。かかる実施形態では、かかる「分割および混合」工程により、固有のランダム配列オリゴヌクレオチドが、細胞膜中に係留されたイニシエーター上に生成され得る。かかる「分割および混合」工程は、付加したランダム配列オリゴヌクレオチドが容器（３２２）中の集団の各細胞が固有の配列に会合されるのに十分な長さになるまで継続され得る（３３０）。いくつかの実施形態では、固有のバーコードが形成された後（３３２）、共通配列のさらなるヌクレオチドが分割および混合を行わずに合成され得る。かかる共通配列は、その後の解析のためにバーコードを操作または増幅させるためのプライマー結合部位などを含み得る。次いで、得られたバーコード付き細胞（３３６）は、図３Ｃに示す単一細胞トランスクリプトーム解析などの用途で使用され得る。ビーズベースのバーコード付けを用いた大規模単一細胞トランスクリプトーム解析の指針は、以下の参考文献に開示されている：Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，５８：６１０－６２０（２０１５）；Ｓａｌｉｂａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２（１４）：８８４５－８８６０（２０１４）；Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第３０１３／０２７４１１７号；Ｍａｃｏｓｋｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，１６１：１２０２－１２１４（２０１５）；およびＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，１６１：１１８７－１２０１（２０１５）など。一般に、前記技術は、（ｉ）単一細胞を捕捉または単離する工程、（ｉｉ）単一細胞を溶解する工程、（ｉｉｉ）ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製する工程、（ｉｖ）ｃＤＮＡを増幅する工程、および（ｖ）配列決定する工程を含む。かかる技術は、特に単一細胞および単一バーコードを保有するビーズを含む液滴を生成することによって、細胞特異的バーコードをｃＤＮＡに結合させる工程をさらに含み得る。
【0082】
いくつかの実施形態では、固有のオリゴヌクレオチドタグは、ホモポリマーセグメントの配列を含むタグを結合させることによって生細胞において合成され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドバーコードを生細胞において合成する方法であって、（ａ）前記細胞の細胞表面分子に結合されているか、前記細胞の細胞表面膜中に係留されている遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを準備する工程；（ｂ）延長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは延長断片をヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、その結果、前記イニシエーターまたは延長断片がホモポリマーセグメントによって延長されて、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長断片を形成し、ここで、第１の工程後の各工程で付加したヌクレオシド三リン酸の種類が直前の工程における種類と異なる、接触させる工程の複数のサイクルを生物学的条件下で繰り返す工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、各サイクルは、非組み込みヌクレオシド三リン酸を除去する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、延長条件は、平均長が１～１００ヌクレオチドの範囲のホモポリマーセグメントを産生するための前記ヌクレオシド三リン酸の濃度、温度、および反応時間を含む。いくつかの実施形態では、ホモポリマーセグメントを含む固有のオリゴヌクレオチドタグは、分割および混合手順を使用して産生される。
【0083】
単一細胞の分析
本発明のいくつかの実施形態では、集団由来の細胞は、リアクター中に分配され、リアクターの各々は単一細胞を含む。当該分野で公知の種々の大規模単一細胞リアクタープラットフォームによってこれを行うことができる（例えば、Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／０２５５４７１号；Ｍａｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／０２８５９７５号；Ｅｄｄ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／００２１９８４号；Ｃｏｌｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４号；Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２００９／１４５９２５号；Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２００９／０１８１８５９号；Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５０：３９０－３９５（２０１１）；およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１１：１２２３－１２３１（２００９）など（本明細書中で参考として援用される）。１つの態様では、ＰＣＡ反応などの反応が起こるマイクロウェルアレイのウェル中に細胞を配置し；別の態様では、ミセルがリアクターとしての機能を果たす場合に、油中水型乳濁液のミセル中に細胞を配置する。マイクロフルイディクスデバイス（例えば、Ｍａｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ（上記で引用）またはＥｄｄ ｅｔ ａｌ（上記で引用））によって生成されたミセルリアクターは、大量乳化過程よりも細胞に対して低い剪断および応力で均一なサイズのミセルが生成され得るので、特に興味深い。乳化（ミセル中でのＰＣＲなどの増幅反応の実施が含まれる）のための組成物および技術は、以下の参考文献（参考として援用される）に見出される：Ｂｅｃｈｅｒ，“Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｔａｗｆｉｋ，米国特許第６，４８９，１０３号；Ｔａｗｆｉｋ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：６５２－６５６（１９９８）；Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０２：１１７－１２４（２００３）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：８８１７－８８２２（２００３）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第８，０４８，６２７号；Ｂｅｒｋａ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，８４２，４５７号および同第８，０１２，６９０号；Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３：５５１－５５９（２００６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３：５４５－５５０（２００６）；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８２（８）：３１８３－３１９０（２０１０）；およびＭｉｃｅｌｌｕｌａ ＤＮＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ（ＥＵＲｘ，Ｇｄａｎｓｋ，Ｐｏｌａｎｄ，２０１１）など。１つの実施形態では、均一な配列タグ（例えば、ビーズ）と反応混合物の混合物を、生体適合性油（例えば、軽鉱油、Ｓｉｇｍａ）の回転混合物中に滴下し、乳化させる。別の実施形態では、均一な配列タグおよび反応混合物を、生体適合性油の直交流に滴下する。使用した油は、１またはそれを超える生体適合性の乳濁液安定剤が補充され得る。これらの乳濁液安定剤には、Ａｔｌｏｘ４９１２、Ｓｐａｎ８０、および他の認められた市販の適切な安定剤が含まれ得る。いくつかの実施形態では、乳濁液は、例えば、少なくとも９４℃、少なくとも９５℃、または少なくとも９６℃まで熱安定性を示し、熱サイクリングが可能である。いくつかの実施形態では、サイズが約５ミクロンから約５００ミクロンまでの範囲の液滴が形成される。いくつかの実施形態では、約１０ミクロンから約３５０ミクロンまで、または約５０から２５０ミクロンまで、または約１００ミクロンから約２００ミクロンまでの範囲の液滴が形成される。有利には、直交流の流体混合は、液滴形成の制御が可能であり、液滴のサイズを均一にすることが可能である。
本発明のいくつかの実施形態では、集団由来の細胞は、リアクター中に分配され、リアクターの各々は単一細胞を含む。当該分野で公知の種々の大規模単一細胞リアクタープラットフォームによってこれを行うことができる（例えば、Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／０２５５４７１号；Ｍａｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／０２８５９７５号；Ｅｄｄ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／００２１９８４号；Ｃｏｌｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４号；Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２００９／１４５９２５号；Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２００９／０１８１８５９号；Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５０：３９０－３９５（２０１１）；およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１１：１２２３－１２３１（２００９）など（本明細書中で参考として援用される）。１つの態様では、ＰＣＡ反応などの反応が起こるマイクロウェルアレイのウェル中に細胞を配置し；別の態様では、ミセルがリアクターとしての機能を果たす場合に、油中水型乳濁液のミセル中に細胞を配置する。マイクロフルイディクスデバイス（例えば、Ｍａｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ（上記で引用）またはＥｄｄ ｅｔ ａｌ（上記で引用））によって生成されたミセルリアクターは、大量乳化過程よりも細胞に対して低い剪断および応力で均一なサイズのミセルが生成され得るので、特に興味深い。乳化（ミセル中でのＰＣＲなどの増幅反応の実施が含まれる）のための組成物および技術は、以下の参考文献（参考として援用される）に見出される：Ｂｅｃｈｅｒ，“Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｔａｗｆｉｋ，米国特許第６，４８９，１０３号；Ｔａｗｆｉｋ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：６５２－６５６（１９９８）；Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０２：１１７－１２４（２００３）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：８８１７－８８２２（２００３）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第８，０４８，６２７号；Ｂｅｒｋａ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，８４２，４５７号および同第８，０１２，６９０号；Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３：５５１－５５９（２００６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３：５４５－５５０（２００６）；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８２（８）：３１８３－３１９０（２０１０）；およびＭｉｃｅｌｌｕｌａ ＤＮＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ（ＥＵＲｘ，Ｇｄａｎｓｋ，Ｐｏｌａｎｄ，２０１１）など。１つの実施形態では、均一な配列タグ（例えば、ビーズ）と反応混合物の混合物を、生体適合性油（例えば、軽鉱油、Ｓｉｇｍａ）の回転混合物中に滴下し、乳化させる。別の実施形態では、均一な配列タグおよび反応混合物を、生体適合性油の直交流に滴下する。使用した油は、１またはそれを超える生体適合性の乳濁液安定剤が補充され得る。これらの乳濁液安定剤には、Ａｔｌｏｘ４９１２、Ｓｐａｎ８０、および他の認められた市販の適切な安定剤が含まれ得る。いくつかの実施形態では、乳濁液は、例えば、少なくとも９４℃、少なくとも９５℃、または少なくとも９６℃まで熱安定性を示し、熱サイクリングが可能である。いくつかの実施形態では、サイズが約５ミクロンから約５００ミクロンまでの範囲の液滴が形成される。いくつかの実施形態では、約１０ミクロンから約３５０ミクロンまで、または約５０から２５０ミクロンまで、または約１００ミクロンから約２００ミクロンまでの範囲の液滴が形成される。有利には、直交流の流体混合は、液滴形成の制御が可能であり、液滴のサイズを均一にすることが可能である。
【0084】
いくつかの実施形態では、かかるリアクター中で利用可能な試薬によって標的核酸および配列タグが同様に増幅されるように、体積分布が均一なミセルが産生される。すなわち、リアクターの体積（例えば、ミセル体積）にばらつきがあると、増幅に失敗し、そして／または増幅の程度が非常に変動し得る。かかる失敗および変動は、集団の個別の細胞中の標的核酸（例えば、遺伝子発現の相違）の定量的比較を妨げるか、その難度が上がる。１つの態様では、変動係数（ＣＶ）が３０パーセントまたはそれ未満の体積分布のミセルが産生される。いくつかの実施形態では、ミセルの体積分布のＣＶは、２０パーセントまたはそれ未満である。
【0085】
試料の細胞および均一な配列タグは、リアクターに配置する前に反応混合物中に懸濁され得る。１つの態様では、反応混合物はＰＣＡ反応混合物であり、少なくとも１対のインナー（または連結）プライマーおよび少なくとも１対のアウタープライマーを有するＰＣＲ反応混合物と実質的に同一である。反応混合物は、１またはそれを超える必要に応じた構成成分（熱安定性制限エンドヌクレアーゼ；１またはそれを超えるプロテイナーゼ阻害剤；単離された細胞の標的核酸の放出を用意にするための溶解剤（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，５：Ｓ１３１－Ｓ１３８（２００８）など）が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞を溶解する工程は、増幅反応を実施する前に細胞を非イオン性界面活性剤（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）Ｘ－１００）の存在下にて９５℃またはそれを超える温度で一定期間加熱することによって行われ得る。１つの実施形態では、かかる高温の期間は、１０～２０分間であり得る。あるいは、細胞を溶解する工程は、１回または複数回の加熱および冷却サイクル（例えば、非イオン性界面活性剤（例えば、０．１％ＴｗｅｅｎＸ－１００）の存在下での９６℃で１５分間、その後の１０℃で１０分間）によって行われ得る。いくつかの実施形態では、以下により完全に記載するように、ミセルリアクターは、マイクロフルイディクスデバイス中で生成され、選別される。
【0086】
単一細胞のトランスクリプトーム解析
図３Ｃでは、いくつかの実施形態のために、バーコード付き細胞（３４０）は、液滴ベースのマイクロ流体デバイス（３４５）を使用してトランスクリプトーム解析のために調製され得、前記デバイスは、バーコード付き単一細胞を水性ミセルに封入し、細胞含有ミセルを、ｃＤＮＡライブラリーを構築するための一連の試薬を含むミセルと合一する。あるいは、マイクロ流体法（Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２０１９／１３９６５０号に開示のものなど）を使用して、細胞含有ミセルを生成し、かかるミセルに試薬を送達させることができる。イニシエーター－バーコードコンジュゲート（３４４）が細胞表面膜に埋め込まれた細胞（３４０）は、ｐＨ、塩濃度、および細胞の完全性を維持するために必要な他の成分を有し得る水溶液（３４２）を含むチャンバー（３４３）に配置される。チャンバー（３４３）から、細胞（３４０）および水溶液（３４２）が通路（３５１）を通過してジャンクション（３５３）に至り、ここで油（３５０）が合流して水性ミセル（３４６）が形成され、そのいくつかは単一細胞を含む。かかる液滴ベースのマイクロフルイディクスデバイスは、周知の設計および技術を使用して構築され得る。例えば、以下の参考文献は、かかるマイクロ流体デバイスの設計および実施の指針を提供している：Ｚａｒｅ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１２：１８７－２０１（２０１０）；Ｌｉｎｋ，米国特許出願公開第２０１２／０３０９００２号；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：６１８－６３０（２０１３）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，９０：１２７３－１２７９（２０１８）；Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１７／０００９２７４号；Ｚａｇｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０２：２５－４８（２０１１）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，８：１４０４９（２０１６）；およびＬｉｎｋ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２００８／００１４５８９号など。
図３Ｃでは、いくつかの実施形態のために、バーコード付き細胞（３４０）は、液滴ベースのマイクロ流体デバイス（３４５）を使用してトランスクリプトーム解析のために調製され得、前記デバイスは、バーコード付き単一細胞を水性ミセルに封入し、細胞含有ミセルを、ｃＤＮＡライブラリーを構築するための一連の試薬を含むミセルと合一する。あるいは、マイクロ流体法（Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２０１９／１３９６５０号に開示のものなど）を使用して、細胞含有ミセルを生成し、かかるミセルに試薬を送達させることができる。イニシエーター－バーコードコンジュゲート（３４４）が細胞表面膜に埋め込まれた細胞（３４０）は、ｐＨ、塩濃度、および細胞の完全性を維持するために必要な他の成分を有し得る水溶液（３４２）を含むチャンバー（３４３）に配置される。チャンバー（３４３）から、細胞（３４０）および水溶液（３４２）が通路（３５１）を通過してジャンクション（３５３）に至り、ここで油（３５０）が合流して水性ミセル（３４６）が形成され、そのいくつかは単一細胞を含む。かかる液滴ベースのマイクロフルイディクスデバイスは、周知の設計および技術を使用して構築され得る。例えば、以下の参考文献は、かかるマイクロ流体デバイスの設計および実施の指針を提供している：Ｚａｒｅ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１２：１８７－２０１（２０１０）；Ｌｉｎｋ，米国特許出願公開第２０１２／０３０９００２号；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：６１８－６３０（２０１３）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，９０：１２７３－１２７９（２０１８）；Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２０１７／０００９２７４号；Ｚａｇｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０２：２５－４８（２０１１）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，８：１４０４９（２０１６）；およびＬｉｎｋ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２００８／００１４５８９号など。
【0087】
細胞含有ミセル（３４６）は、ジャンクション（３５２）で油流（３５４）中の試薬ミセル（３４８）と合一される。試薬ミセル（３４８）は、細胞表面膜を破壊して転写および増幅のためのｍＲＮＡを露出させるための溶解試薬を含む。かかる合一の結果としてミセル（３５６）が生じ、前記ミセルは通路（３６０）を流れる間にインキュベートされ、前記通路の長さは、ミセル（３４８）によって運搬される溶解試薬が、逆転写および増幅のために細胞を完全に溶解し、細胞ライセート（３５８）を産生するのに十分な通過時間を得られるように設計されている。溶解試薬は、以下の参考文献に記載されている：Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，５（３）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２３６；Ｔｈｒｏｎｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，２１：４９０－４９７（２００１）；およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，９２：８１４－８１８（２００９）など。ＰＣＡ反応と共に使用するための例示的な溶解条件は、以下の通りである：１）Ｈ２Ｏ中の細胞に対して９６℃で１５分間、その後に１０℃で１５分間；２）２００ｍＭ ＫＯＨ、５０ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｅｉｔｏｌ）、６５℃まで１０分間加熱；３）４μＬ プロテアーゼベースの溶解緩衝液について：１μＬの１７μＭ ＳＤＳを３μＬの１２５μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫと組み合わせ、その後に３７℃で６０分間、次いで、９５℃で１５分間（プロテイナーゼＫを失活させるため）インキュベートする；４）１０μＬの界面活性剤ベースの溶解緩衝液について：２μＬ Ｈ２Ｏ、２μＬ ２５０ｎｇ／μＬ ｐｏｌｙＡ、２μＬ １０ｍＭ ＥＤＴＡ、２μＬ ２５０ｍＭジチオスレイトール、２μＬ ０．５％Ｎ－ラウリルサルコシン塩溶液。単一細胞解析プラットフォーム、インキュベーション時間、溶解緩衝液、ならびに／またはＰＣＡ反応の他の構成成分、その濃度、および反応体積などは、設計上、特定の適用において最適になるように当業者が選択する。１つの実施形態では、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，９０：１２７３－１２７９（２０１８）に開示のアルカリ溶解緩衝液が使用される。かかる緩衝液は、２０ｍＭ ＮａＯＨ、６０％（ｖ／ｖ）ＰｅＧ－２００、および２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含み、ＲＴ－ＰＣＲ試薬の緩衝能力によって中和され得る。
【0088】
溶解後、ミセル（３５８）中の細胞ライセートは、ジャンクション（３６８）で油流（３６４）由来の試薬ミセル（３６２）と合一される。試薬ミセルは、逆転写酵素およびＰＣＲ反応構成成分を含む。いくつかの実施形態では、かかる構成成分は、市販のＲＴ－ＰＣＲキット（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲシステム）由来の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる構成成分は、テンプレート切り替え転写構成成分を含み得る（例えば、Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０７：４．２２．１－４．２２．１７（２０１４））。合一後、逆転写酵素の変性ならびにその後のｃＤＮＡおよびバーコードのＰＣＲが可能な温度制御デバイス（サーモサイクラーなど）中に液滴を回収する。逆転写反応の異なる実施形態を、図４Ａおよび４Ｂに示す。図４Ａでは、ｐｏｌｙＴプライマー（４０２）をｍＲＮＡ（４００）にアニールし、伸長させて（４０６）第１のＤＮＡ鎖（４０５）（配列番号１７）を形成する。ｍＲＮＡテンプレート（４００）の除去後、遺伝子特異的プライマー（４０８）をアニールし、伸長させてｃＤＮＡを完成させる。プライマー（４０８）は、５’テール（４１０）を含むことができ、この５’テールは共通配列（その後の配列決定のための操作および調製のためのプライマー結合部位など）を含む。図４Ｂでは、単一細胞ｃＤＮＡライブラリーを産生するために使用され得るテンプレート切り替えスキームを示す（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０（４）：８９２－８９７（２００１））。テンプレート（４２２）は、ｍＲＮＡ（４２０）にアニールされ、逆転写酵素（ＭＭＬＶなど）を用いて伸長され（４２４）、それにより、ＲＮＡテンプレートの末端が到達した後に、選択されたヌクレオチド（４２６）が第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端にテンプレートなしで付加される。これにより、アダプター（（４２８）がテンプレートなしの付加物にアニールされ、伸長されて（４３２）第２の鎖が産生され、ｃＤＮＡ（４３０）を完成させることが可能である。アダプター（４２８）の５’セグメントは、その後のハイスループット配列決定のための増幅および調製のための共通配列を含むように設計され得る。
【0089】
いくつかの実施形態では、テンプレート切り替え逆転写後、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ反応は、各ミセル内で行われる。ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）反応は、１またはそれを超える回数のフラグメントアニーリングおよびポリメラーゼ伸長サイクルにおいて複数の核酸断片を共に融合して単一の融合産物を形成可能である（例えば、Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３２：５２２－５４０（２００８））。ＰＣＡ反応には多くの形式がある。目的の１つの形式では、ＰＣＡは、共通の反応体積中で行われる複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に続き、ここで、ＰＣＲの各構成成分は、反応中に得られたアンプリコン由来の鎖を別のアンプリコン由来の鎖にアニールし、伸長して、融合産物または融合産物の前駆体を形成することが可能な少なくとも１つの連結プライマーを含む。種々の形式（および種々の別名の）のＰＣＡは、断片のアセンブリおよび遺伝子合成のための周知の方法であり、そのうちのいくつかの形式が、以下の参考文献に開示されている：Ｙｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：４８９５（１９８９）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：８７９９－８８００（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１６４：４９－５３（１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０：ｃ４３（２００２）；Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ，２６：１２１－１３４（２００８）；およびＸｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３２：５２２－５４０（２００８）など。
【0090】
図４Ｃは、各ｃＤＮＡに同一の細胞特異的バーコードを結合させるためのＰＣＡの使用を示す。「Ｘ」ＤＮＡ（４６２）は、プライマー結合部位に挟まれた酵素合成されたバーコード配列であり得る。プライマー（４７０）および（４７１）は、バーコードおよびｃＤＮＡ上の共通配列にそれぞれアニールし、これらのプライマーは、相補的５’テールを有する。
【0091】
複数の異なる標的核酸（ｃＤＮＡ（４６０）、ｇ１、ｇ２、．．．ｇｎなど）は、同一のバーコード核酸であるＸ（４６２）に連結して（４６４）、複数の融合産物Ｘ－ｇ１、Ｘ－ｇ２、Ｘ－ｇＫ（５６６）を形成する。いくつかの実施形態では、かかる複数とは、２と１００００との間であり；別の実施形態では、２と１０００との間であり；別の実施形態では、２と１００との間である。これらの実施形態のＰＣＡ反応では、多数のｇｉアンプリコン鎖とアニールするための適量のＸアンプリコンが存在するように、インナープライマー（４６８）の濃度は、種々のｇｉ核酸のインナープライマー（例えば、４７１）の濃度より高い場合がある。本発明の方法によれば、融合産物（４６６）は、合一したミセルの反応混合物から抽出され、配列決定され得る。
【0092】
いくつかの実施形態では、細胞特異的バーコードを有するｃＤＮＡライブラリーを生成する方法は、（ａ）固有のオリゴヌクレオチドバーコードを集団の各細胞上に合成して、バーコード付き細胞集団を形成する、合成する工程；（ｂ）各々がポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）反応混合物中に単一のバーコード付き細胞を含む複数のリアクター中にバーコード付き細胞を配置する工程であって、前記ＰＣＡ反応混合物が、一対のアウタープライマーおよびバーコード付き細胞およびオリゴヌクレオチドバーコード中の複数の標的核酸に特異的な連結プライマーの１またはそれを超える対を含む、配置する工程；（ｃ）リアクター中でＰＣＡ反応を行う工程であって、それによりリアクター中で標的核酸とオリゴヌクレオチドバーコードの融合産物が形成される、ＰＣＡ反応を行う工程；および（ｄ）リアクター由来の融合産物を配列決定して、集団中の各細胞の標的核酸を同定する、配列決定する工程を含み得る。
【0093】
単一細胞トランスクリプトーム解析の別の適用例を、図５に示す。この実施形態では、細胞（バーコード無し）（５０２）は、ｐｏｌｙＴビーズ（これもバーコード無し）（５０４）と混合され、マイクロフルイディクスデバイス（５０８）のチャンバー（５００）中の水性混合物に配置される。上記のとおり、マイクロフルイディクスデバイスに依存しないアプローチも適用され得る（例えば、Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２０１９／１３９６５０号）。水性混合物を、通路（５０６）を強制的に通過させて、ジャンクション（５１０）で油流（５１２）へと達し、その結果、水性液滴が形成され、水性液滴（５１６）のうちのいくつかは１個の細胞（５１７ａ）および１個のビーズ（５１７ｂ）を含む。次いで、かかる液滴は、ジャンクション（５２０）で細胞溶解試薬を含む液滴（５１８）と合一して液滴（５２２）を形成し、前記液滴中で細胞が溶解されてｐｏｌｙＡ ＲＮＡを放出し、このｐｏｌｙＡ ＲＮＡがビーズ（５１７ｂ）に結合したｐｏｌｙＴプライマーにアニールする。所望の細胞構成要素（ｍＲＮＡなど）を放出するための適切なインキュベーション後、ライセート含有液滴は、ジャンクション（５３０）で、逆転写酵素試薬（逆転写酵素、適切な塩、および溶解反応によって課せられた状態（例えば、高ｐＨ）を中和するか変化させ得る緩衝液系など）を含む液滴（５２８）と合一される。得られた液滴（５３１）は回収され（５３２）、ｐｏｌｙＡ ＲＮＡがビーズ（５１７ｂ）上のｐｏｌｙＴプライマーにアニールし、ｐｏｌｙＴセグメントの逆転写酵素伸長のためのテンプレートとしての機能を果たすようにインキュベートして、ビーズ（５１７ｂ）に共有結合で付着した単一細胞ｃＤＮＡライブラリーが形成される。次いで、ビーズ（５１７ｂ）は、液滴から回収され、合わせられ、「分割および混合」合成に供されて、固有のバーコードおよび上記のハイスループット配列決定のその後の操作（複製および調製など）のためのさらなる配列（プライマー結合部位など）が付加され得る。
【0094】
明らかに多数の他のマイクロフルイディクスデバイスの配置を使用して、単一細胞および所定の数の均一な配列タグ（例えば、１つの均一な配列タグ、２つの均一な配列タグ）を含むミセルを生成することができるか、ミセルの選択的合一またはエレクトロポレーションなどによってミセルに試薬を選択的に添加することができる（例えば、Ｚａｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０２：２５－４８（２０１１）；Ｂｒｏｕｚｅｓ，ｃｈａｐｔｅｒ １０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０２：１０５－１３９（２０１１）；Ｗｉｋｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０２：１７７－１９６（２０１１）；およびＬｅ Ｇａｃ ｅｔ ａｌ，ｃｈａｐｔｅｒ ７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８５３：６５－８２（２０１２）など）。
【0095】
細胞または組織の固定および透過処理
いくつかの実施形態では、核酸ハイブリッド形成プローブを含む結合化合物および／またはタンパク質特異的結合化合物にカップリングしたイニシエーターは、細胞内標的（細胞内タンパク質、伝令ＲＮＡ、および／またはゲノムＤＮＡなど）を対象にし得る。いくつかの実施形態では、細胞は、かかる細胞内標的に特異的な結合化合物を適用するために、固定および透過処理される。細胞の固定および透過処理は、従来のプロトコール（フローサイトメトリーで使用されるプロトコールなど）によって実施され得る。典型的には、かかるプロコールは、細胞を固定剤で処理する工程、その後の細胞を透過処理剤で処理する工程を含む。固定工程は、典型的には、細胞構造および細胞下構造を保持し、抗体および／またはハイブリッド形成プローブの全ての細胞および細胞内区画への接近を妨害せずに細胞内細胞標的を固定する。広範な固定液が市販されており、試験される標的の性質ならびに使用される抗体および／またはハイブリッド形成プローブの性質に応じて、方法が正確に選択される。固定方法は、一般に、以下の２つのクラスに分類される：有機溶媒および架橋試薬。アルコールおよびアセトンなどの有機溶媒は、細胞の脂質を除去して脱水する一方で、細胞構造上にタンパク質が沈殿する。架橋試薬（パラホルムアルデヒドなど）は、通常は遊離アミノ基を介して分子間架橋を形成するため、連結された抗原のネットワークが作出される。架橋剤は、有機溶媒よりも細胞構造を保存するが、いくつかの細胞構成成分に対する抗原性を低下させる場合があり、抗体および／またはハイブリッド形成プローブを細胞内標的に接近させるための透過処理工程を追加する必要があり得る。例示的な固定および透過処理工程には、メタノール－アセトン固定（冷却メタノール中での－２０℃で１０分間の固定；冷却アセトンでの－２０℃で１分間の透過処理）；パラホルムアルデヒド－トリトン固定（３～４％パラホルムアルデヒド中での１０～２０分間の固定；リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でのリンス；０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００での２～１０分間の透過処理）；パラホルムアルデヒド－メタノール固定（３～４％パラホルムアルデヒド中での１０～２０分間の固定；ＰＢＳでのリンス；冷却メタノールでの－２０℃で５～１０分間の透過処理）が含まれるが、これらに限定されない。透過処理剤には、界面活性剤であるサポニン、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、ＮＰ４０が含まれるが、これらに限定されない。また、透過処理剤には、プロテイナーゼ（プロテイナーゼＫなど）およびストレプトリシンＯなどが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、核酸ハイブリッド形成プローブを含む結合化合物および／またはタンパク質特異的結合化合物にカップリングしたイニシエーターは、細胞内標的（細胞内タンパク質、伝令ＲＮＡ、および／またはゲノムＤＮＡなど）を対象にし得る。いくつかの実施形態では、細胞は、かかる細胞内標的に特異的な結合化合物を適用するために、固定および透過処理される。細胞の固定および透過処理は、従来のプロトコール（フローサイトメトリーで使用されるプロトコールなど）によって実施され得る。典型的には、かかるプロコールは、細胞を固定剤で処理する工程、その後の細胞を透過処理剤で処理する工程を含む。固定工程は、典型的には、細胞構造および細胞下構造を保持し、抗体および／またはハイブリッド形成プローブの全ての細胞および細胞内区画への接近を妨害せずに細胞内細胞標的を固定する。広範な固定液が市販されており、試験される標的の性質ならびに使用される抗体および／またはハイブリッド形成プローブの性質に応じて、方法が正確に選択される。固定方法は、一般に、以下の２つのクラスに分類される：有機溶媒および架橋試薬。アルコールおよびアセトンなどの有機溶媒は、細胞の脂質を除去して脱水する一方で、細胞構造上にタンパク質が沈殿する。架橋試薬（パラホルムアルデヒドなど）は、通常は遊離アミノ基を介して分子間架橋を形成するため、連結された抗原のネットワークが作出される。架橋剤は、有機溶媒よりも細胞構造を保存するが、いくつかの細胞構成成分に対する抗原性を低下させる場合があり、抗体および／またはハイブリッド形成プローブを細胞内標的に接近させるための透過処理工程を追加する必要があり得る。例示的な固定および透過処理工程には、メタノール－アセトン固定（冷却メタノール中での－２０℃で１０分間の固定；冷却アセトンでの－２０℃で１分間の透過処理）；パラホルムアルデヒド－トリトン固定（３～４％パラホルムアルデヒド中での１０～２０分間の固定；リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でのリンス；０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００での２～１０分間の透過処理）；パラホルムアルデヒド－メタノール固定（３～４％パラホルムアルデヒド中での１０～２０分間の固定；ＰＢＳでのリンス；冷却メタノールでの－２０℃で５～１０分間の透過処理）が含まれるが、これらに限定されない。透過処理剤には、界面活性剤であるサポニン、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、ＮＰ４０が含まれるが、これらに限定されない。また、透過処理剤には、プロテイナーゼ（プロテイナーゼＫなど）およびストレプトリシンＯなどが含まれ得る。
【0096】
使用者指定の適用のための酵素的および化学的に合成されたキメラポリヌクレオチド
医学および生物学で使用される生成物は、あらゆる環境で使用され得る構成成分および特定の適用のために新たに提供されなければならない構成成分を含むことが多く、後者の構成成分は、時折、「使用者指定の」または「使用者が決定する」構成成分と呼ばれる。多数の核酸試薬は、この特徴を示す。特に、標識されたハイブリッド形成プローブの共通構成成分は、大量生産され、操作可能なアッセイを得るために特異的構成成分（例えば、目的の核酸標的にハイブリッド形成するプローブの標的特異的構成成分）を供給しなければならない使用者のためのキットとして提供され得る。上記の形式で提供される技術の例には、本発明の方法を使用した既存の化学合成オリゴヌクレオチドと酵素的に使用者指定のオリゴヌクレオチドとの組み合わせとして構築することができるＴａｑｍａｎプローブ、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、および各種ＰＣＲプローブなどが含まれるが、これらに限定されない。図６は、ｔａｑｍａｎプローブまたはｔａｑｍａｎプローブの前駆体を含むかかるキメラ産物の簡潔な例である。５’末端が結合したイニシエーターオリゴヌクレオチド（６０４）を有する固体支持体（６０２）を含む産物（６００）は、この構成成分があらゆる特異的プローブの設計で使用されるので、有機化学技術を使用して集中的に大量生産され得る。この実施形態では、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、切断可能なヌクレオチド「Ｘ」（６０５）および「Ｘ」に対して遠位のヌクレオチド（標識（蛍光ドナーまたはクエンチャーなど）またはドナー標識もしくはアクセプター標識に結合するために使用され得る反応基（クリック化学対のメンバーなど）であり得る部分「Ｒ１」（６０３）が含まれる）を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、塩基（例えば、環外アミン）に結合する。産物（６００）は、使用者が特に関心のある標的に特異的なｔａｑｍａｎプローブを産生するための使用者用キットの構成成分であり得る。産物（６００）のイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に、使用者は、配列特異的伸長物（６０８）を合成することができ、この伸長物は、Ｒ１を用いて操作する相補的なドナーまたはクエンチャーであり得る部分「Ｒ２」（６０７）を有するヌクレオチドを含み得るか、Ｒ２は反応基（かかる標識の結合を容易にすることが可能なＲ１のメンバーと直交性のクリック化学対のメンバーなど）であり得る。合成完了後、伸長されたオリゴヌクレオチドは、支持体（６０２）から切断されて（６１０）、ｔａｑｍａｎプローブ（６１４）および破棄され得る使用済み支持体（６１２）を得ることができる。
医学および生物学で使用される生成物は、あらゆる環境で使用され得る構成成分および特定の適用のために新たに提供されなければならない構成成分を含むことが多く、後者の構成成分は、時折、「使用者指定の」または「使用者が決定する」構成成分と呼ばれる。多数の核酸試薬は、この特徴を示す。特に、標識されたハイブリッド形成プローブの共通構成成分は、大量生産され、操作可能なアッセイを得るために特異的構成成分（例えば、目的の核酸標的にハイブリッド形成するプローブの標的特異的構成成分）を供給しなければならない使用者のためのキットとして提供され得る。上記の形式で提供される技術の例には、本発明の方法を使用した既存の化学合成オリゴヌクレオチドと酵素的に使用者指定のオリゴヌクレオチドとの組み合わせとして構築することができるＴａｑｍａｎプローブ、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、および各種ＰＣＲプローブなどが含まれるが、これらに限定されない。図６は、ｔａｑｍａｎプローブまたはｔａｑｍａｎプローブの前駆体を含むかかるキメラ産物の簡潔な例である。５’末端が結合したイニシエーターオリゴヌクレオチド（６０４）を有する固体支持体（６０２）を含む産物（６００）は、この構成成分があらゆる特異的プローブの設計で使用されるので、有機化学技術を使用して集中的に大量生産され得る。この実施形態では、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、切断可能なヌクレオチド「Ｘ」（６０５）および「Ｘ」に対して遠位のヌクレオチド（標識（蛍光ドナーまたはクエンチャーなど）またはドナー標識もしくはアクセプター標識に結合するために使用され得る反応基（クリック化学対のメンバーなど）であり得る部分「Ｒ１」（６０３）が含まれる）を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、塩基（例えば、環外アミン）に結合する。産物（６００）は、使用者が特に関心のある標的に特異的なｔａｑｍａｎプローブを産生するための使用者用キットの構成成分であり得る。産物（６００）のイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に、使用者は、配列特異的伸長物（６０８）を合成することができ、この伸長物は、Ｒ１を用いて操作する相補的なドナーまたはクエンチャーであり得る部分「Ｒ２」（６０７）を有するヌクレオチドを含み得るか、Ｒ２は反応基（かかる標識の結合を容易にすることが可能なＲ１のメンバーと直交性のクリック化学対のメンバーなど）であり得る。合成完了後、伸長されたオリゴヌクレオチドは、支持体（６０２）から切断されて（６１０）、ｔａｑｍａｎプローブ（６１４）および破棄され得る使用済み支持体（６１２）を得ることができる。
【0097】
類似のキットは、以下のようにシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を準備するために調製され得る：ｉ）イニシエーター配列が結合され、Ｔ７プロモーターが含まれるビーズ；ｉｉ）顧客はビーズ付きのキットを購入し、好ましい標的特異的配列＋２０～２５ｎｔの５’足場ドメインをイニシエーターの末端上に合成する；ｉｉｉ）合成が完了した時点で、（ａ）相補３’足場ドメインを、依然としてビーズに結合しているオリゴヌクレオチド上にアニールし、（ｂ）プライマーを伸長させてｄｓＤＮＡを生成し、（ｃ）逆転写してｓｇＲＮＡ分子を生成する。
【0098】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを含む。いくつかの実施形態では、「キット」は、本発明の方法を実施するための材料または試薬を送達するための任意の送達系を指す。反応アッセイの文脈では、かかる送達系は、反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素など）および／または補助材料（例えば、緩衝液、アッセイ実施のための指示書など）のある場所から別の場所への貯蔵、輸送、または送達が可能な系を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助材料を含む１またはそれを超える包材（例えば、箱）を含む。かかる容器は、意図するレシピエントに一緒にまたは個別に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイで用いる酵素を含み得る一方で、第２の容器はプローブを含む。
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを含む。いくつかの実施形態では、「キット」は、本発明の方法を実施するための材料または試薬を送達するための任意の送達系を指す。反応アッセイの文脈では、かかる送達系は、反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素など）および／または補助材料（例えば、緩衝液、アッセイ実施のための指示書など）のある場所から別の場所への貯蔵、輸送、または送達が可能な系を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助材料を含む１またはそれを超える包材（例えば、箱）を含む。かかる容器は、意図するレシピエントに一緒にまたは個別に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイで用いる酵素を含み得る一方で、第２の容器はプローブを含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、テンプレートなしのポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、テンプレートなしのポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）またはそのバリアントである。いくつかのかかるキットでは、テンプレートなしのポリメラーゼは、３’－Ｏブロックヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡを伸長させるためのキット中のさらなる実施形態では、キットは、イニシエーターを有する固体支持体を含み得る。
【0100】
いくつかの実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドバーコードを合成するための本発明のキットは、ＴｄＴまたはそのバリアント、３’－Ｏブロックヌクレオシド三リン酸、バーコードの分割および混合合成のための伸長反応および脱ブロック反応を行うためのマイクロウェルのアレイを含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、キットは、単一細胞をプロセシングし、この細胞に試薬を送達させるためのマイクロ流体デバイスを含み得る。
【0102】
いくつかの実施形態では、キットは、ｃＤＮＡ上に固有のオリゴヌクレオチドバーコードを合成する方法を実施するためのオリゴヌクレオチドが結合した１またはそれを超える固体支持体を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる１またはそれを超える固体支持体は、ビーズを含み；他の実施形態では、かかる１またはそれを超える固体支持体は、捕捉オリゴヌクレオチドで被覆された表面を有する平面支持体を含む。
【0103】
定義
本明細書中で別段の具体的な定義が無い限り、本明細書中で使用された核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当該分野の標準的な論文およびテキストに従う（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９））。
本明細書中で別段の具体的な定義が無い限り、本明細書中で使用された核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当該分野の標準的な論文およびテキストに従う（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９））。
【0104】
「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）」、「増幅する（ａｍｐｌｉｆｉｅｓ）」、「増幅した（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）」、「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、本明細書中で使用される場合、一般に、１またはそれを超えるコピーが標的ポリヌクレオチドまたはその一部から作製される任意の過程を指す。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を増幅する種々の方法が利用可能であり、そのうちのいくつかの例を本明細中に記載している。増幅は、線形増幅、指数関数的増幅であり得るか、多相増幅過程において線形期および指数関数期の両方を含み得る。増幅方法は、温度変化（熱変性工程など）を含み得るか、熱変性を必要としない等温過程であり得る。「アンプリコン」は、ポリヌクレオチド増幅反応の産物；すなわち、一本鎖または二本鎖であり得、１またはそれを超える出発配列から複製されるポリヌクレオチドのクローン集団を意味する。「増幅（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」は、増幅反応の実施によるアンプリコンの産生を意味する。１またはそれを超える出発配列は、同一配列の１またはそれを超えるコピーであり得るか、異なる配列の混合物であり得る。好ましくは、アンプリコンは、単一の出発配列の増幅によって形成される。アンプリコンは、種々の増幅反応によって産生され得、前記反応の産物は１またはそれを超える出発核酸または標的核酸の複製物を含む。１つの態様では、アンプリコンを産生する増幅反応は、反応物の塩基対合において「テンプレート駆動」され、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかは、テンプレートポリヌクレオチド中に、反応産物の作出に必要な相補物を有する。１つの態様では、テンプレート駆動反応は、核酸ポリメラーゼを用いたプライマー伸長または核酸リガーゼを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションである。かかる反応には、本明細書中で参考として援用される以下の参考文献に開示されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リニアポリメラーゼ反応、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、およびローリングサークル増幅などが含まれるが、これらに限定されない：Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，９６５，１８８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号（ＰＣＲ）；Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，２１０，０１５号（「ｔａｑｍａｎ」プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ）；Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，１７４，６７０号；Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，３９９，４９１号（「ＮＡＳＢＡ」）；Ｌｉｚａｒｄｉ，米国特許第５，８５４，０３３号；Ａｏｎｏ ｅｔ ａｌ，特開平４－２６２７９９（ローリングサークル増幅）など。１つの態様では、本発明のアンプリコンは、ＰＣＲによって生成される。増幅反応が進行するにつれ反応産物を測定可能な検出化学を利用可能な場合、増幅反応は「リアルタイム」増幅（例えば、下記の「リアルタイムＰＣＲ」またはＬｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：２１５０－２１５５（１９９８）および類似の参考文献に記載の「リアルタイムＮＡＳＢＡ」）であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「増幅（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」は、反応を実施するのに必要な全ての反応物（反応中にｐＨを選択したレベルに維持するための緩衝剤、塩類、補因子、および捕捉剤（scavenger）などが含まれ得るが、これらに限定されない）を含む溶液を意味する。
【0105】
「結合化合物」は、いくつかの実施形態では、非核酸リガンドに特異的に結合することができる、同定のためにオリゴヌクレオチドタグが結合され得る任意の分子を意味する。結合化合物には、抗体または抗体由来の化合物（例えば、Ｆａｂ断片）が含まれるが、これらに限定されない。非核酸リガンドには、タンパク質が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、結合化合物は、固体支持体の表面に結合される（例えば、共有結合で付着する）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドタグは、結合化合物に放出可能に結合される；すなわち、オリゴヌクレオチドタグは、所定の条件（例えば、光、高ｐＨ、低ｐＨ、特異的酸化還元条件、または特異的電位など）によって選択的に切断され得る結合を含む連結によって結合されている。
【0106】
２またはそれを超える異なるＴｄＴ中のアミノ酸の位置に関する「機能的に等価な」は、（ｉ）それぞれの位置のアミノ酸がＴｄＴの活性において機能的に同一の役割を果たすこと、および（ｉｉ）それぞれのＴｄＴのアミノ酸配列中の相同なアミノ酸の位置にアミノ酸が存在することを意味する。配列アラインメントおよび／または分子モデリングに基づいて、２またはそれを超える異なるＴｄＴのアミノ酸配列中の位置が等価であるか相同なアミノ酸残基を同定することが可能である。いくつかの実施形態では、機能的に等価なアミノ酸の位置は、進化的に関連する種（例えば、属または科など）のＴｄＴのアミノ酸配列の間で保存された配列モチーフに属する。かかる保存された配列モチーフの例は、Ｍｏｔｅａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８０４（５）：１１５１－１１６６（２０１０）；Ｄｅｌａｒｕｅ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：４２７－４３９（２００２）；および類似の参考文献に記載されている。
【0107】
本明細書中で互換的に使用される「マイクロフルイディクス」デバイスまたは「ナノフルイディクス」デバイスは、各々が、試料（ひいては、目的の細胞分析物または分子分析物を含有し得るか含み得る）、試薬、希釈剤（dilutant）、またはバッファーなどを含む少量の流体を捕捉、移動、混合、分注、または解析するための統合システムを意味する。一般に、「マイクロフルイディクス」および「ナノフルイディクス」という用語は、デバイスのサイズおよび取り扱われる流体の体積の規模が異なることを示す。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのフィーチャは、断面寸法が数百平方マイクロメートル未満であり、細管寸法の（例えば、最大の断面寸法が約５００μｍから約０．１μｍの）通路（すなわち、流路）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロフルイディクスデバイスの容積容量は、１μＬから数ｎＬ（例えば、１０～１００ｎＬ）の範囲である。ナノフルイディクスデバイスにおける対応するフィーチャ（すなわち、構造）の寸法は、典型的には、マイクロフルイディクスデバイスの寸法より１～３桁小さい。当業者は、特定の適用の環境から、どの次元が適切であるかを知るであろう。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスまたはナノ流体デバイスは、１またはそれを超えるチャンバー、ポート、および流路を有し、これらは相互接続および流体連通しており、１またはそれを超える分析反応または分析過程を、単独または支援機能を提供する器具または機器（試料の導入、流体および／または試薬の駆動手段（陽圧もしくは陰圧または音響エネルギーなど）、温度制御、検出システム、ならびにデータ収集および／または統合システムなど）と連携して行うように設計されている。いくつかの実施形態では、マイクロフルイディクスデバイスおよびナノフルイディクスデバイスは、弁、ポンプ、フィルター、および内壁上の特殊機能コーティング（例えば、試料の構成成分または反応物の吸着を防止し、電気浸透による試薬の移動を容易にするため）などをさらに含み得る。かかるデバイスは、ガラス、プラスチック、または他の固体ポリマー材料であり得、かつ特に光学的方法または電気化学的方法を介した試料および試薬の移動の検出およびモニタリングを容易にするための平面形式を有し得る固体基板中の統合デバイスとして作製され得る。いくつかの実施形態では、かかるデバイスは、使い捨て可能である。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスおよびナノ流体デバイスには、不混和流体（軽油など）中に浸漬した液滴（水性液滴など）を形成し、その移動、混合、分注、および解析を制御するデバイスが含まれる。マイクロフルイディクスデバイスおよびナノフルイディクスデバイスの作製および操作は、参考として援用される以下の参考文献によって例示されるように、当該分野で周知である：Ｒａｍｓｅｙ，米国特許第６，００１，２２９号；同第５，８５８，１９５号；同第６，０１０，６０７号；および同第６，０３３，５４６号；Ｓｏａｎｅ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，１２６，０２２号および同第６，０５４，０３４号；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，６１３，５２５号；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，３９９，９５２号；Ｒｉｃｃｏ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ０２／２４３２２号；Ｂｊｏｒｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ９９／１９７１７号；Ｗｉｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，５８７，１２８号；同第５，４９８，３９２号；Ｓｉａ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２４：３５６３－３５７６（２００３）；Ｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８：１１３－１１６（２０００）；Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，９６０，４３７号；Ｃａｏ，“Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ＆Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ＆Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２００４）；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ，ＬａｂＣｈｉｐ，７：１０９４－１１１０（２００７）；およびＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００１）など。
【0108】
互換的に使用される「変異体」または「バリアント」は、本明細書中に記載の天然または基準のＴｄＴポリペプチドに由来し、かつ１またはそれを超える位置に改変または変更（すなわち、置換、挿入、および／または欠失）を含むポリペプチドを指す。バリアントを、当該分野で周知の種々の技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変更するための技術の例には、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、配列者フリング、および合成オリゴヌクレオチド構築が含まれるが、これらに限定されない。変異誘発活性は、タンパク質の（本発明の場合、ポリメラーゼの）配列中の１つまたは数個のアミノ酸の欠失、挿入、または置換からなる。以下の用語法を用いて置換を命名する：Ｌ２３８Ａは、基準（すなわち野生型）配列の２３８位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が以下のアミノ酸のうちの１つで置換されていることを示す：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、およびトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、および小型のアミノ酸（グリシン、アラニン、およびセリン）のグループ内にある。
【0109】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特異的ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を意味する。換言すれば、ＰＣＲは、プライマー結合部位に挟まれた標的核酸の複数のコピーまたは複製物を作製するための反応であり、かかる反応は、以下の工程の１回またはそれを超える回数の反復を含む：（ｉ）標的核酸を変性させる工程、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングする工程、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによってプライマーを伸長させる工程。通常は、反応は、サーマルサイクラー機器における各工程のために最適化された異なる温度でサイクルする。特定の温度、各工程の持続時間、および工程間の変化の速度は、例えば、以下の参考文献によって例示される当業者に周知の多数の要因に依存する：それぞれ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＡｐｐｒｏａｃｈおよびＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１ ａｎｄ １９９５）。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した従来のＰＣＲでは、二本鎖標的核酸は、９０℃を超える温度で変性され、プライマーは、５０～７５℃の範囲の温度でアニールされ、プライマーは、７２～７８℃の範囲の温度で伸長され得る。反応体積は、典型的には、数百ナノリットル（例えば、２００ｎＬ）から数百μＬ（例えば、２００μＬ）までの範囲である。
【0110】
「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖が形成されると、核酸合成の開始点として作用し、テンプレートに沿ってその３’末端から伸長し、その結果、伸長した二重鎖を形成することができる天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。伸長過程中に付加されたヌクレオチド配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常は、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーの長さは、通常は、１４～３６ヌクレオチドの範囲である。
【0111】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、各々は、ヌクレオチド単量体の線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを作り上げる単量体は、規則的な単量体と単量体の相互作用パターン（ワトソン・クリックタイプの塩基対合など）によって天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。かかる単量体およびそのヌクレオシド間連結は、天然に存在し得るか、そのアナログ（例えば、天然に存在するアナログまたは天然に存在しないアナログ）であり得る。天然に存在しないアナログには、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、ロックド核酸、標識（フルオロフォアなど）を結合することが可能な連結基を含む塩基、またはハプテン、または他のオリゴヌクレオチドなどが含まれ得る。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを使用するために酵素的プロセシング（ポリメラーゼによる伸長、またはリガーゼによるライゲーションなど）を必要とする場合はいつでも、当業者は、前記例では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが任意の位置またはいくつかの位置にヌクレオチド間連結、糖部分（ｍｏｉｔｉｅｓ）、または塩基のある特定のアナログを含まないと理解するはずである。ポリヌクレオチドのサイズ範囲は、典型的には、数個の単量体単位（例えば、５～４０個）（ポリヌクレオチドが、通常、「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合）から、数千の単量体単位までである。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが文字（大文字または小文字）の配列（「ＡＴＧＣＣＴＧ」など）によって表される場合はいつでも、別段の指示が無い限り、または文脈から明白でない限り、ヌクレオチドが左から右に５’→３’の順序で並び、かつ「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示し、「Ｉ」がデオキシイノシンを示し、「Ｕ」がウリジンを示すと理解される。他に断りのない限り、用語法および原子番号の慣習は、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示のものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然のヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡについてはこれらのリボース対応物）を含む；しかしながら、ポリヌクレオチドは、例えば、改変された塩基、糖、またはヌクレオチド間連結を含む非天然ヌクレオチドアナログも含み得る。当業者は、酵素が、活性のための特異的なオリゴヌクレオチド基質またはポリヌクレオチド基質の要件（例えば、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖など）を有する場合を認識し、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などの専門書および同様の参考文献由来のガイダンスを用いて、適切な組成物を選択することができる。本明細書中で使用される場合、「ネイティブポリヌクレオチド」は、非天然のリン酸結合、糖、や塩基を持たないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのポリマーを意味する。いくつかの実施形態では、ネイティブポリヌクレオチドは、保護基（環外アミン保護基など）、リンカー（標識を塩基に結合させる基が含まれる）、または標識、または捕捉部分などを有するポリヌクレオチドを除外する。いくつかの実施形態では、ネイティブポリヌクレオチドは、天然のポリヌクレオチド、保護基を持たない化学合成されたか酵素合成されたポリヌクレオチド、または支持体に結合しているか、標識、リンカー、または反応物が結合された前記ポリヌクレオチドのいずれかから抽出されたポリヌクレオチドであり得る。
【0112】
「配列同一性」は、２つの配列（２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列など）の間の適合（例えば、同一のアミノ酸残基）の数（または分率、通常、百分率で表す）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小にしながら重複および同一性が最大になるようにアラインメントしたときの配列の比較によって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じていくつかある数学的なグローバルまたは局所のアラインメントアルゴリズムのうちのいずれかを使用して決定され得る。類似の長さの配列は、全長にわたって配列を最適にアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を使用してアラインメントすることが好ましく、一方で、実質的に異なる長さの配列は、局所アラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００５））を使用してアラインメントすることが好ましい。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定するためのアラインメントを、当該分野の技術の範囲内の種々の方法で（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／またはｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して）行うことができる。当業者は、アラインメントを測定するのに適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大にアラインメントするために必要とされる任意のアルゴリズムが含まれる）を決定することができる。本明細書中の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセント値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作出するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成された値を指し、ここで全ての検索パラメーターは、デフォルト値（すなわち、スコアリング行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドキャップペナルティ＝偽、エンドキャップオープン＝１０、およびエンドキャップ伸長＝０．５）に設定されている。
【0113】
「配列タグ」（または「タグ」）または「バーコード」は、ポリヌクレオチドまたはテンプレート分子に結合され、反応または一連の反応においてポリヌクレオチドまたはテンプレートを同定および／または追跡するために使用されるオリゴヌクレオチドを意味する。配列タグは、ポリヌクレオチドまたはテンプレートの３’末端または５’末端に結合され得るか、かかるポリヌクレオチドまたはテンプレートの内部に挿入されて、線状コンジュゲート（時折、本明細書中で、「タグ化ポリヌクレオチド」、または「タグ化テンプレート」、または「タグ－ポリヌクレオチドコンジュゲート」、または「タグ－分子コンジュゲート」などと呼ばれる）を形成し得る。配列タグのサイズおよび組成は、大きく異なり得る；本明細書中で参考として援用される以下の参考文献は、特定の実施形態に適切な配列タグのセットを選択するための指針を提供している：Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，６３５，４００号；Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍａｃｅｖｉｃｚ，米国特許第７，５３７，８９７号；Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５－１６７０（２０００）；Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ，欧州特許第０３０３４５９号；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５０－４５６（１９９６）；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，欧州特許出願公開第０７９９８９７Ａ１号；およびＷａｌｌａｃｅ，米国特許第５，９８１，１７９号など。配列タグの長さおよび組成を大きく変動させることができ、特定の長さおよび／または組成の選択は、いくつかの要因（例えば、ハイブリッド形成反応を介してまたは酵素反応（配列決定など）を介してリードアウトを生成するためのタグの使用方法；例えば、蛍光色素などで標識するかどうか；一連のポリヌクレオチドなどを明確に同定するために必要な識別可能オリゴヌクレオチドタグの数、および信頼できる同定（例えば、クロスハイブリッド形成または配列決定エラーに由来する誤認が存在しないこと）を確実にするためにセットのタグがどの程度異なる必要があるか、が含まれるが、これらに限定されない）に依存する。１つの態様では、各々の配列タグの長さは、それぞれ、２から３６ヌクレオチドまで、または４から３０ヌクレオチドまで、または８から２０ヌクレオチドまで、または６から１０ヌクレオチドまでの範囲内であり得る。１つの態様では、セットの各配列タグが、同一セットの他のあらゆるタグにおいて少なくとも２つの塩基が異なる固有のヌクレオチド配列を有する配列タグのセットが使用される；別の態様では、セットの各タグの配列が同一セットの他のあらゆるタグの配列と少なくとも３つの塩基が異なる配列タグのセットが使用される。
【0114】
「置換」は、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置き換えられることを意味する。好ましくは、用語「置換」は、アミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基、稀な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン（6-N-methylysine）、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、およびしばしば合成で作製される天然に存在しないアミノ酸残基（例えば、シクロヘキシル－アラニン）から選択される別のアミノ酸残基による置き換えを指す。好ましくは、用語「置換」は、あるアミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基から選択される別のアミノ酸残基による置き換えを指す。記号「＋」は、置換の組み合わせを示す。アミノ酸を、本明細書において以下の命名法に従ってその１文字表記または３文字表記によって示す：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：トレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。本明細書では、以下の用語法を用いて置換を命名する：Ｌ２３８Ａは、親配列の２３８位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が以下のアミノ酸のうちの１つによって置換されていることを示す：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、およびトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、および小型のアミノ酸（グリシン、アラニン、およびセリン）のグループ内にある。
【0115】
「トランスクリプトーム」は、特定の細胞、細胞集合物、試料、または組織タイプで産生された全て（またはほぼ全て）の遺伝子転写物の集合物を意味する。いくつかの実施形態では、トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｍｅ）は、細胞、細胞集合物、試料、または組織タイプの全てまたはほぼ全てのｐｏｌｙＡ伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。
【0116】
細胞、組織、または生物に関する「生存可能な」は、いくつかの実施形態では、細胞、組織、または生物が、成長、培養、またはさらに増殖することが可能であることを意味する。いくつかの実施形態では、生細胞は、生きており、有糸分裂または減数分裂することができ、結合したイニシエーターオリゴヌクレオチドの少なくとも１サイクルのテンプレートなしの酵素延長を受けた後にさらに成長することができる。用語「生細胞」は、生存可能な真核（ｅｕｒｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞、原核細胞、またはウイルスが含まれ得る。いくつかの実施形態では、「生細胞」は、生存可能な真核細胞を意味する；他の実施形態では、「生細胞」は、生存可能な哺乳動物細胞を意味する。「生存可能条件」は、この用語が本明細書中で使用される場合、細胞の生存度に実質的な悪影響を及ぼさない生理化学反応条件（例えば、温度、塩濃度、および溶媒など）である。いくつかの実施形態では、さらなる反応混合物の構成成分（例えば、ビタミンまたはアミノ酸など）が特定の細胞型の生存に必要であると理解される；すなわち、本明細書中で使用される場合、「生存可能条件」は、細胞の生存に必要な条件を指すが、あらゆる細胞型の生存に十分な条件ではない。いくつかの実施形態では、生存可能条件は、０．８～１．０パーセント（ｗ／ｖ）の範囲の濃度の生理学的塩類（特に、ナトリウム、カルシウム、および／またはカリウム）を有する水性反応混合物、ｐＨ６．８～７．８の範囲のｐＨ、および１５～４１℃の範囲の温度を含む。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】