▶ ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-01
(54)【発明の名称】自動バイオリアクターでの使用のための細胞単離
(51)【国際特許分類】
C12M 3/06 20060101AFI20220125BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220125BHJP
【ＦＩ】
C12M3/06
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021533208
(86)(22)【出願日】2019-12-11
(85)【翻訳文提出日】2021-07-21
(86)【国際出願番号】 US2019065731
(87)【国際公開番号】W WO2020123655
(87)【国際公開日】2020-06-18
(31)【優先権主張番号】62/778,078
(32)【優先日】2018-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512190365
【氏名又は名称】ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】マカフィー， エリカ
(72)【発明者】
【氏名】シー， ヤーリン
(72)【発明者】
【氏名】バンダパール， サマタ
(72)【発明者】
【氏名】アブラハム， エイタン
【テーマコード（参考）】
4B029
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA24
4B029BB11
4B029CC01
4B029DF02
4B029DF04
4B029DF06
4B029HA06
4B029HA09
(57)【要約】
本開示は、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットを提供し、自動化細胞工学システムは、自動処理のために標的細胞集団を捕捉するための細胞分離フィルタを含む。本開示はまた、標的細胞集団を分離する方法、ならびにカセットを使用し、かつ方法を行うための自動化細胞工学システムを提供する。
【選択図】図２Ｂ
【選択図】図２Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
自動化細胞工学システムで使用するためのカセットであって、（ａ）細胞試料入力部と、
（ｂ）前記細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタと、
（ｃ）前記細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバと、
（ｄ）前記細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部と、を含み、
前記カセットが、前記細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない、カセット。
【請求項2】
前記細胞分離フィルタが、細胞集団を捕捉するマトリックスを含む、請求項１に記載のカセット。
【請求項3】
前記マトリックスが、標的細胞を捕捉する、請求項２に記載のカセット。
【請求項4】
前記細胞分離フィルタの後の廃棄物収集チャンバをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項5】
前記細胞分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システムをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項6】
前記細胞分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステムと、任意選択で、前記細胞分離フィルタと前記細胞培養チャンバとの間に位置する標的細胞集団保持チャンバと、をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項7】
１つ以上の流体経路をさらに含み、前記流体経路が、前記細胞培養チャンバ内の細胞を乱すことなく、前記細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配をもたらす、請求項１～６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項8】
前記細胞培養チャンバが、低チャンバ高さを有する平坦な非可撓性チャンバである、請求項１～７のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項9】
前記カセットが、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地で予め充填されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項10】
前記バックフラッシュ培地が、抗凝固剤を含有する、請求項９に記載のカセット。
【請求項11】
ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および／または光学密度センサのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項12】
１つ以上のサンプリングポートをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項13】
自動化細胞工学システムで使用するためのカセットであって、（ａ）細胞試料入力部と、
（ｂ）前記細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタであって、前記細胞分離フィルタが、免疫細胞を捕捉するマトリックスを含む、細胞分離フィルタと、
（ｃ）前記免疫細胞を収容するように構成されたチャンバ体積を有する前記免疫細胞の活性化、形質導入、および／または伸長を行うための細胞培養チャンバと、
（ｄ）前記細胞分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステムと、
（ｅ）前記細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部と、を含み、
前記カセットが、前記細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない、カセット。
【請求項14】
前記細胞分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システムをさらに含む、請求項１３に記載のカセット。
【請求項15】
前記細胞培養チャンバに接続された１つ以上の流体経路をさらに含み、前記流体経路が、前記細胞培養チャンバ内の免疫細胞を乱すことなく、前記細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配をもたらす、請求項１３または１４に記載のカセット。
【請求項16】
前記細胞分離フィルタの後の廃棄物収集チャンバをさらに含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項17】
前記細胞分離フィルタと前記細胞培養チャンバとの間に位置する免疫細胞保持チャンバをさらに含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項18】
前記細胞培養チャンバが、低チャンバ高さを有する平坦な非可撓性チャンバである、請求項１３～１７のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項19】
前記カセットが、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地で予め充填されている、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項20】
前記流体経路のうちの１つ以上が、チューブ構成要素を介した酸素化を可能にするシリコンベースの前記チューブ構成要素を含む、請求項１３～１９のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項21】
自動処理のために標的細胞集団を調製する方法であって、前記方法が、（ａ）前記標的細胞集団を含有する細胞試料を、自動化細胞工学システムのカセットに導入することと、
（ｂ）前記細胞試料を細胞分離フィルタに通過させることと、
（ｃ）前記細胞試料から前記標的細胞集団を、前記細胞分離フィルタのマトリックス上に捕捉することと、
（ｄ）前記細胞分離フィルタをバックフラッシュすることと、
（ｅ）前記標的細胞集団が自動処理を受けることができるように、前記細胞分離フィルタから前記標的細胞集団を移送することと、を含む、方法。
【請求項22】
前記移送することが、前記標的細胞集団が自動処理を受けることができるように、前記標的細胞集団を標的細胞集団保持チャンバ、形質導入システム、トランスフェクションのためのシステム、または細胞培養チャンバに移送することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記形質導入システムが、エレクトロポレーションシステムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記バックフラッシュの前に、前記細胞分離フィルタ上の前記捕捉された標的細胞集団を洗浄することをさらに含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞分離フィルタを介して、前記細胞試料から不要な廃棄物を廃棄物収集チャンバに通過させることをさらに含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞分離フィルタを介して前記細胞試料を前記通過させることが、重力濾過を介して行われる、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記方法が、前記標的細胞集団を前記細胞分離フィルタから前記移送した後の遠心分離を除外する、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記自動処理の後に、前記カセットから前記標的細胞集団を収集することをさらに含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
（ａ）密閉可能ハウジングと、（ｂ）前記密閉可能ハウジング内に包含されたカセットであって、前記カセットが、
ｉ．細胞試料入力部、
ｉｉ．前記細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタ、
ｉｉｉ．前記細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバ、および
ｉｖ．前記細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部であって、前記カセットが、前記細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない、細胞試料出力部、を含む、カセットと、
（ｃ）ユーザから入力を受信するためのユーザインターフェースと、を含む、自動化細胞工学システム。
【請求項30】
前記カセットの前記細胞分離フィルタが、細胞集団を捕捉するマトリックスを含む、請求項２９に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項31】
前記マトリックスが、標的細胞を捕捉する、請求項３０に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項32】
前記カセットが、前記細胞分離フィルタの後の廃棄物収集チャンバをさらに含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項33】
前記カセットが、前記細胞分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システムをさらに含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項34】
前記カセットが、前記細胞分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステムと、任意選択で、前記細胞分離フィルタと前記細胞培養チャンバとの間に位置する標的細胞集団保持チャンバと、をさらに含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項35】
前記カセットが、１つ以上の流体経路をさらに含み、前記流体経路が、前記細胞培養チャンバ内の細胞を乱すことなく、前記細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配をもたらす、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項36】
前記カセットの前記細胞培養チャンバが、低チャンバ高さを有する平坦な非可撓性チャンバである、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項37】
前記カセットの前記細胞培養チャンバが、バッグまたはハードチャンバである、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項38】
前記カセットが、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地で予め充填されている、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項39】
前記バックフラッシュ培地が、抗凝固剤を含有する、請求項３８に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項40】
前記カセットが、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および／または光学密度センサのうちの１つ以上をさらに含む、請求項２９～３９のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項41】
前記カセットが、１つ以上のサンプリングポートをさらに含む、請求項２９～４０のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【請求項42】
コンピュータ制御システムをさらに含み、前記ユーザインターフェースが、前記コンピュータ制御システムに結合され、前記自動化細胞工学システムに命令を提供する、請求項２９～４１のいずれか一項に記載の自動化細胞工学システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットを提供し、自動化細胞工学システムは、自動処理のために標的細胞集団を捕捉するための細胞分離フィルタを含む。本開示はまた、標的細胞集団を分離する方法、ならびにカセットを利用して方法を行うことができる自動化細胞工学システムを提供する。
【背景技術】
【0002】
先進的な細胞治療の臨床導入が加速されることが期待される中、これらの療法が世界中の患者に恩恵をもたらすための基礎的な製造戦略に注目が集まっている。細胞療法は、臨床的に大きな可能性を秘めているが、診療報酬に比べて製造コストが高いため、商業化には高い障壁となっている。したがって、費用対効果、プロセス効率、および産物の一貫性の必要性から、多くの細胞療法分野における自動化の取り組みが推進されている。
【0003】
療法のための細胞集団の生成には、種々のプロセスの自動化が必要となる。これには、これらの重要な療法を幅広い患者集団の翻訳のために、細胞の活性化、形質導入、伸長を商業製造プラットフォームに統合することが含まれる。
【0004】
加えて、自動細胞処理プラットフォームでは、細胞集団が外部環境に曝露される回数またはステップを限定して、汚染および他の問題を限定することが強く望まれている。自動化されたシステムに細胞試料を直接提供し得るプロセスが必要とされており、システムでは、任意の細胞単離または細胞濾過が自動化されたシステム内で行われるため、細胞が環境に曝露されるステップの総数を、種々の自動プロセス後の導入および収集に限定することができる。
［発明の概要］
［発明の概要］
【0005】
本明細書において、一部の実施形態では、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットであって、細胞試料入力部と、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタと、細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバと、細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部と、を含む、カセットが提供される。好適には、カセットは、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない。
【0006】
追加の実施形態では、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットであって、細胞試料入力部と、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタであって、細胞分離フィルタが、免疫細胞を捕捉するマトリックスを含む、細胞分離フィルタと、免疫細胞を収容するように構成されたチャンバ体積を有する免疫細胞の活性化、形質導入、および／または伸長を行うための細胞培養チャンバと、細胞分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステムと、細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部と、を含む、カセット。好適には、カセットは、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない。
【0007】
本明細書において、追加の実施形態では、自動処理のために標的細胞集団を調製する方法であって、方法が、標的細胞集団を含有する細胞試料を、自動化細胞工学システムのカセットに導入することと、細胞試料を細胞分離フィルタに通過させることと、細胞試料から標的細胞集団を、細胞分離フィルタのマトリックス上に捕捉することと、細胞分離フィルタをバックフラッシュすることと、標的細胞集団が自動処理を受けることができるように、細胞分離フィルタから標的細胞集団を移送することと、を含む、方法が提供される。
【0008】
また、本明細書では、密閉可能ハウジングと、密閉可能ハウジング内に包含されたカセットであって、カセットが、細胞試料入力部、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタ、細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバ、および細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部であって、カセットが、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない、細胞試料出力部、を含む、カセットと、ユーザから入力を受信するためのユーザインターフェースと、を含む、自動化細胞工学システムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本明細書の実施形態に記載される、自動化細胞工学システムのカセットで実施され得る種々のステップを示す。
【図2A】本明細書の実施形態による例示的なカセットを示す。
【図2B】本明細書の実施形態による例示的な細胞分離フィルタを示す。
【図2C】本明細書の実施形態による例示的な細胞分離フィルタを示す。
【図3A】本明細書の実施形態による自動化細胞工学システムの画像を示す。
【図3B】本明細書の実施形態による自動化細胞工学システムの画像を示す。
【図4】本明細書の実施形態に記載される、例示的な細胞工学システムを包含するラボ空間を示す。
【図5】本明細書の実施形態に記載される、自動化細胞工学システムのカセット内の細胞分離および単離のためのフローパスを示す。
【図6A】ドナー１の全血細胞単離Ｆｉｃｏｌｌおよび細胞分離濾過方法を介した白血球単離後の細胞生存率（％）の比較を示す。
【図6B】ドナー１の全血後の総細胞収率のＦｉｃｏｌｌと細胞分離濾過処理との比較を示す。
【図7A】Ｆｉｃｏｌｌおよび濾過方法を介した全血処理後の１１日間の培養の総細胞収率を示す。
【図7B】Ｆｉｃｏｌｌおよび濾過を介した全血処理後の重複Ｔ－２５フラスコ培養物の平均培養生存率（％）を示す。
【図8A】ドナー２の全血細胞単離Ｆｉｃｏｌｌおよび濾過方法を介した白血球単離後の細胞生存率（％）の比較を示す。
【図8B】ドナー２の全血後の総細胞収率のＦｉｃｏｌｌと濾過処理との比較を示す。
【図9A】Ｆｉｃｏｌｌおよび濾過方法を介した白血球単離後のロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｋ）ドナー細胞生存率（％）の比較を示す。
【図9B】全血Ｆｉｃｏｌｌおよび濾過処理後のロイコパックドナー総細胞収率の比較を示す。
【図10】ＦＡＣＳ分析のゲーティング戦略を示す。
【図11】ドナー１の濾過およびＦｉｃｏｌｌ単離された全血コレクション試料由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞との割合を示す。
【図12】ドナー２の濾過およびＦｉｃｏｌｌ単離された全血コレクション試料由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞との割合を示す。
【図13】濾過およびＦｉｃｏｌｌ単離されたロイコパックのコレクション試料由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞との割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書に示され、記載される特定の実施態様は、実施例であり、それ以外の場合は、いかなる方法でも本出願の範囲を限定することを意図しないことを理解されたい。
【0011】
本明細書で言及される公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、および科学文献は、各々が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される任意の参照と本明細書の特定の教示との間に任意の矛盾がある場合、後者のために解決されるものとする。同様に、本明細書で具体的に教示されている単語または語句の技術分野の定義と単語または語句の定義との間に任意の矛盾がある場合、後者のために解決されるものとする。
【0012】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明示的に別様に示さない限り、それらが参照する用語の複数形も具体的に包含する。「約」という用語は、本明細書では、およそ、その領域内、おおよそ、またはその前後を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、それは、記載された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、数値を、記載された値の上下に２０％の変動で修正するために使用される。
【0013】
本明細書で使用される技術用語および科学用語は、別段定義されない限り、本出願に関連する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書では、当業者に既知の種々の方法論および材料が参照される。
【0014】
実施形態では、本明細書では、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットが提供される。図１は、密封された自動化システムにおいて種々のプロセスを行い得る例示的なカセット１０２を示しており、システムにより、種々の細胞試料および集団の生成が可能となる。かかるプロセスには、活性化、形質導入、伸長、濃縮、および収集／採取ステップが含まれ得る。
【0015】
本明細書に記載されるように、カセットおよび方法は、活性化、形質導入、伸長、濃縮、および採取などのステップを実施するための命令を好適に有する、完全に密封された自動化細胞工学システム３００（図３Ａ、図３Ｂを参照されたい）において好適に利用され、行われる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む遺伝子改変免疫細胞の自動生成のための細胞工学システムが、２０１８年８月３１日に出願された米国特許出願第１６／１１９，６１８号に記載されており（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、システムは、自動化細胞工学システム、ＣＯＣＯＯＮ、またはＣＯＣＯＯＮシステムとも称される。
【0016】
例えば、ユーザは、細胞培養および試薬（例えば、活性化試薬、ベクター、細胞培養培地、栄養素、選択試薬など）、ならびに細胞産生のためのパラメータ（例えば、細胞の開始数、培地の種類、活性化試薬の種類、ベクターの種類、生成される細胞の数または用量など）で予め充填された自動化細胞工学システムを提供することができ、自動化細胞工学システムは、ユーザからさらなる入力なしに、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む遺伝子改変免疫細胞培養物を生成する方法を含む種々の自動化方法を行うことができる。一部の実施形態では、完全に密封された自動化細胞工学システムは、細胞培養物の非滅菌環境への曝露を低減することによって、細胞培養物の汚染を最小限に抑える。追加の実施形態では、完全に密封された自動化細胞工学システムは、ユーザの細胞の取り扱いを低減することによって、細胞培養物の汚染を最小限に抑える。
【0017】
本明細書に記載されるように、自動化細胞工学システム３００は、カセット１０２を好適に含む。したがって、実施形態では、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットが本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「カセット」は、大部分が自己完結型で、取り外し可能で、交換可能な自動化細胞工学システムの要素を指しており、システムには、本明細書に記載の方法の種々の要素を行うための１つ以上のチャンバが含まれ、好適には、細胞培地、活性化試薬、洗浄培地などのうちの１つ以上も含まれる。
【0018】
図２Ａは、自動化細胞工学システムで使用するための例示的なカセット１０２を示している。実施形態では、カセット１０２は、細胞試料入力部２０２を含む。細胞試料入力部２０２は、カセット１０２への導入または充填の前に細胞試料が配置され得る、バイアルまたはチャンバとして図２Ａに示されている。他の実施形態では、細胞試料入力部２０２は、単純に、シリンジまたは血液バッグなどの細胞含有バッグが接続され得る滅菌ロックチューブ（例えばルアーロックチューブ接続など）であり得る。
【0019】
カセット１０２は、カセット内に位置し、細胞試料入力部２０２に流体接続された細胞分離フィルタ２０４をさらに含む。本明細書で使用される場合、「流体接続される」とは、カセット１０２を含むシステムの１つ以上の構成要素が、流体（ガスおよび液体を含む）が漏れるか、または体積を失うことなく構成要素間を通過することができるようにする好適な要素を介して接続されることを意味する。例示的な流体接続として、種々のチューブ、チャネル、およびシリコーンまたはゴムチューブ、ルアーロック接続などのような当該技術分野で既知の接続が挙げられる。流体接続された構成要素は、流体接続を依然として維持しながら、構成要素の各々の間に追加の要素も含み得ることを理解されたい。すなわち、流体接続された構成要素は、構成要素間を通過する流体もこれらの追加の要素を通過することができるように、追加の要素を含み得るが、そうする必要はない。
【0020】
カセット１０２は、細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバ２０６をさらに好適に含む。細胞培養チャンバ２０６の特徴および使用例が本明細書に記載されている。
【0021】
実施形態では、カセット１０２は、細胞培養チャンバに接続された１つ以上の流体経路をさらに含む（図２Ａのカセット１０２の内部を参照）。カセット１０２には、細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部２０８も含まれる。本明細書に記載されるように、細胞試料出力部２０８は、患者におけるさらなる処理、保管、または潜在的な使用のいずれかのための種々の自動化手順に従って、細胞を採取するために利用される。流体経路の例としては、本明細書に記載するように、カセットの要素に栄養素、溶液などを提供する種々のチューブ、チャネル、キャピラリ、マイクロ流体要素などが挙げられる。
【0022】
本明細書に記載されるように、カセット１０２は、細胞分離フィルタ２０４の後の遠心分離器を明示的に除外している。「細胞分離フィルタの後の」には、遠心分離器が細胞分離フィルタの下流に含まれない実施形態、または遠心分離器が細胞分離フィルタ後のバックフラッシュの下流に含まれない実施形態が含まれる。本明細書に記載の種々の細胞分離フィルタおよび方法の使用により、遠心分離手順を介する追加の細胞分離および遠心分離器の使用は必要ないと判明した。ただし、実施形態では、カラム濾過、接線流濾過、および／または磁気濾過システムなどのさらなる濾過システムを利用することができる。
【0023】
例示的な実施形態では、細胞分離フィルタ２０４は、細胞集団、好適には標的細胞を捕捉するマトリックスを含む。好適なマトリックス材料としては、ガスプラズマで処理された種々の多孔質媒体が挙げられる。多孔質媒体は、天然もしくは合成繊維もしくは織物材料であってもよいか、または焼結粉末材料であってもよい。例示的なマトリックス材料としては、例えば、米国特許第４，７０１，２６７号、同第４，９３６，９９８号、同第４，８８０，５４８号、同第４，９２３，６２０号、同第４，９２５，５７２号、および同第５，６７９，２６４号に開示されているものが挙げられ、これらの各々の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「標的細胞集団」または「標的細胞」は、所望のサブセットの細胞を指し、この「標的細胞集団」または「標的細胞」は、残りの標的細胞集団が他の細胞型をほとんど含まないように、デブリまたは他の汚染物質を含むより大きな細胞集団から分離される。例示的な標的細胞集団としては、免疫細胞、癌細胞などが挙げられる。
【0024】
例示的な細胞分離フィルタは、好適には、免疫細胞の捕捉を可能にするマトリックスを含む。すなわち、マトリックスが、マトリックス上またはマトリックス内に免疫細胞を維持する。本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、好塩基球、好酸球、好中球、白血球などを含み、肥満細胞、樹状細胞、自然殺傷細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞などのような細胞を含む。本明細書に記載されるように、カセットおよび細胞分離フィルタを好適に使用して、全血細胞試料または白血球形成試料（白血球が全血から分離される試料）を含む細胞試料から免疫細胞を分離する。
【0025】
図２Ｂおよび図２Ｃは、本明細書に記載のカセットおよび方法で使用するための例示的な細胞分離フィルタを示している。図２Ｂは、サルベージ血液（ヘモネティクス、マサチューセッツ州ブレーンツリー）のための白血球フィルタおよび図２Ｃのシリンジフィルタ（ＰＡＬＬアクロディスク（ＡＣＲＯＤＩＳＣ）（登録商標）、ＰＡＬＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州ポートワシントン）を示している。
【0026】
追加の実施形態では、カセット１０２は、細胞分離フィルタ２０４の後に、分離フィルタに流体接続された廃棄物収集チャンバ５１０（図２Ａのカセット１０２内に包含される）を好適に含む。カセットのフローパス内の廃棄物収集チャンバ５１０の例示的な位置が図５に示されている。廃棄物収集チャンバ５１０は、細胞分離フィルタを通過する廃棄物がさらなる処理または処分のいずれかのために保持され得るように、好適に、後続または下流に位置決めされる（すなわち、細胞分離フィルタの後に流体接続される）。収集され得る廃棄物は、これには、望ましくない細胞、全細胞または溶解細胞のいずれか、ならびに血液成分、ならびに濾過されている細胞試料内の潜在的な汚染物質を好適に含み得る。廃棄チャンバ５１０は、カセット１０２内の固体チャンバもしくはバッグの形態であってもよく、またはカセットの外部にあるが、チューブおよびサンプリングポートなどの流体経路を介して接続されるバッグもしくはチャンバであってもよい。
【0027】
実施形態では、カセット１０２は、カセット１０２内（すなわち、図２Ａに示される構造内）に好適に包含され、分離フィルタ２０４に流体接続される細胞洗浄システム５１２を含む。図５に示されるように、細胞洗浄システム５１２は、分離フィルタ２０４への直接流体経路を可能にするために、カセット１０２の種々の入力ポートの１つに接続され得る。実施形態では、細胞洗浄システム５１２は、カセット内に包含される容器またはバッグであり、カセットは、細胞洗浄培地を好適に含む。細胞洗浄培地は、細胞分離フィルタからカセットの別の部分に標的細胞集団を移送する前に、標的細胞集団および分離フィルタを洗浄し、任意の望ましくない廃棄細胞または標的細胞集団からの汚染を除去するために好適に使用される。細胞洗浄システム５１２はまた、カセット１０２の外側に含まれ得る。さらなる実施形態では、細胞洗浄システム５１２を使用して、標的細胞集団保持チャンバ内に保持されている細胞を洗浄することができる。
【0028】
追加の実施形態では、カセット１０２は、バックフラッシュシステム５１４（カセット１０２の内部に好適に位置しているため、図２では図示せず）を含むが、これは、カセットのためのフローパスの要素として図５に示されている。細胞洗浄システム５１２と同様に、バックフラッシュシステム５１４は、好適には、カセット内に包含される容器またはバッグであり、カセット１０２の種々の入力ポートのうちの１つ以上に接続して、分離フィルタ２０４への直接流体経路を可能にし得る。バックフラッシュシステム５１４はまた、カセットの外部に含まれ得る。本明細書に記載されるように、バックフラッシュシステム５１４は、バックフラッシュシステム内に包含されるバックフラッシュ培地を細胞分離フィルタ２０４内に、またはその上に逆の方法で導入して、分離フィルタによって捕捉された細胞を、フィルタから、保持チャンバまたは細胞培養チャンバを含むカセットの別のセクションに移送し得るように、分離フィルタ２０４に好適に流体接続される。
【0029】
カセット１０２はまた、細胞分離フィルタと細胞培養チャンバとの間に位置する標的細胞集団保持チャンバ５１６（カセット１０２内に位置するため、図２では図示せず）をさらに任意選択で含み得る。図５は、カセットのためのフローパス中の標的細胞集団保持チャンバ５１６の例示的な位置を示している。標的細胞集団保持チャンバ５１６は、好適には、カセット内に位置するリザーバまたは好適なチャンバであり、ここで、分離フィルタ２０４上で捕捉された標的細胞集団がカセットの中に入り、次いで、捕捉された細胞が、標的細胞集団保持チャンバ５１６に移送するためにバックフラッシュシステム５１４を介してバックフラッシュされる。
【0030】
本明細書に記載されるように、種々のチューブ要素を含み得る流体経路は、細胞培養チャンバ内の細胞を乱すことなく、細胞培養チャンバを含むカセットの種々の部分への再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配を好適にもたらす。カセット１０２はまた、本明細書に記載されるように、カセットを通過する流体を駆動するための１つ以上のポンプ５２０および蠕動ポンプを含む関連チューブ、ならびに種々の流体経路を通過する流れを制御するための１つ以上の弁５２２をさらに含む（流体経路内の例示的な位置については、図５を参照されたい）。
【0031】
例示的な実施形態では、図２Ａに示すように、細胞培養チャンバ２０６は、平坦な非可撓性チャンバ（すなわち、プラスチックなどの実質的に非可撓性の材料から作製される）であり、チャンバは、容易に屈曲または湾曲することはない。非可撓性チャンバの使用により、細胞が実質的に乱れていない状態に維持することが可能になる。図２Ａに示されるように、細胞培養チャンバ２０６は、免疫細胞培養物が細胞培養チャンバの底部全体に拡散することを可能にするように配向される。図２Ａに示されるように、細胞培養チャンバ２０６は、床またはテーブルと平行な位置に好適に維持され、細胞培養物が乱されていない状態に維持され、細胞培養チャンバの底部の大きな領域全体に細胞培養物が拡散することが可能となる。実施形態では、細胞培養チャンバ２０６の全体的な厚さ（すなわち、チャンバの高さ）は、約０．５ｃｍ～約５ｃｍ程度と低い。好適には、細胞培養チャンバは、約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌ、より好適には約５０ｍｌ～約２００ｍｌの容量を有するか、または細胞培養チャンバは、約１８０ｍｌの容量を有する。低チャンバ高さ（５ｃｍ未満、好適には４ｃｍ未満、３ｃｍ未満、または２ｃｍ未満）を使用することで、細胞に近い効果的な培地およびガス交換が可能となる。ポートは、細胞を乱すことなく、流体の再循環を介して混合を可能にするように構成されている。より大きな高さの静的血管は、濃度勾配を生成し得、これにより、細胞の近くの領域で酸素および新鮮な栄養素が限定される。フローダイナミクスを制御することで、細胞が乱れることなく培地交換を実施することができる。培地は、細胞喪失のリスクなしに（細胞が存在しない）追加のチャンバから除去され得る。他の実施形態では、細胞培養チャンバ２０６は、バッグまたはハードチャンバである。
【0032】
本明細書に記載されるように、例示的な実施形態では、カセットは、細胞培養物、培養培地、細胞洗浄培地、バックフラッシュ培地、活性化試薬、および／またはこれらの任意の組み合わせを含むベクターのうちの１つ以上で予め充填されている。さらなる実施形態では、これらの種々の要素は、好適な注入ポートなどを介して後から追加することができる。例示的な実施形態では、バックフラッシュ培地は、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝固剤を好適に含有し、分離フィルタから移送される標的細胞集団の凝集を低減する。
【0033】
本明細書に記載されるように、実施形態では、カセットは、ｐＨセンサ５２４、グルコースセンサ（図示せず）、酸素センサ５２６、二酸化炭素センサ（図示せず）、乳酸センサ／モニタ（図示せず）、および／または光学密度センサ（図示せず）のうちの１つ以上を好適にさらに含む。フローパス内の例示的な位置については、図５を参照されたい。カセットはまた、１つ以上のサンプリングポートおよび／または注入ポートを含み得る。かかるサンプリングポート２２０および注入ポート（２２２）の例が図２Ａに示され、フローパス内の例示的な位置が図５に示されており、これらには、カートリッジをエレクトロポレーションユニットまたは追加の培地源などの外部デバイスに接続するためのアクセスポートが含まれ得る。図２Ａはまた、細胞試料入力部２０２、細胞培地などを加温するために使用され得る試薬加温バッグ２２４、および二次チャンバ２３０の位置を示している。
【0034】
実施形態では、カセット１０２は、低温チャンバを好適に含み、低温チャンバは、細胞培養培地の保管に好適な冷蔵領域２２６、ならびに細胞培養の活性化、形質導入、トランスフェクション、および／または伸長を行うのに好適な高温チャンバを含み得る。好適には、高温チャンバは、サーマルバリアによって低温チャンバから分離される。本明細書で使用される場合、「低温チャンバ」は、細胞培地などを冷蔵温度で維持するために、室温未満で好適に維持されるチャンバを指し、より好適には約４℃～約８℃で維持されるチャンバを指す。低温チャンバは、培地のためのバッグまたは他のホルダを含み得、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、または約５Ｌの流体を含む。追加の培地バッグまたは他の流体源は、カセットに外部に接続され、アクセスポートを介してカセットに接続され得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、「高温チャンバ」は、室温を上回って好適に維持され、細胞増殖および成長を可能にするためにより好適な温度、すなわち、約３５～４０℃、およびより好適に約３７℃の温度で維持されるチャンバを指す。実施形態では、高温チャンバは、細胞培養チャンバ２０６（全体を通して増殖チャンバまたは細胞増殖チャンバとも称される）を好適に含む。
【0036】
図３Ａ～図３Ｂは、内部に位置決めされるカセット１０２（図３Ｂにおいて開放されている自動化細胞工学システムのカバー）を有するＣＯＣＯＯＮ自動化細胞工学システム３００を示している。また、バーコードリーダー、およびタッチパッドまたは他の同様のデバイスによる入力を使用して受信する能力を含み得る例示的なユーザインターフェースも示されている。
【0037】
本明細書に記載される自動化細胞工学システムおよびカセットは、好適には、３つの関連する体積、すなわち細胞培養チャンバ体積、作業体積、および総体積を有する。好適には、カセットで使用される作業体積は、プロセスステップに基づく１８０ｍＬ～４６０ｍＬの範囲であり、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、または約１Ｌまで増加させることができる。実施形態では、カセットは、４×１０９個の細胞～１０×１０９個の細胞を容易に実現することができる。プロセス中の細胞濃度は、０．３×１０６細胞／ｍｌ～およそ１０×１０６細胞／ｍｌで変化する。細胞は、細胞培養チャンバ内に位置しているが、培地は、本明細書に記載されるように、追加のチャンバ（例えば、クロスフローリザーバおよびサテライト体積）を通じて連続的に再循環され、作業体積を増加させる。
【0038】
ガス交換ラインを含む流体経路は、例えばシリコーンなどのガス透過性材料から作製されてもよい。一部の実施形態では、自動化細胞工学システムは、細胞生成方法の間、実質的に非収量のチャンバ全体に酸素を再循環させる。したがって、一部の実施形態では、自動化細胞工学システムにおける細胞培養物の酸素レベルは、可撓性のガス透過性バッグ内の細胞培養物の酸素レベルよりも高い。酸素レベルの増加により、細胞の成長および増殖の増加がサポートされ得るため、細胞培養伸長ステップでは、より高い酸素レベルが重要になる可能性がある。
【0039】
実施形態では、本明細書に記載の方法およびカートリッジは、ＣＯＣＯＯＮプラットフォーム（Ｏｃｔａｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（オンタリオ州キングストン））を利用しており、プラットフォームにより、単一のターンキープラットフォームで複数の単位動作が統合される。非常に具体的な細胞の処理目的に合わせて、複数の細胞プロトコルが用意されている。効率的かつ効果的な自動化翻訳を提供するために、記載される方法は、複数の単位動作を組み合わせるアプリケーション固有／スポンサー固有のディスポーザブルカセットの概念を利用しており、全て、最終細胞療法産物の中核的要件に焦点を当てている。複数の自動化細胞工学システム３００は、大容量の細胞または個々の患者のための複数の異なる細胞試料を生成するために、一緒に大規模なマルチユニット動作に統合され得る（図４を参照されたい）。
【0040】
追加の実施形態では、自動化細胞工学システム３００で使用するためのカセット１０２が本明細書に提供されている。好適には、カセットは、細胞試料入力部２０２、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタ２０４を含み、細胞分離フィルタは、免疫細胞を捕捉するマトリックスを含む。カセット１０２は、免疫細胞を収容するように構成されたチャンバ体積を有する免疫細胞の活性化、形質導入、トランスフェクション、および／または伸長を行うための細胞培養チャンバ２０６をさらに含む。カセット１０２はまた、分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステム５１４と、細胞を採取するために細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部２０８と、をさらに好適に含む。本明細書に記載されるように、カセットは、好適には、細胞分離フィルタの後（または細胞分離フィルタの前）に遠心分離器を含まない。
【0041】
追加の実施形態では、本明細書に記載されるように、カセットは、分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システム５１２をさらに含み得る。好適には、カセットは、細胞培養チャンバに接続された１つ以上の流体経路をさらに含み得、流体経路は、細胞培養チャンバ内の免疫細胞を乱すことなく、細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配を好適にもたらす。例示的な実施形態では、流体経路は、チューブ構成要素を通じた酸素化を可能にするシリコンベースのチューブ構成要素を含む。
【0042】
実施形態では、カセットはまた、分離フィルタ２０４の後に好適に廃棄物収集チャンバ５１０をさらに含む。追加の実施形態では、カセットは、細胞分離フィルタと細胞培養チャンバとの間に好適に位置する免疫細胞保持チャンバ５１６を含み得る。
【0043】
本明細書に記載されるように、実施形態では、細胞培養チャンバ２０６は、低チャンバ高さを有する平坦な非可撓性チャンバである。
【0044】
好適な実施形態では、カセットは、本明細書に記載されるように、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地で予め充填されている。
【0045】
さらなる実施形態では、自動処理のための標的細胞集団を調製する方法が本明細書に提供される。本明細書に記載のように、本方法は、好適には、全血試料を含む細胞の試料の導入を可能にし、次いで、さらなる処理のためにこの細胞試料から所望のまたは標的細胞集団を分離し、本明細書に記載されるもののような自動化細胞工学システムにおける、好適にさらに自動化された処理を可能にする。
【0046】
例示的な方法では、標的細胞集団を含有する細胞試料が、自動化細胞工学システム３００のカセット１０２に導入される。本明細書に記載のように、例示的な細胞試料としては、血液試料（全血を含む）、組織試料、体液試料などが挙げられる。
【0047】
実施形態では、方法を行うためのカセットを示す図２Ａ、およびカセットプロセスのフローパスまたはフローチャートを示す図５を参照して記載したように、細胞試料は、細胞試料入力部２０２に好適に導入される。細胞試料は、例えば、シリンジ、容器、バイアル、血液バッグなどから導入することができる。
【0048】
実施形態では、図５に示すように、細胞試料の導入の後に、細胞試料は、ポンプ５２０によって駆動されながら、制御弁（５２２）Ｖ３を通過し、流体経路（一般的には５４０とラベル付けされる）を通過する。
【0049】
次いで、細胞試料は、弁Ｖ１１を通過した後、分離フィルタ２０４を好適に通過する。本明細書に記載されるように、細胞分離フィルタ２０４は、所望の細胞集団を捕捉するためのマトリックスを好適に含み、これには、細胞試料由来の標的細胞集団が含まれる。
【0050】
例示的な実施形態では、バックフラッシュが発生し、その間、細胞分離フィルタ２０４は、バックフラッシュシステム５１２から好適にバックフラッシュされる。かかる実施形態では、バックフラッシュ培地は、細胞分離フィルタをバックフラッシュするために、バックフラッシュシステム５１２に包含され、弁Ｖ４を通過し、弁Ｖ１２および弁Ｖ１を通ってポンプ５２０を介して駆動される。このバックフラッシュは、細胞分離フィルタのマトリックス上に捕捉された標的細胞集団を移送し、その結果、標的細胞集団をフィルタから除去し、（さらなる自動処理を含む）さらなる処理を受けることができる。好適には、細胞がさらなる自動処理手順を受けるにつれて、標的細胞集団の凝固を限定するために、抗凝固剤を含有するバックフラッシュ培地を使用したバックフラッシュが生じる。
【0051】
実施形態では、細胞分離フィルタのマトリックスから除去される標的細胞集団は、例えば、弁Ｖ１１を通過することによって、標的細胞集団保持チャンバ５１６に移送することができる。さらなる実施形態では、細胞分離フィルタのマトリックスから除去される標的細胞集団は、弁Ｖ１１およびＶ９を通過した後、試料ポート（例えば、Ｒ５またはＲ６）を好適に通過して形質導入システム（図示せず）、トランスフェクションシステム（すなわち、非ウイルス法）に移送することができる。例示的な形質導入システムは、当該技術分野で既知であり、例示的なトランスフェクションシステムは、エレクトロポレーションシステムなどを含み、カセット１０２内に含まれ得るか、またはカセット１０２の外部であり得る。追加の実施形態では、細胞分離フィルタのマトリックスから除去される標的細胞集団は、例えば、弁Ｖ１１を通過し、次いで弁Ｖ５またはＶ６を通過することによって、細胞培養チャンバ２０６に移送することができる。本明細書に記載されるように、細胞分離フィルタ後のこれらの種々の要素は、標的細胞集団が、形質導入、トランスフェクション、成長、伸長などを含むさらなる自動処理を受けることを可能にする。
【0052】
追加の実施形態では、本方法は、バックフラッシュの前に、細胞分離フィルタ上で捕捉された標的細胞集団を洗浄することをさらに含み得る。例えば、細胞洗浄システム５１２は、カセット１０２内に包含されるバッグであり得、細胞洗浄培地を含む。細胞洗浄システム５１２は、ポンプ５２０を介して、細胞洗浄培地を弁Ｖ４およびＶ１１に通過させて、細胞分離フィルタ２０４上で捕捉された標的細胞集団を洗浄することができる。好適には、標的細胞集団は、弁Ｖ１およびＶ１３を介して、細胞分離フィルタから廃棄物収集チャンバ５１０に追加の不要な廃棄物が渡される一方で、細胞分離フィルタのマトリックス上に残留する。例示的な実施形態では、細胞試料からの不要な廃棄物は、弁Ｖ１およびＶ１３を介して、細胞分離フィルタを通過し、廃棄物収集チャンバ５１０に入り得る。好適に追加の実施形態は、例えば、弁Ｖ１、Ｖ１２、およびＶ１１を通過することにより、細胞試料由来の廃棄物を、細胞分離フィルタを通して戻して別の濾過サイクルを完了することによって、細胞試料のさらなる濾過が可能となる。細胞洗浄はまた、細胞洗浄培地を標的細胞保持チャンバ５１６に移送し、さらなる処理の前にチャンバ内に保持されている細胞を洗浄することによって、細胞洗浄システム５１２を介して行われ得る。
【0053】
例示的な実施形態では、細胞試料を好適な細胞分離フィルタ２０４に通過させることは、重力濾過を介して行われる。すなわち、細胞分離フィルタを介して細胞試料を駆動させるためにポンプ機構は使用されない。しかしながら、追加の実施形態では、ポンプ５２０を使用して、細胞分離フィルタを通して試料を駆動し、細胞試料に正または負の圧力を生成することができる。シリンジまたは他の機構を使用して、細胞分離フィルタを通して細胞試料を通過させるために、必要に応じて追加の正または負の圧力を提供することもできる。
【0054】
例示的な実施形態では、所望の自動処理の後、標的細胞集団は、好適に収集される。この収集は、試料出力部２０８を介して、または種々の試料ポート２２０のうちの１つを介して生じ得る。
【0055】
全体を通して記載されるように、本明細書に記載されるカセットおよび方法は、遠心分離器、ならびに遠心分離の使用を好適に除外している。好適には、本方法は、標的細胞集団を細胞分離フィルタから移送した後の遠心分離を除外する。この移送は、細胞分離フィルタを介した捕捉の直後に行われるか、または細胞分離フィルタからのバックフラッシュを介して行われるかを問わない。遠心分離を除外することにより、標的細胞集団は、過酷な遠心分離条件を必要とせずに、単純な濾過を介して細胞試料から分離し得ることが判明した。これには、標的細胞集団を全血の試料から除去することが含まれる。
【0056】
しかしながら、さらなる実施形態では、磁気分離プロセスを利用して、標的細胞集団から望ましくない細胞およびデブリをさらに排除および分離することができる。かかる実施形態では、生体分子（例えば、抗体、抗体断片など）が結合している磁気ビーズまたは他の構造は、標的細胞と相互作用し得る。次いで、フィルタ、カラム、フローチューブ、または磁場を有するチャネルなどの使用が含まれる、種々の磁気分離方法を使用して、細胞試料中にあり得る望ましくない細胞、デブリなどから標的細胞集団を分離することができる。例えば、標的細胞集団は、チューブまたは他の構造を通って流れ、磁場に曝露され得る。それによって、標的細胞集団は、磁場によって維持または保持され、望ましくない細胞およびデブリは、チューブを通過し得る。次いで、磁場をオフにして、標的細胞集団は、さらなる自動処理のためにカセットのさらなる保持チャンバまたは他の領域（複数可）を通過することが可能となる。
【0057】
図５のフローパスはまた、細胞培養チャンバ２０６とサテライト体積５５０との間の接続を示している。これは、カセットに追加の貯蔵能力を提供するか、または自動化されたプロセスの全体体積を増加させることができる。図５には、種々のセンサ（例えば、ｐＨセンサ５２４、溶解酸素センサ５２６）、ならびにサンプリング／試料ポートおよび種々の弁（バイパスチェック弁５５２を含む）、ならびに構成要素を接続するシリコーン系ベースのチューブ構成要素を好適に含む、１つ以上の流体経路５４０の例示的な位置決めも示されている。本明細書に記載されるように、シリコーン系チューブ構成要素の使用により、チューブ構成要素を通じた酸素化が可能となり、ガス移送および細胞培養物の最適な酸素化が促進される。カセットのフローパスにおける１つ以上の疎水性フィルタ５５４または親水性フィルタ５５６の使用も図５に示されている。
【0058】
追加の実施形態では、自動化細胞工学システム３００が本明細書に提供される。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、自動化細胞工学システム３００は、好適には、密閉可能ハウジング３０２、および密閉可能ハウジング内に包含されるカセット１０２を含む。本明細書で使用される場合、「密閉可能ハウジング」は、開閉され得る構造を指しており、本明細書に記載されるカセット１０２は、流体供給ライン、ガス供給ライン、電源、冷却接続、加熱接続などのような種々の構成要素を配置し、統合することができる。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、密閉可能ハウジングは、カセットの挿入を可能にするために開放され得（図３Ｂ）、閉鎖され得（図３Ａ）、閉鎖密閉環境を維持して、カセットを利用して本明細書に記載の種々の自動化されたプロセス可能にすることができる。
【0059】
本明細書に記載されるように、カセット１０２は、好適には、細胞試料入力部２０６、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタ２０４、細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバ２０６、および細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部２０８を含む。本明細書に記載されるように、カセット（ならびに自動化細胞工学システム）は、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まないか、または任意の構成で好適に遠心分離器を含まない。
【0060】
図３Ａ～図３Ｂに示されるように、自動化細胞工学システム３００はまた、ユーザから入力を受信するためのユーザインターフェース３０４をさらに含む。ユーザインターフェース３０４は、タッチパッド、タブレット、キーボード、コンピュータ端末、または他の好適なインターフェースであり得、ユーザは、自動化されたプロセスおよびフローパスを制御するために所望の制御および基準を自動化細胞工学システムに入力することを可能にする。好適には、ユーザインターフェースは、自動化細胞工学システムに命令を与え、自動化細胞工学システムの全体的な活動を制御するためにコンピュータ制御システムに結合される。かかる命令には、いつ種々の弁を開閉するか、いつ培地または細胞集団を提供するか、いつ温度を上昇または低下させるかなどが含まれ得る。
【0061】
本明細書に記載されるように、実施形態では、細胞分離フィルタは、標的細胞集団を捕捉するマトリックスを含む。好適には、マトリックスは、免疫細胞を捕捉する。
【0062】
実施形態では、自動化細胞工学システム内のカセットは、分離フィルタの後の廃棄物収集チャンバをさらに含む。分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システムもまた、本明細書に記載されるように含まれ得る。分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステム、ならびに任意選択で、細胞分離フィルタと細胞培養チャンバとの間に位置する標的細胞集団保持チャンバも含まれ得る。実施形態では、自動化細胞工学システムのカセットは、１つ以上の流体経路をさらに含み、流体経路は、細胞培養チャンバ内の細胞を乱すことなく、細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配をもたらす。実施形態では、細胞培養チャンバは、低チャンバ高さを有する平坦な非可撓性チャンバである。
【0063】
自動化細胞工学システムの実施形態では、カセットは、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地（好適には抗凝固剤を含む）で予め充填されている。本明細書に記載されるように、実施形態では、自動化細胞工学システムのカセットは、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および／または光学密度センサ、ならびに好適な実施形態では、１つ以上のサンプリングポートのうちの１つ以上をさらに含み得る。
【0064】
細胞療法の生成における単位動作の自動化により、同種および自家的な細胞療法の用途全体に普遍的な利益の機会がもたらされる。患者固有の自家細胞産物のユニークなシナリオにおいて、自動化の利点は、さらにこれらの療法の最近の臨床的成功によって強調されているが、小バッチＧＭＰ準拠、経済性、患者のトレーサビリティ、およびプロセス逸脱の早期発見の重要なマイクロロットの複雑さのために、特に魅力的なものとなっている。複雑な製造プロトコルの出現に伴い、マイクロロット細胞生成における自動化された単位動作のエンドツーエンドの統合の価値は、これまであまり研究されてこなかったという事実が注目されている。しかしながら、間もなく承認されるこれらの療法の需要が予想されることから、完全に閉鎖したエンドツーエンドのシステムを実装することで、ハンズオンタイムおよび占有面積などの製造上のボトルネックに対する必要な解決策を提供することができる。
【0065】
先進的な療法の開発者は、臨床翻訳のロールアウトの早い段階で自動化を検討し、臨床試験プロトコルのスケールアップを検討することが奨励されている。早期の自動化は、プロトコルの開発に影響を与えるものであり得、後の段階で手動プロセスから自動化されたプロセスに切り替えた場合に比較検討の必要性を回避し、より長期的な商品化ルートのより良い理解を深めることができる。
【0066】
例示的な実施形態では、本明細書に記載の自動化細胞工学システムは、複数のチャンバを含み、本明細書に記載の種々の方法のステップの各々は、自動化細胞工学システムの複数のチャンバの異なるチャンバで実施され、活性化試薬、ベクター、および細胞培養培地の各々は、方法を開始する前に、複数のチャンバの異なるチャンバに包含され、複数のチャンバのうちの少なくとも１つは、細胞を成長させるための温度（例えば、約３７℃）で維持され、複数のチャンバのうちの少なくとも１つは、冷蔵温度（例えば、約４～８℃）で維持される。
【0067】
実施形態では、本明細書に記載の自動化細胞工学システムは、温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および／または光学密度センサで監視される。したがって、一部の実施形態では、自動化細胞工学システムは、温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および／または光学密度センサのうちの１つ以上を含む。追加の実施形態では、自動化細胞工学システムは、所定の培養サイズに基づいて、細胞培養物の温度、ｐＨ、グルコース、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および／または光学密度を調整するように構成される。例えば、自動化細胞工学システムが、細胞培養物の現在の酸素レベルが低すぎて、所望の細胞培養物サイズに対して必要な成長を実現することができないことを検出した場合、自動化細胞工学システムは、例えば、酸素化細胞培養培地を導入することによって、細胞培養培地を酸素化細胞培養培地に置き換えることによって、または細胞培養培地を酸素化成分（すなわち、シリコーンチューブ）を通して流すことによって、細胞培養物の酸素レベルを自動的に増加させる。別の例では、自動化細胞工学システムが、細胞培養物の現在の温度が高すぎること、および細胞が急速に成長しすぎていること（例えば、細胞の可能性のある過密性が望ましくない特徴をもたらし得る）を検出した場合、自動化細胞工学システムは、細胞培養物の温度を自動的に低下させて、細胞の安定した成長速度（または所望の指数的成長速度）を維持する。なおさらなる実施形態では、自動化細胞工学システムは、細胞成長速度および／もしくは細胞数、またはｐＨ、酸素、グルコースなどのような他の監視因子に基づいて、細胞供給のスケジュールを自動的に調整する（すなわち、細胞培養に新鮮な培地および／もしくは栄養素を提供する）。自動化細胞工学システムは、低温チャンバ（例えば、４℃、または－２０℃）に培地（および洗浄液などのような他の試薬）を保管し、加温した培地を細胞培養物に導入する前に、室温チャンバまたは高温チャンバ（例えば、それぞれ、２５℃、または３７℃）で培地を加温するように構成されてもよい。
【0068】
追加の例示的な実施形態
実施形態１は、細胞試料入力部と、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタと、細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバと、細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部と、を含む、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットであり、カセットは、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない。
実施形態１は、細胞試料入力部と、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタと、細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバと、細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部と、を含む、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットであり、カセットは、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない。
【0069】
実施形態２は、細胞分離フィルタが、細胞集団を捕捉するマトリックスを含む、実施形態１に記載のカセットを含む。
【0070】
実施形態３は、マトリックスが標的細胞を捕捉する、実施形態１に記載のカセットを含む。
【0071】
実施形態４は、細胞分離フィルタの後の廃棄物収集チャンバをさらに含む、実施形態１～３に記載のカセットを含む。
【0072】
実施形態５は、細胞分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システムをさらに含む、実施形態１～４に記載のカセットを含む。
【0073】
実施形態６は、細胞分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステムと、任意選択で、細胞分離フィルタと細胞培養チャンバとの間に位置する標的細胞集団保持チャンバと、をさらに含む、実施形態１～５に記載のカセットを含む。
【0074】
実施形態７は、１つ以上の流体経路をさらに含み、流体経路が、細胞培養チャンバ内の細胞を乱すことなく、細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配をもたらす、実施形態１～６に記載のカセットを含む。
【0075】
実施形態８は、細胞培養チャンバが、低チャンバ高さを有する平坦な非可撓性チャンバである、実施形態１～７に記載のカセットを含む。
【0076】
実施形態９は、カセットが、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地で予め充填されている、実施形態１～８に記載のカセットを含む。
【0077】
実施形態１０は、バックフラッシュ培地が、抗凝固剤を含有する、実施形態９に記載のカセットを含む。
【0078】
実施形態１１は、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および／または光学密度センサのうちの１つ以上をさらに含む、実施形態１～１０に記載のカセットを含む。
【0079】
実施形態１２は、１つ以上のサンプリングポートをさらに含む、実施形態１～１１に記載のカセットを含む。
【0080】
実施形態１３は、細胞試料入力部と、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタであって、細胞分離フィルタが、免疫細胞を捕捉するマトリックスを含む、細胞分離フィルタと、免疫細胞を収容するように構成されたチャンバ体積を有する免疫細胞の活性化、形質導入、および／または伸長を行うための細胞培養チャンバと、細胞分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステムと、細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部と、を含む、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットであり、カセットは、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない。
【0081】
実施形態１４は、細胞分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システムをさらに含む、実施形態１３に記載のカセットを含む。
【0082】
実施形態１５は、細胞培養チャンバに接続された１つ以上の流体経路をさらに含み、流体経路が、細胞培養チャンバ内の免疫細胞を乱すことなく、細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配をもたらす、実施形態１３または１４に記載のカセットを含む。
【0083】
実施形態１６は、細胞分離フィルタの後の廃棄物収集チャンバをさらに含む、実施形態１３～１５に記載のカセットを含む。
【0084】
実施形態１７は、細胞分離フィルタと細胞培養チャンバとの間に位置する免疫細胞保持チャンバをさらに含む、実施形態１３～１６に記載のカセットを含む。
【0085】
実施形態１８は、細胞培養チャンバが、低チャンバ高さを有する、平坦な非可撓性チャンバである、実施形態１３～１７に記載のカセットを含む。
【0086】
実施形態１９は、カセットが、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地で予め充填されている、実施形態１３～１８に記載のカセットを含む。
【0087】
実施形態２０は、流体経路のうちの１つ以上が、チューブ構成要素を介した酸素化を可能にするシリコンベースのチューブ構成要素を含む、実施形態１３～１９に記載のカセットを含む。
【0088】
実施形態２１は、自動処理のために標的細胞集団を調製する方法であって、方法が、標的細胞集団を含有する細胞試料を、自動化細胞工学システムのカセットに導入することと、細胞試料を細胞分離フィルタに通過させることと、細胞試料から標的細胞集団を、細胞分離フィルタのマトリックス上に捕捉することと、細胞分離フィルタをバックフラッシュすることと、標的細胞集団が自動処理を受けることができるように、細胞分離フィルタから標的細胞集団を移送することと、を含む、方法である。
【0089】
実施形態２２は、移送することが、標的細胞集団が自動処理を受けることができるように、標的細胞集団を標的細胞集団保持チャンバ、形質導入システム、トランスフェクションのためのシステム、または細胞培養チャンバに移送することを含む、実施形態２１に記載の方法を含む。
【0090】
実施形態２３は、形質導入システムがエレクトロポレーションシステムである、実施形態２２に記載の方法を含む。
【0091】
実施形態２４は、バックフラッシュの前に、細胞分離フィルタ上で捕捉された標的細胞集団を洗浄することをさらに含む、実施形態２１～２３に記載の方法を含む。
【0092】
実施形態２５は、細胞分離フィルタを介して、細胞試料から不要な廃棄物を廃棄物収集チャンバに通過させることをさらに含む、実施形態２１～２４に記載の方法を含む。
【0093】
実施形態２６は、細胞分離フィルタを介して細胞試料を通過させることが、重力濾過を介して行われる、実施形態２１～２５に記載の方法を含む。
【0094】
実施形態２７は、方法が、標的細胞集団を細胞分離フィルタから移送した後の遠心分離を除外する、実施形態２１～２６に記載の方法を含む。
【0095】
実施形態２８は、自動処理の後に、カセットから標的細胞集団を収集することをさらに含む、実施形態２１～２６に記載の方法を含む。
【0096】
実施形態２９は、密閉可能ハウジングと、密閉可能ハウジング内に包含されたカセットであって、カセットが、細胞試料入力部、細胞試料入力部に流体接続された細胞分離フィルタ、細胞分離フィルタに流体接続された細胞培養チャンバ、および細胞培養チャンバに流体接続された細胞試料出力部であって、カセットが、細胞分離フィルタの後の遠心分離器を含まない、細胞試料出力部、を含む、カセットと、ユーザから入力を受信するためのユーザインターフェースと、を含む、自動化細胞工学システムである。
【0097】
実施形態３０は、カセットの細胞分離フィルタが、細胞集団を捕捉するマトリックスを含む、実施形態２９に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0098】
実施形態３１は、マトリックスが標的細胞を捕捉する、実施形態３０に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0099】
実施形態３２は、カセットが、細胞分離フィルタの後の廃棄物収集チャンバをさらに含む、実施形態２９～３１に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0100】
実施形態３３は、カセットが、細胞分離フィルタに流体接続された細胞洗浄システムをさらに含む、実施形態２９～３２に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0101】
実施形態３４は、カセットが、細胞分離フィルタに流体接続されたバックフラッシュシステムと、任意選択で、細胞分離フィルタと細胞培養チャンバとの間に位置する標的細胞集団保持チャンバと、をさらに含む、実施形態２９～３３に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0102】
実施形態３５は、カセットが、１つ以上の流体経路をさらに含み、流体経路が、細胞培養チャンバ内の細胞を乱すことなく、細胞培養チャンバに対する再循環、廃棄物の除去、および均質なガス交換ならびに栄養素の分配をもたらす、実施形態２９～３４に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0103】
実施形態３６は、カセットの細胞培養チャンバが、低チャンバ高さを有する平坦な非可撓性チャンバである、実施形態２９～３５に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0104】
実施形態３７は、カセットの細胞培養チャンバが、バッグまたはハードチャンバである、実施形態２９～３５に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0105】
実施形態３８は、カセットが、培養培地、細胞洗浄培地、およびバックフラッシュ培地で予め充填されている、実施形態２９～３７に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0106】
実施形態３９は、バックフラッシュ培地が抗凝固剤を含有する、実施形態３８に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0107】
実施形態４０は、カセットが、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および／または光学密度センサのうちの１つ以上をさらに含む、実施形態２９～３９に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0108】
実施形態４１は、カセットが、１つ以上のサンプリングポートをさらに含む、実施形態２９～４０に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【0109】
実施形態４２は、コンピュータ制御システムをさらに含み、ユーザインターフェースが、コンピュータ制御システムに結合され、自動化細胞工学システムに命令を提供する、実施形態２９～４１に記載の自動化細胞工学システムを含む。
【実施例】
【0110】
実施例１－自動化細胞工学システムのための細胞濾過の確立
Ｏｃｔａｎｅ Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システムは、細胞療法産物の製造のための、閉鎖型で、自動化されたエンドツーエンドの細胞工学システムである。Ｃｏｃｏｏｎ（商標）は、基本器具、ソフトウェア、カスタマイズ可能なディスポーザブルカセットの３つの主要な構成要素で構成されている。本システムは、上流および下流の両方の細胞培養プロセスで、自動化された細胞単離、伸長、濃縮、およびバッファ交換が可能であるが、遠心分離機能を有していない。
Ｏｃｔａｎｅ Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システムは、細胞療法産物の製造のための、閉鎖型で、自動化されたエンドツーエンドの細胞工学システムである。Ｃｏｃｏｏｎ（商標）は、基本器具、ソフトウェア、カスタマイズ可能なディスポーザブルカセットの３つの主要な構成要素で構成されている。本システムは、上流および下流の両方の細胞培養プロセスで、自動化された細胞単離、伸長、濃縮、およびバッファ交換が可能であるが、遠心分離機能を有していない。
【0111】
接着による標的細胞集団の単離は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、樹状細胞、および単球を含む大部分の接着細胞型に適用することができる。例えば、ヒト骨髄ＭＳＣは、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）カセット増殖チャンバ中の接着によって単離され得る。骨髄組織の接種から１～２日後、汚染された赤血球（ＲＢＣ）および他の懸濁細胞を廃棄物に排出し、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）カセット増殖チャンバ内に付着細胞型が残留する。培地交換は、ＭＳＣの伸長を促進するように設計され、２～３日ごとに行われた。
【0112】
Ｃｏｃｏｏｎ（商標）カセット内でＴ細胞を培養するには、典型的にはドナー由来の全血コレクションからのＴ細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のいずれかの精製集団が必要である。初期Ｃｏｃｏｏｎ（商標）出発物質中のＲＢＣ汚染の量も減少させながら、白血球を得るために必要な前処理手順を排除するために、全血濾過を評価した。
【0113】
Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＡｒｃａｄｉｓ ＷＢＣ（白血球）シリンジフィルタ（カタログ番号ＡＰ－４８５１）およびサルベージ血液用ヘモネティクス白血球フィルタ（カタログ番号ＲＳ－１）（図２Ｂ～図２Ｃ）は、いずれも、ＲＢＣおよび他の汚染細胞を廃棄物に通過させる一方で、フィルタ出口の上流で白血球を捕捉および維持する繊維性マトリックスおよび培地を含有する。次いで、捕捉された白血球をフィルタから逆洗浄し、細胞培養活性のために収集する。アクロディスクＷＢＣシリンジフィルタ（Ｐａｌｌ）は、最大１２ｍＬのドナー全血または白血球増殖試料を処理することができ、一方で、白血球フィルタ（ヘモネティクス）は、最大４５０ｍＬのドナー全血または白血球増殖試料を処理することができる。
【0114】
Ｃｏｃｏｏｎ（商標）カセットの流体経路でこれらのフィルタまたは同様のフィルタを使用することによって、ヒトＴ細胞が、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システム内のＣＡＲ－Ｔおよび他の細胞療法産物の全血またはロイコパックドナー試料から単離され得る。本明細書に記載される提案されたプロセスフローパスにより、エンドユーザがドナーの全血または白血球増殖試料を無菌で直接Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システムに導入することが可能となる。全血フィルタは、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）ディスポーザブルカセット流体経路内に統合されて、白血球を混合細胞集団から分離し、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）増殖チャンバ内で、それらがさらに伸長され得る。最終的な治療産物は、必要に応じて自動的に採取し、新鮮な状態または凍結保存された状態で使用することができる。
【0115】
方法
Ｆｉｃｏｌｌ Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した密度勾配単離
１００ｍＬ～４５０ｍＬの全血または白血球増殖産物を得た。次いで、初期ドナー試料を２つのコレクションに分割した。１つ目はＦｉｃｏｌｌ密度勾配を介して処理するためのものであり、２つ目は細胞分離フィルタを介して処理するためのものである。密度勾配単離のために、初期ドナー試料の半数を、ヒトＰＢＭＣの製造のための標準手順を使用して処理した。具体的には、ドナー試料を等しい体積の２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）に１：１で希釈した。次いで、希釈試料を、３０ｍＬ画分で、５０ｍＬの円錐チューブ当たり最大４５ｍＬの総体積のために、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ密度勾配溶液（ＧＥヘルスケア）上に慎重に層化した。次いで、チューブを室温で４００×ｇで４０分間遠心分離した。血漿の上層を、ＰＢＭＣを含有するチューブのバフィーコート層のおよび１０ｍＬ上方まで除去した。ＰＢＭＣを収集し、収集体積の３倍の２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ中で洗浄した。次いで、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して収集した細胞を二重に計数し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を介して分析し、凍結保存した。
Ｆｉｃｏｌｌ Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した密度勾配単離
１００ｍＬ～４５０ｍＬの全血または白血球増殖産物を得た。次いで、初期ドナー試料を２つのコレクションに分割した。１つ目はＦｉｃｏｌｌ密度勾配を介して処理するためのものであり、２つ目は細胞分離フィルタを介して処理するためのものである。密度勾配単離のために、初期ドナー試料の半数を、ヒトＰＢＭＣの製造のための標準手順を使用して処理した。具体的には、ドナー試料を等しい体積の２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）に１：１で希釈した。次いで、希釈試料を、３０ｍＬ画分で、５０ｍＬの円錐チューブ当たり最大４５ｍＬの総体積のために、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ密度勾配溶液（ＧＥヘルスケア）上に慎重に層化した。次いで、チューブを室温で４００×ｇで４０分間遠心分離した。血漿の上層を、ＰＢＭＣを含有するチューブのバフィーコート層のおよび１０ｍＬ上方まで除去した。ＰＢＭＣを収集し、収集体積の３倍の２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ中で洗浄した。次いで、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して収集した細胞を二重に計数し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を介して分析し、凍結保存した。
【0116】
アクロディスク白血球シリンジフィルタ（Ｐａｌｌ）を使用した全血濾過
製造元の指示に従って、アクロディスクＷＢＣフィルタを使用して、初期ドナー全血および白血球増殖試料の半分、最大５０ｍＬを６ｍＬ～１２ｍＬの画分で処理した。フィルタ入口を１０ｍＬシリンジに取り付け、滅菌廃棄物容器上に取り付けた。６ｍＬ～１２ｍＬの希釈および未希釈の全血およびロイコパック試料の両方をシリンジハウジングに添加した。次いで、試料を、重力を介してＷＢＣフィルタを通して濾過した。試料を完全に濾過する時間を記録した。次いで、フィルタを５ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。細胞を収集するために、ＷＢＣフィルタをシリンジハウジングから慎重に除去し、フィルタの入口側に取り付けられた清潔な１５０ｍＬの採血バッグ（ＷａｌｋＭｅｄ）、および１０ｍＬのＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を充填した培地バッグをＷＢＣフィルタの出口に取り付けた。次いで、フィルタをＰＢＳとバックフラッシュし、１５０ｍＬの採血バッグ（ＷａｌｋＭｅｄ）中に収集した。次いで、収集した細胞懸濁液を、収集体積の３倍の２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ中で洗浄した。次いで、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析のために冷凍保存した試料を使用して細胞を二重に計数した。次いで、同じ条件から単離した細胞をプールし、５％ヒト血清Ａ／Ｂを補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）の６ｍＬ中の１ｅ７個の細胞で重複Ｔ－２５組織フラスコ培養液に接種した。４日目、６日目、８日目、および１１日目に、全ての培養物に対して１００％培地交換および細胞計数を実施した。
製造元の指示に従って、アクロディスクＷＢＣフィルタを使用して、初期ドナー全血および白血球増殖試料の半分、最大５０ｍＬを６ｍＬ～１２ｍＬの画分で処理した。フィルタ入口を１０ｍＬシリンジに取り付け、滅菌廃棄物容器上に取り付けた。６ｍＬ～１２ｍＬの希釈および未希釈の全血およびロイコパック試料の両方をシリンジハウジングに添加した。次いで、試料を、重力を介してＷＢＣフィルタを通して濾過した。試料を完全に濾過する時間を記録した。次いで、フィルタを５ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。細胞を収集するために、ＷＢＣフィルタをシリンジハウジングから慎重に除去し、フィルタの入口側に取り付けられた清潔な１５０ｍＬの採血バッグ（ＷａｌｋＭｅｄ）、および１０ｍＬのＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を充填した培地バッグをＷＢＣフィルタの出口に取り付けた。次いで、フィルタをＰＢＳとバックフラッシュし、１５０ｍＬの採血バッグ（ＷａｌｋＭｅｄ）中に収集した。次いで、収集した細胞懸濁液を、収集体積の３倍の２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ中で洗浄した。次いで、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析のために冷凍保存した試料を使用して細胞を二重に計数した。次いで、同じ条件から単離した細胞をプールし、５％ヒト血清Ａ／Ｂを補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）の６ｍＬ中の１ｅ７個の細胞で重複Ｔ－２５組織フラスコ培養液に接種した。４日目、６日目、８日目、および１１日目に、全ての培養物に対して１００％培地交換および細胞計数を実施した。
【0117】
全血試料の前処理希釈
ドナー１：単一ドナーからの全血の１４８ｍＬを、２画分に分割した。１つ目の７４ｍＬ画分を０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ（全血希釈合計１４８ｍＬ）に１：１で希釈し、２つ目の７４ｍＬ画分を未希釈のままにした。次いで、未希釈画分および希釈画分の両方を、２×７４ｍＬの希釈全血と２×３７ｍＬの未希釈全血とで２つの追加画分に分割し、Ｆｉｃｏｌｌ分離勾配処理およびＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ細胞分離濾過処理の両方で使用した。Ｆｉｃｏｌｌ分離のために未希釈全血を使用することは、標準的な実験室の慣行ではなく、プロセス限定をより良く理解するためにのみこの評価に含めた。ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過試料体積を、３ｍＬ未希釈、６ｍＬ希釈および未希釈、１２ｍＬ希釈および未希釈、および２４ｍＬ希釈した。
ドナー１：単一ドナーからの全血の１４８ｍＬを、２画分に分割した。１つ目の７４ｍＬ画分を０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ（全血希釈合計１４８ｍＬ）に１：１で希釈し、２つ目の７４ｍＬ画分を未希釈のままにした。次いで、未希釈画分および希釈画分の両方を、２×７４ｍＬの希釈全血と２×３７ｍＬの未希釈全血とで２つの追加画分に分割し、Ｆｉｃｏｌｌ分離勾配処理およびＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ細胞分離濾過処理の両方で使用した。Ｆｉｃｏｌｌ分離のために未希釈全血を使用することは、標準的な実験室の慣行ではなく、プロセス限定をより良く理解するためにのみこの評価に含めた。ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過試料体積を、３ｍＬ未希釈、６ｍＬ希釈および未希釈、１２ｍＬ希釈および未希釈、および２４ｍＬ希釈した。
【0118】
ドナー２：第２のドナーからの全血の２７９ｍＬを、全血の１３３ｍＬを希釈せずに残し、第２の１４５ｍＬの全血画分１：１を０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ中で、全血２９０ｍＬを希釈することによって分割した。５４ｍＬの希釈した全血を、Ｆｉｃｏｌｌによって３回に分けて処理した。このドナーのためにＦｉｃｏｌｌを介して処理された未希釈試料は存在しなかった。残りの希釈全血画分および未希釈全血画分を、６ｍＬおよび１２ｍＬ容量のＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過を介して処理した。
【0119】
希釈ロイコパック試料の前処理
ドナー１：単一ドナー由来の１２７ｍＬの白血球増殖産物を、未洗浄試料濾過のために２８ｍＬに分割し、残りの９９ｍＬを、４００ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡ－ＨＢＳＳ中で９９ｍＬを希釈し、遠心分離し、上清を廃棄し、２００ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡ－ＨＢＳＳ中で細胞ペレットを再懸濁させることによって洗浄した。この洗浄された試料の１８０ｍＬを、Ｆｉｃｏｌｌ分離密度勾配のために、および６ｍＬおよび１２ｍＬのＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過処理のために２０ｍＬ利用した。
ドナー１：単一ドナー由来の１２７ｍＬの白血球増殖産物を、未洗浄試料濾過のために２８ｍＬに分割し、残りの９９ｍＬを、４００ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡ－ＨＢＳＳ中で９９ｍＬを希釈し、遠心分離し、上清を廃棄し、２００ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡ－ＨＢＳＳ中で細胞ペレットを再懸濁させることによって洗浄した。この洗浄された試料の１８０ｍＬを、Ｆｉｃｏｌｌ分離密度勾配のために、および６ｍＬおよび１２ｍＬのＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過処理のために２０ｍＬ利用した。
【0120】
結果
白血球分離および収集のための処理時間
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配単離のための未希釈全血画分と希釈全血画分との両方を同時に処理した。３０ｍＬの未希釈全血試料および７４ｍＬの希釈全血試料の処理時間は、白血球／バフィーコートの洗浄までのチューブ層形成時間からおよそ４時間であった。いずれの試料についても、赤血球溶解ステップは含まれなかった。
白血球分離および収集のための処理時間
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配単離のための未希釈全血画分と希釈全血画分との両方を同時に処理した。３０ｍＬの未希釈全血試料および７４ｍＬの希釈全血試料の処理時間は、白血球／バフィーコートの洗浄までのチューブ層形成時間からおよそ４時間であった。いずれの試料についても、赤血球溶解ステップは含まれなかった。
【0121】
Ｐａｌｌ ＷＢＣ細胞分離濾過の場合、６ｍＬ～２４ｍＬの全血試料の合計処理時間は、処理体積および全血希釈に応じて５分～２０分の範囲であった（表１）。最も早い処理時間は、３ｍＬの全血を２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳで１：１に希釈した場合に観察され、３分以内に重力を介して完全に濾過され、平均して８分±３分の総処理時間（濾過、２回の洗浄、およびバックフラッシュ収集）が得られた。平均して、６ｍＬの未希釈全血は、フィルタを通過するのに１０分±２分、総処理時間１９分±２分（濾過、２回の洗浄、およびバックフラッシュ収集）を要した。１：１に希釈した場合、６ｍＬの２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＤＰＢＳ（１２ｍＬの総体積）中の６ｍＬの未希釈全血は、重力を介してフィルタを通過するために平均７分±２分、および総処理時間１３分±４分を要した。１つ目のドナーの場合、１８分後にフィルタを通過したのは１２ｍＬの未希釈全血のうち１１ｍＬだけで、残りの容量と洗浄液とをフィルタに通すためにシリンジのプランジャを手動で押す必要があった。このドナーの場合、１２ｍＬの全血を１２ｍＬの２ｍＭ ＥＤＴＡ／１Ｘ ＰＢＳで１：１に希釈したもの（総体積２４ｍＬ）は、１６分後には約１１ｍＬしか処理できずに目詰まりした。残りの体積およびその後の２つの洗浄を、シリンジフィルタのプランジャでフィルタを通して手動で押し込んだ。第２のドナーについて、１２ｍＬの未希釈の全試料の両方が、３ｍＬおよび５ｍＬの未処理で３０分後に目詰まりした。第２のドナー１２ｍＬの未希釈全血体積に対して、手動介入は試みられず、１：１の希釈も実施されなかった。１つの１０ｍＬの未希釈全血試料を濾過し、１１分後に全体積の重力濾過を完了し、合計処理時間は１９分であった。
【0122】
６ｍＬおよび１２ｍＬの各試料の４ｍＬをフィルタを通して重力を介して処理した後、洗浄されたおよび未洗浄されたロイコパック試料により、ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣフィルタが目詰まりした（表２）。シリンジプランジャを使用して残りの２ｍＬ～８ｍＬの試料を処理するために、手動介入が必要とされた。捕捉した細胞のコレクションのプロセス濾過フローを変更する平均タイミングは、６～７分であった。
【0123】
【表1】
【0124】
【表2】
【0125】
後処理細胞収率および生存率
全血ドナー１：表３に示されるデータ分析から２つのドナー１全血試料を省略したが、これらは、図６Ａおよび図６Ｂに示されている。残りの試料のうち、処理された全血１ｍＬ当たり平均１×１０６個の生存細胞を、ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣフィルタを介して収集し、これに対して、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離を介して処理された全血１ｍＬ当たり０．９×１０６個の細胞を収集した。希釈ＷＢＣ濾過試料と比較して、未希釈ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過試料から、全血１ｍＬ当たり２７．３％少ない生存細胞を得た。希釈Ｆｉｃｏｌｌ試料と比較した場合、未希釈Ｆｉｃｏｌｌ試料から処理された全血１ｍＬ当たり８％多い生存細胞を得た。アクロディスクＷＢＣフィルタを介して処理した場合、未希釈Ｆｉｃｏｌｌ処理と比較して、処理された全血１ｍＬ当たり１５％多い生存細胞を未希釈全血から得た。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法と比較して、アクロディスクＷＢＣ濾過を介して希釈した全血を処理した場合、１ｍＬ当たり３８％多い生存細胞を得た。生存率は全ての試料で類似しており、９１％～９４％の範囲であった。さらに、未希釈血液の体積を、２つのＦｉｃｏｌｌ試料中で慎重に層化した。図６Ａおよび図６Ｂは、細胞収率および生存率の差を示している。
全血ドナー１：表３に示されるデータ分析から２つのドナー１全血試料を省略したが、これらは、図６Ａおよび図６Ｂに示されている。残りの試料のうち、処理された全血１ｍＬ当たり平均１×１０６個の生存細胞を、ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣフィルタを介して収集し、これに対して、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離を介して処理された全血１ｍＬ当たり０．９×１０６個の細胞を収集した。希釈ＷＢＣ濾過試料と比較して、未希釈ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過試料から、全血１ｍＬ当たり２７．３％少ない生存細胞を得た。希釈Ｆｉｃｏｌｌ試料と比較した場合、未希釈Ｆｉｃｏｌｌ試料から処理された全血１ｍＬ当たり８％多い生存細胞を得た。アクロディスクＷＢＣフィルタを介して処理した場合、未希釈Ｆｉｃｏｌｌ処理と比較して、処理された全血１ｍＬ当たり１５％多い生存細胞を未希釈全血から得た。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法と比較して、アクロディスクＷＢＣ濾過を介して希釈した全血を処理した場合、１ｍＬ当たり３８％多い生存細胞を得た。生存率は全ての試料で類似しており、９１％～９４％の範囲であった。さらに、未希釈血液の体積を、２つのＦｉｃｏｌｌ試料中で慎重に層化した。図６Ａおよび図６Ｂは、細胞収率および生存率の差を示している。
【0126】
【表3】
【0127】
濾過プロセスおよびＦｉｃｏｌｌプロセスの両方から新たに単離した一次細胞を、１フラスコ当たり１ｅ７個の生存細胞の標的でＴ－２５組織培養フラスコに接種して、予想されるＣｏｃｏｏｎ接種細胞密度を模倣した。希釈した全血１２ｍＬおよび２４ｍＬ試料中に、１ｅ７個の細胞密度で接種するのに十分な細胞が存在しなかった。６日目までに、全血濾過単離手順を有する全ての培養物は、初期の全細胞数より３～４倍高く、希釈全血、６ｍＬ濾過試料で最も高い細胞数を実現した（図７Ａ）。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配単離後に接種された培養物は、０～１１日目からおよそ９８％の培養生存率を維持しているにもかかわらず、接種日から採取まで有意な成長を示さなかった（図７Ｂ）。全ての培養物は、培養の最初の８日間で約９６％、および１１日目で９２％を超える生存率を維持した。
【0128】
全血ドナー２：平均して、８８．６％±０．９％の生存率を有する処理済み全血１ｍＬ当たり１６．１×１０５個の生存細胞がＦｉｃｏｌｌ分離勾配法を介して得られたのに対し、未希釈濾過試料では、６８．０％±６．２％の生存率を有する３．１１×１０５個、および希釈濾過試料では、７２．７％±２．１％の生存率を有する３．１１×１０５個が得られた（表４、図８Ａ、および図８Ｂ）。希釈ＷＢＣ濾過試料と比較して、未希釈ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過試料で全血１ｍＬ当たり５３％少ない生存細胞を得たが、一方で、ドナー１は、未希釈試料から、希釈試料と比較して２％少ない細胞／ｍＬを得た。アクロディスクＷＢＣフィルタを介して処理した場合、希釈Ｆｉｃｏｌｌ処理と比較して、処理された全血１ｍＬ当たり９１％少ない生存細胞を未希釈全血から得た。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法と比較して、アクロディスクＷＢＣ濾過を介して希釈した全血を処理した場合、１ｍＬ当たり８１％少ない生存細胞を得た。
【0129】
【表4】
【0130】
ロイコパックドナー１：平均して、処理した白血球増殖産物１ｍＬ当たり３２．９×１０６個の生存細胞を、９８．１％±０．６％の生存率でＦｉｃｏｌｌ分離勾配法を介して得た。比較して、処理された洗浄（１：１希釈）白血球増殖産物１ｍＬ当たり８．０２×１０６個の生存細胞、および未洗浄産物の４．３６×１０６個の生存細胞を、それぞれ、９５．８％±０．３％の生存率および９８．４％±０．６％の生存率で濾過方法を介して得た（表５、図９Ａ、および図９Ｂ）。
【0131】
洗浄ＷＢＣ濾過試料と比較して、未洗浄ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過試料から、白血球増殖産物１ｍＬ当たり４６％少ない生存細胞を得た。アクロディスクＷＢＣフィルタを介して処理した場合、希釈Ｆｉｃｏｌｌ処理と比較して、処理された全血１ｍＬ当たり８７％少ない生存細胞を未洗浄ロイコパック試料から得た（図９Ｂ）。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法と比較して、アクロディスクＷＢＣ濾過を介して洗浄された白血球増殖産物を処理した場合、１ｍＬ当たり７６％少ない生存細胞を得た。
【0132】
【表5】
【0133】
ＣＤ３＋Ｔ細胞集団のＦＡＣＳ分析
現在の細胞療法は、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システムのような自動化細胞工学システムのためのＣＡＲ－Ｔ細胞療法手順の最適化に焦点を当てている。これを念頭に置いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞との比率を、Ｆｉｃｏｌｌによって処理された全血および白血病細胞収集と、濾過方法とで比較した（図１０）。
現在の細胞療法は、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システムのような自動化細胞工学システムのためのＣＡＲ－Ｔ細胞療法手順の最適化に焦点を当てている。これを念頭に置いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞との比率を、Ｆｉｃｏｌｌによって処理された全血および白血病細胞収集と、濾過方法とで比較した（図１０）。
【0134】
全血ドナー１：ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（６％～８％）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（４％～１０％）の最も低い割合が、２つの未希釈のＰａｌｌ濾過６ｍＬ全血試料のうちの１つ、ならびに１２ｍＬおよび２４ｍＬの希釈のＰａｌｌ濾過全血試料の両方において観察された（図１１）。全ての他の試料について、およそ２２％±４％のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞および１９％±３％のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＦｉｃｏｌｌおよびＰａｌｌで濾過された全血試料の両方で捕捉された。しかしながら、全ての試料は、各条件内で捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞のおおよそ１：１の比率を維持した。
【0135】
全血ドナー２：未希釈の６ｍＬの全血試料から収集した画分は、およそ３０％～３８％のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞および９％～１２％のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を有する全ての他の条件と比較した場合、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（２３．６％および２２％）ならびにＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（８％および７．５％）の最も低い割合を提示した（図１２）。しかしながら、全ての試料で、３：１のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞対ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞比を示した。２つの全血ドナー間のＣＤ４＋対ＣＤ８＋比の差は、ドナー対ドナーの変動性の結果である可能性が高い。
【0136】
ロイコパックドナー試料：平均して、Ｆｉｃｏｌｌ単離方法を介して処理された全血由来の細胞画分は、４０％±２％のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞および２２．８％±３％のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有した（図１３）。これは、未洗浄で濾過したロイコパック試料よりもおよそ１５％多くのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞および５％多くのＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集したことになる。Ｆｉｃｏｌｌ単離はまた、洗浄した（１：１希釈した）ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣ濾過ロイコパック試料よりも２１％多くのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞および１３％多くのＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を得た。ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞対ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞比が１：１であった１２ｍＬの未洗浄濾過ロイコパック試料を除いて、他の全てのＦｉｃｏｌｌ試料および濾過試料は、２：１のＣＤ３＋ＣＤ４＋対ＣＤ３＋ＣＤ８＋比を有した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋の収率の差は、４ｍＬ以下のロイコパック試料が重力のみを介して濾過されるため、シリンジプランジャを使用してＰａｌｌアクロディスクＷＢＣフィルタを通してロイコパック試料を手動で濾過する必要性によって悪影響を受けている可能性がある。
【0137】
結論
本明細書に記載される方法は、Ｃｏｃｏｏｎシステムを介した全血白血球単離のための、個別にまたは直列に、Ｐａｌｌアクロディスク白血球シリンジフィルタなどの細胞濾過フィルタの使用方法を記載している。Ｃｏｃｏｏｎ（商標）カセットにこれらのフィルタの使用方法を実装するためのアップデートには、以下が含まれる。
本明細書に記載される方法は、Ｃｏｃｏｏｎシステムを介した全血白血球単離のための、個別にまたは直列に、Ｐａｌｌアクロディスク白血球シリンジフィルタなどの細胞濾過フィルタの使用方法を記載している。Ｃｏｃｏｏｎ（商標）カセットにこれらのフィルタの使用方法を実装するためのアップデートには、以下が含まれる。
【0138】
６ｍＬ～１２ｍＬの処理容量のＷＢＣフィルタ当たりの未希釈全血試料または希釈全血試料。
【0139】
全血をＤＰＢＳまたは同様の緩衝液中で潜在的に１：１に希釈し、処理時間を短縮する。
【0140】
重力濾過の可能性。
【0141】
ＰａｌｌアクロディスクＷＢＣフィルタにより、遠心分離なしでＴ細胞の捕捉および伸長が可能となる。全血および白血球増殖産物プロセス能力を有するより大きなフィルタも有用である。特に、ヘモネティクスによるサルベージ血液用白血球フィルタを使用した全血濾過。
【0142】
議論
Ｃｏｃｏｏｎ（商標）の全血からのインライン白血球単離は、白血球捕捉培地／マトリックスを有する特殊フィルタを使用する場合に行うことができる。好適なＰａｌｌまたはヘモネティクスカスタムフィルタを、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システムに使用するために生成することができる。
Ｃｏｃｏｏｎ（商標）の全血からのインライン白血球単離は、白血球捕捉培地／マトリックスを有する特殊フィルタを使用する場合に行うことができる。好適なＰａｌｌまたはヘモネティクスカスタムフィルタを、Ｃｏｃｏｏｎ（商標）システムに使用するために生成することができる。
【0143】
本明細書に記載される方法および用途に対する他の好適な修正および適応を、実施形態のいずれかの範囲から逸脱することなく行うことができることは、関連分野の当業者には容易に明らかであろう。
【0144】
特定の実施形態が本明細書に例示され、記載されてきたが、特許請求の範囲は、記載され、示された部分の特定の形態または構成に限定されないことを理解されたい。本明細書では、例示的な実施形態が開示されており、特定の用語が採用されるが、それらは、限定の目的ではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ使用されている。上記の教示に照らして、実施形態の修正例および変形例が可能である。したがって、実施形態が、具体的に記載された方法以外の方法で実践され得ることを理解されたい。
【0145】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】