特表 2022-512388 ミスフォールドＴＤＰ－４３に対する抗体およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-03

(54)【発明の名称】ミスフォールドＴＤＰ－４３に対する抗体およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220127BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220127BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220127BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20220127BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220127BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220127BHJP

   C12N 15/06 20060101ALI20220127BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20220127BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220127BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220127BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220127BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220127BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220127BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220127BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220127BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220127BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20220127BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220127BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220127BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220127BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K16/18

C07K16/46

C07K19/00

C12N15/06 100

C07K1/22

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12Q1/02

A61K39/395 N

A61P21/00

A61P25/02

A61K48/00

A61K31/7088

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021533492

(86)(22)【出願日】2019-12-16

(85)【翻訳文提出日】2021-08-10

(86)【国際出願番号】 CA2019051823

(87)【国際公開番号】W WO2020118458

(87)【国際公開日】2020-06-18

(31)【優先権主張番号】62/779,904

(32)【優先日】2018-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/923,789

(32)【優先日】2019-10-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】300066874

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア

(71)【出願人】

【識別番号】514316411

【氏名又は名称】プロミス、ニューロサイエンシズ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＭＩＳ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107342

【弁理士】

【氏名又は名称】横田 修孝

(74)【代理人】

【識別番号】100155631

【弁理士】

【氏名又は名称】榎 保孝

(74)【代理人】

【識別番号】100137497

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 未知子

(74)【代理人】

【識別番号】100207907

【弁理士】

【氏名又は名称】赤羽 桃子

(74)【代理人】

【識別番号】100217294

【弁理士】

【氏名又は名称】内山 尚和

(72)【発明者】

【氏名】ニール、アール．キャッシュマン

(72)【発明者】

【氏名】ヨハンネ、カプラン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR56

4B063QS33

4B063QX02

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CA20

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA08

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA55

4C084MA58

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA22

4C084ZA94

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085FF01

4C085FF02

4C085FF12

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA55

4C086MA58

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA22

4C086ZA94

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８に特異的に結合する抗体に関する。単離ペプチド、単離核酸、免疫原、組成物、キット、およびミスフォールドＴＤＰ－４３を検出するための前記試薬を使用する方法も提供される。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然ＴＤＰ－４３と比較してミスフォールドＴＤＰ－４３におけるＴＤＰ－４３配列ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）に結合する、抗体。

【請求項2】

前記抗体が、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係において少なくともＷ６８に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体が、ストレス顆粒に関連しないミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項4】

前記抗体が、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＡＧＷＧＮ（配列番号３）、ＧＷＧＮＬ（配列番号４）および／またはＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号５）に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

前記抗体が、天然ＴＤＰ－４３と比較して少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または少なくとも２０倍ミスフォールドＴＤＰ－４３に対してより選択的である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

前記抗体が、
ｉ．ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部もしくは一部を含んでなる単離ペプチド（ここで、前記一部は、少なくとも５個以上の隣接アミノ酸であり、かつＧＷＧを含んでなり、場合により、前記一部は、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＡＧＷＧＮ（配列番号３）、もしくはＧＷＧＮＬ（配列番号４）である）；または
ｉｉ．ペプチドを含んでなる免疫原（前記ペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬの全部もしくは一部を含んでなり、ここで、前記一部は、配列番号１の少なくとも５個以上の隣接アミノ酸であり、場合により、ｉ）前記免疫原は、複数のペプチドを含んでなり、各ペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部もしくは一部を含んでなり、ここで、前記複数のペプチドは、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成され、もしくはｉｉ）前記ペプチドは、担体タンパク質もしくは免疫原性増強成分と共役し、場合により、前記担体タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、もしくは前記免疫原性増強成分は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であり、場合により、前記免疫原は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係において少なくともＷ６８に特異的に結合する抗体を産生するために使用され、好ましくは、ここで、前記抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する）、
を使用して産生および／またはスクリーニングされる、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

前記抗体がヒト化抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項9】

前記抗体が単鎖抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項10】

前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらの多量体から選択される結合フラグメントである、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項11】

前記抗体がアフィニティー精製される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項12】

軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号１２）、ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ（配列番号１８）、ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ（配列番号２４）、ＧＲＧＤＩ（配列番号３６）、ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ（配列番号４８）、ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ（配列番号１２２）、またはＶＲＱＮＹＥＧＡＹ（配列番号１３２）を含んでなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項13】

軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ３はＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号１２）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ（配列番号１５）を含んでなる；
ＣＤＲ－Ｈ３はＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ（配列番号１８）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ（配列番号２１）を含んでなる；
ＣＤＲ－Ｈ３はＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ（配列番号２４）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＡＧＧＷＲＳＬＮＡ（配列番号２７）を含んでなる；
ＣＤＲ－Ｈ３はＧＲＧＤＩ（配列番号３６）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ（配列番号３９）を含んでなる；
ＣＤＲ－Ｈ３はＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号４２）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ（配列番号４５）を含んでなる；
ＣＤＲ－Ｈ３はＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ（配列番号４８）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ（配列番号５１）を含んでなる；
ＣＤＲ－Ｈ３はＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ（配列番号１２２）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ（配列番号１２５）を含んでなる；または
ＣＤＲ－Ｈ３はＶＲＱＮＹＥＧＡＹ（配列番号１３２）を含んでなり、ＣＤＲ－Ｌ３はＦＱＳＳＨＶＰＷＴ（配列番号１３５）を含んでなる、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項14】

軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＲＹＹ 配列番号 １０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＩＰＧＧＴＴ 配列番号 １１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 １２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＨ 配列番号 １３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＥＡＳ 配列番号 １４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ 配列番号 １５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＮＹＶ 配列番号 １６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＷＦＡＧＩＶＤＴＴ 配列番号 １７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ 配列番号 １８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＳＮＮＲ 配列番号 １９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＹＡＳ 配列番号 ２０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ 配列番号 ２１、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＳＹＶ 配列番号 ２２；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＳＤＴＧＩＮＴ 配列番号 ２３；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ 配列番号 ２４；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＹ 配列番号 ２５；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＡＳ 配列番号 ２６；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＧＷＲＳＬＮＡ 配列番号 ２７、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＥＦＳＦＳＳＲＹＷ 配列番号 ２８；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＴＧＳＩＤＡＴ 配列番号 ２９；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＧＳＤＡＷＧＬＹＦＮＬ 配列番号 ３０；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＨＫＮＮＹ 配列番号 ３１；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＡＳ 配列番号 ３２；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＶＹＳＧＲＩＦＡ 配列番号 ３３、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＴ 配列番号 ３４；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＧＧＩＧＳＴ 配列番号 ３５；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＧＲＧＤＩ 配列番号 ３６；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＲ 配列番号 ３７；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＧＡＳ 配列番号 ３８；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ 配列番号 ３９、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＡＹＹ 配列番号 ４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＴＩＰＩＧＲＴ 配列番号 ４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 ４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＱ 配列番号 ４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＱＡＳ 配列番号 ４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ 配列番号 ４５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＡ 配列番号 ４６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＮＹＥＴ 配列番号 ４７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ 配列番号 ４８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＧ 配列番号 ４９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＴＳ 配列番号 ５０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ 配列番号 ５１、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＮ 配列番号 １２０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＧＴＧＧＩＴ 配列番号 １２１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ 配列番号 １２２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＮＮＮＮ 配列番号 １２３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＳ 配列番号 １２４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ 配列番号 １２５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １３０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＳＮＧＧＳＴ 配列番号 １３１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １３２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １３３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １３４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １３５、または

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＴＮＧＧＳＴ 配列番号 １４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １４５、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項15】

前記抗体が、ｉ）配列番号９８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１０～１２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号９９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３～１５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項16】

前記抗体が、ｉ）配列番号１００において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１００に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１６～１８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または前記抗体が、ｉ）配列番号１０１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０１に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１９～２１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項17】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０２において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０２に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２２～２４において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０３において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２５～２７において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８０において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８１において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項18】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０４において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２８～３０において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０５において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３１～３３において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８２において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８３において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項19】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０６において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３４～３６において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０７において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０７に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３７～３９において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８４において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８５において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項20】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４０～４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４３～４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項21】

前記抗体が、ｉ）配列番号１１０において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１０に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４６～４８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１１１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１１に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４９～５１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項22】

前記抗体が、ｉ）配列番号１２８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２０～１２２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１２９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２３～１２５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項23】

前記抗体が、ｉ）配列番号１３８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３０～１３２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１３９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１３９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３３～１３５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項24】

前記抗体が、ｉ）配列番号１４８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４０～１４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１４９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４３～１４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項25】

請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体および検出可能な標識を含んでなる、免疫複合体。

【請求項26】

ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部または一部を含んでなる単離ペプチドであって、前記一部は、少なくとも５個以上の隣接アミノ酸であり、かつＧＷＧを含んでなる、単離ペプチド。

【請求項27】

前記一部が、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＡＧＷＧＮ（配列番号３）、またはＧＷＧＮＬ（配列番号４）である、請求項２６に記載の単離ペプチド。

【請求項28】

ペプチドを含んでなる免疫原であって、前記ペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬの全部または一部を含んでなり、ここで、前記一部は、配列番号１の少なくとも５個以上の隣接アミノ酸である、免疫原。

【請求項29】

複数のペプチドを含んでなり、各ペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部または一部を含んでなり、ここで、前記複数のペプチドは、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成される、請求項２８に記載の免疫原。

【請求項30】

前記ペプチドが、担体タンパク質または免疫原性増強成分と共役し、場合により、前記担体タンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、または、前記免疫原性増強成分はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項２９に記載の免疫原。

【請求項31】

前記免疫原が、ミスフォールドＴＤＰ－４３に特異的に結合する、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）に特異的に結合する、かつ／または、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係において少なくともＷ６８に特異的に結合する抗体を産生するために使用される、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の免疫原。

【請求項32】

前記抗体が、ミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する、請求項３１に記載の免疫原。

【請求項33】

場合により、ベクターに含まれる、請求項２６～２７のいずれか一項に記載の単離ペプチド、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原、または請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体のアミノ酸残基をコードする、単離核酸。

【請求項34】

請求項２６～２７のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原または請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体を組換え発現する細胞であって、場合により、前記細胞は、抗体を発現する場合にハイブリドーマである、細胞。

【請求項35】

場合により、希釈液、および薬学上許容可能な担体とともに、請求項２６～２７のいずれか一項に記載の単離ペプチド、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体、請求項２５に記載の免疫複合体、請求項３３に記載の単離核酸または請求項３４に記載の細胞を含んでなる、組成物。

【請求項36】

請求項１～２４のいずれか一項に記載の２つ以上の抗体または請求項２５に記載の２つ以上の免疫複合体を含んでなる、組成物。

【請求項37】

アジュバントをさらに含んでなる、前記免疫原を含んでなる、請求項３５に記載の組成物。

【請求項38】

前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、モノホスホリルリピドＡおよび／またはＱＳ２１である、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

対象を治療する方法であって、有効量の請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体、請求項２５に記載の免疫複合体、請求項３３に記載の核酸または請求項３６～３８のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法。

【請求項40】

前記対象が、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有すると疑われる、それを発症するリスクにある、またはそれと診断されている、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ＴＤＰ－４３タンパク質症が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ＴＤＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、および大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から選択される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記抗体、免疫複合体、または組成物が、別のＴＤＰ－４３タンパク質症の治療と組み合わせて投与される、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ＴＤＰ－４３細胞伝播を阻害する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体、請求項２５に記載の免疫複合体、請求項３３に記載の核酸または請求項３６～３９のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法。

【請求項44】

前記抗体、免疫複合体、核酸または組成物が、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、くも膜下腔内投与、眼窩内投与、眼投与、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与または経口投与により投与される、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記抗体、免疫複合体、核酸または組成物が、血液脳関門を介する輸送を促進することで知られる生物活性分子と同時投与される、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

ｉ．請求項２６～２７のいずれか一項に記載の単離ペプチド；
ｉｉ．請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原；
ｉｉｉ．請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体；
ｉｖ．請求項２５に記載の免疫複合体；
ｖ．請求項３３に記載の単離核酸；
ｖｉ．請求項３４に記載の細胞；ならびに／または
ｖｉｉ．請求項３５～３８のいずれか一項に記載の組成物；ならびに
ｖｉｉｉ．前記単離ペプチド、免疫原、抗体、免疫複合体、単離核酸、細胞、および／もしくは組成物を収容するためのバイアルなどのコンパートメント、ならびに
ｉｘ．場合により、ＥＬＩＳＡもしくは本明細書に記載の方法における使用説明書
を含んでなる、キット。

【請求項47】

請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法であって、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原または請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原を含んでなる組成物および場合により薬学上許容可能な担体を非ヒト対象に投与すること、ならびに投与された単離ペプチド、免疫原、または組成物に対して選択的である抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することを含んでなる、方法。

【請求項48】

抗体を調製する方法であって、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原、または請求項２８～３２のいずれか一項に記載の免疫原を含んでなる組成物で非ヒト対象を免疫化することを含んでなる、方法。

【請求項49】

ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８に特異的に結合する抗体を単離することをさらに含んでなる、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

抗体産生ハイブリドーマを形成することをさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法により産生される、抗体。

【請求項52】

細胞質／凝集および／またはミスフォールドＴＤＰ－４３を含んでなることが疑われるサンプルが、細胞質／凝集またはミスフォールドＴＤＰ－４３を含有するかどうかを決定する方法であって、
ａ．前記サンプルを、抗体：ミスフォールドＴＤＰ－４３複合体を形成することを許容する条件下で、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体と接触させること；および
ｂ．任意の複合体の存在を検出すること
を含んでなり、
ここで、検出可能な複合体の存在は、前記サンプルが細胞質／凝集および／またはミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチドを含有し得ることを示すものである、方法。

【請求項53】

前記サンプルが、対象から得た生物サンプルである、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記サンプルが、血液、血清、血漿および／または固形組織、場合により、脳、ＣＳＦおよび／または血液由来の細胞外小胞を含んでなる前述のもののいずれかの画分を含んでなる、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記サンプルが、場合により、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、原発性側索硬化症、または大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）を有するまたは有すると疑われる対象由来のヒトサンプルである、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＲＹＹ 配列番号 １０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＩＰＧＧＴＴ 配列番号 １１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 １２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＨ 配列番号 １３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＥＡＳ 配列番号 １４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ 配列番号 １５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＮＹＶ 配列番号 １６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＷＦＡＧＩＶＤＴＴ 配列番号 １７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ 配列番号 １８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＳＮＮＲ 配列番号 １９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＹＡＳ 配列番号 ２０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ 配列番号 ２１、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＳＹＶ 配列番号 ２２；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＳＤＴＧＩＮＴ 配列番号 ２３；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ 配列番号 ２４；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＹ 配列番号 ２５；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＡＳ 配列番号 ２６；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＧＷＲＳＬＮＡ 配列番号 ２７、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＴ 配列番号 ３４；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＧＧＩＧＳＴ 配列番号 ３５；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＧＲＧＤＩ 配列番号 ３６；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＲ 配列番号 ３７；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＧＡＳ 配列番号 ３８；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ 配列番号 ３９、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＡＹＹ 配列番号 ４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＴＩＰＩＧＲＴ 配列番号 ４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 ４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＱ 配列番号 ４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＱＡＳ 配列番号 ４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ 配列番号 ４５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＡ 配列番号 ４６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＮＹＥＴ 配列番号 ４７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ 配列番号 ４８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＧ 配列番号 ４９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＴＳ 配列番号 ５０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ 配列番号 ５１、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＮ 配列番号 １２０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＧＴＧＧＩＴ 配列番号 １２１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ 配列番号 １２２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＮＮＮＮ 配列番号 １２３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＳ 配列番号 １２４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ 配列番号 １２５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １３０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＳＮＧＧＳＴ 配列番号 １３１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １３２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １３３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １３４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １３５、または

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＴＮＧＧＳＴ 配列番号 １４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １４５、
抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１８年１２月１４日に出願された米国仮出願第６２／７７９，９０４号、および２０１９年１０月２１日に出願された同６２／９２３，７８９号の優先権に基づく３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の利益を主張する特許協力条約出願であり、これらの出願の各々は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

【0002】

配列表の組込み
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して提出され、２０１９年１２月１２日に作成されたコンピューター可読形式の配列表「ＰＰ５４８１１ＰＣ００ ＰＣ００＿ＳＴ２５」（５８，８８７バイト）は、引用することにより本明細書の一部とされる。

【0003】

分野
本開示は、ＴＤＰ－４３抗体、より具体的には、ミスフォールドＴＤＰ－４３を検出するための抗体およびミスフォールドＴＤＰ－４３を検出する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
４３ｋＤａのトランス活性化応答（ＴＡＲ）エレメントＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ－４３）は、４１４アミノ酸タンパク質であり、Ｎ末端ユビキチン様ドメイン（ＮＴＤ、残基１～８０）、残基１０６～１７７（ＲＲＭ１）および残基１９２～２５９（ＲＲＭ２）から構成される２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、ならびにＣ末端ドメイン（ＣＴＤ、残基２７４～４１４）から構成される。ＮＴＤは、核局在化（残基８２～９８におけるＮＬＳモチーフ、ＮＬＳ１ Ｋ８２ＲＫ８４およびＫ９５ＶＫＲ９８）を指示するドメインに隣接する。ＲＲＭ２は、残基２３９から２５０にかけて核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。

【0005】

ＴＤＰ－４３は主に、ＲＮＡ代謝において中心的役割を果たす核タンパク質である。罹患ニューロン内の病原性封入体は、翻訳後修飾されたＴＤＰ－４３を含み得るため、ＴＤＰ－４３は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）疾患スペクトラムにおける研究の焦点となっている。ＴＤＰ－４３のＣＴＤは疾患と特に関連しているが、それは、ほぼ総ての家族性ＡＬＳ／ＦＴＤ関連変異がＴＤＰ－４３において認められる場所であるからである。

【0006】

他の変異としては、ベータストランド４と５との間のＲＲＭ１に位置するＤ１６９Ｇ、ＮＬＳ領域における変異であるＡ９０Ｖ、ならびにＲＲＭ２とＣ末端ドメインとの間のリンカーに存在する変異Ｋ２６３ＥおよびＮ２６７Ｓが挙げられる。

【0007】

ＲＲＭ１およびＲＲＭ２は、ＮＭＲにより構造決定されている。例えば、ＲＲＭ１は、原子分解能三次元構造データのデータベースである蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ）において、ＰＤＢエントリー４ＩＵＦとして入手可能であり、一方、ＲＲＭ２は、ＰＤＢエントリー１ＷＦ０として入手可能であり、ＮＴＤは、ＰＤＢエントリー５ＭＲＧ、２Ｎ４Ｐおよび６Ｂ１Ｇとして入手可能である。

【0008】

４ＩＵＦの構造は、Ｋｕｏら［１］において報告されている。１ＷＦ０の構造は、Ｈｅら［２］において報告されている。２Ｎ４Ｐの構造は、Ｍｏｍｐｅａｎら［３］において報告されている。

【0009】

ＴＤＰ－４３は、孤発型および家族型両方のＡＬＳおよびＦＴＤを有する患者の神経封入体において高リン酸化、ユビキチン化、および断片化されることが認められた［４］。

【0010】

機能的ＴＤＰ－４３は、細胞ストレス時に形成される細胞質凝集体と区別される核オリゴマーとして存在し得る。機能的ＴＤＰ－４３のオリゴマー化は、そのＲＮＡスプライシング機能のために必要である。核におけるＮＴＤにより駆動されたＴＤＰ－４３のオリゴマー化は、細胞質誤局在化および病的凝集の形成を阻害し得る［９］。

【0011】

生理学的ＴＤＰ－４３オリゴマー化は、核磁気共鳴分光法および電子顕微鏡法の組合せでの２．１Ａ結晶構造により明らかにされた、動的なソレノイド様構造を採用し得る、そのＮ末端ドメインにより媒介される［９］。

【0012】

ＴＤＰ－４３の凝集体（封入体）は現在、ＡＬＳのほぼ総て（およそ９７％）の症例およびＦＴＤの症例のおよそ半数（およそ４５％）において認められている。ＴＤＰ－４３は、ＡＬＳ患者の運動ニューロンにおいて認められる細胞質封入体の主成分の１つである。

【0013】

ＴＤＰ－４３封入体の前駆体は、機能的ＴＤＰ－４３よりはるかに低い濃度を有し得る。ミスフォールドＴＤＰ－４３が低濃度であることによって、この標的がとらえにくいものとなっている。

【0014】

細胞質ヒトＴＤＰ－４３を発現するトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスにおける脳由来病的ＴＤＰ－４３ ＦＴＬＤ－ＴＤＰ種子の脳内注射は、時間依存的に脳に伝播したデノボＴＤＰ－４３病変の誘導をもたらしている［１０］。

【0015】

ＴＤＰ－４３に結合する抗体がこれまで記載されてきた。

【0016】

「神経変性疾患の予後および／または診断のための方法、候補化合物および神経変性疾患を治療するための化合物の同定方法」と題するＷＯ２０１２１７４６６６は、抗ＴＤＰ－４３抗体を使用して、ＴＤＰ－４３とＮＦ－kＢ ｐ６５との間の相互作用の評価を通じて、ＡＬＳおよびＦＴＤなどの神経変性疾患を診断する方法を開示している。

【0017】

「神経変性疾患の治療に有用なＴＤＰ－４３結合性ポリペプチド」と題するＷＯ２０１６０８６３２０は、ＡＬＳおよびＦＴＤの治療のための、ＴＤＰ－４３のＲＲＭ１ドメインに結合して、ＮＦ－ｋＢとのその相互作用を妨害する抗体を開示している。

【0018】

天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３よりもミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する抗体が望まれる。

【発明の概要】

【0019】

概要
本発明者らは、天然に折り畳まれた核または細胞質ＴＰＤ－４３ではなく、ＴＤＰ－４３凝集体に優先的に結合する抗体を同定した。本発明者らは、ミスフォールドＴＤＰ－４３において差次的にアクセス可能なエピトープを同定し、ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体における前記エピトープを認識する抗体を産生した。本明細書において示されるように、前記エピトープは、ミスフォールドＴＤＰ－４３（溶媒がアクセス可能）における結合のために利用可能であるが、天然に折り畳まれた非疾患関連ＴＤＰ－４３においては利用不可能である。特に、本発明者らは、Ｗ６８が、ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体に対する抗体特異性を付与するのに重要な残基であることを決定した。このような抗体は、一般にストレス顆粒と関連しない凝集ＴＤＰ－４３を認識し、病原性ＴＤＰ－４３の細胞間伝播を阻害し得る。

【0020】

したがって、ある側面は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部または一部を含んでなる単離ペプチドであって、前記一部は、少なくとも５個のアミノ酸であり、かつＧＷＧを含んでなる、単離ペプチドを含む。

【0021】

別の実施形態において、前記一部は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の少なくとも６個の隣接アミノ酸である。

【0022】

ある実施形態において、前記ペプチドは、最大２１残基であり、場合により、Ｗ６８は、好ましくは、前記ペプチドの三分割中の中央に位置する。

【0023】

別の側面は、ペプチドを含んでなる免疫原であって、前記ペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部または一部を含んでなり、ここで、前記一部は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の少なくとも５個のアミノ酸、場合により、少なくとも６個のアミノ酸である、免疫原を含む。

【0024】

ある実施形態において、前記免疫原は、複数のペプチドを含んでなり、各ペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の少なくとも５個のアミノ酸、場合により、少なくとも６個のアミノ酸を含んでなり、ここで、前記複数のペプチドは、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成される。

【0025】

別の実施形態において、前記ペプチドは、担体タンパク質または免疫原性増強成分と共役する。

【0026】

別の実施形態において、前記担体タンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、または前記免疫原性増強成分はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。

【0027】

ある実施形態において、前記免疫原は、ミスフォールドＴＤＰ－４３に選択的に結合する抗体、かつ／または、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係において少なくともＷ６８に特異的に結合する抗体を産生するために使用される。ある実施形態において、前記抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する。

【0028】

さらなる側面は、ＴＤＰ－４３に結合し、かつ、天然ＴＤＰ－４３と比較してミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する抗体を含む。

【0029】

ある実施形態において、前記抗体は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係において少なくともＷ６８に特異的に結合する。

【0030】

ある実施形態において、前記抗体は、本明細書に記載のペプチドまたは免疫原を使用して産生またはスクリーニングされる。

【0031】

ある実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。

【0032】

ある実施形態において、前記抗体はヒト化抗体である。

【0033】

ある実施形態において、前記抗体は単鎖抗体である。

【0034】

ある実施形態において、前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらの多量体から選択される結合フラグメントである。

【0035】

ある実施形態において、前記抗体はアフィニティー精製される。

【0036】

さらなる側面は、本明細書に記載の抗体および検出可能な標識を含んでなる免疫複合体を含んでなる。

【0037】

さらなる側面は、本明細書に記載のペプチド、免疫原、または抗体のアミノ酸残基をコードする単離核酸、ならびに、例えば、本明細書に記載のペプチド、免疫原または抗体を送達および／または発現するための、前記核酸を含んでなるベクターを含んでなる。

【0038】

さらなる側面は、本明細書に記載のペプチド、免疫原または抗体を組換え発現する細胞を含んでなる。

【0039】

ある実施形態において、抗体を発現する場合の前記細胞は、ハイブリドーマである。

【0040】

さらなる側面は、本明細書に記載の単離ペプチド、免疫原、抗体、免疫複合体、単離核酸、または細胞を含んでなる組成物を含む。

【0041】

ある実施形態において、ペプチドまたは免疫原を含んでなる場合の前記組成物は、アジュバントをさらに含んでなる。

【0042】

ある実施形態において、前記アジュバントは、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、モノホスホリルリピドＡおよび／またはＱＳ２１である。

【0043】

単離ペプチド、免疫原、抗体、免疫複合体、単離核酸、細胞、および／または組成物ならびに前記試薬を収容するためのコンパートメントを含んでなるキットも提供される。

【0044】

別の実施形態において、前記キットは、本明細書に記載の方法のためのＥＬＩＳＡにおける使用説明書をさらに含んでなる。

【0045】

さらなる側面は、抗体を作製する方法であって、本明細書に記載の単離ペプチド（例えば、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の少なくとも５個のアミノ酸、場合により、少なくとも６個のアミノ酸）、免疫原、または組成物を非ヒト対象に投与すること、またはそれで非ヒト対象を免疫化することを含んでなる方法を含む。

【0046】

ある実施形態において、前記方法は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８に特異的に結合する抗体を単離することをさらに含んでなる。

【0047】

ある実施形態において、前記方法は、抗体産生ハイブリドーマを形成することをさらに含んでなる。

【0048】

別の側面は、本明細書に記載の方法により産生される抗体を含む。

【0049】

さらなる側面は、サンプルがミスフォールドＴＤＰ－４３を含有するかどうかを決定する方法であって、前記サンプルを、抗体：ミスフォールドＴＤＰ－４３複合体を形成することを許容する条件下で、本明細書に記載の抗体と接触させること、および任意の複合体の存在を検出することを含んでなり、ここで、検出可能な複合体の存在は、前記サンプルがミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチドを含有し得ることを示すものである、方法を含む。

【0050】

ある実施形態において、前記サンプルは、対象から得た生物サンプルである。

【0051】

ある実施形態において、前記サンプルは、血液、血清、血漿および／または固形組織を含んでなる。

【0052】

ある実施形態において、前記サンプルはヒトサンプルである。

【0053】

ある実施形態において、前記対象は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有する、またはそれを有すると疑われる。

【0054】

対象を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の抗体、免疫複合体、核酸または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法が、さらに提供される。

【0055】

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨および範囲内での種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうから、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示として示されるものであると理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0056】

ここで本開示の実施形態を図面と関連して説明する：

【0057】

【図1】図１Ａ～２Ｌは、核局在化シグナルにおける三重ミスセンスタンデム変異を有するＴＤＰ－４３構築物、野生型ＴＤＰ－４３、または空ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞を示す。前記細胞におけるＴＤＰ－４３は、本明細書に記載のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ペプチドを含んでなる免疫原に対して産生されたＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ペプチドアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗ＴＤＰ－４３抗体（ＧＳ２４０）、またはＴＤＰ－４３－ＨＡ融合構築物と反応する抗ＨＡタグ抗体を使用して検出した。

【図2】図２Ａ～２Ｌは、核局在化シグナルにおける三重ミスセンスタンデム変異を有するＴＤＰ－４３－ＨＡ構築物、野生型ＴＤＰ－４３－ＨＡ、または空ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞を示す。ＴＤＰ－４３は、本明細書に記載のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ペプチドを含んでなる免疫原に対して産生された精製ポリクローナル抗ＴＤＰ－４３抗体（ＧＳ２４３）、または抗ＨＡタグ抗体を使用して、前記細胞において検出した。

【図3】図３Ａ～３Ｅは、マウス（３Ａおよび３Ｂ）ならびにウサギ（３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅ）モノクローナル抗体の結合速度論を示すグラフである。

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、天然に折り畳まれたＴＤＰ４３Ｎ末端ドメインではそうではないが、変性ＴＤＰ４３Ｎ末端ドメインにおける抗体によるエピトープの認識を示す。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、ウサギポリクローナルＧＳ２４０抗体によるＦＴＤ脳（５Ａ）およびＡＬＳ脊髄（５Ｂ）由来の切片の染色を示す画像であり、図５Ｃ～５Ｅは、マウスモノクローナル抗体によるＦＴＤ脳由来の切片の染色を示す画像である。

【図6】図６は、ＷＴ核ＴＤＰ－４３－ＨＡではそうではないが、ΔＮＬＳ－ＴＤＰ４３－ＨＡトランスフェクト細胞における細胞質ＴＤＰ４３凝集体を用いた、マウスモノクローナルＡｂ ２Ｆ７染色の共局在を示す一連の画像である。

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、疾患関連Ｎ末端ＴＤＰ４３エピトープに対する３Ｆ１１マウスモノクローナル抗体は、生理学的ストレス顆粒と反応しないことを示す画像である。

【図8】図８は、ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３－Ｗ６８Ｓトランスフェクト細胞ではそうではないが、ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３トランスフェクト細胞における細胞質ＴＤＰ４３凝集体を用いた、ウサギモノクローナルＡｂ ２８Ｈ３染色の共局在を示す一連の画像である。

【図9】図９は、ＨＥＫ２９３細胞におけるミスフォールドＴＤＰ－４３伝播の抗体遮断を示す。

【発明の具体的説明】

【0058】

本開示の詳細な説明
実施例に記載の通り、本発明者らは、ミスフォールドＴＤＰ－４３において特異的にアクセス可能なエピトープを同定した。本発明者らは、前記エピトープに特異的に結合する抗体を産生した。さらに、本発明者らは、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８の重要性を決定した。このペプチド配列に対して産生された抗体は、天然ＴＤＰ－４３と比較してミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合することが示されている。

【0059】

Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、「ＴＤＰ－４３」（トランス活性化応答エレメント（ＴＡＲ）ＤＮＡ結合タンパク質４３）、あるいは「ＴＤＰ４３」、または特に限定されない限り「ＴＤＰ」という用語は、本明細書で使用する場合、野生型ＴＤＰ－４３、天然ＴＤＰ－４３、ならびに総ての種由来の変異型およびその類似体を含むミスフォールド型を含むあらゆる形態のＴＤＰ－４３、特に、ヒトＴＤＰ－４３（すなわち、ｈＴＤＰ－４３）を意味する。ヒトＴＤＰ－４３は、一般に４１４アミノ酸残基のタンパク質であり、アミノ酸配列（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１３１４８）およびヌクレオチド配列（例えば、アクセッション番号ＨＧＮＣ：１１５７１）は、以前に特徴付けられている。

【0060】

「野生型」は、本明細書で使用する場合、非変異タンパク質または天然に存在するタンパク質の一次アミノ酸配列を指す。

【0061】

「天然」は、本明細書で使用する場合、特定のタンパク質またはその一部の正常な三次元構造を指す。天然ＴＤＰ－４３は、場合により、「天然に折り畳まれた」ＴＤＰ－４３、「正常に折り畳まれた」ＴＰＤ－４３および／または「健常な」ＴＤＰ－４３という。したがって、用語「天然ＴＤＰ－４３」、または「天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３」は、本明細書において、新生翻訳後に天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３、および／または、限定されるものではないが、Ｘ線結晶解析においてもしくは核磁気共鳴スペクトルから再構築された天然構造を示す非共有結合された個々のＴＤＰ－４３ペプチドを含んでなる分子構造を有する、非病態（例えば、正常細胞）において折り畳まれた、二量体ＴＤＰ－４３および三量体ＴＤＰ－４３を含む多量体を指す。天然ＴＤＰ－４３は、そのＮＴＤを介して多量体を形成し、天然に折り畳まれた場合のＴＤＰ－４３は、一般に核である。ＴＤＰ－４３のミスフォールド凝集体は、細胞質であり得、一般に細胞質である。

【0062】

「ミスフォールド」は、本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはその一部の二次構造および三次構造を指し、ポリペプチドが、その適切に機能する状態でのそのポリペプチドに関して正常ではないコンフォメーションをとっていることを示す。ミスフォールディングは、タンパク質における変異、例えば、アミノ酸の欠失、置換、または付加により生じ得るが、野生型配列タンパク質も、疾患においてミスフォールドされ得、例えば、微小環境条件および／またはアミノ酸修飾、例えば、ニトロ化、酸化、カルボニル化もしくは他の修飾の結果として、疾患特異的エピトープを露出させ得る。他の翻訳後修飾としては、異常なユビキチン化、リン酸化、アセチル化、ＳＵＭＯ化、およびＣ末端フラグメントへの切断が挙げられる。ミスフォールドＴＤＰ４３は、凝集および／または細胞質であり得る。ＴＤＰ－４３の文脈において、天然ＴＤＰ－４３は、そのＮＴＤを介して多量体を形成する。ミスフォールド多量体（例えば、疾患関連オリゴマー）は一般に、タンパク質の他の領域、例えば、そのＬＣＤおよび／またはＲＲＭ１ドメインを介してオリゴマー化する。したがって、「ミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチド」、または本明細書においてポリペプチドに言及する場合の「ミスフォールドＴＤＰ－４３」は、細胞質であるかつ／または凝集している、そのＬＣＤおよび／またはＲＲＭ１ドメインを介してオリゴマー化しているＴＤＰ－４３ポリペプチド、非天然二量体および三量体、ならびに大型の凝集体（例えば、５個以上のサブユニット）を含む。ミスフォールドＴＤＰ－４３は、タンパク質機能の喪失、毒性、アミロイド様特徴（例えば、コンゴーレッド染色）の獲得および病原性凝集体の伝播をもたらす凝集体を形成する傾向がある。

【0063】

用語「変異体ＴＤＰ－４３」は、ＴＤＰ－４３の形態、特に、例えば、［６］に記載のバイオインフォマティクスツールに記載の変異を含む、例えば、ＦＴＤまたは家族性ＡＬＳの特徴である置換などのアミノ酸置換をもたらす遺伝子変異の結果として生じるＴＤＰ－４３の内因型を指す。

【0064】

用語「ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）」は、配列番号１において示されるアミノ酸配列：アスパラギン酸、アラニン、グリシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、およびロイシンを意味する。同様に、ＧＷＧは、一文字アミノ酸コードにより同定されるアミノ酸配列を指す。文脈に応じて、アミノ酸配列への言及は、ＴＤＰ－４３または単離ペプチドにおける配列を指し得る。配列ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）は、ＴＤＰ－４３のアミノ酸一次配列における残基６５～７１に相当する。

【0065】

「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、Ｂ細胞もしくはＴ細胞受容体、または抗体もしくはその結合フラグメントにより認識されるタンパク質の領域を意味する。エピトープは、場合により、本明細書において、抗体により認識されるタンパク質の直鎖状アミノ酸配列または領域で表される。エピトープは、１以上の抗原決定基を含んでなり得る。例えば、ミスフォールドエピトープに相当する単離ペプチドに対して作製された抗体は、前記エピトープ配列の一部または全部を認識する。実施例に示されるように、抗体は、結合のためにＴｒｐ６８を必要とし得る。配列番号１の少なくとも５個、場合により、少なくとも６個の残基を含んでなる免疫原は、ミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する、例えば、配列番号１またはＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８に結合する抗体を産生するために使用され得る。「ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）または関連エピトープ」への言及は、例えば、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＤＡＧＷＧＮ（配列番号３）、ＡＧＷＧＮ（配列番号４）、ＡＧＷＧＮＬ（配列番号５）およびＧＷＧＮＬ（配列番号６）などのＴＤＰ－４３ペプチド配列を含んでなる免疫原により産生された抗体により結合されるＴＤＰ－４３上の直鎖状ペプチドまたは領域のいずれかにおける、配列番号１またはその一部を意味する。

【0066】

用語「類似体」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載のペプチド、タンパク質または核酸分子と実質的に同じ機能を実質的に同じ様式で果たす、本発明のアミノ酸およびヌクレオチド配列の部分、伸張、置換、バリアント、修飾または化学的等価物およびそれらの誘導体を含む。ペプチドの類似体は、ＴＤＰ－４３ペプチドに対する付加および欠失も含む。核酸の類似体は、本発明の単離ペプチドをコードする変性ヌクレオチド置換を含む。さらに、類似体ペプチドおよび類似体ヌクレオチド配列は、それらの誘導体を含む。

【0067】

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および修飾Ｌ－アミノ酸およびＤ－アミノ酸の総てを含む。アミノ酸の原子は、例えば、異なる同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素に対して置換された重水素、窒素１４に対して置換された窒素１５、および炭素１２に対して置換された炭素１３および他の同様の変化を含んでなり得る。

【0068】

「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸残基が、タンパク質の所望の特性を消失させることなく、別のアミノ酸残基と置き換わるものである。好適な保存的アミノ酸置換は、類似の疎水性、極性、およびＲ基のサイズを有するアミノ酸を互いに置換することによって行うことができる。保存的アミノ酸置換の例としては、以下のものが挙げられる：

【0069】

【表1】

【0070】

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖、ヒト化および他のキメラ抗体、または完全ヒト抗体、ならびにそれらの結合フラグメントを含むものとする。ベクター化抗体またはイントラボディも含まれる。抗体は、組換え源由来のものでもよく、かつ／または、トランスジェニック動物において産生されたものでもよい。生化学的技術を使用することによって産生され得る、または、ライブラリーから単離され得るヒト抗体も含まれる。ヒト化抗体またはキメラ抗体は、１以上のアイソタイプまたはクラス由来の配列を含んでもよい。

【0071】

句「単離抗体」は、抗体の産生源、例えば、動物、ハイブリドーマまたは他の細胞株（例えば、抗体を産生する組換え細胞）から除去されている、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で産生された抗体を指す。単離抗体は、場合により「精製」され、それは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度を意味する。

【0072】

用語「結合フラグメント」は、本明細書で使用する場合、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含んでなり、かつ抗原に結合する、またはインタクト抗体と競合する抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。例示的な結合フラグメントとしては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらの多量体が挙げられる。フラグメントは、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的処理または酵素処理により得ることができる。フラグメントは、組換え手段によっても得ることができる（下記参照）。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するために処理して、Ｆａｂ’フラグメントを産生することができる。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよび他のフラグメントは、組換え発現技術により構築することもできる。抗体が、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）などの特定の残基内のエピトープに結合すると言われる場合、それが意味するものは、抗体は、特定の残基またはその一部、例えば、（配列番号１）などの特定の残基との関係において少なくとも１個の残基または少なくとも２個の残基を含有するポリペプチドに選択的または特異的に結合する、ということである。このような抗体は、必ずしもＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の総ての残基に接触するわけではなく、前記エピトープ内の総ての単一アミノ酸置換または欠失は、必ずしも結合親和性に重大な影響を及ぼすまたは等しく影響を及ぼすわけではない。

【0073】

用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、エピトープ結合に寄与すると一般に推定される抗体の特定の超可変領域を指す。ＣＤＲ配列を同定する計算法としては、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴが挙げられる。本開示において列挙されるＣＤＲは、ＩＭＧＴ Ｂｌａｓｔを使用して同定されている。当業者ならば、本明細書に含まれる配列を考慮して、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａなどに基づいてＣＤＲ配列を同定することもできるであろう。

【0074】

用語「検出可能な標識」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載のペプチド、抗体または他の化合物に付加または導入することができるペプチド配列、蛍光タンパク質などの部分であって、直接的にまたは間接的にのいずれかで検出可能なシグナルを発生することができる部分を指す。例えば、標識は、放射線不透性の陽電子放出放射性核種（例えば、ＰＥＴイメージングにおける使用のための）、もしくは放射性同位体、例えば、^３Ｈ、^１３Ｎ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ；蛍光（フルオロフォア）もしくは化学発光（発色団）化合物、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン；酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ；造影剤；または金属イオンであってもよい。検出可能な標識は、例えば、二次抗体を使用して間接的に検出可能なものであってもよい。

【0075】

用語「ミスフォールドＴＤＰ－４３において選択的に提示されるまたはアクセス可能であるエピトープ」は、本明細書で使用する場合、単量体型、二量体型または凝集型であるか否かを問わず、例えばＡＬＳまたはＦＴＤ（例えば、疾患関連ミスフォールドＴＤＰ－４３）において存在するミスフォールドＴＤＰ－４３上で選択的に提示されるまたは抗体がアクセス可能であるが、ＴＤＰ－４３の天然の正しく折り畳まれたホモ二量体型の分子表面上ではそうではないエピトープを指す。本明細書において示されるように、Ｗ６８は、ミスフォールドＴＤＰ－４３において選択的に提示されるまたはアクセス可能である。

【0076】

用語「大きな親和性」は、本明細書で使用する場合、抗体Ｘが、標的Ｚよりも強力に（Ｋ_ｏｎ）かつ／または小さな解離定数（Ｋ_ｏｆｆ）で標的Ｙに結合する、抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Ｘは、Ｚよりも標的Ｙに対して大きな親和性を有する。同様に、用語「小さな親和性」は、本明細書において、抗体Ｘが、標的Ｚよりも弱い強さおよび／または大きな解離定数で標的Ｙに結合する、抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Ｘは、Ｚよりも標的Ｙに対して小さな親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性は、１／Ｋ_Ｄに等しいＫ_Ａで表すことができ、ここで、Ｋ_Ｄはｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆに等しい。ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ値は、表面プラズモン共鳴を使用して測定することができる（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用して測定可能）。

【0077】

また、本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」は、抗体の産生を誘発し、免疫原の抗原部分に対して指向したＴ細胞および他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。

【0078】

「免疫原」は、本明細書で使用する場合、免疫応答を誘発する、かつ／または、抗体の産生を引き起こす物質を意味する。免疫原性化合物に加えて、例えば、ＫＬＨにコンジュゲートした単離化合物、同定されたエピトープ、例えば、ＤＡＧＷＧＮＬおよび／または関連エピトープ、例えば、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＤＡＧＷＧＮ（配列番号３）、ＡＧＷＧＮ（配列番号４）、ＡＧＷＧＮＬ（配列番号５）およびＧＷＧＮＬ（配列番号６）に対する交差反応性抗体を誘発するペプチド模倣物を含む、本明細書に記載の複合体および融合体が使用され得る。有用な免疫原としての役割を果たすために、ＴＤＰ－４３ペプチドは、望ましくは、最低約５、６、または７個のＴＤＰ－４３残基および最大約１５、１７、１９、２０または２１個のＴＤＰ－４３アミノ酸を組み込み、場合により、例えば多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）において使用されるリンカーまたは足場を介して、ＫＬＨなどの免疫原性増強剤を場合により組み込む。

【0079】

用語「核酸配列」は、本明細書で使用する場合、天然に存在する塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語は、天然に存在しないモノマーまたはその部分を含んでなる修飾または置換された配列も含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然に存在する塩基を含んでもよい。配列は、修飾された塩基を含有してもよい。このような修飾された塩基の例としては、アザおよびデアザのアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、用語「核酸」は、相補的核酸配列ならびにコドン最適化等価物または同義コドン等価物を含む。用語「単離核酸配列」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により産生された場合には細胞材料もしくは培養培地を、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。単離核酸はまた、核酸が由来する核酸に天然的に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）も実質的に含まない。

【0080】

「動作可能に連結された」は、核酸が、核酸の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味するものとする。好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む、種々の源に由来し得る。適当な調節配列の選択は、選択される宿主細胞に依存し、当業者により容易に達成され得る。このような調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が挙げられる。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに応じて、他の配列、例えば、複製起点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列を、発現ベクターに組み込んでもよい。

【0081】

用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、核酸分子が、例えば、原核細胞および／または真核細胞に導入される、かつ／または、ゲノムに組み込まれることを可能にする、核酸分子のための任意の中間ビヒクルを含んでなり、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベースのベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを含む。用語「プラスミド」は、本明細書で使用する場合、一般に、染色体ＤＮＡを独立に複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物、通常、環状ＤＮＡ二本鎖を指す。

【0082】

「少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中での２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部に対して生じ得る。ハイブリダイズ部分は、一般に、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性は、ナトリウム含有緩衝液中において、ナトリウムイオン濃度および温度の関数（Ｔｍ＝８１．５℃－１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）－６００／ｌ）、または類似の式）により決定されることを認識するであろう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件におけるパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子と類似であるが同一ではない分子を同定するために、１％のミスマッチはＴｍの約１℃の減少をもたらすと想定され得、例えば、核酸分子が９５％超の同一性を有するようにする場合、最終洗浄温度は約５℃減少する。これらの考察に基づき、当業者は、適当なハイブリダイゼーション条件を容易に選択できるであろう。好ましい複数の実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために以下の条件が使用され得る：上記の式に基づいたＴｍ－５℃における５倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５倍デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションに次いで、６０℃での０．２倍ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃での３倍ＳＳＣ中の洗浄工程を含む。しかしながら、等価なストリンジェンシーは、代替の緩衝液、塩および温度を使用して達成され得ると理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002、およびSambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001において見出され得る。

【0083】

本明細書で使用する場合、抗体に関して「特異的に結合する」とは、抗体が、その標的抗原を認識し、かつ構造的に異なる抗原および／または修飾配列もしくは変異配列を有する抗原に対するよりも大きな親和性でその標的に結合することを意味する。例えば、多価抗体は、少なくとも１ｅ－６、少なくとも１ｅ－７、少なくとも１ｅ－８、少なくとも１ｅ－９または少なくとも１ｅ－１０のＫ_Ｄでその標的に結合する。少なくとも１ｅ－８超の親和性が好ましい。１つの可変ドメインを含んでなるＦａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントは、非フラグメント化抗体との多価相互作用よりも１０倍または１００倍小さな親和性でその標的を見出し得る。

【0084】

用語「選択的」または「優先的」は、ある形態のＴＤＰ－４３（例えば、天然タンパク質またはミスフォールドタンパク質）に選択的／優先的に結合する抗体に関して本明細書で使用する場合、結合タンパク質が、少なくとも３倍、または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、または少なくとも５００倍以上の大きな親和性でその形態に結合することを意味する。したがって、特定のコンフォメーション（例えば、ミスフォールドタンパク質）に対してより選択的な抗体は、別の形態と比較して、少なくとも３倍、または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、または少なくとも５００倍以上大きな親和性で、特定の形態のＴＤＰ－４３に優先的に結合する。

【0085】

用語「ミスフォールドＴＤＰ－４３におけるＴＤＰ－４３配列ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）に結合する抗体」は、本明細書で使用する場合、天然ＴＤＰ－４３と比較して、ミスフォールドＴＤＰ－４３の文脈において、前記配列または前記配列の任意の部分に特異的または優先的に結合するが、無関係の配列には結合しない、結合フラグメントなどの抗体を意味する。

【0086】

用語「リンカー」は、本明細書で使用する場合、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＤＡＧＷＧＮ（配列番号３）、ＡＧＷＧＮ（配列番号４）、ＡＧＷＧＮＬ（配列番号５）およびＧＷＧＮＬ（配列番号６）を含んでなるペプチドまたは配列番号１エピトープペプチドの全部と共有結合され得る化学的部分を意味する。リンカーは、グリシン残基および／またはＰＥＧ部分ならびに１以上の機能化可能部分、例えばシステイン残基を含んでなり得る。リンカーは、機能化可能部分を介して、担体タンパク質または免疫原増強成分、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と連結され得る。リンカーは、例えば、１～９個のアミノ酸であり得、機能化可能部分単独であり得る。

【0087】

用語「機能化可能部分」は、本明細書で使用する場合、別の原子団または単一原子（いわゆる「相補的官能基」）と反応して、２つの団または原子の間の化学的相互作用を形成する原子団または単一原子を本明細書で使用する場合に指す「官能基」を有する化学的実体を指す。システインの場合、官能基は、ジスルフィド結合を形成するために反応され得る－ＳＨであり得る。別の原子団との反応は、共有結合または強力な非共有結合であり得、例えば、ビオチン－ストレプトアビジン結合の場合、Ｋｄ約１ｅ－１４を有し得る。強力な非共有結合は、本明細書で使用する場合、少なくとも１ｅ－９、少なくとも１ｅ－１０、少なくとも１ｅ－１１、少なくとも１ｅ－１２、少なくとも１ｅ－１３または少なくとも１ｅ－１４のＫｄでの相互作用を意味する。

【0088】

タンパク質および／または他の剤は、免疫原性を促進するため、または、イン・ビトロ試験におけるプローブとしての役割を果たすためのいずれかのために、ペプチドに対して機能化（例えば、共役／コンジュゲート）され得る。この目的のために、反応する（例えば、共有結合または非共有結合であるが強力な結合を作る）ことができる任意の機能化可能部分を使用してもよい。一つの特定の実施形態において、機能化可能部分は、例えば、イン・ビトロ免疫ブロットまたは免疫組織化学アッセイのために使用される、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強成分、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質であり得る、目的のタンパク質上の不対システインとジスルフィド結合を形成するために反応されるシステイン残基である。

【0089】

用語「動物」または「対象」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、場合により、ヒトを含むまたは除く、動物界の全メンバーを含む。

【0090】

用語「治療すること」または「治療」は、本明細書で使用する場合、および当技術分野で十分理解されるように、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の臨床結果は、限定されるものではないが、検出可能であるか検出不能であるかを問わず、１以上の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の伝播の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の改善または緩和、疾患の再発の減少、および寛解（部分または完全を問わず）を含み得る。「治療すること」および「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することも意味し得る。「治療すること」および「治療」は、本明細書で使用する場合、例えば、家族型のＡＬＳなどの家族型と関連する変異を有すると同定された対象における予防的治療も含む。ＡＬＳなどのＴＤＰ－４３タンパク質症を有する対象は、疾患進行を遅延または緩徐化するために治療され得る。対象は、進行を予防するために、本明細書に記載の化合物、抗体（ベクター化抗体もしくはイントラボディを含む）、免疫原、免疫複合体、または組成物で治療され得る。

【0091】

本開示の範囲の理解において、用語「からなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、言及された特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在を指定し、かつ他の言及されていない特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在を除外する限定的な用語であるものとする。

【0092】

本明細書における終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数および分数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５を含む）。総ての数およびそれらの分数は、用語「約」により修飾されると想定されることも理解される。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容によってそうではないことが明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。用語「約」は、言及されている数のプラスまたはマイナス０．１～５０％、５～５０％、または１０～４０％、好ましくは、１０～２０％、より好ましくは、１０％または１５％を意味する。

【0093】

さらに、特定の項に記載の定義および実施形態は、当業者により理解されるように、それらが好適である本明細書に記載の他の実施形態に適用可能であるものとする。例えば、以下の節において、本発明の異なる側面がより詳細に定義されている。そのように定義された各側面は、そうではないことが明確に示されていない限り、任意の他の１つの側面または複数の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の１つの特徴または複数の特徴と組み合わせてもよい。

【0094】

ＩＩ．ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部または一部を含んでなるペプチドおよびそれらに関連した免疫原
本開示は、ミスフォールドＴＤＰ－４３上のエピトープを同定しており、それに相当するペプチドを使用して産生された抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３を優先的に認識する。実施例において示されるように、エピトープ、特にＷ６８は、天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３においてアクセス不可能であるか、またはさほどアクセス可能ではない。本発明者らは、ＴＤＰ－４３上のアミノ酸残基６５～７１に相当するＴＤＰ－４３ペプチドＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）を含んでなる免疫原を使用して、抗体を産生した。以下に示すように、この残基に関して変異したＴＤＰ－４３と明らかには反応しない前記免疫原を使用して、抗体を産生した。

【0095】

したがって、ある側面は、ＤＡＧＷＧＮＬの全部または一部を含んでなる単離ペプチドであって、前記一部は、少なくとも５個のアミノ酸であり、かつＧＷＧを含んでなる、単離ペプチドを含む。

【0096】

ある実施形態において、前記一部は、配列番号１の少なくとも６個の隣接アミノ酸である。

【0097】

前記ペプチドは、さらなるＴＤＰ－４３連続配列、例えば、最大１１個のアミノ酸、最大１３個のアミノ酸、最大１５個のアミノ酸、最大１７個もしくは１９個または最大２１個のアミノ酸を含んでなり得る。好ましくは、前記配列は、Ｗ６８上の中心またはほぼ中心に位置する。例えば、前記ペプチドが２１アミノ酸長である場合、Ｗ６８は、残基８、９、１０、１１または１２であってもよい。一つの実施形態において、前記ペプチドは、ＥＧＩＬＨＡＰＤＡＧＷＧＮＬＶＹＶＶＮＹＰ（配列番号７）であるか、または最低ＧＷＧを含んでなるその一部である。

【0098】

ある実施形態において、前記ペプチドは、ＴＤＰ－４３の残基１～８０に相当する、ＴＤＰ－４３のＮ末端ユビキチン様ドメイン由来の連続配列を含んでなるか、またはそれである。

【0099】

前記単離ペプチドは、非ＴＤＰ－４３配列、例えば、ＴＤＰ－４３連続配列に対する、例えば、１～９個のグリシンおよび／もしくはＰＥＧ部分ならびに／またはＣｙｓ残基Ｎ末端および／もしくはＣ末端を含んでなるリンカーも含んでなり得る。

【0100】

ペプチドは、固相合成または均一溶液中での合成などの、タンパク質の化学において周知の技術を使用した化学合成により、調製してもよい。

【0101】

本明細書に記載のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてエピトープＷ６８は、ＴＤＰ－４３のミスフォールド伝播株における潜在的な標的であり得、前記エピトープを認識する抗体は、例えば、このような伝播株の検出に有用であり得る。

【0102】

別の側面は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）、場合により、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＤＡＧＷＧＮ（配列番号３）、ＡＧＷＧＮ（配列番号４）、ＡＧＷＧＮＬ（配列番号５）およびＧＷＧＮＬ（配列番号６）の少なくとも５残基、場合により、少なくとも６残基を含んでなるペプチドを含んでなる免疫原を含む。ある実施形態において、前記免疫原のペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬを含んでなる。前記免疫原は、本明細書に記載のさらなるＴＤＰ－４３または非ＴＤＰ－４３残基を有するペプチドも含んでなり得る。ある実施形態において、前記免疫原に含まれるペプチドは、ＴＤＰ－４３の残基１～８０に相当する、ＴＤＰ－４３のＮ末端ユビキチン様ドメイン由来の連続配列を含んでなるか、またはそれである。

【0103】

実施例に記載のように、免疫原は、固相合成または均一溶液中での合成などの、タンパク質の化学において周知の技術を使用して、場合により、Ｃ末端システイン残基またはＮ末端システイン残基（例えば、ｃＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号８）もしくはＤＡＧＷＧＮＬｃ（配列番号９））を有する、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）、ＤＡＧＷＧ（配列番号２）、ＤＡＧＷＧＮ（配列番号３）、ＡＧＷＧＮ（配列番号４）、ＡＧＷＧＮＬ（配列番号５）またはＧＷＧＮＬ（配列番号６）などのペプチドを化学合成することにより、調製することができる。前記ペプチドは、Ｎ末端アセチル化またはＣ末端アミド化され得る。前記ペプチドは、例えば、Ｃ末端システイン残基もしくはＮ末端システイン残基または他の機能化可能部分を介して、免疫原性増強剤にコンジュゲートされ得るか、またはそうでなければ免疫原性を増大させるために修飾され得る。

【0104】

ある実施形態において、前記免疫原は、複数のペプチドを含んでなり、各ペプチドは、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の全部または一部を含んでなり、前記一部は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）の少なくとも５個、場合により、少なくとも６個の残基を含んでなり、ここで、前記複数のペプチドは、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成される。ＭＡＰは、分岐鎖状ポリリシンデンドリマーである。複数のエピトープペプチドは、例えば、リシンのアミノ末端および側鎖の一方または両方に結合する。

【0105】

ある実施形態において、前記ペプチドは、担体タンパク質または免疫原性増強成分と共役する。前記免疫原性増強成分は、例えば、アミド結合、ジスルフィド結合を介して直接的、またはリンカーを介して間接的のいずれかで、化合物と共役し得る。

【0106】

免疫原性増強成分を有する免疫原は、例えば、Lateef et al 2007に記載の方法（引用することにより本明細書の一部とされる）を使用して、前記ペプチド、およびシステインなどの機能化可能部分を含んでなるリンカーを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強成分またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とコンジュゲートすることにより、産生することができる。ある実施形態において、実施例１に記載の方法が使用される。

【0107】

さらなる側面は、ミスフォールドＴＤＰ－４３、例えば、本明細書に記載の免疫原により産生された細胞質および／または凝集ミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する抗体を含む。

【0108】

ある実施形態において、産生された抗体は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係において少なくともＷ６８に特異的に結合する。

【0109】

ＩＩＩ．抗体、免疫複合体、細胞および核酸
ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）または関連エピトープおよび上記の免疫原を含んでなる単離ペプチドは、天然ＴＤＰ－４３と比較してミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する抗体を産生するために使用され得る。

【0110】

したがって、ある側面は、天然ＴＤＰ－４３と比較してミスフォールドＴＤＰ－４３に結合する抗体を含む。

【0111】

ある実施形態において、前記抗体は、ＴＤＰ－４３配列ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）、その関連エピトープまたはその一部に結合し、ここで、前記抗体は、天然ＴＤＰ－４３と比較してミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する。

【0112】

ある実施形態において、前記抗体は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８、その関連エピトープまたはその一部に特異的に結合し、ここで、前記抗体は、天然ＴＤＰ－４３と比較してミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する。

【0113】

ある実施形態において、前記抗体は、天然ＴＤＰ－４３に特異的に結合しない、かつ／またはそれに対して選択的ではない。選択的結合は、本明細書に記載のように、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴測定を使用して測定することができる。

【0114】

ある実施形態において、前記抗体は単離される。

【0115】

さらなる側面は、ＴＤＰ－４３上に存在するエピトープに特異的または選択的に結合する抗体であり、ここで、前記エピトープは、前記抗体に対する結合に主に関与する少なくとも１つのアミノ酸残基を含んでなるか、またはそれからなり、ここで、少なくとも１つのアミノ酸は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８である。ある実施形態において、前記エピトープは、前記抗体に対する結合に主に関与する少なくとも３つの連続したアミノ酸残基を含んでなるか、またはそれらからなり、ここで、前記少なくとも３つの連続したアミノ酸は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）内に含まれるＧＷＧである。

【0116】

モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を、本明細書に記載の免疫原で免疫化された対象から回収し、標準的な体細胞融合手順により骨髄腫細胞と融合させ、それにより、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当技術分野で周知であり（例えば、Kohler and Milstein (Nature 256:495-497 (1975)により最初に開発されたハイブリドーマ技術）、ならびに他の技術、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunol.Today 4:72 (1983)）、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., Methods Enzymol, 121 : 140-67 (1986)）、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., Science 246:1275 (1989)）も周知である。ハイブリドーマ細胞は、所望のエピトープと特異的に反応性である抗体を産生するために、免疫化学的にスクリーニングされ得、モノクローナル抗体は単離され得る。

【0117】

特定の抗原または分子に対して反応性である特異的抗体、または抗体フラグメントは、細胞表面成分を有する細菌において発現される免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの部分をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、作製してもよい。例えば、完全なＦａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域は、ファージ発現ライブラリーを使用して、細菌において発現させることができる（例えば、Ward et al., Nature 41:544-546 (1989); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989);およびMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)参照）。

【0118】

非ヒト種由来の（例えば、マウスまたはウサギ由来の）抗体のヒト化は、文献において十分に記載されている。例えば、ＥＰ－Ｂ１ ０ ２３９４００およびCarter & Merchant 1997 （Curr Opin Biotechnol 8, 449-454, 1997、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）参照。ヒト化抗体はまた、容易に商業的に得られる（例えば、Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain）。

【0119】

ヒト化型の齧歯類抗体は、ＣＤＲグラフティングにより容易に作製される（Riechmann et al. Nature, 332:323-327, 1988）。このアプローチにおいて、齧歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含んでなる６個のＣＤＲループは、対応するヒトフレームワーク領域に連結される。フレームワーク領域のアミノ酸は、抗原認識に影響を及ぼし得るため、ＣＤＲグラフティングはしばしば、親和性が低い抗体をもたらす（Foote & Winter. J Mol Biol, 224: 487-499, 1992）。抗体の親和性を維持するために、部位特異的変異誘発または他の組換え技術により特定のフレームワーク残基を置き換えることがしばしば必要であり、抗原結合部位のコンピューターモデリングにより支援され得る（Co et al. J Immunol, 152: 2968-2976, 1994）。

【0120】

ヒト化型の抗体は、場合により、リサーフェシングにより得られる（Pedersen et al. J Mol Biol, 235: 959-973, 1994）。このアプローチでは、齧歯類抗体の表面残基のみがヒト化される。

【0121】

特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージディスプレイ戦略により同定してもよい（Jespers et al. Bio/Technology, 12: 899-903, 1994）。１つのアプローチにおいて、特異的抗原に対して指向する齧歯類抗体の重鎖が、クローン化され、繊維状ファージ上でのＦａｂフラグメントとしての提示のためにヒト軽鎖のレパートリーと対にされる。ファージは、抗原に対する結合により選択される。選択されたヒト軽鎖はその後、ファージ上での提示のためにヒト重鎖のレパートリーと対にされ、ファージは、抗原に対する結合により再度選択される。結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂフラグメントである。別のアプローチにおいて、メンバーがそれらの外表面上に異なるヒト抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦｖ）を提示する、ファージのライブラリーが作製される（Dower et al., WO 91/17271 and McCafferty et al.、ＷＯ９２／０１０４７）。所望の特異性を有するファージディスプレイ抗体は、特異的抗原に対するアフィニティー濃縮により選択される。いずれかのアプローチから同定されたヒトＦａｂまたはＦｖフラグメントは、哺乳動物細胞におけるヒト抗体としての発現のために再クローン化してもよい。

【0122】

ヒト抗体は、場合により、トランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号）。このアプローチでは、キメラまたは生殖系列変異マウスにおける重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子が欠失される。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイが、その後、このような変異マウスに導入される。そして、得られたトランスジェニックマウスは、抗原チャレンジ時にヒト抗体の完全レパートリーを産生することができる。

【0123】

ヒト化抗体またはヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択される。ヒト化抗体またはヒト抗体は、１以上のアイソタイプまたはクラス由来の配列を含んでもよい。さらに、これらの抗体は、抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖおよびシングルドメイン抗体フラグメントとして、または重鎖および軽鎖がスペーサーにより連結されている単鎖抗体として、一般に産生される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体は、単量体型または重合体型で存在してもよい。ヒト化抗体は、場合により、１つの非ヒト鎖および１つのヒト化鎖（すなわち、１つのヒト化重鎖または軽鎖）を含んでなる。

【0124】

さらに、本明細書に記載のエピトープに対して特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより、容易に単離される。例えば、抗体ファージライブラリーは、場合により、疾患特異的エピトープに対して抗体フラグメントを同定するために、本発明の疾患特異的エピトープを使用することにより、スクリーニングされる。同定された抗体フラグメントは、場合により、本発明の異なる複数の実施形態を有する有用な種々の組換え抗体を産生するために、使用される。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｘｏｍａ社（バークレー、カリフォルニア州）を通じて市販されている。抗体ファージライブラリーをスクリーニングする方法は、当技術分野で周知である。

【0125】

したがって、ある実施形態において、本明細書に記載の抗体は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号１２）、ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ（配列番号１８）、ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ（配列番号２４）、ＧＲＧＤＩ（配列番号３６）、ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ（配列番号４８）、ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ（配列番号１２２）、またはＶＲＱＮＹＥＧＡＹ（配列番号１３２）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、配列ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号１２）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、配列ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ（配列番号１８）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、配列ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ（配列番号２４）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、配列ＧＲＧＤＩ（配列番号３６）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、配列ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ（配列番号４８）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、配列ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ（配列番号１２２）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、配列ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ（配列番号１３２）を含んでなる。

【0126】

したがって、ある実施形態において、本明細書に記載の抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号１２）およびＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ（配列番号１５）；ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ（配列番号１８）およびＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ（配列番号２１）；ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ（配列番号２４）およびＡＧＧＷＲＳＬＮＡ（配列番号２７）；ＧＲＧＤＩ（配列番号３６）およびＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ（配列番号３９）；ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号４２）およびＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ（配列番号４５）；ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ（配列番号４８）およびＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ（配列番号５１）；ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ（配列番号１２２）およびＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ（配列番号１２５）；またはＶＲＱＮＹＥＧＡＹ（配列番号１３２）およびＦＱＳＳＨＶＰＷＴ（配列番号１３５）を含んでなる。

【0127】

一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号１２）およびＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ（配列番号１５）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ（配列番号１８）およびＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ（配列番号２１）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ（配列番号２４）およびＡＧＧＷＲＳＬＮＡ（配列番号２７）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＧＲＧＤＩ（配列番号３６）およびＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ（配列番号３９）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ（配列番号４２）およびＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ（配列番号４５）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ（配列番号４８）およびＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ（配列番号５１）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ（配列番号１２２）およびＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ（配列番号１２５）を含んでなる。一つの実施形態において、前記ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、配列：ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ（配列番号１３２）およびＦＱＳＳＨＶＰＷＴ（配列番号１３５）を含んでなる。

【0128】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＲＹＹ 配列番号 １０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＩＰＧＧＴＴ 配列番号 １１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 １２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＨ 配列番号 １３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＥＡＳ 配列番号 １４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ 配列番号 １５、
抗体を提供する。

【0129】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＮＹＶ 配列番号 １６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＷＦＡＧＩＶＤＴＴ 配列番号 １７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ 配列番号 １８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＳＮＮＲ 配列番号 １９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＹＡＳ 配列番号 ２０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ 配列番号 ２１、
抗体を提供する。

【0130】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＳＹＶ 配列番号 ２２；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＳＤＴＧＩＮＴ 配列番号 ２３；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ 配列番号 ２４；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＹ 配列番号 ２５；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＡＳ 配列番号 ２６；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＧＷＲＳＬＮＡ 配列番号 ２７、
抗体を提供する。

【0131】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＥＦＳＦＳＳＲＹＷ 配列番号 ２８；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＴＧＳＩＤＡＴ 配列番号 ２９；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＧＳＤＡＷＧＬＹＦＮＬ 配列番号 ３０；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＨＫＮＮＹ 配列番号 ３１；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＡＳ 配列番号 ３２；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＶＹＳＧＲＩＦＡ 配列番号 ３３、
抗体を提供する。

【0132】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＴ 配列番号 ３４；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＧＧＩＧＳＴ 配列番号 ３５；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＧＲＧＤＩ 配列番号 ３６；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＲ 配列番号 ３７；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＧＡＳ 配列番号 ３８；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ 配列番号 ３９、
抗体を提供する。

【0133】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＡＹＹ 配列番号 ４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＴＩＰＩＧＲＴ 配列番号 ４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 ４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＱ 配列番号 ４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＱＡＳ 配列番号 ４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ 配列番号 ４５、
抗体を提供する。

【0134】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＡ 配列番号 ４６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＮＹＥＴ 配列番号 ４７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ 配列番号 ４８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＧ 配列番号 ４９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＴＳ 配列番号 ５０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ 配列番号 ５１、
抗体を提供する。

【0135】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＮ 配列番号 １２０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＧＴＧＧＩＴ 配列番号 １２１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ 配列番号 １２２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＮＮＮＮ 配列番号 １２３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＳ 配列番号 １２４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ 配列番号 １２５、
抗体を提供する。

【0136】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １３０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＳＮＧＧＳＴ 配列番号 １３１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １３２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １３３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １３４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １３５、
抗体を提供する。

【0137】

ある側面において、本開示は、場合により融合した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる抗体であって、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、前記軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＴＮＧＧＳＴ 配列番号 １４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １４５、
抗体を提供する。

【0138】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号９８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１０～１２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または前記抗体は、ｉ）配列番号９９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３～１５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0139】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１００において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１００に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１６～１８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体は、ｉ）配列番号１０１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０１に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１９～２１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0140】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１０２において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０２に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２２～２４において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または前記抗体は、ｉ）配列番号１０３において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２５～２７において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８０において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８１において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0141】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１０４において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２８～３０において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体は、ｉ）配列番号１０５において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３１～３３において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８２において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８３において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0142】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１０６において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３４～３６において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または前記抗体は、ｉ）配列番号１０７において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０７に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３７～３９において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８４において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８５において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0143】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１０８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４０～４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または前記抗体は、ｉ）配列番号１０９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４３～４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0144】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１１０において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１０に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４６～４８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体は、ｉ）配列番号１１１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１１に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４９～５１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0145】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１２８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２０～１２２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または前記抗体は、ｉ）配列番号１２９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２３～１２５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0146】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１３８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３０～１３２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体は、ｉ）配列番号１２９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３３～１３５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0147】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１４８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４０～１４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体は、ｉ）配列番号１４９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４３～１４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0148】

ある実施形態において、前記抗体は、配列番号９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１２８、１３８、または１４８のいずれか１つにおいて示される保存的置換アミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。ある実施形態において、前記抗体は、配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１２９、１３９、または１４９のいずれか１つにおいて示される保存的置換アミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。例えば、前記重鎖可変領域および／または前記軽鎖可変領域、場合によりフレームワーク領域１、２および／または３は、１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換を含み得る。

【0149】

ある実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。ある実施形態において、前記抗体は、キメラ抗体、例えば、ヒト化抗体である。ある実施形態において、前記抗体は単鎖抗体である。

【0150】

ある実施形態において、前記抗体はアフィニティー精製される。

【0151】

ある実施形態において、前記抗体は、本明細書に記載の単離ペプチドまたは免疫原を使用して産生またはスクリーニングされる。

【0152】

別の側面は、本明細書に記載の抗体、場合により、本明細書に記載のＣＤＲセットを含んでなる抗体と、ヒトミスフォールドＴＤＰ４３に対する結合に関して競合する抗体を含む。

【0153】

抗体間の競合は、例えば、供試抗体が共通抗原に対する参照抗体の特異的結合を阻害するその能力に関して評価されるアッセイを使用して、決定することができる。過剰な試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍または２０倍）が、競合結合アッセイにおいて測定された結果、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、参照抗体の結合を阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。

【0154】

さらなる側面は、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗体である。ある実施形態において、検出可能な標識は、陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えば、ＰＥＴイメージングにおいて使用され得る。

【0155】

したがって、ある実施形態は、本明細書に記載の抗体および検出可能な標識を含んでなる免疫複合体を提供する。

【0156】

さらなる側面は、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメントおよびミスフォールドＴＤＰ－４３を含んでなる抗体複合体に関する。さらなる側面は、本明細書に記載の抗体またはその一部をコードする単離核酸である。

【0157】

重鎖または軽鎖をコードする核酸、例えば、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２および／もしくはＣＤＲ－Ｈ３領域を含んでなる重鎖をコードする、または本明細書およびより詳しくは表３に記載のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２および／もしくはＣＤＲ－Ｌ３領域を含んでなる軽鎖をコードする核酸も提供される。

【0158】

例えば、核酸配列は、配列番号７６～８９、配列番号１２６～１２７、配列番号１３６～１３７および／または配列番号１４６～１４７のいずれか１つを含んでなる。

【0159】

本開示はまた、本明細書に開示される抗体をコードする核酸配列のバリアントを提供する。

【0160】

例えば、前記バリアントは、少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示される抗体をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、またはコドン縮重または最適化配列を含む。別の実施形態において、バリアント核酸配列は、配列番号７６～８９、配列番号１２６～１２７、配列番号１３６～１３７および／または配列番号１４６～１４７のいずれか１つを含んでなる核酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、最も好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらに最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。

【0161】

さらなる側面は、本明細書に記載の単離ペプチド、免疫原、または抗体のアミノ酸残基をコードする単離核酸を提供する。

【0162】

別の側面は、本明細書に開示される核酸を含んでなる発現カセットまたはベクターである。ある実施形態において、前記ベクターは単離ベクターである。

【0163】

前記ベクターは、抗体および／もしくはその結合フラグメントを産生する、または本明細書に記載のペプチド配列を発現するのに好適なベクターを含む、任意のベクターであり得る。

【0164】

核酸分子は、タンパク質の発現を保証する適当な発現ベクターに、公知の様式で組み込んでもよい。可能性のある発現ベクターとしては、限定されるものではないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。ベクターは、使用される宿主細胞に適合するべきである。発現ベクターは、「宿主細胞の形質転換に好適」であり、それは、発現ベクターが、本明細書に記載のエピトープ／ペプチドまたは抗体に相当するペプチドをコードする核酸分子を含有することを意味する。

【0165】

ある実施形態において、前記ベクターは、例えば、単鎖抗体（例えば、イントラボディ）を発現するのに好適である。好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む、種々の源に由来し得る。このような調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が挙げられる。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに応じて、他の配列、例えば、複製起点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列を、発現ベクターに組み込んでもよい。ある実施形態において、前記調節配列は、神経組織および／または細胞における発現を指示するまたは増大させる。ある実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。組換え発現ベクターは、本明細書に記載の抗体またはエピトープペプチドを発現するためのベクターで形質転換、感染またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子も含有してもよい。組換え発現ベクターは、組換えペプチドの発現または安定性の増大；組換えペプチドの溶解性の増大；ならびに、例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含む、アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによる、標的組換えペプチドの精製における支援をもたらす、融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする発現カセットを含有してもよい。さらに、融合タンパク質の精製に次ぐ融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、タンパク質分解切断部位を標的組換えタンパク質に加えてもよい。典型的な融合発現ベクターとしては、組換えタンパク質に対してそれぞれグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合しているｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられる。

【0166】

別の側面において、本明細書に記載の抗体を発現する細胞も提供される。ある実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の抗体を発現するか、または本明細書に開示されるベクターを含んでなる、単離細胞および／または組換え細胞である。ある実施形態において、前記細胞は、融合細胞、例えば、ハイブリドーマである。

【0167】

前記組換え細胞は、ポリペプチドを産生するのに好適な、例えば、抗体および／またはその結合フラグメントを産生するのに好適な任意の細胞を使用して、作製することができる。例えば、細胞に核酸（例えば、ベクター）を導入するために、前記細胞を、使用されるベクターに応じて、トランスフェクト、形質転換または感染させてもよい。

【0168】

好適な宿主細胞としては、多種多様な原核生物および真核生物宿主細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載のタンパク質は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用して）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させてもよい。

【0169】

ある実施形態において、前記細胞は、酵母、植物、蠕虫、昆虫、鳥、魚、爬虫類および哺乳動物の細胞から選択される真核細胞である。

【0170】

別の実施形態において、前記哺乳動物細胞は、骨髄腫細胞、脾臓細胞、またはハイブリドーマ細胞である。

【0171】

ある実施形態において、前記細胞は神経細胞である。

【0172】

抗体またはペプチドを発現するのに好適な酵母および真菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア属またはクリベロマイセス属および様々な種のアスペルギルス属が挙げられる。酵母Ｓ．セレビシエにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）が挙げられる。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコールは、当業者に周知である。

【0173】

好適であり得る哺乳動物細胞としては、とりわけ、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）およびＮＳ－１細胞が挙げられる。哺乳動物細胞における発現を指示するための好適な発現ベクターとしては、一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０などのウイルス材料由来）、ならびに他の転写および翻訳調節配列が挙げられる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。

【0174】

ある実施形態において、前記細胞は、融合細胞、例えば、ハイブリドーマ細胞であり、前記ハイブリドーマ細胞は、例えば、ミスフォールドＴＤＰ－４３に選択的に結合するものを含む、本明細書に記載のエピトープまたはエピトープ配列に対して特異的な抗体および／または選択的な抗体を産生する。

【0175】

さらなる側面は、本明細書に記載のエピトープに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。

【0176】

ＩＶ．組成物
さらなる側面は、本明細書に記載の単離ペプチド、免疫原、抗体、または免疫複合体を含んでなる組成物である。本明細書に記載の単離ペプチド、免疫原、抗体、または免疫複合体のうち２つ以上を含んでなる組成物も提供される。

【0177】

ある実施形態において、前記組成物は、希釈液を含んでなる。核酸およびベクターのための好適な希釈液としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。

【0178】

抗体もしくはそのフラグメントを含むポリペプチドおよび／または細胞のための好適な希釈液としては、限定されるものではないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝液ならびにグリセロール溶液またはポリペプチドおよび／もしくは細胞を凍結させるのに好適な他の溶液が挙げられる。

【0179】

本明細書に記載のペプチド、化合物または免疫原を含んでなるある実施形態において、前記組成物は、アジュバントを含んでなる。

【0180】

ある実施形態において、前記アジュバントは、ミョウバン、モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１から選択される。

【0181】

使用され得るアジュバントとしては、例えば、通常、ワクチンとして使用される死滅細菌または弱毒細菌の成分である内因性アジュバント（リポ多糖など）である。外因性アジュバントは、一般に抗原と非共有結合され、かつ宿主免疫応答を増強するために処方される免疫調節剤である。水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（まとめて一般にミョウバンという）が、アジュバントとして慣例的に使用される。広範な外因性アジュバントが、免疫原に対する強力な免疫応答を誘発し得る。これらには、サポニン、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ社、ウースター、マサチューセッツ州）またはそれから作製された粒子、例えば、ＩＳＣＯＭおよび（免疫刺激複合体）および膜タンパク質抗原と複合体を形成した（免疫刺激複合体）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、鉱油を有するプルロニックポリマー、死滅マイコバクテリアおよび鉱油、フロイント完全アジュバント、細菌産物、例えば、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）、ならびにリピドＡ、およびリポソームが含まれる。

【0182】

ある実施形態において、前記アジュバントは水酸化アルミニウムである。別の実施形態において、前記アジュバントはリン酸アルミニウムである。水中油型エマルションとしては、スクアレン；落花生油；ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４３８７）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型エマルションは、免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルコサミル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ－ＤＰＰ）テラミド（商標））、または他の細菌細胞壁成分とともに使用してもよい。

【0183】

前記アジュバントは、単一組成物としての免疫原とともに投与してもよい。あるいは、前記免疫原の投与の前、それと同時および／またはその後に、アジュバントを投与してもよい。

【0184】

ある実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部を含んでなる。別の実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部および希釈液を含んでなる。ある実施形態において、前記組成物は無菌組成物である。

【0185】

いくつかの実施形態において、前記組成物は無菌である。

【0186】

ある実施形態において、前記組成物は、ミスフォールドＴＤＰ－４３を検出することなど、本明細書に記載の方法のためのものである。

【0187】

ある実施形態において、前記組成物は、薬学上許容可能な担体、希釈液、および／または賦形剤を含んでなる。ある実施形態において、前記組成物は、例えば、それを必要とする対象、例えば、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有する対象を治療することなど、本明細書に記載の方法のための医薬組成物である。

【0188】

前記組成物は、本明細書に記載の１以上の抗体を含んでなり得る。

【0189】

Ｖ．キットおよびパッケージ
さらなる側面は、無菌バイアルなどのバイアルまたは他の収容容器に含まれた、ｉ）単離ペプチド、ｉｉ）免疫原、ｉｉｉ）抗体、ｉｖ）免疫複合体、ｖ）単離核酸、またはｖｉ）組成物、ならびに場合により、参照剤および／またはその使用説明書を含んでなるキットまたはパッケージに関する。

【0190】

ある実施形態において、前記キットはＥＬＩＳＡである。ある実施形態において、前記キットは、例えば、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ社、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社またはＳｉｎｇｕｌｅｘ社を通じて入手可能なものと類似した、または本明細書に記載の方法を実施するための、マルチプレックスアッセイまたは平面アレイキットである。

【0191】

ある実施形態において、前記キットは、無菌バイアルなどの容器に含まれた本明細書に記載の抗体を含んでなる。

【0192】

ある実施形態において、前記キットは、ＥＬＩＳＡまたは本明細書に記載の方法のための使用説明書を含んでなる。

【0193】

ＶＩ．方法
本明細書に記載の単離ペプチド、免疫原および抗体を作製する方法が含まれる。

【0194】

特に、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８または関連エピトープに対して選択的な抗体を作製する方法が提供される。ある実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の単離ペプチド、免疫原、または組成物を非ヒト対象に投与すること、ならびに免疫原および／またはミスフォールドＴＤＰ－４３のＴＤＰ－４３ペプチドに選択的に結合する抗体を単離することを含んでなる。例えば、抗体を単離することは、本出願に記載の１以上の方法が関与し得る。

【0195】

ある実施形態において、前記方法は、免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの部分をコードする発現ライブラリーから、免疫原および／またはミスフォールドＴＤＰ－４３のＴＤＰ－４３ペプチドに選択的に結合する抗体を単離することを含んでなる。場合により、前記発現ライブラリーはファージディスプレイライブラリーである。

【0196】

さらなる側面は、非ヒト対象において免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載の化合物、免疫原および／または化合物を含んでなる組成物を前記対象に投与すること；ならびに場合により、投与された化合物または免疫原に特異的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含んでなる方法を含む。

【0197】

ある実施形態において、前記方法は、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関係においてＷ６８または関連エピトープに特異的に結合する抗体を単離することをさらに含んでなる。

【0198】

ある実施形態において、前記方法は、抗体産生ハイブリドーマを形成することをさらに含んでなる。例えば、上記で考察したように、モノクローナル抗体は、本明細書に記載の方法を使用して作製することができる。

【0199】

さらなる側面は、本明細書に記載の方法により産生される抗体を提供する。

【0200】

さらなる側面は、サンプルがミスフォールドＴＤＰ－４３を含んでなるかどうかを検出する方法を提供する。

【0201】

ある実施形態において、前記方法は、
ａ．前記サンプルを、抗体：ミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチド複合体を産生することを許容する条件下で、本明細書に記載の抗体と接触させること；および
ｂ．任意の複合体の存在を検出すること
を含んでなり、
ここで、検出可能な複合体の存在は、前記サンプルがミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチドを含有し得ることを示すものである。

【0202】

別の実施形態において、前記方法は、
（ａ）前記対象の試験サンプルを、抗体－抗原複合体を産生することを許容する条件下で、本明細書に記載の抗体と接触させること；
（ｂ）前記試験サンプル中の抗体－抗原複合体の量を測定すること；および
（ｃ）前記試験サンプル中の抗体－抗原複合体の量を対照と比較すること
を含んでなり、
ここで、対照と比較して前記試験サンプル中の抗体－抗原複合体を検出することは、前記サンプルがミスフォールドＴＤＰ－４３を含んでなることを示すものである。

【0203】

前記測定することは、例えば、免疫蛍光によるものであってもよい。前記方法は、共局在染色、例えば、ｐａｎ－ＴＤＰ－４３染色も含み得る。

【0204】

ある実施形態において、前記サンプルは生物サンプルである。ある実施形態において、前記サンプルは、血液、血清、血漿、脳組織、脊髄組織もしくはその抽出物および／またはＣＳＦを含んでなる。前記サンプルは、画分でもあり得る。例えば、前記サンプルは、脳、ＣＳＦおよび／または血液由来の細胞外小胞を含んでなり得る。ある実施形態において、前記サンプルは、ヒト対象から得られる。

【0205】

ある実施形態において、前記サンプルは、ＡＬＳを有する対象に由来する。別の実施形態において、前記サンプルは、ＦＴＤを有する対象に由来する。ある実施形態において、前記サンプルは、大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）に由来する。

【0206】

イムノアッセイ、例えば、フローサイトメトリー、ドットブロットまたはスロットブロット、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、および免疫沈降に次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥ免疫細胞化学を含む、多数の方法を使用して、ミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチドがサンプル中に存在するかどうかを、本明細書に記載の抗体を使用して決定することができる。使用することができる他の免疫ベースの方法としては、シングルプレックスおよびマルチプレックスイムノアッセイプラットフォームが挙げられる。

【0207】

個々の免疫複合体が常磁性ビーズ上に単離され、検出されるシングルプレックスビーズベースのプラットフォームを使用することができる。好適なビーズベースのシングルプレックスプラットフォームとしては、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社から入手可能なものが挙げられる。

【0208】

これらの目的に好適なマルチプレックスイムノアッセイプラットフォームとしては、ビーズまたは粒子ベースのプラットフォーム、および平面アレイプラットフォームが挙げられる。

【0209】

捕捉抗体が、粒子、例えば、蛍光色素ビーズまたは常磁性ビーズ上に固定化され、分析物が第２の検出抗体で検出される、ビーズベースまたは粒子ベースのプラットフォームを使用することができる。好適なビーズベースのマルチプレックスプラットフォームとしては、例えば、ＡｂＣａｍ社製のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）、ＡｂＣａｍ社製のＦｉｒｅＰｌｅｘ（商標）、およびＱｕａｎｔｅｒｉｘ社から入手可能なものが挙げられる。

【0210】

捕捉抗体が、固体表面、例えば、メンブレン、ガラス表面、または例えば９６ウェルプレートもしくは３８４ウェルプレートの個々のウェル上にマイクロアレイ形式で固定化され、分析物が第２の検出抗体で検出される、平面アレイプラットフォームを使用することができる。マイクロアレイプラットフォームの空間的分離のために、スポット座標を使用して、検出された分析物を同定することができる。好適な平面アレイプラットフォームとしては、例えば、Ｑｕａｔｅｒｎｉｘ社またはＭｅｓｏｓｃａｌｅ社から入手可能なものが挙げられる。

【0211】

蛍光標識検出抗体を利用したビーズベースまたは粒子ベースのアッセイに次いで、検出抗体を、免疫複合体から溶出し、かつキャピラリー流体工学およびレーザーを使用して個々の蛍光分子を検出および計数することにより定量化する、単一分子計数を行ってもよい。好適な技術としては、例えば、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ社から入手可能なものが挙げられる。

【0212】

コンフォメーション特異的結合を評価するために、表面プラズモン共鳴を使用することができる。

【0213】

本明細書に記載の標識抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３の位置を検出するために、対象に投与することもできる。

【0214】

ミスフォールドＴＤＰ－４３細胞間伝播を阻害する方法であって、本明細書に記載の抗体を、それを必要とする対象、例えば、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有すると疑われる、それを発症するリスクにある、またはそれと診断されている対象に投与することを含んでなる方法も提供される。

【0215】

ＴＤＰ－４３タンパク質症を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の開示の抗体、免疫複合体、免疫複合体の前記抗体を含んでなる組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法も提供される。

【0216】

ある実施形態において、前記ＴＤＰ－４３タンパク質症は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ＴＤＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、および大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から選択される。

【0217】

さらなる側面は、有効量の本明細書に記載の開示の抗体もしくは免疫複合体、または前記抗体もしくは免疫複合体を含んでなる組成物を、場合により、別のＴＤＰ－４３タンパク質症治療と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、対象を治療する方法である。他のＴＤＰ－４３タンパク質症治療としては、限定されるものではないが、ＡＬＳに対する治療、例えば、リルゾール（リルテックまたはＴｉｇｌｕｔｉｋ（商標））、エダラボン（ラジカヴァ（商標））、およびニューデクスタ（商標）（デキストロメトルファンおよびキニジンの組合せ）が挙げられる。

【0218】

前記抗体は、例えば、薬学上許容可能な担体、希釈液および／または賦形剤と例えば組み合せて、本明細書に記載の組成物に含まれ得、かつ例えば、送達を改善するためのベシクルにおいて処方され得る。抗体（例えば、２以上の抗体）および／または免疫複合体の組合せも使用することができる。

【0219】

本明細書に記載の組成物、抗体、免疫原、および免疫複合体は、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、くも膜下腔内投与、眼窩内投与、眼投与、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与または経口投与により投与され得る。

【0220】

特定の複数の実施形態において、前記組成物は全身投与される。

【0221】

他の複数の実施形態は、本明細書に記載の組成物、抗体、および免疫複合体の、血液脳関門を介する輸送を促進することで知られる生物活性分子との同時投与を企図する。

【0222】

特定の複数の実施形態において、米国特許第７，０１２，０６１号「血液脳関門の透過性を増大させる方法」（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載のように、血液脳関門の透過性を一過性に増大させるように向けられたものなど、血液脳関門を介して本明細書に記載の組成物、抗体、および免疫複合体を投与する方法も企図される。

【0223】

それを必要とする対象または細胞における本明細書に記載の１以上の抗体の発現のための、本明細書に記載の組成物および／または核酸のウイルス送達も、本明細書において企図される。ある側面は、有効量の本明細書に記載の開示のベクター化抗体、または前記ベクター化抗体を含んでなる組成物を、場合により、別のＴＤＰ－４３タンパク質症治療と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、対象を治療する方法を含む。一つの実施形態において、前記ベクター化抗体は、本明細書に記載の抗体をコードする核酸を含んでなるウイルスベクターである。一つの実施形態において、前記方法は、それを必要とする対象におけるイントラボディの細胞内発現のためのものである。イントラボディは、例えば、細胞内ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集を阻害し得るか、またはミスフォールド凝集体のクリアランスを促進する。

【0224】

前記ベクター化抗体は、組成物中のものであり得る。非ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９）およびレンチウイルスベクターなども使用することができる。特定の複数の実施形態において、前記核酸および／またはベクターは、脳室内注射またはくも膜下腔内注射され得る。

【0225】

上記の開示は、一般に、本出願を説明するものである。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、例示の目的のためにのみ説明され、本出願の範囲を限定することを意図したものではない。状況が便宜を示唆し得るか、与え得る限り、形態の変更および均等物の置換が企図される。特定の用語が本明細書において使用されているが、このような用語は、説明的な意味であることを意図し、限定の目的のためのものではない。

【0226】

以下の限定されない例は、本開示の例示的なものである：

【実施例】

【0227】

実施例１
ＴＤＰ－４３エピトープ
ＴＤＰ－４３ ＮＴＤは、ユビキチン様ドメインを含んでなる。ＴＤＰ－４３ ＮＴＤ Ｔｒｐ６８は、タンパク質を含有する他のユビキチン様ドメイン（例えば、ヒトユビキチン、アキシン１、ヒトおよびＤｖｌ－２）と整列される場合、ＴＤＰ－４３に一意的に存在する［９］。Ｔｒｐ６８は、ＰＤＢＩＤ ２Ｎ４Ｐおよび６Ｂ１ＧなどのＰＤＢ構造において溶媒露出されていないことを決定した。Ｔｒｐ６８（すなわち、ＮＭ＿００７３７５．３において表されるヒト配列中の位置）は、ミスフォールドＴＤＰ－４３において溶媒露出されている（抗体がアクセス可能）であろうと仮定した。トリプトファン６８を中心とする７個のアミノ酸ペプチドを選択し、実施例２に記載の通りに免疫原を設計した。

【0228】

実施例２
免疫原の構築
ペプチドＤＡＧＷＧＮＬｃ（配列番号９）を、標準的なプロトコール（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に従って合成した。前記ペプチドのＮ末端をアセチル化した。

【0229】

次いで、合成されたペプチドを、Ｃ末端ｃｙｓ残基を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（免疫化用）またはＢＳＡ（スクリーニング用）にコンジュゲートし、実施例３において使用する免疫原を産生した。

【0230】

実施例３
ポリクローナル抗体の作製および選択
Ｃ末端システインを介してＫＬＨに連結されたペプチドＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）を含んでなる免疫原を使用して、ポリクローナル抗体を産生した。

【0231】

免疫化
２匹のニュージーランドウサギ（ＧＳ２４０およびＧＳ２４３と名付けた）を、実施例２に記載のＫＬＨコンジュゲートＤＡＧＷＧＮＬｃ（配列番号９）ペプチドを使用して、免疫化した（動物あたり一次免疫および２回の追加免疫注射）。３回目の免疫化後、血液を各ウサギから採取し、抗血清を単離した。保存剤（０．０２％アジ化ナトリウム終濃度）を、各単離抗血清（未精製抗血清）に加えた。免疫前血清も各動物から得、保存剤（０．０２％アジ化ナトリウム）と合わせた。

【0232】

アフィニティー精製
各ウサギ抗血清のＩｇＧ画分を、硫酸塩沈殿により単離した。次いで、沈殿を、樹脂をＤＡＧＷＧＮＬペプチドで調製したアフィニティーカラム沈殿に供した。抗血清をカラム中でインキュベートした後、ＰＢＳ中のステップワイズｐＨグラジエントを使用して、抗体を溶出させた。終濃度をＢＣＡアッセイにより決定し、滴定をＥＬＩＳＡにより行った。ＧＳ２４０由来のアフィニティー精製抗体は、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、ＧＳ２４３由来のアフィニティー精製抗体は、約０．６ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。

【0233】

ＥＬＩＳＡ条件：
ＥＬＩＳＡプレートを、４μｇ／ウェルのＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ペプチド、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１００μＬ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。

【0234】

使用した二次抗体は、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ Ｆｃモノクローナル二次抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ａ０１８５６）であった。

【0235】

ＥＬＩＳＡの結果を表１Ａおよび１Ｂに示し、それらは、未精製抗血清（１Ａ）および免疫化ペプチドに対して作製されたアフィニティー精製抗体（１Ｂ）の段階希釈の結合を示す。

【0236】

【表2】

【0237】

【表3】

【0238】

実施例４
ミスフォールドＴＤＰ－４３の検出
アフィニティー精製抗体を、免疫細胞化学を使用した細胞トランスフェクションアッセイにおいて、天然ＴＤＰ－４３ポリペプチドおよびミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチドに結合するそれらの能力に関して試験した。

【0239】

方法
使用した細胞培養および免疫組織化学法は、Pokrishevsky E, Grad LI, Cashman NR. (2016) TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Sci Rep. 2016;6:22155. doi: 10.1038/srep22155（引用することにより本明細書の一部とされる）において以前に記載された方法に基づいている。

【0240】

簡単に述べれば、０．０１％ポリ－Ｄリシンでプレコートされたホウケイ酸塩カバーガラス上で、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、米国）を含有する完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３ＦＴ；ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）を培養した。細胞を、製造業者の説明書に従って、リポフェクタミン（商標）ＬＴＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、米国）を使用して、キメラレポータータンパク質を有する異なるＴＤＰ－４３ ＤＮＡプラスミド構築物でトランスフェクトした。使用した構築物は、空ベクター、核局在化シグナルにおける三重ミスセンスタンデム変異を有するＨＡ－タグヒトＴＤＰ－４３（ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３）、本来のＮＬＳ配列を有するヒトＴＤＰ４３（ＷＴ－ＴＤＰ４３）、およびトリプトファン６８がセリンに変異したΔＮＬＳ－ＴＤＰ４３（Ｗ６８Ｓ）であった。

【0241】

トランスフェクションの４８時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドに３７℃にて１時間固定し、冷ＰＢＳ中で迅速に洗浄し、ＰＢＳ中０．０１％トリトンＸにおいて１０分間透過処理し、次いで、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で室温にて１時間ブロッキングした。染色のために、実施例３に記載のアフィニティー精製ウサギ抗体を、ＰＢＳ中１０％ＮＧＳに希釈し、抗血清ＧＳ２４０については約０．５μｇ／ｍＬ、抗血清ＧＳ２４３については約０．６０μｇ／ｍＬとし、１μｇ／ｍｌラット抗ＨＡタグを対比染色として使用した（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、インディアナ州）。細胞を両抗体で４℃にて一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中で３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）－５６８または６４７蛍光色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバッド、カリフォルニア州；１：１０００希釈）にコンジュゲートした二次抗体で、暗所にて室温で１時間インキュベートした。ＤＮＡを、２μｇ／ｍｌビス－ベンズイミドＨ３３３４２三塩酸塩（ヘキスト３３３４２）を使用して１分間対比染色した。最後にＰＢＳ中で４回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、バーミンガム、アラバマ州）を滴下したスライドガラスに細胞を載せた。個々の切片の共焦点画像を、ＬＡＳ－Ｘ（商標）ソフトウェアを用いたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８（商標）顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｃａｎａｄａ社）を使用して、撮影した。

【0242】

結果：
結果を図１Ａ－１Ｌおよび２Ａ－２Ｌに示す。

【0243】

図１Ａ、１Ｅ、１Ｉ、２Ａ、２Ｅおよび２Ｉにおいて、核局在化シグナルにおける三重ミスセンスタンデム変異を有するＨＡ－タグＴＤＰ－４３構築物によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、ＨＡ抗体により検出された、細胞質におけるＴＤＰ－４３凝集体を示している。ＨＡ陽性凝集体も、ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３ Ｗ６８Ｓトランスフェクト細胞では明らかである（図１Ｂ、１Ｆ、１Ｊ、２Ｂ、２Ｆおよび２Ｊ）。アフィニティー精製ポリクローナル抗体ＧＳ２４０（図１）およびＧＳ２４３（図２）は、トリプトファン６８残基（Ｔｒｐ６８）を含んでなる、ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３トランスフェクト細胞における凝集体を認識するが（図１Ａ、１Ｅ、１Ｉ、２Ａ、２Ｅおよび２Ｉ）、Ｔｒｐ６８がセリンに変異している場合、同じ反応性は示さない（図１Ｂ、１Ｆ、１Ｊ、２Ｂ、２Ｆおよび２Ｊ）。したがって、抗ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ポリクローナルウサギ抗体は、Ｔｒｐ６８残基を含んでなるミスフォールドＴＤＰ－４３ＮＴＤに対する選択性を有する。

【0244】

ＨＡタグ野生型ＴＤＰ－４３は、核局在化シグナルに変化をもたらさずに過剰発現する場合、一般に核に局在化し、核ＴＤＰ－４３は、ＧＳ２４０またはＧＳ２４３アフィニティー精製血清に結合しない（図１Ｃ、１Ｇ、１Ｋ、２Ｃ、２Ｇおよび２Ｋ）。興味深いことに、ＧＳ２４０およびＧＳ２４３は、これらの細胞の細胞質に存在する場合、依然として野生型ＴＤＰ－４３に結合し（図１Ｋおよび２Ｋ）、それにより、Ｎ末端ユビキチン様ドメイン（ＮＴＤ）は、細胞質に誤局在する場合、ＷＴ－ＴＤＰ４３においてミスフォールドされ得ることが示唆される。

【0245】

ＧＳ２４０およびＧＳ２４３ポリクローナル抗体は、ＴＤＰ－４３凝集体の非存在下で最小の反応性を示す（図１Ｌおよび２Ｌのバックグラウンド染色、空ベクタートランスフェクションにおいて認められるように）。両抗体の反応性は、細胞質中の凝集体におけるミスフォールドＴＤＰ－４３に対して選択的であり、Ｔｒｐ６８の存在を必要とする。

【0246】

実施例５
マウスモノクローナル抗体の産生
ＫＬＨに連結されたｃＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号８）またはＤＡＧＷＧＮＬｃ（配列番号９）などのＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）を含んでなるペプチドを、モノクローナル抗体を産生するために使用することができる。

【0247】

免疫化 簡単に述べれば、長期間にわたる一連の水溶液皮下注射によりマウスを免疫化し、その後、マウスを安楽死させ、ハイブリドーマ細胞株の作製のためにリンパ球を回収する。

【0248】

融合体／ハイブリドーマの発生 リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）の存在下でマウスＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。融合細胞を、ＨＡＴ選択を用いて培養する。この方法は、半固体メチルセルロースベースのＨＡＴ選択培地を使用して、ハイブリドーマの選択およびクローニングを１つの工程にまとめるものである。単一細胞由来ハイブリドーマは、成長し、半固体培地上でモノクローナルコロニーを形成する。融合事象のおよそ１０日後、得られたハイブリドーマクローンを、９６ウェル組織培養プレートに移し、対数増殖中期に達するまで（およそ５日）、ＨＴ含有培地中で成長させる。

【0249】

ハイブリドーマ分析（スクリーニング）
ハイブリドーマ由来の組織培養上清は、スクリーニング抗原に対する間接的ＥＬＩＳＡにより試験することができ、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ二次を用いてＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の両方を探索し、ＴＭＢ基質で展開することができる。

【0250】

陽性培養物を、分泌を確認するためのスクリーニング抗原、および無関係の抗原（ヒトトランスフェリン）に対して再試験する。目的のクローンを、それらがＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかどうかを決定するために抗体捕捉ＥＬＩＳＡによりアイソタイピングし、例えば、ｔｒｙ６８を欠く他のペプチド－ＢＳＡコンジュゲートに対する間接的ＥＬＩＳＡにより、試験することができる。

【0251】

陽性ＩｇＧ分泌クローンを大規模生産に供する。

【0252】

アイソタイピング
ハイブリドーマ抗体を、抗体捕捉実験を用いてアイソタイピングする。捕捉プレートを、１００ｕＬ／ウェル炭酸コーティング緩衝液ｐＨ９．６にて、１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体で、４℃にて一晩コーティングする。一次抗体（ハイブリドーマ上清）を１００ｕｇ／ｍＬで加える。二次抗体を１：５，０００で加える。ヤギ抗マウスＩｇＧγ－ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ－ＨＲＰを、ＰＢＳ－ツイーン中の１００ｕＬ／ウェルで、３７℃にて１時間振り混ぜながら加える。全洗浄工程は、ＰＢＳ－ツイーンで３０分間行う。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で展開し、等容量１Ｍ ＨＣｌで停止する。

【0253】

抗体含有ハイブリドーマ組織培養上清を、免疫グロブリン型に関して分類し、陰性対照ペプチドおよびＢＳＡに対してスクリーニングする。陰性対照ペプチドまたはＢＳＡに結合しないＩｇＧ産生クローンを、ペプチドＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）への結合に関して、ＥＬＩＳＡにより試験する。

【0254】

実施例６
ウサギモノクローナル抗体の産生
Ｃ末端システインを介してＫＬＨにコンジュゲートしたＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ペプチド（ペプチド－ＫＬＨ）を、ＴＤＰ－４３ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を分泌するＢ細胞の作製のためのウサギ免疫化に使用した。単離Ｂ細胞の間接的ＥＬＩＳＡ試験に基づき、Ｂ細胞を、ＲＮＡ単離および組換えプラスミドＤＮＡの作製のために選択した。精製ｍＡｂの作製のために、機能的抗原結合組換えｍＡｂをトランスフェクトし、発現させた。

【0255】

免疫化：
２組のウサギを同時に免疫化した：１組は、迅速なウサギ（２８日）免疫化によるものであり、１組は、標準的なウサギ（７８日）免疫化によるものであった。

【0256】

迅速なウサギ免疫化：２匹のニュージーランドホワイト（ＮＺＢ）ウサギを、２００μｇのペプチド－ＫＬＨの皮下注射（ＳＣ）により免疫化した。免疫化後７および１４日目に、ウサギに対して、１００μｇのペプチド－ＫＬＨの１回目および２回目の追加免疫注射（ＳＣ）を行った。２１日目に、試験出血を行い、ＩｇＧに対する間接的ＥＬＩＳＡプロービングにより、血清を滴定した。２８日目に、ヘパリン加全血採取および下流でのウサギモノクローナル抗体の展開のために、ウサギを放血させた。適当な力価は、１：６４，０００希釈での０．３００ＯＤ超である。

【0257】

標準的なウサギ免疫化：２匹のニュージーランドホワイト（ＮＺＢ）ウサギを、２５０μｇのペプチド－ＫＬＨの皮下注射（ＳＣ）により免疫化した。免疫化後２８および４７日目に、ウサギに対して、２５０μｇのペプチド－ＫＬＨの１回目および２回目の追加免疫注射（ＳＣ）を行った。５８日目に、試験出血を行い、ＩｇＧに対する間接的ＥＬＩＳＡプロービングにより、血清を滴定した。６６日目に、２５０μｇのペプチド－ＫＬＨの３回目の追加免疫を投与した（ＳＣ）。７８日目に、ヘパリン加全血採取および下流でのウサギモノクローナル抗体の展開のために、ウサギを放血させた。適当な力価は、１：６４，０００希釈での０．３００ＯＤ超である。日数は、＋／－１～２日変動し得る。

【0258】

Ｂ細胞の単離、濃縮およびスクリーニング － １４日
Ｂ細胞のイン・ビトロ培養 － ７日：ウサギ由来のＢ細胞を、ヘパリン加全血から単離し、培養した。ＴＤＰ４３ペプチドを用いて、バイオパニングを行った。さらなる培養およびスクリーニングのために、抗原特異的Ｂ細胞をその後に蒔いた。

【0259】

抗体分析（スクリーニング） － ７日：プレートからのＢ細胞培養上清を、間接的ＥＬＩＳＡによりＢＳＡコンジュゲートＴＤＰ４３直鎖状ペプチドに対して試験した。これは、ウサギＩｇＧ抗体に対する二次抗体で探索した。最も応答性を示した抗原特異的Ｂ細胞を、新しいプレートに移した。次いで、クローン上清を、ＢＳＡコンジュゲートＴＤＰ４３直鎖状ペプチドに対する間接的ＥＬＩＳＡにより滴定し、トップクローン選択を位置付けるために捕捉した。

【0260】

実施例７
モノクローナル抗体のクローニングおよびシークエンシング
マウスｍＡｂのクローニング
いくつかのマウスハイブリドーマクローンに関する重鎖免疫グロブリン遺伝子および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の可変領域を同定し、配列決定した。

【0261】

方法
全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から単離し、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーのいずれかを使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。重鎖および軽鎖の抗体フラグメントを、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）により増幅した。増幅した抗体フラグメントを、標準クローニングベクターに別々にクローン化した。コロニーＰＣＲを行い、正確なサイズのインサートを有するクローンに関してスクリーニングした。ハイブリドーマ細胞株あたり、５個のクローンを選択し、重鎖および軽鎖の両方に関して配列決定した。５個のクローンを用いて配列アラインメントを行い、各モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖配列を確信的に決定した。

【0262】

配列を以下の表２、３および４に示し、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を、表３および４において下線および太字で示す。

【0263】

ウサギｍＡｂのクローニング
クローニング － １４日：トップクローンに関して、抗体ＲＮＡの単離および組換えプラスミドＤＮＡの作製を行った。各トップクローンに関して、重鎖および軽鎖可変領域を、ウサギ重鎖およびカッパ定常領域を含有する別々の哺乳動物発現ベクターにクローン化した。

【0264】

発現 － １４日：重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターを、小規模トランスフェクションのために哺乳動物細胞にコトランスフェクトした。上清をＢＳＡコンジュゲートＴＤＰ４３ペプチドに対する間接的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、機能的組換えｍＡｂが作製されたことを確認した。

【0265】

精製：トップ組換えｍＡｂ（１つの重鎖および１つの軽鎖を含有するＤＮＡ構築物）を、以下の表２、３および４に示すように配列決定し、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を、表３および４において下線および太字で示す。さらなるｍＡｂを配列決定し、配列番号５２～７５、９０～９７、および１１２～１１９を有していた。

【0266】

【表4】

【0267】

【表5】

【0268】

【表6】

【0269】

実施例８
直接結合アッセイ
ペプチド（ＢＳＡにコンジュゲートした）に対する抗血清、ハイブリドーマ上清または精製抗体の結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した表面プラズモン共鳴により調べることができる。

【0270】

高密度（少なくとも１０００レスポンスユニット（ＲＵ））のフローセルに固定化された抗原を使用して、結合分析を行う。選択されたクローンの希釈を、結合を評価するための表面に逐次的に注入する。

【0271】

親和性速度論および特異性分析のために、ＤＡＱＷＧＮＬ（配列番号１）またはＧＷＧを含んでなり、かつＢＳＡにコンジュゲートされたペプチドを、隣接するフローセルに低密度（５０～１００ＲＵ）で固定化する。次いで、選択されたクローン（４．７ｎＭ～７５ｎＭ）の段階２倍希釈を、６０μｌ／分で３分間表面に逐次的に注入した後、解離相が続く。二重参照減算の後、センサーグラムをラングミュア１：１結合モデルに当てはめる。同じセンサーチップおよび同じ条件を用いて、最大３回の別々の分析を、連続した３日間で行う。

【0272】

結合分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－２）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＧｍｂＨ社、ハンブルク、ドイツ）を使用して行うこともできる。ＭＡＳＳ－２は、高強度レーザー光および高速光学走査を使用して、結合相互作用をリアルタイムでモニタリングする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング分析バイオセンサーである。ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートを、標準的なアミンカップリング化学を使用して、Ｈｉｇｈ Ａｍｉｎｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＡＣ）センサーチップの別々のフローセルに共有結合的に固定化し、未反応部位を遮断する。隣接するフローセルを、参照対照表面としてのＢＳＡで同様に固定化する。

【0273】

モノクローナル抗体の結合速度論
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を用いて、ペプチドエピトープに対するモノクローナル抗体の結合速度論を測定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートしたペプチドを、センサーチップのフローセルに非常に低密度（およそ５０ＲＵ）で固定化した。３１．２５ｎＭから０．２４ｎＭに４倍希釈した精製マウスまたはウサギモノクローナル抗体を、表面におよそ５分間逐次的に注入した後、緩衝液における解離および表面再生が続いた。速度論曲線当てはめおよびラングミュア１：１相互作用モデルを用いて、結合パラメーターを計算した。マウスおよびウサギ両方のモノクローナル抗体は、図３Ａ～３Ｅおよび以下の表５に示すように、ペプチドエピトープに対してナノモル以下の高い親和性を示した。ウサギモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体（１０^－１０ｎＭ範囲）と比較して大きな親和性（１０^－１１ｎＭ範囲）を示した。

【0274】

【表7】

【0275】

実施例９
エピトープは、天然に折り畳まれたＴＤＰ Ｎ末端ドメインではそうではないが、変性ＴＤＰ Ｎ末端ドメインにおける抗体により認識される
ＴＤＰ－４３のＮ末端ドメイン（残基１～８０）を、大腸菌におけるプラスミドから発現させ、以前に記載の通りに精製した(Wang et al. 2018 EMBO)。精製ＴＤＰ－４３ ＮＴＤをＰＢＳに対して透析し、０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、－８０℃で保存した。ウエスタンブロット解析のために、製造業者の仕様書に従って、Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓシステムを使用してネイティブＰＡＧＥを行った。タンパク質サンプルを、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと混合した。プレキャストＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）４～１６％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを、４℃にて１５０Ｖ定電圧で６０分間、次いで、２５０Ｖで３０分間ランした。製造業者の仕様書に従って、Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓシステムを使用して変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。タンパク質サンプルを、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと混合した。プレキャストＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを、室温にて２００Ｖ定電圧で３５分間ランした。次いで、製造業者のプロトコールに従って、ＸＣｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を使用してタンパク質をＰＶＤＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）メンブレンにブロットした。ブロットをＴＢＳＴ中５％粉乳においてブロッキングし、次いで、精製ウサギポリクローナル抗体ＧＳ２４０で４℃にて一晩インキュベートした。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（Ｂｉｏｒａｄ社、米国）での検出のために、ロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を使用した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）基質を、製造業者の説明書に従って使用した。図４Ａに示されるように、抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の変性ＴＤＰ－４３ ＮＴＤのみを認識および染色し、ネイティブＰＡＧＥゲル上のＴＤＰ－４３ ＮＴＤに対してはそうではなく、それにより、エピトープは、天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３においてアクセス不可能であり、ミスフォールディング時に露出するようになることが確認された（レーン１、２、３は、それぞれ０．６、０．３、０．１５μｇ／レーンを含有する）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図４Ｂ）は、天然型または変性型のＴＤＰ－４３ ＮＴＤは、単量体のままであることを示している。参考のために、分子量マーカーを重ねている。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（１０／３００）ＨＰＬＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）上の高速液体クロマトグラフィー機器を使用して、ＳＥＣを行った。６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＤＴＴ中での３７℃における１０分間のインキュベーションにより、ＴＤＰ－４３ ＮＴＤ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を変性させた。得られたタンパク質サンプル（１００μｌ）を、同じ緩衝液で前平衡化したカラムにロードし、０．５ｍｌ／分で溶出させた。天然型を、５ｍＭ ＤＴＴを含有する１倍ＰＢＳ緩衝液で前平衡化したカラムにロードし、０．５ｍｌ／分で溶出させた。

【0276】

実施例１０
患者サンプルの免疫組織化学
脳および脊髄サンプルをＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋから得、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（アムステルダム、オランダ）にて処理および染色した。ホルマリン固定、パラフィン包埋組織からの切片（８μＭ厚）を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ｐｌｕｓ組織スライド（Ｍｅｎｚｅｌ－Ｇｌａｓｅｒ社、ドイツ）に載せ、３７℃で一晩乾燥させた。切片を脱パラフィンし、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．３％Ｈ_２Ｏ_２に３０分間浸漬し、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。ホルマリン固定は、組織標本における抗原部位を遮蔽し得るタンパク質架橋を形成する。タンパク質架橋を壊すために、スライドを熱およびトリス－ＥＤＴＡ（ｐＨ９）で前処理した。一次試験抗体を抗体希釈液（Ｓｉｇｍａ社）で希釈し、１：４０００（ウサギポリクローナルＧＳ２４０抗体、３Ｅ８マウスモノクローナル抗体）または１：２０００（マウスモノクローナル抗体３Ｆ１１および２Ｆ７）の希釈で、４℃にて一晩インキュベートした。二次ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ／マウス抗体（ＥＶ－ＧαＭ ＨＲＰ、ＤＡＫＯ社）を室温で３０分間加え、次いで、色素原３，３，－ジアミノベンジジン（ＤＡＫＯ社）を１０分間加えた。切片をヘマトキシリンで対比染色して細胞の核を可視化し、脱水し、Ｑｕｉｃｋ－Ｄ封入剤（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ社）を使用して封入した。

【0277】

前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）Ｂ型患者由来の脳切片の染色を、図５Ａ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅに示す。図５Ａに示されるように、ウサギポリクローナルＧＳ２４０抗体は、白質（ＷＭ）および灰白質（ＧＭ）の両方において病的ＴＤＰ４３の染色を示している。３Ｆ１１（図５Ｃ）および３Ｅ８（図５Ｅ）モノクローナル抗体は、ＧＭにおいて病的ＴＤＰ－４３を主に検出しているが、一方、２Ｆ７モノクローナル抗体（図５Ｄ）は、ＷＭおよびＧＭの両方において染色を示している。ウサギポリクローナルＧＳ２４０抗体は、ＡＬＳ脊髄切片（図５Ｂ）でも試験し、運動ニューロンおよび周囲組織において陽性を示した。これらの結果は、抗体は、患部組織においてｉｎ ｓｉｔｕで示される病原性ＴＤＰ－４３のエピトープを認識できることを示している。

【0278】

実施例１１
モノクローナル抗ＴＤＰ４３抗体によるトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の代表的な染色
実施例４に記載のように、免疫組織化学を使用した細胞トランスフェクションアッセイにおいて、マウスモノクローナル抗体およびウサギモノクローナル抗体を、ミスフォールドＴＤＰ－４３に対する選択的結合に関して試験した。簡単に述べれば、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ４３（細胞質凝集体を形成する）もしくはＨＡタグ野生型（ＷＴ）ＴＤＰ－４３（核において発現した）をコードするプラスミドまたは空ベクターでトランスフェクトした。抗ＴＤＰ－４３抗体を、染色のために１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、蛍光標識抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧを、検出用二次抗体として使用した。ニワトリ抗ＨＡタグ抗体、次いで蛍光標識抗ニワトリ二次抗体を、トランスフェクトＴＤＰ－４３の検出のために使用した。２Ｆ７マウスモノクローナル抗体で得られた代表的な結果を、図６に示す。トランスフェクトΔＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、細胞質に誤局在し、そこでは、抗ＨＡタグ抗体での染色により容易に検出される凝集体を形成する。２Ｆ７抗体は、マージ画像における２個の染色シグナルの共局在により確認されるように、同じ凝集体を認識した。対照的に、ＨＡタグ抗体により核において検出されるトランスフェクトＷＴ ＴＤＰ４３は、２Ｆ７抗体により染色されなかった。予想されたように、空ベクターでトランスフェクトした細胞は、ＨＡタグ染色を全く示さない。それらは、２Ｆ７抗体による染色を全く示さず、これにより、２Ｆ７は内因性核ＷＴ ＴＤＰ－４３の認識もできないことが示された。

【0279】

試験した他の抗体でも同様の結果が得られ、それらを表６に要約する。試験した抗体による染色のこのパターンは、ＷＴ ＴＤＰ－４３と比較したＴＤＰ－４３のミスフォールド病原性凝集体に対するそれらの選択性を示している。

【0280】

【表8】

【0281】

実施例１２
生理学的ストレス顆粒の免疫細胞化学
ミスフォールドＴＤＰ－４３に対するモノクローナル抗体が生理学的ストレス顆粒と反応したかどうかを決定するために、ストレスを受けたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に対して染色を行った。簡単に述べれば、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に対して、１ｎＭ亜ヒ酸ナトリウムへの６０分間の曝露により、ストレスを与えた。次いで、細胞を、ストレス顆粒マーカーＧ３ＢＰ１に対する蛍光標識抗体または１０ｕｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＴＤＰ－４３試験抗体で染色した後、標識二次抗体で検出した。マウスモノクローナル抗体３Ｆ１１で得られた代表的な結果を、図７Ａおよび７Ｂに示す。１つの抗体を除いて、試験した他の抗体で同様の結果が得られ、それらは以下の表７に含まれる。ストレスを受けた細胞は、細胞質におけるＧ３ＢＰ１＋ストレス顆粒の大量の点状の染色を示した（図７Ａ）。比較して、３Ｆ１１抗体で染色した同じ細胞（図７Ｂ）は、Ｇ３ＢＰ１染色の位置において細胞質顆粒の存在を示さず、３Ｆ１１はこれらの細胞におけるストレス顆粒と反応しないことが示された。生理学的ストレス顆粒におけるＴＤＰ－４３に対する試験した抗体の結合の欠如は、それらがこれらのストレス顆粒の保護機能を妨げる可能性は低いことを示唆するものである。

【0282】

【表9】

【0283】

実施例１３
選択されたｍＡｂのキャラクタリゼーション
トリプトファン６８（Ｔｒｐ６８）がセリンに変異したＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３（Ｗ６８Ｓ）との比較でＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において形成された細胞質凝集体の認識に関して、モノクローナル抗体を実施例４に記載のように試験した。空ベクターを対照として使用した。図８に示される代表的な例において、細胞を、２μｇ／ｍｌのＴＤＰ－４３ウサギモノクローナル抗体２８Ｈ３－２８Ｋ１、１μｇ／ｍｌのマウスｐａｎ－ＴＤＰ４３、または０．５μｇ／ｍｌのニワトリ抗ＨＡタグのいずれかで染色した。蛍光標識二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－抗ウサギ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗マウスおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８－抗ニワトリを、結合一次抗体の検出のために使用した。核をヘキスト３３３４２色素で染色した。ＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３でトランスフェクトした細胞において、２８Ｈ３－２８Ｋ１抗体は、ミスフォールドΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３のＨＡ陽性凝集体とともに共局在した細胞質凝集体を染色した。対照的に、Ｔｒｐ６８を欠くΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３－Ｗ６８Ｓにより形成された細胞質凝集体の染色は認められなかった。予想されたように、空ベクターでトランスフェクトした細胞は、ＨＡタグ染色を全く示さなかった。それらは、２８Ｈ３－２８Ｋ１による染色を全く示さず、これにより、抗体は内因性核ＷＴ ＴＤＰ－４３を認識しないことが確認された。ｐａｎ－ＴＤＰ－４３抗体は、両形態のトランスフェクトＴＤＰ－４３および内因性核ＴＤＰ－４３により形成された細胞質凝集体を認識した。

【0284】

試験したほとんどの他の抗体でも同様の結果が得られ、それらを表８に要約する。ポリクローナルウサギ抗体で認められたように、試験したモノクローナル抗体による染色のこのパターンは、溶媒露出Ｔｒｐ６８残基を含んでなるミスフォールドＴＤＰ－４３ ＮＴＤに対するそれらの選択性を示している。ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３－Ｗ６８Ｓのいくつかの凝集体に結合したクローン２０は、生理学的ストレス顆粒に結合した。

【0285】

【表10】

【0286】

実施例１４
ＨＥＫ２９３細胞におけるミスフォールドＴＤＰ－４３伝播の抗体遮断
ドナーＨＥＫ２９３細胞を、ミスフォールドＴＤＰ－４３を発現させるために、ＴＤＰ－４３のＨＡタグ核局在化シグナル欠損変異体、ＨＡ－ΔＮＬＳ－ＴＤＰ４３で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、条件培地をドナー細胞から回収し、１，０００ｇで１０分間遠心分離して、浮遊細胞デブリを培地から除去した。清澄な条件培地を、３０ｕｇ／ｍｌの各個々のＴＤＰ－４３ミスフォールディング特異的抗体または対照マウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ社）で、室温で１時間、一定に回転させながらインキュベートした後、それにナイーブレシピエントＨＥＫ２９３細胞を加えた。試験した抗体には、ＴＤＰ－４３のＮ末端エピトープに対する３つのマウスモノクローナル抗体（３Ｆ１１、２Ｆ７、３Ｅ８）および立体構造ＲＲＭ１エピトープ（ＷＯ２０１８／２１８３５２として発表されているＰＣＴ ＣＡ／２０１８／０５０６３４）に対する２つの抗体（９Ｃ５、５Ｂ７）が含まれた。インキュベーションの４８時間後、レシピエント細胞培地を除去し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＳＤＳに溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイを使用して測定した。２５ｕｇのライセートを１０％ＮｕＰａｇｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ社）上で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、次いで、ＨＡタグ（Ａｂｃａｍ社、ウサギ、１：１０００）またはローディング対照としてのＧＡＰＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社、マウス、１：５０Ｋ）に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。ＨＡおよびＧＡＰＤＨ免疫反応性をＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで検出し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂを使用して強度を定量化した。

【0287】

ＨＡ－ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３でトランスフェクトしたドナー細胞は、多量のＨＡタグＴＤＰ－４３を含有していた。対照マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）で処置したドナー細胞上清でインキュベートしたナイーブレシピエント細胞は、検出可能な量のＨＡタグＴＤＰ－４３を含有しており、ＨＡ－ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３タンパク質のミスフォールド凝集体が、ドナー細胞からレシピエント細胞へと細胞外伝播したことが示された。ミスフォールディング特異的ＴＤＰ－４３抗体で前処置したドナー細胞上清でインキュベートしたレシピエント細胞は、比較的少ない量のＨＡタグＴＤＰ－４３を含有しており、抗体による伝播の阻害が示された。陰性対照として、非トランスフェクトドナー細胞由来の上清でインキュベートしたレシピエント細胞は、検出可能なＨＡタグＴＤＰ－４３を全く含有していなかった。ウエスタンブロットの定量分析を図９に示す。各抗体に関して、ＨＡタグシグナルをＧＡＰＤＨシグナルに対して最初に正規化し（ＨＡ強度／ＧＡＰＤＨ強度）、試験抗体に関して得られた値を、対照ｍＩｇＧ１で得られた値で割った。対照ｍＩｇＧ１と比較して、試験した総ての抗体は、ドナー細胞上清からミスフォールドＨＡ－ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３の伝播を阻害し、レシピエント細胞における低レベルのＨＡタグＴＤＰ－４３をもたらした。

【0288】

実施例１５
ミスフォールド疾患関連ＴＤＰ－４３に対して選択的な抗体の作製
ＴＤＰ－４３のミスフォールド分子種は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭葉認知症（ＦＴＬＤ）における神経毒性およびプリオン様細胞間伝播に関係している。ＴＤＰ－４３ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）におけるトリプトファン（Ｔｒｐ６８）は、天然に折り畳まれたＮＴＤにおいてアクセス不可能であるにもかかわらず、ＳＯＤ１ミスフォールディング伝播の交差播種に関与することが見出された［９］。ＴＤＰ－４３が細胞質に誤局在／凝集する場合、ＮＴＤ Ｔｒｐ６８は露出するようになると仮定した。

【0289】

デザイン／方法
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ｐＡｂ、ｍＡｂ）を作製するために、Ｔｒｐ６８を含む、折り畳まれていないＮＴＤ直鎖状ペプチドエピトープでウサギを免疫化した。ｍＡｂを作製するために、同じエピトープでマウスを免疫化した。免疫化ペプチドに対するモノクローナル抗体親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。ＮＴＤを大腸菌において発現させ、適切に折り畳まれたモノマー状態をサイズ排除クロマトグラフィーにより確認し、次いで、変性およびネイティブゲル電気泳動ならびに免疫ブロットを用いた試験を行った。抗体特異性を、患者サンプルに対する免疫組織化学（ＩＨＣ）、および核局在化配列のＴＤＰ－４３三重タンデム変異（ΔＮＬＳ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の免疫細胞化学（ＩＣＣ）により確認した。ミスフォールドＴＤＰ－４３の細胞間伝播を阻害する抗体の能力を、イン・ビトロで評価した。

【0290】

結果
ｍＡｂのＳＰＲは、エピトープに対するピコモル親和性を明らかにした。組換えＮＴＤは、変性条件下でのみｐＡｂ免疫反応性を示した。正常ＣＮＳではそうではないが、ＡＬＳ／ＦＴＬＤ ＣＮＳ切片のＩＨＣは、抗体に対して反応性であった。ＩＣＣは、核野生型ＴＤＰ－４３ではそうではないが、誤局在／凝集したΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３に対する免疫反応性を明らかにした。抗体は、ＨＥＫ２９３細胞における生理学的ストレス顆粒においてＴＤＰ－４３を認識することもできなかった。Ｔｒｐ６８がセリンに変異したΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３構築物は、トランスフェクト細胞において免疫反応性を示さず、Ｔｒｐ６８は免疫化ペプチドにおいて免疫優性であることが示された。細胞培養アッセイにおいて試験した抗体は、病因の中心であると考えられているプロセスである（参考文献１０、１１、１２）、ミスフォールドＴＤＰ－４３の細胞間伝播を阻害することができた。

【0291】

結論
生理学的に重要な分子種を残しながら、ミスフォールド／凝集した疾患関連ＴＤＰ－４３に対して選択的であるＮＴＤ Ｔｒｐ６８の溶媒露出に感受性が高い抗体のファミリーを開発した。これらの抗体は、ＴＤＰ－４３関連疾患に対するバイオマーカーおよび免疫療法の用途において有用性を見出し得る。

【0292】

好ましい実施例であると現在考えられているものを参照して本出願を説明したが、本出願は開示された実施例に限定されないと理解されるべきである。反対に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および均等な構成を網羅することを意図するものである。

【0293】

総ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。具体的には、例えば、表または他所に示されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む、本明細書において示される各アクセッション番号に関連した配列は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

【0294】

特許請求の範囲は、好ましい実施形態および実施例により限定されてはならないが、全体として明細書と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。

【0295】

明細書において言及された参考文献の引用
[1] Kuo PH, Chiang CH, Wnag YT, Doudeva LG, Yuan HS, The Crystal Structure of TDP-43 RRM1-DNA Complex Reveals the Specific Recognition for UG- and TG-Rich Nucleic Acids. Nucleic Acids Res., 2014, vol 42, 4712.
[2] DOI: 10.2210/pdb1wf0/pdb (No publication).
[3] Mompean, M., Romano, V., Pantoja-Uceda, D., Stuani, C., Baralle, F. E., Buratti, E., and Laurents, D. V. The TDP-43 N- Terminal Domain Structure at High Resolution. FEBS J., 2016, 283, 1242.
[4] Arai, T., Hasegawa, M., Akiyama, H., Ikeda, K., Nonaka, T., Mori, H., Mann, D., Tsuchiya, K., Yoshida, M., Hashizume, Y., and Oda, T. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau- negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 351, 602-611.
[5] Chantelle F. Sephton, Shannon K. Good, Stan Atkin, Colleen M. Dewey, Paul Mayer III, Joachim Herz, and Gang Yu J. Biol. Chem. 2010, vol.285, No.9, 6826- 6834.
[6] Abel, O., Powell, J.F.,Andersen, P.M., and Al-Chalabi, A. Hum Mutat, 2012, 33:1345-51.
[7] Hamley, I.W. PEG-Peptide Conjugates 2014; 15, 1543-1559; dx.doi.org/10.1021/bm500246w.
[8] Roberts, MJ et al Chemistry for peptide and protein PEGylation 64: 116-127.
[9] Afroz, T et al. Functional and dynamic polymerization of the ALS-linked protein TDP-43 antagonizes its pathologic aggregation. Nat Comm (2017) 8:45.
[10] Porta, S et al. Patient-derived frontotemporal lobar degeneration brain extracts induce formation and spreading of TDP-43 pathology in vivo. Nature Comm (2018) 9:4220.
[11] Brettschneider, J et al. Sequential distribution of pTDP-43 pathology in behavioral variant frontotemporal dementia (bvFTD). Acta Neuropathol (2014) 127: 423.
[12] Feiler, M.S. et al. TDP-43 is intercellularly transmitted across axon terminals. J Cell Biol (2015) 211: 897.

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】