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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-03
(54)【発明の名称】核酸増幅及び識別方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20220127BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20220127BHJP
C12Q 1/6855 20180101ALN20220127BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12Q1/6855 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2021533570
(86)(22)【出願日】2019-12-13
(85)【翻訳文提出日】2021-08-03
(86)【国際出願番号】 EP2019085095
(87)【国際公開番号】W WO2020120747
(87)【国際公開日】2020-06-18
(31)【優先権主張番号】18212743.1
(32)【優先日】2018-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508160196
【氏名又は名称】レクソジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＸＯＧＥＮ ＧｍｂＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】イボンネ ゲーペル
(72)【発明者】
【氏名】パメラ モル
(72)【発明者】
【氏名】トルステン レダ
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンダー ザイツ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA08
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR20
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR62
4B063QS34
4B063QX01
(57)【要約】
本発明は、核酸テンプレートの標識化した増幅断片を産生するための方法であって、前記テンプレート核酸を提供すること、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを前記テンプレート核酸にアニーリングすること、テンプレート特異的な方法において少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、それによって伸長産物を作成し、ここで前記伸長する反応が、前記伸長産物が前記テンプレート核酸の５’末端又は前記伸長産物の下流の前記テンプレート核酸にアニールされる核酸伸長ストッパーに到達する場合に停止すること、識別配列をその５’末端上に含むアダプター核酸を提供し、ここで前記識別配列がそれに対して接触する場合に、前記伸長ストッパーにハイブリダイズしないこと、前記アダプター核酸をその５’末端で前記伸長産物の３’末端に連結し、それによって標識化した増幅断片を産生することの工程を含む方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸テンプレートの標識化した増幅断片を産生するための方法であって、前記テンプレート核酸を提供すること、
前記テンプレート核酸に少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングすること、
テンプレート特異的な方法において、前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、それによって伸長産物を作成することであって、ここで前記伸長産物が前記テンプレート核酸の５’末端に又は前記伸長産物の前記テンプレート核酸の下流へアニールされる核酸伸長ストッパーに到達する際に、前記伸長反応が停止し、
識別配列をその５’末端上に含むアダプター核酸を提供し、ここで前記識別配列は前記伸長ストッパー又は前記テンプレートにハイブリダイズせず、
前記アダプター核酸をその５’末端で前記伸長産物の３’末端に連結し、それによって標識化した増幅断片を産生すること
のステップを含む方法。
【請求項2】
前記伸長産物が前記テンプレート核酸の５’末端に到達する場合において、ヌクレオチドポリメラーゼが前記伸長産物にテンプレートでないヌクレオチドを、好ましくは前記ポリメラーゼの末端トランスフェラーゼ活性により、付加することを可能にし、かつ／又は好ましくは、ここで１から１５のテンプレートでないヌクレオチドを少なくとも７０％の前記伸長産物に付加する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
複数のアダプター核酸が前記ライゲーションステップにおいて提供されかつ使用され、ここで前記複数のアダプターが異なる識別配列を有し、好ましくはここで少なくとも１０の、より好ましくは少なくとも５０の、異なる識別配列を有するアダプター核酸がライゲーションステップにおいて提供されかつ使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記識別配列がランダム配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記伸長ストッパーがプライマー活性を有し、かつまた前記伸長工程の間に伸長され、好ましくは、ここで少なくとも９の、より好ましくは少なくとも４９の、前記テンプレートにアニーリングするための異なるアニーリング配列を有し、かつそれによって前記テンプレート核酸の異なる位置にアニールする可能性のある、伸長ストッパーが用いられる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記アニーリング配列がランダム配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記アダプター核酸が前記伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されず、又はハイブリダイズされず、好ましくは、前記アダプター核酸が前記伸長ストッパーに結合される又はハイブリダイズされる場合に、続いて、前記識別配列が前記伸長ストッパーを前記テンプレートへアニーリングするための前記伸長ストッパーのアニーリング配列と無関係である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記テンプレートがＲＮＡであり、好ましくはここで逆転写酵素が伸長のために使用される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記オリゴヌクレオチドプライマー及び好ましくはまた前記伸長ストッパーがユニバーサル増幅配列を含み、かつ／又は前記アダプター核酸がユニバーサルアダプター増幅配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが前記テンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列を含み、それは前記テンプレート内のオリゴ（Ａ）配列にアニーリングするためのオリゴ（Ｔ）配列を含み、好ましくはここで前記オリゴ（Ｔ）配列がオリゴ（Ｔ）配列から異なる一以上の３’アンカーヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ライゲーション反応がクラウディング剤、好ましくは、ポリマー又はポリアルキルグリコールのような化合物を含むポリマー、好ましくはＰＥＧ、オクトキシノール若しくはトリトンＸ、又はポリソルベート、好ましくはツイーンの存在下で起こり；かつ／又はここで、前記伸長ストッパー及びまた好ましくは前記オリゴヌクレオチドプライマーは前記テンプレートへアニーリングするためのアニーリング配列の融解温度を高める一以上の修飾したヌクレオチドを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
少なくとも１つの、好ましくは少なくとも９つの、伸長ストッパーはプライマー活性を有し、かつまた前記伸長工程時に伸長され、かつ少なくとも２つの、好ましくは１０の、異なる識別配列を含むアダプター核酸が使用され、それによって、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも１０の、異なる標識化した増幅断片が産生され、任意に前記標識化した増幅断片を増幅し、さらに固有である増幅断片の前記配列をアセンブリすることを含み、ここで前記標識は固有の増幅断片を同定するために使用される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
テンプレート核酸にハイブリダイズすること及びその３’末端上の伸長反応をプライミングすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、テンプレート核酸とハイブリダイズすることができる、好ましくはその３’末端上の伸長反応をプライミングすることができる、一以上の伸長ストッパー、
識別配列をその５’末端上に含む一以上のアダプター核酸であって、ここで前記識別配列が前記伸長ストッパーとハイブリダイズせず、好ましくはここで前記アダプター核酸が伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されず、又はハイブリダイズされない一以上のアダプター核酸、
逆転写酵素、及びオリゴヌクレオチドリガーゼを含む、
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項14】
少なくとも１０の、より好ましくは少なくとも５０の、異なる識別配列を有するアダプター核酸を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが前記テンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列を含み、それは前記テンプレート内のオリゴ（Ａ）配列にアニーリングするためのオリゴ（Ｔ）配列を含み、好ましくはここで、前記オリゴ（Ｔ）配列が前記オリゴ（Ｔ）配列から異なる一以上の３’アンカーヌクレオチドを含む、請求項１３又は１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸分析及び増幅の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
米国２０１０／０２７３２１９ Ａ１では、標的の核酸にバーコードを付けるための、マルチプライマー増幅のための方法を記載している。
【0003】
ＷＯ２０１２／１３４８８４ Ａ１では、マルチプレックス増幅反応におけるテンプレート核酸にバーコードを付けることを記載している。
【0004】
ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２では、オリゴヌクレオチドプライマー及びストッパーを用いて、シークエンシングのための核酸部分を産生するために用いられるポリメラーゼにより鎖置換及び読み過ごしを防止する、テンプレート核酸の増幅した核酸部分を産生するための方法を記載している。この方法は、核酸増幅時の偏りを除去するだろう。
【0005】
ＷＯ２０１４／０７１３６１ Ａ１では、バーコードを付したアダプター核酸を用いて二重のバーコードを付した核酸を作製する方法を記載している。
【0006】
米国２０１４／０２７４７２９ Ａ１では、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡライブラリーを産生するための方法を記載している。
【0007】
ＥＰ ３ １１９ ８８６ Ｂ１では、テンプレートＲＮＡから核酸産物を産生する定量的な方法を記載している。
【0008】
米国２０１８／１６３２０１ Ａ１では、Ｃ末尾をｃＤＮＡ鎖の３’末端に付加する逆転写方法に関する。
【0009】
ＷＯ２０１６／１３８５００ Ａ１では、シークエンシングのための核酸にバーコードを付けるための方法を記載している。確率的な、すなわち、ランダムな、バーコードを分子ラベルとして用いる。
【0010】
また分子バーコードとも呼ばれる、分子ラベル、又は固有分子識別子（ＵＭＩｓ）は、開発され、ＰＣＲ ｄｕｐｌｉｃａｔｅを同定し、配列特異的なＰＣＲの偏りを減らし、かつまれな変異を検出する。シーケンシングライブラリー調製の任意のＰＣＲ増幅の前に、ＲＮＡ分子に固有分子識別子を取り付けることは、各インプット分子について別々の固有性を確立する。これは、連続したＰＣＲ増幅の偏りの影響を排除することを可能にし、それは、多くのＰＣＲサイクルが必要とされる場合に、例えば、単一の細胞の研究におけるような低いテンプレートインプット量からシークエンシングライブラリーを作成する場合に、特に重要である。ＰＣＲ後、同じ配列及びまた同じＵＭＩを共有する分子は、同じインプット分子から由来した同一のコピーであると考えられる（Ｓｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：１３１２１）。
【発明の概要】
【0011】
本発明の目的は、テンプレート核酸の配列断片を産生することの改善した方法を提供することであり、そのテンプレート核酸のその配列と対応する連結される配列への前記配列断片の配置及びアセンブリを容易にする。また、所望される改善は、断片産生時の配列の偏りを減らし、かつそのテンプレートの全長にわたり配列断片のカバレッジを増やし、作成した連結した配列における信頼性を増やすだろう。
【0012】
従って、本発明は前記テンプレート核酸を提供する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを前記テンプレート核酸にアニーリングすること、テンプレート特異的な方法において少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、それによって伸長産物を作成し、ここで前記伸長する反応が、その伸長産物がそのテンプレート核酸の５’末端又はその伸長産物の下流のそのテンプレート核酸にアニールされる核酸伸長ストッパーに到達する際に停止すること、識別配列をその５’末端上に含むアダプター核酸を提供し、ここで前記識別配列がそこへ（伸長ストッパーへ）接触し、好ましくはまたそのテンプレートには接触しない場合には、その伸長ストッパーにハイブリダイズしないこと、そのアダプター核酸をその５’末端でその伸長産物の３’末端に連結し、それによって標識化した増幅断片を産生することの工程を含む核酸テンプレートの標識化した増幅断片を産生するための方法を提供する。
【0013】
また、本発明は前記テンプレート核酸を提供すること、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを前記テンプレート核酸へアニーリングすること、テンプレート特異的な方法において少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、それによって伸長産物を作成すること、識別配列を含むアダプター核酸を提供し、ここで前記識別配列がそのテンプレートにハイブリダイズしないこと、そのアダプター核酸が好ましくはその５’末端でその伸長産物のその３’末端に連結し、それによって標識化した増幅断片を産生することの工程を含む核酸テンプレートの標識化した増幅断片を産生するための方法を提供する。
【0014】
本発明はさらに本方法を実施するための適当なキットを提供する。本発明のキットは、テンプレート核酸にハイブリダイズすること及びその３’末端上で伸長反応をプライミングすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、テンプレート核酸にハイブリダイズすることができる、好ましくはその３’末端上に伸長反応をプライミングすることができる一以上の伸長ストッパー、その５’末端上に識別配列を含む一以上のアダプター核酸であって、ここで前記識別配列がその伸長ストッパーにハイブリダイズしない、好ましくはここでそのアダプター核酸が伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されないアダプター核酸、逆転写酵素、及びオリゴヌクレオチドリガーゼを含みうる。そのキットの異なる成分は、バイアルのような異なる容器において提供されうる。
【0015】
以下の詳細な開示は、方法及びキットを含む、全ての側面、並びに本発明の態様を読み取れる。すなわち、方法の記載はそのキットに適当でありうる。本方法に記載される任意の成分は、そのキットの部分でありうる。そのキットの成分は本発明の方法において使用されうる。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、核酸テンプレートの標識化した増幅断片を産生するための方法を提供し、ここで識別配列は、これらの断片を増幅する前にラベルとして導入される。テンプレート核酸は、多数のコピーにおいて存在しうる。本発明に従い、断片化はたいてい増幅時に、すなわち、与えられた長さのテンプレートから生じる工程であり、一以上（たいていより多くの）断片が、そのテンプレート部分の増幅時に産生される。産生した断片の配列は、これらの相補的な核酸断片を合成するための断片及びプライマーが異なるテンプレートのコピー上の異なる部位でアニールすると同時にテンプレートのコピーが発生した場合に重複しうる。本発明の構想はテンプレートごとの単一の断片に作用するが、好ましくは、多くの断片が一つのテンプレート分子から、たいてい、そのテンプレートへ異なる場所で結合する多数のプライマーを用いることによって、産生される。
【0017】
本発明は産生した断片に識別配列を結合することにより先行の方法を改善する。識別配列はプライマー又は伸長後の相補的な核酸断片の合成によって導入されうる。続いて、その識別配列は、アダプター核酸による伸長産物のライゲーションによって導入される。驚くべきことに、そのライゲーション反応は、一本鎖の識別配列によって生じ、すなわち、ハイブリダイズされない（又は「自由な」）５’末端を有する識別配列の部分が伸長した産物の３‘末端に連結しうる。そのライゲーション反応は、たいてい、好ましくは識別配列の５’末端上に提供されるリン酸残基を含む。驚くべきことに、ハイブリダイゼーションによって支持される、テンプレート又はストッパー配列に依存せず、伸長産物の３’末端へのアダプター核酸の近接が（実施例に示されるように）必要とされる。そのような近接は、（また、本明細書では伸長ストッパー又は単にストッパーと称され、またそれは、テンプレートごとに１より多い断片が産生される場合においてさらなるプライマーである）テンプレートに結合されるオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのための相補的な配列部分（下流、すなわち、識別配列の３’方向）を有するアダプター核酸を提供することによって支持されることができ、有向の近接は必要とされず、かつ所望される単純な拡散工程の結果でありうる。特に、そのアダプター核酸がそのテンプレート核酸の５’末端に到達する伸長産物と連結されうることが示されており、そしてここでさらなる下流の伸長ストッパーは存在しない。そのようなライゲーション反応は、その伸長産物のこの末端に直接的に又はポリメラーゼが添加された後の、いくつかのポリメラーゼが有するその末端トランスフェラーゼ活性に基づく、一以上のテンプレートでないヌクレオチドに生じうる。テンプレートの５’末端に対応する伸長産物へのこのライゲーションは、いくつかの驚くべき有益な利点を有する：それはテンプレートの５’末端で断片の発生を増加し、そしてそれゆえ先行技術の方法では失われている、その配列カバレッジは基本的に増加する。以前の方法において、その断片開始部位の分布は一定であり、（テンプレートコピーの数、平均の断片の大きさ、及びシークエンシングリード長の結果である）その３’及び５’末端でゼロに近い、より低いカバレッジを有するテンプレートの中央の断片による高いカバレッジ分布に繋がる。５’末端上のこの効果は本発明の方法によって緩和される。さらに、また本発明はそのテンプレートの３’末端上のカバレッジを増加する態様も提供する。
【0018】
（伸長反応ごとに一つの断片分子として産生される）増幅断片は、たいていさらに増幅され、すなわちコピーされる。これは、連結した識別配列が増幅されることを意味し、従って同様にコピーされることを意味する。たいてい、その識別配列はとても多種多様であるので、ランダム選択プロセスは、同じ配列を有するが、一つのテンプレートの異なるコピーに起因する単一の断片を固有に同定することを可能にする。本発明の全ての態様において、その識別配列は、それらが異なる識別配列を有するので、シークエンシング後の断片コピーがそのテンプレートの異なるコピーに由来するかどうか、又はそれらが同じテンプレート分子から由来し、かつ前記さらなる増幅の間に作製される単なるコピーであるかどうかを決定することに役立つ。
【0019】
前記テンプレート核酸を提供する工程を含む、核酸テンプレートの標識化した増幅断片を産生することを提供するさらなる方法は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを前記テンプレート核酸にアニーリングすること、テンプレート特異的な方法において少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、それによって伸長産物を作成すること、識別配列を含むアダプター核酸を提供し、ここで前記識別配列がそのテンプレートにハイブリダイズしないこと、アダプター核酸を好ましくはその５’でその伸長産物の３’に連結し、それによって標識化した増幅断片を産生することの工程を含む。この方法は上記と本質的に同じであり、ストッパーを用いないことを除いて、本明細書に記載される全ての好ましい態様が適用される。ストッパー機能を有しえない、多数のプライマーが用いられうる。アダプター核酸は、拡散プロセス後にさらに伸長産物に連結されうる。ライゲーションのために、その伸長産物は、そのテンプレートに又は一本鎖としてさらにハイブリダイズされうる。しかしながら、好ましくはストッパーを用いる。
【0020】
本発明の方法は前記テンプレート核酸を提供する工程から開始する。そのテンプレート分子は本発明の方法における使用について当業者に利用可能に作製される。たいてい、そのテンプレートは、核酸分子の試料において提供される。そのようなテンプレート核酸は細胞、例えば、原核又は真核細胞から単離されうる。特定の態様において、そのテンプレートはＲＮＡである。総ＲＮＡ又はＲＮＡの断片、例えば細胞のｍＲＮＡ又はｒＲＮＡを除去したＲＮＡが提供されうる。操作が容易なＲＮＡ量は例えば、０．１ｐｇから５００ｎｇ、１ｐｇから２００ｎｇ、１０ｐｇから１００ｎｇ、又は０．１ｎｇから１００ｎｇのｒＲＮＡ除去したＲＮＡ又は０．１ｎｇから１０００ｎｇの総ＲＮＡである。ある態様において、総ＲＮＡ量は例えば、１０ｐｇであり、そしてｒＲＮＡのないＲＮＡ量は１ｐｇ未満でありうる。プライマー、ストッパー及びアダプターは好ましくはＤＮＡである。
【0021】
本方法はさらに少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを前記テンプレート核酸にアニーリングすることを含む。オリゴヌクレオチドプライマーはオリゴヌクレオチド分子であり、好ましくはそのテンプレートにアニールするＤＮＡであり、当該分野において標準的な慣例であるように伸長反応をプライミングすることが可能である。そのオリゴヌクレオチドプライマー（又は単に「プライマー」）は好ましくは、例えば４ヌクレオチドから３０ヌクレオチド（ｎｔ）長のその長さの少なくとも一部におけるテンプレートにアニールする。そのプライマーはそのテンプレートにアニールしない部分を有しうる。そのようなさらなる部分は、増幅断片がさらに増幅されそのコピーを産生する場合に、他のオリゴヌクレオチドにアニールするために用いることができ、かつ／又は上述のさらなる増幅のために使用されうる。そのようなさらなる部分又は部位はそれゆえ他のプライマーがこの増幅／コピー反応のために結合する配列を有する。また、そのような部分は第一のリンカー配列として称される。第一のリンカー配列は好ましくは４ｎｔから３０ｎｔ長を有する。
【0022】
主要な発明方法に戻り、少なくとも１つのヌクレオチドプライマーはテンプレート特異的な方法において伸長され、それによって伸長産物（相補的な配列）を作成する。そのような反応は当該分野で標準であり、そしてたいていポリメラーゼを使用する。そのテンプレートがＲＮＡである場合に、続いてＲＮＡ依存的なポリメラーゼ、例えば逆転写酵素が用いられる。そのテンプレートがＤＮＡである場合に、続いて、ＤＮＡ依存的なポリメラーゼが用いられる。その伸長する反応は、それが伸長産物の下流のテンプレート核酸にアニールされる核酸伸長ストッパーに到達する際に、又はその伸長産物がテンプレート核酸の５’末端に到達する際に、停止する。明らかに、その伸長反応がそのテンプレートの５’末端に到達し、そしてそれゆえテンプレートを使い果たす際に、それは停止する。いくつかのポリメラーゼでは、この時点で伸長産物に一以上のテンプレートでないヌクレオチドを加えうる。それは、産生した標識化した増幅した断片の配列分析において、５’カバレッジ産物について選択する場合に、許容可能であり、又は有利でさえある。しかしながら、テンプレートでないヌクレオチドのこの追加は、必要でない。また、伸長反応は、
その伸長反応が、その伸長産物の下流のテンプレート核酸にアニールされる核酸伸長ストッパーに到達する際に停止する。そのような停止される反応は（参照によって本明細書に取り込まれる）ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２の長さで記載されている。このＷＯ－文書において、その伸長ストッパーは「オリゴヌクレオチドストッパー」又は「さらなるオリゴヌクレオチドプライマー」として称される。本発明に従い、一つの用語、すなわち、核酸伸長ストッパー又は単に「伸長ストッパー」又は単に「ストッパー」が用いられる。また、本発明のストッパーはプライマーであり、それから、ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２の「さらなるオリゴヌクレオチドプライマー」と対応しうる。本質的に、そのようなストッパーは、テンプレートの障壁を提示することによって、上流の伸長反応の伸長反応を停止する（従って、そのストッパーは伸長産物の下流にある）。そのストッパーはテンプレートにアニール又はハイブリダイズされ、かつその伸長反応は、そのストッパーに置き換わらず、そしてそれゆえ停止する。読み過ごし、すなわちストッパーの置換は、副反応であると考えられる。ストッパーの置換を防止する方策は、ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２に長さで記載され、これらは本発明に従って使用されうる。簡潔に、（鎖置換活性のために）そのストッパーの置換を妨げる好ましい方法及び意味は、そのテンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列における融解温度を高める一以上の修飾したヌクレオチドを含む伸長ストッパー（テンプレートにアニールする／ハイブリダイズする一部のストッパー）を用いることである。融解温度の増加は、未修飾の、天然の核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡに関する。そのような修飾は、例えば、ＬＮＡ（ロック核酸）、ＺＮＡ（ｚｉｐ核酸）、２’フルオロヌクレオシド／２’フルオロヌクレオチド又はＰＮＡ（ペプチド性又はペプチド核酸）である。他の方法は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼを用いるか、又はインターカレーターを用いる。好ましくは、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドが修飾される。好ましくは、その修飾した核酸は、テンプレートにハイブリダイズするそのストッパーの配列部分の５’側にある。ハイブリダイズしない５’向きのストッパーのさらなる部分がありうる－例えば、さらなる増殖反応における増幅／コピーのための上記のオリゴヌクレオチドプライマーについての記載と同様に働く増殖配列（「プライマーリンカー配列」）－実際に、そのようなさらなる部分がそのアダプター核酸に結合する／ハイブリダイズすることについて好ましい－以下参照。そのアダプターは「第一のリンカー配列」に、又はオリゴヌクレオチドストッパーの別の部分に結合／ハイブリダイズしうる。好ましい態様において、その伸長ストッパー及びまた好ましくは、そのオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列（リンカー）における融解温度を増やす一以上の修飾したヌクレオチドを含む。
その伸長反応が、その伸長産物の下流のテンプレート核酸にアニールされる核酸伸長ストッパーに到達する際に停止する。そのような停止される反応は（参照によって本明細書に取り込まれる）ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２の長さで記載されている。このＷＯ－文書において、その伸長ストッパーは「オリゴヌクレオチドストッパー」又は「さらなるオリゴヌクレオチドプライマー」として称される。本発明に従い、一つの用語、すなわち、核酸伸長ストッパー又は単に「伸長ストッパー」又は単に「ストッパー」が用いられる。また、本発明のストッパーはプライマーであり、それから、ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２の「さらなるオリゴヌクレオチドプライマー」と対応しうる。本質的に、そのようなストッパーは、テンプレートの障壁を提示することによって、上流の伸長反応の伸長反応を停止する（従って、そのストッパーは伸長産物の下流にある）。そのストッパーはテンプレートにアニール又はハイブリダイズされ、かつその伸長反応は、そのストッパーに置き換わらず、そしてそれゆえ停止する。読み過ごし、すなわちストッパーの置換は、副反応であると考えられる。ストッパーの置換を防止する方策は、ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２に長さで記載され、これらは本発明に従って使用されうる。簡潔に、（鎖置換活性のために）そのストッパーの置換を妨げる好ましい方法及び意味は、そのテンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列における融解温度を高める一以上の修飾したヌクレオチドを含む伸長ストッパー（テンプレートにアニールする／ハイブリダイズする一部のストッパー）を用いることである。融解温度の増加は、未修飾の、天然の核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡに関する。そのような修飾は、例えば、ＬＮＡ（ロック核酸）、ＺＮＡ（ｚｉｐ核酸）、２’フルオロヌクレオシド／２’フルオロヌクレオチド又はＰＮＡ（ペプチド性又はペプチド核酸）である。他の方法は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼを用いるか、又はインターカレーターを用いる。好ましくは、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドが修飾される。好ましくは、その修飾した核酸は、テンプレートにハイブリダイズするそのストッパーの配列部分の５’側にある。ハイブリダイズしない５’向きのストッパーのさらなる部分がありうる－例えば、さらなる増殖反応における増幅／コピーのための上記のオリゴヌクレオチドプライマーについての記載と同様に働く増殖配列（「プライマーリンカー配列」）－実際に、そのようなさらなる部分がそのアダプター核酸に結合する／ハイブリダイズすることについて好ましい－以下参照。そのアダプターは「第一のリンカー配列」に、又はオリゴヌクレオチドストッパーの別の部分に結合／ハイブリダイズしうる。好ましい態様において、その伸長ストッパー及びまた好ましくは、そのオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列（リンカー）における融解温度を増やす一以上の修飾したヌクレオチドを含む。
【0023】
伸長反応後、好ましくは、テンプレートに結合しないプライマー及びストッパーは精製工程において除去される。すなわち、テンプレートにハイブリダイズされる伸長産物は、精製され、そしてさらなる加工のために保持される。本発明の他の態様は、精製なく単一の容量において行われる。そのような精製は、当業者に既知の方法、例えば、テンプレート又は伸長産物の固相（例えばビーズ）への固定化、そして任意の未結合のプライマー及びストッパーを除去するために洗浄することにより行いうる。例示の方法は固相可逆固定（ＳＰＲＩ；ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２３（２２）：４７４２－４７４３）である。
【0024】
本発明の方法は、その５’末端上に識別配列を含むアダプター核酸を提供する工程を含む。また、さらに、配列タグ、例えば増幅のための配列（増幅配列）は、アダプター核酸の一部でありうる。その５’末端は、その識別配列により、後者の標識をするための伸長産物の３’末端への連結を意図される末端である。その識別配列は伸長ストッパー又はテンプレートにハイブリダイズしてはならない。それゆえ、それは、たいてい一本鎖であり、そしてハイブリダイズしない。本明細書において、「識別配列」という用語は、たとえ識別配列の一部だけが後に識別のために用いられるとしても、ハイブリダイズしない又はアニーリングしないアダプター核酸の５’末端部分について用いられる。また、そのアダプター核酸は、相補的なプライマー配列を含み、それは、（アダプターリンカー配列と呼ばれる）上述のような標識化した増幅断片のさらなる増幅反応のための標的である。その識別配列は、伸長ストッパーに相補体を有しない識別配列について配列を選択することによってその伸長ストッパーへの又はそのテンプレートへのハイブリダイゼーションから保護されうる。また、そのテンプレート上に相補体を有しないので、識別配列を選択できる可能性がある。これは、そのテンプレートが既知である場合に、容易に行われうる。それが未知であるが、生物学的な原料由来である場合に、続いてその識別配列は、生物学的な核酸内にない又はまれに生じる配列から選択されうる。そのような配列は、「スパイク－イン」核酸、例えば、ＥＲＣＣ（外部ＲＮＡ標準コンソーシアム）の配列又はＳＩＲＶ（スパイク－インＲＮＡ変異体）配列（例えば、ＥＲＣＣ、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００５ ６：１５０；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１１，２１（９）：１５４３－１５５１；ＷＯ ２０１６／００５５２４ Ａ１、全てが参照によって本明細書に取り込まれる）から既知である。その識別配列が副反応においてそのテンプレートにアニールする場合に、続いてこの状況は、たいてい次工程におけるライゲーションを防止し、それゆえ、標識化した断片へと繋がらず、そして従って結果として見られない。そのような副反応は許容されうるが、好ましくはない。そのテンプレートへのその識別配列（及び好ましくは、その全体のアダプター核酸）のアニーリングを防止する最も容易かつ最も好ましい方法は、その伸長反応後にアダプター核酸を単に提供することによる。伸長反応後に、そのテンプレートは、伸長産物（及びプライマー及びストッパー）との二本鎖の形態である。この形態において、そのテンプレートが既にハイブリダイゼーションパートナーによって既に覆われているので、そのアダプター核酸は任意のさらなるテンプレートに結合できない。この好ましい方法において、その識別配列は、そのテンプレートへの相補体である配列さえ有することができ、かつそのテンプレートにハイブリダイズすることができるが、方法工程の継続により、そのように妨げられる。つまり、テンプレート配列は本態様において、必要とされるとは考えられない。
【0025】
ストッパーへのその識別配列のアニーリングを防止する最も好ましい選択は、ストッパーの一部及びアダプターの一部がお互いに相補的な配列を有することである。ストッパーへのアダプターの近接により、その相補配列は第一にハイブリダイズし、そしてその識別配列は一本鎖のままである。
【0026】
本発明の方法はさらに、アダプター核酸をその５’末端をその伸長産物の３’末端に連結し、それによって、標識化した増幅断片を産生することを含む。ライゲーションはたいていリガーゼ酵素を用いて実施される。リガーゼの型は、連結されるオリゴヌクレオチドの性質に依存し、当業者によって選択されうる。例示的なリガーゼはＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼを含む。また、そのリガーゼはＲＮＡリガーゼ、特にＤＮＡリガーゼ活性を有するＲＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ２でありうる。さらなるリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、ａｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡリガーゼ、切り取られたＲｎ１２（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｒｎ１２）、切り取られたＲ１２ Ｋ２２７Ｑ（Ｒｎ１２ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｋ２２７Ｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓリガーゼ、メタン生成細菌のＲＮＡリガーゼ、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）Ａｐｐリガーゼ（ＮＥＢ）、クロレラウイルスＤＮＡリガーゼ又はＳｐｌｉｎｔＲリガーゼである。そのリガーゼは、一本鎖又は二本鎖リガーゼでありうる。また、ありうるものは、並行に実施される、例えば、異なる伸長産物及び／又はアダプター核酸分子が存在し、同時に連結されなければならない場合の、一反応容量における異なる反応のためのリガーゼの組み合わせである。好ましい組み合わせは、ＤＮＡリガーゼ及びＲＮＡリガーゼ又は一本鎖リガーゼ及び二本鎖リガーゼである。そのリガーゼ反応は、アダプター核酸のその識別配列の５’末端上に好ましくは提供されるリン酸残基をたいてい含む。また、他の５’部位はライゲーション、例えばアデニル化した末端のライゲーションのために用いられうる。そのようなものは、切断した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）リガーゼ又はＡｐｐ－リガーゼによって連結されうる。
【0027】
産生したラベル化した増幅断片は：プライマー配列－伸長産物配列－伸長産物配列に隣接する識別配列を有するアダプター配列のライゲーション後に５’から３’までの構造を有するだろう。そのプライマー配列は、「プライマーリンカー配列」を有し、かつ／又はそのアダプター配列が「アダプターリンカー配列」を有しうる。本発明の方法の産物、すなわち、産生したラベル化した増幅断片は、好ましくはさらに増幅される。そのようなさらなる増幅は、当業者に既知の方法、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）又は線形増幅によって産生したラベル化した増幅断片のコピーを産生する。そのようなさらなる増幅は、好ましくはリンカー配列、特に断片末端上に位置されるリンカー配列上に、すなわちプライマー配列及びアダプター配列の部分内に、特に好ましくは、プライマー配列の５’末端及びアダプター配列の３’末端上に、ラベル化した増幅断片に結合するさらなるプライマーの使用をたいてい含む。これらのプライマー及びアダプターに関して上述されるように、それらはさらなる増幅のそのようなプライマーに結合する既知配列の領域（「プライマーリンカー配列」及び「アダプターリンカー配列」）を有しうる。これらの領域（又は「一部」）は非常に長く、特異的でありうるのでテンプレートに結合しない；それらはユニバーサルプライマー結合部位でありうる。すなわち、好ましくは固有である、識別配列と対照的に、異なるアダプター／プライマー間で選択的でない。
【0028】
識別配列は増幅断片のための固有の標識を提供し、またそれゆえ本明細書で固有分子識別子（ＵＭＩ）として称される。その識別配列は、さらなる増幅の複製（例えば、ＰＣＲ）を同定し、かつ配列依存的な増幅の偏りの影響の減少しうる。好ましい態様において、その識別配列は、さらなる増幅前の、伸長産物（断片）に連結されるそれぞれの位置で、主に、ランダムなヌクレオチドの分布を有するオリゴヌクレオチドである。識別配列が均等に分布され、かつそれらの値が同一の伸長産物の数よりもかなり大きい場合に、続いて同じ識別配列が二つの同一の伸長産物（異なるコピー）に連結されることはありそうにない。この場合において、さらなる増幅後の別々の異なる識別配列の数は、さらなる増幅前の数と同じである。また、本発明の識別配列は、Ｓｅｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：１３１２１）内のＵＭＩｓについて記載されるように用いられうる。標識した断片の全体の配列又は全体の配列の一部は、次世代シークエンシング法及びさらなる配列解析において「リード」として考えられうる。一以上のリードはデータ分析の間に組み立てられ、そのテンプレートの連結した配列を得る。続いて、また、データ分析は、テンプレート分子及び断片の定量的な分析になり、それは、例えばヒントがＲＮＡスプライシングバリアントの異なる発現率である、特定のテンプレートコピーが重複している又は提示不足の場合に、見識を提供しうる。好ましい態様において、本発明は、さらに固有である増幅断片の配列をアセンブリングし、ここでその標識が固有の増幅断片を同定するために用いられる工程を含む。増幅した標識した増幅断片における異なる識別配列は、固有の増幅断片を識別する。その識別配列は、アセンブリ又は任意の他のデータ分析工程において、重複及び複製の識別及び除去を可能にする。
【0029】
好ましい態様において、その識別配列は、３ｎｔ（ヌクレオチド）長以上、好ましくは３ｎｔから２０ｎｔ、特に好ましくは４ｎｔから１５ｎｔ又は５ｎｔから１０ｎｔ、例えば、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ長以上である。そのような長さは容易な操作及び効率的なライゲーション反応のために十分に小さいが、単一の増幅産物の所望される識別を提供する、好ましくはそこへの固有のラベルを提供する、それらのヌクレオチドのヌクレオチド置換のために、十分に多量の異なる識別配列をさらに提供する。
【0030】
好ましい態様において、伸長産物がテンプレート核酸の５’末端に到達する場合において、ヌクレオチドポリメラーゼは、伸長産物にテンプレートでないヌクレオチドを、好ましくはポリメラーゼの末端トランスフェラーゼ活性によって、付加することを可能にし、かつ／又は好ましくは１から１５のテンプレートでないヌクレオチドを伸長産物の少なくとも７０％において付加する。上述のように、そのようなテンプレートでない核酸の付加は、いくつかのポリメラーゼの特性である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００１，３０（３）：５７４－５８２参照）。この活性は、逆転写酵素において、たとえば、Ｍ－ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）逆転写酵素又はＡＭＶ（アルファルファモザイクウイルス）逆転写酵素において、もっとも顕著である。これらのテンプレートでないヌクレオチドは、たいてい任意のヌクレオチド型（Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃ）であり、そしてランダムのように思われる。これは、異なるテンプレートの５’末端の伸長産物が５’末端に対応する同じ配列を共有できるが、続いてそのようなテンプレートでない追加の産物である、異なる、一見したところランダムのさらなるヌクレオチドによって継続されうる。これらの異なる追加はテンプレート化した繰り返し配列とテンプレートでないランダムの追加との間の転移で、テンプレート配列の５’末端の正確な位置を識別するために用いられうる。テンプレートでないヌクレオチドの付加後、その標識化した断片は識別配列によって継続し、これらは、上記のように用いられうる。（また）識別配列がランダムである場合において、テンプレートでないランダムヌクレオチドはその識別配列の一部のように扱われる。定まった部分のアダプター配列に関連する識別配列の位置は、明確に識別配列を同定する。
【0031】
特に好ましい態様において、複数のアダプター核酸をライゲーションステップにおいて提供し、用いる。これらの複数のアダプターは異なる識別配列を有しうる。これは、アダプターの固有の識別とその産生した断片とを連結することを可能にする。好ましくは、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０、又はさらに１００以上又は２００以上の、異なる識別配列を有するアダプター核酸がライゲーション工程において提供され、使用される。特定の態様において、同じ配列を有する異なる産生される断片が予想されるのと同じだけ異なる識別配列を有するアダプター、又は好ましくは異なる識別配列を有するより多くのアダプターが用いられる。多数のテンプレートコピーの予想は、試料の型、例えば、全細胞ＲＮＡ、全細胞ｍＲＮＡ（トランスクリプトーム）、ＲＮＡ量、及び試料の複雑さ（トランスクリプトーム全体を対象にする場合と遺伝子パネルの場合のように選択した遺伝子又は転写物のみを標的にする場合がありうるが、何種類の異なる転写変異体が標的にされるか）等に基づきうる。
【0032】
特定の態様において、その識別配列はランダム配列である。「ランダム配列」は少なくとも一部の識別配列のランダム合成のために高い変異性を有する異なる配列の混合物として理解されうる。ランダム配列は、４つの天然に生じるヌクレオチド（Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃ）における前記配列について潜在的にその全体の結合力のある領域を覆う。そのランダム配列はＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ（Ｕ）よりランダムに選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のヌクレオチドを覆いうる。ヌクレオチドＴ及びＵの配列のハイブリダイズする可能性という用語は、本明細書において交換可能に用いられる。ランダム配列部分について全体の結合可能性領域はｍｎであり、ここでｍは用いられるヌクレオチド型（好ましくはＡ、Ｇ，Ｃ、Ｔ（Ｕ）の４つ全て）の数であり、かつｎはランダムヌクレオチドの数である。それゆえ、ここでそれぞれのありうる配列が示され、ランダムヘキサマーは４６＝４０９６の異なる配列からなる。その識別配列はテンプレートに結合してはならない。全ての場合、特にランダム識別配列において、伸長反応後にアダプター核酸を加えることが好ましい。伸長産物がストッパー（又はそのテンプレートの末端）に到達し、そして本質的にその全体のテンプレートが続いて伸長産物を有する二本鎖の形態である場合に、続いて、そのアダプター核酸はテンプレートと結合することから妨げられる。
【0033】
本発明のさらなる態様において、プライマー及びストッパーが選択され（伸長産物に対して下流にあるストッパーを有する）テンプレート核酸において関心のある一以上の標的配列に結合し、特定のテンプレート部分の伸長配列が得られる。特定の領域のそのような標的化は好ましくは、テンプレートとしての転写物（ＲＮＡ）又は遺伝子（ｇＤＮＡ）のために用いられる。識別配列は遺伝子パネルにおいて用いられる場合に特に役立つ。例えばテンプレートの異なる種の配列変異体の分析について、例えば、スプライシングバリアント又はテンプレート配列を変化する他のものである。
【0034】
全てのその態様及び側面について本発明の特定の好ましい態様において、また伸長ストッパーはプライマー活性を有し、かつまた伸長工程時に伸長される。これは、１より多いプライマーが用いられること、かつほとんどのプライマーがストッパー機能を有することを意味する（すなわち、置換を防止する－上記参照）。いくつかのプライマーを用いることは、テンプレートが多くの産生される断片をもたらすことを意味し、すなわち、カバレッジを改善する。プライマーはテンプレートに結合するが、それらは、異なるプライマーがテンプレート上の異なる位置に結合する場合に包括的なカバレッジを提供するだろう。（また、好ましくはストッパーである）多数のプライマーを用いる本発明方法は、上流の伸長産物がちょうど停止した場合に、テンプレート上の位置で新たな伸長産物が伸長を開始するので、カバレッジを増やすだろう。これは、全体のテンプレートを覆う多くの断片をもたらす。さらに、また、テンプレート分子の異なる部分に結合する（同義語として用いられる本態様において）ストッパー／プライマーが用いられることを意味する。一般的に、テンプレート分子に結合することは、プライマー及びストッパーのアニーリング配列によって決定される。この配列は、そのテンプレートとハイブリダイズし、そしてテンプレート上の異なる位置に結合するために変化しうる。好ましくは、少なくとも９、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも４９、少なくとも５０、例えば、１００以上又は２００以上のテンプレートへアニーリングするための異なるアニーリング配列を有する伸長ストッパーが用いられる。それによって、それらはテンプレート核酸上の潜在的に異なる位置にアニールするだろう。好ましくは、そのアニーリング配列はランダム配列である。ランダム配列は、プライマー、ストッパー及び同様のプライマー機能を有するストッパーの識別配列に関連して上記に記載される。好ましくは、アニーリング配列のランダム配列は、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ（Ｕ）からランダムに選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のヌクレオチドをカバーしうる。
【0035】
好ましくは、そのアダプター核酸は伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されない。例えば、化学反応、複合体形成又はハイブリダイゼーションにより、そのような結合反応は、上流の伸長産物の３’末端に近いアダプター核酸のそれ自身がストッパー又はテンプレートにハイブリダイズしないその識別配列への配置を促進し、そして、それは驚くべきことに、ライゲーション反応が作用するために必要とされない。好ましくは、そのアダプター核酸が伸長ストッパーに結合又はハイブリダイズされる場合に、続いて、その識別配列は、テンプレートへの伸長ストッパーをアニーリングするための伸長ストッパーのアニーリング配列とは無関係に選択される。アニーリング配列とその識別配列の両方は、ランダム配列であり、好ましくはお互い無関係に選択される。これは、たいていストッパー及びアダプターの核酸部分がユニバーサル配列である場合に、すなわち、任意のアダプターは（好ましくは本発明の全ての態様について）任意のストッパーに結合し、そしてさらにアダプター核酸は、例えば、アダプターが伸長反応後のみに提供される場合に、ストッパーに結合されることを提供されないことを保証される。他の態様又は本反応の他の部分において、それらは結合せず、例えばその伸長反応がそのテンプレートの５’末端に到達する際に、そのストッパーはそのテンプレート上に少なくとも最小のアニーリング配列を必要とし、それは、最も下流の停止位置を５’末端から、いくつかのヌクレオチド上流に移動するので、たいてい、ストッパーはハイブリダイズされない。また、そのアダプターは伸長ストッパーに結合又はハイブリダイゼーションせずに、その伸長産物に連結できる。しかしながら、そのアダプター核酸がその伸長産物に連結される場合に、前記伸長ストッパー及び／又はその伸長産物が、特に好ましくはその３’末端において、さらに、そのテンプレートへハイブリダイズされる全ての態様において好ましい。また、特に好ましくは、伸長反応及び／又は特定の態様において、特に好ましくは、ライゲーション後に、そのアダプター核酸が伸長ストッパーにハイブリダイズされることが好ましい。
【0036】
本発明の方法及びキットの好ましい場合において、そのオリゴヌクレオチドプライマーそしてまた好ましくは必ずしも伸長ストッパーではないが、ユニバーサル増幅配列（「プライマーリンカー配列」、上記参照）を含み、かつ／又はここで、そのアダプター核酸はユニバーサルアダプター増幅配列（「アダプターリンカー配列」上記参照）を含む。そのような増幅配列又は「リンカー」を、用いることができ、既に上述されるようにプライマーを結合し、さらに増幅する。ユニバーサル配列は、全てのプライマー、ストッパー、又はアダプターについて、それぞれ同じであることを意味する。これは、これらのオリゴヌクレオチドに同じプライマー型が結合することを可能にする。また、特に好ましい態様において、そのユニバーサル増幅配列（リンカー配列）は、プライマー、ストッパー及びアダプターについて同じであり、すなわち、さらなる増幅プライマーはオリゴヌクレオチドプライマー、伸長ストッパー、及びアダプター核酸等に結合しうる。プライマーの一つの型のみがさらなるの増幅について必要であるので、これは容易な操作を促す。他の態様において、そのプライマー、ストッパー及びアダプターは、異なるユニバーサル増幅配列（リンカー配列）を有し、すなわち、さらなる増幅プライマーはオリゴヌクレオチドプライマーのみに結合でき、別のさらなる増幅プライマーはアダプター核酸にのみ結合しうる。これらのグループにおいて、そのプライマーは、好ましくはユニバーサルである。これは、容易な操作を可能にするが、標識した断片の両末端についてプライマーが異なり、そして特異的に選択されうるので、より良い制御を可能にする。
【0037】
好ましい態様において、特別なオリゴヌクレオチドが、好ましくはテンプレートの３’末端上の、テンプレートの選択される配列を選択し、かつアニールするために用いられる。オリゴ（Ａ）末尾を含むｍＲＮＡ、又はＲＮＡの任意の他の型の場合において、そのような３’末端が相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、例えば、前記オリゴ（Ａ）末尾に相補的であるオリゴ（ｄＴ）アニーリング配列を含むものとアニールされうる。好ましくは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、そのテンプレートの選択される配列にアニーリングするためのアニーリング配列を含む。好ましくは、前記オリゴ（ｄＴ）配列はオリゴ（ｄＴ）配列から異なる一以上の３’アンカーヌクレオチドを含む。これは、適当な配置及びオリゴ（Ａ）テンプレート配列の５’末端に結合することを可能にする。そのアンカーヌクレオチドは、オリゴ（Ａ）部分の次のテンプレート上の次のＡでないもの（例えばＴ、Ｇ、Ｃ）にアニールするだろう。次のＡでないヌクレオチドが未知である場合に、異なるアンカープライマー、例えば（テンプレート上の次のＡでない（例えば、Ｔ、Ｇ、Ｃ）に相補的な）それぞれＴでない（例えば、Ａ、Ｇ，Ｃ）ヌクレオチドを有する３つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを有するオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を使用できうる。好ましい態様において、二つのアンカーヌクレオチドが用いられる。前記Ｔでないヌクレオチドの隣のアンカーヌクレオチドは、オリゴ（Ｔ）に隣接しないので、任意のヌクレオチド型（Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃ）より選択されうる。前記特別なオリゴヌクレオチドプライマーは、その特別なオリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートの３’末端に又は近くにアニールする場合には、これらは必要ないので、ストッパーでなく、アダプターへハイブリダイゼーションするための配列を含みえない。これは、上流の伸長産物がその位置に到達しないことを意味する。もちろん、プライマー／ストッパーの製造においての容易さ又は統一性について、そのような配列及び／又はストッパー機能は存在しうる。
【0038】
好ましくは、そのライゲーション反応はクラウディング剤の存在下である。Ｚｉｍｍｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８３；８０（１９）：５８５２－６に参照されるように、クラウディング剤は効果的な反応量を減らすことによってお互いに相互作用するアダプター及び伸長産物の可能性を増やす。さらなるクラウディング剤は、例えば米国第５，５５４，７３０号、米国第８，０１７，３３９号及びＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２において開示される。好ましくは、そのクラウディング剤は、巨大分子、ポリマー又はポリアルキルグリコールのような化合物を含むポリマー、好ましくはＰＥＧ、オクトキシノール、又はトリトンＸ、又はポリソルベート、好ましくはツイーンである。好ましい態様において、そのクラウディング剤は、５体積％から３５体積％、特に好ましくは１０体積％から２５体積％の濃度において用いられる。好ましくは、そのクラウディング剤は、２００から３５０００ｇ／モル、好ましくは１０００から１００００ｇ／モルの分子量を有する。特に、好ましいものは、特に前記分子量を有する、ＰＥＧのようなポリアルキルグリコールである。クラウディング剤は好ましくは本発明のキットにおいて、好ましくはライゲーションバッファーにおいて提供される。
【0039】
任意の成分において、キットについて他の成分は、バッファー、塩、酵素学的な補助因子及び金属、例えばポリメラーゼ及びリガーゼのためのＭｎ２＋及びＭｇ２＋、溶媒、容器である。
【0040】
本発明は本発明の方法を実施するためのキットを提供する。そのようなキットは今までに記載される任意の化合物及び意味を含みうる。好ましくはそのキットは、
（ｉ）テンプレート核酸へハイブリダイズすること及びその３’末端上の伸長反応をプライミングすることを可能にする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉ）テンプレート核酸にハイブリダイズすることを可能にする、好ましくはその３’末端上の伸長反応をプライミングすることを可能にする一以上の伸長ストッパー、（ｉｉｉ）識別配列をその５’末端上に含む一以上のアダプター核酸であって、ここで前記識別配列がその伸長ストッパーにハイブリダイズされない、好ましくは、ここでそのアダプター核酸が伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されないもの、（ｉｖ）逆転写酵素、及び（ｖ）オリゴヌクレオチドリガーゼを含み、（ｉｖ）及び（ｖ）は、本発明とは無関係に多くの実験室で利用できる可能性があるので、任意でありうる。その重要な部分はアダプター／ストッパーの設計であり、特にアダプター上の識別配列である。好ましくは異なる識別配列を有する複数のアダプターは、上記のようにキットにおいて提供される。そのキットの全てのこれらの成分は、上述され、そしてまた、その任意の好ましい態様はそのキットを同様に適用する。好ましくは、そのキットは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０の異なる識別配列を有するアダプター核酸を含む。そのような好ましい態様の理由は上記に与えられている。好ましくは、そのオリゴヌクレオチドプライマーはそのテンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列を含み、それはテンプレート内のオリゴ（Ａ）配列にアニーリングするためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み、好ましくは、ここで前記オリゴ（ｄＴ）配列はオリゴ（ｄＴ）配列から異なる一以上の３’アンカーヌクレオチドを含む。また、そのキットは精製のための固相、例えば、ビーズ、好ましくは磁性ビーズ（上記の詳細な方法を参照、また、キットの成分の適合性及び態様について読み取れるもの）を含む。
（ｉ）テンプレート核酸へハイブリダイズすること及びその３’末端上の伸長反応をプライミングすることを可能にする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉ）テンプレート核酸にハイブリダイズすることを可能にする、好ましくはその３’末端上の伸長反応をプライミングすることを可能にする一以上の伸長ストッパー、（ｉｉｉ）識別配列をその５’末端上に含む一以上のアダプター核酸であって、ここで前記識別配列がその伸長ストッパーにハイブリダイズされない、好ましくは、ここでそのアダプター核酸が伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されないもの、（ｉｖ）逆転写酵素、及び（ｖ）オリゴヌクレオチドリガーゼを含み、（ｉｖ）及び（ｖ）は、本発明とは無関係に多くの実験室で利用できる可能性があるので、任意でありうる。その重要な部分はアダプター／ストッパーの設計であり、特にアダプター上の識別配列である。好ましくは異なる識別配列を有する複数のアダプターは、上記のようにキットにおいて提供される。そのキットの全てのこれらの成分は、上述され、そしてまた、その任意の好ましい態様はそのキットを同様に適用する。好ましくは、そのキットは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０の異なる識別配列を有するアダプター核酸を含む。そのような好ましい態様の理由は上記に与えられている。好ましくは、そのオリゴヌクレオチドプライマーはそのテンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列を含み、それはテンプレート内のオリゴ（Ａ）配列にアニーリングするためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み、好ましくは、ここで前記オリゴ（ｄＴ）配列はオリゴ（ｄＴ）配列から異なる一以上の３’アンカーヌクレオチドを含む。また、そのキットは精製のための固相、例えば、ビーズ、好ましくは磁性ビーズ（上記の詳細な方法を参照、また、キットの成分の適合性及び態様について読み取れるもの）を含む。
【0041】
上記のような全ての好ましい態様は組み合わされうる。また、そのような方法では、（「「鎖置換停止プライマー」とも呼ばれる」）ストッパーである（リンカー配列を有する）ランダムプライマーを使用する。伸長反応後に、好ましくは（テンプレートへハイブリダイズした）伸長産物の精製は、未結合のプライマー及びストッパーを除去するために行われる。続いて、それらのリンカー及び識別配列を有するアダプターは、その伸長産物に連結する。その識別配列は好ましくは４から１２ｎｔの間の長さを有するランダム配列を有する。リガーゼが最後及び最後から２番目におけるある５’に位置したヌクレオチドに都合がよいことによりライゲーションの偏りを課す傾向があるので、一つの好ましい選択は、別に長い識別配列の混合物を使用することである。そのような偏りがリードの質に影響しうるので、そのような混合物は、ライゲーションジャンクションの領域にわたってシークエンシングする場合に、ヌクレオチド置換を均質化する。しかしながら、可変の識別配列は、任意の他の定義される配列のように、さらにより不偏のライゲーションを提供し、そしてまた同時にＵＭＩ（固有分子識別子）として寄与する。ＵＭＩのような、識別配列は、同一配列を有する、又はマイナーなシークエンスエラーを説明する参照の注釈において同一の位置に位置付ける、シークエンシングリードが、異なるテンプレート分子又は一つテンプレート分子から由来するか、そして単にさらなる増幅の結果物（ＰＣＲ複製）であるか決定することを可能にする。そのアダプターは存在する場合に、プライマーにハイブリダイズされる。
【0042】
また、ＵＭＩｓのような、識別配列は、個人間における本当のＳＮＰｓ（一塩基多型）と、逆転写時又は早期ＰＣＲサイクル内において導入されるエラー（変異）であって後に増幅されるものとの間を区別しうる。それらのランダムに生じ増幅されるエラーの全ては、同じ識別子であり、ゆえに試料中の「本物のＳＮＰｓ」は様々な異なる識別子を有する。又は、取り込みミス及びそれゆえＲＴ時のエラーに繋がる塩基の修飾を導入するＲＮＡ編集では、より高い信頼性で定量化されると考えられる。
【0043】
また、遺伝性疾患の原因となる集団、分子マーカー及び変異におけるアレル頻度を確実に決定し、定量化するためにＵＭＩｓのような、識別配列が用いられうる。好ましくは、ＤＮＡテンプレートはこの態様のために用いられる。
【0044】
さらに好ましい組み合わせは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも９つの、伸長ストッパーがプライマー活性を有し、かつまたその伸長工程の間で伸長され、かつ少なくとも２つ、好ましくは１０の異なる識別配列を含むアダプター核酸が用いられ、ここで、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも１０の、異なる標識化した断片を産生し、任意にその標識化した断片を増幅し、さらに固有である増幅断片の配列をアセンブリすることを含み、ここでその標識は固有の増幅断片を同定するために用いられる、本発明の方法である。増幅した標識化した断片における異なるラベルは、固有の増幅断片を識別するために用いられうる。
【0045】
さらなる好ましい方法は、プライマー機能を有するストッパーを使用する。好ましくは、複数のそのようなプライマーが用いられる。そのような方法において、ストッパーとプライマーとの間を区別することなく、本発明の態様は、以下のように定義されうる：前記テンプレート核酸を提供すること、前記テンプレート核酸へ複数のオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングすること、テンプレート特異的な方法においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、それによって複数の伸長産物を作り、ここで前記伸長する反応がその伸長産物がそのテンプレートの５’末端又はそのような伸長産物の下流のテンプレート核酸にアニールされるオリゴヌクレオチドプライマーに到達する際に停止すること、識別配列をそれらの５’末端上に含む複数のアダプター核酸を提供し、ここで前記識別配列がオリゴヌクレオチドプライマー又はそのテンプレートにハイブリダイズしないこと、それらのそれぞれの５’末端で複数のアダプター核酸をその伸長産物の３’末端に連結し、それによって、複数の標識化した増幅断片を産生することの工程を含むテンプレート核酸の標識化した増幅断片を産生するための方法。これは、特許請求の範囲及び上記の任意に特定の記載した側面と組み合わされうる好ましい態様である。ストッパーについて上記の全ては、これらのプライマーがプライマー機能を有するストッパーであるので、本態様のプライマーを提供する。「複数」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマー、（プライマーの伸長の結果物である）伸長産物、アダプター核酸及び（伸長及びアダプターライゲーションの結果物である）標識化した増幅断片について用いられる。示されるように、これらの複数のいくつかの量は本方法の結果である。オリゴヌクレオチドプライマー及びアダプター核酸の量は、上記のように、選択されうる。それらの量を、独立して選択できるが、好ましくは与えられる伸長産物にペアで関係するためにほぼ同じである。好ましくは、その複数は、例えば、１０以上、５０以上、１００以上、２００以上等である。多くの異なるオリゴヌクレオチドプライマー及びアダプター核酸が：そのオリゴヌクレオチドプライマーがそのテンプレート上の多数の異なる位置に結合するために、異なる識別配列を有するアダプター核酸、好ましくは、標識した増幅断片の固有の識別配列のために、用いられうる。本態様において、プライマー及びストッパーは同じであるが、またストッパー機能を必要としない（しかし有しうる）特殊なプライマー、例えば、上記のようなオリゴ（Ａ）標的プライマーのような５’末端特異的なプライマーを加えられうる。
【0046】
本発明は、本発明のこれらの態様に制限されることなく、さらに以下の図及び実施例において記載される。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】ＳＤＳ特性を有するプライマーを用いるＵＭＩ－リンカー標識化した短いｃＤＮＡライブラリー及びＲＮＡのボディー内に部分的に相補的なＵＭＩ－含有リンカーオリゴを作ることの略図 ａ）一般的な鎖置換停止プライマーＰｎはＲＮＡ転写物にハイブリダイズされ、そしてプライマーＰｎ＋１はテンプレートＲＮＡのプライマーＰｎよりもより上流（５’）の位置にハイブリダイズされる。逆転写酵素の場合に、伸長するＰｎがプライマーＰｎ＋１に到達すると、そのポリメラーゼ反応は、ＷＯ２０１３／０３８０１０ Ａ２において記載されている鎖置換停止技術により停止されるだろう。Ｌ１に相補的なＬ２を含むＵＭＩ－含有リンカーオリゴは、プライマーＰｎ及びＰｎ＋１にハイブリダイズされる。ｂ）ライゲーションの際に、その伸長産物は、すぐにそのリンカーのＬ２鎖に先行するＵＭＩに連結される。再度この様式において、その末端に存在する二つのリンカー配列（Ｌ１、Ｌ２）を有し、かつ固有分子識別子を含むｃＤＮＡライブラリーは作成される。ｃ）最終的に、ＰＣＲを実施し、これらのライブラリーを増幅する。
【0048】
【図2a】ＵＭＩ－含有ライブラリーの産生 図２ａ）はＳＤＳ＋ライゲーション手法によって産生されるライブラリーを示す。 ＵＭＩを含む部分的に相補的なＬ２アダプターのライゲーション（図１参照）は、一本鎖リガーゼ又は二本鎖リガーゼ（レーン２、３）のいずれかを用いて実施されうる。リガーゼが省かれる場合に、ライブラリーは産生しない（レーン１）。ライゲーション後、Ｌ１及びＬ２リンカーを含むｃＤＮＡ断片はＰＣＲにより増幅され分析される。示されたものは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上で運用されるＨＳ ＤＮＡアッセイからのゲル画像である。ｂ）ハイブリダイズしないスターター及びアダプターオリゴによるＳＤＳ＋ライゲーション手法を用いるＵＭＩを含むライブラリーの産生の略図。この場合において、そのアダプターオリゴＬ２’は、伸長スターターＰｎに相補的な配列を含まない。ｃ）複製ライブラリーのゲル画像及び電気泳動図はハイブリダイズしない伸長スターター及びＵＭＩを含むアダプターオリゴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）を用いて産生される。画像は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）上で運用されるＨＳ ＤＮＡアッセイから得られる。
【0049】
【図2b-c】ＵＭＩ－含有ライブラリーの産生 図２ａ）はＳＤＳ＋ライゲーション手法によって産生されるライブラリーを示す。 ＵＭＩを含む部分的に相補的なＬ２アダプターのライゲーション（図１参照）は、一本鎖リガーゼ又は二本鎖リガーゼ（レーン２、３）のいずれかを用いて実施されうる。リガーゼが省かれる場合に、ライブラリーは産生しない（レーン１）。ライゲーション後、Ｌ１及びＬ２リンカーを含むｃＤＮＡ断片はＰＣＲにより増幅され分析される。示されたものは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上で運用されるＨＳ ＤＮＡアッセイからのゲル画像である。ｂ）ハイブリダイズしないスターター及びアダプターオリゴによるＳＤＳ＋ライゲーション手法を用いるＵＭＩを含むライブラリーの産生の略図。この場合において、そのアダプターオリゴＬ２’は、伸長スターターＰｎに相補的な配列を含まない。ｃ）複製ライブラリーのゲル画像及び電気泳動図はハイブリダイズしない伸長スターター及びＵＭＩを含むアダプターオリゴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）を用いて産生される。画像は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）上で運用されるＨＳ ＤＮＡアッセイから得られる。
【0050】
【図3】転写物の改善した５’末端のカバレッジは、ＲＮＡテンプレートの５’末端でｃＤＮＡへのＬ２リンカーのライゲーションによってもたらされうる。 ａ）転写物の５’末端でのＲＴ反応の略図。下流のプライマーＰｎ＋１によってＳＤＳなしに、そのＲＴのその末端のデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ活性（ＴｄＴ）は、突出を産生するｃＤＮＡの３‘末端にテンプレートでないヌクレオチドを付加する。ｂ）テンプレートでないｎｔｓは、プライマーＰｎ＋１を含むＬ１についてハイブリダイゼーション部位のいずれかに寄与しうる。部分的にＬ２とハイブリダイズされることと併せて、ＵＭＩ－Ｌ２リンカーのライゲーションは二本鎖において起こりうる。ｃ）一方で、ＵＭＩ－Ｌ２リンカーをプライミングしなければ、一本鎖として連結されうる。ｄ）図３ａ）－ｃ）に体系的に示されるように産生されるライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００（シングルリード、７５ｂｐ）においてシークエンシングした。示されるものは、（ＳＩＲＶ ｓｅｔ ３，Ｌｅｘｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ ＃０５１．０Ｎに示されるように）ＥＲＣＣ－０１３０の５’末端にマッピングするリードである。リードは、追加の及び不適合の塩基のトリミングなしに分析される。ＥＲＣＣ－０１３０の注釈に対応する灰色においてマークしたヌクレオチド、及び黒色において示したヌクレオチドは、そのＲＴのＴｄＴ活性によってテンプレートでないものの付加から由来される。ＥＲＣＣ－０１３０の５’末端について得られるリードの３０の代表的な配列は、以下に示される。リード配列は上から下へ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～４２である。ｅ）慣習のプロトコルと比較されるＳＤＳ／ライゲーション手法の改善した５’末端のカバレッジ。ライブラリーを慣習のプロトコル（ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｅ７７６０Ｓ）、又はそのＳＤＳ／ライゲーション手法を用いて調製し、そしてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００（ペアエンドリード、１５０ｂｐ）によりシークエンシングした。ＥＲＣＣ－０１３０へのリードマッピングを上書きし、そして長方形として示される期待されるカバレッジと比較した。左側：慣習のＲＮＡライブラリー調製プロトコル、右側：新規ＳＤＳ／ライゲーション技術によって得られるカバレッジ。
【0051】
【図4】ＳＤＳ／ライゲーション手法並びに一般的な（Ｐｎ）及びオリゴ－ｄＴプライマー（ＰｄＴ）の組み合わせによって３’末端のカバレッジを改善するために用いられる反応の略図。 ａ）一般的なプライマーＰｎをそのＲＮＡボディー内のＲＮＡテンプレートにハイブリダイズする。加えて、本オリゴ－ｄＴプライマー（ＰｄＴ）を、ポリアデニル化した転写物の３’末端のポリ（Ａ）尾部にハイブリダイズする。下流のプライマーＰｎが到達し、鎖置換を停止するまで、ＲＴはＰｄＴを伸長するだろう。ｂ）ライゲーションの際に、ＵＭＩ－含有Ｌ２リンカーは３’末端、産生するＬ１とＬ２との連結、転写物の３’末端を覆うＵＭＩ－含有ｃＤＮＡライブラリーに及ぶｃＤＮＡ断片に連結される。ｃ）全体のトランスクリプトームにわたる転写物の３’末端の増強したカバレッジを示すｇｅｎｅ ｂｏｄｙ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｐｌｏｔ。ライブラリーを、ランダムプライミングの混合物、及び実施例３に記載されるオリゴ－ｄＴの第一鎖合成プライマーを用いてＳＤＳ＋ライゲーションのプロトコルを用いて調製した。ライブラリーはＮｅｘｔＳｅｑ５００機器によりシークエンシングされ、トランスクリプトームにわたるｇｅｎｅ ｂｏｄｙ ｃｏｖｅｒａｇｅは、以前に記載したＳＤＳ＋ライゲーションプロトコルと比較してプロットされた。ｄ）慣習のライブラリー調製方法（上図）及び改善した３’末端カバレッジをもたらすオリゴ－ｄＴタイトレーションによるＳＤＳ＋ライゲーションプロトコル（下図）について内在的なハウスキーピング遺伝子（ＨＳＰ９０）にわたる例示的なカバレッジ。
【0052】
【図5a】転写物の５’及び３’のカバレッジの全体の改善。転写開始部位すなわち転写物の本当の５’末端、及び転写終結部位すなわち転写物の本当の３’末端は、ＳＤＳ＋ライゲーションプロトコルを用いて分解されるが、二つの例示的な慣習のライブラリー調製方法を用いる場合には分解されない。図３ａ－ｃ）に体系的に示されるＳＤＳ＋ライゲーションプロトコルを用いて産生されるライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００によりシークエンシングする（ペアエンド、１５０ｂｐ）。慣習のライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃａｔａｌｏｇ＃２００２０５９６又は２００２０５９７（＝慣習１）又はＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ７７６０Ｓ（＝慣習２）のいずれかを用いてメーカーの指示に従って調製する。ａ）示されるものは、（ＳＩＲＶ ｓｅｔ３、Ｌｅｘｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃０５１．０Ｎにおいて存在するように、）検出したＥＲＣＣｓの本当の５’及び３’末端へのリードマッピングである。リードを既知の配列によってＲＮＡｓにおけるＥＲＣＣスパイクに位置付けた。全ての検出したＥＲＣＣｓについて集積したマップ化したリードの標準化したカバレッジを、点線によりマークした転写開始（ＴＳＳ）及び転写終結部位（ＴＥＳ）に対応する絶対ヌクレオチ位置においてプロットした。ｂ）伸長した５’カバレッジは、本当のＴＳＳを明らかにする。上図：上記のようにＳＤＳ＋ライゲーションプロトコル又は慣習のライブラリー調製を用いて産生されるように凝集したイントロンの可視化によるｇａｐｄｈについてのカバレッジの特性。リード配列は、上から下にＳＥＱ ＩＤｓ Ｎｏ．４３からＮｏ，６７である。ｇａｐｄｈの注釈に対応する黒色でマークしたヌクレオチド、及び不適合又はＲＴのＴｄＴ活性によるテンプレートでない追加に由来される灰色において示される。転写物の５’末端でリードの積み重ねにより産生される開始部位クラスターは、再注釈のＴＳＳに用いられうる。その注釈され手動で決定したＴＳＳは、太字で示した注釈したコンセンサス配列で矢印により示される。
【0053】
【図5b】転写物の５’及び３’のカバレッジの全体の改善。転写開始部位すなわち転写物の本当の５’末端、及び転写終結部位すなわち転写物の本当の３’末端は、ＳＤＳ＋ライゲーションプロトコルを用いて分解されるが、二つの例示的な慣習のライブラリー調製方法を用いる場合には分解されない。図３ａ－ｃ）に体系的に示されるＳＤＳ＋ライゲーションプロトコルを用いて産生されるライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００によりシークエンシングする（ペアエンド、１５０ｂｐ）。慣習のライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃａｔａｌｏｇ＃２００２０５９６又は２００２０５９７（＝慣習１）又はＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ７７６０Ｓ（＝慣習２）のいずれかを用いてメーカーの指示に従って調製する。ａ）示されるものは、（ＳＩＲＶ ｓｅｔ３、Ｌｅｘｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃０５１．０Ｎにおいて存在するように、）検出したＥＲＣＣｓの本当の５’及び３’末端へのリードマッピングである。リードを既知の配列によってＲＮＡｓにおけるＥＲＣＣスパイクに位置付けた。全ての検出したＥＲＣＣｓについて集積したマップ化したリードの標準化したカバレッジを、点線によりマークした転写開始（ＴＳＳ）及び転写終結部位（ＴＥＳ）に対応する絶対ヌクレオチ位置においてプロットした。ｂ）伸長した５’カバレッジは、本当のＴＳＳを明らかにする。上図：上記のようにＳＤＳ＋ライゲーションプロトコル又は慣習のライブラリー調製を用いて産生されるように凝集したイントロンの可視化によるｇａｐｄｈについてのカバレッジの特性。リード配列は、上から下にＳＥＱ ＩＤｓ Ｎｏ．４３からＮｏ，６７である。ｇａｐｄｈの注釈に対応する黒色でマークしたヌクレオチド、及び不適合又はＲＴのＴｄＴ活性によるテンプレートでない追加に由来される灰色において示される。転写物の５’末端でリードの積み重ねにより産生される開始部位クラスターは、再注釈のＴＳＳに用いられうる。その注釈され手動で決定したＴＳＳは、太字で示した注釈したコンセンサス配列で矢印により示される。
【実施例】
【0054】
実施例１：第一鎖のｃＤＮＡ断片への固有分子識別子（ＵＭＩ）のライゲーション
【0055】
ライブラリーをメーカーの指示に従いコントロールミックス（Ｌｅｘｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃０５１．０Ｎ）におけるＳＩＲＶ Ｓｅｔ ３ ｓｐｉｋｅを含むユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃７４００００）から調製した。
【0056】
ｃＤＮＡ合成後、２から２４ヌクレオチドの、好ましくは６から１２ヌクレオチドの間の長さの固有分子識別子を含む下流のプライマー（Ｐｎ＋１（Ｌ２））を、テンプレートＲＮＡとのハイブリッドにおいて、新たに転写されるｃＤＮＡ鎖に連結しうる。逆転写をオリゴ、テンプレート、及びＷＯ２０１３／０３８０１０Ａ２に記載されるような条件を用いて実施した。様々なリガーゼ及びそれらの組み合わせを以下のようなオリゴと連結するために用いうる：
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８：（Ｐｈｏｓ）（５’－＋ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９：（Ｐｈｏｓ）（５’－＋ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））。
逆転写（ＲＴ）後、その試料をメーカーの指示に従い、磁性精製ビーズ（ＡＭＰｕｒｅ Ｂｅａｄｓ；Ａｇｅｎｔｃｏｕｒｔ）を有する固相可逆固定（ＳＰＲＩ）によって精製した。そのｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、２０μＬの水又は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０において溶出し、１７μＬの上清を新しいＰＣＲプレート内に移した。続いて、ライゲーション反応を２０％ ＰＥＧ－８０００、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２５℃）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ ｍＭ ＤＴＴ、０．４ ｍＭ ＡＴＰ、０．０１％ トリトン－Ｘ１００、５０ μｇ／ｍＬ ＢＳＡ及び一本鎖特異的なリガーゼ及び／又は二本鎖特異的なリガーゼのいずれかでありうる２０ユニットのリガーゼを有する６０μＬにおいて実施した。連結されない小断片及び残存するオリゴをＳＰＲＩ精製により除去した。全ての残存する第一のｃＤＮＡライブラリーを、高い忠実性のポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応において、そして以下のプログラムで増幅した：９８℃で３０秒に続き、９８℃で１０秒の１０～２５ＰＣＲサイクル、６５℃で２０秒、そして７２℃で３０秒。最終の伸長を７２℃で６０秒間実施した。図１ｂ）は、鎖置換停止プライマー（Ｌ１）に相補的な配列を有するＵＭＩ－含有リンカーオリゴ（Ｌ２）への基本的な伸長したｃＤＮＡのライゲーションの一般原理を示す。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８：（Ｐｈｏｓ）（５’－＋ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９：（Ｐｈｏｓ）（５’－＋ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ－３’（３ＩｎｖｄＴ））。
逆転写（ＲＴ）後、その試料をメーカーの指示に従い、磁性精製ビーズ（ＡＭＰｕｒｅ Ｂｅａｄｓ；Ａｇｅｎｔｃｏｕｒｔ）を有する固相可逆固定（ＳＰＲＩ）によって精製した。そのｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、２０μＬの水又は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０において溶出し、１７μＬの上清を新しいＰＣＲプレート内に移した。続いて、ライゲーション反応を２０％ ＰＥＧ－８０００、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２５℃）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ ｍＭ ＤＴＴ、０．４ ｍＭ ＡＴＰ、０．０１％ トリトン－Ｘ１００、５０ μｇ／ｍＬ ＢＳＡ及び一本鎖特異的なリガーゼ及び／又は二本鎖特異的なリガーゼのいずれかでありうる２０ユニットのリガーゼを有する６０μＬにおいて実施した。連結されない小断片及び残存するオリゴをＳＰＲＩ精製により除去した。全ての残存する第一のｃＤＮＡライブラリーを、高い忠実性のポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応において、そして以下のプログラムで増幅した：９８℃で３０秒に続き、９８℃で１０秒の１０～２５ＰＣＲサイクル、６５℃で２０秒、そして７２℃で３０秒。最終の伸長を７２℃で６０秒間実施した。図１ｂ）は、鎖置換停止プライマー（Ｌ１）に相補的な配列を有するＵＭＩ－含有リンカーオリゴ（Ｌ２）への基本的な伸長したｃＤＮＡのライゲーションの一般原理を示す。
【0057】
図２における例示は、様々なリガーゼがオリゴヌクレオチドを含むＵＭＩのライゲーション反応を実施しうることを示し、そしてそれゆえ、ＰＣＲ（図２ａ、レーン２－３）により両方のＰＣＲリンカーを含みＰＣＲにより増幅可能であるｃＤＮＡ断片を産生する。対照的に、任意のリガーゼを省いているコントロール試験では、反応の特異性を強調することを増幅されうるライブラリーがないことを示す（図２ａ），レーン１）。
【0058】
実施例２：ハイブリダイズしない伸長スターター及びアダプターオリゴヌクレオチドを用いるライブラリー産生。
【0059】
メーカーの指示に従い、コントロールミックス（Ｌｅｘｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃０５１．０Ｎ）にＳＩＲＶ Ｓｅｔ ３ ｓｐｉｋｅを含むユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ａｇｌｉｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃７４００００）からライブラリーを調製した。
【0060】
逆転写（ＲＴ）を実施例１において記載されるように実施した。ＲＴに続き、その試料をメーカーの指示に従い、磁性精製ビーズ（ＡＭＰｕｒｅ Ｂｅａｄｓ；Ａｇｅｎｔｃｏｕｒｔ）を有する固相可逆固定（ＳＰＲＩ）により精製し、そしてその精製したｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを２０μＬ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０において溶出し、１７μＬの上清を新しいＰＣＲプレート内に移した。ライゲーションを実施例１に記載の条件を用いて実施したが、逆転写反応をプライミングするために用いられる伸長スターターに相補的な配列を含まないアダプターオリゴヌクレオチドを提供している。従って、そのオリゴヌクレオチドアダプターは、ハイブリダイズできず、そして補充により新たに生じた伸長産物の３’末端の近傍にもたらされない（図２ｂ））。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０：（Ｐｈｏｓ）（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧ－３’（３ＳｐｃＣ３）のようなオリゴは、伸長スターターに相補的な配列を有しない。両方のリンカー配列を含む断片を、実施例１に記載されるように除去した後に増幅した。図２ｃ）は、ハイブリダイズしない伸長スターター及びアダプターオリゴによって生じた二つの複製ＳＤＳ＋ライゲーションライブラリーについてライブラリートレースのゲル画像及び電気泳動図を示す。
【0061】
実施例３：末端トランスフェラーゼ活性及び第一鎖ｃＤＮＡ断片へのＵＭＩ－リンカーのｓｓ－ライゲーションの結果としての改善した５’末端のカバレッジ。
【0062】
ライブラリーを、メーカーの指示に従い、コントロールミックス（Ｌｅｘｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃０５１．０Ｎ）内のＳＩＲＶ Ｓｅｔ３ ｓｐｉｋｅを含むユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃７４００００）から調製した。
【0063】
第一鎖ｃＤＮＡ合成を、テンプレートＲＮＡ分子の５’末端で停止する。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、そのｃＤＮＡ鎖の３’末端でテンプレートでないヌクレオチドの付加を触媒する（図３ａ）。
【0064】
逆転写反応後、ＵＭＩ－リンカーオリゴ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ １－９）のライゲーションは、二本鎖形成（図３ｂ）及び突出一本鎖（図３ｃ）において起こりうる。ＳＰＲＩ精製及びＰＣＲ増幅後、ライブラリーをＮｅｘｔＳｅｑ５００上で、一本鎖読み取り又は対の末端様式のいずれかでシークエンシングした。ＥＲＣＣ－０１３０の５’末端へのリードマッピングを不適合なヌクレオチドの事前のクリッピングなく分析した。ＥＲＣＣ－０１３０の５’末端を覆うリードを図３ｄに例示的に示す。末端のヌクレオチドの付加及び伸長した一本鎖でのＵＭＩライゲーションは改善した５’カバレッジをもたらす。共通のＲＮＡ－配列ライブラリー調製と本発明とのカバレッジの特性の比較を図３ｅに示す。カバレッジは全ての配列したリード（灰色において示されたトレース）と長方形として示される期待される均一のカバレッジと比較した。一方で、慣習のプロトコルから由来した配列データにおいて、５’及び３’末端はいずれかの末端へ勾配において明らかに低い効率でカバーされ、新規プロトコルは、転写の極端な５’末端へのさらなるリードマッピングを作成する（図３ｅ，右）。
【0065】
実施例４：オリゴｄＴ第一鎖合成プライマーのタイトレーションによる３’末端カバレッジの改善
【0066】
転写３’末端のカバレッジは、ランダムプライマーＳＤＳオリゴの混合物に加えられる第一鎖プライマー（Ｌ１を含むＰｎ）オリゴ－ｄＴを用いることによって修飾され、好ましくは増加されうる。それらは、ランダムヌクレオチドの通常の分布に従って、既にＴ－豊富な及びＴ－のみのプライミング配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１ ５’－ＧＴＧＡＣＴＧ－ＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ＋ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ＋Ｖ－３’）を含み、３’末端でカバレッジを高める。ランダムプライマーとポリｄＴ Ｌ１プライマーとの間の選択される比率に依存して、３’末端部位での配列の深度の変化が目立ちうる（図４）。ランダムＳＤＳプライマー及び特定のオリゴｄＴプライマー、並びにプライマーの長さ及びＬＮＡ含有量は様々であり、３’末端の過剰発現の量を決定するだろう。
【0067】
ライブラリーをランダムプライミング置換停止プライマーのみ又は様々な量のオリゴｄＴ第一鎖プライマー（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１）との混合物を用いて、ＳＤＳ＋ライゲーションにより調製した。その結果のライブラリーをＮｅｘｔＳｅｑ５００上のシークエンシングにかけ、データを分析し、そして全体のトランスクリプトームにわたるｇｅｎｅ ｂｏｄｙ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｐｌｏｔをｒｓｅｑｃから利用可能なｇｅｎｅＢｏｄｙ＿ｃｏｖｅｒａｇｅ ｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いて位置づけられるリードから作成した（図４ｃ）。３’末端のカバレッジは、逆転写の際にオリゴ－ＤＴプライマーの付加により有意に増加しうる。
【0068】
さらに、遺伝子カバレッジをカスタムスクリプトを用いて模範的に可視化し、個々の遺伝子状のカバレッジを評価した。図４ｄでは、５’及び３’末端が過小発現されることで有名な、慣習のＲＮＡライブラリー調製プロトコル（上図）により入手されるハウスキーピング遺伝子ＨＳＰ９０のカバレッジを示す。対照的に、オリゴｄＴタイトレーションによるＳＤＳ－ライゲーションプロトコルは改善した５’及び３’カバレッジを示す（下図）。
【0069】
実施例５：５’及び３’カバレッジの改善は、真の転写開始及び終結部位の決定を手助けする。
【0070】
ＳＤＳ＋ライゲーションライブラリーを、実施例３及び４に記載されるように、コントロールミックス（Ｌｅｘｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃０５１．０Ｎ）内のＳＩＲＶ Ｓｅｔ ３ ｓｐｉｋｅを含むリボ欠失ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃７４００００）により調製した。リボソームＲＮＡの除去は、メーカーの指示に従い、ＲｉｂｏＣｏｐ（Ｌｅｘｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ＃０３７．９６）を用いることによってもたらされうる。比較として、二つの慣習のライブラリー調製方法を同じリボ欠失ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ：ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃａｔａｌｏｇ＃２００２０５９６若しくは２００２０５９７（＝慣習１）又はＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ｔｏｕｒｏｋｕｓｈｏｕｈｙｏｕ ），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ７７６０Ｓ（＝慣習２）を，メーカーの指示に従い用いた。その結果のライブラリーをＮｅｘｔＳｅｑ５００上のシークエンシングにかけ、そしてそのデータを分析した。ｇｅｎｅ ｂｏｄｙ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｐｌｏｔをＳＩＲＶ Ｓｅｔ３において存在する全ての検出したＥＲＣＣｓについて、作成した。図５ａ）では、既知の転写開始（ＴＳＳ）及び転写終結部位（ＴＥＳ）、点線により示される両方に対応している絶対ヌクレオチド位置について集積した配置したリードの標準化したカバレッジを示す。３’末端の減少したカバレッジ及び正確な５’末端の欠失分解を示す、両方の慣習のライブラリー調製と比較して、５’及び３’末端でのカバレッジは、ＳＤＳ＋ライゲーションライブラリーから由来した試料について有意に増加した。
【0071】
さらに、遺伝子カバレッジを、カスタムスクリプトを用いて内在ハウスキーピング遺伝子、ｇａｐｔｈについて模範的に可視化し、個々の遺伝子のカバレッジを評価した。図５ｂ）は、凝集したイントロンの可視化によりｇａｐｔｈについてのカバレッジの特性を示す。ｇａｐｔｈ（ＳＥＱ ＩＤｓ Ｎｏ．４３ｋａｒａＮｏ．６７）へのリードマッピングを追加及び不適合の塩基のトリミングなしに分析した。コンセンサス配列（一番上の行）に適合するヌクレオチドを黒色でマークし、そして注釈したコンセンサス配列から逸脱している又はテンプレートでない付加から由来したヌクレオチドを灰色においてマークした。ＳＤＳ＋ライゲーションライブラリー調製物から由来した試料について見られるリードの積み重ねに基づき、真正の転写開始部位を関心のある転写物について、決定し、再注釈しうる。図５ｂ）において示される実施例において、（注釈した＋１の位置に関して）ＴＳＳを手動で－１５の位置に調節した。同様に、高スループットＮＧＳ試験のための真正のＴＳＳで一本鎖ヌクレオチドの分解を含む完全な転写物の総合的な分析を可能にする、真正の転写開始及び末端部位を関心のある完全な転写物について再評価しうる。これは、規格化されそしてより複雑なアプローチ、例えば５’キャプチャーシークエンシング技術（ＣＡＧＥ－Ｓｅｑ）又は低スループットの方法論、例えば５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）とは対照的に、単にＳＤＳ＋ライゲーションライブラリー調製方法を用いることによってもたらされうる。
【図1】
【図2a】
【図2b-c】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-01-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸テンプレートの標識化した増幅断片を産生するための方法であって、前記テンプレート核酸を提供すること、
前記テンプレート核酸に少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングすること、
テンプレート特異的な方法において、前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、それによって伸長産物を作成することであって、ここで前記伸長産物が（ａ）前記テンプレート核酸の５’末端に又は（ｂ）前記伸長産物の前記テンプレート核酸の下流へアニールされる核酸伸長ストッパーに到達する際に、前記伸長反応が停止し、
識別配列をその５’末端上に含むアダプター核酸を提供し、ここで前記識別配列は前記伸長ストッパー又は前記テンプレートにハイブリダイズせず、
前記アダプター核酸をその５’末端で前記伸長産物の３’末端に連結し、ここでライゲーションのために前記伸長産物が前記テンプレートにハイブリダイズされ、それによって標識化した増幅断片を産生すること
のステップを含む方法。
【請求項2】
前記伸長産物が前記テンプレート核酸の５’末端に到達する場合において、ヌクレオチドポリメラーゼが前記伸長産物にテンプレートでないヌクレオチドを、好ましくは前記ポリメラーゼの末端トランスフェラーゼ活性により、付加することを可能にし、かつ／又は好ましくは、ここで１から１５のテンプレートでないヌクレオチドを少なくとも７０％の前記伸長産物に付加する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
複数のアダプター核酸が前記ライゲーションステップにおいて提供されかつ使用され、ここで前記複数のアダプターが異なる識別配列を有し、好ましくはここで少なくとも１０の、より好ましくは少なくとも５０の、異なる識別配列を有するアダプター核酸がライゲーションステップにおいて提供されかつ使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記識別配列がランダム配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記伸長ストッパーがプライマー活性を有し、かつまた前記伸長工程の間に伸長され、好ましくは、ここで少なくとも９の、より好ましくは少なくとも４９の、前記テンプレートにアニーリングするための異なるアニーリング配列を有し、かつそれによって前記テンプレート核酸の異なる位置にアニールする可能性のある、伸長ストッパーが用いられる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記アニーリング配列がランダム配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記アダプター核酸が前記伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されず、又はハイブリダイズされず、好ましくは、前記アダプター核酸が前記伸長ストッパーに結合される又はハイブリダイズされる場合に、続いて、前記識別配列が前記伸長ストッパーを前記テンプレートへアニーリングするための前記伸長ストッパーのアニーリング配列と無関係である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記テンプレートがＲＮＡであり、好ましくはここで逆転写酵素が伸長のために使用される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記オリゴヌクレオチドプライマー及び好ましくはまた前記伸長ストッパーがユニバーサル増幅配列を含み、かつ／又は前記アダプター核酸がユニバーサルアダプター増幅配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが前記テンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列を含み、それは前記テンプレート内のオリゴ（Ａ）配列にアニーリングするためのオリゴ（Ｔ）配列を含み、好ましくはここで前記オリゴ（Ｔ）配列がオリゴ（Ｔ）配列から異なる一以上の３’アンカーヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ライゲーション反応がクラウディング剤、好ましくは、ポリマー又はポリアルキルグリコールのような化合物を含むポリマー、好ましくはＰＥＧ、オクトキシノール若しくはトリトンＸ、又はポリソルベート、好ましくはツイーンの存在下で起こり；かつ／又はここで、前記伸長ストッパー及びまた好ましくは前記オリゴヌクレオチドプライマーは前記テンプレートへアニーリングするためのアニーリング配列の融解温度を高める一以上の修飾したヌクレオチドを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
少なくとも１つの、好ましくは少なくとも９つの、伸長ストッパーはプライマー活性を有し、かつまた前記伸長工程時に伸長され、かつ少なくとも２つの、好ましくは１０の、異なる識別配列を含むアダプター核酸が使用され、それによって、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも１０の、異なる標識化した増幅断片が産生され、任意に前記標識化した増幅断片を増幅し、さらに固有である増幅断片の前記配列をアセンブリすることを含み、ここで前記標識は固有の増幅断片を同定するために使用される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが前記テンプレート核酸にアニールされ、前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをテンプレート特異的な方法において伸長し、それによって少なくとも２つの伸長産物を作成し、ここで前記伸長反応は前記伸長産物が（ａ）前記テンプレート核酸の５’末端、及び（ｂ）前記伸長産物の下流のテンプレート核酸にアニーリングする核酸伸長ストッパーとしてのオリゴヌクレオチドプライマーに到達する際に停止する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
テンプレート核酸にハイブリダイズすること及びその３’末端上の伸長反応をプライミングすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、テンプレート核酸とハイブリダイズすることができる、好ましくはその３’末端上の伸長反応をプライミングすることができる、一以上の伸長ストッパー、
識別配列をその５’末端上に含む一以上のアダプター核酸であって、ここで前記識別配列が前記伸長ストッパーとハイブリダイズせず、好ましくはここで前記アダプター核酸が伸長ストッパーに結合され、ハイブリダイズされ、又は結合されず、又はハイブリダイズされない一以上のアダプター核酸、
逆転写酵素、及びオリゴヌクレオチドリガーゼを含む、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項15】
少なくとも１０の、より好ましくは少なくとも５０の、異なる識別配列を有するアダプター核酸を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項16】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが前記テンプレートにアニーリングするためのアニーリング配列を含み、それは前記テンプレート内のオリゴ（Ａ）配列にアニーリングするためのオリゴ（Ｔ）配列を含み、好ましくはここで、前記オリゴ（Ｔ）配列が前記オリゴ（Ｔ）配列から異なる一以上の３’アンカーヌクレオチドを含む、請求項１４又は１５に記載のキット。
【国際調査報告】