特表 2022-512560 キラル化合物の立体異性化のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】キラル化合物の立体異性化のための方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 213/75 20060101AFI20220131BHJP

   C07K 1/00 20060101ALI20220131BHJP

   C07D 215/38 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/47 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/4406 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20220131BHJP

   C07B 55/00 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C07D213/75

C07K1/00

C07D215/38 CSP

A61K31/47

A61K31/4406

A61K31/198

C07B55/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021517406

(86)(22)【出願日】2019-09-27

(85)【翻訳文提出日】2021-05-17

(86)【国際出願番号】 EP2019076272

(87)【国際公開番号】W WO2020065047

(87)【国際公開日】2020-04-02

(31)【優先権主張番号】18197409.8

(32)【優先日】2018-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518254193

【氏名又は名称】エバーハルト カールス ユニバーシタット テュービンゲン

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100163544

【弁理士】

【氏名又は名称】平田 緑

(74)【代理人】

【識別番号】100183656

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 晃

(72)【発明者】

【氏名】ホーラック，ジーニー

(72)【発明者】

【氏名】レンマ―ホーファー，ミヒャエル

【テーマコード（参考）】

4C055

4C086

4C206

4H006

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C055AA01

4C055BA01

4C055CA53

4C055CB17

4C055DA01

4C055GA10

4C086AA01

4C086AA03

4C086BC17

4C086BC28

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA20

4C206AA01

4C206AA03

4C206FA53

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA10

4C206NA20

4H006AA02

4H006AC82

4H006BC10

4H006BC19

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA05

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は制御された立体異性化（キラル化合物のラセミ体、非ラセミ混合物、およびエピマーの混合物への立体変換を含む）のための新規方法を提供する。本発明の方法は、所与の化合物または化合物の混合物の、エナンチオマーおよびジアステレオマーの両方の、異なる比率の（Ｓ）および（Ｒ）立体異性体の混合物の完全に制御された生成を提供する。本発明により提供されるそのような混合物および前記混合物の同位体標識された変種は、さまざまな生化学的および医学的用途における真正性または外部または内部標準として有用である。さらに、本発明の方法により、以前は利用できなかったいくつかのアミノ酸ならびにその分解および酸化生成物から特定の立体異性体を生成することが可能である。よって、本発明は、追加の態様において、アミノ酸型構造を有する以前は利用できなかった立体異性体（エナンチオマー、エピマー、およびそれらの混合物（ラセミ体など））の群の生成を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キラル化合物を立体異性化（ラセミ化またはエピマー化）するための方法であって、該方法は次の工程：
(a) 次を含む混合物を提供する工程：
(aa) 少なくとも1つの不斉炭素原子を含むキラル化合物、
(bb) 立体異性化タグ、および
(cc) 任意で、バッファー、および、
(b.1)混合物を50～200℃の温度に30分～24時間加熱する工程；または
(b.2)混合物を200～400Wのマイクロ波で、50～300℃の温度で、1分～6時間処理する工程、
を含む、方法。.

【請求項2】

工程(b.1)での加熱は、55℃～95℃の温度範囲で行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

キラル化合物は次の式(I) を有する：

【化1】

（式中、R₁、R₂、およびR₃の基は化学的に同一ではなく、環を形成してもよく、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基または尿素基からなる群から独立して選択され、R₄は、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基または尿素基からなる群から選択される）
好ましくは、該キラル化合物は、アミノ酸、好ましくはタンパク質構成アミノ酸から選択されるが、非タンパク質構成アミノ酸、非リボソーム性アミノ酸および合成アミノ酸が含まれる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

キラル化合物を活性化して以下の式(IIa)の中間体化合物を得る工程を含むものであって：

【化2】

式中、R₇は、N、O、S、もしくはSeから選択してよく、または好ましくは以下の化合物(II)および化合物 (III)のいずれかである：

【化3】

【化4】

立体異性化タグは、以下の化合物の少なくとも１つを含む

【化5】

式中、R₁₁およびR₁₂は、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基または尿素基からなる基から独立して選択される、
請求項３に記載の方法。

【請求項5】

立体異性化タグは、化合物A₁～A₉からなる群から選択される少なくとも１つの化合物に由来するか、または、その化合物を含むか、またはその化合物からなり：

【化6】

式中、R₄、R₅、R₆、R₈およびR₁₂は、それぞれ独立して、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基、または尿素基からなる群から選択され、および
HalおよびOSu は脱離基であり、
R₇およびR₉は、N、O、S、もしくはSeから独立して選択されてよく、
Xは、N、O、S、Se、またはCであってよく、
Yは、C、S、P、またはSeであってよい、
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

立体異性化タグは、アミノフェニル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AC）、3-アミノピリジルN-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（APC）、および好ましくは6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート(AQC, AccQ)から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

立体異性化された化合物から立体異性化タグを除去する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

(i)キラル化合物および／または(ii) 立体異性化タグは、安定、メタ安定、または不安定な同位体で同位体標識されており、同位体は、好ましくは¹¹C、¹²C、¹³C、¹⁴C、¹⁴N、¹⁵N、¹⁶O、¹⁷O、¹⁸O、³²S、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se、⁷⁹Se、⁸⁰Se、⁸²Se、³¹P、³²P、³³P、¹²³I、¹²⁷I、¹²⁹I、¹³¹I、¹³⁵I、¹⁸F、¹⁹F、¹H、²Hおよび³Hから選択され、最も好ましくは¹²C、¹⁴N、¹⁶O、³²S、³¹P、¹²⁷I、¹⁹Fおよび¹Hから選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

(i)請求項３に記載の式（I）に示される1つ以上の不斉中心を有するキラル化合物の不斉中心Cに関する（Ｒ）立体異性体を製造する方法であって、該方法は請求項１～８のいずれか１の方法工程を行うことを含むものであって、式（I）のキラル化合物の不斉中心Cが（Ｓ）配置である、方法、または
(ii)請求項３に記載の式（I）に示される1つ以上の不斉中心を有するキラル化合物の不斉中心Cに関する（Ｓ）立体異性体を製造する方法であって、該方法は請求項１～８のいずれか１の方法工程を行うことを含むものであって、式（I）のキラル化合物の不斉中心Cが（Ｒ）配置である、方法。

【請求項10】

請求項３に記載の式（Ｉ）に示されるキラル化合物の事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物を生成する方法であって、該事前定義された立体異性体の混合物は、式（Ｉ）に示されるキラル化合物の不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体の事前決定された比率Ｙを含むものであって、該事前定義された立体異性体の混合物は、請求項１～８のいずれか１の方法工程を行うことによって得られるものであり、請求項１～８のいずれか１に記載の方法の工程ａ）の混合物は、不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）エナンチオマーの比率Ｘのキラル化合物を含み、ここで、Ｘ＜Ｙであり、および、工程（b.1）の温度および／または時間または工程（b.2）の電力（W）および時間は、十分な量の（Ｒ）立体異性体を（Ｓ）立体異性体にエピマー化して、反応混合物中の（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体の事前決定された比率Ｙに到達するように選択され、そして、それにより事前定義された立体異性体の混合物を取得する、方法。

【請求項11】

請求項３に記載の式（Ｉ）に示されるキラル化合物の事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物を生成する方法であって、該事前定義された立体異性体の混合物は、式（Ｉ）に示されるキラル化合物の不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体の事前決定された比率Ｙを含むものであって、該事前定義された立体異性体の混合物は、請求項１～８のいずれか１の方法工程を行うことによって得られるものであり、請求項１～８のいずれか１に記載の方法の工程ａ）の混合物は、不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）エナンチオマーの比率Ｘのキラル化合物を含み、ここで、Ｘ＞Ｙであり、および、工程（b.1）の温度および／または時間または工程（b.2）の電力（W）および時間は、十分な量の（Ｓ）立体異性体を（Ｒ）立体異性体にエピマー化して、反応混合物中の（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体の事前決定された比率Ｙに到達するように選択され、そして、それにより事前定義された立体異性体の混合物を取得する、方法。

【請求項12】

事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物が優先的に同位体標識された生物学的サンプル内で調製されるものであって、該事前定義された立体異性体の混合物は、生物学的サンプル中の１以上のキラルな生物学的化合物を検出、同定および／または定量化するための外部または内部標準として使用される、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物が酸素の存在下で調製される、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項14】

請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、キラル化合物の事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物。

【請求項15】

例えば、前記キラルな生物学的化合物を検出および／または定量化する方法の内部標準としての、生物学的サンプル中の１以上のキラルな生物学的化合物を検出、同定および／または定量化する方法における請求項１４に記載の事前定義された立体異性体の混合物の使用。

【請求項16】

対象からの生物学的サンプル中のキラル化合物（分析物）の（R）-および／または（S）-立体異性体を検出、同定および／または定量化する方法であって、
(a)内部標準として、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の優先的に同位体標識された事前定義された立体異性体の混合物を生物学的サンプルに追加することによってサンプルを準備する工程、
(b)例えば質量分析器を使用して、同定および／または定量化される分析物エナンチオマーと一緒に内部標準として前記優先的に同位体標識されたエナンチオマーの存在について溶離液を分析する工程、
を含む、方法。

【請求項17】

立体異性体である化合物であって、
(i) D-¹³C₅,¹⁵N-バリン、D-¹³C₆-ロイシン、 D-¹³C₆,¹⁵N-ロイシン、D-¹³C₆-イソロイシン、 D-¹³C₆,¹⁵N-イソロイシン、 DL-¹³C₆-イソロイシン、 DL-¹³C₆,¹⁵N-イソロイシン、 D-¹³C₅-メチオニン、 D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニン、 DL-¹³C₅-メチオニン、 DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニン、 D-¹³C₅-プロリン、 D-¹³C₅,¹⁵N-プロリン、DL-¹³C₅-プロリン、 D-¹³C₃-セリン、D-¹³C3,¹⁵N-セリン、 D-¹³C₄-トレオニン、 D-¹³C₄,¹⁵N-トレオニン、 DL-¹³C₄-トレオニン、 DL-¹³C₄,¹⁵N-トレオニン、 D-¹³C₃-システイン、 D-¹³C₃,¹⁵N-システイン、 D-¹³C₆-システイン、 D-¹³C₆,¹⁵N-システイン、 D-¹³C₉-フェニルアラニン、 DL-¹³C₉-チロシン、DL-¹³C₉,¹⁵N-チロシン、 D-¹³C₁₁-トリプトファン、 D-¹³C₁₁,¹⁵N₂-トリプトファン、 DL-¹³C₁₁-トリプトファン、 DL-¹³C₁₁,¹⁵N₂-トリプトファン、 DL-¹³C₅,¹⁵N-グルタミン酸、 D-¹³C₄,¹⁵N-アスパラギン酸、 DL-¹³C₄,¹⁵N-アスパラギン酸、 D-¹³C₅-グルタミン、 DL-¹³C₅-グルタミン、 DL-¹³C₅,¹⁵N-グルタミン、 DL-¹³C₅,¹⁵N₂-グルタミン、 D-¹³C₄,¹⁵N₂-アスパラギン、 DL-¹³C₄-アスパラギン、 DL-¹³C₄,¹⁵N-アスパラギン、 DL-¹³C₄,¹⁵N₂-アスパラギン、 D-¹³C₆-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N₂-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N₃-ヒスチジン、 DL-¹³C₆-ヒスチジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N-ヒスチジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₂-ヒスチジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₃-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N-リジン、D-¹³C₆,¹⁵N₂-リジン、DL-¹³C₆,¹⁵N-リジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₂-リジン、D - ¹³C₆-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N₂-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N₃-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N₄-アルギニン、 DL-¹³C₆-アルギニン、 DL-¹³C₆,¹⁵N-アルギニン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₂-アルギニン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₃-アルギニンから選択されるタンパク質構成アミノ酸、
(ii) Metから選択された酸化生成物: L-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(S), D-¹³C₅,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(RS)、
(iii) Trpから選択された分解生成物: L-¹³C₁₀,¹⁵N₂-キヌレニン、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-キヌレニン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₂-キヌレニン、L-¹³C₁₀,¹⁵N-キヌレニン、D-¹³C₁₀,¹⁵N-キヌレニン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-キヌレニン、L-¹³C₁₀-キヌレニン、D-¹³C₁₀-キヌレニン、DL-¹³C₁₀-キヌレニン、
(iv) D-¹³C₆-アロイソロイシン、D-¹³C₆,¹⁵N-アロイソロイシン、DL-¹³C₆-アロイソロイシン、DL-¹³C₆,¹⁵N-アロイソロイシン、D-¹³C₄-アロトレオニン、D-¹³C₄ ¹⁵N-アロトレオニン、DL-¹³C₄-アロトレオニン、DL-¹³C₄ ¹⁵N-アロトレオニン、D-¹³C₄-ホモセリン、D-¹³C₄ ¹⁵N-ホモセリン、DL-¹³C₄-ホモセリン、DL-¹³C₄ ¹⁵N-ホモセリン、D-¹³C₄,¹⁵N-ホモシステイン、D-¹³C₄-ホモシステイン、DL-¹³C₄,¹⁵N-ホモシステイン、DL-¹³C₄-ホモシステイン、D-¹³C₈ ¹⁵N₂-ホモシステイン、D-¹³C₈ ¹⁵N-ホモシステイン、D-¹³C₈-ホモシステイン、DL-¹³C₈N₂-ホモシステイン、DL-¹³C₈N-ホモシステイン、DL-¹³C₈-ホモシステイン、D-¹³C₅,¹⁵N₂-オルニチン、D-¹³C₅,¹⁵N-オルニチン、D-¹³C₅-オルニチン、DL-¹³C₅,¹⁵N₂-オルニチン、DL-¹³C₅,¹⁵N-オルニチン、DL-¹³C₅-オルニチン、D-¹³C₆,¹⁵N₃-シトルリン、D-¹³C₆,¹⁵N₂-シトルリン、D-¹³C₆,¹⁵N-シトルリン、D-¹³C₆-シトルリン、DL-¹³C₆,¹⁵N₃-シトルリン、DL-¹³C₆,¹⁵N₂-シトルリン、DL-¹³C₆,¹⁵N-シトルリン、DL-¹³C₆-シトルリン、D-¹³C₅,¹⁵N-ノルバリン、D-¹³C₅-ノルバリン、DL-¹³C₅,¹⁵N-ノルバリン、DL-¹³C₅-ノルバリン、D-¹³C₆,¹⁵N-ノルロイシン、D-¹³C₆-ノルロイシン、DL-¹³C₆,¹⁵N-ノルロイシン、DL-¹³C₆-ノルロイシン、D-¹³C₄,¹⁵N-2-アミノ酪酸、D-¹³C₄-2-アミノ酪酸、DL-¹³C₄,¹⁵N-2-アミノ酪酸、DL-¹³C₄-2-アミノ酪酸、D-¹³C₄,¹⁵N-アミノ酪酸、D-¹³C₄-アミノイソ酪酸、DL-¹³C₄,¹⁵N-アミノイソ酪酸、DL-¹³C₄-アミノイソ酪酸、D-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(R)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(S)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(R)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(S)、D-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(R)、D-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(S)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(R)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(S)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(R)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(S)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(R)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(S)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₃-デオキシヒプシン、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-デオキシヒプシン、D-¹³C₁₀,¹⁵N-デオキシヒプシン、D-¹³C₁₀-デオキシヒプシン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₃-デオキシヒプシン、DL- ¹³C₁₀,¹⁵N₂-デオキシヒプシン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-デオキシヒプシン、DL-¹³C₁₀-デオキシヒプシンから選択される異常アミノ酸、
から選択される、化合物。

【請求項18】

ラセミ化タグを有するまたは有しない、請求項１７に記載の立体異性体を含むラセミまたは非ラセミ組成物であって、好ましくは、ラセミまたは非ラセミ組成物は医薬組成物の形態である、ラセミまたは非ラセミ組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は制御された立体異性化（キラル化合物のラセミ体、非ラセミ混合物、およびエピマーの混合物への立体変換を含む）のための新規方法を提供する。本発明の方法は、所与の化合物または化合物の混合物の、エナンチオマーおよびジアステレオマーの両方の、異なる比率の（Ｓ）および（Ｒ）立体異性体の混合物の完全に制御された生成を提供する。本発明により提供されるそのような混合物および前記混合物の同位体標識された変種は、さまざまな生化学的および医学的用途における真正性または外部または内部標準として有用である。さらに、本発明の方法により、以前は利用できなかったいくつかのアミノ酸ならびにその分解および酸化生成物から特定の立体異性体を生成することが可能である。よって、本発明は、追加の態様において、アミノ酸型構造を有する以前は利用できなかった立体異性体（エナンチオマー、エピマー、およびそれらの混合物（ラセミ体など））の群の生成を提供する。

【背景技術】

【0002】

プロテオミクス、グリコミクス、リピドミクス、またはメタボロミクスなど、いわゆる「オミクス」分析の継続的に拡大する分野では、高いサンプルスループットと超高速分離が不可欠であり、適度に高速でシンプルなサンプル前処理技術が必要である。超高速液体クロマトグラフィーと高分解能質量分析（UHPLC-HRMS）を組み合わせることで、分析対象物の高速分離と可能な限り最高の質量対電荷（m/z）精度が組み合わされる。分析対象物の（クロマトグラフィー）事前分離を省略した直接注入HRMS分析アプローチの場合、正確な定量分析には、内部標準、好ましくは同位体標識された内部標準が不可欠である。実際のサンプルのLC-MS分析に関しては、希釈およびシュートアプローチは、LC-MS分析の前に単純なサンプル希釈工程しか含まれていないため、最速のサンプル前処理手法のようである。したがって、このアプローチは、薬物や代謝物の分析から、インスリンや他のバイオ医薬品などの大きなタンパク質を構成する（proteinogenic）分子に至るまで、LC-MS分析でますます人気が高まっている。同位体標識された化合物は、標識されていない対応物と同一の化学的性質を共有し、標的分析物と同一（例：¹³Cまたは¹⁵N標識）または非常に類似した保留（例：²H標識）を示し、および、LCとMSの間のインターフェースとして最も一般的に利用されているエレクトロスプレーイオン化法（ESI）と同じイオン抑制またはイオン増強の対象となり、マトリックス効果は自然に補正されるため、同位体標識された内部標準の使用は、定量分析で可能な限り最高の精度を確保するために最も重要である。オミクスコミュニティ内の今後の研究分野は、「キラルメタボロミクス」、特にアミノ酸メタボロミクスである。同位体標識されたL-アミノ酸標準混合物は高価であるか入手できず、キラル同位体標識されたD-アミノ酸標準混合物はほとんど入手できないため、共溶出するサンプルアミノ酸と同位体標識された内部標準との間の質量電荷比を決定する質量分析検出器がない場合、多くの研究では外部キャリブレーションを適用するか、ラセミのノルロイシン（racemic norleucine）のような非タンパク質構成アミノ酸を内部標準として使用する。希釈およびシュートアプローチとキラル分離を組み合わせるには、正確な定量分析のための同位体標識アミノ酸標準の入手可能性と適用性が不可欠である。

【0003】

今日まで、酸に不安定で分解しやすいアミノ酸であるグルタミン、アスパラギン、およびトリプトファンを除いて¹³C¹⁵N -L-アミノ酸の部分的に完全な混合物のみが利用可能である。ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸組成の測定には、酸または塩基触媒加水分解が、それらの対応する遊離アミノ酸、グルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化に関与することから、得られる加水分解物には存在しない。したがって、市販の¹³C¹⁵N -L-アミノ酸混合物は、非キラルアミノ酸に適用できるが、タンパク質加水分解物のキラルアミノ酸定量には部分的にしか適用できず、グルタミンとアスパラギンのような生体サンプルに存在するすべての遊離アミノ酸のキラル分析には適用できない。D-グルタミン酸が神経学的に重要であり、グルタミンが代謝的に重要であり、特に癌研究において、癌細胞はグルタミンの大量消費を示すことを考慮すると、遊離グルタミンとグルタミン酸の「正確な」定量化と比較が重要である。したがって、いくつか例を挙げると、アロトレオニン、アロイソロイシン、シトルリン、テアニン、またはヒドロキシプロリンなどのいくつかの異常アミノ酸を含むアミノ酸を含むすべてのタンパク質を構成するアミノ酸を含む、同位体標識されたキラルアミノ酸標準の入手可能性または直接的な調製が緊急に求められている。最も一般的で広く使用されているアプローチは、氷酢酸中および高温下での芳香族アルデヒドとのシッフ塩基形成を介したアミノ酸およびアミノ酸アミドのN末端ラセミ化である。

【0004】

あるいはまた、オキサゾロン形成および塩基誘導開環を介したN-アセチルアミノ酸のC末端ラセミ化が文献で報告された。さらに、いくつかの特許文献は、対応する酸の存在下および200℃までの熱処理でのN-アシル、N-フェナセチル、N-ベンゾイル-およびN-フェナセチル-ホスフィノアミノ酸誘導体ならびにN-フェナシル-ヒドロキシプロリンのラセミ化を説明する。これらの方法の主な欠点は、前述のとおり、酸処理および熱処理中のいくつかのアミノ酸の分解である。一般的に、ペプチド鎖内またはペプチド鎖の末端でのアミノ酸のエピマー化は、エピマー化するアミノ酸の素因、ペプチド鎖内のそれらの位置、および隣接するアミノ酸基の特性に依存する。N末端修飾ペプチドに関しては、アセチル化されたGly-L-Leuは酸性条件下でラセミ化するが、対応するN-アセチル-L-Leu-Glyはラセミ化しないことが報告され、これはN末端アミノ酸を決定するための可能なツールとして提案された。

【0005】

非誘導体化ジペプチドの場合、非特許文献１では、1,4-ピペラジン-2,5-ジオン（ジケトピペラジン）中間体の形成によるC末端のエピマー化および配列の反転（inversion）が観察された。全体として、ジペプチドのキラル分離に関してあまり情報はない。しかしながら、ジペプチドはアルコール飲料に含まれており、日本酒やビール、およびワインの味に影響を与えていると考えられ、潜在的な抗腫瘍剤を合成するための構成要素として使用されている。生物学的流体中のD-アミノ酸含有量は非常に低い（1％未満）かもしれないが、一方で、ある種の非リボソームペプチドはD-アミノ酸を主に含むことができる。同様に、治療用ペプチドは、代謝の安定性を高めるための戦略として、D-アミノ酸を含んでよい。したがって、アミノ酸の種類や分析用途に応じて、1～5％のD-アミノ酸から25～50％のD-アミノ酸まで、目的にあった量の同位体標識アミノ酸を用いて、同位体標識キラルアミノ酸混合物を調製することができれば有益である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Steinberg, S. et al. Science (Washington, DC,United States 1981, 213, 544-545)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、本発明の目的は、エナンチオマーなどの立体異性体の生成するための、およびラセミ、非ラセミ、または立体異性体混合物などの事前決定された比率のそれらの混合物を生成するための新規な方法を提供することであった。本発明の１つの追加の目的は、理論的には可能であるが、従来技術のいかなる手段によっても今日まで入手できず、天然に存在することもない化合物のエナンチオマーを提供することであった。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、以前は利用できなかったキラル化合物の立体異性体、および任意の比率の立体異性体を含むそれらの混合物の生成を可能にする化合物の立体異性化（ラセミ化およびエピマー化）のための改良された方法に関する。特に、本発明は、以前は入手できなかった、または非常に骨の折れる方法を使用してのみ入手できた立体異性体の混合物に関する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

本発明は、非限定的な実施例および添付の図面と併せて検討される場合、詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。

【0010】

【図1】図１は、 トレオニンについて示される立体異性化タグRでタグ付けされたアミノ酸の提案された立体異性化メカニズムを示し、図１ａはL-Thrおよび図１ｂはL- aThrを示し、立体異性化は位置2でのみ発する。ThrおよびaThrの位置3にある2番目の不斉中心は影響を受けない。立体異性化タグRの例を示す、すなわち、6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）、3-アミノピリジルN-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（APC）、およびアミノフェニル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AC）。APCおよびACタグの適用例を図２ａに示す。図１ｃは、Thr-AQCおよびaThr-AQCの立体異性化のクロマトグラフィーの結果を示す。エナンチオマーの分離は、Chiralpak ZWIX(+)カラム（150 x 4 mm、3 μm）を用いて、TOF-ESI-MSの検出はポジティブモードでのロングハイドロオーガニックグラジエント溶出法を使用し行った。L-Thr、L-aThr、DL-Thr、およびDL-aThrの立体異性化後の同重体化合物ThrとaThr ([Thr-AQC + H]+: m/z 290.11408)の抽出イオンクロマトグラム(XICs)は、それぞれ、D-aThrとL-Thr；D-ThrとL-aThr；D-aThr、D-Thr、L-aThrとL-Thr；およびD-aThr、D-Thr、L-aThrとL-Thrの立体異性体混合物を提供する。実験条件は実施例１に示される。

【図2】図２ａは、抽出イオンクロマトグラム(XIC)が、3-アミノピリジルN-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（APC）、アミノフェニル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AC）、および6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）の3つの立体異性化タグ用であることを示す。APCタグとACタグはサーモシェーカー（TS）を用いて立体異性化を行い、AQCタグはマイクロ波照射（MW）を用いて立体異性化を行った例を示す。APC-Phe ([M+H]⁺: m/z 286.1186)、AC-u-¹³C¹⁵N-Phe([M+H]⁺: m/z 295.1506)、およびAQC-u-¹³C¹⁵N-Phe([M+H]⁺: m/z 346.1615)。オリジナルのL-立体異性体のXICを灰色で、立体異性体化されたサンプルのXICを黒色で示すことに留意。エナンチオマー分離は、Chiralpak ZWIX(+) (150 x 4 mm、4 μm)カラムを用いて、ポジティブイオン化モードのUHPLC-QTOF-ESI-MSでのロングハイドロオーガニックデュアルグラジエント法を使用して行った。サンプルの調製は、実施例２に記載。 図２ｂは、立体異性化後のAQCタグ付きL-シトルリン([Cit-AQC+H]⁺: m/z 346.1510)、L-テアニン([The-AQC+H]⁺: m/z 345.15570)およびトランス-4-L-ヒドロキシ-プロリン([Hyp-AQC+H]⁺:m/z 302.1135) のための抽出イオンクロマトグラム(XIC)を示す。トランス-4-L-Hyp（2S、4R）がシス-4-D-Hyp（2R、4R）を提供し、シス-4-L-Hyp（2S、4S）がトランス-4-D-Hyp（2R、4S）を提供した（データ示さず）ことに留意。オリジナルのL-立体異性体のXICを灰色で、立体異性体化されたサンプルのXICを黒色で示すことにも留意。エナンチオマー分離は、Chiralpak ZWIX(+)カラム (150 x 4 mm、3 μm)を用いて、ポジティブイオン化モードのUHPLC-QTOF-ESI-MSでのロングハイドロオーガニックデュアルグラジエント法を使用して行った。サンプルの調製は、実施例３に記載。 図２ｃは、立体異性化後の[AQC-(D/L-Arg)-Gly-(L-Asp) + H]⁺: m/z 517.21537、および[AQC-(D/L-[²H]-Arg)-Gly-(L-Asp) +H]⁺: m/z 518.22165 の抽出イオンクロマトグラム(XIC)を示す。AQC-(L-Arg)-Gly-(L-Asp)およびAQC-(D-Arg)-Gly-(L-Asp)のエナンチオマー分離は、1 μLの注入量でのChiralpakZWIX(+) (150 x 4 mm、3 μm)カラムにおいて、ショートグラジエント溶出法で行った。サンプルの調製は、実施例４に記載。

【図3】図３ａは、0.2Mまたは0.4Mのホウ酸ナトリウムバッファーを用いて、8.8、8.5、8.0、7.5、および7.0のpH値でu-¹²C, ¹⁴N-L-アミノ酸（全20種のアミノ酸の混合物）を誘導体化した後、窒素でパージし、サーモシェーカーを用いて95℃で15時間の立体異性化を行った際の、AQCタグ付け前、AQCタグ付け後、および立体異性化後に測定した溶液中のpH値の概要を示す。立体異性化は、例示的にPhe-AQC ([Phe-AQC+H]⁺: m/z336.13427)の抽出イオンクロマトグラム(XIC)を用いて決定した。さらに、立体異性化が成功した場合はフック（V）で表示し、失敗した場合はクロス（X）で表示した。サンプルの調製は、実施例５に記載。 図３ｂは、さまざまなpH値、それぞれpH8.69およびpH8.83の20 mM および0.2Mホウ酸バッファー溶液でグルタミンを立体異性化した後のAQCタグ付きグルタミン酸([Glu-AQC+ H]⁺: m/z 318.10845)の抽出イオンクロマトグラム(XIC)を示す。さらに、サンプル溶液を0.1M塩酸、超純水、および0.2Mホウ酸バッファー（pH 8.83）で10倍に希釈した。エナンチオマー分離は、Chiralpak ZWIX(+) カラム (150 x 4 mm、3 μm)を用いて、ポジティブイオン化モードのUHPLC-QTOF-ESI-MSを使用したショートグラジエント溶出法で行った。サンプルの調製は、実施例６に記載。

【図4】図４は、u-¹²C¹⁴Nアミノ酸（図４ａおよび図４ｃ）およびAsn、Gln、Trpを含まないu-¹³C¹⁵Nアミノ酸（図４ｂおよび図４ｄ）のAQC誘導体化混合物の立体異性化の結果を示す。図４ａおよび図４ｂにおいて、立体異性化（n=1）は、10分（55℃、75℃および95℃）、30分（55℃、75℃および95℃）および1時間（55℃、75℃、95℃）で実行され、図４ｃおよび図４ｄにおいて、立体異性化（n=3）は95℃で1時間、6時間、15時間で実行された。条件Aの場合、立体異性化後、AQCによる追加の誘導体化でサンプルを分析され、一方、条件Bのサンプルは、AQCによる追加の誘導体化なしで分析された。後者は、AQCタグがほとんどL-エナンチオマーから切断され、立体異性化されたD-エナンチオマーからは切断されないことを示した。エナンチオマー分離は、ロングハイドロオーガニックデュアルグラジエントUHPLC-QTOF-ESI(+)-MS法を用いたChiralpak ZWIX(+) カラム (150 x 4 mm、3 μm)で行った。ピーク積分は、Sciex MultiQuant^TMソフトウェアを使用して実行された。サンプルの調製は、実施例７および実施例８に記載。

【図5】図５は、95℃で6時間の立体異性化後の、対応するAQCタグ付きu-¹³C¹⁵N-L-アミノ酸（黒）のTOF-MS実験の抽出イオンクロマトグラム(XIC) を示す。Euroisotop、Asn、Gln、Trpのメタボロミクスアミノ酸ミックスにアミノ酸が不足している場合、対応するAQCタグ付きu-¹²C¹⁴N-L-アミノ酸の立体異性化の結果は灰色で示される。エナンチオマー分離は、ポジティブイオン化モードのUHPLC-QTOF-ESI-MSを使用したロングハイドロオーガニックデュアルグラジエント溶出法を用いたChiralpak ZWIX(+) カラム (150 x 4 mm、3 μm)で行った。サンプルの調製は、実施例９に記載。

【図6】図６は、95℃で、酸素の存在下でa）6時間およびb）24時間（0.25 mM u-¹³C¹⁵Nアミノ酸混合物）の、 および超音波処理および窒素によるパージのc）3時間後およびd）12時間後の立体異性化後のAQCタグ付きu-¹³C¹⁵N-メチオニン([u-¹³C¹⁵N-Met-AQC + H]⁺: m/z326.12015)およびそのAQCタグ付き酸化生成物u-¹³C¹⁵N-メチオニンスルホキシド-AQC ([u-¹³C¹⁵N-Met-(O)-AQC + H]⁺: m/z342.11506)およびu-¹³C¹⁵N-メチオニンスルホン-AQC([u-¹³C¹⁵N-Met-(O)₂-AQC + H]⁺:m/z 358.10998) の抽出イオンクロマトグラム(XIC) を示す。u-¹²C¹⁴N-ヒスチジン-AQC ([u-¹²C¹⁴N-His-AQC+ H]⁺: m/z 326.12531)は、u-¹³C¹⁵N-メチオニン-AQCと同重体（isobaric）であることに留意。エナンチオマー分離は、ポジティブイオン化モードのUHPLC-QTOF-ESI-MS法を使用したロングハイドロオーガニックデュアルグラジエント溶出を用いたChiralpak ZWIX(+) カラム (150 x 4 mm、3 μm)で行った。Chiralpak ZWIX(+)では、Pro-AQCを除いて、D-エナンチオマーはL-エナンチオマーよりも先に溶出する傾向があるので、Met(O)-AQCおよびMet(O)₂-AQCは想定されていたが、Metの溶出順序が確認された。サンプルの調製は、実施例１０に記載。

【図7】図７は、2.5 μLの注入量での、ポジティブイオン化モードのショートグラジエントUPLC-QTOF-ESI-MS法を用いたChiralpak ZWIX(+)カラム (150 x 4 mm、3 μm)を使用する、AQCタグで95℃で15時間立体異性化した後の極性u-¹³C-藻類の凍結乾燥細胞（Euroisotop、CLM-2065-05）抽出物のエナンチオマー分離を示す。対応するu-¹³C-アミノ酸の抽出イオンクロマトグラム(XIC)と、溶出したL-エナンチオマーとD-エナンチオマーのマススペクトルの抜粋を示す。エナンチオマー分離は、ポジティブイオン化モードのUHPLC-QTOF-ESI-MS法のショートグラジエント溶出を用いたChiralpakZWIX(+) カラム (150 x 4 mm、3 μm)で行った。グレーでハイライトされたm/z値はAQCタグ付きu-¹³Cアミノ酸と明確に識別された一方で、黒いイタリック体のm/z値は対応するAQCタグ付きu-¹²Cアミノ酸のものと類似していたことに留意。また、他の立体異性化したアミノ酸型化合物や非キラルな代謝物も発見された。データは示さず。サンプルの調製は、実施例１１に記載。

【図8】図８は、300Wで15分および30分のマイクロ波照射を使用した55℃および75℃での立体異性化後のフェニルアラニン-AQC([Phe-AQC + H]⁺: m/z336.13427)の抽出イオンクロマトグラム(XIC)を示す。95℃の場合、5分および15分のラセミ化時間は立体異性化タグの切断を示した。a）のXICは、AQCタグ付きPheの立体異性化と、それに続く0.2Mホウ酸ナトリウムバッファーでの1:10希釈後の結果を示す。b）のXICは、AQCで再誘導体化した後の対応するサンプル溶液の結果を示し、これは1:10希釈に類似している。エナンチオマー分離は、ポジティブイオン化モードのUHPLC-QTOF-ESI-MS法ロングデュアルグラジエント溶出を用いたChiralpak ZWIX(+) カラム (150 x 4 mm、3 μm)で行った。

【発明を実施するための形態】

【0011】

特に明記されていない限り、「含む（include）」、「含む（includes）」、「含む（including）」などの用語は、制限のないものであることが意図されている。したがって、例えば、「含む」は「含むがこれ限定されるものではない」を意味する。

【0012】

特に明記されていない限り、冠詞「a」、「an」、および「the」は「1つ以上」を意味する。

【0013】

本明細書において、用語「約」は定量化などの測定で生じる実験誤差の範囲を包含する。特に明記されていない限り、「約」という単語が前に付いているすべての数値は、示された数値が通常の実験誤差に応じて変化する可能性があることを特定するものとする。ある態様において、用語「約」は、示された数値の+/- 20％、より好ましくは+/- 10％、+/-5％、そして、最も好ましくは示された値の+/- 2％以下の範囲を指すものとする。

【0014】

本明細書で単独でまたは別の基の一部として使用される「アルキル」という用語は、いくつかの実施形態では、鎖長が特に制限されない限り、最大５０、４０、３０、２０、好ましくは１０個の炭素の直鎖および分枝鎖飽和ラジカルの両方、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを指す。

【0015】

したがって、本発明は第１の態様において、キラル化合物を立体異性化（ラセミ化またはエピマー化）するための方法によって規定され、該方法は次の工程を含む：
(a) 次を含む混合物を提供する工程：
(aa) 少なくとも1つの不斉炭素原子を含むキラル化合物、
(bb) 立体異性化タグ、および
(cc) 任意で、混合物のpHを、塩基性または酸性pH、より好ましくは約7から約10のpHなどの好ましい値に調整するバッファー、
任意で、混合物中のラセミ化タグのモル濃度がキラル化合物のモル濃度よりも高いものであり、および、
(b)キラル化合物の立体異性化（またはエピマー化）を起こすのに十分な時間、混合物を十分な温度に加熱する工程。

【0016】

いくつかの態様において、バッファーはホウ酸塩バッファーであることが好ましく、さらにより好ましくは、ホウ酸塩バッファーのモル濃度は約0.4Mであり、使用されるホウ酸塩バッファーのpHは、好ましくは約pH8である。

【0017】

本発明のいくつかの態様において、混合物中のラセミ化タグのモル濃度は、キラル化合物のモル濃度よりも高い。あるいは他の態様において、混合物中のラセミ化タグのモル濃度は、キラル化合物のモル濃度以下である。

【0018】

１つの好ましい態様において、キラル化合物は次の式(I)を有する。

【化1】

式中、R₁、R₂、およびR₃の基は化学的に同一ではなく、環を形成してもよく、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基または尿素基からなる群から独立して選択されるものであって、R₁、R₂、およびR₃のそれぞれは、1つまたは複数の同位体標識された原子が含まれてもよい。さらに、R₄、C、およびNは、同位体標識されていても、されていなくてもよい。R₄は任意の基でよいが、好ましくは、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基または尿素基からなる群から選択されてよく、1つまたは複数の同位体標識された原子が含まれてもよい。

【0019】

本発明のいくつかの例にとしては、6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）タグ付けされたタンパク質構成アミノ酸、異常アミノ酸、およびグルタミン、アスパラギン、テアニン、およびシトルリン、トリプトファンの分解を伴わない側鎖を含むアミド結合の脱アミド化を伴わないジペプチドおよびトリペプチドの穏やかなN末端のエピマー化が挙げられる。さらに、この方法では、規定量のCN-同位体標識D-アミノ酸を含むCN-同位体標識キラルアミノ酸混合物を調製することができ、この混合物は、様々なレベルのD-アミノ酸を含む異なるサンプルタイプの内部標準として使用することができる。さらに、異常アミノ酸、アロイソロイシン、アロテオニン、テアニン、シトルリン、およびヒドロキシルプロリンの立体異性化（エピマー化およびラセミ化）や、ジペプチド、トリペプチドのN末端エピマー化を示す。また、本発明では、統合された（unified）(u)-¹³C,¹⁵N標識藻類凍結乾燥細胞について示されているように、細胞抽出物中で直接タンパク質構成アミノ酸と異常アミノ酸のエピマー化が可能であり、それによりキラルなアミノ酸や類似体を含む生体・診断サンプルの正確な定量のための内部標準となる、キラルな同位体で標識された細胞抽出物を調製することができる。さらに、本発明では、u-¹³C, ¹⁵N-メチオニンスルホキシドおよびu-¹³C,¹⁵N-メチオニンスルホンに示されるように、前記アミノ酸およびアミノ酸類似体のキラルな分解物および酸化物を調製することができる。

【0020】

いくつかの好ましい態様において、立体異性化は、酸または塩基の存在下で行われる。他の好ましい態様において、混合物は、酸または塩基を含む。他の態様では、反応は不活性ガス環境下（または大気中）で行われる。

【0021】

用語「立体異性体」とは、分子式と結合原子の配列（構成）は同じだが、空間における原子の3次元的な向きが異なるだけの異性体の分子を意味する。

【0022】

用語「立体異性化」は、ある立体異性体から別の立体異性体への立体変換が行われる工程、すなわち、立体異性体的にキラルな化合物が、ある立体構造から別の異なる立体構造に変換される工程を指す。

【0023】

本明細書で使用される用語「エピマー化」は、光学活性化合物中の２つ以上のキラル中心のうち、１つがその配置を変化させる工程を指す。

【0024】

用語「ラセミ化」は、前述のようなキラル化合物の立体異性化工程であって、最終的にキラル化合物の２つのエナンチオマー（50：50の比率）のラセミ混合物を得ることを目的とする工程を指すものとする。

【0025】

用語「不斉中心」は、キラル化合物中の原子で、２つの基が入れ替わると立体異性体になるような基を持つ原子を意味するものとする。

【0026】

用語「不斉炭素原子」は、キラル化合物の中で、不斉中心となる炭素原子のことを指すものとする。

【0027】

用語「エナンチオマー」は、重ね合わせることができない（同一ではない）鏡像である２つの立体異性体のうちの１つを意味する。したがって、エナンチオマーのグループは、より大きなグループであるキラル化合物の立体異性体のサブグループとなる。

【0028】

用語「ラセミ混合物」または「ラセミ体」は、１つのキラル中心に関してキラル分子の左巻きと右巻きのエナンチオマーが同量である立体異性体の混合物を意味する。一方、用語「エピマー混合物」は、２つ以上のキラル中心の存在下で１つのキラル中心に関してキラル分子の左巻きと右巻きのエナンチオマーの量が等しくない立体異性体の混合物を指す。さらに、用語「立体異性体混合物」は、１つまたは複数のキラル中心の存在下で左巻きおよび右巻きのエナンチオマーの量が等しいかまたは等しくない立体異性体の混合物を指す。

【0029】

用語「異性体」は、化学結合構造と合計式が同じであるが、分子内の原子の配置が異なり、特性が異なる２つ以上の化合物のそれぞれを意味する。したがって、異性体のグループは、上記で定義された立体異性体およびエナンチオマーのより特定されたグループを包含する。

【0030】

用語「ジアステレオマー」は、キラリティーの中心が２つ以上ある立体異性体を意味し、ジアステレオマーは、互いに鏡像ではない分子である。

【0031】

用語「エピマー」は、立体異性体のペアの１つである分子に関係するものとする。２つの異性体は、２つ以上の不斉中心のうちの１つだけで配置が異なる。

【0032】

本明細書で使用される用語「アルキル」は、1～40個の炭素原子の分岐または非分岐飽和炭化水素基であり（炭素原子のより狭い範囲は、本明細書では「Cx-Cyアルキル」として指定されてよく、xおよびyは整数である）、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、またはテトラデシル等が挙げられる。アルキル基は置換または非置換であってよく、指定されていない場合はいずれかとして解釈されるべきである。用語「非置換アルキル基」は、炭素と水素だけで構成されるアルキル基として本明細書で定義される。用語「置換アルキル基」は、アリール基、置換アリール基、ヘテロ芳香族基、置換ヘテロ芳香族基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、尿素基、グアニジン基、エステル、アルデヒド、ケトン、ヒドロキシル基、アルコキシ基、チオール基、チオアルキル基、またはハロゲン化物、ハロゲン化アシル、アクリレート、またはビニルエーテルを含むがこれらに限定されない基で置換された１つ以上の水素原子を有するアルキル基として本明細書で定義される。例えば、アルキル基は、アルキルヒドロキシ基であってよく、アルキル基の水素原子のいずれかがヒドロキシル基で置換されている。

【0033】

本明細書で定義される用語「アルキル」 はシクロアルキル基を含む。本明細書に記載の用語「シクロアルキル基」は、少なくとも３つの炭素原子、およびいくつかの態様では３から２０個の炭素原子から構成される非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルキル基の例としては、これに限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含む。用語シクロアルキル基は、環の炭素原子の少なくとも１つが、窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるがこれらに限定されないヘテロ原子で置換されているヘテロシクロアルキル基をも含む。

【0034】

本明細書で使用される用語「芳香族基」は、任意の「アリール基」であり、ベンゼン、ナフタレンなどを含むがこれらに限定されない任意の炭素ベースの芳香族基に関係することを意味する。用語「アリール基」は、「ヘテロアリール基」としても知られる「ヘテロ芳香族基」をも含み、芳香族基の環内に少なくとも１つのヘテロ原子が組み込まれている、少なくとも３つの炭素原子から構成される芳香族環を意味する。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれるが、これらに限定されない。アリール基は、置換または非置換であり得る。アリール基は、本明細書で定義される、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアルコキシを含むがこれらに限定されない１つ以上の基で置換することができる。いくつかの態様において、用語「アリール基」は、３から３０個の炭素原子を有する置換または非置換のアリールおよびヘテロアリール環に限定される。

【0035】

用語「カルボキシル基」は、酸素原子に二重結合し、ヒドロキシル基に単一結合した炭素原子からなる有機官能基を指す。したがって、「カルボキシル基」は、式CO₂Hの有機官能基を指す。誤解を避けるため、用語「カルボキシル基」は、例えば、アルデヒドまたはケトンなどの、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）を含む他の有機官能基は含まない。

【0036】

本発明の用語「ホスホン酸基」は、次の構造：-PO（OH）₂を有する化学基を指す。 したがって、本発明では、本発明の好ましい態様において、ホスホン酸基は、-PO(OH₂)基が炭素原子に共有結合していると定義できる。例えば、それらがキラル炭素原子または非キラル炭素原子（ホスホアミノ酸）上の水素原子またはカルボン酸基を置き換えるため、または言い換えれば、-PO（OH₂）基は、本明細書で定義されるように、脂肪族ラジカルもしくは基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロ基またはアリール基の置換基であるためである。

【0037】

用語「スルホン酸基」は、スルホン酸またはスルホン酸基が結合している、本明細書で定義される、アルキル基を指す。

【0038】

用語「エステル基」、「アミド基」、「カルバメート基」、「尿素基」は、当業者によく知られている本技術分野におけるそれらの一般的な意味に従って理解されるものとする。

【0039】

工程(b)の加熱は、(b.1) 混合物を約50～約200℃の温度に30分～24時間加熱する工程；または(b.2)混合物を、約200～約400Wのマイクロ波で、約50～約300℃、より好ましくは約50～約150℃の温度で、1分～6時間、好ましくは約2分～約120分処理する工程、により行うことができる。混合物の加熱には、当業者に知られているあらゆる手段を用いることができるが、好ましくはヒートブロックやサーモシェーカーを用いることが含まれる。より好ましくは、工程(b.1)での加熱は、約55℃～約95℃の温度範囲で行われる。

【0040】

いくつかの好ましい態様において、本発明の方法は、工程a)の後であるが、工程b.1)の前、それぞれ処理工程b.2)混合物を脱気するさらなる工程を含み、好ましくは混合物の脱気は超音波処理および／または窒素、ヘリウムまたはアルゴンでパージし、反応溶液を不活性ガス、好ましくは窒素またはアルゴンで覆うことによる。

【0041】

上記のステップ(a)項目(cc)で示された混合物のpHを調整するためのバッファーは、それぞれのpHを調整するためのバッファーを直接添加することによって実現され得る、あるいは、pHは、外部バッファーを使用せずに混合物内で直接調整できることが理解されるべきである。混合物を約8未満のpH値、例えば約7のpH値に調整するために、約0.4 Mのホウ酸ナトリウムバッファーなどのホウ酸バッファーを使用することが好ましい。本発明の好ましい態様では、約0.4Mのホウ酸塩バッファーを使用して混合物を約8のpHに調整する。

【0042】

本発明に関し「立体異性化タグ」は、キラル化合物の立体異性体の混合物から特定の立体異性体を生成するために使用できる任意の化合物でなければならないが、好ましくは、本発明のラセミ化タグの立体異性化タグは、以下の化合物A₁～A₉からなる群から選択される少なくとも１つの化合物に由来するか、または、その化合物を含むか、またはその化合物からなる。

【化2】

式中、R₅、R₆、R₈およびR₁₂は、それぞれ独立して、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基、または尿素基からなる群から選択され、任意で１つまたは複数の同位体標識された原子を含み、
HalおよびOSu は脱離基であり、
R₇およびR₉は、N、O、S、もしくはSe、またはそれらの同位体から独立して選択してよく、
Xは、N、O、S、Se、Cまたはそれらの同位体であってよく、
Yは、C、S、P、Se、またはそれらの同位体であってよく、
さらに、式A₁～A₉において、残りのNまたはCのそれぞれは、それぞれ¹⁴N、¹²C、またはNおよびCの同位体であってよい。

【0043】

本発明の１つの好ましい態様において、ラセミ化タグは、化合物A₁およびA₄のうちの１つまたはそれらの混合物を含むか、またはそれらからなる。

【0044】

本発明の最も好ましい態様では、ラセミ化タグは、アミノフェニル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AC）、3-アミノピリジルN-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（APC）、および最も好ましくは6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートから選択される。

【0045】

一般的には、キラル化合物の種類は何ら制限されない。多くの異なる構造の立体異性化（エピマー化またはラセミ化）に対する本発明の適用性は、添付の実施例に示されている。しかしながら、好ましくは、本発明による立体異性化（エピマー化、ラセミ化）分子は、アミノ酸、好ましくはタンパク質構成アミノ酸からなる群から選択されるが、非タンパク質構成アミノ酸、非リボソーム性アミノ酸および合成アミノ酸、ならびにメチオニンスルホキシドおよびメチオニンスルホンなどのホスホアミノ酸およびその酸化・分解生成物などのアミノ酸類縁体を含む。さらに本発明は、その末端に遊離アミノ基を有するペプチド、そのN末端にアミノ基を有するタンパク質、またはそれらの混合物を含むものであって、それぞれの化合物は、少なくとも１つの同位体標識された原子を含んでよい。

【0046】

さらなる好ましい態様において、キラル化合物は、スルホンアミド基、アミド基、尿素基、カルバメート基、またはインドール基などの熱、酸、および／またはアルカリに不安定な置換基を含む。

【0047】

本発明のいくつかの態様において、混合物は、少なくとも１つの溶媒をさらに含む。本発明の反応に使用するのに適した溶媒には、キラル化合物およびラセミ化タグが反応温度で実質的に可溶性である溶媒が含まれる。適した溶媒の非限定的な例は、従来の有機溶媒であり、例えば、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、アセトン、アセトニトリル、メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジエチルエーテル、およびC1～C4アルコール、トルエン、ならびに水および前述の混合物である。特に好ましい溶媒は水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、THF、DMSO、DMFからなる群から選択され、最も好ましくは、水またはアセトニトリルである。任意の態様において、好ましくは、溶媒は、たとえば²Hを使用して同位体標識されている。.この態様は、キラル化合物が、立体異性化（エピマー化またはラセミ化）工程中にそのキラル中心で同位体標識されるので、有利である。さらに、アミノ酸、例えば、Glu、Asp、Gln、Asn、およびTyr は２つの追加の重水素イオンによってさらに標識される(米国特許3,699,159参照 (発明者 Irving Putter、譲受人Merck Co Inc; 17 Oct.1972; 本文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる). さらに、¹⁸Oを含む同位体標識溶媒を使用すると、エピマー化工程中に、例えば、Met(¹⁸O)やMet(¹⁸O)₂などのキラル化合物の¹⁸O標識酸化生成物がさらに生成される。

【0048】

本発明の方法では、好ましくは、それぞれのキラル化合物が溶解しているマトリックス溶液は、酸性溶液、例えば、0.1M HCl、単なる非限定的な例としてu-¹³C¹⁵N-代謝アミノ酸混合物の場合、バッファー溶液、例えば、0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー（pH8.0）または生物学的マトリックス溶液、例えば、u-¹³C藻類凍結細胞抽出液）などである。

【0049】

いくつかの態様において本発明の方法は、立体異性化（エピマー化またはラセミ化）工程は、空気および／または酸素の存在下で行われるため、それぞれのキラル化合物の追加の酸化および分解生成物が発生することを包含する。さらに、同位体で標識された溶媒を用いて酸化および分解を行うことができる。生成された酸化生成物や分解生成物は、1つ以上の同位体標識された実体を含み、追加の不斉中心が生成されていてもいなくてもよい。例えば、空気および／または酸素の存在下、溶液中のu- ¹³C,¹⁵N-Met単独または混合物の一部として、溶媒の一部として²H₂ ¹⁸OまたはH₂ ¹⁸Oの存在下で行われるエピマー化は、u- ¹³C¹⁵N-Met-S¹⁸Oの形成をもたらし、硫黄原子は酸化工程中にキラリティーを獲得したため、キラル化合物は追加の不斉中心を獲得した。さらにまた、u- ¹³C¹⁵N-Met-S¹⁸O₂が形成されることがあるが、この場合、立体異性化（エピマー化またはラセミ化）工程の後に、不斉中心の数が増加することはない。

【0050】

いくつかの態様において、立体異性化（エピマー化またはラセミ化）の方法は、キラル化合物を活性化して以下の式(IIa)の化合物を得る工程を含み得る：

【化3】

式中、R₇は、N、O、S、もしくはSe、またはそれらの同位体から選択してよく、あるいは以下の化合物(II)および化合物 (III)のいずれかが好ましい：

【化4】

【化5】

ここで、本方法では、立体異性化タグは、以下の化合物の少なくとも１つを含む

【化6】

式中、R₁₁およびR₁₂は、水素、直鎖または分岐アルキル基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、エステル基、アミド基、カルバメート基または尿素基からなる基から独立して選択され、任意で１つまたは複数の同位体標識原子を含む。

【0051】

式A₁～A₉の活性化された立体異性化タグを用いる戦略と、式(IIa)またはより具体的には式(II)および／または(III)の活性化されたエナンチオマーと式A₁₀～A₁₃の非活性化された立体異性体を組み合わせる戦略の両方が、式(IV)の同じ中間体を提供する。さらに、本発明は、中間体構造（IV）を生成することを含む方法、および上記定義の置換基を持つ中間体自体に関する。

【化7】

【0052】

いくつかの態様において、立体異性化（エピマー化またはラセミ化）工程の完了後、立体異性化（エピマー化またはラセミ化）された化合物から立体異性化タグを除去することがさらに好ましい。立体異性化（エピマー化またはラセミ化）された化合物からの立体異性化タグの完全な切断は、例えば、マイクロ波照射または同等の手段で行うことができ、単なる非限定的な例として、95℃で5分間のマイクロ波照射が挙げられる。立体異性化タグの切断生成物の除去は、逆相クロマトグラフィーによってクロマトグラフィー的に行うことができる。生成した立体異性体に立体異性化タグを付与したもの、または立体異性化タグを付与していないものについて、キラル分離を行い、精製された立体異性体（またはエナンチオマー）を得ることができる。複雑な多成分混合物の場合、立体異性化タグを用いた立体異性体の非キラル分離は、最新の技術による逆相クロマトグラフィーで行うことができ、一方、立体異性化タグのない立体異性体の非キラル分離は、最新の技術によるHILICクロマトグラフィーで行うことができる。立体異性化タグを用いた立体異性体のキラル分離は、キラルカラムChiralPAK ZWIX(+)、ChiralPAK ZWIX(-)、ChiralPAK QNAX、ChiralPAK QDAXを用いて行うことができる。立体異性体の複雑な混合物の場合には、非キラルとキラルの分離を組み合わせた2D-LC法も可能である。表面に結合した立体異性化タグの場合、上述のように、表面に結合した立体異性化タグを切断した後、立体異性化した（エピマー化したまたはラセミ化した）生成物を、追加の精製工程なしに、溶液中で直接得ることができる。

【0053】

(i)キラル化合物および／または(ii)ラセミ化タグは、安定、メタ安定、または不安定な同位体で同位体標識されており、さらに別の実施形態も好ましい。同位体は、好ましくは¹¹C、¹²C、¹³C、¹⁴C、¹⁴N、¹⁵N、¹⁶O、¹⁷O、¹⁸O、³²S、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se、⁷⁹Se、⁸⁰Se、⁸²Se、³¹P、³²P、³³P、¹²³I、¹²⁷I、¹²⁹I、¹³¹I、¹³⁵I、¹⁸F、¹⁹F、¹H、²Hおよび³Hから選択され、最も好ましくは同位体は¹²C、¹⁴N、¹⁶O、³²S、³¹P、¹²⁷I、¹⁹Fおよび¹Hから選択され、使用される。

【0054】

本発明の方法は、単純なキラル化合物の立体異性化（エピマー化やラセミ化）の利用に限定されるものではなく、複数の不斉中心を持つ化合物の立体異性体を生成する可能性も含むものとする。したがって、いくつかの好ましい態様において、キラル化合物は、1つまたは複数の、例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上の、不斉中心を含む。複数の不斉中心の１つのみをラセミ化タグのさらなる標的とすることにより、このようなより複雑なキラル化合物を選択的にエピマー化することができる。本発明の方法の別の有利な点である。

【0055】

本発明の方法では、立体異性化タグが、例えば、粒子、樹脂、モノリス、膜、または平面などの基質に結合していることが好ましい場合がある。典型的なビーズや樹脂は、ポリマー粒子、シリカゲル粒子、ナノ粒子、ナノロッド、磁気ビーズなどを含み、または、平面は、ウェルプレート、カートリッジ、ピペットチップ、マイクロチップまたは他の管状構造物の内表面を含む。

【0056】

本発明の別の態様は、 上記式（I）に示される1つ以上の不斉中心を有するキラル化合物の不斉中心Cに関する（Ｓ）立体異性体の製造方法に関し、該方法は、本発明による立体異性化（エピマー化またはラセミ化）の方法を行うことを含むものであって、式（I）に示されるキラル化合物の不斉中心Cは（Ｒ）配置である。したがって、本発明は、（Ｒ）立体異性体を（Ｓ）立体異性体に変換する方法を提供する。例えば、この変換は、（Ｒ）エナンチオマーまたはジアステレオマーから（Ｓ）エナンチオマーまたはジアステレオマーへの変換であってもよい。

【0057】

本発明の別の態様は、請求項１に記載の式（I）に示される1つ以上の不斉中心を有するキラル化合物の不斉中心Cに関する（Ｒ）立体異性体の製造方法に関し、該方法は請求項１～１５のいずれか１の方法工程を行うことを含むものであって、式（I）のキラル化合物の不斉中心Cが（Ｓ）配置である。したがって、本発明は、（Ｓ）立体異性体を（Ｒ）立体異性体に変換する方法を提供する。例えば、この変換は、（Ｓ）エナンチオマーまたはジアステレオマーから（Ｒ）エナンチオマーまたはジアステレオマーへの変換であってよい。

【0058】

本発明の方法を複数回連続して行うことで、1つの化合物の異なるキラル中心を標的とし、複雑さに関係なく、任意のキラル化合物の実質的にほぼすべての立体異性体を作ることができる。

【0059】

本発明の別の態様は、式（Ｉ）に示されるキラル化合物の事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物を生成する方法に関し、事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物は、式（Ｉ）に示されるキラル化合物の不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体（またはエピマー）の事前決定された比率Ｙを含むものであって、
事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物は、本発明による立体異性化（エピマー化またはラセミ化）のための方法の工程を実行することによって得られるものであり、および
本発明による方法における工程ａ）の混合物は、不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）立体異性体（またはエピマー）の比率Ｘのキラル化合物を含み、ここで、Ｘ＜Ｙであり、および

【0060】

工程（b.1）の温度および／または時間または工程（b.2）の電力（W）および時間は、十分な量の（Ｒ）立体異性体（またはエピマー）を（Ｓ）立体異性体（またはエピマー）に立体異性化（エピマー化）して、反応混合物中の（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体（またはエピマー）の事前決定された比率Ｙに到達するように選択され、そして、それにより事前定義された立体異性体（エピマーまたはラセミの）混合物を取得する。

【0061】

本発明の別の態様は、式（Ｉ）に示されるキラル化合物の事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物を生成する方法に関し、事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物は、式（Ｉ）に示されるキラル化合物の不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体（またはエピマー）の事前決定された比率Ｙを含むものであって、
事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物は、本発明の立体異性化（エピマー化またはラセミ化）のための方法の工程を実行することによって得られるものであり、
本発明による方法における工程ａ）の混合物は、不斉中心Ｃの（Ｒ）／（Ｓ）エピマーの比率Ｘのキラル化合物を含み、ここで、Ｘ＞Ｙであり、および
工程（b.1）の温度および／または時間または工程（b.2）の電力（W）および時間は、十分な量の（Ｒ）立体異性体（またはエピマー）を（Ｓ）立体異性体（またはエピマー）に立体異性化して、反応混合物中の（Ｒ）／（Ｓ）－立体異性体の事前決定された比率Ｙに到達するように選択され、そして、それにより事前定義されたラセミの混合物を取得する。
いくつかの好ましい態様において、エピマーはエナンチオマーであり、他の態様では、立体異性体（またはエピマー）は互いにジアステレオマーである。

【0062】

本明細書に記載される好ましい方法は、例えば、質量分析における内部代謝物コントロール（標準）として使用するために、事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物を生成するために使用される。.いくつかの態様では、立体異性体の混合物は、非ラセミ体の混合物、あるいはラセミ体の混合物である。

【0063】

さらに別の態様では、キラル化合物の事前定義された立体異性体の混合物を提供するものであって、該立体異性体の混合物は、本明細書で前述したように、事前定義されたエピマーの混合物を生成する方法によって得られる。

【0064】

さらに、生物学的サンプル中の１つまたは複数のキラル生物学的化合物を検出および／または定量化する方法における、本発明による事前定義された立体異性体（エナンチオマーまたはジアステレオマー）の混合物の使用が提供される。本明細書では事前定義された立体異性体の混合物は、検出、同定、および／または定量化の方法における内部標準として使用される。

【0065】

事前定義されたエピマーの混合物を生成するための上記の方法は、エピマーではない事前定義された立体異性体の混合物を生成するために使用することもでき、したがって、化合物の複数のキラル中心でそれらの構成が互いに異なる。しかしながら、そのようなより複雑な混合物は、本発明による立体異性化（またはエピマー化）の方法を複数回および／または酸素の存在下で単に実行することによって、本発明の方法によって容易に得ることができる。例えば、最初に第１のキラル中心で立体異性体を生成し、次にそのように生成された立体異性体を使用して、そこから別のキラル中心（第１のキラル中心と等しくない）に関して第２の立体異性体を生成し、それにより複雑な立体異性体化合物を生成する。したがって、この多段階工程の最初の生成物（educt）と最終生成物は、互いに立体異性体であるが、複数のキラル中心で構成が異なり、したがって、互いのエピマーではない。例えば、最初に第１のキラル中心で立体異性体（またはエピマー）を生成し、次にそのように生成された立体異性体（またはエピマー）を使用して酸素の存在下でエピマー化を実行すること、別の不斉中心（第１の不斉中心と等しくない）を生成することにより、そこから第２の立体異性体（またはエピマー）を生成すること。これは、メチオニンからメチオニン－スルホキシドへの酸化的立体異性化（エピマー化）中に起こり、硫黄原子に２番目のキラル中心を生成する。

【0066】

いくつかの態様において、事前定義された立体異性体（またはエピマー）の混合物は、同位体標識された内部標準であることが好ましい場合がある。このような標準は、特に、例えば質量分析を使用して、天然に存在する立体異性化合物を定量化するための方法において有用である。本発明による検出、同定および／または定量化の方法は、好ましくは、イメージングベースの技術、核磁気共鳴（NMR）法、あるいは、質量分析（MS）法であり、好ましくは、大気圧化学イオン化（APCI）、大気圧光イオン化（APPI）、エレクトロスプレーイオン化（ESI）、誘導結合プラズマイオン化（ICP）、化学イオン化（CI）、電子衝撃（EI）、高速原子衝撃（FAB）、電界脱離／電界イオン化（FD/FI）、サーモスプレーイオン化（TSP）、マトリックス支援レーザー脱離（MALDI）、さまざまな質量分析計とハイフンでつなぐもの、例えば、シングル四重極、トリプル四重極-MS（TripleQuad-MS）、イオントラップ（IT-MS）、OrbitrapベースのMS、トリプル四重極線形イオントラップ（QTRAP-MS） 、飛行時間型MS（TOF-MS）、四重極飛行時間型MS（QTOF-MS）、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析（FT-ICR-MS）から選択されるMS法イオン化である。

【0067】

本発明の別の態様は、対象からの生物学的サンプル中のキラル化合物（分析物）の（R）-および／または（S）-立体異性体を検出、同定および／または定量化する方法を提供するものであって、(a)内部標準として、前述のような事前定義された立体異性体の混合物を生物学的サンプルに追加することによってサンプルを準備する工程、(b)例えば質量分析器を使用して、前記立体異性体の存在について溶離液を分析する工程、を含む。 好ましい態様において、立体異性体は、エナンチオマー、エピマー、またはジアステレオマーである。

【0068】

本明細書によれば、生物学的サンプルは、少なくとも１つの生体分子を含む任意の非細胞または細胞サンプルから選択することができる。好ましくは、細胞サンプル、例えば、細菌、古細菌、などの任意の原核細胞または真核細胞、真菌、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞などの単細胞または多細胞真核細胞を含むサンプルである。より好ましくは、サンプルは、ホモジナイズされた組織サンプルなどの十分な液体であるか、または唾液、汗、尿、血液、血清、血漿、髄液、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される体液である。好ましい態様において、生物学的サンプルは、マウス、ラット、またはヒトのサンプルなどの哺乳類のサンプルである。最も好ましくは、患者から得られたヒトサンプルである。

【0069】

本発明による定量化のための方法は、好ましくは、対象（例えば、ヒト患者）における障害を診断する際に使用するためのものであってよく、好ましくは、該障害は、対象のサンプルにおける一定量の立体異性体の存在の有無によって特徴付けられる。本発明によって生成された事前定義された立体異性体の混合物は、診断される疾患に関連する立体異性体または立体異性体の比率の定量化中に内部標準として有利に使用される。本発明に関し、第１のキットは、同位体標識されたおよび／または非同位体標識されたタンパク質構成アミノ酸および／または異常アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはタンパク質および／または細胞抽出物（例えば、藻類、酵母、哺乳動物、細菌）および／またはホモジナイズされた組織サンプルおよび／または体液（例えば血漿）、好ましくはpH8でモル濃度0.4Mのバッファー溶液、立体異性化タグおよび溶媒、好ましくはアセトニトリル（立体異性化タグを可溶化するため）の混合物を有する溶液を含む。第２のキットは、本発明によって生成される立体異性体の０．５～５％、５～２５％および２５～５０％の好ましい立体異性体比範囲を有する立体異性化タグでタグ付けされたタンパク質構成アミノ酸のそれぞれの立体異性体の０．１から５０％の範囲である様々な立体異性体比を有する標準溶液を含む。第３のキットは、本発明によって生成される立体異性体の好ましい立体異性体比の範囲が０．５～５％、５～２５％および２５～５０％である立体異性化タグなしのタンパク質構成アミノ酸のそれぞれの立体異性体の０．１から５０％の範囲である様々な立体異性体比を有する標準溶液を含む。

【0070】

別の態様において、本明細書に記載の方法によって得られる立体異性体もまた、本発明の一部を形成する。

【0071】

本発明に関し、本発明者らは、単離または従来技術の方法論によって以前は得られなかった多種多様な立体異性体を初めて生成した。したがって、別の態様において、本発明は、少なくとも以下の立体異性体を提供する。

【0072】

以下の追加の化合物も本発明の一部を形成する：

【0073】

タンパク質構成アミノ酸：D-¹³C₅,¹⁵N-バリン、D-¹³C₆-ロイシン、 D-¹³C₆,¹⁵N-ロイシン、D-¹³C₆-イソロイシン、 D-¹³C₆,¹⁵N-イソロイシン、 DL-¹³C₆-イソロイシン、 DL-¹³C₆,¹⁵N-イソロイシン、 D-¹³C₅-メチオニン、 D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニン、 DL-¹³C₅-メチオニン、 DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニン、 D-¹³C₅-プロリン、 D-¹³C₅,¹⁵N-プロリン、DL-¹³C₅-プロリン、 D-¹³C₃-セリン、D-¹³C3,¹⁵N-セリン、 D-¹³C₄-トレオニン、 D-¹³C₄,¹⁵N-トレオニン、 DL-¹³C₄-トレオニン、 DL-¹³C₄,¹⁵N-トレオニン、 D-¹³C₃-システイン、 D-¹³C₃,¹⁵N-システイン、 D-¹³C₆-システイン、 D-¹³C₆,¹⁵N-システイン、 D-¹³C₉-フェニルアラニン、 DL-¹³C₉-チロシン、DL-¹³C₉,¹⁵N-チロシン、 D-¹³C₁₁-トリプトファン、 D-¹³C₁₁,¹⁵N₂-トリプトファン、 DL-¹³C₁₁-トリプトファン、 DL-¹³C₁₁,¹⁵N₂-トリプトファン、 DL-¹³C₅,¹⁵N-グルタミン酸、 D-¹³C₄,¹⁵N-アスパラギン酸、 DL-¹³C₄,¹⁵N-アスパラギン酸、 D-¹³C₅-グルタミン、 DL-¹³C₅-グルタミン、 DL-¹³C₅,¹⁵N-グルタミン、 DL-¹³C₅,¹⁵N₂-グルタミン、 D-¹³C₄,¹⁵N₂-アスパラギン、 DL-¹³C₄-アスパラギン、 DL-¹³C₄,¹⁵N-アスパラギン、 DL-¹³C₄,¹⁵N₂-アスパラギン、 D-¹³C₆-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N₂-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N₃-ヒスチジン、 DL-¹³C₆-ヒスチジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N-ヒスチジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₂-ヒスチジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₃-ヒスチジン、 D-¹³C₆,¹⁵N-リジン、D-¹³C₆,¹⁵N₂-リジン、DL-¹³C₆,¹⁵N-リジン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₂-リジン、D - ¹³C₆-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N₂-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N₃-アルギニン、 D-¹³C₆,¹⁵N₄-アルギニン、 DL-¹³C₆-アルギニン、 DL-¹³C₆,¹⁵N-アルギニン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₂-アルギニン、 DL-¹³C₆,¹⁵N₃-アルギニン、

【0074】

メチオニンからの酸化生成物：L-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁵N-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁵N,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(S))、L-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(S-(R))、D-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(S))、D-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(R-(R))、DL-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(S))、DL-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホキシド(RS-(R))、L-¹³C₅-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホン(S)、D-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁸O-メチオニンスルホン(RS)、L-¹³C₅,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(S), D-¹³C₅,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(R)、DL-¹³C₅,¹⁸O₂-メチオニンスルホン(RS)。

【0075】

トリプトファンからの分解生成物：L-¹³C₁₀,¹⁵N₂-キヌレニン、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-キヌレニン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₂-キヌレニン、L-¹³C₁₀,¹⁵N-キヌレニン、D-¹³C₁₀,¹⁵N-キヌレニン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-キヌレニン、L-¹³C₁₀-キヌレニン、D-¹³C₁₀-キヌレニン、DL-¹³C₁₀-キヌレニン

【0076】

異常アミノ酸: D-¹³C₆-アロイソロイシン、D-¹³C₆,¹⁵N-アロイソロイシン、DL-¹³C₆-アロイソロイシン、DL-¹³C₆,¹⁵N-アロイソロイシン、D-¹³C₄-アロトレオニン、D-¹³C₄ ¹⁵N-アロトレオニン、DL-¹³C₄-アロトレオニン、DL-¹³C₄ ¹⁵N-アロトレオニン、D-¹³C₄-ホモセリン、D-¹³C₄ ¹⁵N-ホモセリン、DL-¹³C₄-ホモセリン、DL-¹³C₄ ¹⁵N-ホモセリン、D-¹³C₄,¹⁵N-ホモシステイン、D-¹³C₄-ホモシステイン、DL-¹³C₄,¹⁵N-ホモシステイン、DL-¹³C₄-ホモシステイン、D-¹³C₈ ¹⁵N₂-ホモシステイン、D-¹³C₈ ¹⁵N-ホモシステイン、D-¹³C₈-ホモシステイン、DL-¹³C₈N₂-ホモシステイン、DL-¹³C₈N-ホモシステイン、DL-¹³C₈-ホモシステイン、D-¹³C₅,¹⁵N₂-オルニチン、D-¹³C₅,¹⁵N-オルニチン、D-¹³C₅-オルニチン、DL-¹³C₅,¹⁵N₂-オルニチン、DL-¹³C₅,¹⁵N-オルニチン、DL-¹³C₅-オルニチン、D-¹³C₆,¹⁵N₃-シトルリン、D-¹³C₆,¹⁵N₂-シトルリン、D-¹³C₆,¹⁵N-シトルリン、D-¹³C₆-シトルリン、DL-¹³C₆,¹⁵N₃-シトルリン、DL-¹³C₆,¹⁵N₂-シトルリン、DL-¹³C₆,¹⁵N-シトルリン、DL-¹³C₆-シトルリン、D-¹³C₅,¹⁵N-ノルバリン、D-¹³C₅-ノルバリン、DL-¹³C₅,¹⁵N-ノルバリン、DL-¹³C₅-ノルバリン、D-¹³C₆,¹⁵N-ノルロイシン、D-¹³C₆-ノルロイシン、DL-¹³C₆,¹⁵N-ノルロイシン、DL-¹³C₆-ノルロイシン、D-¹³C₄,¹⁵N-2-アミノ酪酸、D-¹³C₄-2-アミノ酪酸、DL-¹³C₄,¹⁵N-2-アミノ酪酸、DL-¹³C₄-2-アミノ酪酸、D-¹³C₄,¹⁵N-アミノ酪酸、D-¹³C₄-アミノイソ酪酸、DL-¹³C₄,¹⁵N-アミノイソ酪酸、DL-¹³C₄-アミノイソ酪酸、D-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(R)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(S)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(R)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(S)、D-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(R)、D-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(S)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(R)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₃-ヒプシン(S)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(R)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₂-ヒプシン(S)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(R)、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-ヒプシン(S)、D-¹³C₁₀,¹⁵N₃-デオキシヒプシン、D-¹³C₁₀,¹⁵N₂-デオキシヒプシン、D-¹³C₁₀,¹⁵N-デオキシヒプシン、D-¹³C₁₀-デオキシヒプシン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N₃-デオキシヒプシン、DL- ¹³C₁₀,¹⁵N₂-デオキシヒプシン、DL-¹³C₁₀,¹⁵N-デオキシヒプシン、DL-¹³C₁₀-デオキシヒプシン。

【0077】

いくつかの好ましい態様において、本発明の立体異性体は、本明細書の他の場所に記載されているように同位体標識することができる。別の態様において、ラセミ化タグの有無にかかわらず、本発明の立体異性体（上記表および／または上記の化合物）を含むエピマー、ラセミまたは非ラセミ組成物が提供される。

【0078】

薬学的に許容される担体および／または賦形剤とともに、本明細書に記載の立体異性体または任意の立体異性体混合物を含む、医薬組成物も提供される。

【0079】

例として、本発明の医薬組成物は、0.1％から100％（w/w）の活性成分（本明細書では、本発明の立体異性体または本明細書に記載の方法によって得られた立体異性体の本発明の混合物）、例えば、約0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％など、好ましくは、約1％から約20％、約10％から約85％（w/w）の剤（例えば、医薬投与と適合性がある、潤滑剤、徐放性ビヒクル、希釈剤、乳化剤、保湿剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤または抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など）を含んでよい。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野でよく知られている。従来の媒体または剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。補助剤も組成物に組み込むことができる。

【0080】

本発明（または本発明と一緒に使用するため）の医薬組成物は、典型的には、意図された投与経路と互換性があるように製剤される。投与経路の例としては、経口、非経口、例えば、髄腔内、動脈内、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）および経粘膜投与が含まれる。

【0081】

ある態様において、医薬組成物は、 本発明（または本発明と一緒に使用するため）の化合物の持続放出または制御放出のために製剤化される。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。材料（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含む）は商業的に入手することもでき、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、当業者に知られている方法に従って調製することができる。

【0082】

投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、経口、直腸または非経口組成物を剤形で製剤化することは特に有利である。本明細書で使用される剤形は、治療される対象の単一投与量として適した物理的に別個の単位を含み、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果および個人の治療のためにそのような活性化合物を配合する技術に内在する制限によって決定され、またそれに直接依存するものである。

【0083】

本発明の医薬組成物の例示的な単位剤形は、錠剤、カプセル（例えば、粉末、顆粒、マイクロ錠剤またはマイクロペレットなど）、懸濁液、または単回使用の事前充填された注射器である。ある態様において、キットは、単回投与の投与単位を製造するために提供される。キットは、乾燥した有効成分を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を含むことができる。あるいは、キットには、シングルチャンバーおよびマルチチャンバーの事前充填された注射器を含めることができる。

【実施例】

【0084】

本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。

【0085】

実施例１： AQCタグ付きトレオニンの調製と立体異性化

【0086】

試験溶液 0.25 mM L-Thr、L-aThr、DL-ThrおよびDL-aThr (10 μL) は、20 mMホウ酸バッファー（80 μL）および10 μL AQC（ACN中3 mg/mL）を使用して誘導体化し、サーモシェーカーを使用して95℃で18時間立体異性化した。抽出したイオンクロマトグラムを図１ｃに示す。

【0087】

実施例２：さまざまな立体異性化タグ（APC、ACおよびAQC）、およびさまざまな加熱方法（サーモシェーカーおよびマイクロ波）の比較

【0088】

0.25 mM u-¹²C¹⁴N-L-アミノ酸混合物と0.25mM u-¹³C¹⁵N-L-アミノ酸混合物を含むアミノ酸溶液を、立体異性化タグ3-アミノピリジルN-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（APC）、アミノフェニル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AC）および6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）溶液（10 μLのサンプル、80 μLの20 mMホウ酸バッファー、および10μLの立体異性化タグ（ACN中3mg/mL）を55℃で10分間加熱）で誘導体化した後、立体異性化は、サーモシェーカー（TS）を使用して95℃で18時間APCおよびACタグ付きサンプルに対して、マイクロ波照射（MW）を使用して75℃で15分間AQCタグ付きサンプルに対して実行した。すべてのサンプルは、分析前に10μLのそれぞれの立体異性化タグで再誘導体化された。 抽出イオンクロマトグラムを図２ａに示す。

【0089】

実施例３： L-シトルリン、L-テアニンおよびトランス-4-L-ヒドロキシ-プロリンの立体異性化

【0090】

異常アミノ酸、L-シトルリン、L-テアニンおよびトランス-4-L-ヒドロキシ-プロリンの0.25mM溶液を6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）溶液（10μLのサンプル、80μLの20 mMホウ酸バッファー、および10μLのAQC（ACN中3 mg/mL）を55℃で10分間加熱）で誘導体化した後、立体異性化は、サーモシェーカーを使用して95℃で18時間行った。すべてのサンプルは、分析前に10μLのAQCで再誘導体化された。 抽出イオンクロマトグラムを図２ｂに示す。

【0091】

実施例４：トリペプチド（L-Arg）-Gly-（L-Asp）の立体異性化

【0092】

70μLの0.2Mホウ酸バッファーに、10μLの2.5 mM（L-Arg）-Gly-（L-Asp）および20μLのAQC（ACN中3 mg/mL）を添加し、55℃で10分間加熱した。マイクロ遠心チューブを遠心分離にかけ、1分間超音波処理し、窒素ガスで覆った（30秒）。サーモシェーカーを用いて95℃で15時間立体異性化を行った。並行して、0.2 M重水素化ホウ酸バッファーを使用して同じ誘導体化手順を実行し、キラル中心で水素-重水素交換（HDX）を誘導した。20μLのAQCで立体異性化および再誘導体化した後、ACNで容量を100μLに調整した。抽出イオンクロマトグラムを図２ｃに示す。

【0093】

実施例５：立体異性化の結果に対する溶液中のpH値の影響

【0094】

pH値は、6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）による誘導体化前（n=5）、AQCによる誘導体化後、95℃で15時間の立体異性化後、n=4のサンプル溶液（赤のエラーバー）について、マイクロpH電極（Hanna Instruments Inc、Voehringen、GermanyのHI1083B）を使用して決定した。pH値8.8、8.5、8.0、7.5および7.0の180μLの0.2Mまたは0.4Mのホウ酸ナトリウムバッファーに、0.1 M HCl（0.50 μmol）中の10μLの2.5 mM u-¹²C,¹⁴N-L-アミノ酸（20アミノ酸すべての混合物）溶液を加え、続いて60 μLのAQC溶液（アセトニトリル中3mg/mL; 0.63μmol）で誘導体化した。95℃で15時間の立体異性化の前に、すべての溶液を1分間超音波処理し、窒素で1分間コーティングした。エナンチオマー分離は、ChiralPAK ZWIX (+)（150 x4 mm、3μm）カラムで、ショートグラジエント溶出法を使用して行った。抽出イオンクロマトグラムを図３ａに示す。

【0095】

実施例６： AQCタグ付けされたグルタミンの分解におけるpH値の影響

【0096】

AQCタグ付けされたグルタミンの立体異性化。誘導体化の前に、2.5mM L-グルタミンストック溶液（0.1 M HCl中）を10mM HCl、超純水および0.2 Mホウ酸バッファー（pH8.83）を使用して0.25 mMに希釈し、続いて超音波処理をし、空気を窒素に置き換えた。サーモシェーカーを使用した95℃で95℃の立体異性化の前後、pH測定（n=10）は、AQCの誘導体化（アセトニトリル溶液中、10μL 0.25 mM Gln、70μL 0.2 Mホウ酸バッファー、および20μL 3 mg/mL AQC、55℃で10分）後に実行された。抽出イオンクロマトグラムを図３ｂに示す。

【0097】

実施例７：時間と温度に依存する立体異性化パート１：

【0098】

80μLの20mMホウ酸バッファー（pH 8.8）に、0.025 mM u-¹²C¹⁴Nアミノ酸と0.025mM u-¹³C¹⁵Nアミノ酸を含む10μLのL-アミノ酸標準溶液、および10μL 6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC、ACN 中3mg/mL）を、エッペンドルフ(Hamburg、Germany)の1.5mLセーフロック反応チューブに加えた。以下の立体異性化条件を調査した（n=1）、10分（55℃、75℃および95℃）、30分（55℃、75℃および95℃）および1時間（55℃、75℃および95℃） 。Grant Instruments社（Shepreth、England）のGrant-bioPHMTサーモシェーカーのシェーカー速度を600rpmに設定した。室温に達した後、すべてのサンプルを遠心分離し、ACNで容量を100 μLに調整し、さらに処理せずに分析した。エナンチオマー分離は、ChiralpakZWIX(+)カラム（150 x 4 mm、3μm）で、ロングUHPLC-QTOF-ESI(+)-MS法を使用して実行した。結果は図４ａおよび図４ｂに示す。

【0099】

実施例８：時間と温度に依存する立体異性化パート２およびNMR溶媒研究：

【0100】

80μLの20mMホウ酸バッファー（pH 8.8）に、0.25 mM u-¹²C¹⁴Nアミノ酸と0.25mM u-¹³C¹⁵Nアミノ酸を含む10μLのL-アミノ酸標準溶液、および10μL 6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC、ACN 中3mg/mL）を、エッペンドルフ(Hamburg、Germany)の1.5mLセーフロック反応チューブに加えた。誘導体化は55℃で10分間行い、続いて遠心分離、1分間の超音波処理、および空気の窒素置換（30秒）を行った。以下の立体異性化条件を調査した（n=3）、95℃および600rpmで1時間、6時間および15時間。室温に達した後、すべてのサンプルを遠心分離し、容量を100μLに調整し、さらにAQCで誘導体化した (サンプル (A))、これは、0.025mMアミノ酸にサンプルを1:10に希釈したものに類似する。さらに、15時間のサンプルは、追加の再誘導体化を行わずに、0.2 Mホウ酸バッファーで1:10に希釈しただけである（サンプル（B））。結果は図４ｃおよび図４ｄに示す。

【0101】

アセトニトリル：水（1:2, (v/v)）中の飽和L-フェニルグリシン（PG）溶液(50 mg/mL; 15μL)を等モル量の6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC、ACN 中3mg/mL、478μL）で55℃で15分間誘導体化した。PG-AQCの精製は、バイナリーポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン、およびファクションコレクターを備えたAgilent 1100 HPLCシステムを用いて、AgilentのEclipse XDB-C18（4.6 x 150 mm, 5 μm）カラムによるC18逆相クロマトグラフィーで行い、移動相A（MPA）には0.01%のギ酸を水に溶かしたものを、移動相B（MPB）にはHPLCグレードのアセトニトリルを使用した。注入量は50 μLだった。回収したPG-AQCのピークフラクションをGeneVacで濃縮した。精製したL-PG-AQCをACN-d₃: D₂O (1:2)に溶解し、飽和溶液として保存した。以下の実験には、この飽和したL-PD-AQC溶液の100μLのアリコートを使用した。溶媒を変更する場合は、100 μLのL-PG-AQCをGeneVacで乾燥させた後、それぞれの溶媒または溶液に再懸濁した。

【0102】

a) ACN-d₃:D₂O (1:2)中、無処理の、精製されたL-PG-AQC；サンプル b) - h) は、95℃で12時間加熱したもので、これらの溶媒組成は異なる：b) ACN-d₃:D₂O（1:2）中のL-PG-AQC、c) ACN-d₃:D₂O（1:2）中の、0.2Mホウ酸ナトリウム-d₃バッファー（pH8.8）処理、d) ACN-d₃:D₂O（1:2）中の、0.5%のFA処理、e) DMSO-d₆中の、f)DMSO-d₆中の、0.2Mホウ酸ナトリウム- d₃バッファー（pH8.8）処理、g) DMSO-d₆中の4x10^-3% NaOD (w/v) 処理、およびh) DMSO-d₆中の、4x10^-5% NaOD (w/v) 処理。

【0103】

フェニルグリシン-AQC (PG-AQC)のキラル分離 は、UHPLC-QTOF-ESI(+)システムを用いて、ChiralPAK ZWIX(+)カラム(150 x 4 mm, 3 μm)で行った。移動相には、9.4mMのNH₄Faと9.4mMのFAを含むMeOH:H₂O(98:2)を、流速300 μL/min、カラム温度30℃で使用した。立体異性化の結果は、[PG-AQC+H]⁺および[PG-AQC-[²H)+H]+の抽出イオンクロマトグラム（XIC）、および検討した立体異性化条件でのHDX実験におけるD-PG-AQCの11.6分およびL-PG-AQCの12.5分でのマススペクトルによって可視化された。

【0104】

一般的に、酸や塩基が存在しない場合（例えば：例a）およびe））には、立体異性化は見られなかった。ギ酸などの酸や水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下では、立体異性化が見られた。溶媒の種類については、有機溶媒の水溶液やDMSOなどの有機溶媒でも立体異性化が見られた。立体異性化の結果は、bおよびh＜fおよびg＜cおよびdである。

【0105】

実施例９：同位体で標識されたu-¹³C¹⁵N-L-アミノ酸混合物の立体異性化

【0106】

6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC、ACN 中3mg/mL）で誘導体化し、95℃で6時間インキュベートした、0.025 mMのu-¹²C¹⁴N-L-アミノ酸を含む溶液 (20 天然アミノ酸、灰色)および 0.025 mM u-¹³C¹⁵N-L-アミノ酸(Euroisotop社製メタボロミクス用アミノ酸ミックス、Eurisotop社のAsn、Gln、Trpを含まない非標識標準品、黒) の立体異性化、保持時間の不一致およびピークエリアが低すぎるため、Cysを省略した。結果は図５に示す。

【0107】

実施例１０：同位体標識されたu-¹³C¹⁵N-DL-メチオニンスルホキシド（Met-(O)）およびu-¹³C15N-DL-メチオニンスルホン（(Met-(O)2）の調製

【0108】

超音波洗浄と窒素パージの後にa) 6時間および b) 24時間 (0.25 mM u-13C15N amino acid mixture)、およびfor c) 3時間および12時間、95℃の酸素存在下での立体異性化したときの、AQCタグ付きu-¹³C¹⁵N-メチオニン（0.025 mMのu-¹³C¹⁵N-およびu-¹²C¹⁴N-アミノ酸混合物中に存在）からの酸化生成物u-¹³C¹⁵N-メチオニンスルホキシド（Met-(O)）およびu-¹³C¹⁵N-メチオニンスルホン（Met-(O)₂）の調製。さらにAQCで誘導体化した後、エナンチオマー分離を行った。結果は図６に示す。

【0109】

実施例１１：キラル同位体標識u-¹³C-藻類細胞抽出物の調製

【0110】

10.33 mg u-¹³C-藻類凍結乾燥細胞（Euroisotop、CLM-2065-05）を1.5 mLマイクロ遠心チューブに量り取り、50μLのアセトニトリル：水（ACN：H₂O;1：1（v/v））で懸濁し、氷上で5分間インキュベートし、氷上で5分間超音波処理し、氷上でエッペンドルフペスティル（Eppendorf Pestile）でホモジナイズした後、950μLのACN：H₂O（1：1（v/v））を加え、1分間ボルテックスし、4℃で3000rpmで3x 30秒（チューブを180度回転）遠心分離した。上清を2mLマイクロ遠心チューブに移し、300μLのTBMEで抽出した（1分間のボルテックスと1分間の超音波処理）。脂質と葉緑素を含む最上層を別のチューブに移し、-20℃で保存した。前述のように、細胞ペレットをさらに3回抽出した。4回の抽出の水相をGeneVacで乾固させ、プールし、氷上での5分間の超音波処理と1分間のボルテックスにより、それぞれを100μLのACN：H₂O;1：4（v/v）に再懸濁した。 u-¹³C-藻類抽出物は-20℃で保存した。

【0111】

遠心分離後、10μLの極性抽出物を60μLの0.4 Mホウ酸バッファー（pH 8.00）に添加し、続いて30μLのAQC（ACN中3 mg/mL）を添加した。反応溶液を直ちに55℃、800rpmで10分間サーモシェーカーに置いた。AQC誘導体化抽出液を遠心分離し、1分間超音波処理し、窒素ガスで30秒間パージし、反応チューブをさらにパラフィルムで密封した。立体異性化反応は、サーモシェーカー上で95℃で15時間行った。室温に達した後、20μLのAQC（ACN中3 mg/mL）を添加し、抽出物を55℃で10分間加熱して、立体異性化プロセス中にAQCタグを失ったアミノ基を再誘導体化した。ポジティブイオン化モードのエナンチオマー分離にショートグラジエント溶出法を採用したZWIX (+)カラム（150 x 4 mm、3 μm）でのUPLC-QTOF-ESI-MS分析の前に、反応溶液の容量をアセトニトリルで100 μLに調整した。結果は図７に示す。

【0112】

実施例１２：ギ酸および水酸化ナトリウムの存在下での重水素化溶媒ACN：H₂O（1：2）およびDMSO中のフェニルグリシンの立体異性化

【0113】

アセトニトリル：水（1：2、（v/v））中の飽和L-フェニルグリシン（PG）溶液（50 mg/mL; 15μL）を、等モル量の6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC、ACN 中3 mg/mL、478μL）で55℃で15分間誘導体化した。PG-AQCの精製は、バイナリーポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン、およびファクションコレクターを備えたAgilent 1100 HPLCシステムを用いて、AgilentのEclipse XDB-C18（4.6 x 150 mm, 5 μm）カラムによるC18逆相クロマトグラフィーで行い、移動相A（MPA）には0.01%のギ酸を水に溶かしたものを、移動相B（MPB）にはHPLCグレードのアセトニトリルを使用した。注入量は50 μLだった。回収したPG-AQCのピークフラクションをGeneVacで濃縮した。精製したL-PG-AQCをACN-d₃: D₂O (1:2)に溶解し、飽和溶液として保存した。以下の実験には、この飽和したL-PD-AQC溶液の100μLのアリコートを使用した。溶媒を変更する場合は、100 μLのL-PG-AQCをGeneVacで乾燥させた後、それぞれの溶媒または溶液に再懸濁した。以下の立体異性化実験を行った：a) ACN-d₃:D₂O (1:2)中、無処理の、精製されたL-PG-AQC；サンプル b) - h) は、95℃で12時間加熱したもので、これらの溶媒組成は異なる：b) ACN-d₃:D₂O（1:2）中のL-PG-AQC、c) ACN-d₃:D₂O（1:2）中の、0.2Mホウ酸ナトリウム-d₃バッファー（pH8.8）処理、d) ACN-d₃:D₂O（1:2）中の、0.5%のFA処理、e) DMSO-d₆中の、0.2Mホウ酸ナトリウム- d₃バッファー（pH8.8）処理、g) DMSO-d₆中の4x10^-3% NaOD (w/v) 処理、およびh) DMSO-d₆中の、4x10^-5% NaOD (w/v) 処理。フェニルグリシン-AQC (PG-AQC)のキラル分離は、UHPLC-QTOF-ESI(+)システムを用いて、ChiralpakZWIX(+)カラム(150 x 4 mm, 3 μm)で行った。移動相には、9.4mMのNH₄Faと9.4mMのFAを含むMeOH:H₂O(98:2)を、流速300 μL/min、カラム温度30℃で使用した。 立体異性化の結果は、[PG-AQC+H]⁺ : m/z 322.11862および[PG-AQC-[²H)+H]+ : m/z 323.12489の抽出イオンクロマトグラム（XIC）、および検討した立体異性化条件でのHDX実験におけるD-PG-AQCの11.6分およびL-PG-AQCの12.5分でのマススペクトルによって可視化された。一般的に、酸や塩基が存在しない場合（例えば：例a）およびe））には、立体異性化は見られなかった。ギ酸などの酸や水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下では、立体異性化が見られた。溶媒の種類については、有機溶媒の水溶液やDMSOなどの有機溶媒でも立体異性化が見られた。立体異性化の結果は、bおよびh＜fおよびg＜cおよびdである。

【0114】

実施例１３：立体異性化タグのタグ付き立体異性体混合物の調製

【0115】

180 μLのホウ酸バッファー（好ましくはpH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）に、10 μLの2.5 mM L-アミノ酸混合物（0.50 μmol）および60 μLの立体異性化タグ（例えば、ACN中の3 mg/mL AQC; 0.63 μmol）を添加し（250μLで最終濃度0.1 mM）、すぐに55℃で10分間加熱した。遠心分離、30秒間の超音波処理、さらに30秒間の窒素によるパージの後、溶液を95℃で15時間立体異性化した。

【0116】

実施例１４：立体異性化タグのタグ付き単一立体異性体の調製

【0117】

160 μLのホウ酸バッファー（好ましくはpH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）に、20 μLの2.5 mM 単一L-アミノ酸混合物（50nmol）および20 μLの立体異性化タグ（例えば、ACN中の3 mg/mL AQC; 210 nmol）を添加し（200μLで最終濃度0.25 mM）、すぐに55℃で10分間加熱した。遠心分離、30秒間の超音波処理、さらに30秒間の窒素によるパージの後、溶液を95℃で15時間立体異性化した。AQCタグ付きアミノ酸の精製とAQC分解生成物6-アミノキノリン（AMQ）およびビス-アミノキノリン尿素の除去は、C18逆相クロマトグラフィーを介して実行した。

【0118】

実施例１５：精製された立体異性体タグ付きD-またはL-立体異性体の調製

【0119】

精製されたAQCタグ付き立体異性体アミノ酸の混合物は、ZWIX(+)カラム（150 x 4 mm、3 μm）を使用してさらに分離された。単一の立体異性体分離には、ショートグラジエント溶出法を使用したが、単純な多成分混合物には、ロンググラジエント溶出法を使用した。複雑な多成分混合物の場合、1次元での非キラルC18-RPクロマトグラフィーと2次元での立体異性体分離を組み合わせた2D-LC法が使用された。あるいは、Chiralpak ZWIX(-)、Chiralpak QNAX、またはChiralpak QD-AXカラムが使用できる。

【0120】

実施例１６：タグなしの立体異性体混合物の調製

【0121】

遠心分離後、立体異性化されたAQCタグ付き立体異性体溶液（実施例１３および１４）をマイクロ波チューブに移し、窒素でパージし、95℃で5分間300ワットで照射してAQCタグを切断した。非標識アミノ酸の精製およびAQC分解生成物6-アミノキノリン（AMQ）およびビス－アミノキノリン尿素の除去は、C18逆相クロマトグラフィーを介して行われた。精製および非標識アミノ酸分離は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を介して行うこともできることに留意。マイクロ波でAQCタグが除去された結果は図８に示す。

【0122】

実施例１７：精製されたタグなしD-および／またはL-立体異性体の調製

【0123】

精製された標識なしの立体異性体アミノ酸の混合物は、ZWIX(+)カラム（150 x 4 mm、3μm）を使用してさらに分離された。単一の立体異性体の分離には、ショートグラジエント溶出法を使用した。複雑な多成分混合物の場合、1次元の非キラルHILICクロマトグラフィーと2次元の立体異性体分離を組み合わせた2D-LC法を使用した。あるいは、Chiralpak ZWIX(-)が使用できる。

【0124】

実施例１８：キット構成1a

【0125】

キット1aは、 u-¹²C¹⁴N -タンパク質構成L-アミノ酸の混合物を含む標準溶液、同位体標識されたu-¹³C-およびu-¹³C¹⁵N -タンパク質構成L-アミノ酸の標準溶液、ホウ酸バッファー（好ましくはpH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）、立体異性化タグ、およびLC-MSグレードのアセトニトリルを包含する。

【0126】

実施例１９： キット構成1b

【0127】

キット1b は、u-¹²C¹⁴N-タンパク質構成DL-アミノ酸を含む標準溶液（好ましくは、立体異性体比の範囲は0.5～5％、5～25％、および／または25～50％のD-立体異性体）、立体異性タグのタグ付き同位体標識u-¹³C-またはu-¹³C¹⁵N-タンパク質構成DL-アミノ酸の標準溶液（好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲は0.5～5％、5～25％、および／または25～50％）、ホウ酸バッファー（好ましくは、pH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）、立体異性化タグ、LC-MSグレードのアセトニトリルを包含する。

【0128】

実施例２０：キット構成1c

【0129】

キット1cは、u-¹²C¹⁴N-タンパク質構成DL-アミノ酸を含む標準溶液（好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲は0.5～5％、5～25％、および／または25～50％）、ホウ酸バッファー（好ましくは、pH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）を有するまたは有さない、同位体標識されたu-¹³C-またはu-¹³C¹⁵N-タンパク質構成DL-アミノ酸の標準溶液（好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲は0.5～5％、5～25％および／または25～50％）、立体異性化タグ、およびLC-MSグレードのアセトニトリルを包含する。

【0130】

実施例２１：キット構成 2

【0131】

キット2は、1つまたは複数の立体異性タグのタグ付きu-¹²C¹⁴N- 異常L-またはD-またはDL立体異性体の標準溶液（好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲が0.5～5％、5～25％および／または25～50％）、ホウ酸バッファー（好ましくは、pH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）を有するまたは有さない、1つまたは複数の立体異性化タグのタグ付き同位体標識u-¹³C-またはu-¹³C¹⁵N-異常L-、D-またはDL-立体異性体の標準溶液（好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲が0.5～5、5～25％および／または25～50％で請求項Xに記載されている1つまたは複数の立体異性体の）、立体異性化タグ、およびLC-MSグレードのアセトニトリルを包含する。

【0132】

実施例２２：キット構成 3

【0133】

キット3は、1つまたは複数のu-¹²C¹⁴N-異常L-またはD-またはDL立体異性体の標準溶液（好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲が0.5～5％、5～25％および／または25～50％で請求項Xに記載されている1つまたは複数の立体異性体の）、ホウ酸バッファー（好ましくは、pH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）を有するまたは有さない、それぞれの同位体標識されたu-¹³C-またはu-¹³C¹⁵N-異常L-、D-またはDL-立体異性体（好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲が0.5～5％、5～25％および／または25～50％で請求項Xに記載されている1つまたは複数の立体異性体の）の1つまたは複数の標準溶液 、の）、立体異性化タグ、およびLC-MSグレードのアセトニトリルを包含する。

【0134】

実施例２３：キット構成 4

【0135】

キット4 は、ホウ酸バッファー（好ましくは、pH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）を有するまたは有さない、好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲が0.5～5％、5～25％および／または25～50％の、立体異性化タグがタグ付けされた同位体標識されたu-¹³C-またはu-¹³C¹⁵N-細胞抽出物（例えば、藻類、酵母、哺乳類、細菌）を含む溶液、立体異性化タグ、およびLC-MSグレードのアセトニトリルを包含する。

【0136】

実施例２４： キット構成5

【0137】

キット5は、ホウ酸バッファー（好ましくは、pH8.0の0.4Mホウ酸ナトリウムバッファー）を有するまたは有さない、好ましくは、D-立体異性体の立体異性体比の範囲が0.5～5％、5～25％および／または25～50％の、同位体標識されたu-¹³C-またはu-¹³C¹⁵N-細胞抽出物（例えば、藻類、酵母、哺乳類、細菌）を含む溶液、立体異性化タグ、およびLC-MSグレードのアセトニトリルを包含する。

【0138】

実施例２５：固体支持体に固定化されたラセミ化タグを使用したマイクロ波誘導ラセミ化

【0139】

メリフィールド樹脂0.5 g (0.69 mmol)に、50倍過剰(4.41 g、32.5 mmol)のＮ－アセチル－４－アミノフェノール（パラセタモール）を加えた。この混合物を水酸化カリウムのメタノール飽和溶液に加え、撹拌しながら60℃で4時間加熱した。続いて、樹脂を熱トルエンおよび熱メタノール（それぞれ３回）で洗浄し、多孔度４のガラス漏斗フィルターを通してろ過した。樹脂を60℃で一晩乾燥させた後、Ph. Eur. 8に記載されているように、パラセタモールから水性硫酸を用いて、還流と適度な撹拌の下で1時間かけて酢酸部分を切断した。修飾アミノ官能性樹脂を水で3回、メタノールで3回洗浄した後、60℃で一晩乾燥させた。

【0140】

最終工程で、2 mmol (0.5 g)のN,N’-ジスクシンイミジルカーボネート(DSC)を50 mLの乾燥アセトニトリル中の樹脂に加え、窒素下で１時間還流加熱した。固体支持体上の最終的な活性化ラセミ化タグを乾燥した無水アセトニトリルで3回洗浄し、乾燥アセトニトリル中で4℃で放置した。

【0141】

固体支持体に固定化された活性化ラセミ化タグへのアミノ酸の固定化は、0.25 mM [u-¹³C¹⁵N]-L-アミノ酸を含む0.25mM L-アミノ酸溶液10μLを4Mホウ酸バッファー（pH8.10）中の修飾支持体に添加することで行いシェーカー上で55℃で10分間加熱した。室温に達した後、このスラリーをガラス製マイクロ波チューブに移し、窒素で1分間パージした後、CEM社製ラボラトリーマイクロ波オーブンを用いて300Wおよび75℃に調整し、30分間ラセミ化した。ラセミ化後、電子レンジを300W、95℃に設定して5分間加熱することで、遊離したスカレミック（scalemic、非ラセミ）のアミノ酸を支持体から分離した。スラリーを遠心分離し、遊離の非誘導体化アミノ酸溶液をChiralpak ZWIX(+)カラム（150 x 3 mm、3μm）で、ポジティブイオン化モードのショートグラジエント溶出UHPLC-QTOF-ESI-MS法を使用して分析した。

【0142】

ヒドロキシスクシンイミジル
結果

【0143】

アミノ酸誘導体化試薬6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートは、アミノ酸やペプチドなどのアミノ機能性化合物や薬剤に、発色団や高感度のフルオロフォアを導入するために、一般的に広く使われている。本明細書に記載の立体異性化（エピマー化、ラセミ化）の方法は非常に簡単で、サンプルをAQCで誘導体化し、10分後に空気を不活性ガスに置換し、サーモシェーカーで30分から15時間、95℃で加熱する。エピマー化は、グルタミン、アスパラギン、またはトリプトファンを失うことなく行われる。D-アミノ酸レベルは、インキュベーション時間に依存する。D-アミノ酸レベルが1～5％必要な場合、95℃でのエピマー化時間は30分で十分であるといえる。インキュベーション時間を60分に増やすと、2～10％のD-アミノ酸を含む¹³C¹⁵N-標識アミノ酸標準混合物が得られ、6時間および15時間インキュベーションすると、D-アミノ酸のレベルがそれぞれ15～30％および20～45％に増加する。すべてのタンパク質構成アミノ酸、異常アミノ酸、およびペプチドのキラル分離は、ロイシン、イソロイシン、およびプロリンの重要なエナンチオマーペアを分離するために均一濃度溶出工程、続いて、グルタミン酸の重要なエナンチオマーペアに関して、他のすべてのアミノ酸を高速で溶出する二重溶出グラジエントを用いてキラル双性イオンChiralpak ZWIX(+)カラムを用いて行った。グラジエントを行っている間、0.2mL/minから0.5mL/minへの流量の増加、および水分含有量の増加により、アミノ酸が溶出される。ペプチドの分離では、グラジエント工程がわずかに変更されているが、移動相は変更されていない。本明細書では、柔軟性が向上し、近い将来、単純な立体異性化およびシュートアプローチで実行される非常に正確な定量的キラルアミノ酸メタボロミクス研究が容易になる、双性イオンChiralpak ZWIX(+)カラム用のユニバーサルキラル分離プロトコルと組み合わせた、天然および異常アミノ酸の望ましいD-アミノ酸組成とD-アミノ酸レベルを使用して、オーダーメイドの内部標準を生成するための簡単でシンプルな手順のパッケージを紹介した。

【0144】

本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない１つまたは複数の要素または制限がない状態で適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」等は、広範かつ制限なく読まれなければならない。さらに、本明細書で使用される用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定ではなく、示されおよび説明される特徴またはその一部の同等物を除外する意図なく使用されるが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。このように、本発明は例示的な実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された本明細書に具体化された発明の修正および変形は、当業者によって到達され得るものであり、そのような修正および変形は、本発明の範囲内とみなされる。

【0145】

材料と方法

【0146】

本研究で使用したすべての溶媒およびギ酸（FA）は、CarlROTH（Karlsruhe、Germany）の超LC-MSグレードのものだった。すべてのL-アミノ酸、DL-アミノ酸、L-アロ-イソロイシン、DL-イソロイシン、L-アロ-トレオニン、DL-アロ-テオニン、L-シトルリン、トランス-4-L-ヒドロキシプロリンおよび3-アミノピリジンは、 Sigma Aldrich、Schnelldorf（Germany）のものである。アニリンはMerck（Darmstadt、Germany）のものを使用した。Metabolomics Standard Mix（MSK-A2-1.2; 0.1MHCl中2.5mM）およびu-¹³C-Algal凍結乾燥細胞（CLM-2065-05）を含む2.5mM均一標識u-¹³C¹⁵Nアミノ酸の溶液 は、EuroisotopGmbH (Saarbruecken、Germany)のものを使用した。この¹³C¹⁵Nアミノ酸標準液には、アスパラギン、グルタミン、トリプトファンは含まれていないことに留意。自社で調製した¹²C¹⁴Nアミノ酸標準混合物の濃度も0.1M HCl中2.5mMだった。テアニンはTCI(Zwijndrecht、Belgium)のものを使用した。ELGA(Celle、Germany)のWater PurelabAnalytics Purification Systemを使用して水を精製した。窒素ガス5.0品質は、Westfalen Austria GmbH (Muenster、Germany)を使用した。6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC、AccQ）は、SynchemUG & Co. KG (Felsberg/Altenburg、Germany)から購入し、また、Steven Cohen (EP0533200A1)および De Antoniset.al. (AnalBiochem, 1994, 223, 191)によって自社で調製した。立体異性化タグ、アミノフェニル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AC）および3-アミノピリジルN-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（APC）はAQCで説明されているように調製された。立体異性化タグを使用した誘導体化反応は、Grant Instruments Ltd. (Shepreth、England)の1.5 mLマイクロ遠心チューブ（PSC24N）用のサーモシェーカーPHMTGant-bioで行った。一方、立体異性化反応は、蓋を使用しないPeqlab(Erlangen、Germany)の1.5mLマイクロ遠心チューブ用のサーモシェーカーpeqlab thrillerを使用して行った。誘導体化には、Starlab(Hamburg、Germany)の1.5 mL クリスタルクリアマイクロ遠心チューブを使用した。立体異性化には、Sigma-Aldrich Schnelldorf (Germany)から購入したエッペンドルフ（登録商標） セーフロック1.5mLマイクロ遠心チューブをさらにチューブを密封するためにパラフィルムと組み合わせて使用した。あるいは、立体異性化には、Starlabのマイクロ遠心チューブをパラフィルムおよびマイクロ遠心チューブ用のCarlROTH (Karlsruhe、Germany)のMμlti（登録商標）-リッドロックと組み合わせて使用した。

【0147】

HPLC-TOF-ESI-QTOF-MS分析：液体クロマトグラフィー分離は、サーモスタット付きカラムオーブンを備えたAgilent 1290 UHPLC systemおよびAgilent(Waldbronn、Germany)のMS-calibrant delivery用のAgilent 1100 systemおよびCTC Analytics (Zwingen、Switzerland)のCTC-PAL HTS HTCオートサンプラーで行った。すべてのLC-MS測定は、質量校正に酢酸ナトリウムクラスターを使用しエレクトロスプレーイオン化モードで動作するDuosprayイオン源を備える、Sciex（Ontario、Canada）のTripleTOF5600+機器で実施した。HPLC-QTOF-ESI-MS測定は、すべてのタグなしおよびすべてのシングルおよびダブルAQCタグ付きアミノ酸化合物（サポート情報）の質量対電荷比を含む包含リストを使用する高感度モードの情報依存取得（IDA）と組み合わせたTOFスキャンを使用したポジティブイオン化モードで実行された。以下の機器設定を使用した：カーテンガス（CUR）40 psi、イオン源ガス（噴霧ガス; GS1）60 psi、ヒーターガス（乾燥ガス; GS2）60 psi、イオンスプレー電圧フローティング（ISVF）5500 V、イオン源温度（TEM）400℃、衝突 エネルギー（CE）10 V、デクラスタリングポテンシャル100V。TOFの実行には、30～2000 m/zのスキャン範囲と250msの蓄積時間を使用した。 動的バックグラウンド減算を使用したIDA実験では、CE 46 V、DP100V、蓄積時間100msを使用した。

【0148】

AQCタグ付けされた、APCタグ付けされたおよびACタグ付けされたアミノ酸およびAQCタグ付けされた異常アミノ酸のロングハイドロオーガニックデュアルグラジエント溶出法は、以下のクロマトグラフィー条件を使用するChiralpak ZWIX(+) カラム (150 x 4 mm、3 μm) と組み合わせて使用された：移動相A（MP A）：9.4 mM NH₄FA、9.4 mM FA、ACN：MeOH：H₂O（75：25：2;（v/v））；移動相B（MP B）：MP A：9.4 mM NH₄FA、H₂O 中の9.4 mM FA（1：1、（v/v））；均一濃度の実行：MPA 0.2 mL/minで0～35分；デュアルグラジエントモード：グラジエント１（流速）：0～45 min 0.2 mL/min、45～50 min 0.2～0.5 mL/min および 50～65 min 0.5 mL/min；グラジエント２（ハイドロオーガニック）：35～45分0％ MP Bから40％ MP B、45～50分から60％ B、50～60分から100％ B、60～65分100％ B、続いて0.2 mL/minでの100％ MP Aへのカラム再平衡化。カラム温度は30℃に保たれ、サンプル注入量は均一に2.5μLだった。

【0149】

AQCタグ付けされたアミノ酸、タグなしアミノ酸およびAQCタグ付けされたRGDペプチドのショートグラジエント溶出法は、以下のクロマトグラフィー条件を使用するChiralpak ZWIX(+) (150 x 4 mm i.d.、3 μm) カラムと組み合わせて使用された：移動相A（MP A）：9.4 mM NH₄FA、9.4 mM FA、MeOH：H₂O（98：2;（v/v））；移動相B（MP B）：MP A：9.4 mM NH₄FA、H₂O 中の9.4 mM FA（1：1、（v/v））；700μL/minで0～9分100％ MP-A、9～20分 100％ MP-B、20～25分 100％ MP-B、続いて100％ MP-Aへ再平衡化。特に記載がない限り、注入量は2.5μLだった。

【0150】

ChiralPAK ZWIX (+)カラム(150 x 4mm、3 μm)でのフェニルグリシン-AQC（PG-AQC）のエナンチオマー分離では、9.4 mM NH₄Faおよび9.4 mM FAを含む移動相MeOH:H₂O（98：2;（v/v））を、300 μL/minの流速および30℃のカラム温度で使用した。

【0151】

図面の用語
and others および他
Intensity 強度
Time [min] 時間［分］
tagged タグ付けされた
L-Citrulline L-シトルリン
L-Theanine L-テアニン
trans-4-L-Hydroxyproline トランス-4-L-ヒドロキシプロリン
before 前
after 後
with HDX HDXでの
Mass/Charge 質量／電荷
before AQC-tagging AQCタグ付前
after AQC-tagging AQCタグ付後
after stereoisomerization 立体異性化後
pH-Value in Sample Solution サンプル溶液中のpH値
pH-Value of Sodium Borate Buffer (BB) ホウ酸ナトリウムバッファー（BB）のpH値
Derivatization Buffer 誘導体化バッファー
Borate Buffer ホウ酸バッファー
Sample Dilution Solution サンプル希釈溶液
Borate ホウ酸
Amino Acids アミノ酸
racemization time ラセミ化時間
min 分

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】