特表 2022-512594 キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の群

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の群

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220131BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/13

C12N15/12

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/725

A61P35/00

A61K35/17 Z

A61P35/02

C12N5/10

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021518489

(86)(22)【出願日】2019-10-04

(85)【翻訳文提出日】2021-06-02

(86)【国際出願番号】 EP2019076917

(87)【国際公開番号】W WO2020070290

(87)【国際公開日】2020-04-09

(31)【優先権主張番号】18198850.2

(32)【優先日】2018-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】19175974.5

(32)【優先日】2019-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＲＩＪ

２．ＴＲＩＴＯＮ

３．Ｐｌｕｒｏｎｉｃ

(71)【出願人】

【識別番号】520217526

【氏名又は名称】ザンクト アンナ キンダークレプスフォルシュング

(71)【出願人】

【識別番号】519177828

【氏名又は名称】ウニベルジテート フュル ボーデンクルトゥル ウィーン

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】ベンヤミン ザルツァー

(72)【発明者】

【氏名】マンフレート レーナー

(72)【発明者】

【氏名】ミヒャエル トラックスルマイヤー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA05

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

(57)【要約】

２、３又は４つのＣＡＲ分子から成るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の群であって、
ここで、ＣＡＲの群のメンバーは、それらのアミノ酸配列において、お互い異なっていても又は同一であっても良く、そして前記群のＣＡＲ分子のそれぞれは、少なくとも膜ドメイン、及び抗原結合部分又は抗原結合部分を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位のいずれかを含む外部ドメインを含み、
前記群の各ＣＡＲ分子は、少なくとも１つの二量体化ドメインを含み、ここで一対の二量体化ドメインのこの二量体化は、調節分子により誘発され、そして任意には、別の調節分子により還元されるか、又は調節分子の非存在下で起こり、そして調節分子により還元され、そして
その一般的なコンフォメーションにおける群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、それぞれ、前記群の他のＣＡＲ分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるシステインアミノ酸部分を有さず、そして
前記群のＣＡＲ分子、及び前記群のＣＡＲ分子の結合できる他のポリペプチドの抗原結合部分は、１つの標的抗原に対して、又は異なる標的分子の非共有複合体に対して特異的である、
ＣＡＲｓの群が開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２、３又は４つのＣＡＲ分子から成るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の群であって、
ここで、ＣＡＲの群のメンバーは、それらのアミノ酸配列において、お互い異なっていても又は同一であっても良く、そして前記群のＣＡＲ分子のそれぞれは、少なくとも膜ドメイン、及び抗原結合部分又は抗原結合部分を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位のいずれかを含む外部ドメインを含み、そして
ここで、前記群の少なくとも１つのＣＡＲ分子は、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介してシグナルを伝達できる少なくともシグナル伝達領域を含むエンドドメインをさらに含み、そして
ここで、前記群の各ＣＡＲ分子のエンドドメインは、それぞれのＣＡＲ分子がエンドドメインを含む場合、細胞において発現される場合、細胞膜の細胞内側に位置し、前記群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、細胞において発現される場合、細胞膜の細胞外側に位置し、そして前記群の各ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、細胞において発現される場合、細胞膜に位置し、
前記群の各ＣＡＲ分子は、前記群の他のＣＡＲ分子とのホモ又はヘテロニ量体化を仲介できる少なくとも１つの二量体化ドメインを含み、ここで一対の二量体化ドメインのこの二量体化は、調節分子により誘発され、そして任意には、別の調節分子により還元されるか、又は調節分子の非存在下で起こり、そして調節分子により還元され、ここで調節分子は、生理的条件下で、一対の二量体化ドメインの少なくとも１つのメンバーに結合することができ、そして二量体化を誘発又は低減することにより、２、３又は４つのＣＡＲ分子から成るＣＡＲの非共有的に複合体化された群の形成を誘発するか又は低減し、そして
その一般的なコンフォメーションにおける群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、それぞれ、前記群の他のＣＡＲ分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるシステインアミノ酸部分を有さず、そして
前記群のＣＡＲ分子、及び前記群のＣＡＲ分子の結合できる他のポリペプチドの抗原結合部分は、１つの標的抗原に対して、又は異なる標的分子の非共有複合体に対して特異的であり、そして
前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭであり、そして
別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭである、
ＣＡＲｓの群。

【請求項2】

前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、１ｍＭ～１５０ｎＭ、好ましくは１ｍＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１ｍＭ～３００ｎＭ、特に１ｍＭ～４００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、１ｍＭ～１５０ｎＭ、好ましくは１ｍＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１ｍＭ～３００ｎＭ、特に１ｍＭ～４００ｎＭである、請求項１に記載のＣＡＲｓの群。

【請求項3】

前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、５００μＭ～１００ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～１００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～１００ｎＭ、特に５０μＭ～１００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、５００μＭ～１００ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～１００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～１００ｎＭ、特に５０μＭ～１００ｎＭである、請求項１に記載のＣＡＲｓの群。

【請求項4】

前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、５００μＭ～１５０ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～３００ｎＭ、特に５０μＭ～４００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、５００μＭ～１５０ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～３００ｎＭ、特に５０μＭ～４００ｎＭである、請求項１に記載のＣＡＲｓの群。

【請求項5】

前記ＣＡＲｓの群の又は前記群のＣＡＲ分子に結合出来る他のポリペプチドの抗原結合部分に特異的に認識される各標的抗原が、天然に存在する細胞表面抗原か、又は天然に存在する細胞表面抗原に結合されるポリペプチド、糖又は脂質である、請求項１～４のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【請求項6】

前記ＣＡＲｓの群の又は前記群のＣＡＲ分子に結合出来る他のポリペプチドの抗原結合部分が、細胞上、固相表面上、又は脂質二重層上に存在する１つ以上の特異的抗原、好ましくは細胞の１つ以上の標的抗原に結合し、特に１つ以上の標的抗原が、CD19, CD20, CD22, CD23, CD28, CD30, CD33, CD35, CD38, CD40, CD42c, CD43, CD44, CD44v6, CD47, CD49D, CD52, CD53, CD56, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79A, CD79B, CD80, CD82, CD85A, CD85B, CD85D, CD85H, CD85K, CD96, CD107a, CD112, CD115, CD117, CD120b, CD123, CD146, CD148, CD155, CD185, CD200, CD204, CD221, CD271, CD276, CD279, CD280, CD281, CD301, CD312, CD353, CD362, BCMA, CD16V, CLL-1, Ig kappa, TRBC1, TRBC2, CKLF, CLEC2D, EMC10, EphA2, FR-a, FLT3LG, FLT3, Lewis-Y, HLA-G, ICAM5, IGHA1/IgA1, IL-1RAP, IL-17RE, IL-27RA, MILR1, MR1, PSCA, PTCRA, PODXL2, PTPRCAP, ULBP2, AJAP1, ASGR1, CADM1, CADM4, CDH15, CDH23, CDHR5, CELSR3, CSPG4, FAT4, GJA3, GJB2, GPC2, GPC3, IGSF9, LRFN4, LRRN6A/LINGO1, LRRC15, LRRC8E, LRIG1, LGR4, LYPD1, MARVELD2, MEGF10, MPZLI1, MTDH, PANX3, PCDHB6, PCDHB10, PCDHB12, PCDHB13, PCDHB18, PCDHGA3, PEP, SGCB, vezatin, DAGLB, SYT11, WFDC10A, ACVR2A, ACVR2B, 未分化リンパ腫キナーゼ, カドヘリン24, DLK1, GFRA2, GFRA3, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EFNB1, EPOR, FGFR2, FGFR4, GALR2, GLG1, GLP1R, HBEGF, IGF2R, UNC5C, VASN, DLL3, FZD10, KREMEN2, TMEM169, TMEM198, NRG1, TMEFF1, ADRA2C, CHRNA1, CHRNB4, CHRNA3, CHRNG, DRD4, GABRB3, GRIN3A, GRIN2C, GRIK4, HTR7, APT8B2, NKAIN1, NKAIN4, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1I, CACNG8, CACNG4, CLCN7, KCN§A4, KCNG2, KCNN3, KCNQ2, KCNU1, PKD1L2, PKD2L1, SLC5A8, SLC6A2, SLC6A6, SLC6A11, SLC6A15, SLC7A1, SLC7A5P1, SLC7A6, SLC9A1, SLC10A3, SLC10A4, SLC13A5, SLC16A8, SLC18A1, SLC18A3, SLC19A1, SLC26A10, SLC29A4, SLC30A1, SLC30A5, SLC35E2, SLC38A6, SLC38A9, SLC39A7, SLC39A8, SLC43A3, TRPM4, TRPV4, TMEM16J, TMEM142B, ADORA2B, BAI1, EDG6, GPR1, GPR26, GPR34, GPR44, GPR56, GPR68, GPR173, GPR175, LGR4, MMD, NTSR2, OPN3, OR2L2, OSTM1, P2RX3, P2RY8, P2RY11, P2RY13, PTGE3, SSTR5, TBXA2R, ADAM22, ADAMTS7, CST11, MMP14, LPPR1, LPPR3, LPPR5, SEMA4A, SEMA6B, ALS2CR4, LEPROTL1, MS4A4A, ROM1, TM4SF5, VANGL1, VANGL2, C18orf1, GSGL1, ITM2A, KIAA1715, LDLRAD3, OZD3, STEAP1, MCAM, CHRNA1, CHRNA3, CHRNA5, CHRNA7, CHRNB4, KIAA1524, NRM.3, RPRM, GRM8, KCNH4, Melanocortin 1受容体, PTPRH, SDK1, SCN9A, SORCS1, CLSTN2, エンドセリン転換酵素様-1, リゾホスファチジン酸受容体2, LTB4R, TLR2, 神経栄養性チロシンキナーゼ1, MUC16, B7-H4, 上皮成長因子受容体(EGFR), ERBB2, HER3, EGFRバリアントIII (EGFRvIII), HGFR, FOLR1, MSLN, CA-125, MUC-1, 前立腺特異的膜抗原(PSMA), メソテンシン, 上皮細胞接着分子(EpCAM), L1-CAM, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, VEGFR1, VEGFR2, 高分子量メラノーマ関連抗原(HMW-MAA), MAGE-A l, IL-13R-α2, ジシアロガングリオシド(GD2及びGD3),腫瘍関連糖抗(CA-125, CA-242, Tn及びシアリル-Tn), 4-1BB, 5T4, BAFF, 炭酸脱水酵素9 (CA-IX), C-MET, CCR1, CCR4, FAP, フィブロネクチン外部ドメイン-B (ED-B), GPNMB, IGF-1受容体, インテグリンα5β1, インテグリンαvβ3, ITB5, ITGAX,エンビギン, PDGF-Rα, ROR1, シンデカン1, TAG-72, テネイシンC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, NKG2D-リガンド, 腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体(MHC)分子, 好ましくはPR1/HLA-A2, 系譜特異的又は組織特異的組織抗原、好ましくはCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD24, CD25, CD34, CD80, CD86, CD133, CD138, CD152, CD319, エンドグリン及びMHC分子からなる群から好ましくは選択される分子を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【請求項7】

ＤＮＡ、ＲＮＡ又はインビトロで転写されたＲＮＡから選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。

【請求項8】

ＤＮＡ、ＲＮＡ又はインビトロで転写されたＲＮＡから選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子のキット。

【請求項9】

前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１～６のいずれか１項のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター又はキット。

【請求項10】

請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子を生産するように、請求項７又は８のいずれかに記載の核酸分子又は核酸分子のキットを用いて、又は請求項９に記載のベクター又はベクターのキットを用いて、インビトロ又はエクスビボで改変された細胞、又は当該改変された２つ以上の細胞を含むキット。

【請求項11】

請求項７又は８のいずれかに記載の核酸又は核酸のキット、請求項９に記載のベクター又はベクターのキット、又は請求項１０に記載の細胞又は細胞のキットを含む、医薬調製品。

【請求項12】

癌を有する個体において癌を治療する方法に用いられる、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群であって、以下の工程：
ｉ）個体から得られたＮＫ細胞または好ましくはＴリンパ球を、本発明によるＣＡＲの群のそれぞれのＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターで遺伝子改変し、ここでＣＡＲの群の各抗原結合部分は、個体の癌細胞上の標的抗原に特異的であり、そして前記遺伝子改変は、インビトロ又はエキソビボで行われ；
ii) 遺伝子組み換え細胞を個体に導入し；そして
iii) 群のそれぞれの ＣＡＲ 分子の二量体化を誘導又は低減するために、好ましくは、群のそれぞれの ＣＡＲ 分子の二量体化を誘導するために、少なくとも 1 つの調節分子の有効量を個体に投与することを含み、それにより、ＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導または低減し、好ましくはＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導し、それにより、ＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導または低減し、好ましくはＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導し、ここで、それぞれの標的抗原又は異なる標的抗原のそれぞれの共有又は非共有複合体を発現する癌細胞との接触に基づいて、ＣＡＲの非共有複合体群が、遺伝子組み換え細胞の活性化を仲介し、癌細胞を死滅させ、癌の治療を可能にする；
ＣＡＲｓの群。

【請求項13】

個体における癌の治療方法に用いる請求項１０に記載の細胞であって、ＣＡＲｓの群の各抗原結合部分が個体の癌細胞上の標的抗原に特異的であり、以下の工程：
i)個体に細胞を導入する工程；及び
ii)前記群の２つ、３つ又は４つのＣＡＲ分子、好ましくは前記群の３つのＣＡＲ分子、尚もより好ましくは前記群の４つのＣＡＲ分子を含む、非共有結合複合体の形成を誘導する又は減少する、好ましくは誘導する、１つ以上の制御分子を有効量で個体に投与する工程、ここで各標的抗原又は異なる標的抗原の各共有結合又は非共有結合複合体を発現する癌細胞と接触したＣＡＲｓの非共有結合複合群が、癌細胞の死滅を誘導する遺伝子改変細胞の活性化を誘導することにより癌の治療を可能とする；
を含む、細胞。

【請求項14】

キットであって、以下：
－請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群、請求項９に記載のベクター又はベクターのキット、又は請求項１０に記載の細胞又は細胞のキット；及び
－１つ、２つ又は３つの制御分子、好ましくは２つ、尚もより好ましくは１つの制御分子；
を含む、キット。

【請求項15】

細胞上の標的抗原へのＴリンパ球又はＮＫ細胞の結合が必要であることを特徴とする疾患の治療において使用され、好ましくは腫瘍患者の治療、特に以下：
Ewing肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、造骨肉腫、中皮腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、平滑筋肉腫、黒色腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、網膜芽腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、慢性骨髄増殖性腫瘍、急性骨髄性白血病、B-細胞CLL、T-細胞CLLを含む慢性リンパ球性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病及び有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、B-細胞リンパ腫、Hodgkinリンパ腫、非Hodgkinリンパ腫、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、膀胱癌、気管支癌、結腸癌、結腸直腸癌、 胃癌、肺の小細胞癌及び非小細胞癌、肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、骨形成細胞癌、上皮癌、および鼻咽頭癌、非定型髄膜種、島細胞癌、髄様癌、間葉腫、肝細胞癌、肝芽腫、明細胞癌及び神経繊維腫縦隔、から選択される腫瘍を有する腫瘍患者の治療において使用される、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群、請求項９のいずれか１項に記載のベクター又はベクターのキット、請求項１０のいずれか１項に記載の細胞又は細胞のキット、特にＴリンパ球又はＮＫ細胞、又は請求項８、９又は１４のいずれか１項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、２、３又は４つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子から成るＣＡＲの群に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＡＲ Ｔ細胞、すなわちキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されたＴ細胞を用いた免疫療法は、癌治療において最も有望なアプローチの１つである。現在まで、この治療戦略の高い可能性は、Ｂ細胞悪性腫瘍の患者における印象的な臨床応答により実証されている。しかしながら、この成功を他の腫瘍にさらに変換することは、現在、いくつかのハードルにより妨げられている（Lim and June, Cell. 2017;168(4):724）。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞は、投与後に複製する製薬であり、そしてその活性は可逆的に十分に制御され得ない。現在まで、条件付きＣＡＲについてのいくつかの戦略が開発されて来た（Lim and June, Cell. 2017;168(4):724）。それらの戦略は、小分子薬剤の投与、又は標的抗原及びＣＡＲに結合する二重特異的タンパク質の注入による可逆的調節を可能にする（Wu et al. Science. 2015;350(6258):aab4077; Juillerat et al. Sci Rep. 2016;6:18950; Ma et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(4):E450; Urbanska et al. J Transl Med. 2014;12:347; Urbanska et al. Cancer Res. 2012;72(7):1844; Cartellieri et al. Blood Cancer J. 2016;6(8):e458）。本発明は、結合力、すなわちＣＡＲ群の個々の抗原結合部分、及び／又は前記群のＣＡＲ分子に結合できる他のポリペプチドの個々の抗原結合部分の親和性の相乗的増幅の調節に基くＣＡＲの機能を調節するための新規戦略を提供する。具体的には、新規ＣＡＲは、特にヒト患者の治療に、副作用のリスクなしに、又は少なくとも低められた副作用を伴って、インビボで適用可能である必要がある。腫瘍治療のための手段、特に腫瘍の治療のための免疫療法の概念を提供することが、さらなる目的である。

【0003】

国際公開第ＷＯ２０１７／１８０９９３Ａ１号は、サルベージキメラ抗原受容体システムを開示している。

【0004】

Lanitis et al. (Cancer Immunol. Res. 1 (2013), 43-53)は、シグナル伝達ドメインが解離したキメラ抗原受容体Ｔ細胞が、インビボでの毒性の可能性が低い集中的な抗腫瘍活性を示すことを報告している。

【0005】

Kloss et al. (Nat. biotechnol. 31 (2012), 71-75)は、バランスの取れたシグナル伝達を伴う組み合わせ抗原認識が、操作されたＴ細胞による選択的な腫瘍根絶を促進することを報告している。

【0006】

国際公開ＷＯ ２０１５/０７５４６８ Ａ１は、活性化エンドドメインを含むＣＡＲを備えたＣＡＲシステムを開示している。

【0007】

Wu et al. (Science 350 (2015), 293 and aab4077-1 to aab4077-10)は、小分子ゲートキメラ受容体を介した治療用Ｔ細胞の遠隔制御について説明している。

【0008】

Ajina et al. (Mol. cancer therap. 17 (2018), 1795-1815は、ＣＡＲトニックシグナル伝達に対処するための戦略をレビューしている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、２、３又は４つのＣＡＲ分子から成るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の群に基くシステムを提供し、
ここで、ＣＡＲの群のメンバーは、それらのアミノ酸配列において、お互い異なっていても又は同一であっても良く、そして前記群のＣＡＲ分子のそれぞれは、少なくとも膜ドメイン、及び抗原結合部分又は抗原結合部分を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位のいずれかを含む外部ドメインを含み、そして
ここで、前記群の少なくとも１つのＣＡＲ分子は、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介してシグナルを伝達できる少なくともシグナル伝達領域を含むエンドドメインをさらに含み、そして
ここで、前記群の各ＣＡＲ分子のエンドドメインは、それぞれのＣＡＲ分子がエンドドメインを含む場合、細胞において発現される場合、細胞膜の細胞内側に位置し、前記群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、細胞において発現される場合、細胞膜の細胞外側に位置し、そして前記群の各ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、細胞において発現される場合、細胞膜に位置し、
前記群の各ＣＡＲ分子は、前記群の他のＣＡＲ分子とのホモ又はヘテロニ量体化を仲介できる少なくとも１つの二量体化ドメインを含み、ここで一対の二量体化ドメインのこの二量体化は、調節分子により誘発され、そして任意には、別の調節分子により還元されるか、又は調節分子の非存在下で起こり、そして調節分子により還元され、ここで調節分子は、生理的条件下で、一対の二量体化ドメインの少なくとも１つのメンバーに結合することができ、そして二量体化を誘発又は低減することにより、２、３又は４つのＣＡＲ分子から成るＣＡＲの非共有的に複合体化された群の形成を誘発するか又は低減し、そして
その一般的なコンフォメーションにおける群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、それぞれ、前記群の他のＣＡＲ分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるシステインアミノ酸部分を有さず、そして
前記群のＣＡＲ分子、及び前記群のＣＡＲ分子の結合できる他のポリペプチドの抗原結合部分は、１つの標的抗原に対して、又は異なる標的分子の非共有複合体に対して特異的であり、そして
前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭであり、そして
別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

現在まで、条件付きで活性的なＣＡＲのためのいくつかの戦略が開発されて来た。そのようなＣＡＲの例は、欧州特許第２ ９５６ １７５ Ｂ１号、米国特許第２０１７００８１４１１Ａ1 号及び国際公開第ＷＯ２０１７０３２７７７ Ａ１号に開示されている。しかしながら、本発明の戦略は、ＣＡＲ機能を調節するための根本的に異なる原理を表している。本発明によるＣＡＲ機能を調節するための基礎となる原理は、ＣＡＲの群であり、ここで前記群の個々のＣＡＲ分子の個々の抗原結合部分は、それらのそれぞれの標的抗原に対して低い親和性しか有さないので、一価の相互作用のみ、ＣＡＲ発現細胞において弱い細胞内シグナル伝達を引起すか、又はシグナル伝達をまったく引起さない。それぞれ、１つの抗原結合部分を含み、そしてさらに、前記群のＣＡＲ分子に結合できる他のポリペプチドの使用の場合、他のポリペプチドの抗原結合部分とそのそれぞれの標的抗原との間の相互作用、又は他のポリペプチドと、前記群のそれぞれのＣＡＲ分子上のその結合部位との間の相互作用は、低い親和性のものでなければならないので、一価の相互作用は、ＣＡＲ発現細胞において弱い細胞内シグナル伝達のみを誘発するか、又はシグナル伝達を全く誘発しない。しかしながら、前記群の２、３又は４つのＣＡＲ分子の非共有アセンブリーは、二価又は四価の方法で、直接的に又は間接的に他のポリペプチドを介して、それらのそれぞれの標的抗原（又は異なる標的抗原の非共有又は共存複合体）と相互作用することができる多価ＣＡＲ複合体の形成をもたらす。この多価相互作用は、低親和性、すなわち結合力の相乗的増幅をもたらす。重要なことには、そのような多価相互作用は、前記群のＣＡＲ分子の非共有複合体形成に依存している。この非共有複合体化は調節され得るので、これは、究極的に、ＣＡＲ機能の調節を促進する。

【発明の効果】

【0011】

従って、一価のみならず、多価の相互作用も、ＣＡＲの複合群を効率的に誘発することを確実にするために、前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭである。好ましい実施形態によれば、前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、１ｍＭ～１５０ｎＭ、好ましくは１ｍＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１ｍＭ～３００ｎＭ、特に１ｍＭ～４００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、１ｍＭ～１５０ｎＭ、好ましくは１ｍＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１ｍＭ～３００ｎＭ、特に１ｍＭ～４００ｎＭである。他の好ましい実施形態によれば、前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、５００μＭ～１００ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～１００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～１００ｎＭ、特に５０μＭ～１００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、５００μＭ～１００ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～１００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～１００ｎＭ、特に５０μＭ～１００ｎＭである。他の好ましい実施形態によれば、前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、５００μＭ～１５０ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～３００ｎＭ、特に５０μＭ～４００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、５００μＭ～１５０ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～３００ｎＭ、特に５０μＭ～４００ｎＭである。本明細書に示される任意の親和性値は、定常状態分析を用いて、例えば実施例セクションにおける実施例１及び９において実施されるように、ｐＨ７．４、２５℃で、Biacore T200 装置 (GE Healthcare)により実施される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定される親和性を示すことに注意すべきである。

【0012】

本発明によるＣＡＲの群の定義された二量体化、三量体化又は四量体化を促進するために、ＣＡＲの群の各ＣＡＲ分子は、少なくとも１つの二量体化ドメインを含む。本発明によれば、一対のそれらの二量体ドメインの二量体化は、この一対の二量体化ドメインの少なくとも１つのメンバーに、生理学的条件下で結合できる調節分子により調節され、それにより、前記群の２、３又は４つのＣＡＲ分子の定義された非共有複合体の形成を誘発するか、又は妨げる。ＣＡＲの群が活性化ＩＴＡＭ又は阻害ＩＴＩＭを含むかどうかに依存して、ＣＡＲの非共有的に複合体化された群は、それぞれの標的抗原、又は異なる標的抗原のそれぞれの非共有又は共有複合体を発現する標的細胞に応答して、ＣＡＲの前記群を発現するように修飾された細胞を、効率的に活性化するか又は阻害できる。

【0013】

本発明によるＣＡＲの群の設計により促進される結合力の調節は、現在使用されているＣＡＲ分子のフォーマットによっては不可能であろう。第一に、これは、現在使用されるＣＡＲ分子の少なくとも一部が、細胞において発現される場合、細胞外システム残基間のジスルフィド結合に起因する二量体（又はオリゴマー）を形成する事実によるものである。しかしながら、ＣＡＲ分子のそのような制御されていない二量体化又はオリゴマー化は、ＣＡＲ複合体化の効率的な調節を妨げ、そして従って、標的抗原又は共有又は非共有複合体化された標的抗原の認識に基くその得られる結合力効果の認識を妨げる。

【0014】

このために、本発明によれば、その「一般的コンフォメーション」（すなわち、天然において折りたたまれたコンフォメーション）での群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、それぞれ、前記群の他のＣＡＲ分子と分子間ジスルフィド結合を形成できるシステインアミノ酸部分を含まない。言い換えれば、本発明による群のＣＡＲ分子の細胞外ドメインは、ＣＡＲの天然に折りたたまれたコンフォメーションで分子内ジスルフィド結合に関与しない（すなわち、前記群の特定のＣＡＲ分子内で形成される）何れのシステインも含むべきではない。例えば、天然のコンフォメーションで分子間ジスルフィド結合を形成できる（すなわち、前記群の他のＣＡＲ分子と）、ＣＤ８αのヒンジ領域におけるシステインは、例えば突然変異又は欠失により除外される必要がある。他方では、ＣＡＲ分子の本来のコンフォメーションで分子内ジスルフィド結合に関与している（そして、従って、他のＣＡＲ分子との分子間結合の形成にアクセスできない）システインは、本発明によるＣＡＲの群のＣＡＲに存在することができ。１つの例として、分子内ジスルフィド結合を形成する抗体フラグメントのＩｇドメイン内（例えば、ｓｃＦｖ内）のシステインは、本発明によるＣＡＲの群のＣＡＲ分子中に存在することができる。例えば、ｓｃＦｖにおけるそれらのシステインは分子内ジスルフィド結合に関与しているので、それらは分子間ジスルフィド結合には利用できず（ＣＡＲ分子がその一般的な、すなわち天然のコンフォメーションで存在する場合）、それにより、前記群のＣＡＲ分子の望ましくない共有二量体化又はオリゴマー化を回避する。

【0015】

一般的に、本発明によるＣＡＲの群の複合体化を仲介するよう意図されたドメイン以外のドメインにより仲介されたＣＡＲ分子の非共有二量体化又はオリゴマー化もまた、ＣＡＲ複合体化の効率的な調節、及び従って、本発明によるＣＡＲの群の機能の調節を妨げるであろう。

【0016】

従って、ＣＡＲ分子のそのような非共有二量体化又はオリゴマー化は、そのようなドメインの排除又は操作により、生物学的に可能な限り防止されるか、又は少なくとも最小限にされる必要がある。

【0017】

例えば、現在のＣＡＲの抗原結合部分は通常、個々の分子間の可変Ｌ（ＶＬ）ドメイン及び可変Ｈ（ＶＨ）ドメインの分子間へテロ二量体化のためにオリゴマー化する傾向がある一本鎖可変フラグメント（ｃｓＦｖ）に基いている（Hudson et al., J Immunol Methods. 1999; 231(1-2):177-89; Long et al., Nat Med. 2015;21(6):581-90）。従って、本発明のＣＡＲの群の個々の分子は、好ましくは、ｓｃＦｖベースの抗原結合部分、又はＣＡＲ分子の望ましくない、及び制御されていない共有又は非共有複合体形成を潜在的に導く他の分子成分を含まない。

【0018】

本発明のＣＡＲの群の分子設計の基本的構造は、ＣＡＲの群の非共有複合体化、及びそれにより、標的抗体認識に基くＣＡＲの群の結合力の条件付調節の可能性を破壊しないで特定の部位で変化させられ得る。

【0019】

例えば、ＣＡＲの群は、２つのＣＡＲ分子、又はあるいは、標的抗原認識に基く結合の効果、及び標的細胞上の低密度の標的抗原分子をまた認識する能力をさらに高めるために、３又は４つのＣＡＲ分子から成ることができる。

【0020】

本発明によれば、ＣＡＲの群は、調節分子の存在又は非存在に機能的に依存するように設計され、これは、少なくとも１つの二量体化ドメインに結合し、そして一対の二量体化ドメインの相互作用を誘発するか又は低減できる任意の分子であり得る。それらの分子は通常、小分子であるが、例えば腫瘍の間質に蓄積する可溶性タンパク質でもあり得、これは、多くの場合、それ自体、天然においてヘテロ二量体化する（例えば、ＩＬ－１２のようなヘテロ二量体化サイトカインのサブユニット）又は天然においてホモ二量体化する（例えば、ＶＥＧＦ（実施例７に使用されるような）、ＴＧＦ－β１、等）タンパク質である。調節分子は、生理学的条件下で、ＣＡＲ分子のエンドドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は外部ドメインに位置する一対の二量体化ドメインの少なくとも１つのメンバーに結合することができる。しかしながら、異なる細胞間でのＣＡＲ分子の架橋によりフラトリサイドの可能性を排除するために、二量体化ドメインは、エンドドメイン、及び／又はＣＡＲの群のＣＡＲ分子の膜貫通ドメイン、より好ましくは、エンドドメインに組込まれる。

【0021】

ＣＡＲの群の個々のＣＡＲ分子は、標的抗原に対して、又は統合された抗原結合部分を介して異なる標的抗原の非共有又は共有複合体に直接的に結合するか、又はＣＡＲ分子に結合でき、そして抗原結合部分を含む別のポリペプチドを介して間接的に、結合することができる。そのような別のポリペプチドは、それにより、ＣＡＲの群に属さず、そして例えば共有結合されたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）分子などの他のポリペプチドの共有結合修飾を介して直接的に又は間接的に前記群のＣＡＲ分子における結合部位に非共有結合できる可溶性タンパク質として定義される。ＣＡＲ分野で良く知られており（Cho et al., Cell. 2018;173(6):1426-1438; Ma et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(4):E450-458; Urbanska et al., Cancer Res. 2012;72(7):1844-1852）、そして現在クリニックで試験されている（Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2:377-391）抗原への間接的なＣＡＲ結合のこの原理は、本発明のＣＡＲの群に組込まれ得る。この場合、原則として、低親和性結合は、必ずしも、他のポリペプチドの抗原結合部分を介して起こる必要はないが、抗原結合部分を含む他のポリペプチドが結合できる結合部位を介してＣＡＲ分子で起こることもできる。

【0022】

しかしながら、抗原結合部分を含み、そしてＣＡＲ分子に結合できる別のポリペプチドを投与する必要性を回避するために、ＣＡＲの群自体の各ＣＡＲ分子の外部ドメインが抗原結合部分を含むことが好ましい。

【0023】

上記のように、本発明による、前記群のＣＡＲ分子の基本的構造は、異なる用途の必要性に適合され得る。細胞外側から細胞内側への群のＣＡＲ分子中のドメインの順序は、好ましくは、細胞の表面上で、以下の基本的構造に一致する：抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位、好ましくは空間最適化のためのヒンジ領域、及び膜貫通ドメイン。ＣＡＲのＩＴＡＭ含有群の好ましい実施形態によれば、膜貫通ドメインは、好ましくは、少なくとも１つのＣＡＲ分子において、共刺激ドメインを含むシグナル伝達領域が続き、ここで好ましくは、この共刺激シグナル伝達領域、又は任意には、膜貫通ドメインに続いて、少なくとも１つの二量体化ドメイン、及びさらに、少なくとも１つのＣＡＲ分子においては、少なくとも１つのＩＴＡＭを含むシグナル伝達領域が存在し、ここで共刺激及びＩＴＡＭ含有シグナル伝達領域の順序は、逆にされ得る。ＩＴＡＭを含まないＣＡＲ分子は、共刺激シグナル伝達領域を欠くか、又は１つの共刺激シグナル伝達領域、又は２つの共刺激シグナル伝達領域、又はさらに多くの共刺激シグナル伝達領域、しかし好ましくは、２つ以下の共刺激シグナル伝達領域、又はさらにより好ましくは、１つの共刺激シグナル伝達領域のみを含む。ＣＡＲの群を含むＩＴＩＭの場合、膜貫通ドメインに続いて、優先的に、少なくとも１つのＣＡＲ分子においては、ＩＴＩＭを含む阻害シグナル伝達領域が存在する。この阻害シグナル伝達領域、又は任意には、膜貫通ドメインに続いて、少なくとも１つの二量体化ドメイン、及び任意には、第２の阻害シグナル伝達領域が存在する。一般的に、ＩＴＡＭ及びＩＴＩＭを含むＣＡＲの群においては、群の各ＣＡＲ分子のために少なくとも１つが必須である二量体化ドメインは、外部ドメイン又は膜貫通ドメインに、代替的に又は追加的に配置され得るが、好ましくは、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間、及び／又は特に、２つのシグナル伝達領域間、及び／又はＣＡＲ分子の細胞内末端に配置され得る。最終的に、前記群のＣＡＲ分子の任意の２つの隣接する成分（例えば、抗原結合部分、抗原結合部分を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、シグナル伝達領域、二量体化ドメイン）は任意には、リンカーにより分離され得る。

【0024】

異なる標的抗原、又は異なる標的抗原の異なる非共有又は共有複合体に対して向けられたＣＡＲの異なる群はまた、標的抗原の損失により誘発される腫瘍の免疫回避を阻害するために、細胞において共発現され得る。ＣＡＲの群はまた、所定の細胞において他のタンパク質と共に、共発現され得る。

【0025】

１．抗原結合部分：
本発明によるＣＡＲの群の個々のＣＡＲ分子の抗原結合部分は、標的抗原分子の単一の選択されたエピトープに対して向けられ得る。この場合、ＣＡＲの複合体化された群による効率的なシグナル伝達は、高密度の標的抗原、又は二量体化／オリゴマー化する標的抗原の能力のいずれかを必要とする。単量体標的抗原分子の効率的且つ高感度の標的化を可能にするためには、本発明によるＣＡＲの群の個々のＣＡＲ分子はまた、選択された標的抗原の異なる（すなわち、重複しない）エピトープに対して、又は天然に置いて、共有複合体（例えば、ＴＣＲα／ＴＣＲβ鎖）、又は非共有複合体（例えばＭＭＣ IIα／β鎖又はＥｒｂＢ－１／ＥｒｂＢ－２）を形成する異なる分子上に位置する異なるエピトープに対して向けられ得る。それらの場合、すなわち同じ標的抗原上の重複しないエピトープ、又は異なるが、複雑な標的抗原上のエピトープを標的とする場合、ＣＡＲの群の標的エピトープは単一分子、又はエピトープの非常に高い局所濃度に対応する複合分子上に位置するので、結合の効果は強く増大される。

【0026】

本発明によるＣＡＲの群への使用のために適切な抗原結合部分は、任意の抗原結合ポリペプチドであり得（Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2:377-391）、広範囲の種類のものが当業界において知られている（Simeon et al., Protein Cell. 2017; Gilbreth et al., Curr Opin Struct Biol. 2012;22(4):413-420; Koide et al., ACS Chem Biol. 2009;4(5):325-334; Traxlmayr et al., J Biol Chem. 2016;291(43):22496-22508）。一方、より多くの非抗体結合タンパク質が報告されており（Pluckthun, Alternative Scaffolds: Expanding the options of antibodies. In: Little M, ed. New York: Cambridge University Press; 2009:244-271; Chapman et al., Cell Chem Biol. 2016;23(5):543-553; Binz et al., Nat Biotechnol. 2005;23(10):1257-1268; Vazquez-Lombardi et al., Drug Discov Today. 2015;20(10):1271-1283）、そして実際、合成ライブラリー設計及び選択が、抗原結合部分としても潜在的に機能することができる任意のタンパク質に適用され得る（Pluckthun, 代替足場：抗体の選択肢を拡大する : Little M, ed. New York: Cambridge University Press; 2009:244-271において）。

【0027】

場合によっては、抗原結合部分は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）又はそのヒトバージョンのような他の抗体ベースの認識ドメイン、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化バーション、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）又は「ラクダ化」抗体可変ドメインであり得る。場合によっては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメイン、例えば一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ，ＶａＶを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）は、また使用に適している可能性がある。好ましくは、ＣＡＲの群の各分子の抗原結合部分は、以下を含む：１つのタンパク質ドメインのみ、好ましくはヒト又は非ヒトＶＨ又はＶＬ単一ドメイン抗体（ナノボディ）、又はブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、リポカリン、ＳＨ３ドメインン、フィブロネクチンIII型（ＦＮ３）ドメイン、ノッチン、Ｓｓｏ７ｄ、ｒｃＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｇｐ２、ＤＡＲＰｉｎｓ又はユビキチンに基く操作された抗原結合部分；低親和性結合及び同型相互作用の欠如のために選択、又は操作された、リガンド、受容体又は補助受容体。リガンドは、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１３など）；成長因子（例えば、ヘレグリンなど）；及び同様のものを含む。リガンドは、リガンドの受容体結合フラグメント（例えば、ＨＧＦのペプチド(Thayaparan et al., Oncoimmunology. 2014;6(12):e1363137)；インテグリン結合ペプチド（例えば、配列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐを含むペプチド）；などであり得る。同様に、受容体は、受容体のリガンド結合フラグメントであり得る。適切な受容体は、例えば、以下を含む：サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１３受容体; ＩＬ－２受容体など）; 細胞接着分子（例えば、ＣＤ１１ａ（Park et al., Sci Rep. 2017;7(1):14366); など）; ＰＤ－１；及び同様のもの。ＣＡＲの群の各分子の抗原結合部分は、好ましくは、ＣＡＲ分子の望ましくない凝集を引起さない。上記のように、前記群のＣＡＲ分子のそのような望ましくない二量体化又はオリゴマー化は、前記群のＣＡＲ分子の二量体化、三量体化又は四量体化状態の効率的な制御を妨げる。このために、抗原結合部分は、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）でないことが好ましい。本発明によるＣＡＲの群の臨床的適用可能性を目的として、抗原結合部分は、好ましくは、ヒト単一タンパク質ドメイン（例えば、フィブロネクチンIII型ドメイン（ＦＮ３）ベースのモノボディ）に由来する。

【0028】

２．ヒンジ領域：
いくつかの実施形態によれば、前記群のＣＡＲ分子の外部ドメインは、抗原結合部分（又は少なくとも抗原結合を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位）と膜貫通ドメイン、好ましくはＣＤ８α（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ / Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｐ０１７３２－１に従ってのアミノ酸配列位置１３８～１８２）、又はＣＤ２８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ / Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｐ１０７４７に従ってのアミノ酸配列位置１１４～１５２）、又はＰＤ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ / Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔＱ１５１１６に従ってのアミノ酸配列の位置１４６－１７０）由来のヒンジ領域との間に挿入されたヒンジ領域を含み、ここでＣＤ８α、ＣＤ２８又はＰＤ－１由来の配列は、Ｎ末端及び／又はＣ末端切断され得、そして前記配列の境界内で任意の長さを有することができ、そしてここで、ＣＤ８α及びＣＤ２８由来の前記ヒンジにおけるシステイン残基は、欠失されるか、又は他のアミノ酸残基により置換される。原則として、柔軟な膜アンカー、及びまた、より多くの受容体の他の部分は、前記群のＣＡＲ分子のヒンジ領域及び／又は膜貫通ドメインへの使用のために適しており（Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2:377-391）、但し、必要に応じて、それらは、本発明による二量体化を妨げるために修飾される。

【0029】

選択された標的抗原の最適な結合のための個々の構造条件に依存して、ＣＡＲ分子のヒンジ領域は、以下の長さを有することができる：約２つのアミノ酸～約５０のアミノ酸、例えば約４つのアミノ酸（ａａ）～約１０のａａ、約１０のａａ～約１５のａａ、約１５のａａ～約２０のａａ、約２０のａａ～約２５のａａ、約２５のａａ～約３０のａａ、約３０のａａ～約４０のａａ、又は約４０のａａ～約５０のａa。任意には、ヒンジ領域は、例えば構造化ドメインが組込まれている場合、５０以上のアミノ酸を含むことができる（例えば、米国特許第２０１８ / ００９４０４４Ａ１号に開示されているように、ＣＡＲ修飾細胞の富化を促進するためのＣＤ３４ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２８９０６－１ ａａ ４２-１４０から）。

【0030】

好ましくは、他のポリペプチド、好ましくはグリシン及びグリシン－セリンポリマーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒの両方は、比較的構造化されておらず、そして従ってＣＡＲ成分間の中性デザーとして機能し得るので、ヒンジのために使用され得る。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのｐｈｉ－ｐｈｉ空間にアクセスし、そしてより長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（Scheraga, Rev. Computational Chem. 1992; 11173-11142）。従って、それらの標的抗原への最適な結合のためにＣＡＲ分子を調整するためには、抗原結合部分（又は少なくとも抗原結合部分を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位）と、膜貫通ドメインとの間に挿入されるヒンジ領域は、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ及び/又はグリシン－セリンポリマー（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１の整数である）を含む。

【0031】

３．膜貫通ドメイン：
ＣＡＲの群の各分子は、真核細胞膜中への挿入のための膜貫通ドメインを含む。真核生物（例えば、哺乳類）細胞の細胞膜へのポリペプチドの挿入を提供する任意の膜貫通（ＴＭ）ドメインが、使用のために適切である。例えばヒトＣＤ８α（Uniprot P01732, アミノ酸 (aa) 183-206）のＴＭ配列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCが使用され得る。適切なＴＭ配列のさらなる例は、以下を含む：ヒトＣＤ８β由来：LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC（Uniprot P10966、aa 173-195）；ヒトＣＤ４由来：ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC（Uniprot P01730、aa 398-422）; ヒトＣＤ３ゼータ由来：LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV（Uniprot P20963、aa 31-53）; ヒトＣＤ２８由来：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV（Uniprot P10747、aa 154-179）; ヒトＣＤ１３４（ＯＸ４０）由来：VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL（Uniprot P43489、aa 215-240）; ヒトＣＤ２７由来：ILVIFSGMFLVFTLAGALFLH（Uniprot P26842、aa 192-212）; ヒトＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）由来：FWLPIGCAAFVVVCILGCILI（Uniprot Q9Y6W8、aa 141-161）; ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）由来：VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI（Uniprot Q15116、aa 171-191）;ヒトＤＡＰ１２由来：GVLAGIVMGDLVLTVLIALAV（Uniprot O43914、aa 41-61）; 及びヒトＣＤ７由来：ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA（Uniprot P09564、aa 178-201）。

【0032】

４．免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）：
本発明によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子は、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介してシグナルを伝達できるエンドドメインを含む。ＩＴＡＭモチーフは、ＹＸ_１Ｘ_２Ｌ／Ｉであり、ここでＸ１及びＸ２は独立して任意のアミノ酸である。ＩＴＡＭ含有エンドドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１２を超えるＩＴＡＭモチーフを含む。シグナル伝達エンドドメインのＩＴＡＭ含有部分は、好ましくは、任意のＩＴＡＭ含有タンパク質に由来し、そしてそれらが由来するタンパク質全体の配列全体を含む必要はない。適切なＩＴＡＭ含有ポリペプチドの例は、以下を含む：ＤＡＰ１２； ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖）; ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）; ＣＤ３Ｅ（ＣＤ3イプシロン）; ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）; ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）; 及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖）。

【0033】

特に好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つのＣＡＲ分子中の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３－ＺＥＴＡ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺなどとしても知られてる）の細胞質ドメインに由来する。例えば、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列（２つのイソフォーオム）のいずれかの、約５０のアミノ酸～約６０のアミノ酸（ａａ）、約６０のａａ～約７０のａａ、約７０のａａ～約８０のａａ、約８０のａａ～約９０のａａ、約９０のａａ～約１００のａａ、約１００のａａ～約１１０のａａ、約１１０のａａ～約１１５のａａ、約１１５のａａ～ 約１２０のａａ、約１２０のａａ～約１３０のａａ、約１３０のａａ～約１４０のａａ、約１４０のａａ～約１５０のａａ、又は約１５０のａａ～約１６０の連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (Uniprot P20963-3 ) 又は
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (Uniprot P20963-1)、ここでＩＴＡＭモチーフは、太字で、下線が引かれている。

【0034】

同様に、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、全長ＣＤ３ゼータアミノ酸配列のＩＴＡＭ含有部分を含むことができる。従って、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (Uniprot P20963-3 aa 52-163)、
NQLYNELNLGRREEYDVLDKR (Uniprot P20963-3 aa 69-89)、EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK (Uniprot P20963-3 aa 107-128)、DGLYQGLSTATKDTYDALHMQ (Uniprot P20963-3 aa 138-158)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0035】

ＩＴＡＭ含有ドメインはまた、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖（ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３－ＤＥＬＴＡ; Ｔ３Ｄ； ＣＤ３抗原、デルタサブユニット; ＣＤ３デルタ; ＣＤ３ｄ抗原、デルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）; ＯＫＴ３、デルタ鎖; Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖; Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖; 等とも呼ばれる）に由来する場合もある。例えば、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列（２つのイソフォーム）：Uniprot P04234-1; Uniprot P04234-2のいずれかの、約１００のアミノ酸～約１１０のアミノ酸（ａａ）、約１１０のａａ～約１１５のａａ、約１１５のａａ～約１２０のａａ、約１２０のａａ～約１３０のａａ、約１３０のａａ～約１４０のａａ、約１４０のａａ～約１５０のａａ、又は約１５０のａａ～約１７０のａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0036】

同様に、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、全長ＣＤ３デルタアミノ酸配列のＩＴＡＭ含有部分を含むことができる。従って、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
DQVYQPLRDRDDAQYSHLGGN (Uniprot P04234-1 aa 146-166)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0037】

ＩＴＡＭ含有ドメインはまた、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３/Ｌｅｕ－４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ｃ鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ3eなどとしても知られている）に由来する場合もある。例えば、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列Uniprot P07766-1の、約１００のアミノ酸～約１１０のアミノ酸（ａａ）、約１１０のａａ～約１１５のａａ、約１１５のａａ～約１２０のａａ、約１２０のａａ～約１３０のａａ、約１３０のａａ～約１４０のａａ、約１４０のａａ～約１５０のａａ、又は約１５０のａａ～約２０５のａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0038】

同様に、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、全長ＣＤ３イプシロンアミノ酸配列のＩＴＡＭ含有部分を含むことができる。従って、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR (Uniprot P07766-1 aa 185-205)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0039】

ＩＴＡＭ含有ドメインはまた、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ガンマ鎖（Ｄ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ガンマ鎖、ＣＤ３－ＧＡＭＭＡ、Ｔ３Ｇ、ガンマポリペプチド（ＴｉＴ３複合体などとしても知られている）に由来する場合もある。例えば、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列の、約１００のアミノ酸～約１１０のアミノ酸（ａａ）、約１１０のａａ～約１１５のａａ、約１１５のａａ～約１２０のａａ、約１２０のａａ～約１３０のａａ、約１３０のａａ～約１４０のａａ、約１４０のａａ～約１５０のａａ、又は約１５０のａａ～約１８０のａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN (Uniprot P09693-1)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0040】

同様に、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、全長ＣＤ３ガンマアミノ酸配列のＩＴＡＭ含有部分を含むことができる。従って、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
DQLYQPLKDREDDQYSHLQGN (Uniprot P09693-1 aa 157-177)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0041】

ＩＴＡＭ含有ドメインはまた、ＤＡＰ１２（ TＹＲＯＢＰ ；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質; ＫＡＲＡＰ； ＰＬＯＳＬ； ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２； ＫＡＲ関連タンパク質; ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質; キラー活性化受容体関連タンパク質; キラー活性化受容体関連タンパク質; 等としても知られている）に由来する場合がある。例えば、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列（４つのイソフォーム）：Uniprot O43914-1; Uniprot O43914-2; Uniprot O43914-3; Uniprot X6RGC9-1のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0042】

同様に、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、全長ＤＡＰ１２アミノ酸配列のＩＴＡＭ含有部分を含むことができる。従って、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
ESPYQELQGQRSDVYSDLNTQ (Uniprot O43914-1 aa 88-108)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0043】

ＩＴＡＭ含有ドメインはまた、ＦＣＥＲ１Ｇ（ ＦＣＲＧ ；Ｆｃイプシロン受容体Iガンマ鎖; Ｆｃ受容体ガンマ鎖; ｆｃ－イプシロンＲｌ－ガンマ; ｆｃＲｇａｍｍａ； ｆｃｅＲＩガンマ; 高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ; 免疫グロブリンＥ受容体、高親和性、ガンマ鎖; 等とも呼ばれる）に由来する場合がある。例えば、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (Uniprot P30273)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0044】

同様に、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、全長ＦＣＥＲ１Ｇアミノ酸配列のＩＴＡＭ含有部分を含むことができる。従って、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
DGVYTGLSTRNQETYETLKHE (Uniprot P30273 aa 62-82)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0045】

ＩＴＡＭ含有ドメインはまた、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖; ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連アルファ）; ＭＢ－１膜糖タンパク質; ig-alpha; 膜結合免疫グロブリン関連タンパク質; 表面ＩｇＭ関連タンパク質; 等とも呼ばれる）に由来する場合がある。例えば、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列（２つのイソフォーオム）のいずれかの、約１００のアミノ酸～約１１０のアミノ酸（ａａ）、約１１０のａａ～約１１５のａａ、約１１５のａａ～約１２０のａａ、約１２０のａａ～約１３０のａａ、約１３０のａａ～約１５０のａａ、約１５０のａａ～約２００のａａ、又は約２００のａａ～約２２０のａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (Uniprot P11912-1) 又は
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (Uniprot P11912-2)、ここでＩＴＡＭモチーフは、太字で、下線が引かれている。

【0046】

同様に、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、全長ＣＤ７９Ａアミノ酸配列のＩＴＡＭ含有部分を含むことができる。従って、適切なＩＴＡＭ含有ドメインは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG (Uniprot P11912-1 aa 185-205)、ここでＩＴＡＭは、太字で、下線から引かれている。

【0047】

従って、本発明によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つのＣＡＲ分子のエンドドメインは、少なくとも１つのＩＴＡＭを優先的に含み、前記ＩＴＡＭは、好ましくはＣＤ３ゼータ、ＤＡＰ１２、Ｆｃ－イプシロン受容体１ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）から選択される。

【0048】

ＩＴＡＭの数は、ＣＡＲのシグナル伝達効率と相関するので（James, Sci Signal. 2018;11(531)）、ＣＡＲの群は好ましくは、最後の３つのＩＴＡＭを全て含み、ここでＩＴＡＭは、前記群の単一のＣＡＲ分子のみに限定され得る。あるいは、前記群のいくつかの又は全てのＣＡＲ分子は、少なくとも１つのＩＴＡＭを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、前記群のＣＡＲ分子の異なるエンドドメインにおけるＩＴＡＭ含有部分は、同じ受容体に由来し、一方、他の実施形態によれば、前記群のＣＡＲ分子の異なるエンドドメインにおけるＩＴＡＭ含有部分は、異なる受容体に由来する。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲの群は、好ましくは、ＣＤ３ゼータに由来する、ＩＴＡＭ含有部分を含む１つの分子のみを含む。他の実施形態によれば、ＣＡＲの群は、２つの分子から成り、ここで両者は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質ドメインの一部を含む。ベクトルペイロードに関しては、ＣＡＲの群内のＩＴＡＭ総数は、好ましくは３～６である。さらに、ＩＴＡＭ含有配列は、相同組換えのリスクを最少にするために、ヌクレオチド配列の相同性を最小限にするように選択及び／又は操作される。

【0049】

５．共刺激ドメイン：
好ましい実施形態によれば、前記群の少なくとも１つのＣＡＲ分子のエンドドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭ由来の共刺激ドメインを含むシグナル伝達領域を含み、それにより、ＣＡＲの群に含まれる共刺激ドメインは、任意には、異なる共刺激受容体に由来することができる。

【0050】

ＣＡＲの群のＣＡＲ分子の共刺激シグナル伝達領域に含めるのに適切な共刺激ドメインは、約３０のａａ～約７０のａａの長さを有することができ、例えば共刺激ドメインは、約３０の aa ～約３５のaa、 約３５のaa ～ 約４０のaa、 約４０のaa ～ 約４５のaa、 約４５のaa ～ 約５０のaa、 約５０のaa ～ 約５５のaa、 約５５のaa ～ 約６０のaa、 約６０のaa ～ 約６５のaa、又は約６５のaa ～ 約７０のaaの長さを有することができる。任意には、共刺激ドメインは、約７０のａａ～約１００のａａ、約１００のａａ～約２００のａａ、又は２００以上のａａの長さを有することができる。

【0051】

特に好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質４－１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９； ＣＤ１３７; ４－１ＢＢ； ＣＤｗ１３７； ＩＬＡ; 等としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７０１１ ａａ ２１４-２５５に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0052】

好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２８（また、Ｔｐ４４としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０７４７ ａａ １７７８－２２０に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0053】

特に好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＩＣＯＳ（また、ＡＩＬＩＭ、ＣＤ２７８及び ＣＶＩＤ１としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ６Ｗ８ ａａ １６５-１９９に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0054】

好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２７（また、Ｓ １５２、Ｔ１４、ＴＮＦＲＳＦ７及びＴｐ５５としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２６８４２ ａａ ２１２-２６０に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0055】

好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＯＸ－４０（また、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＰ５－９０２Ｐ８．３、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、 ＯＸ４０、ＴＸＧＰ１Ｌとしても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４３４８９ ａａ ２４１-２７７に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0056】

他の実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＢＴＬＡ（また、ＢＴＬＡ１及びＣＤ２７２としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７Ｚ６Ａ９ ａａ １７６-２８９に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0057】

他の実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＧＩＴＲ（また、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＰ５－９０２Ｐ８．２、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７及びＧＩＴＲ－Ｄとしても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ５Ｕ５ ａａ １８８-２４１に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0058】

他の実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＨＶＥＭ（また、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＲＰ３－３９５Ｍ２０．６、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７０、ＨＶＥＡ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ及びＴＲ２としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９２９５６ ａａ ２２４-２８３に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９。

【0059】

他の実施形態によれば、ＣＡＲの群の少なくとも１つの分子における共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ３０（また、ＴＮＦＲＳＦ８、Ｄ１Ｓ１６６Ｅ、 及びＫｉ－１としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２８９０８ ａａ ４０９-５９５の、約１００のアミノ酸～約１１０のアミノ酸（ａａ）、約１１０のａａ～約１１５のａａ、約１１５のａａ～約１２０のａａ、約１２０のａａ～約１３０のａａ、約１３０のａａ～約１４０のａａ、約１４０のａａ～約１５０のａａ、約１５０のａａ～約１６０のａａ、又は約１６０のａａ～約１８５のａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0060】

６．阻害ドメイン：
ＣＡＲの群が阻害シグナルを誘発することも目的としている場合、前記群の少なくとも１つのＣＡＲ分子のエンドドメインは、ＰＤ－１、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ９６、ＫＩＲ２ＤＬ、ＫＩＲ３ＤＬ、ＳＬＡＭファミリーメンバー、ＣＤ３００ / ＬＭＩＲファミリーメンバー、ＣＤ２２及びその他のＳｉｇｌｅｃファミリーメンバーから優先的に選択された阻害受容体のＩＴＩＭ含有細胞質部分（又はその一部）を含むシグナル伝達領域を含み、それにより、ＣＡＲの群により含まれる阻害シグナル伝達領域は、任意には、異なる阻害受容体に由来することができる。阻害ＩＴＩＭは、当業界において良く知られており（Ravetch and Lanier, Science. 2000;290(5489):84; Barrow and Trowsdale, Eur J Immunol. 2006;36(7):1646）、そしてそれぞれの阻害ドメインの配列は、例えば米国特許第２０１８／００４４３９９ Ａ１号 及び 米国特許第２０１７／０２６０２６８ Ａ１号に開示されている。原則として、例えばＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３又はＣＤ５などのＩＴＩＭとは独立してそれらの阻害機能を媒介する他の阻害受容体の細胞質ドメインもまた、ＣＡＲ分子の阻害シグナル伝達領域に含めるのに適切である。

【0061】

ＣＡＲの群のＣＡＲ分子の阻害シグナル伝達領域に含めるのに適切な阻害ドメインは、約３０のａａ～約１００のａａの長さを有することができ、例えば阻害ドメインは、約３０の aa ～約５０のaa、 約５０のaa ～ 約７０のaa、 又は約７０のaa ～ 約１００のaaの長さを有する。他の場合、阻害ドメインは、約１００のａａ～約１００のａａ～約２００のａａ、又は２００以上のａａの長さを有することができる。

【0062】

例えば、適切な阻害ドメインは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：ＰＤ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５１１６ ａａ １９２-２８８）、ＣＤ８５Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５０２２ ａａ ４６５-６３１）、ＣＤ８５Ｃ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５０２３ ａａ ４８０-５９０）、ＣＤ８５Ｄ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｎ４２３ ａａ ４８３-５９８）、ＣＤ８５Ｋ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＨＪ６ ａａ ２８１-４４８） ）、ＫＩＲ３ＤＬ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｎ７４３ ａａ ３４４-４１０）、ＫＩＲ３ＤＬ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４３６２９ ａａ ３６１-４４４）、ＫＩＲ３ＤＬ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４３６３０ ａａ ３６１-４５５）、ＣＴＬＡ4（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６４１０ ａａ １８３-２２３）、ＬＡＧ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８６２７ ａａ ４７２-５２５）、ＴＩＭ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＴＤＱ０ ａａ ２２４-３０１）、ＬＡＩＲ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＧＴＸ８ ａａ １８７-２８７）、 ＫＩＲ２ＤＬ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４３６２７ ａａ ２６５-３４８）、ＣＤ８５Ｊ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＨＬ６ ａａ ４８３-６５０）、ＴＩＧＩＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ４９５Ａ１ ａａ １６３-２４４）、ＣＥＡＣＡＭ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１３６８８ ａａ ４５３-５２６）、ＣＤ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６１２７ ａａ ４０３-４９５）、ＣＤ９６（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４０２００ ａａ ５４１-５８５）、ＣＤ２２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３ ａａ ７０７-８４７）、 ＣＳＦ１Ｒ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０７３３３ ａａ ５３９-９７２）。

【0063】

７．リンカー：
ＣＡＲの群の分子は、いずれか２つの隣接するドメイン（すなわち、ＣＡＲ分子の成分）の間にリンカーを含むことができる。例えば、リンカーは、膜貫通ドメインとシグナル伝達領域との間に配置され得る。別の例として、リンカーは、シグナル伝達領域と二量体化ドメインとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、２つの二量体化ドメインの間に配置され得る。 別の例として、リンカーは、２つのシグナル伝達領域の間に配置され得る。別の例として、リンカーは、膜貫通ドメインと二量体化ドメインとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、抗原結合部分と膜貫通ドメインとの間のＣＡＲ分子の外部ドメインに配置されえる。別の例として、リンカーは、別のポリペプチドが結合することができる結合部位と膜貫通ドメインとの間のＣＡＲ分子の外部ドメインに配置され得る。別の例として、リンカーは、シグナル配列と抗原結合部分との間のＣＡＲ分子の外部ドメインに配置され得る。別の例として、リンカーは、シグナル配列と別のポリペプチドが結合することができる結合部位との間のＣＡＲ分子の外部ドメインに配置され得る。別の例として、リンカーは、シグナル配列と二量体化ドメインとの間のＣＡＲ分子の外部ドメインに配置され得る。別の例として、リンカーは、二量体化ドメインと抗原結合部分との間のＣＡＲ分子の外部ドメインに配置され得る。別の例として、リンカーは、二量体化ドメインと別のポリペプチドが結合することができる結合部位との間のＣＡＲ分子の外部ドメインに配置され得る。

【0064】

リンカーは、長さが約１～約４０のアミノ酸を含むペプチドであり得る。連結ペプチドは、適切なリンカーが好ましくは一般に柔軟なペプチドをもたらす配列を有することを念頭に置いて、事実上任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシン、セリン、アラニンなどの小さなアミノ酸は、柔軟なペプチドを作成する際に使用することが好ましい。そのような配列の作成は、当業者にとって日常的である。適切なリンカーは容易に選択され得、そして異なる長さのもの、例えば1つのアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０のアミノ酸、２つのアミノ酸～１５のアミノ酸、３つのアミノ酸～１２のアミノ酸、４つのアミノ酸～１０のアミノ酸、５つのアミノ酸～９つのアミノ酸、６ つのアミノ酸～８つのアミノ酸、又は７つのアミノ酸～８つのアミノ酸の長さであり、そして、１、２、３、４、５、６、又は７つのアミノ酸であり得る。例示的な柔軟なリンカーは、以下を含む：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン-セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ及び（ＧＧＧＳ）ｎ（ここでnは少なくとも1の整数である）を含む）、又はグリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野で知られている他の柔軟なリンカー。例示的な柔軟なリンカーは、以下を含む：ＧＧＳＧ（配列番号１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号 ６）、及び同様のもの。当業者は、上記の任意の要素に結合されたペプチドの設計が全て又は部分的に柔軟であるリンカーを含み得、結果的に、リンカーは柔軟なリンカー及び柔軟でない構造を与える１又は２以上の部分を含むことができることを認識するであろう。

【0065】

８．追加のドメイン：
ＣＡＲの対象群の分子は、１又は２以上の追加のポリペプチドをさらに含むことができ、ここでそのようなドメインは、例えばシグナル配列；エピトープタグ；及び／又は検出できるシグナルを生成するポリペプチドを含む。ＣＡＲの対象の群への使用のために適切であるシグナル配列は、天然に存在するシグナル配列、合成（例えば、人工の）シグナル配列などを含む、任意の真核生物シグナル配列を含む。適切なエピトープタグは、以下を含む：例えば、血球凝集素（ＨＡ;例えば、アミノ酸配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号７））、ＦＬＡＧ（例えば、アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号８））、c-ｍｙｃ（例えば、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号９））、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ（例えば、アミノ酸配列ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号７６））、ヘキサヒスチジンタグ（６ｘＨＩＳ;例えば、アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号７７））、及び同様のもの。適切な検出できるシグナル産生タンパク質は、例えば蛍光タンパク質などを含む。適切な蛍光タンパク質は、以下を含む：例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、、増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、シトリン、ｍシトリン、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、セルリアン、Ｔサファイア、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－モノマー、Ｊ－Ｒｅｄ、ダイマー２、t-ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、レニラＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、楓タンパク質及びキンドリングタンパク質、Ｂ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン及びアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質及びフィコビリタンパク質コンジュゲート。蛍光タンパク質の他の例は、以下を含む：ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅｌ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909）、及び同様のもの。例えば、Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973に記載されるように、花中類からの種々の蛍光及び着色タンパク質のいずれかが、使用に適している。

【0066】

９．二量体化ドメイン：
２つのＣＡＲ分子を含むＣＡＲの群の複合体化は、ＣＡＲ分子当たり単一の二量体化ドメインにより媒介され得、それにより、このドメインは、ホモ二量体化又はヘテロ二量体化のためのドメインであり得る。ＣＡＲの群が、３又は４つのＣＡＲ分子を含む実施形態によれば、前記群の少なくとも１つのＣＡＲ分子は、好ましくは、二量体化を通して三量体又は四量体の形成を促進するために、２つ以上の二量体化ドメインを含む。

【0067】

９．１条件付きホモ二量体化のための二量体化ドメイン：
好ましい実施形態によれば、ホモ二量体化のための適切な二量体化ドメインの例は、以下を含む：ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ＦＫＰＢ変異体Ｆ３６Ｖ（ｄｍｒＢ）、ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）。それらのホモ二量体化ドメインの配列、及びそれらのホモ二量体化に適切な調節分子は、当業界において知られており（Rutkowska et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2012;51(33):8166）、そして例えば国際公開第ＷＯ２０１４２７２６１号に開示されている。

【0068】

例えば、二量体化ドメインは、ＦＫＢＰに由来し、そしてアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６２９４２－１に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0069】

別の例として、二量体化ドメインは、ＧｙｒＢ（また、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢとしても知られている）に由来し、そして大腸菌 Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０ＡＥＳ６－１のＧｙｒＢアミノ酸配列（又は任意の生物のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ配列）の約１００のアミノ酸～約１１０のアミノ酸（ａａ）、約２００のａａ～約３００のａａ、約３００のａａ～約４００のａａ、約４００のａａ～約５００のａａ、約５００のａａ～約６００のａａ、約６００のａａ～約７００のａａ、又は又は約７００のａａ～約８００のａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合、二量体化ドメインは、大腸菌からのＧｙｒＢアミノ酸配列のアミノ酸１－２２０に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0070】

別の例として、二量体化ドメインは、ＤＨＦＲ（また、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＤＨＦＲＰ１、及びＤＹＲとしても知られている）に由来し、そしてアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００３７４－１に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0071】

別の例として、二量体化ドメインは、ＤｍｒＢ結合ドメイン（すなわち、ＤｍｒＢホモ二量体化ドメイン）に由来し、そして配列番号１０に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0072】

二量体化は、異なる調節分子、例えばＦＫＢＰのホモ二量体化のためのＦＫ１０１２及びＡＰ１５１０（Amara et al. PNAS 1997;94(20):10618）；ＧｙｒＢのホモ二量体化のためのクメルマイシン又はクメルマイシンの類似体（Ｐｕｂｃｈｅｍ ＣＩＤ ５４６７５７６８）（Farrar et al. Nature. 1996;383:178; 及び 米国特許第 ６，９１６，８４６号）；ＤＨＦＲのホモ二量体化のためのメトトレキサートのホモ二官能性二量体（ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ １２６９４１）（例えば、米国特許第８，２３６，９２５号に開示されるような）；及び好ましい実施形態によれば、ＤｍｒＢのホモ二量体化のためのＡＰ２０１８７（ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ７８３５７７８４）及びＡＰ１９０３（ＰｕｂＣｈｅｎ ＣＩＤ１６１３５６２５）により達成され得る。

【0073】

９．２．条件付きへテロ二量体化のための二量体化ドメイン：
２．２．１．核内受容体からのリガンド結合ドメインに基くＣＡＲ分子の条件付きへテロ二量体化：

【0074】

好ましい実施形態によれば、本発明によるＣＡＲの群の少なくとも２つのＣＡＲ分子は、核内受容体からのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）である１つのメンバー及び共調節ペプチドである第２のメンバーを含む一対のヘテロ二量体化ドメインによりへテロ二量体化され得る。適切な小分子（すなわち、本発明による調節分子）の結合に基いて核内受容体に由来するＬＢＤは、それぞれの共調節ペプチドとヘテロ二量体化することができる。このシステムは、目的のタンパク質のヘテロ二量体化のために使用され得る。ＬＢＤ及び共調節ペプチドの適切な配列は、適切な調節分子と一緒に、例えば米国特許第２０１７／０３０６３０３Ａ１号に開示されている。適切なＬＢＤは、以下を含む、種々の核内受容体のいずれかから選択され得る：ＥＲ－アルファ、ＥＲ－ベータ、ＰＲ、ＡＲ、ＧＲ、ＭＲ、ＲＡＲ－アルファ、ＲＡＲ－ベータ、ＲＡＲ－ガンマ、ＴＲ－アルファ、ＴＲ－ベータ、ＶＤＲ、ＥｃＲ、ＲＸＲ－アルファ、ＲＸＲ－ベータ、ＲＸＲ－ ガンマ、ＰＰＡＲ－アルファ、ＰＰＡＲ－ベータ、ＰＰＡＲ－ガンマ、ＬＸＲ－アルファ、ＬＸＲ－ベータ、ＦＸＲ、ＰＸＲ、ＳＸＲ、構成的アドロストラン受容体、ＳＦ－１、ＬＲＨ－１、ＤＡＸ－１、ＳＨＰ、ＴＬＸ、ＰＮＲ、ＮＧＦ１－Ｂ－アルファ、ＮＧＦ１－Ｂ－ベータ、ＮＧＦ１－Ｂ－ガンマ、ＲＯＲ－アルファ、ＲＯＲ－ベータ、ＲＯＲ－ガンマ、ＥＲＲ－アルファ、ＥＲＲ－ベータ、ＥＲＲ－ガンマ、ＧＣＮＦ、ＴＲ２／４、ＨＮＦ－４、ＣＯＵＰ－ＴＦ－アルファ、ＣＯＵＰ－ＴＦ－ベータ、及びＣＯＵＰ－ＴＦ－ ガンマ。

【0075】

核内受容体（核内ホルモン受容体と同義語）の略語は、次の通りである。Ｒ：エストロゲン受容体; ＰＲ：プロゲステロン受容体; ＡＲ：アンドロゲン受容体; ＧＲ：糖質コルチコイド受容体; ＭＲ：鉱質コルチコイド受容体; ＲＡＲ：レチノイン酸受容体; ＴＲ－アルファ/ベータ：甲状腺受容体; ＶＤＲ：ビタミンＤ３受容体; ＥｃＲ：エクジソン受容体; RXR：レチノイン酸Ｘ受容体; ＰＰＡＲ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体; ＬＸＲ：肝臓Ｘ受容体; ＦＸＲ：ファルネソイドＸ受容体; ＰＸＲ / ＳＸＲ：プレグナンＸ受容体/ステロイド及び生体異物受容体; ＳＦ－１：ステロイド産生因子１; ＤＡＸ－１：投与量に敏感な性転換－Ｘ染色体上の副腎形成不全先天性臨界領域、遺伝子１; ＬＲＨ－１：肝臓受容体ホモログ１; ＳＨＰ：小さなヘテロダイマーパートナー； ＴＬＸ：テールレス遺伝子; ＰＮＲ：光受容体特異的核内受容体; ＮＧＦ１－Ｂ：神経成長因子; ＲＯＲ：ＲＡＲ関連オーファン受容体; ＥＲＲ：エストロゲン関連受容体; ＧＣＮＦ：生殖細胞核因子; Ｒ２/４：精巣受容体; ＨＮＦ－４：肝細胞核因子; ＣＯＵＰ－ＴＦ：チキンオーバルブミン上流プロモーター、転写因子。

【0076】

９．２．１．１ ＬＢＤ：
ミネラルコルチコイド受容体：
場合によっては、１対のヘテロ二量体化ドメインのメンバーとして含めるのに適したＬＢＤは、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤはＭＲのＬＢＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２３５）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0077】

例えば、ＭＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＩＡＣ６．１ ａａ １１２－３５９; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９１５７３．１ ａａ ３６５－６１２; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５７Ｎ１ ａａ ７３４－９８１; ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＧ１１０７２．１ ａａ １７３－５０１; ＰＤＢ ２ＡＡ６＿Ａ ａａ ２８－２７５; ＰＤＢ ２ＡＡ２＿Ａ ａａ ２８－２７５; ＰＤＢ ２Ａ３Ｉ＿Ａ ａａ ６－２５３； ＰＤＢ ２ＯＡＸ＿Ａ ａａ ９－２５６; ＰＤＢ １Ｙ９Ｒ＿Ａ ａａ ８－２５５; ＰＤＢ ２ＡＢＩ＿Ａ ａａ ９－２５６、そして約２００のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸の長さ、又は２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する；例えば、２４８のアミノ酸の長さを有する）。

【0078】

例えば、ＭＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２３５ ａａ ６８６－９８４に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２５０のアミノ酸～２９９のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、又は２７５のアミノ酸～２９９のアミノ酸の長さを有する）。

【0079】

例えば、ＭＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２３５ ａａ ７３７－９８４に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２００のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有し；例えば、２４８のアミノ酸の長さを有する）。

【0080】

例えば、ＭＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２３５ ａａ ６８６－９８４(Ｓ８１０Ｌ置換を有する)に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２５０のアミノ酸～２９９のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、又は２７５のアミノ酸～２９９のアミノ酸の長さを有する）。

【0081】

例えば、ＭＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２３５ ａａ ７３７－９８４(Ｓ８１０Ｌ置換を有する)に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２００のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有し；例えば、２４８のアミノ酸の長さを有する）。

【0082】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＭＲのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列SLTARHKILHRLLQEGSPSDI (Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５７８８ ａａ ６８１－７０１)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約２１のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、２１のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0083】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＭＲのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列QEAEEPSLLKKLLLAPANTQL (Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＢＫ２ ａａ １３６－１５６)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約２１のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、２１のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0084】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＭＲのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列SKVSQNPILTSLLQITGNGGS (Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５６４８ ａａ ５９６－６１６)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約２１のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、２１のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0085】

アンドロゲン受容体：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、アンドロゲン受容体のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＡＲのＬＢＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0086】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６１９－９１９に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２５０のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、又は２７５のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する）。

【0087】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６９０－９１９に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約１９０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２１０のアミノ酸、又は２１０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する）。

【0088】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６１９－９１９（Ｔ８７７Ａ置換を有する）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２５０のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、又は２７５のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する）。

【0089】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６９０－９１９（Ｔ８７７Ａ置換を有する）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約１９０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２１０のアミノ酸、又は２１０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する）。

【0090】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６１９－９１９（Ｆ８７６Ｌ置換を有する）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２５０のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、又は２７５のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する）。

【0091】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６９０－９１９（Ｆ８７６Ｌ置換を有する）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約１９０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２１０のアミノ酸、又は２１０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する）。

【0092】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６１９－９１９（Ｆ８７６Ｌ及びＴ８７７Ａ置換を有する）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約２５０のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、又は２７５のアミノ酸～３０１のアミノ酸の長さを有する）。

【0093】

例えば、ＡＲのＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０２７５ ａａ ６９０－９１９（Ｆ８７６Ｌ及びＴ８７７Ａ置換を有する）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、そして約１９０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２１０のアミノ酸、又は２１０のアミノ酸～２３０のアミノ酸の長さを有する）。

【0094】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＡＲのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列ESKGHKKLLQLLTCSSDDR (Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ６Ｑ９ ａａ ６１４－６３２)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約１９のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、１９のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0095】

プロゲステロン受容体：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、プロゲステロン（ＰＲ）受容体のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＰＲのＬＢＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６４０１）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0096】

例えば、ＰＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＵＶＹ３ ａａ ４５６－７０３; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０７８１２．１ ａａ ５３９－７８６; ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＱ１４５１８．１ ａａ ３０６－５５３; ＰＤＢ １ＳＲ７＿Ａ ａａ １２－２５９; ＰＤＢ １ＳＱＮ＿Ａ ａａ １４－２６１; ＰＤＢ １Ｅ３Ｋ ａａ １１－２５８; ＰＤＢ １Ａ２８＿Ａ ａａ ９－２５６;そして約２００のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有し；例えば、２４８のアミノ酸の長さを有する）。

【0097】

例えば、ＰＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６４０１ ａａ ６７８－９３３;そして約２００のアミノ酸～２５６のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２５６のアミノ酸の長さを有し；例えば、２５６のアミノ酸の長さを有する）。

【0098】

例えば、ＰＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６４０１ ａａ ６８６－９３３;そして約２００のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有し；例えば、２４８のアミノ酸の長さを有する）。

【0099】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＰＲのＬＢＤである場合、二量体化ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF (Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５３７６ ａａ ２２５１－２２７５)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約２５のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0100】

甲状腺ホルモン受容体－β：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、甲状腺ホルモン受容体－β（ＴＲ－β）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＴＲ－β（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２８）のＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0101】

例えば、ＴＲ－βのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ４Ｔ８Ｖ６ ａａ ２２３－５０２; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９０３８２．１ ａａ １５９－４０１; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８１１５．２ ａａ １７０－４１２; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＰＶＥ４．２ ａａ １４１－３９２; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２８．２ ａａ ２１６－４５８; ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＳ１１２４９．１ ａａ １７９－４１９; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＸＰ＿００１１８５９７７．１ ａａ １８６－４１６; ＰＤＢ １ＮＡＶ＿Ａ ａａ １７－２５９; ＰＤＢ ２ＰＩＮ＿Ａ ａａ ８－２５０； ＰＤＢ ３Ｄ５７＿Ａ ａａ ２２－２６４; ＰＤＢ １Ｎ４６＿Ａ ａａ １３－２５５; ＰＤＢ １ＢＳＸ＿Ａ ａａ １５－２５７;そして約２００のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２３０のアミノ酸、２３０のアミノ酸～２４０のアミノ酸、又は２４０のアミノ酸～２５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0102】

例えば、ＴＲ－βのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２８ ａａ ２０２－４６１;そして約２００のアミノ酸～２６０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２６０のアミノ酸を有し；例えば、２６０のアミノ酸の長さを有する）。

【0103】

例えば、ＴＲ－βのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２８ ａａ ２１６－４６１;そして約２００のアミノ酸～２４６のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２４６のアミノ酸を有し；例えば、２４６のアミノ酸の長さを有する）。

【0104】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーが、ＴＲ－βのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、例えばアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ６Ｑ９ ａａ ６２７-８２９ 又は Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ６Ｑ９ ａａ ６７３－７５０ 又は Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５５９６ ａａ ７２１－１０２１を含むＮＣＯＡ３／ＳＲＣ３ポリペプチドであり得る。

【0105】

エストロゲン受容体－α：
好ましい実施形態によれば、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、エストロゲン受容体－α（ＥＲ－α）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＥＲ－αのＬＢＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３３７２）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0106】

例えば、ＥＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６２１２．１ ａａ ３０４－５４１; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ８１５５９．１ ａａ ３０２－５３９; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７ＺＵ３２ ａａ ２８０－５１７; ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＢ１０６４９．１ ａａ ３０３－５２９; ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＱ４２６９６．１ ａａ ２２６－４６８; GｅｎＢａｎｋ ＡＣＣ８５９０３．１ ａａ １４１－３７５; ＰＤＢ １ＸＰ９＿Ａ ａａ ４－２４１; PＤＢ １ＹＹ４＿Ａ ａａ １－２３６；そして約２００のアミノ酸～２４０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２３０のアミノ酸、２３０のアミノ酸～２３５のアミノ酸、又は２３５のアミノ酸～２４０のアミノ酸の長さを有する）。

【0107】

例えば、ＥＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３３７２ ａａ ３０５－５３３；そして約１８０のアミノ酸～２２９のアミノ酸の長さを有する（例えば、１８０のアミノ酸～２００のアミノ酸、又は２００のアミノ酸～２２９のアミノ酸の長さを有し；例えば、２２９のアミノ酸の長さを有する）。

【0108】

例えば、ＥＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３３７２ ａａ ２８２－５９５；そして約２５０のアミノ酸～３１４のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、２７５のアミノ酸～３００のアミノ酸、又は３００のアミノ酸～３１４のアミノ酸の長さを有し；例えば、３１４のアミノ酸の長さを有する）。

【0109】

例えば、ＥＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３３７２ ａａ ３１０－５４７；そして約１９０のアミノ酸～２３８のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２２０のアミノ酸、又は２２０のアミノ酸～２３８のアミノ酸の長さを有し；例えば、２３８のアミノ酸の長さを有する）。

【0110】

例えば、ＥＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３３７２ ａａ ３０５－５３３（置換Ｄ３５１Ｙを有する）；そして約１８０のアミノ酸～２２９のアミノ酸の長さを有する（例えば、１８０のアミノ酸～２００のアミノ酸、又は２００のアミノ酸～２２９のアミノ酸の長さを有し；例えば、２２９のアミノ酸の長さを有する）。

【0111】

例えば、ＥＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３３７２ ａａ ２８２－５９５（置換Ｄ３５１Ｙを有する）；そして約２５０のアミノ酸～３１４のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、２７５のアミノ酸～３００のアミノ酸、又は３００のアミノ酸～３１４のアミノ酸の長さを有し；例えば、３１４のアミノ酸の長さを有する）。

【0112】

例えば、ＥＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３３７２ ａａ ３１０－５４７（置換Ｄ３５１Ｙを有する）；そして約１９０のアミノ酸～２３８のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２２０のアミノ酸、又は２２０のアミノ酸～２３８のアミノ酸の長さを有し；例えば、２３８のアミノ酸の長さを有する）。

【0113】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＥＲ－αのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列DAFQLRQLILRGLQDD (配列番号１１)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約１６のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、１６のアミノ酸～２０のアミノ酸、２０のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0114】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＥＲ－αのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列SPGSREWFKDMLS (配列番号１２)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約１３のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、１３のアミノ酸～１５のアミノ酸、１５のアミノ酸～２０のアミノ酸、２０のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0115】

エストロゲン受容体－β（ＥＲ－β）：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、エストロゲン受容体－β（ＥＲ－β）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＥＲ－β（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９２７３１）のＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0116】

例えば、ＥＲ－βのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６２１２．１ ａａ ３０４-５４１; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ８１５５９．１ ａａ ３０２-５３９; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７ＺＵ３２ ａａ ２８０－５１７; ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＢ１０６４９．１ ａａ ３０３－５２９; ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＱ４２６９６．１ ａａ ２２６－４６８; ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣ８５９０３．１ ａａ １４１－３７５; ＰＤＢ １ＸＰ９＿Ａ ａａ ４－２４１; ＰＤＢ １ＹＹ４＿Ａ ａａ １－２３６;そして約２００のアミノ酸～２４３のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２３０のアミノ酸、２３０のアミノ酸～２３５のアミノ酸、又は２３５のアミノ酸～２４３のアミノ酸の長さを有する）。

【0117】

例えば、ＥＲ－βのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９２７３１ ａａ ２６０－５０２；そして約２００のアミノ酸～２４３のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２３０のアミノ酸、２３０のアミノ酸～２３５のアミノ酸、又は２３５のアミノ酸～２４３のアミノ酸の長さを有る）。

【0118】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＥＲ－βのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列PRQGSILYSMLTSAKQT (配列番号１３)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約１７のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、１７のアミノ酸～２０のアミノ酸、２０のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0119】

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体－γ：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体－γ（ＰＰＡＲ－γ）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＰＰＡＲ－γ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３７２３１）のＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0120】

例えば、ＰＰＡＲ－γのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７Ｔ０２９ ａａ ９５－４３５; ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＬ２６２４５．１ ａａ ９５－４３５; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＸＰ＿７８１７５０．１ ａａ １３７－３７８; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＸＰ ７８４４２９．２ ａａ ２１９－４７８; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＮＰ＿００１００１４６０．１ ａａ ２０７－４７４; ＰＤＢ ２Ｊ１４＿Ａ ａａ １７－２８４； ＰＤＢ １ＦＭ６＿Ｄ ａａ ４－２７１;そして約２００のアミノ酸～２６９のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸、又は２５０のアミノ酸～２６９のアミノ酸の長さを有する）。

【0121】

例えば、ＰＰＡＲ－γのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３７２３１ ａａ １７４－４７５；そして約１５０のアミノ酸～２０２のアミノ酸の長さを有する（例えば、１５０のアミノ酸～１６０のアミノ酸、１６０のアミノ酸～１７０のアミノ酸、１７０のアミノ酸～１９０のアミノ酸、又は１９０のアミノ酸～２０２のアミノ酸の長さを有る）。

【0122】

例えば、ＰＰＡＲ－γのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３７２３１ ａａ １８１－４７５；そして約２００のアミノ酸～２６９のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸、又は２５０のアミノ酸～２６９のアミノ酸の長さを有る）。

【0123】

例えば、ＰＰＡＲ－γのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３７２３１ ａａ ２０５－４７５；そして約２００のアミノ酸～２６９のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２５０のアミノ酸、又は２５０のアミノ酸～２７１のアミノ酸の長さを有る）。

【0124】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＰＰＡＲ－γのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS (Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５７８８－１ ａａ ６７６－７００)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約２５のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、２５のアミノ酸～２８のアミノ酸、２８のアミノ酸～２９のアミノ酸、２９のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0125】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＰＰＡＲ－γのＬＢＤである場合、ペアの第２メンバーは、アミノ酸配列PKKENNALLRYLLDRDDPSDV (配列番号１４)又はPKKKENALLRYLLDKDDTKDI (Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５５９６－１ ａａ ７３７－７５７)を含む共調節ペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約２１のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、２１のアミノ酸～２３のアミノ酸、２３のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0126】

糖質コルチコイド受容体：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０４１５０－３を有するＧＲ のＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0127】

例えば、ＧＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ４ＲＩＲ９ ａａ １１０－３５６; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４９８４４．１ ａａ ５３０－７７６; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＮＰ＿００１０３２９１５．１ ａａ ５２６－７７２; ＰＤＢ １ＮＨＺ＿Ａ ３４－２８０； ＰＤＢ １Ｍ２Ｚ＿Ａ ａａ １１－２５７; ＰＤＢ ３ＢＱＤ＿Ａ ａａ ９－２５５; ＰＤＢ ３ＣＬＤ＿Ａ ａａ １３－２５９;そして約２００のアミノ酸～２４７のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、２２５のアミノ酸～２３０のアミノ酸、２３０のアミノ酸～２４０のアミノ酸、又は２４０のアミノ酸～２４７のアミノ酸の長さを有する）。

【0128】

例えば、ＧＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０４１５０－３ ａａ ５３２－７７８；そして約２００のアミノ酸～２４７のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２５のアミノ酸、又は２２５のアミノ酸～２４７のアミノ酸の長さを有し；例えば、２４７のアミノ酸の長さを有する）。

【0129】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＧＲのＬＢＤである場合、そのペアの第２メンバーは、例えばアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５７８８ ａａ １１７２－１４４１又はそのフラグメント、又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５５９６ ａａ ３２０－１０２１又はそのフラグメントを含むＮＣＯＡ２／ＳＲＣ２ ポリペプチドであり得る。

【0130】

ビタミンＤ受容体：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＶＤＲ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１１４７３） のＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0131】

例えば、ＶＤＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ４２３９２．１ ａａ １４７-４５０; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＮＰ＿００１０７９２８８．１ ａａ １２５-４２１; ＰＤＢ ２ＨＢＨ＿Ａ ａａ ５-３０１; ＰＤＢ １Ｓ０Ｚ＿Ａ ａａ １１-２６２;そして約２５０のアミノ酸～３１０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、２７５のアミノ酸～３００のアミノ酸、又は３００のアミノ酸～３１０のアミノ酸の長さを有する）。

【0132】

例えば、ＶＤＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１１４７３ ａａ １２４-４２６；そして約２５０のアミノ酸～３０のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、２７５のアミノ酸～３００のアミノ酸、又は３００のアミノ酸～３０３のアミノ酸の長さを有する）。

【0133】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＶＤＲのＬＢＤである場合、そのペアの第２メンバーは、例えばアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５７８８ ａａ １１７２－１４４１又はそのフラグメント、又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５５９６ ａａ ３２０－１０２１又はそのフラグメントを含むＮＣＯＡ１／ＳＲＣ１ ポリペプチドであり得る。

【0134】

例えば、場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＶＤＲのＬＢＤである場合、ペアの他のメンバーは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５５９６ ａａ ７４４-７５１を含むＮＣＯＡ２／ＳＲＣ２ ポリペプチドであり得、ここで共調節ペプチドは、約８のアミノ酸～約５０のアミノ酸の長さを有する（例えば、共調節ペプチドは、８のアミノ酸～１０のアミノ酸、１０のアミノ酸～１５のアミノ酸、１５のアミノ酸～２０のアミノ酸、２０のアミノ酸～２３のアミノ酸、２３のアミノ酸～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸～３５のアミノ酸、３５のアミノ酸～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸～４５のアミノ酸、又は ４５のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さを有する）。

【0135】

甲状腺ホルモン受容体－α：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、甲状腺ホルモン受容体－α（ＴＲ－α）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＴＲ－α（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２７－２） に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0136】

例えば、ＴＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８１１５．２ ａａ １７０－４１２; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＰＶＥ４．２ ａａ １４１－３９２; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２８．２ ａａ ２１６－４５８； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＳ１１２４９．１ ａａ １７９－４１９; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＸＰ＿００１１８５９７７．１ ａａ １８６－４１６; ＰＤＢ １ＮＡＶ＿Ａ ａａ １７－２５９; ＰＤＢ ２ＰＩＮ＿Ａ ａａ ８－２５０； ＰＤＢ ３Ｄ５７＿Ａ ａａ ２２-２６４; ＰＤＢ １Ｎ４６＿Ａ ａａ １３－２５５； ＰＤＢ １ＢＳＸ＿Ａ ａａ １５－２５７;そして約１９０のアミノ酸～２４５のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２１０のアミノ酸、２１０のアミノ酸～２３０のアミノ酸、又は２３０のアミノ酸～２４５のアミノ酸の長さを有する）。

【0137】

例えば、ＴＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２７ ａａ １６２－４０４；そして約１９０のアミノ酸～２４３のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２１０のアミノ酸、２１０のアミノ酸～２３０のアミノ酸、又は２３０のアミノ酸～２４３のアミノ酸の長さを有する）。

【0138】

ＴＲ－αのための適切な共調節ペプチドは、ＳＲＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、ＳＲＣ１ポリペプチドに由来する、８のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さのペプチド）であり得る。

【0139】

レチノイン酸受容体－β：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、レチノイン酸受容体－β（ＲＡＲ－β）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、ＲＡＲ－β（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２６－２） に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0140】

例えば、ＲＡＲ－βのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ４Ｈ２Ｗ２ ａａ ４００－６３４； Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２２４４８．２ ａａ １８６－４１６; ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ２８６９９．２ ａａ ２０９－４３９; Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９１３９２．２ ａａ １７６－４０６; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＸＰ＿７７９９７６．２ ａａ １３４－３６２; ＮＣＢＩ ＲＥＦ ＳＥＱ ＸＰ＿００２２０４３８６．１ ａａ １７９－４０９; ＰＤＢ １ＸＡＰ＿Ａ ａａ ３２－２６２； ＰＤＢ １ＸＤＫ＿Ｂ ａａ ３４－２６４； ＰＤＢ １ＤＫＦ＿Ｂ ａａ ５－２３５；そして約１８０のアミノ酸～２３５のアミノ酸の長さを有する（例えば、１８０のアミノ酸～２００のアミノ酸、２００のアミノ酸～２２０のアミノ酸、又は２２０のアミノ酸～２３５のアミノ酸の長さを有する）。

【0141】

例えば、ＲＡＲ－βのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８２６ ａａ １７９－４０９；そして約１８０のアミノ酸～２３１のアミノ酸の長さを有する（例えば、１８０のアミノ酸～２００のアミノ酸、２００のアミノ酸～２２０のアミノ酸、又は２２０のアミノ酸～２３１のアミノ酸の長さを有する）。

【0142】

ＲＡＲ－βのための適切な共調節ペプチドは、ＳＲＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、ＳＲＣ１ポリペプチドに由来する、８のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さのペプチド）であり得る。

【0143】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＲＡＲ－βのＬＢＤである場合、そのペアの他のメンバーは、例えばアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５７８８ ａａ １１７２－１４４１又はそのフラグメントを含むＮＣＯＡ１／ＳＲＣ１ ポリペプチドであり得る。

【0144】

ヘテロ二量体化ドメインのペアの１つのメンバーがＲＡＲ－βのＬＢＤである場合、そのヘテロ二量体ペアの他のメンバーは、例えばアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５５５９６ ａａ ３２０－１０２１又はそのフラグメントを含むＮＣＯＡ２／ＳＲＣ２ ポリペプチドであり得る。

【0145】

ファルネソイドＸ受容体：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６ＲＩ１－２を有するＦＸＲに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0146】

例えば、ＦＸＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６ＲＩ１－２ ａａ ２３７－４７２；そして約１００のアミノ酸～１３６のアミノ酸の長さを有する（例えば、１００のアミノ酸～１１０のアミノ酸、１１０のアミノ酸～１２０のアミノ酸、又は１２０のアミノ酸～１３６のアミノ酸の長さを有する）。

【0147】

ＦＸＲのための適切な共調節ペプチドは、ＳＲＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、ＳＲＣ１ポリペプチドに由来する、８のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さのペプチド）であり得る。

【0148】

ＬＸＲ－α：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、肝臓Ｘ受容体－α（ＬＸＲ－α）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１３１３３－１を有するＬＸＲ－αのＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0149】

例えば、ＬＸＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１３１３３－１ ａａ １８２－４４７；そして約２００のアミノ酸～２６６のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２０のアミノ酸、２２０のアミノ酸～２４０のアミノ酸、又は２４０のアミノ酸～２６６のアミノ酸の長さを有する）。

【0150】

ＬＸＲ－αのための適切な共調節ペプチドは、ＳＲＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、ＳＲＣ１ポリペプチドに由来する、８のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さのペプチド）であり得る。

【0151】

ＲＯＲ－γ：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、レチノイド関連オーファン受容体－γ（ＲＯＲ－γ）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ５１４４９－２を有するＲＯＲ－γのＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0152】

例えば、ＲＯＲ－γのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ５１４４９－２ ａａ ２３７－４９７；そして約２００のアミノ酸～２６１のアミノ酸の長さを有する（例えば、２００のアミノ酸～２２０のアミノ酸、２２０のアミノ酸～２４０のアミノ酸、又は２４０のアミノ酸～２６１のアミノ酸の長さを有する）。

【0153】

ＲＯＲ－γのための適切名共調節ペプチドは、ＮＣＯＲＮＲペプチド (CDPASNLGLEDIIRKALMGSFDDK, Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７Ｚ５１６－１ ａａ ２１６０－２１８２)であり得る。

【0154】

ＲＯＲ－γのための適切な共調節ペプチドは、ＳＲＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、ＳＲＣ１ポリペプチドに由来する、８のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さのペプチド）であり得る。

【0155】

ＲＸＲ－α：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、レチノイド－Ｘ受容体－α（ＲＸＲ－α）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１９７９３－１を有するＲＸＲ－αのＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0156】

例えば、ＲＸＲ－αのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１９７９３－１ ａａ ２２５－４６２；そして約１９０のアミノ酸～２３８のアミノ酸の長さを有する（例えば、１９０のアミノ酸～２００のアミノ酸、２００のアミノ酸～２１０のアミノ酸、又は２１０のアミノ酸～２３８のアミノ酸の長さを有する）。

【0157】

ＲＸＲ－αのための適切な共調節ペプチドは、ＳＲＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、ＳＲＣ１ポリペプチドに由来する、８のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さのペプチド）であり得る。

【0158】

ＰＸＲ：
場合によっては、ヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーとして含むのに適したＬＢＤは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ－α）のＬＢＤであり得る。例えば、場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５４６９－１を有するＰＸＲのＬＢＤに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５４６９－１を有するアミノ酸１４３－４２８に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ＬＢＤは、アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５４６９－１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0159】

例えば、ＰＸＲのＬＢＤは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ：アミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５４６９－１ ａａ １３０－４３４；そして約２５０のアミノ酸～３０２のアミノ酸の長さを有する（例えば、２５０のアミノ酸～２７５のアミノ酸、２７５のアミノ酸～２９０のアミノ酸、又は２９０のアミノ酸～３０２のアミノ酸の長さを有する）。

【0160】

ＰＸＲのための適切な共調節ペプチドは、ＳＲＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、ＳＲＣ１ポリペプチドに由来する、８のアミノ酸～５０のアミノ酸の長さのペプチド）であり得る。

【0161】

９．２．１．２．共調節ポリペプチド：
適切な共調節ポリペプチドは、完全長の天然に存在する核ホルモン共調節ポリペプチドを含む。適切な共調節ポリペプチドは、天然に存在する核ホルモン共調節ポリペプチドのフラグメントを含む。適切な共調節ポリペプチドは、合成又は組換え核ホルモン共調節ポリペプチドを含む。適切な共調節ポリペプチドは、８のアミノ酸～２０００のアミノ酸の長さを有することができる。適切な共調節ポリペプチドは、８のアミノ酸 ～５０のアミノ酸、例えば、 ８のアミノ酸 ～１０のアミノ酸、 １０ のアミノ酸 ～１５ のアミノ酸、１５ のアミノ酸 ～２０ のアミノ酸、２０ のアミノ酸 ～２５のアミノ酸、２５のアミノ酸 ～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸 ～３５ のアミノ酸、３５のアミノ酸 ～４０のアミノ酸、４０のアミノ酸 ～４５のアミノ酸、又は４５のアミノ酸 ～５０のアミノ酸の長さを有することができる。適切な共調節ポリペプチドは、５０のアミノ酸 ～１００のアミノ酸、例えば、５０のアミノ酸 ～６０のアミノ酸、 ６０のアミノ酸 ～７０のアミノ酸、７０のアミノ酸 ～８０のアミノ酸、８０のアミノ酸 ～９０のアミノ酸、又は９０のアミノ酸 ～１００のアミノ酸の長さを有することができる。適切な共調節ポリペプチドは、１００のアミノ酸 ～２００のアミノ酸、２００のアミノ酸 ～３００のアミノ酸、 ３００のアミノ酸 ～４００のアミノ酸、４００のアミノ酸 ～５００ のアミノ酸、５００のアミノ酸 ～６００のアミノ酸、６００のアミノ酸 ～７００のアミノ酸、７００のアミノ酸 ～８００のアミノ酸、８００のアミノ酸 ～９００のアミノ酸、又は９００のアミノ酸 ～１０００のアミノ酸の長さを有することができる。適切な共調節ポリペプチドは、１０００のアミノ酸～２０００のアミノ酸の長さを有することができる。

【0162】

適切な共調節は、以下を含む：ステロイド受容体コアクチベーター（ＳＲＣ）－１、ＳＲＣ－２、ＳＲＣ－３、ＴＲＡＰ２２０－１、ＴＲＡＰ２２０－２、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲＩＰ１、ＣｏＲＮＲｂｏｘ、ａｌｐｈａ－ｂｅｔａＶ、ＴＩＦ１、ＴＩＦ２、ＥＡ２、ＴＡ１、ＥＡＢ１、ＳＲＣ１－１、ＳＲＣ１－２、ＳＲＣ１－３、ＳＲＣ１－４ａ、ＳＲＣ１－４ｂ、ＧＲＩＰ１－１、ＧＲＩＰ１－２、ＧＲＩＰ１－３、ＡＩＢ１－１、ＡＩＢ１－２、ＡＩＢ１－３、ＰＧＣ１ａ、ＰＧＣ１ｂ、ＰＲＣ、ＡＳＣ２－１、ＡＳＣ２－２、ＣＢＰ－１、ＣＢＰ－２、Ｐ３００、ＣＩＡ、 ＡＲＡ７０－１、ＡＲＡ７０－２、ＮＳＤ１、ＳＭＡＰ、Ｔｉｐ６０、ＥＲＡＰ１４０、Ｎｉｘ１、ＬＣｏＲ、ＣｏＲＮＲ１（Ｎ－ＣｏＲ）、ＣｏＲＮＲ２、ＳＭＲＴ、ＲＩＰ１４０－Ｃ、ＲＩＰ１４０－１、ＲＩＰ１４０－２、ＲＩＰ１４０－３、ＲＩＰ１４０－４、ＲＩＰ１４０－５、ＲＩＰ１４０－６、ＲＩＰ１４０－７、ＲＩＰ１４０－８、ＲＩＰ１４０－９、ＰＲＩＣ２８５－１、ＰＲＩＣ２８５－２、ＰＲＩＣ２８５－３、ＰＲＩＣ２８５－４及びＰＲＩＣ２８５－５。

【0163】

それぞれのＬＢＤ二量体化パートナーとのヘテロ二量体化に適した共調節ポリペプチドは、好ましくは、８のアミノ酸 ～１０のアミノ酸、１０のアミノ酸 ～ １５のアミノ酸、１５のアミノ酸 ～ ２０のアミノ酸、２０のアミノ酸 ～ ２５のアミノ酸、２５のアミノ酸 ～ ３０のアミノ酸、３０のアミノ酸 ～ ３５のアミノ酸、３５のアミノ酸 ～ ４０のアミノ酸、４０のアミノ酸 ～ ４５のアミノ酸又は ４５のアミノ酸 ～５０ のアミノ酸の長さを有し；そして好ましくは、下記アミノ酸配列の８～５０の連続したアミノ酸のストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％の配列同一性を有する：ＳＲＣ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５７８８－１）、ＳＲＣ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５５９６－１）、ＳＲＣ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ６Ｑ９－５）、ＰＧＣ１ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＢＫ２－１）、ＰＧＣ１ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８６ＹＮ６－１）、ＰＰＲＣ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＶ６７－1)、ＴＲＡＰ２２０（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５６４８－１）、ＮＣＯＡ６ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１４６８６－１)、ＣＲＥＢＢＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９２７９３－１）、ＥＰ３００（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０９４７２－１)、ＮＣＯＡ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＨＣＤ５－１）、ＮＣＯＡ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１３７７２－１）、ＴＲＩＭ２４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ１５１６４－２)、ＮＳＤ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６Ｌ７３－１）、ＢＲＤ８（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｈ０Ｅ９－２）、ＫＡＴ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９２９９３－１）、ＮＣＯＡ７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＩ０８－１）、Ｎｉｘ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＢＱＩ９－１）、ＬＣｏＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６ＪＮ０－１）、Ｎ－ＣｏＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５３７６－１）、ＮＣＯＲ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ６１８－１）、ＲＩＰ１４０（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４８５５２－１）、 ＰＲＩＣ２８５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＢＹＫ８－２)。

【0164】

好ましい実施形態によれば、適切な共調節ペプチドは、ＬＸＸＬＬモチーフを含み、ここでＸは任意のアミノ酸であり；ここで共調節ペプチドは、８ のアミノ酸 ～ ５０のアミノ酸、例えば、 ８のアミノ酸 ～１０のアミノ酸、１０ のアミノ酸 ～１２のアミノ酸、１２のアミノ酸 ～１５のアミノ酸、１５のアミノ酸 ～ ２０のアミノ酸、２０のアミノ酸 ～ ２５のアミノ酸、２５のアミノ酸 ～３０のアミノ酸、３０のアミノ酸 ～ ３５のアミノ酸、３５のアミノ酸 ～ ４０のアミノ酸、 ４０のアミノ酸 ～ ４５のアミノ酸、又は４５のアミノ酸 ～５０のアミノ酸の長さを有する。

【0165】

適切な共調節ペプチドの例は、以下の通りである：SRC1: (Uniprot Q15788-1 aa 676 - 700) CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS; SRC1-2: (Uniprot Q15788-1 aa 682 - 702; SNP rs1049021 E685A) SLTARHKILHRLLQEGSPSDI; SRC3-1: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614 - 632) ESKGHKKLLQLLTCSSDDR; SRC3: (配列番号14) PKKENNALLRYLLDRDDPSDV; PGC-1: (Uniprot Q9UBK2-1 aa 138 - 154) AEEPSLLKKLLLAPANT; PGC1a: (Uniprot Q9UBK2-1 aa 136 - 156) QEAEEPSLLKKLLLAPANTQL; TRAP220-1: (Uniprot Q15648-1 aa 596 - 616) SKVSQNPILTSLLQITGNGGS; NCoR: (Uniprot O75376-1 aa 2251 - 2275) GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF; NR0B1: (Uniprot P51843-1 aa 74 - 90) PRQGSILYSMLTSAKQT; NRIP1: (Uniprot P48552-1 aa 374 - 390) AANNSLLLHLLKSQTIP; TIF2: (Uniprot Q15596-1 aa 737 - 757) PKKKENALLRYLLDKDDTKDI; CoRNR Box: (配列番号11) DAFQLRQLILRGLQDD; abV: (配列番号12) SPGSREWFKDMLS; TRAP220-2: (Uniprot Q15648-1 aa 637 - 657) GNTKNHPMLMNLLKDNPAQDF; EA2: (配列番号 15) SSKGVLWRMLAEPVSR; TA1: (配列番号 16) SRTLQLDWGTLYWSR; EAB1: (配列番17) SSNHQSSRLIELLSR; SRC2: (Uniprot Q15596-1 aa 683 - 701) LKEKHKILHRLLQDSSSPV; SRC1-3: (Uniprot Q15788-1 aa 1428 - 1441) QAQQKSLLQQLLTE; SRC1-1: (Uniprot Q15788-1 aa 625 - 645) KYSQTSHKLVQLLTTTAEQQL; SRC1-2: (Uniprot Q15788-1 aa 682 - 702; SNP rs1049021 E685A) SLTARHKILHRLLQEGSPSDI; SRC1-3: (Uniprot Q15788-1 aa 741 - 761) KESKDHQLLRYLLDKDEKDLR; SRC1-4a: (Uniprot Q15788-1 aa 1427 - 1441) PQAQQKSLLQQLLTE; SRC1-4b: (Uniprot Q15788-1 aa 1427 - 1441 L1435R) PQAQQKSLRQQLLTE; GRIP1-1: (Uniprot Q15596-1 aa 633 - 653) HDSKGQTKLLQLLTTKSDQME; GRIP1-2: (Uniprot Q15596-1 aa 682 - 702) SLKEKHKILHRLLQDSSSPVD; GRIP1-3: (Uniprot Q15596-1 aa 737 - 757) PKKKENALLRYLLDKDDTKDI; AIB1-1: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 613 - 633) LESKGHKKLLQLLTCSSDDRG; AIB1-2: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 677 - 697) LLQEKHRILHKLLQNGNSPAE; AIB1-3: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 730 - 750) KKKENNALLRYLLDRDDPSDA; PGC1a: (Uniprot Q9UBK2-1 aa 136 - 156) QEAEEPSLLKKLLLAPANTQL; PGC1b: (Uniprot Q86YN6-1 aa 148 - 168) PEVDELSLLQKLLLATSYPTS; PRC: (Uniprot Q5VV67-1 aa 156 - 176) VSPREGSSLHKLLTLSRTPPE; TRAP220-1: (Uniprot Q15648-1 aa 596 - 616) SKVSQNPILTSLLQITGNGGS; TRAP220-2: (Uniprot Q15648-1 aa 637 - 657) GNTKNHPMLMNLLKDNPAQDF; ASC2-1: (Uniprot Q14686-1 aa 879 - 899) DVTLTSPLLVNLLQSDISAGH; ASC2-2: (Uniprot Q14686-1 aa 1483 - 1503) AMREAPTSLSQLLDNSGAPNV; CBP-1: (Uniprot Q92793-1 aa 62 - 82) DAASKHKQLSELLRGGSGSSI; CBP-2: (Uniprot Q92793-1 aa 350 - 370) KRKLIQQQLVLLLHAHKCQRR; P300: (Uniprot Q09472-1 aa 73 - 93) DAASKHKQLSELLRSGSSPNL; CIA: (Uniprot Q9HCD5-1 aa 337 - 357) GHPPAIQSLINLLADNRYLTA; ARA70-1: (Uniprot Q13772-1 aa 84 - 104) TLQQQAQQLYSLLGQFNCLTH; ARA70-2: (Uniprot Q13772-1 aa 320 - 340) GSRETSEKFKLLFQSYNVNDW; TIF1: (Uniprot O15164-2 aa 718 - 738) NANYPRSILTSLLLNSSQSST; NSD1: (Uniprot Q96L73-1 aa 899 - 919) IPIEPDYKFSTLLMMLKDMHD; SMAP: (Uniprot Q9H0E9-2 aa 263 - 283) ATPPPSPLLSELLKKGSLLPT; Tip60: (Uniprot Q92993-1 aa 481 - 501) VDGHERAMLKRLLRIDSKCLH; ERAP140: (Uniprot Q8NI08-1 aa 514 - 534) HEDLDKVKLIEYYLTKNKEGP; Nix1: (Uniprot Q9BQI9-1 aa 236 - 256) ESPEFCLGLQTLLSLKCCIDL; LCoR: (Uniprot Q96JN0-1 aa 45 - 65) AATTQNPVLSKLLMADQDSPL; CoRNR1 (N-CoR): (Uniprot O75376-1 aa 239 - 268) MGQVPRTHRLITLADHICQIITQDFARNQV; CoRNR2 (N-CoR): (Uniprot O75376-1 aa 2260 - 2273) NLGLEDIIRKALMG; CoRNR1 (SMRT): (Uniprot Q9Y618-1 aa 2131 - 2170) APGVKGHQRVVTLAQHISEVITQDTYRHHPQQLSAPLPAP; CoRNR2 (SMRT): (Uniprot Q9Y618-1 aa 2347 - 2360) NMGLEAIIRKALMG; RIP140-C: (配列番号 18) RLTKTNPILYYMLQKGGNSVA; RIP140-1: (Uniprot P48552-1 aa 13 - 33) QDSIVLTYLEGLLMHQAAGGS; RIP140-2: (Uniprot P48552-1 aa 125 - 145) KGKQDSTLLASLLQSFSSRLQ; RIP140-3: (Uniprot P48552-1 aa 177 - 197) CYGVASSHLKTLLKKSKVKDQ; RIP140-4: (Uniprot P48552-1 aa 258 - 278) KPSVACSQLALLLSSEAHLQQ; RIP140-5: (Uniprot P48552-1 aa 372 - 392) KQAANNSLLLHLLKSQTIPKP; RIP140-6: (Uniprot P48552-1 aa 493 - 513) NSHQKVTLLQLLLGHKNEENV; RIP140-7: (配列番号19) NLLERRTVLQLLLGNPTKGRV; RIP140-8: (Uniprot P48552-1 aa 811 - 831) FSFSKNGLLSRLLRQNQDSYL; RIP140-9: (Uniprot P48552-1 aa 928 - 948) RESKSFNVLKQLLLSENCVRD; PRIC285-1: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 458 - 518) ELNADDAILRELLDESQKVMV; PRIC285-2: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 541 - 561) YENLPPAALRKLLRAEPERYR; PRIC285-3: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 596 - 616) MAFAGDEVLVQLLSGDKAPEG; PRIC285-4: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 1435 - 1455) SCCYLCIRLEGLLAPTASPRP; and PRIC285-5: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 1652 - 1672) PSNKSVDVLAGLLLRRMELKP。

【0166】

場合によっては、所定のＬＢＤは、２以上の異なる共調節ポリペプチドと対にされ得る。例えば、ＰＰＡＲ－γ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３７２３１）は、以下と対にされ得る：ＳＲＣ１ (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R)、ＳＲＣ２ (Uniprot Q15596-1 aa 683-701)、ＳＲＣ３ (配列番号 14; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632)又は ＴＲＡＰ２２０ (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657)。別の例として、 ＥＲ－ＡＬＰＨＡ (Uniprot P03372) が、以下と対にされ得る：ＣｏＲＮＲ (Uniprot O75376-1 aa 239-268; Uniprot O75376-1 aa 2260-2273; Uniprot Q9Y618-1 aa 2131-2170; Uniprot Q9Y618-1 aa 2347-2360), ａｌｐｈａ－ｂｅｔａＶ (配列番号１２)又は ＴＡ１ (配列番号１６)。別の例として、ＥＲ－ｂｅｔａ (Uniprot Q92731) が、以下と対にされ得る：ＣｏＲＮＲ (Uniprot O75376-1 aa 239-268; Uniprot O75376-1 aa 2260-2273; Uniprot Q9Y618-1 aa 2131-2170; Uniprot Q9Y618-1 aa 2347-2360), alpha-betaV (配列番号12)又は TA1(配列番号16)。別の例として、 ＡＲ (Uniprot P10275) が、以下と対にされ得る： ＳＲＣ１ (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R)、ＳＲＣ２ (Uniprot Q15596-1 aa 683-701)、ＳＲＣ３ (配列番号１４; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632)又は ＴＲＡＰ２２０ (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657)。別の例として、ＰＲ (Uniprot P06401) が、以下と対にされ得る： ＳＲＣ１ (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R)、ＳＲＣ２ (Uniprot Q15596-1 aa 683-701)、 ＳＲＣ３ (配列番号１４; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632), TRAP220 (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657), NR0B1 (Uniprot P51843-1 aa 74-90)、 ＰＧＣ１Ｂ (Uniprot Q86YN6-1 aa 148-168)、 ＮＲＩＰ１(Uniprot P48552-1 aa 374-390)、 ＥＡ２ (配列番号１５)又は ＥＡＢ１ (配列番号１７)。別の例として、ＴＲ－ｂｅｔａ (Uniprot P10828) が、以下と対にされ得る： ＳＲＣ１ (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R)、ＳＲＣ２ (Uniprot Q15596-1 aa 683-701)、 ＳＲＣ３ (配列番号１４; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632)、 又はＴＲＡＰ２２０ (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657)。

【0167】

９．２．１．３．ＬＢＤベースのヘテロ二量体化のための調節分子：
ヘテロは二量体化ドメインのペアの１つのメンバーが核ホルモン受容体のＬＢＤである場合、使用される調節分子の少なくとも１つのタイプは、前記群の最初のＣＡＲ分子のＬＢＤに結合でき、その後、前記群の第２のＣＡＲ分子における共調節ペプチドと二量体化され得る。

【0168】

ＬＢＤベースのヘテロ二量体化システムのための適切な調節分子は、当業界において知られている。ＬＢＤベースのヘテロ二量体化システムのための調節分子の例は、以下を含む：コルチコステロン（（8S、9S、10R、11S、13S、14S、17S）-11-ヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,11、 12,14,15,16,17-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; デオキシコルチコステロン（（8S、9S、10R、13S、14S、17S）-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15、 16,17-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; コルチゾール（（8S、9S、10R、11S、13S、14S、17R）-11,17-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,11、 12,14,15,16-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 11-デオキシコルチゾール（（8R、9S、10R、13S、14S、17R）-17-ヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,11,12、 14,15,16-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）；コルチゾン（（8S、9S、10R、13S、14S、17R）-17-ヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,12,14、 15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3,11-ジオン）; 18-ヒドロキシコルチコステロン（（8S、9S、10R、11S、13R、14S、17S）-11-ヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-13-（ヒドロキシメチル）-10-メチル-1,2,6,7、 8,9,11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 1α-ヒドロキシコルチコステロン（（1S、8S、9S、10R、11S、13S、14S、17S）-1,11-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-1,2,6,7、 8,9,11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; アルドステロン（（8S、9S、10R、11S、13R、14S、17S）-11-ヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10-メチル-3-オキソ-1,2,6,7,8,9、 11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-13-カルバルデヒド）; アンドロステンジオン（（8R、9S、10R、13S、14S）-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン- 3,17-ジオン）; 4-ヒドロキシ-アンドロステンジオン（（8R、9S、10R、13S、14S）-4-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-デカヒドロ- 1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,17-ジオン）; 11β-ヒドロキシアンドロステンジオン（（8S、9S、10R、11S、13S、14S）-11-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-デカヒドロ- 1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,17-ジオン）; アンドロスタンジオール（（3R、5S、8R、9S、10S、13S、14S）-10,13-ジメチル-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16、 17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,17-ジオール）; アンドロステロン（（3R、5S、8R、9S、10S、13S、14S）-3-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12、 14,15,16-テトラデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-オン）; エピアンドロステロン（（3S、5S、8R、9S、10S、13S、14S）-3-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12、 14,15,16-テトラデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-オン）; アドレノステロン（（8S、9S、10R、13S、14S）-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3,11、 17-トリオン）; デヒドロエピアンドロステロン（（3S、8R、9S、10R、13S、14S）-3-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16- ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-オン）; デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（[（3S、8R、9S、10R、13S、14S）-10,13-ジメチル-17-オキソ-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15、 16-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル]硫酸水素塩）; テストステロン（（8R、9S、10R、13S、14S、17S）-17-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17- ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; エピテストステロン（（8R、9S、10R、13S、14S、17R）-17-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17- ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 5α-ジヒドロテストステロン（（5S、8R、9S、10S、13S、14S、17S）-17-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12、 14,15,16,17-テトラデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 5β-ジヒドロテストステロン（（5R、8R、9S、10S、13S、14S、17S）-17-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12、 14,15,16,17-テトラデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 5β-ジヒドロテストステロン（（5R、8R、9S、10S、13S、14S、17S）-17-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12、 14,15,16,17-テトラデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 11β-ヒドロキシテストステロン（（8S、9S、10R、11S、13S、14S、17S）-11,17-ジヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,11,12,14、 15,16,17-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 11-ケトテストステロン（（8S、9S、10R、13S、14S、17S）-17-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,12,14,15,16,17-デカヒドロ- 1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,11-ジオン）; エストロン（（8R、9S、13S、14S）-3-ヒドロキシ-13-メチル-7,8,9,11,12,14,15,16-オクタヒドロ-6H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-オン） ; エストラジオール（（8R、9S、13S、14S、17S）-13-メチル-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3,17-ジオール） ; エストリオール（（8R、9S、13S、14S、16R、17R）-13-メチル-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3,16、 17-トリオール）; プレグネノロン（1-[（3S、8S、9S、10R、13S、14S、17S）-3-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15 、16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]エタノン）; 17-ヒドロキシプレグネノロン（1-[（3S、8R、9S、10R、13S、14S、17R）-3,17-ジヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,3,4,7,8,9,11 、12,14,15,16-ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]エタノン）; プロゲステロン（（8S、9S、10R、13S、14S、17S）-17-アセチル-10,13-ジメチル-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17- ドデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 17-ヒドロキシプロゲステロン（（8R、9S、10R、13S、14S、17R）-17-アセチル-17-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,11,12,14,15、 16-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; T3（（2S）-2-アミノ-3- [4-（4-ヒドロキシ-3-ヨードフェノキシ）-3,5-ジヨードフェニル]プロパン酸）; T4（（2S）-2-アミノ-3- [4-（4-ヒドロキシ-3,5-ジヨードフェノキシ）-3,5-ジヨードフェニル]プロパン酸）; スピロノラクトン（S-[（7R、8R、9S、10R、13S、14S、17R）-10,13-ジメチル-3,5'-ジオキソスピロ[2,6,7,8,9,11,12,14、 15,16-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17,2'-オキソラン] -7-イル]エタンチオエート）; エプレレノン（PubChem CID 443872）; 酢酸シプロテロン（PubChem CID 9880）; ヒドロキシフルタミド（2-ヒドロキシ-2-メチル-N- [4-ニトロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル]プロパンアミド）; エンザルタミド（4- [3- [4-シアノ-3-（トリフルオロメチル）フェニル] -5,5-ジメチル-4-オキソ-2-スルファニリデンイミダゾリジン-1-イル] -2-フルオロ-N-メチルベンズアミド）; ARN-509（4- [7- [6-シアノ-5-（トリフルオロメチル）ピリジン-3-イル] -8-オキソ-6-スルファニリデン-5,7-ジアザスピロ[3.4]オクタン-5-イル] -2 -フルオロ-N-メチルベンズアミド）; 3,3'-ジインドリルメタン（DIM）（3-（1H-インドール-3-イルメチル）-1H-インドール）; ベキロステリド（（4aR、10bR）-8-クロロ-4-メチル-1,2,4a、5,6,10b-ヘキサヒドロベンゾ[f]キノリン-3-オン）; ビカルタミド（N- [4-シアノ-3-（トリフルオロメチル）フェニル] -3-（4-フルオロフェニル）スルホニル-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミド）; N-ブチルベンゼン-スルホンアミド（NBBS）（N-ブチルベンゼンスルホンアミド）; デュタステリド（（1S、3aS、3bS、5aR、9aR、9bS、11aS）-N- [2,5-ビス（トリフルオロメチル）フェニル] -9a、11a-ジメチル-7-オキソ-1,2,3,3a、 3b、4,5,5a、6,9b、10,11-ドデカヒドロインデノ[5,4-f]キノリン-1-カルボキサミド）; エプリステリド（（8S、9S、10R、13S、14S、17S）-17-（tert-ブチルカルバモイル）-10,13-ジメチル-2,7,8,9,11,12,14,15,16,17- デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-カルボン酸）; フィナステリド（（1S、3aS、3bS、5aR、9aR、9bS、11aS）-N-tert-ブチル-9a、11a-ジメチル-7-オキソ-1,2,3,3a、3b、4,5,5a、 6,9b、10,11-ドデカヒドロインデノ[5,4-f]キノリン-1-カルボキサミド）; フルタミド（2-メチル-N- [4-ニトロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル]プロパンアミド）; イゾンステリド（（4aR、10bR）-8-[（4-エチル-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル）スルファニル] -4,10b-ジメチル-2,4a、5,6-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[f ]キノリン-3-オン）; ケトコナゾール（1- [4- [4-[[（2R、4S）-2-（2,4-ジクロロフェニル）-2-（イミダゾール-1-イルメチル）-1,3-ジオキソラン-4-イル]メトキシ] フェニル]ピペラジン-1-イル]エタノン）; N-ブチルベンゼン-スルホンアミド（N-ブチルベンゼンスルホンアミド）; ニルタミド（5,5-ジメチル-3- [4-ニトロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル]イミダゾリジン-2,4-ジオン）; メゲストロール（（8R、9S、10R、13S、14S、17R）-17-アセチル-17-ヒドロキシ-6,10,13-トリメチル-2,8,9,11,12,14,15,16-オクタヒドロ- 1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; ツロステリド（（1S、3aS、3bS、5aR、9aR、9bS、11aS）-6,9a、11a-トリメチル-7-オキソ-N-プロパン-2-イル-N-（プロパン-2-イルカルバモイル）-2、 3,3a、3b、4,5,5a、8,9,9b、10,11-ドデカヒドロ-1H-インデノ[5,4-f]キノリン-1-カルボキサミド）; ミフェプリストン（（8S、11R、13S、14S、17S）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -17-ヒドロキシ-13-メチル-17-プロプ-1-イニル-1,2,6,7,8 、11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; リロプリストン（（8S、11R、13S、14S、17R）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -17-ヒドロキシ-17-[（Z）-3-ヒドロキシプロプ-1-エニル] -13-メチル-1 、2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; オナプリストン（（8S、11R、13R、14S、17S）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -17-ヒドロキシ-17-（3-ヒドロキシプロピル）-13-メチル-1,2,6,7,8 、11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; アソプリスニル（（8S、11R、13S、14S、17S）-11- [4-[（E）-ヒドロキシイミノメチル]フェニル] -17-メトキシ-17-（メトキシメチル）-13-メチル-1,2,6,7 、8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; J912（（8S、11R、13S、14S、17S）-17-ヒドロキシ-11- [4-[（Z）-ヒドロキシイミノメチル]フェニル] -17-（メトキシメチル）-13-メチル-1,2,6,7 、8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; CDB-2914（（8S、13S、14S、17R）-17-アセチル-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -17-ヒドロキシ-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12 、14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; JNJ-1250132（[（8S、11R、13S、14S、17R）-17-アセチル-13-メチル-3-オキソ-11-（4-ピペリジン-1-イルフェニル）-1,2,6,7,8 、11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]アセテート）; ORG-31710（（6R、8S、11R、13S、14S、17R）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -6,13-ジメチルスピロ[1,2,6,7,8,11,12,14 、15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17,2'-オキソラン] -3-オン）; ORG-33628（（8S、11R、13S、14S、17R）-11-（4-アセチルフェニル）-13-メチル-3'-メチリデンス
ピロ[1,2,6,7,8,11,12,14,15 、16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17,2'-オキソラン] -3-オン）; ORG-31806（（7S、8S、11R、13S、14S、17R）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -7,13-ジメチルスピロ[1,2,6,7,8,11,12,14 、15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17,2'-オキソラン] -3-オン）; ZK-112993（（8S、11R、13S、14S、17S）-11-（4-アセチルフェニル）-17-ヒドロキシ-13-メチル-17-プロプ-1-イニル-1,2,6,7,8、 11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; ORG-31376（（8S、11R、13S、14R、17S）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -13-メチルスピロ[1,2,6,7,8,11,12,14,15,16 -デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17,2'-オキソラン] -3-オン）; ORG-33245（（8S、13S、14S、17R）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -13-メチル-3'-メチリデンスピロ[1,2,6,7,8,11,12,14、 15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17,2'-オキソラン] -3-オン）; ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753（3-（2,2,4-トリメチル-1H-キノリン-6-イル）ベンゾニトリル）; LG120830（3-フルオロ-5-（2,2,4-トリメチル-1H-キノリン-6-イル）ベンゾニトリル）; LG1447; LG121046; CGP-19984A（ナトリウム;メチル[（2Z）-3-メチル-2-[（Z）-[5-メチル-3-（2-メチルプロプ-2-エニル）-4-オキソ-1,3-チアゾリジン- 2-イリデン]ヒドラジニリデン] -4-オキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル]ホスフェート）; RTI-3021-012（8S、11R、13S、14S、17R）-17-アセチル-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -17-ヒドロキシ-13-メチル-1,2,6,7,8、 11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; RTI-3021-022（（8S、11R、13S、14S、17R）-17-アセチル-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -17-ヒドロキシ-13-メチル-1,2,6,7,8 、11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; RTI-3021-020; RWJ-25333（（3,4-ジクロロフェニル）-（6-フェニル-4,5-ジヒドロ-3H-ピリダジン-2-イル）メタノン）; ZK-136796; ZK-114043（（8S、11R、13S、14S、17S）-11-（4-アセチルフェニル）-17-ヒドロキシ-17-[（E）-3-ヒドロキシプロプ-1-エニル] -13-メチル-1 2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; ZK-230211（（8S、11R、13S、14S、17S）-11-（4-アセチルフェニル）-17-ヒドロキシ-13-メチル-17-（1,1,2,2,2-ペンタフルオロエチル）-1 2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734（（8S、11R、13S、14S、17R）-11- [4-（ジメチルアミノ）フェニル] -17-ヒドロキシ-17-[（Z）-3-ヒドロキシプロプ-1-エニル] -13-メチル -1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; ZK-137316; アソプリスニル（（8S、11R、13S、14S、17S）-11- [4-[（E）-ヒドロキシイミノメチル]フェニル] -17-メトキシ-17-（メトキシメチル）-13-メチル-1,2,6,7 、8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 4- [17β-メトキシ-17α-（メトキシメチル）-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1-（E）-[O-（エチルアミノ）カルボニル]オキシム; （Z）-6 '-（4-シアノフェニル）-9,11α-ジヒドロ-17β-ヒドロキシ-17α-[4-（1-オキソ-3-メチルブトキシ）-1-ブテニル] 4'H-ナフト[3' 、2 '、1'; 10,9,11] estr-4-エン-3-オン; 11β-（4-アセチルフェニル）-17β-ヒドロキシ-17α-（1,1,2,2,2-ペンタ-フルオロエチル）エストラ-4,9-ジエン-3-オン; 11β-（4-アセチルフェニル）-19,24-ジノール-17,23-エポキシ-17アルファ-コラ-4,9,20-トライ-n-3-オン; （Z）-11ベータ、19- [4-（3-ピリジニル）-o-フェニレン] -17ベータ-ヒドロキシ-17α-[3-ヒドロキシ-1-プロペニル] -4-アンドロステン-3-オン; 11β-[4-（1-メチルエテニル）フェニル]-17α-ヒドロキシ-17β-β-ヒドロキシプロピル）-13α-エストラ-4,9-ジエン-3-オン; 4 '、5'-ジヒドロ-11ベータ-[4-（ジメチルアミノ）フェニル] -6ベータ-メチルスピロ[エストラ-4、-9-ジエン-17ベータ、2'（3'H）-フラン] -3-オン; ドロスピレノン（PubChem CID 68873）; T3（（2S）-2-アミノ-3- [4-（4-ヒドロキシ-3-ヨードフェノキシ）-3,5-ジヨードフェニル]プロパン酸）; KB-141（2- [3,5-ジクロロ-4-（4-ヒドロキシ-3-プロパン-2-イルフェノキシ）フェニル]酢酸）; ソベチローム（2- [4-[（4-ヒドロキシ-3-プロパン-2-イルフェニル）メチル] -3,5-ジメチルフェノキシ]酢酸）; GC-24（2- [4-[（3-ベンジル-4-ヒドロキシフェニル）メチル] -3,5-ジメチルフェノキシ]酢酸）; 4-OH-PCB106（2-クロロ-4-（2,3,4,5-テトラクロロフェニル）フェノール）; エプロチローム（3- [3,5-ジブロモ-4-（4-ヒドロキシ-3-プロパン-2-イルフェノキシ）アニリノ] -3-オキソプロパン酸）; MB07811（PubChem CID 15942005）; QH2（2-[（2E）-3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエニル] -5,6-ジメトキシ-3-メチルベンゼン-1,4-ジオール）; MB07344（[4-[（4-ヒドロキシ-3-プロパン-2-イルフェニル）メチル] -3,5-ジメチルフェノキシ]メチルホスホン酸）; タモキシフェン（2- [4-[（Z）-1,2-ジフェニルブト-1-エニル]フェノキシ] -N、N-ジメチルエタンアミン）; 4-OH-タモキシフェン（4-[（Z）-1- [4- [2-（ジメチルアミノ）エトキシ]フェニル] -2-フェニルブト-1-エニル]フェノール）; ラロキシフェン（[6-ヒドロキシ-2-（4-ヒドロキシフェニル）-1-ベンゾチオフェン-3-イル]-[4-（2-ピペリジン-1-イルエトキシ）フェニル]メタノン）; ラソフォキシフェン（（5R、6S）-6-フェニル-5- [4-（2-ピロリジン-1-イルエトキシ）フェニル] -5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-オール）; アゼドキシフェン（1-[[4- [2-（アゼパン-1-イル）エトキシ]フェニル]メチル] -2-（4-ヒドロキシフェニル）-3-メチルインドール-5-オール）; ファルソデックス（（7R、8R、9S、13S、14S、17S）-13-メチル-7- [9-（4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチルスルフィニル）ノニル] -6,7,8,9,11 、12,14,15,16,17-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3,17-ジオール）; クロミフェン（2- [4-[（E）-2-クロロ-1,2-ジフェニルエテニル]フェノキシ] -N、N-ジエチルエタンアミン）; フェマレル（）; オルメロキシフェン（1- [2- [4-[（3R、4R）-7-メトキシ-2,2-ジメチル-3-フェニル-3,4-ジヒドロクロメン-4-イル]フェノキシ]エチル]ピロリジン）; トレミフィエン（2- [4-[（Z）-4-クロロ-1,2-ジフェニルブト-1-エニル]フェノキシ] -N、N-ジメチルエタンアミン）; オスペミフェン（2- [4-[（Z）-4-クロロ-1,2-ジフェニルブト-1-エニル]フェノキシ]エタノール）; 及びエチニルエストラジオール（（8R、9S、13S、14S、17R）-17-エチニル-13-メチル-7,8,9,11,12,14,15,16-オクタヒドロ-6H-シクロペンタ[a]フェナントレン- 3,17-ジオール）; エストラジオール（（8R、9S、13S、14S、17S）-13-メチル-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3,17-ジオール） ; エチニルエストラジオール（（8R、9S、13S、14S、17R）-17-エチニル-13-メチル-7,8,9,11,12,14,15,16-オクタヒドロ-6H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3 、17-ジオール）; チアゾリジンジオン:(例：ロシグリタゾン（5-[[4- [2- [メチル（ピリジン-2-イル）アミノ]エトキシ]フェニル]メチル] -1,3-チアゾリジン-2,4-ジオン）; ピオグリタゾン（5-[[4- [2-（5-エチルピリジン-2-イル）エトキシ]フェニル]メチル] -1,3-チアゾリジン-2,4-ジオン）; ロベグリタゾン（5-[[4- [2-[[6-（4-メトキシフェノキシ）ピリミジン-4-イル]-メチルアミノ]エトキシ]フェニル]メチル] -1,3-チアゾリジン-2,4-ジオン）; トログリタゾン（5-[[4-[（6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチル-3,4-ジヒドロクロメン-2-イル）メトキシ]フェニル]メチル] -1,3-チアゾリジン-2,4 -ジオン））；ファルグリタザール（（2S）-2-（2-ベンゾイラニリノ）-3- [4- [2-（5-メチル-2-フェニル-1,3-オキサゾール-4-イル）エトキシ]フェニル]プロパン酸）; アレグリタザール（（2S）-2-メトキシ-3- [4- [2-（5-メチル-2-フェニル-1,3-オキサゾール-4-イル）エトキシ] -1-ベンゾチオフェン-7-イル]プロパン酸 ）; 及びフェノフィブリン酸（2- [4-（4-クロロベンゾイル）フェノキシ] -2-メチルプロパン酸）; ベンゾピラノキノリンA276575、マプラコラット（（2R）-1,1,1-トリフルオロ-4-（5-フルオロ-2,3-ジヒドロ-1-ベンゾフラン-7-イル）-4-メチル-2-[[（2 -メチルキノリン-5-イル）アミノ]メチル]ペンタン-2-オール）; ZK 216348（4-（2,3-ジヒドロ-1-ベンゾフラン-7-イル）-2-ヒドロキシ-4-メチル-N-（4-メチル-1-オキソ-2,3-ベンゾオキサジン-6-イル） -2-（トリフルオロメチル）ペンタンアミド）; 55D1E1; デキサメタゾン（（8S、9R、10S、11S、13S、14S、16R、17R）-9-フルオロ-11,17-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13,16-トリメチル-6,7、 8,11,12,14,15,16-オクタヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; プレドニゾロン（（8S、9S、10R、11S、13S、14S、17R）-11,17-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-7,8,9,11,12,14、 15,16-オクタヒドロ-6H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; プレドニゾン（（8S、9S、10R、13S、14S、17R）-17-ヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-6,7,8,9,12,14,15,16- オクタヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3,11-ジオン）; メチルプレドニゾロン（（6S、8S、9S、10R、11S、13S、14S、17R）-11,17-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-6,10,13-トリメチル-7,8,9,11、 12,14,15,16-オクタヒドロ-6H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; プロピオン酸フルチカゾン（[（6S、8S、9R、10S、11S、13S、14S、16R、17R）-6,9-ジフルオロ-17-（フルオロメチルスルファニルカルボニル）-11-ヒドロキシ-10,13,16-トリメチル-3- オキソ-6,7,8,11,12,14,15,16-オクタヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]プロパノエート）; ベクロメタゾン-17-モノプロピオネート（[（8S、9R、10S、11S、13S、14S、16S、17R）-9-クロロ-11-ヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13,16-トリメチル-3 -オキソ-6,7,8,11,12,14,15,16-オクタヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]プロパノエート）; ベタメタゾン（（8S、9R、10S、11S、13S、14S、16S、17R）-9-フルオロ-11,17-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13,16-トリメチル-6,7、 8,11,12,14,15,16-オクタヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; リメキソロン（（8S、9S、10R、11S、13S、14S、16R、17S）-11-ヒドロキシ-10,13,16,17-テトラメチル-17-プロパノイル-7,8,9,11,12,14、 15,16-オクタヒドロ-6H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; パラメタゾン（（6S、8S、9S、10R、11S、13S、14S、16R、17R）-6-フルオロ-11,17-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13,16-トリメチル-7、 8,9,11,12,14,15,16-オクタヒドロ-6H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; およびヒドロコルチゾン（（8S、9S、10R、11S、13S、14S、17R）-11,17-ジヒドロキシ-17-（2-ヒドロキシアセチル）-10,13-ジメチル-2,6,7,8,9,11 、12,14,15,16-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）; 1,25-ジヒドロキシビタミンD3（カルシトリオール）（（1R、3S、5Z）-5-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（2R）-6-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン -2-イル] -7a-メチル-2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1,3-ジオール）；1,25-ジヒドロキシビタミンD3（カルシトリオール）（（1R、3S、5Z）-5-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（2R）-6-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン -2-イル] -7a-メチル-2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1,3-ジオール） パリカリトール（（1R、3R）-5-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（E、2R、5S）-6-ヒドロキシ-5,6-ジメチルヘプト-3-エン -2-イル] -7a-メチル-2,3,3a、5,6,7-ヘキ
サヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン]シクロヘキサン-1,3-ジオール）、ドキセルカルシフェロール（（1R、3S、 5Z）-5-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（E、2R、5R）-5,6-ジメチルヘプト-3-エン-2-イル] -7a-メチル -2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1,3-ジオール）；25-ヒドロキシビタミンD3（カルシフェジオール）（（1S、3Z）-3-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（2R）-6-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル ] -7a-メチル-2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1-オール）、コレカルシフェロール（（1S、3Z）-3- [（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-7a-メチル-1-[（2R）-6-メチルヘプタン-2-イル] -2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ- 1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1-オール）、エルゴカルシフェロール（（1S、3Z）-3-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（E、2R、5R）-5,6-ジメチルヘプト-3-エン-2-イル ] -7a-メチル-2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1-オール）、タカルシトール（（1R、3S、5Z）- 5-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（2R、5R）-5-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル] -7a-メチル-2,3,3a、 5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1,3-ジオール）、22-ジヒドロエルゴカルシフェロール（（1S、3Z）-3-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（2R、5S）-5,6-ジメチルヘプタン-2-イル] -7a- メチル-2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -4-メチリデンシクロヘキサン-1-オール）、（6Z）-タカルシオール（（1S）-3-[（ Z）-2-[（1R、7aR）-7a-メチル-1-[（2R）-6-メチルヘプタン-2-イル] -1,2,3,3a、6,7-ヘキサヒドロインデン-4-イル] エテニル] -4-メチルシクロヘキサ-3-エン-1-オール）、2-メチレン-19-ノル-20（S）-1α-ヒドロキシ-ビスホモプレグナカルシフェロール（（1R、3R）-5-[（2E）-2-[（1R、3aS、7aR）-1-[（2S）- ブタン-2-イル] -7a-メチル-2,3,3a、5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-インデン-4-イリデン]エチリデン] -2-メチリデンシクロヘキサン-1,3-ジオール）、19-ノル -26,27-ジメチレン-20（S）-2-メチレン-1α、25-ジヒドロキシビタミンD3、2-メチレン-1α、25-ジヒドロキシ-（17E）-17（20）-デヒドロ-19-ノルビタミンD3 、2-メチレン-19-ノル-（24R）-1α、25-ジヒドロキシビタミンD2、2-メチレン-（20R、25S）-19,26-ジノール-1α、25-ジヒドロキシビタミンD3、2-メチレン-19-ノル- 1α-ヒドロキシ-プレグナカルシフェロール、1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ホモプレグナカルシフェロール、（20R）-1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビスホモプレグナカルシフェロール、2-メチレン-19-ノル-（20S）-1α-ヒドロキシ-トリショモプレグナカルシフェロール、2-メチレン-23,23-ジフルオロ-1α-ヒドロキシ-19-ノル-ビスホモプレグナカルシフェロ-1,2-メチレン-（20S）-23、 23-ジフルオロ-1α-ヒドロキシ-19-ノル-ビスホモプレグナン-カルシフェロール、（2-（3 'ヒドロキシプロピル-1'、2'-イデン）-19,23,24-トリノール-（20S）-1α-ヒドロキシビタミンD3、 2-メチレン-18,19-ジノール-（20S）-1α、25-ジヒドロキシビタミンD3、及び同様のもの；レチノイン酸（（2E、4E、6E、8E）-3,7-ジメチル-9-（2,6,6-トリメチルシクロヘキセン-1-イル）ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸）、すべて- トランスレチノイン酸（（2E、4E、6E、8E）-3,7-ジメチル-9-（2,6,6-トリメチルシクロヘキセン-1-イル）ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸）、9-シス-レチノイン酸（（2E、4E、6Z、8E）-3,7-ジメチル-9-（2,6,6-トリメチルシクロヘキセン-1-イル）ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸 ）、タミバロテン（4-[（5,5,8,8-テトラメチル-6,7-ジヒドロナフタレン-2-イル）カルバモイル]安息香酸）、13-cis-レチノイン酸（（2Z、4E、6E、8E） -3,7-ジメチル-9-（2,6,6-トリメチルシクロヘキセン-1-イル）ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸）、（2E、4E、6Z、8E）-3,7-ジメチル-9-（2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセネイル）ノナ-2,4,6、-8-テトラエン酸、9-（4- メトキシ-2,3,6-トリメチル-フェニル）-3,7-ジメチル-ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸、6- [3-（1-アダマンチル）-4-メトキシフェニル] -2- ナフトエ酸、4- [1-（3,5,5,8,8-ペンタメチル-テトラリン-2-イル）エテニル]安息香酸、レチノ安息香酸（4-[（5,5,8,8-テトラメチル-6 、7-ジヒドロナフタレン-2-イル）カルバモイル]安息香酸）、エチル6- [2-（4,4-ジメチルチオクロマン-6-イル）エチニル]ピリジン-3-カルボキシレート、レチノイルt-ブチレート、レチノイルピナコール及びレチノイルコレステロール；オベチコール酸（（4R）-4-[（3R、5S、6R、7R、8S、9S、10S、13R、14S、17R）-6-エチル-3,7-ジヒドロキシ-10,13-ジメチル-2、 3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]ペンタン酸）、LY2562175（6-（4-（（5-シクロプロピル-3-（2,6-ジクロロフェニル）イソオキサゾール-4-イル）メトキシ）ピペリジン-1-イル）-1-メチル-1H-インドール-3-カルボン酸） 、およびGW4064（3- [2- [2-クロロ-4-[[3-（2,6-ジクロロフェニル）-5-（1-メチルエチル）-4-イソキサゾリル-]メトキシ]フェニル]エテニル]安息香酸） ; T0901317（N-（2,2,2-トリフルオロエチル）-N- [4- [2,2,2-トリフルオロ-1-ヒドロキシ-1-（トリフルオロメチル）エチル]フェニル]ベンゼンスルホンアミド）、GW3965（3- [3-[[[2-クロロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル]メチル]（2,2-ジフェニルエチル）アミノ]プロポキシ]ベンゼン酢酸塩酸塩）、及びLXR-623（2-[（2- クロロ-4-フルオロフェニル）メチル] -3-（4-フルオロフェニル）-7-（トリフルオロメチル）インダゾール）; GNE-3500（27、1- {4- [3-フルオロ-4-（（3S、6R）-3-メチル-1,1-ジオキソ-6-フェニル-[1,2]チアジナン-2-イル- メチル）-フェニル]-ピペラジン-1-イル}-エタノン）; 7ベータ、27-ジヒドロキシコレステロール（（3S、7R、8S、9S、10R、13R、14S、17R）-17-[（2R）-7-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル] -10,13-ジメチル- 2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,7-ジオール）、及び7α、27-ジヒドロキシコレステロール（（3S、7S、8S、9S、10R、13R、14S、17R）-17-[（2R）-7-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル] -10,13-ジメチル- 2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,7-ジオール）; 9-シスレチノイン酸（（2E、4E、6Z、8E）-3,7-ジメチル-9-（2,6,6-トリメチルシクロヘキセン-1-イル）ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸） 、LGD100268（6- [1-（3,5,5,8,8-ペンタメチル-6,7-ジヒドロナフタレン-2-イル）シクロプロピル]ピリジン-3-カルボン酸）、CD3254（3- [4-ヒドロキシ-3-（5,6,7,8-テトラヒドロ-3,5,5,8,8-ペンタメチル-2-ナフタレニル）-フェニル] -2-プロペン酸）、およびCD2915（Sorensen et al. (1997) Skin Pharmacol. 10:144）。

【0169】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）のＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、スピロノラクトン及びエプレレノンを含む。スピロノラクトンは、１０～３５ｍｇ／日の範囲の用量、例えば２５ｍｇ／日で投与され得る。

【0170】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：酢酸シプロテロン、ヒドロキシフルタミド、エンザルタミド、ＡＲＮ－５０９、３，３‘－ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、ベキロステリド、ビカルタミド、N-ブチルベンゼン-スルホンアミド（ＮＢＢＳ）、デュタステリド、エプリステリド、フィナステリド、フルタミド、ゾンステリド、ケトコナゾール、N-ブチルベンゼン－スルホンアミド、ニルタミド、メゲストロール、ステロイド系抗アンドロゲン、及びツロステリド。

【0171】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、プロゲステロン受容体（ＰＲ）のＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：ミフェプリストン（RU-486; 11ベータ-[4N、N-ジメチルアミノフェニル] -17ベータ-ヒドロキシ-17-（1-プロピニル）-エストラ-4,9-ジエン-3-オン）; リロプリストン（11ベータ-（4N、N-ジメチルアミノフェニル）-17ベータ-ヒドロキシ-17-（（Z）-3-ヒドロキシプロペニル）エストラ-4,9-ジエン-3-オン）; オナプリストン（11β-（4N、N-ジメチルアミノフェニル）-17α-ヒドロキシ-17-（3-ヒドロキシプロピル）-13α-エストラ-4,9-ジエン-3-オン）; アソプリスニル（ベンズアルデヒド、4-[（11ベータ、17ベータ）-17-メトキシ-17-（メトキシメチル）-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11-イル] -1-（E）-オキシム; J867）; J912（4- [17ベータ-ヒドロキシ-17アルファ-（メトキシメチル）-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11ベータ-イル]ベンズアルデヒド-（1E）-オキシム）; 及びCDB-2914（17α-アセトキシ-11β-（4-N、N-ジメチルアミノフェニル）-19-ノルプレグナ-4,9-ジエン-3,20-ジオン）。他の適切な二量体化剤は、以下を含む：例えば、JNJ-1250132、（6alpha、11beta、17beta）-11-（4-ジメチルアミノフェニル）-6-メチル-4 '、5'-ジヒドロスピロ[エストラ-4,9-ジエン-17,2'（3'H ）-フラン] -3-オン（ORG-31710）; （11ベータ、17アルファ）-11-（4-アセチルフェニル）-17,23-エポキシ-19,24-ジノルコラ-4,9-、20-トリエン-3-オン（ORG-33628）; （7β、11β、17β）-11-（4-ジメチルアミノフェニル-7-メチル] -4 '、5'-ジヒドロスピロ[エストラ-4,9-ジエン-17,2'（3'H）-フラン] -3 -オン（ORG-31806）; ZK-112993; ORG-31376; ORG-33245; ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753; LG120830; LG1447; LG121046; CGP-19984A; RTI-3021-012; RTI-3021-022; RTI-3021-020; RWJ-25333; ZK-136796; ZK-114043; ZK-230211; ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734; ZK-137316; 4- [17β-メトキシ-17α-（メトキシメチル）-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1-（E）-オキシム; 4- [17β-メトキシ-17α-（メトキシメチル）-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1-（E）-[O-（エチルアミノ）カルボニル]オキシム; 4- [17ベータ-メトキシ-17α-（メトキシメチル）-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1-（E）-[O-（エチルチオ）カルボニル]オキシム; （Z）-6 '-（4-シアノフェニル）-9,11アルファ-ジヒドロ-17β-ヒドロキシ-17α-[4-（1-オキソ-3-メチルブトキシ）-1-ブテニル] 4'H-ナフト[3' 、2 '、1'; 10,9,11] エストラ-4-エン-3-オン; 11β-（4-アセチルフェニル）-17β-ヒドロキシ-17α-（1,1,2,2,2-ペンタ-フルオロエチル）エストラ-4,9-ジエン-3-オン; 11β-（4-アセチルフェニル）-19,24-ジノール-17,23-エポキシ-17α-コラ-4,9,20-トリエン-3-オン; （Z）-11β、19- [4-（3-ピリジニル）-o-フェニレン] -17β-ヒドロキシ-17α-[3-ヒドロキシ-1-プロペニル] -4-アンドロステン-3-オン; 11β-[4-（1-メチルエテニル）フェニル]-17α-ヒドロキシ-17β-β-ヒドロキシプロピル）-13α-エストラ-4,9-ジエン-3-オン; 4 '、5'-ジヒドロ-11β-[4-（ジメチルアミノ）フェニル] -6β-メチルスピロ[エストラ-4、-9-ジエン-17β、2'（3'H）-フラン] -3-オン、及び ドロスピレノン。

【0172】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、甲状腺受容体－β（ＴＲ－β）のＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：T3（3,5,3'-トリヨード-L-チロニン）; KB-141（3,5-ジクロロ-4-（4-ヒドロキシ-3-イソプロピルフェノキシ）フェニル酢酸）; ソベチローム（GC-1としても知られています）（3,5-ジメチル-4-（4'-ヒドロキシ-3'-イソプロピルベンジル）-フェノキシ酢酸）; GC-24（3,5-ジメチル-4-（4'-ヒドロキシ-3'-ベンジル）ベンジルフェノキシ酢酸）; 4-OH-PCB106（4-OH-2 '、3,3'、4 '、5'-ペンタクロロビフェニル）; エプロチローム; MB07811（（2R、4S）-4-（3-クロロフェニル）-2-[（3,5-ジメチル-4-（4'-ヒドロキシ-3'-イソプロピルベンジル）フェノキシ）メチル] -2-オキシド-[1 、3,2]-ジオキサホスホナン）; QH2; 及び（3,5-ジメチル-4-（4'-ヒドロキシ-3'-イソプロピルベンジル）フェノキシ）メチルホスホン酸（MB07344）。

【0173】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、エストロゲン受容体－α（ＥＲ－α）のＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：タモキシフェン、4-OH-タモキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、バゼドキシフェン、ファルソデックス、クロミフェン、フェマレル、オルメロキシフェン、トレミフェン、オスペミフェン、及びエチニルエストラジオール。

【0174】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、エストロゲン受容体－β（ＥＲ－β）のＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：エストラジオール（E2;または17-ベータ-エストラジオール）、及びエチニルエストラジオール。

【0175】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＰＰＡＲ－γのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、ロベグリタゾン、トログリタゾン）、ファルグリタザール、アレグリタザール、及びフェノフィブリン酸。

【0176】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＧＲのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下であり得る：選択的ＧＲアゴニスト（ＳＥＧＲＡ）又は選択的ＧＲモジュレーター（ＳＥＧＲＭ）。

【0177】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＧＲのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：ベンゾピラノキノリンＡ２７６５７５、マプラコラット、ＺＫ ２１６３４８、５５Ｄ１Ｅ１、デキサメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、プロピオン酸フルチカゾン、ベクロメタゾン－１７－モノプロピオン酸、ベタメタゾン、リメキソロン、パラメタゾン、及びヒドロコルチゾン。

【0178】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＶＤＲのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下であり得る：1,25-ジヒドロキシビタミンD3（カルシトリオール）、パリカリトール、ドキセルカルシフェロール、25-ヒドロキシビタミンD3（カルシフェジオール）、コレカルシフェロール、エルゴカルシフェロール、タカルシオール、22-ジヒドロエルゴカルシフェロール、（6Z）-タカルシオール、2-メチレン-19-ノル-20（S） -1α-ヒドロキシ-ビスホモプレグナカルシフェロール、19-ノル-26,27-ジメチレン-20（S）-2-メチレン-1α、25-ジヒドロキシビタミンD3、2-メチレン-1α、25-ジヒドロキシ-（17E）-17（20）-ジヒドロ-19-ノル -ビタミンD3、2-メチレン-19-ノル-（24R）-1α、25-ジヒドロキシビタミンD2、2-メチレン-（20R、25S）-19,26-ジノール-1α、25-ジヒドロキシビタミンD3、2-メチレン-19-ノル-1α-ヒドロキシ-プレグナカルシフェロール、1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ホモプレグナカルシフェロール 、（20R）-1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビスホモプレグナカルシフェロール、2-メチレン-19-ノル-（20S）-1α-ヒドロキシ-トリショモプレグナカルシフェロール、2-メチレン-23,23-ジフルオロ-1α-ヒドロキシ-19-ノル-ビスホモプレグナカルシフェロ-1,2-メチレン-（20S）-23、 23-ジフルオロ-1α-ヒドロキシ-19-ノル-ビスホモプレグナ-n-カルシフェロール、（2-（3 'ヒドロキシプロピル-1'、2'-イデン）-19,23,24-トリノール-（20S）-1α-ヒドロキシビタミンD3、2-メチレン-18,19-ジノール-（20S）-1α、 25-ジヒドロキシビタミンD3など。

【0179】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＲＡＲ－βのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下であり得る：レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、9-cis-レチノイン酸、タミバロテン、13-cis-レチノイン酸、（2E、4E、6Z、8E）-3,7-ジメチル-9-（2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセネイル）ノナ-2 、4、6、-8-テトラエン酸、9-（4-メトキシ-2,3,6-トリメチル-フェニル）-3,7-ジメチル-ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸、6- [3-（1-アダマンチル）-4- メトキシフェニル] -2-ナフトエ酸、4- [1-（3,5,5,8,8-ペンタメチル-テトラリン-2-イル）エテニル]安息香酸、レチノ安息香酸、エチル6- [2-（4,4-ジメチルチオクロマン-6-イル）エチニル ]ピリジン-3-カルボキシレート、レチノイルt-酪酸、レチノイルピナコール、及びレチノイルコレステロール。

【0180】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＦＸＲ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：オベチコール酸、ＬＹ２５６２１７５（6-（4-（（5-シクロプロピル-3-（2,6-ジクロロフェニル）イソオキサゾール-4-イル）メトキシ）ピペリジン-1-イル）-1-メチル-1H-インドール-3- カルボン酸）、及びＧＷ４０６４（3- [2- [2-クロロ-4-[[3-（2,6-ジクロロフェニル）-5-（1-メチルエチル）-4-イソキサゾリル-]メトキシ]フェニル]エテニル]安息香酸）。

【0181】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＬＸＲ－α（ＰＲ）のＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：Ｔ０９０１３１７（N-（2,2,2-トリフルオロエチル）-N- [4- [2,2,2-トリフルオロ-1-ヒドロキシ-1-（トリフルオロメチル）エチル]フェニル]ベンゼンスルホンアミド）、ＧＷ３９６５（3- [3-[[[2-クロロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル]メチル]（2,2-ジフェニルエチル）アミノ]プロポキシ]ベンゼン酢酸塩酸塩）、及びＬＸＲ－６２３（2-[（2- クロロ-4-フルオロフェニル）メチル] -3-（4-フルオロフェニル）-7-（トリフルオロメチル）インダゾール。

【0182】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＲＯＲ－γのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：ＧＮＥ－３５００（27、1- {4- [3-フルオロ-4-（（3S、6R）-3-メチル-1,1-ジオキソ-6-フェニル-[1,2]チアジナン-2-イル- メチル）-フェニル]-ピペラジン-1-イル}-エタノン）。

【0183】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＲＯＲ－γのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：7β、27-ジヒドロキシコレステロール、及び7α、27-ジヒドロキシコレステロール。

【0184】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＲＸＲ－αのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：9-シスレチノイン酸、ＬＧＤ１００２６８、ＣＤ３２５４（3- [4-ヒドロキシ-3-（5,6,7,8-テトラヒドロ-3,5,5,8,8-ペンタメチル-2-ナフタレニル）-フェニル]- 2-プロペン酸）、及びＣＤ２９１５ (Sorensen et al. (1997) Skin Pharmacol. 10:144)。

【0185】

ヘテロ二量体化ドメインのペアが、ＰＸＲのＬＢＤ及び対応する共受容体ペプチドを含む場合、適切な調節分子は、以下を含む：リファンピシン、クロトリマゾール、及びロバスタチン。

【0186】

９．２．２．リポカリンフォールド分子に基くＣＡＲ分子の条件付へテロ二量体化：
他の好ましい実施形態によれば、本発明のＣＡＲの群の少なくとも２つのＣＡＲ分子は、２０１７年１２月２０日に提出された欧州特許第１７２０８９２４．５号に開示されるように、リポカリンフォールド分子である１つのメンバー、及びリポカリンフォールド結合相互作用パートナーである第２のメンバーを含む一対のヘテロ二量体化ドメインによりヘテロ二量体化され得る。好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールドベースのヘテロ二量体化システムは、以下を含み：
（ａ）リポカリンフォールド分子、
（ｂ）１５００Ｄａ又はそれ以下の低分子量を有するリポカリンフォールドリガンド、及び
（ｃ）リポカリンフォールド結合相互作用パートナー、
ここで、前記リポカリンフォールド分子は、リポカリンフォールドリガンドに結合することができ、そして
ここで、リポカリンフォールドリガンドに結合されるリポカリンフォールド分子は、リポカリンフォールドリガンドに結合されないリポカリンフォールド分子の親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性で、リポカリンフォールド結合相互作用パートナーに結合し、そして
ここで、リポカリンフォールド結合相互作用パートナーは、任意のリポカリンフォールドリガンドの存在下で、任意の天然に存在するリポカリンフォールド分子に対して、１０μＭ以下の親和性を有する天然に存在するタンパク質ではない。

【0187】

さらなる好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールドベースのヘテロ二量体化システムは、以下を含み：
（ａ）リポカリンフォールド分子、
（ｂ）１５００Ｄａ又はそれ以下の低分子量を有するリポカリンフォールドリガンド、及び
（ｃ）リポカリンフォールド結合相互作用パートナー、
ここで、リガンドフォールド分子は、リポカリンフォールドリガンドがリポカリンフォールド分子に結合されない場合、少なくとも第１のコンフォメーション、及びリポカリンフォールドリガンドがリポカリンフォールド分子に結合される場合、少なくとも第２のコンフォメーションを有し；
ここで、第２のコンフォメーションでリポカリンフォールドに結合されるリポカリンフォールド分子は、第１のコンフォメーションでリポカリンフォールドリガンドに結合されないリポカリンフォールド分子の親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性でリポカリンフォールド結合相互作用パートナーに結合し、そして
ここで、リポカリンフォールド結合相互作用パートナーは、任意のリポカリンフォールドリガンドの存在下で、任意の天然に存在するリポカリンフォールド分子に対して、１０μＭ以下の親和性を有する天然に存在するタンパク質ではない。

【0188】

条件付きヘテロ二量体化のためのこのリポカリンフォールド分子ベースのシステムは一般的に、リポカリンフォールドリガンドが結合されているか、否かに依存して、リポカリンフォールド結合相互作用パートナーに対するリポカリンフォールド分子の親和性の実質的な差異に依存する。親和性ウィンドウ（すなわち、それぞれ、リポカリンフォールドリガンドに結合されているか、又は結合されていないリポカリンフォールド分子に対するリポカリンフォールド結合相互作用パートナーの親和性）が、生理学的条件下でのヘテロ二量体化の調節を可能にする合理的な親和性範囲で存在することが好ましい。従って、リガンド結合された状態のリポカリンフォールド分子に対するリポカリンフォールド結合相互作用パートナーの親和性は、１０μＭ未満、好ましくは２μ未満、特に４００ｎＭ未満であることが好ましい。

【0189】

リポカリンフォールド結合パートナーが、リポカリンフォールドリガンドによりチャージされたか、又はチャージされなかったリポかリンフォールド分子に結合するよう設計されているかに依存して、リポカリンフォールド分子ベースのシステムが、それぞれ、条件付へテロ二量体化（すなわち、切り替え）又は構成的へテロ二量体化のために使用され得る。リポカリンフォールド結合相互作用パートナーはまた、リポカリンフォールドリガンドの存在下ではなく、非依存下でリポカリンフォールド分子に結合するよう設計され得るので、このシステムには、また、ヘテロ二量体化を条件付きで、防止するためにも使用され得る（すなわち、切り替え）。原則として、リポカリンフォールド分子ベースのシステムは、任意には、少なくとも２つの異なるリポカリンフォールドリガンドを結合するように設計され得、ここでそれに応じて選択されたリポカリンフォールド結合相互作用パートナーは、２つの示差的に誘導されたコンフォメーション状態間を区別することができ、これが、次に、２つの異なるリポカリンフォールドリガンドを連続的に追加することにより、条件付きでオンとオフの切り替えが可能になる。

【0190】

本発明に従ってヘテロ二量体化ドメインとして使用され得るリポカリンフォールド分子は、リポカリンフォールドリガンドが結合し（又はその中で）、そしてリポカリンフォールド相互作用パートナーへのリポカリンフォールド分子の結合を可能にする、リポカリンフォールドの構造モチーフを含む任意のタンパク質であり得る。

【0191】

リポカリンフォールド分子は、ＳＣＯＰデータベース（バージョン１．７５）においてリポカリンスーパーファミリーに分類される任意の天然に存在する分子、又はその変異体として定義される。しかしながら、限られた数のアミノ酸のみを交換することが好ましい。

【0192】

好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールド分子は、天然に存在するｉＬＢＰ（細胞内脂質結合タンパク質）、天然に存在するリポカリン又はアンチカリン、及び１～３０のアミノ酸交換を伴うそれらの分子のいずれかの誘導体及びそのフラグメントと同一の分子である。別の好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールド分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５又は３０のアミノ酸交換を伴う、天然に存在するリポカリン又はｉＬＢＰの誘導体である。

【0193】

本発明の好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールド分子は、リポカリンフォールドリガンド結合を最適にするために、１つ又は２以上のアミノ酸交換、挿入及び／又は欠失により設計される。好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールド分子は、天然に存在するか、又はさもなければ、（そのアミノ酸配列により）開示された、βバレル構造において、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％の配列同一性を有するリポカリンフォールド分子の誘導体であり、それにより、このβ－バレル構造は、以下から選択されるアミノ酸残基の領域に好ましくは、構造的に対応する領域として定義される：
－ヒトＲＢＰ４（ＰＤＢエントリー１ＲＢＰのアミノ酸残基番号付けスキームによる）におけるアミノ酸残基２１－３０、４１－４７、５２－５８、７１－７８、８５－８８、１０２－１０９、１１４－１２０及び１３２－１３８、これはヒトＲＢＰ４における構造的に保存されたβ－鎖を定義する；
－ヒト涙液リポカリン（ＴＬＣ：Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により定義されるような）におけるアミノ酸残基１４－２３、３７－４３、４８－５４、６２－６９、７６－７９、８４－９１、９６－１０２及び１１１－１１７、これはヒトＴＬＣにおける構造的に保存されたβ－鎖を定義する；
－ヒトアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ；Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により定義されるような）におけるアミノ酸残基４４－５３、６９－７５、８１－８７、９６－１０３、１１０－１１３、１１９－１２６、１３１－１３７及び１４２－１４８、これはヒトＡｐｏＭにおける構造的に保存されたβ－鎖を定義する；
－ヒト細胞レチノイン酸結合タンパク質II（ＣＲＡＢＰII：ＰＤＢエントリー２ＦＳ６でのアミノ酸残基番号付けスキームに従う）におけるアミノ酸残基５－１２、４１－４５、５０－５４、６１－６５、７１－７３、８１－８７、９３－９６、１０８－１１２、１１９－１２４及び１２９－１３５、これはヒトＣＲＡＢＰIIにおける構造的に保存されたβ－鎖を定義する；
－ヒト脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１：ＰＤＢエントリー２Ｆ７３でのアミノ酸番号付けスキームに従う）におけるアミノ酸残基５－１２、３９－４３、４８－５２、５９－６３、６９－７１、７９－８５、９１－９４、９９－１０３、１０９－１１４ 及び １１９－１２５、これはヒトＦＡＢＰ１における構造的に保存されたβ－鎖を定義する。

【0194】

好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールド分子は、少なくとも構造的に保存されたリポカリンフォールドのβ－バレル構造をカバーする、少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に少なくても１２０のアミノ酸の長さの天然に存在するリポカリン又はその誘導体のフラグメントであり、又はここで、リポカリンフォールド分子は、少なくとも構造的に保存されたリポカリンフォールドのβ－バレル構造をカバーする、少なくとも８０、好ましくは少なくとも８５、特に少なくとも９０のアミノ酸の長さの天然に存在するｉＬＢＰ又はその誘導体のフラグメントであり、ここで前記構造的に保存されたβ－パレル構造は、以下から選択されるアミノ酸残基の領域に好ましくは、構造的に対応するアミノ酸位置を含むか、又はそれらから成る：
－ヒトＲＢＰ４（ＰＤＢエントリー１ＲＢＰのアミノ酸残基番号付けスキームによる）におけるアミノ酸残基２１－３０、４１－４７、５２－５８、７１－７８、８５－８８、１０２－１０９、１１４－１２０及び１３２－１３８、これはヒトＲＢＰ４における構造的に保存されたβ－鎖を定義する；
－ヒト涙液リポカリン（ＴＬＣ：Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により定義されるような）におけるアミノ酸残基１４－２３、３７－４３、４８－５４、６２－６９、７６－７９、８４－９１、９６－１０２及び１１１－１１７、これはヒトＴＬＣにおける構造的に保存されたβ－鎖を定義する；
－ヒトアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ；Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により定義されるような）におけるアミノ酸残基４４－５３、６９－７５、８１－８７、９６－１０３、１１０－１１３、１１９－１２６、１３１－１３７及び１４２－１４８、これはヒトＡｐｏＭにおける構造的に保存されたβ－鎖を定義する；
－ヒト細胞レチノイン酸結合タンパク質II（ＣＲＡＢＰII：ＰＤＢエントリー２ＦＳ６でのアミノ酸残基番号付けスキームに従う）におけるアミノ酸残基５－１２、４１－４５、５０－５４、６１－６５、７１－７３、８１－８７、９３－９６、１０８－１１２、１１９－１２４及び１２９－１３５、これはヒトＣＲＡＢＰIIにおける構造的に保存されたβ－鎖を定義する；ＰＤＢエントリー２Ｆ３におけるアミノ酸残基番号付けスキームに従う；
－ヒト脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１：ＰＤＢエントリー２Ｆ７３でのアミノ酸番号付けスキームに従う）におけるアミノ酸残基５－１２、３９－４３、４８－５２、５９－６３、６９－７１、７９－８５、９１－９４、９９－１０３、１０９－１１４ 及び １１９－１２５、これはヒトＦＡＢＰ１における構造的に保存されたβ－鎖を定義する。

【0195】

さらなる好ましい実質形態によれば、リポカリンフォールド分子は、好ましくは、以下から選択されるアミノ酸残基の構造的に対応する、構造的に保存されたβ－バレル構造の外側に、最大１５、最大３０又は最大５０のアミノ酸欠失及び／又は最大１５、最大３０又は最大５０のアミノ酸挿入を有する、天然に存在するリポカリン又はｉＬＢＰの誘導体である：
－ＰＤＢエントリー１ＲＢＰにおけるアミノ酸残基番号付けに従って、ヒトＲＢＰ４における構造的に保存されたβ－鎖に隣接する領域を定義する、ヒトＲＢＰ４におけるアミノ酸残基１－２０、３１－４０、４８－５１、５９－７０、７９－８４、８９－１０１、１１０－１１３、１２１－１３１及び １３９－１８３；
－ヒトＴＬＣにおける構造的に保存されたβ－鎖に隣接する領域を定義する、ヒトＴＬＣにおけるアミノ酸残基１－１３、２４－３６、４４－４７、５５－６１、７０－７５、８０－８３、９２－９５、１０３－１１０及び１１８－１５８（Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985におけるアミノ酸残基番号付けに従って）；
－ヒトＡｐｏＭ（ＡｐｏＭ；Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により定義されるようなアミノ酸残基番号付けに従って）におけるアミノ酸残基１－４３、５４－６８、７６－８０、８８－９５、１０４－１０９、１１４－１１８、１２７－１３０、１３８－１４１及び１４９－１８８、これはヒトＡｐｏＭにおける構造的に保存されたβ－鎖に隣接する領域を定義する；
－ヒトＣＲＡＢＰII（ＰＤＢエントリー２ＦＳ６でのアミノ酸残基番号付けスキームに従う）におけるアミノ酸残基１－４、１３－４０、４６－４９、５５－６０、６６－７０、７４－８０、８８－９２、９７－１０７、１１３－１１８、１２５－１２８及び１３６－１３７、これはヒトＣＲＡＢＰIIにおける構造的に保存されたβ－鎖に隣接する領域を定義する；
－ヒトＦＡＢＰ１（ＰＤＢエントリー２Ｆ７３でのアミノ酸残基番号付けスキームに従う）におけるアミノ酸残基１－４、１３－３８、４４－４７、５３－５８、６４－６８、７２－７８、８６－９０、９５－９８、１０４－１０８、１１５－１１８及び１２６－１２７、これはヒトＦＡＢＰ１における構造的に保存されたβ－鎖に隣接する領域を定義する。

【0196】

別の好ましい実施形態によれば、リポカリンフォールド分子は、少なくとも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、 ２５、２６、２７、２８、２９、又は ３０のアミノ酸交換を伴う、リポカリンスーパーファミリーの天然に存在するメンバーの誘導体である。

【0197】

さらに好ましい実施形態によれば、本発明に従ってヘテロ二量体化ドメインとして使用されるリポカリンフォールド分子は、リポカリン、すなわち＋１トポロジーに配置される８本鎖の上下のβ－バレルを含み、８番目のβ－鎖のＣ末端の後にα－鎖が続くタンパク質である。

【0198】

本発明に従って調節分子として使用され得るリポカリンフォールドリガンドは、「小分子」、例えばポリペプチド及びタンパク質、例えばリポカリンフォールド分子に比較して「小さい」。従って、リポカリンフォールドリガンドは、１５００Ｄａ以下、好ましくは１０００Ｄａ以下、特に７５０Ｄａ以下の分子量を有する。リポカリンフォールドリガンドの好ましいＭｗ範囲は、５０～１５００Ｄａ、好ましくは７５～１５００Ｄａ、特に１５０～７５０Ｄａである。好ましくは、リポカリンフォールドリガンドは、リポカリンフォールド構造のバレル及びループ領域により形成されるリポカリンフォールド分子の尾部に結合することができる。

【0199】

リポカリンフォールドリガンドは、リポカリンフォールド分子に対して、１ｍＭ未満、好ましくは１００μＭ未満、特に１０μＭ末端の親和性を有することが好ましい。リポカリンフォールドリガンドと、リポカリンフォールド分子との間のこの親和性は、Ｋｄ（解離定数）値として定義され、そして好ましくは、自動ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ－ＩＴＣ 機器 (Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)を用いて等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により決定される。

【0200】

リポカリンフォールドリガンドが選択され得る例は、以下の通りである：
Nr データベース HMDB
1 ナフシリン
2 ガーベリノール
3 モンテルカスト
4 フルラゼパム
5 バルビツール酸キニジン
6グリセオリンI
7 グリセオリンII
8 (-)-シンプテロカルピン
9 カンゾノール W
10 6α-ヒドロキシファセオリン
11 (1a,5b,6a)-7-プロトイルデン-1,5,6,14-テトロール 14-(2,4-ジヒドロキシ-6-メチル安息香酸)
12 4'-O-メチルカンゾノール W
13 シクロキエヴィトーン
14リコフラノン
15 アルミラチン
16 2-(4-メチル-3-ペンテニル)アントラキノン
17 ソラフェニブ ベータ-D-グルクロニド
18 ヘテロフィリン
19 2'-O-メチルファセオリンイソフラバン
20 チアプリド
21 グルテン エキソルフィン C
22マルベロフランM
23ダルキサントンG
24 スクラレオール
25 コルプドックス
26 カンゾノールF
27 マンゴスチノン
28 ガンカオニンX
29ルブラフラボンD
30 シクロキエビトン水和物
31 グリセオリジンII
32 シクランデレート
33 ダルキサントン E
34モルシン
35 (E)-2',4,4'-トリヒドロキシ-3-プレニルカルコン
36 ダルキサントンH
37 ジュデオール
38 アルトニンE
39 カンゾノールT
40 フラグランソルA
41 ダルキサントンF
42 マルベロフランT
43 ガルシマンゴゾンA
44 アルトニンB
45 アステルトキシン データベース
データベースKEGG
46 オキシフェドリン
47 プロフルトリン
48 モンフロロトリン
49 キシロイルスルファミン
50 セトチアミン塩酸塩水和物
51 ダイセチアミン塩酸塩水和物
52 ダイセタミン
53 オキソラミン
54 オクサラミン
55 クリナトールメシル酸塩
56 イオフルベンズアミドＩ
57 セリチニブ
58 ジカディア
59 イミプロトリン
60 トリクラベンダゾール
61 ファシネックス
62 ブリバニブアラニネート
63 トランスフルトリン
64 エノリカムナトリウム
65 エノリカムナトリウム一水和物
66 ジブカイン
67 シンチョカイン
68 ヌペルカイン
69トラメチニブ
データベースWDI
70 フルクロキサシリン
71 S-ファルネシルチオサリチル酸
72 2-フルオロトロパプリド
73 ブタンピシリン
74 ジクロキサシリン硫酸塩
75 フロキサシリン
76 イブシリン
77 プラゾシリン
78 サレタミド
79 テトラクロルサリシラニリド
80 カルベニシリン
81 ジクロメチド
82 メチルスルフォメットロン
83 トリクロロサリシラニライド
84 クロメトシリン
85 シストダイチン-F
86 デタノサル
87 ディアバローネ
88 ディクロフォプ
89 エピフェネチシリン
90 FTALIL-MEDEYOL
91 サルタミド塩酸塩
92 チアプリド塩酸塩
93 トランキュリン-A
94 デオキシフェンタレニルグルクロン
95 ラフルニマス
96 メラゾラム
97 ディブサドル
98 フェネチシリンカリウム
99 プラノサル
100 ダレフォルミス
101 ディフェニシリン
102 フェノテロール塩酸塩
103 ギガンティック酸
104 ハロリトラリン-B
105 イソプロピシリン
106 プログアニル塩酸塩
107 ピラノクントーン-B
108 ツベロシン
109 ゾフィエラミド-B
110クロキサシリンナトリウム
111 レチミド塩酸塩
112 バイジェネ-B
113 ビドウィロン-B
114 カルベニシリン二ナトリウム
115 ヒドロキシプロカイン
116 オクラトキシン-A
117 セロックス
118 マカラガフラバノン-B
119 メノキシマイシン-B
120 ペニシリン-S
121 ソラリジン
122 ルビギノン-C1
123 セコシュードオプテロシン-E
124 アサジスルフィド
125 バランカド酸-A
126 ベフェドン
127 メルドナール-B
128 ネラミノール
129 フォモプソライド-A
130 強酸
131 ゾフィエラミド-A
132 シストダイチン-B
133 ジクロキサシリン
134 フロロプロプラノロール
135 イリオシコリン-B
136 インディカニン-B
137 ジャカレビン
138 コッタミデC
139 メキソラミン
140 マイカペロキシド-H
141 オトギリン
142オキソラミン塩酸塩
143 オキソプロパリン-A
144プルバラノール-A
145 ルビギノン-C2
146 テラクリルシコニン
147 クロディナフォプ －プロパルギル-エステル
148 マザティコール
149 セホクディム
150 スルファグアノール
151 バラペリドン
152フルクロキサシリンナトリウム
153 ジオディアモライドタ
154 ルカントーンスルホキシド
155 メレオライド-D
156 ナドキソロール塩酸塩
157 ベクロブリック酸グルクロニド
158 クロキサシリン
159 ハイパーギノン-B
160 オリゴスポロール-A
161 塩酸プロポキシカイン
162 ロニフィブラート
163 スーダンブルーGN
164 トリコダーマミド-B
165ボトリラミド-A
166 カルフェシリン
167 クレソディム
168 デュタドルピン
169 エピコクリオキノン-B-14
170 フルラゼパム
171 ハイドロキシフルクロキサシリン
172 リナカンチン-C
173 テフルベンズロン
174 ゼニサラート
175 アンチマイシン-A8A
176 ARTOINDONESIANIN-U
177 ブロンコケイン
178 エノリカム
179 イパジライド
180 モーダント-ブラウン-1
181 プロプラノロールフェノバルビタール
182 プギニンA
183 アンフィビン-H
184 アルミラリック酸
185 カリンダシリン
186 クロロバイオケート
187 クロロプログアニル
188 シリンドロール-B
189 エクリプタルバイン
190 ガルシガーリン-A
191O-デメチルクロロスリシン
192サンゲノン-C
193 テトラペロール-G
194 クロルサルフロン
195 デキサメタゾン・ジエチルアミノアセテート
196 ダイエット
197 ピリドベリシン
198 スベンダゾール
199 チオカイン
200 トラペジフォリキサントン
201 トリクラザン
202 3',4'-ジクロロベンザミル
203 カエトビリジン-C
204 サイクロレガチン
205 フルラゼパム一塩酸塩
206 フシジラクトン-B
207 グリセオケリンメチルエステル
208 イソブチルシコニン
209 ミシニケート
210 アジュダゾール-B
211 シストダイチン-E
212 デメチルプラエカンソン-A
213 デストラキシン-A
214 ジフェニドールエンボナート
215 ディスコキオライド-B
216 イルマノライド-2
217 ラクトキノマイシン
218 ネオボルニーバル
219 サロトラーレン-D
220 アビシノン-V
221 アクチロメ
222 クロルフルアズロン
223 チョンドリジエン-18,20
224 EUGLOBAL-G2
225 イダルビシン塩酸塩
226ムチシクマラノン-A
227 3-O-メチルカロポカルピン
228 アロクラミド塩酸塩
229 アノプテリン
230 脱酸素
231 EUGLOBAL-IIC
232 イリシコリン-C
233 ミシノライドII
234 スイリン
235 トコトリエノール・ガンマ
236 インドシナノンベータ
237 イソチオバミン
238 メベベリン
239 ムチシクマラノン-D
240 ニムフェオール-C
241 プルソカイン
242 ZIMET-20-84
243 2,4-D-ブトキシプロピル
244 アビシノンIV
245 バイジェネ-A
246 クリソクラム酸
247 エポロン-B
248 エトキシケイン
249 フロレナミン
250グアイアコール-メフェナメート
251 マキシマ-イソフラボン-C
252 サルコディクチン-B
253 トリクラベンダゾール
254 アキオフラン
255 アステリキノン
256 ジエチルグリ コレートトリヒドラジド
257 マロトフィリッペンス-D
258 ナフトキサート
259 PACHYDICTYOL-A-エポキシド
260 ラトジャドン
261 サルベリン塩酸塩
262 4-メナハイドロキノン
263 ボトリルアミド-C
264 エルサミシン
265 フェンフルスリン
266 ムチシフェノン-A
267 サンゲノン-A
268 シュヴェインファーチン-A
269 バニリジロール
270 4-O-メチルメレオリド
271アセチルビスミオン-F
272 アルフェンタニル塩酸塩
273 アスペルテトロニン-A
274 ベータヒドロキシイソバレリルシコニン
275 カルビソカイン
276 クロロプログアニル塩酸塩
277 クリプトフィシン-52
278 ジデメチルトコトリエノール
279 フルソル-DA
280 ピリドキシフェン
281 ティアゼシム塩酸塩
282 ブトクタマイド
283 デオキシシコニン
284 カンビエル酸-A
285 リコフラノン
286 プレドニリデン・ジエチルアミノ酢酸
287 シュードオプテロシン-G
288 トリケンディオール
289 ゾアパタノール
290 エルゴキン-C
291 ペンタモキサン塩酸塩
292 スキャンデニン
293アクチノピロン-C
294 アミトン
295 クラトキヤボレノン-C
296 サイモポール
297 ドキシサイクリン水和物
298 フラビジュロール-C
299フラン-12
300 ミリアポロン-3
301 オリノシノライド
302 トナベルサット
303 ビスミオーネ-B
304 アミケリン
305 ブタモキサン塩酸塩
306 クロロバイオシン
307サイクロコムユニット
308 フェナザフロール
309 ビスミオーネD
310 3-トリクロルメタフォス
311 アミノプロピロンフェニルブタゾン
312 ジオクレノール
313 グリフォリン
314 ハイパージョビノール-A
315 タモラリジン
316 トメントール
317 トランスデルタトコトリエノロイ酸
318 ジアセトロール塩酸塩
319デュトマイシン
320 リグロバストシド-O
321 ライスパロール-B
322 エレクキオーネ-A
323 サロトラーレン-A
324 シタマカイン 3
325 トリコポリンII
326 3-ヒドロキシトルファゼパム
327 ジメタプラマイド
328フェノテロール塩酸塩
329 フェンカプトン
330 クラトキヤボレノン-B
331 エトモキサン塩酸塩
332 イソセントラテリン
333 カリマンタシン-A
334 ヒスパグラブリジン-A
335 ランカシクリノール
336 マクロキサントン
337 ピシリン塩酸塩
338 プルフラビン-A
339 シグモイディンＩ
340 フェナラマイド
341 ハイドロキシアクラシノマイシン-M,2
342 ソフォラディン
343 アスコクロリン
344 ベータヒドロキシサンシュール
345 ビストロマイド-K
346 クロルテトラサイクリンボレート
347デヒドロアスコクロリン-8+,9+
348 ジメチリウムクロリド
349 マカランギン
350マルセロマイシン
351 ベンゾイルゴミシン-H
352 クリンダマイシン塩酸塩
353 ハイドロキシアスコクロリン-8+
354 ネオカルジリン-A
355 カエトビリジン-B
356 クロルテトラサイクリンビスルファート
357ナピラジオマイシン-C1
358 サロアスピジン-B
359 サラシーヌ
360エレクトーンB
361 ホモジニア酸
62 アステリキノン-B1
363 デタミッド
364 ルブラキサントン
365 ドラスタチン-19
366 エデトール
367 ファセオリジン
368 ゲドカルニル
369 マンミシン-B 3
70 サンタロール-ベータ-サリチル酸
371 コワニン
372 インディブリン
373 コワノール
374 カラタビシン
375ピクロキシダイン
376 プロキサゾール
377 ストロビルリン-E
378 エレクキオン-B
379 スリカイニド
380 ジエチラミノメチルルチン
381 トロペシン
382 ピクロキシジン塩酸塩
383 HEX-1
384 デクロバニルロビオシン
データベース MDDR
385ルビジノーネC2
386 フロバフェン
387 テトロノチオジン
388 ラフルニマス
389 マイカペロキシドA
390 フルラゼパム塩酸塩
391 ルビギノン C1
392 クリナトールメシル酸塩
393 ドラスタチンD
394 エポラクタイン
395 レキシパファント
データベース CHEMBL
396 カルベニシリン
397 ディクロフォプ
398 エピフェニチシリン
399 フロバフェン
400ギガンティックアシッド
401 フェネチシリンカリウム
402 ディフェニシリン
データベース Pubchem
403 アコチアミド
404 アコジボロール
405 アクマピモド
406 アパルタミド
407ASP3026
408AZD1480
409 BIIB021
410ブランプラム
411 ブレキナール
412 クロロプログアニル
413 エムリカサン
414エナシデニブ
415 エノリカム
416 フルラゼパム
417 ILX295501
418 インディブリン
419 メトクロプラミド
420 メバスタチン
421 MK0686
422 ナバリキシン
423 ネファゾドン
424 パントプラゾール
425 パビネタント
426 SCYX-7158
427 シッカニン
428 スルホグアノール
429 スニチニブ
430 スボレキサント
431 チアプリド
432 トナバーサット
433 ウリモレリン
434 シパミド
435 MGGBYMDAPCCKCT-UHFFFAOYSA-N
436 VNBRGSXVFBYQNN-UHFFFAOYSA-N
437 YUHNXUAATAMVKD-PZJWPPBQSA-N

【0201】

９．２．３．条件付へテロ二量体化のためのさらなるシステム：
本発明によれば、例えば、ＣＡＲの群の２つのＣＡＲ分子のヘテロ二量体化のための１対の二量体化ドメインは、また、以下から選択され得る：
a） ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＢ、変異体Ｔ８２Ｌ）
b） ＧＡＩ 及び ＧＩＤ１
c） ＦＫＢＰ 及びカルシニューリン触媒サブユニット Ａ (ＣｎＡ)
d） ＦＫＢＰ及びシクロフィリン
e） ＰＹＬ 及びＡＢＩ。

【0202】

それらのヘテロ二量体化ドメインの配列、及びそれらのヘテロ二量体化ドメインの二量体化に適した調節分子は、当業者において良く知られており（Rutkowska et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2012;51(33):8166）、そして例えば、国際公開第ＷＯ２０１４１２７２６１号に開示されている。

【0203】

ＧＡＩ、ＧＩＤ１、ＦＫＢＰ、ＣｎＡ、シクロフィリン、ＰＹＬ、及びＡＢＩから選択されたヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーは、約５０のアミノ酸～役３００又はそれ以上のアミノ酸の長さを有することができ；例えばヘテロ二量体化ドメインのペアのメンバーは、約 ５０のａａ～ 約１００のａａ、約１００のａａ～ 約１５０のａａ、約１５０のａａ～ 約２００のａａ、約２００のａａ～ 約２５０のａａ、約２５０のａａ～ 約３００のａａ、又は３００以上 のａａの長さを有することができる。

【0204】

例えば、好ましいヘテロ二量体化ドメインは、ＦＫＢＰに由来することができ、そしてアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６２９４２－１に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0205】

別の例として、ヘテロ二量体化ドメインは、カルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＰＰＰ３ＣＡ； ＣＡＬＮ; カルナ; カルナ1; ＣＣＮ１； ＣＮＡ１； ＰＰＰ２Ｂ； ＣＡＭ－ＰＲＰ 触媒サブユニット；カルシニューリンＡα; カルモジュリン依存性カルシニューリン Ａ サブユニット α アイソ フォーム；プロテインホスファターゼ ２Ｂ、触媒サブユニット、αアイソフォーム、 等としても知られている）に由来することができ、そしてアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０８２０９－１ アミノ酸(aa) ５６－３４７ (ＰＰ２Ａｃ ドメイン)に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0206】

別の例として、ヘテロ二量体化ドメインは、シクロフィリン（シクロフィリンＡ、ＰＰＩＡ、ＣＹＰＡ、ＣＹＰＨ、ＰＰＩａｓｅ Ａ、 等としても知られている）に由来することができ、そしてアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６２９３７－１に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0207】

別の例として、ヘテロ二量体化ドメインは、ＭＴＯＲ（ＦＫＢＰ－ラパマイシン関連タンパク質；ＦＫ５０６ 結合タンパク質 １２－ラパマイシン関連タンパク質 １; ＦＫ５０６ 結合タンパク質 １２－ラパマイシン関連タンパク質 ２; ＦＫ５０６ 結合タンパク質 １２－ラパマイシン複合体関連タンパク質 １; フラップ; ＦＲＡＰ１； ＦＲＡＰ２； ＲＡＦＴ１;及びＲＡＰＴ１としても知られている）に由来することができ、そしてアミノ酸配列Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４２３４５－１ ａａ ２０２１－２１１３ (「Ｆｒｂ」としても知られる: Ｆｋｂｐ－Ｒａｐａｍｙｃｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ)に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0208】

別の例として、ヘテロ二量体化ドメインは、ＰＹＬタンパク質（アブシジン酸受容体及びＲＣＡＲとしても知られている）に由来することができ、そして以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：ＰＹＬ１０ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｈ１Ｒ０－１）；ＰＹＬ１１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＦＪ５０）；ＰＹＬ１２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＦＪ４９－１）；ＰＹＬ１３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＳＮ５１－１）; ＰＹＬ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＶＺＳ８－１）；ＰＹＬ２ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ８０９９２－１）；ＰＹＬ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＳＳＭ７－１）；ＰＹＬ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ８０９２０－１）；ＰＹＬ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＦＬＢ１－１）；ＰＹＬ６（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｓ８Ｅ３－１）；ＰＹＬ７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１ＥＣＦ１－１）；ＰＹＬ８（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＦＧＭ１－１）； ＰＹＬ９（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８４ＭＣ７－１）；ＰＹＲ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ４９６８６－１）。

【0209】

別の例として、ヘテロ二量体化ドメインは、ＡＢＩタンパク質（アブシジン酸非感受性としても知られている）に由来することができ、そしてタンパク質、例えばシロイヌナマズ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のそれら：ＡＢＩ１（アブシシン酸非感受性 １、プロテインホスファターゼ ２Ｃ ５６、ＡｔＰＰ２Ｃ５６、Ｐ２Ｃ５６、及び ＰＰ２Ｃ ＡＢＩ１としても知られている）及び／又はＡＢＩ２（Ｐ２Ｃ７７、プロテインホスファターゼ ２Ｃ ７７、ＡｔＰＰ２Ｃ７７、アブシジン酸非感受性 ２、プロテインホスファターゼ ２Ｃ ＡＢＩ２、ＰＰ２Ｃ ＡＢＩ２としても知られている）に由来することができる。例えば適切なヘテロ二量体化ドメインは、次のアミノ酸配列：ＡＢＩ１ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４９５９７－１）; ＡＢＩ２ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ０４７１９－１）のいずれかの約１００のアミノ酸 ～ 約１１０のアミノ酸 (aa)、約１１０のaa ～ 約１１５のaa、約１１５のaa ～ 約１２０のaa、約１２０のaa ～ 約１３０のaa、約１３０のaa ～ 約１４０のaa、約１４０のaa ～ 約１５０のaa、約１５０のaa ～約１６０ のaa、約１６０のaa ～ 約１７０のaa、約１７０のaa ～ 約１８０のaa、約１８０ のaa ～ 約１９０のaa又は 約１９０ のaa ～ 約２００ のaaの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0210】

別の例として、ヘテロ二量体化ドメインは、ＧＡＩ シロイヌナズナタンパク質（ジベレリン酸非感受性、及び ＤＥＬＬＡ タンパク質 ＧＡＩとしても知られている）に由来することができ、そしてアミノ酸配列：Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＬＱＴ８－１の約１００のアミノ酸 ～ 約１１０のアミノ酸 (aa)、約１１０のaa ～ 約１１５のaa、約１１５のaa ～ 約１２０のaa、約１２０のaa ～ 約１３０のaa、約１３０のaa ～ 約１４０のaa、約１４０のaa ～ 約１５０のaa、約１５０のaa ～約１６０ のaa、約１６０のaa ～ 約１７０のaa、約１７０のaa ～ 約１８０のaa、約１８０ のaa ～ 約１９０のaa又は 約１９０ のaa ～ 約２００ のaaの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0211】

別の例として、ヘテロ二量体化ドメインは、ＧＩＤ１ シロイヌナズナタンパク質（ジベレリン受容体 ＧＩＤ１としても知られている）に由来することができ、そしてアミノ酸配列：ＧＩＤ１Ａ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＭＡＡ７－１）； ＧＩＤ１Ｂ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＬＹＣ１－１）； ＧＩＤ１Ｃ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９４０Ｇ６－１のいずれかの約１００のアミノ酸 ～ 約１１０のアミノ酸 (aa)、約１１０のaa ～ 約１１５のaa、約１１５のaa ～ 約１２０のaa、約１２０のaa ～ 約１３０のaa、約１３０のaa ～ 約１４０のaa、約１４０のaa ～ 約１５０のaa、約１５０のaa ～約１６０ のaa、約１６０のaa ～ 約１７０のaa、約１７０のaa ～ 約１８０のaa、約１８０ のaa ～ 約１９０のaa又は 約１９０ のaa ～ 約２００ のaaの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0212】

９．２．３に記載されるヘテロ二量体化ドメインのヘテロ二量体化が、異なる調節分子により達成され得る（ヘテロ二量体化ドメインのペアに続く括弧内に示される）：
b)ＦＫＢＰ 及び ＣｎＡ (ラパマイシン);
c) ＦＫＢＰ 及びシクロフィリン (ラパマイシン);
d)ＦＫＢＰ 及び ＦＲＧ (ラパマイシン);
h）ＰＹＬ及びＡＢＩ（アブシジン酸）;
j) ＧＡＩ 及び ＧＩＤ１ (ジベレリン又はジベレリン類似体 ＧＡ－３Ｍ)。

【0213】

上記のように、ラパマイシン（ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ ５２８４６１６）は、調節分子として作用することができる。他方では、ラパマイシン誘導体又は類似体も使用され得る。例えば、国際公開第Ｗ０９６/４１８６５号; 国際公開第ＷＯ９９/３６５５３号; 国際公開第ＷＯ０１/１４３８７号;及び Ye et al (1999) Science 283:88-91を参照のこと。例えば、類似体、相同体、誘導体、及びラパマイシンに構造的に関連する他の化合物「ラパログ」は、中でも、ラパマイシンに対して以下の修飾の１つを有するラパマイシンの変異体を含む：Ｃ７、Ｃ４２及び／又はＣ２９におけるメトキシの脱メチル化、除去又は置換；Ｃ１３、Ｃ４３及び／又はＣ２８におけるヒドロキシの除去、誘導体化又は置換；Ｃ１４、Ｃ２４ 及び/又は Ｃ３０ でのケトンの還元、除去又は誘導体化。；６ 員ピペコリン酸環の ５ 員プロリル環による置換；及びシクロヘキシル環上の代替置換又はシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換。さらなる情報は、例え米国特許第５，５２５，６１０号; 第５，３１０，９０３号、 第５，３６２，７１８号; 及び第５，５２７，９０７号に提供される。Ｃ－２８ヒドロキシル基の選択的エピマー化が記載されている；国際公開第ＷＯ０１／１４３８７号を参照のこと。ラパマイシンの代替としての使用に適する追加の合成調節分子は、米国際特許公開第２０１２／０１３００７６号に記載されるそれら、例えば２８－エピラパマイシン（ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ １３１６６８１２３）を含む。

【0214】

次の式の化合物もラパログとして適切である：

【化1】

（例えば、米国特許第ＵＳ７０６７５２６Ｂ１号に開示される）、ここでｎは１又は２であり；Ｒ^２８及びＲ^４３は独立して、Ｈ、又は置換された又は置換されていない脂肪族又はアシル部分であり；Ｒ^７ａ及びＲ^７ｂの１つは、Ｈであり、そして他はハロ、Ｒ^Ａ、 ＯＲ^Ａ、 ＳＲ^Ａ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ^Ａ、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^ＡＲ^Ｂ、－ＮＲ^ＡＲ^Ｂ、－ＮＲ^ＢＣ（ＯＲ）Ｒ^Ａ、ＮＲ^ＢＣ（Ｏ）ＯＲ^Ａ、－ＮＲ^ＢＳＯ_２Ｒ^Ａ又は ＮＲ^ＢＳＯ_２ＮＲ^ＡＲ^Ｂ‘であり；又はＲ^７ａ及びＲ^７ｂは、一緒では、テトラエン部分のＨである：

【化2】

ここでＲ^ＡはＨ又は置換された又は非置換の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、又はヘテロアリール部分であり、そしてＲ^Ｂ及びＲ^Ｂ’は独立して、Ｈ、ＯＨ、又は置換された又は非置換の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール又はヘテロアリール部分である。

【0215】

９．３．分泌された可溶性因子による細胞外二量体化：
本発明によるＣＡＲの群の少なくとも２つのＣＡＲ分子の非共有複合体化はまた、分泌された可溶性因子、例えば腫瘍間質に蓄積するタンパク質により誘発され、それにより、多くの場合、それらのタンパク質自体がホモ－又はヘテロ二量体化することができる。この場合、それらの可溶性因子は、本発明の調節分子として作用する。次に、二量体化ドメインは、例えば生来の受容体のドメイン（又はそれに由来する短いペプチド；例えば、Young et al., J Biol Chem. 2004;279(46):47633-42）（これに、可溶性因子が結合できる）、又は分泌された可溶性因子に結合するよう操作された任意の抗原結合ポリペプチド（上記チャプター１「抗原結合部分」にすでに記載される）（例えば、ＴＧＦ－β１結合ペプチド（Dotor et al., Cytokine. 2007;39(2):106-15）、又はＶＥＧＦ結合ＣＨ２－ＣＨ３－Ｆｃドメイン（Lobner et al., MAbs. 2017;9(7):1088-1104）、実施例７において二量体ドメインとして使用されるような）であり得る。

【0216】

１０．標的抗原：
本発明の好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群、及び前記群のＣＡＲ分子に結合できる他のポリペプチドの各抗原結合部分は、細胞上に存在する標的抗原、好ましくは、細胞、固体表面、又は脂質二重層に存在する標的抗原に結合する。

【0217】

本発明によれば、ＣＡＲの群の抗原結合部分により、又は他方では、前記群のＣＡＲ分子に結合できる他のポリペプチドの抗原結合部分により、特異的に認識される特定の標的抗原は、天然に存在する細胞表面抗原又はポリペプチド、天然に存在する細胞表面抗原に結合される炭水化物又は脂質であり得る。

【0218】

結合効果を最大限に生かすためには、ＣＡＲの群の抗原結合部分、又は他方では、前記群のＣＡＲ分子に結合できる他のポリペプチドの抗原結合部分は、同じ標的抗原上の異なる重複しないエピトープ、又は共有又は非共有複合体を自然に形成する標的抗原に、好ましくは向けられる。そのような共局在されるエピトープ又は抗原を標的とする利点は、実施例６に示されている。

【0219】

ＣＡＲの群の抗原結合部分、及び前記群のＣＡＲ分子に結合できる別のポリペプチドの抗原結合部分が特異的に結合できる抗原の例は、以下を含む：例えば、CD19、 CD20、 CD22、 CD23、 CD28、 CD30、 CD33、 CD35、 CD38、 CD40、 CD42c、 CD43、 CD44、 CD44v6、 CD47、 CD49D、 CD52、 CD53、 CD56、 CD70、 CD72、 CD73、 CD74、 CD79A、 CD79B、 CD80、 CD82、 CD85A、 CD85B、 CD85D、 CD85H、 CD85K、 CD96、 CD107a、 CD112、 CD115、 CD117、 CD120b、 CD123、 CD146、 CD148、 CD155、 CD185、 CD200、 CD204、 CD221、 CD271、 CD276、 CD279、 CD280、 CD281、 CD301、 CD312、 CD353、 CD362、 BCMA、 CD16V、 CLL-1、 Ig kappa、 TRBC1、 TRBC2、 CKLF、 CLEC2D、 EMC10、 EphA2、 FR-a、 FLT3LG、 FLT3、 Lewis-Y、 HLA-G、 ICAM5、 IGHA1/IgA1、 IL-1RAP、 IL-17RE、 IL-27RA、 MILR1、 MR1、 PSCA、 PTCRA、 PODXL2、 PTPRCAP、 ULBP2、 AJAP1、 ASGR1、CADM1、 CADM4、 CDH15、 CDH23、 CDHR5、 CELSR3、 CSPG4、 FAT4、 GJA3、 GJB2、 GPC2、 GPC3、 IGSF9、 LRFN4、 LRRN6A/LINGO1、 LRRC15、 LRRC8E、 LRIG1、 LGR4、 LYPD1、 MARVELD2、 MEGF10、 MPZLI1、 MTDH、 PANX3、 PCDHB6、 PCDHB10、 PCDHB12、 PCDHB13、 PCDHB18、 PCDHGA3、 PEP、 SGCB、 ベザチン、 DAGLB、 SYT11、 WFDC10A、 ACVR2A、 ACVR2B、 未分化リンパ腫キナーゼ、 カドヘリン24、 DLK1、 GFRA2、 GFRA3、 EPHB2、 EPHB3、 EPHB4、 EFNB1、 EPOR、 FGFR2、 FGFR4、 GALR2、 GLG1、 GLP1R、 HBEGF、 IGF2R、 UNC5C、 VASN、 DLL3、 FZD10、 KREMEN2、 TMEM169、 TMEM198、 NRG1、 TMEFF1、 ADRA2C、 CHRNA1、 CHRNB4、 CHRNA3、 CHRNG、 DRD4、 GABRB3、 GRIN3A、 GRIN2C、 GRIK4、 HTR7、 APT8B2、 NKAIN1、 NKAIN4、 CACNA1A、 CACNA1B、 CACNA1I、 CACNG8、 CACNG4、 CLCN7、 KCNA4、 KCNG2、 KCNN3、 KCNQ2、 KCNU1、 PKD1L2、 PKD2L1、 SLC5A8、 SLC6A2、 SLC6A6、 SLC6A11、 SLC6A15、 SLC7A1、 SLC7A5P1、 SLC7A6、 SLC9A1、 SLC10A3、 SLC10A4、 SLC13A5、 SLC16A8、 SLC18A1、 SLC18A3、 SLC19A1、 SLC26A10、 SLC29A4、 SLC30A1、 SLC30A5、 SLC35E2、 SLC38A6、 SLC38A9、 SLC39A7、 SLC39A8、 SLC43A3、 TRPM4、 TRPV4、 TMEM16J、 TMEM142B、 ADORA2B、 BAI1、 EDG6、 GPR1、 GPR26、 GPR34、 GPR44、 GPR56、 GPR68、 GPR173、 GPR175、 LGR4、 MMD、 NTSR2、 OPN3、 OR2L2、 OSTM1、 P2RX3、 P2RY8、 P2RY11、 P2RY13、 PTGE3、 SSTR5、 TBXA2R、 ADAM22、 ADAMTS7、 CST11、 MMP14、 LPPR1、 LPPR3、 LPPR5、 SEMA4A、 SEMA6B、 ALS2CR4、 LEPROTL1、 MS4A4A、 ROM1、 TM4SF5、 VANGL1、 VANGL2、 C18orf1、 GSGL1、 ITM2A、 KIAA1715、 LDLRAD3、 OZD3、 STEAP1、 MCAM、 CHRNA1、 CHRNA3、 CHRNA5、 CHRNA7、 CHRNB4、 KIAA1524、 NRM.3、 RPRM、 GRM8、 KCNH4、 メラノコルチン1受容体、PTPRH、SDK1、SCN9A、SORCS1、CLSTN2、エンドセリン変換酵素様-1、リゾリン酸受容体2、LTB4R、TLR2、神経向性チロシンキナーゼ1、MUC16、B7-H4、上皮成長因子受容体 (EGFR)、ERBB2、HER3、EGFR バリアント III (EGFRvIII)、HGFR、FOLR1、MSLN、CA-125、MUC-1、前立腺特異的膜抗原 (PSMA)、メソセリン、上皮細胞接着分子（EpCAM）、L1-CAM、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、VEGFR1、VEGFR2、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、MAGE-A 1、IL-13R-α2、ジシアロガングリオシド (GD2 及び GD3)、腫瘍関連炭水化物抗原 (CA-125、CA-242、Tn 及びシアリル-Tn)、4-1BB、5T4、BAFF、炭酸脱水酵素 9 (CA-IX)、-MET、CCR1、CCR4、FAP、フィブロネクチンエクストラドメインB（ED-B）、GPNMB、IGF-1受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαvβ3、ITB5、ITGAX、エンビギン、PDGF-Rα、ROR1、シンデカン1、TAG-72 、テネイシンC、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘍特異的ペプチド エピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子である NKG2D-リガンド、好ましくPR1 / HLA-A2、系統特異的又は組織特異的な組織抗原、好ましくはCD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD24、CD25、CD34、CD80、CD86、CD133、CD138、CD152、CD319、エンドグリン、MHC分子、など。

【0220】

１１．核酸、細胞の調製、治療用途：
発明の別の側面によれば、本発明による群のＣＡＲのＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。本発明による核酸は、いくつかの実施形態において、例えば発現ベクターを含むＤＮＡ又はＲＮＡである。本発明の核酸は、また、他の形で、例えばウィルスベクターの形でも提供され得る。核酸は、細胞内で活性又は条件付きで活性であり、いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ、例えば、インビトロで合成されたＲＮＡとして存在または存在し得る。ＲＮＡ又はＤＮＡの宿主細胞への導入は、インビトロ又はエクスビボ又はインビボで行うことができる。例えば、宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球など）は、ＣＡＲの群のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを用いて、インビトロ又はエクスビボでエレクトロポレーションすることができる。

【0221】

場合によっては、本開示の核酸は、２つ、又は３つ又は４つのＣＡＲ分子のいずれかから成る、本発明によるＣＡＲ群のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、２、３、又は４つのCAR分子のいずれかから成るＣＡＲの群の1つの分子をそれぞれコードする１、２、３、又は４つの別個のヌクレオチド配列を含む。

【0222】

ＣＡＲの群のＣＡＲ分子が異なる核酸分子によってコードされる場合、本発明は、ＣＡＲの群の１、２、３、又は４つの分子をコードする少なくとも２つの核酸のキットを提供し、ここでも、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はインビトロ転写されたＲＮＡから選択されることが好ましい。

【0223】

本発明はまた、本発明による核酸（すなわち、ＣＡＲの群のＣＡＲ分子をコードする）を含むベクター及び／又は核酸のキット（ＣＡＲの群のＣＡＲ分子をコードする）を提供する。

【0224】

そのようなベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、及びベクターの複製及び／又は維持を提供する他の特徴を含むことができる。適切なベクターは、例えば、プラスミド、ウィルスベクターなどを含む。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に知られており；本発明による組換え構築物を生成するために、多くが市販されている。以下のベクトルは、例として提供されている。細菌: ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ ｌ７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ (Stratagene、La Jolla、CA、USA)；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、 ｐＫＫ２３３－３、 ｐＤＲ５４０、 及び ｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Uppsala, Sweden)。真核生物: ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。ベクターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有することができる。発現宿主において機能する選択マーカーが存在し得る。適切なベクターは、以下を含む：ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルスベクターに基づくウイルスベクター(例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイサルコーマウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳癌ウイルス）及び同様のもの)。形質導入された細胞のゲノムに効率的に組み込まれる能力のために、好ましいベクターは、レトロウイルスベクター、特にガンマレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター、すなわちレトロウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターである。好ましいレトロウイルスベクターの例は、自己不活性化レンチウイルスベクターである(Milone et al., Mol Ther. 2009;17(8):1453-1464に提供される)。診療所で使用できるレンチウイルスベクターの他の例、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（登録商標）ベクターシステムなどを含む。非臨床型のレンチウイルスベクターも入手可能であり、当業者に知られている。トランスフェクトされた細胞のゲノムに効率的に組み込むことができる他のタイプの好ましいベクターは、トランスポゾンベクター、好ましくはＰｉｇｇｙＢＡＣベースのベクター及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベースのベクターである。目的の遺伝子を細胞のゲノムに組み込むためのさらに重要な非ウイルス戦略は、部位特異的ヌクレアーゼ技術（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に基づく）、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓテクノロジーに基づいている(例えば、Gaj et al., Trends Biotechnol. 2013;31(7):397-405; 及び Ren et al., Protein Cell 2017;8(9):634-643 によって説明されている)。これらの技術は、任意の ＤＮＡ 分子 (一本鎖 ＤＮＡ 又は二本鎖 ＤＮＡ; ベクター、ＰＣＲ アンプリコンなどの形で) からの定義されたヌクレオチド配列の組み込みを可能にし、そして興味のある遺伝子は、内因性プロモーターの下流のゲノムに組み込むことができるため、魅力的である(例えば、Eyquem et al., Nature. 2017;543(7643):113-117 による)。

【0225】

本発明はまた、少なくとも２つのベクターのキットを提供し、各ベクターは、本発明によるＣＡＲの群の１、２、３又は４つのＣＡＲ分子をコードする核酸配列を含む。同じか又は異なる宿主系（例えば、ベクターによる形質転換又は増殖後にベクターがＣＡＲ分子を発現する適切な細胞）での発現を達成するために、ベクターに同じか又は異なる調節配列を提供することができる。

【0226】

本発明によるベクター又はベクターのキットにおいては、ＣＡＲの群のＣＡＲ分子をコードする核酸は、転写制御エレメントに作動可能に連結され、発現ベクターを生成することができる。そのような転写制御エレメントは、プロモーター、エンハンサーなどであり得、適切なプロモーター及びエンハンサーエレメントは当技術分野で知られている。細菌細胞における発現のためには、適切なプロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ及びｔｒｃを含む。真核細胞での発現のためには、適切なプロモーターは、以下を含む：Ｌ鎖及び/又はＨ鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー要素、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期の ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスの長い末端反復体に存在するプロモーター (例えば、ガンマレトロウイルスの ５‘－ＬＴＲ、又はモロニーマウス白血病ウイルス (ＭＭＬＶ) の ５’－ＬＴＲ のサブエレメント Ｒ 及び Ｕ３ を含むプロモーター配列)、マウス幹細胞ウイルス (ＭＳＣＶ) に存在するプロモーター、マウス メタロチオネイン－Ｉ プロモーター、イントロンを含むまたは含まない ＥＦ１－α、ホスホグリセリン酸キナーゼ (ＰＧＫ) のプロモーター、及び当技術分野で知られている種々の組織特異的プロモーター。可逆的誘導性プロモーターを含む適切な可逆性プロモーターは、当技術分野で知られている。そのような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば真核生物及び原核生物から単離及び誘導することができる。第２の生物、例えば第１の原核生物及び第２の真核生物、第１の真核生物及び第２の原核生物等で使用するための第１の生物に由来する可逆的プロモーターの修飾は、当技術分野で周知である。そのような可逆的プロモーター、及びそのような可逆的プロモーターに基づくが、但し追加の制御タンパク質も含むシステムは、以下を含む：アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化タンパク質（ＡｌｃＲ）に応答するプロモーターなど）、テトラサイクリン調節プロモーター (例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒｓ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ などを含むプロモーター システム)、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系など）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターシステムなど）、病因関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーターなど）、温度調節プロモーター (例えば、熱ショック誘導性プロモーター (例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０)、大豆熱ショックプロモーターなど)、光調節プロモーター、合成誘導プロモーターなど。

【0227】

場合によっては、適切なプロモーターを含む遺伝子座又は構築物又は導入遺伝子は、誘導性システムの誘導を介して不可逆的に切り替えられ得る。不可逆的スイッチの誘導に適したシステムは、当技術分野で周知であり、例えば、不可逆的スイッチの誘導は、Ｃｒｅ－ｌｏｘを介した組換えを利用することができる。当技術分野で知られているリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組換え部位などの任意の適切な組み合わせを使用して、不可逆的に切り替え可能なプロモーターを生成することができる。部位特異的組換えを行うための方法、メカニズム、及び要件は、本明細書の別の場所に記載されており、不可逆的にスイッチされたプロモーターの生成に使用され、当技術分野で周知である。場合によっては、プロモーターは、ＣＤ８細胞特異的プロモーター、ＣＤ４細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、又はＮＫ特異的プロモーターである。例えば、ＣＤ４遺伝子プロモーターを用いることができる。 別の例として、ＣＤ８遺伝子プロモーターを使用することができる。ＮＫ 細胞特異的発現は、ネリ （ｐ４６） プロモーターの使用によって達成できる。いくつかの実施形態によれば、例えば、 酵母細胞での発現のためには、適切なプロモーターは、以下である：構成的プロモーター、例えばＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーター等；又は調節可能なプロモーター、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＣＵＰ1プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２ プロモーター、ＥＮＯ プロモーター、ＴＰ１ プロモーター、及び ＡＯＸ１ (例えば、Ｐｉｃｈｉａ で使用するための)。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内にある。原核生物宿主細胞での使用に適したプロモーターは、以下を含む：バクテリオファージ Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ プロモーター；ｔｒｐ プロモーター；ｌａｃオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えばｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター； ｔｒｃ プロモーター；ｔａｃプロモーターなど；ａｒａＢＡＤプロモーター；インビボ で制御されるプロモーター、例えばｓｓａＧプロモーターま他は関連プロモーター、ｐａｇＣプロモーター、ｎｉｒＢプロモーターなど；ｓｉｇｍａ７０ プロモーター、例えばコンセンサス ｓｉｇｍａ７０ プロモーター (例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号 ＡＸ７９８９８０、ＡＸ７９８９６１、及び ＡＸ７９８１８３ を参照のこと)；固定相プロモーター、例えば、 ｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーター等；病原性島ＳＰＩ－２由来のプロモーター；ａｃｔＡプロモーター; ｒｐｓＭプロモーター； ｔｅｔ プロモーター；ＳＰ６プロモーター; など。 大腸菌などの原核生物での使用に適した強力なプロモーターは、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７、及び ＰＬａｍｂｄａ を含む。細菌宿主細胞で使用するオペレーターの例は、以下を含む：ラクトース プロモーター オペレーター (ラクトースと接触すると、Ｌａｃｉ リプレッサー タンパク質が構造を変化させ、それによって Ｌａｃｉ リプレッサー タンパク質がオペレーターに結合するのを防ぎます)、トリプトファン プロモーター オペレーター (トリプトファンと複合体を形成すると、ＴｒｐＲ リプレッサー タンパク質は、オペレーターに結合するコンフォメーションを有し；トリプトファンが存在しない場合、ＴｒｐＲ リプレッサー タンパク質はオペレーターに結合しないコンフォメーションを有する)、及び tac プロモーター オペレーター。

【0228】

本発明の好ましい実施形態によれば、ベクター又は少なくとも２つのベクターのキットは、Ｔリンパ球特異的プロモーター又はＮＫ細胞特異的プロモーター、又は、CARの群のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＥＦ１－αプロモーターを含む。

【0229】

さらなる側面によれば、本発明はまた、本発明によるＣＡＲの群のすべてのＣＡＲ分子を産生するように改変された遺伝子改変細胞に関する。本発明の細胞はまた、本発明のベクター（例えば、ウイルス又はプラスミド上清液として）を産生するために使用され得、そこからそれらはさらに精製され、増幅及び精製された形態でこれらのベクターを提供し得る。

【0230】

好ましい実施形態によれば、細胞は、本発明によるＣＡＲの群のＣＡＲ分子を生成するように遺伝子改変された哺乳動物細胞である。好ましい哺乳動物細胞は、幹細胞、前駆細胞、又は幹細胞又は前駆細胞に由来する細胞、好ましくはリンパ球である。本発明に従って遺伝子改変されるさらに好ましい細胞は、初代細胞及び不死化細胞系である。医薬用途では、ヒト細胞、特にリンパ球が特に好ましい。しかしながら、非ヒト初代細胞及び細胞株は、特に本発明によるシステムを用いて科学的問題に対処するために、適切な細胞型、例えば非ヒト霊長類細胞株、ゲッ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などである可能性があり得る。

【0231】

本発明によるさらに好ましい細胞は、以下であり得る：ＨｅＬａ 細胞 (例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） 番号ＣＣＬ－２)、ＣＨＯ 細胞 (例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６)、２９３ 細胞 (例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３)、Ｖｅｒｏ 細胞、 ＮＩＨ ３Ｔ３ 細胞 (例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８)、Ｈｕｈ-7 細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１ 細胞、マウス Ｌ 細胞 (ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１．３)、ヒト胎児腎 (ＨＥＫ) 細胞 (ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３)、ＨＬＨｅｐＧ２ 細胞、Ｈｕｔ－７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ－６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、ＹＴＳ）等。いくつかの好ましい例では、本発明による細胞は不死化細胞株ではなく、個体から得られた細胞（例えば初代細胞）である。例えば、場合によっては、細胞は個体から得られた免疫細胞である。例として、細胞は個体から得られたＴリンパ球である。 別の例として、細胞は個体から得られた細胞傷害性細胞である。別の例として、細胞は、個体から得られた幹細胞又は前駆細胞である。

【0232】

特に好ましい実施形態によれば、本発明によるＣＡＲの群の個々のＣＡＲ分子をコードする少なくとも２つのベクターのベクター又はキットで形質転換された本発明による哺乳動物細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。

【0233】

さらなる側面によれば、本発明は、本発明による核酸、本発明による核酸のキット、本発明によるベクター又はベクターのキット、又は 本発明による細胞又は細胞のキットに関する。

【0234】

本開示は、条件付きで活性化可能な細胞を生成する方法を提供する。この方法は、一般に、本開示によるＣＡＲの条件付き活性群をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター又はベクターのキット、又はＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）で哺乳動物細胞を遺伝子改変することを含む。好ましい実施形態にれば、遺伝子改変された細胞は、ａ）ＣＡＲの群の抗原結合部分が結合する標的抗原又は天然に複合体化された標的抗原、及びｂ）少なくとも１種類の調節分子の存在下で条件付きで活性化される。任意には、遺伝子改変細胞は、ＣＡＲの群の抗原結合部分が結合する標的抗原又は天然に複合体を形成した標的抗原の存在下で活性化可能であり、少なくとも1種類の調節分子の追加の存在下では活性化が困難である。遺伝子改変は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで実施することができる。細胞は、免疫細胞 (例えば、Ｔ リンパ球又は ＮＫ 細胞)、幹細胞、前駆細胞などであり得る。

【0235】

遺伝子改変は、エクスビボで行うことが好ましい。 例えば、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）、幹細胞、またはＮＫ細胞は、個体から得ることができ、個体から得られた細胞は、本開示によるＣＡＲの群を発現するように遺伝子改変される。好ましい実施形態によれば、遺伝子改変細胞は、以下の存在下で条件付きで活性化可能である：ａ）ＣＡＲの群の抗原結合部分、あるいはＣＡＲの群に結合することができる他のポリペプチドの抗原結合部分が結合する標的抗原または天然に複合化された標的抗原；b) 少なくとも 1 種類の調節分子。場合によっては、遺伝子改変細胞は、例えば、投与前の細胞の増殖過程中に、生体外で活性化される。遺伝子改変細胞が個体 (例えば、細胞が得られた個体) に導入される場合、遺伝子改変細胞は、例えば、少なくとも 1 つの調節分子を個体に投与することにより、インビボで活性化することができ、但し、 抗原結合部分のそれぞれの標的抗原は、個体の細胞表面に生理学的発現レベルで存在する場合である。遺伝子組み換え細胞は、個人の細胞表面に生理学的発現レベルで存在する標的抗原と接触し；そして好ましい実施形態によれば、少なくとも１種類の調節分子を個体に投与すると、遺伝子改変細胞が活性化される。任意で、CARの群の複合体形成が調節分子の存在によって阻害され得る実施形態において、遺伝子改変細胞は、少なくとも1種類の調節分子を個体に投与した後、活性化可能性を低くすることができる。

【0236】

例えば、遺伝子改変細胞が Ｔ リンパ球又は ＮＫ 細胞である場合、遺伝子改変細胞は、活性化すると、ＣＡＲ の群 (又は他のポリペプチドの抗原結合部分）は、その表面上で結合することができます。

【0237】

本開示は、ＣＡＲの対象群を使用する様々な治療方法を提供する。

【0238】

本発明によるＣＡＲの非共有複合体群は、Ｔリンパ球又はNK細胞に存在する場合、標的細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。本発明による、非共有結合的に複合化されたＣＡＲの群は、場合によっては、少なくとも抗原結合部分を含み、ＣＡＲ分子に結合することができる他のポリペプチドの存在に依存して、 選択された標的抗原又は標的細胞上に存在する天然に複合化された標的抗原の選択された複合体に結合でき、それにより、好ましい実施形態によれば、ＣＡＲの群を生成するように遺伝子改変されたＴリンパ球又はＮＫ細胞による標的細胞の殺傷を媒介する。

【0239】

標的細胞には癌細胞が含まれる。従って、本開示は、標的癌細胞を殺す、又はその増殖を阻害する方法を提供し、前記方法は、標的癌細胞を、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞が標的を認識するようにＣＡＲの対象群を生成するように遺伝子改変された細胞傷害性免疫エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞）と接触させることを含み、結果的に、Ｔリンパ球またはNK細胞が、標的癌細胞の表面に存在する標的抗原又は標的抗原複合体を認識し、標的細胞の死滅を仲介する。

【0240】

本開示は、癌を有する個体において癌を治療する方法を提供する。好ましい実施形態によれば、この方法は、ｉ）個体から得られたＮＫ細胞または好ましくはＴリンパ球を、本発明によるＣＡＲの群のそれぞれのＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターで遺伝子改変し、ここでＣＡＲの群の各抗原結合部分は、個体の癌細胞上の標的抗原に特異的であり、そして前記遺伝子改変は、インビトロ又はエキソビボで行われ；ii) 遺伝子組み換え細胞を個体に導入し；そしてiii) 群のそれぞれの ＣＡＲ 分子の二量体化を誘導又は低減するために、好ましくは、群のそれぞれの ＣＡＲ 分子の二量体化を誘導するために、少なくとも 1 つの調節分子の有効量を個体に投与することを含み、それにより、ＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導または低減し、好ましくはＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導し、それにより、ＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導または低減し、好ましくはＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導し、ここで、それぞれの標的抗原又は異なる標的抗原のそれぞれの共有又は非共有複合体を発現する癌細胞との接触に基づいて、ＣＡＲの非共有複合体群が、遺伝子組み換え細胞の活性化を仲介し、癌細胞を死滅させ、癌の治療を可能にする。

【0241】

本明細書に開示される方法による治療を受けやすい癌腫は、以下を含む：食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌（皮膚癌の一種）、扁平上皮癌（様々な組織）、移行上皮癌（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱癌、気管支癌、結腸癌、結腸直腸癌、 胃癌、肺の小細胞癌及び非小細胞癌を含む肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌又は胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、骨形成細胞癌、上皮癌、および鼻咽頭癌。本明細書に開示される方法による治療を受けやすい肉腫は、以下を含む：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮肉腫、ユーイング肉腫、軟部肉腫、及びその他の肉腫肉腫。本明細書に開示される方法による治療を受けやすい他の固形腫瘍は、以下を含む：神経膠腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴覚神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫。本明細書に開示される方法による治療を受けやすい白血病は、以下を含む：a）慢性骨髄増殖性症候群（多能性造血幹細胞の腫瘍性疾患）; b) 急性骨髄性白血病 (多能性造血幹細胞または限られた系統の可能性の造血細胞の腫瘍性形質転換); c) B細胞CLL、T細胞CLL前リンパ球性白血病、及び有毛細胞白血病を含む慢性リンパ球性白血病(CLL;免疫学的に未熟で機能的に無能な小リンパ球のクローン増殖);及びd) 急性リンパ芽球性白血病 (リンパ芽球の蓄積を特徴とする)。 本方法を使用して治療できるリンパ腫は、B細胞リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）は、 Ｂ 細胞リンパ腫 (例えば、バーキットリンパ腫); ホジキンリンパ腫; 非ホジキンリンパ腫などを含む。本明細書に開示される方法による治療を受けやすい他の癌は、以下を含む：非定型髄膜腫 (脳)、膵島細胞癌 (膵臓)、髄様癌 (甲状腺)、間葉腫 (腸)、肝細胞癌 (肝臓)、肝芽腫 (肝臓)、明細胞癌 (腎臓)、および縦隔神経線維腫。

【0242】

本方法は、炎症状態および自己免疫疾患を治療するために使用することもできる。CARの対象群は、免疫調節法で使用するために、ヘルパーT細胞又は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞で発現させることができる。免疫調節方法は、例えば、病原体に対する哺乳動物対象における免疫応答を増強し； 免疫無防備状態の対象における免疫応答の増強し；炎症反応の軽減し; 例えば、自己免疫疾患を治療するために、自己抗原に対する哺乳動物対象の免疫応答を減少させ； 臓器又は組織の拒絶反応を減少させるために、移植された器官又は組織に対する哺乳動物対象の免疫応答を減少させることを含む。その方法が自己抗原に対する免疫応答を低減することを含む場合、ＣＡＲの群を活性化するために使用される標的抗原の少なくとも1つは自己抗原であることが好ましい。その方法が移植臓器又は組織に対する免疫応答を低減することを含む場合、ＣＡＲの群を活性化するために使用される抗原の少なくとも1つは、移植臓器に特異的な抗原であることが好ましい。

【0243】

上記のように、本開示の治療方法は、それを必要とする個体に、有効量の１つまたは複数の異なる調節分子および任意選択で１つまたは複数の異なる他のポリペプチドを投与することを含み、他のポリペプチドのそれぞれは抗原結合部分を含み、ここで他のポリペプチドのそれぞれは、抗原結合部分を含み、ＣＡＲの群のＣＡＲ分子の細胞外結合部位に結合することができる。

【0244】

発明によるｃａｒの群を発現するＴリンパ球又はＮＫ細胞（「エフェクター細胞」）を受容した、それを必要とする個体に投与される各調節分子の必要な有効量は、必要な各調節分子の存在下対非存在下での抗原発現標的細胞との接触に基づいて、それらのエフェクター細胞の異なる応答によって定義される。従って、これらのエフェクター細胞の応答は、インターフェロン-ガンマ、及び/又はマクロファージ炎症性タンパク質－１ (ＭＩＰ－１)α、及び/又はＭＩＰ－１β、及び/又はグランザイムＢ、及び/又はＩＬ－２、及び/又はＴＮＦ、及び /又はＩＬ－１０、及び/又はＩＬ－４、及び/又はエフェクター細胞脱顆粒によって定義され、ここで細胞の脱顆粒は、任意には、少なくとも抗原結合部分を含み、そしてＣＡＲの群のＣＡＲ分子の結合部位に結合することができる必要な各他のポリペプチドの有効濃度の存在下で、細胞当たり１００，０００を超える標的抗原分子又は標的抗原複合体を発現する標的細胞と接触した後、ＣＤ１０７ａ を表面に転位するエフェクター細胞のパーセンテージ、つまり脱顆粒アッセイを使用したフローサイトメトリー分析によって検出された ＣＤ１０７ａ 陽性エフェクター細胞のパーセンテージによって検出されることが好ましい (例えば、Proff et al., Front Micro -バイオル。2016;7:844)。好ましい実施形態によれば、各必要な調節分子の有効濃度の存在下対非存在下におけるエフェクター細胞の応答は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、又はさらにより好ましくは少なくとも１００％異なり、ここで、必要な各調節分子の有効濃度は、必要な各調節分子の有効量を、それを必要とする個体に1回以上投与することによって達成される濃度である。少なくとも抗原結合部分を含み、そしてＣＡＲの群に結合することができる必要なそれぞれの他のポリペプチドの有効濃度は、細胞当たり１００，０００を超える標的抗原分子又は標的抗原複合体を発現する標的細胞と、少なくとも1つの抗原結合部分を含みそしてＣＡＲの群に結合できる必要な他のポリペプチドの存在下と非存在下で接触した後、ＣＡＲ の完全に複合体化された対象群 (すなわち、ＣＡＲ の群に含まれるすべての二量体化ドメイン) の応答によって定義され、ここで応答は、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、又はさらにより好ましくは少なくとも１００％異なり、そして少なくとも抗原結合部分を含み、そしてＣＡＲの群に結合することができる必要な各他のポリペプチドの有効濃度は、それらの他のポリペプチドのそれぞれの有効量を1回以上の用量で、ＣＡＲの対象群を発現するＴリンパ球又はＮＫ細胞を受け取っている必要がある個体に投与することによって達成される濃度である。

【0245】

本発明によるＣＡＲの群のＣＡＲ分子に結合することができる調節分子および抗原特異的他のポリペプチドの両方を、以後、まとめて「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」と呼ぶ。

【0246】

本方法において、「ＣＡＲの群に特異的に結合する薬剤」は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便利な手段を使用して宿主に投与され得る。従って、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、治療投与のための種々の製剤に組み込まれ得る。より具体的には、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に製剤化することができ、そして固体、半固体、液体又は気体形態の製剤に製剤化することができる。 錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、エアロゾルとして、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、エアロゾルなどの固体、半固体、液体又は気体の形態の製剤に処方され得る。医薬的剤形では、「ＣＡＲ の群に特異的に結合する剤」は、薬学的に許容される塩の形で投与され得、又はそれらは、単独で、または適切に組み合わせて、また他の医薬的に活性な化合物と組み合わせて使用することもできる。以下の方法および賦形剤は、単なる例示である。

【0247】

適切な賦形剤ビークルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせであり得る。さらに、必要に応じて、ビークルは、少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985を参照のこと。いずれにしても、投与される組成物または製剤は、治療を受ける対象において所望の状態を達成するのに十分な量の必要な「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」を含む。医薬的に許容される賦形剤、例えばビークル、アジュバント、担体又は希釈剤は、公衆が容易に入手できる。さらに、医薬的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤などは、一般に容易に入手可能である。経口剤の場合、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、錠剤、散剤、顆粒剤又はカプセル剤を製造するために、単独で、又は以下の適切な添加剤、例えば、例えば従来の添加剤、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はジャガイモデンプン;結合剤、例えば晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ又はカルボキシメチルセルロースナトリウム；滑剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム；必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤及び香味剤と組合して使用され得る。

【0248】

「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、以下の水性又は非水性の溶媒に、それらを溶解、懸濁又は乳化することにより注射用製剤とすることができる：植物油又は他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル又はプロピレングリコール；及び 必要に応じて、従来の添加剤、例えば可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、防腐剤を添加できる。

【0249】

「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」を含む医薬組成物は、所望の純度を有する「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤及び/又は等張化剤と混合することによって調製することができる。許容される担体、賦形剤及び/又は安定剤は、好ましくは、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、そして以下を含む：緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、クエン酸などの抗酸化物質；防腐剤（エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロル－ｍ－クレゾール、メチル又はプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、又はそれらの組み合わせなど）; アミノ酸、例えばアルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンおよびそれらの組み合わせ；単糖類、二糖類およびその他の炭水化物;タンパク質、例えばゼラチン又は血清アルブミン;キレート剤、例えばＥＤＴＡ;糖、例えばトレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸; 及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、又はポリエチレングリコール (ＰＥＧ)。

【0250】

医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であり得、ここで凍結乾燥製剤は、投与前に無菌溶液で再構成する必要がある。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、通常、純水の量に戻すことであり (通常、凍結乾燥中に除去された量に相当します)；しかしながら、抗菌剤を含む溶液は、非経口投与用の医薬組成物の製造に使用できる；また、Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54を参照のこと。

【0251】

「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、徐放性製剤においても任意に製剤化することができる。 徐放性製剤は、当技術分野で周知の方法を用いて調製することができる。徐放性製剤の適切な例は、「ＣＡＲ の群に特異的に結合する剤」を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、ここでマトリックスは成形品の形、たとえば、フィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、L－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタメートの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸－グリコール酸共重合体、及びポリ－D-（-）-3-ヒドロキシ酪酸を含む。生物活性の損失の可能性は、適切な添加剤の使用、水分含有量の制御、及び特定のポリマー マトリックス組成の開発によって防ぐことができる。

【0252】

適切な投与量は、主治医または他の資格のある医療関係者が、さまざまな臨床的要因に基づいて決定することができる。医療分野でよく知られているように、任意の1 人の患者に対する投与量は、以下の多くの要因に依存する：患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の「ＣＡＲの群に特異的に結合する薬剤」、患者の性別、投与の時間及び経路、一般的な健康、及び同時に投与されている他の薬。「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、投与量当たり１ｎｇ/ｋｇ体重～２０ｍｇ/ｋｇ体重、例えば０．１ ｍｇ/ｋｇ 体重～１０ ｍｇ/ｋｇ 体重、例えば ０．５ ｍｇ/ｋｇ 体重～５ ｍｇ/ｋｇ 体重の量で投与され得；しかしながら、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲より低いか又は高い用量が想定される。投与計画が持続注入である場合、体重１ｋｇ当たり１分間に１μg～１０ｍｇの範囲でもよい。

【0253】

当業者は、用量レベルが特定の「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」、症状の重症度、及び被験者の副作用に対する感受性の関数として変化し得ることを容易に理解するであろう。所定の化合物の好ましい投与量は、当業者により様々な手段により容易に決定できる。

【0254】

１つ又は２以上の「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、薬物送達に適した利用可能な任意の方法及び経路を使用して個体に投与することができ、これには、インビボ及びエクスビボの方法、並びに全身及び局所の投与経路が含まれる。従来の医薬的に許容される投与経路には、腫瘍内、腫瘍周囲、筋肉内、気管内、頭蓋内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、直腸、鼻、経口、及びその他の経腸及び非経口投与経路が含まれる。投与経路は、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」及び/又は望ましい効果に応じて、必要に応じて組み合わせるか、又は調整することができる。「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、単回投与又は複数回投与することができる。好ましい実施形態によれば、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、経口的に、又は静脈内に投与することができる。他の実施形態によれば、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、吸入経路を介して投与することができる。さらに他の実施形態によれば、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、鼻腔内、局所、又は腫瘍内にも投与することができる。さらに他の実施形態によれば、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」を腫瘍周囲に投与することができる。脳腫瘍の治療のための他の実施形態によれば、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」を頭蓋内投与することができる。

【0255】

「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、全身経路又は局所経路を含む、従来の薬物の送達に適した利用可能な従来の方法及び経路を使用して宿主に投与することができる。一般的に、本発明によって意図される投与経路は、経腸、非経口、又は吸入経路を含む。吸入投与以外の非経口投与経路は、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、被膜内、脊髄内、胸骨内、腫瘍内、腫瘍周囲、および静脈内経路を含む。「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」の全身又は局所送達を行うために、非経口投与を行うことができる。全身送達が望ましい場合、投与は通常、侵襲的または全身的に吸収された局所的又は粘膜的製剤の投与を含む。「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、経腸投与によって対象に送達することもできる。経腸投与経路は、経口及び直腸（例えば、坐剤を使用する）送達を含む。

【0256】

治療とは、宿主を苦しめる病的状態に関連する症状の少なくとも改善を意味し、ここで、改善は、少なくともパラメーター、例えば癌などの治療中の病的状態に関連する症状の大きさの減少を指す広い意味で使用される。従って、治療には、病的状態、又は少なくともそれに関連する症状が完全に抑制され、例えば発生が防止され、又は停止され、例えば終了される状況も含まれ、結果的に、宿主が病的状態、又は少なくとも病的状態を特徴付ける症状に苦しむことがないようになる。

【0257】

「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、注射及び/又は送達によって、例えば、脳動脈内の部位に、又は脳組織に直接投与され得る。「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、例えば、直接注射により、浸透圧ポンプ又は徐放性粒子などの薬物送達デバイスの移植により、標的部位へのバイオリスティック送達などにより、標的部位に直接投与することもできる。さらに、「ＣＡＲの群に特異的に結合する剤」は、標準的な癌治療に対する補助療法として投与することができる。標準的な癌治療には、手術（例えば、癌性組織の外科的除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法治療、抗体治療、生物反応修飾治療、及びこれらの特定の組み合わせが含まれる。

【0258】

さまざまな対象が、癌を治療する対象方法による治療に適している。適切な対象には、例えば、癌を患っている、癌と診断されている、癌を発症するリスクがある、癌を患っており、癌の再発のリスクがある、 他の治療法で治療され、そのような治療に反応しなかった、又はそのような治療に対する最初の反応の後に再発した、個体、例えば、ヒト又はヒト以外の動物を含む。

【0259】

本免疫調節方法による治療に適した対象は、自己免疫疾患を有する個体；臓器または組織の移植レシピエントである個人；免疫不全の個人;及び病原体に感染している個人を含む。

【図面の簡単な説明】

【0260】

【図1-1】図１は、ＣＡＲの群の例示的アーキテクチャの概略図を示す。

【0261】

【図1-2】図１は、ＣＡＲの群の例示的アーキテクチャの概略図を示す。

【0262】

【図1-3】図１は、ＣＡＲの群の例示的アーキテクチャの概略図を示す。

【0263】

【図1-4】図１は、ＣＡＲの群の例示的アーキテクチャの概略図を示す。

【0264】

【図1-5】図１は、ＣＡＲの群の例示的アーキテクチャの概略図を示す。

【0265】

【図1-6】図１は、ＣＡＲの群の例示的アーキテクチャの概略図を示す。

【0266】

【図1-7】図１は、ＣＡＲの群の例示的アーキテクチャの概略図を示す。

【0267】

【図2】図２は、ヒトＥＧＦＲに対する種々のｒｃＳｓｏ７ｄベースの抗原結合部分のＫｄ値を示す。

【0268】

【図3-1】図３は、システインを形成する細胞外ジスルフィド結合が、ＣＡＲ機能の調節のための結合力効果の利用を妨げることができることを示す。

【0269】

【図3-2】図３は、システインを形成する細胞外ジスルフィド結合が、ＣＡＲ機能の調節のための結合力効果の利用を妨げることができることを示す。

【0270】

【図4-1】図４は、ｓｃＦｖ含有ＣＡＲ分子の二量体化／オリゴマー化が、ＣＡＲ機能の調節のための結合力効果の利用を妨げることを示す。

【0271】

【図4-2】図４は、ｓｃＦｖ含有ＣＡＲ分子の二量体化／オリゴマー化が、ＣＡＲ機能の調節のための結合力効果の利用を妨げることを示す。

【0272】

【図4-3】図４は、ｓｃＦｖ含有ＣＡＲ分子の二量体化／オリゴマー化が、ＣＡＲ機能の調節のための結合力効果の利用を妨げることを示す。

【0273】

【図5-1】図５は、条件付きホモ二量体化によりＣＡＲの群の結合力を調節することによるＣＡＲ機能の調節を示す。

【0274】

【図5-2】図５は、条件付きホモ二量体化によりＣＡＲの群の結合力を調節することによるＣＡＲ機能の調節を示す。

【0275】

【図6】図６は、インビボでＣＡＲの群を発現する安定的に形質導入されたＴ細胞の機能の調節を示す。

【0276】

【図7-1】図７は、インビボ実験に使用されたＣＡＲ修飾Ｔ細胞の機能的なインビトロ特性を示す。

【0277】

【図7-2】図７は、インビボ実験に使用されたＣＡＲ修飾Ｔ細胞の機能的なインビトロ特性を示す。

【0278】

【図7-3】図７は、インビボ実験に使用されたＣＡＲ修飾Ｔ細胞の機能的なインビトロ特性を示す。

【0279】

【図7-4】図７は、インビボ実験に使用されたＣＡＲ修飾Ｔ細胞の機能的なインビトロ特性を示す。

【0280】

【図8-1】図８は、ヘテロ二量体化によるＣＡＲの群の結合力、標的抗原が単量体であるか二量体であるかに応じたＣＡＲ Ｔ細胞の感度の調節を示す。

【0281】

【図8-2】図８は、ヘテロ二量体化によるＣＡＲの群の結合力、標的抗原が単量体であるか二量体であるかに応じたＣＡＲ Ｔ細胞の感度の調節を示す。

【0282】

【図8-3】図８は、ヘテロ二量体化によるＣＡＲの群の結合力、標的抗原が単量体であるか二量体であるかに応じたＣＡＲ Ｔ細胞の感度の調節を示す。

【0283】

【図8-4】図８は、ヘテロ二量体化によるＣＡＲの群の結合力、標的抗原が単量体であるか二量体であるかに応じたＣＡＲ Ｔ細胞の感度の調節を示す。

【0284】

【図9-1】図９は、ＶＥＧＦによるＣＡＲの群の結合力の調節を示す。

【0285】

【図9-2】図９は、ＶＥＧＦによるＣＡＲの群の結合力の調節を示す。

【0286】

【図10-1】図１０は、ＨＥＲ２に対するアフィボディベースのＣＡＲ群の生成と機能を示す。

【0287】

【図10-2】図１０は、ＨＥＲ２に対するアフィボディベースのＣＡＲ群の生成と機能を示す。

【0288】

【図10-3】図１０は、ＨＥＲ２に対するアフィボディベースのＣＡＲ群の生成と機能を示す。

【0289】

【図11-1】図１１は、３又は４つのＣＡＲ分子からなるＣＡＲの群を示す。

【0290】

【図11-2】図１１は、３又は４つのＣＡＲ分子からなるＣＡＲの群を示す。

【0291】

【図12-1】図１２は、異なる共刺激ドメインを含むＣＡＲの群を示す。

【0292】

【図12-2】図１２は、異なる共刺激ドメインを含むＣＡＲの群を示す。

【0293】

【図13-1】図１３は、異なるＣＡＲシグナル伝達バックボーンに融合された異なるｒｃＳｓｏ７ｄ及びアフィボディベースの結合部分を含むＣＡＲ分子の発現を示す。

【0294】

【図13-2】図１３は、異なるＣＡＲシグナル伝達バックボーンに融合された異なるｒｃＳｓｏ７ｄ及びアフィボディベースの結合部分を含むＣＡＲ分子の発現を示す。

【0295】

【図14-1】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0296】

【図14-2】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0297】

【図14-3】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0298】

【図14-4】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0299】

【図14-5】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0300】

【図14-6】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0301】

【図14-7】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0302】

【図14-8】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0303】

【図14-9】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0304】

【図14-10】図１４は、異なるＣＡＲ分子の設計の概略図を示す。

【0305】

【図15-1】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0306】

【図15-2】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0307】

【図15-3】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0308】

【図15-4】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0309】

【図15-5】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0310】

【図15-6】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0311】

【図15-7】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0312】

【図15-8】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0313】

【図15-9】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0314】

【図15-10】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0315】

【図15-11】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【0316】

【図15-12】図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す。

【実施例】

【0317】

図１：ＣＡＲ群の典型的なアーキテクチャの概略図を示す。図１Ａは、本明細書におけるＣＡＲ群のＣＡＲ分子の基本構造の概略図であり、前記構造において、抗原結合部分がＣＡＲ分子に組み込まれており（左）、前記ＣＡＲ分子は、抗原結合部分を含む別のポリペプチドの結合部位に結合する結合部位を含む（右）。低親和性相互作用は、抗原結合部分と標的抗原の間、又はＣＡＲ分子の結合部位と、ＣＡＲ分子の結合部位に結合する他のポリペプチドの結合部位との間で起こる。一群の少なくとも１つのＣＡＲ分子は、少なくとも１つのＩＴＡＭ又は少なくとも１つのＩＴＩＭのいずれかを含む少なくとも１つのシグナリング領域を含む必要がある。ＣＡＲ分子の提示例において、エンドドメインは、例示的に、単一のシグナリング領域を含む。図示したＣＡＲ分子の各構成要素間の線は、所望のリンカーを示す。二量体化ドメイン（前記群の各ＣＡＲ分子に少なくとも１つは必須）及び所望の追加ドメイン又は構成要素は図示せず。
図１Ｂは、２、３、又は４つのＣＡＲ分子からなるＣＡＲの群において、少なくとも１つのシグナリング領域を含み得るＣＡＲ分子の数を示した模式図である（所定のＣＡＲ分子のシグナリング領域の全体を白いボックスで表す）。少なくとも１つのシグナリング領域を含むＣＡＲ分子のうち、全部又は一部のみであるが少なくとも１つのＣＡＲ分子は、少なくとも１つのＩＴＡＭ又は少なくとも１つのＩＴＩＭを含む。簡潔に、エクトドメイン及び二量体化ドメイン、及び所望の追加ドメイン又は構成要素は図示せず。図示したＣＡＲ分子の各構成要素間の線は、所望のリンカーを示す。
図１Ｃは、２つのＣＡＲ分子からなるＣＡＲの一群を例として、シグナリング領域の配置を示した模式図である。図示例は、様々な配置の可能な組み合わせの一部のみを示しているにすぎない。例えば、ＣＡＲ分子は、２以上のＩＴＡＭ含有シグナリング領域又は２以上の共刺激シグナリング領域を含み得る。ＣＡＲの阻害群（図示せず）では、ＩＴＡＭ含有シグナリング領域はＩＴＩＭ含有シグナリング領域によって置換され、共刺激シグナリング領域は省略されるか、他の阻害ドメインによって置換される。簡潔に、外部ドメイン及び二量体化ドメイン、及び所望の追加ドメイン又は構成要素は図示せず。図示したＣＡＲ分子の各構成要素間の線は、所望のリンカーを示す。
図１Ｄ～図１Ｎは、二量体化ドメインがＣＡＲ群の非共有複合体形成にどのように使用され得るかを示した模式図である。図示例は、配置の可能な組み合わせの一部のみを示しているにすぎない。図示例では、ホモ二量体化ドメイン及びヘテロ二量体化ドメインの異なる対が、ＣＡＲ分子の異なる位置に示され、それぞれが１つ又は２つのシグナリング領域を例示的に含む。好ましい例（図１Ｅ、左）において、３つのＣＡＲ分子からなる一群のＣＡＲは、ヘテロ二量体化ドメインの単一のペアの２つのメンバーのみを含み、それに応じて、単一の種類の制御分子によって制御され得る。簡潔に、シグナリング領域、膜貫通ドメイン、及び二量体化ドメインのみを図示する。図示したＣＡＲ分子の一部の構成要素間の線は、所望のリンカーを示している。二量体化ドメインの同様の配置も細胞外に組み込まれ得る。
図１Ｏは、制御分子として作用する細胞外可溶性因子によるＣＡＲ群の非共有複合体形成を例示した図である。制御分子は、単量体タンパク質及び本来ホモ二量体化又はヘテロ二量体化するタンパク質を用いて概略的に例示した。図示したＣＡＲ分子は、例示的に、１つのシグナリング領域のみを含む。所望の追加の二量体化ドメイン及び所望の追加のドメイン又は構成要素は図示せず。抗原結合ドメイン（又は結合部位）及び二量体化ドメインの順序は逆であってもよい。すなわち、抗原結合ドメイン（又は結合部位）は、二量体化ドメインよりも原形質膜に近接していてもよい。図示したＣＡＲ分子の各構成要素間の線は、所望のリンカーを示す。

【0318】

図２は、３つの補完的な方法で決定したヒトＥＧＦＲに対する様々なｒｃＳｓｏ７ｄ系抗原結合部分（スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）に融合）のＫ_ｄ値を示した図である。（ａ）高レベルの短縮型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）を発現するジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞に結合した様々ｓｆＧＦＰ融合タンパク質量のフローサイトメトリーによる定量化。（ｂ）及び（ｃ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＥＧＦＲの細胞外ドメインを含むキメラＥＧＦＲタンパク質でコーティングされたマトリックスを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。親和性は、（ｂ）動力学的分析法又は（ｃ）定常状態分析法のいずれかで決定した。

【0319】

図３：システインを形成する細胞外ジスルフィド結合は、ＣＡＲ機能制御のための結合活性（アビディティー）効果の利用を阻止する。（Ａ）ＣＡＲシグナリングの骨格であるＳ－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ（「Ｃｙｓ」）の「Ｃｙｓ」及びＳ－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ（「Ｓｅｒ」）の「Ｓｅｒ」のアーキテクチャがそれぞれジスルフィド結合を形成可能かどうかを示した概略図。これらのシグナリングの骨格は、様々なｒｃＳｓｏ７ｄ系抗原結合部分に融合し、初代ヒトＴ細胞での機能試験のために発現させた。（Ｂ）初代ヒトＴ細胞における５μｇのｍＲＮＡのエレクトロポレーションから２０時間後の典型的なＣＡＲ発現（「Ｃｙｓ」又は「Ｓｅｒ」ＣＡＲ骨格のいずれかに融合したｒｃＳｓｏ７ｄバリアント「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」で示す）。導入遺伝子を発現していないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。（Ｃ）３μｇのｔＥＧＦＲコード化ｍＲＮＡのエレクトロポレーションから２０時間後の標的細胞として使用したジャーカット細胞におけるｔＥＧＦＲの発現。コンストラクトを含まないジャーカットＴ細胞（「コンストラクトなし」）及びそれぞれのアイソタイプ対照（「アイソタイプ対照」）を、陰性対照として使用した。ＣＡＲの機能は、標的細胞殺傷（Ｄ）及びＩＦＮ－γ産生（Ｅ）に関する様々なＣＡＲで修飾した初代ヒトＴ細胞の能力を測定することによって試験した。４人の異なるドナー（異なる記号で示される）のＴ細胞に、提示したＣＡＲコンストラクトの５μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、翌日、ジャーカットＴ細胞（３μｇのｔＥＧＦＲ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションした）と、２：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で３７℃で４時間培養した。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。

【0320】

図４：ｓｃＦｖ含有ＣＡＲ分子の二量体化／多量体化は、ＣＡＲ機能の制御のための結合活性効果の利用を阻止する。（Ａ）実験で使用したＣＡＲの概略図。（Ｂ、Ｃ、及びＤ）５μｇの各ｍＲＮＡのエレクトロポレーションから２０時間後のヒト初代Ｔ細胞におけるＣＡＲコンストラクトの発現。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。（Ｅ）５μｇのｔＥＧＦＲコード化ｍＲＮＡのエレクトロポレーションから２０時間後の標的細胞として使用したジャーカット細胞におけるｔＨＥＲ２の発現。コンストラクトを含まないジャーカットＴ細胞（「コンストラクトなし」）を、陰性対照として使用した。ＣＡＲ Ｔ細胞をＪｕｒｋａｔ－ｔＨＥＲ２細胞と３７℃で４時間、Ｅ：Ｔ比２：１で共培養した。図４Ｆ及び図４Ｇは、ＣＡＲの能力を示す図であり、ｓｃＦｖ ４Ｄ５－５を、細胞毒性（Ｇ）及びＩＦＮ－γ産生（Ｆ）を誘発するために２つの異なるＣＡＲシグナリング骨格（ジスルフィド結合形成可能である又は可能でない、すなわち、４Ｄ５－５－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ（配列番号５９）の場合は「Ｃｙｓ」及び４Ｄ５－５－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ（配列番号６０）の場合は「Ｓｅｒ」））に融合した。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌが２つの別々のポリペプチド（「Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ」、４Ｄ５－５（ｓｐｌｉｔ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号５６及び配列番号５７））に融合したＣＡＲの機能を、（Ｈ）に示す。単量体シグナリング骨格が４Ｄ５－５－ｓｃＦｖに融合されたＣＡＲ ４Ｄ５－５－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ（配列番号６０）を発現する初代Ｔ細胞を、陽性対照として使用した。異なるドナーである３個体のＣＡＲ Ｔ細胞（異なる記号で示す）を、ｔＨＥＲ２をトランスフェクトした及びトランスフェクトしていないジャーカットＴ細胞の混合物と、３７℃で４時間、Ｅ：Ｔ比４：１：１（Ｔ細胞：ｔＨＥＲ２^ｐｏｓジャーカット細胞：ｔＨＥＲ２^ｎｅｇジャーカット細胞）で共培養し、生存ｔＨＥＲ２^ｐｏｓ及びｔＨＥＲ２^ｎｅｇ標的細胞の比率を、フローサイトメトリーによって決定した。二量体化を誘導するために、前記Ｔ細胞を二量体化剤ＡＰ２０１８７で前処理した（１０ｎＭ、３０分、３７℃）。同一濃度のＤＭＳＯでの処理は、対照条件として使用した。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）及びＶ_Ｈ鎖のみを発現するＴ細胞（「４Ｄ５－５（Ｖ_Ｈ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ」（配列番号５７））を、陰性対照として使用した。

【0321】

図５：ＣＡＲ分子のホモ二量体化によるＣＡＲ結合活性の制御。（Ａ）制御分子ＡＰ２０１８７によって複合化されたＣＡＲ群の模式図。図示例では、ＥＧＦＲに対するｒｃＳｓｏ７ｄ系抗原結合部分を、抗原結合部分として使用した。（Ｂ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズによる活性化の１４日後（すなわち、各ＣＡＲコンストラクトによる安定的形質導入から１３日後）の、初代ヒトＴ細胞における、ＥＧＦＲに対して高い親和性又は低い親和性を持つ抗原結合部分を含むＣＡＲ分子の発現（すなわち、それぞれＳ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」（配列番号４９）及びＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」（配列番号４６））。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。（Ｃ）標的細胞株「Ａ４３１－ｆＬｕｃ」におけるＥＧＦＲの発現。非染色細胞（「非染色」）及びそれぞれのアイソタイプ対照（「アイソタイプ対照」）を、陰性対照として使用した。（Ｄ）ルシフェラーゼ発現標的細胞株Ａ４３１－ｆＬｕｃ殺傷するための、異なるＣＡＲコンストラクトで形質導入した初代ヒトＴ細胞の能力。３個体のドナーの初代Ｔ細胞（異なる記号で示す）に、ＣＤ１９（ＣＤ１９－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ「ＣＤ１９－ＢＢｚ」（配列番号５８））に対するｒｃＳｓｏ７ｄ系ＣＡＲ Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」）及びＳ（３２）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」））又はｓｃＦｖ系ＣＡＲのいずれかをコード化するベクターを安定的に形質導入し、陰性対照として使用した。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、追加の陰性対照として使用した。ＡＰ２０１８７は、「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」（Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ）及び「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」（Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ）の非共有結合二量体化の制御分子として使用した。二量体化は、Ｔ細胞を１０ｎＭのＡＰ２０１８７で３７℃で３０分間前処理することにより誘導した。同一濃度のＤＭＳＯでの処理を、対照条件として使用した。修飾Ｔ細胞の細胞毒性は、１０：１のＥ：Ｔ比で３７℃で４時間共培養した後、Ａ４３１－ｆＬｕｃ標的細胞を発現する生存ルシフェラーゼを定量することによって決定した。

【0322】

図６：ＮＳＧマウスモデルにおけるインビボで安定的に形質導入さしたＣＡＲ Ｔ細胞の機能の制御。（Ａ）二量体化の有効性は、インビボＮＳＧマウスモデルにおけるＣＡＲ活性化を誘導した。９～１６週齢のＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼ及びｔＥＧＦＲをコードするベクターを安定的に形質導入した、０．５×１０^６個のＮａｌｍ６細胞（「Ｎａｌｍ６－ｔＥＧＦＲ－ｆＬｕｃ」）を静脈内注射した。３日後、前記ＮＳＧマウスを、１０×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内投与によって処理した（抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズによる活性化の１４日後、すなわち安定的形質導入から１３日後）。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の注射を、対照条件として使用した。４個体のマウスからなるＳ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号４９）で処理した群を除いて、５個体のＮＳＧマウスを各処理群に用いた。二量体化は、２ｍｇ／ｋｇのホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７を、１１日間（矢印で示す注射日）の腹腔内投与することによって誘導した。二量体化剤を投与しなかった群には、対照条件としてそれぞれの媒体溶液を腹腔内投与した。腫瘍サイズ（各処理群の平均）を、ＮＳＧマウスの全身を含む対象領域内で測定した全光子束として示す。（Ｂ）Ｓ（３２）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号４６）ＣＡＲ Ｔ細胞で処理したが、１１日目まで二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）ＡＰ２０１８７を投与しなかったマウスへの二量体化剤の投与を延期することにより、効率的なＣＡＲ活性化及び腫瘍増殖の調節がもたらされることを示す。

【0323】

図７：安定的に形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ機能の制御。（Ａ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズによる活性化の１４日後（すなわち、各ＣＡＲコンストラクトによる安定的形質導入から１３日後）の、初代ヒトＴ細胞における、ＥＧＦＲに対して高い親和性又は低い親和性を持つ抗原結合部分を含むＣＡＲ分子の発現（すなわち、それぞれＳ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」（配列番号４９）及びＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」（配列番号４６））。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。（Ｂ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズによる活性化の１４日後（すなわち、安定的形質導入から１３日後）の、初代ヒトＴ細胞における、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ ＣＤ１９－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ「ＣＤ１９－ＢＢｚ」（配列番号５８）の発現。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。（Ｃ及びＤ）Ｎａｌｍ６－ｆＬｕｃ細胞及びＮａｌｍ６－ｔＥＧＦＲ－ｆＬｕｃ細胞それぞれにおけるｔＥＧＦＲの発現。非染色細胞及びそれぞれのアイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。（Ｅ及びＦ）異なるＣＡＲ分子を発現する初代ヒトＴ細胞によるＮａｌｍ６－ｆＬｕｃ細胞及びＮａｌｍ６－ｔＥＧＦＲ－ｆＬｕｃ細胞の溶解。３個体のドナーの初代Ｔ細胞（異なる記号で示す）に、ＣＤ１９（ＣＤ１９－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ「ＣＤ１９－ＢＢｚ」）に対するｒｃＳｓｏ７ｄ系ＣＡＲ Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」及びＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」）又はｓｃＦｖ系ＣＡＲのいずれかをコード化するベクターを安定的に形質導入し、陰性対照として使用した。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。ＡＰ２０１８７は、「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」（Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ）及び「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」（Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ）の非共有結合二量体化の制御分子として使用した。二量体化は、Ｔ細胞を１０ｎＭのＡＰ２０１８７で３７℃で３０分間前処理することにより誘導した。同一濃度のＤＭＳＯでの処理を、対照条件として使用した。修飾Ｔ細胞の細胞毒性は、１０：１のＥ：Ｔ比で３７℃で４時間共培養した後、標的細胞を発現する生存ルシフェラーゼを定量することによって決定した。

【0324】

図８：ＣＡＲ分子のヘテロ二量体化によるＣＡＲ群の結合活性の制御及びＣＡＲ Ｔ細胞の感受性に対する標的抗原の共局在の影響。５μｇの各ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの２０時間後の、標的細胞として使用したジャーカット細胞におけるｔＥＧＦＲ融合タンパク質（「ＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ」、条件的ホモ二量体化）の発現を、（Ａ）に図示した。非染色細胞（「モック（ｍｏｃｋ）」）及びそれぞれのアイソタイプ対照（「アイソタイプ」）を、陰性対照として使用した。（Ｂ及びＣ）異なる量のそれぞれのｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたジャーカットＴ細胞におけるｔＥＧＦＲの発現レベルの相関。（Ｄ及びＥ）５μｇの各ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの２０時間後の初代ヒトＴ細胞における異なるＣＡＲの発現。制御分子ＡＰ２１９６７による条件的ヘテロ二量体化のために、高親和性及び低親和性のｒｃＳｓｏ７ｄバリアント（それぞれ「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」及び「Ｅ１１．４．１．－Ｇ３２Ａ」）を、８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ骨格及び８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ骨格の両方に融合した。得られたコンストラクト（Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ（配列番号４８）、Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ（配列番号４７）、Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ（配列番号５０）、Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＦＲＢ－３ｚ（配列番号５１））の発現を、それらの組み込んだタグ（８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚの場合はＳｔｒｅｐ Ｉｉ及び８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚの場合はＦＬＡＧ）を解して検出した。（Ｆ）単量体又は二量体の標的抗原ｔＥＧＦＲを発現する標的細胞に応答した、ＣＡＲ Ｔ細胞の二量体化誘発活性化の感度の測定のために使用した実験系の分子構造。この系では、ＣＡＲ分子は制御分子ＡＰ２１９６７によって条件的にヘテロ二量体化され、標的抗原ｔＥＧＦＲはＡＰ２０１８７によって条件的にホモ二量体化された。標的細胞で発現されたｔＥＧＦＲ分子の数並びにＡＰ２１９６７及びＡＰ２０１８７の有無の両方に依存する、初代ヒトＴ細胞における細胞毒性及びＩＦＮ－γ産生をそれぞれ誘発するＣＡＲの能力（平均±標準偏差、ｎ＝３、３個体の異なるドナー）を、（Ｇ）及び（Ｈ）に示す。３個体のドナーからの初代Ｔ細胞を、各ＣＡＲ分子の５μｇのｍＲＮＡ（すなわち、図示されるように、低親和性コンストラクトＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ ｐｌｕｓ Ｓ（Ｇ３２Ａ）－ｓｅｒ８－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ又は高親和性コンストラクトＳ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ ｐｌｕｓ Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ）でエレクトロポレーションし、様々な量のｔＥＧＦＲを発現するジャーカットＴ細胞と共培養した。共培養は、４：１：１のＥ：Ｔ比（Ｔ細胞：ｔＥＧＦＲ^ｐｏｓジャーカット細胞：ｔＥＧＦＲ^ｎｅｇジャーカット細胞）で３７℃で４時間行った。ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性は、生存ｔＥＧＦＲ^ｐｏｓ標的細胞及びｔＥＧＦＲ^ｎｅｇ標的細胞の比率をフローサイトメトリーにより定量化することによって決定した。ＣＡＲ二量体化を誘導するために、初代ヒトＴ細胞を、ＡＰ２１９６７（５００ｎＭ、３０分、３７℃）で前処理し、ＥＧＦＲ二量体化を誘導するために、ジャーカットＴ細胞をＡＰ２０１８７（１０ｎＭ、３０分、３７℃）で前処理した。同一濃度のエタノール（ＡＰ２１９６７の場合）又はＤＭＳＯ（ＡＰ２０１８７の場合）による処理を、対照条件として使用した。

【0325】

図９：腫瘍微小環境に蓄積する細胞外因子の例としてのＶＥＧＦによって制御され得るＣＡＲの生成。図示例では、可溶性因子ＶＥＧＦを制御分子として使用し、ＥＧＦＲ特異的ｒｃＳｓｏ７ｄ系バインダーＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａを抗原結合部分として使用した。それぞれのＣＡＲのアーキテクチャの概略図を（Ａ）及び（Ｂ）に示す。５μｇのｍＲＮＡのエレクトロポレーションの２０時間後のジャーカットＴ細胞における標的抗原ｔＥＧＦＲの発現を、（Ｃ）に示す。初代ヒトＴ細胞における２つのポリペプチドの発現を、抗ＩｇＧ１抗体を使用して検出した（Ｄ）。ＶＥＧＦ結合部位（膜貫通ドメインを含まないＪａｎｕｓ－ＣＴ６－Ｆｃドメイン）を含むＣＡＲ分子及びＩｇＧ－Ｆｃドメインを含まない対照ＣＡＲの検出のために、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体を追加的に使用した。初代Ｔ細胞における様々なＣＡＲによって引き起こされる細胞毒性を、ＦＡＣＳに基づく細胞毒性アッセイで測定した（Ｅ）。３個体の異なるドナーからのＣＡＲ Ｔ細胞（異なる記号で示す）を、ｔＥＧＦＲをトランスフェクトしたジャーカット細胞と３７℃で４時間、Ｅ：Ｔ比として４：１：１（Ｔ細胞：ｔＥＧＦＲ^ｐｏｓジャーカット細胞：ｔＥＧＦＲ^ｎｅｇジャーカット細胞）で共培養した。ＣＡＲの二量体化は、Ｔ細胞をＶＥＧＦで前処理することによって誘導した（濃度は記載の通り、３０分、３７℃）。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）は陰性対照として使用し、ＣＡＲ Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚを含むＴ細胞は陽性対照として使用した。

【0326】

図１０：本発明による一群のＣＡＲでの使用に適したアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）ベースの結合部分のスクリーニング。アフィボディであるｚＨＥＲ２－ＷＴの親和性は、アラニンによるエピトープ結合に関与し得る全てのアミノ酸を置換することによって低減した。ｚＨＥＲ２－ＷＴの様々なバリアントは、条件的二量体化のための細胞内ホモ二量体化ドメインＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）を含むＣＡＲシグナリング骨格である８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚに融合した。これらのＣＡＲのアーキテクチャを（Ａ）に示す。（Ｂ及びＣ）ジャーカットＴ細胞における標的抗原ｔＨＥＲ２の発現及び初代Ｔ細胞におけるアフィボディベースのＣＡＲの発現。初代Ｔ細胞及びジャーカットＴ細胞に、それぞれのコンストラクトをコードする５μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの２０時間後に発現を測定した。初代Ｔ細胞及びコンストラクトを発現しないジャーカットＴ細胞（それぞれ「ＣＡＲなし」及び「コンストラクトなし」）を陰性対照として使用した。（Ｄ）初代Ｔ細胞における１３種類のアフィボディベースのＣＡＲ（それぞれ、「Ｌ９Ａ」、「Ｒ１０Ａ」、「Ｑ１１Ａ」、「Ｙ１３Ａ」、「Ｗ１４Ａ」、「Ｑ１７Ａ」、「Ｗ２４Ａ」、「Ｔ２５Ａ」、「Ｓ２７Ａ」、「Ｒ２８Ａ」、「Ｒ３２Ａ」、「Ｙ３５Ａ」、及び「ｚＨＥＲ２－ＷＴ」）（ＣＡＲシグナリングバックボーンに融合したアフィボディベースの抗原結合部分の配列は、配列番号２６～配列番号３８に示す）の発現。初代Ｔ細胞に、それぞれのコンストラクトをコードする５μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの２０時間後に発現を測定した。コンストラクトを発現しないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を陰性対照として使用した。（Ｅ）二量体化によるアフィボディベースのＣＡＲの活性化。２個体のドナーからの初代Ｔ細胞（異なる記号で示す）を、各コンストラクトに５μｇでエレクトロポレーションした。標的細胞の特異的溶解は、ｔＨＥＲ２－トランスフェクトした異なるＣＡＲ Ｔ細胞を共インキュベーションした後、ルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイで測定した（Ｅ：Ｔ比２：１、３７℃で４時間）。ＣＡＲの二量体化は、Ｔ細胞をＡＰ２０１８７で前処理することによって誘導した（１０ｎＭ、３０分、３７℃）。同一濃度のＤＭＳＯでの処理は、対照条件として使用した。ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、陰性対照として使用した。図１０Ｆに、ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＨＥＲ２の細胞外ドメインを含むキメラＨＥＲ２タンパク質で被覆したマトリックスを使用したＳＰＲ分析によって決定される、ヒトＨＥＲ２に対するそれぞれのアフィボディベースの結合部分（スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）に融合）のＫ_ｄ値を示す。親和性は、動力学的法で決定した。

【0327】

図１１：３個及び４個のＣＡＲ分子からなるＣＡＲ群の機能的特徴付け。（Ａ及びＢ）それぞれ３個又は４個ＣＡＲ分子からなるＣＡＲ群の模式図。（Ｃ及びＤ）各コンストラクトの５μｇのｍＲＮＡのエレクトロポレーションの２０時間後のジャーカットＴ細胞におけるＣＡＲの三量体及び四量体群の発現。コンストラクトを発現しないジャーカットＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を陰性対照として使用した。

【0328】

図１２：異なる共刺激分子を含むＣＡＲ群の発現及び機能。（Ａ）それぞれが、その共刺激シグナリング領域にＣＤ２８、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の共刺激ドメインを含む、２個のＣＡＲ分子からなる一群のＣＡＲの概略図。（Ｂ及びＣ）ジャーカットＴ細胞又は初代ヒトＴ細胞における５μｇのｍＲＮＡのエレクトロポレーションから２０時間後のＣＡＲ分子の発現（赤色ヒストグラム）。コンストラクトを発現しないジャーカットＴ細胞又は初代ヒトＴ細胞（「ＣＡＲなし」）を、それぞれ陰性対照として使用した（青色で塗りつぶしたヒストグラム）。（Ｄ）Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＯＸ４０－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚをコードする５μｇのｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたジャーカットＴ細胞におけるＮＦ－κＢ及びＮＦ－ＡＴプロモーターの誘導。これらの細胞を、ＡＰ２０１８７の存在下又は非存在下で、５μｇのｔＥＧＦＲコード化ｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたジャーカットＴ細胞を用いて、さらに２０時間、共培養した又はしなかった。ＣＡＲ発現レポーター細胞におけるＮＦ－κＢ及びＮＦ－ＡＴプロモーターの誘導は、それぞれ高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）及びＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）の発現のフローサイトメトリー分析によって検出した。提示したＣＡＲ分子を発現する初代ヒトＴ細胞の細胞毒性を（Ｅ）に示す。それぞれのＣＡＲ分子をコードする５μｇのｍＲＮＡのエレクトロポレーションの２０時間後、Ｔ細胞を標的細胞とさらに４時間又は２０時間３７℃で４：１：１のＥ：Ｔ比（Ｔ細胞：ｔＥＧＦＲ^ｐｏｓジャーカット細胞：ｔＥＧＦＲ^ｎｅｇジャーカット細胞）で共培養した。
ＣＡＲ分子群の二量体化は、ジャーカット細胞（Ｄ）及び初代ヒトＴ細胞（Ｅ）を１０ｎＭのＡＰ２０１８７で３７℃で３０分間前処理することにより誘導した。同一濃度のＤＭＳＯでの処理を、対照条件として使用した。

【0329】

図１３：異なるＣＡＲシグナリング骨格に融合したｒｃＳｓｏ７ｄ及びアフィボディベースの結合部分を含むＣＡＲ分子の発現。（Ａ）それぞれのｍＲＮＡの５μｇのエレクトロポレーションから２０時間後の初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲコンストラクト「Ｍｙｃ－Ｓ（１８．４．２）－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号３９）、「Ｓ（１８．４．２）－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号４０）、及び「Ｓ（１８．４．２）－Ｇ４Ｓ－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号４１）の発現。ＣＡＲを含まない初代Ｔ細胞を、陰性対照として使用した（塗りつぶしたヒストグラム）。ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、及び抗ヒトＩｇＧ１抗体からなる融合タンパク質を用いて発現を検出した。（Ｂ）それぞれのｍＲＮＡの５μｇのエレクトロポレーションから２０時間後の初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲコンストラクト「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－Ｇ４Ｓ－ｍｙｃ－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号４２）、「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－Ｇ４Ｓ－ＳｔｒｅｐＩＩ－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号４３）、及び「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－Ｇ４Ｓ－ｈｉｓ－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号４５）の発現。ＣＡＲを含まない初代Ｔ細胞は、陰性対照として使用した（塗りつぶしたヒストグラム）。ＣＡＲの発現は、抗ｃ－ｍｙｃ抗体、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩ抗体、又は抗ヘキサヒスチジン抗体をそれぞれ使用して検出した。（Ｃ）それぞれのｍＲＮＡの５μｇのエレクトロポレーションから２０時間後の初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲコンストラクト「Ｓ（ＷＴ）－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号７４）、「Ｓ（Ｇ２５Ａ）－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号７２）、「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号４３）、「Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号７５）、「Ｓ（Ｇ２５Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号７３）、及び「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ」（配列番号４４）の発現。ＣＡＲを含まない初代Ｔ細胞は、陰性対照として使用した（塗りつぶしたヒストグラム）。発現は、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩ抗体を使用して検出した。（Ｄ）それぞれのｍＲＮＡの５μｇのエレクトロポレーションから２０時間後の初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲコンストラクト「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ」（配列番号４６）、「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ」（配列番号４７）、「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ」（配列番号４８）、及び「Ａ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ」（配列番号５２）の発現。ＣＡＲを含まない初代Ｔ細胞は、陰性対照として使用した（塗りつぶしたヒストグラム）。示されるように、抗ＦＬＡＧ抗体、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩ抗体、又は抗ヘキサヒスチジン抗体のいずれかを使用して、発現を検出した。

【0330】

図１４は、様々なＣＡＲ分子の設計の概略図を示す図である。対応するアミノ酸配列を図１５に示す。

【0331】

図１５は、異なるＣＡＲ分子のアミノ酸配列を示す図である。

【0332】

実施例１：本発明のＣＡＲ群で使用されるｒｃＳｓｏ７ｄをベースとした低親和性シングルドメイン結合性部分の作製
第一の実施例は、本発明のＣＡＲ群の抗原結合部分として使用するのに適した低親和性の抗原結合部分を作製するための戦略を示すものである。電荷低減型（Ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｈａｒｇｅ）Ｓｓｏ７ｄ（ｒｃＳｓｏ７ｄ）は、古細菌スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来の低分子（約７ｋＤａ）ＤＮＡ結合タンパク質の電荷低減型である。電荷の低減は、静電的相互作用を減少させることで、非特異的結合を最小限にする。ｒｃＳｓｏ７ｄは、高い熱安定性と単量体挙動を有するシングルドメインのタンパク質抗原結合部分であり、そのため、好適な結合性スキャフォールドの一例である。１９ｎＭのＫ_ｄでヒトＥＧＦＲに結合する（Ｔｒａｘｌｍａｙｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２０１６年；２９１巻（４３号）：頁２２４９６～２２５０８）、特徴がはっきりした抗原結合部分ｒｃＳｓｏ７ｄ Ｅ１１．４．１から、アラニンスキャンを行って、エピトープ結合に関与している可能性のある全てのアミノ酸をアラニンで置換することにより、低親和性変異体を作製した。すなわち、それぞれの変異体において、抗原結合に関与する１つの位置を、アラニンに変異させた。ｒｃＳｓｏ７ｄ Ｅ１１．４．１の変異体をｓｆＧＦＰと融合し、細菌発現系で可溶性タンパク質として発現させた。融合タンパク質の模式的な構造を図１４Ｇに示す。（ｉ）それぞれの標的抗原ＥＧＦＲを高レベルで発現するようにｍＲＮＡエレクトロポレーションで改変されたジャーカットＴ細胞に対して、ｓｆＧＦＰを有する結合性部分である可溶性融合タンパク質の、滴定実験を行うことにより、また、（ｉｉ）ＩｇＧ－Ｆｃと融合したＥＧＦＲの細胞外ドメインをロードしたプロテインＡチップ上でＳＰＲ実験を行うことにより、結合親和性を求めた。アラニンスキャンの結果と得られた抗原結合部分の親和性を図２に示す。

【0333】

タンパク質抗原結合部分のアラニンスキャン
エピトープ結合に関与する全てのアミノ酸の部位特異的変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント・ゲノミクス社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて行った。プライマーはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア（アジレント・ゲノミクス社）を用いて設計し、オリゴヌクレオチドはバイオマース社（Ｂｉｏｍｅｒｓ）により合成された。

【0334】

ｒｃＳｓｏ７ｄベース抗原結合部分の発現及び精製
結合性スキャフォールドは、ｐＥ－ＳＵＭＯベクター（ライフ・センサーズ社（Ｌｉｆｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ））を用いて、ａｓ ｓｆＧＦＰ融合タンパク質（Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグと、それに続くｒｃＳｓｏ７ｄ又はアフィボディと、ｓｆＧＦＰとからなる）として発現された。ｓｆＧＦＰレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、アドジーン社（Ａｄｄｇｅｎｅ）（プラスミド＃５４７３７）から入手した。簡潔に説明すると、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞（Ｔｕｎｅｒ ＤＥ３）を、熱ショック形質転換を用いて、ｗｉｔｈ 配列検証済みプラスミドで形質転換させた。３７℃で一晩培養した後、培養液を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したテリフィックブロス（ＴＢ）培地（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４％グリセロール、２．３１ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、及び１６．４３ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４＊３Ｈ_２Ｏ）で１：１００希釈し、振盪しながら３７℃でインキュベートした。培養液のＡ_６００がおよそ２に達したら、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、導入遺伝子の発現を誘導し、２０℃で一晩細胞をさらに培養した。細胞を遠心分離（５０００ｇ、２０分、４℃）で回収し、超音波処理用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波処理し（２×９０秒、デューティサイクル５０％、振幅は５に設定）、再度遠心して細胞片を除去した。ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（クロンテック・ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いて、未精製細胞抽出物からヘキサヒスチジンタグ付き融合タンパク質を精製した。１０ｍＭイミダゾールを添加後、超音波処理後の上清を上記樹脂上に２回アプライし、その後、漸増量のイミダゾール（５～１５ｍＭ）を含有する平衡緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄工程を実施した。２５０ｍＭイミダゾールを添加した平衡緩衝液をアプライすることで、結合性スキャフォールドを溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １０Ｋ遠心式フィルター（メルクミリポア社（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いてＰＢＳへの緩衝液交換を行った後、それぞれのモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより濃度を求め、最後に、タンパク質を－８０℃で直接凍結した。

【0335】

ヒト細胞株の維持
ジャーカットＴ細胞は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＣＲＩ）のＳａｂｉｎｅ Ｓｔｒｅｈｌ博士から譲渡されたものであり、１０％ＦＣＳ（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を添加したＲＰＭＩ－１６４０（サーモサイエンティフィック社）中で維持した。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｏｎ）で細胞株認証を受けた。フローサイトメーターをベースとした細胞計数プラットフォームである、ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（サーモサイエンティフィック社）により、細胞密度をモニターした。

【0336】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ））を製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行った。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いた。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて、適合されたプロトコルにより精製した。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液（キアゲン社）、エタノール（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））、及び２－メルカプトエタノール（メルク社）の混合物で希釈した。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行った。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（サーモサイエンティフィック社）で行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結した。一過性の導入遺伝子発現のために、ジャーカットＴ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ））を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。以下のプロトコルを各種細胞型に用いた：ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0337】

抗体及びフローサイトメトリー
ジャーカットＴ細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ（サーモサイエンティフィック社）、０．２％ヒトアルブミン（ＣＳＬベーリング社（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ））、及び０．０２％アジ化ナトリウム）中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、そのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）を用いて、改変標的抗原ｔＥＧＦＲの発現を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0338】

細胞膜上の結合親和性の測定
ジャーカットＴ細胞を、各種腫瘍抗原を高レベルで発現するように改変した。そのため、３μｇのｔＥＧＦＲコードｍＲＮＡをジャーカットＴ細胞にエレクトロポレーションし、１日後、エフェクター細胞と共培養した。ＰＢＳで洗浄後、細胞を０．１％ＢＳＡ（シグマ・アルドリッチ社）含有ＰＢＳ中に再懸濁し、各腫瘍抗原に対しての抗原結合部分の親和性を求めるために、異なる濃度のｓｆＧＦＰ融合型バインダータンパク質と一緒にインキュベートした。振盪しながら４℃で１時間インキュベートした後、プレートを遠心し（４５０ｇ、７分間、４℃）、上清を捨て、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａにより細胞を得た。細胞はエンドサイトーシスを避けるため氷上で維持した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフト社（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いたカーブフィッティングによりＫ_ｄを得た。

【0339】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた結合親和性の測定
ＳＰＲ実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で行った。実験は全て、脱気及び濾過を行った、２５℃の、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（メルクミリポア社）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行った。ｈＥＧＦＲ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ社）を、流速１０μＬ／分で、６０秒間、濃度６．６７μｇ／ｍＬで、プロテインＡセンサーチップ（ＧＥヘルスケア社）上に固定した。ｒｃＳｓｏ７ｄをベースとした抗原結合部分の親和性を求めるため、５つの濃度（抗原結合部分の予想Ｋ_ｄに基づく）の各種タンパク質を、シングルサイクルカイネティクスモードで、流速３０μＬ／分で、１５秒間注入し、その後、解離工程（３０秒間）を行った。再生は１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を用いて流速３０μＬ／分で３０秒間行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いたカーブフィッティングによりＫ_ｄを得た。

【0340】

実施例２：細胞外ジスルフィド結合形成システインはアビディティ効果の完全利用を防止することでＣＡＲ機能の可逆的調節を行う
例えばＣＤ８αとしての、細胞外ヒンジ領域内の細胞外ジスルフィド結合形成システインは、本発明のアビディティ効果の利用を防止することができる。実施例２において、ＣＤ８αのヒンジ領域内の２つの細胞外システイン残基（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４位及びＣ１８１位）がセリン残基によって置換された、又は置換されていない、ＣＡＲシグナル伝達骨格に、実施例１の結合部分の低親和性変異体「Ｅ１１．４．１ Ｇ３２Ａ」を融合し、このことを明らかにした。システイン含有ＣＡＲバリアント（「Ｃｙｓ」）が標的細胞に応答したＴ細胞活性化を効率的に惹起するのに対して、セリン含有バリアント（「Ｓｅｒ」）は、Ｔ細胞を惹起しないか、あるいは不十分に惹起するのみであった。本実施例はすなわち、本発明のＣＡＲ群で使用するのに適したＣＡＲ分子を作製する際の、ジスルフィド結合形成を防止することの重要性を示している。図３Ａの模式図は、被験構築物の設計を例示している。図３Ｂ及び図３Ｃは、ＣＡＲ及び標的抗原の発現を示している。初代ヒトＴ細胞に、それぞれの構築物のｍＲＮＡ（５μｇ）をエレクトロポレーションで導入し、エレクトロポレーションの２０時間後にＳｔｒｅｐ ＩＩタグを介してＣＡＲ発現を検出した。ジャーカットＴ細胞に、ＥＧＦＲの切断型（ｔＥＧＦＲ）をコードするｍＲＮＡ（３μｇ）をエレクトロポレーションで導入した。完全長ＥＧＦＲをＮ末端及びＣ末端の両方で切断することで、その天然リガンドであるＥＧＦと結合することができず、キナーゼドメインが存在しないために、二量体化特性が減弱された、機能的に不活性なヒトポリペプチドを作製した（Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．、２０１１年；１１８巻（５号）：頁１２５５～１２６３）。得られた導入遺伝子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子２受容体αサブユニット（ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒａ）のリーダー配列と、２つの細胞外膜近位ドメイン及び膜貫通ドメインを含むヒトＥＧＦＲの第３３４～６７５番アミノ酸（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００５３３）と、からなる。導入遺伝子の発現を、エレクトロポレーションの２０時間後に、ＥＧＦＲに対する抗体を介して検出した。Ｔ細胞のエレクトロポレーションの２０時間後、ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイを用いることで（図３Ｄ）、また、ＥＬＩＳＡを用いて当該Ｔ細胞から放出されたサイトカインを定量化することで（図３Ｅ）、ＣＡＲの機能を測定した。図３Ｄ及び図３Ｅは、試験された親和性が最も低い抗原結合部分（「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」）が、標的細胞との二価の相互作用時のみ、すなわち、ＣＤ８αヒンジ内にシステインを含有するＣＡＲ（「Ｃｙｓ」）と融合された場合には、Ｔ細胞を惹起できるが、それらのシステインがセリンによって置換されたＣＡＲ（「Ｓｅｒ」）と融合された場合では、Ｔ細胞を惹起しないか、あるいは不十分に惹起するのみであることを示している。逆に、親和性が増加した抗原結合部分（Ｅ１１．４．１－ＷＴ及びＥ１１．４．１－Ｇ２５Ａ）は、一価の相互作用時でも、すなわち、「Ｓｅｒ」ＣＡＲ骨格と融合された場合でも、強力な細胞毒性を惹起した。

【0341】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ステムセルテクノロジーズ社（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯ（シグマ・アルドリッチ社）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（サーモサイエンティフィック社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２（ペプロテック社（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。ジャーカットＴ細胞は、ＣＣＲＩのＳａｂｉｎｅ Ｓｔｒｅｈｌ博士から譲渡されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持した。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0342】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行った。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いた。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キットを用いて、適合されたプロトコルにより精製した。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液、エタノール、及び２－メルカプトエタノールの混合物で希釈した。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行った。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結した。一過性の導入遺伝子発現のために、初代Ｔ細胞又はジャーカットＴ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社）を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。以下のプロトコルを各種細胞型に用いた：初代Ｔ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、５ｍｓ、４ｍｍキュベット）、ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0343】

抗体及びフローサイトメトリー
初代ヒトＴ細胞又は腫瘍細胞株をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム）中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現を、一次抗体としての抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ））と、ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型二次抗体（イーバイオサイエンス社（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））とを用いて、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグを介して検出した。ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）を用いて、改変標的抗原ｔＥＧＦＲの発現を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0344】

導入遺伝子コンストラクトの構築
シグナルペプチドのＣＤ３３、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ジェンスクリプト社によって合成された。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする各配列はアドジーン社から得た（プラスミド＃１１０１１）。Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）及び可動性リンカーの挿入はＰＣＲにより行った。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））を製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0345】

ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイ
ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を、ＣＡＲ Ｔ細胞と、１０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比２：１で、白色丸底９６ウェルプレート（シグマ・アルドリッチ社）内で、３７℃で４時間、フェノール不含ＲＰＭＩ（サーモサイエンティフィック社）、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ－グルタミン（サーモサイエンティフィック社）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンからなる細胞毒性アッセイ用培地中で、共培養した。最後に、共培養物の残存ルシフェラーゼ活性を求めることで、残存した生細胞を定量した。１０分間室温に戻した後、ルシフェリンを細胞懸濁液に添加し（１５０μｇ／ｍＬの終濃度；パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））、２０分後にＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。特異的溶解率を下記式で求めた。特異的溶解率＝１００－（（エフェクターと標的細胞の共培養物を含むウェルから得られたＲＬＵ）／（標的細胞のみを含むウェルから得られたＲＬＵ）×１００））。

【0346】

ＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン放出
初代ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン分泌の評価を、標的細胞と、Ｅ：Ｔ比１：１又は２：１で、平底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間又は２４時間、共培養することにより、行った。いくつかの実験で、細胞毒性を求めるための共培養実験から得られた上清中の、放出サイトカインの定量を行った。上清は、遠心（１６００ｒｐｍ、７分間、４℃）して残存した細胞とデブリを除去した後、－８０℃で凍結した。分泌ＩＦＮ－γの分析には、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（登録商標）キット（イーバイオサイエンス社）を製造業者の説明書に従って用いて、ＥＬＩＳＡを行った。測定はＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いて行った。

【0347】

実施例３：単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は細胞膜におけるＣＡＲクラスタリングを惹起することにより、アビディティ効果の利用を防いで、ＣＡＲ機能の可逆的な調節を行うことができる
第３の実施例では、ＣＡＲ分子におけるｓｃＦｖベース結合部分の組み込みが、アビディティ効果の利用を防ぎ、抗原組み合わせの特異的な認識を行うことができることを示す。図４Ａに示されたＣＡＲ構築物の模式図は、試験されたＣＡＲバリアント（４Ｄ５－５－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ、４Ｄ５－５－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ、４Ｄ５－５（ｓｐｌｉｔ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ）の設計を図示している。図示された例では、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖ ４Ｄ５－５を抗原結合部分として用い、単量体（「Ｓｅｒ」）又は二量体（「Ｃｙｓ」）のＣＡＲシグナル伝達骨格に組み込んだ。図４Ｂは、初代Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を示している。ｓｃＦｖ ４Ｄ５－５に対する効果的な結合親和性が１．１μＭと報告されており（Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１５年；７５巻（１７号）：頁３５９６～３６０７）、これはＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａの親和性と同等である。ＨＥＲ２の切断型（ｔＨＥＲ２）を発現するジャーカットＴ細胞を標的細胞株とした（図３Ｅ）。セリン含有ＣＡＲ「４Ｄ５－５－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ」によって惹起された、ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌（図３Ｆ）及び標的細胞の溶解（図３Ｇ）は、低親和性ｓｃＦｖにもかかわらず、システイン含有ＣＡＲ「４Ｄ５－５－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ」と比較して、わずかに減少しているのみであり、これは、実施例２のＣＡＲ Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ（配列番号４４））に低親和性ｒｃＳｓｏ７ｄベース抗原結合部分を用いて確認されたこと（図３）とは大きく異なる。ダイアボディ形成で確認されたように、Ｔ細胞表面のｓｃＦｖで一緒に連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは、同じ一本鎖分子内で（すなわち同じＣＡＲ分子内で）二量体化できるだけでなく、分子間連結（すなわち異なるＣＡＲ分子間の連結）を形成することもできる。これは、精製ｓｃＦｖタンパク質の場合で報告されたように、二量体化を、あるいはオリゴマー化をも媒介し（Ａｔｗｅｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１９９９年；１２巻（７号）：頁５９７～６０４）、以前に確認されたＣＡＲクラスタリング（Ｌｏｎｇら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、２０１５年；２１巻（６号）：頁５８１～５９０）の説明になる。最終的に、このｓｃＦｖの二量体化又はオリゴマー化は、単量体ＣＡＲ骨格をベースとした場合であっても、二価又は多価のＣＡＲの形成をもたらす。したがって、Ｖ_ＨとＶ_Ｌとの間のリンカーを切断することで、オリゴマー化が防がれるため、単量体ＣＡＲ骨格をベースとした低親和性ＣＡＲの活性化が防がれる。さらに、リンカーを含まないＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインが、Ｔ細胞表面上で少なくとも部分的にヘテロ二量体化し、機能的なＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌヘテロ二量体（すなわち、Ｆｖ）を形成できると仮定した。Ｆｖ間に非特異的な接着性がないならば、これらのＦｖは、低親和性（４Ｄ５－５の場合ではＫｄ１．１μＭ）であるために、（Ｖ_Ｈ保有鎖と細胞内で融合したＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖドメインを介した）２つのＦｖの制御された二量体化後のみ、Ｔ細胞活性化を惹起できるはずである。実際に、図４Ｈは、これがその通りであることを示しており、低親和性ｓｃＦｖ ４Ｄ５－５のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを２つの別々の膜アンカー分子上に分離（配列番号５６及び配列番号５７）することで示すことができた。予想の通り、これらの構築物を発現するＣＡＲ Ｔ細胞（図４Ｃ及び図４Ｄ）は、ｔＨＥＲ２陽性標的細胞によって活性化されなかった。しかし、Ｖ_Ｈ構築物がＡＰ２０１８７によってホモ二量体化した場合、上記Ｔ細胞は上記標的細胞によって活性化された（図４Ｈ）。この二量体化剤の存在下でのＴ細胞活性化により、２つの別々の構築物が実際にＴ細胞表面上で機能的なＦｖを形成することと、二量体化剤の非存在下での活性化の欠如がＦｖの一価性によるものであることが、確認された。これは、４Ｄ５－５の低親和性と、実施例２でｒｃＳｓｏ７ｄベース抗原結合部分を用いて得られた知見と、一致する。比較のため、ｓｃＦｖ型（すなわち、リンカー「２１８」によって連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ）の発現を、低発現であるのにもかかわらずＣＡＲ Ｔ細胞の強力な活性化をもたらした（図４Ｈ）、Ｖ_Ｈ構築物を用いて得られた発現レベル（図４Ｃ）に、おおよそに調整した。まとめると、図４のデータは、少なくともある特定のｓｃＦｖ型が、Ｔ細胞表面上の隣接し合う分子間でのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの分子間ヘテロ二量体化によって、部分的に二量体化（又はオリゴマー化）することを、強く示唆している。システインアミノ酸残基によって引き起こされた二量体化又はオリゴマー化（上述）と同様、少なくともある特定のｓｃＦｖバリアントによって媒介された、ＣＡＲ分子の無制御な二量体化又はオリゴマー化は、制御分子とは無関係に、ホモ二量体化又はホモオリゴマー化を引き起こし得る。したがって、本発明の、好ましい実施形態では、ＣＡＲ群のＣＡＲ分子の抗原結合部分も、上記群のＣＡＲ分子に結合している他のポリペプチドの抗原結合部分も、ｓｃＦｖではない。

【0348】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌを用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。ジャーカットＴ細胞は、ＣＣＲＩのＳａｂｉｎｅ Ｓｔｒｅｈｌ博士から譲渡されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持した。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0349】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行った。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いた。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キットを用いて、適合されたプロトコルにより精製した。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液、エタノール、及び２－メルカプトエタノールの混合物で希釈した。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行った。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結した。一過性の導入遺伝子発現のために、初代Ｔ細胞又はジャーカットＴ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社）を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。以下のプロトコルを各種細胞型に用いた：初代Ｔ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、５ｍｓ、４ｍｍキュベット）、ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0350】

抗体及びフローサイトメトリー
初代ヒトＴ細胞又は腫瘍細胞株をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム）中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現を、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社）を用いてＳｔｒｅｐ ＩＩタグを介して、又は一次抗体として抗ＦＬＡＧタグ抗体（クローンＬ５、バイオレジェンド社）を用いてＦＬＡＧタグを介して、検出し、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体の場合はＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型二次抗体を用いた。ＰＥ結合型抗ＨＥＲ２抗体（クローン２４Ｄ２、バイオレジェンド社）を用いて、改変標的抗原ｔＨＥＲ２の発現を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0351】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒａシグナルペプチド、抗ヒトＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＦＭＣ６３、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ジェンスクリプト社によって合成された。シグナルペプチドＩｇＧｋ、抗ヒトＨＥＲ２ ｓｃＦｖ ４Ｄ５－５、及び二量体形成ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモサイエンティフィック社）によって合成された。ＨＥＲ２の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする各配列はアドジーン社から得た（プラスミド＃１６２５７）。Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）又はＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）及び可動性リンカーの挿入はＰＣＲにより行った。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0352】

ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイ
ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を、ＣＡＲ Ｔ細胞と、１０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比２：１で、白色丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、フェノール不含ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンからなる細胞毒性アッセイ用培地中で、共培養した。最後に、共培養物の残存ルシフェラーゼ活性を求めることで、残存した生細胞を定量した。１０分間室温に戻した後、ルシフェリンを細胞懸濁液に添加し（１５０μｇ／ｍＬの終濃度）、２０分後にＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。特異的溶解率を下記式で求めた。特異的溶解率＝１００－（（エフェクターと標的細胞の共培養物を含むウェルから得られたＲＬＵ）／（標的細胞のみを含むウェルから得られたＲＬＵ）×１００））。

【0353】

ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ
ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ用に、２つの標的細胞集団を作製した：（ｉ）ｅＧＦＰと各標的抗原をコードするＲＮＡとをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞、及び、（ｉｉ）ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡのみをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞。これら２つの集団を１：１比で混合し、ＣＡＲ Ｔ細胞と、２０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比４：１：１で、丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞を添加しなかった標的細胞を対照条件（「標的のみ」）とした。上記インキュベーション時間の経過後、共培養物を遠心し（５分間、１６００ｒｐｍ、４℃）、上清を後のサイトカイン測定用に集め、残った細胞は、ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウムからなるＦＡＣＳ用緩衝液１００μＬ中に再懸濁した。標的抗原陽性細胞集団及び標的抗原陰性細胞集団の生存率を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて求め、特異的溶解を下記式で算出した。
特異的溶解率＝（１－（（（試料のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（試料のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％））））＊１００。

【0354】

ＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン放出
初代ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン分泌の評価を、標的細胞と、Ｅ：Ｔ比１：１又は２：１で、平底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間又は２４時間、共培養することにより、行った。いくつかの実験で、細胞毒性を求めるための共培養実験から得られた上清中の、放出サイトカインの定量を行った。上清は、遠心（１６００ｒｐｍ、７分間、４℃）して残存した細胞とデブリを除去した後、－８０℃で凍結した。分泌ＩＦＮ－γの分析には、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（登録商標）キット（イーバイオサイエンス社）を製造業者の説明書に従って用いて、ＥＬＩＳＡを行った。測定はＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いて行った。

【0355】

インビトロにおける導入遺伝子の二量体化
共培養実験に先立ち、導入遺伝子の二量体化を誘導した。初代Ｔ細胞を各細胞培地中で最終細胞濃度に希釈した。ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７（メドケムエクスプレス社（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ））を、細胞培地で希釈し、終濃度１０ｎＭで添加した。同一濃度の各溶媒対照ＤＭＳＯの添加を対照とした。導入遺伝子の二量体化が効率的に行われるように、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後インビトロ実験に用いた。

【0356】

実施例４：ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖのホモ二量体化を介してアビディティを制御することによるスイッチ可能ＣＡＲ（ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ＣＡＲ）の作製
第４の実施例では、条件的なホモ二量体化によりＣＡＲ群のアビディティを制御することによる、ＣＡＲ機能の制御が示される。この目的のために、単量体ＣＡＲ骨格に、ＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ バリアントをベースとしたホモ二量体化ドメインを組み込み（図５Ａに図示）、この骨格を、ＥＧＦＲに対して高い親和性又は低い親和性を有する結合部分と融合した（すなわち、それぞれ、Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」（配列番号４９）及びＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」（配列番号４６））。初代ヒトＴ細胞に、得られたＣＡＲ分子をコードするレンチウイルスベクターを導入した。ＣＡＲの発現をＳｔｒｅｐ ＩＩタグを介して検出し、図５Ｂに示す。機能解析のために、ＣＡＲ Ｔ細胞を、高レベルのＥＧＦＲを発現する（図５Ｃ）標的細胞株Ａ４３１－ｆＬｕｃとＥ：Ｔ比１０：１で、３７℃で４時間共培養した。標的細胞の細胞毒性を、ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイで求めた。ＣＤ１９特異的標準ＣＡＲ ＣＤ１９－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚを発現するＴ細胞「ＣＤ１９－ＢＢｚ」（配列番号５８）と、ＣＡＲを含まないＴ細胞（「ＣＡＲなし」）とを、対照条件として用いた。標的細胞との共培養に先立ち、１０ｎＭ ＡＰ２０１８７をＴ細胞に添加することで、ＣＡＲ二量体化を誘導した。溶媒対照ＤＭＳＯの添加を対照とした。図５Ｄは、低親和性結合部分Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａを有するＣＡＲ（Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号４６））の機能が、二量体化剤ＡＰ２０１８７の存在に強く依存していたが、高親和性結合部分Ｅ１１．４．１－ＷＴを有するＣＡＲ（Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号４９））の機能はそれに依存していなかったことを示している。ＣＡＲ発現を伴わないＴ細胞を用いた対照条件で分かる通り、二量体化剤はそれ自体、標的細胞の溶解に影響を及ぼさなかった。

【0357】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌを用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。Ａ４３１類表皮癌細胞は１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（サーモサイエンティフィック社）中で維持した。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0358】

Ｔ細胞及び細胞株の形質導入
パントロピックＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスのウイルス作製を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（クロンテック・ラボラトリーズ社）から、第３世代ピューロマイシンセレクション可能ｐＣＤＨ導入遺伝子ベクター（システム・バイオサイエンス社（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））と、第２世代ウイルスパッケージングプラスミドｐＭＤ２．Ｇ及びｐｓＰＡＸ２（共にアドジーン社から入手、それぞれプラスミド＃１２２５９及び＃１２２６０）とを用いて、行った。同時トランスフェクションを、Ｐｕｒｅｆｅｃｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（システム・バイオサイエンス社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて行った。上清を、トランスフェクションの１日後及び２日後に集め、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（クロンテック・ラボラトリーズ社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて濃縮した。
レンチウイルスによる形質導入の２４時間前に、抗ＣＤ３／２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて、初代Ｔ細胞を活性化した。細胞培養プレートを、製造業者の取扱説明書に従ってＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（クロンテック・ラボラトリーズ社）でコートし、レンチウイルスと初代Ｔ細胞の共存を促進した。細胞を濃縮レンチウイルス上清に１日間暴露し、その後ウイルス粒子を除去した。３日後、導入遺伝子が高レベル且つ均一に発現されるように、Ｔ細胞を１μｇ／ｍＬピューロマイシン（シグマ・アルドリッチ社）で処理した。Ｔ細胞を、２％Ｏｃｔａｐｌａｓ（オクタファルマ社）、１％Ｌ－グルタミン、２．５％ＨＥＰＥＳ（サーモサイエンティフィック社）、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加したＡＩＭ－Ｖ（ライフテクノロジーズ社）からなるＴ細胞形質導入用培地中で増殖させた。
形質導入の時点で指数関数的な細胞成長が行われるように、レンチウイルスによる形質導入の２４時間前に、細胞株を分割した。細胞を異なる濃度のレンチウイルス上清に１日間暴露した。形質導入の３日後、１～８μｇ／ｍＬの範囲の濃度のピューロマイシンによるセレクションを行い、非形質導入細胞を排除した。

【0359】

抗体及びフローサイトメトリー
初代ヒトＴ細胞又は腫瘍細胞株をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム 中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現の、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグを介した検出を、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社）、又はＣＤ１９－ＢＢｚ ＣＡＲの場合はプロテインＬを一次抗体として用い、さらに、ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の二次抗体を用いて、行った。ＥＧＦＲ発現を、ＰＥ結合型抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）で検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0360】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＣＤ３３シグナルペプチド、低親和性ｒｃＳｓｏ７ｄバリアントＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）、可動性Ｇ_４Ｓリンカー、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、二量体形成ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモサイエンティフィック社）によって合成された。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0361】

ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイ
ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を、ＣＡＲ Ｔ細胞と、１０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比２：１で、白色丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、フェノール不含ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンからなる細胞毒性アッセイ用培地中で、共培養した。最後に、共培養物の残存ルシフェラーゼ活性を求めることで、残存した生細胞を定量した。１０分間室温に戻した後、ルシフェリンを細胞懸濁液に添加し（１５０μｇ／ｍＬの終濃度）、２０分後にＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。特異的溶解率を下記式で求めた。
特異的溶解率＝１００－（（エフェクターと標的細胞の共培養物を含むウェルから得られたＲＬＵ）／（標的細胞のみを含むウェルから得られたＲＬＵ）×１００））。

【0362】

インビトロにおける導入遺伝子の二量体化
共培養実験に先立ち、導入遺伝子の二量体化を誘導した。初代Ｔ細胞を各細胞培地中で最終細胞濃度に希釈した。ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７を、細胞培地で希釈し、終濃度１０ｎＭで添加した。同一濃度の各溶媒対照ＤＭＳＯの添加を対照とした。導入遺伝子の二量体化が効率的に行われるように、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後インビトロ実験に用いた。

【0363】

実施例５：薬剤投与でアビディティを制御可能なＣＡＲ群を発現する安定的に遺伝子導入されたＴ細胞による腫瘍担持マウスの処置
実施例５では、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１ＷＪＩ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの白血病モデルにおいて、制御分子の存在下では、低親和性ＣＡＲ「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ」（配列番号４６）を発現する、レンチウイルス導入を受けたＴ細胞によって、腫瘍成長を効率的に阻害できるが、制御分子の非存在下では阻害できないことが示される。
上記インビボモデルのために、高発現のｔＥＧＦＲ（約１×１０^６ ｔＥＧＦＲ分子／細胞）及び生物発光イメージングの使用による腫瘍成長のインビボ定量化用のホタルルシフェラーゼのためのベクターを導入された、Ｂ－ＡＬＬ細胞株Ｎａｌｍ６が使用された。０．５×１０^６個のＮａｌｍ６－ｔＥＧＦＲ－ｆＬｕｃ細胞をＮＳＧマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した場合、無処置マウスでは指数関数的な腫瘍成長が生じた。しかし、図６Ａは、腫瘍細胞注射の３日後に、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ ＣＤ１９－８ｃｙｓ－ＢＢ－３ｚ（配列番号５８）又は高親和性抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ「Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ」（配列番号４９）を発現する１０×１０^６個のＴ細胞を静脈内注射した場合に、ＮＳＧマウスにおけるこの細胞株の増殖が効率的に阻害されたことを示している。重要なこととして、低親和性ＥＧＦＲ－ＣＡＲ「Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ」（配列番号４６）を有するＴ細胞も、ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７（すなわち、制御分子）を定期的に投与した場合に限り、白血病増殖を阻害したが（図６Ａ）、このことは、ＣＡＲ Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚが、二量体状態（すなわち、複合型ＣＡＲ群＝ＯＮ状態）でのみ充分な活性を有することを示している。二量体化剤の非存在下（すなわち、非複合型ＣＡＲ＝ＯＦＦ状態）では、中程度の増殖阻害（図６Ａ）しか確認されなかった。Ｔ細胞注射の１１日後、この後者のマウス群に二量体化剤（すなわち、制御分子）を投与した場合、ＣＡＲ分子の複合体化が引き起こされることで、２匹のマウスに担持された腫瘍が強く減少し、他の３匹のマウスでは中程度中程度の阻害が生じる結果となった（図６Ｂ）。まとめると、これらのインビボ実験は、インビトロでのデータを確認するものであり、低親和性抗原結合部分を有するＣＡＲ分子を発現する細胞は、当該ＣＡＲ分子が複合体化（すなわちアセンブル）してＣＡＲ群となり、アビディティを得てはじめて、効率的に惹起されることを示している。
ＣＡＲの発現は、ｒｃＳｓｏ７ｄベースＣＡＲの場合では抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体を用いて検出し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの場合ではプロテインＬを用いて検出した（それぞれ、図７Ａ及び図７Ｂ）。インビトロにおける機能特性評価のため、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＥＧＦＲを発現しないＮａｌｍ６細胞（「Ｎａｌｍ６－ｆＬｕｃ」）又は高レベルのＥＧＦＲを発現するＮａｌｍ６細胞（「Ｎａｌｍ６－ｔＥＧＦＲ－ｆＬｕｃ」）（図７Ｅ及び図７Ｆ）と、３７℃で４時間、Ｅ：Ｔ比１０：１で、共培養した。標的細胞との共培養に先立ち、１０ｎＭ ＡＰ２０１８７をＴ細胞に添加することで、ＣＡＲホモ二量体化を誘導した。溶媒対照ＤＭＳＯの添加を対照とした。図７Ｃ及び図７Ｄは、それぞれＮａｌｍ６－ｆＬｕｃ細胞又はＮａｌｍ６－ＥＧＦＲ－ｆＬｕｃ細胞と共培養されたＣＡＲ Ｔ細胞の、細胞溶解能を示している。

【0364】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌを用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0365】

Ｔ細胞及び細胞株の形質導入
パントロピックＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスのウイルス作製を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞から、第３世代ピューロマイシンセレクション可能ｐＣＤＨ導入遺伝子ベクター）と、第２世代ウイルスパッケージングプラスミドｐＭＤ２．Ｇ及びｐｓＰＡＸ２（共にアドジーン社から入手、それぞれプラスミド＃１２２５９及び＃１２２６０）とを用いて、行った。同時トランスフェクションを、Ｐｕｒｅｆｅｃｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて行った。上清を、トランスフェクションの１日後及び２日後に集め、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを製造業者の取扱説明書に従って用いて濃縮した。
レンチウイルスによる形質導入の２４時間前に、抗ＣＤ３／２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて、初代Ｔ細胞を活性化した。細胞培養プレートを、製造業者の取扱説明書に従ってＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコートし、レンチウイルスと初代Ｔ細胞の共存を促進した。細胞を濃縮レンチウイルス上清に１日間暴露し、その後ウイルス粒子を除去した。３日後、導入遺伝子が高レベル且つ均一に発現されるように、Ｔ細胞を１μｇ／ｍＬピューロマイシンで処理した。Ｔ細胞を、２％Ｏｃｔａｐｌａｓ、１％Ｌ－グルタミン、２．５％ＨＥＰＥＳ、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加したＡＩＭ－ＶからなるＴ細胞形質導入用培地中で増殖させた。
形質導入の時点で指数関数的な細胞成長が行われるように、レンチウイルスによる形質導入の２４時間前に、細胞株を分割した。細胞を異なる濃度のレンチウイルス上清に１日間暴露した。形質導入の３日後、非形質導入細胞を排除するために、１～８μｇ／ｍＬの範囲の濃度のピューロマイシンによるセレクションを行った。

【0366】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＣＤ３３シグナルペプチド、低親和性ｒｃＳｓｏ７ｄバリアントＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）、可動性Ｇ_４Ｓリンカー、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、二量体形成ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモサイエンティフィック社）によって合成された。ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒａシグナルペプチド及び抗ヒトＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＦＭＣ６３をコードする各ヌクレオチド配列は、ジェンスクリプト社によって合成された。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列はアドジーン社から得た（プラスミド＃１１０１１）。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0367】

抗体及びフローサイトメトリー
初代ヒトＴ細胞又は腫瘍細胞株をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム 中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現の、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグを介した検出を、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社）、又はＣＤ１９－ＢＢｚ ＣＡＲの場合はプロテインＬを一次抗体として用い、さらに、ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の二次抗体を用いて、行った。ＥＧＦＲ発現を、ＰＥ結合型抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）で検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0368】

ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイ
ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を、ＣＡＲ Ｔ細胞と、１０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比２：１で、白色丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、フェノール不含ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンからなる細胞毒性アッセイ用培地中で、共培養した。最後に、共培養物の残存ルシフェラーゼ活性を求めることで、残存した生細胞を定量した。１０分間室温に戻した後、ルシフェリンを細胞懸濁液に添加し（１５０μｇ／ｍＬの終濃度）、２０分後にＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。特異的溶解率を下記式で算出した。
特異的溶解率＝１００－（（エフェクターと標的細胞の共培養物を含むウェルから得られたＲＬＵ）／（標的細胞のみを含むウェルから得られたＲＬＵ）×１００））。

【0369】

インビトロにおける導入遺伝子の二量体化
共培養実験に先立ち、導入遺伝子の二量体化を誘導した。初代Ｔ細胞を各細胞培地中で最終細胞濃度に希釈した。ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７を、細胞培地で希釈し、終濃度１０ｎＭで添加した。同一濃度の各溶媒対照ＤＭＳＯの添加を対照とした。導入遺伝子の二量体化が効率的に行われるように、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後インビトロ実験に用いた。

【0370】

インビボにおける標的細胞死滅
ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１ＷＪＩ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスはアンナ・シュピーゲル（Ａｎｎａ Ｓｐｉｅｇｅｌ）動物育種施設で飼育された。後の実験のために、マウスをウィーン医科大学の前臨床研究所（ＰＩＬ）に移した。全ての手順はウィーン市５８課サービスセンター（Ｍａｇｉｓｔｒａｔｓａｂｔｅｉｌｕｎｇ ５８， Ｖｉｅｎｎａ）に承認された通りに実施した（ＧＺ： ８１３２６７／２０１５／２４）。
初代Ｔ細胞を、「Ｔ細胞及び細胞株の形質導入」に示されたプロトコルを用いて、ＣＤ１９特異的対照ＣＡＲ（ＣＤ１９－ＢＢｚ）、ＥＧＦＲ特異的高親和性ＣＡＲ及びＥＧＦＲ特異的低親和性ＣＡＲ（それぞれ「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」及び「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」）を発現するように改変した。形質導入後、ＣＡＲ Ｔ細胞をインビボ実験前に１４日間を超えて増殖させ、充分な細胞数を得た。
ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７（クロンテック・ラボラトリーズ社）を、製造業者の取扱説明書に従って、溶媒液中に溶解させた。簡潔には、ＡＰ２０１８７をまず、エタノール中に１２．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、激しくボルテックスしながら溶解させた。次に、この化合物を、ＰＥＧ－４００（シグマ・アルドリッチ社）及びＴｗｅｅｎ－８０（シグマ・アルドリッチ社）の適切な混合物水溶液を用いて、最終作用濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。得られた溶媒液は、注射用水中の４％エタノール、１０％ＰＥＧ－４００、及び１．７％Ｔｗｅｅｎ－８０からなるものであった。ＡＰ２０１８７の作業用ストックは、注射の直前に調製し、滅菌濾過し、３０分以内に使用した。
ｔＥＧＦＲ－ＦＫＢＰ及びｆＬｕｃを高レベルに発現するよう改変されたＮａｌｍ６細胞（「Ｎａｌｍ６－ｔＥＧＦＲ－ｆＬｕｃ」）を、ＰＢＳ中に再懸濁し、３５μｍセルストレーナー（コーニング社製Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過し、５×１０^６／ｍＬの終濃度に設定した。０．５×１０^６個の細胞を、各ＮＳＧマウス（雄及び雌のマウス；ウィーン医科大学、生物医学研究科）の尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。３日後、マウスを各種ＣＡＲ Ｔ細胞で処置（１０×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈に静脈内注射）し、その後、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を用いてホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７（２ｍｇ／ｋｇの用量）又は溶媒対照を注射した。二量体化剤ＡＰ２０１８７（２ｍｇ／ｋｇ）又は溶媒対照は、指定の０日目（Ｔ細胞注射直後）、１日目、２日目、４日目、７日目、９日目、及び１１日目に投与した。全ての対照条件は、各種溶媒対照（注射用水中の４％エタノール、１０％ＰＥＧ－４００、及び１．７％Ｔｗｅｅｎ－８０）を用いて処置した。腫瘍の成長及びコントロールを、生物発光イメージング（ＢＬＩ）でモニターした。実験の最後にマウスを頸椎脱臼で屠殺した。

【0371】

生物発光イメージング（ＢＬＩ）
腫瘍成長のＢＬＩイメージングを、ウィーン医科大学の前臨床研究所（ＰＩＬ）で、Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー社）を用いて行った。Ｄ－ルシフェリン基質（パーキンエルマー社）を、終濃度が１５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ中に溶解させ、滅菌濾過した。マウスをイソフルランで麻酔し、ルシフェリン作業用ストック（最終用量１５０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した。１５～２０分後、１～３匹のマウスをＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍに移し、生物発光を、中ビニングモードで、１秒～２分の撮像時間で測定し、不飽和画像を得た。ルシフェラーゼ活性をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （キャリパー社（Ｃａｌｉｐｅｒ））で解析し、マウスの全身を含む関心領域内の光子束を測定した。

【0372】

実施例６：標的抗原が単量体か二量体かに依存した、ＣＡＲ分子のヘテロ二量体化によるＣＡＲアビディティの制御、及びＣＡＲ Ｔ細胞の感受性
実施例６では、ＣＡＲ分子のアビディティをヘテロ二量体化により制御した。さらに、本実施例では、制御分子の存在下又は非存在下における、高親和性結合部分「Ｅ１１．４．１－ＷＴ」を含むＣＡＲ群（Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ＋Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＦＲＢ－３ｚ）を発現するＴ細胞と比較した、低親和性結合部分「Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ」を含むＣＡＲ群（Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ＋Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ）を発現するＴ細胞の感受性、及び、標的抗原が単量体となるか結合型となるかに対する影響、が示される。
標的細胞（ジャーカットＴ細胞）に、ｔＥＧＦＲをコードする異なる量のｍＲＮＡ（０．０２μｇ～１０μｇ）をエレクトロポレーションで導入したところ、数百分子／細胞から約３００，０００分子／細胞の範囲のｔＥＧＦＲの発現レベルが得られた。ジャーカットＴ細胞におけるｔＥＧＦＲの発現（ＭＦＩ及び分子／細胞）を図８Ａ～図８Ｃに示す。二量体形成ドメイン間のクロストークを最小限にするため、オルソゴナルな二量体化系を標的細胞及びエフェクター細胞に用いた。この目的のため、低親和性抗原結合部分Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ及び高親和性抗原結合部分Ｅ１１．４．１－ＷＴを、それぞれヘテロ二量体形成ドメインＦＫＢＰ又はＦＲＢを含む、単量体ＣＡＲ骨格８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ及び８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚに導入し（Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａの場合はＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ＋Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ、Ｅ１１．４．１－ＷＴの場合はＳ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ＋Ｓ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚ）、得られたＣＡＲ分子のラパログＡＰ２１９６７による条件的ヘテロ二量体化を行った（図８Ｆに図示）。初代ヒトＴ細胞に、各構築物のｍＲＮＡ（５μｇ）をエレクトロポレーションで導入し、エレクトロポレーションの２０時間後に、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ及びＦＬＡＧタグを用いて発現を検出した（図８Ｄ及び図８Ｅ）。図８Ｇ及び図８Ｈは、ＡＰ２１９６７（ＣＡＲのヘテロ二量体化の場合）及びＡＰ２０１８７（ｔＥＧＦＲのホモ二量体化の場合）の存在下又は非存在下における、ジャーカットＴ細胞の表面上に存在する抗原分子数に依存した、低親和性結合ドメインを有するＣＡＲを発現するＴ細胞及び高親和性結合ドメインを有するＣＡＲを発現するＴ細胞の、細胞毒性を惹起する能力及びサイトカインを分泌する能力を示している。高親和性ＣＡＲ分子であるＳ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ及びＳ（ＷＴ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚを含むＣＡＲ群は、抗原又はＣＡＲ群の二量体化とは無関係に、低抗原用量で、効率的なエフェクター機能を惹起した。低親和性ＣＡＲ分子であるＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＫＢＰ－３ｚ及びＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＢＢ－ＦＲＢ－３ｚを含むＣＡＲ群は、制御分子ＡＰ２１９６７の存在に大きく依存し、ＡＰ２１９６７の非存在下では、高抗原用量であっても、エフェクター機能を惹起しないか、不十分に惹起するのみであった。Ｔ細胞による強力な細胞溶解機能及びサイトカイン分泌は、ＣＡＲ分子及び抗原分子の両方が二量体化した場合にのみ確認された。

【0373】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌを用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。ジャーカットＴ細胞は、ＣＣＲＩのＳａｂｉｎｅ Ｓｔｒｅｈｌ博士から譲渡されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持した。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0374】

抗体及びフローサイトメトリー
初代ヒトＴ細胞又は腫瘍細胞株をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現を、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社）を用いてＳｔｒｅｐ ＩＩタグを介して、又は一次抗体として抗ＦＬＡＧタグ抗体（クローンＬ５、バイオレジェンド社）を用いてＦＬＡＧタグを介して、検出し、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体の場合はＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型二次抗体を用いた。ＥＧＦＲの発現を、ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）で検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0375】

導入遺伝子表面密度の測定
ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベクトン・ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を製造業者の取扱説明書に従って用いて、各種Ｔ細胞の表面上のｔＥＧＦＲ及び各種ＣＡＲの分子数を定量化した。「抗体及びフローサイトメトリー」に記載のプロトコルを用いて、導入遺伝子発現細胞及び非トランスフェクト対照細胞を飽和濃度の各種ＰＥ標識抗体で染色した。蛍光強度の幾何平均を求め、対照細胞を用いた非特異的結合に対して補正し、細胞当たりの結合抗体数（ＡＢＣ）の推定に用いた。

【0376】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＣＤ３３シグナルペプチド、低親和性ｒｃＳｓｏ７ｄバリアントＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）、可動性Ｇ_４Ｓリンカー、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、二量体形成ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ及びＦＲＢ、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモサイエンティフィック社）によって合成された。二量体形成ドメインＦＫＢＰをコードするヌクレオチド配列はジェンスクリプト社によって合成された。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする配列はアドジーン社から得た（プラスミド＃１１０１１）。可動性リンカーの挿入はＰＣＲで実行した。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0377】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行った。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いた。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キットを用いて、適合されたプロトコルにより精製した。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液、エタノール（メルク社）、及び２－メルカプトエタノールの混合物で希釈した。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行った。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結した。一過性の導入遺伝子発現のために、初代Ｔ細胞又はジャーカットＴ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社）を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。以下のプロトコルを各種細胞型に用いた：初代Ｔ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、５ｍｓ、４ｍｍキュベット）、ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0378】

ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ
ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ用に、２つの標的細胞集団を作製した：（ｉ）ｅＧＦＰと各標的抗原をコードするＲＮＡとをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞、及び、（ｉｉ）ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡのみをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞。これら２つの集団を１：１比で混合し、ＣＡＲ Ｔ細胞と、２０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比４：１：１で、丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞を添加しなかった標的細胞を対照条件（「標的のみ」）とした。上記インキュベーション時間の経過後、共培養物を遠心し（５分間、１６００ｒｐｍ、４℃）、上清を後のサイトカイン測定用に集め、残った細胞は、ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウムからなるＦＡＣＳ用緩衝液１００μＬ中に再懸濁した。標的抗原陽性細胞集団及び標的抗原陰性細胞集団の生存率を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて求め、特異的溶解を下記式で算出した
。特異的溶解率＝（１－（（（試料のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（試料のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％））））＊１００。

【0379】

ＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン放出
初代ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン分泌の評価を、標的細胞と、Ｅ：Ｔ比１：１又は２：１で、平底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間又は２４時間、共培養することにより、行った。いくつかの実験で、細胞毒性を求めるための共培養実験から得られた上清中の、放出サイトカインの定量を行った。上清は、遠心（１６００ｒｐｍ、７分間、４℃）して残存した細胞とデブリを除去した後、－８０℃で凍結した。分泌ＩＦＮ－γの分析には、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（登録商標）キット（イーバイオサイエンス社）を製造業者の説明書に従って用いて、ＥＬＩＳＡを行った。測定はＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いて行った。

【0380】

インビトロにおける導入遺伝子の二量体化
共培養実験に先立ち、導入遺伝子の二量体化を誘導した。初代Ｔ細胞及びジャーカットＴ細胞を各細胞培地中で最終細胞濃度に希釈した。ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７及びヘテロ二量体化剤ＡＰ２１９６７（クロンテック・ラボラトリーズ社）を細胞培地中で希釈し、それぞれ１０ｎＭ及び５００ｎＭの終濃度で添加した。それぞれ同濃度の溶媒対照ＤＭＳＯ及びエタノールの添加を対照とした。導入遺伝子の二量体化が効率的に行われるように、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後インビトロ実験に用いた。

【0381】

実施例７：ＶＥＧＦによるＣＡＲ群のアビディティの制御
第７の実施例では、細胞外可溶性因子と複合体化可能なＣＡＲ群を作製するための戦略が示され、当該細胞外可溶性因子はこの場合本発明における制御分子としての役割を果たした。示された例では、ＶＥＧＦを、ＣＡＲ Ｓ（Ｇ３２Ａ）－Ｊ．ＣＴ６－８ｓｅｒ－ＢＢ－３ｚ（配列番号６４及び配列番号６５）のホモ二量体化のための二量体化剤（すなわち制御分子）候補として用いた。この目的のため、改変されたＣＨ２－ＣＨ３－ＩｇＧ１－Ｆｃドメインを、ＣＡＲ分子のエクトドメインに組み入れ（配列番号６５）、ＣＨ２－ＣＨ３－Ｆｃドメイン「ヤヌスＣＴ６」を含む可溶性構築物（配列番号６４）と共発現させ、これは、ＶＥＧＦに対し高親和性結合を示すように改変されたものであり（Ｌｏｂｎｅｒら、ＭＡｂｓ．、２０１７年；９巻（７号）：頁１０８８～１１０４）、ＣＡＲ分子のエクトドメイン内のＣＨ２－ＣＨ３－Ｆｃドメインとのジスルフィド架橋の形成を介して共有結合的にヘテロ二量体化する。両構築物のＣＨ２－ＣＨ３ドメインには、ホモ二量体化を最小限にするための改変を行った（Ｌｏｂｎｅｒら、ＭＡｂｓ．、２０１７年；９巻（７号）：頁１０８８～１１０４）。所与の実施例では、Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａを、その協同的結合への依存性から、抗原結合部分として用いられた。図９Ａは、上記２つの構築物（配列番号６４及び配列番号６５）を含むＶＥＧＦ依存的ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲを表す模式図を示しており、図９Ｂは、ＶＥＧＦ添加の効果を示している。ジャーカットＴ細胞に、ｔＥＧＦＲのｍＲＮＡ（５μｇ）をエレクトロポレーションで導入し、エレクトロポレーションの２０時間後に発現を検出した（図９Ｃ）。初代ヒトＴ細胞に、各構築物のｍＲＮＡ（５μｇ）をエレクトロポレーションで導入した。このＴ細胞は、この後、ヤヌス－ＣＴ６－Ｆｃドメインと融合された、且つ膜貫通ドメインを含有しない、低親和性Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａ結合部分を含む構築物（配列番号６４）と結合した、単量体第２世代ＣＡＲシグナル伝達骨格（配列番号６５）を含む、ＣＡＲ分子を発現した。２つの構築物を発現する（図９Ｄ）ＣＡＲ Ｔ細胞を、異なる量のＶＥＧＦで処理し、高レベルのｔＥＧＦＲを発現する（図９Ｃ）ジャーカットＴ細胞と共培養した。図９Ｅは、ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイを用いることで測定された、細胞毒性を惹起する能力を示している。図９Ｅは、ＣＡＲ群が、ＶＥＧＦ（すなわち制御分子）依存的に、標的細胞に対するＴ細胞毒性を惹起したことを示している。このことは、ＶＥＧＦなどの細胞外可溶性因子を制御分子とすることで、本発明におけるＣＡＲ群の複合体化を促進できることを示している。

【0382】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌを用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ（シグマ・アルドリッチ社）及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。ジャーカットＴ細胞は、ＣＣＲＩのＳａｂｉｎｅ Ｓｔｒｅｈｌ博士から譲渡されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持した。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0383】

抗体及びフローサイトメトリー
初代ヒトＴ細胞又は腫瘍細胞株をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現を、一次抗体として、抗ＳｔｒｅｐＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社）を用いてＳｔｒｅｐ ＩＩタグを介して、又はビオチン化抗ヒトＩｇＧ１抗体（クローンＪＤＣ－１０、ビゾール社（Ｂｉｏｚｏｌ））を用いてＦｃドメインを介して、さらに、二次染色試薬としてＰＥ結合型ストレプトアビジンを用いて、検出した。ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）を用いて、改変標的抗原ｔＥＧＦＲの発現を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0384】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＣＤ３３シグナルペプチド、低親和性ｒｃＳｓｏ７ｄバリアントＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）、可動性Ｇ_４Ｓリンカー、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモサイエンティフィック社）によって合成された。ＣＨ２－ＣＨ３－Ｆｃドメイン「ヤヌスＣＴ６」を含むプラスミド及び変異型「ＷＴ」ＣＨ２－ＣＨ３－Ｆｃドメインを含むプラスミドは、ウィーン天然資源生命科学大学のＥｌｉｓａｂｅｔｈ Ｌｏｂｎｅｒ氏の好意により提供を受けた。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする各配列はアドジーン社から得た（プラスミド＃１１０１１）。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0385】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行った。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いた。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キットを用いて、適合されたプロトコルにより精製した。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液、エタノール、及び２－メルカプトエタノールの混合物で希釈した。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行った。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結した。一過性の導入遺伝子発現のために、初代Ｔ細胞又はジャーカットＴ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社）を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。以下のプロトコルを各種細胞型に用いた：初代Ｔ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、５ｍｓ、４ｍｍキュベット）、ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0386】

ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ
ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ用に、２つの標的細胞集団を作製した：（ｉ）ｅＧＦＰと各標的抗原をコードするＲＮＡとをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞、及び、（ｉｉ）ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡのみをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞。これら２つの集団を１：１比で混合し、ＣＡＲ Ｔ細胞と、２０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比４：１：１で、丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞を添加しなかった標的細胞を対照条件（「標的のみ」）とした。上記インキュベーション時間の経過後、共培養物を遠心し（５分間、１６００ｒｐｍ、４℃）、上清を後のサイトカイン測定用に集め、残った細胞は、ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウムからなるＦＡＣＳ用緩衝液１００μＬ中に再懸濁した。標的抗原陽性細胞集団及び標的抗原陰性細胞集団の生存率を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて求め、特異的溶解を下記式で算出した。
特異的溶解率＝（１－（（（試料のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（試料のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％））））＊１００。

【0387】

ＶＥＧＦの組み換え発現及び精製
ヒトＶＥＧＦ（第１４～１０８番残基）の切断型の組み換え発現は、以前に（Ｌｏｂｎｅｒら、ＭＡｂｓ．、２０１７年；９巻（７号）：頁１０８８～１１０４）に記述された。

【0388】

実施例８：ＨＥＲ２に対するアフィボディベースのＣＡＲ群の作製
第８の実施例では、本発明におけるＣＡＲ群での使用に好適な、ＨＥＲ２に対するアフィボディベースの結合部分の作製及び特定を行った。再び、ヒトＨＥＲ２に対する高親和性結合するよう改変された、十分に特徴付けされた現存の抗原結合部分から始めた（Ｗｉｋｍａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．、２００４年；１７巻（５号）：頁４５５～４６２）。潜在的なＮ型糖鎖修飾部位を除去し、ＩｇＧ結合を減少させるため、２つの点変異（Ｎ２３Ａ及びＳ３３Ｋ）を結合性スキャフォールドのフレームワーク領域に導入し（Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１０年；３９８巻（２号）：頁２３２～４７）、抗原結合部分「ｚＨＥＲ２－ＷＴ」を得た。抗原結合に関与する全てのアミノ酸を順次アラニンに変異させ、それぞれ１つのアラニン変異を含む各種変異体を得ることにより、「ｚＨＥＲ２－ＷＴ」のアラニンスキャニングを行って、低親和性変異体を作製した。適切な抗原結合部分の選別のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で１３種の変異体を発現させ、それらの親和性を測定する代わりに、全ての変異体を、条件的にホモ二量体化可能なＣＡＲ骨格（配列番号５２におけるバインダーｚＨＥＲ２－ＷＴ（ＷＴ）で例示）に直接組み込むことで機能スクリーニングを行った（図１０Ａ）。このようにして、各種ＣＡＲを発現するＴ細胞を、ｔＨＥＲ２をコードするｍＲＮＡ（５μｇ）をエレクトロポレーションで導入されたジャーカットＴ細胞との共培養において、ホモ二量体化剤の存在下及び非存在下での活性化について、直接的にスクリーニングすることができた。図１０Ｂは、ジャーカット細胞におけるｔＨＥＲ２の発現を示している。初代ヒトＴ細胞に、各ＣＡＲ構築物のｍＲＮＡ（５μｇ）をエレクトロポレーションで導入し、エレクトロポレーションの２０時間後に、ヘキサヒスチジンタグを介して発現を検出した（図１０Ｃ）。１３種の各種アフィボディベースＣＡＲの発現は全て同等であった（図１０Ｄ）。構築物を発現しない初代Ｔ細胞を陰性対照として用いた（「ＣＡＲなし」）。機能性スクリーニングのために、ジャーカットＴ細胞と共培養との共培養に先立ち、ＣＡＲ Ｔ細胞を１０ｎＭのＡＰ２０１８７で３７℃で３０分間処理することで、ＣＡＲ分子の二量体化を誘導した。溶媒対照ＤＭＳＯの添加を対照とした。Ｅ：Ｔ比２：１で３７℃で４時間共培養した後、ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイを行うことで、細胞毒性を惹起するＣＡＲの能力を測定した。１０ｎＭ ＡＰ２０１８７の存在下又は非存在下でＴ細胞において細胞毒性を惹起する各種ＣＡＲの能力を図１０Ｅに示す。高親和性アフィボディｚＨＥＲ２－ＷＴは、ＡＰ２０１８７の存在とは無関係に、効率的な標的細胞溶解を惹起した。同様に、変異体Ｑ１１Ａ、Ｑ１７Ａ、Ｗ２４Ａ、Ｔ２５Ａ、Ｓ２７Ａ、及びＲ２８Ａを含むＣＡＲは、二量体化剤の存在に大きな依存性を示さなかった。Ｙ１３Ａ置換及びＷ１４Ａ置換を含むアフィボディ抗原結合部分を含むＣＡＲによっては細胞毒性は惹起されなかったが、Ｙ３５Ａは低レベルの細胞毒性を惹起した。二量体化誘導性の活性化が、Ｌ９Ａ変異体、Ｒ１０Ａ変異体、及びＲ３２Ａ変異体を用いた場合に確認され、したがって、これらは、本発明におけるＣＡＲ分子への組み込みに適した結合部分である。

【0389】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ステムセルテクノロジーズ社（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。ジャーカットＴ細胞は、ＣＣＲＩのＳａｂｉｎｅ Ｓｔｒｅｈｌ博士から譲渡されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持した。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0390】

抗体及びフローサイトメトリー
初代ヒトＴ細胞又は腫瘍細胞株をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現を、ＡＦ６４７結合型抗ペンタヒスチジンタグ抗体（キアゲン社）を用いてヘキサヒスチジンタグを介して検出した。ＰＥ結合型抗ＨＥＲ２抗体（クローン２４Ｄ２、バイオレジェンド社）を用いて、改変標的抗原ｔＨＥＲ２の発現を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0391】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行った。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いた。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キットを用いて、適合されたプロトコルにより精製した。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液、エタノール、及び２－メルカプトエタノールの混合物で希釈した。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行った。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結した。一過性の導入遺伝子発現のために、初代Ｔ細胞又はジャーカットＴ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社）を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。以下のプロトコルを各種細胞型に用いた：初代Ｔ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、５ｍｓ、４ｍｍキュベット）、ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0392】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＣＤ３３シグナルペプチド、アフィボディｚＨＥＲ２－ＷＴ、ヘキサヒスチジンタグ、可動性Ｇ_４Ｓリンカー、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、二量体形成ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成された。ＨＥＲ２の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする各配列はアドジーン社から得た（プラスミド＃１６２５７）。可動性リンカーの挿入はＰＣＲで実行した。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0393】

タンパク質抗原結合部分のアラニンスキャン
エピトープ結合に関与する全てのアミノ酸の部位特異的変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて行った。プライマーはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア（アジレント・ゲノミクス社）を用いて設計し、オリゴヌクレオチドはバイオマース社により合成された。

【0394】

ルシフェラーゼをベースとした細胞毒性アッセイ
ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を、ＣＡＲ Ｔ細胞と、１０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比２：１で、白色丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、フェノール不含ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンからなる細胞毒性アッセイ用培地中で、共培養した。最後に、共培養物の残存ルシフェラーゼ活性を求めることで、残存した生細胞を定量した。１０分間室温に戻した後、ルシフェリンを細胞懸濁液に添加し（１５０μｇ／ｍＬの終濃度）、２０分後にＥＮＳＰＩＲＥマルチモードプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。特異的溶解率を下記式で算出した。
特異的溶解率＝１００－（（エフェクターと標的細胞の共培養物を含むウェルから得られたＲＬＵ）／（標的細胞のみを含むウェルから得られたＲＬＵ）×１００））。

【0395】

インビトロにおける導入遺伝子の二量体化
共培養実験に先立ち、導入遺伝子の二量体化を誘導した。初代Ｔ細胞を各細胞培地中で最終細胞濃度に希釈した。ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７を、細胞培地で希釈し、終濃度１０ｎＭで添加した。同一濃度の溶媒対照ＤＭＳＯの添加を対照とした。導入遺伝子の二量体化が効率的に行われるように、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後インビトロ実験に用いた。

【0396】

アフィボディベースの抗原結合部分の発現及び精製
結合性スキャフォールドは、ｐＥ－ＳＵＭＯベクターを用いて、ａｓ ｓｆＧＦＰ融合タンパク質（Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグと、それに続くｒｃＳｓｏ７ｄ又はアフィボディと、ｓｆＧＦＰとからなる）として発現された。融合タンパク質の模式的な構造を図１４Ｇに示す。アフィボディベースのバインダーｚＨＥＲ２の種々の変異体を、図１４Ｇに示されるものと同様に、ｓｆＧＦＰと融合した。ｓｆＧＦＰレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、アドジーン社（プラスミド＃５４７３７）から入手した。簡潔に説明すると、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞（Ｔｕｎｅｒ ＤＥ３）を、熱ショック形質転換を用いて、ｗｉｔｈ配列検証済みプラスミドで形質転換させた。３７℃で一晩培養した後、培養液を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＴＢ培地（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４％グリセロール、２．３１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、及び１６．４３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４＊３Ｈ２Ｏ）で１：１００希釈し、振盪しながら３７℃でインキュベートした。培養液のＡ６００がおよそ２に達したら、１ｍＭのＩＰＴＧの添加により、導入遺伝子の発現を誘導し、２０℃で一晩細胞をさらに培養した。細胞を遠心分離（５０００ｇ、２０分、４℃）で回収し、超音波処理用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波処理し（２×９０秒、デューティサイクル５０％、振幅は５に設定）、再度遠心して細胞片を除去した。ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎを用いて、未精製細胞抽出物からヘキサヒスチジンタグ付き融合タンパク質を精製した。１０ｍＭイミダゾールを添加後、超音波処理後の上清を上記樹脂上に２回アプライし、その後、漸増量のイミダゾール（５～１５ｍＭ）を含有する平衡緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄工程を実施した。２５０ｍＭイミダゾールを添加した平衡緩衝液をアプライすることで、結合性スキャフォールドを溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １０Ｋ遠心式フィルターを用いてＰＢＳへの緩衝液交換を行った後、それぞれのモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより濃度を求め、最後に、タンパク質を－８０℃で直接凍結した。

【0397】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた結合親和性の測定
ＳＰＲ実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置で行った。実験は全て、脱気及び濾過を行った、２５℃の、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（メルクミリポア社）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行った。ｈＨＥＲ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）を、流速１０μＬ／分で、６０秒間、濃度４μｇ／ｍＬで、プロテインＡセンサーチップ上に固定した。アフィボディをベースとした抗原結合部分の親和性を求めるため、５つの濃度（抗原結合部分の予想Ｋ_ｄに基づく）の各種タンパク質を、シングルサイクルカイネティクスモードで、流速３０μＬ／分で、１５秒間（ｚＨＥＲ２－Ｒ１０Ａ及びｚＨＥＲ２－Ｒ３２Ａ）又は６０秒間（ｚＨＥＲ２－ＷＴ）注入し、その後、解離工程（ｚＨＥＲ２－Ｒ１０Ａ及びｚＨＥＲ２－Ｒ３２Ａの場合は６０秒間、ｚＨＥＲ２－ＷＴの場合は１８０秒間）を行った。再生は１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を用いて流速３０μＬ／分で３０秒間行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いたカーブフィッティングによりＫ_ｄを得た。

【0398】

実施例１０：３つ又は４つのＣＡＲ分子を含むＣＡＲ群の作製
２種のオルソゴナルな二量体化プラットフォーム（ＡＰ２１９６７を用いるＦＫＢＰ／ＦＲＢ；ＡＰ２０１８７を用いるＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ／ＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ）及び低親和性結合部分Ｅ１１．４．１－Ｇ３２Ａを用いることで、３つ（２つの構築物（配列番号４８）及び（配列番号６７）を含む）又は４つＣＡＲ分子（２つの構築物（配列番号４８）及び（配列番号６８）を含む）を複合体化状態で含む、条件的に活性を示すＣＡＲ群を作製するための戦略を例示する。３つ又は４つのＣＡＲ分子を複合体化してＣＡＲ群とすることで、アビディティ効果が増加し、これにより各種抗原に対する感受性を増加させることができる。図１１Ａ及び図１１Ｂは、それぞれ三量体ＣＡＲ及び四量体ＣＡＲを表す模式図を示している。ジャーカットＴ細胞に、三量体ＣＡＲ群又は四量体ＣＡＲ群の２つの別々の鎖をコードするｍＲＮＡ（５μｇ）をエレクトロポレーションで導入し、エレクトロポレーションの２０時間後に、それぞれのシグナル伝達鎖に応じてＳｔｒｅｐ ＩＩタグ又はＦＬＡＧタグを介して、ＣＡＲ発現を検出した。図１１Ｃは三量体ＣＡＲ群及び四量体ＣＡＲ群の発現を示している。

【0399】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ステムセルテクノロジーズ社）を用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。ＮＦκＢ依存性ｅＧＦＰ遺伝子及びＮＦＡＴ依存性ＣＦＰ遺伝子で改変されたジャーカットＴレポーター細胞株は、ウィーン医科大学のＰｅｔｅｒ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ博士の好意により提供されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持する。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受ける。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターする。

【0400】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行う。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いる。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キットを用いて、適合されたプロトコルにより精製する。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液、エタノール、及び２－メルカプトエタノールの混合物で希釈する。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行う。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結する。一過性の導入遺伝子発現のために、ジャーカットＴ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ））を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行う。以下のプロトコルを用いる：初代Ｔ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、５ｍｓ、４ｍｍキュベット）、ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0401】

抗体及びフローサイトメトリー
初代Ｔ細胞及びジャーカットＴ細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理する。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色する。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理する。ＣＡＲ構築物の発現を、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社）を用いてＳｔｒｅｐ ＩＩタグを介して、又は一次抗体として抗ＦＬＡＧタグ抗体（クローンＬ５、バイオレジェンド社）を用いてＦＬＡＧタグを介して、検出し、抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ 抗体の場合はＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型二次抗体を用いる。ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）を用いて、改変標的抗原ｔＥＧＦＲの発現を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0402】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＣＤ３３シグナルペプチド、低親和性ｒｃＳｓｏ７ｄバリアントＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、可動性Ｇ４Ｓリンカー、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、二量体形成ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ及びＦＲＢ、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモサイエンティフィック社）によって合成される。二量体形成ドメインＦＫＢＰをコードするヌクレオチド配列はジェンスクリプト社によって合成される。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする各配列はアドジーン社から入手する（プラスミド＃１１０１１）。可動性リンカー及びＦＬＡＧタグは各種ＰＣＲプライマーを用いて挿入する。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行する。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いる。

【0403】

ジャーカットＴレポーター細胞株による転写因子活性の測定
同一ウェル内の、各種腫瘍抗原を発現するジャーカットＴレポーター細胞及びジャーカットＴ標的細胞の効率的な区別が可能となるように、ジャーカットＴレポーター細胞株を別個の蛍光タンパク質で示差的に標識する。好適な蛍光タンパク質は、ｄＫｅｉｍａ（アドジーン社＃５４６１８）、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ（アドジーン社＃５４５０５）、又はレポータータンパク質に対するクロストークが最小である同様のタンパク質とすることができる。各ＣＡＲを発現するジャーカットＴレポーター細胞における転写因子のＮＦ－ＡＴ及びＮＦ－κＢの活性を、標的細胞と、０．２５：１、０．５：１、１：１、又は２：１のＥ：Ｔ比で、丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間、８時間、１６時間、又は２４時間、共培養することにより評価する。細胞はＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いて獲得し、ジャーカットＴレポーター細胞の活性化は、各レポータータンパク質の蛍光強度の幾何平均又はレポータータンパク質陽性細胞の割合を測定することにより求める。

【0404】

インビトロにおける導入遺伝子の二量体化
共培養実験に先立ち、導入遺伝子の二量体化を誘導する。初代Ｔ細胞及びジャーカットＴ細胞を各細胞培地中で最終細胞濃度に希釈する。ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７及びヘテロ二量体化剤ＡＰ２１９６７を細胞培地中で希釈し、それぞれ１０ｎＭ及び５００ｎＭの終濃度で添加する。同一濃度の各溶媒対照ＤＭＳＯ又はエタノールの添加をそれぞれ対照とした。導入遺伝子の二量体化が効率的に行われるように、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後インビトロ実験に用いる。

【0405】

ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ
ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ用に、２つの標的細胞集団を作製する：（ｉ）ｅＧＦＰと各標的抗原をコードするＲＮＡとをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞、及び、（ｉｉ）ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡのみをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞。これら２つの集団を１：１比で混合し、ＣＡＲ Ｔ細胞と、２０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比４：１：１で、丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間又は２４時間、共培養する。ＣＡＲ Ｔ細胞を添加しなかった標的細胞を対照条件（「標的のみ」）とする。上記インキュベーション時間の経過後、共培養物を遠心し（５分間、１６００ｒｐｍ、４℃）、上清を後のサイトカイン測定用に集め、残った細胞は、ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウムからなるＦＡＣＳ用緩衝液１００μＬ中に再懸濁する。標的抗原陽性細胞集団及び標的抗原陰性細胞集団の生存率を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて求め、特異的溶解を下記式で算出する。
特異的溶解率＝（１－（（（試料のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（試料のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％））））＊１００。

【0406】

実施例１１：ＣＡＲ分子の共刺激シグナリング領域に異なる共刺激ドメインを含むＣＡＲ群の作製
過去２０年に亘り、異なる共刺激ドメインを含有する第２世代のＣＡＲ分子が、Ｔ細胞を効率的に活性化できることが示されてきた。実施例１１は、シグナリング領域に異なる共刺激ドメインを含むＣＡＲ分子も、制御分子によりＴ細胞機能を制御するためのアビディティ効果の利用において、本発明のＣＡＲ群と関連して働くことを示している。図１２Ａは、共刺激シグナリング領域にＣＤ２８又はＩＣＯＳ又はＯＸ４０を含有する、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲ分子である、Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－２８－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号６９）、Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＩＣＯＳ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号７０）、及びＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＯＸ４０－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ（配列番号７１）の、構造を示している。ジャーカット細胞及び初代ヒトＴ細胞における各ＣＡＲ分子の発現を、それぞれ図１２Ｂ及び図１２Ｃに示した。発現の解析は、５μｇの各ｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入した２０時間後に、組み込まれたＳｔｒｅｐ ＩＩタグを介して、フローサイトメトリーで行った。非複合型状態（すなわち一価）及び複合型状態（すなわち二価）のＣＡＲ分子の、ジャーカット細胞においてプロモーターＮＦ－κＢ及びＮＦ－ＡＴを活性化する能力、並びに、初代ヒトＴ細胞において細胞傷害性エフェクター機能を惹起する能力を、それぞれ図１２Ｄ及び図１２Ｅに示す。図１２Ｄは、Ｓ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＯＸ４０－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚが、ＮＦ－κＢ及びＮＦ－ＡＴレポーターを安定に導入されたジャーカット細胞で発現された場合、制御分子ＡＰ２０１８７と複合体形成し二価ＣＡＲ群となった場合には、ＮＦ－κＢ及びＮＦ－ＡＴを効率的に惹起できるが、非複合型の一価状態では惹起できないことを示している。同様に、初代ヒトＴ細胞では、ＣＡＲ分子であるＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＩＣＯＳ－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚ及びＳ（Ｇ３２Ａ）－８ｓｅｒ－ＯＸ４０－ＦＫＢＰ（３６Ｖ）－３ｚによって、当該ＣＡＲ分子がＡＰ２０１８７と複合体形成しＣＡＲ群となった場合のみ、特異的溶解が効率的に惹起された（図１２Ｅ）。まとめると、これにより、本発明のＣＡＲ群のＣＡＲ分子の共刺激シグナリング領域内の共刺激ドメインの種類が変更可能であることが確認される。

【0407】

ヒト細胞株の維持
初代ヒトＴ細胞を、アフェレーシス後の匿名化健常ドナーの血液（オーストリア赤十字社（ウィーン、オーストリア）から入手したバフィーコート）から得た。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ステムセルテクノロジーズ社）を用いたネガティブセレクションにより濃縮した。単離精製後のＴ細胞は、使用まで、２０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で凍結保存した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性化し、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２００ＩＵ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ－２を添加されたＲＰＭＩ－１６４０からなるヒトＴ細胞培地中で増殖させた。初代Ｔ細胞を少なくとも１４日間培養した後、実験を行った。ジャーカットＴ細胞は、ＣＣＲＩのＳａｂｉｎｅ Ｓｔｒｅｈｌ博士から譲渡されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持した。ＮＦκＢ依存性ｅＧＦＰ遺伝子及びＮＦＡＴ依存性ＣＦＰ遺伝子で改変されたジャーカットＴレポーター細胞株は、ウィーン医科大学のＰｅｔｅｒ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ博士の好意により提供されたものであり、１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で維持する。細胞株は定期的にマイコプラズマ混入検査にかけられ、ドイツのマルチプレクション社で細胞株認証を受けた。ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓにより、細胞密度をモニターした。

【0408】

ｍＲＮＡのインビトロ転写及びエレクトロポレーション
ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔを製造業者の取扱説明書に従って用いて、インビトロ転写を行った。反応用テンプレートとして５０～２００ｎｇのカラム精製ＰＣＲ産物を用いた。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム精製キットを用いて、適合されたプロトコルにより精製した。簡潔には、ｍＲＮＡ溶液を、ＲＬＴ緩衝液、エタノール、及び２－メルカプトエタノールの混合物で希釈した。この混合物をＲＮｅａｓｙカラムにロードし、製造業者の取扱説明書に従って精製を行った。溶出をＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで行い、精製後のｍＲＮＡはエレクトロポレーションまで－８０℃で凍結した。一過性の導入遺伝子発現のために、初代Ｔ細胞に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラド社）を用いた、異なる量の各種ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った。以下のプロトコルを用いる：初代Ｔ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、５ｍｓ、４ｍｍキュベット）、ジャーカットＴ細胞（矩形波プロトコル、５００Ｖ、３ｍｓ、４ｍｍキュベット）。

【0409】

抗体及びフローサイトメトリー
初代Ｔ細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウム 中に再懸濁し、４℃で１０分間１０％ヒト血清で処理した。各種一次抗体で、４℃で２５分間、細胞を染色した。染色細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体で４℃で２５分間染色するか、又はそのままＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで処理した。ＣＡＲ構築物の発現を、一次抗体としての抗Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ抗体（クローン５Ａ９Ｆ９、ジェンスクリプト社）と、ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型二次抗体とを用いて、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグを介して検出した。ＰＥ結合型又はＡＰＣ結合型の抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＡＹ１３、バイオレジェンド社）を用いて、改変標的抗原ｔＥＧＦＲの発現を検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析を行った。

【0410】

導入遺伝子コンストラクトの構築
ＣＤ３３シグナルペプチド、低親和性ｒｃＳｓｏ７ｄバリアントＥ１１．４．１－Ｇ３２Ａ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、可動性Ｇ_４Ｓリンカー、ヒト単量体ＣＤ８αヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３２、Ｃ１６４Ｓ、及びＣ１８１Ｓ）、及びＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、二量体形成ドメインＦＫＢＰ Ｆ３６Ｖ、並びにＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインをコードする各ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモサイエンティフィック社）によって合成された。ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、及びＯＸ４０の各細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡクローン由来のものであった（シノ・バイオロジカル社（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ））。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする各配列はアドジーン社から得た（プラスミド＃１１０１１）。可動性リンカーは各種ＰＣＲプライマーを用いて挿入した。機能的導入遺伝子へのヌクレオチド配列構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者の取扱説明書に従って用いることで、実行した。模式図及び配列をそれぞれ図１４及び図１５に示す。得られたコンストラクトはＰＣＲで増幅した後、インビトロ転写に用いた。

【0411】

ジャーカットＴレポーター細胞株による転写因子活性の測定
同一ウェル内の、各種腫瘍抗原を発現するジャーカットＴレポーター細胞及びジャーカットＴ標的細胞の効率的な区別が可能となるように、ジャーカットＴレポーター細胞株を別個の蛍光タンパク質で示差的に標識した。好適な蛍光タンパク質は、ｄＫｅｉｍａ（アドジーン社＃５４６１８）、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ（アドジーン社＃５４５０５）、又はレポータータンパク質に対するクロストークが最小である同様のタンパク質であった。各ＣＡＲを発現するジャーカットＴレポーター細胞における転写因子のＮＦ－ＡＴ及びＮＦ－κＢの活性を、標的細胞と、０．２５：１、０．５：１、１：１、又は２：１のＥ：Ｔ比で、丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で２４時間、共培養することにより評価した。細胞はＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いて獲得し、ジャーカットＴレポーター細胞の活性化は、各レポータータンパク質の蛍光強度の幾何平均又はレポータータンパク質陽性細胞の割合を測定することにより求めた。

【0412】

ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ
ＦＡＣＳをベースとした細胞毒性アッセイ用に、２つの標的細胞集団を作製した：（ｉ）ｅＧＦＰと各標的抗原をコードするＲＮＡとをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞、及び、（ｉｉ）ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡのみをエレクトロポレーションで導入されたジャーカット細胞。これら２つの集団を１：１比で混合し、ＣＡＲ Ｔ細胞と、２０，０００個の標的細胞／ウェルとしてＥ：Ｔ細胞比４：１：１で、丸底９６ウェルプレート内で、３７℃で４時間又は２４時間、共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞を添加しなかった標的細胞を対照条件（「標的のみ」）とした。上記インキュベーション時間の経過後、共培養物を遠心し（５分間、１６００ｒｐｍ、４℃）、上清を後のサイトカイン測定用に集め、残った細胞は、ＰＢＳ、０．２％ヒトアルブミン、及び０．０２％アジ化ナトリウムからなるＦＡＣＳ用緩衝液１００μＬ中に再懸濁した。標的抗原陽性細胞集団及び標的抗原陰性細胞集団の生存率を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて求め、特異的溶解を下記式で算出した。
特異的溶解率＝（１－（（（試料のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（試料のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｅＧＦＰ陽性細胞の％）／（「標的のみ」対照のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の％））））＊１００。

【0413】

よって、本発明は、以下の好ましい実施形態を開示するものである：

【0414】

１．２、３又は４つのＣＡＲ分子から成るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の群であって、
ここで、ＣＡＲの群のメンバーは、それらのアミノ酸配列において、お互い異なっていても又は同一であっても良く、そして前記群のＣＡＲ分子のそれぞれは、少なくとも膜ドメイン、及び抗原結合部分又は抗原結合部分を含む別のポリペプチドが結合できる結合部位のいずれかを含む外部ドメインを含み、そして
ここで、前記群の少なくとも１つのＣＡＲ分子は、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は少なくとも１つの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介してシグナルを伝達できる少なくともシグナル伝達領域を含むエンドドメインをさらに含み、そして
ここで、前記群の各ＣＡＲ分子のエンドドメインは、それぞれのＣＡＲ分子がエンドドメインを含む場合、細胞において発現される場合、細胞膜の細胞内側に位置し、前記群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、細胞において発現される場合、細胞膜の細胞外側に位置し、そして前記群の各ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、細胞において発現される場合、細胞膜に位置し、
前記群の各ＣＡＲ分子は、前記群の他のＣＡＲ分子とのホモ又はヘテロニ量体化を仲介できる少なくとも１つの二量体化ドメインを含み、ここで一対の二量体化ドメインのこの二量体化は、調節分子により誘発され、そして任意には、別の調節分子により還元されるか、又は調節分子の非存在下で起こり、そして調節分子により還元され、ここで調節分子は、生理的条件下で、一対の二量体化ドメインの少なくとも１つのメンバーに結合することができ、そして二量体化を誘発又は低減することにより、２、３又は４つのＣＡＲ分子から成るＣＡＲの非共有的に複合体化された群の形成を誘発するか又は低減し、そして
その一般的なコンフォメーションにおける群の各ＣＡＲ分子の外部ドメインは、それぞれ、前記群の他のＣＡＲ分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるシステインアミノ酸部分を有さず、そして
前記群のＣＡＲ分子、及び前記群のＣＡＲ分子の結合できる他のポリペプチドの抗原結合部分は、１つの標的抗原に対して、又は異なる標的分子の非共有複合体に対して特異的であり、そして
前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭであり、そして
別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、１ｍＭ～１００ｎＭである、
ＣＡＲｓの群。

【0415】

２．前記抗原結合部分がタンパク質ドメインを１つだけ含む、態様１に記載のＣＡＲｓの群。

【0416】

３．前記抗原結合部分がタンパク質ドメインを１つだけ含み、ヒト細胞の表面上に発現したとき前記群のＣＡＲ分子のの二量体化又はオリゴマー化を引き起こさず、前記タンパク質ドメインが、好ましくは、ブドウ球菌Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａのｚ－ドメインに基づくヒト又は非ヒトＶＨ又はＶＬ単一ドメイン抗体（ナノボディ）又は改変抗原結合部分、リポカリン、ＳＨ３ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、ノッチン（knottins）、Ｓｓｏ７ｄ、rcSso7d、Sac7d、Gp2、DARPin、ユビキチン、受容体、受容体のリガンド、又は共受容体からなる群から選択される、態様１又は２のいずれかに記載のＣＡＲｓの群。

【0417】

４．前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、１ｍＭ～１５０ｎＭ、好ましくは１ｍＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１ｍＭ～３００ｎＭ、特に１ｍＭ～４００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、１ｍＭ～１５０ｎＭ、好ましくは１ｍＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１ｍＭ～３００ｎＭ、特に１ｍＭ～４００ｎＭである、態様１～３のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0418】

５．前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、５００μＭ～１００ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～１００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～１００ｎＭ、特に５０μＭ～１００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、５００μＭ～１００ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～１００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～１００ｎＭ、特に５０μＭ～１００ｎＭである、態様１～３のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0419】

６．前記群のＣＡＲ分子の個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性は、５００μＭ～１５０ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～３００ｎＭ、特に５０μＭ～４００ｎＭであり、そして別のポリペプチドの個々の各抗原結合部分のその標的抗原への親和性、又は他方では、この他のポリペプチドのそのそれぞれのＣＡＲ分子の結合部位への親和性は、５００μＭ～１５０ｎＭ、好ましくは２５０μＭ～２００ｎＭ、より好ましくは１２５μＭ～３００ｎＭ、特に５０μＭ～４００ｎＭである、態様１～３のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0420】

７．前記ＣＡＲｓの群の又は前記群のＣＡＲ分子に結合出来る他のポリペプチドの抗原結合部分に特異的に認識される各標的抗原が、天然に存在する細胞表面抗原か、又は天然に存在する細胞表面抗原に結合されるポリペプチド、糖又は脂質である、態様１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0421】

８．前記ＣＡＲｓの群の又は前記群のＣＡＲ分子に結合出来る他のポリペプチドの抗原結合部分が、細胞上、固相表面上、又は脂質二重層上に存在する１つ以上の特異的抗原、好ましくは細胞の１つ以上の標的抗原に結合する、態様１～７のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0422】

９．前記ＣＡＲｓの群の又は前記群のＣＡＲ分子に結合出来る他のポリペプチドの１つ以上の抗原結合部分がが結合する１つ以上の標的抗原が、CD19, CD20, CD22, CD23, CD28, CD30, CD33, CD35, CD38, CD40, CD42c, CD43, CD44, CD44v6, CD47, CD49D, CD52, CD53, CD56, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79A, CD79B, CD80, CD82, CD85A, CD85B, CD85D, CD85H, CD85K, CD96, CD107a, CD112, CD115, CD117, CD120b, CD123, CD146, CD148, CD155, CD185, CD200, CD204, CD221, CD271, CD276, CD279, CD280, CD281, CD301, CD312, CD353, CD362, BCMA, CD16V, CLL-1, Ig kappa, TRBC1, TRBC2, CKLF, CLEC2D, EMC10, EphA2, FR-a, FLT3LG, FLT3, Lewis-Y, HLA-G, ICAM5, IGHA1/IgA1, IL-1RAP, IL-17RE, IL-27RA, MILR1, MR1, PSCA, PTCRA, PODXL2, PTPRCAP, ULBP2, AJAP1, ASGR1, CADM1, CADM4, CDH15, CDH23, CDHR5, CELSR3, CSPG4, FAT4, GJA3, GJB2, GPC2, GPC3, IGSF9, LRFN4, LRRN6A/LINGO1, LRRC15, LRRC8E, LRIG1, LGR4, LYPD1, MARVELD2, MEGF10, MPZLI1, MTDH, PANX3, PCDHB6, PCDHB10, PCDHB12, PCDHB13, PCDHB18, PCDHGA3, PEP, SGCB, vezatin, DAGLB, SYT11, WFDC10A, ACVR2A, ACVR2B, 未分化リンパ腫キナーゼ, カドヘリン24, DLK1, GFRA2, GFRA3, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EFNB1, EPOR, FGFR2, FGFR4, GALR2, GLG1, GLP1R, HBEGF, IGF2R, UNC5C, VASN, DLL3, FZD10, KREMEN2, TMEM169, TMEM198, NRG1, TMEFF1, ADRA2C, CHRNA1, CHRNB4, CHRNA3, CHRNG, DRD4, GABRB3, GRIN3A, GRIN2C, GRIK4, HTR7, APT8B2, NKAIN1, NKAIN4, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1I, CACNG8, CACNG4, CLCN7, KCN§A4, KCNG2, KCNN3, KCNQ2, KCNU1, PKD1L2, PKD2L1, SLC5A8, SLC6A2, SLC6A6, SLC6A11, SLC6A15, SLC7A1, SLC7A5P1, SLC7A6, SLC9A1, SLC10A3, SLC10A4, SLC13A5, SLC16A8, SLC18A1, SLC18A3, SLC19A1, SLC26A10, SLC29A4, SLC30A1, SLC30A5, SLC35E2, SLC38A6, SLC38A9, SLC39A7, SLC39A8, SLC43A3, TRPM4, TRPV4, TMEM16J, TMEM142B, ADORA2B, BAI1, EDG6, GPR1, GPR26, GPR34, GPR44, GPR56, GPR68, GPR173, GPR175, LGR4, MMD, NTSR2, OPN3, OR2L2, OSTM1, P2RX3, P2RY8, P2RY11, P2RY13, PTGE3, SSTR5, TBXA2R, ADAM22, ADAMTS7, CST11, MMP14, LPPR1, LPPR3, LPPR5, SEMA4A, SEMA6B, ALS2CR4, LEPROTL1, MS4A4A, ROM1, TM4SF5, VANGL1, VANGL2, C18orf1, GSGL1, ITM2A, KIAA1715, LDLRAD3, OZD3, STEAP1, MCAM, CHRNA1, CHRNA3, CHRNA5, CHRNA7, CHRNB4, KIAA1524, NRM.3, RPRM, GRM8, KCNH4, Melanocortin 1受容体, PTPRH, SDK1, SCN9A, SORCS1, CLSTN2, エンドセリン転換酵素様-1, リゾホスファチジン酸受容体2, LTB4R, TLR2, 神経栄養性チロシンキナーゼ1, MUC16, B7-H4, 上皮成長因子受容体(EGFR), ERBB2, HER3, EGFRバリアントIII (EGFRvIII), HGFR, FOLR1, MSLN, CA-125, MUC-1, 前立腺特異的膜抗原(PSMA), メソテンシン, 上皮細胞接着分子(EpCAM), L1-CAM, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, VEGFR1, VEGFR2, 高分子量メラノーマ関連抗原(HMW-MAA), MAGE-A l, IL-13R-α2, ジシアロガングリオシド(GD2及びGD3),腫瘍関連糖抗(CA-125, CA-242, Tn及びシアリル-Tn), 4-1BB, 5T4, BAFF, 炭酸脱水酵素9 (CA-IX), C-MET, CCR1, CCR4, FAP, フィブロネクチン外部ドメイン-B (ED-B), GPNMB, IGF-1受容体, インテグリンα5β1, インテグリンαvβ3, ITB5, ITGAX,エンビギン, PDGF-Rα, ROR1, シンデカン1, TAG-72, テネイシンC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, NKG2D-リガンド, 腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体(MHC)分子, 好ましくはPR1/HLA-A2, 系譜特異的又は組織特異的組織抗原、好ましくはCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD24, CD25, CD34, CD80, CD86, CD133, CD138, CD152, CD319, エンドグリン及びMHC分子からなる群から好ましくは選択される分子を含む、態様１～８のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0423】

１０．前記群のＣＡＲ分子の外部ドメインが、抗原結合部分と膜貫通ドメインとの間に挿入された構造的に柔軟なヒンジ領域、好ましくはCD8アルファ（UniProtKB/Swiss-Prot P01732-1のアミノ酸位置１３８～１８２)、CD28（UniProtKB/Swiss-Prot P10747のアミノ酸位置１３８～１８２)、又はPD-1（UniProtKB/Swiss-Prot Q15116のアミノ酸位置１４６～１７０)に由来するヒンジ領域を含み、ここでＣＤ８アルファ、ＣＤ２８又はＰＤ－１に由来する配列のＮ末端又はＣ末端が短縮され、それら配列領域の境界の内の任意の長さを有し、そしてＣＤ８アルファ及びＣＤ２８に由来するヒンジが欠失し、又は他のアミノ酸残基によって置き換えられる、態様１～９のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0424】

１１．前記ＣＡＲ分子のドメインが異なるタンパク質に由来し、これらのドメインの２つ以上がアミノ酸リンカー配列によって連結され、当該リンカーが好ましくは長さ１～４０アミノ酸である、態様１～１０のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0425】

１２．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の、好ましくは前記群の全てのＣＡＲ分子の二量体化ドメインの二量体化が、制御分子の結合によって促進される、態様１～１１のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0426】

１３．１つのＣＡＲ分子内に２つ以上のヘテロ二量体化ドメインがある場合、そのＣＡＲ分子内のヘテロ二量体化ドメインは、細胞膜によって隔てられ、及び/又はそれぞれがヘテロ二量体化ドメインのペアの同じメンバーであり、及び／又ははそれぞれがヘテロ二量体化ドメインの異なるペアのメンバーであり、そのため制御分子の存在下及び非存在下互いに結合できないため、前記群のＣＡＲ分子の制御できない数を含む複合体の形成が妨げられる、態様１～１２のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0427】

１４．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の二量体化ドメインが：カルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）、シクロフィリン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ギラーゼＢ（ＧｙｒＢ）、GAI, GID1, PYL, ABI、好ましくはFK506結合タンパク質12 (FKBP12, FKBP), FKBP変異体F36V及びFKBP-ラパマイシン関連タンパク質(FRB)変異体T82Lから選択される、態様１～１３のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0428】

１５．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の二量体化が、核受容体及び共制御ペプチド由来のリガンド結合ドメインを含むヘテロ二量体化ドメインのペアによって仲介される、態様１～１４のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0429】

１６．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の二量体化が、リポカリンフォールド分子及びリポカリンフォールド結合相互作用パートナーによって仲介される、態様１～１５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0430】

１７．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の二量体化が、核受容体及び共制御ペプチド由来のリガンド結合ドメインを含むヘテロ二量体化ドメインのペアによって仲介され、ここで核受容体由来のリガンド結合ドメインが、エストロゲン受容体、エクジソン受容体、グルココルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、ビタミンＤ受容体、PPARγ受容体、PPARβ受容体、PPARα受容体、プレグナンＸ受容体、肝臓Ｘ受容体、ファルネソイドＸ受容体、レチノイドＸ受容体、ＲＡＲ関連オルファン受容体、レチノイン酸受容体、及びSRC1, GRIP1, AIB1, PGC1a, PGC1b, PRC, TRAP220, ASC2, ASC2-1, ASC2-2, CBP, CBP-1, CBP-2, P300, CIA, ARA70, ARA70-1, ARA70-2, NSD1, SMAP, Tip60, ERAP140, Nix1, LCoR, N-CoR, SMRT, RIP140, RIP140-1, RIP140-2, RIP140-3, RIP140-4, RIP140-5, RIP140-6, RIP140-7, RIP140-8, RIP140-9, PRIC285, PRIC285-1, PRIC285-2, PRIC285-3, PRIC285-4, PRIC285-5, SRC1-1, SRC1-2, SRC1-3, SRC1-4a, SRC1-4b, SRC2, SRC3, SRC3-1, PGC1, TRAP220-1, TRAP220-2, NR0B1, NRIP1, TIF1, TIF2, CoRNR Box, CoRNR1, CoRNR2, βV, EA2, TA1, EAB1, GRIP1-1, GRIP1-2, GRIP1-3, AIB1-1, AIB1-2, AIB1-3, PGC1a, PGC1bから選択される核受容体のそれぞれ適合する共制御分子から選択される、態様１～１６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0431】

１８．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の二量体化が、リポカリンフォールド分子及びリポカリンフォールド結合相互作用パートナーによって仲介され、ここでリポカリンフォールド分子が、構造的に保存されたβバレル構造の外側に、最大１５、最大３０、又は最大５０アミノ酸欠失、及び／又は最大１５、最大３０、又は最大５０アミノ酸挿入を有する天然に存在するリポカリン又はiLBPの誘導体であり、好ましくは以下から選択されるアミノ酸に構造的に対応する：
―ＰＤＢエントリー１ＲＢＰにおけるアミノ酸残基ナンバリングに対応するヒトＲＢＰ４における構造的に保存されたβストランドに隣接する領域を規定するヒトＲＢＰ４のアミノ酸残基1-20, 31-40, 48-51, 59-70, 79-84, 89-101, 110-113, 121-131及び139-183；
―ヒトＴＬＣの構造的に保存されたβストランドに隣接する領域を規定するSchiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985)におけるアミノ酸残基ナンバリングに従うヒトＴＬＣにおけるアミノ酸残基1-13, 24-36, 44-47, 55-61, 70-75, 80-83, 92-95, 103-110及び118-158；
－ヒトＡｐｏＭの構造的に保存されたβストランドに隣接する領域を規定するSchiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985)におけるアミノ酸残基ナンバリングに従うヒトＡｐｏＭにおけるアミノ酸残基1-43, 54-68, 76-80, 88-95, 104-109, 114-118, 127-130, 138-141及び149-188；
―ヒトCRABPIIの構造的に保存されたβストランドに隣接する領域を規定するＰＤＢエントリー２Ｆ７３におけるアミノ酸残基ナンバリングに従うヒトCRABPIIにおけるアミノ酸残基1-4, 13-40, 46-49, 55-60, 66-70, 74-80, 88-92, 97-107, 113-118, 125-128及び136-137；
―ヒトFABP1の構造的に保存されたβストランドに隣接する領域を規定するＰＤＢエントリー２Ｆ７３におけるアミノ酸残基ナンバリングに従うヒトFABP1におけるアミノ酸残基1-4, 13-38, 44-47, 53-58, 64-68, 72-78, 86-90, 95-98, 104-108, 115-118及び126-127；
態様１～１７のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0432】

１９．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の二量体化が、リポカリンフォールド分子及びリポカリンフォールド結合相互作用パートナーによって仲介され、ここでリポカリンフォールド分子が、βバレル構造と７０％以上、好ましくは８０％以上、特に９０％以上の配列同一性を有する天然に存在するリポカリン又はiLBPの誘導体であり、それによりこのβバレル構造が好ましくは以下から選択されるアミノ酸残基の領域に構造的に対応する：
―ヒトRBP4の構造的に保存されたβストランドを規定する（PDB entry 1RBPにおけるアミノ酸残基ナンバリングに従う）ヒトＲＢＰ４におけるアミノ酸残基21-30, 41-47, 52-58, 71-78, 85-88, 102-109, 114-120及び132-138；
―ヒトＴＬＣの構造的に保存されたβストランドを規定する（ＴＬＣ；Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により規定される）ヒト涙リポカリンにおけるアミノ酸残基14-23, 37-43, 48-54, 62-69, 76-79, 84-91, 96-102及び111-117；
―ヒトCRABPIIの構造的に保存されたβストランドを規定する（CRABPII；Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により規定される）ヒトアポリポタンパク質Ｍにおけるアミノ酸残基44-53, 69-75, 81-87, 96-103, 110-113, 119-126, 131-137及び142-148；
―ヒトApoMの構造的に保存されたβストランドを規定する（ApoM；PDB entry 2FS6におけるアミノ酸残基ナンバリングに従う）ヒト細胞レチノイン酸結合タンパク質ＩＩにおけるアミノ酸残基5-12, 41-45, 50-54, 61-65, 71-73, 81-87, 93-96, 108-112, 119-124及び129-135；
―ヒトFABP1の構造的に保存されたβストランドを規定する（FABP1；PDB entry 2F73におけるアミノ酸残基ナンバリングに従う）ヒト脂肪酸結合タンパク質１におけるアミノ酸残基5-12, 39-43, 48-52, 59-63, 69-71, 79-85, 91-94, 99-103, 109-114及び119-125；
態様１～１８のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0433】

２０．前記群の２つ以上のＣＡＲ分子の二量体化が、リポカリンフォールド分子及びリポカリンフォールド結合相互作用パートナーによって仲介され、ここでリポカリンフォールド分子が、リポカリンフォールドの構造的に保存されたβバレル構造を少なくともカバーする長さ８０以上、好ましくは１００以上、特に１２０以上のアミノ酸長の天然に存在するリポカリン又はその誘導体であり、又はリポカリンフォールドの構造的に保存されたβバレル構造を少なくともカバーする長さ８０以上、好ましくは８５以上、特に９０以上のアミノ酸長の天然に存在するiLBP又はその誘導体であり、当該構造的に保存されたβバレル構造が、以下から選択されるアミノ酸残基の領域に構造的に対応するアミノ酸位置を含み又はそれからなる：
―ヒトRBP4の構造的に保存されたβストランドを規定する（PDB entry 1RBPにおけるアミノ酸残基ナンバリングに従う）ヒトＲＢＰ４におけるアミノ酸残基21-30, 41-47, 52-58, 71-78, 85-88, 102-109, 114-120及び132-138；
―ヒトＴＬＣの構造的に保存されたβストランドを規定する（ＴＬＣ；Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により規定される）ヒト涙リポカリンにおけるアミノ酸残基14-23, 37-43, 48-54, 62-69, 76-79, 84-91, 96-102及び111-117；
―ヒトCRABPIIの構造的に保存されたβストランドを規定する（CRABPII；Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985により規定される）ヒトアポリポタンパク質Ｍにおけるアミノ酸残基44-53, 69-75, 81-87, 96-103, 110-113, 119-126, 131-137及び142-148；
―ヒトApoMの構造的に保存されたβストランドを規定する（ApoM；PDB entry 2FS6におけるアミノ酸残基ナンバリングに従う）ヒト細胞レチノイン酸結合タンパク質ＩＩにおけるアミノ酸残基5-12, 41-45, 50-54, 61-65, 71-73, 81-87, 93-96, 108-112, 119-124及び129-135；
―ヒトFABP1の構造的に保存されたβストランドを規定する（FABP1；PDB entry 2F73におけるアミノ酸残基ナンバリングに従う）ヒト脂肪酸結合タンパク質１におけるアミノ酸残基5-12, 39-43, 48-52, 59-63, 69-71, 79-85, 91-94, 99-103, 109-114及び119-125；
態様１～１９のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0434】

２１．前記制御分子が、人体内の生理的環境中、又は細胞内の生理的条件下、細胞の表面で、又は標準化された生理的条件下、好ましくはＰＢＳ条件下で達成され得る濃度で可溶性である分子であり、当該ＰＢＳ条件が137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄及び18 mM KH₂PO₄である、態様１～２０のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0435】

２２．１つ以上の制御分子が、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、アブシジン酸、ジベレリン又はジベレリンアナログＧＡ３－ＡＭ、クメルマイシン、ビス－メトトレキサート、AP20187,又はAP1903から選択される、態様１～２１のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0436】

２３．１つ以上の制御分子が核受容体からのリガンド結合ドメインと結合し、コルチコステロン(11ベータ,21-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン); デオキシコルチコステロン (21-ヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン);コルチゾール(11ベータ,17,21-トリヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン); 11-デオキシコルチゾール(17,21-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン);コルチゾン(17,21-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3,11,20-トリオン); 18-ヒドロキシコルチコステロン (11ベータ,18,21-トリヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン); 1.アルファ.-ヒドロキシコルチコステロン(1 アルファ,11ベータ,21-トリヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン);アルドステロン18,11-ヘミアセタール of 11ベータ,21-ジヒドロキシ-3,20-ジオキソ-4-プレグネン-18-アール; アンドロステンジオン (4-アンドロステン-3,17-ジオン); 4-ヒドロキシ-アンドロステンジオン; 11β-ヒドロキシアンドロステンジオン (11 ベータ-4-アンドロステン-3,17-ジオン); アンドロスタンジオール (3-ベータ,17-ベータ-アンドロスタンジオール); アンドロステロン (3アルファ-ヒドロキシ-5アルファ-アンドロスタン-17-オン); エピアンドロステロン (3ベータ-ヒドロキシ-5アルファ-アンドロスタン-17-オン);アドレノステロン(4-アンドロステン-3,11,17-トリオン); デヒドロエピアンドロステロン (3ベータ-ヒドロキシ-5-アンドロステン-17-オン); デヒドロエピアンドロステロン スルフェート (3ベータ-スルホキシ-5-アンドロステン-17-オン); テストステロン (17ベータ-ヒドロキシ-4-アンドロステン-3-オン); エピテストステロン (17アルファ-ヒドロキシ-4-アンドロステン-3-オン); 5α-ジヒドロテストステロン (17ベータ-ヒドロキシ-5アルファ-アンドロスタン-3-オン 5β-ジヒドロテストステロン; 5-ベータ-ジヒドロキシ テストステロン (17ベータ-ヒドロキシ-5ベータ-アンドロスタン-3-オン); 11β-ヒドロキシテストステロン (11ベータ,17ベータ-ジヒドロキシ-4-アンドロステン-3-オン); 11-ケトテストステロン (17ベータ-ヒドロキシ-4-アンドロステン-3,17-ジオン); エストロン (3-ヒドロキシ-1,3,5(10)-エストラトリエン-17-オン); エストラジオール (1,3,5(10)-エストラトリエンe-3,17ベータ-ジオール); エストリオール 1,3,5(10)-エストラトリエンe-3,16アルファ,17ベータ-トリオール; プレグネンノロン(3-ベータ-ヒドロキシ-5-プレグネン-20-オン); 17-ヒドロキシプレグネノロン(3-ベータ,17-ジヒドロキシ-5-プレグネン-20-オン); プロゲステロン (4-プレグネン-3,20-ジオン); 17-ヒドロキシプロゲステロン (17-ヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン); プロゲステロン (プレグン-4-エン-3,20-ジオン); T3; T4;スピロラクトン；エプレレノン；酢酸シプロテロン、ヒドロキシフルタミド；エンザルタミドARN-509; 3,3′-ジインドリルメタン (DIM);ベクスロステリド；ジカルタミド；Ｎ－ブチルベンゼン―スルホンアミド（ＮＢＢＳ）；ドゥタステリド；エプリステリド；フィナステリド；フルタミド；イゾンステリド；ケトコナゾール；Ｎ－ブチルベンゼン―スルホンアミド；ニルタミド；メゲストロール；ツロステリド；メフェプリストン(RU-486; 11β-[4 N,N-ジメチルアミノフェニル]-17β-ヒドロキシ-17-(1-プロピニル)-エストラ-4,9-ジエン-3-オン);リロプリストン（11β-(4 N,N-ジメチルアミノフェニル)-17β-ヒドロキシ-17-((Z)-3-ヒドロキシプロペニル)エストラ-4,9-ジエン-3-オン);オナプリストン(11β-(4 N,N-ジメチルアミノフェニル)-17α-ヒドロキシ-17-(3-ヒドロキシプロピル)-13α-エストラ-4,9-ジエン-3-オン);アソプリスニル(ベンザルデヒドe, 4-[(11β,17β)-17-メトキシ-17-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11-yl]-1-(E)-オキシム; J867); J912 (4-[17β-ヒドロキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-yl]ベンザルデヒド-(1E)-オキシム); CDB-2914 (17α-アセトキシ-11β-(4-N,N-ジメチルアミノフェニル)-19-ノルプレグンa-4,9-ジエン-3,20-ジオン); JNJ-1250132 (6α,11β,17β)-11-(4-ジメチルアミノフェニル)-6-メチル-4′,5′-ジヒドロスピロ[エストラ-4,9-ジエンe-17,2′(3′H)-フラン]-3-オン (ORG-31710); (11β,17α)-11-(4-アセチルフェニル)-17,23-エポキシ-19,24-ジノルコラ-4,9-,20-トリエン-3-オン (ORG-33628); (7β,11β,17β)-11-(4-ジメチルアミノフェニル-7-メチル]-4′,5′-ジヒドロスピロ[エストラ-4,9-ジエンe-17,2′(3′H)-フラン]-3-オン (ORG-31806); ZK-112993; ORG-31376; ORG-33245; ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753; LG120830; LG1447; LG121046; CGP-19984A; RTI-3021-012; RTI-3021-022; RTI-3021-020; RWJ-25333; ZK-136796; ZK-114043; ZK-230211; ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734; ZK-137316; 4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-yl]ベンザルデヒドe-1-(E)-オキシム; 4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-yl]ベンザルデヒドe-1-(E)-[O-(エチルアミノ)カルボニル]オキシム; 4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンザルデヒドe-1-(E)-[O-(エチルチオ)カルボニル]オキシム; (Z)-6′-(4-シアノフェニル)-9,11α-ジヒドロ-17β-ヒドロキシ-17α-[4-(1-オキソ-3-メチルブトキシ)-1-ブテニル]4′H-ナフト[3′,2′,1′;10,9,11]エストル-4-エン-3-オン; 11β-(4-アセチルフェニル)-17β-ヒドロキシ-17α-(1,1,2,2,2-ペンタ-フルオロエチル)エストラ-4,9-ジエン-3-オン; 11β-(4-アセチルフェニル)-19,24-ジノール-17,23-エポキシ-17アルファ-コラ-4,9,20-トリエン-n-3-オン; (Z)-11ベータ,19-[4-(3-ピリジニル)-o-フェニレン]-17ベータ-ヒドロキシ-17α-[3-ヒドロキシ-1-プロペニル]-4-アンドロステン-3-オン; 11ベータ-[4-(1-メチルエテニル)フェニル]-17α-ヒドロキシ-17ベータ-β-ヒドロキシプロピル)-13α-エストラ-4,9-ジエン-3-オン; 4′,5′-ジヒドロ-11ベータ-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-6ベータ-メチルスピロ[エストラ-4,-9-ジエン-17ベータ,2′(3′H)-フラン]-3-オン;ドロスピレノン; T3 (3,5,3′-トリヨード-L-チロシン); KB-141 (3,5-ジクロロ-4-(4-ヒドロキシ-3-イソプロピルフェノキシ)フェニル酢酸);ソベチロン(3,5-ジメチル-4-(4′-ヒドロキシ-3′-イソプロピルベンジル)-フェノキシ酢酸); GC-24 (3,5-ジメチル-4-(4′-ヒドロキシ-3′-ベンジル)ベンジルフェノキシ酢酸); 4-OH-PCB106 (4-OH-2′,3,3′,4′,5′-ペンタクロロビフェニル);エピロチロム; MB07811 ((2R,4S)-4-(3-クロロフェニル)-2-[(3,5-ジメチル-4-(4′-ヒドロキシ-3′-イソプロピルベンジル)フェノキシ)メチル]-2-オキシド-[1,3,2]-ジオキサホスホナン); QH2; (3,5-ジメチル-4-(4′-ヒドロキシ-3′-イソプロピルベンジル)フェノキシ)メチルリン酸(MB07344); タモキシフェン; 4-OH-タモキシフェン;ラクソキシフェン; ラアソフォキシフェン、バゼドキシフェン；ファルソデクス；クロミフェン；フェマレル；オルメロキシフェン；トレミフィエン；オスペミフェン；エストラジオール (17-ベータ-エストラジオール);エチニルエストラジオール;チアゾリジンジオン (好ましくはロシグリタゾン、ピオグリタゾン、ロベグリタゾン、トログリタゾン)；ファルグリタザル；アレグリタザル；フェノフィブリック酸；ベンゾピラノキノリンＡ２７６５７５；マプラコラート； ZK 216348; 55D1E1; デキサメタゾン；プレドニゾロン；プレドニゾン；メチルプレドニゾロン；フルチカゾンプロピオネート；ベクロメタゾン－１７－モノプロピオン酸；ベタメタゾン；リメキソロン；パラメタゾン；ヒドロコルチゾン； 1,25-ジヒドロキシビタミンD3 (カルシトリオール); パリカリトール;ドキセルカルシフェロール; 25-ヒドロキシビタミンD3 (カルシフジオール);クロレカルシフェロール;エルゴカルシフェロール;タカルシオール; 22-ジヒドロエルゴカルシフェロール; (6Z)-タカルシオール; 2-メチエン-19-ノル-20(S)-1α-ヒドロキシ-ビスホモプレグナカルシフェロール; 19-ノル-26,27-ジメチレン-20(S)-2-メチレン-1α,25-ジヒドロキシビタミンD3; 2-メチレン-1α,25-ジヒドロキシ-(17E)-17(20)-デヒドロ-19-ノルビタミンD3; 2-メチレン-19-ノル-(24R)-1α,25-ジヒドロキシビタミン D2; 2-メチレン-(20R,25S)-19,26-ジノール-1α,25-ジヒドロキシビタミン D3; 2-メチレン-19-ノル-1α-ヒドロキシ-プレグンアカルシフェロール; 1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ホモプレグンアカルシフェロール; (20R)-1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-bisホモプレグンアカルシフェロール; 2-メチレン-19-ノル-(20S)-1α-ヒドロキシ-trisホモプレグンアカルシフェロール; 2-メチレン-23,23-ジフルオロ-1α-ヒドロキシ-19-ノル-bisホモプレグンアカルシフェロ-1; 2-メチレン-(20S)-23,23-ジフルオロ-1α-ヒドロキシ-19-ノル-bisホモプレグナン-カルシフェロール; (2-(3′ ヒドロキシプロピル-1′,2′-イデン)-19,23,24-トリノル-(20S)-1α-ヒドロキシビタミン D3; 2-メチレン-18,19-dinor-(20S)-1α,25-ジヒドロキシビタミン D3;レチノイン酸;全-trans-レチノイン酸; 9-cis-レチノイン酸;タミバロテン; 13-cis-レチノイン酸; (2E,4E,6Z,8E)-3,7-ジメチル-9-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセネイル)ノナ-2,4,6,-8-テトラエノン酸; 9-(4-メトキシ-2,3,6-トリメチル-フェニル)-3,7-ジメチル-ノナ-2,4,6,8-テトラエノン酸; 6-[3-(1-アダマンチル)-4-メトキシフェニル]-2-ナフト酸; 4-[1-(3,5,5,8,8-ペンタメチル-テトラリン-2-イル)エテニル]ベンゾイン酸;レチノベンゾイン酸;エチル6-[2-(4,4-ジメチルチオクロマン-6-イル)エチニル]ピリドン-3-カルボキシレート;レチノイルt-ブチレート;レチノイルピナコール;レチノイルコレステロール;オベチクロル酸; LY2562175 (6-(4-((5-シクロプロピル-3-(2,6-ジクロロフェニル)イソキサゾル-4-yl)メトキシ)ピペリジン-1-yl)-1-メチル-1H-インドール-3-カルボン酸); GW4064 (3-[2-[2-クロロ-4-[[3-(2,6-ジクロロフェニル)-5-(1-メチルエチル)-4-イソキサゾリル]メトキシ]フェニル]エテニル]安息香酸); T0901317 (N-(2,2,2-トリフルオロエチル)-N-[4-[2,2,2-トリフルオロ-1-ヒドロキシ-1-(トリフルオロメチル)エチル]フェニル]ベンゼンスルホンアミド); GW3965 (3-[3-[[[2-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル]メチル](2,2-ジフェニルエチル)アミノ]プロポキシ]ベンゼン酢酸塩酸); LXR-623; GNE-3500 (27, 1-{4-[3-フルオロ-4-((3S,6R)-3-メチル-1,1-ジオキソ-6-フェニル-[1,2]チアジナン-2-イルメチル)-フェニル]-ピペラジン-1-イル}-エタノン); 7β, 27-ジヒドロキシコレステロール; 7α, 27-ジヒドロキシコレステロール; 9-cisレチノイン酸; LGD100268; CD3254 (3-[4-ヒドロキシ-3-(5,6,7,8-テトラヒドロ-3,5,5,8,8-ペンタメチル-2-ナフタレニル)フェニル]-2-プロペノン酸); CD2915 (Sorensen et al. (1997) Skin Pharmacol. 10:144);リファムピシン;クロトリマゾール;及びロバスタチン；
から選択される、態様１～２２のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0437】

２４．少なくとも１つの制御分子がタモキシフェンであり、分子受容体由来、好ましくはエストロゲン受容体アルファ又はエストロゲン受容体ベータ由来のリガンド結合ドメインと結合する、態様１～２３のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0438】

２５．少なくとも１つの制御分子がリポカリンフォールド分子であり、フェンレチニド (Pubchem CID 5288209), N-エチルレチナミド(Pubchem CID 5288173), 全-trans レチノイン酸 (Pubchem CID 444795), アクセロフテン (Pubchem CID 5287722), A1120 (Pubchem CID 25138295) 及びその誘導体(Cioffi et al., J Med Chem. 2014;57(18):7731-7757; Cioffi et al., J Med Chem. 2015;58(15):5863-5888), 1,4-butanediol (Pubchem CID 8064), スフィンゴシン-1-リン酸(Pubchem CID 5283560), テトラデカン酸(Pubchem CID 11005), インディカキサンチン(Pubchem CID 6096870 and 12310796), ブルガキサンチンI (Pubchem CID 5281217), Montelukast (Pubchem CID 5281040), Cyclandelate (Pubchem CID 2893), Oxolamine (Pubchem CID 13738), Mazaticol (Pubchem CID 4019), Butoctamid (Pubchem CID 65780), Tonabersat (Pubchem CID 6918324), Novazin (Pubchem CID 65734), Diphenidol (Pubchem CID 3055), Alloclamide (Pubchem CID 71837), Diacetolol (Pubchem CID 50894), Acotiamide (Pubchem CID 5282338), Acoziborole (Pubchem CID 44178354), Acumapimod (Pubchem CID 11338127), Apalutamide (Pubchem CID 24872560), ASP3026 (Pubchem CID 25134326), AZD1480 (Pubchem CID 16659841), BIIB021 (Pubchem CID 16736529), Branaplam (Pubchem CID 89971189), Brequinar (Pubchem CID 57030), Chlorproguanil (Pubchem CID 9571037), Clindamycin (Pubchem CID 446598), Emricasan (Pubchem CID 12000240), Enasidenib (Pubchem CID 89683805), Enolicam (Pubchem CID 54679203), Flurazepam (Pubchem CID 3393), ILX-295501 (Pubchem CID 127737), Indibulin (Pubchem CID 2929), Metoclopramide (Pubchem CID 4168), Mevastatin (Pubchem CID 64715), MGGBYMDAPCCKCT-UHFFFAOYSA-N (Pubchem CID 25134326), MK0686 (Pubchem CID 16102897), Navarixin (Pubchem CID 11281445), Nefazodone (Pubchem CID 4449), Pantoprazole (Pubchem CID 4679), Pavinetant (Pubchem CID 23649245), Proxazole (Pubchem CID 8590), SCYX-7158 (Pubchem CID 44178354), Siccanin (Pubchem CID 71902), Sulfaguanole (Pubchem CID 9571041), Sunitinib (Pubchem CID 5329102), Suvorexant (Pubchem CID 24965990), Tiapride (Pubchem CID 5467), Tonabersat (Pubchem CID 6918324), VNBRGSXVFBYQNN-UHFFFAOYSA-N (Pubchem CID 24794418), YUHNXUAATAMVKD-PZJWPPBQSA-N (Pubchem CID 44548240), Ulimorelin (Pubchem CID 11526696), Xipamide (Pubchem CID 26618), Tropesin (Pubchem CID 47530), Triclabendazole (Pubchem CID 50248), Triclabendazoleスルホキシド(Pubchem CID 127657), Triclabendazoleスルホン(Pubchem CID 10340439)及びTrametinib (Pubchem CID 11707110)から選択される、態様１～２４のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0439】

２６．少なくとも１つの制御分子が、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、AP20187, AP1903, Tamoxifen, Emricasan及びA1120から選択される、態様１～２５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0440】

２７．細胞外から細胞の細胞内側への前記群のＣＡＲ分子におけるドメインの順番が：抗原結合部分を含む他のポリペプチドと結合出来る抗原結合部分又は結合部位、好ましくは空間最適化のためのヒンジ領域、及び貫通ドメイン、
ＣＡＲｓのＩＴＡＭ－含有群の好ましい場合において、膜貫通ドメインは１つ以上のＣＡＲ分子において好ましくは共刺激ドメインを含むシグナル領域が続き、好ましくはこの共刺激シグナル領域又は任意で膜貫通ドメインは、１つ以上の二量体化ドメインが続き、更に１つ以上のＣＡＲ分子において、１つ以上のＩＴＡＭを含むシグナル領域が続き、共刺激及びＩＴＡＭ含有シグナル領域の順番は反対でもよく、ＩＴＡＭを含まないＣＡＲ分子は共刺激シグナル領域を欠くか、１つの共刺激シグナル領域を有し、又は２つの共刺激シグナル領域を有し、又はそれ以上の共刺激シグナル領域を有するが、好ましくは３つ以上の共刺激シグナル領域を有さず、又は尚もより好ましくは共刺激シグナル領域を１つしか有さず、
ＣａｒｓのＩＴＩＭ含有群の場合、膜貫通ドメインは好ましくは１つ以上のＣＡＲ分子においてＩＴＩＭ含有阻害シグナル領域が続き、好ましくはこの阻害シグナル領域、又は任意で膜貫通ドメインは、１つ以上の二量体化ドメイン、及び任意で第二の阻害シグナル領域が続き、
ＣＡＲｓのＩＴＡＭ及びＩＴＩＭ含有群において、ＣＡＲ分子の２つの隣接する成分が任意でリンカーにより隔てられ、
ＣＡＲｓのＩＴＡＭ及びＩＴＩＭ含有群において、少なくとも１つが群の各ＣＡＲ分子に必須である二量体化ドメインが外部ドメイン又は膜貫通ドメインの代わりに又は加えて配置されるが、好ましくは好ましくは膜貫通ドメイン及びシグナル領域の間、及び／又は特に２つのシグナル領域の間、及び／又は特にＣＡＲｓ分子の細胞内末端に配置される、
態様１～２６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0441】

２８．前記群の各ＣＡＲ分子が、１つ以上の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は１つ以上の免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介してシグナルを伝達出来る１つ以上のシグナル領域を含む、態様１～２７のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0442】

２９．前記二量体化ドメインが、前記群のＣＡＲ分子の内部ドメイン中、及び／又は膜貫通ドメイン、好ましくは内部ドメイン中に配置される、態様１～２８のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0443】

３０．前記群のＣＡＲ分子の２つ以上の外部ドメインが、好ましくは１つだけタンパク質ドメインを含む二量体化ドメインを含み、制御分子が細胞から分泌され二量体化ドメインの二量体化を誘導する、態様１～２８のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0444】

３１．前記群の１つ以上のＣＡＲ分子が１つ以上のＩＴＡＭを介してシグナルを伝達出来るシグナル領域を含む内部ドメインを含み、ＣＡＲｓの群が好ましくは３つ以上のＩＴＡＭを含む、態様１～３０のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0445】

３２．前記群の１つ以上のＣＡＲ分子の内部ドメインが１つ以上のＩＴＡＭを含み、当該ＩＴＡＭがＣＤ３ゼータ、ＤＡＰ１２、Ｆｃ－イプシロン受容体１γ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３γ及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）、好ましくはＣＤ３ゼータから選択される、態様１～３１のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0446】

３３．前記群の１つ以上のＣＡＲ分子の内部ドメイン中の共刺激シグナル領域の共刺激ドメインが、4-1BB (CD137), CD28, ICOS, BTLA, OX-40, CD2, CD6, CD27, CD30, CD40, GITR, 及びHVEM, 好ましくは4-1BB 及びICOSに由来する、態様１～３２のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0447】

３４．前記群の１つ以上のＣＡＲ分子が、PD-1, CD85A, CD85C, CD85D, CD85J, CD85K, LAIR1, TIGIT, CEACAM1, CD96, KIR2DL, KIR3DL, SLAMファミリーメンバー, CD300/LMIRファミリーメンバー, CD22及び他のＳｉｇｌｅｃファミリーメンバー由来の細胞質阻害ドメインを含有する内部ドメインを含有する、態様１～３０のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0448】

３５．前記群の１つ以上のＣＡＲ分子が、PD-1, CD85A, CD85C, CD85D, CD85J, CD85K, LAIR1, TIGIT, CEACAM1, CD96, KIR2DL, KIR3DL, SLAMファミリーメンバー, ITIM含有CD300/LMIRファミリーメンバー, CD22及び他のＩＴＩＭ含有Ｓｉｇｌｅｃファミリーメンバーに由来する１つ以上のＩＴＩＭを介してシグナルを伝達出来るシグナル領域を含む内部ドメインを含む、態様１～３０及び３４のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0449】

３６．各ＣＡＲ分子の外部ドメインが抗原結合部分を含む、態様１～３５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0450】

３７．前記群が２つ又は３つのＣＡＲ分子、好ましくは２つのＣＡＲ分子を有する、態様１～３６のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0451】

３８．前記群が３つのＣＡＲ分子からなり、３つのＣＡＲ分子の１つの内部ドメインがＦＫＢＰ１２又は或いはＦＲＢ（変異体Ｔ８２Ｌ）から選択される二量体化ドメインのペアの同じメンバーの２つのコピーを含み、他の２つのＣＡＲ分子のそれぞれの内部ドメインが、それぞれ二量体化ドメインのペアの他のメンバーの１つのコピーを含み、制御分子がラパログである、態様１～１４、２１、２２、２６～２９又は３１～３７のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0452】

３９．前記群が３つのＣＡＲ分子からなり、３つのＣＡＲ分子の１つの内部ドメインが核受容体のリガンド結合ドメイン又は或いは同じ各受容体の適合共刺激分子から選択される二量体化ドメインのペアの同じメンバーの２つのコピーを含み、他の２つのＣＡＲ分子のそれぞれの内部ドメインが、それぞれ二量体化ドメインのペアの他のメンバーの１つのコピーを含み、制御分子がＴａｍｏｘｉｆｅｎである、態様１～１３、１５、１７、２３、２４、２６～２９又は３１～３７のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0453】

４０．前記群が３つのＣＡＲ分子からなり、３つのＣＡＲ分子の１つの内部ドメインがリポカリンフォールド分子又はリポカリンフォールド結合相互作用パートナーのいずれかから選択される二量体化ドメインのペアの同じメンバーの２つのコピーを含み、他の２つのＣＡＲ分子のそれぞれの内部ドメインが、それぞれ二量体化ドメインのペアの他のメンバーの１つのコピーを含み、制御分子が、フェンレチニド (15-[(4-ヒドロキシフェニル)アミノ]レチナール), N-エチルレチナミド, 全-trans レチノイン酸, アクセロフテン, A1120 (PubChem CID 25138295) 及びその誘導体、 1,4-ブタンジオール, スフィンゴシン-1-リン酸, テトラデカン酸, インディカキサンチン, ブルガキサンチン, Montelukast, Cyclandelate, Oxolamine, Mazaticol, Butoctamid, Tonabersat, Novazin, Diphenidol, Neobornyval, Alloclamide, Diacetolol, Acotiamide, Acoziborole, Acumapimod, Apalutamide, ASP3026, AZD1480, BIIB021, Branaplam, Brequinar, Chlorproguanil, Clindamycin, Emricasan, Enasidenib, Enolicam, Flurazepam, ILX-295501, Indibulin, Metoclopramide, Mevastatin, MGGBYMDAPCCKCT-UHFFFAOYSA-N, MK0686, Navarixin, Nefazodone, Pantoprazole, Pavinetant, Proxazole, SCYX-7158, Siccanin, Sul-faguanole, Sunitinib, Suvorexant, Tiapride, Tonabersat, VNBRGSXVFBYQNN-UHFFFAOYSA-N, YUHNXUAATAMVKD-PZJWPPBQSA-N, Ulimorelin, Xipamide, Tropesin, Triclabendazole, Triclabendazoleスルホキシド, Triclabendazoleスルホン及びTrametinibから選択される、態様１～１３、１６、１８～２１、２５～２９又は３１～３７のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0454】

４１．ＤＮＡ、ＲＮＡ又はインビトロで転写されたＲＮＡから選択される、態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。

【0455】

４２．ＤＮＡ、ＲＮＡ又はインビトロで転写されたＲＮＡから選択される、態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子のキット。

【0456】

４３．前記核酸分子が、ベクター中に存在し、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡとして感染性ウイルス粒子中に格納されている、態様４２に記載の核酸分子のキット。

【0457】

４４．前記核酸配列が、リンパ球中での強力で安定な組換え発現を仲介する配列と連結され、ここでそのような配列は好ましくは、ガンマレトロウイルスの５´ＬＴＲ又はＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の５´ＬＴＲのサブエレメントＲ及びＵ３、又はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター又はより好ましくはヒト伸長因子１（ＥＦ－１）アルファプロモーターを含む、態様４１～４３のいずれか１項に記載の核酸分子又は核酸分子。

【0458】

４５．第一の核酸が前記群の第一のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含み、第二の核酸が前記群の第二のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含み、任意で前記キットが更に、ＣＡＲｓの群が３つ以上の異なるＣＡＲ分子からなる場合、前記群の第三のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸を含み、任意で前記キットが更に、ＣＡＲｓの群が４つ以上の異なるＣＡＲ分子からなる場合、前記群の第四のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む第四の核酸を含む、態様４２～４４のいずれか１項に記載の核酸分子のキット。

【0459】

４６．前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター又はキット。

【0460】

４７．前記ベクターが組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター又はトランスポゾンベクター、好ましくはSleeping Beautyトランスポゾンベクター又はPiggyBacトランスポゾンベクターであり、ベクターがレトロウイルスベクター、好ましくはガンマレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、態様４６に記載のベクター又はベクターのキット。

【0461】

４８．前記ベクターが発現ベクターであり、好ましくはヌクレオチド配列がリンパ球中での強力で安定な組換え発現を仲介する配列と操作可能に連結された発現ベクターであり、そのような配列が好ましくは、ガンマレトロウイルスの５´ＬＴＲ又はＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の５´ＬＴＲのサブエレメントＲ及びＵ３、又はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター又はより好ましくはヒト伸長因子１（ＥＦ－１）アルファプロモーターを含む、態様４６又は４７のいずれかに記載のベクター又はベクターのキット。

【0462】

４９．第一のベクターが前記群の第一のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含み、第二のベクターが前記群の第二のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含み、任意で前記キットが更に、ＣＡＲｓの群が３つ以上の異なるＣＡＲ分子からなる場合、前記群の第三のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む第三のベクターを含み、任意で前記キットが更に、ＣＡＲｓの群が４つ以上の異なるＣＡＲ分子からなる場合、前記群の第四のＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む第四のベクターを含む、態様４６～４８のいずれか１項に記載のベクターのキット。

【0463】

５０．態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群の個別のＣＡＲ分子を生産するように、態様４１～４５のいずれか１項に記載の核酸分子又は核酸分子のキットを用いて、又は態様４６～４９のいずれか１項に記載のベクター又はベクターのキットを用いて、インビトロ又はエクスビボで改変された細胞、又は当該改変された２つ以上の細胞を含むキット。

【0464】

５１．前記細胞が哺乳類細胞、好ましくは造血幹細胞（ＨＳＣ）、又はＨＳＣ由来の細胞、より好ましくはＮＫ細胞又はＴ細胞、特にＴ細胞である、態様５０に記載の細胞又は細胞のキット。

【0465】

５２．前記細胞が、態様４６～４９のいずれか１項のベクター又はベクターのキットを用いてトランスフェクション又は遺伝子導入された、態様５０又は５１のいずれかに記載の細胞又は細胞のキット。

【0466】

５３．前記細胞がゲノム中に態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群をコードするヌクレオチド配列を安定的に取り込んでいる、態様５０～５２のいずれか１項に記載の細胞又は細胞のキット。

【0467】

５４．前記細胞が、部位指向的ヌクレアーゼ技術を用いて、好ましくは甚句フィンガーヌクレアーゼ技術を用いて、又は尚もより好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を用いて、ゲノム中に態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群をコードするヌクレオチド配列を安定的に取り込んでいる、態様５０～５２のいずれか１項に記載の細胞又は細胞のキット。

【0468】

５５．態様４１～４５のいずれか１項に記載の核酸又は核酸のキット、態様４６～４９のいずれか１項に記載のベクター又はベクターのキット、又は態様５０～５２のいずれか１項に記載の細胞又は細胞のキットを含む、医薬調製品。

【0469】

５６．前記ウイルスベクターが好ましくは感染性ウイルス粒子中に含まれる、態様５５に記載の医薬調製品。

【0470】

５７．態様５０～５４のいずれか１項に記載の細胞を作製する方法であって、細胞内に、態様４１～４５のいずれか１項に記載の核酸分子又は核酸分子のキット、又は態様４６～４９のいずれか１項に記載のベクター又はベクターのキットを導入する、好ましくは当該細胞のゲノム内にインビトロ又はエクスビボで安定的に組み込むことを含む、方法。

【0471】

５８．癌を有する個体において癌を治療する方法に用いられる、態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群であって、以下の工程：
ｉ）個体から得られたＮＫ細胞または好ましくはＴリンパ球を、本発明によるＣＡＲの群のそれぞれのＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターで遺伝子改変し、ここでＣＡＲの群の各抗原結合部分は、個体の癌細胞上の標的抗原に特異的であり、そして前記遺伝子改変は、インビトロ又はエキソビボで行われ；
ii) 遺伝子組み換え細胞を個体に導入し；そして
iii) 群のそれぞれの ＣＡＲ 分子の二量体化を誘導又は低減するために、好ましくは、群のそれぞれの ＣＡＲ 分子の二量体化を誘導するために、少なくとも 1 つの調節分子の有効量を個体に投与することを含み、それにより、ＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導または低減し、好ましくはＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導し、それにより、ＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導または低減し、好ましくはＣＡＲの群の非共有複合体形成を誘導し、ここで、それぞれの標的抗原又は異なる標的抗原のそれぞれの共有又は非共有複合体を発現する癌細胞との接触に基づいて、ＣＡＲの非共有複合体群が、遺伝子組み換え細胞の活性化を仲介し、癌細胞を死滅させ、癌の治療を可能にする；
ＣＡＲｓの群。

【0472】

５９．個体における癌の治療方法に用いる態様５０～５４のいずれか１項に記載の細胞であって、ＣＡＲｓの群の各抗原結合部分が個体の癌細胞上の標的抗原に特異的であり、以下の工程：
i)個体に細胞を導入する工程；及び
ii)前記群の２つ、３つ又は４つのＣＡＲ分子、好ましくは前記群の３つのＣＡＲ分子、尚もより好ましくは前記群の４つのＣＡＲ分子を含む、非共有結合複合体の形成を誘導する又は減少する、好ましくは誘導する、１つ以上の制御分子を有効量で個体に投与する工程、ここで各標的抗原又は異なる標的抗原の各共有結合又は非共有結合複合体を発現する癌細胞と接触したＣＡＲｓの非共有結合複合群が、癌細胞の死滅を誘導する遺伝子改変細胞の活性化を誘導することにより癌の治療を可能とする；
を含む、細胞。

【0473】

６０．キットであって、以下：
－態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群、態様４６～４９のいずれか１項に記載のベクター又はベクターのキット、又は態様５０～５４のいずれか１項に記載の細胞又は細胞のキット；及び
－１つ、２つ又は３つの制御分子、好ましくは２つ、尚もより好ましくは１つの制御分子；
を含む、キット。

【0474】

６１．細胞上の標的抗原へのＴリンパ球又はＮＫ細胞の結合が必要であることを特徴とする疾患の治療において使用され、好ましくは腫瘍患者の治療、特に以下：
Ewing肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、造骨肉腫、中皮腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、平滑筋肉腫、黒色腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、網膜芽腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、慢性骨髄増殖性腫瘍、急性骨髄性白血病、B-細胞CLL、T-細胞CLLを含む慢性リンパ球性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病及び有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、B-細胞リンパ腫、Hodgkinリンパ腫、非Hodgkinリンパ腫、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、膀胱癌、気管支癌、結腸癌、結腸直腸癌、 胃癌、肺の小細胞癌及び非小細胞癌、肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、骨形成細胞癌、上皮癌、および鼻咽頭癌、非定型髄膜種、島細胞癌、髄様癌、間葉腫、肝細胞癌、肝芽腫、明細胞癌及び神経繊維腫縦隔、から選択される腫瘍を有する腫瘍患者の治療において使用される、態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群、態様４６～４９のいずれか１項に記載のベクター又はベクターのキット、態様５０～５４のいずれか１項に記載の細胞又は細胞のキット、特にＴリンパ球又はＮＫ細胞、又は態様４２～４９又は６０のいずれか１項に記載のキット。

【0475】

６２．Ｔリンパ球又はＮＫ細胞の活性を調節する方法であって、以下：
インビボ又はエクスビボで、１つ以上の制御分子の存在下、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞を、細胞又は固相表面上の、標的抗原、又は異なる標的抗原の非共有結合又は共有結合複合体と接触させる工程、ここで、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞は、態様１～４０、６４又は６５のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群を生産するように遺伝子改変されており、制御分子の存在が、非共有結合的に複合したＣＡＲｓの群の形成を誘導する又は減少する、好ましくは誘導することにより、遺伝子改変された細胞の１つ以上の活性を調節する；
を含む、方法。

【0476】

６３．遺伝子改変された細胞の活性が、増殖、細胞生存、アポトーシス、遺伝子発現、又は免疫活性化である、態様６２に記載の方法。

【0477】

６４．前記ＣＡＲｓの群の非共有結合複合体形成が、有効濃度の１つ以上の制御分子の存在下で誘導され、ＮＫ細胞又は好ましくはＴリンパ球中で発現したとき、ＣＡＲｓの群が、その非共有結合複合体状態で、標的抗原を発現する標的細胞と接触した宿主細胞において反応を引き起こし、この反応が、インターフェロンガンマ、及び／又はマクロファージ炎症性タンパク質‐1（ＭＩＰ－１）アルファ、及び／又はＭＩＰ－１ベータ、及び／又はグランザイムＢ、及び／又はＩＬ－２、及び／又はＴＮＦ、及び／又はＩＬ－１０及び／又はＩＬ－４の放出により、及び／又は細胞の脱顆粒によって定義され、ここで、細胞の脱顆粒が、好ましくは、ＣＡＲｓの群により認識される各標的抗原を１００，０００分子以上発現する標的細胞と接触した後のＣＤ１０７ａ陽性エフェクター細胞のパーセンテージによって検出され、ＣＡＲｓの群の非共有結合複合体形成を誘導するのに必要な全ての制御分子の有効量の存在下で引き起こされる応答が、いずれかの制御分子の不在下で引き起こされる応答よりも２０％以上高く、好ましくは５０％以上高く、及び尚もより好ましくは１００％以上高く、それぞれ必要な制御分子の有効濃度が、治療を必要とする個体に１回以上の用量で有効量の各制御分子を投与することによって達成される濃度である、態様１～４０のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【0478】

６５．前記ＣＡＲｓの群の非共有結合複合体形成が、有効濃度の１つ以上の制御分子の存在下で減少され、ＮＫ細胞又は好ましくはＴリンパ球中で発現したとき、ＣＡＲｓの群が、その非共有結合複合体状態で、標的抗原を発現する標的細胞と接触した宿主細胞において反応を引き起こし、この反応が、インターフェロンガンマ、及び／又はマクロファージ炎症性タンパク質‐1（ＭＩＰ－１）アルファ、及び／又はＭＩＰ－１ベータ、及び／又はグランザイムＢ、及び／又はＩＬ－２、及び／又はＴＮＦ、及び／又はＩＬ－１０及び／又はＩＬ－４の放出により、及び／又は細胞の脱顆粒によって定義され、ここで、細胞の脱顆粒が、好ましくは、いずれかの制御分子の不在下で引き起こされるＣＡＲｓの群により引き起こされる応答が、ＣＡＲｓの群により認識される各標的抗原を１００，０００分子以上発現する標的細胞と接触した後のＣＤ１０７ａ陽性エフェクター細胞のパーセンテージによって検出され、ＣＡＲｓの群に含まれる二量体化ドメインの二量体化を減少するのに必要な各制御分子の有効量の存在下でＣＡＲｓの群により引き起こされる引き起こされる応答よりも２０％以上高く、好ましくは５０％以上高く、及び尚もより好ましくは１００％以上高く、それぞれ必要な制御分子の有効濃度が、治療を必要とする個体に１回以上の用量で有効量の各制御分子を投与することによって達成される濃度である、態様１～１１又は１３～４０のいずれか１項に記載のＣＡＲｓの群。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図14-5】

【図14-6】

【図14-7】

【図14-8】

【図14-9】

【図14-10】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【図15-5】

【図15-6】

【図15-7】

【図15-8】

【図15-9】

【図15-10】

【図15-11】

【図15-12】

【配列表】

2022512594000001.app

【国際調査報告】