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特表2022-512602活性成分としてＴＳＰ１タンパク質インヒビターを含有する、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】活性成分としてＴＳＰ１タンパク質インヒビターを含有する、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20220131BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220131BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 31/4439 20060101ALI20220131BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20220131BHJP
A23L 33/13 20160101ALI20220131BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220131BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220131BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220131BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220131BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20220131BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20220131BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P43/00 111
A61K31/713
A61K48/00
A61K31/4439
A61P43/00 105
A61P43/00 121
A23L33/17
A23L33/13
C12Q1/02
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/53 D
C12N15/12
C12N15/113 140Z
C07K16/28
C12N15/115 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021518582
(86)(22)【出願日】2019-08-30
(85)【翻訳文提出日】2021-06-02
(86)【国際出願番号】 KR2019011199
(87)【国際公開番号】W WO2020071641
(87)【国際公開日】2020-04-09
(31)【優先権主張番号】10-2018-0118430
(32)【優先日】2018-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515238703
【氏名又は名称】コリア アドヴァンスド インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】ハン，ヨンマン
(72)【発明者】
【氏名】ド，ヒョサン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B018
4B063
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045AA40
2G045CB01
2G045DA36
2G045FA36
2G045FA37
2G045FB03
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD20
4B018MD44
4B018ME14
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS33
4B063QS35
4B063QX02
4C084AA17
4C084AA19
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4C084NA14
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC17
4C086EA16
4C086GA02
4C086GA07
4C086GA08
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZC41
4C086ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、活性成分としてＴＳＰ１タンパク質インヒビターを含有する、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物に関する。具体的には、本発明の、ファブリー病患者に由来する人工多能性幹細胞においてＴＳＰ１遺伝子をノックアウトすることにより生産した血管内皮細胞において、細胞形態の回復、ＴＳＰ１遺伝子の発現の減少、抗血管新生因子である、ＴＳＰ１タンパク質およびリン酸化ＳＭＡＤタンパク質の発現レベルの減少、および血管新生因子である、ＫＤＲタンパク質およびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルの増大が確認され、よって、ＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ファブリー病の処置において有効的に使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
活性成分としてＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項2】
ＴＳＰ１遺伝子が、配列番号１により表されるヌクレオチド配列から構成されるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項3】
ＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターが、ＴＳＰ１遺伝子を構成するポリヌクレオチドに対する、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択される、いずれか１以上を含む、請求項１に記載のファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項4】
ＴＳＰ１タンパク質が、配列番号２により表されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチドである、請求項１に記載のファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項5】
ＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターが、ＴＳＰ１タンパク質を構成するポリペプチドに相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣物、マトリックス類似体、アプタマー、および抗体からなる群から選択されるいずれか１以上を含む、請求項１に記載のファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項6】
活性成分として、ＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品。
【請求項7】
ファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ：１）ＴＳＰ１タンパク質を発現する細胞株に試験材料を処置すること；
２）細胞株におけるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した発現レベルを有する試験材料を選択すること
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項8】
ステップ１）の試験材料が、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、活性化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物エキス、動物組織抽出物および血漿からなる群から選択される１以上の物質である、請求項７に記載のファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法。
【請求項9】
ステップ２）のタンパク質発現レベルが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、サンドイッチ酵素免疫アッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈殿、免疫組織化学、蛍光免疫アッセイおよびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）からなる群から選択されるいずれか１以上の方法により測定される、請求項７に記載のファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法。
【請求項10】
ファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ：１）ＴＳＰ１タンパク質に試験材料を処置すること；
２）ＴＳＰ１タンパク質の活性レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した活性レベルを有する試験材料を選択すること
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項11】
ステップ２）のタンパク質活性レベルが、酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析およびタンパク質チップからなる群から選択されるいずれか１以上の方法により測定される、請求項１０に記載のファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法。
【請求項12】
ファブリー病の診断に必要な情報を提供するためのタンパク質検出方法であって、以下のステップ：１）対象に由来する試料中のＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
２）ファブリー病を発症するリスクのある対象として、対照群と比較してＴＳＰ１タンパク質の増大した発現レベルを有する対象を決定すること
を含む、前記タンパク質検出方法。
【請求項13】
活性成分としてＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項14】
ＳＢ－４３１５４２が、以下の式１：【化1】
により表される化合物である、請求項１３に記載のファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項15】
ＳＢ－４３１５４２が、ファブリー病を有する患者の血管内皮細胞中のＴＳＰ１タンパク質の発現を低減させる、請求項１３に記載のファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項16】
ＳＢ－４３１５４２が、ファブリー病を有する患者の血管内皮細胞中のＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）およびｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素合成酵素）タンパク質の発現を増大させる、請求項１３に記載のファブリー病を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項17】
活性成分として、ＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品。
【請求項18】
ＳＢ－４３１５４２が、ファブリー病を有する患者の血管内皮細胞中の、ＴＳＰ１タンパク質の発現を低減させる、およびＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現を増大させる、請求項１７に記載のファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の背景
１．本発明の分野
本発明は、活性成分としてＴＳＰ１タンパク質インヒビターを含有する、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物に関する。
１．本発明の分野
本発明は、活性成分としてＴＳＰ１タンパク質インヒビターを含有する、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
２．関連技術の説明
ファブリー病は、α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子であるＧＬＡにおける突然変異によって引き起こされるＸ遺伝子に関連する劣性遺伝性疾患である。ＧＬＡ遺伝子は、ヒトにおいては第７エクソンのｘｑ２２．１位置に存在する遺伝子であり、合計４２９個のアミノ酸から構成される前駆体タンパク質からプロセシングされた３７０個のアミノ酸から構成される糖タンパク質をコードする（Schiffmann, R. Pharmacology & therapeutics 122, 65-77 (2009)）。
現在までに、ＧＬＡ遺伝子に現れることが知られている４００個超の突然変異部位が報告されており（http://www.hgmd.cf.ac.uk）、ファブリー病の症状の重症度は、ＧＬＡ遺伝子の突然変異位置に応じて異なる。アルファ－ガラクトシダーゼの活性を、ほとんどの突然変異では全く示さないが、いくつかのミスセンス突然変異により、５～１０％の残余酵素活性を示す。これらの突然変異を有する患者は、臨床的に重要な病態生理を示さない（Clarke, J. T. Annals of internal medicine 146, 425-433 (2007)）。
ファブリー病は、α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子であるＧＬＡにおける突然変異によって引き起こされるＸ遺伝子に関連する劣性遺伝性疾患である。ＧＬＡ遺伝子は、ヒトにおいては第７エクソンのｘｑ２２．１位置に存在する遺伝子であり、合計４２９個のアミノ酸から構成される前駆体タンパク質からプロセシングされた３７０個のアミノ酸から構成される糖タンパク質をコードする（Schiffmann, R. Pharmacology & therapeutics 122, 65-77 (2009)）。
現在までに、ＧＬＡ遺伝子に現れることが知られている４００個超の突然変異部位が報告されており（http://www.hgmd.cf.ac.uk）、ファブリー病の症状の重症度は、ＧＬＡ遺伝子の突然変異位置に応じて異なる。アルファ－ガラクトシダーゼの活性を、ほとんどの突然変異では全く示さないが、いくつかのミスセンス突然変異により、５～１０％の残余酵素活性を示す。これらの突然変異を有する患者は、臨床的に重要な病態生理を示さない（Clarke, J. T. Annals of internal medicine 146, 425-433 (2007)）。
【0003】
ファブリー病はまた、リソソーム酵素の欠損を示す。この酵素欠損は、バーキットリンパ腫細胞において志賀毒素受容体として作用する中性スフィンゴ糖脂質であるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３、ＣＤ７７）の過剰な蓄積に起因することが知られている（Nudelman, E. et al. Science New York, N.Y 220, 509-511 (1983)）。Ｇｂ３の蓄積は、ファブリー病を有する患者において、血管細胞、心細胞、腎臓上皮細胞、または神経細胞などの様々な細胞に現れる。とりわけ、血管細胞におけるＧｂ３の蓄積は、脳卒中または心筋梗塞などの全身性の心臓血管機能障害を引き起こす。
【0004】
過去、ファブリー病は、１１７，０００人の男性に１人が発症すると報告されていた（Meikle, P. J. et al. Jama 281, 249-254 (1999)）。しかしながら、近年、発生頻度が急速に上昇し、３，１００～３，７００人の男性の子供（male children）の１人が発症すると報告されている（Spada, M. et al. American journal of human genetics 79, 31-40 (2006)）。
【0005】
ファブリー病を処置する唯一の方法として、反復酵素補充療法が用いられている。具体的には、アルファ－ガラクトシダーゼとして、ファブラザイム（アガルシダーゼ ベータ）（Eng, C.M. et al. The New England journal of medicine 345, 9-16 (2001)）またはリプレガル（アガルシダーゼ アルファ）（Schiffmann, R. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 365-370 (2000)）を投与することにより、ファブリー病を有する患者の様々な細胞種に蓄積されたＧｂ３を除去する。静脈内注射により投与された酵素は、原形質膜上のマンノース６－ホスファート（Ｍ６Ｐ）受容体を介して細胞内に入り、リソソームに移動する。このような治療用酵素の投与は、ファブリー病の処置において中心的な役割を果たす。しかしながら、ファブラザイムまたはリプレガルなどの組換え酵素は血液中で不安定であり、反復投与によりアレルギー反応が誘導され得る可能性がある（Eng, C. M. et al. The New England journal of medicine 345, 9-16 (2001); Schiffmann, R. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 365-370 (2000); Sakuraba, H. et al. Journal of human genetics 51, 180-188 (2006)）。
【0006】
ファブリー病の研究や治療剤の開発のためには、マウスにおいてＧＬＡのノックアウトを誘導した後、内皮機能障害におけるＧｂ３の蓄積の役割を研究することが一般的である。ＧＬＡノックアウトマウスモデルにおいて、大動脈内皮細胞のカベオラにおいてＧｂ３の異常な蓄積が観察された（Shu, L. & Shayman, J. A. The Journal of biological chemistry 282, 20960-20967 (2007)）。このようなＧｂ３の異常な蓄積は、ＧＬＡノックアウト内皮細胞においてカルシウムチャネル機能の減少を引き起こし得ることが報告されている（Park, S. et al. Cardiovascular research 89, 290-299 (2010)）。それにもかかわらず、ＧＬＡノックアウトマウスにおけるＧｂ３の蓄積の程度はファブリー病患者のそれとはやや異なるため、ＧＬＡノックアウトマウスモデルは、ファブリー病患者において誘導される様々な合併症を再現できないという点で限界を有する（Taguchi, Maruyama et al, Biochemical Journal 456, 373-383 (2013)）。
【0007】
他方、幹細胞は、組織を構成する各細胞に分化する前の段階の細胞であり、胚、胎児および成人の各組織から得ることができる。そして、幹細胞とは、未分化な状態で無限に増殖することができる自己増殖能と、特定の分化刺激によって様々な組織の細胞に分化する潜在能力である多能性を有する細胞を指す。幹細胞は、分化（環境）の刺激によって特定の細胞に分化し、細胞分裂が停止している分化細胞とは異なり、それらは細胞分裂によってそれら自身と同一の細胞を生産することができ（自己再生）、よって増殖（拡大）特徴を有する。幹細胞は、異なる環境または分化刺激によって他の細胞に分化することもでき、よって分化の柔軟性を有する。
【0008】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含むヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、様々な種類の細胞種に分化することができる。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、in vitroで分化させることができ、免疫拒絶を伴うことなく疾患を処置するために、または疾患の初期メカニズムの理解および評価の手段として使用することができる（Muotri, A. R. Epilepsy Behav 14 Suppl 1: 81-85 (2009); Marchetto, M. C., B. Winner, et al. Hum Mol Genet 19(R1): R71-76 (2010)）。
【0009】
様々な遺伝性疾患を有する患者に由来するｉＰＳＣを、疾患に関連する細胞種に直接分化させると、それらは疾患特異的な表現型を示す（Park, I. H. et al. Cell 134, 877-886 (2008); Tiscornia, G. et al. Nature medicine 17, 1570-1576 (2011)）。これらの疾患特異的なｉＰＳＣは、疾患に関連する細胞種に分化させることができ、よって疾患の特定のメカニズムの確認や治療剤のスクリーニングに有効に使用することができる。
【0010】
よって、本発明者らは、ファブリー病のための治療剤として使用されているファブラザイムの問題を認識し、その問題を克服することができる患者特異的な治療剤の開発を試みた。その一方で、本発明者らは、ｉＰＳＣを使用してファブリー病を研究するための幹細胞モデルを確立し、ＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）タンパク質がファブリー病の血管障害の原因であることを同定した。加えて、本発明者らは、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞の細胞形態の回復、ＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）遺伝子の発現の減少、抗血管新生因子である、ＴＳＰ１タンパク質およびリン酸化ＳＭＡＤタンパク質の発現レベルの減少、血管新生因子である、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）タンパク質およびｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素合成酵素）タンパク質の発現レベルの増大を確認することにより、本発明を完成させた。
【発明の概要】
【0011】
本発明の概要
本発明の目的は、ファブリー病を予防または処置するための、ＴＳＰ１タンパク質インヒビターの使用を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明は、活性成分としてＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
本発明はまた、活性成分としてＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品を提供する。
本発明の目的は、ファブリー病を予防または処置するための、ＴＳＰ１タンパク質インヒビターの使用を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明は、活性成分としてＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
本発明はまた、活性成分としてＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品を提供する。
【0012】
本発明はまた、ファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
１）ＴＳＰ１タンパク質を発現する細胞株に試験材料を処置すること；
２）細胞株におけるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した発現レベルを有する試験材料を選択すること
を含む、前記スクリーニング方法を提供する。
本発明はまた、ファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
１）ＴＳＰ１タンパク質に試験材料を処置すること；
２）ＴＳＰ１タンパク質の活性レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した活性レベルを有する試験材料を選択すること
を含む、前記スクリーニング方法を提供する。
１）ＴＳＰ１タンパク質を発現する細胞株に試験材料を処置すること；
２）細胞株におけるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した発現レベルを有する試験材料を選択すること
を含む、前記スクリーニング方法を提供する。
本発明はまた、ファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
１）ＴＳＰ１タンパク質に試験材料を処置すること；
２）ＴＳＰ１タンパク質の活性レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した活性レベルを有する試験材料を選択すること
を含む、前記スクリーニング方法を提供する。
【0013】
本発明はまた、ファブリー病の診断に必要な情報を提供するためのタンパク質検出方法であって、以下のステップ：
１）対象に由来する試料中のＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
２）ファブリー病を発症するリスクのある対象として、対照群と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の増大した発現レベルを有する対象を決定すること
を含む、前記タンパク質検出方法を提供する。
本発明はまた、活性成分としてＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
加えて、本発明は、活性成分として、ＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品を提供する。
１）対象に由来する試料中のＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
２）ファブリー病を発症するリスクのある対象として、対照群と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の増大した発現レベルを有する対象を決定すること
を含む、前記タンパク質検出方法を提供する。
本発明はまた、活性成分としてＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
加えて、本発明は、活性成分として、ＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品を提供する。
【発明の効果】
【0014】
有利な効果
本発明の、ファブリー病患者に由来する人工多能性幹細胞中のＴＳＰ１遺伝子をノックアウトすることにより生産される血管内皮細胞において、細胞形態の回復、ＴＳＰ１遺伝子の発現の減少、抗血管新生因子である、ＴＳＰ１タンパク質およびリン酸化ＳＭＡＤタンパク質の発現レベルの減少、および血管新生因子である、ＫＤＲタンパク質およびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルの増大が確認されており、よってＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ファブリー病の処置において有効に使用され得る。
本発明の、ファブリー病患者に由来する人工多能性幹細胞中のＴＳＰ１遺伝子をノックアウトすることにより生産される血管内皮細胞において、細胞形態の回復、ＴＳＰ１遺伝子の発現の減少、抗血管新生因子である、ＴＳＰ１タンパク質およびリン酸化ＳＭＡＤタンパク質の発現レベルの減少、および血管新生因子である、ＫＤＲタンパク質およびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルの増大が確認されており、よってＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ファブリー病の処置において有効に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0015】
図面の簡単な説明
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【図21b-d】図２１ｂは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃１）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２の処置による細胞形態変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）。 図２１ｃは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃２）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２の処置による細胞形態変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）。 図２１ｄは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃３）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２の処置による細胞形態変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）。
【0023】
【図21e】図２１ｅは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃４）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２の処置による細胞形態変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）。
【0024】
【図23b-d】図２３ｂは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃１）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２の処置による管形成変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）。 図２３ｃは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃２）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２の処置による管形成変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）。 図２３ｄは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃３）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２の処置による管形成変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）。
【0025】
【図24a】図２４ａは、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃１）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＳＢ４３１５４２またはロサルタンの処置による細胞形態変化を確認する図表である（ＦＺ：ファブラザイム、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２、Ｌｏｓ：ロサルタン）。
【0026】
【0027】
【0028】
【図33】図３３は、配列決定法により、ファブリー病を有する患者（Ｆａｂ＃１）に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから調製したＴＳＰ１遺伝子ノックアウト細胞株におけるＴＳＰ１遺伝子のノックアウトを確認する図表である。
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
好ましい態様の説明
以下、本発明は、詳細に説明される。
本発明は、活性成分としてＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または処置するための、医薬組成物を提供する。
ＴＳＰ１遺伝子は、当該技術分野において知られているいずれかの配列から構成されるすべてのポリヌクレオチドを含み得、活性を低減させない、１以上の置換、挿入、欠失、およびそれらの組み合わせを有するバリアントを含み得る。バリアントは、本発明のＴＳＰ１遺伝子配列と８０％、９０％、９５％、９８％以上の相同性を有し得る。本発明の態様において、ＴＳＰ１遺伝子は、配列番号１により表されるヌクレオチド配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。ＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターは、ＴＳＰ１タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡを抑制する限り、当該技術分野において知られているいずれかの材料を含むことができ、化学合成またはin vitro転写合成などの様々な方法によって調製され得る。発現インヒビターは、ＴＳＰ１遺伝子を構成するポリヌクレオチドに相補的に結合する、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択される、いずれか１以上を含み得る。
以下、本発明は、詳細に説明される。
本発明は、活性成分としてＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または処置するための、医薬組成物を提供する。
ＴＳＰ１遺伝子は、当該技術分野において知られているいずれかの配列から構成されるすべてのポリヌクレオチドを含み得、活性を低減させない、１以上の置換、挿入、欠失、およびそれらの組み合わせを有するバリアントを含み得る。バリアントは、本発明のＴＳＰ１遺伝子配列と８０％、９０％、９５％、９８％以上の相同性を有し得る。本発明の態様において、ＴＳＰ１遺伝子は、配列番号１により表されるヌクレオチド配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。ＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターは、ＴＳＰ１タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡを抑制する限り、当該技術分野において知られているいずれかの材料を含むことができ、化学合成またはin vitro転写合成などの様々な方法によって調製され得る。発現インヒビターは、ＴＳＰ１遺伝子を構成するポリヌクレオチドに相補的に結合する、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択される、いずれか１以上を含み得る。
【0031】
ワトソン・クリック塩基対で定義されるアンチセンスヌクレオチドとは、ＤＮＡ、未成熟なｍＲＮＡまたは成熟したｍＲＮＡの相補的なヌクレオチド配列に結合（ハイブリダイズ）することにより、ＤＮＡからタンパク質への遺伝情報の流れを妨げる配列を指す。加えて、アンチセンスヌクレオチドはモノマー単位の長鎖であるため、標的ＲＮＡ配列に対するアンチセンスヌクレオチドは容易に合成することができる。
【0032】
前記ｓｉＲＮＡとは、特定のｍＲＮＡの切断を介してＲＮＡ干渉を誘導することができる短い二本鎖ＲＮＡを指す。加えて、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが完全に対をなす領域に限定されるものではなく、ミスマッチ（対応するヌクレオチドは相補的でない）やバルジ（一方の鎖に対応するヌクレオチドがない）に起因する、鎖が対をなさない領域を含み得る。ｓｉＲＮＡの末端構造は、標的遺伝子の発現がＲＮＡ干渉効果により抑制され得る限り、平滑末端または突出末端のいずれかを有していてもよく、接着性の末端構造は、３’末端突出構造や５’末端突出構造の両方であり得る。
【0033】
前記ｓｈＲＮＡとは、強力なヘアピンターンを作るＲＮＡの配列を指し、これを、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子の発現をサイレンシングするために使用することができる。加えて、細胞導入のためのベクターを使用してｓｈＲＮＡは細胞へ送達され得、かかるベクターは常に娘細胞へ送達され、遺伝子サイレンシングは継承され得る。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞内メカニズムによりｓｉＲＮＡに分解され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に結合し、複合体がｓｉＲＮＡに対応するｍＲＮＡに結合してそれを分解する。
【0034】
前記リボザイムとは、特異的なＲＮＡ切断を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子を指す。リボザイムの分子配列と相補的な標的ＲＮＡとの特異的なハイブリダイゼーションにより、エンドヌクレアーゼ的（endonucleolytic）切断を誘導することができる。リボザイムは、標的ＲＮＡに相補的な１以上の配列の切断を担う既知の配列、または機能的に等価な配列を含むことができる。加えて、リボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムまたはセッシュ（Cech）型リボザイム、エンドリボヌクレアーゼＲＮＡであり得、安全性と標的化を向上させるために、修飾されたオリゴヌクレオチドによって形成され得る。その一方で、リボザイムは、in vivoで標的遺伝子を発現する細胞へ分配され得る。トランスフェクトされた細胞が内因性の標的メッセンジャーを破壊し、翻訳を阻害するのに充分な量のリボザイムを産生できるように、強力な構成的ポリメラーゼＩＩＩまたはポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下でリボザイムをコードするＤＮＡコン構築物が使用され得る。リボザイムは触媒活性を有するので、他のアンチセンス分子とは異なり、細胞内で低濃度に維持される必要があるかもしれない。
【0035】
前記ＴＳＰ１タンパク質は、当該技術分野で知られている、いずれかの配列から構成されるポリペプチドを含み得る。ポリペプチドは、タンパク質の機能に影響を与えない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換またはそれらの組み合わせにより異なる配列を有するアミノ酸のバリアントであり得る。全体として分子の活性を変化させないタンパク質やペプチドのアミノ酸交換は当該技術分野において知られている。いくつかのケースにおいて、それは、リン酸化、硫酸化、アクリラート化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化などにより修飾され得る。バリアントは、本発明のＴＳＰ１タンパク質と少なくとも８０％、９０％、または９５％の相同性を有し得る。本発明の態様において、ＴＳＰ１タンパク質は、配列番号２により表されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチドであり得る。
【0036】
ＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ＴＳＰ１タンパク質を構成するポリペプチドに相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣物、マトリックス類似体、アプタマー、および抗体からなる群から選択されるいずれか１以上を含み得る。
【0037】
ペプチドおよびペプチド模倣物は、ＴＳＰ１タンパク質の他のタンパク質に対する結合を抑制することによりＴＳＰ１タンパク質活性を阻害し得る。ペプチド模倣物は、ペプチドまたは非ペプチドであり得、psi結合などの非ペプチド結合により結合するアミノ酸から構成され得る。非加水分解性ペプチド模倣物は、β－ターンジペプチドコア、ケト－メチレン偽ペプチド、アゼピン、ベンゾジアゼピン、β－アミノアルコールまたは主残基としての置換ガンマラクタム環を使用して調製され得る。
【0038】
前記アプタマーとは、それ自体により安定した３次構造を有し、高い親和性と特異性で標的分子に結合することができる一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾された核酸）を指す。アプタマーは、有機物、ペプチド、膜タンパク質などと結合し、その機能を遮断することができるため、単一の抗体に代わる一種の化学抗体とみなすことができる。加えて、アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統進化法）と呼ばれるオリゴヌクレオチドライブラリーを用いて、特定の化学分子や生体分子に高い親和性および選択性で結合するオリゴマーを分離することによって得られる。
【0039】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。特定のタンパク質に対する抗体は、タンパク質の配列が知られている場合、当該技術分野において周知である技法を使用して容易に調製することができる。具体的には、抗体は、ハイブリドーマ法やファージ抗体ライブラリー技術を使用して調製することができる。一般に、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、抗原タンパク質を注射した、マウスなどの免疫学的に適切な宿主動物から単離された免疫細胞と、がん細胞株とを融合させることにより調製することができる。これらの２つの群の細胞の融合は、ポリエチレングリコールまたは同種のものを使用して行い、抗体産生細胞は標準的な培養方法により増殖され得る。均一な細胞集団を限界希釈法を使用したサブクローニングにより得た後、抗原特異的な抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞は、in vitroまたはin vivoで大量培養することにより調製することができる。上記の方法により調製された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーなどの方法を使用して分離および精製することができる。
【0040】
ポリクローナル抗体は、バイオマーカータンパク質またはそのフラグメントを免疫原として外部の宿主に注射することによって調製され得る。外部宿主は、マウス、ラット、ヒツジ、およびウサギなどの哺乳動物であり得る。免疫原が筋肉内、腹腔内、または皮下注射により注射される場合、それは、抗原性を増大させるためにアジュバントとともに投与され得る。その後、外部の宿主から定期的に血液を回収して、抗原に対する改善された力価と特異性を示す血清を得て、それから抗体は単離および精製され得る。
【0041】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、ファブリー病を有する患者の細胞を使用して人工多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）を調製し、幹細胞の特徴（図１および２）、ＧＬＡ活性の低下（図３）、およびリソソーム関連タンパク質の発現レベルの増大（図４および５）を確認した。本発明者らはまた、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞を調製し（図６および７）、血管内皮細胞の特徴（図８～１０）、ＧＬＡ活性の減少（図１１）、ＫＤＲタンパク質及びｅＮＯＳタンパク質の発現レベルの減少（図１２および１３）、およびＴＳＰ１タンパク質の発現レベルの増大（図１４～１６）を確認した。
【0042】
本発明者らはまた、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化させた血管内皮細胞において、Ｇｂ３タンパク質によって血管障害が誘導されること（図１７～２０）、ＴＧＦ－βインヒビターであるＳＢ４３１５４２が血管障害の処置において効果を有すること（図２１～２３）を確認した。しかしながら、別のＴＧＦ－βインヒビターであるロサルタンの治療効果は確認できなかった（図２４）。
【0043】
加えて、本発明者らは、ＦＢ－ｉＰＳＣのアイソタイプ対照細胞株（図２５～２７）とそれから分化した血管内皮細胞を調製し、ＧＬＡ活性（図２８）および血管障害（図２９～３１）の回復を確認した。本発明者らはまた、ＴＳＰ１遺伝子をノックアウトしたＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株を調製し（図３２および３３）、血管障害の回復を確認した（図３４～３７）。
したがって、本発明のＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ファブリー病の予防または処置に有効に使用され得る。
したがって、本発明のＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ファブリー病の予防または処置に有効に使用され得る。
【0044】
本発明の医薬組成物は、活性成分として、本発明のＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを組成物の総重量に対して１０～９５重量％の濃度で含有することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、活性成分に加えて、活性成分と同じまたは同様の機能を有する１以上の有効成分を含有することができる。
【0045】
本発明の医薬組成物は、担体、希釈剤、賦形剤、または生物学的調製物に一般的に使用されるもののうち少なくとも２つの組み合わせを含有することができる。薬学的に許容し得る担体は、本発明の組成物を生体内で制限されることなく送達することができるいずれかの担体であり得る、生理食塩水、滅菌水、リンガー溶液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、麦芽デキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの構成成分の１以上を含む混合物などの、Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc．に記載されている化合物により例示される。必要ならば、酸化防止剤、緩衝剤、および静菌剤などの一般的な添加剤をさらに加えることができる。
【0046】
組成物を製剤化する場合、それは一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤および界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。
本発明の組成物は、経口製剤または非経口製剤として製剤化され得る。経口投与用のための固形製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒、およびカプセルである。これらの固形製剤は、１以上の組成物を、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、およびゼラチンなどの１以上の好適な賦形剤と混合することによって調製される。加えて、ステアリン酸マグネシウムやタルクなどの潤滑剤をそれに添加することができる。経口投与のための液体製剤は、懸濁液、溶液、エマルションまたはシロップであり、上記の製剤は、湿潤剤、甘味料、芳香剤および防腐剤などの様々な賦形剤を含有し得る。
本発明の組成物は、経口製剤または非経口製剤として製剤化され得る。経口投与用のための固形製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒、およびカプセルである。これらの固形製剤は、１以上の組成物を、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、およびゼラチンなどの１以上の好適な賦形剤と混合することによって調製される。加えて、ステアリン酸マグネシウムやタルクなどの潤滑剤をそれに添加することができる。経口投与のための液体製剤は、懸濁液、溶液、エマルションまたはシロップであり、上記の製剤は、湿潤剤、甘味料、芳香剤および防腐剤などの様々な賦形剤を含有し得る。
【0047】
非経口投与のための製剤は、滅菌水溶液、水不溶性賦形剤、懸濁液、およびエマルションである。水不溶性賦形剤や懸濁液は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチロレート（ethylolate）のような注射可能なエステルなどを含有し得る。
本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与することができ、非経口投与は、皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、および胸腔内注射からなる群から選択され得る。
本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与することができ、非経口投与は、皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、および胸腔内注射からなる群から選択され得る。
【0048】
組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。有効量は、疾患のタイプ、重症度、薬剤の活性、薬剤に対する患者の感受性、投与時間、投与ルート、処置の期間、同時に使用する薬剤などに応じて決定することができる。本発明の組成物は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与することができる。併用投与においては、投与は逐次的でまたは同時であり得る。しかしながら、所望される効果のために、本発明による医薬組成物に含まれる活性成分の量は、０．００１～１０，０００ｍｇ／ｋｇ、具体的に言うと０．１～５ｇ／ｋｇであり得る。投与頻度は、１日１回または１日数回であり得る。
【0049】
本発明はまた、活性成分としてＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターを含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品を提供する。
ＴＳＰ１遺伝子およびＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターは、上に記載のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＴＳＰ１遺伝子は、配列番号１により表されるヌクレオチド配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。加えて、発現インヒビターは、ＴＳＰ１遺伝子を構成するポリペプチドに相補的に結合する、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムからなる群から選択されるいずれか１以上を含み得る。
ＴＳＰ１遺伝子およびＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターは、上に記載のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＴＳＰ１遺伝子は、配列番号１により表されるヌクレオチド配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。加えて、発現インヒビターは、ＴＳＰ１遺伝子を構成するポリペプチドに相補的に結合する、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムからなる群から選択されるいずれか１以上を含み得る。
【0050】
ＴＳＰ１タンパク質およびＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、上に記載のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＴＳＰ１タンパク質は、配列番号２により表されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチドであり得る。加えて、活性インヒビターは、ＴＳＰ１タンパク質を構成するポリペプチドに相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣物、マトリックス類似体、アプタマー、および抗体からなる群から選択されるいずれか１以上を含み得る。
【0051】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、ファブリー病を有する患者の細胞を使用して人工多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）を調製し、幹細胞の特徴（図１および２）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）活性の低下（図３）、およびリソソーム関連タンパク質の発現レベルの増大（図４および５）を確認した。本発明者らはまた、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞を調製し（図６および７）、血管内皮細胞の特徴（図８～１０）、ＧＬＡ活性の減少（図１１）、ＫＤＲタンパク質及びｅＮＯＳタンパク質の発現レベルの減少（図１２および１３）、およびＴＳＰ１タンパク質の発現レベルの増大（図１４～１６）を確認した。
【0052】
本発明者らはまた、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化させた血管内皮細胞において、Ｇｂ３タンパク質によって血管障害が誘導されること（図１７～２０）、ＴＧＦ－βインヒビターであるＳＢ４３１５４２が血管障害の処置において効果を有すること（図２１～２３）を確認した。しかしながら、別のＴＧＦ－βインヒビターであるロサルタンの治療効果は確認できなかった（図２４）。
【0053】
加えて、本発明者らは、ＦＢ－ｉＰＳＣのアイソタイプ対照細胞株（図２５～２７）とそれから分化した血管内皮細胞を調製し、ＧＬＡ活性（図２８）および血管障害（図２９～３１）の回復を確認した。本発明者らはまた、ＴＳＰ１遺伝子をノックアウトしたＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株を調製し（図３２および３３）、血管障害の回復を確認した（図３４～３７）。
したがって、本発明のＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ファブリー病の予防または寛解に有効に使用され得る。
したがって、本発明のＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、ファブリー病の予防または寛解に有効に使用され得る。
【0054】
本発明のＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、食品添加剤として使用され得る。そのケースにおいて、本発明のＴＳＰ１遺伝子発現インヒビターまたはＴＳＰ１タンパク質活性インヒビターは、そのまま、または従来の方法による他の食品構成要素と混合されて、添加されてもよい。活性成分の量は、使用の目的に従って、調節され得る。一般に、本発明の活性成分は、好ましくは食品の総重量に対して、０．０１～９０重量部で健康機能性食品に添加される。
加えて、健康機能性食品の形態およびタイプについて具体的な限定はない。上記の物質が添加される健康機能性食品の形態は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液体および丸薬であり得る。
加えて、健康機能性食品の形態およびタイプについて具体的な限定はない。上記の物質が添加される健康機能性食品の形態は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液体および丸薬であり得る。
【0055】
本発明の健康機能性食品は、他の従来の健康食品のように、様々なフレーバーまたは天然の炭水化物などを追加的に含む。上記の天然の炭水化物は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトールおよびエリスリトールなどの糖アルコールのうちの１つであり得る。そのほかに、タウマチンおよびステビア抽出物などの天然の甘味剤、ならびにサッカリンおよびアスパルテームなどの合成甘味剤が、甘味剤として含まれ得る。
上に言及された成分に加えて、本発明の健康機能性食品は、様々な栄養素において、ビタミン、ミネラル、フレーバー、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド粘稠化剤、ｐＨ調節因子、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコールなどを含み得る。すべての言及した成分は、単独でまたは一緒に添加され得る。これらの成分の比率は、本発明の組成物の１００重量部に対して、０．０１～０．１重量部の範囲から選択され得る。
上に言及された成分に加えて、本発明の健康機能性食品は、様々な栄養素において、ビタミン、ミネラル、フレーバー、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド粘稠化剤、ｐＨ調節因子、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコールなどを含み得る。すべての言及した成分は、単独でまたは一緒に添加され得る。これらの成分の比率は、本発明の組成物の１００重量部に対して、０．０１～０．１重量部の範囲から選択され得る。
【0056】
本発明はまた、ＴＳＰ１タンパク質を使用する、ファブリー病のための候補治療剤のスクリーニング方法を提供する。
ＴＳＰ１タンパク質は、上記のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＴＳＰ１タンパク質は、配列番号２により表されるアミノ酸配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。
ＴＳＰ１タンパク質は、上記のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＴＳＰ１タンパク質は、配列番号２により表されるアミノ酸配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。
【0057】
具体的に言うと、方法は、以下のステップ：
１）ＴＳＰ１タンパク質を発現する細胞株に試験材料を処置すること；
２）細胞株におけるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した発現レベルを有する試験材料を選択すること
から構成され得る。
ステップ１）の試験材料は、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、活性化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物および血漿からなる群から選択される１以上の物質であり得る。
ステップ２）のタンパク質発現レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、サンドイッチ酵素免疫アッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈殿、免疫組織化学、蛍光免疫アッセイおよびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）からなる群から選択されるいずれか１以上の方法により測定され得る。
１）ＴＳＰ１タンパク質を発現する細胞株に試験材料を処置すること；
２）細胞株におけるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した発現レベルを有する試験材料を選択すること
から構成され得る。
ステップ１）の試験材料は、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、活性化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物および血漿からなる群から選択される１以上の物質であり得る。
ステップ２）のタンパク質発現レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、サンドイッチ酵素免疫アッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈殿、免疫組織化学、蛍光免疫アッセイおよびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）からなる群から選択されるいずれか１以上の方法により測定され得る。
【0058】
別の方法は、以下のステップ：
１）ＴＳＰ１タンパク質に試験材料を処置すること；
２）ＴＳＰ１タンパク質の活性レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した活性レベルを有する試験材料を選択すること
から構成され得る。
ステップ１）の試験材料は、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、活性化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物および血漿からなる群から選択される１以上の物質であり得る。
ステップ２）のタンパク質活性レベルが、酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析およびタンパク質チップからなる群から選択されるいずれか１以上の方法により測定され得る。
１）ＴＳＰ１タンパク質に試験材料を処置すること；
２）ＴＳＰ１タンパク質の活性レベルを測定すること；および
３）試験材料で処置していない対照と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の低減した活性レベルを有する試験材料を選択すること
から構成され得る。
ステップ１）の試験材料は、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、活性化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物および血漿からなる群から選択される１以上の物質であり得る。
ステップ２）のタンパク質活性レベルが、酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析およびタンパク質チップからなる群から選択されるいずれか１以上の方法により測定され得る。
【0059】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、ファブリー病を有する患者に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルの増大（図１４～１６）、およびＴＳＰ１遺伝子をノックアウトしたＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株から分化した血管内皮細胞における血管障害の回復（図３４～３７）を確認した。したがって、ＴＳＰ１タンパク質の発現または活性のレベルを測定する方法は、ファブリー病の候補治療剤をスクリーニングするために有効的に使用され得る。
【0060】
本発明はまた、ＴＳＰ１タンパク質を使用する、ファブリー病の診断に必要な情報を提供するためのタンパク質検出方法を提供する。
ＴＳＰ１タンパク質は、上記のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＴＳＰ１タンパク質は、配列番号２により表されるアミノ酸配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。
具体的に言うと、方法は、以下のステップ：
１）患者に由来する試料中のＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
２）ファブリー病を発症するリスクのある対象として、対照群と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の増大した発現レベルを有する対象を決定すること
から構成され得る。
ＴＳＰ１タンパク質は、上記のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＴＳＰ１タンパク質は、配列番号２により表されるアミノ酸配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。
具体的に言うと、方法は、以下のステップ：
１）患者に由来する試料中のＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを測定すること；および
２）ファブリー病を発症するリスクのある対象として、対照群と比較して、ＴＳＰ１タンパク質の増大した発現レベルを有する対象を決定すること
から構成され得る。
【0061】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、ファブリー病を有する患者に由来するＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルの増大（図１４～１６）、およびＴＳＰ１遺伝子をノックアウトしたＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株から分化した血管内皮細胞における血管障害の回復（図３４～３７）を確認した。したがって、ＴＳＰ１タンパク質の発現のレベルを測定する方法は、ファブリー病の診断に必要な情報を提供するために有効的に使用され得る。
【0062】
本発明はまた、活性成分としてＴＧＦ－βシグナリング経路インヒビターであるＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または処置するための、医薬組成物を提供する。
「ＴＧＦ（トランスフォーマミング成長因子）ベータシグナリング経路インヒビター」とは、ＴＧＦベータにより媒介されるシグナリングを阻害する物質を意味する。ＴＧＦベータは、in vivoにおいて、細胞増殖、分化、アポトーシス、遊走、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）産生、血管新生、および発生などの様々な生理学的なプロセスを調節するタンパク質である。
ＴＧＦベータシグナリング経路インヒビターは、ＳＢ－４３１５４２であり得るが、ＴＧＦシグナリングを阻害することができるいずれかの物質であれば、とくに限定することなく使用することができる。本発明において、ＳＢ４３１５４２が、ＴＧＦベータシグナリング経路インヒビターとして使用され、これは、以下の式１により表され得る。
「ＴＧＦ（トランスフォーマミング成長因子）ベータシグナリング経路インヒビター」とは、ＴＧＦベータにより媒介されるシグナリングを阻害する物質を意味する。ＴＧＦベータは、in vivoにおいて、細胞増殖、分化、アポトーシス、遊走、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）産生、血管新生、および発生などの様々な生理学的なプロセスを調節するタンパク質である。
ＴＧＦベータシグナリング経路インヒビターは、ＳＢ－４３１５４２であり得るが、ＴＧＦシグナリングを阻害することができるいずれかの物質であれば、とくに限定することなく使用することができる。本発明において、ＳＢ４３１５４２が、ＴＧＦベータシグナリング経路インヒビターとして使用され、これは、以下の式１により表され得る。
【化1】
【0063】
前記ＳＢ－４３１５４２は、ファブリー病を有する患者の血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現を低減させ、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）およびｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素合成酵素）タンパク質の発現を増大させることができる。
【0064】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、Ｇｂ３タンパク質によって、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞において、血管障害が誘導されたこと（図１７～２０）、およびＴＧＦ－βインヒビターであるＳＢ４３１５４２が血管障害の処置において効果を有すること（図２１～２３）を確認した。したがって、本発明のＳＢ－４３１５４２化合物は、ファブリー病の予防または処置のために有効的に使用することができる。
【0065】
医薬組成物は、上記のとおりの特徴を有し得る。
加えて、本発明は、活性成分としてＴＧＦ－βシグナリング経路インヒビターであるＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品を提供する。
ＴＧＦ－βシグナリング経路インヒビターまたはＳＢ－４３１５４２は、上記のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＳＢ－４３１５４２は、以下の式１の構造を有し得、ファブリー病を有する患者の血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現を低減させ得、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現を増大させ得る。
加えて、本発明は、活性成分としてＴＧＦ－βシグナリング経路インヒビターであるＳＢ－４３１５４２を含む、ファブリー病を予防または寛解するための健康機能性食品を提供する。
ＴＧＦ－βシグナリング経路インヒビターまたはＳＢ－４３１５４２は、上記のとおりの特徴を有し得る。例えば、ＳＢ－４３１５４２は、以下の式１の構造を有し得、ファブリー病を有する患者の血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現を低減させ得、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現を増大させ得る。
【化2】
【0066】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、Ｇｂ３タンパク質によって、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞において、血管障害が誘導されたこと（図１７～２０）、およびＴＧＦ－βインヒビターであるＳＢ４３１５４２が血管障害の処置において効果を有すること（図２１～２３）を確認した。したがって、本発明のＳＢ－４３１５４２化合物は、ファブリー病の予防または寛解のために有効的に使用することができる。
健康機能性食品は、上記のとおりの特徴を有し得る。
健康機能性食品は、上記のとおりの特徴を有し得る。
【0067】
以下、本発明を以下の例により詳細に説明する。
しかしながら、以下の例は本発明を説明するためのみのものであり、本発明の内容はこれに限定されるものではない。
しかしながら、以下の例は本発明を説明するためのみのものであり、本発明の内容はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【0068】
例１：ファブリー病を有する患者に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の調製
ファブリー病の研究について、線維芽細胞をファブリー病を有する患者から単離し、以下の様式でｉＰＳ細胞を誘導した。
具体的には、Asan Medical Center（Seoul、Korea）においてファブリー病を有する患者の同意を得て、患者を局所麻酔に供し、次いでパンチ生検を使用した皮膚組織生検を実施することにより皮膚組織を得た。ファブリー病を有する４人の患者の臨床情報を以下の表１に示す。すべての実験は、病院の施設内審査委員会の審査の下で実施した。
ファブリー病の研究について、線維芽細胞をファブリー病を有する患者から単離し、以下の様式でｉＰＳ細胞を誘導した。
具体的には、Asan Medical Center（Seoul、Korea）においてファブリー病を有する患者の同意を得て、患者を局所麻酔に供し、次いでパンチ生検を使用した皮膚組織生検を実施することにより皮膚組織を得た。ファブリー病を有する４人の患者の臨床情報を以下の表１に示す。すべての実験は、病院の施設内審査委員会の審査の下で実施した。
【0069】
【表1】
【0070】
得られた皮膚組織から線維芽細胞を単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンおよび１％非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ中で培養した。次いで、多能性マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ－ＭＹＣを発現するレトロウイルスの形質導入による異所性発現について当技術分野において知られている技法を使用して、線維芽細胞からＦＢ－ｉＰＳＣの発生を誘導した（Takahashi, K et al, Cell 131(5): 861-872, 2007）。細胞を３日間培養し、培養フィーダー細胞としてマウス胎児線維芽細胞を使用して継代培養し、２０％ＫＯＳＲ（ノックアウト血清置換）、５０ユニット／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で長期間培養した。その後、幹細胞のそれと同様の形態的特徴を有するコロニーを単離して、ＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株を構築した。
【0071】
実験例１：ファブリー病を有する患者に由来するｉＰＳＣの幹細胞特徴の確認
＜１－１＞ＦＢ－ＩＰＳＣの多能性の確認
未分化のＦＢ－ｉＰＳＣが多能性を示すかどうかを確認するために、免疫染色を使用してＦＢ－ｉＰＳＣにおける幹細胞性マーカーの発現を確認した。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣを、ホルムアルデヒド溶液を使用して固定し、それを０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処置して細胞膜を透過性にした。その後、処置した細胞をＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、４％の正常ロバ血清を添加し、これに続いて、室温にて１時間ブロッキングした。次いで、一次抗体として、抗ＯＣＴ４抗体（１：３００、R&D Systems, USA）、抗ＳＯＸ２抗体（BD Transduction Laboratories, USA）、抗ＮＡＮＯＧ抗体（１：３００、Cell Signaling Technology, USA）、抗ＳＳＥＡ－４抗体（１：３００、R&D Systems, USA）、抗ＴＲＡ－１－８１抗体（１：３００、Millipore, USA）または抗ＴＲＡ－１－６０抗体（１：３００、Millipore, USA）で処置し、４℃で反応させ、これに続きＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、Alexa Fluor488またはAlexaFluor 594抱合二次抗体（Invitrogen、USA）で処置し、室温にて１時間反応させ、これに続いて、ＰＢＳＴで６回洗浄した。この時、最後の洗浄時に核をＤＡＰＩ（４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）で蛍光染色した。次いで、染色されたＦＢ－ｉＰＳＣを蛍光顕微鏡（Olympus, Japan）またはZeiss LSM 510共焦点顕微鏡（Carl Zeiss, Germany）で観察することにより、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１、およびＴＲＡ－１－６０タンパク質の発現を確認した。
その結果、図１に示すように、幹細胞性マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ－１－８１およびＴｒａ－１－６０タンパク質がＦＢ－ｉＰＳＣにおいて正常細胞のレベルで発現していた。以上の結果から、ＦＢ－ｉＰＳＣは胚性幹細胞と同じ多能性を有することが確認された。
＜１－１＞ＦＢ－ＩＰＳＣの多能性の確認
未分化のＦＢ－ｉＰＳＣが多能性を示すかどうかを確認するために、免疫染色を使用してＦＢ－ｉＰＳＣにおける幹細胞性マーカーの発現を確認した。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣを、ホルムアルデヒド溶液を使用して固定し、それを０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処置して細胞膜を透過性にした。その後、処置した細胞をＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、４％の正常ロバ血清を添加し、これに続いて、室温にて１時間ブロッキングした。次いで、一次抗体として、抗ＯＣＴ４抗体（１：３００、R&D Systems, USA）、抗ＳＯＸ２抗体（BD Transduction Laboratories, USA）、抗ＮＡＮＯＧ抗体（１：３００、Cell Signaling Technology, USA）、抗ＳＳＥＡ－４抗体（１：３００、R&D Systems, USA）、抗ＴＲＡ－１－８１抗体（１：３００、Millipore, USA）または抗ＴＲＡ－１－６０抗体（１：３００、Millipore, USA）で処置し、４℃で反応させ、これに続きＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、Alexa Fluor488またはAlexaFluor 594抱合二次抗体（Invitrogen、USA）で処置し、室温にて１時間反応させ、これに続いて、ＰＢＳＴで６回洗浄した。この時、最後の洗浄時に核をＤＡＰＩ（４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）で蛍光染色した。次いで、染色されたＦＢ－ｉＰＳＣを蛍光顕微鏡（Olympus, Japan）またはZeiss LSM 510共焦点顕微鏡（Carl Zeiss, Germany）で観察することにより、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１、およびＴＲＡ－１－６０タンパク質の発現を確認した。
その結果、図１に示すように、幹細胞性マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ－１－８１およびＴｒａ－１－６０タンパク質がＦＢ－ｉＰＳＣにおいて正常細胞のレベルで発現していた。以上の結果から、ＦＢ－ｉＰＳＣは胚性幹細胞と同じ多能性を有することが確認された。
【0072】
＜１－２＞ＦＢ－ＩＰＳＣの核型の確認
例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣの核型分析をGenDix（Korea）に依頼し、例１で調製したＦＢ－ｉＰＳＣが正常な核型を有することが確認された。
図２に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣは、４６、ＸＹの正常な核型を有していた。
例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣの核型分析をGenDix（Korea）に依頼し、例１で調製したＦＢ－ｉＰＳＣが正常な核型を有することが確認された。
図２に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣは、４６、ＸＹの正常な核型を有していた。
【0073】
実験例２：ＦＢ－ｉＰＳＣにおけるアルファ－ガラクトシダーゼ（α－ガラクトシダーゼ、ＧＬＡ）の減少した活性の確認
ファブリー病を有する患者において、ＧＬＡ活性はゼロに近いはずであるので、ＦＢ－ｉＰＳＣのＧＬＡ活性を以下の方法で確認した。
具体的には、１００ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２００ｍＭリン酸ナトリウム二塩基性を含有する２００μｌのＧＬＡアッセイ緩衝液（ｐＨ４．６）を、例１で調製したＦＢ－ｉＰＳＣの細胞ペレットに添加し、これに続き、１秒粉砕、１秒休憩の合計１０秒のプログラムで超音波処理した。その後、細胞ライセートの上清を、４℃において１３００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により得た。次いで、３０μｌの２００ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡＣ）、６μｌの５０ｍＭ ４－ＭＵ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４ＭＵａＧａｌ）、１４μｌのＧＬＡアッセイ緩衝液、および１０μｌの得られた細胞ライセート上清を混合することにより、ＧＬＡ分析のための混合物を調製した。調製した混合物を９６ウェルプレートに添加し、これに続き３７℃で１時間インキュベートした。
培養が完了したら、２００ｍＭグリシン（ｐＨ１０．３２）を含有するＧＬＡ停止緩衝液を各ウェルに添加して反応を停止し、Victorプレートリーダー（Perkin Elmer、USA）を使用して、３５５および４６０ｎｍの波長で蛍光を確認した。
その結果、図３に示すように、正常な対照群とは異なり、ＧＬＡ活性はＦＢ－ｉＰＳＣにおいて示されなかった。
ファブリー病を有する患者において、ＧＬＡ活性はゼロに近いはずであるので、ＦＢ－ｉＰＳＣのＧＬＡ活性を以下の方法で確認した。
具体的には、１００ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２００ｍＭリン酸ナトリウム二塩基性を含有する２００μｌのＧＬＡアッセイ緩衝液（ｐＨ４．６）を、例１で調製したＦＢ－ｉＰＳＣの細胞ペレットに添加し、これに続き、１秒粉砕、１秒休憩の合計１０秒のプログラムで超音波処理した。その後、細胞ライセートの上清を、４℃において１３００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により得た。次いで、３０μｌの２００ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡＣ）、６μｌの５０ｍＭ ４－ＭＵ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４ＭＵａＧａｌ）、１４μｌのＧＬＡアッセイ緩衝液、および１０μｌの得られた細胞ライセート上清を混合することにより、ＧＬＡ分析のための混合物を調製した。調製した混合物を９６ウェルプレートに添加し、これに続き３７℃で１時間インキュベートした。
培養が完了したら、２００ｍＭグリシン（ｐＨ１０．３２）を含有するＧＬＡ停止緩衝液を各ウェルに添加して反応を停止し、Victorプレートリーダー（Perkin Elmer、USA）を使用して、３５５および４６０ｎｍの波長で蛍光を確認した。
その結果、図３に示すように、正常な対照群とは異なり、ＧＬＡ活性はＦＢ－ｉＰＳＣにおいて示されなかった。
【0074】
実験例３：ファブリー病を有する患者におけるリソソーム関連タンパク質発現レベルの確認
ファブリー病はリソソーム蓄積症に分類されるため、ＦＢ－ｉＰＳＣおよびファブリー病患者の試料の各々におけるリソソーム関連タンパク質の発現レベルを以下の方法により確認した。
＜３－１＞ＦＢ－ｉＰＳＣにおけるＬＣ３（オートファジー関連タンパク質軽鎖３）タンパク質発現レベルの確認
ＦＢ－ｉＰＳＣにおけるリソソーム関連タンパク質ＬＣ３の発現レベルを、ウエスタンブロッティングにより確認した。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣを、ファブリー病のための治療剤であるファブラザイムと飢餓培地との様々な組み合わせで処置した。Pro-Prep solution（Intron Biotechnology, Korea）を各試料に添加し、４℃で反応させ、これに続き１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を得た。得られた上清をアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、これに続き４％スキムミルクでブロッキングした。次いで、抗ＬＣ３抗体（１：１０００、Santacruz, USA）で処置し、４℃で２４時間反応させ、これに続きｔｗｅｅｎ－２０を含有するＴＢＳで３回洗浄した。タンパク質の発現レベルを、従来のウエスタンブロッティングによって確認した。各タンパク質の発現レベルを、対照としてＧＡＰＤＨを使用して補正した。
その結果、図４に示すように、ファブラザイム処置に関係なく、ＬＣ３タンパク質の発現レベルは正常細胞においてよりもＦＢ－ｉＰＳＣにおいて高かった。
ファブリー病はリソソーム蓄積症に分類されるため、ＦＢ－ｉＰＳＣおよびファブリー病患者の試料の各々におけるリソソーム関連タンパク質の発現レベルを以下の方法により確認した。
＜３－１＞ＦＢ－ｉＰＳＣにおけるＬＣ３（オートファジー関連タンパク質軽鎖３）タンパク質発現レベルの確認
ＦＢ－ｉＰＳＣにおけるリソソーム関連タンパク質ＬＣ３の発現レベルを、ウエスタンブロッティングにより確認した。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣを、ファブリー病のための治療剤であるファブラザイムと飢餓培地との様々な組み合わせで処置した。Pro-Prep solution（Intron Biotechnology, Korea）を各試料に添加し、４℃で反応させ、これに続き１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を得た。得られた上清をアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、これに続き４％スキムミルクでブロッキングした。次いで、抗ＬＣ３抗体（１：１０００、Santacruz, USA）で処置し、４℃で２４時間反応させ、これに続きｔｗｅｅｎ－２０を含有するＴＢＳで３回洗浄した。タンパク質の発現レベルを、従来のウエスタンブロッティングによって確認した。各タンパク質の発現レベルを、対照としてＧＡＰＤＨを使用して補正した。
その結果、図４に示すように、ファブラザイム処置に関係なく、ＬＣ３タンパク質の発現レベルは正常細胞においてよりもＦＢ－ｉＰＳＣにおいて高かった。
【0075】
＜３－２＞ファブリー病を有する患者の試料におけるＬＣ３、ベクリン１およびユビキチンタンパク質の発現レベルの確認
ファブリー病患者試料におけるリソソームシグナリングシステムに関連するＬＣ３、ベクリン１、およびユビキチンタンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロッティングによって確認した。
具体的には、血管内皮細胞を、例１のファブリー病を有する患者から得られた皮膚組織から単離し、ファブラザイムで処置した。次いで、ＬＣ３、ベクリン１およびユビキチンタンパク質の発現レベルを、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを実施することにより確認した。このとき、抗体として、抗ＬＣ３抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、および抗ベクリン１抗体（１：５００、Santacruz, SA）、および抗ユビキチン抗体（１：１０００、Santacruz, USA）を使用した。
その結果、図５に示すように、ＬＣ３、ベクリン１、ユビキチンタンパク質の発現レベルは、ファブラザイム処置に関係なく、正常細胞においてよりもファブリー病を有する患者の血管内皮細胞において高かった。
上記の結果から、ファブリー病を有する患者においてリソソームは正常に機能せず、治療剤であるファブラザイムの処置後でさえもリソソーム蓄積症の特徴は回復しなかったことが確認された。
ファブリー病患者試料におけるリソソームシグナリングシステムに関連するＬＣ３、ベクリン１、およびユビキチンタンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロッティングによって確認した。
具体的には、血管内皮細胞を、例１のファブリー病を有する患者から得られた皮膚組織から単離し、ファブラザイムで処置した。次いで、ＬＣ３、ベクリン１およびユビキチンタンパク質の発現レベルを、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを実施することにより確認した。このとき、抗体として、抗ＬＣ３抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、および抗ベクリン１抗体（１：５００、Santacruz, SA）、および抗ユビキチン抗体（１：１０００、Santacruz, USA）を使用した。
その結果、図５に示すように、ＬＣ３、ベクリン１、ユビキチンタンパク質の発現レベルは、ファブラザイム処置に関係なく、正常細胞においてよりもファブリー病を有する患者の血管内皮細胞において高かった。
上記の結果から、ファブリー病を有する患者においてリソソームは正常に機能せず、治療剤であるファブラザイムの処置後でさえもリソソーム蓄積症の特徴は回復しなかったことが確認された。
【0076】
例２：ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞の調製
ファブリー病を有する患者の血管障害を確認するために、血管内皮細胞を以下の方法に従って、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化させた（図６）。
具体的には、例１で調製したＦＢ－ｉＰＳＣを、フィーダーフリー状態で３日間培養した。その後、培地を１％ Ｂ２７を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地と交換し、それに５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡおよび２０ｎｇ／ｍｌのＢＰＭ４を成長因子として添加し、次いで細胞を２日間培養して中胚葉細胞に分化させた。培地を、０．５％ Ｂ２７を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地と交換し、それに５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡおよび５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを成長因子として添加し、次いで、細胞を２日間培養して、血管前駆体に分化させた。血管内皮細胞に分化することができるＣＤ３４陽性細胞を、ＣＤ３４磁気ビーズを使用して磁気活性化セルソーティング（MACS）を実施することにより、誘導された血管前駆体から単離した。単離されたＣＤ３４陽性細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａおよび１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを成長因子として含有するＥＧＭ－２培地（Lonza, USA）中でさらに２日間培養して、血管内皮細胞に分化させた。
その結果、図７に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから血管内皮細胞の分化が誘導され、ＣＤ３４およびＣＤ３１を発現する１５％超の細胞が生成された。
ファブリー病を有する患者の血管障害を確認するために、血管内皮細胞を以下の方法に従って、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化させた（図６）。
具体的には、例１で調製したＦＢ－ｉＰＳＣを、フィーダーフリー状態で３日間培養した。その後、培地を１％ Ｂ２７を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地と交換し、それに５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡおよび２０ｎｇ／ｍｌのＢＰＭ４を成長因子として添加し、次いで細胞を２日間培養して中胚葉細胞に分化させた。培地を、０．５％ Ｂ２７を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地と交換し、それに５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡおよび５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを成長因子として添加し、次いで、細胞を２日間培養して、血管前駆体に分化させた。血管内皮細胞に分化することができるＣＤ３４陽性細胞を、ＣＤ３４磁気ビーズを使用して磁気活性化セルソーティング（MACS）を実施することにより、誘導された血管前駆体から単離した。単離されたＣＤ３４陽性細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａおよび１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを成長因子として含有するＥＧＭ－２培地（Lonza, USA）中でさらに２日間培養して、血管内皮細胞に分化させた。
その結果、図７に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから血管内皮細胞の分化が誘導され、ＣＤ３４およびＣＤ３１を発現する１５％超の細胞が生成された。
【0077】
実験例４：ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞の特徴の確認
＜４－１＞血管内皮細胞マーカータンパク質の発現の確認
ファブリー病患者に由来する血管内皮細胞が正常に分化したかどうかを確認するために、免疫染色を使用して血管内皮細胞マーカータンパク質であるＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＣＤ３１およびＶＥ－カドヘリン（血管内皮カドヘリン）の発現を確認した。実験は、例２において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。このとき、抗ＫＤＲ抗体（１：３００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＣＤ３１抗体（１：３００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗ＶＥ－カドヘリン抗体（１：３００、Abcam, UK）を一次抗体として使用した。
その一方で、血管内皮細胞間でのＣＤ３１およびＣＤ１０５を発現する細胞の分布を、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）によって確認した。具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をアキュターゼで処置し、遠心分離して細胞ペレットを得た。細胞ペレットを２％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁し、４０μｍの孔径を有するストレーナーを使用して細胞をろ過した。ろ過した細胞をＦＡＣＳ特異的抗体として抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Biolegend, USA）および抗ＣＤ１０５抗体（１：２００、Biolegend, USA）で処置し、４℃で３分間反応させた。反応が完了したら、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で５回洗浄し、細胞分布をＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーター（BD biosciences）を使用して確認した。
その結果、図８に示すように、血管内皮細胞マーカーであるＫＤＲ、ＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリンタンパク質が、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において正常細胞レベルで発現し、ＣＤ３１およびＣＤ１０５タンパク質の発現は、一様に分布していた。上記の結果から、血管内皮細胞は正常にＦＢ－ｉＰＳＣから分化したことが確認された。
＜４－１＞血管内皮細胞マーカータンパク質の発現の確認
ファブリー病患者に由来する血管内皮細胞が正常に分化したかどうかを確認するために、免疫染色を使用して血管内皮細胞マーカータンパク質であるＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＣＤ３１およびＶＥ－カドヘリン（血管内皮カドヘリン）の発現を確認した。実験は、例２において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。このとき、抗ＫＤＲ抗体（１：３００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＣＤ３１抗体（１：３００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗ＶＥ－カドヘリン抗体（１：３００、Abcam, UK）を一次抗体として使用した。
その一方で、血管内皮細胞間でのＣＤ３１およびＣＤ１０５を発現する細胞の分布を、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）によって確認した。具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をアキュターゼで処置し、遠心分離して細胞ペレットを得た。細胞ペレットを２％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁し、４０μｍの孔径を有するストレーナーを使用して細胞をろ過した。ろ過した細胞をＦＡＣＳ特異的抗体として抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Biolegend, USA）および抗ＣＤ１０５抗体（１：２００、Biolegend, USA）で処置し、４℃で３分間反応させた。反応が完了したら、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で５回洗浄し、細胞分布をＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーター（BD biosciences）を使用して確認した。
その結果、図８に示すように、血管内皮細胞マーカーであるＫＤＲ、ＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリンタンパク質が、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において正常細胞レベルで発現し、ＣＤ３１およびＣＤ１０５タンパク質の発現は、一様に分布していた。上記の結果から、血管内皮細胞は正常にＦＢ－ｉＰＳＣから分化したことが確認された。
【0078】
＜４－２＞血管内皮細胞の形態と脈管形成の確認
ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞の形態の変化と脈管形成を以下の方法で確認した。
最初に、例２において調製した血管内皮細胞を１３日間培養しながら、９日目、１１日目、および１３日目に細胞の形態を位相差顕微鏡で確認した。
他方、７０μｌのマトリゲル（corning）ストック溶液を９６ウェルプレートに入れ、３７℃で硬化させ、次いで例２において調製した１ｘ１０４血管内皮細胞とＥＧＭ２培地をそれに添加して管形成を確認した。
その結果、図９および図１０に示すように、正常対照群とは異なり、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞は、培養が進行して異常な形状に変化するにつれて、広範に広がり、マトリゲル上に管形成は観察されなかった。上記の結果から、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞が血管障害を示すことが確認された。
ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞の形態の変化と脈管形成を以下の方法で確認した。
最初に、例２において調製した血管内皮細胞を１３日間培養しながら、９日目、１１日目、および１３日目に細胞の形態を位相差顕微鏡で確認した。
他方、７０μｌのマトリゲル（corning）ストック溶液を９６ウェルプレートに入れ、３７℃で硬化させ、次いで例２において調製した１ｘ１０４血管内皮細胞とＥＧＭ２培地をそれに添加して管形成を確認した。
その結果、図９および図１０に示すように、正常対照群とは異なり、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞は、培養が進行して異常な形状に変化するにつれて、広範に広がり、マトリゲル上に管形成は観察されなかった。上記の結果から、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞が血管障害を示すことが確認された。
【0079】
実験例５：ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞における減少したＧＬＡ活性の確認
ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞におけるＧＬＡ活性を、以下の方法で確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例２に記載されたのと同じ様式で実施した。
その結果、図１１に示すように、正常対照群とは異なり、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞はＧＬＡ活性を何ら示さなかった。
ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞におけるＧＬＡ活性を、以下の方法で確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例２に記載されたのと同じ様式で実施した。
その結果、図１１に示すように、正常対照群とは異なり、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞はＧＬＡ活性を何ら示さなかった。
【0080】
実験例６：ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞におけるＫＤＲタンパク質の発現の確認
ファブリー病は血管合併症を引き起こすため、ＫＤＲタンパク質の発現を以下の方法により確認し、ファブリー病を有する患者において血管障害を確認した。
＜６－１＞ＫＤＲタンパク質の発現部位の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＫＤＲタンパク質の発現部位を免疫染色により確認した。実験を、例２で調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。このとき、抗ＫＤＲ抗体（１：３００、Cell Signaling Technologies, USA）を一次抗体として使用した。
その結果、図１２に示すように、ファブリー病を有する患者に由来するの血管内皮細胞におけるＫＤＲタンパク質の発現部位が正常対照群とは異なることが確認された。
ファブリー病は血管合併症を引き起こすため、ＫＤＲタンパク質の発現を以下の方法により確認し、ファブリー病を有する患者において血管障害を確認した。
＜６－１＞ＫＤＲタンパク質の発現部位の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＫＤＲタンパク質の発現部位を免疫染色により確認した。実験を、例２で調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。このとき、抗ＫＤＲ抗体（１：３００、Cell Signaling Technologies, USA）を一次抗体として使用した。
その結果、図１２に示すように、ファブリー病を有する患者に由来するの血管内皮細胞におけるＫＤＲタンパク質の発現部位が正常対照群とは異なることが確認された。
【0081】
＜６－２＞ＫＤＲタンパク質シグナリングシステムの確認
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＫＤＲタンパク質シグナリングシステムに関連するＫＤＲ、ｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素合成酵素）およびＴＳＰ１（トロンボスポンジン１型）の発現レベルをウエスタンブロッティングにより確認した。
具体的に、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムで処置し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）を抗体として使用した。
その結果、図１３に示すように、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルは、正常対照群と比較して、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において減少し、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルは、ファブラザイム処置にかかわらず正常対照群と比較して増大した。上記の結果から、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルは、ファブリー病により増大し、それはファブラザイムにより阻害されなかったことが確認された。
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＫＤＲタンパク質シグナリングシステムに関連するＫＤＲ、ｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素合成酵素）およびＴＳＰ１（トロンボスポンジン１型）の発現レベルをウエスタンブロッティングにより確認した。
具体的に、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムで処置し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）を抗体として使用した。
その結果、図１３に示すように、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルは、正常対照群と比較して、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において減少し、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルは、ファブラザイム処置にかかわらず正常対照群と比較して増大した。上記の結果から、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルは、ファブリー病により増大し、それはファブラザイムにより阻害されなかったことが確認された。
【0082】
実験例７：ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現の確認
ファブリー病の血管関連合併症がＴＳＰ１タンパク質の過剰発現によって引き起こされているかどうかを判断するために、ＴＳＰ１タンパク質のシグナリングシステムを以下の方法により確認した。
ファブリー病の血管関連合併症がＴＳＰ１タンパク質の過剰発現によって引き起こされているかどうかを判断するために、ＴＳＰ１タンパク質のシグナリングシステムを以下の方法により確認した。
【0083】
＜７－１＞ＴＧＦ－β（トランスフォーミング成長因子ベータ）活性化の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の上流シグナリングシステムであるＴＧＦ－βタンパク質の活性化を確認するために、ウエスタンブロッティングを使用してＳＭＡＤ２タンパク質のリン酸化を確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムで処置し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。このとき、抗体として抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）および抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を使用した。
その結果、図１４に示すように、ＳＭＡＤ２タンパク質のリン酸化レベルは、ファブラザイム処置に関わらず、正常対照群と比較して、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において増大した。上記の結果から、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞においてＴＧＦ－βタンパク質が活性化されたことが確認された。
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の上流シグナリングシステムであるＴＧＦ－βタンパク質の活性化を確認するために、ウエスタンブロッティングを使用してＳＭＡＤ２タンパク質のリン酸化を確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムで処置し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。このとき、抗体として抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）および抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を使用した。
その結果、図１４に示すように、ＳＭＡＤ２タンパク質のリン酸化レベルは、ファブラザイム処置に関わらず、正常対照群と比較して、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において増大した。上記の結果から、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞においてＴＧＦ－βタンパク質が活性化されたことが確認された。
【0084】
＜７－２＞ＴＧＦ－βの活性化によるＴＳＰ１タンパク質の発現レベルの増大の確認
ＴＧＦ－βの活性化がＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを増大させるかどうかを確認するために、ＴＳＰ－１タンパク質を含む関連タンパク質の発現レベルをウエスタンブロッティングを使用して確認した。
具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をアクチビンＡで処置してＴＧＦ－βを活性化し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。このとき、抗体として抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｂＦＧＦ抗体（１：１０００、Bioss, USA）、抗ＡＮＧ２抗体（１：１０００、Bioss, USA）および抗ｖＥＧＦ抗体（１：１０００、Santacruz、USA）を使用した。
その結果、図１５に示すように、ＴＳＰ１タンパク質の発現は、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞においてアクチビンＡによって増大した。上記の結果から、ＴＧＦ－βタンパク質の活性化によりＴＳＰ１タンパク質の発現レベルが増大したことが確認された。
ＴＧＦ－βの活性化がＴＳＰ１タンパク質の発現レベルを増大させるかどうかを確認するために、ＴＳＰ－１タンパク質を含む関連タンパク質の発現レベルをウエスタンブロッティングを使用して確認した。
具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をアクチビンＡで処置してＴＧＦ－βを活性化し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。このとき、抗体として抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｂＦＧＦ抗体（１：１０００、Bioss, USA）、抗ＡＮＧ２抗体（１：１０００、Bioss, USA）および抗ｖＥＧＦ抗体（１：１０００、Santacruz、USA）を使用した。
その結果、図１５に示すように、ＴＳＰ１タンパク質の発現は、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞においてアクチビンＡによって増大した。上記の結果から、ＴＧＦ－βタンパク質の活性化によりＴＳＰ１タンパク質の発現レベルが増大したことが確認された。
【0085】
＜７－３＞ＴＳＰ１タンパク質の発現場所の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現場所を免疫染色により確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。抗ＴＳＰ１抗体（１：２００、Santacruz, USA）を一次抗体として使用した。
その結果、図１６に示すように、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において増大したＴＳＰ１タンパク質は、正常な対照と比較して細胞全体に分布していた。
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現場所を免疫染色により確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。抗ＴＳＰ１抗体（１：２００、Santacruz, USA）を一次抗体として使用した。
その結果、図１６に示すように、ファブリー病を有する患者に由来する血管内皮細胞において増大したＴＳＰ１タンパク質は、正常な対照と比較して細胞全体に分布していた。
【0086】
実験例８：Ｇｂ３（グロボトリアオシルセラミド３）タンパク質によって誘導された血管障害の確認
ファブリー病を有する患者の細胞および器官に蓄積されたＧｂ３タンパク質が血管障害を誘導するかどうかを以下の方法により確認した。
＜８－１＞血管内皮細胞の形態の変化の確認
Ｇｂ３タンパク質により引き起こされる血管内皮細胞の形態の変化を、以下の方法で確認した。
具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質（MATREYA LLC, USA）で９日間処置し、次いで細胞の形態を確認した。
その結果、図１７に示すように、正常な血管内皮細胞の形態は、Ｇｂ３タンパク質によってＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞のように広がった形態に変化した。
ファブリー病を有する患者の細胞および器官に蓄積されたＧｂ３タンパク質が血管障害を誘導するかどうかを以下の方法により確認した。
＜８－１＞血管内皮細胞の形態の変化の確認
Ｇｂ３タンパク質により引き起こされる血管内皮細胞の形態の変化を、以下の方法で確認した。
具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質（MATREYA LLC, USA）で９日間処置し、次いで細胞の形態を確認した。
その結果、図１７に示すように、正常な血管内皮細胞の形態は、Ｇｂ３タンパク質によってＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞のように広がった形態に変化した。
【0087】
＜８－２＞血管障害関連遺伝子の発現レベルの確認
Ｇｂ３タンパク質による血管障害関連遺伝子の発現レベルの変化を、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を使用して確認した。
具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質で１、３または５日間処置し、easy-BLUE（Intron）を使用して細胞からＲＮＡを抽出した。次いで、従来の様式でＲＴ－ＰＣＲを行い、血管障害に関連する、ＫＤＲ、ｅＮＯＳ、およびＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）遺伝子のＲＮＡ発現レベルを確認した。
その結果、図１８ａ～１８ｃに示すように、ＫＤＲ、ｅＮＯＳ、およびＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、ＬｙｓｏＧｂ３タンパク質の処置の１日後に増大した。ＲＮＡ発現レベルは徐々に減少し、３日後および５日後、ＫＤＲおよびｅＮＯＳ遺伝子のＲＮＡ発現レベルは正常対照細胞のそれよりも低く、ＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルは正常対照細胞のそれと同様であった。
Ｇｂ３タンパク質による血管障害関連遺伝子の発現レベルの変化を、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を使用して確認した。
具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質で１、３または５日間処置し、easy-BLUE（Intron）を使用して細胞からＲＮＡを抽出した。次いで、従来の様式でＲＴ－ＰＣＲを行い、血管障害に関連する、ＫＤＲ、ｅＮＯＳ、およびＴＳＰ１（トロンボスポンジン１）遺伝子のＲＮＡ発現レベルを確認した。
その結果、図１８ａ～１８ｃに示すように、ＫＤＲ、ｅＮＯＳ、およびＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、ＬｙｓｏＧｂ３タンパク質の処置の１日後に増大した。ＲＮＡ発現レベルは徐々に減少し、３日後および５日後、ＫＤＲおよびｅＮＯＳ遺伝子のＲＮＡ発現レベルは正常対照細胞のそれよりも低く、ＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルは正常対照細胞のそれと同様であった。
【0088】
＜８－３＞血管障害関連タンパク質の発現レベルの確認
Ｇｂ３タンパク質による血管障害関連タンパク質の発現レベルの変化を、ウエスタンブロッティングを使用して確認した。具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質で３、６または９日間処置し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗体として抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＡＫＴ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗リン酸化ＡＫＴ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を使用した。
その結果、図１９に示すように、ＬｙｓｏＧｂ３タンパク質の処置によりＴＳＰ１タンパク質の発現レベルは増大し、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルおよびＡＫＴタンパク質のリン酸化は減少した。
Ｇｂ３タンパク質による血管障害関連タンパク質の発現レベルの変化を、ウエスタンブロッティングを使用して確認した。具体的には、正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質で３、６または９日間処置し、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式でウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗体として抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＡＫＴ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗リン酸化ＡＫＴ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を使用した。
その結果、図１９に示すように、ＬｙｓｏＧｂ３タンパク質の処置によりＴＳＰ１タンパク質の発現レベルは増大し、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルおよびＡＫＴタンパク質のリン酸化は減少した。
【0089】
＜８－４＞ＴＳＰ１タンパク質の発現場所の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現場所を免疫染色により確認した。正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質で処置した後、実験例＜１－１＞に記載されているのと同じ様式で実験を行った。一次抗体として抗ＴＳＰ１抗体（１：２００、Santacruz, USA）を使用した。
その結果、図２０に示すように、ＬｙｓｏＧｂ３タンパク質の処置によって増大したＴＳＰ１タンパク質は、細胞全体に分布していた。
上記の結果から、Ｇｂ３タンパク質がファブリー病を有する患者の血管障害を引き起こす主要な物質であることが確認された。
ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１タンパク質の発現場所を免疫染色により確認した。正常なｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞をＬｙｓｏＧｂ３タンパク質で処置した後、実験例＜１－１＞に記載されているのと同じ様式で実験を行った。一次抗体として抗ＴＳＰ１抗体（１：２００、Santacruz, USA）を使用した。
その結果、図２０に示すように、ＬｙｓｏＧｂ３タンパク質の処置によって増大したＴＳＰ１タンパク質は、細胞全体に分布していた。
上記の結果から、Ｇｂ３タンパク質がファブリー病を有する患者の血管障害を引き起こす主要な物質であることが確認された。
【0090】
実験例９：ファブリー病を有する患者の血管障害に対するＴＧＦ－βインヒビターの治療効果の確認
＜９－１＞ＳＢ４３１５４２による血管内皮細胞の形態の変化の確認
ＴＧＦ－βインヒビターであるＳＢ４３１５４２による血管内皮細胞の形態の変化を以下の方法により確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞に対してファブラザイムのみで処置した対照群、ＳＢ４３１５４２（Cayman Chemical, USA）のみで処置した実験群、およびファブラザイムおよびＳＢ４３１５４２で処置した実験群を使用して、細胞の形態を確認した。
その結果、図２１ａ～２１ｅに示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞の異常な形態がＳＢ４３１５４２により正常に回復した。
＜９－１＞ＳＢ４３１５４２による血管内皮細胞の形態の変化の確認
ＴＧＦ－βインヒビターであるＳＢ４３１５４２による血管内皮細胞の形態の変化を以下の方法により確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞に対してファブラザイムのみで処置した対照群、ＳＢ４３１５４２（Cayman Chemical, USA）のみで処置した実験群、およびファブラザイムおよびＳＢ４３１５４２で処置した実験群を使用して、細胞の形態を確認した。
その結果、図２１ａ～２１ｅに示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞の異常な形態がＳＢ４３１５４２により正常に回復した。
【0091】
＜９－２＞ＳＢ４３１５４２による血管内皮細胞のシグナリングシステムの確認
ＳＢ４３１５４２による血管障害関連タンパク質の発現レベルの変化を、ウエスタンブロッティングを使用して確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムのみで処置した対照群、ならびにファブラザイムおよびＳＢ４３１５４２で処置した実験群を使用して、実験例＜３－１＞に記載したのと同様の方法でウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を抗体として使用した。
その結果、図２２に示すように、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルはＳＢ４３１５４２によって減少したが、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルは増大した。
ＳＢ４３１５４２による血管障害関連タンパク質の発現レベルの変化を、ウエスタンブロッティングを使用して確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムのみで処置した対照群、ならびにファブラザイムおよびＳＢ４３１５４２で処置した実験群を使用して、実験例＜３－１＞に記載したのと同様の方法でウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、および抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を抗体として使用した。
その結果、図２２に示すように、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルはＳＢ４３１５４２によって減少したが、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルは増大した。
【0092】
＜９－３＞ＳＢ４３１５４２による血管内皮細胞の脈管形成の確認
ＳＢ４３１５４２により引き起こされる血管内皮細胞の脈管形成を以下の方法により確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムのみで処置した対照群、ＳＢ４３１５４２のみで処置した実験群、ファブラザイムとＳＢ４３１５４２で処置した実験群を使用し、管形成を実験例＜４－２＞に記載したのと同じ様式において確認した。
その結果、図２３ａ～２３ｅに示すように、血管内皮細胞はＳＢ４３１５４２によってマトリゲル上に管形状を形成した。
ＳＢ４３１５４２により引き起こされる血管内皮細胞の脈管形成を以下の方法により確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムのみで処置した対照群、ＳＢ４３１５４２のみで処置した実験群、ファブラザイムとＳＢ４３１５４２で処置した実験群を使用し、管形成を実験例＜４－２＞に記載したのと同じ様式において確認した。
その結果、図２３ａ～２３ｅに示すように、血管内皮細胞はＳＢ４３１５４２によってマトリゲル上に管形状を形成した。
【0093】
＜９－４＞ロサルタンによる血管内皮細胞の形態の変化の確認
ＴＧＦ－βインヒビターであるロサルタンによる血管内皮細胞の形態の変化を以下の方法で確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムのみで処置した対照群、ファブラザイムとＳＢ４３１５４２で処置した実験群、ファブラザイムとロサルタン（Cayman Chemical, USA）で処置した実験群を使用して、細胞の形態を確認した。
その結果、図２４ａおよび２４ｂに示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞の異常な形態はＳＢ４３１５４２によって正常に回復した一方で、ロサルタンは効果がなかった。
上記の結果から、ＳＢ４３１５４２はファブリー病を有する患者における血管障害に対する治療効果を示したが、ロサルタンの効果は確認できなかった。
ＴＧＦ－βインヒビターであるロサルタンによる血管内皮細胞の形態の変化を以下の方法で確認した。
具体的には、例２において調製した血管内皮細胞をファブラザイムのみで処置した対照群、ファブラザイムとＳＢ４３１５４２で処置した実験群、ファブラザイムとロサルタン（Cayman Chemical, USA）で処置した実験群を使用して、細胞の形態を確認した。
その結果、図２４ａおよび２４ｂに示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞の異常な形態はＳＢ４３１５４２によって正常に回復した一方で、ロサルタンは効果がなかった。
上記の結果から、ＳＢ４３１５４２はファブリー病を有する患者における血管障害に対する治療効果を示したが、ロサルタンの効果は確認できなかった。
【0094】
例３：ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株の調製
ファブリー病を有する患者の血管障害に関する客観的な実験のために、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを使用してＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株を調製した（図２５および２６）。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣにおいて、ＧＬＡ遺伝子の欠損を、以下の表２に示す配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを用いた従来の方法により修正した。標的（表３）についてより高いインデル頻度を有する標的２を使用して編集細胞株を調製し、それからＤＮＡを抽出し、これに続き、配列決定した。
ファブリー病を有する患者の血管障害に関する客観的な実験のために、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを使用してＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株を調製した（図２５および２６）。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣにおいて、ＧＬＡ遺伝子の欠損を、以下の表２に示す配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを用いた従来の方法により修正した。標的（表３）についてより高いインデル頻度を有する標的２を使用して編集細胞株を調製し、それからＤＮＡを抽出し、これに続き、配列決定した。
【0095】
【表2】
【0096】
【0097】
例４：ＦＢ－ｉＰＳＣのアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞の調製
血管内皮細胞を、例２に記載されているのと同じ様式で、例３において調製したＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞を分化させることによって調製した。
血管内皮細胞を、例２に記載されているのと同じ様式で、例３において調製したＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞を分化させることによって調製した。
【0098】
実験例１０：ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株および血管内皮細胞におけるＧＬＡ活性の回復の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株およびそれから分化した血管内皮細胞においてＧＬＡ活性が回復したかどうかを以下の方法で確認した。実験を、例３において調製したＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株および例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例２に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図２８に示すように、ＧＬＡ活性はＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株およびそれから分化した血管内皮細胞において回復した。
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株およびそれから分化した血管内皮細胞においてＧＬＡ活性が回復したかどうかを以下の方法で確認した。実験を、例３において調製したＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株および例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例２に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図２８に示すように、ＧＬＡ活性はＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞株およびそれから分化した血管内皮細胞において回復した。
【0099】
実験例１１：ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞における血管障害の回復の確認
＜１１－１＞血管障害関連タンパク質の発現レベルの確認
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞における血管障害関連タンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロッティングによって確認した。例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡ（Genzyme, USA）で処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式で、ウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）および抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を抗体として使用した。
その結果、図２９に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞において、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルとＳＭＡＤタンパク質のリン酸化が減少し、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルが増大した。
＜１１－１＞血管障害関連タンパク質の発現レベルの確認
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞における血管障害関連タンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロッティングによって確認した。例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡ（Genzyme, USA）で処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式で、ウエスタンブロッティングを行った。そのとき、抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）および抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を抗体として使用した。
その結果、図２９に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞において、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルとＳＭＡＤタンパク質のリン酸化が減少し、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルが増大した。
【0100】
＜１１－２＞抗脈管形成因子タンパク質の発現場所の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞における抗脈管形成因子タンパク質の発現場所を免疫染色により確認した。
具体的には、実験を、例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡで処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。一次抗体として、抗ＶＥ－カドヘリン抗体（１：３００、Abcam, UK）および抗ＴＳＰ１抗体（１：２００、Santacruz, USA）を使用した。
その結果、図３０に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞においてＴＳＰ１タンパク質の分布が減少した。
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞における抗脈管形成因子タンパク質の発現場所を免疫染色により確認した。
具体的には、実験を、例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡで処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜１－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。一次抗体として、抗ＶＥ－カドヘリン抗体（１：３００、Abcam, UK）および抗ＴＳＰ１抗体（１：２００、Santacruz, USA）を使用した。
その結果、図３０に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞においてＴＳＰ１タンパク質の分布が減少した。
【0101】
＜１１－３＞血管内皮細胞の脈管形成の確認
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞の脈管形成を以下の方法により確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡで処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜４－２＞に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図３１に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞は、マトリゲル上でより良好な管形状を形成した。
上記の結果から、ＧＬＡ遺伝子の修正がファブリー病を有する患者において血管障害を回復させたことが確認された。
ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞の脈管形成を以下の方法により確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡで処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜４－２＞に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図３１に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＦＢ－ｉＰＳＣアイソタイプ対照細胞から分化した血管内皮細胞は、マトリゲル上でより良好な管形状を形成した。
上記の結果から、ＧＬＡ遺伝子の修正がファブリー病を有する患者において血管障害を回復させたことが確認された。
【0102】
例５：ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株の構築
ファブリー病患者の血管障害の原因として知られているＴＳＰ１遺伝子がノックアウトされたＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株を、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを使用して構築した（図３２）。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣのＴＳＰ１遺伝子を、以下の表４に示す配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを使用した従来の方法によりノックアウトした。ノックアウト細胞株を、標的について高いインデル頻度を有する標的２（表５）を使用して調製し、それからＤＮＡを抽出し、これに続き、配列決定をした。
ファブリー病患者の血管障害の原因として知られているＴＳＰ１遺伝子がノックアウトされたＦＢ－ｉＰＳＣ細胞株を、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを使用して構築した（図３２）。
具体的には、例１において調製したＦＢ－ｉＰＳＣのＴＳＰ１遺伝子を、以下の表４に示す配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを使用した従来の方法によりノックアウトした。ノックアウト細胞株を、標的について高いインデル頻度を有する標的２（表５）を使用して調製し、それからＤＮＡを抽出し、これに続き、配列決定をした。
【0103】
【表4】
【0104】
【0105】
例６：ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞の調製
血管内皮細胞を、例２に記載したのと同じ様式で、例５において調製したＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞を分化させることにより調製した。
血管内皮細胞を、例２に記載したのと同じ様式で、例５において調製したＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞を分化させることにより調製した。
【0106】
実験例１２：ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞における血管障害の回復の確認
＜１２－１＞血管内皮細胞の形態の変化の確認
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞の形態の変化を以下の方法で確認した。実験において、例２において調製した血管内皮細胞とＧＬＡで処置した例６において調製した血管内皮細胞を使用して細胞形態を確認した。
その結果、図３４に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞は異常な形態を示した一方で、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞は正常な形態を示した。
＜１２－１＞血管内皮細胞の形態の変化の確認
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞の形態の変化を以下の方法で確認した。実験において、例２において調製した血管内皮細胞とＧＬＡで処置した例６において調製した血管内皮細胞を使用して細胞形態を確認した。
その結果、図３４に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞は異常な形態を示した一方で、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞は正常な形態を示した。
【0107】
＜１２－２＞血管内皮細胞におけるＴＳＰ１遺伝子の発現レベルの確認
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ＰＣＲにより確認した。具体的には、ＲＴ－ＰＣＲは、例２において調製した血管内皮細胞および例６において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜８－２＞に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図３５に示すように、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＣ細胞から分化した血管内皮細胞において、ＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、正常対照細胞やＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して減少した。
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞におけるＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ＰＣＲにより確認した。具体的には、ＲＴ－ＰＣＲは、例２において調製した血管内皮細胞および例６において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜８－２＞に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図３５に示すように、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＣ細胞から分化した血管内皮細胞において、ＴＳＰ１遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、正常対照細胞やＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して減少した。
【0108】
＜１２－３＞血管障害関連タンパク質の発現レベルの確認
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞における血管障害関連タンパク質の発現レベルをウエスタンブロッティングにより確認した。具体的には、ウエスタンブロッティングを、例２において調製した血管内皮細胞および例６において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）および抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を抗体として使用した。
その結果、図３６に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞において、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルとＳＭＡＤタンパク質のリン酸化が減少し、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルが増加した。
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞における血管障害関連タンパク質の発現レベルをウエスタンブロッティングにより確認した。具体的には、ウエスタンブロッティングを、例２において調製した血管内皮細胞および例６において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜３－１＞に記載したのと同じ様式で実施した。抗ＴＳＰ１抗体（１：１０００、Santacruz, USA）、抗ＫＤＲ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗ｅＮＯＳ抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）および抗ＳＭＡＤ２抗体（１：１０００、Cell Signaling Technologies, USA）を抗体として使用した。
その結果、図３６に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞において、ＴＳＰ１タンパク質の発現レベルとＳＭＡＤタンパク質のリン酸化が減少し、ＫＤＲおよびｅＮＯＳタンパク質の発現レベルが増加した。
【0109】
＜１２－４＞血管内皮細胞の脈管形成の確認
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞の脈管形成を以下の方法で確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡで処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜４－２＞に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図３７に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞は、マトリゲル上でより良好な管形状を形成した。
上記の結果から、ＴＳＰ１タンパク質はファブリー病を有する患者において血管障害を引き起こす主要なタンパク質であり、その発現の阻害がファブリー病を治癒し得ることが確認された。
ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞の脈管形成を以下の方法で確認した。実験を、例２において調製した血管内皮細胞およびＧＬＡで処置した例４において調製した血管内皮細胞を使用して、実験例＜４－２＞に記載したのと同じ様式で実施した。
その結果、図３７に示すように、ＦＢ－ｉＰＳＣから分化した血管内皮細胞と比較して、ＴＳＰ１遺伝子ノックアウトＦＢ－ｉＰＳＣ細胞から分化した血管内皮細胞は、マトリゲル上でより良好な管形状を形成した。
上記の結果から、ＴＳＰ１タンパク質はファブリー病を有する患者において血管障害を引き起こす主要なタンパク質であり、その発現の阻害がファブリー病を治癒し得ることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18a】
【図18b】
【図18c】
【図19】
【図20】
【図21a】
【図21b-d】
【図21e】
【図22】
【図23a】
【図23b-d】
【図23e】
【図24a】
【図24b】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【配列表】
【国際調査報告】