特表 2022-512613 間葉系間質細胞を拡大するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】間葉系間質細胞を拡大するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/51 20150101AFI20220131BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20220131BHJP

   C12N 9/26 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 9/48 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

A61K35/51

A61P29/00

A61K45/00

A61P37/02

A61P37/06

A61P9/10

A61P9/00

A61P11/00

A61P1/04

A61K39/395 U

A61K38/19

A61K38/20

C12N5/077

C12N9/26

C12N9/48

C12N9/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021518730

(86)(22)【出願日】2019-10-04

(85)【翻訳文提出日】2021-05-28

(86)【国際出願番号】 US2019054901

(87)【国際公開番号】W WO2020073029

(87)【国際公開日】2020-04-09

(31)【優先権主張番号】62/741,933

(32)【優先日】2018-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500039463

【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム

【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ，ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ

【住所又は居所原語表記】２１０ Ｗｅｓｔ ７ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ ７８７０１ Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シュポール、エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】レズヴァニ、カタユン

(72)【発明者】

【氏名】メント、マイエラ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B050LL10

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BD39

4B065BD44

4B065CA44

4C084AA19

4C084DA01

4C084DA12

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB59

4C087BB64

4C087MA56

4C087MA57

4C087MA59

4C087MA60

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA36

4C087ZA59

4C087ZA68

4C087ZB07

4C087ZB09

4C087ZB11

(57)【要約】

【課題】 間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の集団の拡大とその使用が提供される。
【解決手段】 間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の集団を拡大するための方法が本明細書中に提供され、その方法は、臍帯組織に由来するＭＳＣの集団をプレ活性化サイトカインカクテルで処理する工程を含む。それらのＭＳＣで免疫障害を処置する方法がさらに本明細書中に提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を拡大するための方法であって、
（ａ）臍帯組織からＭＳＣの集団を取得する工程；
（ｂ）前記ＭＳＣを、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１７からなる群より選択される少なくとも３つのサイトカインの存在下においてプレ活性化する工程；および
（ｃ）拡大されたＭＳＣの集団を取得するために、前記プレ活性化されたＭＳＣを拡大する工程
を含む、方法。

【請求項2】

臍帯組織由来の前記ＭＳＣの集団が、予め凍結保存されている集団である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記取得工程が、前記臍帯組織を酵素カクテルで処理する工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記酵素カクテルが、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼＮＢ４／６である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記酵素カクテルが、ＤＮＡｓｅをさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項7】

前記ヒアルロニダーゼが、０．５～１．５Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記ヒアルロニダーゼが、１Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記コラゲナーゼが、０．１～１Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４～８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記コラゲナーゼが、０．５Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４～９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記ＤＮＡｓｅが、２００～３００Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項６に記載の方法。

【請求項12】

前記ＤＮＡｓｅが、２５０Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項６に記載の方法。

【請求項13】

前記ＭＳＣが、プレ活性化の前に少なくとも８５％の培養密度まで培養される、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

前記ＭＳＣが、プレ活性化の前に６～８日間培養される、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

少なくとも５億個のＭＳＣが、プレ活性化の前に取得される、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記プレ活性化工程が、１２～２４時間である、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記プレ活性化工程が、１６時間である、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記ＭＳＣが、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１７の存在下においてプレ活性化される、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

ＴＮＦα、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－１βが、５～１５ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

ＴＮＦα、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－１βが、１０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１～１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

前記ＩＬ－１７が、２０～４０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１～２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

前記ＩＬ－１７が、３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１～２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

前記拡大工程が、機能的閉鎖系において行われる、請求項１～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記機能的閉鎖系が、バイオリアクターである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記バイオリアクターが、中空繊維バイオリアクターである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

拡大工程が、７日未満にわたって行われる、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

拡大工程が、５～６日間行われる、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

前記ＭＳＣが、少なくとも５０倍拡大される、請求項１～２７のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

前記ＭＳＣが、少なくとも７０倍拡大される、請求項１～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項30】

前記ＭＳＣが、２８時間未満の倍加時間を有する、請求項１～２９のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

前記拡大されたＭＳＣの集団が、骨髄ＭＳＣよりも高い免疫抑制性の表現型を有する、請求項１～３０のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

前記拡大されたＭＳＣの集団が、サイトカインによるプレ活性化なしで拡大された臍帯組織由来のＭＳＣよりも高い免疫抑制性の表現型を有する、請求項１～３１のいずれかに記載の方法。

【請求項33】

前記免疫抑制性の表現型が、抗アポトーシス因子、抗炎症因子、免疫調節因子および／または化学誘引ホーミング因子の発現によって測定される、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

抗アポトーシス因子が、ＶＧＥＦおよび／またはＴＧＦβである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記抗炎症因子が、ＴＳＧ－６である、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記化学誘引ホーミング因子が、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ３である、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記免疫調節性因子が、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ、ＰＧＥ２、ＩＬ－１０およびＴＧＦβからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項38】

前記拡大されたＭＳＣの集団が、骨髄由来のＭＳＣと比べて、幹細胞性マーカーおよび／またはケモカインレセプターの高発現を有する、請求項１～３７のいずれかに記載の方法。

【請求項39】

前記幹細胞性マーカーが、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｔｒｏ－１、Ｏｃｔ－４、ＮａｎｏｇおよびＣｏｘ－２からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ケモカインレセプターが、ＶＥＧＦ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＧＥ、ＣＸＣＲ４、ＩＬ－１０およびＴＧＦβからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記拡大されたＭＳＣの集団が、骨髄由来のＭＳＣと比べて、接着および侵入に関係する遺伝子の高発現を有する、請求項１～４０のいずれかに記載の方法。

【請求項42】

前記接着および侵入に関係する遺伝子が、ＧＬＧ１、ＶＣＡＭ１、ＣＸＣＲ４、ＩＣＡＭ１、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＳＥＬＰＧ、ＳＴＡＴ１、ＩＦＩＴＴ３、ＩＳＧ１５、ＳＴＡＴ２、ＭＸ１、ＯＡＳ１、ＩＦＩ６、ＪＡＫ２、ＴＡＰ１、ＩＦＩ３５、ＩＦＩＴＭ１、ＰＳＭ８９、ＩＲＦ１、ＩＦＩＴＭ３、ＰＴＰＮ２、ＲＥＬＡ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＪＵＮ、ＡＲＮＴ、ＨＩＦ１およびＣＵＬ２からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記方法が、ＧＭＰ準拠である、請求項１～４２のいずれかに記載の方法。

【請求項44】

前記拡大されたＭＳＣを凍結保存する工程をさらに含む、請求項１～４３のいずれかに記載の方法。

【請求項45】

コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅを含む、臍帯組織を解離するための組成物。

【請求項46】

前記組成物が、ＭＳＣを単離するために臍帯組織を解離する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記組成物が、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅからなる、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項48】

前記組成物が、ＢＳＡまたはトリプシン阻害剤を含まない、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。

【請求項49】

前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼＮＢ４／６である、請求項４５～４８のいずれかに記載の方法。

【請求項50】

前記ヒアルロニダーゼが、０．５～１．５Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４５～４９のいずれかに記載の方法。

【請求項51】

前記ヒアルロニダーゼが、１Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４５～５０のいずれかに記載の方法。

【請求項52】

前記コラゲナーゼが、０．１～１Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４５～５１のいずれかに記載の方法。

【請求項53】

前記コラゲナーゼが、０．５Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４５～５２のいずれかに記載の方法。

【請求項54】

前記ＤＮＡｓｅが、２００～３００Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４５～５４のいずれかに記載の方法。

【請求項55】

前記ＤＮＡｓｅが、２５０Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項４５～５４のいずれかに記載の方法。

【請求項56】

請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法によって作製された拡大されたＭＳＣおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。

【請求項57】

炎症性疾患の処置における本発明者らのための、請求項５６に記載の組成物。

【請求項58】

被験体における炎症性疾患を処置する方法であって、前記方法は、治療有効量の臍帯組織由来ＭＳＣを前記被験体に投与する工程を含む、方法。

【請求項59】

前記被験体が、ヒトである、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記臍帯組織由来ＭＳＣが、請求項１～４４のいずれか１項に従って作製される、請求項５８または５９に記載の方法。

【請求項61】

前記臍帯組織由来ＭＳＣが、予め凍結保存されている、請求項５８に記載の方法。

【請求項62】

前記炎症性疾患が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫疾患、急性虚血性脳卒中、心筋損傷、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または炎症性腸疾患である、請求項５８～６０のいずれかに記載の方法。

【請求項63】

前記ＭＳＣが、同種異系である、請求項５８～６２のいずれかに記載の方法。

【請求項64】

前記ＭＳＣが、全身投与または局所投与される、請求項５８～６３のいずれかに記載の方法。

【請求項65】

前記ＭＳＣが、直腸、鼻、頬側、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内もしくは頭蓋内の経路を介してまたは埋め込みレザバーを介して投与される、請求項５８～６４のいずれかに記載の方法。

【請求項66】

前記ＭＳＣが、少なくとも１つのさらなる治療薬とともに投与される、請求項５８～６５のいずれかに記載の方法。

【請求項67】

前記少なくとも１つのさらなる治療薬が、治療有効量の免疫調節剤または免疫抑制剤である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、またはケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

炎症性障害を処置するための、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法によって作製された治療有効量の拡大されたＭＳＣの使用。

【請求項70】

前記炎症性疾患が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫疾患、急性虚血性脳卒中、心筋損傷、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または炎症性腸疾患である、請求項６９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年１０月５日出願の米国特許仮出願第６２／７４１，９３３号の利益を主張する。この仮出願の全体が参照により本明細書中に援用される。

【0002】

背景
１．分野
本発明は、概して、医学および免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、間葉系間質細胞の拡大およびその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

２．関連技術の説明
過去１０年間にわたって、骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）が、移植片対宿主病、虚血性／非虚血性循環器疾患、虚血性脳卒中をはじめとした種々の臨床状況において、および遺伝子送達媒体として、治療に使用されてきた。ＢＭ－ＭＳＣの限界としては、ドナーの年齢が上がるにつれてその細胞の数および分化能が低下すること、ＢＭ－ＭＳＣ産物の品質が一定しないこと、ならびに必要なＢＭ吸引手技が侵襲性であることが挙げられる。正常な乳児の誕生後、臍帯血組織（ＣＢｔ）は通常、廃棄されるので、この出発物質の収集は、非侵襲性である。ＣＢｔ－ＭＳＣは、ＢＭ－ＭＳＣよりも速くかつ多い数に拡大でき、類似の免疫抑制特性を有する。したがって、臨床で使用するために多数のＣＢｔ－ＭＳＣを作製するＧＭＰ準拠の手順を開発する必要性がまだ満たされていない。

【発明の概要】

【0004】

要旨
第１の実施形態において、本開示は、ＣＢｔ由来のＭＳＣを拡大するための方法を提供し、その方法は、臍帯組織からＭＳＣの集団を取得する工程；ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１７からなる群より選択される少なくとも３つのサイトカインの存在下においてそれらのＭＳＣをプレ活性化する工程；および拡大されたＭＳＣの集団を取得するために、そのプレ活性化されたＭＳＣを拡大する工程を含む。特定の態様において、この方法は、ＧＭＰ準拠である。いくつかの態様において、臍帯組織由来のＭＳＣの集団は、予め凍結保存されているか、または新鮮なもしくは予め凍結保存された臍帯組織に由来する。

【0005】

いくつかの態様において、上記取得工程は、臍帯組織を酵素カクテルで処理する工程を含む。その酵素カクテルは、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼを含み得る。ある特定の態様において、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＮＢ４／６である。さらなる態様において、酵素カクテルは、ＤＮＡｓｅをさらに含む。ヒアルロニダーゼは、０．５～１．５Ｕ／ｍＬの濃度、例えば、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、コラゲナーゼは、０．１～１Ｕ／ｍＬの濃度、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１Ｕ／ｍＬである。ある特定の態様において、ＤＮＡｓｅは、２００～３００Ｕ／ｍＬの濃度、例えば、２００、２２５、２５０、２７５または３００Ｕ／ｍＬである。

【0006】

上記ＭＳＣは、プレ活性化の前に、少なくとも８５％の培養密度、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の培養密度まで培養され得る。いくつかの態様において、上記ＭＳＣは、プレ活性化の前に６～８日間、例えば、６、７または８日間培養される。ある特定の態様において、少なくとも５億個、例えば、６億、７億、８億、９億または１０億個のＭＳＣが、プレ活性化の前に取得される。プレ活性化は、１２～２４時間、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間であり得る。

【0007】

ある特定の態様において、上記ＭＳＣは、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１７の存在下においてプレ活性化される。いくつかの態様において、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－１βは、５～１５ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｎｇ／ｍＬまたはそれを超える。ある特定の態様において、ＩＬ－１７は、２０～４０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば、２０、２５、３０、３５、４０ｎｇ／ｍＬまたはそれを超える濃度で存在する。

【0008】

いくつかの態様において、上記拡大は、バイオリアクターなどの機能的閉鎖系において行われる。例えば、バイオリアクターは、中空繊維バイオリアクターである。ある特定の態様において、拡大は、７日未満、例えば、６、５または４日間行われる。上記ＭＳＣは、少なくとも５０倍、例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０倍またはそれを超えて拡大され得る。いくつかの態様において、上記ＭＳＣは、２８時間未満、例えば、２７、２６、２５または２４時間の倍加時間を有する。いくつかの態様において、上記方法は、拡大されたＭＳＣを凍結保存する工程をさらに含む。

【0009】

ある特定の態様において、拡大されたＭＳＣの集団は、骨髄ＭＳＣよりも高い免疫抑制性の表現型を有する。いくつかの態様において、拡大されたＭＳＣの集団は、サイトカインによるプレ活性化なしで拡大されたＣＢｔ由来ＭＳＣよりも高い免疫抑制性の表現型を有する。特定の態様において、その免疫抑制性の表現型は、抗アポトーシス因子（例えば、ＶＧＥＦおよび／またはＴＧＦβ）、抗炎症因子（例えば、ＴＳＧ－６）、免疫調節因子および／または化学誘引ホーミング因子（例えば、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ３）の発現によって測定される。いくつかの態様において、免疫調節因子は、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ、ＰＧＥ２、ＩＬ－１０およびＴＧＦβからなる群より選択される。具体的な態様において、拡大されたＭＳＣの集団は、ＢＭ－ＭＳＣと比べて、幹細胞性マーカーおよび／またはケモカインレセプターの高発現を有する。例示的な幹細胞性マーカーとしては、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｔｒｏ－１、Ｏｃｔ－４、ＮａｎｏｇおよびＣｏｘ－２が挙げられ、ケモカインレセプターとしては、ＶＥＧＦ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＧＥ、ＣＸＣＲ４、ＩＬ－１０およびＴＧＦβが挙げられる。いくつかの態様において、拡大されたＭＳＣの集団は、いくつかの免疫制御経路、例えば、Ｔ細胞疲弊、顆粒球の接着および血管外遊出、抗原提示経路、免疫応答の負の制御、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の正の制御、リンパ球アポトーシスプロセスの正の制御、無顆粒白血球の接着および血管外遊出、低酸素に対する細胞応答の制御、ＴＧＦβシグナル伝達、ＮＦＫβシグナル伝達、ＩＬ－６シグナル伝達、ｉＮｏｓおよびｅＮｏｓシグナル伝達１、ＳＴＡＴ４およびＰＩ３Ｋシグナル伝達の正の制御、ならびにＴ細胞アポトーシスの誘導に関連する遺伝子の発現を誘導した。ある特定の態様において、拡大されたＭＳＣの集団は、接着および侵入に関係するホーミングレセプターおよび重要な接着分子をはじめとした、血管外遊出およびホーミングに関係する遺伝子の高発現を有する。例示的な接着マーカーおよび侵入マーカーとしては、ＧＬＧ１、ＶＣＡＭ１、ＣＸＣＲ４、ＩＣＡＭ１、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＳＥＬＰＧ、ＳＴＡＴ１、ＩＦＩＴＴ３、ＩＳＧ１５、ＳＴＡＴ２、ＭＸ１、ＯＡＳ１、ＩＦＩ６、ＪＡＫ２、ＴＡＰ１、ＩＦＩ３５、ＩＦＩＴＭ１、ＰＳＭ８９、ＩＲＦ１、ＩＦＩＴＭ３、ＰＴＰＮ２、ＲＥＬＡ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＪＵＮ、ＡＲＮＴ、ＨＩＦ１およびＣＵＬ２が挙げられる。

【0010】

本開示はさらに、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅを含む、臍帯組織を解離するための組成物を提供する。いくつかの態様において、その組成物は、ＭＳＣを単離するために臍帯組織を解離する。ある特定の態様において、その組成物は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅからなる。特定の態様において、その組成物は、ＢＳＡもしくはトリプシン阻害剤を含まないか、またはＢＳＡもしくはトリプシン阻害剤を本質的に有しない。例えば、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＮＢ４／６である。ヒアルロニダーゼは、０．５～１．５Ｕ／ｍＬ、例えば、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５Ｕ／ｍＬの濃度であり得る。いくつかの態様において、コラゲナーゼは、０．１～１Ｕ／ｍＬの濃度、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１Ｕ／ｍＬである。ある特定の態様において、ＤＮＡｓｅは、２００～３００Ｕ／ｍＬの濃度、例えば、２００、２２５、２５０、２７５または３００Ｕ／ｍＬである。いくつかの態様において、ＣＢｔ由来のＭＳＣは、予め凍結保存されている。

【0011】

さらなる実施形態は、上記実施形態の方法によって作製された拡大されたＭＳＣおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を提供する。炎症性障害の処置において使用するための上記実施形態の方法によって作製された拡大されたＭＳＣを含む組成物が、さらに本明細書中に提供される。いくつかの態様において、その炎症性疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫疾患、急性虚血性脳卒中、心筋損傷、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または炎症性腸疾患である。特定の態様において、それらのＭＳＣは、同種異系である。それらのＭＳＣは、全身投与または局所投与され得る。

【0012】

別の実施形態において、被験体における炎症性疾患を処置する方法が提供され、その方法は、治療有効量のＣＢｔ由来ＭＳＣ、例えば、本実施形態に従って作製されたＣＢｔ－ＭＳＣを前記被験体に投与する工程を含む。特定の態様において、被験体は、ヒトである。いくつかの態様において、ＣＢｔ由来のＭＳＣは、予め凍結保存されている。

【0013】

いくつかの態様において、炎症性疾患は、ＧＶＨＤ、自己免疫疾患、急性虚血性脳卒中、心筋損傷、ＡＲＤＳまたは炎症性腸疾患である。特定の態様において、ＭＳＣは、同種異系である。ＭＳＣは、全身投与または局所投与され得る。例えば、ＭＳＣは、直腸、鼻、頬側、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内もしくは頭蓋内の経路を介してまたは埋め込みレザバーを介して投与される。さらなる態様において、ＭＳＣは、少なくとも１つのさらなる治療薬とともに投与される。いくつかの態様において、少なくとも１つのさらなる治療薬は、治療有効量の免疫調節剤または免疫抑制剤である。特定の態様において、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、またはケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である。

【0014】

さらなる実施形態は、炎症性障害を処置するための、治療有効量のＣＢｔ由来ＭＳＣ（例えば、本実施形態に従って作製されたＣＢｔ－ＭＳＣ）の使用を提供する。いくつかの態様において、ＣＢｔ由来ＭＳＣは、予め凍結保存されている。いくつかの態様において、炎症性疾患は、ＧＶＨＤ、自己免疫疾患、急性虚血性脳卒中、心筋損傷、ＡＲＤＳまたは炎症性腸疾患である。特定の態様において、ＭＳＣは、同種異系である。ＭＳＣは、全身投与または局所投与され得る。例えば、ＭＳＣは、直腸、鼻、頬側、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内もしくは頭蓋内の経路を介してまたは埋め込みレザバーを介して投与される。さらなる態様において、ＭＳＣは、少なくとも１つのさらなる治療薬とともに投与される。いくつかの態様において、少なくとも１つのさらなる治療薬は、治療有効量の免疫調節剤または免疫抑制剤である。特定の態様において、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、またはケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である。

【0015】

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および改変が明らかになるので、その詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に例証として与えられることが理解されるべきである。

【0016】

以下の図面は、本明細書の一部を成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含められる。本開示は、本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明とともに、これらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】臍帯組織からＭＳＣを単離および拡大するためのＧＭＰ準拠プロトコルを示している概略図。

【0018】

【図2】バイオリアクターを用いて、臍帯組織由来のプレ活性化されたＭＳＣを拡大および作製するためのＧＭＰ準拠プロトコルを示している概略図。

【0019】

【図3】テルモバイオリアクターにおける骨髄および臍帯組織からのＭＳＣの大規模拡大のデータ。

【0020】

【図4】臍帯組織由来のＭＳＣが、骨髄由来のＭＳＣより高レベルの幹細胞性マーカーを発現していることを示しているフローサイトメトリー解析。

【0021】

【図5A】プレ活性化されたＣＢｔ－ＭＳＣは、Ｔ細胞の増殖および活性化に対して未処置ＣＢｔ－ＭＳＣよりも高い抑制効果を示す。未処置ＭＳＣと対比した、プレ活性化ＭＳＣによって媒介されるＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖の抑制。

【図5B】プレ活性化されたＣＢｔ－ＭＳＣは、Ｔ細胞の増殖および活性化に対して未処置ＣＢｔ－ＭＳＣよりも高い抑制効果を示す。未処置ＭＳＣと対比した、プレ活性化ＭＳＣによって媒介されるＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の抑制。

【0022】

【図6A】ＣＢｔ－ＭＳＣのプレ活性化は、それらの免疫抑制性の治療能力を向上させる。プレ活性化されたＣＢｔ－ＭＳＣは、プレ活性化された骨髄ＭＳＣよりも高い免疫抑制性の表現型を示す。

【図6B】ＣＢｔ－ＭＳＣのプレ活性化は、それらの免疫抑制性の治療能力を向上させる。ＭＳＣのプレ活性化は、免疫制御性分子ＴＧＳ－６の分泌を増加させる。

【図6C】ＣＢｔ－ＭＳＣのプレ活性化は、それらの免疫抑制性の治療能力を向上させる。ＣＢｔ－ＭＳＣのプレ活性化は、それらの表面上の免疫調節性分子の発現を誘導し、それらの治療効果を最大にする。

【0023】

【図7】サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＦＮ、ＩＬ１およびＩＬ－１７）の本カクテルによるＣＢｔ－ＭＳＣのプレ活性化が、市販の調製物よりも高い治療効果を有する。

【0024】

【図8A】新鮮なＣＢｔ由来ＭＳＣは、異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）マウスモデルにおいて生存時間を延長した。ＧＶＨＤコントロールと比べて、新鮮なＢＭ由来ＭＳＣまたはＣＢＴ由来ＭＳＣを投与されたマウスの全生存時間の有意な延長が示されている。

【図8B】新鮮なＣＢｔ由来ＭＳＣは、異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）マウスモデルにおいて生存時間を延長した。ＧＶＨＤコントロールと比べて、（ＢＭ－またはＣＢＴ－ＭＳＣで）処置されたマウスの肝臓、脾臓および結腸のＧＶＨＤ徴候のわずかな低減を実証している病理組織学的サンプル。

【図8C】新鮮なＣＢｔ由来ＭＳＣは、異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）マウスモデルにおいて生存時間を延長した。尾静脈を介してマウスに注入されたＤｉＲ免疫蛍光標識ＭＳＣを用いた短期間の体内分布実験。ＣＢｔ－ＭＳＣは、ＢＭ－ＭＳＣと比べて７２時間にわたって有意な残留性の改善を示した。

【0025】

【図9A】ＣＢｔ－ＭＳＣの活性化は、より高い免疫抑制特性を有するユニークなプロファイルを明らかにした。休止ＭＳＣと活性化ＭＳＣとの間で差次的に発現された遺伝子のヒートマップは、休止ＣＢｔ－ＭＳＣと比べて、活性化ＣＢｔ－ＭＳＣにおいて、８１６個の遺伝子のアップレギュレーションおよび３８３個の遺伝子のダウンレギュレーションを示した。

【図9B】ＣＢｔ－ＭＳＣの活性化は、より高い免疫抑制特性を有するユニークなプロファイルを明らかにした。休止ＣＢｔ－ＭＳＣおよび活性化ＣＢｔ－ＭＳＣに対して評価された遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）は、細胞の活性化が、いくつかの免疫制御経路（例えば、Ｔ細胞疲弊、免疫応答の負の制御、ＩＬ－６シグナル伝達およびＴ細胞アポトーシスの誘導）に関連する遺伝子の発現を誘導したことを明らかにした。

【0026】

【図10A】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。活性化ＣＢｔ－ＭＳＣおよび休止ＣＢｔ－ＭＳＣから抽出されたＲＮＡにおいて行われたＩＰＡ解析のヒートマップは、活性化ＣＢｔＭＳＣにおける接着および侵入に関係するホーミングレセプターおよび重要な接着分子をはじめとした、血管外遊出およびホーミングと関係するいくつかの遺伝子の活性化を明らかにした。

【図10B】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。フローサイトメトリーによって評価された、活性化ＣＢＴ ＭＳＣおよび休止ＭＳＣにおけるホーミングレセプター、接着分子および侵入タンパク質（メタロプロテイナーゼ）のヒートマップ。

【図10C】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。７２時間の蛍光解析の後、活性化ＣＢＴ－ＭＳＣが、コントロールＣＢｔ－ＭＳＣよりも長く、最大３日間マウスに残留したことが観察された。

【図10D】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。７２時間の蛍光解析の後、活性化ＣＢＴ－ＭＳＣが、コントロールＣＢｔ－ＭＳＣよりも長く、最大３日間マウスに残留したことが観察された。

【図10E】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。注射の３時間後、４８時間後および７２時間後にマウス組織を回収し、平均放射効率を組織別に計算した。肺については図１０Ｆ、肝臓については図１０Ｇおよび脾臓については図１０Ｈに示されているように、コントロールＭＳＣ群と比べて活性化ＣＢｔ－ＭＳＣ群では、蛍光レベルがより高い傾向が示された。

【図10F】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。注射の３時間後、４８時間後および７２時間後にマウス組織を回収し、平均放射効率を組織別に計算した。肺については図１０Ｆ、肝臓については図１０Ｇおよび脾臓については図１０Ｈに示されているように、コントロールＭＳＣ群と比べて活性化ＣＢｔ－ＭＳＣ群では、蛍光レベルがより高い傾向が示された。

【図10G】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。注射の３時間後、４８時間後および７２時間後にマウス組織を回収し、平均放射効率を組織別に計算した。肺については図１０Ｆ、肝臓については図１０Ｇおよび脾臓については図１０Ｈに示されているように、コントロールＭＳＣ群と比べて活性化ＣＢｔ－ＭＳＣ群では、蛍光レベルがより高い傾向が示された。

【図10H】活性化は、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布を高めた。注射の３時間後、４８時間後および７２時間後にマウス組織を回収し、平均放射効率を組織別に計算した。肺については図１０Ｆ、肝臓については図１０Ｇおよび脾臓については図１０Ｈに示されているように、コントロールＭＳＣ群と比べて活性化ＣＢｔ－ＭＳＣ群では、蛍光レベルがより高い傾向が示された。

【0027】

【図11A】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、新鮮な活性化ＣＢｔ－ＭＳＣと比べて、類似の生存能、表現型、およびＴ細胞活性化制御の有効性を示した。アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムアッセイを用いたフローサイトメトリーによって測定されたＣＢｔ－ＭＳＣの生存能に関する代表的なＦＡＣＳプロット。

【図11B】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、新鮮な活性化ＣＢｔ－ＭＳＣと比べて、類似の生存能、表現型、およびＴ細胞活性化制御の有効性を示した。すべての異なる比において、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されたＴ細胞の全体的な抑制を示している、Ｔ細胞増殖ＣＦＳＥアッセイの代表的なヒストグラム。

【図11C】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、新鮮な活性化ＣＢｔ－ＭＳＣと比べて、類似の生存能、表現型、およびＴ細胞活性化制御の有効性を示した。免疫抑制因子の発現の持続性を示している、新鮮なまたは凍結／解凍された細胞を用いたときの活性化ＭＳＣの表現型の代表的なＦＡＣＳプロット。

【0028】

【図12A】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減した。図１２Ａは、マウス群を用いたインビボ実験を要約している（１群につきｎ＝８匹のマウス）。未処置（ＧＶＨＤコントロール）、非活性化ＣＢｔ－ＭＳＣのレシピエント、およびレシピエント活性化ＣＢｔ－ＭＳＣの生存曲線。このデータは、非活性化ＭＳＣまたはコントロールと比べたときの、活性化ＣＢＴ－ＭＳＣのレシピエントに対する延命効果を示している。

【図12B】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減した。図１２Ｂは、マウス群を用いたインビボ実験を要約している（１群につきｎ＝８匹のマウス）。他の２群に対して活性化ＣＢｔ－ＭＳＣのレシピエントの体重減少が小さいことを示している体重変動率。

【図12C】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減した。図１２Ｃは、マウス群を用いたインビボ実験を要約している（１群につきｎ＝８匹のマウス）。活性化ＣＢＴ－ＭＳＣ群のＧＶＨＤがより低いことを再度示している平均ＧＶＨＤスコア。

【図12D】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減した。終了時点におけるマウスの３群間で比較した門脈肝臓炎症。

【図12E】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減した。未処置マウス（コントロール）、休止ＣＢｔ－ＭＳＣで処置されたマウスおよび活性化（活性化された）ＭＳＣで処置されたマウスの血液学的検査の比較。これらの血液検査には、ＷＢＣ数、ＭＣＶ、ＭＣＨＣ、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板数、ＲＢＣ数、ＭＣＨ、ＲＤＷ、アルブミン、アルカリホスファターゼ、カリウム、ＬＤＨ、ＡＳＴ、グルコース、ＡＬＴ、リン、総タンパク質が含まれる。結果は、コントロール群または非活性化ＭＳＣ群と比べて、活性化ＭＳＣで処置された群における血小板数、グルコース、ＷＢＣ数および肝機能（ＡＬＴ、ＡＳＴ）の改善を示している。

【図12F】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減した。活性化ＣＢｔ－ＭＳＣと非活性化ＣＢｔ－ＭＳＣの両方が、コントロールマウスと比べて炎症性サイトカインの存在を減少させたことを明らかにしている、マウスの血液中のサイトカインレベルの結果。

【図12G】凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣは、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減した。２４日目のマウスの血液中のヒトＣＤ４５のパーセンテージ。左のパネルは、各群の代表的なＦＡＣＳプロットを示しており、右のパネルは、コントロール群（未処置）と比較した統計比較を伴うバープロットを示しており、^＊＊ｐ値＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１は、両方のＭＳＣレシピエント群の血液中のヒトＣＤ４５^＋細胞がより少ないことを示しており、活性化ＭＳＣが、非活性化ＭＳＣレシピエントよりも少ないことを示している。

【発明を実施するための形態】

【0029】

例証的な実施形態の説明
骨髄由来のＭＳＣは、長年、難治性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するために使用されており、より最近では、虚血性脳卒中、循環器疾患、炎症性腸疾患および急性呼吸窮迫症候群をはじめとした再生医学の状況において使用されている。胎盤静脈からの臍帯血が大規模に評価されたが、骨髄と比べてＭＳＣの生成が全く一定せず、不十分であり、ＭＳＣの起源としては最適には及ばない。したがって、本開示のある特定の実施形態は、臍帯組織に由来するＭＳＣを拡大するための方法を提供する。本方法は、バイオリアクター内で大量のＣＢｔ由来ＭＳＣを作製するための、優良製造規範（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）準拠の頑強な方法を提供する。

【0030】

特に、ＭＳＣを拡大するための本方法は、プレ活性化なしで作製されたものよりも有意に抑制性であるＣＢｔ由来ＭＳＣを作製するプレ活性化工程を含み得る。プレ活性化工程は、ＭＳＣをサイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１７の存在下において培養する工程を含み得る。したがって、本方法は、新規のＧＭＰ準拠システムを用いて、より短い時間でＣＢｔ由来ＭＳＣをＢＭ由来ＭＳＣよりも大量に作製できる。ゆえに、ＣＢｔ－ＭＳＣをＢＭ由来ＭＳＣよりも安価かつ効率的に作製できる。

【0031】

本研究において、プレ活性化され、拡大されたＭＳＣは、ＢＭ由来ＭＳＣよりも多くの「幹細胞性」マーカーを発現すると見出された。それらの幹細胞性マーカーの発現が高まると、プレ活性化され、拡大されたＭＳＣが、脳、心臓、消化管および肺をはじめとした生命維持に不可欠な器官のより特異的な再生を提供できるようになり得る。本プレ活性化されたＭＳＣはまた、ＧＶＨＤでは消化管および皮膚をはじめとした炎症部位に、ならびに急性の炎症が生じている再生医学の状況では脳および心臓に、ホーミングする能力を高め得る、より高レベルの免疫抑制性因子およびケモカインレセプター（ＶＥＧＦ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＧＥ、ＣＸＣＲ４、ＩＬ－１０およびＴＧＦβを含む）を発現する。本方法によって作製された活性化ＭＳＣは、いくつかの免疫制御経路、例えば、Ｔ細胞疲弊、顆粒球の接着および血管外遊出、抗原提示経路、免疫応答の負の制御、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の正の制御、リンパ球アポトーシスプロセスの正の制御、無顆粒白血球の接着および血管外遊出、低酸素に対する細胞応答の制御、ＴＧＦβシグナル伝達、ＮＦＫβシグナル伝達、ＩＬ－６シグナル伝達、ｉＮｏｓおよびｅＮｏｓシグナル伝達１、ＳＴＡＴ４およびＰＩ３Ｋシグナル伝達の正の制御、ならびにＴ細胞アポトーシスの誘導に関連する遺伝子の発現を誘導したことも見出された。活性化されたＭＳＣは、活性化されたＣＢｔＭＳＣにおける接着および侵入に関係するホーミングレセプターおよび重要な接着分子をはじめとした、血管外遊出およびホーミングと関係するいくつかの遺伝子、例えば、ＧＬＧ１、ＶＣＡＭ１、ＣＸＣＲ４、ＩＣＡＭ１、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＳＥＬＰＧ、ＳＴＡＴ１、ＩＦＩＴＴ３、ＩＳＧ１５、ＳＴＡＴ２、ＭＸ１、ＯＡＳ１、ＩＦＩ６、ＪＡＫ２、ＴＡＰ１、ＩＦＩ３５、ＩＦＩＴＭ１、ＰＳＭ８９、ＩＲＦ１、ＩＦＩＴＭ３、ＰＴＰＮ２、ＲＥＬＡ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＪＵＮ、ＡＲＮＴ、ＨＩＦ１およびＣＵＬ２の活性化も示した。

【0032】

本システムを用いることにより、再生医学として患者に注入するための、ＧＭＰ準拠の機能的閉鎖系において多数の臨床グレードのＣＢｔ由来ＭＳＣを作製することができる。したがって、本明細書中に提供される高度に免疫抑制性のＭＳＣを、例えば、炎症状態、例えば、ＧＶＨＤおよび自己免疫疾患の処置のために、ならびに急性虚血性脳卒中、心筋損傷、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および炎症性腸疾患をはじめとした再生医学の状況において、使用するための方法がさらに本明細書中に提供される。

【0033】

Ｉ．定義
本明細書中で使用されるとき、特定の構成要素に関する「本質的に含まない」は、その特定の構成要素が、意図的に組成物に製剤化されていないことおよび／または夾雑物としてですらもしくは微量ですら存在しないことを意味するために本明細書中で使用される。ゆえに、ある組成物の任意の意図されない混入に起因する、その特定の構成要素の総量は、０．０５％未満、好ましくは、０．０１％未満である。標準的な分析方法ではその特定の構成要素の量を検出できない組成物が最も好ましい。

【0034】

本明細書中で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。請求項で使用されるとき、語「ａ」または「ａｎ」は、語「～を含む」とともに使用されるとき、１つまたは１つより多いことを意味し得る。

【0035】

請求項での用語「または」の使用は、選択肢だけを指すと明示的に示されない限り、またはそれらの選択肢が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢だけおよび「および／または」を指すという定義を支持する。本明細書中で使用されるとき、「別の」は、少なくとも第２のものまたはそれ以上のものを意味し得る。用語「約」とは、述べている値プラスまたはマイナス５％のことを指す。

【0036】

用語「間葉系幹細胞」、「間葉系間質細胞」または「ＭＳＣ」は、本明細書中で使用されるとき、中胚葉に由来する多能性体性幹細胞であって、とりわけ結合組織、骨髄の間質、脂肪細胞、真皮および筋肉を含む多様な表現型を有する子孫細胞を生成する自己再生能および自己分化能を有する多能性体性幹細胞のことを指す。ＭＳＣは、一般に、マーカーＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＨＬＡ－ＤＲが陰性であり、マーカーＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ９０およびＣＤ７３が陽性であることを特徴とする細胞マーカー発現プロファイルを有する。ＭＳＣは、任意のタイプの組織から単離され得る。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯または末梢血から単離され得る。特定の実施形態において、ＭＳＣは、骨髄由来の幹細胞である。

【0037】

用語「機能的閉鎖」とは、系全体を密閉するか、または収集システムに通じるすべての接続部に滅菌バリアフィルターを設けることによって、流体の無菌性を確保するように密封された系のことを指す。

【0038】

用語「バイオリアクター」とは、滅菌された閉鎖系において、栄養分を細胞に提供し、代謝産物を除去し、ならびに細胞成長を促す生理化学的な環境を提供する、大規模細胞培養系のことを指す。特定の態様において、生物学的および／または生化学的プロセスは、モニターされたおよび制御された環境条件および操作条件下で、例えば、ｐＨ、温度、圧力、栄養分供給および廃棄物除去の下で生じる。本開示によると、本方法とともに使用するのに適したバイオリアクターの基本クラスには、中空繊維バイオリアクターが含まれる。

【0039】

用語「中空繊維」は、バイオリアクター内に含められた細胞に栄養分（溶液中の）を送達する際に使用するためのおよびバイオリアクター内に含められた細胞から廃棄物材料（溶液中の）を除去するために使用するための、規定のサイズ、形状および密度のポアを含む（任意の形状の）中空構造を含むと意図されている。本開示では、中空繊維は、吸収性または非吸収性の材料から構築され得る。繊維には、管状の構造が含まれるが、これに限定されない。

【0040】

「免疫障害」、「免疫関連障害」または「免疫媒介性障害」とは、疾患の発症または進行において免疫応答が重要な役割を果たす障害のことを指す。免疫媒介性障害としては、自己免疫障害、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病ならびに炎症性およびアレルギー性の状態が挙げられる。

【0041】

「自己免疫疾患」とは、免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち自己抗原）に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を起こし、結果として組織に対して損傷を起こす疾患のことを指す。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、または通常、粘膜表面にコロニー形成している（共生生物として知られている）微生物などの共生生物に由来し得る。

【0042】

用語「移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）」とは、骨髄移植の一般的で重篤な合併症のことを指し、ここで、移植レシピエント自身の組織に対する、免疫学的に能力のある供与されたリンパ球の反応が存在する。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーからの幹細胞を使用するまたは含む任意の移植において起こり得る合併症である。いくつかの実施形態において、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）であり、いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤは、急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）である。

【0043】

「免疫応答のパラメータ」は、免疫応答の任意の特定の測定可能な態様であり、それらとしては、サイトカインの分泌（ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γなど）、ケモカインの分泌、遊走または細胞蓄積の変化、免疫グロブリンの産生、樹状細胞の成熟、制御性の活性、制御性Ｂ細胞の数、および免疫系の任意の細胞の増殖が挙げられるがこれらに限定されない。免疫応答の別のパラメータは、免疫学的攻撃に起因する任意の器官の構造的損傷または機能的低下である。当業者は、公知の研究室アッセイを用いて、これらのパラメータのいずれか１つの上昇を容易に判断できる。１つの非限定的な具体例では、細胞増殖を評価するために、^３Ｈ－チミジンの組み込みを評価し得る。免疫応答のパラメータの「実質的な」上昇は、コントロールと比べたときのこのパラメータの有意な上昇である。実質的な上昇の非限定的な具体例は、少なくとも約５０％の上昇、少なくとも約７５％の上昇、少なくとも約９０％の上昇、少なくとも約１００％の上昇、少なくとも約２００％の上昇、少なくとも約３００％の上昇および少なくとも約５００％の上昇である。同様に、免疫応答のパラメータの阻害または低下は、コントロールと比べたときのこのパラメータの有意な低下である。実質的な低下の非限定的な具体例は、少なくとも約５０％の低下、少なくとも約７５％の低下、少なくとも約９０％の低下、少なくとも約１００％の低下、少なくとも約２００％の低下、少なくとも約３００％の低下および少なくとも約５００％の低下である。統計的検定、例えば、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡまたはＴ検定を用いることにより、第２の作用物質を用いて応答するサンプルのパーセントと比べたときの、１つの作用物質によって誘導される応答の規模の差を比較することができる。いくつかの例では、ｐ≦０．０５が有意であり、観察される任意のパラメータの上昇または低下が確率変動に起因する確率が５％未満であることを示唆する。当業者は、有用な他の統計的アッセイを容易に特定できる。

【0044】

疾患もしくは状態を「処置する」または疾患もしくは状態の処置とは、その疾患の徴候または症状を軽減する目的で、１つ以上の薬物を患者に投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。処置の望ましい効果としては、疾患の進行速度の低下、疾患状態の回復または緩和、および予後の緩解または改善が挙げられる。軽減は、現れる疾患または状態の徴候または症状が現れた後のみならず現れる前に生じ得る。したがって、「処置する」または「処置」は、疾患または望ましくない状態を「予防する」またはそれらの「予防」を含み得る。さらに、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、詳細には、患者に対して周辺効果しか及ぼさないプロトコルを含む。

【0045】

本願全体にわたって使用される用語「治療効果」または「治療的に有効な」とは、この状態に対する医学的処置に関して被験体の福祉を促進または向上する何らかのことを指す。これには、ある疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の処置は、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の成長速度の低下、または転移の予防を含み得る。癌の処置とは、癌を有する被験体の生存時間の延長のことも指し得る。

【0046】

「被験体」および「患者」とは、ヒトまたは非ヒト、例えば、霊長類、哺乳動物および脊椎動物のことを指す。特定の実施形態において、被験体は、ヒトである。

【0047】

本明細書中で広く使用されるとき、「薬学的に許容され得る」とは、適正な医学的判断の範囲内であって、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応なしに、または合理的なベネフィット／リスク比に見合う他の問題もしくは合併症なしに、人間および動物の組織、器官および／または体液との接触において使用するのに適した、化合物、材料、組成物および／または剤形のことを指す。

【0048】

「薬学的に許容され得る塩」は、上で定義されたように薬学的に許容され得る、かつ所望の薬理学的活性を有する、本明細書中に開示される化合物の塩を意味する。そのような塩には、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）；または有機酸（例えば、１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、３－フェニルプロピオン酸、４，４’－メチレンビス（３－ヒドロキシ－２－エン－１－カルボン酸）、４－メチルビシクロ［２．２．２］オクタ－２－エン－１－カルボン酸、酢酸、脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ｏ－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ－クロロベンゼンスルホン酸、フェニル置換アルカン酸、プロピオン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第三級ブチル酢酸、トリメチル酢酸など）と形成される酸付加塩が含まれる。薬学的に許容され得る塩には、存在する酸性プロトンが無機塩基または有機塩基と反応できるときに形成され得る塩基付加塩も含まれる。許容され得る無機塩基としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウムおよび水酸化カルシウムが挙げられる。許容され得る有機塩基としては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ－メチルグルカミンなどが挙げられる。本発明の任意の塩が、全体として薬理学的に許容され得る限り、その塩の一部を形成する特定の陰イオンまたは陽イオンは重要ではないことが認識されるべきである。薬学的に許容され得る塩ならびにそれらの調製方法および使用方法のさらなる例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ＆ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ ｅｄｓ．，Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００２）に提示されている。

【0049】

「薬学的に許容され得るキャリア」、「薬物キャリア」または単に「キャリア」は、化学物質の運搬、送達および／または輸送に関わる活性成分薬剤とともに製剤化される、薬学的に許容され得る物質である。薬物キャリアは、例えば、薬物バイオアベイラビリティを調節するため、薬物代謝を低減するためおよび／または薬物毒性を低減するための制御放出技術をはじめとした、薬物の送達および有効性を改善するために使用され得る。いくつかの薬物キャリアは、特定の標的部位への薬物送達の有効性を高め得る。キャリアの例としては、リポソーム、ミクロスフェア（例えば、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）からできているもの）、アルブミンミクロスフェア、合成ポリマー、ナノ繊維、タンパク質－ＤＮＡ複合体、タンパク質結合体、赤血球、ビロソームおよびデンドリマーが挙げられる。

【0050】

用語「培養する」とは、好適な培地中で細胞をインビトロにおいて維持、分化および／または増殖することを指す。「濃縮される」は、ある細胞が生物内に存在している組織で見られるパーセンテージよりも高い、全細胞に対するパーセンテージで存在する細胞を含む組成物を意味する。

【0051】

「単離された」生物学的構成要素（例えば、血液学的材料の一部、例えば、血液構成要素）とは、その構成要素が天然に存在する生物の他の生物学的構成要素から実質的に分離または精製された構成要素のことを指す。単離された細胞は、その細胞が天然に存在する生物の他の生物学的構成要素から実質的に分離または精製された細胞である。

【0052】

本明細書中で使用されるとき、用語「実質的に」は、所望の構成要素の少なくとも８０％、より好ましくは、所望の構成要素の９０％、または最も好ましくは、所望の構成要素の９５％を含む組成物を表すために用いられる。いくつかの実施形態において、その組成物は、所望の構成要素の少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％を含む。

【0053】

ＩＩ．間葉系間質細胞
本開示は、ＭＳＣの拡大に関する。培養において使用されるＭＳＣとしては、任意の幹細胞起源、例えば、臍帯、臍帯血、胎盤、胚性幹細胞、脂肪組織、骨髄または他の組織特異的間葉に由来する細胞が挙げられ得る。これらのサンプルは、新鮮サンプル、凍結サンプルまたは冷蔵サンプルであり得る。特定の態様において、ＭＳＣは、臍帯組織、およびこれらのＣＢｔ由来ＭＳＣを拡大するための方法に由来する。特定の態様において、ＭＳＣは、自家性または同種異系であり得るヒトＭＳＣである。

【0054】

Ａ．臍帯組織からのＭＳＣの単離
１つの実施形態において、ＭＳＣは、１つ以上の酵素活性の存在下において単離される。組織からの細胞単離において使用するための広範囲の消化酵素が当該分野で公知であり、それらには、消化性が低いと考えられている酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から消化性が高いと考えられている酵素（例えば、パパインおよびトリプシン）に及ぶ酵素が含まれる。現在好ましいのは、粘液溶解性（ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ）酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシンまたはエラスターゼ）およびデオキシリボヌクレアーゼである。より好ましいのは、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼおよび粘液溶解性活性から選択される酵素活性である。細胞は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびディスパーゼのうちの１つ以上の活性の存在下において単離され得る。

【0055】

臍帯組織は、哺乳動物、例えば、ヒトから入手され得る。特に、臍帯組織は、待機的帝王切開術の後の正期新生児から入手される。臍帯組織は、ペニシリン／ストレプトマイシンなどを含むプラズマライト（ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）に入れられた状態で運ばれ得る。次いで、臍帯組織は、分割され、例えば、３０～９０分間、特に７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０分間、３０～４０℃、特に３７℃においてインキュベートされ得る。

【0056】

臍帯組織は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよび／またはＤＮＡｓｅを含む本明細書中に提供される酵素カクテル中で解離され得る。特に、コラゲナーゼは、コラゲナーゼ－ＮＢ４／６（Ｓｅｒｖａ）である。次いで、臍帯組織は、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）などの解離装置（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ）において解離され得る。次いで、その細胞懸濁液が、濾過され、洗浄され、培地、例えば、ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐとともに１０％血小板溶解物、Ｌ－グルタミン、ヘパリンを含むアルファ－ＭＥＭ培地（完全培地）に再懸濁され、Ｔ１７５フラスコに播種され、次いで、ＭＳＣが約８０％コンフルエントになるまで培養される。次いで、それらの細胞は、回収され、抗生物質を含まない完全培地を用いて約８０％コンフルエンスまで拡大される。その培養は、約６～８日間、特に約７日間であり得る。

【0057】

ＭＳＣ培養用の細胞培養表面としては、標準的な組織培養容器および２次元表面（シート、スライド、培養皿、培養フラスコ、バッグ、培養ボトルまたはマルチウェルディッシュを含む）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0058】

上記成長条件を提供することにより、細胞に対する培養液、サプリメント、雰囲気の条件および相対湿度に関する広範囲の選択肢が可能になる。好ましい温度は、３７℃であるが、しかしながら、温度は、他の培養条件および細胞または培養物の所望の用途に応じて、約３５℃～３９℃の範囲であり得る。

【0059】

当業者は、成長培地に補充されるものが多様であり得ること、および成長培地が当該分野で公知の任意の方法で変更され得ること、および特定の理由のために最適化され得ることを認識するだろう。さらに、上記細胞は、血清添加の非存在下の既知組成の培地をはじめとした他の多くの培養液中でも成長できる。いくつかのそのような培地が、下記に例証される。上記細胞の通例の培養および維持に加えて、そのような分化能のある（ｐｏｔｅｎｔ）細胞から特定の細胞型または特定の細胞の祖先への分化に影響するための他の多くの培地が当該分野で公知である。当業者は、これらの培地が多くの目的に有用であり、本発明の範囲内に含められるが、必ずしも通例の培養および拡大にとって好ましいわけではないことを認識するだろう。

【0060】

培養液に対する上記細胞の柔軟性に加えて、それらの細胞は、種々の環境条件下で成長できる。特に、上記細胞は、広範囲の雰囲気条件下で成長できる。現在好ましいのは、約５％～約２０％Ｏ_２の範囲またはそれ以上のＯ_２の雰囲気である。上記細胞は、これらの条件下、通常、約５％ＣＯ_２の存在下において、および窒素としての大気のバランスにおいて、成長培地中で十分に成長し、拡大する。当業者は、上記細胞が、種々の培地中のより広い範囲の条件を許容し得ること、および特定の目的に対する最適化が適切であり得ることを認識するだろう。

【0061】

培養前の細胞の凍結保存または本明細書中に開示される拡大された細胞の凍結保存は、公知の方法に従って行われ得る。例えば、細胞を「凍結培地」、例えば、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含み、５～１０％グリセロールも含むまたは含まない培養液に、例えば、約１～２×１０^６細胞／ｍｌの密度で懸濁し得る。それらの細胞を、ガラスバイアルまたはプラスチックバイアルに分注し得、次いで、密封し、プログラマブルフリーザーまたはパッシブフリーザーの凍結チャンバーに移し得る。最適な凍結速度は、経験的に決定され得る。例えば、融解熱によって約－１℃／分の温度変化をもたらす凍結プログラムが使用され得る。細胞を含むバイアルが－８０℃に到達したら、それらは液体窒素貯蔵領域に移され得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、任意の幹細胞起源から単離されたばかりの細胞を凍結保存して、細胞バンクを構成してもよく、必要に応じ、その一部を解凍することによって取り出し、次いでそれを用いて本発明の拡大された細胞を作製してもよい。解凍は、迅速に、例えば、バイアルを液体窒素から３７℃のウォーターバスに移すことによって、行われ得る。解凍されたバイアルの内容物は直ちに、栄養培地（ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）などの適切な培地を含む培養容器に滅菌条件下で移され得る。それらの細胞を、培養中に、例えば倒立顕微鏡を用いて細胞増殖を検出するために毎日調べてよく、適切な密度に到達したらすぐに継代培養してよい。

【0063】

必要に応じ、細胞を細胞バンクから取り出し、インビトロにおいて、例えば、３次元足場培養物として、またはインビボにおいて、例えば、組織の再構成または修復が必要とされる部位に細胞を直接投与することによって、新しい幹細胞または組織の作製に用いてよい。本明細書中に記載されるように、本開示の拡大されたＭＳＣは、それらの細胞が最初に被験体自身の組織から単離された被験体において組織を再構成または修復するために使用され得る（すなわち、自己細胞）。あるいは、本明細書中に開示される拡大されたＭＳＣは、任意の被験体において組織を再構成または修復するためのユビキタスなドナー細胞として使用され得る（すなわち、異種細胞）。

【0064】

Ｂ．ＭＳＣのプレ活性化
次いで、臍帯組織から単離されたＭＳＣは、プレ活性化のためにサイトカインの存在下において培養され得る。そのサイトカインは、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１βおよび／またはＩＬ－１７であり得、特に、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１７である。プレ活性化工程は、約１２～２４時間、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９時間、特に１６時間であり得る。ＴＮＦα、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－１βは、５～１５ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ｎｇ／ｍＬ、特に約１０ｎｇ／ｍＬであり得る。ＩＬ－１７は、２０～４０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば、２５、３０または３５ｎｇ／ｍＬ、特に約３０ｎｇ／ｍＬで存在し得る。

【0065】

Ｃ．バイオリアクター内でのＭＳＣの拡大
次いで、上記ＭＳＣは、バイオリアクターなどの機能的閉鎖系において拡大され得る。拡大は、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｔｅｒｕｍｏ）において、例えば、４～１０日間、特に５～６日間、行われ得る。

【0066】

バイオリアクターは、静的バイオリアクター、撹拌フラスコバイオリアクター、回転壁容器バイオリアクター、中空繊維バイオリアクターおよび直接灌流バイオリアクターを含む一般的なカテゴリーに従ってグループ化され得る。バイオリアクター内では、細胞は、浮遊していてもよく、または多孔性の３次元足場（ヒドロゲル）上に播種されて固定化されていてもよい。

【0067】

中空繊維バイオリアクターは、培養中の物質移動を向上させるために使用され得る。中空繊維バイオリアクターは、中空繊維に基づいた３Ｄ細胞培養系であり、その中空繊維は、１０～３０ｋＤａという典型的な分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）範囲を有する並行して配置された小型の半透性毛細管膜である。これらの中空繊維膜は、束ねられて、管状のポリカーボネートシェル内に収容されて、中空繊維バイオリアクターカートリッジを形成していることが多い。入口および出口が付いているそれらのカートリッジ内は、中空繊維内の毛細管内（ＩＣ）の空間と中空繊維の周りの毛細管外（ＥＣ）の空間の２コンパートメントである。

【0068】

したがって、本開示の場合、バイオリアクターは、中空繊維バイオリアクターであり得る。中空繊維バイオリアクターは、その繊維の管腔内に細胞が包埋されていて、管腔外の空間を培地が灌流していてもよいし、あるいは、中空繊維を通って気体および培地の灌流を提供して、管腔外の空間内で細胞が成長してもよい。本開示に適した中空繊維バイオリアクターは、当該分野で公知であり、それらとしては、Ｃａｒｉｄｉａｎ（Ｔｅｒｕｍｏ）ＢＣＴ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられ得るが、これに限定されない。

【0069】

中空繊維は、バイオリアクターにおける栄養分の送達および廃棄物の除去に適しているべきである。中空繊維は、任意の形状であってよく、例えば、円形および管状または同心円状の輪の形状であってよい。中空繊維は、吸収性または非吸収性の膜で構成され得る。例えば、中空繊維の好適な構成要素としては、ポリジオキサノン、ポリラクチド、ポリグラクチン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／トリメチレンカーボネート、セルロース、メチルセルロース、セルロースポリマー、セルロースエステル、再生セルロース、プルロニック（登録商標）、コラーゲン、エラスチンおよびそれらの混合物が挙げられる。

【0070】

バイオリアクターは、細胞を播種する前にプライミングされ得る。そのプライミングは、ＰＢＳなどの緩衝液で洗い流すことを含み得る。プライミングは、バイオリアクターをフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングすることも含み得る。次いで、そのバイオリアクターは、アルファＭＥＭなどの培地で洗浄され得る。

【0071】

上記ＭＳＣは、バイオリアクターに約１００～１，０００細胞／ｃｍ^２、例えば、約１５０細胞／ｃｍ^２、約２００細胞／ｃｍ^２、約２５０細胞／ｃｍ^２、約３００細胞／ｃｍ^２、例えば、約３５０細胞／ｃｍ^２、例えば、約４００細胞／ｃｍ^２、例えば、約４５０細胞／ｃｍ^２、例えば、約５００細胞／ｃｍ^２、例えば、約５５０細胞／ｃｍ^２、例えば、約６００細胞／ｃｍ^２、例えば、約６５０細胞／ｃｍ^２、例えば、約７００細胞／ｃｍ^２、例えば、約７５０細胞／ｃｍ^２、例えば、約８００細胞／ｃｍ^２、例えば、約８５０細胞／ｃｍ^２、例えば、約９００細胞／ｃｍ^２、例えば、約９５０細胞／ｃｍ^２または約１０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種され得る。特に、それらの細胞は、約４００～５００細胞／ｃｍ^２の細胞密度、例えば、約４５０細胞／ｃｍ^２で播種され得る。

【0072】

バイオリアクターに播種される細胞の総数は、約１．０×１０^６～約１．０×１０^８細胞、例えば、約１．０×１０^６～５．０．０×１０^６、５．０×１０^６～１．０×１０^７、１．０×１０^７～５．０×１０^７、５．０×１０^７～１．０×１０^８細胞であり得る。特定の態様において、バイオリアクターに播種される細胞の総数は、約１．０×１０^７～約３．０×１０^７、例えば、約２．０×１０^７細胞である。

【0073】

上記細胞は、任意の好適な細胞培養液に播種されてよく、それらの多くは、商業的に入手可能である。例示的な培地としては、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、Ｍｅｄｉａ１９９、ＨＡＭＳなどが挙げられる。１つの実施形態において、培地は、アルファＭＥＭ培地、特に、Ｌ－グルタミンが補充されたアルファＭＥＭである。培地は、以下のうちの１つ以上が補充され得る：成長因子、サイトカイン、ホルモンまたはＢ２７、抗生物質、ビタミンおよび／または小分子薬物。特に、培地は、無血清であり得る。

【0074】

いくつかの実施形態において、上記細胞は、室温でインキュベートされ得る。恒温器は、加湿され得、約５％ＣＯ_２かつ約１％Ｏ_２である雰囲気を有し得る。いくつかの実施形態において、ＣＯ_２濃度は、約１～２０％、２～１０％または３～５％の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、Ｏ_２濃度は、約１～２０％、２～１０％または３～５％の範囲であり得る。

【0075】

ＩＩＩ．使用方法
本開示の拡大されたＭＳＣは、疾患および損傷の処置および回復において幅広く応用される。本開示の拡大されたＭＳＣは、組織の修復、再構成および再生ならびに遺伝子の送達をはじめとした多くの治療用途において有用である。本開示のＭＳＣは、系統拘束（ｌｉｎｅａｇｅ－ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞と無拘束（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞の両方を含み得るので、複数の治療目標を達成するために、両方の細胞型を一緒に、いくつかの実施形態では同時に用いることができる。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の拡大されたＭＳＣは、幹細胞移植片として直接使用できるか、または本明細書中の上記で述べたように懸濁液中もしくは細胞培養支持足場上の幹細胞移植片として使用できる。

【0076】

本開示のある特定の実施形態は、炎症性障害または免疫媒介性障害を処置または予防するために本明細書中に提供されるＭＳＣを使用するための方法に関する。その方法は、治療有効量のＭＳＣを被験体に投与することによってその被験体における炎症性障害または免疫媒介性障害を処置または予防する工程を含む。

【0077】

本方法に従って作製されたＭＳＣは、実験的および治療的な用途をはじめとした多くの潜在的な用途を有する。特に、そのような細胞集団は、望ましくないまたは不適当な免疫応答を抑制する際に極めて有用であることが想定される。

【0078】

１つの実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患に罹患している被験体に、本明細書中に提供されるＭＳＣが投与される。１つの実施形態において、その被験体は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および自己免疫性睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック多発性皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐａｔｅ－ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化群、巣状糸球体硬化症または膜性腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎または疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書中に開示される方法を用いて処置され得る自己免疫疾患のいくつかの例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。被験体は、喘息などのアレルギー性障害も有し得る。

【0079】

さらに別の実施形態では、被験体は、移植される器官または幹細胞のレシピエントであり、拡大されたＭＳＣを用いて、拒絶反応が予防および／または処置される。特定の実施形態において、被験体は、移植片対宿主病を有するか、または移植片対宿主病を発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーからの幹細胞を使用するまたは含む任意の移植に関して起こり得る合併症である。ＧＶＨＤには、急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後の最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、手および足における赤みがかった発疹が挙げられ、それは、剥皮または皮膚の水疱形成を伴って広がることがあり、より重篤になることがある。急性ＧＶＨＤは、胃および腸にも影響することがあり、その場合、筋痙攣、悪心および下痢が認められる。皮膚および目の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響していることを示唆する。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいて等級付けされる：ステージ／グレード１が軽度であり；ステージ／グレード４が重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植の３ヶ月後またはそれ以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、さらに、慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液腺、口の唾液腺ならびに胃壁および腸を滑らかにする腺にも影響し得る。移植される器官の例としては、臓器移植片、例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺および／または心臓、あるいは細胞移植片、例えば、小島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄または造血性幹細胞もしくは他の幹細胞が挙げられる。移植片は、複合性の移植片、例えば、顔面の組織であり得る。ＭＳＣは、移植の前、移植と同時、または移植の後に、投与され得る。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、移植の前に、例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週間前、少なくとも２週間前、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前または少なくとも１ヶ月前に投与される。１つの非限定的な具体例では、治療有効量のＭＳＣの投与は、移植の３～５日前に行われる。

【0080】

さらなる実施形態において、被験体への治療有効量のＭＳＣの投与は、その被験体における炎症を処置または阻害する。したがって、上記方法は、治療有効量のＭＳＣを被験体に投与して炎症過程を阻害する工程を含む。炎症性障害の例としては、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染症または慢性細菌感染症に起因する慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示される方法は、アレルギー性障害を処置するためにも用いることができる。

【0081】

ＭＳＣの投与は、免疫抑制または炎症阻害が所望であるときはいつでも、例えば、疾患または炎症の最初の徴候または症状が現れたときはいつでも利用できる。これらは、一般的な徴候または症状、例えば、疼痛、浮腫、体温上昇であってもよいし、罹患器官の機能不全に関係する特定の徴候または症状であってもよい。例えば、腎臓移植片拒絶では、血清クレアチニンレベルの上昇があり得るのに対して、ＧＶＨＤでは、発疹があり得、喘息では、息切れおよび喘鳴があり得る。

【0082】

ＭＳＣの投与は、目的の被験体における免疫媒介性疾患を予防するためにも利用され得る。例えば、ＭＳＣは、移植レシピエントになる予定の被験体に移植の前に投与され得る。別の例では、ＭＳＣは、Ｔ細胞枯渇なしで同種異系骨髄移植を受ける被験体に投与される。さらなる例では、ＭＳＣは、糖尿病の家族歴を有する被験体に投与され得る。他の例では、ＭＳＣは、喘息発作を予防するために、喘息を有する被験体に投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量のＭＳＣが、症状に先立って被験体に投与される。ＭＳＣの投与は、制御性細胞を含まない他の治療を受けた患者と比べて、その後の免疫学的事象もしくは症状（例えば、喘息発作）の発生率もしくは重症度の低下または患者の生存時間の改善をもたらし得る。

【0083】

処置の有効性は、当業者に公知の多くの方法によって測定され得る。１つの実施形態では、白血球数（ＷＢＣ）を用いて、被験体の免疫系の応答性を測定する。ＷＢＣは、被験体における白血球の数を測る。当該分野で周知の方法を用いて、被験体の血液サンプル中の白血球を、他の血液細胞から分離し、計数する。白血球の正常値は、約４，５００～約１０，０００白血球／μｌである。それより少ない白血球数は、その被験体における免疫抑制の状態を示唆し得る。

【0084】

別の実施形態において、被験体における免疫抑制は、Ｔリンパ球の数を用いて測定され得る。当該分野で周知の方法を用いて、被験体の血液サンプル中の白血球を、他の血液細胞から分離する。Ｔリンパ球は、当該分野における標準的な方法、例えば、免疫蛍光法またはＦＡＣＳを用いて、他の白血球と区別される。Ｔ細胞またはＴ細胞の特定の集団の数の減少は、免疫抑制の尺度として使用できる。処置前のＴ細胞の数（または特定の集団内の細胞の数）と比べたときの、Ｔ細胞の数またはＴ細胞の特定の集団の数の減少を用いることにより、免疫抑制が誘導されたことを示すことができる。

【0085】

他の例では、炎症を評価するために、炎症部位における好中球浸潤が測定され得る。好中球浸潤を評価するために、ミエロペルオキシダーゼ活性が測定され得る。ミエロペルオキシダーゼは、多形核白血球および単球のアズール親和性顆粒に存在する血液タンパク質である。ミエロペルオキシダーゼは、ハロゲン化物イオンがそれらのそれぞれの次亜ハロゲン酸に酸化するのを触媒し、それらの次亜ハロゲン酸は、微生物殺滅のために食細胞によって使用される。したがって、組織におけるミエロペルオキシダーゼ活性の低下は、好中球浸潤の低減を反映し、炎症阻害の尺度として働き得る。

【0086】

別の例では、被験体の有効な処置は、その被験体におけるサイトカインレベルを測定することによって測定され得る。体液中または細胞サンプル中のサイトカインレベルが、従来の方法によって測定される。例えば、酵素免疫スポットまたは「ＥＬＩＳＰＯＴ」アッセイなどのイムノスポットアッセイが使用され得る。このイムノスポットアッセイは、単一細胞レベルでサイトカイン分泌を検出するための高感度の定量的アッセイである。イムノスポット法および応用法は、当該分野で周知であり、例えば、欧州特許第９５７３５９号に記載されている。標準的なイムノスポットアッセイの変法が当該分野で周知であり、それは、本開示の方法においてサイトカイン産生の変化を検出するために用いることができる（例えば、米国特許第５，９３９，２８１号および米国特許第６，２１８，１３２号を参照のこと）。

【0087】

治療有効量のＭＳＣは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、心臓内もしくは関節内注射または注入をはじめとしたいくつかの経路によって投与され得る。

【0088】

免疫抑制の誘導または炎症の処置もしくは阻害において使用するためのＭＳＣの治療有効量は、処置される被験体において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するために必要なＭＳＣの量、または自己免疫性疾患もしくは同種免疫性疾患を後退させるために必要なＭＳＣの量、または自己免疫疾患によって引き起こされる症状、例えば、疼痛および炎症を和らげることができるＭＳＣの量であり得る。これは、炎症に伴う症状、例えば、疼痛、浮腫および体温上昇を和らげるために必要な量であり得る。これは、移植された器官の拒絶反応を減少させるまたは予防するために必要な量でもあり得る。

【0089】

上記ＭＳＣは、疾患状態を回復させるために、上記疾患と一致した処置レジメンで、例えば、１日から数日間にわたって１回または数回で、投与され得るか、または疾患の進行を阻害するためおよび疾患の再発を予防するために、長期間にわたる定期的な投与で投与され得る。製剤において用いられる正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度にも依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。ＭＳＣの治療有効量は、処置される被験体、苦痛の重症度およびタイプならびに投与様式に依存する。いくつかの実施形態において、ヒト被験体の処置において使用され得る用量は、少なくとも３．８×１０^４、少なくとも３．８×１０^５、少なくとも３．８×１０^６、少なくとも３．８×１０^７、少なくとも３．８×１０^８、少なくとも３．８×１０^９または少なくとも３．８×１０^１０制御性細胞／ｍ^２で変動する。ある特定の実施形態において、ヒト被験体の処置において使用される用量は、約３．８×１０^９～約３．８×１０^１０制御性細胞／ｍ^２で変動し得る。さらなる実施形態において、ＭＳＣの治療有効量は、約５×１０^６細胞／ｋｇ体重～約７．５×１０^８細胞／ｋｇ体重、例えば、約２×１０^７細胞～約５×１０^８細胞／ｋｇ体重または約５×１０^７細胞～約２×１０^８細胞／ｋｇ体重で変動し得る。ＭＳＣの正確な量は、被験体の年齢、体重、性別および生理学的状態に基づいて当業者によってすぐに決定される。有効量は、インビトロモデルまたは動物モデルの試験系から導かれた用量反応曲線から外挿され得る。

【0090】

本開示の拡大されたＭＳＣは、投与前にキャリア媒質中に入れられ得る。注入に向けて、本開示の拡大されたＭＳＣは、任意の生理的に許容され得る媒質に入れられた状態で、静脈内を含む血管内に投与され得るが、再生および分化にとって適切な部位がそれらの細胞にあり得る場合、それらは、骨髄などの他の好都合な部位に導入されてもよい。通常、少なくとも約１×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとも約５×１０^５細胞／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約９×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも約１０×１０^６細胞／ｋｇまたはそれ以上が投与される。例えば、Ｂａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７：６３５－６４５を参照のこと。ＭＳＣは、注射、カテーテル法などをはじめとした任意の方法によって導入され得る。所望であれば、さらなる薬物または成長因子が同時投与され得る。興味深い薬物としては、５－フルオロウラシル、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－３、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγおよびエリトロポイエチンなどのサイトカインを含む成長因子が挙げられる。さらに、ＭＳＣは、コラーゲン、マトリゲルを伴ってそれらだけでまたは他のヒドロゲルとともに注射され得る。

【0091】

１つの実施形態において、本開示の拡大されたＭＳＣ集団は、損傷したまたは罹患した間葉系組織（例えば、心臓、膵臓、肝臓、脂肪組織、骨、軟骨、内皮、神経、アストロサイト、真皮など）を修復または再構成するために使用され得る。拡大されたＭＳＣが、損傷部位に移動するかまたは配置されると、それらは、分化して新しい組織を形成し、器官の機能を補完できる。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、血管新生を促進するために使用され、ゆえに酸素供給および組織からの廃棄物除去を改善する。これらの実施形態では、本開示の拡大されたＭＳＣを用いることにより、分化した組織および器官（例えば、心不全におけるような虚血性心臓または脳卒中におけるような虚血性神経）の機能を高めることができる。

【0092】

本開示の拡大されたＭＳＣは、遺伝子治療を必要とする患者において遺伝子治療のためにも使用され得る。いくつかの実施形態では、特に、一過性の遺伝子発現が必要とされる場合、または細胞の成熟および分裂によって遺伝子導入が促される場合に、より成熟した系統拘束細胞が有用であり得る。例えば、いくつかのレトロウイルスベクターは、遺伝子がインテグレートされるために細胞が細胞周期を繰り返す（ｃｙｃｌｉｎｇ）ことを必要とする。新しい治療的な遺伝子を送達するために幹細胞および前駆細胞に形質導入するための方法は、当該分野で公知である。

【0093】

投与されるＭＳＣは、本明細書中に記載される細胞とさらなる目的の細胞との混合物も含み得る。さらなる目的の細胞としては、分化した肝臓細胞、分化した心筋、分化した膵臓細胞などが挙げられるがこれらに限定されない。

【0094】

拡大されたＭＳＣは、免疫媒介性障害を処置するための１つ以上の他の治療薬と併用して投与され得る。併用療法としては、１つ以上の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫枯渇剤（ｉｍｍｕｎｅ－ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリンまたは糖質コルチコイド、例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、糖質コルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）または非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェンまたはナプロキセンナトリウム））、サイトカイン（例えば、インターロイキン－１０またはトランスフォーミング成長因子－ベータ）、ホルモン（例えば、エストロゲン）またはワクチンが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、抗体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧまたはＢ細胞を認識する抗体）；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；照射；またはケモカイン、インターロイキンまたはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、抗ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含むがこれらに限定されない免疫抑制剤または免疫寛容誘発剤が投与され得る。そのようなさらなる医薬品は、所望の効果に応じて制御性Ｂ細胞の投与前、投与中または投与後に投与され得る。上記細胞および作用物質のこの投与は、同じ経路または異なる経路による投与、および同じ部位または異なる部位における投与であり得る。

【0095】

ＩＶ．キット
いくつかの実施形態において、例えば、ＭＳＣを作製するための１つ以上の培地および構成要素を含み得るキットが提供される。そのような製剤は、因子のカクテルを、ＭＳＣとの併用に適した形態で含み得る。その試薬系は、必要に応じて、水性の媒質に入れられた状態または凍結乾燥された形態で包装され得る。キットの容器手段としては、構成要素が入れられ得る、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が一般に挙げられる。キットに１つより多い構成要素が存在する場合、そのキットは、通常、さらなる構成要素が別々に入れられ得る第２の、第３のまたは他のさらなる容器も含む。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、１つのバイアルに含められてもよい。キットの構成要素は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および／または構成要素が、乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成され得る。その溶媒は、別の容器手段内に提供されてもよいことが想定される。キットは、典型的には、商業的販売のためにキットの構成要素を閉じ込めた状態で含めるための手段も含む。そのような容器としては、所望のバイアルを保持する射出成形またはブロー成形のプラスチック容器が挙げられ得る。キットは、使用するための指示書、例えば、印刷された形式またはデジタル形式などの電子的な形式の指示書も含み得る。

【実施例】

【0096】

Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本発明の実施において十分に機能すると本発明者らが発見した手法であり、ゆえにその実施にとって好ましい形式であると考えることができることが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それらの変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、なおも同様または類似の結果をもたらすと認識するべきである。

【0097】

実施例１－間葉系間質細胞の拡大
Ｔｅｒｕｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎシステム（使用したバイオリアクター）は、ＧＭＰに適合した細胞作製のために設計された自動中空繊維細胞培養プラットフォームである。簡潔には、臍帯組織を正常分娩から入手し、ヒアルロニダーゼ含有酵素カクテル（コラゲナーゼＮＢ６ ０．５Ｕ／ｍｌ、ヒアルロニダーゼ１Ｕ／ｍｌおよびＤＮＡｓｅ２５０Ｕ／ｍｌ）を使用してその組織を消化した。消化後、その細胞をフラスコにプレーティングし、数日間培養した。細胞が約８５％コンフルエントになったら、トリプシン処理し、再度プレーティングし、培養し、コンフルエントになったら、継代数１（Ｐ１）として取り出し、凍結した（図１）。

【0098】

次いで、Ｐ１細胞を解凍し、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒにおいて４～６日間拡大した（培養密度に達するまで）。そのバイオリアクター内のグルコースレベルおよびラクテートレベルに基づいて理想的な培養密度が特定されたら、その細胞を、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１７を含む本サイトカイン組み合わせで１６時間プレ活性化し、洗浄し、回収し、様々なアッセイにおいて評価するか、または臨床での使用に向けて凍結した（図２）。

【0099】

２０００万個の臍帯組織由来ＭＳＣおよび骨髄由来ＭＳＣをそのバイオリアクターに加えたとき、臍帯組織を用いて作製されたＭＳＣの数は、より短い時間で、骨髄由来のＭＳＣの数のほぼ２倍になった（図３）。ＣＢｔ－ＭＳＣは、有意に多い数の「幹細胞性」マーカーＮｅｓｔｉｎ、Ｓｔｒｏ－１、Ｏｃｔ－４、ＮａｎｏｇおよびＣｏｘ－２を発現した（図５）。重要なことには、プレ活性化されたＣＢｔ－ＭＳＣは、ベースラインの（活性化されていない）ＣＢｔ－ＭＳＣまたはＢＭ－ＭＳＣよりも抑制性であった（図５）。それらは、より高レベルの抗アポトーシス因子（ＶＧＥＦ、ＴＧＦβ）、抗炎症／抗増殖因子（ＴＳＧ－６）、免疫調節因子（ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ、ＰＧＥ２、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ）および化学誘引ホーミング因子（ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３）を発現した（図６）。したがって、プレ活性化され、拡大されたＣＢｔ－ＭＳＣは、臨床的に妥当な多い量で効率的に作製され、他のＭＳＣ調製物よりも高い治療効果を有した（図７）。

【0100】

実施例２－材料および方法
ＣＢｔは、待機的帝王切開術の後の、正期新生児の同意した健康な母体から入手した。そのＣＢｔを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むプラズマライトに入れた状態で運んだ。そのＣＢｔを７等分に切断し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）において、コラゲナーゼ－ＮＢ４／６（Ｓｅｒｖａ）およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含み、ＤＮａｓｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含むまたは含まない、様々な酵素の組み合わせを含むＣ－Ｔｕｂｅｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）内で３７℃において７６分間インキュベートした。その細胞懸濁液を濾過し、洗浄し、ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐとともに１０％血小板溶解物、Ｌ－グルタミン、ヘパリンを含むアルファ－ＭＥＭ培地（完全培地）に再懸濁し、Ｔ１７５フラスコに播種し、次いで、ＭＳＣが８０％コンフルエントになるまで培養した。それらの細胞を回収し、抗生物質を含まない完全培地を用いてＴ１７５フラスコにおいて８０％コンフルエンスまで拡大してＰ１とした。

【0101】

Ｐ１の回収後、ＭＳＣを典型的なＭＳＣ表面マーカーの発現についてフローサイトメトリーによって解析し、凍結保存した。続いて、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｔｅｒｕｍｏ）において５～６日間、拡大を行った。ＣＢｔ－ＭＳＣの免疫抑制能を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖アッセイ（ＣＦＳＥ）およびＣＤ４^＋Ｔ細胞サイトカイン分泌アッセイによってインビトロで試験した。ＣＢｔ－ＭＳＣの半数をインターフェロンガンマでプレ活性化し、次いで、９６ウェルプレートに播種し、残りの半数を未処置で播種した。翌日、そのＭＳＣを、単離された１０^５個のＣＤ４^＋Ｔ細胞と１：１、１：２、１：１０および１：２０の比でインキュベートした。ネガティブコントロールを除くすべてのウェルにＣＤ３／２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。単離されたＴ細胞をＣＦＳＥで１０分間染色し、次いで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とインキュベートした後、ＭＳＣと共培養した。

【0102】

７２時間後、ウェルをＢＦＡ（１０×）、ＰＭＡ（１００×）およびイオノマイシン（１０×）で処置した。ウェルの半数を回収し、洗浄し、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。次いで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に続いて、１×緩衝液を加え、細胞をＩＬ－２（ＢＤ）、ＴＮＦ－アルファ（ＢＤ）およびインターフェロンガンマ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）について染色した。５日目に、残りのウェルを回収し、抗ＣＤ４－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。すべてのサンプルに対してＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーを行い、次いで、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。

【0103】

酵素消化後、ＤＮａｓｅなしのサンプルは、Ｐ０からＰ１への成長が不良だった（１０日までに８０％未満のコンフルエント）ので、排除した。ＮＢ４、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅを標準的な酵素組み合わせとした。５１×１０Ｅ６個という中央値のＣＢｔ－ＭＳＣ（４５～６２×１０Ｅ６個の範囲の細胞）でバイオリアクターに播種した後、バイオリアクター内で５～６日間拡大することによって、１４９５×１０Ｅ６個という中央値のＣＢｔ－ＭＳＣが得られた（１２４５～１９３５×１０Ｅ６の範囲）。ＣＢｔ－ＭＳＣの倍加時間（ＭＳＣが増殖し、数が２倍になるのに必要な時間）の中央値は、２８．２時間（２４．５～２９．７の範囲）だった（ｎ＝３）。免疫抑制アッセイは、ＣＢｔＭＳＣが、用量依存的様式でＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを実証した。さらに、ＣＢｔ－ＭＳＣは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の各後続世代を用いたとき、刺激されたＣＤ４^＋Ｔ細胞上のサイトカイン発現（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）を減少させた。したがって、本方法は、ＣＢｔ全体からＭＳＣを単離するための新規の標準化されたＧＭＰ準拠プロトコルを提供する。免疫抑制特性を有するＣＢｔ－ＭＳＣの大規模拡大を、Ｔｅｒｕｍｏバイオリアクターにおいて迅速かつ効率的に行うことができる。

【0104】

実施例３－間葉系幹細胞の特徴付け
実施例１において得られたＭＳＣを、インビボで特徴付けることにより、それらの機能を測定した。新鮮なＣＢｔ由来ＭＳＣは、異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）マウスモデルにおいて生存時間を延長させたことが見出された（図８）。

【0105】

ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）７週齢雄マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入し、実験前の１週間、順化させた。マウス（１１週齢）に致死線量以下で照射し（３００ｃＧｙ）、その２４時間後である実験の０日目に、２×１０^６個のＧ－動員末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）を移植した。次いで、そのマウスに、ＢＭまたはＣＢｔ由来のＭＳＣを注入１回あたり２×１０^６の用量で５回、＋８、＋１１、＋１４、＋１８および＋２１日目に尾静脈注射を介して投与した。生存時間、体重減少、毛衣の手触り、身体活動、皮膚の完全性および背中の曲がり具合を毎日記録した。Ｃｏｏｋｅ ｅｔ ａｌが記載した臨床スコアリングシステムを用いてＧＶＨＤの重症度を評価した。１群あたり５匹のマウスを用い、実験を３回行った。結果は、ＧＶＨＤコントロールと比べて、新鮮なＢＭ由来ＭＳＣまたはＣＢＴ由来ＭＳＣを投与されたマウスの全生存時間の有意な延長を示した（図８Ａ）。

【0106】

いくつかの実験では、７５０ｎｍで励起し、７８２ｎｍに発光ピークを有するＮＩＲ親油性カルボシアニン色素であるＸｅｎｏｌｉｇｈｔ ＤｉＲ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｒｏｄｇａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でＢＭ－ＭＳＣまたはＣＢｔ－ＭＳＣを標識した。細胞をＰＢＳに再懸濁し（１×１０^６細胞／ｍｌ）、ＤｉＲ（１０μｇ ＤｉＲ／ｍｌ）と３７℃において３０分間インキュベートした。次いで、それらの細胞を培養液で２回洗浄して、組み込まれなかった色素を除去した。図８Ｂは、ＧＶＨＤコントロールと比べて、（ＢＭ－またはＣＢＴ－ＭＳＣで）処置されたマウスの肝臓、脾臓および結腸のＧＶＨＤ徴候のわずかな低減を実証している病理組織学的サンプルを示している。図８Ｃおよび８Ｄは、尾静脈を介してマウスに注入されたＤｉＲ免疫蛍光標識ＭＳＣを用いた短期間の体内分布実験を示している。ＣＢｔ－ＭＳＣは、ＢＭ－ＭＳＣと比べて７２時間にわたって有意な残留性の改善を示した。

【0107】

次に、ＣＢｔ－ＭＳＣの活性化が、より高い免疫抑制特性を有するユニークなプロファイルを明らかにしたことが見出された（図９）。ＣＢｔ－ＭＳＣを、１％Ｌ－グルタミンおよび５％ヒト血小板溶解物が補充されたアルファＭＥＭ培地を用いて、８５％コンフルエンスになるまで培養した。次いで、培地を活性化培地（１％Ｌ－グルタミン、ＩＦＮガンマ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦアルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１Ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１７（１０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたアルファＭＥＭ培地）に２４～３６時間、交換した。その後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、製造指示書に従って精製した（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。１つの培養条件につき１２個のサンプルを解析した。ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの事前増幅および配列決定の品質管理を行った後、ｃＤＮＡライブラリーを調製し、これらの細胞のトランスクリプトームをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００システムにおいて配列決定した。ＲＮＡｓｅｑデータの解析は、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ部門が行った。ＴＯＰＨＡＴ２ ｖ２．０．１３４６を用いて、シーケンシングリードをヒト参照ゲノム（ｈｇ３８）とアラインメントした。マッピングされたリードを、ｈｇ３８ ＧＥＮＣＯＤＥ ｖ２５遺伝子モデルに基づくＨＴＳＥＱ４７，４８を用いてカウントすることによって、遺伝子発現レベルを測定した。差次的に発現された遺伝子を、ＥｄｇｅＲパッケージ４８をＦＤＲ（誤発見率）カットオフ＜０．０１および倍率変化＞２で用いて特定した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（登録商標）（ＩＰＡ（登録商標），Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ネットワーク解析を行った。

【0108】

図９Ａに要約されているように、休止ＭＳＣと活性化ＭＳＣとの間で差次的に発現された遺伝子のヒートマップは、休止ＣＢｔ－ＭＳＣと比べて、活性化ＣＢｔ－ＭＳＣにおいて、８１６個の遺伝子のアップレギュレーションおよび３８３個の遺伝子のダウンレギュレーションを示した。休止ＵＣ－ＭＳＣおよび活性化ＵＣ－ＭＳＣに対して評価された遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）は、細胞の活性化が、いくつかの免疫制御経路（例えば、Ｔ細胞疲弊、免疫応答の負の制御、ＩＬ－６シグナル伝達およびＴ細胞アポトーシスの誘導）に関連する遺伝子の発現を誘導したことを明らかにした（図９Ｂ）。

【0109】

活性化によって、ＧＶＨＤ異種移植マウスモデルにおいてＣＢｔ－ＭＳＣのホーミングおよび体内分布が高まったことも観察された（図１０）。活性化ＣＢｔ－ＭＳＣおよび休止ＣＢｔ－ＭＳＣから抽出されたＲＮＡにおいてそれらを対比させて行われたＩＰＡ解析は、活性化ＣＢｔＭＳＣにおける接着および侵入に関係するホーミングレセプターおよび重要な接着分子をはじめとした、血管外遊出およびホーミングと関係するいくつかの遺伝子の活性化を明らかにし、これが、ヒートマップに示されている（図１０Ａ）。フローサイトメトリーによって評価された、活性化ＣＢＴ ＭＳＣおよび休止ＭＳＣにおけるホーミングレセプター、接着分子および侵入タンパク質（メタロプロテイナーゼ）のヒートマップ（図１０Ｂ）。体内分布実験の場合、ＧｖＨＤ誘導後（０日目にＰＢＰＣ注入）、ＤｉＲで予め標識された休止ＣＢｔ－ＭＳＣまたは活性化ＣＢｔ－ＭＳＣを＋８日目に尾静脈注射によってＮＳＧマウスに投与した（マウス１匹につき２×１０^６個のＭＳＣ）。

【0110】

図１０Ｃおよび１０Ｄに示されているように、７２時間の蛍光解析の後、活性化ＣＢＴ－ＭＳＣが、コントロールＣＢｔ－ＭＳＣよりも長く、最大３日間マウスに残留したことが観察された。図１０Ｅに示されているように、次いで、注射の３時間後、４８時間後および７２時間後にマウス組織を回収し、平均放射効率を組織別に計算した。肺については図１０Ｆ、肝臓については図１０Ｇおよび脾臓については図１０Ｈに示されているように、コントロールＭＳＣ群と比べて活性化ＣＢｔ－ＭＳＣ群では、蛍光レベルがより高い傾向が示された。

【0111】

次に、凍結保存された活性化ＵＣＭＳＣが、新鮮な活性化ＵＣＭＳＣと比べて、類似の生存能、表現型、およびＴ細胞活性化制御の有効性を示したことが観察された（図１１）。活性化された細胞を回収し、２週間凍結した。その後、細胞を解凍し、それらの表現型を、フローサイトメトリーを用いて解析した。図１１Ａは、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムアッセイを用いたフローサイトメトリーによって測定されたＣＢｔ－ＭＳＣの生存能に関する代表的なＦＡＣＳプロットを示している。ＣＢｔＭＳＣ（休止および活性化）によって媒介されるＴ細胞免疫抑制をＣＦＳＥアッセイによって評価した。簡潔には、リンパ球を健常志願者のＰＢＭＮＣから得て、フィコールによって単離した。Ｔ細胞を、ＰａｎｔＴ細胞マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｉｃ）を用いて単離し、５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。次いで、それらをリンパ球培地：１０％ＦＢＳ、１％Ｌ－グルタミン、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に懸濁した。共培養アッセイの場合、１００ｕｌのＭＳＣを９６ウェルプレートに異なる濃度（１×１０^６／ｍｌ、０．５×１０^６／ｍｌ、１×１０^５／ｍｌ）で播種し、１時間インキュベートした。上記アッセイの場合、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激された１０^５個のリンパ球を、ＭＳＣ単層上に４日間播種した。その後、細胞を回収し、洗浄し、生存能（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕｉａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４について染色した。Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって評価した。ナイーブ（未刺激）リンパ球（ネガティブコントロール）、およびＭＳＣなしの刺激Ｔ細胞（ポジティブコントロール）をコントロールとして使用した。図１１Ｂは、Ｔ細胞増殖ＣＦＳＥアッセイの代表的なヒストグラムを示しており、すべての異なる比において、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されたＴ細胞の全体的な抑制が示されている。図１１Ｃは、免疫抑制因子の発現の持続性を示している、新鮮なまたは凍結／解凍された細胞を用いたときの活性化ＭＳＣの表現型の代表的なＦＡＣＳプロットを示している。

【0112】

凍結保存された活性化ＣＢｔ－ＭＳＣが、全生存時間を延長し、ＧＶＨＤ毒性を低減させたことも観察された（図１２）。上に記載されたように、マウスに３００ｃＧｙを照射した後、２４時間以内に２×１０^６個のＧ－動員ＰＢＰＣを注入した。ＣＢｔ－ＭＳＣを解凍し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、食塩水に２×１０^６細胞／０．１ｍＬの濃度で再懸濁した。そのＣＢｔ－ＭＳＣを、すべての実験で解凍の３時間以内に注入した。ＧＶＨＤコントロールマウスには、０．１ｍＬの食塩水溶液を注射した。この実験の場合、各群から１１匹のマウスを用いた。各群の３匹のマウスを、組織学的解析のために２４日目に安楽死させた。マウスを麻酔し、血液を採取し、処理した。ヒトリンパ球集団をフローサイトメトリーによって測定した。血漿サンプルを解析して、マイクロアレイアッセイを用いてサイトカインを測定した。アッセイは、３つ組で行われた。

【0113】

図１２Ａ～Ｃは、マウス群を用いたインビボ実験を要約している（１群につきｎ＝８匹のマウス）。図１２Ａは、未処置（ＧＶＨＤコントロール）、非活性化ＣＢｔ－ＭＳＣのレシピエント、およびレシピエント活性化ＣＢｔ－ＭＳＣの生存曲線を示している。このデータは、非活性化ＭＳＣまたはコントロールと比べたときの、活性化ＣＢＴ－ＭＳｃのレシピエントに対する延命効果を示した。図１２Ｂは、他の２群に対して活性化ＣＢｔ－ＭＳＣのレシピエントの体重減少が小さいことを示している体重変動率を示している。図１２Ｃは、平均ＧＶＨＤスコアを示しており、これは、活性化ＣＢＴ－ＭＳＣ群のＧＶＨＤがより低いことを再度示している。図１２Ｄは、終了時点におけるマウスの３群間で比較した門脈肝臓炎症を示している。図１２Ｅは、未処置マウス（コントロール）、休止ＣＢｔ－ＭＳＣで処置されたマウスおよび活性化（活性化された）ＭＳＣで処置されたマウスの血液学的検査の比較を示している。これらの血液検査には、ＷＢＣ数、ＭＣＶ、ＭＣＨＣ、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板数、ＲＢＣ数、ＭＣＨ、ＲＤＷ、アルブミン、アルカリホスファターゼ、カリウム、ＬＤＨ、ＡＳＴ、グルコース、ＡＬＴ、リン、総タンパク質が含まれる。結果は、コントロール群または非活性化ＭＳＣ群と比べて、活性化ＭＳＣで処置された群における血小板数、グルコース、ＷＢＣ数および肝機能（ＡＬＴ、ＡＳＴ）の改善を示している。

【0114】

図１２Ｆは、マウスの血液中のサイトカインレベルの結果を示しており、活性化ＣＢｔ－ＭＳＣと非活性化ＣＢｔ－ＭＳＣの両方が、コントロールマウスと比べて炎症性サイトカインの存在を減少させたことを明らかにした。図１２Ｇは、２４日目のマウスの血液中のヒトＣＤ４５のパーセンテージを示している。左のパネルは、各群の代表的なＦＡＣＳプロットを示しており、右のパネルは、コントロール群（未処置）と比較した統計比較を伴うバープロットを示しており、^＊＊ｐ値＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１は、両方のＭＳＣレシピエント群の血液中のヒトＣＤ４５^＋細胞がより少ないことを示しており、活性化ＭＳＣが、非活性化ＭＳＣレシピエントよりも少ないことを示している。

【0115】

本明細書中に開示および特許請求される方法のすべてが、本開示に鑑みて、過度の実験を行うことなく実施および実行され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の点から説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された方法および方法の工程または工程の順序に変更が適用されてもよいことが当業者には明らかだろう。より詳細には、同じまたは類似の結果が達成される限り、化学的かつ生理的に関係するある特定の作用物質を本明細書中に記載される作用物質の代わりに用いてもよいことが明らかだろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変のすべてが、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。

【0116】

文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A-1】

【図5A-2】

【図5B-1】

【図5B-2】

【図6A】

【図6B】

【図6C-1】

【図6C-2】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図11A】

【図11B-1】

【図11B-2】

【図11C-1】

【図11C-2】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図12G】

【国際調査報告】