特表 2022-512628 ＣＤ１３７を標的とする抗体およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】ＣＤ１３７を標的とする抗体およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220131BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220131BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

C12P21/08

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 Y

A61P35/00

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021518965

(86)(22)【出願日】2019-10-09

(85)【翻訳文提出日】2021-05-20

(86)【国際出願番号】 EP2019077368

(87)【国際公開番号】W WO2020074584

(87)【国際公開日】2020-04-16

(31)【優先権主張番号】18199334.6

(32)【優先日】2018-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】19166283.2

(32)【優先日】2019-03-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515310984

【氏名又は名称】ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】テア グンデ

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス ブロック

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン ヘス

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドル シモナン

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン バルムート

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085BB41

4C085BB42

4C085DD62

4C085GG01

4H045AA11

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体、ならびにその医薬組成物およびその使用方法に関する。本発明はさらに、前記抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞、および前記抗体を産生する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それぞれ配列番号：１、２、および３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：１６、および１８の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ３配列、および配列番号：１７の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＬＣＤＲ２配列を含む、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する単離抗体。

【請求項2】

それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、およびそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体は、配列番号：１３、１４、および１５、好ましくは配列番号：１３および１５、より好ましくは配列番号：１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：２５、２６、および２７、好ましくは配列番号：２５および２７、より好ましくは配列番号：２５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項4】

（ａ）配列番号：１３のＶＨ配列および配列番号：２５のＶＬ配列；（ｂ）配列番号：１４のＶＨ配列および配列番号：２６のＶＬ配列；または（ｃ）配列番号：１５のＶＨ配列および配列番号：２７のＶＬ配列を含む、請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

特に競合ＥＬＩＳＡによって測定されるように、前記抗体はＣＤ１３７とそのリガンドＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用を阻害しない、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

前記抗体は、
（ｉ）表面プラズモン共鳴によって測定されるように、５０ ｎＭ未満、特に１０ ｎＭ未満、より具体的には５ ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｉｉ）任意選択で、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、５０ ｎＭ未満、特に１０ ｎＭ未満、より具体的には５ ｎＭ未満のＫＤでカニクイザルＣＤ１３７に結合する；
（ｉｉｉ） 任意選択で、特にＳＰＲによって測定されるように、ヒトＣＤ４０に結合せず、および／またはヒトＯＸ４０に結合しない；
（ｉｖ） ｓｃＦｖフォーマットの場合、示差走査蛍光測定によって決定される、少なくとも５０℃、たとえば、少なくとも５５℃、好ましくは少なくとも６０℃、より好ましくは少なくとも６４℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特にここで前記抗体は、ｐＨ６．４の５０ ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ中で製剤化される；
（ｖ） ｓｃＦｖフォーマットの場合、本発明の抗体が１０ ｍｇ／ｍｌの開始濃度にあり、特にここで本発明の抗体はｐＨ６．４の１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中で製剤化される場合、４℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保存した後、７％未満、たとえば６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、好ましくは２％未満のモノマー含有量の損失を有する；および／または
（ｖｉ） ｓｃＦｖフォーマットの場合、本発明の抗体が１０ ｍｇ／ｍｌの開始濃度にあり、特にここで本発明の抗体はｐＨ６．４の１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中で製剤化される場合、５回の連続した凍結融解サイクル後、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含有量の損失を有する、
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

前記単離抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、およびアンキリンベースのドメイン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、フィブロネクチン、および抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（たとえば、Ｆ－ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むが、これらに限定されない代替スキャフォールドベースの結合ドメイン、好ましくはＦｖ、またはｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

前記ｓｃＦｖは、配列番号：２９、配列番号：３０、および配列番号：３１、好ましくは配列番号：２９および配列番号：３１、より好ましくは配列番号：２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の抗体。

【請求項9】

前記抗体は、ＣＤ１３７のアミノ酸残基Ａｓｎ４２が結合について重要な残基でないという条件で、ヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに、ＣＤ１３７の細胞外ドメインの遠位部分、特にシステインリッチドメインＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２内、より具体的には配列番号：３２のアミノ酸残基２４～８６内に位置するエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する、単離抗体。

【請求項10】

前記抗体は、残基Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｃｙｓ４５、Ｐｒｏ４９、Ｓｅｒ５２、およびＳｅｒ８０を含む、実施例１３に従って決定される一組の重要な残基によって特徴付けられるエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する、請求項９に記載の単離抗体。

【請求項11】

前記抗体は、残基Ａｌａ３３、Ａｓｎ４０、およびＣｙｓ４８をさらに含む、実施例１３に従って決定される一組の重要な残基によって特徴付けられるエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する、請求項１０に記載の単離抗体。

【請求項12】

前記抗体は、残基Ｐｒｏ３２、Ｇｌｙ３４、Ｔｈｒ３５、Ｓｅｒ４６、Ｐｒｏ４７、Ｐｒｏ５０、Ｃｙｓ７８、およびＳｅｒ７９をさらに含む、実施例１３に従って決定される一組の重要な残基によって特徴付けられるエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する、請求項１１に記載の単離抗体。

【請求項13】

前記抗体は、多特異性分子、特に少なくとも第二の機能性分子を有する多特異性分子である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項15】

医薬としての使用のための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体、または請求項１４の組成物。

【請求項16】

がんの治療に使用するための医薬の製造に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体、または請求項１４に記載の組成物。

【請求項17】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。

【請求項18】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、請求項１～１３のいずれかに記載の抗体をコードする核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む方法。

【請求項19】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体、または請求項１４に記載の組成物を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体、および医薬組成物、ならびにその使用方法に関する。本発明はさらに、上記抗体をコードする核酸、上記核酸を含むベクター、上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞、および上記抗体を産生する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、細胞外ドメインのシステインリッチな偽反復（ｐｓｅｕｄｏｒｅｐｅａｔ）を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とする受容体のタンパク質スーパーファミリーである（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｅｌｌ． １０４： ４８７－５０１）。現在、２７のＴＮＦファミリーメンバーが特定されている。ＴＮＦＲＳＦメンバーおよびそのリガンドは主に免疫細胞で発現し、Ｔ細胞性免疫応答において免疫調節物質の役割を果たしている。ＴＮＦＲＳＦメンバーは、樹状細胞の生存およびＴ細胞のプライミング能力の強化、エフェクターＴ細胞の最適な生成、最適な抗体応答、および炎症反応の増幅において役割を果たす。

【0003】

ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー９、ＴＮＦＲＳＦ９）は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの表面糖タンパク質である。これは、誘導性の共刺激Ｔ細胞受容体である。ＣＤ１３７の発現は活性化に依存し、活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、濾胞ＤＣを含む樹状細胞（ＤＣ）、刺激されたマスト細胞、分化中の骨髄細胞、単球、好中球、好酸球（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２２９（１）： １９２－２１５（２００９））、および活性化Ｂ細胞（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８４（２）：７８７－７９５（２０１０））を含む免疫細胞の幅広いサブセットを網羅している。さらに、ＣＤ１３７の発現は、腫瘍血管系（Ｂｒｏｉｌ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ． １１５（４）：５４３－５４９ （２００１）； Ｓｅａｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １１（６）：５３９－５５４ （２００７））およびアテローム性動脈硬化症の内皮（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７（１０）： １２９２ １３０１ （２００８））でも実証されている。

【0004】

ＴＮＦファミリーの分子であるＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ、４－１ＢＢＬ、またはｔｎｆｓｆ９）は、ＣＤ１３７について知られている細胞間天然リガンドである（Ａｌｄｅｒｓｏｎ， Ｍ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２２１９－２２２７ （１９９４）； Ｐｏｌｌｏｋ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：３６７－３７４ （１９９４）； Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｒ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３： ２６３１－２６４１ （１９９３））。ＣＤ１３７のリガンドはホモ三量体を形成し、ＣＤ１３７を介したシグナル伝達は、細胞表面の連結分子から進行し、三量体化されたリガンドによって架橋される（Ｗｏｎ， Ｅ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８５： ９２０２－９２１０ （２０１０））。ＣＤ１３７の高次クラスタリングは、シグナル伝達を仲介するために必要であることが示唆された。ＣＤ１３７は、細胞質尾部でアダプターＴＲＡＦ－２およびＴＲＡＦ－１と結合し、共免疫沈降を引き起こす。これは、Ｔ細胞でのＣＤ１３７の活性化により増強される（Ｓａｏｕｌｌｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７： １８４９－１８６２ （１９９８）； Ｓａｂｂａｇｈ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０： ８０９３－８１０１ （２００８））。ＣＤ１３７によるＴＲＡＦ－１およびＴＲＡＦ－２の動員により、ＮＦ－ｋＢ、ならびにＥＲＫ、ＪＮＫ、およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼを含むマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼカスケードが下流で活性化される。ＮＦ－ｋＢの活性化は、Ｂｃｌ－２ファミリーの生存促進性のメンバー（ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｅｍｂｅｒ）であるＢｆｌ－１およびＢｃｌ－ＸＬの上方制御につながる。アポトーシス促進タンパク質Ｂｉｍは、ＴＲＡＦ－１およびＥＲＫ依存的に下方制御される（Ｓａｂｂａｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０（１２）：８０９３－８１０１ （２００８））。ＣＤ１３７の主な作用は、２つ以上のＴＲＡＦ－２分子を互いに分子的に近接させて配置することであることが示唆されている（Ｓａｎｃｈｅｚ-Ｐａｕｌｅｔｅ， Ａ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４６（３）： ５１３－５２２ （２０１６））。これに基づいて、ＣＤ１３７シグナル伝達を駆動する主な要因は、原形質膜のマイクロパッチ内のＴＲＡＦ－２で組み立てられたＣＤ１３７部分の相対密度であると仮定された（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐａｕｌｅｔｅ， Ａ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４６（３）： ５１３－５２２ （２０１６））。全体として、ＣＤ１３７シグナル伝達は多量体化によって促進され、ＣＤ１３７分子の架橋がＣＤ１３７共刺激活性の重要な要因であることが提示された。

【0005】

ＣＤ１３７はＴ細胞を共刺激して、確立された腫瘍の根絶、初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌ）応答の拡大、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のメモリープールの強化、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）合成の誘導等のエフェクター機能を行う。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の機能および生存におけるＣＤ１３７刺激の重要な役割は、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用の操作を通じて腫瘍の治療に利用できる可能性がある。実際、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究は、抗ＣＤ１３７抗体による治療が複数の腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮をもたらしたことを示した。たとえば、アゴニスト抗マウスＣＤ１３７抗体は、Ｐ８１５マスト細胞腫腫瘍、および低免疫原性腫瘍モデルＡｇ１０４に対する免疫応答を誘導することが実証された（Ｉ． Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ３（６）：６８２－５ （１９９７））。単独療法および併用療法の両方の予防的および治療的設定におけるＣＤ１３７アゴニストｍＡｂの有効性、ならびに抗腫瘍保護Ｔ細胞メモリー応答がいくつかの研究で報告されている（Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２２２：２７７－２８６ （２００８））。ＣＤ１３７アゴニストは、さまざまな自己免疫モデルにおける自己免疫反応も阻害する（Ｖｉｎａｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８４（９）：７２６－７３６ （２００６））。

【0006】

現在臨床段階にある２つの抗ＣＤ１３７抗体は、完全ヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂであるウレルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、および完全ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂであるウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ）である（Ｃｈｅｓｔｅｒ Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｏｃｔ；６５（１０）：１２４３－８ （２０１６））。ＣＤ１３７に作用する治療用抗体の利用は非常に有望な治療戦略であるが、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の有効性の低さ、毒性の高さ、有害事象などの困難と結びついている。ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、免疫系および臓器機能の変化を引き起こし、毒性のリスクを高めることが示された。ナイーブマウスおよび担がんマウスにおける高用量のＣＤ１３７アゴニスト抗体は、肝臓へのＴ細胞浸潤、および肝臓の炎症と一致するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの上昇を誘発することが報告されている（Ｎｉｕ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８（７）：４１９４－４２１３ （２００７）； Ｄｕｂｒｏｔ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２８（１）：１０５－１１８ （２０１１））。ＣＤ１３７アゴニスト抗体のヒト治療的使用に関する最初の臨床研究でも、肝酵素の上昇および肝炎の発生率の増加が示された（Sznol M., et al., J Clin Oncol 26(115S):3007 (2008); Ascierto PA, et al., Semin Oncol 37(5):508-516 (2010); Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct;65(10):1243-8 (2016)）。致命的となる可能性のある肝炎は、以前に治療されたステージＩＩＩ／ＩＶメラノーマのＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）フェーズＩＩ抗ＣＤ１３７試験、全国臨床試験（ＮＣＴ）００６１２６６４で観察された。この試験および他のいくつかの試験（NCT00803374, NCT00309023, NCT00461110, NCT00351325）は、有害事象のために終了した（Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct;65(10):1243-8 (2016)）。このような有害事象は、おそらくＴ細胞の全身的な過剰刺激が原因である。

【0007】

したがって、当分野では、一般的な抗増殖薬の固有の副作用なしに、特に現在利用可能なＣＤ１３７抗体に匹敵するより低い毒性を有する、より高い効力を有する改善された治療用抗ヒトＣＤ１３７抗体を生成する必要がある。

【発明の概要】

【0008】

本発明の目的は、ヒトＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合し、治療に使用するための有益な特性、たとえば改善された親和性、有効性、安全性、ならびに改善された溶解性、開発性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ）、および安定性等の改善された生物物理学的特性を有する抗体を提供することである。特に、他の細胞表面分子から直接および独立していないＣＤ１３７抗体は、結合時にＣＤ１３７シグナル伝達を引き起こす。

【0009】

一つの実施形態では、本発明は、新規のＣＤ１３７抗体に関する。

【0010】

一つの実施形態では、本発明は、本発明の単離抗体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。

【0011】

別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の抗体、または本発明の組成物に関する。

【0012】

一つの態様では、本発明は、それを必要とする対象のがんの治療における使用のための本発明の抗体、または本発明の組成物に関する。

【0013】

一つの態様では、本発明はそれを必要とする対象のがんの治療における使用のための医薬の製造における、本発明の抗体、または本発明の組成物の使用に関する。

【0014】

別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明の抗体、または本発明の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象のがんを治療する方法に関する。

【0015】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸に関する。さらなる態様では、本発明は、上記核酸を含むベクターに関する。さらなる態様では、本発明は、上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞に関する。

【0016】

別の態様では、本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の抗体を産生する方法に関する。

【0017】

以下の項目に要約される、本発明の態様、有利な特徴、および好ましい実施形態は、それぞれ単独で、または組み合わせて、本発明の目的を解決することにさらに寄与する：
１． １セットのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ここで該１セットのＣＤＲは、
ＨＣＤＲ１’は、配列番号：１、４、７、および１０のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列であり；
ＨＣＤＲ２’は、配列番号：２、５、８、および１１のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列であり；
ＨＣＤＲ３’は、配列番号：３、６、９、および１２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列であり；
ＬＣＤＲ１’は、配列番号：１６、１９、および２２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列であり；
ＬＣＤＲ２’は、配列番号：１７、２０、および２３のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列であり；および
ＬＣＤＲ３’は、配列番号：１８、２１、および２４のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列である、
１セットのＣＤＲと比較して、１０個以下のアミノ酸置換を有する、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する単離抗体。
２． １セットのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ここで該１セットのＣＤＲは、
ＨＤＲ’１は、配列番号：１に記載のとおりである；
ＨＤＲ’２は、配列番号：２に記載のとおりである；
ＨＤＲ’３は、配列番号：３に記載のとおりである；
ＬＤＲ’１は、配列番号：１６に記載のとおりである；
ＬＤＲ’２は、配列番号：１７に記載のとおりである；
ＬＤＲ’３は、配列番号：１８に記載のとおりである；
１セットのＣＤＲと比較して、１０個以下のアミノ酸置換を有する、項目１に記載の抗体。
３． 重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで：
（ａ） 上記ＶＨは、順番に、３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、および
（ｂ） 上記ＶＬは、順番に、３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、
項目１または項目２に記載の抗体。
４． （ａ） 上記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１、４、７、および１０のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１を含み、好ましくはそれからなり；（ｂ） 上記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２、５、８、および１１のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：２を含み、好ましくはそれからなり；（ｃ） 上記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３、６、９、および１２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：３を含み、好ましくはそれからなり；（ｄ） 上記ＬＣＤＲ１は、配列番号：１６、１９、および２２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１６を含み、好ましくはそれからなり；（ｅ） 上記ＬＣＤＲ２は、配列番号：１７、２０、および２３のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１７を含み、好ましくはそれからなり；（ｆ） 上記ＬＣＤＲ３は、配列番号：１８、２１、および２４のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１８を含み、好ましくはそれからなる、
項目３に記載の抗体。
５． 上記抗体は、：（ａ） それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列；（ｂ） それぞれ配列番号：４、５、および６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１９、２０、および２１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列；（ｃ） それぞれ配列番号：７、８、および９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列；（ａ） それぞれ配列番号：１０、１１、および１２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：２２、２３、および２４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列
を含む、項目３に記載の抗体。
６． （ａ） 配列番号：１のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ１；（ｂ） 配列番号：２のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ２；（ｃ） 配列番号：３のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、ＨＣＤＲ３；（ｄ） 配列番号：１６のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ１；（ｅ） 配列番号：１７のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ２；および（ｆ） 配列番号：１８のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、ＬＣＤＲ３
を含む、項目３の抗体。
７． 上記ＶＨは、ＶＨ３フレームワークＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含む、項目３～６のいずれか一つに記載の抗体。
８． 上記ＶＬは、Ｖκフレームワーク ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、具体的にはＶκ１またはＶΚ３ ＦＲ１～ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１～ＦＲ３、およびＶκ ＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４またはＶκ３ ＦＲ４、およびＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４を含み；具体的にはＶλ ＦＲ４は配列番号：３３～配列番号：３９のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、配列番号：３３～配列番号：３９のいずれかに記載のＶλ ＦＲ４、好ましくは、配列番号：３３、または配列番号：３４に記載のＶλ ＦＲ４、より好ましくは配列番号：３３に記載のＶλ ＦＲ４を含む、項目３～７のいずれか一つに記載の抗体。
９． 上記ＶＨは、配列番号：１３、１４、および１５、好ましくは配列番号：１３、または１５、より好ましくは配列番号：１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む；および／または上記ＶＬは、配列番号：２５、２６、および２７、好ましくは配列番号：２５、または２７、より好ましくは配列番号：２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目３～８のいずれか一つに記載の抗体。
１０． 上記ＶＨは、配列番号：１３、１４、および１５、好ましくは配列番号：１３、または１５、より好ましくは配列番号：１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；および／または上記ＶＬは、配列番号：２５、２６、および２７、好ましくは配列番号：２５、または２７、より好ましくは配列番号：２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目３～９のいずれか一つに記載の抗体。
１１． （ａ） 配列番号：１３のＶＨ配列および配列番号：２５のＶＬ配列；（ｂ） 配列番号：１４のＶＨ配列および配列番号：２６のＶＬ配列；または（ｃ） 配列番号：１５のＶＨ配列および配列番号：２７のＶＬ配列を含む、項目１～１０のいずれか一つに記載の抗体。
１２． 上記抗体は、
ａ） 表面プラズモン共鳴によって測定されるように、５０ ｎＭ未満、具体的には１０ ｎＭ未満、より具体的には５ ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する；および
ｂ） 任意選択で、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、５０ ｎＭ未満、具体的には１０ ｎＭ未満、より具体的には５ ｎＭ未満のＫＤでカニクイザルＣＤ１３７に結合する；および
ｃ） 任意選択で、ウレルマブと交差競合する（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｅｔｅ）、
項目１～１１のいずれか一つに記載の抗体。
１３． 上記抗体は、特に競合ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＣＤ１３７とそのリガンドＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用を阻害しない、項目１～１２のいずれか一つに記載の抗体。
１４． 上記抗体は、特にＳＰＲによって測定されるように、ヒトＣＤ４０に結合せず、および／またはヒトＯＸ４０に結合しない、項目１～１３のいずれか一つに記載の抗体。
１５． 上記抗体は、：
ａ） ｓｃＦｖフォーマットの場合、示差走査蛍光測定によって決定される、少なくとも５０℃、たとえば、少なくとも５５℃、好ましくは少なくとも６０℃、より好ましくは少なくとも６４℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特にここで上記抗体は、ｐＨ６．４の５０ ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ中で製剤化される；および／または
ｂ） ｓｃＦｖフォーマットの場合、本発明の抗体が１０ ｍｇ／ｍｌの開始濃度にあり、特にここで本発明の抗体はｐＨ６．４の１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中で製剤化される場合、４℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保存した後、７％未満、たとえば６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、好ましくは２％未満のモノマー含有量の損失を有する；および／または
ｄ） ｓｃＦｖフォーマットの場合、本発明の抗体が１０ ｍｇ／ｍｌの開始濃度にあり、特にここで本発明の抗体はｐＨ６．４の１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中で製剤化される場合、５回の連続した凍結融解サイクル後、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含有量の損失を有する、
項目１～１４のいずれか一つに記載の抗体。
１６． 上記抗体は、ＣＤ１３７のアミノ酸残基Ａｓｎ４２が結合について重要な残基でないという条件で、ヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに、ＣＤ１３７の細胞外ドメインの遠位部分、特にシステインリッチドメインＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２内、より具体的には配列番号：３２のアミノ酸残基２４～８６内に位置するエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する、単離抗体。
１７． 上記単離抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、およびアンキリンベースのドメイン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、フィブロネクチン、および抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（たとえば、Ｆ－ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））を含むが、これらに限定されない代替スキャフォールドベースの結合ドメイン、好ましくはＦｖ、またはｓｃＦｖからなる群から選択される、項目１～１６のいずれか一つに記載の抗体。
１８． 一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ；ｓｃＦｖ）である、項目１～１７のいずれか一つに記載の抗体。
１９． 上記ｓｃＦｖは、配列番号：２９、配列番号：３０、および配列番号：３１、好ましくは配列番号：２９または配列番号：３１、より好ましくは配列番号：２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項目１８に記載の抗体。
２０． 抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧである、項目１７に記載の単離抗体。
２１． 抗体はヒト化されている、項目１～２０のいずれか一つに記載の単離抗体。
２２． 上記抗体は、多特異性分子、特に少なくとも第二の機能性分子を有する多特異性分子である、項目１～２１のいずれか一つに記載の抗体。
２３． 上記抗体は、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ； ｔａｎｄｅｍ ｄｉ－ｓｃＦｖ）、ｔａｎｄｅｍ ｔｒｉ－ｓｃＦｖ、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ；Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｙ；Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）１）、Ｆａｂ、Ｆａｂ－Ｆｖ２、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ_３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｌ）、またはＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｈ））、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体（ｄｉ－ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ融合物、ｓｃＦｖ－ＨＳＡ－ｓｃＦｖ融合物、ジダイアボディ（ｄｉ－ｄｉａｂｏｄｙ）、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＶＤ、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合物、たとえばｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖および軽鎖の両方のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに基づく二重特異性抗体、たとえばノブ・イントゥ・ホール（Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ）抗体（ＫｉＨｓ）；ヘテロ二量体Ｆｃドメインまたは他のヘテロ二量体化ドメインのいずれかの鎖のＮ末端および／またはＣ末端に融合したＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＤｂ、タンデムジｓｃＦｖ（ｔａｎｄｅｍ－ｄｉ－ｓｃＦｖ）、タンデムトリｓｃＦｖ（ｔａｎｄｅｍ ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）１、Ｆａｂ、Ｆａｂ－Ｆｖ２、ＣＯＶＤ、ＭＡＴＣＨ、およびＤｕｏＢｏｄｉｅｓからなる群から選択される、フォーマットにある、項目２２の抗体。
２４． 項目１～２３のいずれか一つの抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
２５． 医薬品として使用するための、項目１～２３のいずれか一つの抗体、または項目２４の組成物。
２６． がんの治療における使用のための医薬品の製造に使用するための、項目１～２３のいずれか一つの抗体または項目２４の組成物。
２７． がんの治療における使用のための、項目１～２３のいずれか一つの抗体または項目２４の組成物。
２８． それを必要とする対象におけるがんの治療のための、項目１～２３のいずれか一つの抗体、または項目２４の組成物の使用。
２９． 対象に治療有効量の項目１～２３のいずれか一つに記載の抗体または項目２４の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんの治療方法。
３０． 項目１～２３のいずれか一つに記載の抗体をコードする核酸。
３１． 項目３０に記載の核酸を含むベクター。
３２． 項目３０に記載の核酸または項目３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
３３． 項目３０に記載の核酸または項目３１に記載のベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、項目１～２３のいずれか一つに記載の抗体を産生する方法。
３４． 項目１～２３のいずれか一つに記載の抗体または項目２４の組成物を含む、キット。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ウサギＩｇＧクローン３８－２７－Ａ１１とウレルマブおよびウトミルマブのエピトープ結合結果のヒートマップ。固定化された分子（行）に対する被験物質分子（列）のパーセント（％）で表した理論上のＲｍａｘに正規化された結合レベル。結合なし（濃い灰色）は同じエピトープを意味し、明るい灰色は第二の分子（被験物質）が結合でき、固定化された分子とは別のエピトープを有することを意味する。

【図2】競合ＥＬＩＳＡではＣＤ１３７ＬへのＣＤ１３７結合の阻害はない。ＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を評価する競合ＥＬＩＳＡで測定された吸光度は、それぞれＰＲＯ１３５９またはＰＲＯ１３６０の濃度の増加に応じて表される。阻害抗体ヤギ抗ヒトＣＤ１３７は参照として機能した。

【図3】フローサイトメトリー（ＦＣ）で評価した、ＰＲＯ１３５９およびＰＲＯ１３６０の、ヒトＣＤ１３７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合。得られた蛍光シグナルの幾何平均を、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表す。ウレルマブを参照として使用した。

【図4】（Ａ） ＣＤ１３７の構造。ＣＲＤ１～４は、システインリッチドメイン１～４を示す。（Ｂ） ＣＤ１３７ ＥＣＤの設計された構築物。

【図5】三重特異性ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１４８０およびＰＲＯ１４８１は、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）で６時間および２４時間刺激されたＨＣＣ８２７細胞の存在下で、ＣＤ１３７活性化アッセイで試験した。この実験では、ＰＲＯ８８５はＣＤ１３７シグナル伝達の相対的な活性化を評価するための参照分子として機能した。三重特異性ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１１８６を各プレートに取り、その活性を他のｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ分子と比較した。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を添加してから６時間または２４時間後に発光を読み取り、ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ４ＰＬ ｆｉｔ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、ＲＬＵ値を増加させた試験分子の濃度のみをフィットさせた。

【図6】ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化アッセイ。ＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＡで刺激し、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ構築物ＰＲＯ１４８０の段階希釈液で９６時間処理した。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡによる採取した上清中のＩＬ－２の定量化によって評価した。ＰＲＯ１４８０による処理は、参照分子の混合物と比較した場合、顕著なＩＬ－２分泌をもたらした。データは、ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ４ＰＬ ｆｉｔ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してフィットさせた。

【図7】ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）の有りまたは無しの刺激されたヒトＰＢＭＣのＩＬ－２分泌（９６時間、１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ）。ＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌのＳＥＡで刺激し、参照分子アベルマブおよびウレルマブおよびｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ ＰＲＯ１４８０およびＰＲＯ１１８６の混合物の段階希釈液で９６時間処理した。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡによる採取した上清中のＩＬ－２の定量化によって評価した。ＰＲＯ１４８０による処理は、ＰＲＯ１４８６による処理と比較した場合、顕著なＩＬ－２分泌をもたらした。データは、ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ４ＰＬ ｆｉｔ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してフィットさせた。

【図8】異なる抗ＣＤ１３７抗体断片によるＴ細胞活性化の力価および最大値。抗体構築物ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ ＰＲＯ１４８０およびＰＲＯ１１８６によるＴ細胞活性化の力価および最大値を、図７に示すように、それぞれＩＬ－２分泌の曲線下面積（ＡＵＣ）およびＩＬ－２分泌の最大刺激によって表す。

【図9】さまざまな抗ＣＤ１３７抗体断片のＣＤ１３７結合の概略図。ＣＤ１３７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ１～4）で構成されている。（Ａ） 抗ＣＤ１３７抗体ＰＲＯ１４８０は、ＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２のＥＣＤの遠位部分に含まれるＣＤ１３７上のエピトープに結合する。（Ｂ）対照的に、抗ＣＤ１３７抗体ＰＲＯ１１８６は、ＣＲＤ４の細胞に近接するＥＣＤの部分に含まれるＣＤ１３７上のエピトープに結合する。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、ヒトＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合する抗体、および医薬組成物、製造方法、ならびにそのような抗体および組成物の使用方法を提供する。

【0020】

別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

【0021】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、特に断りのない限り、本明細書ではそれらの制限のない非限定的な意味で使用される。したがって、そのような後者の実施形態に関して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、より狭い用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を含む。

【0022】

本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の言及は、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。たとえば、用語「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、それらの混合物を含む複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）を含む。複数形を化合物、塩等に使用する場合、これは、単一の化合物、塩等も意味すると解釈される。

【0023】

第一の態様では、本発明は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する抗体に関する。

【0024】

一つの態様では、本開示は、１セットのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する単離抗体を提供し、ここで該１セットのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１’は、配列番号：１、４、７、および１０のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１のアミノ酸配列であり；ＨＣＤＲ２’は、配列番号：２、５、８、および１１のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：２のアミノ酸配列であり；ＨＣＤＲ３’は、配列番号：３、６、９、および１２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：３のアミノ酸配列であり；ＬＣＤＲ１’は、配列番号：１６、１９、および２２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１６のアミノ酸配列であり；ＬＣＤＲ２’は、配列番号：１７、２０、および２３のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１７のアミノ酸配列であり；およびＬＣＤＲ３’は、配列番号：１８、２１、および２４のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１８のアミノ酸配列である、１セットのＣＤＲと比較して１０個以下のアミノ酸置換、たとえば９個以下のアミノ酸置換、８個以下のアミノ酸置換、７個以下のアミノ酸置換、６個以下のアミノ酸置換、５個以下のアミノ酸置換、４個以下のアミノ酸置換、３個以下のアミノ酸置換、２個以下のアミノ酸置換、１個または０個のアミノ酸置換、好ましくは０個のアミノ酸置換を有する。

【0025】

特定の実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号：１、２、および３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、配列番号：１６および１８の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＬＤＣＲ１およびＬＤＣＲ３配列、ならびに配列番号：１７の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＬＤＣＲ２配列を含む、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する単離抗体に関する。

【0026】

本明細書で使用する用語「抗体」等は、以下を含む：全抗体またはその一本鎖；および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖；および抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域、またはＶＬ領域を含む分子（多重特異性抗体を含むがこれに限定されない）。天然に存在する「全抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも二つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の三つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成されている。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0027】

本明細書で使用する用語「抗原結合断片」、「その抗原結合断片」、「抗原結合部分」等は、特異的に所与の抗原（たとえば、ＣＤ１３７）に結合する能力を保持する、インタクトな全抗体の一つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片によって行うことができる。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインで構成されるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；およびアンキリンベースのドメイン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、フィブロネクチン、および抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（たとえば、Ｆ－ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））を含むが、これらに限定されない代替スキャフォールドベースの結合ドメイン。
用語「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，“ ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリング方法）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） ＪＭＢ ２７３， ９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリング方法）、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリング（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ， ７， １３２－１３６ （１９９９）； Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ５５－７７ （２００３） （「ＩＭＧＴ」ナンバリング方法）によって記載されたもの、およびＨｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９ （２００１） ６５７－６７０（「ＡＨｏ」ナンバリング)に記載されたナンバリング方法を含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して決定された境界を有するアミノ酸配列である。たとえば、古典的な形式の場合、Ｋａｂａｔでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基に３１－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）、および９５－１０２（ＨＣＤＲ３）の番号をつける；および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基には、２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）、および８９－９７（ＬＣＤＲ３）の番号をつける。Ｃｈｏｔｈｉａでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸には２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５２－５６（ＨＣＤＲ２）、および９５－１０２（ＨＣＤＲ３）の番号をつける；およびＶＬのアミノ酸残基には、２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）、および８９－９７（ＬＣＤＲ３）の番号をつける。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲはヒトＶＨのアミノ酸残基２６－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）、および９５－１０２（ＨＣＤＲ３）、およびヒトＶＬのアミノ酸残基２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）、および８９－９７（ＬＣＤＲ３）で構成される。ＴＭＧＴでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基には約２６－３５（ＨＣＤＲ１）、５１－５７（ＨＣＤＲ２）、９３－１０２（ＨＣＤＲ３）の番号をつけ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基には約２７－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）、および８９－９７（ＬＣＤＲ３）の番号をつける（「Ｋａｂａｔ」によるナンバリング）ＩＭＧＴでは、抗体のＣＤＲは、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎを使用して決定することができる。

【0028】

本発明の文脈では、特に明記しない限り、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによって提案されたナンバリングシステム（「ＡＨｏ」）が使用される（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９ （２００１） ６５７－６７０）。さらに、以下の残基は、ＡＨｏナンバリングスキームに従ってＣＤＲとして定義されている： ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１とも呼ばれる）：Ｌ２４－Ｌ４２；ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２とも呼ばれる）：Ｌ５８－Ｌ７２；ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる）：Ｌ１０７－Ｌ１３８；ＨＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１とも呼ばれる）：Ｈ２７－Ｈ４２；ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２とも呼ばれる）：Ｈ５７－Ｈ７６；ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる）：Ｈ１０８－Ｈ１３８。明確にするために、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによるナンバリングシステムは、異なるＶＨおよびＶＬサブファミリーの両方、特にＣＤＲで、天然に存在する抗体に見られる長さの多様性を考慮に入れており、配列のギャップを提供する。したがって、所与の抗体可変ドメインでは、通常、１～１４９のすべての位置がアミノ酸残基によって占められるわけではない。

【0029】

好ましくは、「抗原結合領域」は、可変軽（ＶＬ）鎖の少なくともアミノ酸残基４～１３８および可変重（ＶＨ）鎖の５～１３８（いずれの場合も、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）、より好ましくは、ＶＬの３～１４４およびＶＨの４～１４４のアミノ酸残基を含み、そして特に好ましくは、完全なＶＬおよびＶＨ鎖（ＶＬの１～１４９およびＶＨの１～１４９のアミノ酸位置）である。抗原結合部分はまた、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、ｖ－ＮＡＲ及びｂｉｓ－ｓｃＦｖに組み込むことができる（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２３， １１２６， ３６を参照のこと）。抗体の抗原結合部分は、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）等のポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植することができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載している米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと）。抗原結合部分は、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むことができる（Ｚａｐａｔａ ｅｔ aｌ．， １９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７－１０６２；および米国特許第５，６４１，８７０号）。

【0030】

本明細書で使用される用語「結合特異性」は、異なる抗原決定基ではなく、一つの抗原決定基と反応する個々の抗体結合部位の能力を指す。本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する」または「特異的である」は、標的と抗体との間の結合等の測定可能かつ再現可能な相互作用を指し、これは、生体分子を含む不均一な分子集団の存在下での標的の存在を決定する。たとえば、標的（エピトープであってもよい）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合活性、より容易に、および／またはより長い持続時間でこの標的に結合する抗体である。その最も一般的な形態では（そして定義された参照が言及されていない場合）、「特異的結合」は、たとえば当分野で知られている特異性アッセイ法に従って決定されるように、所望の標的と無関係の分子とを区別する抗体の能力を指す。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験、およびペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。たとえば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコアリングは、標準的な発色［ｃｏｌｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ］（たとえば、西洋ワサビペルオキシドを用いた二次抗体および過酸化水素を用いたテトラメチルベンジジン）によって行うことができる。特定のウェルでの反応は、たとえば４５０ｎｍでの吸光度によって記録される。典型的なバックグラウンド（=ネガティブ反応）は約０．１ＯＤであってもよい；典型的な陽性反応は約１ＯＤであってもよい。これは、正のスコアと負のスコアの比率が１０倍以上になる可能性があることを意味する。さらなる例では、ＳＰＲアッセイを行うことができ、ここで、バックグラウンドとシグナルとの間の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍の差は、特異的結合を示す。通常、結合特異性の決定は、単一の参照分子ではなく、粉乳、トランスフェリン等の約３～５個の無関係な分子のセットを使用して行われる。本発明の抗体は、ヒトＣＤ１３７に対して結合特異性を有する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＣＤ１３７に対して結合特異性を有し、そして、特にＳＰＲによって決定されるように、ヒトＣＤ４０に結合せず、および／またはヒトＯＸ４０に結合しない。

【0031】

好適には、本発明の抗体は単離抗体である。本明細書で使用する用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（たとえば、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ１３７以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体は、他の種のＣＤ１３７分子等、他の抗原と交差反応する可能性がある。したがって、一つの実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＣＤ１３７およびカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］（カニクイザル［Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ］または「カニクイザル［Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ］」としても知られている）ＣＤ１３７に対して結合特異性を有する。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0032】

好適には、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書で使用する、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、それらのアミノ酸配列が実質的に同一であるか、または同じ遺伝的供給源に由来する抗体を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープ（単数）に対する結合特異性および親和性、または特定のエピトープ（複数）に対する結合特異性および親和性を示す。

【0033】

本発明の抗体は、キメラ抗体、およびヒト化抗体を含むが、これらに限定されない。

【0034】

用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその一部が、抗原結合部位（可変領域）が、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種、または完全に異なる分子の定常領域に連結されるように、変更、置換、または交換され、これによりキメラ抗体に新しい特性、たとえば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等を与える；または（ｂ）可変領域またはその一部は、異なる、または変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換、または交換される。たとえば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリン由来の定常領域で置換することによって改変することができる。ヒト定常領域での置換により、キメラ抗体は、元のマウス抗体と比較して、ヒトにおける抗原性を低下させながら、抗原を認識する際のその特異性を保持することができる。

【0035】

本明細書で使用する「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持しながら、ヒトにおいて免疫原性が低い抗体である。これは、たとえば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分をそれらのヒト対応物（すなわち、定常領域および可変領域のフレームワーク部分）で置換することによって達成することができる。追加のフレームワーク領域の改変は、ヒトフレームワーク配列内、ならびに別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列内で行うことができる。本発明のヒト化抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異、または安定性または産生を促進するための保存的置換）。たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１－６８５５， １９８４； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４４：６５－９２， １９８８； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： １５３４－１５３６， １９８８； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．， ２８：４８９－４９８， １９９１；およびＰａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．， ３１： １６９－２１７， １９９４を参照されたい。ヒト工学技術の他の例は、米国特許第5,766,886号に開示されているＸｏｍａ技術を含むが、これらに限定されない。

【0036】

本明細書で使用する用語「組換えヒト化抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作成または単離されるすべてのヒト抗体、たとえば、ヒト化抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、例として、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子、配列の全部または一部を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を含む。

【0037】

好適には、本発明の抗体は、ヒト化されている。好適には、本発明の抗体は、ヒト化されており、ウサギ由来のＣＤＲを含む。

【0038】

用語「ＣＤ１３７」は、特に本明細書で配列番号：３２として複製されたＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ０７０１１のヒトＣＤ１３７を指す。好適には、本発明の抗体は、ＣＤ１３７、具体的には本明細書で配列番号：３２として複製された、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ０７０１１で示されるヒトＣＤ１３７を標的にする。好適には、本発明の抗体は、ヒトおよびカニクイザル［ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ （Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）］ＣＤ１３７を標的にする。本発明の抗体は、ＣＤ１３７に特異的に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有し、特にＳＰＲによって決定されるように、ヒトＣＤ４０に結合しない、および／またはヒトＯＣ４０に結合しない。好ましくは、本発明の抗体は、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用を遮断しない。

【0039】

好適には、本発明の抗体は、ＣＤ１３７アゴニストである。「アクティベーター」、または「活性化抗体［ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ］」、または「アゴニスト」、または「アゴニスト抗体」は、それが結合する抗原によるシグナル伝達を増強または開始するものである。本発明の文脈において、用語「ＣＤ１３７アゴニスト」は、そのＣＤ１３７抗原結合フラグメントのクラスター化時にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化することができ、たとえば、上記ＣＤ１３７抗原結合フラグメントの少なくとも２つの結合は、結合したＣＤ１３７分子の多量体化およびそれらの活性化を可能にする、本発明の抗体を包含する。一部の実施形態では、アゴニスト抗体は、天然のリガンドの存在なしにシグナル伝達を活性化する。

【0040】

本発明の抗体は、実施例を含む、本明細書に記載されるように単離されたヒト化モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。そのような抗ヒトＣＤ１３７抗体の例は、その配列が表１に記載されている抗体である。本明細書に記載の抗体の生成および特性解析（characterization）に関する追加の詳細は、実施例に提供されている。

【0041】

ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本開示の単離抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、ここで：（ａ）上記ＶＨは、３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を順番に含み、（ｂ）上記ＶＬは、３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を順番に含む。明確にするために、ＣＤＲ領域は互いに連結されていないが、フレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ４に隣接している。

【0042】

本発明は、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合する抗体を提供し、上記抗体は、表１に列挙されたＶＨ ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。具体的には、本発明は、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体を提供し、上記抗体は表１に列挙された対応するＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、または３つのＶＨ ＣＤＲを含む。

【0043】

本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含むヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する単離抗体を提供し、ここで上記ＶＨは、３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を順番に含み、上記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１、４、７、および１０のいずれか一つから選択される、好ましくは配列番号：１のアミノ酸配列を有し、上記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２、５、８、および１１のいずれか一つから選択される、好ましくは配列番号：２のアミノ酸配列を有し、上記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３、６、９、および１２のいずれか一つから選択される、好ましくは配列番号：３のアミノ酸配列を有する。具体的には、本発明は、ヒトＣＤ１３７に対して結合特異性を有し、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む抗体を提供する。

【0044】

本発明はまた、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合する抗体を提供し、上記抗体は、表１に列挙されたＶＬ ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む。具体的には、本発明は、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体を提供し、上記抗体は表１に列挙された対応するＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、または３つのＶＬ ＣＤＲを含む。

【0045】

本発明は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する単離抗体を提供し、ここで上記ＶＬは、３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を順番に含み、上記ＬＣＤＲ１は、配列番号：１６、１９、および２２のいずれか一つから選択される、好ましくは配列番号：１６のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＤＲ２は、配列番号：１７、２０、および２３のいずれか一つから選択される、好ましくは配列番号：１７のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＤＲ３は、配列番号：１８、２１、および２４のいずれか一つから選択される、好ましくは配列番号：１８のアミノ酸配列を有する。具体的には、本発明は、ヒトＣＤ１３７に対して結合特異性を有し、それぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む抗体を提供する。

【0046】

好適には、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する単離抗体を提供し、ここで：
（ａ）上記ＶＨは、３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を順番に含み、上記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１、４、７、および１０のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有し、上記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２、５、８、および１１のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有し、上記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３、６、９、および１２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有する；および
（ｂ）上記ＶＬは、３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を順番に含み、上記ＬＣＤＲ１は、配列番号：１６、１９、および２２のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＤＲ２は、配列番号：１７、２０、および２３のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＤＲ３は、配列番号：１８、２１、および２４のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有する。

【0047】

具体的には、本発明は、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有し、（ａ）それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに（ｂ）それぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む抗体を提供する。

【0048】

本発明の他の抗体は、変異しているが、表１に記載の配列に示されるＣＤＲ領域とのＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。一つの態様では、本発明の他の抗体は、表１に記載の配列に示される配列に示されるＣＤＲ領域と比較した場合、ＣＤＲ領域において１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が変異している変異アミノ酸配列を含む。

【0049】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」または「同一性」は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。核酸、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体配列に関する「パーセント（％）同一性」および「相同性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセントの配列同一性を達成した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、特定の核酸、ペプチド、またはポリペプチド配列の核酸／アミノ酸残基と同一である候補配列の核酸／アミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、またはＡＬＩＧＮソフトウェア等の、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

【0050】

配列比較の場合、通常、一つの配列が参照配列として機能し、それに対してテスト配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用しても、代替パラメータを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0051】

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２， １９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０， １９９０に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公開されている。

【0052】

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０の重み付け表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ． Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ （Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ４： １１－１７， １９８８）のアルゴリズムを使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、およびギャップの重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さの重み１、２、３、４、５、または６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （Ｊ． Ｍｏｌ， Ｂｉｏｌ． ４８：４４４－４５３， １９７０）アルゴリズムを使用して決定することができる。

【0053】

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸、たとえば、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタメート、およびＯ－ホスホセリンである。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、一つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特に明記しない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に修飾されたバリアントを暗黙のうちに包含する。

【0054】

好適には、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本発明の単離された抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで：
（ａ）上記ＶＨは、順番に、３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、
上記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１、４、７、および１０のいずれか一つ、好ましくは配列番号：１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有し；
上記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２、５、８、および１１のいずれか一つ、好ましくは配列番号：２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有し；
上記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３、６、９、および１１のいずれか一つ、好ましくは配列番号：３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有し；および／または
（ｂ）上記ＶＬは、順番に、３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
上記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１６、１９、および２２のいずれか一つ、好ましくは配列番号：１６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有し；
上記ＨＣＤＲ２は、配列番号：１７、２０、および２３のいずれか一つ、好ましくは配列番号：１７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有し；
上記ＨＣＤＲ３は、配列番号：１８、２１、および２４のいずれか一つ、好ましくは配列番号：１８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する。

【0055】

一つの実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む： （ａ）それぞれ配列番号：１、２、および３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、および／またはそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３。一つの実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む： （ａ）それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、および／またはそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列。

【0056】

さらなる実施形態では、本発明は、ＣＤ１３７（たとえば、ヒトＣＤ１３７タンパク質）に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。本発明の文脈において、用語「ＶＨ」（可変重鎖）、「ＶＬ」（可変軽鎖）、「Ｖκ」および「Ｖλ」は、配列同一性および相同性に従ってグループ化された抗体重鎖および軽鎖配列のファミリーを指す。たとえば、ＢＬＯＳＵＭ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ． ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｊ． Ｇ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ （１９９２） １０９１５－１０９１９）等の相同性検索マトリックスを使用することによる配列相同性の決定の方法、および相同性による配列のグループ化は、当業者に周知である。ＶＨ、ＶκおよびＶλについては、たとえば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６ （２０００） ５７－８６は、ＶＨをＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２～ＶＨ６に、ＶκをＶκ１～Ｖκ４に、ＶλをＶλ１からＶλ３にグループ化する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、抗体のＶκ鎖、Ｖλ鎖、およびＶＨ鎖は、それぞれ生殖系列κ鎖ＶおよびＪセグメント、生殖系列λ鎖ＶおよびＪセグメント、および重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントのランダムな再構成の結果である。特定の抗体可変鎖がどのサブファミリーに属するかは、対応するＶセグメント、特にフレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ３によって決定される。したがって、本出願において、フレームワーク領域ＨＦＲ１～ＨＦＲ３のみの特定のセットによって特徴付けられる任意のＶＨ配列は、任意のＨＦＲ４配列、たとえば、重鎖生殖系列Ｊセグメントの一つから取られたＨＦＲ４配列、または再構成されたＶＨ配列から取られたＨＦＲ４配列と組み合わせることができる。

【0057】

好適には、本発明は、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離された抗体（たとえば、ヒトＣＤ１３７タンパク質）を提供し、ここで、上記抗体は、ＶＨ３ドメインを含む。ＶＨ３ファミリーに属するＶＨの特定の例は、配列番号：１３または配列番号：１４の下に示されている。特に、配列番号：１３または配列番号：１４から取られたフレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ３は、ＶＨ３ファミリーに属する（表１、太字ではない最初の３つの領域）。好適には、本明細書で使用されるＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号：１３または配列番号：１４のＦＲ１～ＦＲ３に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１～ＦＲ３を含むＶＨである。より具体的には、配列番号：１３または配列番号：１４から取られたフレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ４は、ＶＨ３ファミリーに属する（表１、太字ではない領域）。好適には、本明細書で使用されるＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号：１３または配列番号：１４のＦＲ１～ＦＲ４に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１～ＦＲ４を含むＶＨである。

【0058】

好適には、本発明は、ＣＤ１３７（たとえば、ヒトＣＤ１３７タンパク質）に特異的に結合する単離抗体を提供する。ここで、上記抗体は、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、具体的にはＶκ１、またはＶκ３フレームワーク、好ましくはＶκ１フレームワーク ＦＲ１～３、およびＶκ ＦＲ４から選択される、好ましくはＶκ１ ＦＲ４またはＶκ３ ＦＲ４フレームワーク、およびＶλ ＦＲ４である、フレームワークＦＲ４を含む。好適なＶκ１フレームワーク ＦＲ１～ＦＲ３は、配列番号：２５または配列番号：２６に記載のとおりである（表１、ＦＲ領域は太字ではない）。好適なＶκ１フレームワーク ＦＲ１～ＦＲ３は、ＦＲ１～ＦＲ３に対応し、配列番号：２５または配列番号：２６から取得したアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセント同一性を有するアミノ酸配列を含む（表１、ＦＲ領域は太字ではない）。

【0059】

好適なＶλ ＦＲ４は、配列番号：３３～配列番号：３９に記載のとおりである。一つの実施形態では、本発明は、ＣＤ１３７（たとえば、ヒトＣＤ１３７タンパク質）に特異的に結合する単離抗体を提供する。ここで、上記抗体は、配列番号：３３～配列番号：３９のいずれかから選択され、好ましくは配列番号：３３または配列番号：３４、より好ましくは配列番号：３３であるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセント同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含む。

【0060】

一つの実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む：
（ｉ） それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ） ＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；および
（ｉｉｉ） ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、具体的にはＶκ１またはＶκ３ ＦＲ１～ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１～ＦＲ３を含むＶＬフレームワーク、およびＶκ ＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４またはＶκ３ ＦＲ４、およびＶλ ＦＲ４、具体的には配列番号：３３～配列番号：３９のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、配列番号：３３または配列番号：３４、より好ましくは配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より具体的には配列番号：３３～配列：３９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくは配列番号：３３または配列番号：３４、より好ましくは配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４。

【0061】

一つの実施形態では、したがって、本発明は、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有し、以下を含むＶＬを含む抗体を提供する：
（ｉ） ＣＤＲドメイン ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；
（ｉｉ） ヒトＶκフレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ３、具体的にはヒトＶκ１フレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ３；
（ｉｉｉ） （ａ）ＦＲ４のヒトＶλ生殖系列配列、特に配列番号：３３～３９、好ましくは配列番号：３３または配列番号：３４、より好ましくは配列番号：３３の列挙から選択されるＶλ生殖系列配列；および（ｂ）配列番号：３３～配列番号：３９、好ましくは配列番号：３３または配列番号：３４、より好ましくは配列番号：３３のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ４に対して最も近いヒトＶλ生殖系列配列と比較して、一つまたは二つの変異、具体的には一つの変異を有する、Ｖλベースの配列。

【0062】

より好ましい実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む：
（ｉ） それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ） ＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１～ＦＲ４；および
（ｉｉｉ） Ｖκ１フレームワークＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、および配列番号：３３～配列番号：３９のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、具体的には配列番号：３３～配列番号：３９のいずれか一つ、好ましくは配列番号：３３または配列番号：３４、より好ましくは配列番号：３３に記載のＶλ ＦＲ４を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン。

【0063】

本発明は、ＣＤ１３７（たとえば、ヒトＣＤ１３７タンパク質）に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、表１に列挙されたＶＨドメインを含む。

【0064】

本発明はまた、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、表１に列挙されたＶＨアミノ酸配列を含み［ｃｏｍｐｒｉｓｅ］（または、あるいは、それからなり［ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ］）、ここで、フレームワーク配列（たとえば、ＣＤＲではない配列）中の約１０個以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。

【0065】

本発明はまた、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、表１に列挙されたＶＨアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（たとえば、ＣＤＲではない配列）中の約２０個以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。

【0066】

本発明の他の抗体は、変異しているが、表１に記載の配列に示されているＶＨ領域とのＶＨ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。

【0067】

本発明は、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は表１に列挙されているＶＬドメインを含む。

【0068】

本発明はまた、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、表１に列挙されたＶＬアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（たとえば、ＣＤＲではない配列）中の約１０個以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。

【0069】

本発明はまた、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、表１に列挙されたＶＬアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（たとえば、ＣＤＲではない配列）中の約２０個以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）。

【0070】

本発明の他の抗体は、変異しているが、表１に記載の配列に示されているＶＬ領域とのＶＬ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。

【0071】

好適には、本発明は、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、配列番号：１３または配列番号：１４または配列番号：１５、好ましくは配列番号：１３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％、好ましくは少なくとも９０％、同一であるアミノ酸を含む重鎖可変領域を含み、そして具体的にはここで、上記抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む。一つの実施形態では、本発明は、単離抗体またはヒトＣＤ１３７に特異的に結合するそれを提供し、ここで上記抗体は、配列番号：１３のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで上記重鎖可変領域はＧ５１Ｃ（ＡＨｏナンバリング）を含む。さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで上記抗体は、配列番号：１４のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで上記重鎖可変領域はＶ２Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、およびＱ１４１Ｐ（ＡＨｏナンバリング）を含む。

【0072】

別の実施形態では、本発明は、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、ここで、上記抗体は、配列番号：２５または配列番号：２６または配列番号：２７、好ましくは配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％、好ましくは少なくとも９０％、同一であるアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含み、そして具体的にはここで、上記抗体は、それぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む。一つの実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで上記抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで上記軽鎖可変領域はＴ１４１Ｃ（ＡＨｏナンバリング）を含む。さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで上記抗体は、配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで上記軽鎖可変領域はＩ２Ｆ、Ｍ４Ｌ、およびＡ５１Ｐ（ＡＨｏナンバリング）を含む。

【0073】

本発明はまた、ＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、ここで、上記抗体は、配列番号：１３、１４、および配列番号：１５からなる群から選択され、好ましくは配列番号：１３であるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％、好ましくは少なくとも９０％、同一であるアミノ酸を含む重鎖可変領域；および配列番号：２５、２６、および２７からなる群から選択され、好ましくは配列番号：２５であるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％、好ましくは少なくとも９０％、同一であるアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。

【0074】

一つの実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む： 配列番号：１３、１４、および１５のいずれかから選択され、好ましくは配列番号：１３であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：２５、２６、および２７のいずれかから選択され、好ましくは配列番号：２５であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。

【0075】

したがって、本発明は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する単離抗体を提供し、上記抗体は、配列番号：１３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％、好ましくは少なくとも９０％、同一であるアミノ酸を含む重鎖可変領域；および配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％、好ましくは少なくとも９０％、同一であるアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含み、そしてここで抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、および／またはそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含み、好ましくはここで抗体は、配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む。

【0076】

さらなる実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する、本発明の単離抗体は、以下を含む： （ａ）配列番号：１３のＶＨ配列および配列番号：２５のＶＬ配列； （ｂ）配列番号：１４のＶＨ配列および配列番号：２６のＶＬ配列；または （ｃ）配列番号：１５のＶＨ配列および配列番号：２７のＶＬ配列。好ましい実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する、本発明の単離抗体は、配列番号：１３のＶＨ配列および配列番号：２５のＶＬ配列を含む。

【0077】

一つの実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する、本発明の抗体は、以下を含む：
（ａ）それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＨ配列、および配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＬ配列；
（ｂ）それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＨ配列、および配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＬ配列、好ましくはここで該ＶＨはＶ２Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、およびＱ１４１Ｐ（ＡＨｏナンバリング)を含む、および該ＶＬはＩ２Ｆ、Ｍ４Ｌ、およびＡ５１Ｐ（ＡＨｏナンバリング）を含む；または
（ｃ）それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＨ配列、および配列番号：２７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＬ配列、好ましくはここで該ＶＨはＧ５１Ｃ（ＡＨｏナンバリング)を含む、および該ＶＬはＴ１４１Ｃ（ＡＨｏナンバリング）を含む。

【0078】

好ましい実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する、本発明の抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＨ配列、および配列番号：２７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、ＶＬ配列を含み、好ましくはここで該ＶＨはＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏナンバリング)を含む、および該ＶＬはＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏナンバリング）を含む。好適には、本発明の上記抗体は、特に、システインの対が上記ＶＨ上のＧｌｙ５１（ＡＨｏナンバリング）および上記ＶＬ上のＴｈｒ１４１（ＡＨｏナンバリング）を置換する、フレームワーク領域内に人工ドメイン間ジスルフィド架橋を形成するように変異される。驚くべきことに、ドメイン間ジスルフィド架橋を含む本発明のそのような抗体は、顕著に増加した熱安定性を有することが見出された。

【0079】

ジスルフィド架橋（「ＳＳ架橋」または「ｄｉＳ」）に関する用語「人工」は、ＳＳ架橋が野生型抗体によって自然に形成されるのではなく、親分子の操作された変異体によって形成されることを意味し、ここで少なくとも一つの外来アミノ酸がジスルフィド結合に寄与している。人工ジスルフィド架橋の部位特異的工学は、天然免疫グロブリンまたは国際公開第２００９／０００００６号に記載されているようなモジュラー抗体で自然に利用可能なものとは明らかに区別される。これは、人工二硫化物架橋の橋脚の部位の少なくとも一つが通常、野生型抗体のＣｙｓ残基の位置とは別に配置されているため、フレームワーク領域内に代替または追加のジスルフィド架橋が提供されるためである。本発明の人工ジスルフィド架橋は、抗体ドメイン（「ドメイン内架橋」）内で操作することができ、これは、ベータシート構造を安定化するか、またはドメイン（「ドメイン間架橋」）またはドメインの鎖（「鎖間架橋」）を架橋して、本発明による多重特異性抗体の構造を制約し、潜在的な結合パートナーとのその相互作用をサポートする。

【0080】

一つの実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する本発明の抗体は、以下を含む：
（ａ）配列番号：１３のＶＨ配列および配列番号：２５のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号：１４のＶＨ配列および配列番号：２６のＶＬ配列；または
（ｃ）配列番号：１５のＶＨ配列および配列番号：２７のＶＬ配列。

【0081】

好ましい実施形態では、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有する、本発明の抗体は、配列番号：１３のＶＨ配列および配列番号：２５のＶＬを含む。

【0082】

一つの実施形態では、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体は、表１に記載の抗体である。一つの実施形態では、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体は、配列番号：２９、配列番号：３０、または配列番号：３１に記載されるとおりである。一つの実施形態では、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体は、配列番号：３０に記載されるとおりである。一つの実施形態では、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体は、配列番号２９：または配列番号：３１に記載されるとおりである。好ましい実施形態では、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体は、配列番号２９に記載されているとおりである。

【0083】

本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異しているが、表１に記載の配列に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５パーセントの同一性を有するものを含む。一つの実施形態では、表１に記載の配列に示される可変領域と比較した場合、実質的に同じ治療活性を保持しながら、可変領域において１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が変異している変異アミノ酸配列を含む。本明細書で使用される用語「実質的に同じ活性」とは、親抗体、たとえば、本開示の抗体、特に表1に記載の本開示の抗体について決定される活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％、少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１６０％、または少なくとも１７０％、または少なくとも１８０％、または少なくとも１９０％、例として最大２００％である、実質的に同じ活性によって示される活性を指す。

【0084】

これらの抗体のそれぞれがＣＤ１３７に結合でき、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２、および３領域によって提供されることを考えると、
ＶＨ ＣＤＲ１、２、および３配列とＶＬ ＣＤＲ１、２、および３配列を「混合および一致させる［ｍｉｘｅｄ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ］」ことができる（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲを混合および一致させることができる）が、ただし本発明の他のＣＤ１３７結合結合分子を作成するために、各抗体はＶＨ ＣＤＲ１、２、および３およびＶＬ ＣＤＲ１、２、および３を含む必要がある。そのような「混合および一致させた」ＣＤ１３７結合抗体は、当技術分野で知られている結合アッセイおよび実施例に記載されているもの（たとえば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似したＣＤＲ配列に置換する必要がある。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似したＣＤＲ配列に置換する必要がある。新規のＶＨおよびＶＬ配列は、一つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体について本明細書に示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似した配列で変異させることによって作成できることは、通常の当業者には容易に明らかである。

【0085】

さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載の配列に相同であるアミノ酸配列を含む抗体を提供し、上記抗体はＣＤ１３７に結合し、表１に記載のそれらの抗体の所望の機能特性を保持する。

【0086】

たとえば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体を提供し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号：１３、１４、および１５からなる群から選択され、好ましくは配列番号：１３であるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号：２５、２６、および２７からなる群から選択され、好ましくは配列番号：２５であるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み；ここで抗体はヒトＣＤ１３７に特異的に結合する。

【0087】

一つの実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に記載の配列と５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、または９９パーセント同一であってもよい。一つの実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて同一であってもよい。

【0088】

一つの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここでこれらのＣＤＲ配列の一つまたは複数は、本明細書に記載の抗体またはその保存的修飾に基づいて特定のアミノ酸配列を有し、ここで抗体は、本発明のＣＤ１３７結合抗体の所望の機能特性を保持する。

【0089】

用語「保存的に修飾されたバリアント（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）」または「保存的バリアント（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ）」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮退のために、機能的に同一の多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードしている。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置で、コードされたポリペプチドを変更することなく、コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸バリアントは「サイレントバリアント」であり、これは保存的に修飾されたバリアントの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列はまた、核酸のすべての可能なサイレントバリエーションを記載している。当業者は、核酸の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生成できることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列に暗示されている。

【0090】

ポリペプチド配列の場合、「保存的に修飾されたバリアント」または「保存的バリアント」は、ポリペプチド配列への個々の置換、欠失または付加を含み、それがアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間同族体（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇ）、および対立遺伝子に追加され、そしてそれらを除外しない。次の８つの群は、相互に保存的に置換されたアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１９８４）を参照のこと）。一つの実施形態では、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を与えたり変更したりしないアミノ酸修飾を指すために使用される。

【0091】

したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とからなる単離モノクローナル抗体を提供し、ここで： 重鎖可変領域ＣＤＲ１は、好ましくは、配列番号：１、４、７、１０のいずれかから選択される、好ましくは配列番号：１であるアミノ酸配列、またはその保存的バリアントからなる；重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号：２、５、８、１１のいずれかから選択される、好ましくは配列番号：２であるアミノ酸配列、またはその保存的バリアントからなる；重鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列番号：３、６、９、１２のいずれかから選択される、好ましくは配列番号：３であるアミノ酸配列、またはその保存的バリアントからなる；軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、好ましくは、配列番号：１６、１９、２２のいずれかから選択される、好ましくは配列番号：１６であるアミノ酸配列、またはその保存的バリアントからなる；軽鎖可変領域ＣＤＲ２は、好ましくは、配列番号：１７、２０、２３のいずれかから選択される、好ましくは配列番号：１７であるアミノ酸配列、またはその保存的バリアントからなる；軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、好ましくは、配列番号：１８、２１、２４のいずれかから選択される、好ましくは配列番号：１８であるアミノ酸配列、またはその保存的バリアントからなる； ここで、抗体はＣＤ１３７に特異的に結合し、追加の架橋の有無にかかわらずＣＤ１３７シグナル伝達を活性化することができる。

【0092】

一つの実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現に最適化されており、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有し、ここでこれらの配列の一つまたは複数は、本明細書に記載の抗体またはその保存的修飾であり、ここで抗体は本発明のＣＤ１３７結合抗体の所望の機能的特性を保持している。したがって、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、哺乳動物細胞における発現に最適化された単離モノクローナル抗体を提供し、ここで： 重鎖可変領域は、配列番号：１３、１４、および１５のいずれかから選択される、好ましくは配列番号：１３であるアミノ酸配列、またはその保存的修飾を含む；軽鎖可変領域は、配列番号：２５、２６、および２７のいずれか一つから選択される、好ましくは配列番号：２５であるアミノ酸配列、またはその保存的修飾を含む； ここで、抗体はＣＤ１３７に特異的に結合し、追加の架橋の有無にかかわらずＣＤ１３７シグナル伝達を活性化することができる。

【0093】

一つの実施形態では、本発明の抗体は、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有する哺乳動物細胞における発現のために最適化され、ここでこれらの配列の一つまたは複数は、本明細書に記載の抗体またはその保存的修飾に基づいて特定のアミノ酸配列を有し、ここで抗体は、本発明のＣＤ１３７結合抗体の所望の機能特性を保持する。

【0094】

本明細書で使用する場合、用語「最適化された」は、産生細胞または生物、一般に真核細胞、たとえば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用して、アミノ酸配列をコードするよう改変されたヌクレオチド配列を意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている開始ヌクレオチド配列によって最初にコードされたアミノ酸配列を完全にまたは可能な限り保持するように設計されている。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように設計されている。しかしながら、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現もまた、本明細書において想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、最適化されたとも呼ばれる。

【0095】

別のタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させて、それによって「親和性成熟」として知られる目的の抗体の一つまたは複数の結合特性（たとえば、親和性）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を行って突然変異を導入することができ、抗体結合に対する効果、または目的の他の機能的特性は、本明細書に記載され、実施例に提供されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。（上記で説明したように）保存的な修飾を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失である可能性があってもよい。さらに、通常、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基が変更される。

【0096】

「親和性成熟」抗体は、それらの変化を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、その一つまたは複数の可変ドメインに一つまたは複数の変化を有するものである。一つの実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルの親和性さえも有する。親和性成熟抗体は、当技術分野で知られている方法によって産生される。たとえば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３ （１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。超可変領域（ＨＶＲ）および／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、たとえば、以下によって記載されている：Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３ （１９９４）； Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １６９：１４７－１５５ （１９９５）； Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４（７）：３３１０－９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２６：８８９－８９６ （１９９２）。

【0097】

本発明の抗体はさらに、改変抗体を操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）するための出発物質として本明細書に示される一つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して調製することができ、その改変抗体は、出発抗体から変化した特性を有してもよい。抗体は、例えば一つまたは複数のＣＤＲ領域内および／または一つまたは複数のフレームワーク領域内の、一つまたは両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内の一つまたは複数の残基を修飾することによって操作することができる。追加的または代替的に、抗体は、たとえば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を改変することによって操作することができる。

【0098】

実行できる可変領域エンジニアリングの一つのタイプは、ＣＤＲグラフトである。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）にあるアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体－抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された、特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７； Ｊｏｎｅｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５； Ｑｕｅｅｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６： １００２９－１００３３；Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許番号第５，２２５，５３９号、およびＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許番号第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号を参照のこと）。

【0099】

このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列または再構成された抗体配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から取得することができる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットのｗｗｗ.ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）、ならびにＫａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７７６－７９８；およびＣｏｘ， Ｊ． Ｐ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｅｕｒ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：８２７－８３６で見出すことができ、それぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＩＭＧＴ」データベース（インターネットのｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能；Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：２０９－２１２を参照；それぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。）で見出すことができる。

【0100】

本発明の抗体で使用するためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体によって使用されるフレームワーク配列、たとえば、本発明のモノクローナル抗体によって使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列に構造的に類似するものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列、およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植することができ、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して一つ以上の変異を含むフレームワーク領域に移植することができる。たとえば、特定の例において、抗体の抗原結合能力を維持または増強するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出された（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌに対する米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号を参照）。

【0101】

得られるポリペプチドがＣＤ１３７に特異的に結合する少なくとも一つの結合領域を含む限り、多種多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを使用することができる。そのようなフレームワークまたはスキャフォールドは、ヒト免疫グロブリンの５つの主要なイディオタイプ、その抗原結合断片を含み、そして好ましくはヒト化された態様を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。

【0102】

一つの態様では、本発明は、本発明のＣＤＲを移植することができる非免疫グロブリンスキャフォールドを使用して非免疫グロブリンベースの抗体を生成する方法に関する。既知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドは、それらが標的ＣＤ１３７タンパク質に対して特異的な結合領域を含む限り、使用することができる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、ドイツ、フライシング）、小型モジュール免疫医薬［ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏ－ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ］（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、ワシントン州シアトル）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マウンテンビュー）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、スウェーデン）、およびアフィリン（ガンマクリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、ハレ、ドイツ）を含むが、これらに限定されない。

【0103】

好適には、本発明の抗体は、ＣＤ１３７に特異的に結合し、以下のパラメータの一つまたは複数を特徴とする：
（ｉ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合、５０ｎＭ未満、具体的には１０ｎＭ未満、より具体的には５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｉｉ）ＳＰＲによって測定した場合、５×１０^－３ｓ^－１以下、または１０^－３ｓ^－１以下または５×１０^－４ｓ^－１以下、または１０^－４ｓ^－１以下のＫ_ｏｆｆ速度でヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｉｉｉ）ＳＰＲによって測定した場合、少なくとも１０^４Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも５×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも１０^６Ｍ^－１ｓ^－１のＫ_ｏｎ速度でヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｉｖ）任意選択で、ウレルマブと交差競合する；
（ｖ）任意選択で、カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］（カニクイザル［Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ］）ＣＤ１３７と交差反応する；
（ｖｉ）任意選択で、特に競合ＥＬＩＳＡで測定した場合、ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌの間の相互作用を阻害しない。

【0104】

本明細書で使用する場合、用語「親和性」は、単一の抗原部位での抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力を介して多数の部位で抗原と相互作用する；相互作用が多いほど、親和性は強くなる。

【0105】

「結合親和性」は、一般に、分子（たとえば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（たとえば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」、「結合する（ｂｉｎｄ ｔｏ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ ｔｏ）」または「結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ）」は、結合対のメンバー（たとえば、抗体断片と抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に抗原に速く結合し、より長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、それらのいずれも本発明の目的のために使用することができる。結合親和性、すなわち結合強度を測定するための特定の例示的かつ例示的な実施形態を以下に記載する。

【0106】

本明細書で使用される用語「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」、「Ｋａ」、または「Ｋ_ｏｎ」は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図し、一方、本明細書で使用される用語「Ｋ_ｄｉｓ」、「Ｋｄ」、または「Ｋ_ｏｆｆ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。一つの実施形態では、本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図している。本発明による「ＫＤ」または「ＫＤ値」または「Ｋ_Ｄ」または「Ｋ_Ｄ値」は、一つの実施形態では、ＭＡＳＳ－１ ＳＰＲ機器（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定される。親和性を測定するために、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ａ１２０－１１１Ａ）を、標準的なアミンカップリング法を使用してセンサーチップ（ＳＰＲ－２親和性センサー、高容量アミン、Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）に固定化する。Ｂ細胞上清中のウサギモノクローナル抗体は、固定化された抗ウサギＩｇＧ抗体によって捕捉される。十分な捕捉を可能にするには、Ｂ細胞上清中の最小ＩｇＧ濃度が必要である。モノクローナル抗体を捕捉した後、ヒトＣＤ１３７ ＥＣＤ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３１０－１５－１ＭＧ）を９０ｎＭの濃度で３分間フローセルに注入し、センサーチップに捕捉されたＩｇＧからタンパク質の解離を５分間進行させる。各注入サイクルの後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌを２回注入して表面を再生させる。見かけの解離（ｋｄ）と会合（ｋａ）の速度定数、および見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、ＭＡＳＳ－１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）で１対１のラングミュア結合モデルを使用して計算され、曲線近似の品質は、曲線近似の品質の尺度である相対Ｃｈｉ^２（分析物の外挿された最大結合レベルに正規化されたＣｈｉ^２）に基づいてモニターされる。Ｃｈｉ^２の値が小さくなるほど、１対１のラングミュア結合モデルへの適合がより正確になる。リガンド結合の応答単位（ＲＵ）が抗体捕捉のＲＵの少なくとも２％である場合、結果は有効であるとみなす。抗体捕捉のＲＵが２％未満のリガンド結合のＲＵを有するサンプルは、捕捉された抗体に対するＣＤ１３７の特異結合を示さないとみなす。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比率として計算する。たとえば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３：８６５－８８１ （１９９９）を参照されたい。

【0107】

好適には、ＣＤ１３７に対する本発明の抗体の親和性は、ＣＤ１３７に対するＣＤ１３７Ｌの親和性に匹敵するか、またはそれより高くてもよい。好適には、ＣＤ１３７に対する本発明の抗体の親和性は、ＣＤ１３７に対するウレルマブの親和性に匹敵するか、またはそれより高くてもよい。ＣＤ１３７結合ドメインのより高い親和性は、抗体での使用に特に好適であってもよく、ここで、上記抗体は、ＣＤ１３７に対して一価であることが理解されるであろう。抗体の結合親和性は、たとえば、解離定数（ＫＤ）によって決定してもよい。より強い親和性はより低いＫＤによって表され、より弱い親和性はより高いＫＤによって表される。

【0108】

したがって、好適な実施形態では、本発明の抗体は、特にＳＰＲによって測定した場合、５～５０，０００ｐＭ、５～４０，０００ｐＭ、５～３０，０００ｐＭ、５～２０，０００ｐＭ、５～１０，０００ｐＭ、５～９，０００ｐＭ、５～８，０００ｐＭ、５～７，０００ｐＭ、５～６，０００ｐＭ、５～５，０００ｐＭの間のＫＤを有してもよい。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、特にＳＰＲによって測定した場合、１０ｎＭと１０ｐＭの間、好ましくは１０ｎＭと０．１ｎＭの間、より好ましくは５ｎＭと１ｎＭの間のＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。

【0109】

好適な実施形態では、本発明の抗体は、特にＳＰＲによって測定した場合、約５０ｎＭ未満、約４５ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満のＫＤを有してもよい。好適には、本発明の抗体は、特にＳＰＲによって測定した場合、１０ｎＭ未満のＫＤを有する。好ましくは、本発明の抗体は、特にＳＰＲによって測定した場合、５ｎＭ未満のＫＤを有するヒトＣＤ１３７に結合する。

【0110】

好適には、本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって測定した場合、少なくとも１０^３Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも１０^４Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも５×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも５×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上、少なくとも１０^６Ｍ^－１ｓ^－１以上のＫ_ｏｎ速度でヒトＣＤ１３７に結合する。好適には、本発明の抗体は、ＳＰＲによって測定した場合、少なくとも１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上、具体的には少なくとも５×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上のＫ_ｏｎ速度を有する。

【0111】

好適には、本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって測定した場合、少なくとも１０^－３ｓ^－１以下、３×１０^－３ｓ^－１以下、５×１０^－３ｓ^－１以下、１０^－４ｓ^－１以下、５×１０^－４ｓ^－１以下のＫ_ｏｆｆ速度でヒトＣＤ１３７に結合する。好適には、本発明の抗体は、ＳＰＲによって測定した場合、５×１０^－３ｓ^－１以下のＫ_ｏｆｆ速度を有する。

【0112】

好適には、本発明の抗体は、有益な生物物理学的特性を有する。

【0113】

好適には、本発明の抗体は、ｓｃＦｖフォーマットである場合、示差走査蛍光光度法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）によって決定されるように、少なくとも５０℃、たとえば、少なくとも５５℃、好ましくは少なくとも６０℃、より好ましくは少なくとも６５℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、ここで上記抗体は、ｐＨ ６．４、１５０ ｍＭ ＮａＣｌの５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液で製剤化される。ＤＳＦは以前に記載されている（Ｅｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， ＭＡｂｓ， ９（１） （２０１７）， ６８－８４； Ｎｉｅｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２（９） （２００７） ２２１２－２２２１）。ｓｃＦｖコンストラクトの熱変性の遷移の中点は、蛍光色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを使用した示差走査蛍光光度法によって決定される（Ｗｏｎｇ ＆ Ｒａｌｅｉｇｈ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ （２０１６） １８３４－１８４０を参照のこと）。ｐＨ６．４のリン酸－クエン酸緩衝液中のサンプルは、５０μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度で製剤化され、総量１００μｌに５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅの最終濃度が含まれている。２５μｌの調製サンプルを白壁の（ｗｈｉｔｅ－ｗａｌｌｅｄ）ＡＢ ｇｅｎｅ ＰＣＲプレートに３回ずつ添加する。アッセイはサーマルサイクラーとして使用されるｑＰＣＲマシンで行い、蛍光発光はソフトウェアのカスタム色素キャリブレーションルーチンを使用して検出する。試験サンプルを含むＰＣＲプレートは、２５℃から９６℃まで１℃刻みで温度ランプに供され、各温度上昇後に３０秒休止する。 総アッセイ時間は約２時間である。Ｔｍは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって、数学的な二次導関数法を使用して計算し、曲線の変曲点を計算する。報告されるＴｍは、３回の測定の平均である。

【0114】

本発明の抗体は、特にｓｃＦｖ（一本鎖抗体［ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ］）抗体フォーマットで表される場合、本発明の抗体が初濃度１０ｍｇ／ｍｌであり、特にここで本発明の抗体がｐＨ ６．４の１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液で製剤化される場合、少なくとも２週間、特に少なくとも４週間の保管後の７％未満の、たとえば６％未満、５％未満、３％未満、好ましくは２％未満のモノマー含有量の損失を特徴とする。モノマー含有量の損失は、ＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムの濃度曲線下面積の計算によって決定される。ＳＥ－ＨＰＬＣは、米国薬局方の第６２１章で概説されているように、固体固定相と液体移動相に基づく分離技術である。この方法では、疎水性の固定相と水性の移動相を利用して、分子の大きさおよび形状に基づいて分子を分離する。分子の分離は、特定のカラムの空隙容量（Ｖ０）および総透過量（ＶＴ）の間で発生する。ＳＥ－ＨＰＬＣによる測定は、自動サンプル注入および検出波長２８０ｎｍに設定されたＵＶ検出器を備えたＣｈｒｏｍａｓｔｅｒＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行う。機器は、ソフトウェアＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バージョン3．３．２ ＳＰ２）によって制御される。このソフトウェアは、結果のクロマトグラムの分析もサポートする。タンパク質サンプルは遠心分離によって除去され、注入前にオートサンプラーで４～６℃の温度に保持される。ｓｃＦｖサンプルの分析には、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ４０３－４Ｆカラム（昭和電工株式会社、＃Ｆ６９８９２０２）を、推奨流量０．３５ｍＬ／分の標準化された緩衝生理食塩水移動相（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、３００ｍＭ塩化ナトリウム）とともに使用した。注入あたりの目標サンプル負荷は５μｇである。サンプルは波長２８０ｎｍのＵＶ検出器で検出し、データは好適なソフトウェア一式（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ）で記録する。得られたクロマトグラムは、Ｖ０からＶＴの範囲で分析されるため、溶出時間が１０分を超えるマトリックス関連ピークは除外される。

【0115】

さらに、本発明の抗体は、特にｓｃＦｖ（一本鎖抗体［ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ］）抗体フォーマットで表される場合、本発明の抗体が初濃度１０ｍｇ／ｍｌであり、特にここで本発明の抗体がｐＨ ６．４の１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸－クエン酸緩衝液で製剤化される場合、５回の連続した凍結融解サイクル後の５％未満の、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含有量の損失を特徴とする。

【0116】

用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合することができる抗原の局所領域を指す。エピトープは、たとえば、ポリペプチドの隣接アミノ酸であってもよく、またはエピトープは、たとえば、ポリペプチド（単数）またはポリペプチド（複数）の２つ以上の非隣接領域から一緒になりうる。

【0117】

一つの実施形態では、本発明の抗体は、ウレルマブとのＣＤ１３７への結合について交差競合する。ＢＭＳ－６６３５１３とも呼ばれるウレルマブは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂからの完全にヒト化されたＩｇＧ４ ｍＡｂであり、国際公開第２００４／０１０９４７号、米国特許第６，８８７，６７３号、および米国特許第７，２１４，４９３号に記載されており、これらは参照により、その全体が本出願に組み込まれる。好適には、本発明の抗体は、非限定的な理論によれば、ウレルマブと同じまたは重複する（たとえば、構造的に類似した、または空間的に近位の）エピトープに結合しうる。

【0118】

一つの実施形態では、本発明の抗体は、ウトミルマブとの結合について交差競合しない。本発明は、ウトミルマブとは異なるエピトープに結合する抗体を提供する。ＰＦ－０５０８２５６６とも呼ばれるウトミルマブは、Ｐｆｉｚｅｒからの完全ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂであり、国際公開第２０１２／０３２４３３号および米国特許第８，８２１，８６７号に記載されており、これらは、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。好適には、本発明の抗体は、非限定的な理論によれば、ウトミルマブとは異なる（たとえば、構造的に異なる、または空間的に離れた）エピトープに結合しうる。本明細書で使用される用語「認識する」は、その立体配座エピトープを見つけて相互作用する（たとえば、結合する）抗体を指す。

【0119】

本発明の抗体は、ＣＤ１３７のアミノ酸残基Ａｓｎ４２が結合にとって重要な残基ではないという条件で、ＣＤ１３７の細胞外ドメインの遠位部分に位置するエピトープ、特にシステインリッチドメイン１～２（ＣＲＤ１～２）内、特に配列番号：３２のアミノ酸残基２４～８６内に位置するエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する。

【0120】

したがって、さらなる態様では、本開示はまた、本開示の例示的な抗体のいずれか、特に表１に列挙される例示的な抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗体を提供する。本開示は、上記抗体が、ＣＤ１３７のアミノ酸残基Ａｓｎ４２がＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２の結合にとって重要な残基ではないという条件で、より具体的には、ＣＤ１３７のアミノ酸残基Ａｓｎ４２が結合にとって重要な残基ではないという条件で、配列番号：３２のアミノ酸残基２４～８６内で、特にシステインリッチドメイン内の、ＣＤ１３７の細胞外ドメインの遠位部分に位置するエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する単離された抗体を提供する。

【0121】

特定の実施形態では、上記抗体は、残基Ａｒｇ ４１、Ｇｌｎ４３、Ｃｙｓ４５、Ｐｒｏ４９、Ｓｅｒ５２、およびＳｅｒ８０を含む、実施例１３に従って決定される一組の重要残基を特徴とするエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する。

【0122】

本発明の文脈において、用語「重要残基」は、抗体ベースの分子が結合しているエピトープの一部であり、抗体ベースの分子とそのエピトープ間の相互作用にとって重要である抗原の残基に関する。特に、重要残基は、次の基準の一つまたは複数を満たすことを特徴とする：（ｉ）抗体ベースの分子がエピトープに結合すると、５０％以上埋没すること、（ｉｉ）特定の側鎖水素結合相互作用を有すること、（ｉｉｉ）水素結合ネットワークに関与していること、および／または（ｉｖ）抗体ベースの分子の重要な結合残基との重要な相互作用を示すこと。特定の実施形態では、これらの基準は、実施例１３に開示された方法に従って決定される。

【0123】

特定の実施形態では、上記抗体は、残基Ａｌａ３３、Ａｓｎ４０、およびＣｙｓ４８をさらに含む、実施例１３に従って決定される一組の重要残基を特徴とするエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する。

【0124】

特定の実施形態では、上記抗体は、残基Ｐｒｏ３２、Ｇｌｙ３４、Ｔｈｒ３５、Ｓｅｒ４６、Ｐｒｏ４７、Ｐｒｏ５０、Ｃｙｓ７８、およびＳｅｒ７９をさらに含む、実施例１３に従って決定される一組の重要残基を特徴とするエピトープでヒトＣＤ１３７細胞外ドメインに結合する。

【0125】

一部の実施形態では、単離抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに／またはそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含み、好ましくはここで該抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む。好適には、抗体は、上記の一つまたは複数の生物学的特性を有する。

【0126】

したがって、追加の抗体は、ＣＤ１３７結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合する（たとえば、統計的に有意な方法での結合を競合的に阻害する）それらの能力に基づいて同定することができる。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＤ１３７上の同じエピトープへの結合について、本開示の例示的な抗体のいずれか、特に表１に列挙される例示的な抗体のいずれかと競合または交差競合する単離抗体を提供する。

【0127】

用語「競合する」または「交差競合する」および関連用語は、本明細書では互換的に使用され、標準的な競合結合アッセイにおいてＣＤ１３７への他の抗体または結合剤の結合に干渉する抗体または他の結合剤の能力を意味する。

【0128】

抗体または他の結合剤がＣＤ１３７への別の抗体または結合分子の結合に干渉することができる能力または程度、およびしたがってそれが本発明に従って交差競合すると言えるかどうかは、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができる。一つの特に好適な定量的交差競合アッセイは、ＦＡＣＳまたはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎベースのアプローチを使用して、標的へのそれらの結合に関して、標識された（たとえば、Ｈｉｓタグ付加、ビオチン化、または放射性標識された）抗体またはその断片と他の抗体またはその断片との間の競合を測定する。一般に、交差競合抗体またはその断片は、たとえば、交差競合アッセイにおいて標的に結合するものであり、その結果、アッセイ中、および二次抗体またはその断片の存在下で、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの記録された置換（ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、所与の量で存在する、試験される有望な（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ）クロスブロッキング抗体またはその断片による最大理論的置換［ｍａｘｉｍｕｍ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ］（たとえば、クロスブロックする必要があるコールドの（たとえば、非標識）抗体またはその断片による置換）の最大１００％（たとえば、ＦＡＣＳベースの競合アッセイにおいて）である。好ましくは、交差競合する抗体またはその断片は、１０％から１００％の間であり、より好ましくは５０％から１００％の間である記録された置換（ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を有する。

【0129】

好適には、本発明の単離抗体は、以下からなる群から選択される： モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、およびアンキリンベースのドメイン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、フィブロネクチン、および抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（たとえば、Ｆ－ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））を含むが、これらに限定されない代替スキャフォールドベースの結合ドメイン。

【0130】

好適には、本発明の単離抗体はＦｖ断片である。好適には、本発明の単離抗体はｓｃＦｖ断片である。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」または「ｓＦｖ」抗体は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む（たとえば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４）， ｐｐ． ２６９－３１５を参照のこと）。特定の実施形態では、上記機能的断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含むｓｃＦｖフォーマットであり、ここで、上記リンカーは、４つのグリシンアミノ酸残基および１つのセリンアミノ酸残基の一つまたは複数のユニット（ＧＧＧＧＳ）_ｎを含み、ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、８または８、好ましくはｎ＝４である。特定の実施形態では、上記機能的断片は、配列番号：２８によるリンカーを含むｓｃＦｖフォーマットである。一つの実施形態では、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する本発明の単離抗体は、配列番号：２９、配列番号：３０、および配列番号：３１からなる群から選択される、好ましくは配列番号：２９であるアミノ酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の単離抗体は、配列番号：２９、配列番号：３０、または配列番号：３１で示される、好ましくは配列番号：２９である一本鎖抗体［ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ］（ｓｃＦｖ）である。一つの実施形態では、本発明の単離抗体は、配列番号：３０で示される一本鎖抗体［ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ］（ｓｃＦｖ）である。一つの実施形態では、本発明の単離抗体は、配列番号：３１で示される一本鎖抗体［ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ］（ｓｃＦｖ）である。好ましい実施形態では、本発明の単離抗体は、配列番号：３５で示される一本鎖抗体［ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ］（ｓｃＦｖ）である。

【0131】

好適には、本発明の単離抗体は、ＩｇＧ抗体アイソタイプである。用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体クラス（たとえば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例としてＩｇＧ１またはＩｇＧ４）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスの一つの改変版も含み、ここでＦｃ機能を変更するため、たとえばエフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するための改変がなされてきた。一つの実施形態では、本発明の単離抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択され、好ましくはＩｇＧ４であるＩｇＧである。好適には、本発明の単離抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ配列、および配列番号：２５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含むＩｇＧ４である。より具体的な実施形態では、本発明の単離抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖配列、および配列番号：２６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含むＩｇＧ４である。好適には、本発明の単離抗体は、それぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ配列、および配列番号：２７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含むＩｇＧ４である。

【0132】

別の特定の実施形態では、本発明の単離抗体は、多重特異性分子、具体的には、少なくとも一つの第二の機能性分子、たとえば、二重特異性分子、三重特異性分子、四重特異性、五重特異性、または六重特異性分子を有する多重特異性分子である。

【0133】

本明細書で使用する用語「多重特異性分子」または「多重特異性抗体」は、少なくとも２つ以上の異なる標的（たとえば、ＣＤ１３７およびＣＤ１３７とは異なる別の標的）上の２つ以上の異なるエピトープに結合するか、または同じ標的の２つ以上の異なるエピトープに結合する抗体を指す。用語「多重特異性分子」は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性、および六重特異性抗体を含む。本明細書で使用する用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる標的上、または同一の標的上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。本明細書で使用する用語「三重特異性抗体」は、３つの異なる標的上、または同一の標的上の３つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。

【0134】

本発明の抗体、またはその抗原結合領域は、誘導体化されるか、または別の機能性分子、たとえば、別のペプチドまたはタンパク質（たとえば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に連結されて、少なくとも二つの結合部位および／または異なる標的分子に結合する多重特異性分子を生成することができる。本発明の抗体は、実際には、誘導体化されるか、または２つ以上の他の機能性分子に連結されて、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成することができる。本発明の多重特異性分子を作成するために、本発明の抗体は、一つまたは複数の他の結合分子、たとえば別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣物に対して（たとえば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合等によって）機能的に連結されてもよく、その結果、多重特異性分子が生じる。

【0135】

したがって、本発明は、少なくとも一つのＣＤ１３７に対する第一の結合特異性、および第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む多重特異性分子を含む。たとえば、第二の標的エピトープは、ＣＤ１３７と異なる別の標的分子上に存在する。

【0136】

二価のＣＤ１３７抗体は、外因性のクラスター化がない場合にシグナル伝達を誘導する能力が一般的に弱いことが示された。例示するために、抗ＣＤ１３７抗体ウトミルマブは、抗ヒトＦ（ａｂ’）２二次抗体に架橋されているか、または組織培養プラスチックに固定化されている場合にのみ、ＣＤ１３７シグナル伝達を活性化することができる（Ｆｉｓｈｅｒ ａｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６１：１７２１－１７３３（２０１２））。ＴＮＦＲＳＦの別のメンバーであるＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）に対するげっ歯類のアゴニスト抗体の研究は、外因性のクラスター化がＦｃγ受容体との相互作用によって部分的に達成できることを示唆している（Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４５）：１０３０－１０ （２０１１）； Ｗｈｉｔｅ ＡＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８７（４）：１７５４－１７６３ （２０１１））。しかし、Ｆｃγ受容体との相互作用は、エフェクター機構を介してＣＤ１３７発現細胞を枯渇させる可能性がある。したがって、ＣＤ１３７を標的とする現在の二価抗体は、効果のないアゴニストであるか、ＣＤ１３７陽性細胞の枯渇につながる。好適には、多重特異性分子の第二の結合特異性は、本発明のＣＤ１３７結合抗体の追加の架橋を提供することができる。したがって、本発明は、少なくとも一つのＣＤ１３７に対する第一の結合特異性、および第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む多重特異性分子を含む。たとえば、第二の標的エピトープは、第一の標的エピトープと異なるＣＤ１３７の別のエピトープである。多重特異性分子は、第一および第二の標的エピトープに加え、第三の結合特異性をさらに含んでもよい。

【0137】

さらなる実施形態では、本発明は、ＣＤ１３７特異性に対し、一価、二価、または多価、好ましくは一価である多重特異性分子を含む。

【0138】

本発明の別の特定の実施形態では、本発明の単離抗体は、ＣＤ１３７特異性に対して一価、または多価、たとえば二価、三価、四価、五価、または六価である分子である。

【0139】

本明細書で使用する用語「一価分子」または「一価抗体」は、標的分子、たとえばＣＤ１３７の単一のエピトープに結合する抗体を指す。

【0140】

用語「多価分子」または「多価抗体」は、複数の原子価を有する単一の結合分子を指し、ここで「原子価」は、同一の標的分子上のエピトープに結合する抗原結合部分の数として説明される。したがって、単一の結合分子は、複数の標的分子、またはエピトープの複数のコピーを含む標的分子上の複数の結合部位に結合することができる。多価抗体の例は、二価抗体、三価抗体、四価抗体、五価抗体等を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語「二価抗体」は、それぞれが同一のエピトープに結合する２つの抗原結合部分を有する抗体を指す。

【0141】

好適には、本発明の単離抗体は、多重特異性分子、たとえば二重特異性分子、および／または多価分子、たとえばＣＤ１３７特異性分子に対して一価、ＣＤ１３７特異性分子に対して二価であり、これは非限定的な例として、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ； ｔａｎｄｅｍ ｄｉ－ｓｃＦｖ）、ｔａｎｄｅｍ ｔｒｉ－ｓｃＦｖ、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ；Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｙ；Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）１）、Ｆａｂ、Ｆａｂ－Ｆｖ２、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ_３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｌ）、またはＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｈ））、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体（ｄｉ－ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ融合物、ｓｃＦｖ－ＨＳＡ－ｓｃＦｖ融合物、ジダイアボディ（ｄｉ－ｄｉａｂｏｄｙ）、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＶＤ、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合物、たとえばｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖および軽鎖の両方のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに基づく二重特異性抗体、たとえばノブ・イントゥ・ホール（Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ）抗体（ＫｉＨｓ）；ヘテロ二量体Ｆｃドメインまたは他のヘテロ二量体化ドメインのいずれかの鎖のＮ末端および／またはＣ末端に融合したＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＤｂ、タンデムジｓｃＦｖ（ｔａｎｄｅｍ－ｄｉ－ｓｃＦｖ）、タンデムトリｓｃＦｖ（ｔａｎｄｅｍ ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）１、Ｆａｂ、Ｆａｂ－Ｆｖ２、ＣＯＶＤ、ＭＡＴＣＨ（国際公開第２０１６／０２０２４５７号；Ｅｇａｎ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ｍＡｂｓ ９ （２０１７） ６８－８４に記載されている）、およびＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙ技術によって調製された二重特異性ＩｇＧ）（ＭＡｂｓ． ２０１７ Ｆｅｂ／Ｍａｒ；９（２）：１８２－２１２． ｄｏｉ： １０．１０８０／１９４２０８６２.２０１６．１２６８３０７）に基づくフォーマットを含む、当技術分野で知られている任意の好適な多重特異性、たとえば二重特異性フォーマットから選択される。

【0142】

用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）内のＶＬ結合したＶＨを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアリングを強制され、２つの抗原結合部位を作成する。特定の実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、上記リンカーは、４つのグリシンアミノ酸残基および１つのセリンアミノ酸残基のユニット（ＧＧＧＧＳ）_ｎを含み、ここで、ｎ＝１、または２、好ましくは１である。ダイアボディは二価または二重特異性であってもよい。ダイアボディは、たとえば、欧州特許第４０４０９７号、国際公開第９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４ （２００３）、およびＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４－６４４８（１９９３）でより完全に説明されている。

【0143】

二重特異性ｓｃＤｂ、特に二重特異性モノマーｓｃＤｂは、リンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３によってＶＨＡ－Ｌ１－ＶＬＢ－Ｌ２－ＶＨＢ－Ｌ３－ＶＬＡ、ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＬＢ－Ｌ３－ＶＬＡ、ＶＬＡ－Ｌ１－ＶＬＢ－Ｌ２－ＶＨＢ－Ｌ３－ＶＨＡ、ＶＬＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＬＢ－Ｌ３－ＶＨＡ、ＶＨＢ－Ｌ１－ＶＬＡ－Ｌ２－ＶＨＡ－Ｌ３－ＶＬＢ、ＶＨＢ－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＬＢ、ＶＬＢ－Ｌ１－ＶＬＡ－Ｌ２－ＶＨＡ－Ｌ３－ＶＨＢ、またはＶＬＢ－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＨＢの順序で結合された２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）またはその断片および２つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）またはその断片を特に含み、ここでＶＬＡドメインとＶＨＡドメインは共同で第一の抗原の抗原結合部位を形成し、ＶＬＢとＶＨＢは共同で第二の抗原の抗原結合部位を形成する。

【0144】

リンカーＬ１は、具体的には２～１０アミノ酸、より具体的には３～７アミノ酸、最も具体的には５アミノ酸のペプチドであり、リンカーＬ３は、具体的には１～１０アミノ酸、より具体的には２～７アミノ酸、最も具体的には５アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、リンカーＬ１および／またはＬ３は、４つのグリシンアミノ酸残基および１つのセリンアミノ酸残基のユニット（ＧＧＧＧＳ）_ｎを含み、ここで、ｎ＝１、または２、好ましくは１である。

【0145】

中間リンカーＬ２は、具体的には１０～４０アミノ酸、より具体的には１５～３０アミノ酸、そして最も具体的には２０～２５アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、上記リンカーＬ２は、一つまたは複数の４つのグリシンアミノ酸残基および１つのセリンアミノ酸残基のユニット（ＧＧＧＧＳ）_ｎを含み、ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、または８、好ましくはｎ＝４である。

【0146】

本発明の一つの実施形態では、単離抗体は、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖフォーマットの多重特異性および／または多価の抗体である。用語「ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ」は抗体フォーマットを指し、ここで一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片はフレキシブルなＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーによって一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）に融合されている。一つの実施形態では、上記フレキシブルなＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、２～４０アミノ酸、たとえば２～３５、２～３０、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０アミノ酸、具体的には１０アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、上記リンカーは、一つまたは複数の４つのグリシンアミノ酸残基および１つのセリンアミノ酸残基のユニット（ＧＧＧＧＳ）_ｎを含み、ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、または８、好ましくはｎ＝２である。

【0147】

本発明の一つの実施形態では、国際公開第２０１６／０２０２４５７号； Ｅｇａｎ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ｍＡｂｓ ９ （２０１７） ６８－８４に記載されているＭＡＴＣＨフォーマットの単離抗体は多重特異性および／または多価である。

【0148】

本発明の多重特異性および／または多価分子は、当技術分野で知られている任意の簡便な抗体製造法を使用して産生することができる（たとえば、二重特異性構築物の生成に関してＦｉｓｃｈｅｒ， Ｎ． ＆ Ｌｅｇｅｒ， Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４ （２００７） ３－１４；二重特異性ダイアボディおよびタンデムｓｃＦｖに関してＨｏｒｎｉｇ， Ｎ． ＆ Ｆａｒｂｅｒ－Ｓｃｈｗａｒｚ， Ａ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９０７ （２０１２）７１３－７２７、 および国際公開第９９／５７１５０号を参照のこと）。本発明の二重特異性構築物の調製の好適な方法の具体例は、とりわけ、Ｇｅｎｍａｂ（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１０ （２０１３） ５１４５－５１５０を参照のこと）およびＭｅｒｕｓ（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０６ （２０１０） ７４１－７５０を参照のこと）技術をさらに含む。機能性抗体Ｆｃ部分を含む二重特異性抗体の産生方法も当技術分野で知られている（たとえば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ８６ （１９９４） １２７－１３４）；およびＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １２１ （１９８６） ２１０－２２８を参照のこと）。

【0149】

本発明の多重特異性および多価分子で使用することができる他の抗体は、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体である。

【0150】

本発明の多重特異性分子は、当技術分野で知られている方法を使用して、構成要素の結合特異性を結合することによって調製することができる。たとえば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され、次に互いに結合されてもよい。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合にはさまざまなカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－５－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）（たとえば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６０： １６８６； Ｌｉｕ， Ｍ Ａ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：８６４８を参照のこと）を含む。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ， １９８５ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ． Ｍｉｔｔ． Ｎｏ． ７８， １１８－１３２； Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３）、およびＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９： ２３６７－２３７５に記載されている方法を含む。結合剤（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は、ＳＡＴＡおよびｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， １１１）から入手できる。

【0151】

結合特異性が抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合することができる。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、結合の前に、奇数のスルフヒドリル残基、たとえば１つを含むように改変される。

【0152】

あるいは、２つ以上の結合特異性を同じベクターにコードし、同じ宿主細胞で発現および構築することができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ Ｘ ｍＡｂ、ｍＡｂ Ｘ Ｆａｂ、Ｆａｂ Ｘ Ｆ （ａｂ’）２、またはリガンド Ｘ Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の多重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子、または２つの結合決定基を含む一本鎖多重特異性分子であってもよい。多重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含んでもよい。多重特異性分子を調製するための方法は、たとえば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。

【0153】

二重特異性分子のそれらの特異的標的への結合は、たとえば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（たとえば、増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般に、目的の複合体に特異的な標識試薬（たとえば、抗体）を使用することによって、特に目的のタンパク質―抗体複合体の存在を検出する。

【0154】

さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。本発明はまた、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合する抗体のＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。そのような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のために最適化することができる。

【0155】

用語「核酸」は、本明細書で用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、一本鎖型または二本鎖型のいずれかの、一つまたは複数のデオキシリボ核酸またはリボ核酸およびそのポリマーを指す。上記用語は、既知のヌクレオチドアナログまたは修飾された骨格残基または結合を含む核酸を包含し、これらは、合成、天然、および非天然に存在し、参照核酸と同様の結合特性を有し、および参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。そのようなアナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）を含むが、これらに限定されない。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（たとえば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、以下に詳述するように、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１， １９９１； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８， １９８５；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８， １９９４）。

【0156】

本発明は、上記のＣＤ１３７結合抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。適切な発現ベクターから発現される場合、これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドは、ＣＤ１３７抗原結合能力を示すことができる。

【0157】

表１に記載のＣＤ１３７結合抗体の重鎖または軽鎖由来の少なくとも１つのＣＤＲ領域および通常は３つすべてのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも本発明で提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、表１に記載されているＣＤ１３７結合抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列のすべてまたは実質的にすべてをコードする。コードの縮重のため、さまざまな核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。

【0158】

ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、またはＣＤ１３７結合抗体をコードする既存配列（たとえば、以下の実施例に記載されるような配列）のＰＣＲ突然変異誘発によって生成することができる。核酸の直接化学合成は、当技術分野で知られている方法、たとえばＮａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８： １０９， １９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ．， ２２： １８５９， １９８１のジエチルホスホロアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法［ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｍｅｔｈｏｄ］によって達成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、たとえば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｈ． Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ （Ｅｄ．）， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｎ．Ｙ．， １９９２； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ， １９９０； Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：９６７， １９９１； およびＥｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７， １９９１に記載されているように行うことができる。

【0159】

上記のＣＤ１３７結合抗体を産生するための発現ベクターおよび宿主細胞も本発明で提供される。

【0160】

用語「ベクター」は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すことを意図している。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞で自律複製することができる（たとえば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。

【0161】

さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形をしている。本明細書では、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」を互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（たとえば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等のそのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。

【0162】

用語「作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、２つ以上のポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは転写調節配列と転写された配列との機能的関係を指す。たとえば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写された配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写された配列に物理的に隣接している、すなわち、それらはシス作動性である。しかし、エンハンサー等の一部の転写調節配列は、転写を増強するコード配列に物理的に隣接している必要はなく、近接して配置されている必要もない。

【0163】

ＣＤ１３７結合抗体鎖または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させるために、様々な発現ベクターを使用することができる。ウイルスベースの発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞で抗体を産生することができる。非ウイルスベクターおよび系は、通常はタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを備えたプラスミド、エピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（たとえば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＮＡＴ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５， １９９７を参照のこと）。たとえば、哺乳動物（たとえばヒト）細胞中におけるＣＤ１３７結合ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＭＰＳ Ｖベクター、および他のタンパク質を発現するための当技術分野で知られている多くの他のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０ベースのベクター、乳頭腫ウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）ベースのベクターを含む。上記のＢｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，； Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４９：８０７，１９９５；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８： １４３， １９９２を参照されたい。

【0164】

発現ベクターの選択は、ベクターが発現される対象の宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、ＣＤ１３７結合抗体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーターおよび他の調節配列（たとえば、エンハンサー）を含む。一つの実施形態では、誘導性プロモーターは、誘導性条件下を除いて、挿入配列の発現を防止するために使用される。誘導性プロモーターは、たとえば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、その発現産物が宿主細胞によってよりよく許容されるコード配列について集団にバイアスをかけることなく、非誘導条件下で拡大することができる。プロモーターに加えて、ＣＤ１３７結合抗体の効率的な発現のために他の調節エレメントも必要または望ましい場合がある。これらのエレメントは、通常、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現の効率は、使用中の細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強することができる（たとえば、Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５，１９９４；およびＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５３：５１６， １９８７を参照のこと）。たとえば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。

【0165】

発現ベクターはまた、挿入されたＣＤ１３７結合抗体配列によってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を提供してもよい。多くの場合、挿入されたＣＤ１３７結合抗体配列は、ベクターに含まれる前にシグナル配列に連結される。ＣＤ１３７結合抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、定常領域またはその一部もコードする場合がある。そのようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それにより、インタクトな抗体およびその抗原結合断片の産生をもたらす。通常、このような定常領域はヒトである。

【0166】

用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すことを意図していることを理解されたい。突然変異または環境の影響のいずれかにより、ある程度の改変が次の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。

【0167】

ＣＤ１３７結合抗体鎖を保持および発現するための宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかであってもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび発現するのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主は、桿菌（ｂａｃｉｌｌｉ）、たとえばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および他の腸内細菌科、たとえばサルモネラ、セラチア、および様々なシュードモナス種を含む。これらの原核生物宿主では、通常、宿主細胞と互換性のある発現制御配列（たとえば、複製起点）を含む発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージ由来のプロモーター系等、様々な周知のプロモーターがいくつも存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択でオペレーター配列を用いて発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためのリボソーム結合部位配列等を有する。他の微生物、たとえば酵母もまた、本発明のＣＤ１３７結合ポリペプチドを発現するために使用することができる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。

【0168】

一つの実施形態では、哺乳動物宿主細胞を使用して、本発明のＣＤ１３７結合ポリペプチドを発現および産生する。たとえば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、または外因性発現ベクターを保持する哺乳動物細胞株のいずれかであってもよい。これらは、正常な死ぬ運命の（ｍｏｒｔａｌ）または正常または異常な不死の動物またはヒト細胞を含む。たとえば、インタクトな免疫グロブリンを分泌することができる多くの好適な宿主細胞株が開発されており、これには、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが含まれる。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養の使用は、一般にたとえばＷｉｎｎａｃｋｅｒ， ＦＲＯＭ ＧＥＮＥＳ ＴＯ ＣＬＯＮＥＳ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｎ．Ｙ．， １９８７で議論されている。哺乳動物宿主細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサー等の発現制御配列（たとえば、Ｑｕｅｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ８９：４９－６８， １９８６を参照のこと）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列等の必要なプロセシング情報部位を含んでもよい。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含む。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、時期特異的（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、および／または調節可能（ｍｏｄｕｌａｔａｂｌｅ）または調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）であってもよい。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳ Ｖプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（たとえば、ヒト前初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で知られているプロモーター－エンハンサーの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0169】

目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主のタイプに応じて異なる。たとえば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に一般に利用されるが、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用することができる（一般にＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２０１２を参照のこと）。他の方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソームを介した形質転換、注入およびマイクロインジェクション、バリスティック法（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン－核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ， Ｃｅｌｌ ８８：２２３， １９９７）、ＤＮＡの薬剤増強取り込み（ａｇｅｎｔ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ＤＮＡ）、およびｅｘ ｖｉｖｏ形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収量の生産には、安定した発現がしばしば望まれる。たとえば、ＣＤ１３７結合抗体鎖または結合断片を安定して発現する細胞株は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入後、細胞を選択培地に切り替える前に、強化培地（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｄｉａ）で１～２日間増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、選択培地で導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖が可能になる。耐性があり、安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適した組織培養技術を使用して増殖させることができる。したがって、本発明は、本発明の抗体を産生する方法を提供し、ここで、上記方法は、本発明の抗体をコードする核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養し、それによって上記本発明の抗体またはその断片を発現させる工程を含む。

【0170】

さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。薬学的に許容される担体は、組成物を増強または安定化するか、または組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。

【0171】

本発明の医薬組成物は、当技術分野で知られている様々な方法によって投与することができる。投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて異なる。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下で行うか、または標的部位の近位に投与することができる。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射または注入による）に好適であるべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、および多重特異性分子を材料でコーティングして、化合物を不活性化する可能性のある酸および他の自然条件の作用から化合物を保護することができる。

【0172】

本発明の医薬粗組成物は、当技術分野で周知であり、日常的に実施されている方法に従って調製することができる。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ２０ｔｈ ｅｄ．， ２０００；およびＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒy Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照されたい。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、治療上有効量または有効用量のＣＤ１３７結合抗体が、本発明の医薬組成物において使用される。ＣＤ１３７結合抗体は、当業者に知られている従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。投与レジメンは、最適な所望の応答（たとえば、治療応答）を提供するように調整される。たとえば、単一のボーラスを投与することができ、いくつかの分割された用量を経時的に投与することができ、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例して減少または増加させることができる。投与の容易さおよび用量の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象の単一用量として適した物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。

【0173】

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対して有毒になることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得るように変更することができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および治療される患者の以前の病歴等の要因に依存する。

【0174】

抗体は通常、複数回投与される。単回投与の間隔は、毎週、毎月、または毎年であってもよい。患者のＣＤ１３７結合抗体の血中濃度を測定することで示されるように、間隔も不規則になる可能性であってもよい。あるいは、抗体は徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者の抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかによって異なってもよい。予防的用途では、比較的低用量が長期間にわたって比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、一生治療を受け続ける。治療的用途では、疾患の進行が減少または終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔での比較的高投与量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防レジメン（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｒｅｇｉｍｅ）を施すことができる。

【0175】

一つの態様では、本発明は、本明細書で定義される本発明の抗ＣＤ１３７抗体、および一つまたは複数の追加の治療薬、たとえば一つまたは複数の抗がん剤、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤、ホルモン治療、ワクチン、および／または他の免疫療法を含む医薬の組み合わせを提供する。好適には、本発明の抗ＣＤ１３７抗体は、ＰＤ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＥＡＣＡＭ（たとえば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲ ｂｅｔａ、およびＩＤＯ（インドールアミン－２，３ジオキシゲナーゼ）から選択される抑制性（または免疫チェックポイント）分子の阻害剤と組み合わせて使用してもよい。抑制性分子の阻害は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルで行われてもよい。

【0176】

驚くべきことに、本発明の抗ＣＤ１３７抗体は、ＰＤＬ１阻害剤と組み合わせて使用する場合、強力で有益な相乗的相互作用、および改善された抗増殖活性を有することが見出された。したがって、本発明は、本明細書で定義される本発明の抗ＣＤ１３７抗体と、特に増殖性疾患の治療または予防に使用するためのＰＤＬ１阻害剤とを含む医薬の組み合わせを提供する。本発明はさらに、本明細書で定義される本発明の抗ＣＤ１３７抗体と、特に増殖性疾患の治療または予防における同時、別個、または連続使用のためのＰＤＬ１阻害剤とを含む医薬の組み合わせに関する。

【0177】

用語「組み合わせ」または「医薬品の組み合わせ」は、本明細書では、一つの剤形の固定された組み合わせ、非固定の組み合わせ、または併用投与用パーツキットを指すよう定義されており、治療薬、たとえば本発明の抗ＣＤ１３７抗体およびＰＣＬ１阻害剤は、組み合わせパートナーが協調的、例えば相乗効果を示すことを可能にする時間間隔内で、一緒に、独立して同時に、または別個に投与することができる。

【0178】

用語「固定された組み合わせ（ｆｉｘｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、治療薬、たとえば、本発明の抗ＣＤ１３７抗体およびＰＤＬ１阻害剤を、単一の成分（ｅｎｔｉｔｙ）または剤形で同時に患者に投与することを意味する。

【0179】

用語「非固定の組み合わせ（ｎｏｎ－ｆｉｘｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」治療薬、たとえば、本発明の抗ＣＤ１３７抗体およびＰＤＬ１阻害剤の両方を、特定の時間制限なしに、別個の成分（ｅｎｔｉｔｙ）または剤形で同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、または連続して患者に投与することを意味し、ここでそのような投与は、対象、たとえばそれを必要とする哺乳動物またはヒトの体内に２つの治療薬の治療上有効なレベルを提供する。

【0180】

用語「ＰＤＬ１」は、特にＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９ＮＺＱ７のヒトＰＤＬ１を指す。

【0181】

用語「遮断薬」または「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、それが結合する標的分子の生物活性を阻害または低減する薬剤を指す。一部の実施形態では、阻害剤は、標的分子の生物活性を実質的または完全に阻害する。好適なＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１の結合パートナーに対する結合能力を標的とし、減少させ、および／または阻害し、それによってＰＤＬ１の機能に干渉する。特に、好適なＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１とＰＤ－１の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、好適なＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１とＰＤ－１およびＢ７－１との相互作用を遮断する。好適には、本発明の医薬の組み合わせで利用されるＰＤＬ１阻害剤は、抗ＰＤＬ１抗体である。

【0182】

本明細書で使用する用語「相乗効果」は、たとえば、（ａ）本発明の抗ＣＤ１３７抗体、および（ｂ）ＰＤＬ１阻害剤等の２つの治療薬の作用を指し、たとえば、増殖性疾患、特にがん、またはその症状の症候性進行を遅らせる効果を生み出し、これはそれら自体によって投与される各治療薬の効果の単純な加算よりも大きい。相乗効果は、好適な方法、たとえばＳｉｇｍｏｉｄ－Ｅｍａｘ式（Ｈｏｌｆｏｒｄ， Ｎ．Ｈ．Ｇ． ａｎｄ Ｓｃｈｅｉｎｅｒ， Ｌ．Ｂ．， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ６： ４２９－４５３ （１９８１））、Ｌｏｅｗｅ ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ式（Ｌｏｅｗｅ， Ｓ． ａｎｄ Ｍｕｉｓｃｈｎｅｋ， Ｈ．， Ａｒｃｈ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １１４：３１３－３２６（１９２６））、およびｍｅｄｉａｎ－ｅｆｆｅｃｔ式（Ｃｈｏｕ， Ｔ．Ｃ． ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ， Ｐ．， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ． ２２：２７－５５（１９８４））を使用して計算することができる。上記の各方程式を実験データに適用して、対応するグラフを生成し、薬剤の組み合わせの効果を評価するのに役立てることができる。上記の式に関連する対応するグラフは、それぞれ濃度効果曲線、アイソボログラム曲線、および組み合わせ指数曲線（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ｃｕｒｖｅ）である。相乗効果は、当業者によって知られている方法に従って組み合わせの相乗効果スコアを計算することによってさらに示すことができる。

【0183】

本明細書で使用する用語「併用投与」は、単一の患者への選択された治療薬の投与を包含するように定義され、治療薬が必ずしも同じ投与経路によってまたは同時に投与されるとは限らない治療レジメンを含むことを意図する。

【0184】

用語「組み合わせ製剤」は、上記で定義された治療薬（ａ）および（ｂ）を独立して、または区別された量の治療薬（ａ）および（ｂ）の異なる固定された組み合わせの同時または異なる時点での使用によって投与できるという意味で、特に、「部品のキット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）」を指すよう定義される。次に、部品のキットの部品は、部品キットの任意の部分について、たとえば、同時にまたは時系列的にずらして、すなわち、異なる時点で、等しいまたは異なる時間間隔で投与することができる。組み合わせ製剤中に投与される治療薬（ａ）対治療薬（ｂ）の総量の比率は、たとえば、治療される患者亜母集団のニーズ、または 一人の患者のニーズに対応するために変更できる。

【0185】

本明細書で使用する用語「連合治療活性のある（ｊｏｉｎｔｌｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）」または「連合治療効果（ｊｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）」は、治療薬が、治療する温血動物、特にヒトにおいて、依然として有益な相互作用（好ましくは相乗効果）（連合治療効果）を示すことを好むような時間間隔で別々に（時系列的にずらされた方法で、特に配列特異的な方法で）与えらることができることを意味する。これが事実であるかどうかは、とりわけ、血中レベルを追跡することによって決定することができ、両方の治療薬が少なくとも特定の時間間隔の間に治療されるヒトの血中に存在することを示す。

【0186】

本発明の医薬的組み合わせは、特に増殖性疾患の治療または予防に使用するための、本明細書で定義される本発明の抗ＣＤ１３７抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の医薬の組み合わせは、本発明の抗体を含み、ここで上記抗体はそれぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ配列、および配列番号：２５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含むＩｇＧ４である。別の実施形態では、本発明の医薬的組み合わせは、本発明の抗体を含み、ここで上記抗体はそれぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ配列、および配列番号：２６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含むＩｇＧ４である。別の実施形態では、本発明の医薬的組み合わせは、本発明の抗体を含み、ここで上記抗体はそれぞれ配列番号：１、２、および３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号：１６、１７、および１８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、配列番号：１５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ配列、および配列番号：２７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含むＩｇＧ４である。

【0187】

一つの態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の抗体、または本発明の組成物、または本発明の組み合わせに関する。

【0188】

別の態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんの治療における使用のための医薬の製造における使用のための、本発明の抗体、または本発明の組成物、または本発明の組み合わせに関する。

【0189】

一つの態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんの治療における使用のための、本発明の抗体、または本発明の組成物、または本発明の組み合わせに関する。

【0190】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における増殖性疾患、特にがんの治療のための、本発明の抗体、または本発明の組成物、または本発明の組み合わせの使用に関する。

【0191】

一つの態様では、本発明は、対象に治療上有効量の本発明の抗体、または本発明の組成物、または本発明の組み合わせを投与することを含む、それを必要とする対象における増殖性疾患、特にがんを治療する方法を提供する。

【0192】

用語「対象」はヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非哺乳動物、たとえば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。特に断りのない限り、用語「患者」または「対象」は、本明細書では互換的に使用される。

【0193】

本明細書で使用する用語「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療された（ｔｒｅａｔｅｄ）」等は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患および／または疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒、または疾患の進行を遅らせるという点で治療的でありうる。本明細書で使用さする「治療」は、哺乳動物、たとえば、ヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、以下を含む：（ａ）疾患を阻害する、すなわち、その発症を阻止する；（ｂ）病気を和らげる、すなわち病気の退行を引き起こす。

【0194】

用語「治療上有効量」または「有効量（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ａｍｏｕｎｔ）」は、疾患の治療のために哺乳動物または他の対象に投与された場合に、疾患のそのような治療を行うのに十分である薬剤の量を指す。「治療上有効量」は、薬剤、疾患とその重症度、および治療対象の年齢、体重等によって異なる。

【0195】

一つの実施形態では、増殖性疾患はがんである。用語「がん」は、異常な細胞の急速で制御されていない成長を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に広がる可能性がある。用語「腫瘍」および「がん」は、本明細書では互換的に使用され、たとえば、両方の用語は、固体および液体、たとえば、びまん性腫瘍または循環腫瘍を包含する。本明細書で使用する場合、用語「がん」または「腫瘍」は、前悪性、ならびに悪性のがんおよび腫瘍を含む。用語「がん」は、本明細書では、すべての固形および血液学的悪性腫瘍を含む広範囲の腫瘍を意味するために使用される。そのような腫瘍の例は、以下を含むが、これらに限定されない：良性または特に悪性の腫瘍、固形腫瘍、脳がん、腎臓がん、肝臓がん、副腎がん、膀胱がん、乳がん、胃がん（たとえば、胃腫瘍）、食道がん、卵巣がん、頸部がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん（たとえば、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がん）、膣がん、甲状腺がん、メラノーマ（たとえば、切除不能または転移性メラノーマ）、腎細胞がん、肉腫、神経膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸がん、特に結腸がんまたは結腸直腸腺腫、頭頚部腫瘍、子宮内膜がん、カウデン症候群、レルミット－デュクロ病、Ｂａｎｎａｙａｎ－Ｚｏｎａｎａ症候群、前立腺肥大、特に上皮性の新生物、好ましくは乳がんまたは扁平上皮がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（たとえば、フィラデルフィア染色体陽性の慢性骨髄性白血病）、急性リンパ芽球性白血病（たとえば、フィラデルフィア染色体陽性の急性リンパ芽球性白血病）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、白血病、およびそれらの任意の組み合わせ。好ましい実施形態では、がんは肺がん、好ましくは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、上記がんは結腸直腸がんである。

【0196】

本発明の抗体、または本発明の多重特異性分子、または本発明の組成物、または本発明の組み合わせは、固形腫瘍だけでなく、液体腫瘍の増殖も阻害する。さらなる実施形態では、増殖性腫瘍は固形腫瘍である。用語「固形腫瘍」は特に乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、胃がん［ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ］（特に胃がん［ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ］）、子宮頸がん、肺がん（たとえば、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がん）、および頭頚部腫瘍を意味する。さらに、腫瘍の種類および使用される特定の組み合わせに応じて、腫瘍体積の減少を得ることができる。本発明の抗体、または本発明の多重特異性分子、または本発明の組成物、または本発明の組み合わせはまた、がんに罹患している対象における腫瘍の転移拡散および微小転移巣の成長または発症を防止するのに好適である。

【0197】

用語「予防する」または「予防」は、疾患または疾患の任意の二次的影響の発症の完全な阻害を指す。本明細書で使用する用語「予防する」または「予防」は、疾患の素因がある可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない個人において疾患または状態が発生するのを予防することを包含する。

【0198】

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の抗体を含むキットに関する。また、本開示の中には、本発明の多重特異性分子を含むキットがある。また、本開示の中には、本発明の医薬組成物を含むキットがある。キットは、次のような一つまたは複数の他の要素を含んでもよい：使用説明書；他の試薬、たとえば標識、治療薬、または標識または治療薬または放射線防護組成物に対し抗体をキレートかまたは他の方法で結合させるのに有用な薬剤；投与のための抗体分子を調製するためのデバイスまたは他の材料；薬学的に許容される担体；および対象に投与するためのデバイスまたは他の材料。特定の実施形態では、キットは、薬学的に有効な量で本発明の抗体を含む。さらなる実施形態では、キットは、凍結乾燥形態の本発明の抗体の薬学的に有効な量、および希釈剤、ならびに任意選択で、使用説明書を含む。上記キットは、再構成用のフィルター針および注射用の針をさらに含んでもよい。

【0199】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0200】

【表2】

【0201】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【0202】

この出願の本文全体を通して、明細書の本文（たとえば、表１から３）と配列表の間に矛盾がある場合は、明細書の本文が優先するものとする。

【0203】

明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴もまた、単一の実施形態で組み合わせて提供できることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供することができる。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、あたかもすべての組み合わせが個別に明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のすべての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、あたかもそのような部分的組み合わせのそれぞれが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。

【0204】

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに追加して、本発明の様々な改変が、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。

【0205】

それぞれの特許法の下で可能な範囲で、本明細書に引用されているすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0206】

以下の実施例は、上記の発明を説明するが、しかしながら、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者にそのようなものとして知られている他の試験モデルもまた、特許請求される発明の有益な効果を決定することができる。

【実施例】

【0207】

ヒトＣＤ１３７に対する新規抗体
実施例１：ヒトＣＤ１３７に対するウサギ抗体の産生
ウサギを、組換えにより産生および精製されたヒトＣＤ１３７細胞外ドメイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， カタログ番号３１０－１５－１ＭＧ）で免疫化した。免疫化の間、抗原に対する体液性免疫応答の強さを、抗原へのポリクローナル血清抗体の検出可能な結合を依然として生成した各ウサギの血清の最大希釈（力価）を決定することによって定性的に評価した。固定化された抗原（組換えヒトＣＤ１３７ ＥＣＤ）に対する血清抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した。

【0208】

実施例２： ヒットの同定および選択
ヒット同定法の中で、フローサイトメトリーベースのソーティング法が開発された。これは、高親和性のヒトＣＤ１３７ ＥＣＤ結合Ｂ細胞を特異的に検出して分離することを可能にする。ＣＤ１３７結合Ｂ細胞を同定するために、ＣＤ１３７ ＥＣＤを蛍光色素Ｒ－フィコエリトリン（ＲＰＥ）で標識した。ＣＤ１３７Ｌ結合部位および標識ＣＤ１３７上の抗ＣＤ１３７抗体の結合部位は、かさばるＲＰＥ標識によって遮断される可能性があるため、エピトープの接触性はフローサイトメトリーによって確認した。ヒトＩｇＧ１、ウレルマブ、ウサギポリクローナル抗ヒトＣＤ１３７またはヤギポリクローナル抗ヒトＣＤ１３７のＦｃ部分に融合したＣＤ１３７Ｌ ＥＣＤをプロテインＧビーズに捕捉し、Ｒ－ＰＥ標識ＣＤ１３７の結合をフローサイトメトリーで確認した。蛍光強度は、ビーズに固定化されたＣＤ１３７Ｌに結合した標識ＣＤ１３７の量に比例する。ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌおよび抗ＣＤ１３７抗体への結合が見られたが、ＲＰＥ標識ＣＤ１３７のインフリキシマブへの結合は検出されなかった。

【0209】

スクリーニング：
ＣＤ１３７特異的抗体（ＩｇＧ）を発現するＢ細胞を、ソーティングキャンペーン（ｓｏｒｔｉｎｇ ｃａｍｐａｉｇｎ）で分離した。スクリーニング段階で得られた結果は、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の培養上清由来の未精製の抗体を使用して行ったアッセイに基づいている。各細胞培養上清中のウサギモノクローナル抗体は、組換えヒトＣＤ１３７ ＥＣＤに結合するためのハイスループットＥＬＩＳＡで特徴づけられた。ＣＤ１３７結合上清は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７に対する結合動態についてさらに特徴づけられた。さらに、ＣＤ１３７Ｌおよびウレルマブに対するＣＤ１３７相互作用の中和能を競合ＥＬＩＳＡによって決定した。安定した形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞で発現した膜性ＣＤ１３７への結合も評価した。上清のマウスＣＤ１３７結合能を直接ＥＬＩＳＡで分析した。

【0210】

直接ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、２５０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＤ１３７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３１０－１５－１ＭＧ）を含む５０μｌのＰＢＳを４℃で一晩添加することによりコーティングした。翌日、プレートをオーバーフローモードでウェルあたり３００μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、２７０μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ ２０）を各ウェルに振とうせずにＲＴで１時間添加した。次に、プレートをオーバーフローモードで３００μｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、各上清５０μｌを添加し、プレートを穏やかに撹拌しながら室温で１．５時間インキュベートした。３００μｌの洗浄バッファーでオーバーフローモードで３回洗浄した後、ブロッキングバッファーで１：５，０００に希釈した５０μｌのＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を各ウェルに添加した。章動ミキサー（ｎｕｔａｔｉｎｇ ｍｉｘｅｒ）でＲＴで１時間インキュベートした後、５０μｌのＴＭＢ（３，３’、５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加する前に、プレートをオーバーフローモードでウェルあたり３００μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。５～１０分の展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）後、ウェルあたり５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加して酵素反応を停止し、参照波長として６９０ｎｍを使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。

【0211】

ＳＰＲによるｈＣＤ１３７に対する親和性
ヒトＣＤ１３７に対する抗体の結合親和性を、ＭＡＳＳ－１ ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用したＳＰＲによって測定した。親和性スクリーニングでは、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ａ１２０－１１１Ａ）を、標準的なアミンカップリング法を使用してセンサーチップ（ＳＰＲ－２親和性センサー、高容量アミン、Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）に固定化した。Ｂ細胞上清中のウサギモノクローナル抗体は、固定化された抗ウサギＩｇＧ抗体によって捕捉された。十分な捕捉を可能にするには、Ｂ細胞上清中の最小ＩｇＧ濃度が必要である。モノクローナル抗体を捕捉した後、ヒトＣＤ１３７ ＥＣＤ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３１０－１５－１ＭＧ）を９０ｎＭの濃度で３分間フローセルに注入し、センサーチップに捕捉されたＩｇＧからタンパク質の解離を５分間進行させた。各注入サイクルの後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌを２回注入して表面を再生させた。見かけの解離（ｋ_ｄ）と会合（ｋ_ａ）の速度定数、および見かけの解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）は、ＭＡＳＳ－１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）で１対１のラングミュア結合モデルを使用して計算され、曲線近似の品質は、曲線近似の品質の尺度である相対Ｃｈｉ^２（分析物の外挿された最大結合レベルに正規化されたＣｈｉ^２）に基づいてモニターされた。Ｃｈｉ^２の値が小さくなるほど、１対１のラングミュア結合モデルへの適合がより正確になる。ほとんどのヒットで、相対的なＣｈｉ^２値は１５％未満であった。リガンド結合の応答単位（ＲＵ）が抗体捕捉のＲＵの少なくとも２％であった場合、結果は有効であるとみなした。抗体捕捉のＲＵが２％未満のリガンド結合のＲＵを有するサンプルは、捕捉された抗体に対するＣＤ１３７の特異結合を示さないとみなした。

【0212】

ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ 競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを５０ｎｇ／ｍｌのＣＤ１３７ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８３８－４Ｂ－１００）を含む５０μｌのＰＢＳを４℃で一晩添加することによって、コーティングした。翌日、プレートをオーバーフローモードでウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、３００μｌのブロッキングバッファー（１％のＢＳＡおよび０．２％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）を各ウェルに章動ミキサー（ｎｕｔａｔｉｎｇ ｍｉｘｅｒ）でＲＴで１時間添加した。次に、陽性対照（中和ヤギ抗ＣＤ１３７抗体）を１００％ネガティブ上清で希釈し、５０μｌの中和抗体を結合プレートの対応するウェルに添加した。さらに、ポジティブヒットの上清５０μｌを結合プレートに移動し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。次に、ＥＬＩＳＡプレートをオーバーフローモードでウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した５０μｌの２０ｎｇ／ｍｌビオチン化組換えヒトＣＤ１３７リガンド（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号４１Ｌ－Ｈ５２５７）をウェルに添加した。振とうしながら１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをオーバーフローモードでウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーで希釈した５０μｌの１０ｎｇ／ｍｌストレプトアビジン―ポリ－ＨＲＰをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢを添加した後、５～１０分間展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）した。最終的に、５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加して酵素反応を停止し、参照波長として６９０ｎｍを使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。

【0213】

ＳＰＲによる種の特異性：カニクイザルＣＤ１３７
カニクイザルＣＤ１３７に対する結合動態は、ヒトＣＤ１３７に対する結合について記載したのと同じＳＰＲセットアップを使用して、最初のスクリーニングＥＬＩＳＡで特定されたヒットについても決定したが、ヒトＣＤ１３７ ＥＣＤをカニクイザルＣＤ１３７ ＥＣＤに置換した（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号４１Ｂ－Ｃ５２Ｈ４）。

【0214】

ウレルマブ競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌのウレルマブ（Ｅｖｉｔｒｉａ、シュリーレン、スイスによって製造された）を含む５０μｌのＰＢＳを４℃で一晩添加することによって、コーティングした。翌日、プレートをオーバーフローモードでウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、３００μｌのブロッキングバッファー（１％のＢＳＡおよび０．２％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）を各ウェルに章動ミキサー（ｎｕｔａｔｉｎｇ ｍｉｘｅｒ）でＲＴで１時間添加した。次に、ウレルマブを９５％ネガティブ上清を添加して希釈し、７．５ｎｇ／ｍｌの５％ビオチン化ヒトＣＤ１３７ＥＣＤ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， カタログ番号３１０－１５－１ＭＧ）と１時間プレインキュベートし、結合プレートの対応するウェルに添加した。さらに、ポジティブヒットの上清５０μｌも添加し、７．５ｎｇ／ｍｌの５％ビオチン化ヒトＣＤ１３７ＥＣＤ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， カタログ番号３１０－１５－１ＭＧ）と１時間プレインキュベートし、結合プレートに移動し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。次に、ＥＬＩＳＡプレートをオーバーフローモードでウェルあたり４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、次に、ブロッキングバッファーで希釈した５０μｌの１０ｎｇ／ｍｌストレプトアビジン―ポリ－ＨＲＰをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢを添加した後、５～１０分間展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）した。最終的に、５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加して酵素反応を停止し、参照波長として６９０ｎｍを使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。

【0215】

ＦＣによる細胞ベースの結合アッセイ：ヒトＣＤ１３７
Ｊｕｒｋａｔ野生型（ＣＤ１３７を発現しない対照細胞）およびＪｕｒｋａｔ ＣＤ１３７細胞（クローンＣ６，１）を回収し、細胞数を決定した。細胞懸濁液を5分間４００×ｇで遠心分離し、ＰＢＳ－ＥＢ（１×ＤＰＢＳ、２％ ＢＣＳ Ｈ．Ｉ．、２ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈した細胞懸濁液４０μｌ（４０，０００細胞）を結合プレートの指定ウェルに添加した。ポジティブヒット由来の上清をプレートレイアウトに従って９６ウェルプレートに直接移動した。陽性対照サンプル（ウレルマブ）をＰＢＳ－ＥＢで希釈し、プレートに移動した。最終サンプルは９５％陰性上清であった。４℃で１時間インキュベートした後、１００μｌのＰＢＳ－ＥＢを使用してプレートを３回洗浄した。次に、細胞ペレットを２μｇ／ｍｌの濃度の５０μｌ二次抗体溶液で再懸濁し（Ｂ細胞クローン用：ＡＦ６４７で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ；ウレルマブ用：ＰＥで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ）、４℃で１時間インキュベートした。次に、１００μｌのＰＢＳ－ＥＢを使用して細胞を再度３回洗浄した。次に、細胞ペレットを５０μｌのＰＢＳ－ＥＢで再懸濁し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ２０６０フローサイトメーターデバイスで分析した。２０，０００イベントのＰＥおよびＡＦ６４７の蛍光強度を各サンプルについて記録し、蛍光強度ＭＦＩの幾何平均を計算した。データを最初に非特異的抗体結合（ブランクおよびＪｕｒｋａｔ野生型細胞結合）について補正し、次にウレルマブについて得られた結合レベルに正規化した。

【0216】

直接ＥＬＩＳＡ マウスＣＤ１３７
マウス交差反応性ＣＤ１３７結合剤を同定するための最初の工程として、マウスＣＤ１３７に対する直接ＥＬＩＳＡを実施した。この目的のために、Ｂ細胞クローンの細胞培養上清をマウスＣＤ１３７に対する抗体の存在についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを２５０ｎｇ／ｍｌのマウスＣＤ１３７（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号４１Ｂ－Ｍ５２Ｈ７）を含む５０μｌのＰＢＳを４℃で一晩添加することによって、コーティングした。翌日、プレートをオーバーフローモードでウェルあたり３００μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、２７０μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ ２０）を各ウェルに振とうせずにＲＴで１時間添加した。次に、プレートをオーバーフローモードで３００μｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、５０μｌの各上清を添加し、プレートをＲＴで穏やかな撹拌下で１．５時間インキュベートした。３００μｌの洗浄バッファーでオーバーフローモードで３回洗浄した後、ブロッキングバッファーで１：５，０００に希釈した５０μｌのＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を各ウェルに添加した。章動ミキサー（ｎｕｔａｔｉｎｇ ｍｉｘｅｒ）でＲＴで１時間インキュベートした後、５０μｌのＴＭＢを添加する前に、プレートをオーバーフローモードでウェルあたり３００μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。５～１０分の展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）後、ウェルあたり５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加して酵素反応を停止し、参照波長として６９０ｎｍを使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
このアッセイでは、８５個のＢ細胞クローンの上清がバックグラウンドを明らかに上回っている（＞ ０．１ ＯＤ）シグナルを生成した。

【0217】

ＳＰＲによる種の特異性：マウス
マウスＣＤ１３７に対する結合動態も、ヒトＣＤ１３７に対する結合について記載したのと同じＳＰＲセットアップを使用して決定したが、該ケースではヒトＣＤ１３７ ＥＣＤをマウスＣＤ１３７ ＥＣＤに置換した（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号４１Ｂ－Ｍ５２Ｈ７）。

【0218】

スクリーニングヒットの選択
Ｂ細胞上清中のモノクローナル抗体の薬理学的特性に基づいて、ヒット確認分析のためにクローン３８－２７－Ａ１１を選択した。Ｂ細胞上清中のクローン３８－２７－Ａ１１のモノクローナル抗体の薬理学的特性を表４に示す。次の工程では、選択したクローンをＲＮＡ単離およびＲＴ－ＰＣＲに使用して、ウサギ抗体軽および重鎖可変領域（３８－２７－Ａ１１）の配列を増幅した。

【0219】

【表4】

【0220】

【表5】

【0221】

【表6】

【0222】

実施例４： モノクローナル抗体３８－２７－Ａ１１の薬理学的解析
４．１ ヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７に対する親和性
精製されたモノクローナルウサギ抗体３８－２７－Ａ１１のヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７への結合動態は、ＳＰＲ測定によって測定した（表５および６）。ヒトＣＤ１３７に対する抗体の結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ＳＰＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した。実験のセットアップに関しては、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ａ１２０－１１１Ａ）を、標準的なアミンカップリング法を使用してセンサーチップ（ＣＭ５チップ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。ウサギモノクローナル抗体を固定化した抗ウサギＩｇＧ抗体で捕捉した。モノクローナル抗体の捕捉後、ヒトＣＤ１３７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３１０－１５）またはカニクイザルＣＤ１３７（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号４１Ｂ－Ｃ５２Ｈ４）をフローセルに９０～０．３５ｎＭの範囲の濃度で３分間注入し、センサーチップに捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を１２分間進行させた。見かけの解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数、および見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルを使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ソフトウェア評価ツール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で計算した。

【0223】

４．２ 組換えウサギＩｇＧ ３８－２７－Ａ１１のエピトープビニング
組換えウサギＩｇＧ ３８－２７－Ａ１１の結合エピトープを解析するために、ＭＡＳＳ－１機器（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用してＳＰＲによってエピトープビニングを実行した。このアプローチを使用することにより、ＣＤ１３７上のウサギＩｇＧ ３８－２７－Ａ１１の結合エピトープをウレルマブおよびウトミルマブに対してマッピングした。サンドイッチセットアップを利用して、抗体がヒトＣＤ１３７への相互の結合を遮断するかどうかを調べた。ウサギＩｇＧ ３８－２７－Ａ１１と競合ＩｇＧは、大容量アミンセンサーチップ（ＨＣＡ、Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）に固定化した。次に、９０ｎＭの抗原ＣＤ１３７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３１０－１５）を注入し、ウサギＩｇＧ ３８－２７－Ａ１１に捕捉した後、すぐに２２．５ｎＭの二次抗体（競合ＩｇＧ）を注入した。各ウサギＩｇＧでのヒトＣＤ１３７の捕捉レベルと第二の結合剤の応答レベルを決定した（応答単位、ＲＵ）。関与するタンパク質の分子量および捕捉レベルに依存する理論的最大応答（Ｒｍａｘ）を計算することにより、捕捉された抗原上のタンパク質の相対的結合レベル（％）を決定した。分子がＣＤ１３７上の同じエピトープまたは重複する（たとえば、構造的に類似または空間的に近位の）エピトープに結合する場合、捕捉されたＣＤ１３７上に注入された抗体の結合は観察されるべきではない。その結果、抗体の結合が観察されると、２つの抗体ペアが重複しないエピトープに結合する。相対的結合レベル（％）は、各抗体ペアについて決定された。定義により、１０％未満の結合レベルはＣＤ１３７で同じまたは重複している（たとえば、構造的に類似または空間的に近位の）エピトープを示し、３０％を超えると重複していないエピトープを示す。ＩｇＧ ３８－２７－Ａ１１はＣＤ１３７への結合についてウトミルマブと競合せず、重複しないエピトープを示唆したが、ＣＤ１３７への結合についてウレルマブと競合し、同じまたは重複するエピトープを示唆した（図１）

【0224】

４．３ ＮＦ－ｋＢレポーター遺伝子アッセイによるＣＤ１３７シグナル伝達の活性化
ＣＤ１３７クラスタリング、およびそれに続くＣＤ１３７シグナル伝達を活性化する力価は、ＮＦ－ｋＢレポーター遺伝子アッセイで評価した。このアッセイでは、ＮＦ－ｋＢ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達の活性化を評価した。ＣＤ１３７シグナル伝達の活性は、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株でＣＤ１３７が誘導するＮＦ－ｋＢ活性化によって駆動されるルシフェラーゼ発現の測定によってレポートされる。さらに、シグナル伝達経路の活性化に必要なＣＤ１３７のクラスター化は、二価の抗ＣＤ１３７ウサギＩｇＧの結合を介して促進される。

【0225】

詳細には、ＣＤ１３７を発現するＮＦ－ｋＢレポーター遺伝子Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）の５０，０００個の細胞を９６ウェル白色細胞培養プレートに播種した。９，０００～１．３７ｎｇ／ｍｌの範囲のウサギＩｇＧの３倍段階の段階希釈液をアッセイバッファーで調製した。各希釈液に、２．５倍を超える架橋抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号Ａ１２０－１１１Ａ）を添加した。ＣＤ１３７シグナル伝達を誘導するのに、さらなるクラスター化なしの抗体結合で十分かどうかを判断するために、各ウサギＩｇＧの最高濃度を架橋剤なしでも測定した。陽性対照としてのウレルマブを各プレートに含め、ウレルマブの架橋は、１．２５過剰の架橋剤（ウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号Ａ８０－３０４Ａ）を各希釈液に添加することによって行った。ウサギＩｇＧで行ったように、ウレルマブの最高濃度も、架橋剤を添加せずに測定した。組換えＩｇＧおよびウレルマブの調製した段階希釈液をレポーター遺伝子細胞に添加し、加湿細胞培養インキュベーター内で３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼの発現は、ルシフェラーゼ試薬の添加によって検出し、抗ＣＤ１３７ ＩｇＧの添加の６時間後に発光リーダーによって読み取った。データは、試験サンプルの相対発光単位（ＲＬＵ）を、架橋剤を使用して最高濃度のウレルマブについて測定されたＲＬＵに正規化することによって分析した。正規化されたデータは、ウサギＩｇＧ濃度の関数としてプロットし、ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ４ＰＬ ｆｉｔを使用してフィットさせた。ＮＦ－ｋＢシグナル伝達の最大活性化（ウレルマブと比較して）、ＥＣ_５０値、および相対ＥＣ_５０値（ウレルマブと比較して）をレポートした（表７）。

【0226】

【表7】

【0227】

実施例５： ウサギＩｇＧ ３８－２７－Ａ１１のヒト化
ヒットスクリーニング中に得られたデータに基づいて、ＣＤ１３７結合剤３８－２７－Ａ１１を、ＶＨ３ベースのフレームワークにＣＤＲを移植することによってヒト化した（表８）。フルグラフトは、ＡＨｏヒト化プロトコルに従ったＣＤＲの移植およびフレームワーク残基を示す（ＣＤＲ移植と抗原と接触する可能性のあるすべてのウサギ残基の移植（ＡＨｏによる）は、変異（ウサギフレームワーク残基）の総数を減少させるために、界面形成時に溶媒のアクセス可能性が２０％を超える変化を伴う残基に限定された）。

【0228】

【表8】

【0229】

コドン最適化ヌクレオチド配列を設計し、対応する遺伝子を合成そ、哺乳動物発現ベクターにクローン化した。表９は、ｓｃＦｖ分子の製造の概要である。哺乳類コンストラクトの発現は、ＣＨＯｇｒｏ一過性トランスフェクションキット（Ｍｉｒｕｓ）を使用してＣＨＯ－Ｓ細胞で行った。培養物は、３７℃での発現の５～７日（細胞生存率７０％未満）後に遠心分離によって回収され、タンパク質は、プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーによって清澄化された培養上清から精製され、必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製工程（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ ｓｔｅｐ）を続けた。製造された材料の品質管理には、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の標準的な分析方法を使用した。

【0230】

実施例６： ヒトｓｃＦｖの薬理学的特性化
６．１ ヒトＣＤ１３７に対する親和性
ヒト化ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）のヒトＣＤ１３７に対する親和性をＴ２００デバイス（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＳＰＲ分析により測定した。この実験では、Ｆｃタグ付きヒトＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８３８－４Ｂ－１００）をＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ（カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）を使用して捕捉した。各分析物注入サイクルの後、抗ヒトＦｃ特異的ＩｇＧが再生され、新しい抗原が捕捉された。ｓｃＦｖは、分析対象物の濃度が０．１９～４５ｎＭ（３倍希釈工程）の範囲で、ランニングバッファーで希釈された、捕捉されたＣＤ１３７に対する用量反応ｍｕｌｔｉ－ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃアッセイを使用して分析物として注入された。結合時間および解離時間は、それぞれ３００秒および７２０秒に設定した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用して適合された。データを表１０に示す。

【0231】

６．２ 種の交差反応性（ＳＰＲによるカニクイザルＣＤ１３７への結合）
カニクイザルＣＤ１３７への交差反応性は、ヒトＣＤ１３７への結合を測定するために使用したのと同様のアッセイで、カニクイザルＦｃタグ付きＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９３２４－４Ｂ－１００）を使用して測定した。表１１は、ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）で得られた親和性の概要である。

【0232】

６．３ 競合ＥＬＩＳＡによるＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌの中和
抗ヒトＣＦ１３７ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）がＣＤ１３７のＣＤ１３７に対する結合に干渉しなかったことを示すため、競合ＥＬＩＳＡを使用した。市販の抑制性ポリクローナル抗ＣＤ１３７ヤギ抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎｌｉｎｅ、カタログ番号ＡＢＩＮ６３６６０９）を参照として使用した。実験のセットアップに関しては、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＤ１３７（Ｆｃタグ付き、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８３８－４Ｂ－１００）をＥＬＩＳＡプレートに一晩コーティングし、５０μｇ／ｍｌから始まるｓｃＦｖの３倍段階の段階希釈をＥＬＩＳＡプレートに添加した。その後、ビオチン化ＣＤ１３７Ｌ（ＣＤ１３７Ｌのｉｎ－ｈｏｕｓｅビオチン化、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号４１Ｌ－Ｈ５２５７）を添加し、ストレプトアビジン－ＨＲＰの添加により結合リガンドを検出した。最後に、ＨＲＰ基質ＴＭＢを追加した。５分の展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）後、１Ｍ ＨＣｌで反応を停止した。吸光度は、４５０ｎｍおよび参照波長として６９０ｎｍで測定した。データを表１２に示す。

【0233】

【表9】

【0234】

【表10】

【0235】

【表11】

【0236】

６．４ フローサイトメトリーによるヒトＣＤ１３７発現細胞への結合
ヒトＣＤ１３７発現細胞への結合能は、ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）について測定した。５０，０００個のＣＤ１３７発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（またはＣＤ１３７の発現を欠く参照細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞として）を丸底の非組織培養処理した９６ウェルプレートに分配した。細胞を１００μｌのＰＢＳで４００×ｇで５分間遠心分離することによって２回洗浄した。細胞を試験したｓｃＦｖおよび参照ＩｇＧ ウレルマブの染色バッファー（ＰＢＳ、２％熱不活化ＢＣＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）で調製した、１０，０００～０．６４ｎｇ／ｍｌの範囲の５倍段階の段階希釈液１００μｌに再懸濁した（ｓｃＦｖの場合：３８１．１９～０．０２ｎＭ）。章動ミキサー（ｎｕｔａｔｉｎｇ ｍｉｘｅｒ）で４℃で１時間インキュベートした後、細胞を１００μｌの染色バッファーで３回洗浄し、４００×ｇで５分間の遠心分離工程を行った。次に、ｓｃＦｖで処理した細胞を０．５μｇ／ｍｌのＡＰＣ標識プロテインＬを含む１００μｌの染色バッファーに再懸濁し、ウレルマブ（ヒトＩｇＧ４）で処理した細胞を２μｇ／ｍｌのＡＰＣで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧを含む１００μｌの染色バッファーに再懸濁した。章動ミキサー（ｎｕｔａｔｉｎｇ ｍｉｘｅｒ）でプレートを４℃で１時間インキュベートした後、１００μｌの染色バッファーで３回洗浄し、最終容量５０μｌの染色バッファーに再懸濁した。最後に、ウェルあたり２０，０００イベントのＡＰＣシグナルを、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターシステム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したフローサイトメトリーによって分析した。各プレートの個々のＥＣ_５０値は、各プレートに沿って採取された参照分子ウレルマブのＥＣ_５０に対して較正した（相対ＥＣ_５０：ＥＣ_５０、ウレルマブ／ＥＣ５０、テストｓｃＦｖ）。データは表１３および図１に要約されている。

【0237】

６．５ ＳＰＲによるＣＤ１３７対ＣＤ４０およびＯＸ４０の選択性
カニクイザルＣＤ１３７との交差反応性に加え、抗ヒトＣＤ１３７ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）のヒトＣＤ１３７との結合の選択性が望まれ、ＣＤ４０やＯＸ４０等のＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーには結合しないことが望まれる。したがって、ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）のヒトＣＤ４０およびＯＣ４０への結合を試験した。ｓｃＦｖのヒトＦｃタグ付きＣＤ４０（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤ０－Ｈ５２５３）およびヒトＦｃタグ付きＯＸ４０（Ａｃｒｏ－Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＯＸ０－Ｈ５２５５）をＴ２００デバイス（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＳＰＲ分析により測定した。この実験では、Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４０およびＯＸ４０をＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ（カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）を使用して捕捉した。各分析物注入サイクルの後、抗ヒトＦｃ特異的ＩｇＧが再生され、新しい抗原が捕捉された。ｓｃＦｖは、ランニングバッファーで希釈した高濃度の１８０ｎＭの分析物を使用して分析物として注入さした。結合時間および解離時間は、それぞれ３００秒および７２０秒に設定した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用して適合された。データは表１４に要約されている。

【0238】

【表12】

【0239】

【表13】

【0240】

【表14】

【0241】

実施例７： ヒト化ｓｃＦｖの生物物理学的特徴
ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）は、精製後、遠心濃縮管を使用して１０ｍｇ／ｍＬ未満に濃縮した（表１５）。

【0242】

ｓｃＦｖを、４週間の安定性試験等の安定性試験に供した。この試験では、ｓｃＦｖを１０ｍｇ／ｍｌの水性バッファー（ｐＨ６．４の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸リン酸バッファー）に製剤化し、－８０℃、４℃、および４０℃で４週間保存した。少なくとも、製剤中のモノマーとオリゴマーの割合は、１週間後、２週間後、および各研究の終了時にＳＥ－ＨＰＬＣピーク面積を積分することによって評価された。表１６は、調査のｄ２８で得られたｄ７とエンドポイントの測定値を比較している。さらに、ｓｃＦｖ分子の適合性は、凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクル（コロイド安定性）に関して評価された。Ｆ／Ｔ安定性評価では、保存安定性研究と同じ分析方法（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ－Ｖｉｓ）およびパラメータ（％モノマー含有量および％モノマー損失）を適用して、５回のＦ／Ｔサイクルを超える分子の品質をモニターした。表１７は、５回の繰り返しＦ／Ｔサイクルにわたるモノマー含有量の経過を％で示している。Ｆ／Ｔサイクルを繰り返した後、２％を超えるモノマー含有量を失った分子はなかった。

【0243】

分子の熱変性は、蛍光色素ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅを使用して評価した。関連する賦形剤条件のサンプルを調製し、ｑＰＣＲマシンでアッセイを実施した。ソフトウェアのカスタム色素キャリブレーションルーチンを使用して、蛍光発光を検出した。試験サンプルを含むＰＣＲプレートを２５℃から９６℃まで１℃刻みで温度上昇させた。展開遷移の中点（Ｔｍ）は、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって、数学的な二次導関数法を使用して計算され、曲線の変曲点が計算された。報告されたＴｍは、３回の測定の平均である。表１８は、一般的なバッファー（ｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸－クエン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で製剤化された分子の融解温度を示している。

【0244】

ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２）およびＰＲＯ１３６０（３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３）を、短期間のｐＨストレス安定性研究に供した。この研究では、ｓｃＦｖ分子がｐＨ３．５～７．５の一連の水性バッファー（リン酸－クエン酸）系中で１ ｍｇ／ｍｌで製剤化された。それぞれのバッファー系で４℃および４０℃で２週間保存した後、％モノマー含有量および％モノマー損失を分析した。研究期間中のモノマー含有量、モノマー損失、濃度、および濃度損失の表形式の要約を表１９に示す。

【0245】

【表15】

【0246】

【表16】

【0247】

【表17】

【0248】

【表18】

【0249】

【表19】

【0250】

実施例８： 溶液中のＣＤ１３７ ＥＣＤバリアントの複合体形成分析によるエピトープマッピング
この研究では、さまざまなＣＤ１３７ ＥＣＤバリアントが、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）および膜の近位の柄（ｓｔａｌｋ）であるアノテートされた構造モチーフに基づいて設計された（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、Ｑ０７０１１；図４Ａ）：

【0251】

【化1】

*アミノ酸２４～１８６に及ぶＣＤ１３７の細胞外ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ０７０１１；ＣＤ１３７の完全な配列は配列番号３２を参照）は、４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ１～４）および膜の近位の柄（ｓｔａｌｋ）で構成されている。下線が引かれた残基は、ウトミルマブのエピトープが位置するアミノ酸配列を示す（国際公開第２０１２／０３２４３３号）。

【0252】

モチーフの組み合わせ（図４Ｂ）は、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ部位（３Ｃ部位）およびヒトヒンジーＦｃドメインにＮ末端で結合していた。膜近位モチーフＣＲＤ４および柄（ｓｔａｌｋ）は常に排他的に一緒に組み込まれていた。合計８個のＣＤ１３７ ＥＣＤバリアントおよびＰＲＯ１４８０が結合分析に含まれていた（図４、表２０）。タンパク質の発現は、一過性のＣＨＯｇｒｏ発現システム（Ｍｉｒｕｓ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅＣＨＯ－Ｓ細胞で行った。目的の遺伝子は哺乳類の発現に最適化され、合成され、標準のｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングされた。シグナル配列は、マウス重鎖ＩｇＧに由来する。発現培養物は、３７℃で６～７日間（細胞生存率＜７０％）、または３７℃で１日間、バッチで培養した後、５～６日間３２℃に温度を移行した。培養上清は、遠心分離とそれに続く０．４５μｍろ過によって分離された。標的タンパク質は、ＰＲＯ１４８０のプロテインＬアフィニティークロマトグラフィーまたはＣＤ１３７ ＥＣＤバリアントのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続く研磨サイズ排除クロマトグラフィー（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって、清澄化された培養上清から捕捉された。結合実験中、ＰＲＯ１４８０を各ＣＤ１３７ ＥＣＤバリアントとともに、ＫＤの少なくとも５００倍の濃度で等モル比でインキュベートした。結合の評価（ｙｅｓまたはｎｏ）は、個々のタンパク質と比較した複合体のＳＥ－ＨＰＬＣによる保持時間シフト分析で行われた。結果は表２１に要約される。

【0253】

【表20-1】

【表20-2】

【0254】

【表21】

【0255】

発明の抗体を含む多重特異性分子
本発明の抗体を含む例示的な多重特異性分子は、表３に含まれている。ＰＲＯ１４８０およびＰＲＯ１４８１は、それぞれ、３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０２および３８－２７－Ａ１１ ｓｃ０３に由来する。

【0256】

実施例９： ＰＤＬ１、ＣＤ１３７、ＨＳＡ、およびＭＳＡに対する親和性
ＰＤＬ１に対する親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００デバイス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＰＲ測定によって測定された。この実験では、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅキット（カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）を使用して、さまざまな種のＦｃタグ付きＰＤＬ１を捕捉した。各分析物注入サイクルの後、抗ヒトＦｃ特異的ＩｇＧが再生され、新しい抗原が捕捉された。すべてのフォーマットで、多重特異性分子は、分析対象物の濃度が０．１８～４５ｎＭ（２倍希釈工程）の範囲で、ランニングバッファーで希釈された、用量反応ｍｕｌｔｉ－ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃアッセイを使用して分析物として注入された。結合時間および解離時間は、それぞれ３００秒および７２０秒に設定した。見かけの解離（ｋｄ）と会合（ｋａ）の速度定数、および見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルを使用して計算した。異なる種のＣＤ１３７への親和性は、異なる種のＣＤ１３７－Ｆｃキメラタンパク質が固定化抗体によって捕捉されたことを除いて、ＰＤＬ１と同じセットアップを使用して測定した。

【0257】

Ｆｃを含むフォーマットは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体によって直接捕捉された。バイオセンサーチップに捕捉されたＩｇＧへの結合について、９０～０．３５ｎＭの範囲のＰＤＬ１細胞外ドメインまたはＣＤ１３７細胞外ドメインの２倍段階希釈を試験した。各注入サイクルの後、３Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液を１回注入することで表面を再生した。

【0258】

異なる種の血清アルブミン（ＳＡ）に対する分子の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００デバイス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＰＲ測定によって測定した。ＳＡは、アミン結合化学を使用してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接結合された。再生スカウティング（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｃｏｕｔｉｎｇ）および表面性能試験を行って最適なアッセイ条件を見出した後、用量反応を測定し、得られた結合曲線を二重参照（空の参照チャネルおよびゼロ分析物注入）し、１：１のラングミュアモデルを使用して適合させて動態パラメータを取得した。アッセイは、ｐＨ５．５の１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎバッファーで行った。

【0259】

得られたデータは表２２に要約されている。クローン３８－２７－Ａ１１に由来するＣＤ１３７特異的ヒト化構築物の結合動態の測定は、ほぼ同一の親和性を示している（表２２のクローン３８－２７－Ａ１１、ＰＲＯ１４８０、およびＳＴＲグラフトＰＲＯ１４８１のＣＤＲグラフトを比較されたい）。

【0260】

実施例１０： ＣＤ１３７を発現する遺伝子導入ＮＦ－ｋＢ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株の細胞ベースのアッセイを使用した、抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７分子のＣＤ１３７アゴニスト効果の評価
このアッセイでは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達の活性化を評価した。ＣＤ１３７シグナル伝達の活性は、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株でＣＤ１３７が誘導するＮＦ－ｋＢ活性化によって駆動されるルシフェラーゼ発現の測定によってレポートされる。ルシフェラーゼの発現は、ＣＤ１３７の活性と直接相関している。さらに、シグナル経路の活性化に必要なＣＤ１３７のクラスター化は、Ｊｕｒｋａｔ細胞とＰＤＬ１発現細胞株の間の免疫シナプスの形成を介して促進される。したがって、レポーター細胞株でのＣＤ１３７のクラスター化および活性化には、ＰＤＬ１の発現が必要である。

【0261】

ＰＤＬ１発現を増加させるために１０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮｙで２４時間刺激したＨＣＣ８２７細胞を、９６ウェル培養プレートにウェルあたり２５，０００細胞で播種した。次に、抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７分子の段階希釈液および競合他社のウレルマブを調製し、細胞に添加した。次に、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を２５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡを含むまたは含まないアッセイ培地で調製し、ウェルあたり４０，０００細胞の細胞密度で添加した。ルシフェラーゼの発現は、ルシフェラーゼ試薬の添加によって検出し、Ｊｕｒｋａｔ細胞の添加の６時間後または２４時間後に発光リーダーによって読み取った。試験サンプルの相対発光単位（ＲＬＵ）をＰＲＯ８８５について測定したＲＬＵ（図５）に対して正規化することによってデータを分析し、ＣＤ１３７シグナル伝達の相対的活性化の値を得た。図５および表２３に示すように、クローン３８－２７－Ａ１１に由来するｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ ＰＲＯ１４８０およびＰＲＯ１４８１は、ＣＤ１３７シグナル伝達を刺激することができた。

【0262】

【表22】

【0263】

【表23】

【0264】

実施例１１： スーパー抗原ＳＥＡで刺激されたヒトＰＢＭＣを使用した細胞ベースのアッセイにおける、ＰＤＬ１遮断とＣＤ１３７刺激の併用による刺激効果の評価
この実験では、ＰＤ－１／ＰＤＬ１阻害とＣＤ１３７アゴニズムの相乗効果を評価した。このアッセイでは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞でそれぞれＰＤＬ１、Ｔ細胞でＣＤ１３７の発現を誘導するために、スーパー抗原であるブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）で刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７分子を適用することにより、２つのＴ細胞制御性シグナル伝達経路が同時に標的にされた： 抑制性ＰＤ－１／ＰＤＬ１経路の阻害、および三重特異性抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７×ＨＳＡ分子によって媒介される免疫シナプスの形成を介したＣＤ１３７経路の活性化（ＰＲＯ１４８０）。Ｔ細胞の活性化を、インターロイキン２（ＩＬ－２）の分泌によって評価され、参照分子アベルマブおよびウレルマブの混合物によって媒介されるＰＤＬ１阻害によって媒介される効果と比較した。

【0265】

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって新鮮なヒト全血から分離した。次に、抗ＣＤ５６抗体およびＭＡＣＳ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＰＢＭＣのＮＫ細胞を枯渇させた。次に、ウェルあたり１００，０００個のＰＢＭＣを９６ウェルプレートに添加し、続いてＰＲＯ１４８０または１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＳＥＡを含むアッセイバッファー中のウレルマブとアベルマブの組み合わせの段階希釈液を添加した。３７℃および５％ＣＯ_２で９６時間インキュベートした後、細胞上清を回収し、培養上清中のヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）レベルを、キットの説明書に従ってＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＩＬ－２ヒトＥＬＩＳＡ ＭＡＸアッセイを使用して定量した。ＩＬ－２濃度を、ＩＬ－２標準曲線から補間し、逆算し、ＥＣ_５０値の計算のためにアベルマブ／ウレルマブの組み合わせおよびＰＲＯ１４８０濃度に対してプロットした。

【0266】

図６に示すように、ＩＬ－２は、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用の遮断、およびＰＲＯ１４８０の添加によるＣＤ１３７の刺激に続いて、Ｔ細胞によって分泌された。アベルマブおよびウレルマブの組み合わせと比較した場合、ＰＲＯ１４８０はより高いＴ細胞活性化およびより優れた作用強度を示した。この知見は、三重特異性抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７×ＨＳＡ ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ ＰＲＯ１４８０が、参照分子であるアベルマブおよびウレルマブの混合物と比較した場合、より強いＴ細胞刺激を誘導できることを示している。

【0267】

実施例１２： 同時のＰＤＬ１遮断およびＣＤ１３７刺激の刺激効果のエピトープ依存性
実施例１１は、異なる抗ＣＤ１３７抗体断片を有する２つの構築物の刺激効果を比較することによって繰り返された。一連の３～４回の個別実験からの単一の代表的な例からのデータを示す図７に示すように、ＩＬ－２は、ＰＤ－１／ＰＤＬ１相互作用の同時遮断およびＰＲＯ１４８０およびＰＲＯ１１８６の添加によるＣＤ１３７の刺激に続いて、Ｔ細胞によって分泌された（実施例１０を参照されたい）。ＣＤ１３７ ＥＣＤのＣＲＤ４の膜近位エピトープを標的とするＰＲＯ１１８６（図９（Ｂ）を参照）と比較した場合、ＣＤ１３７ ＥＣＤのＣＲＤ１およびＣＲＤ２の膜遠位先端エピトープを標的とするＰＲＯ１４８０（図９（Ａ）を参照）は、より高いＩＬ－２分泌および優れた作用強度によって示されるように、より高い最大Ｔ細胞活性化を示した（図８は、前記一連の３～４回の個別実験のプールされた結果を示す）。この知見は、膜遠位端エピトープを標的とする三重特異性抗ＰＤＬ１×ＣＤ１３７×ＨＳＡ ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ ＰＲＯ１４８０が、非遠位エピトープを標的とする分子と比較した場合、より強いＴ細胞共刺激を誘導できることを示している。

【0268】

実施例１３： エピトープの決定
ＰＲＯ１３５９単独および４－１ＢＢのＥＣＤとの複合体の構造決定
ｓｃＦｖ（ＰＲＯ１３５９）は、ＣＨＯ細胞で一過性に発現し、Ｃａｐｔｏ－Ｌレジン（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して回収物から精製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質を高モノマー含有量にポリッシュした。

【0269】

４－１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ０７０１１）の残基２４～１６０は、Ｎ末端分泌配列およびＩｄｅＳ切断部位を含むＣ末端ヒンジレスＦｃタグで発現された［Ｎｏｖａｒｒａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｈｉｎｇｅｌｅｓｓ Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＩｄｅＳ． ｍＡｂｓ， ２０１６． ８（６）： ｐ．１１１８－１１２５］。融合タンパク質はＣＨＯ細胞で一過性に発現し、プロテインＡレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞上清から捕捉された。Ｆｃタグは３７℃でＩｄｅＳによって切断され、プロテインＡビーズを使用して除去された。

【0270】

抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９の結晶化
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮される。結晶化条件は、母液とタンパク質の比率が１：１のシッティングドロップ蒸気拡散法によってスクリーニングされた。結晶を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、２Ｍ ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４で成長させ、１００％エチレングリコールを母液に最終濃度２０％になるように添加して凍結保護した。

【0271】

抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９と４－１ＢＢのＥＣＤの複合体の結晶化
複合体は、等モル比の両方のタンパク質を混合した後、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７中のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５サイズ排除クロマトグラフィーカラムで複合体を精製することにより形成された。

【0272】

複合体に対応する画分を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。初期結晶は、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、２２％ＰＥＧ２０００ ＭＭＥ、０．１７Ｍ～０．２３Ｍ酢酸カルシウム、および等量の母液と複合体中で、２０℃でシッティングドロップ蒸気拡散法を行うことによって成長させた。ＳｅｅｄＢｅａｄｓ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して結晶を粉砕し、その後の結晶化スクリーニングで種晶（ｃｒｙｓｔａｌｓ ｓｅｅｄｓ）として使用した。

【0273】

最終結晶は、０．１Ｍ酢酸トリスｐＨ８．５、１Ｍギ酸ナトリウム、２５％ＰＥＧ２０００ ＭＭＥ、母液対タンパク質対種晶（ｓｅｅｄ）の比率が１：１：０．１２５の状態で２０℃で成長させた。結晶を８０ｍＭ酢酸トリスｐＨ８．５、０．８Ｍギ酸ナトリウム、２２．４％ＰＥＧ２０００ ＭＭＥ、２０％エチレングリコールで凍結保護し、液体窒素で凍結した。

【0274】

回折実験および構造解（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
スイスのフィリゲンにあるＰａｕｌ－ＳｃｈｅｒｒｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＳｗｉｓｓＬｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅで、ｓｃＦｖのみおよび４－１ＢＢとの複合体のネイティブデータセットが収集された。ｓｃＦｖは空間群Ｐ６５で結晶化し、ＸＤＳを使用して１．６Åの分解能で処理された。複合体は空間群Ｉ２２２で結晶化し、ＸＤＳを使用して２．２Åの分解能で処理された［Ｋａｂｓｃｈ， Ｗ．， ＸＤＳ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ， ２０１０． ６６（２）： ｐ．１２５－１３２．］。

【0275】

ｓｃＦｖの構造は、ｉｎ－ｈｏｕｓｅのｓｃＦｖモデルを使用したＰｈａｓｅｒによる分子置換によって解決された［ＭｃＣｏｙ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ， ２００７． ４０（４）： ｐ．６５８－６７４］。複雑な構造は、ｓｃＦｖ ａｐｏ構造および４－１ＢＢの縮小モデル（ｐｄｂコード：６ＢＷＶ、鎖Ｄ）を使用した分子置換によって解決された。

【0276】

改良（Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）
構造はＲｅｆｍａｃを使用して改良された［Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ， Ｇ．Ｎ．， Ａ．Ａ． Ｖａｇｉｎ， ａｎｄ Ｅ．Ｊ． Ｄｏｄｓｏｎ， Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ－Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｍｅｔｈｏｄ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ， １９９７． ５３（３）： ｐ．２４０－２５５．］。

【0277】

アポ構造は１．６Åの分解能に改良され、残基１～１１０および１２８～２５１は電子密度と１５．８％／１８％の最終的なＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅ値によって明確に定義されている。複雑な構造も同様に２．２Åの分解能に改良された。ＣＤ１３７の場合、残基２４～１５８は電子密度で表示され、残基１３９～１４９および１５６～１５８は弱く定義されている。ｓｃＦｖは、残基３～１０９および１３１～２５２に対して明確に定義されている。複合体は、１９．２％／２３．５％のＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅ値に改良した。

【0278】

インターフェース記述
ＣＤ１３７エピトープ
結合インターフェースは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰＩＳＡサービスを使用して分析する［Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ， Ｅ． ａｎｄ Ｋ． Ｈｅｎｒｉｃｋ， Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｓｔａｔｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７． ３７２（３）： ｐ．７７４－７９７．］。ＣＤ１３７のエピトープは、第一および第二のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）内にある。ｓｃＦｖの結合時に埋もれるアクセス可能な表面積は７７０Å^２である（表２６を参照されたい）。重要な残基を表２４に示す。水素結合ネットワークを表２５に要約する。

【0279】

【表24-1】

【表24-2】

【0280】

【表25】

* アラニンに変異した場合、親和性は１０００分の１以下に減少した。

【0281】

【表26】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

2022512628000001.app

【国際調査報告】