特表 2022-512650 抗体ライブラリー及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】抗体ライブラリー及び方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20220131BHJP

   C40B 40/10 20060101ALI20220131BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00 ZNA

C40B40/10

C40B40/08

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021519644

(86)(22)【出願日】2019-10-22

(85)【翻訳文提出日】2021-06-03

(86)【国際出願番号】 GB2019053010

(87)【国際公開番号】W WO2020084298

(87)【国際公開日】2020-04-30

(31)【優先権主張番号】1817188.4

(32)【優先日】2018-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1904754.7

(32)【優先日】2019-04-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1905032.7

(32)【優先日】2019-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506180073

【氏名又は名称】フュージョン アンティボディーズ ピーエルシー

【氏名又は名称原語表記】ＦＵＳＩＯＮ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＰＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ビュイック， リチャード

(72)【発明者】

【氏名】スコット， クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】マッキャン， ダラッグ

(72)【発明者】

【氏名】マクギアー， レオナ

(72)【発明者】

【氏名】モーガン， ヒュー

(72)【発明者】

【氏名】キャンベル， ナターシャ

(72)【発明者】

【氏名】マクローリー， ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】オケイン， アンソニー

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA11

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、抗体ライブラリーを生成する方法、そのような方法を使用して生産された抗体ライブラリー、及びバリアント抗体に関する。現在、抗体結合を改善する方法（親和性成熟アッセイ）は、改善された特性を有するごく一部のバリアントを同定するために、抗体バリアントの膨大なライブラリー（しばしば＞１０^１０）をスクリーニングすることを要求する。本発明は、標的抗体のフレームワーク及び相補性決定領域のヌクレオチド配列を取得し、脱アミノ化体細胞超変異酵素によって認識されるモチーフを同定することを含む。次に、これらの変異のうちの１つ又は複数を組み込んだバリアントの小さなライブラリーが作出される。バリアントの比較的高い割合が、増加した親和性を有することが見出された。本発明の技術は、トラスツズマブ及びカテプシンＳ抗体で実証され、そして生産されたバリアントもまた特許請求される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）参照抗体の軽鎖アミノ酸配列と比較した場合、軽鎖配列に少なくとも２つのアミノ酸変更を有するか、
（ｉｉ）参照抗体の重鎖アミノ酸配列と比較した場合、重鎖配列に少なくとも２つのアミノ酸変更を有するか、又は
（ｉｉｉ）参照抗体の軽鎖アミノ酸配列と比較した場合、軽鎖配列に少なくとも１つのアミノ酸変更を有し、且つ参照抗体の重鎖アミノ酸配列と比較した場合、重鎖配列に少なくとも１つのアミノ酸変更を有する、参照抗体のバリアントであって；
前記アミノ酸変更のそれぞれが、バリアントＤＮＡ配列のＤＮＡセグメントから独立的にコードされるアミノ酸残基にあり、
バリアントの前記ＤＮＡセグメントが、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性のＤＮＡモチーフにおける点変異によって、参照抗体をコードする対応するＤＮＡ配列のセグメントとは異なっている、参照抗体のバリアント。

【請求項2】

前記体細胞超変異誘導酵素が、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）であり、前記ＤＮＡモチーフが、ＤＧＹＷ又はＷＲＣＨ、例えばＲＧＹＷ又はＷＲＣＹであり、ここで、Ｄはアデニン、グアニン又はチミンであり、Ｒはアデニン又はグアニンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｈはアデニン又はシトシン又はチミンであり、Ｗはアデニン又はチミンであり、Ｙはシトシン又はチミンである、請求項１に記載のバリアント抗体。

【請求項3】

前記参照抗体がトラスツズマブである、請求項１又は請求項２に記載のバリアント抗体。

【請求項4】

前記アミノ酸変更がｌｃ９Ｎ、ｌｃ９Ｔ、ｌｃ９Ｉ、ｌｃ９Ｒ、ｌｃ９Ｋ、ｌｃ２５Ｇ、ｌｃ２５Ｖ、ｌｃ２５Ｄ、ｌｃ３１Ｎ、ｌｃ３１Ｓ、ｌｃ３１Ｉ、ｌｃ３２Ｄ、ｌｃ３２Ｇ、ｌｃ３２Ｖ、ｌｃ３２Ｔ、ｌｃ３２Ｎ、ｌｃ３２Ｓ、ｌｃ３２Ｉ、ｌｃ３２Ｐ、ｌｃ３２Ｌ、ｌｃ３２Ｆ、ｌｃ３３Ｌ、ｌｃ３３Ｉ、ｌｃ３４Ｇ、ｌｃ３４Ｖ、ｌｃ３４Ｄ、ｌｃ３８Ｅ、ｌｃ３８Ｋ、ｌｃ４０Ａ、ｌｃ４０Ｓ、ｌｃ４０Ｔ、ｌｃ４３Ｇ、ｌｃ４３Ｖ、ｌｃ４３Ｔ、ｌｃ４３Ｎ、ｌｃ４３Ｓ、ｌｃ４３Ｉ、ｌｃ４３Ｐ、ｌｃ４３Ｌ、ｌｃ４３Ｆ、ｌｃ４６Ｖ、ｌｃ４６Ｉ、ｌｃ４７Ｖ、ｌｃ５１Ｓ、ｌｃ５１Ｐ、ｌｃ５１Ｔ、ｌｃ７６Ｒ、ｌｃ７６Ｎ、ｌｃ７６Ｔ、ｌｃ７６Ｋ、ｌｃ７６Ｉ、ｌｃ７９Ｋ、ｌｃ７９Ｅ、ｌｃ８０Ｔ、ｌｃ８０Ｓ、ｌｃ８０Ａ、ｌｃ８５Ｓ、ｌｃ８５Ｎ、ｌｃ８５Ｉ、ｌｃ８９Ｈ、ｌｃ９０Ｅ、ｌｃ９０Ａ、ｌｃ９１Ｎ、ｌｃ９１Ｄ、ｌｃ９１Ｙ、ｌｃ９３Ｓ、ｌｃ９３Ｎ、ｌｃ９３Ｉ、ｌｃ９４Ｓ、ｌｃ９４Ｎ、ｌｃ９４Ｉ、ｌｃ１０１Ｄ、ｌｃ１０２Ｓ、ｌｃ１０２Ｎ、ｈｃ２Ｌ、ｈｃ２Ｉ、ｈｃ３Ｈ、ｈｃ４Ｍ、ｈｃ４Ｖ、ｈｃ１３Ｋ、ｈｃ１３Ｅ、ｈｃ１４Ａ、ｈｃ１４Ｔ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ１６Ａ、ｈｃ１６Ｖ、ｈｃ１６Ｄ、ｈｃ２３Ｅ、ｈｃ２３Ｇ、ｈｃ２３Ｖ、ｈｃ２３Ｔ、ｈｃ２３Ｋ、ｈｃ２３Ｒ、ｈｃ２３Ｉ、ｈｃ２３Ｐ、ｈｃ２３Ｌ、ｈｃ２３Ｓ、ｈｃ２４Ｄ、ｈｃ２４Ｇ、ｈｃ２４Ｖ、ｈｃ２４Ｔ、ｈｃ２４Ｎ、ｈｃ２４Ｓ、ｈｃ２４Ｉ、ｈｃ２４Ｐ、ｈｃ２４Ｌ、ｈｃ２４Ｆ、ｈｃ２６Ａ、ｈｃ２６Ｖ、ｈｃ２６Ｄ、ｈｃ２８Ｋ、ｈｃ３５Ｎ、ｈｃ３５Ｄ、ｈｃ３５Ｙ、ｈｃ４８Ｌ、ｈｃ４８Ｉ、ｈｃ４９Ｇ、ｈｃ４９Ｓ、ｈｃ５６Ａ、ｈｃ５６Ｖ、ｈｃ５６Ｄ、ｈｃ５８Ｓ、ｈｃ５８Ｎ、ｈｃ５８Ｉ、ｈｃ６１Ｇ、ｈｃ６１Ｖ、ｈｃ６１Ｄ、ｈｃ７９Ｇ、ｈｃ７９Ｖ、ｈｃ７９Ｄ、ｈｃ８２Ｅ、ｈｃ８２Ｋ、ｈｃ８５Ｒ、ｈｃ８８Ｄ、ｈｃ８８Ｔ、ｈｃ８８Ｓ、ｈｃ８８Ｐ、ｈｃ８８Ｇ、ｈｃ９２Ｇ、ｈｃ９２Ｖ、ｈｃ９２Ｄ、ｈｃ１０３Ａ、ｈｃ１０３Ｖ、ｈｃ１０３Ｄ、ｈｃ１０６Ｄ、ｈｃ１０６Ｇ、ｈｃ１０６Ｖ、ｈｃ１０６Ｔ、ｈｃ１０６Ｎ、ｈｃ１０６Ｓ、ｈｃ１０６Ｉ、ｈｃ１０６Ｐ、ｈｃ１０６Ｌ、ｈｃ１０６Ｆ、ｈｃ１１４Ｓ、ｈｃ１１４Ｎ、及びｈｃ１１４Ｉからなる群から選択される、請求項３に記載のバリアント抗体。

【請求項5】

前記アミノ酸変更がｌｃ９Ｔ、ｌｃ９Ｉ、ｌｃ９Ｒ、ｌｃ９Ｋ、ｌｃ４３Ｆ、ｌｃ４７Ｖ、ｌｃ５１Ｐ、ｌｃ５１Ｔ、ｌｃ１０１Ｄ、ｈｃ２Ｌ、ｈｃ３Ｈ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ１６Ｖ、ｈｃ２４Ｐ、ｈｃ２６Ａ、ｈｃ２６Ｖ、ｈｃ４８Ｉ、ｈｃ５８Ｓ、ｈｃ６１Ｖ、ｈｃ７９Ｖ、ｈｃ８５Ｒ、ｈｃ８８Ｇ、ｈｃ９２Ｖ、ｈｃ９２Ｄ、ｈｃ１０３Ａ、ｈｃ１０３Ｖ、ｈｃ１０６Ｖ、ｈｃ１１４Ｓ、ｈｃ１１４Ｎ、及びｈｃ１１４Ｉからなる群から選択される、請求項４に記載のバリアント抗体。

【請求項6】

バリアントの軽鎖及び重鎖配列が、請求項４に記載のアミノ酸変更以外のどの残基においても参照抗体の配列と異ならない、請求項３～５のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項7】

前記バリアント抗体分子が、表８のバリアント番号１９又は表８に列挙された他の抗体のいずれかについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有する、請求項３～６のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項8】

前記バリアント抗体分子が、表２～７に列挙された抗体のいずれかについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有する、請求項３～６のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項9】

トラスツズマブと比較して、ｌｃ９Ｋ、ｌｃ４３Ｆ、及びｈｃｌ０６Ｖのアミノ酸変更を含むトラスツズマブ抗体のバリアントである、請求項３～８のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項10】

前記バリアントが、カテプシンＳ抗体のバリアントであり、前記参照抗体がＦｓｎ５０３ｈである、請求項１又は請求項２に記載のバリアント抗体。

【請求項11】

前記アミノ酸変更がｌｃ１２Ａ、ｌｃ１２Ｓ、ｌｃ１２Ｔ、ｌｃ１９Ｖ、ｌｃ２８Ｒ、ｌｃ３２Ｔ、ｌｃ３２Ｉ、ｌｃ４５Ａ、ｌｃ４５Ｓ、ｌｃ４５Ｔ、ｌｃ５０Ｈ、ｌｃ５１Ｖ、ｌｃ５１Ｆ、ｌｃ５１Ｉ、ｌｃ５６Ｌ、ｌｃ５６Ｆ、ｌｃ５６Ｉ、ｌｃ５８Ｋ、ｌｃ６６Ｓ、ｌｃ６９Ａ、ｌｃ６９Ｖ、ｌｃ８１Ｔ、ｌｃ８１Ｉ、ｌｃ８１Ｎ、ｌｃ８５Ｐ、ｌｃ８５Ｓ、ｌｃ８５Ｔ、ｌｃ９０Ｌ、ｌｃ９０Ｆ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｓ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｎ、ｌｃ１０８Ｎ、ｈｃ３Ｈ、ｈｃ４Ｖ、ｈｃ４Ｍ、ｈｃ１０Ａ、ｈｃ１０Ｖ、ｈｃ１４Ａ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ２４Ｇ、ｈｃ２４Ｖ、ｈｃ３０Ｔ、ｈｃ３０Ｉ、ｈｃ３１Ｒ、ｈｃ３１Ｔ、ｈｃ３７Ｌ、ｈｃ３７Ｆ、ｈｃ４０Ｐ、ｈｃ４０Ｓ、ｈｃ５２Ｓ、ｈｃ５２Ｉ、ｈｃ５３Ｓ、ｈｃ５３Ｉ、ｈｃ８４Ｔ、ｈｃ８４Ｉ、ｈｃ９２Ｇ、及びｈｃ９２Ｖからなる群から選択される、請求項１０に記載のバリアント抗体。

【請求項12】

前記アミノ酸変更がｌｃ１２Ａ、ｌｃ１２Ｓ、ｌｃ１２Ｔ、ｌｃ１９Ｖ、ｌｃ４５Ｓ、ｌｃ４５Ｔ、ｌｃ５０Ｈ、ｌｃ５１Ｖ、ｌｃ５６Ｉ、ｌｃ８１Ｉ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｓ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｎ、ｌｃ１０８Ｎ、ｈｃ１０Ａ、ｈｃ１０Ｖ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ３０Ｉ、ｈｃ３１Ｒ、ｈｃ３７Ｌ、ｈｃ３７Ｆ、ｈｃ４０Ｐ、ｈｃ４０Ｓ、ｈｃ５２Ｉ、及びｈｃ９２Ｇからなる群から選択される、請求項１１に記載のバリアント抗体。

【請求項13】

バリアントの軽鎖及び重鎖配列が、請求項１１に記載のアミノ酸変更以外のどの残基においても参照抗体の配列と異ならない、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項14】

前記バリアント抗体分子が、表１に列挙された抗体のいずれかについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項15】

前記バリアントの軽鎖及び重鎖配列が、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、合計で少なくとも３つ、例えば、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つのアミノ酸変更を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項16】

前記アミノ酸変更のうちの１つ又は複数が、前記バリアント抗体のフレームワーク領域にある、請求項１～１５のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項17】

前記アミノ酸変更のうちの１つ又は複数が、前記バリアント抗体のＣＤＲにある、請求項１～１６のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項18】

前記アミノ酸変更の全てが、前記バリアント抗体のフレームワーク領域にある、請求項１６に記載のバリアント抗体。

【請求項19】

参照抗体と比較した前記バリアント抗体分子の親和性の変化が－２より大きく、参照抗体と比較した前記バリアント抗体分子の安定性の変化が－２より大きい、請求項１～１８のいずれか一項に記載のバリアント抗体。

【請求項20】

各抗体分子が、参照抗体のバリアントであり、各抗体分子のアミノ酸配列が、１つ又は複数のアミノ酸残基において参照抗体のアミノ酸配列と異なっており、前記アミノ酸残基のそれぞれが、バリアントＤＮＡ配列のＤＮＡセグメントから独立的にコードされ、バリアントの前記ＤＮＡセグメントが、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性のＤＮＡモチーフにおける点変異によって、参照抗体をコードする対応するＤＮＡ配列のセグメントとは異なっている、抗体分子のライブラリー。

【請求項21】

前記体細胞超変異誘導酵素が、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である、請求項２０に記載のライブラリー。

【請求項22】

前記ＤＮＡモチーフが、ＤＧＹＷ又はＷＲＣＨ、例えばＲＧＹＷ又はＷＲＣＹであり、ここで、Ｄはアデニン、グアニン又はチミンであり、Ｒはアデニン又はグアニンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｈはアデニン又はシトシン又はチミンであり、Ｗはアデニン又はチミンであり、Ｙはシトシン又はチミンである、請求項２１に記載のライブラリー。

【請求項23】

前記抗体分子のそれぞれをコードするヌクレオチド配列が、前記ＤＮＡモチーフの残基以外のどの残基においても参照抗体のヌクレオチド配列と異ならない、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項24】

前記ＤＮＡモチーフのうちの１つ又は複数が、前記抗体分子のフレームワーク領域をコードするＤＮＡ配列にある、請求項２０～２３のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項25】

前記ＤＮＡモチーフのうちの１つ又は複数が、前記抗体分子のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列にある、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項26】

前記ＤＮＡモチーフの全てが、前記抗体分子のフレームワーク領域をコードするＤＮＡ配列にある、請求項２４に記載のライブラリー。

【請求項27】

各バリアントのＤＮＡ配列が、前記ＤＮＡモチーフの前記点変異を起源とする脱アミノ化部位、異性化部位、Ｎ結合型グリコシル化部位又は酸化部位を含まない（又はコードしない）、請求項２０～２６のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項28】

ライブラリーの各メンバーが、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の抗体分子のライブラリーの抗体分子をコードする、ヌクレオチド配列のライブラリー。

【請求項29】

バリアント抗体分子のライブラリーを生成／生産する方法であって、前記バリアント抗体分子が、参照抗体のバリアントであり、前記方法が、前記参照抗体の複数のバリアントを含むライブラリーが生成されるように、
ａ）参照抗体をコードするヌクレオチド配列を提供するステップ、
ｂ）前記ヌクレオチド配列において、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性の１つ又は複数のＤＮＡモチーフを同定するステップ；
ｃ）前記ＤＮＡモチーフのうちの１つ又は複数について、前記ＤＮＡモチーフの残基を置換するための少なくとも１つのバリアントヌクレオチド残基を選択するステップであり、前記置換が、参照抗体と比較して、前記ＤＮＡモチーフによってコードされるアミノ酸配列に変更を有するバリアント抗体分子をコードするバリアントヌクレオチド配列をもたらす、ステップ；及び
ｄ）ステップ（ｂ）と（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、方法。

【請求項30】

バリアントの前記ライブラリーをスクリーニングして、参照抗体が結合するエピトープへの結合を決定するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

参照抗体に対して所定の値よりも大きい親和性及び／又は安定性で前記エピトープに結合することが決定されたそれらのバリアントを使用して、バリアント抗体分子の最適化されたライブラリーを生成する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

コンピュータ実装方法である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

バリアント抗体分子を合成するステップをさらに含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ライブラリーが、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の抗体分子のライブラリーである、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

参照抗体が、トラスツズマブ又は抗カテプシンＳ抗体Ｆｓｎ０５０３ｈである、請求項２０～２７のいずれか一項に記載のライブラリー又は請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体ライブラリーを生成する方法、そのような方法を使用して生産された抗体ライブラリー、及びバリアント抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

抗体親和性は、会合速度と解離速度の比率としての、抗体とそれが特異的に結合するタンパク質との間の相互作用の強さの尺度である。この比率の最適化が望ましい多くの理由がある。親和性の増加は、抗体治療が特定の用量でより効果的であることを意味してもよく、又はそれは、用量ごとに必要な薬剤がより少なくなり、そして診断試験が感度を向上させ得ることを意味してもよい。また、親和性を低下させることも、組織への浸透を必要とし、したがって、より速い解離を必要とする一部の薬剤にとっては有益となることがある。また、二重特異性抗体は、有効性を最大化するために、各結合部位の親和性の複雑な調整を必要とすることも示されている。

【0003】

既存の親和性成熟プラットフォームは一般的には、抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）内に焦点を合わせたランダム変異誘発を通じてバリアントの大規模なライブラリーを作出することを含む。このプロセスは、改善された特性を有するごく一部のバリアントを同定するために、非常に多数のバリアント（しばしば＞１０^１０）をスクリーニングするという欠点を有する。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、先行技術の問題の多くに対処する。実施例に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、所与の抗体配列をコードするヌクレオチド配列への変異を、体細胞超変異に関与する酵素により標的化されるＤＮＡモチーフに対応する部位に制限することによって、所与の抗体配列の変異体のライブラリーを作出することができ、このライブラリーは、多くの既存の技術によって調製されたものと比較すると、比較的小さいが、比較的高い割合の増加した親和性、又は凝集性、又は融点、又はＣＨＯ細胞における発現レベル又はそれらの組み合わせを有するバリアントを含むことを示した。本発明者らは、２つの無関係な抗体、抗カテプシンＳ抗体、Ｆｓｎ０５０３ｈ（Ｆｕｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌｔｄ）、及び抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）を利用して本発明を例証した。

【0005】

したがって、本発明の第１の態様は、抗体分子のライブラリーを提供し、各抗体分子は、参照抗体のバリアントであり、各抗体分子のアミノ酸配列は、１つ又は複数のアミノ酸残基において参照抗体のアミノ酸配列と異なっており、前記アミノ酸残基のそれぞれは、バリアントをコードするＤＮＡ配列のＤＮＡセグメントから独立的にコードされ、バリアントの前記ＤＮＡセグメントは、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性のＤＮＡモチーフにおける点変異によって、参照抗体をコードする対応するＤＮＡ配列のセグメントとは異なっている。

【0006】

本発明の第２の態様は、バリアント抗体分子のライブラリーを生成／生産する方法であって、前記バリアント抗体分子が、参照抗体のバリアントであり、前記方法が、前記参照抗体の複数のバリアントを含むライブラリーが生成されるように、以下のステップを含む、方法を提供する：
ａ）参照抗体をコードするヌクレオチド配列を提供するステップ、
ｂ）前記ヌクレオチド配列において、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性の１つ又は複数のＤＮＡモチーフを同定するステップ；
ｃ）前記ＤＮＡモチーフのうちの１つ又は複数について、前記ＤＮＡモチーフの残基を置換するための少なくとも１つのバリアントヌクレオチド残基を選択するステップであり、前記置換が、参照抗体と比較して、前記ＤＮＡモチーフによってコードされるアミノ酸配列に変更を有するバリアント抗体分子をコードするバリアントヌクレオチド配列をもたらす、ステップ；及び
ｄ）ステップ（ｂ）と（ｃ）を繰り返すステップ。

【0007】

参照抗体は、バリアントが望まれるか又は必要とされる任意の抗体分子であり得る。一実施形態では、前記参照抗体は、ヒト化抗体分子である。

【0008】

本発明の第３の態様は、バリアント抗体分子を生成する方法であって、前記バリアント抗体分子が、参照抗体のバリアントであり、前記方法が、以下のステップを含む、方法を提供する：
ａ）参照抗体をコードするヌクレオチド配列を提供するステップ、
ｂ）前記ヌクレオチド配列において、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性の１つ又は複数のＤＮＡモチーフを同定するステップ；
ｃ）前記ＤＮＡモチーフのうちの１つ又は複数について、前記ＤＮＡモチーフの残基を置換するための少なくとも１つのバリアントヌクレオチド残基を選択するステップであり、前記置換が、参照抗体と比較して、前記ＤＮＡモチーフによってコードされるアミノ酸配列に変更を有するバリアント抗体分子をコードするバリアントヌクレオチド配列をもたらす、ステップ。

【0009】

本発明の一実施形態では、前記体細胞超変異誘導酵素は、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。

【0010】

本発明の実施形態では、前記ＤＮＡモチーフは、ＤＧＹＷ又はＷＲＣＨ、例えばＲＧＹＷ又はＷＲＣＹであり、ここで、Ｄはアデニン、グアニン又はチミンであり、Ｒはアデニン又はグアニンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｈはアデニン又はシトシン又はチミンであり、Ｗはアデニン又はチミンであり、Ｙはシトシン又はチミンである。

【0011】

前記ＤＮＡモチーフは、ＤＮＡのいずれかの鎖上にあってもよい。前記ＤＮＡモチーフが複数ある場合、モチーフは重複していてもよい。

【0012】

本発明者らは、本発明の抗体ライブラリー又は本発明の方法に従って生産される抗体ライブラリーが、ライブラリーのメンバーを、終止コドン又は実際のところ参照抗体と比較して、例えば安定性又は結合の観点から、潜在的に望ましくないと考えられる他のモチーフのいずれをもバリアント抗体分子内にもたらさない、体細胞超変異誘導酵素により標的化されるＤＮＡモチーフの変異に起因するそれらのバリアントにさらに限定することによって、洗練され得ることを示した。

【0013】

したがって、本発明の特定の実施形態では、各バリアントのＤＮＡ配列は、前記ＤＮＡモチーフの前記点変異を起源とする脱アミノ化部位、異性化部位、Ｎ結合型グリコシル化部位又は酸化部位を含まない（又はコードしない）。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡモチーフのうちの１つ又は複数は、前記抗体分子のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列にある。しかしながら、実施例に記載されるように、本発明者らは、いくつかの参照抗体と共に本方法を使用して、生成されたバリアントが、参照抗体の対応するＣＤＲと比較して、一部のＣＤＲには変異を有さないことがあることを示している。

【0015】

一実施形態では、バリアントは、参照配列の対応するＣＤＲと比較して、１つ又は複数のそのＣＤＲに変更を有さない。

【0016】

そのような一実施形態では、バリアントは、参照配列の対応するＣＤＲと比較して、軽鎖ＣＤＲ１に変更を有さない。

【0017】

別のそのような実施形態では、バリアントは、参照配列の対応するＣＤＲと比較して、軽鎖ＣＤＲ２に変更を有さない。

【0018】

別のそのような実施形態では、バリアントは、参照配列の対応するＣＤＲと比較して、軽鎖ＣＤＲ３に変更を有さない。

【0019】

別のそのような実施形態では、バリアントは、参照配列の対応するＣＤＲと比較して、重鎖ＣＤＲ１に変更を有さない。

【0020】

別のそのような実施形態では、バリアントは、参照配列の対応するＣＤＲと比較して、重鎖ＣＤＲ２に変更を有さない。

【0021】

別のそのような実施形態では、バリアントは、親配列の対応するＣＤＲと比較して、重鎖ＣＤＲ３に変更を有さない。

【0022】

さらに、実施例に示されるように、参照抗体のいくつかのバリアントでは、バリアントを特徴付ける変異の多くが、バリアント抗体分子のフレームワーク領域にあり得る。

【0023】

したがって、本発明のライブラリー又は方法の特定の実施形態では、前記ＤＮＡモチーフのうちの１つ又は複数が、前記抗体分子のフレームワーク領域をコードするＤＮＡ配列にある。いくつかのそのような実施形態では、前記ＤＮＡモチーフの全てが、前記抗体分子のフレームワーク領域をコードするＤＮＡ配列にある。

【0024】

本発明の一実施形態では、２０％を超える、例えば、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、又は９０％を超える、参照抗体の対応する位置におけるヌクレオチド残基とは異なる各バリアント抗体のヌクレオチド残基が、体細胞超変異誘発酵素による脱アミノ化に対して感受性のＤＮＡモチーフの残基である。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態では、前記抗体分子のそれぞれをコードするヌクレオチド配列は、前記ＤＮＡモチーフの残基以外のどの残基においても参照抗体のヌクレオチド配列と異ならない。

【0026】

本発明の抗体ライブラリー及び／又は本発明の方法を使用して生産される抗体ライブラリーは、高親和性及び／又は安定性のバリアントの割合を高めるために、さらに洗練されてもよい。

【0027】

本発明の抗体ライブラリー及び／又は本発明の方法を使用して生産される抗体ライブラリーは、異なる凝集性を有する、すなわち互いに凝集する能力がより低いバリアントの割合を高めるために、さらに洗練されてもよい。本発明の抗体ライブラリー及び／又は本発明の方法を使用して生産される抗体ライブラリーは、特定の融点特性を有するバリアントの割合を高めるために、さらに洗練されてもよい。本発明の抗体ライブラリー及び／又は本発明の方法を使用して生産される抗体ライブラリーは、ＣＨＯ細胞において好ましい又は所望の発現レベルを示すバリアントの割合を高めるために、さらに洗練されてもよい。本発明の抗体ライブラリー及び／又は本発明の方法を使用して生産される抗体ライブラリーは、高い親和性、安定性、所望の凝集特性、所望の融点特性、所望の発現レベル特性又はそれらの組み合わせを有するバリアントの割合を高めるために、さらに洗練されてもよい。

【0028】

したがって、本発明において、本方法は、参照抗体の結合標的への前記バリアント抗体分子の結合の親和性及び／又は安定性、参照抗体と比べた融点、参照抗体と比べた凝集性、参照抗体と比べた発現レベル又はそれらの組み合わせを決定するステップをさらに含んでいてもよい。したがって、本発明の方法の一実施形態では、前記方法は、バリアントの前記ライブラリーをスクリーニングして、参照抗体が結合するエピトープへの結合を決定するステップをさらに含む。適当には、本発明の方法は、バリアントの前記ライブラリーをスクリーニングして、参照抗体と比較したバリアントの融点、発現レベル、凝集レベル又は安定性を決定するステップをさらに含んでいてもよい。参照抗体と比べて所定の値よりも小さい又は大きい親和性及び／又は安定性で前記エピトープに結合するか、又は融解特性若しくは凝集特性若しくは発現特性を有すると決定されたそれらのバリアントを使用して、バリアント抗体分子の最適化されたライブラリーを生成することができる。前記スクリーニング方法は、従来のインビトロ技術によるものであってもよい。そのような技術は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、速度論的方法又は平衡／溶液法を含むことができる。別の方法では、前記スクリーニングは、例えば、コンピュータに実装された分子ドッキングソフトウェアを使用して、参照抗体のエピトープへのバリアントの結合をモデル化するインシリコ技術によるものであってもよい。

【0029】

実施例に示されているように、分子ドッキングソフトウェアを使用すると、予測される親和性と安定性によってバリアントをランキングすることができ、ＤＮＡ合成と発現のためのバリアントの小さなライブラリーの選択が可能となる。本発明者らは、そのような小さなライブラリー内で、エラープローンＰＣＲやファージディスプレイなどの既存の技術によって生成されるライブラリーにおいて同定されると予想される数と比較して、非常に多くのバリアントが、増加した親和性を有することを実証した。

【0030】

分子ドッキングソフトウェア製品は市販されている。エピトープへの抗体結合をモデル化するのに適した任意の適当なソフトウェア又はツールが、本発明において使用され得る。例えば、適当なソフトウェアは、ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒのＢｉｏｌｕｍｉｎａｔｅソフトウェアを含むが、他のソフトウェアも利用できる。

【0031】

したがって、本発明の実施形態では、抗体ライブラリーは、参照抗体によって結合されるエピトープに対する参照抗体の親和性と比較して、前記エピトープへの増加した親和性を有するバリアントを１％より多く、例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％より多く含む。

【0032】

本発明の方法の一実施形態では、本方法は、コンピュータ実装方法である。

【0033】

本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様による、バリアント抗体分子のライブラリーを生成する方法を実行するための命令を含む、コンピュータ可読記憶媒体を提供する。

【0034】

本発明の方法では、コンピュータにより実装されているかどうかにかかわらず、本方法は、バリアント抗体分子を合成するステップをさらに含んでいてもよい。

【0035】

本発明の方法の実施形態では、方法が、例えば、ドッキングモデリングソフトウェアによるコンピュータ実装スクリーニング方法を含む場合、本発明の方法は、参照抗体が結合するエピトープへの結合を決定するためのバリアントの前記ライブラリーのインビトロスクリーニングをさらに含んでいてもよい。

【0036】

本発明の第５の態様は、トラスツズマブ抗体のバリアントであり、前記バリアントは、（ｉ）参照抗体の軽鎖アミノ酸配列と比較した場合（ここで、前記参照抗体はトラスツズマブである）、軽鎖配列に少なくとも２つのアミノ酸変更を有するか、（ｉｉ）トラスツズマブの重鎖アミノ酸配列と比較した場合、重鎖配列に少なくとも２つのアミノ酸変更を有するか、又は（ｉｉｉ）トラスツズマブの軽鎖アミノ酸配列と比較した場合、軽鎖配列に少なくとも１つのアミノ酸変更を有し、そしてトラスツズマブの重鎖アミノ酸配列と比較した場合、重鎖配列に少なくとも１つのアミノ酸変更を有し；前記アミノ酸変更のそれぞれは、バリアントＤＮＡ配列のＤＮＡセグメントから独立的にコードされるアミノ酸残基にあり、バリアントの前記ＤＮＡセグメントは、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性のＤＮＡモチーフにおける点変異によって、参照抗体をコードする対応するＤＮＡ配列のセグメントとは異なっている。

【0037】

本発明の第５の態様の一実施形態では、前記アミノ酸変更はｌｃ９Ｎ、ｌｃ９Ｔ、ｌｃ９Ｉ、ｌｃ９Ｒ、ｌｃ９Ｋ、ｌｃ２５Ｇ、ｌｃ２５Ｖ、ｌｃ２５Ｄ、ｌｃ３１Ｎ、ｌｃ３１Ｓ、ｌｃ３１Ｉ、ｌｃ３２Ｄ、ｌｃ３２Ｇ、ｌｃ３２Ｖ、ｌｃ３２Ｔ、ｌｃ３２Ｎ、ｌｃ３２Ｓ、ｌｃ３２Ｉ、ｌｃ３２Ｐ、ｌｃ３２Ｌ、ｌｃ３２Ｆ、ｌｃ３３Ｌ、ｌｃ３３Ｉ、ｌｃ３４Ｇ、ｌｃ３４Ｖ、ｌｃ３４Ｄ、ｌｃ３８Ｅ、ｌｃ３８Ｋ、ｌｃ４０Ａ、ｌｃ４０Ｓ、ｌｃ４０Ｔ、ｌｃ４３Ｇ、ｌｃ４３Ｖ、ｌｃ４３Ｔ、ｌｃ４３Ｎ、ｌｃ４３Ｓ、ｌｃ４３Ｉ、ｌｃ４３Ｐ、ｌｃ４３Ｌ、ｌｃ４３Ｆ、ｌｃ４６Ｖ、ｌｃ４６Ｉ、ｌｃ４７Ｖ、ｌｃ５１Ｓ、ｌｃ５１Ｐ、ｌｃ５１Ｔ、ｌｃ７６Ｒ、ｌｃ７６Ｎ、ｌｃ７６Ｔ、ｌｃ７６Ｋ、ｌｃ７６Ｉ、ｌｃ７９Ｋ、ｌｃ７９Ｅ、ｌｃ８０Ｔ、ｌｃ８０Ｓ、ｌｃ８０Ａ、ｌｃ８５Ｓ、ｌｃ８５Ｎ、ｌｃ８５Ｉ、ｌｃ８９Ｈ、ｌｃ９０Ｅ、ｌｃ９０Ａ、ｌｃ９１Ｎ、ｌｃ９１Ｄ、ｌｃ９１Ｙ、ｌｃ９３Ｓ、ｌｃ９３Ｎ、ｌｃ９３Ｉ、ｌｃ９４Ｓ、ｌｃ９４Ｎ、ｌｃ９４Ｉ、ｌｃ１０１Ｄ、ｌｃ１０２Ｓ、ｌｃ１０２Ｎ、ｈｃ２Ｌ、ｈｃ２Ｉ、ｈｃ３Ｈ、ｈｃ４Ｍ、ｈｃ４Ｖ、ｈｃ１３Ｋ、ｈｃ１３Ｅ、ｈｃ１４Ａ、ｈｃ１４Ｔ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ１６Ａ、ｈｃ１６Ｖ、ｈｃ１６Ｄ、ｈｃ２３Ｅ、ｈｃ２３Ｇ、ｈｃ２３Ｖ、ｈｃ２３Ｔ、ｈｃ２３Ｋ、ｈｃ２３Ｒ、ｈｃ２３Ｉ、ｈｃ２３Ｐ、ｈｃ２３Ｌ、ｈｃ２３Ｓ、ｈｃ２４Ｄ、ｈｃ２４Ｇ、ｈｃ２４Ｖ、ｈｃ２４Ｔ、ｈｃ２４Ｎ、ｈｃ２４Ｓ、ｈｃ２４Ｉ、ｈｃ２４Ｐ、ｈｃ２４Ｌ、ｈｃ２４Ｆ、ｈｃ２６Ａ、ｈｃ２６Ｖ、ｈｃ２６Ｄ、ｈｃ２８Ｋ、ｈｃ３５Ｎ、ｈｃ３５Ｄ、ｈｃ３５Ｙ、ｈｃ４８Ｌ、ｈｃ４８Ｉ、ｈｃ４９Ｇ、ｈｃ４９Ｓ、ｈｃ５６Ａ、ｈｃ５６Ｖ、ｈｃ５６Ｄ、ｈｃ５８Ｓ、ｈｃ５８Ｎ、ｈｃ５８Ｉ、ｈｃ６１Ｇ、ｈｃ６１Ｖ、ｈｃ６１Ｄ、ｈｃ７９Ｇ、ｈｃ７９Ｖ、ｈｃ７９Ｄ、ｈｃ８２Ｅ、ｈｃ８２Ｋ、ｈｃ８５Ｒ、ｈｃ８８Ｄ、ｈｃ８８Ｔ、ｈｃ８８Ｓ、ｈｃ８８Ｐ、ｈｃ８８Ｇ、ｈｃ９２Ｇ、ｈｃ９２Ｖ、ｈｃ９２Ｄ、ｈｃ１０３Ａ、ｈｃ１０３Ｖ、ｈｃ１０３Ｄ、ｈｃ１０６Ｄ、ｈｃ１０６Ｇ、ｈｃ１０６Ｖ、ｈｃ１０６Ｔ、ｈｃ１０６Ｎ、ｈｃ１０６Ｓ、ｈｃ１０６Ｉ、ｈｃ１０６Ｐ、ｈｃ１０６Ｌ、ｈｃ１０６Ｆ、ｈｃ１１４Ｓ、ｈｃ１１４Ｎ、及びｈｃ１１４Ｉからなる群から選択される。

【0038】

本発明の文脈において、変異は、上記の命名法を使用して識別され、ここで、ｌｃ＝軽鎖、ｈｃ＝重鎖、番号は鎖のアミノ酸残基を指し、大文字はその部位のアミノ酸変異を表す１文字のアミノ酸コードである。したがって、例えば、第４の態様について上に列挙したアミノ酸変更において、ｌｃ９Ｎは、バリアントトラスツズマブ軽鎖の９位にあるアスパラギンを指す。

【0039】

本発明の第５の態様の実施形態では、前記アミノ酸変更はｌｃ９Ｔ、ｌｃ９Ｉ、ｌｃ９Ｒ、ｌｃ９Ｋ、ｌｃ４３Ｆ、ｌｃ４７Ｖ、ｌｃ５１Ｐ、ｌｃ５１Ｔ、ｌｃ１０１Ｄ、ｈｃ２Ｌ、ｈｃ３Ｈ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ１６Ｖ、ｈｃ２４Ｐ、ｈｃ２６Ａ、ｈｃ２６Ｖ、ｈｃ４８Ｉ、ｈｃ５８Ｓ、ｈｃ６１Ｖ、ｈｃ７９Ｖ、ｈｃ８５Ｒ、ｈｃ８８Ｇ、ｈｃ９２Ｖ、ｈｃ９２Ｄ、ｈｃ１０３Ａ、ｈｃ１０３Ｖ、ｈｃ１０６Ｖ、ｈｃ１１４Ｓ、ｈｃ１１４Ｎ、及びｈｃ１１４Ｉからなる群から選択される。

【0040】

第５の態様の一実施形態では、バリアントの軽鎖及び重鎖配列は、第５の態様に関連して上に記載されているアミノ酸変更以外のどの残基においても参照抗体の配列と異ならない。

【0041】

本発明の第６の態様は、カテプシンＳ抗体のバリアントを提供し、前記バリアントは、（ｉ）参照抗体の軽鎖アミノ酸配列と比較した場合（ここで、前記参照抗体はＦｓｎ５０３ｈである）、軽鎖配列に少なくとも２つのアミノ酸変更を有するか、（ｉｉ）Ｆｓｎ５０３ｈの重鎖アミノ酸配列と比較した場合、重鎖配列に少なくとも２つのアミノ酸変更を有するか、又は（ｉｉｉ）Ｆｓｎ５０３ｈの軽鎖アミノ酸配列と比較した場合、軽鎖配列に少なくとも１つのアミノ酸変更を有し、そしてＦｓｎ５０３ｈの重鎖アミノ酸配列と比較した場合、重鎖配列に少なくとも１つのアミノ酸変更を有し；前記アミノ酸変更のそれぞれは、バリアントＤＮＡ配列のＤＮＡセグメントから独立的にコードされるアミノ酸残基にあり、バリアントの前記ＤＮＡセグメントは、体細胞超変異誘導酵素による脱アミノ化に対して感受性のＤＮＡモチーフにおける点変異によって、参照抗体をコードする対応するＤＮＡ配列のセグメントとは異なっている。

【0042】

本発明の第６の態様の一実施形態では、前記アミノ酸変更はｌｃ１２Ａ、ｌｃ１２Ｓ、ｌｃ１２Ｔ、ｌｃ１９Ｖ、ｌｃ２８Ｒ、ｌｃ３２Ｔ、ｌｃ３２Ｉ、ｌｃ４５Ａ、ｌｃ４５Ｓ、ｌｃ４５Ｔ、ｌｃ５０Ｈ、ｌｃ５１Ｖ、ｌｃ５１Ｆ、ｌｃ５１Ｉ、ｌｃ５６Ｌ、ｌｃ５６Ｆ、ｌｃ５６Ｉ、ｌｃ５８Ｋ、ｌｃ６６Ｓ、ｌｃ６９Ａ、ｌｃ６９Ｖ、ｌｃ８１Ｔ、ｌｃ８１Ｉ、ｌｃ８１Ｎ、ｌｃ８５Ｐ、ｌｃ８５Ｓ、ｌｃ８５Ｔ、ｌｃ９０Ｌ、ｌｃ９０Ｆ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｓ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｎ、ｌｃ１０８Ｎ、ｈｃ３Ｈ、ｈｃ４Ｖ、ｈｃ４Ｍ、ｈｃ１０Ａ、ｈｃ１０Ｖ、ｈｃ１４Ａ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ２４Ｇ、ｈｃ２４Ｖ、ｈｃ３０Ｔ、ｈｃ３０Ｉ、ｈｃ３１Ｒ、ｈｃ３１Ｔ、ｈｃ３７Ｌ、ｈｃ３７Ｆ、ｈｃ４０Ｐ、ｈｃ４０Ｓ、ｈｃ５２Ｓ、ｈｃ５２Ｉ、ｈｃ５３Ｓ、ｈｃ５３Ｉ、ｈｃ８４Ｔ、ｈｃ８４Ｉ、ｈｃ９２Ｇ、及びｈｃ９２Ｖからなる群から選択される。

【0043】

本発明の第６の態様の一実施形態では、前記アミノ酸変更はｌｃ１２Ａ、ｌｃ１２Ｓ、ｌｃ１２Ｔ、ｌｃ１９Ｖ、ｌｃ４５Ｓ、ｌｃ４５Ｔ、ｌｃ５０Ｈ、ｌｃ５１Ｖ、ｌｃ５６Ｉ、ｌｃ８１Ｉ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｓ、ｌｃ９６Ｉ、ｌｃ９６Ｎ、ｌｃ１０８Ｎ、ｈｃ１０Ａ、ｈｃ１０Ｖ、ｈｃ１４Ｓ、ｈｃ３０Ｉ、ｈｃ３１Ｒ、ｈｃ３７Ｌ、ｈｃ３７Ｆ、ｈｃ４０Ｐ、ｈｃ４０Ｓ、ｈｃ５２Ｉ、及びｈｃ９２Ｇからなる群から選択される。

【0044】

本発明の第６の態様の一実施形態では、バリアントの軽鎖及び重鎖配列は、第６の態様に関連して上に記載されているアミノ酸変更以外のどの残基においても参照抗体の配列と異ならない。

【0045】

本発明の第５の態様の一実施形態では、前記バリアント抗体分子は、表２～７に列挙された抗体のいずれかについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有する。第４の態様の別の実施形態では、前記バリアント抗体分子は、表８に列挙された抗体のいずれかについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有する。そのような一実施形態では、前記バリアント抗体は、表８に列挙された抗体のいずれか１つについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有し、トラスツズマブ軽鎖及び重鎖配列と比較して、表８に列挙された前記抗体について示されているもの以外のアミノ酸変異を有さない。

【0046】

本発明の第５の態様の一実施形態では、前記バリアント抗体は、変異ｌｃ４３Ｆを有する。

【0047】

本発明の第５の態様の一実施形態では、前記バリアント抗体は、表８のバリアント抗体１９、５又は６のいずれかについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有する。そのような一実施形態では、前記バリアントは、トラスツズマブ軽鎖及び重鎖配列と比較して、表８の前記バリアント抗体について示されるもの以外のいかなるアミノ酸変異も有さない。

【0048】

本発明の第５の態様の一実施形態では、バリアント抗体は、トラスツズマブと比較して、ｌｃ９Ｋ、ｌｃ４３Ｆ、及びｈｃ１０６Ｖのアミノ酸変更を含むトラスツズマブ抗体のバリアントである。一実施形態では、バリアント抗体は、表８に列挙されているバリアント抗体１９である。

【0049】

本発明の第５の態様の別の実施形態では、バリアント抗体は、トラスツズマブと比較して、ｌｃ９Ｒ、ｌｃ４３Ｆ、及びｈｃ１１４Ｓのアミノ酸変更を含むトラスツズマブ抗体のバリアントである。一実施形態では、バリアント抗体は、表８に列挙されているバリアント抗体５である。

【0050】

本発明の第５の態様の別の実施形態では、バリアント抗体は、トラスツズマブと比較して、ｌｃ９Ｉ、ｌｃ４３Ｆ、ｌｃ１０１Ｄ及びｈｃ７９Ｖのアミノ酸変更を含むトラスツズマブ抗体のバリアントである。一実施形態では、バリアント抗体は、表８に列挙されているバリアント抗体６である。

【0051】

本発明の第６の態様の一実施形態では、前記バリアント抗体分子は、表１に列挙された抗体のいずれかについて示されるアミノ酸変異の組み合わせを有する。

【0052】

本発明の第５又は第６の態様の特定の実施形態では、前記バリアントの軽鎖及び重鎖配列は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、合計で少なくとも３つ、例えば、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つのアミノ酸変更を含む。

【0053】

本発明の第５又は第６の態様の特定の実施形態では、前記アミノ酸変更のうちの１つ又は複数は、前記バリアント抗体のフレームワーク領域にある。本発明の第５又は第６の態様の特定の実施形態では、前記アミノ酸変更の全てが、前記バリアント抗体のフレームワーク領域にある。

【0054】

本発明の第５又は第６の態様の特定の実施形態では、前記アミノ酸変更のうちの１つ又は複数は、前記バリアント抗体のＣＤＲにある。

【0055】

本発明の第５又は第６の態様の特定の実施形態では、参照抗体と比較した前記バリアント抗体分子の親和性の変化は－２より大きく、参照抗体と比較した前記バリアント抗体分子の安定性の変化は－２より大きい。本発明の第５又は第６の態様の特定の実施形態では、参照抗体と比較した前記バリアント抗体分子の親和性の変化は－１０より大きく、例えば－１５より大きく、例えば－２０より大きく、例えば－２５よりも大きい。

【0056】

本発明の第５又は第６の態様の特定の実施形態では、参照抗体と比較した前記バリアント抗体分子の安定性の変化は－１０より大きく、例えば－３０より大きく、例えば－５０より大きく、例えば－６０よりも大きい。適当には、凝集特性、融点特性又は発現レベルは、参照抗体と少なくとも２倍、３倍、１０倍異なっていてもよい。

【0057】

疑義を避けるために、負の親和性値が大きいほど、親和性は大きくなる。したがって、親和性値が－１０である抗体は、親和性値が－５である抗体よりも大きな親和性値を有すると考えられる。同様に、負の安定性値が大きいほど、安定性は高くなる。したがって、安定性値が－１０である抗体は、安定性値が－５である抗体よりも大きな安定性値を有すると考えられる。

【0058】

親和性と安定性は、任意の適当な方法で評価され得る。実施例において、本発明者らは、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒの生物製剤ツールＭａｅｓｔｒｏの一部として、残基スキャニング親和性成熟ツールを使用した。値は、親抗体に相対的であり、親和性の改善の最小値は、親和性と安定性の両方で－２ｋｃａｌ／ｍｏｌとした。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1A】図１は、Ｆｓｎ０５０３ｈ抗体の軽鎖と重鎖のアミノ酸配列を、各鎖上の潜在的な変異を表示しつつ、示している（配列番号１及び２）。二重に囲まれたアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されなかった。二重に囲まれたアスタリスク（^＊）は、同様に許容されなかった終止コドンを表す。単に囲まれたアミノ酸領域はＣＤＲである。

【図1B】図１は、Ｆｓｎ０５０３ｈ抗体の軽鎖と重鎖のアミノ酸配列を、各鎖上の潜在的な変異を表示しつつ、示している（配列番号１及び２）。二重に囲まれたアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されなかった。二重に囲まれたアスタリスク（^＊）は、同様に許容されなかった終止コドンを表す。単に囲まれたアミノ酸領域はＣＤＲである。

【図2】図２は、Ｆｓｎ０５０３ｈとカテプシンＳの間の予測されるタンパク質－タンパク質相互作用を示す模式的モデルである。

【図3-1】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-2】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-3】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-4】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-5】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-6】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-7】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-8】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-9】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-10】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-11】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図3-12】図３は、１～６個の変異について、コンビナトリアルな様式でアミノ酸変異の親和性と安定性の予測を列挙した表１を示している。青で強調表示されている変異のグループは、変化が－２よりも大きい、安定性と親和性の両方が改善されたバリアントを表している。

【図4】図４は、発現させた各バリアントと親のＦｓｎ０５０３ｈ抗体とのＥＬＩＳＡでの比較を示している。

【図5】図５は、Ｏｃｔｅｔ装置（Ｐａｌｌ）を使用してＢＬＩで測定した各バリアントの親和性（ＫＤ）測定値を親Ｆｓｎ０５０３ｈ抗体のものと並べて示している。

【図6】図６は、Ｆｓｎ０５０３ｈのバリアントの親和性ｏｎ－ｏｆｆレートマップを示している。親抗体は、白抜きの点で示されている。４．４５ｎＭの線は、親抗体と同等の親和性を表し、親和性が増加した（＜４．４５ｎＭ）任意のバリアントは、４．４５ｎＭの線の左側の領域内にある。

【図7-1】図７は、トラスツズマブ抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示しており、野生型抗体軽鎖の各位置のアミノ酸残基が太字で表示され、該当する場合には、各残基の右側の四角に潜在的な変異が示されている。二重の線で示されているアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されていない。二重の線のアスタリスク（^＊）は、同様に許可されなかった終止コドンを表している。相補性決定領域ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。

【図7-2】図７は、トラスツズマブ抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示しており、野生型抗体軽鎖の各位置のアミノ酸残基が太字で表示され、該当する場合には、各残基の右側の四角に潜在的な変異が示されている。二重の線で示されているアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されていない。二重の線のアスタリスク（^＊）は、同様に許可されなかった終止コドンを表している。相補性決定領域ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。

【図7-3】図７は、トラスツズマブ抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示しており、野生型抗体軽鎖の各位置のアミノ酸残基が太字で表示され、該当する場合には、各残基の右側の四角に潜在的な変異が示されている。二重の線で示されているアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されていない。二重の線のアスタリスク（^＊）は、同様に許可されなかった終止コドンを表している。相補性決定領域ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。

【図8-1】図８は、トラスツズマブ抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示しており、野生型抗体抗体鎖の各位置のアミノ酸残基が太字で表示され、該当する場合には、各残基の右側の四角に潜在的な変異が示されている。二重の線で示されているアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されていない。二重の線のアスタリスク（^＊）は、同様に許可されなかった終止コドンを表している。相補性決定領域ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。

【図8-2】図８は、トラスツズマブ抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示しており、野生型抗体抗体鎖の各位置のアミノ酸残基が太字で表示され、該当する場合には、各残基の右側の四角に潜在的な変異が示されている。二重の線で示されているアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されていない。二重の線のアスタリスク（^＊）は、同様に許可されなかった終止コドンを表している。相補性決定領域ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。

【図8-3】図８は、トラスツズマブ抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示しており、野生型抗体抗体鎖の各位置のアミノ酸残基が太字で表示され、該当する場合には、各残基の右側の四角に潜在的な変異が示されている。二重の線で示されているアミノ酸は、その位置での使用がまれであるため、ライブラリーにおいては許容されていない。二重の線のアスタリスク（^＊）は、同様に許可されなかった終止コドンを表している。相補性決定領域ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。

【図9】図９は、抗体のタンパク質構造にアミノ酸の変化をもたらし、親和性の増加を導く変化を抗体のＤＮＡ配列に引き起こすために、どのように体細胞超変異が使用され得るかを模式的に示している。

【図10】図１０は、残基スキャニングの実行に使用された、ヒトＨＥＲ２と複合体を形成したトラスツズマブの完全に解明された結晶構造を示している。ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＶがトラスツズマブに結合することが見出された。

【図11A-1】図１１ａは、参照トラスツズマブ抗体と比較して１つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表２を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。Δ親和性は、トラスツズマブの親和性との比較で予測されるｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギー変化（ΔΔＧ）である。Δ安定性は、トラスツズマブの安定性との比較で予測される自由エネルギー変化（ΔΔＧ）である。負のΔ親和性及び負のΔ安定性の値は、トラスツズマブと比較して改善された親和性と改善された安定性を表すと考えられる。

【図11A-2】図１１ａは、参照トラスツズマブ抗体と比較して１つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表２を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。Δ親和性は、トラスツズマブの親和性との比較で予測されるｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギー変化（ΔΔＧ）である。Δ安定性は、トラスツズマブの安定性との比較で予測される自由エネルギー変化（ΔΔＧ）である。負のΔ親和性及び負のΔ安定性の値は、トラスツズマブと比較して改善された親和性と改善された安定性を表すと考えられる。

【図11B-1】図１１ｂは、参照トラスツズマブ抗体と比較して２つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表３を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11B-2】図１１ｂは、参照トラスツズマブ抗体と比較して２つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表３を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11B-3】図１１ｂは、参照トラスツズマブ抗体と比較して２つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表３を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11B-4】図１１ｂは、参照トラスツズマブ抗体と比較して２つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表３を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11B-5】図１１ｂは、参照トラスツズマブ抗体と比較して２つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表３を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-1】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-2】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-3】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-4】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-5】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-6】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-7】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-8】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11C-9】図１１ｃは、参照トラスツズマブ抗体と比較して３つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表４を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-1】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-2】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-3】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-4】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-5】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-6】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-7】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-8】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-9】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-10】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-11】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-12】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11D-13】図１１ｄは、参照トラスツズマブ抗体と比較して４つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表５を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-1】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-2】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-3】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-4】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-5】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-6】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-7】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-8】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-9】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-10】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-11】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-12】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-13】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-14】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-15】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11E-16】図１１ｅは、参照トラスツズマブ抗体と比較して５つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表６を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-1】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-2】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-3】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-4】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-5】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-6】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-7】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-8】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-9】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-10】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-11】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-12】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-13】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-14】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-15】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-16】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-17】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-18】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図11F-19】図１１ｆは、参照トラスツズマブ抗体と比較して６つの変異を持つトラスツズマブバリアントを列挙した表７を示している。２列目において、Ｌは軽鎖を示し、Ｈは重鎖を示している。

【図12-1】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-2】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-3】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-4】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-5】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-6】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-7】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-8】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図12-9】図１２は、改善された親和性に従ってランキングされた、改善された親和性と改善された安定性の両方を有する表１～７までの１００個のトラスツズマブバリアントを列挙した表８を示している。

【図13A】図１３は、ｋｃａｌ／ｍｏｌの予測自由エネルギー変化（ΔΔＧ）を使用して、親和性に基づきスコア付けした、上位５つのトラスツズマブバリアントを模式的に示している。１番目と３番目にランキングされたバリアントには、合計５つの変異があり、ランク２と４は４つの変異を有し、最後にランク５は３つのアミノ酸変異を含んでいる。トラスツズマブが結合するＨＥＲ２のドメインＩＶはシアンで着色されている一方、ｓｃＦｖは緑、ＣＤＲは赤で着色されている。変異は、黄色でハイライトされている。

【図13B】図１３は、ｋｃａｌ／ｍｏｌの予測自由エネルギー変化（ΔΔＧ）を使用して、親和性に基づきスコア付けした、上位５つのトラスツズマブバリアントを模式的に示している。１番目と３番目にランキングされたバリアントには、合計５つの変異があり、ランク２と４は４つの変異を有し、最後にランク５は３つのアミノ酸変異を含んでいる。トラスツズマブが結合するＨＥＲ２のドメインＩＶはシアンで着色されている一方、ｓｃＦｖは緑、ＣＤＲは赤で着色されている。変異は、黄色でハイライトされている。

【図13C】図１３は、ｋｃａｌ／ｍｏｌの予測自由エネルギー変化（ΔΔＧ）を使用して、親和性に基づきスコア付けした、上位５つのトラスツズマブバリアントを模式的に示している。１番目と３番目にランキングされたバリアントには、合計５つの変異があり、ランク２と４は４つの変異を有し、最後にランク５は３つのアミノ酸変異を含んでいる。トラスツズマブが結合するＨＥＲ２のドメインＩＶはシアンで着色されている一方、ｓｃＦｖは緑、ＣＤＲは赤で着色されている。変異は、黄色でハイライトされている。

【図14】図１４は、ランキングに使用されたレポートポイントを表示した２０サンプルのセンサーグラムを示している。アッセイは２５℃で実施。

【図15】図１５は、ＨＥＲ２に結合するトラスツズマブバリアントのｏｆｆレートランキングを示すグラフを示しており、安定な結合体（最良の結合体を青で囲ってある）を同定するための安定性＿初期と安定性＿後期を示している。合計８９のサンプルが結合安定性に関して分析され、ランキングされたが、わかりやすくするために２９のみが示されている。トラスツズマブは市販の抗体物質である。野生型は、トラスツズマブの配列を持ち、全てのトラスツズマブバリアント／変異体と同時に一過的に発現された抗体である。変異体はトラスツズマブバリアントである。変異体５、６、及び１９は、表８に番号５、６、及び１９として列挙されているトラスツズマブバリアントである。アッセイは２５℃で実施。

【図16】図１６は、ＨＥＲ２に結合するトラスツズマブバリアントのｏｆｆレートランキングを示すグラフを示し、図１５に示される上位の結合体の小さなサブセットから安定な結合体を同定するための安定性＿初期と安定性＿後期を示している（これらの結合体は１００％残留線に最も近い）。合計で、１４のトラスツズマブバリアントが結合安定性に関して分析され、ランキングされた。トラスツズマブは市販の抗体である。野生型は、全てのトラスツズマブバリアント／変異体と同時に一過的に発現された物質である。変異体はトラスツズマブバリアントである。変異体５、６、及び１９は、表８に番号５、６、及び１９として列挙されているトラスツズマブバリアントである。アッセイは３７℃で実施。

【図17-1】図１７は、３７℃のランニングバッファーにおける様々なＨＥＲ２濃度（２倍段階希釈；最高濃度が曲線上に示されている）についての、非共有結合で固定されたトラスツズマブ（ａ）、野生型（ｂ）、変異体５（ｃ）及び（ｄ）変異体１９抗体の表面でモニターされた参照補正ＢＬＩ結合曲線（黒）を示している。見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）及び会合速度（ｋ_ａ）定数は、装置に付属のソフトウェアを使用して、単純な１：１相互作用モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢをセンサーグラムにグローバルフィッティング（赤）させることによって決定された。グローバルフィッティングの結果は、表９にまとめられている。

【図17-2】図１７は、３７℃のランニングバッファーにおける様々なＨＥＲ２濃度（２倍段階希釈；最高濃度が曲線上に示されている）についての、非共有結合で固定されたトラスツズマブ（ａ）、野生型（ｂ）、変異体５（ｃ）及び（ｄ）変異体１９抗体の表面でモニターされた参照補正ＢＬＩ結合曲線（黒）を示している。見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）及び会合速度（ｋ_ａ）定数は、装置に付属のソフトウェアを使用して、単純な１：１相互作用モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢをセンサーグラムにグローバルフィッティング（赤）させることによって決定された。グローバルフィッティングの結果は、表９にまとめられている。

【図18】図１８は、トラスツズマブバリアントの親和性の予測と測定の間の相関関係を模式的に示している。

【図19-1】図１９は、３７℃のランニングバッファー中、一定範囲の濃度の野生型（ａ）、変異体５（ｂ）及び（ｃ）変異体１９抗体において、非共有結合で固定されたＨＥＲ２の表面でモニターされたブランク補正ＢＬＩ結合曲線（黒）を示している。見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）及び会合速度（ｋ_ａ）定数は、装置に付属のソフトウェアを使用して、単純な１：１相互作用モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢをセンサーグラムにグローバルフィッティング（赤）させることによって決定された。グローバルフィッティングの結果は、表１０にまとめられている。

【図19-2】図１９は、３７℃のランニングバッファー中、一定範囲の濃度の野生型（ａ）、変異体５（ｂ）及び（ｃ）変異体１９抗体において、非共有結合で固定されたＨＥＲ２の表面でモニターされたブランク補正ＢＬＩ結合曲線（黒）を示している。見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）及び会合速度（ｋ_ａ）定数は、装置に付属のソフトウェアを使用して、単純な１：１相互作用モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢをセンサーグラムにグローバルフィッティング（赤）させることによって決定された。グローバルフィッティングの結果は、表１０にまとめられている。

【図20-1】図２０は、３７℃のランニングバッファー中、一定範囲の濃度の野生型（ａ）、変異体５（ｂ）、及び（ｃ）変異体１９抗体に提示された、一定範囲の濃度でコーティングされた非共有結合で固定されたＨＥＲ２の表面でモニターされた、二重参照補正ＢＬＩ結合曲線（黒）を示している。見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）及び会合速度（ｋ_ａ）定数は、装置に付属のソフトウェアを使用して、単純な１：１相互作用モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢをセンサーグラムにグローバルフィッティング（赤）させることによって決定された。グローバルフィッティングの結果が、表１１、１２及び１３にまとめられている。

【図20-2】図２０は、３７℃のランニングバッファー中、一定範囲の濃度の野生型（ａ）、変異体５（ｂ）、及び（ｃ）変異体１９抗体に提示された、一定範囲の濃度でコーティングされた非共有結合で固定されたＨＥＲ２の表面でモニターされた、二重参照補正ＢＬＩ結合曲線（黒）を示している。見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）及び会合速度（ｋ_ａ）定数は、装置に付属のソフトウェアを使用して、単純な１：１相互作用モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢをセンサーグラムにグローバルフィッティング（赤）させることによって決定された。グローバルフィッティングの結果が、表１１、１２及び１３にまとめられている。

【図21】図２１は、トランスフェクトされたＣＨＯの上清１ｍｌあたりに得られた精製ＩｇＧのｍｇとして発現されたＯｃｔｅｔイムノアッセイによるＦｓｎ０５０３バリアントの発現収量を示している。野生型はオレンジ色で示されている。

【図22】図２２は、Ｆｓｎ０５０３バリアントの融点測定値（ＴＭ１及びＴＭ２）を摂氏で示している。野生型は１位にある。

【図23】図２３は、サイズ排除クロマトグラフィーによるＦｓｎ０５０３バリアントの単分散（非凝集）分子の割合の測定値を示している。野生型はオレンジ色で示されている。

【発明を実施するための形態】

【0060】

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。

【0061】

明細書を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数又は整数の群を含むことを意味すると理解されるが、任意の他の整数又は整数の群を除外するものではない。

【0062】

本明細書で使用される場合、「ａ（一つ）」、「ａｎ（一つ）」及び「ｔｈｅ（その）」などの用語は、明らかに文脈上別段の要求がない限り、単数形及び複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「活性剤」又は「薬理学的活性剤」への言及は、単一の活性剤及び２つ以上の異なる活性剤の組み合わせを含む一方、「担体」への言及は、単一の担体と同様に２つ以上の担体の混合物などを含む。

【0063】

「ＤＮＡセグメント」という用語は、ＤＮＡ配列の一部分を指す。本発明の文脈において、ＤＮＡセグメントは、抗体分子をコードするより長いＤＮＡ配列の一部であるＤＮＡ残基の一部分であり得る。ＤＮＡセグメントは、体細胞超変異誘導酵素の配列特異的結合部位であるＤＮＡモチーフを形成するＤＮＡ残基からなっていてもよい。

【0064】

本明細書で使用される「から本質的に成る」という用語は、本発明が必ず列挙された項目を含み、本発明の基本的で新規な特性に実質的に影響を及ぼさない列挙されていない項目も含む余地があることを意味する。

【0065】

本明細書で定義される「エピトープ」は、抗体分子によって認識され、結合され得る複数のアミノ酸残基を指す。エピトープは一般に、化学的に活性な表面基から構成され、特異的な三次元構造特性と共に、エピトープの三次元構造に寄与する特異的な電荷特性を有する。

【0066】

本発明の抗体分子又は本発明において使用するための抗体分子は、非隣接エピトープに結合してもよい。「非隣接エピトープ」は、残基がポリペプチド配列の長さに沿って非連続的に間隔をあけられるか又はグループ化されるように、配列において直線的でない一連のアミノ酸残基から構成されるエピトープである。

【0067】

「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では、ペプチド結合又はアイソスターなどの修飾ペプチド結合によって共有結合された一連の少なくとも２つのアミノ酸を記述するために交換可能に使用される。ペプチド又はタンパク質を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は課されない。さらに、ポリペプチドという用語は、ペプチドのフラグメント、類似体、及び誘導体にまで及び、ここで、前記フラグメント、類似体、又は誘導体は、フラグメント、誘導体、又は類似体が由来するペプチドと同じ生物学的機能活性を保持している。

【0068】

本明細書においてポリペプチド構成要素を記述するために使用される命名法は、アミノ基（Ｎ）が各アミノ酸残基の左側に提示され、カルボキシル基が右側に提示される従来の慣行に従う。

【0069】

抗体及び抗体分子
「抗体」は、天然のものであるか部分的又は全体的に合成的に生産されたものであるかにかかわらず、免疫グロブリンである。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、又は抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質又はペプチドも包含する。これらは天然源に由来してもよく、又は部分的若しくは全体的に合成的に生産されてもよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ及びそれらのアイソタイプサブクラス、及びＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ若しくはＦｄなどの抗原結合ドメインを含むフラグメント、及び二重特異性抗体である。

【0070】

抗体は多くの方法で改変することができ、「抗体」及び「抗体分子」という用語は、必要な特異性を有する結合ドメインを有する任意の結合メンバー又は物質を包含すると解釈されるべきである。本発明の抗体分子又は抗体分子において使用するための抗体分子は、モノクローナル抗体、又はフラグメント、誘導体、機能的同等物又は相同体であり得る。この用語は、天然のものであるか完全に又は部分的に合成されたものであるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。したがって、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物を含むキメラ分子が含まれる。

【0071】

抗体の定常領域は、任意の適当な免疫グロブリンサブタイプのものであり得る。特定の実施形態では、ヒト免疫グロブリン分子が使用される場合、抗体のサブタイプはＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥクラスのものであり得る。そのような抗体はさらに、任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に属し得る。

【0072】

抗体全体のフラグメントは、抗原結合の機能を果たすことができる。そのような結合フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１抗体ドメインを含むか、又はそれらからなるＦａｂフラグメント；単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能とするペプチドリンカーによってＶＨドメインとＶＬドメインが連結されている一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；並びに、遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異性フラグメントであり得る二重特異性抗体である。

【0073】

特定の実施形態では、ヒト化抗体が使用され得る。ヒト化抗体は、非ヒト抗体の超可変領域とヒト抗体の定常領域を有する改変抗体であってもよい。したがって、結合メンバーは、ヒト定常領域を含み得る。超可変領域以外の可変領域もまた、ヒト抗体の可変領域に由来してもよく、及び／又は非ヒト抗体に由来してもよい。他の場合には、可変領域全体が非ヒト抗体に由来してもよく、抗体はキメラ化されていると言われる。

【0074】

モノクローナル抗体や他の抗体を取得し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を生産することが可能である。そのような技法は、異なる免疫グロブリンの定常領域、又は定常領域とフレームワーク領域に対する抗体の免疫グロブリン可変領域、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを導入することを含み得る。ハイブリドーマ又は抗体を産生する他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受けてもよく、これは、産生される抗体の結合特異性を変えることも、変えないこともある。

【0075】

抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ラクダ抗体、サメ抗体及びインビトロ抗体からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、抗原結合フラグメントが使用され得る。抗原結合フラグメントは、前述の抗体のいずれかに由来し得る。特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント及びｄＡｂフラグメントからなる群から選択される。特定の実施形態では、抗体は、２つの完全な重鎖及び２つの完全な軽鎖、又はそれらの抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態では、抗体は、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ、又はそれらの抗原結合フラグメントのものである。抗体がアイソタイプＩｇＧのものである特定の実施形態では、抗体は、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ３、又はそれらの抗原結合フラグメントのものであり得る。特定の実施形態では、抗体は、サブタイプＩｇＧ４、又はその抗原結合フラグメントのものである。

【0076】

抗体の生産
抗体は、多くの技術によって提供され得る。例えば、抗原への結合特異性を有するアミノ酸配列を同定するために、ファージディスプレイベースのバイオパニングアッセイなどのコンビナトリアルなスクリーニング技術が使用され得る。このようなファージディスプレイバイオパニング技術は、糸状菌の表面に抗体結合フラグメントを提示することによって、免疫選択を模倣した手順で適当なエピトープ結合リガンドを同定する方法に利用される、ファージディスプレイライブラリーの使用を伴う。特異的な結合活性を有するファージが選択される。その後、選択されたファージは、キメラ、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、又はヒト抗体の生産に使用され得る。抗体は、当技術分野で知られている方法を使用して、抗原に結合するそれらの能力について試験され得る。

【0077】

本発明で使用するための抗体又は抗原フラグメントはまた、化学合成によって全体的又は部分的に生成されてもよい。抗体は、十分に確立された標準的な液相又は好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に調製することができ、その一般的な説明は広く入手可能であり、当業者にはよく知られている。さらに、それらは溶液中で、液相法によって、又は固相、液相、及び溶液化学の任意の組み合わせによって、調製されてもよい。

【0078】

本発明における使用に適した抗体又は抗体フラグメントを生産する別の便利な方法は、発現系における核酸の使用によって、それらをコードする核酸を発現させることである。

【0079】

抗体は、抗体の人工レパートリーを生産するための抗体遺伝子の突然変異誘発によって生成されてもよい。この技術は、抗体ライブラリーの調製を可能とする。特定のエピトープに対して特異性を有する結合分子を同定するために、人工ｓｃＦｖレパートリーなどの免疫グロブリンの人工レパートリーが、免疫グロブリン源として使用されてもよい。

【0080】

レパートリーを生成する方法は、当該技術分野おいて十分に特徴付けられている。

【0081】

抗体ライブラリーを生成する任意の適当な手段が、本発明と併せて使用され得る。ファージディスプレイ技術に代表されるような、大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールが当技術分野において知られている。繊維状バクテリオファージの表面に多様なペプチド配列が提示されるこのような系は、標的抗原に結合する特異的な抗体フラグメントのインビトロ選択及び増幅のための抗体フラグメント（及びそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作出するために有用であることが証明されている。ＶＨ及びＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム空間に誘導するリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結され、結果として得られる抗体フラグメントが、バクテリオファージの表面に、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩ）への融合物として提示される。或いは、抗体フラグメントは、ラムダファージキャプシド（ファージ本体）の外部に提示される。ファージベースのディスプレイ系の利点は、それらが生物学的系であるため、単に選択されたライブラリーメンバーを含むファージを細菌細胞で増殖させることにより、選択されたライブラリーメンバーを増幅できることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列が、ファージ又はファージミドベクターに含まれているため、配列決定、発現及びその後の遺伝子操作が、比較的簡単である。

【0082】

バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリー及びラムダファージ発現ライブラリーの構築方法は、当技術分野においてよく知られている。

【0083】

ポリペプチドを生産するための方法は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、次いで、培養物から発現されたポリペプチドを回収することを含み得る。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順が、使用される宿主細胞の種類や、ポリペプチドが細胞内型、膜結合型、又は宿主細胞から分泌される可溶型であるかどうかなどといった要因に応じて変化することを認識するであろう。

【0084】

任意の適当な発現系が使用され得る。ベクターは、哺乳動物、鳥類、微生物、ウイルス、細菌、又は昆虫の遺伝子に由来するものなど、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本発明のポリペプチド又はフラグメントをコードするＤＮＡを含んでいてもよい。調節配列がＤＮＡ配列に機能的に関係している場合、ヌクレオチド配列は作動可能に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。所望の宿主細胞での複製する能力を与える複製起点、及び形質転換体を同定するための選択遺伝子が一般に、発現ベクターに組み込まれる。

【0085】

さらに、適当なシグナルペプチド（天然又は異種）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるように、インフレームで本発明の核酸配列に融合することができる。目的の宿主細胞において機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、翻訳中にポリペプチドから切断されるが、細胞からのポリペプチドの分泌を可能にする。

【0086】

ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、高等真核細胞及び酵母を含む。また、原核生物の系も適している。

【0087】

哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞は、宿主細胞としての使用に特に好ましい。ＣＨＯ細胞は、その培養とトランスフェクションの容易さから、タンパク質の生産に広く用いられている。ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞は、非常に高密度にまで増殖させることができ、タンパク質の高発現を可能にする浮遊細胞株である。目的のプラスミドＤＮＡは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬）と複合体を形成させてＤＮＡを凝縮させることによって、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ得る。この凝縮したＤＮＡは、エンドサイトーシスによってＥｘｐｉＣＨＯ細胞に入り、核で発現される。発現されたタンパク質は、細胞培養上清に存在し、適切な日数が経過した後に回収される。

【0088】

核酸
本発明に従った使用のための核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができ、そして全体的又は部分的に合成されたものであり得る。好ましい態様において、本発明で使用するための核酸は、上記で定義された本発明の抗体又は抗体フラグメントをコードする。当業者は、本発明の抗体分子又は本発明において使用するための抗体分子をなおも提供する核酸への置換、欠失、及び／又は付加を決定することができるであろう。

【0089】

本発明において使用するための抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列は、当業者によって容易に調製され得る。これらの技術は、（ｉ）例えばゲノム源からそのような核酸のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、又は（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製を含む。抗体フラグメントをコードするＤＮＡは、コード化ＤＮＡを取得すること、発現される部分のいずれかの側の適当な制限酵素認識部位を同定すること、そしてＤＮＡから前記部分を切り出すことを含む、当業者に知られている任意の適当な方法で生成及び使用され得る。次に、その部分は、標準的な市販の発現系において適当なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。別の組換えアプローチは、適当なＰＣＲプライマーによりＤＮＡの関連部分を増幅することである。改変ペプチドの発現を導くため、又は核酸を発現するために使用される宿主細胞におけるコドン選好を考慮に入れるために、例えば部位特異的変異誘発を使用して、配列の改変を行うことができる。

【0090】

核酸は、上記のように少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物として含まれていてもよい。構築物は、上記のような１つ又は複数の構築物を含む組換え宿主細胞内に含まれ得る。発現は、核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、うまい具合に達成され得る。発現による生産に続いて、抗体又は抗体フラグメントは、任意の適当な技術を使用して単離及び／又は精製され、次いで適切に使用されてもよい。

【0091】

様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系が、よく知られている。適当な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫及びバキュロウイルスの系を含む。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞を含む。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。大腸菌などの原核細胞における抗体及び抗体フラグメントの発現は、当技術分野で十分に確立されている。培養中の真核細胞における発現もまた、結合メンバーの生産のための選択肢として当業者に利用可能である。抗体を生産するための一般的な技術は、この分野の当業者によく知られている。

【0092】

本発明の特定の実施形態では、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え核酸が提供される。定義により、そのような核酸は、コーディング一本鎖核酸、前記コーディング核酸及びそれに対する相補的核酸からなる二本鎖核酸、又はこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含む。

【0093】

さらに、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然に存在する重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメイン、又はその変異体をコードする本物の配列を有する、酵素的又は化学的に合成された核酸であり得る。
本発明の実施形態を添付の図を参照して、例示としてのみ、ここに説明する：

【実施例】

【0094】

材料及び方法
ライブラリーの設計
ヒトの体内で抗体内に変異を生じさせる役割を果たすＡＩＤ酵素によって認識される３’から５’の鎖における特定のＤＮＡ配列モチーフＲＧＹＷと５’から３’の鎖におけるＷＲＣＹを検索して、ヒトにおける天然の体細胞超変異を模倣することにより、抗体ライブラリーを（ｉ）ヒト化抗カテプシンＳ抗体、Ｆｓｎ０５０３ｈ（Ｆｕｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ベルファスト）（Ｋｗｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１年、１０：１４７）及び（ｉｉ）トラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）のそれぞれについて生成した。

【0095】

ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列モチーフＲＧＹＷの２位のグアニン又はＤＮＡ配列モチーフＷＲＣＹの３位のシトシンに導入された点変異を有しており、ヌクレオチドが任意の他のヌクレオチドに変異している。ヒトのＡＩＤ酵素は、これらの位置に自然突然変異を導入する。これは、単一の位置のアミノ酸に可能な変化を引き起こすことができる。抗体配列全体にわたって天然に可能な全てのアミノ酸を生成して、初期ライブラリーを形成するために、これらの可能な全ての変異が、抗体ＤＮＡ配列全体にわたって３’から５’及び５’から３’の鎖の両方向で同定された。

【0096】

次に、新たに生成されたアミノ酸配列から、脱アミド化部位、異性化部位、ｎ－結合型グリコシル化部位、及び酸化部位など、任意の認識されている配列の負担を取り除くことにより、各ライブラリーの大きさを管理した。

【0097】

分子ドッキング
各ライブラリーについて、Ｍａｅｓｔｒｏ １１．７（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）の抗体予測ツールを使用して、ホモロジーモデリングを実行し、重鎖及び軽鎖可変鎖領域のアミノ酸配列に基づいて抗体モデルを生成した。抗原はＰＤＢからインポートした。Ｆｓｎ０５０３ｈの場合、発明者らは、結合した薬物（ＰＤＢコード：３ＭＰＥ）を伴うＣ２５Ｓ変異を有するヒトカテプシンＳ（ＣａｔＳ）の結晶構造をインポートした。トラスツズマブバリアントのライブラリーの場合、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）（ＰＤＢコード：１Ｎ８Ｚ）の細胞外ドメインを使用した。

【0098】

抗体モデルと抗原モデルの両方について、タンパク質調製ウィザード（Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を使用して、結合次数を割り当て（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（ＣＣＤ）データベースを使用）、水素を追加し、金属へのゼロ次結合を作出し、ジスルフィド結合を作出し、セレノメチオニンをメチオニンに変換し、Ｐｒｉｍｅを使用して欠落している側鎖とループを埋め、Ｅｐｉｋを使用してｈｅｔ状態を生成した。ＰｒｏｔＡｓｓｉｇｎ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を使用して、構造をさらに洗練し、ヒドロキシル、アスパラギン、グルタミン、及びヒスチジンの状態を定義した。水以外との結合が３つ未満の水は除去した。最後に、ＯＰＬＳ３ｅ力場を使用して構造を最小化した。（Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）。

【0099】

タンパク質－タンパク質ドッキングツールのＰｒｉｍｅを使用して、カテプシンＳを抗体モデルの表面にドッキングさせた。抗体のＣＤＲ領域のみを分子ドッキングのために考慮した。非ＣＤＲ領域はマスクした。Ｃａｔ Ｓのエピトープに関するインビトロ情報を使用して、ランクに基づき、（タンパク質相互作用分析ツールを使用した）形状の相補性と表面相互作用の洞察から、適当なドッキングした配置を選択した。

【0100】

同様に、トラスツズマブバリアントについて、タンパク質－タンパク質ドッキングツールのＰｒｉｍｅを使用して、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）（ＰＤＢコード：１Ｎ８Ｚ）の細胞外ドメインを抗体モデルの表面にドッキングさせた。抗体のＣＤＲ領域のみを分子ドッキングのために考慮した。非ＣＤＲ領域はマスクした。ランクに基づき、（タンパク質相互作用分析ツールを使用した）形状の相補性と表面相互作用の我々の洞察から、適当なドッキングした配置を選択した。

【0101】

コンビナトリアルな変異の分析
抗体－抗原複合体のドッキングした配置に対して、残基スキャニングを実施した。抗原に対する抗体の親和性を高め、安定性を高めるために、高度に保存された残基を避けて、情報に基づいた変異を抗体に対して行った。

【0102】

残基スキャニングはまず、元の構造から単一のアミノ酸が変異したモデルを生成することによって行い、野生型Ａｂから最大６つの同時変異まで（同じ変異で）繰り返した。残基変異ツールは、元の野生型抗体－抗原複合体と比較した変異体の安定性と親和性を計算した。

【0103】

次に、バリアントを野生型と比較した親和性の違いと安定性の違いによって分類した。安定性の違いと親和性の違いについて－２の閾値より低いスコアを選択し、２つのスコアの組み合わせに基づいてランキングした（親和性の違いを優先）。

【0104】

Ｆｓｎ５０３ｈ抗体及びトラスツズマブ抗体の最良のバリアントを合成し、インビトロで分析した。

【0105】

抗体合成
一過性トランスフェクション：
５００ｍｌの通気した三角フラスコ中のＥｘｐｉＣＨＯ発現培地において１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ_２で、懸濁液適合ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を４～６×１０^６細胞／ｍｌでルーチン的に培養した。Ｆｓｎ０５０３ｈのバリアントのそれぞれについて、１μｇ／ｍｌのＤＮＡを遠心分離管内で４％（ｖ／ｖ）ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭで希釈した。別のチューブで、０．３２％（ｖ／ｖ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを３．７％ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭで希釈した。次に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ／ＯｐｔｉＰＲＯミックスをＤＮＡ／ＯｐｔｉＰＲＯミックスに加え、室温で３分間インキュベートした後、１２５ｍｌの通気した三角フラスコ中、最終密度６×１０^６細胞／ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞２５ｍｌに加えた。トランスフェクトされた各培養物を３７℃、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍで一晩培養した。トランスフェクションの２０時間後、細胞に０．６％（ｖ／ｖ）ＥｘｐｉＣＨＯエンハンサーと２４％（ｖ／ｖ）ＥｘｐｉＣＨＯフィードを補充した。次に、培養物を３２℃、５％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍのインキュベーターに移した。培養物は４０００ｒｐｍで４０分間、１８℃で遠心分離することにより回収した。

【0106】

精製：
１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ）を充填したＴｒｉｃｏｒｎ ５／５０カラム（ＧＥ）、続いて１０ｍｌ（２×５ｍｌ）のＨｉｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（Ｄｅｓａｌｔ）カラム（ＧＥ）を使用して、２段階のＦｓｎ０５０３ｈ ＷＴ及びバリアント抗体の精製を行った。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＰｒｉｓｍＡ親和性媒体は、その高いｍＡｂ結合と特異性の特性と、効率的な定置洗浄（ＣＩＰ）のためのアルカリ耐性のために選択された。別段明記しない限り、全てのステップを４ｍｌ／分の流速を使用して室温で実施した。ローディング後（ＡＫＴＡサンプルポンプを使用して実施）、プロテインＡカラムを１０カラム量（ＣＶ）のＰＢＳで洗浄し（逆流モード）、続いて１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０によるワンステップ溶出を行った（逆流モード）。２８０ｎｍで吸光度が１２０ｍＡＵを超えたときにプロテインＡ溶出液を２ｍｌループに回収し（１０ｍｍフローセルを備えたＡＫＴＡ）、事前に平衡化したＤｅｓａｌｔカラムに直ちに注入した。Ｄｅｓａｌｔピーク溶出は、溶出液の吸光度が１００ｍＡＵを超えたときに、２～８℃で９６ウェル２ｍｌブロック中に回収した。また、相互汚染を回避するために、自動化プロセスに親和性カラムと脱塩カラムの両方のＣＩＰを含めた。ＣＩＰは、０．２ＭのＮａＯＨを使用して、全ての接触経路について各サンプル間で実施した（カラムの洗浄には逆流モードを使用した）。

【0107】

発現のレベルは、培養培地１ｍｌあたりの精製後の物質の総収量として決定した。

【0108】

トラスツズマブバリアントを同様な技術を使用して合成した。

【0109】

親和性ランキング
酵素結合免疫吸着アッセイ：
ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを４℃で２４時間、ＰＢＳ中１ｇ／ｍｌの６６種の０５０３バリアントでコーティングした。ＥＣ５０の結果を得るために、バリアントをＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍｌ～１ｎｇ／ｍｌで段階的に希釈し、同じものを２つコーティングした。標準曲線は４℃で２４時間、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌでコーティングした親０５０３抗体を使用して調製した。２４時間後、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ２００μｌを各ウェルに加え、除去して、３回交換した。２００ｎｇ／ｍｌのＣａｔ Ｓ抗原１００μｌを各ウェルに加え、ＲＴ、１５０ｒｐｍで１時間３０分間振盪させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、乾燥させた。５μｇ／ｍｌの抗ｈｉｓ－ＨＲＰを１００μｌ各ウェルに加え、１５０ｒｐｍ、ＲＴで１時間３０分間振盪させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回、ＰＢＳで１回洗浄し、乾燥させた。ＴＭＢ１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１０分間インキュベートした後、１ＭのＨＣＬを５０μｌ加え、プレートの吸光度を４５０ｎｍで測定した。

【0110】

Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムを使用した親和性ランキング（Ｆｓｎ５０３ｈバリアント）：
親和性ランキングアッセイは、まず抗ヒトＯｃｔｅｔバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ部品番号１８－５０６０）を使用してＩｇＧを捕捉し、続いてＨＢＳ－ＥＢＴバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中で２分間のベースラインステップにより行った。次に、ｍＡｂ捕捉バイオセンサーを２００ｎｇ／ｍｌの組換えカテプシンＳ抗原を含むウェルに１０分間沈め（会合ステップ）、続いてランニングバッファー中で１０分間の解離ステップを行った。二重参照補正を可能にするために、ＩｇＧ捕捉センサーをバッファーのみを含むウェルに浸し、ブランクセンサーも抗原を含むウェルに浸した。この参照は、捕捉ＩｇＧの自然な解離とセンサー表面への抗原の非特異的結合の両方を補償する手段を提供した。全てのステップは、ＨＢＳ－ＥＢＴバッファー中２５℃で、１０００ｒｐｍの一定流速で実施した。各サンプルに対して新しいセンサーを使用した。解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して計算した。使用した消耗品は全て、ＦｏｒｔｅＢｉｏの推奨品であった。

【0111】

バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム）を用いた抗体の定量化：
ＩｇＧ含有量を測定するために、２００μＬ量（０．０６～５１２μｇ／ｍｌの範囲）の抗体標準とＩｇＧ含有細胞上清（検量線の測定範囲内で希釈）を１×ＨＢＳ－ＥＢＴバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）を用いて２つ調製し、９６ウェルブラックマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ部品番号６５５２０９）のウェル中に配置した。プロテインＡバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＰＮ １８－５０１０）を使用して、全てのサンプル及び標準を２回測定した。プレートをＯｃｔｅｔに設置し、サーモスタット付きチャンバー内で２５℃に平衡化させた。実行は、センサーをウェル中に配置することによって開始し、全てコンピュータ制御下で、層の厚さ（ナノメートル、ｎｍ）の経時変化を測定した。データは、一度に８つのサンプル（１つのプレートカラムを同時に測定）の各セットについて４００～１０００ｒｐｍの流速（軌道流）で１８０～６００秒間取得した。Ｏｃｔｅｔ Ｕｓｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．１を使用して、データを自動的に処理した。測定時間と流速は、必要な感度に応じて変更した。

【0112】

バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム）を使用した親和性ランキング（トラスツズマブバリアント）：
親和性ランキングアッセイは、まず抗ヒトＯｃｔｅｔバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ部品番号１８－５０６０）を使用して^＊ＩｇＧを捕捉し、続いてＨＢＳ－Ｐ＋バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中で２分間のベースラインステップにより行った。次に、ｍＡｂ捕捉バイオセンサーを５ｎＭの組換えＨＥＲ２（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｐ／Ｎ．Ｈ５２２５）抗原を含むウェルに１５分間沈め（会合ステップ）、続いてランニングバッファー中で２０分間の解離ステップを行った。二重参照補正を可能にするために、ＩｇＧ捕捉センサーをバッファーのみを含むウェルに浸し、ブランクセンサーも抗原を含むウェルに浸した。この参照は、捕捉ＩｇＧの自然な解離とセンサー表面への抗原の非特異的結合の両方を補償する手段を提供した。ステップは、ＨＢＳ－ＥＢＴバッファー中２５℃又は３７℃のいずれかで、１０００ｒｐｍの一定流速で実施した。各サンプルに対して新しいセンサーを使用した。解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して計算した。使用した消耗品は全て、ＦｏｒｔｅＢｉｏの推奨品であった。

【0113】

^＊同様なローディングレベルを可能とするために、（上記のようにして）定量化したＩｇＧ含有細胞上清を同一の濃度に希釈した。

【0114】

バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム）を用いたＫ_Ｄ測定：
速度論的アッセイは、まず抗ヒトＦｃ Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを使用してＩｇＧを捕捉し、続いてＨＢＳ－Ｐ＋バッファーのランニングバッファーでそれぞれ２分間の、２つのベースラインステップを行うことによって実施した。次に、ｍＡｂ捕捉バイオセンサーを、様々な濃度のＨＥＲ２を含むウェルに１５分間沈め、続いてランニングバッファー中で２０分間解離させた。二重参照補正を可能にするために、ＩｇＧ捕捉センサーをバッファーのみを含むウェルに浸し、ブランクセンサーも一連の濃度の抗原を含むウェルに浸した。この参照は、捕捉ＩｇＧの自然な解離とセンサー表面への抗原の非特異的結合の両方を補償する手段を提供した。全てのステップは、３７℃の動態バッファー中、１０００ｒｐｍの一定流速で実施した。

【0115】

融点の決定
抗体は通常、集合した分子の異なる部分の熱変性の結果として、ＴＭ１及びＴＭ２と呼ばれる２つの測定可能な融点を分析において示す。これらの値をサーマルシフトアッセイによって決定した。５μｌのＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを含む溶液（［ＰＢＳ、ｐＨ７．４で１／２００に希釈）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及び４５μｌの０．３ｍｇ／ｍｌの抗体をロープロファイルＰＣＲチューブ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；ＴＬＳ０８５１）に添加した。チューブを光学式超透明シーリングキャップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；ＴＣＳ０８０３）で密封し、ｉ－Ｃｙｃｌｅｒ ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で２０℃～９０℃まで１℃刻みで加熱した。プレートのウェルの蛍光変化を電荷結合（ＣＣＤ）カメラで同時にモニターした。励起波長と発光波長は、それぞれ４８５ｎｍと５７５ｎｍであった。タンパク質のアンフォールディング遷移温度の中点Ｔ_ｍは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｉＱ５ソフトウェアを使用して計算した。

【0116】

単分散性の決定
抗体調製物内の免疫グロブリンの個々の遊離分子として定義される、各バリアントの単分散性のレベルもまた、野生型分子とは異なることが示された。この測定値は、抗体分子の凝集傾向の指標として一般的に使用される。凝集は、タンパク質分子が多量体複合体へと会合し、時間の経過とともに抗体調製物の溶解性と活性を低下させる傾向であり、溶液中の抗体分子の安定性に寄与する重要な属性である。

【0117】

これを、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した抗体溶液において決定した。リン酸緩衝生理食塩水を使用して全てのサンプルを最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。抗体の高度に精製されたサンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００増加１０／３００ＧＬゲル濾過カラムに個別にローディングした。５０μｌのサンプルを注入し、カラム流速を０．７５μｌ／分に維持した。分離と平衡化のステップを２２℃のリン酸緩衝生理食塩水中で行った。タンパク質のピークを２８０及び２１４ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルをＵｎｉｃｏｒｎエミュレーションソフトウェアパッケージ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。結果は、各ピークのＶ_ｒ（ｍｌ）及び相対ピーク面積（％）として報告されている。

【0118】

実施例１＿カテプシンＳ抗体のバリアント
ライブラリーの設計
図１に示すように、Ｆｓｎ０５０３ｈ抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのＤＮＡ配列を分析して、体細胞超変異中に変異を受けやすいモチーフを調べ、これらの変異の結果に対応する潜在的なアミノ酸を親配列の上にプロットした。ＤＮＡ変異の結果として生成される望ましくないアミノ酸又は終止コドンを同定した。

【0119】

フレームワーク領域内にＣＤＲよりも多くの変異があり、特にＣＤＲ－Ｈ３が機能的な変異を持たないことは驚くべき発見であった。

【0120】

分子ドッキング
親のＦｓｎ０５０３ｈ抗体可変ドメイン（Ｋｗｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１年、１０：１４７）を、方法に記載されているようにして、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ分子ドッキングソフトウェアを使用してカテプシンＳタンパク質とドッキングさせた。ドッキング手順の結果を図２に示す。

【0121】

コンビナトリアルな変異誘発
ドッキングされた構造内にアミノ酸残基の変異を導入し、親和性と安定性の両方の相対的な違いを予測した。安定性又は親和性のさらなる利益が予測されなくなるまで、導入する変異の数を増やした。コンビナトリアルな変異誘発の結果を図３に示す。本発明者らは、親和性及び安定性の両方に予測される改善を有する６６のバリアントを同定した。次に、方法に記載されているようにして、これらのバリアントをコードするＤＮＡを合成し、抗体を発現させ、精製した。

【0122】

ＥＬＩＳＡ
精製したバリアントのそれぞれを、組換えカテプシンＳタンパク質への結合についてＥＬＩＳＡにより分析した。結果（図４）は、１２のバリアントが親のＦｓｎ０５０３ｈよりも高い相対ＯＤを有することを示しており、カテプシンＳ標的に対する親和性がより高いことを潜在的に示している。

【0123】

親和性ランキング
親Ｆｓｎ０５０３ｈ抗体との各バリアントの正確な親和性の比較を決定するために、カテプシンＳとの相互作用を、方法に記載されているようにして、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてＢＬＩにより測定した。

【0124】

結果は、Ｆｓｎ０５０３ｈ抗体の平均読み取り値に対して測定した場合、バリアントの約５０％が改善した親和性を有することを示している（図６）。会合（Ｋｏｎ）と解離（Ｋｄｉｓ）速度を図５に示す。

【0125】

発現への影響
上記のようにＣＨＯにおいて発現された６６のバリアントはまた、野生型と比較して一定範囲の発現レベルを示した。ＩｇＧレベルは、精製後にＢＬＩ Ｏｃｔｅｔ装置上での定量的ヒトＩｇＧイムノアッセイによって決定され、精製上清量に対する総量を表している。

【0126】

融点の変化
６６のバリアントは、抗体分子に関連する安定性の特性に一定範囲の変動も示した。これは、免疫グロブリン分子で一般的に観察される２つの融点における融解温度プロファイルの変化を含む。融点測定の結果を図２２に示す。Ｍｕｔ ６やＭｕｔ ４９などの一部のバリアントは、単一の融解温度のみが観察可能であり、明確な２相融解パターンを失っているように見えることは注目に値する。

【0127】

単分散性の変化
この特性は、６６のバリアントの分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって分析され、図２３に示されるように、分析されたバリアント間に一定範囲の値を示している。
実施例２－トラスツズマブバリアント

【0128】

ライブラリーの設計
ヒトで自然に生じる体細胞超変異に基づき、トラスツズマブの抗体バリアントのライブラリーを生成した。図９に示すように、上記の方法を使用して、体細胞超変異を再現し、トラスツズマブのＤＮＡ配列に自然に生じる変異を生成し、その後、それぞれのアミノ酸変異へと翻訳した。これらの変異を、相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域の両方の特異的な部位における潜在的な変異のライブラリーにまとめ（図７及び８）、この方法の潜在的なアミノ酸の結果を親配列の横に詳細に示した。ＤＮＡ変異の結果として生成される任意の望ましくないアミノ酸又は終止コドンを同定した。

【0129】

ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）（ＰＤＢコード：１Ｎ８Ｚ）の細胞外ドメインと複合体を形成したトラスツズマブの完全に解明された結晶構造を図１０に示す。図７及び８に示したトラスツズマブ変異のライブラリーを変異体スキャニングに使用した。まず単一のアミノ酸変異を分析し、続いて２つの変異から合計６つの変異まで重鎖と軽鎖を分析することにより変異体を連続的にスキャンし、その後、親和性と安定性に基づいてバリアントをランキングした。Ｆｓｎ５０３ｈライブラリーと同様に、方法に記載したようにして、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ分子ドッキングソフトウェアを使用した。

【0130】

ドッキングされた構造内にアミノ酸残基の変異を導入し、親和性と安定性の両方の相対的な違いを予測した。安定性又は親和性のさらなる利益が予測されなくなるまで、導入する変異の数を増やした。コンビナトリアルな変異誘発の結果を、図１１及び１２の表に詳細に示す。トラスツズマブの合計５５８の潜在的なバリアントが、改善された親和性と改善された安定性の両方を有することが判明した。上位にランキングされた５つのバリアントの親和性を図１３に示す。これらのバリアントの中で、重鎖と軽鎖にわたる合計５つの変異が、最も一般的であることが判明した。予測された自由エネルギー変化（ΔΔＧ）を使用して、バリアントを親抗体の親和性と比較してスコアリングした。

【0131】

Ｏｆｆレートランキング
８９のトラスツズマブバリアントのパネルを、バイオレイヤー干渉法を使用してＨＥＲ２抗原への結合についてスクリーニングした（詳細については、材料及び方法を参照）。レポートポイントをカラーバーとして示した２０サンプルのセンサーグラムを図１４に示す。図１５は、安定性＿後期に対してプロットした安定性＿初期のレポートポイントの散布図を示している。結合安定性が高く、解離が遅い最高の結合体（合計１４）が、青い円で強調表示されている。より生物学的に関連性のあるデータを提供するために、３７℃でこれらの変異体に対してｏｆｆレートランキング実験を繰り返した（図１６）。変異体１９は、ＷＴトラスツズマブと比較して安定性が向上しているようであり、速度論的分析に使用された。

【0132】

ＫＤの決定
サンプルは全て、新たに調製したランニングバッファーで希釈した。トラスツズマブ又はバリアント（変異体）のいずれかを、記載の捕捉方法（材料及び方法を参照）を使用して、一連のバイオセンサーの表面に固定化した。結合応答を生成するために、ＨＥＲ２を表面に通した。ＨＥＲ２相互作用の結合データをバイオセンサーにより３７℃で回収した。結果を全体的にフィッティングし、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、及びＫ_Ｄの最良の値を取得するために、ＨＥＲ２抗原の希釈系列（５ｎＭ～０．０７８ｎＭ）を会合ステップで使用した。表面に固定したＩｇＧへの抗原の結合に関する応答データを１：１結合モデルに適合させ、データトレースを生成した（赤－図１７を参照）。実験は重複して２回行い、平均速度論的パラメーターを表９にまとめた。例えば、データは、変異体１９が、野生型の対照及び市販のトラスツズマブと比較して、見かけ上、約２倍の親和性の増加を示すことを示している。親和性の増加は主に、野生型抗体の１．２０Ｅ－０４と比較して、より遅いＫｄ、６．０４Ｅ－０５によるものである。図１８は、改善された親和性と安定性のインシリコ予測によって選択されたトラツズマブバリアントの実際の親和性と予測された親和性の比較を概略的に示している。実際のＯｃｔｅｔ親和性ランキングは、上位２０の予測とかなり良く相関している。

【0133】

【表1】

【0134】

Ｒ^２値は、適合と実験データがどのくらい良く相関するかを示し、０．９５を超えると適合が良いと考えられる；Ｘ^２は、偏差の２乗の合計であり、一般には３未満となるべきである；Ｘ^２は、実験データと近似曲線との間の誤差の尺度である。Ｘ^２が小さいほど、適合性が良いことを示す。

【0135】

モノマーのＫＤの決定
上位のバリアントの親和性をさらに検証し、上位２つのバリアント（ＭＵＴ ５及びＭＵＴ １９）内の親和性の測定値に対する結合力の寄与を理解するために、これらの分子を酵素的切断によって、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及びＣＨ１定常ドメインからなり、１分子ごとに単一の抗原結合ドメインを有する単量体型のフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントとして調製した。

【0136】

最初の測定は、プローブを２．５μｇ／ｍｌのビオチン化Ｈｅｒ２組換えＦｃ融合タンパク質でコーティングした後に行った。Ｈｅｒ２表面への結合について、一定範囲の濃度の３つの単量体抗体のそれぞれを評価した。この場合には、二重参照は適用しなかった。センサーグラムデータを図１９に、結果の速度論的計算（１：１モデル）を表１０に列挙する。

【0137】

【表2】

【0138】

次に、０．６２５、１．２５、又は２．５μｇ／ｍｌのビオチン化Ｈｅｒ２組換えＦｃ融合タンパク質でコーティングすることにより、センサーを調製した。次に、精製されたＦａｂフラグメントを、これらのプローブへの結合について試験した。これらの測定のセンサーグラムトレースを図２０に示し、詳細を表１１、１２、及び１３に示す。このデータについては、前の実験とは異なり、プローブ表面での非特異的相互作用による任意のドリフトを除外するために、二重参照とした。

【0139】

【表3】

【0140】

【表4】

【0141】

【表5】

【0142】

親和性の値がコーティング濃度の結果として変化するように見えるため、これらのモノマー分析から、ＷＴトラスツズマブ分子と比較したＭＵＴ ５及びＭＵＴ １９の親和性の増加に明確な値を割り当てるのは困難である。理論に拘束されることは望まないが、これは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ装置の感度限界での動作の問題によるものと考えられる。

【0143】

結論
本発明の方法を使用して、本発明者らは、抗体バリアントの非常に大きな物理的ライブラリーを生成して、その後に選択／スクリーニングプロセスを行う必要無く、その標的に対する抗体の親和性を改善できることを首尾よく実証した。さらに、発現により、抗体分子の潜在的な開発可能性に関して、いずれも関心の対象となる親和性、発現レベル、及び物理化学的特性を含む、関心の持たれる様々な属性を提示するバリアントのプールが生成される。

【0144】

本発明は、特定の例を参照して特に示され、説明されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、その中で形態及び詳細の様々な変更を行い得ることが、当業者により理解されるであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図3-6】

【図3-7】

【図3-8】

【図3-9】

【図3-10】

【図3-11】

【図3-12】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9】

【図10】

【図11A-1】

【図11A-2】

【図11B-1】

【図11B-2】

【図11B-3】

【図11B-4】

【図11B-5】

【図11C-1】

【図11C-2】

【図11C-3】

【図11C-4】

【図11C-5】

【図11C-6】

【図11C-7】

【図11C-8】

【図11C-9】

【図11D-1】

【図11D-2】

【図11D-3】

【図11D-4】

【図11D-5】

【図11D-6】

【図11D-7】

【図11D-8】

【図11D-9】

【図11D-10】

【図11D-11】

【図11D-12】

【図11D-13】

【図11E-1】

【図11E-2】

【図11E-3】

【図11E-4】

【図11E-5】

【図11E-6】

【図11E-7】

【図11E-8】

【図11E-9】

【図11E-10】

【図11E-11】

【図11E-12】

【図11E-13】

【図11E-14】

【図11E-15】

【図11E-16】

【図11F-1】

【図11F-2】

【図11F-3】

【図11F-4】

【図11F-5】

【図11F-6】

【図11F-7】

【図11F-8】

【図11F-9】

【図11F-10】

【図11F-11】

【図11F-12】

【図11F-13】

【図11F-14】

【図11F-15】

【図11F-16】

【図11F-17】

【図11F-18】

【図11F-19】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図12-6】

【図12-7】

【図12-8】

【図12-9】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20-1】

【図20-2】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

2022512650000001.app

【国際調査報告】