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▶ ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】ＫＩＲ７．１遺伝子療法ベクターおよびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20220131BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220131BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220131BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
A61K48/00
A61P27/02
A61K35/76
A61K38/17
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021519805
(86)(22)【出願日】2019-10-10
(85)【翻訳文提出日】2021-06-09
(86)【国際出願番号】 US2019055635
(87)【国際公開番号】W WO2020077091
(87)【国際公開日】2020-04-16
(31)【優先権主張番号】62/743,623
(32)【優先日】2018-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591013274
【氏名又は名称】ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100218578
【弁理士】
【氏名又は名称】河井 愛美
(72)【発明者】
【氏名】パトナイク ビカシュ
(72)【発明者】
【氏名】シャーヒー パワン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084DC50
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
本発明は、Ｋｉｒ７．１の発現のための遺伝子療法コンストラクトおよび医薬組成物に関する。遺伝子療法コンストラクトは、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを含むベクターを含む。不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドと関連する状態を有する対象を治療する方法もまた、提供される。
【選択図】図１－１
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを含む、遺伝子療法ベクター。
【請求項2】
前記Ｋｉｒ７．１ポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項3】
前記プロモーターが、異種性プロモーターである、請求項１または２のいずれか１項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項4】
前記プロモーターが、対象の目における網膜色素上皮（ＲＰＥ）において活性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項5】
前記プロモーターが、ＥＦ１ａプロモーターまたはＶＭＤ２プロモーターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項6】
前記プロモーターが、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＥＦ１ａプロモーターである、請求項５に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項7】
前記プロモーターが、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＶＭＤ２プロモーターである、請求項５に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項8】
前記プロモーターおよびポリヌクレオチドが、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡでコードされる、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項9】
前記遺伝子療法ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１～８のいずれか１項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項10】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項９に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項11】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１０に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項12】
前記レンチウイルスベクターが、表５または表６において挙げられる構成成分の少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項13】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である、請求項１０に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項14】
前記ＡＡＶベクターが、表２または表３に挙げられる構成成分の少なくとも１つをさらに含む、請求項１３に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項15】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２ベクターである、請求項１３～１４のいずれか１項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項16】
前記ウイルスベクターが、ウイルス粒子である、請求項９～１５のいずれか１項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項17】
前記ウイルス粒子が、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を含む、請求項１６に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項18】
配列番号５（ＥＦ１ａ－Ｋｉｒ７．１）または配列番号６（ＶＭＤ２－Ｋｉｒ７．１）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項19】
請求項１～１８に記載の遺伝子療法ベクターのいずれか一つおよび医薬的に許容される担体を含む、治療組成物。
【請求項20】
Ｋｉｒ７．１ポリペプチドの不十分な発現または機能と関連する状態を有する対象を治療する方法であって、治療上有効量の、請求項１～１８に記載の遺伝子療法ベクターのいずれか１つまたは請求項１９に記載の治療組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項21】
前記状態が、ＫＣＮＪ１３遺伝子における少なくとも１つの機能が喪失した変異と関連する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記少なくとも１つの機能が喪失した変異が、Ｗ５３Ｔｅｒ、Ｑ１１６Ｒ、Ｉ１２０Ｔ、Ｔ１５３Ｉ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６６Ｔｅｒ、Ｌ２４１Ｐ、Ｅ２７６Ａ、Ｓ１０５Ｉ、およびＧ２１９Ｔｅｒからなる群から選択される配列番号１に対する置換を生じる、請求項２０～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記状態が、レーバー先天黒内障１６（ＬＣＡ１６）、網膜色素変性症、およびスノーフレーク硝子体網膜変性（ＳＶＤ）からなる群から選択される、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記遺伝子療法ベクターまたは治療組成物が、眼内投与される、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記遺伝子療法ベクターまたは治療組成物が、前記対象の少なくとも１方の目に網膜下投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記遺伝子療法ベクターの１０9～１０12コピーが、前記対象に投与される、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記対象がヒトである、請求項２０～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における異種性ポリペプチドを発現させる方法であって、前記ＲＰＥ細胞を、前記異種性ポリペプチドに作動可能に結合されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）ウイルス粒子と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１０日に出願した米国仮出願第６２／７４３，６２３号の優先権を主張し、その内容は、参照により全体が取り込まれる。
本出願は、２０１８年１０月１０日に出願した米国仮出願第６２／７４３，６２３号の優先権を主張し、その内容は、参照により全体が取り込まれる。
【0002】
連邦政府資金による研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により認められたＥＹ０２４９９５の下、政府の支持で完成された。政府は、本発明においてある種の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所により認められたＥＹ０２４９９５の下、政府の支持で完成された。政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【0003】
配列表
サイズ３４．２ｋｂであり、２０１９年１０月９日に作成され、本出願と一緒にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、「９６０２９６＿０３９６２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名された配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
サイズ３４．２ｋｂであり、２０１９年１０月９日に作成され、本出願と一緒にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、「９６０２９６＿０３９６２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名された配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【0004】
導入
レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、出生時の重篤な視野喪失により特徴付けられる、遺伝性小児形態の盲目である。ＬＣＡを有する小児はまた、眼球彷徨（眼振）、奥目、明るい光への過敏症、および中枢神経系異常を含む、様々な他の異常を示し得る。典型的には、乳児の最初の数ヶ月以内に、両親は、視覚の応答性および眼振の欠如に気付く。ＬＣＡを有する乳児の網膜は、正常に思われるが、（たとえあるとしても）活性は、網膜電図検査（ＥＲＧ）により網膜においてほとんど検出されない。しかしながら、前期思春期までに、網膜色素上皮（ＲＰＥ）における色素性変化および狭窄血管の存在を含む、網膜の見た目における様々な変化が検出され得る。
レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、出生時の重篤な視野喪失により特徴付けられる、遺伝性小児形態の盲目である。ＬＣＡを有する小児はまた、眼球彷徨（眼振）、奥目、明るい光への過敏症、および中枢神経系異常を含む、様々な他の異常を示し得る。典型的には、乳児の最初の数ヶ月以内に、両親は、視覚の応答性および眼振の欠如に気付く。ＬＣＡを有する乳児の網膜は、正常に思われるが、（たとえあるとしても）活性は、網膜電図検査（ＥＲＧ）により網膜においてほとんど検出されない。しかしながら、前期思春期までに、網膜色素上皮（ＲＰＥ）における色素性変化および狭窄血管の存在を含む、網膜の見た目における様々な変化が検出され得る。
【0005】
ＬＣＡは、典型的には、常染色体劣性遺伝で家系を通じて継承される。外網膜視細胞および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において発現する少なくとも２１遺伝子における変異が、ＬＣＡと関連する。ここ十年以内に、ヒトＫＣＮＪ１３遺伝子における常染色体劣性の変異（染色体遺伝子座２ｑ３７．１の６０３２０３）は、ＬＣＡ１６として知られるＬＣＡの特定の形態を有する患者において同定された。これまでに、ＬＣＡ１６病原性対立遺伝子バリアントは、ｃ．１５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）、ｃ．３５９Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｉｓｏ１２０Ｔｈｒ）、ｃ．４５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５３Ｉｓｏ）、ｃ．４９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６６Ｔｅｒ）、およびｃ．７２２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ２４１Ｐｒｏ）を含む。加えて、化合物異種性ＫＣＮＪ１３変異ｃ．３１４Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１０５Ｉｓｏ）およびｃ．６５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇ２１９Ｔｅｒ）は、ＬＣＡ患者5における早期発症網膜ジストロフィーを引き起こすことが知られている。常染色体優性ＫＣＮＪ１３変異であるｃ．４８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６２Ｔｒｐ）は、スノーフレーク硝子体網膜変性（ＳＶＤ ＯＭＩＭ－１９３２３０）と呼ばれる早期発症盲目を引き起こす。
【0006】
ヒトＫＣＮＪ１３遺伝子は、内向き整流のカリウムチャンネル－Ｋｉｒ７．１をコードする。Ｋｉｒ７．１タンパク質は、網膜の機能および健康を調節する、ＲＰＥの細胞先端プロセスを含むいくつかのヒト組織において発現する。他の器官におけるＫｉｒ７．１チャンネルの役割は、まだ解明されていない。
【0007】
Ｋｉｒ７．１の役割は、ＬＣＡ１６のような状態において理解され始めているが、Ｋｉｒ７．１タンパク質の不十分な発現または機能と関連するチャネル病または状態を治療するための承認された療法はない。したがって、かかる状態を治療する新規療法のニーズが、当該技術分野においてある。
【発明の概要】
【0008】
本発明の一態様では、遺伝子療法ベクターが提供される。遺伝子療法ベクターは、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを含んでもよい。
【0009】
別の態様では、本発明は、治療組成物に関する。治療組成物は、本明細書において記載される遺伝子療法ベクターのいずれかおよび医薬的に許容される担体を含んでもよい。
【0010】
本発明のさらなる態様では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドの不十分な発現または機能と関連する状態を有する対象を治療する方法が提供される。本方法は、治療上有効量の、本明細書において記載される遺伝子療法ベクターのいずれかまたは本明細書において記載される治療組成物を対象に投与することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1-1】図１Ａ～１Ｎは、ＬＣＡ１６表現型を有する患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥを示す。（図１Ａ）正常なＴＧＧ配列（配列番号１９）を有する成熟ＲＰＥ細胞（明視野画像）の説明。家系図は、試料の起源を示している。（図１Ｂ）ＴＡＧ配列（配列番号２０）を有するＬＣＡ１６発端者からもたらされる成熟ＲＰＥ細胞の明視野画像。（図１Ｃ）均一な異常を有さない患者試料における正常な核型。（図１Ｄ）対照、ＬＣＡ１６、ならびに野生型ｉＰＳＣ－ＲＰＥ株およびヒト胎児ＲＰＥ細胞由来のＮｈｅ１切断産物の解析。全長Ｋｉｒ７．１配列は、長さ１０８３ｂｐであり、切断産物は、長さ９２５および１５８ｂｐである。（図１Ｅ）ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞におけるＲＰＥ細胞特異的遺伝子発現。（図１Ｆ）代表的なＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の電子顕微鏡写真。（図１Ｇ）１０μｍの細胞内の平均ミトコンドリア（Ｍｉｔ）数の比較。（図１Ｈ）ＲＰＥ頂端（ＡＰ）プロセスの平均長さの評価。（図１Ｉ）対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥ 細胞におけるＫｉｒ７．１（赤色）、ＺＯ－１（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光局在化。より下のパネルとサイドのパネルの両方により、ＺＯ－１およびＤＡＰＩ（ｚスタック画像）を参照して、Ｋｉｒ７．１の極性化した分布を明らかにした。（図１Ｊ）ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるＫｉｒ７．１（赤色）、ＺＯ－１（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）の局在化。（図１Ｋ）両方の組織試料におけるＲＰＥ細胞特異的タンパク質の発現を示す、ウエスタンブロット。Ｋｉｒ７．１に対するＣ末端特異的抗体を使用し、本発明者らは、対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥ由来の細胞全体の溶解物においてＫｉｒ７．１タンパク質を検出したが、ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ由来のものでは検出しなかった。対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥ（図１Ｌ）およびＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ（図１Ｍ）試料内でのファゴソーム（赤色）局在化。（図１Ｎ）栄養を与えた４時間後、およびその後の４８時間の消化期間、または栄養を与えた１日後、続いて消化の６日間での、対照および疾患のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞における固定した２００μｍ2範囲内の平均ファゴソーム数のプロット。
【図1-2】同上。
【図1-3】同上。
【図1-4】同上。
【図1-5】同上。
【図1-6】同上。
【図2-1】図２Ａ～２Ｎは、ナンセンス変異抑制または遺伝子増大を通じた、推定Ｋｉｒ７．１機能喪失を示す。（図２Ａ）対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞における正常外部Ｋ＋（黒色）または高い外部Ｒｂ＋（淡青色）を使用したＫｉｒ７．１電流についての平均電流－電位（Ｉ／Ｖ）曲線のプロット。（図２Ｂ）ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞における正常Ｋ＋（赤色）および高Ｒｂ＋（淡青色）を使用した平均Ｉ／Ｖ曲線。（図２Ｃ）－１５０ｍＶで測定した内向きの電流振幅の平均プロット。ａおよびｂで示す、色表示。（図２Ｄ）ＬＣＡ１６（赤色）ＲＰＥ細胞を脱分極するための対照（黒色）細胞の平均膜電位の比較。（図２Ｅ）ＮＢ８４での処置前（赤色）および後（ダークブルー）の平均Ｉ／Ｖ関係。Ｒｂ＋で測定した電流を、淡青色のトレースとして示す。－１５０ｍＶで測定した平均内向き電流（図２Ｆ）およびＮＢ８４の効果を示すための膜電位（図２Ｇ）の評価。（図２Ｈ）ＧＦＰが融合したタンパク質を、抗ＧＦＰ抗体をトラップとして使用して沈殿させ、銀染色により、全長Ｋｉｒ７．１およびＷ５３Ｘタンパク質についての精製成分バンドを示す。ＧＦＰ対照試料は、より小さなタンパク質産物を示す。（図２Ｉ）細胞溶解物のウエスタンブロット解析により、ＧＦＰ特異的抗体でプローブ結合させたとき、それぞれのバンドを示す。全長タンパク質産物の部分的修復を、ＮＢ８４処理後に観察する。（図２Ｊ）ヒトＫｉｒ７．１クローンの正常コピーを発現するＧＦＰ陽性細胞において測定したＫｉｒ７．１電流についての平均Ｉ／Ｖ曲線のプロット。Ｋ＋（緑色）とＲｂ＋（淡青色）トレースの両方を示す。遺伝子増大後の救出を示すための、－１５０ｍＶで測定した電流振幅（図２Ｋ）および膜電位（図２Ｌ）の平均プロット。（図２Ｍ）野生型Ｋｉｒ７．１（緑色）、ＺＯ－１（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）タンパク質を示す、培養したＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ。Ｚスタック面を、下側のパネルおよびサイドパネルで示す。（図２Ｎ）抗ＧＦＰ抗体を使用することによる、遺伝子増大後に検出したＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞におけるＫｉｒ７．１タンパク質発現のウエスタンブロット解析。
【図2-2】同上。
【図2-3】同上。
【図2-4】同上。
【図2-5】同上。
【図2-6】同上。
【図3】図３Ａ～３Ｄは、患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の表現型を示す。基底の陥入を有する正常円柱形態、巨大な核、ミトコンドリア（ｍ）、メラノソームおよび伸長プロセス（ａｐ）を有する未変化の頂端膜を示す、対照ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞（図３Ａ）およびＬＣＡ１６ ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞（図３Ｂ）の電子顕微鏡写真の比較。蛍光標識したウシＰＯＳと共に１日間、細胞に栄養を与えた６日間後に画像化したＰＯＳ（赤色）および核（青色）を示す、ｘ－ｙ－ｚ面の生きた対照ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ（図３Ｃ）および患者由来のｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ（図３Ｄ）細胞の画像。さらなる未消化の赤色蛍光ＰＯＳ粒子は、ＬＣＡ１６ ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞において視認できる。
【図4】図４Ａ～４Ｄは、ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥのサブ集団が、膜電位における救出を示したが、電流振幅については示さなかったことを示す。（図４Ａ）１００μＭ ＮＢ８４での細胞の処置後の正常Ｋ＋リンガーおよび高Ｒｂ＋リンガー溶液におけるＬＣＡ１６ ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞のサブグループにおける平均電流応答のＩ／Ｖプロット。（図４Ｂ）５００μＭ ＮＢ８４での処置後のＬＣＡ１６ ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるＫ＋およびＲｂ＋電流応答を示す、Ｉ／Ｖプロット。（図４Ｃ）１００または５００μＭ ＮＢ８４でのＬＣＡ１６ ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥの処理後の対照レベルに対する膜電位の救出を示す、膜電位の平均プロット。（図４Ｄ）１００または５００μＭ ＮＢ８４のいずれかでの処理後の電流振幅における救出を明確に示さない、電流振幅プロット。
【図5】図５Ａ～５Ｄは、ＣＨＯ細胞において異所性に発現したＴｒｐ５３Ｔｅｒのリードスルーを示す。ＬＣＡ１６ ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞においてと同様に、形質導入したＣＨＯ細胞は、ＮＢ８４での処理後のみＲｂ＋により活性化された内部整流Ｋｉｒ７．１電流を示した。（図５Ａ）電流振幅と膜電位の両方の回復を示す、ＮＢ８４での処理後のＫ＋（黒色）およびＲｂ＋（赤色）電流を示す、細胞のＩ／Ｖプロット。（図５Ｂ）電流振幅ではなく、膜電位のみの回復を説明する、Ｋ＋（黒色）およびＲｂ＋（赤色）についての多少の直線性Ｉ／Ｖプロットを示す、ＮＢ８４処理細胞の群。Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ発現ＣＨＯ細胞の処理後の電流振幅（図５Ｃ）と膜電位（図５Ｄ）の両方の平均回収の比較。
【図6-1】図６Ａ～６Ｄは、機能的救出に必要な野生型タンパク質発現の程度の決定を示す。本発明者らは、どのくらいの遺伝子増大／修正が、チャンネル機能を回復させるのに必要とされるかを定量することに特に興味を持った。本発明者らは、ＣＨＯ細胞におけるＴｒｐ５３Ｔｅｒもしくは野生型Ｋｉｒ７．１タンパク質単独のいずれか、または様々な組み合わせで発現させた。（図６Ａ）電流記録を、Ｉ／Ｖプロットとして示す。（図６Ｂ）ｘ軸についての拡大スケールにおいて、静止膜電位は、タンパク質発現の２０％のみを成す野生型タンパク質での負のシフトを示す。（図６Ｃ）野生型タンパク質発現を増加させる機能としての標準化した電流振幅（塗りつぶした円）または膜電位（灰色の棒）のいずれかの平均プロット。実ラインは、図６Ｄに示す方程式を使用した分布について最も適している。最大半量電流を、野生型タンパク質発現の約２６％で得た。（図６Ｄ）最大半量応答および傾斜を示す、最善の適合曲線の値。
【図6-2】同上。
【図7】図７Ａ～７Ｄは、処理モダリティーにわたる膜電位の救出の比較を示す。（図７Ａ）ｘ軸の拡大スケールにおいて、対照（黒色）およびＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ（赤色）の静止膜電位は、Ｉ／Ｖプロットにおける正のシフトを示した。（図７Ｂ）ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞（赤色のトレース）について、ＮＢ８４での処理は、Ｉ／Ｖ－プロットを負にシフトした（青色）。（図７Ｃ）平均Ｉ／Ｖのプロットはまた、遺伝子増大（緑色）の静止電位の負のシフトを示した。（図７Ｄ）静止膜電位の棒グラフ比較により、ＮＢ８４での処理後、または遺伝子増大の際に対照レベルへのＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥの回復を示した。
【図8】野生型（左パネル）とＷ５３Ｘ変異（右パネル）安定細胞由来の細胞全体の電流と電位の関係を示す。野生型の安定な細胞における内部に整流するＫ＋電流（黒色のトレース）は、Ｒｂ＋（赤色のトレース）により優位に増加した。右側のＷ５３Ｘ変異の安定な細胞において、Ｋ＋電流もＲｂ＋電流も記録しなかった（ｐ＝１．０５Ｅ－０．５）。
【図9】図９Ａ～９Ｅは、Ｗ５３Ｘ変異発現ＣＨＯ細胞の遺伝子増大が、以前の電流なし（図９Ａ、黒色のトレースにおけるプロット）と比較して、平均内部整流Ｋ＋電流（図９Ａ、赤色のトレースにおけるＩＶプロット）の回復を有することを示す。（図９Ｂ）遺伝子増大後のＷ５３Ｘ変異発現細胞における平均のより高いＲｂ＋電流（赤色のトレース）。（図９Ｃ）Ｒｂ＋透過性における正味の増加は、遺伝子増大後にＫｉｒ７．１ チャンネルを介して増加した（青色）。（図９Ｄ）Ｗ５３Ｘ発現細胞のＡＡＶ－Ｋｉｒ７．１形質導入後の静止膜電位（ＲＭＰ）の完全な回復は、青色の四角として表した。（図９Ｅ）列Ｗ５３Ｘ＋ＡＡＶ（赤色のバンド）における遺伝子増大後の全長タンパク質産物の発現を示す、ウエスタンブロット結果。
【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、ＡＡＶ－Ｋｉｒ７．１を通じて遺伝子増大後のＷ５３Ｘ変異列におけるＫｉｒ７．１発現（緑色）を示す（図１０Ａ）。（図１０Ｂ）より高い拡大率の画像は、膜マーカーＷＧＡ－Ａｌｅｘａ ５９４に並んだＫｉｒ７．１タンパク質の膜局在化を示す。より下のパネルにおいて、赤色および緑色についてのラインスキャンは、膜マーカーおよびＫｉｒ７．１共局在化を示す。
【図11-1】インビボでのＫｉｒ７．１遺伝子療法を示す。左は、網膜電図の正常な波形を示すが、遺伝子増大後の変化を示さない、対照マウスである。中程は、右の黒色のトレースにおけるｃ波を示さない、条件ノックアウトマウスである。Ｋｉｒ７．１発現に直接依存する、この波は、遺伝子療法の４週間後に完全に回復する。平均結果を、ボックスプロットにおいて示し、これは、実験的遺伝子療法におけるｃ波の有意な回復を伴う。
【図11-2】同上。
【図12】Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のための典型的なＡＡＶウイルスベクターについてのベクターマップを示す。
【図13】Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のための典型的なレンチウイルスベクターについてのベクターマップを示す。
【図14-1】図１４Ａ～Ｆは、遺伝子療法後のＫｉｒ７．１タンパク質を欠く網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の機能回復を示す。（図１４Ａ）ＰＢＳ注射の８週間後のＲＰＥ応答機能を示す、ＷＴマウスおよびｃＫＯ対照マウスに対する注射対照。（図１４Ｂ）スクリーニング中のａ波、ｂ波およびｃ波を示さなかった、Ｋｉｒ７．１ｃＫＯマウスのＥＲＧ応答。ＲＰＥと視細胞の両方が変性したので、恒常的ＥＦ１ａプロモーターまたはＲＰＥ特異的ＶＭＤ２プロモーターのいずれかを有するレンチウイルスでのＫｉｒ７．１の送達は、重大な表現型に起因して、ＲＰＥ機能を救出するのに失敗した。（図１４Ｃ）ＲＰＥのｃ波を、ＥＦ１ａおよびＶＭＤ２プロモーターによりもたらされるｋｃｎｊ１３遺伝子を有するレンチウイルスの網膜下送達により、ｃＫＯマウスにおいて回復し、ここで、視細胞は、変性しなかったが、スクリーニング中にＲＰＥ細胞からの応答を有さなかった。（図１４Ｄ）、（図１４Ｅ）、（図１４Ｆ）それぞれ、スクリーニング中およびレンチウイルス遺伝子送達の８週間後の、対照マウス、回復を伴わないｃＫＯマウス（ａ波、ｂ波、ｃ波なし）、およびｃ波が回復したマウス（ａ波、ｂ波だが、ｃ波なし）の網膜構造を示す、代表的な光干渉断層撮影（ＯＣＴ）画像。
【図14-2】同上。
【図14-3】同上。
【図15】図１５Ａ～１５Ｅは、ｃ波回復を示さなかったマウスのサブセットの結果を示す。（図１５Ａ）ＥＦ１ａおよびＶＭＤ２プロモーターによりもたらされる、ｋｃｎｊ１３遺伝子を有するレンチウイルスの注射後のｃ波回復を示さなかったマウスのサブセットを表す、グラフ。（図１５Ｂ）、（図１５Ｃ）スクリーニング中のｃ波を有さないｃＫＯマウスの光干渉断層撮影（ＯＣＴ）画像は、未変化の網膜を示すが、８週間後に衰退し、これにより、ＲＰＥ細胞におけるＫｉｒ７．１タンパク質の欠如に起因して経時的に網膜変性の進行性性質を明らかにする。（図１５Ｄ）、（図１５Ｅ）視細胞（ａ波およびｂ波）由来の応答を有するが、ＲＰＥからのｃ波応答を欠く、ｃＫＯマウスのもの由来の網膜構造を示す、ＯＣＴ画像。ｋｃｎｊ１３遺伝子を有するレンチウイルスの注射は、ｃ波を回復させるのに失敗し、注射に起因してＲＰＥ形質導入または横断の無効率性に起因し得た。
【図16-1】特異的な構成成分を含有する本発明の典型的なＡＡＶベクター、およびＲＰＥ特異的プロモーターおよびＫｉｒ７．１遺伝子を含むＡＡＶベクターについての適当な典型的な配列を示す、表２および表３を示す。
【図16-2】同上。
【図16-3】同上。
【図16-4】同上。
【図17-1】レンチウイルスベクターについての特異的な成分および適当な典型的な配列を含む、本発明の典型的なレンチウイルスベクターを示す、表５および表６を示す。
【図17-2】同上。
【図17-3】同上。
【図17-4】同上。
【図17-5】同上。
【図17-6】同上。
【発明を実施するための形態】
【0012】
ここで、本発明者らは、レーバー先天黒内障１６（ＬＣＡ１６）またはＫｉｒ７．１タンパク質の不十分な発現もしくは機能と関連する他の状態を治療するために使用され得る新規遺伝子療法ベクターおよび治療組成物を開示する。非限定的な例では、本発明者らは、驚くべきことに、遺伝子療法アプローチを使用して、低減した電気生理学的表現型を有するＲＰＥ細胞をもたらす、インビトロまたはインビボのいずれかで網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるＫｉｒ７．１ポリペプチド機能を有効に回復させ得ることを示す。したがって、本発明者らは、遺伝子療法アプローチを使用して、膜タンパク質Ｋｉｒ７．１を有効に送達し得ることを見出した。本発明者らは、Ｋｉｒ７．１タンパク質オープンリーディングフレーム単独の発現が、適切な細胞内コンパートメントに輸送されるＫｉｒ７．１タンパク質を得るのに十分であることを、一部示す。これらの結果は、レーバー先天黒内障１６（ＬＣＡ１６）またはＫｉｒ７．１タンパク質の不十分な発現もしくは機能と関連する他の状態を治療するための可能性のある根治療法の希望をもたらす。
【0013】
遺伝子療法ベクター
本発明の一態様では、遺伝子療法ベクターが提供される。遺伝子療法ベクターは、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを含んでもよい。一般的なアプローチは、本発明のある特定の態様では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクトを有する細胞を提供し、これにより、細胞におけるＫｉｒ７．１ポリペプチドの発現を可能にする。発現コンストラクトの送達後、発現コンストラクトによりコードされるＫｉｒ７．１ポリペプチドは、細胞の転写および翻訳機構により合成される。
本発明の一態様では、遺伝子療法ベクターが提供される。遺伝子療法ベクターは、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを含んでもよい。一般的なアプローチは、本発明のある特定の態様では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクトを有する細胞を提供し、これにより、細胞におけるＫｉｒ７．１ポリペプチドの発現を可能にする。発現コンストラクトの送達後、発現コンストラクトによりコードされるＫｉｒ７．１ポリペプチドは、細胞の転写および翻訳機構により合成される。
【0014】
本明細書において使用される場合、「Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクト」は、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを指す。
【0015】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸」および「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（それらの用語は、互換的に使用されてもよい）、または任意のそのフラグメントを指す。これらの語句はまた、天然または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ（１本鎖または２本鎖であってもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表してもよい）を指す。一部の実施形態では、本明細書において記載される、プロモーターおよびＫｉｒ７．１ポリヌクレオチドまたはＫｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクトは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡでコードされる。
【0016】
本明細書において使用される場合、「遺伝子療法ベクター」は、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクトを細胞（すなわち、真核生物細胞）に送達するために使用され得るウイルスまたは非ウイルスベクターシステムを指す。両方の広範なタイプのベクターシステムは、セクションに従い記載される。遺伝子療法の目的のための発現コンストラクトの送達において利用される２つの主要なアプローチ；間接的なエクスビボ方法または直接的なインビボ方法のいずれかが存在する。エクスビボ遺伝子導入は、培養中の（宿主）細胞のベクター修飾および遺伝子レシピエントにベクター修飾された細胞の投与または移植を含む。インビボ遺伝子導入は、標的源または治療レシピエントへのベクターの直接的導入（例えば、注射、注入）を含む。
【0017】
本発明のある特定の実施形態では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクトは、細胞のゲノムに安定に統合されてもよい。なおさらなる実施形態では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクトは、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして細胞において安定的または一過性に維持されてもよい。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞サイクルと独立したまたは同調した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現コンストラクトが、どのように細胞に送達されるか、および／または細胞におけるどの場所に核酸がとどまるかは、利用されるベクターのタイプに依存する。次の遺伝子送達方法は、好ましい適用に最も適当な遺伝子送達システムを選択し、開発するためのフレームワークをもたらす。
【0018】
非ウイルス遺伝子療法ベクター
一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、送達粒子であってもよい。ポリヌクレオチドの送達に適した送達粒子は、当該技術分野において公知であり、ポリマー粒子、リポソーム粒子、ならびに脂質および少なくとも１つのタイプのポリマーを含む粒子を含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、送達粒子は、共通のリポフェクタミン試薬を使用して形成されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、送達粒子であってもよい。ポリヌクレオチドの送達に適した送達粒子は、当該技術分野において公知であり、ポリマー粒子、リポソーム粒子、ならびに脂質および少なくとも１つのタイプのポリマーを含む粒子を含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、送達粒子は、共通のリポフェクタミン試薬を使用して形成されてもよい。
【0019】
送達粒子は、ナノスケール粒子および／またはマイクロスケール粒子を、例えば、ゲノム編集のため細胞への成分の送達ビークルとして含んでもよい。粒子は、約５００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ、０．０５μｍ、０．０２μｍ、０．０１μｍ未満の有効平均直径を有し得るか、または５００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ、０．０５μｍ、０．０２μｍ、０．０１μｍ（例えば、０．０１～５μｍ）のいずれかにより結び付けられる範囲内の有効平均直径を有し得る。ナノスケール粒子およびマイクロスケール粒子は、それぞれ、「ナノ粒子」および「マイクロ粒子」として言及されてもよい。
【0020】
ポリマー粒子は、当該技術分野において記載されている。（米国特許公開第２０１４００６６３８８号）。ポリマー粒子は、生分解性ポリマー分子を含んでもよいか、または形成されてもよく、一部の実施形態では、デンドリマーを含んでもよい。適当なデンドリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含み得るが、これに限定されない。ポリアミドアミンデンドリマーは、治療剤の細胞内送達のためのビークルとして当該技術分野において使用されている。現在開示されるナノ粒子の調製に適したポリアミドアミンデンドリマーは、第３、第４、第５、または好ましくは、少なくとも第６世代のデンドリマーを含んでもよい。
【0021】
ポリマー粒子はまた、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（例えば、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ））、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（３－ヒドロキシブチラート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマラート、ポリ（オルソエステル）、ポリオール／ジケテンアセタール付加ポリマー、ポリ－アルキル－シアノ－アクリレート（ＰＡＣ）、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキソン（ＰＣＰＰ）ポリ［ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）、ＰＳＡ、ＰＣＰＰとＰＣＰＭのコポリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリ（偽アミノ酸）、ポリホスファゼン、ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］およびポリ［（オルガノ）ホスファゼン］の誘導体、ポリ－ヒドロキシ酪酸、またはＳ－カプロン酸、エラスチン、ゼラチン、およびキトサンを含み得るが、これらに限定されない、他の生分解性ポリマー分子を含んでもよいか、または形成されてもよい。（例えば、Ｋｕｍａｒｉら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ７５（２０１０年）１－１８；ならびに米国特許第６，９１３，７６７号；第６，８８４，４３５号；第６，５６５，７７７号；第６，５３４，０９２号；第６，５２８，０８７号；第６，３７９，７０４号；第６，３０９，５６９号；第６，２６４，９８７号；第６，２１０，７０７号；第６，０９０，９２５号；第６，０２２，５６４号；第５，９８１，７１９号；第５，８７１，７４７号；第５，７２３，２６９号；第５，６０３，９６０号；および第５，５７８，７０９号；ならびに米国公開第２００７／００８１９７２号；ならびに国際公開第２０１２／１１５８０６号；ならびに国際公開第２０１２／０５４４２５号を参照のこと）。一部の実施形態では、粒子は、ＰＬＧＡとＰＡＭＡＭの混合物を含んでもよい。
【0022】
ポリマー粒子は、当該技術分野において公知の方法により調製されてもよい。（国際出願公開第２０１２／１１５８０６号；および第２０１２／０５４４２５号）。ナノ粒子を調製する適当な方法は、溶媒蒸発、ナノ沈殿、乳化／溶媒分散、塩析、透析、および超臨界流体技術を含み得るが、限定されない、予め形成されたポリマーの分散液を利用する方法を含んでもよい。一部の実施形態では、ナノ粒子は、二重の乳化（例えば、水中油中水）を形成すること、続いて、溶媒蒸発を行うことにより、調製されてもよい。開示される方法により得られるナノ粒子は、所望に応じて、洗浄および凍結乾燥などのさらなる処理工程に供されてもよい。場合により、ナノ粒子は、保存剤（例えば、トレハロース）と合わせられてもよい。
【0023】
ミセルおよびリポソームベースの粒子はまた、適当な送達粒子として働いてもよい。例えば、米国特許第８，２５２，３２４号を参照。ミセルは、両親媒性分子により形成される自己集合球形コロイド状ナノ粒子である。ミセルはまた、液体コロイドにおいて分散された凝集界面活性剤分子として記載される。水性環境において分離される、ミセルの中心は、それらの薬物動態および体内分布を改善しながら、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を被包し、それらを分解および生物学的周辺物から保護する能力がある。ミセルは、一般に、直径５～５０ｎｍのオーダーであり、故に、透過性および滞留効果に起因した、梗塞領域および腫瘍などの漏出性脈管構造を有する病理学的範囲において蓄積する能力がある。ミセルはまた、粒子システムによる薬物標的において主要な障壁：網内系による非特異的取り込みおよび腎分泌を逃れる能力がある。ミセルと対照的に、リポソームは、直径およそ５０～１，０００ｎｍの二層化リン脂質小胞である。リポソームは、生物学的に不活性であり、完全に生体適合性であり、それらは、無毒性反応または抗原反応を実際に引き起こす。リポソームに含まれるポリヌクレオチドは、リポソームにより、外部培地の破壊的作用から保護される。したがって、リポソームは、それらの内容物を細胞内に、異なる細胞成分内でさえ送達することができる。一般に、リポソームは、多数の研究室検査および臨床試験において示された通り、有意な治療可能性を有する将来有望なキャリアとみなされる。
【0024】
送達粒子はまた、脂質およびポリマー成分を含む粒子を含んでもよい。例えば、リン脂質二層およびポリ（ベータ－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）を含む粒子は、ポリヌクレオチドのインビボ送達のため開発された。
【0025】
送達粒子は、好ましくは、標的化細胞による取り込みを促進する物理的特性を有する。例えば、好ましくは、粒子は、標的化細胞による取り込みを促進するサイズおよび電荷を有する。典型的には、粒子は、１ミクロン未満の平均有効直径を有し、好ましくは、粒子は、約２５ｎｍ～約５００ｎｍ、より好ましくは、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、最も好ましくは、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍの平均有効直径を有する。粒子のサイズ（例えば、平均有効直径）は、当該技術分野において公知の方法により評価されてもよく、それは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、光子相関スペクトロスコピー（ＰＣＳ）、ナノ粒子表面積モニター（ＮＳＡＭ）、凝縮粒子カウンター（ＣＰＣ）、微分型電気移動度測定装置（ＤＭＡ）、走査型移動度粒径測定器（ＳＭＰＳ）、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、エアロゾル飛行時間質量分析（ＡＴＦＭＳ）、およびエアロゾル粒子質量分析（ＡＰＭ）を含み得るが、これらに限定されない。
【0026】
送達粒子は、たとえ粒子が、それらの表面に特異的なリガンドを含まなくとも、細胞により非特異的に取り込まれる。しかしながら、開示される送達粒子は、特定の細胞タイプを特異的に標的にするリガンドも含むよう設計されてもよい。送達粒子のより特異的な標的化を達成するために、かかる粒子は、高度な結合法を使用して様々なリガンドで修飾されてもよい。例えば、抗体および小ペプチドは、ポリエチレングリコール鎖の水にさらされたチップに結合されている。抗体および小ペプチドはまた、反応性ｐ－ニトロフェニルカルボニル、Ｎ－ベンゾトリアゾールカルボニルまたはマレイミド末端ＰＥＧ－ホスファチジルエタノールアミンを介して結合されている。
【0027】
ウイルス遺伝子療法ベクター
遺伝子療法ベクターはまた、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、ウイルス粒子であってもよいか、またはＤＮＡプラスミドにコードされてもよい。ウイルスベクターが、ウイルス粒子、例えば、レンチウイルスのウイルス粒子である一部の実施形態では、ウイルス粒子は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を含んでもよい。ある特定のウイルスベクターが、細胞に効率的に感染するかまたは侵入する能力、宿主細胞ゲノムに統合する能力、およびウイルス遺伝子を安定的に発現する能力は、多数の異なるウイルスベクターシステムの開発および適用に繋がった（Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９８）。ウイルスシステムは、現在、エクスビボおよびインビボ遺伝子導入用ベクターとしての使用のため、開発されている。例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、ヒト疾患の治療について現在評価されている。以下に記載される様々なウイルスベクターは、特定の遺伝子療法適用に依存し、特定の長所と短所を示す。
遺伝子療法ベクターはまた、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、ウイルス粒子であってもよいか、またはＤＮＡプラスミドにコードされてもよい。ウイルスベクターが、ウイルス粒子、例えば、レンチウイルスのウイルス粒子である一部の実施形態では、ウイルス粒子は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を含んでもよい。ある特定のウイルスベクターが、細胞に効率的に感染するかまたは侵入する能力、宿主細胞ゲノムに統合する能力、およびウイルス遺伝子を安定的に発現する能力は、多数の異なるウイルスベクターシステムの開発および適用に繋がった（Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９８）。ウイルスシステムは、現在、エクスビボおよびインビボ遺伝子導入用ベクターとしての使用のため、開発されている。例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、ヒト疾患の治療について現在評価されている。以下に記載される様々なウイルスベクターは、特定の遺伝子療法適用に依存し、特定の長所と短所を示す。
【0028】
本発明に従い使用され得る適当なウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスベクターを含み得るが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクターを含んでもよい。
【0029】
ここで、非限定的な例では、本発明者らは、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのいずれかを使用して、インビトロまたはインビボのいずれかで、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞において、首尾よく導入し、発現させて、ＫＣＮＪ１３遺伝子における機能的欠損を低減し得ることを示す。したがって、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはＡＡＶ、適当には、ＡＡＶ２ベクターであってもよい。本明細書において記載されるＡＡＶベクターは、表２または表３において挙げられる成分の少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８種をさらに含んでもよい。本明細書において記載されるレンチウイルスベクターは、表５または表６において挙げられる成分の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種をさらに含んでもよい。
【0030】
レトロウイルスベクター
本発明のある特定の実施形態では、Ｋｉｒ７．１発現コンストラクトの遺伝子送達のためのレトロウイルスの使用が考慮される。レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターは、ＲＮＡゲノムを含むＲＮＡウイルスである。宿主細胞にレトロウイルスが感染するとき、ゲノムＲＮＡは、ＤＮＡ中間体に逆転写され、感染した細胞の染色体ＤＮＡに導入される。この統合されたＤＮＡ中間体は、プロウイルスとして言及される。レトロウイルスの特定の利点は、それらが、免疫原性ウイルスタンパク質を発現することなく、宿主ＤＮＡに統合させることにより、対象の遺伝子（例えば、治療遺伝子）を分裂細胞に安定的に感染させることができることである。理論的に、統合されたレトロウイルスベクターは、対象の遺伝子を発現している、感染した宿主細胞の生存の間、維持される。
本発明のある特定の実施形態では、Ｋｉｒ７．１発現コンストラクトの遺伝子送達のためのレトロウイルスの使用が考慮される。レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターは、ＲＮＡゲノムを含むＲＮＡウイルスである。宿主細胞にレトロウイルスが感染するとき、ゲノムＲＮＡは、ＤＮＡ中間体に逆転写され、感染した細胞の染色体ＤＮＡに導入される。この統合されたＤＮＡ中間体は、プロウイルスとして言及される。レトロウイルスの特定の利点は、それらが、免疫原性ウイルスタンパク質を発現することなく、宿主ＤＮＡに統合させることにより、対象の遺伝子（例えば、治療遺伝子）を分裂細胞に安定的に感染させることができることである。理論的に、統合されたレトロウイルスベクターは、対象の遺伝子を発現している、感染した宿主細胞の生存の間、維持される。
【0031】
レンチウイルスベクターは、分裂している細胞と分裂していない細胞の両方に感染することができる、レトロウイルスの種類である。レンチウイルスは、最大６ヶ月間、それらの標的細胞の遺伝子の発現を変化させることができるので、レンチウイルスを使用して、高度に有効な遺伝子療法をもたらすことができる。それらは、従前の遺伝子療法が使用することができなかった細胞タイプである、ニューロン、マクロファージ、造血幹細胞、網膜視細胞、ならびに筋および肝細胞などの、分裂していない細胞または最後まで分化した細胞のため使用することができる。
【0032】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
パルボウイルスファミリーのメンバーである、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子送達治療剤のためますます使用されているヒトウイルスである。ＡＡＶは、他のウイルスシステムにおいて見られない特性のいくつかの利点を有する。第一に、ＡＡＶは、分裂していない細胞を含む、広範な宿主細胞に感染することができる。第二に、ＡＡＶは、異なる種由来の細胞に感染することができる。第三に、ＡＡＶは、ヒトまたは動物の疾患と関連せず、統合の際に宿主細胞の生物学的特性を変化させないようである。例えば、ヒト集団の８０～８５％が、ＡＡＶに暴露されていると推定される。最後に、ＡＡＶは、それ自体が、製造、保存および輸送要件に適している、広範な物理的および化学的条件で安定である。
パルボウイルスファミリーのメンバーである、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子送達治療剤のためますます使用されているヒトウイルスである。ＡＡＶは、他のウイルスシステムにおいて見られない特性のいくつかの利点を有する。第一に、ＡＡＶは、分裂していない細胞を含む、広範な宿主細胞に感染することができる。第二に、ＡＡＶは、異なる種由来の細胞に感染することができる。第三に、ＡＡＶは、ヒトまたは動物の疾患と関連せず、統合の際に宿主細胞の生物学的特性を変化させないようである。例えば、ヒト集団の８０～８５％が、ＡＡＶに暴露されていると推定される。最後に、ＡＡＶは、それ自体が、製造、保存および輸送要件に適している、広範な物理的および化学的条件で安定である。
【0033】
ＡＡＶゲノムは、４６８１ヌクレオチドを含有する、直線の１本鎖ＤＮＡ分子である。ＡＡＶゲノムは、一般に、およそ１４５ｂｐ長の末端逆位配列（ＩＴＲ）により、各末端に隣接する内部非繰り返しゲノムを含む。ＩＴＲは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての、ＤＮＡ複製起源を含む複数の機能を有する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶなどを含む、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかからもたらされ得る。本明細書において開示されるＡＡＶウイルスベクターの５’および３’ＩＴＲは、これらのＡＡＶ血清型のいずれかからもたらされてもよい。本明細書において開示されるＡＡＶウイルスベクターに隣接する５’および３’ＩＴＲは、全く、同一であるか、または同じＡＡＶ血清型からもたらされるわけではない。したがって、ｒＡＡＶベクター設計および産生により、異なるＡＡＶ血清型間のカプシドタンパク質を交換するのを可能にする。例えば、ＡＡＶ２－ＩＴＲが隣接し、ＡＡＶ２カプシドにパッケージングされる、発現カセットを含む相同なベクター、同様に、導入遺伝子発現カセットに、例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接するが、カプシドが、ＡＡＶ５などのような別のＡＡＶ血清型から生じる、異種性ハイブリッドベクターが産生され得る。適当には、一部の実施形態では、本発明者らは、ＡＡＶ２ウイルスベクターを使用して、Ｋｉｒ７．１発現コンストラクトを細胞に有効に送達し得ることを見出した。
【0034】
ＡＡＶゲノムの内部の非繰り返し部分は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）およびカプシド（キャップ）遺伝子としても知られる、２つの巨大なオープンリーディングフレームを含む。ｒｅｐおよびキャップ遺伝子は、ウイルスが複製し、ウイルスゲノムをビリオンにパッケージングするのを可能にするウイルスタンパク質をコードする。少なくとも４種のウイルスタンパク質のファミリーは、それらの見かけの分子量に従い命名された、ＡＡＶ ｒｅｐ領域、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０から発現する。ＡＡＶキャップ領域は、少なくとも３種のタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。
【0035】
ＡＡＶは、ＡＡＶビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニア）との同時観戦を必要とするヘルパー依存性ウイルスである。ヘルパーウイルスとの同時感染の不存在下で、ＡＡＶは、ウイルスゲノムは、宿主細胞染色体に侵入するが、感染性ビリオンは、産生されない、潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染は、統合されたゲノムを「救出し」、これにより、それが、そのゲノムを複製し、感染性ＡＡＶビリオンにパッケージングすることを可能にする。ＡＡＶは、異なる種由来の細胞に感染することができるが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種のものでなければならない（例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスが同時感染したイヌ細胞において複製する）。
【0036】
ＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの内部非複製部分を欠損させること、およびＩＴＲ間に異種性遺伝子を挿入することにより、対象の遺伝子を送達するように操作されている。異種性遺伝子は、標的細胞における遺伝子発現をもたらす能力がある異種性プロモーター（恒常的、細胞特異的、または誘導可能）に作動可能に結合されてもよい。異種性遺伝子を含有する感染性組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するために、適当な産生細胞株は、異種性遺伝子を含有するｒＡＡＶベクターで遺伝子導入される。産生細胞に、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をそれらのそれぞれの内在性プロモーターまたは異種性プロモーターの制御下で有する第２のプラスミドが同時に感染する。最後に、産生細胞に、ヘルパーウイルスが感染する。これらの因子が同時にもたらされると、異種性遺伝子は、それが野生型ＡＡＶゲノムであったように、複製され、パッケージングされる。標的細胞に、生じたｒＡＡＶビリオンが感染するとき、異種性遺伝子が、侵入し、標的細胞において発現する。標的細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにアデノウイルスヘルパー遺伝子を欠くので、ｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶをさらに複製するか、パッケージングするか、または形成することができない。
【0037】
適当なＡＡＶベクターは、当該技術分野において公知である。例えば、適当なＡＡＶベクターは、その全体が参照により取り込まれる、「全脈絡膜萎縮患者のｉＰＳＣ由来網膜色素上皮におけるＡＡＶ２／５介在性遺伝子療法」において示される、ＡＡＶ２／５を含む。例えば、Ｃｅｒｅｓｏら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４を参照。本遺伝子送達に適当に適合され得るＡＡＶベクターのさらなる例は、「ヒト多能性幹細胞、ＲＰＥ、ならびにヒトおよびラット皮質ニューロンにおけるベクター血清型１～９、７ｍ８、および８ｂを使用した比較ＡＡＶ－ｅＧＦＰ導入遺伝子発現」において見ることができる。Ｄｕｏｎｇら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ．２０１９を参照。
【0038】
アデノウイルスベクター
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターが、Ｋｉｒ７．１発現コンストラクトの送達のため、考慮される。「アデノウイルスベクター」は、（ａ）コンストラクトのパッケージングを支持するのに、および（ｂ）そこにクローニングされたコンストラクトを最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するそれらのコンストラクトを含むことを意味する。
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターが、Ｋｉｒ７．１発現コンストラクトの送達のため、考慮される。「アデノウイルスベクター」は、（ａ）コンストラクトのパッケージングを支持するのに、および（ｂ）そこにクローニングされたコンストラクトを最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するそれらのコンストラクトを含むことを意味する。
【0039】
アデノウイルスは、サイズ３０～３５ｋｂの範囲にあるゲノムを含む、直鎖２本鎖ＤＮＡを含む。本発明によるアデノウイルスベクターは、遺伝子操作された形態のアデノウイルスを含む。アデノウイルス遺伝子導入の利点は、分裂していない細胞、中間サイズのゲノム、操作の容易さ、高い感染性を含む、広範な細胞タイプに感染する能力を含み、それらは、高いタイターまで成長することができる。さらに、アデノウイルスＤＮＡは、他のウイルスベクターと関連する可能性のある遺伝毒性なく、エピソーム方法で複製することができるので、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体統合を生じない。アデノウイルスはまた、構造上安定であり、広範な増幅後に、ゲノム再編成は検出されなかった。本発明による典型的なアデノウイルスベクターは、アデノウイルスＥ１領域を有さない複製欠損ベクターである。アデノウイルス成長および操作は、当業者に知られており、広範な宿主範囲をインビトロおよびインビボで示す。例えば、米国特許第５，６７０，４８８号；米国特許第５，９３２，２１０号；米国特許第５，８２４，５４４号を参照。
【0040】
単純ヘルペスウイルスベクター
Ｉ型およびＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、７０～８０種の遺伝子をコードする、およそ１５０ｋｂの２本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを含有する。野生型ＨＳＶは、溶菌性に細胞に感染し、ある特定の細胞（例えば、ニューロン）における潜伏性を確立することができる。アデノウイルスと同様に、ＨＳＶはまた、様々な細胞タイプに感染することができる。治療用遺伝子送達における使用のため、ＨＳＶは、低減した複製欠損でなければならない。複製欠損ＨＳＶヘルパーウイルスを含まない細胞株を生成するためのプロトコールが、記載されている（米国特許第５，８７９，９３４号；米国特許第５，８５１，８２６号、各々が、その全体が参照により具体的に本明細書に取り込まれる）。
Ｉ型およびＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、７０～８０種の遺伝子をコードする、およそ１５０ｋｂの２本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを含有する。野生型ＨＳＶは、溶菌性に細胞に感染し、ある特定の細胞（例えば、ニューロン）における潜伏性を確立することができる。アデノウイルスと同様に、ＨＳＶはまた、様々な細胞タイプに感染することができる。治療用遺伝子送達における使用のため、ＨＳＶは、低減した複製欠損でなければならない。複製欠損ＨＳＶヘルパーウイルスを含まない細胞株を生成するためのプロトコールが、記載されている（米国特許第５，８７９，９３４号；米国特許第５，８５１，８２６号、各々が、その全体が参照により具体的に本明細書に取り込まれる）。
【0041】
他のウイルスベクター
遺伝子送達のためのウイルスベクターの開発および有用性は、一定に改善し、確信している。ポックスウイルス；例えば、ワクシニアウイルス、アルファウイルス；例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、レオウイルスおよびインフルエンザＡウイルスなどの他のウイルスベクターが、本発明における使用のため考慮され、標的システムの必要な特性に従い、選択されてもよい。
遺伝子送達のためのウイルスベクターの開発および有用性は、一定に改善し、確信している。ポックスウイルス；例えば、ワクシニアウイルス、アルファウイルス；例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、レオウイルスおよびインフルエンザＡウイルスなどの他のウイルスベクターが、本発明における使用のため考慮され、標的システムの必要な特性に従い、選択されてもよい。
【0042】
プロモーター
本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」。「プロモーター領域」または「プロモーター配列」は、一般に、遺伝子の転写制御領域を指し、それは、本明細書において記載されるポリヌクレオチドの５’もしくは３’側において、またはポリヌクレオチドのコード領域内で、またはポリヌクレオチドにおけるイントロン内で見られ得る。典型的には、プロモーターは、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始する能力のあるＤＮＡ制御領域である。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上流（５’方向）に拡大して、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必須の最小数の塩基またはエレメントを含む。転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１とともにマッピングすることにより便宜的に定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が、プロモーター配列内にある。
本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」。「プロモーター領域」または「プロモーター配列」は、一般に、遺伝子の転写制御領域を指し、それは、本明細書において記載されるポリヌクレオチドの５’もしくは３’側において、またはポリヌクレオチドのコード領域内で、またはポリヌクレオチドにおけるイントロン内で見られ得る。典型的には、プロモーターは、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始する能力のあるＤＮＡ制御領域である。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上流（５’方向）に拡大して、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必須の最小数の塩基またはエレメントを含む。転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１とともにマッピングすることにより便宜的に定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が、プロモーター配列内にある。
【0043】
一部の実施形態では、プロモーターは、Ｋｉｒ７．１が発現されるべき、細胞タイプに特異的である。例えば、適当な細胞タイプは、とりわけ、網膜色素上皮、小腸細胞、子宮細胞、腎臓細胞を含む。プロモーターは、極性化した細胞、例えば、方向性を有する細胞に特異的であってもよく、Ｋｉｒ７．１カリウムポンプは、細胞の極性化を維持するのに役割を果たす。組織特異的な方法で使用され得る適当なプロモーターは、記載されるＲＰＥプロモーター（例えば、ＥＦ１ａまたはＶＭＤ２）および以下の表７において見られるプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、対象の目における網膜色素上皮（ＲＰＥ）において活性である。
【0044】
「プロモーター」は、例えば、対象において見られるＫＣＮＪ１３遺伝子の内在性プロモーターであってもよい。あるいは、プロモーターは、異種性プロモーター（すなわち、非ＫＣＮＪ１３遺伝子のプロモーター）であってもよい。本発明の実施に有用な異種性プロモーターは、恒常的、誘導可能、一過性制御、発生に応じて制御、化学的に制御、組織優先的および組織特異的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【0045】
適当な異種性プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターまたはＶＭＤ２プロモーターを含み得るが、これらに限定されない。典型的なＥＦ１ａプロモーターは、配列番号３として提供される。典型的なＶＭＤ２プロモーターは、配列番号４として提供される。適当なＥＦ１ａプロモーターはまた、配列番号３に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する、配列番号３として提供されるＥＦ１ａプロモーターのバリアントを含んでもよい。適当なＶＭＤ２プロモーターはまた、配列番号４に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する、配列番号４として提供されるＶＭＤ２プロモーターのバリアントを含んでもよい。
【0046】
本明細書において記載されるプロモーターおよびＫｉｒ７．１ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドに関して、語句「％配列同一性」、「パーセント同一性」、または「％同一性」は、標準的なアルゴリズムを使用して整列された少なくとも２種のポリヌクレオチド配列間の塩基一致のパーセンテージを指す。ポリヌクレオチド配列のアライメント法は、周知である。
【0047】
一部の実施形態では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドをコードする開示されるポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に結合される。本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドは、それが、第２のポリヌクレオチド配列と機能的に関連して位置するとき、「作動可能に結び付けられる」か、または「作動可能に結合される」。例えば、プロモーターは、それが、ポリヌクレオチドの転写に影響し得るように、ポリヌクレオチドに結び付けられるなら、プロモーターは、ポリヌクレオチドに作動可能に結合される。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも１０種のプロモーターに作動可能に結合されてもよい。
【0048】
本明細書において使用される場合、「Ｋｉｒ７．１ポリペプチド」は、カリウムが、細胞から出るよりむしろ細胞に入ることを可能にするより大きな傾向により特徴付けられる内向き整流のカリウムチャンネルを指す。ヒトＫｉｒ７．１ポリペプチドは、配列番号１として提供される。Ｋｉｒ７．１ポリペプチドはまた、配列番号１に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する、配列番号１として提供されるヒトＫｉｒ７．１ポリペプチドのバリアントまたは相同体であってもよい。
【0049】
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」を互換的に使用して、アミノ酸のポリマーを指す。本明細書において考慮されるポリペプチドは、典型的には、天然に存在するアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）のポリマーを含む。
【0050】
Ｋｉｒ７．１ポリペプチドに関して、語句「％配列同一性」、「パーセント同一性」、または「％同一性」は、標準的なアルゴリズムを使用して整列された少なくとも２種のアミノ酸配列間の塩基一致のパーセンテージを指す。アミノ酸配列のアライメント法は、周知である。いくつかのアライメント法は、保存的アミノ酸置換を考慮する。以下でより詳細に説明される、かかる保存的置換は、一般に、置換の部位にて電荷および疎水性を保存し、これにより、ポリペプチドの構造（そしてそれ故、機能）を保存する。アミノ酸配列についてのパーセント同一性は、当該技術分野において理解される通り、決定されてもよい。（例えば、米国特許第７，３９６，６６４号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。一般的に使用され、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）により提供され、それは、そのウェブサイトでＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．を含むいくつかのソースから入手可能である。ＢＬＡＳＴソフトウエア一式は、公知のアミノ酸配列を様々なデータベース由来の他のアミノ酸配列と整列させるために使用される「ｂｌａｓｔｐ」を含む様々な配列解析プログラムを含む。
【0051】
ポリペプチド配列同一性は、例えば、特定の配列番号により定義される、定義されるポリペプチド配列全体の長さにわたり測定され得るか、またはより短い長さ、例えば、より長い定義されるポリペプチド配列、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０または少なくとも１５０の連続する残基のフラグメントから取り出されるフラグメントの長さにわたり測定されてもよい。かかる長さは、単に例示であり、本明細書、表、図または配列表において示される配列により支持される任意のフラグメント長が、パーセント同一性が測定され得る長さを記載するために使用され得ることは、理解される。
【0052】
本明細書において開示されるＫｉｒ７．１ポリペプチドは、「バリアント」ポリペプチド、「変異体」および「その誘導体」を含んでもよい。本明細書において使用される場合、用語「野生型」は、当業者により理解される業界用語であり、それは、バリアントまたは変異形態から区別される通り、天然で生じるので、ポリペプチドの典型的な形態を意味する。本明細書において使用される場合、「バリアント」、「変異体」または「誘導体」は、参照タンパク質またはポリペプチド分子と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド分子を指す。バリアントまたは変異体は、参照分子と比較して、アミノ酸残基の１つまたは複数の挿入、欠損、または置換を有してもよい。例えば、Ｋｉｒ７．１ポリペプチド変異またはバリアントは、本明細書において開示されるＫｉｒ７．１「野生型」ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の１つまたは複数の挿入、欠損、または置換を有してもよい。「野生型」Ｋｉｒ７．１ポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号１として提供される。この配列は、参照配列として使用されてもよい。
【0053】
本明細書において提供されるＫｉｒ７．１ポリペプチドは、全長ポリペプチドであってもよいか、または全長ポリペプチドのフラグメントであってもよい。本明細書において使用される場合、「フラグメント」は、配列が同一であるが、参照配列より長さが短い、アミノ酸配列の部分である。フラグメントは、最大、参照配列の全体の長さマイナス少なくとも１つのアミノ酸残基を含んでもよい。例えば、フラグメントは、それぞれ、参照ポリペプチドの５～３５０の連続するアミノ酸残基を含んでもよい。一部の実施形態では、フラグメントは、参照ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、または２５０の連続するアミノ酸残基を含んでもよい。フラグメントは、分子のある特定の領域から好ましくは選択され得る。用語「少なくともフラグメント」は、全長ポリペプチドを包含する。Ｋｉｒ７．１ポリペプチドのフラグメントは、全長Ｋｉｒ７．１ポリペプチドのアミノ酸配列の連続する部分を含むか、または本質的にからなってもよい（配列番号１を参照）。フラグメントは、全長Ｋｉｒ７．１ポリペプチドと比較して、Ｎ末端切断物、Ｃ末端切断物、または両方の切断物を含んでもよい。
【0054】
Ｋｉｒ７．１ポリペプチドにおける「欠損」は、１つまたは複数のアミノ酸残基の不存在下で生じるアミノ酸配列における変化を指す。欠損は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００以上のアミノ酸残基を取り除いてもよい。欠損は、内部欠損および／または末端欠損（例えば、Ｎ末端切断物、Ｃ末端切断物もしくは参照ポリペプチドの両方）を含んでもよい。
【0055】
Ｋｉｒ７．１ポリペプチドにおける「挿入」および「付加」は、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加を生じる、アミノ酸配列における変化を指す。挿入または付加は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上のアミノ酸残基を指してもよい。Ｋｉｒ７．１ポリペプチドのバリアントは、Ｎ末端挿入、Ｃ末端挿入、内部挿入、またはＮ末端挿入、Ｃ末端挿入、および内部挿入の任意の組み合わせを有してもよい。
【0056】
本明細書において考慮されるＫｉｒ７．１ポリペプチドバリアント、変異体、誘導体、またはフラグメントのアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸置換を含んでもよい。例えば、バリアント、変異体、誘導体、またはフラグメントポリペプチドは、参照分子と比較して保存的アミノ酸置換を含んでもよい。「保存的アミノ酸置換」は、置換が参照ポリペプチドの特性と最小で干渉すると推定される場所の異なるアミノ酸についてのアミノ酸の置換である、これらの置換である。言い換えると、保存的アミノ酸置換は、参照ポリペプチドの構造および機能を実質的に保存する。保存的アミノ酸置換は、一般に、（ａ）例えば、ベータシートもしくはアルファらせん形構造としての、置換の範囲におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）置換の部位での分子の電荷もしくは疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大きさを維持する。
【0057】
本明細書において記載される、開示されるバリアントおよびフラグメントＫｉｒ７．１ポリペプチドは、参照ポリペプチドにより示される１種または複数の機能的または生物学的活性（例えば、野生型Ｋｉｒ７．１ポリペプチド（すなわち、配列番号１）により示される１種または複数の機能的または生物学的活性）を有してもよい。適当には、開示されるバリアントまたはフラグメントＫｉｒ７．１ポリペプチドは、参照ポリペプチドのカリウムコンダクタンス特性の少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％を保持する。本明細書において使用される場合、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドの「機能的フラグメント」は、例えば、全長ＡＤＨポリペプチドのカリウムコンダクタンス特性の少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％を保持する配列番号１のポリペプチドのフラグメントである。
【0058】
さらに、追加のＫｉｒ７．１ポリペプチドバリアントは、２種以上の種由来のＫｉｒ７．１ポリペプチド配列を整列させることにより生成され得ることは、当業者に容易に明らかであろう。これらのアライメントに基づき、当業者は、ポリペプチドのカリウムコンダクタンス特性の特性に実質的に影響することなく、変更され（すなわち、置換され、欠損されるなど）得る様々なアミノ酸残基を同定してもよい。例えば、当業者は、参照Ｋｉｒ７．１ポリペプチドにおける置換は、他の種由来の他のＫｉｒ７．１ポリペプチドにおける対応する位置で生じる代替のアミノ酸残基に基づき得ることは、理解するだろう。
【0059】
一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、配列番号５（ＥＦ１ａ－Ｋｉｒ７．１）または配列番号６（ＶＭＤ２－Ｋｉｒ７．１）に対する少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであってもよい。
【0060】
治療組成物
別の態様では、本発明は、治療組成物に関する。治療組成物は、本明細書において記載される遺伝子療法ベクターのいずれかおよび医薬的に許容される担体を含んでもよい。治療組成物は、利用される投薬量および濃度でそれらに暴露されている細胞または対象にとって無毒性である、医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含んでもよい。大抵、医薬希釈剤は、ｐＨ緩衝水溶液中である。医薬的に許容される担体または賦形剤の例は、水、リン酸塩、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）ブランドの界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）界面活性剤などの非イオン性界面活性剤を含んでもよいが、これらに限定されない。
別の態様では、本発明は、治療組成物に関する。治療組成物は、本明細書において記載される遺伝子療法ベクターのいずれかおよび医薬的に許容される担体を含んでもよい。治療組成物は、利用される投薬量および濃度でそれらに暴露されている細胞または対象にとって無毒性である、医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含んでもよい。大抵、医薬希釈剤は、ｐＨ緩衝水溶液中である。医薬的に許容される担体または賦形剤の例は、水、リン酸塩、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）ブランドの界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）界面活性剤などの非イオン性界面活性剤を含んでもよいが、これらに限定されない。
【0061】
治療方法
本発明のさらなる態様では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドの不十分な発現または機能と関連する状態を有する対象を治療する方法が提供される。本方法は、治療上有効量の、本明細書において記載される遺伝子療法ベクターのいずれかまたは本明細書において記載される治療組成物を対象に投与することを含んでもよい。本明細書において使用される、用語「対象」および「患者」を互換的に使用して、ヒトと非ヒトの両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどのような哺乳類および非哺乳類を含んでもよい。一部の実施形態では、対象は、ヒト患者である。対象は、不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドを示す細胞（すなわち、ＲＰＥ細胞）を有するヒト患者であってもよい。
本発明のさらなる態様では、Ｋｉｒ７．１ポリペプチドの不十分な発現または機能と関連する状態を有する対象を治療する方法が提供される。本方法は、治療上有効量の、本明細書において記載される遺伝子療法ベクターのいずれかまたは本明細書において記載される治療組成物を対象に投与することを含んでもよい。本明細書において使用される、用語「対象」および「患者」を互換的に使用して、ヒトと非ヒトの両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどのような哺乳類および非哺乳類を含んでもよい。一部の実施形態では、対象は、ヒト患者である。対象は、不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドを示す細胞（すなわち、ＲＰＥ細胞）を有するヒト患者であってもよい。
【0062】
不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドと関連する条件は、対象が、対照と比較して、低減または除去されるＫｉｒ７．１発現または機能を細胞の内側または外側において有する条件を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「対照」は、野生型Ｋｉｒ７．１機能を有する対象を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、対照は、ＫＣＮＪ１３遺伝子の発現を制御する非制御配列（すなわち、プロモーター、エンハンサーなど）またはＫＣＮＪ１３遺伝子（すなわち、配列番号１および２）のコード領域のいずれかにおいて機能を喪失した変異を含まない、野生型ＫＣＮＪ１３遺伝子を有する対象であってもよい。
【0063】
対象は、不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドを示し得る、いくつかの「細胞」を有してもよい。本明細書において使用される場合、「細胞」は、野生型対象におけるＫｉｒ７．１ポリペプチドを正常に発現する細胞を差してもよい。適当な細胞は、網膜細胞または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞などの目の細胞を含んでもよいが、これらに限定されない。Ｋｉｒ７．１はまた、腎臓、甲状腺、ＣＮＳニューロン、上衣細胞、脈絡叢上皮、脊髄、子宮筋層平滑筋、小腸、胃粘膜ならびに胃壁細胞の神経細胞を含む様々な器官の上皮細胞、および肺、前立腺、肝臓、膵臓、蝸牛神経核、精巣および卵巣における上皮細胞である。
【0064】
一部の実施形態では、不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドと関連する状態は、ＫＣＮＪ１３遺伝子における少なくとも１つの機能喪失した変異と関連してもよい。ヒトＫＣＮＪ１３遺伝子は、ＵｎｉＰｒｏｔ０６０９２８として提供される。他の非ヒト対象におけるＫＣＮＪ１３遺伝子は、当該技術分野において周知の相同性検索方法を使用することにより同定されてもよい。ＫＣＮＪ１３遺伝子における適当な機能が喪失した変異は、Ｗ５３Ｔｅｒ、Ｑ１１６Ｒ、Ｉ１２０Ｔ、Ｔ１５３Ｉ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６６Ｔｅｒ、Ｌ２４１Ｐ、Ｅ２７６Ａ、Ｓ１０５Ｉ、およびＧ２１９Ｔｅｒからなる群から選択される配列番号１として提供されるＫｉｒ７．１タンパク質に対して少なくとも１個の置換を含み得る。一部の実施形態では、不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドと関連する状態は、レーバー先天黒内障１６（ＬＣＡ１６）、網膜色素変性症、またはスノーフレーク硝子体網膜変性（ＳＶＤ）であってもよいが、これらに限定されない。
【0065】
一部の実施形態では、不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドを示す細胞は、対象の小腸内にある。適当なベクターを、例えば、ＨＩＦＡＢＰ、ＨＭＵＣ２、またはＨＬＹ（表７において見られる）を含むが、これらに限定されない、小腸特異的プロモーターを使用して構築して、Ｋｉｒ７．１を小腸に標的化してもよい。小腸における不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１を有する対象を治療する方法は、提供される。方法は、対象の小腸においてＫｉｒ７．１の発現をもたらすために、Ｋｉｒ７．１ポリヌクレオチドに作動可能に結合された小腸特異的プロモーター、例えば、ＨＩＦＡＢＰ、ＨＭＵＣ２、もしくはＨＬＹを含む、治療上有効量の遺伝子療法ベクター、またはベクターを含む治療上有効量の治療組成物を、対象に投与することを含んでもよい。
【0066】
一部の実施形態では、細胞は、対象の子宮における不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドを示す。適当なベクターを、平滑筋特異的プロモーター、例えば、ＳＭ２２ａ（表７において見られる）を使用して構築して、Ｋｉｒ７．１を子宮に標的化してもよい。子宮における不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１を有する対象を治療する方法は、提供される。方法は、子宮においてＫｉｒ７．１の発現をもたらすために、Ｋｉｒ７．１ポリヌクレオチドに作動可能に結合された平滑筋もしくは子宮特異的プロモーター、例えば、ＳＭ２２ａを含む、治療上有効量の遺伝子療法ベクター、またはベクターを含む、治療上有効量の治療組成物を対象に投与することを含んでもよい。この方法は、子宮の平滑筋内でＫｉｒ７．１発現を制御すること、および／またはカリウムバランスを制御することにより、子宮収縮を制御することを可能にし得る。
【0067】
一部の実施形態では、不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドを示す細胞は、対象の腎臓内にある。腎特異的発現を生じる適当なプロモーターは、例えば、ＫＡＰ（腎アンドロゲンにより制御されるタンパク質）またはＮＰＨＳ２（ポドシン）プロモーターを含むが、これらに限定されない（表７を参照）。腎臓内で不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドと関連する状態を有する対象を治療する方法が、提供される。方法は、対象の腎臓においてＫｉｒ７．１を発現させるために、Ｋｉｒ７．１ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合された腎特異的プロモーター（例えば、ＫＡＰもしくはＮＰＨＳ２）を含む治療上有効量の遺伝子療法ベクター、またはかかるベクターを含む、治療上有効量の治療組成物を対象に投与することを含んでもよい。
【0068】
【表1】
【0069】
不十分な発現または機能のＫｉｒ７．１ポリペプチドと関連する状態を「治療すること」は、対象における細胞内または細胞外での機能的Ｋｉｒ７．１ポリペプチドのレベルの増加を含むが、これらに限定されない。機能的Ｋｉｒ７．１の量における増加は、それが発現される細胞内でのカリウムチャンネルの適切な機能を生じ、これにより、疾患の１つまたは複数の症状の軽減を導き得る、少なくとも約１０％、好ましくは、少なくとも約２０％、あるいは、約３０％の増加であることを必要とするのみであってもよいことは、当業者により理解されるだろう。例えば、細胞内での非機能的Ｋｉｒ７．１に対する機能的Ｋｉｒ７．１の比は、カリウムチャンネルが適切に機能するのを可能にするのに十分である必要があり、細胞タイプおよび位置に依存して、変動してもよい。
【0070】
本明細書において使用される場合、「治療上有効量」または「有効量」は、状況、障害または状態を治療するため対象に投与されるとき、治療（上で定義された）に作用するのに十分である組成物の量を意味する。治療上有効量は、化合物、製剤または組成物、治療されるべき対象の疾患ならびにその重症度および年齢、体重、物理的状態および応答性に依存して変動する。
【0071】
本明細書において記載される組成物（すなわち、遺伝子療法ベクターおよび／または治療組成物）は、例えば、眼内、局所、鼻腔内、筋肉内、もしくは皮下を含む、局所または全身を含むが、これらに限定されない、当業者に公知の任意の方法により投与されてもよい。眼内投与されるとき、一部の実施形態では、組成物（すなわち、遺伝子療法ベクターおよび／または治療組成物）は、例えば、対象の少なくとも１方の網膜への注射により網膜下投与されてもよい。網膜において、組成物（すなわち、遺伝子療法ベクターおよび／または治療組成物）の送達のための標的化領域は、中心上網膜または斑を含んでもよい。
【0072】
任意の所定の場合で投与される特定の投薬量は、当業者に周知である通り、投与される組成物または複数の組成物、治療または阻害されるべき疾患、対象の状態、および組成物の活性または対象の応答を改変し得る他の関連する医学的要因に従い調節されることは、理解されるだろう。例えば、特定の対象に特異的な用量は、年齢、体重、一般的状態の健康、食事、投与のタイミングおよび様式、組み合わせて使用される医薬ならびに療法が適用される特定の障害の重症度に依存する。所定の患者のための投薬量は、例えば、本明細書において記載される組成物の差次的活性の慣習的比較、および適当な従来の薬理学的または予防的プロトコールの手段によるなどの、公知の剤の差次的活性の慣習的比較を使用して決定することができる。対象のための最大投薬量は、所望されないか、または許容されない副作用を引き起こさない最大投薬量である。個々の治療計画に関して変動する数は多く、相当な範囲の用量が予想される。投与経路はまた、投薬要件に影響する。
【0073】
本明細書において記載される有効な投薬料は、投与される総量を指し、すなわち、１つより多くの組成物が投与されるなら、有効な投薬量は、投与される総量に対応する。組成物は、１回用量として、または分割用量として投与することができる。例えば、組成物は、４時間、６時間、８時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、１週間、２週間、または３週間以上隔てて、２回以上で投与されてもよい。
【0074】
本明細書において記載される、組成物（すなわち、遺伝子療法ベクターおよび／または治療組成物）を、対象に１回または複数回投与して、対象における細胞内または細胞外での機能的Ｋｉｒ７．１ポリペプチドのレベルを有効に増加させてもよい。組成物（遺伝子療法ベクターまたは治療組成物）は、対象に送達されるＫｉｒ７．１ポリペプチドをコードする発現コンストラクトのコピー数に基づき、投与されてもよい。対象は、１０6～１０14、もしくは１０8～１０12、もしくは１０9～１０11、またはそれらの任意の範囲のコピーで投与されてもよい。遺伝子療法ベクターがウイルスベクターである実施形態では、対象は、１０6～１０14、もしくは１０8～１０12、もしくは１０9～１０11、またはそれらの任意のウイルスゲノムで投与されてもよい。
【0075】
本開示は、本明細書において記載される構成の特定の詳細、成分の配置、または方法の工程に限定されない。本明細書において開示される組成物および方法は、以下の開示に照らして、当業者に明らかであろう様々な方法で作製され、実施され、使用され、実行されおよび／または形成される能力がある。本明細書において使用される用語および専門用語は、説明のみの目的であり、請求の範囲を制限するとみなされるべきではない。本明細書および請求の範囲において使用される第１、第２、および第３のような序数標識は、様々な構造または方法の工程を指し、任意の特定の構造もしくは工程、またはかかる構造もしくは工程についての任意の特定の順序もしくは配置を示すために構成されないことを意味する。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において別段示されないか、または文脈により明確に否定されない限り、任意の適当な順序で行うことができる。本明細書において提供される任意および全ての例、または典型的な語句（例えば、「例えば」）の使用は、開示を促すことを単に意図し、別段主張されない限り、本開示の範囲に対する制限を暗示しない。明細書における語句、および図面において示される構成はいずれも、主張されない要素が、開示される主題の実施に必須でないことを示すと解されるべきではない。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」およびそのバリエーションの本明細書における使用は、その後に挙げられる要素およびその均等物、ならびに追加の要素を包含することを意味する。ある特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」として挙げられる実施形態はまた、それらのある種の要素「から本質的になる」および「からなる」としてみなされる。
【0076】
本明細書における値の範囲の列挙は、別段本明細書において示されない限り、範囲内にある各々の別個の値を個別に反映する手短な方法として働くことが単に意図され、各々の別個の値は、それが、本明細書において個別に列挙されたように、明細書に取り込まれる。例えば、濃度範囲が、１％～５０％として示されるなら、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値が、本明細書において明確に挙げられることが意図される。具体的に意図されるものの単なる例示であり、列挙される最小値と最大値の間ならびにそれらを示す数値の全ての可能性のある組み合わせは、本開示において明確に示されるべきであるとみなされるべきである。特定の列挙される量または量の範囲を記載するための語「約」の使用は、列挙される量に非常に近い値が、製造許容差、測定を行う際の装置およびヒューマンエラーなどに起因して説明され得るか、または当然そうである値などのその量で含まれることを示すことを意味する。量に言及する全てのパーセンテージは、別段示されない限り、重量である。
【0077】
本明細書において引用される任意の非特許文献または特許文献を含む、任意の参考文献が、先行技術を構成することは、認められない。特に、別段示されない限り、本明細書における任意の文献の参照は、これらの文献のいずれかが、当該技術分野および米国または任意の他の国における共通する一般的な知識の一部を形成するという承認を構成しない。参考文献の任意の考察は、それらの著者が主張し、本出願人が、本明細書において引用される文献のいずれかの正確性および適切さに異議を唱える権利を留保するものを述べている。本明細書において引用される全ての参考文献は、別段明確に示されない限り、その全体が参照により完全に取り込まれる。本開示は、引用される参考文献において見出される任意の定義および／または記載の間にいずれかの不均衡が存在する場合には、支配するだろう。
【0078】
別段文脈により特定されないか、または示されない限り、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、「１つまたは複数」を意味する。例えば、「タンパク質」または「ＲＮＡ」は、それぞれ、「１つまたは複数のタンパク質」または「１つまたは複数のＲＮＡ」を意味すると解釈されるべきである。
【0079】
以下の実施例は、単に説明であることを意味し、本発明の範囲または添付の請求の範囲の範囲への制限として意味しない。
【実施例】
【0080】
実施例１－変異特異的な盲目のための精密医療
レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、少なくとも２１種の異なる遺伝子と関連する遺伝性小児盲目である。本発明者らは、患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を使用して、非機能的Ｋｉｒ７．１イオンチャンネルを生じるＫＣＮＪ１３遺伝子におけるナンセンス変異に起因する、ＬＣＡ１６の根底にある分子機序を明らかにした。リードスルーまたは遺伝子増大のいずれかを使用して、本発明者らは、精密医療アプローチを介して患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞におけるＫｉｒ７．１チャンネル機能を救出した。
レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、少なくとも２１種の異なる遺伝子と関連する遺伝性小児盲目である。本発明者らは、患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を使用して、非機能的Ｋｉｒ７．１イオンチャンネルを生じるＫＣＮＪ１３遺伝子におけるナンセンス変異に起因する、ＬＣＡ１６の根底にある分子機序を明らかにした。リードスルーまたは遺伝子増大のいずれかを使用して、本発明者らは、精密医療アプローチを介して患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞におけるＫｉｒ７．１チャンネル機能を救出した。
【0081】
外網膜視細胞および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において発現する少なくとも２１種の遺伝子における変異は、出生および幼児期から、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）として知られる遺伝性盲目の形態を引き起こす。過去１０年以内で、ＫＣＮＪ１３遺伝子における常染色体劣性の変異（染色体遺伝子座２ｑ３７．１上の６０３２０３）が、ＬＣＡ表現型を有する患者において同定された（ＬＣＡ１６ ＯＭＩＭ－６１４１８６、ＬＣＡを引き起こすことが示された第１６番目の遺伝子）1~3。ＬＣＡ１６病原性対立遺伝子バリアントは、ｃ．１５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）、ｃ．３５９Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｉｓｏ１２０Ｔｈｒ）、ｃ．４５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５３Ｉｓｏ）、ｃ．４９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６６Ｔｅｒ）、およびｃ．７２２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ２４１Ｐｒｏ）を含む1、2、4。加えて、化合物異種性ＫＣＮＪ１３変異ｃ．３１４Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１０５Ｉｓｏ）およびｃ．６５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇ２１９Ｔｅｒ）は、ＬＣＡ患者5における早期発症網膜ジストロフィーを引き起こすことが知られている5。常染色体優性ＫＣＮＪ１３変異であるｃ．４８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６２Ｔｒｐ）は、スノーフレーク硝子体網膜変性（ＳＶＤ ＯＭＩＭ－１９３２３０）と呼ばれる早期発症盲目を引き起こす6。
【0082】
遺伝子スクリーニングにおける進歩は、チャネル病により引き起こされる障害のアレイの本発明者らの理解を間違いなく改善し、ＫＣＮＪ１３が、健常および疾患において果たす役割の本発明者らの理解を拡張する。カリウムチャンネルを内部へ整流する、Ｋｉｒ７．１は、ＫＣＮＪ１３によりコードされ、いくつかの組織において発現する7、8。網膜において、Ｋｉｒ７．１は、ＲＰＥの細胞先端プロセスにおいてもっぱら発現し、ここで、それは、網膜の機能および健常さを調節する。他の器官におけるＫｉｒ７．１チャンネルの役割は、まだ解明されていない9、10。
【0083】
他のチャネル病と同様に、ＫＣＮＪ１３における機能の喪失は、好適な治療標的である。本発明者らは、精密医療アプローチを適応し、ここで、本発明者らは、患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を使用して、ＬＣＡ１６をモデルにし、変異特異的かつ遺伝子増大アプローチに基づき、新規の療法を探索した。
【0084】
結果
本発明者らは、マウス網膜におけるＫｉｒ７．１の標的化阻害（ｓｉＲＮＡまたは薬理学的ブロッカーのいずれかを使用して誘導した）が、ＬＣＡ１６患者において観察されたものと一致する、変化した網膜電図表現型を引き起こすことを、既に報告した11。ここで、本発明者らは、ＫＣＮＪ１３遺伝子のエクソン２におけるナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）を有し、罹患していない健常なファミリーメンバーである、一人のＬＣＡ１６患者からの皮膚生検由来の患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の本発明者らの開発の概要を述べる。本発明者らは、転写因子の混合物を使用して、インビトロ分化を介して得たＲＰＥ細胞における特徴的なＬＣＡ１６病理特性をモデル化することができた12。これらの細胞は、敷石の様子および色素沈着を含む、正常なＲＰＥ形態を有していた（図１Ａおよび１Ｂ）。ＤＮＡ配列決定により、対照細胞が異種性であり、一方、ＬＣＡ１６細胞が、変異１５８Ｇ＞Ａについてホモ接合性であることを確認した。加えて、ＬＣＡ１６細胞は、正常な核型を有していた（図１Ｃ）。ＬＣＡ１６変異は、Ｎｈｅ１の制限酵素を導入し、これにより、Ｋｉｒ７．１変異配列を患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおいて同定し、ホモ接合性変異の存在をさらに検証することを可能にした（図１Ｄ）。対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥを試験し、ドナーの遺伝子型と一致する、異種性キャリアであると見出した（図１Ｄ）。２つの細胞タイプの間でＲＰＥ特異的遺伝子の発現の差はなかった（図１Ｅ）。したがって、患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、遺伝性網膜ジストロフィーの遺伝子型を有し、それゆえ、疾患特異的な細胞モデルをもたらすと確認した1。
本発明者らは、マウス網膜におけるＫｉｒ７．１の標的化阻害（ｓｉＲＮＡまたは薬理学的ブロッカーのいずれかを使用して誘導した）が、ＬＣＡ１６患者において観察されたものと一致する、変化した網膜電図表現型を引き起こすことを、既に報告した11。ここで、本発明者らは、ＫＣＮＪ１３遺伝子のエクソン２におけるナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）を有し、罹患していない健常なファミリーメンバーである、一人のＬＣＡ１６患者からの皮膚生検由来の患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の本発明者らの開発の概要を述べる。本発明者らは、転写因子の混合物を使用して、インビトロ分化を介して得たＲＰＥ細胞における特徴的なＬＣＡ１６病理特性をモデル化することができた12。これらの細胞は、敷石の様子および色素沈着を含む、正常なＲＰＥ形態を有していた（図１Ａおよび１Ｂ）。ＤＮＡ配列決定により、対照細胞が異種性であり、一方、ＬＣＡ１６細胞が、変異１５８Ｇ＞Ａについてホモ接合性であることを確認した。加えて、ＬＣＡ１６細胞は、正常な核型を有していた（図１Ｃ）。ＬＣＡ１６変異は、Ｎｈｅ１の制限酵素を導入し、これにより、Ｋｉｒ７．１変異配列を患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおいて同定し、ホモ接合性変異の存在をさらに検証することを可能にした（図１Ｄ）。対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥを試験し、ドナーの遺伝子型と一致する、異種性キャリアであると見出した（図１Ｄ）。２つの細胞タイプの間でＲＰＥ特異的遺伝子の発現の差はなかった（図１Ｅ）。したがって、患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、遺伝性網膜ジストロフィーの遺伝子型を有し、それゆえ、疾患特異的な細胞モデルをもたらすと確認した1。
【0085】
Ｋｉｒ７．１チャンネルは、ＲＰＥの高度に専門化した頂端膜プロセス内に局在化する11、13。未変化の頂端膜構造の電子顕微鏡画像解析により、細胞が、未変化の基底膜陥入を含む、極性化した構造を有し、対照において長さ１．４９±０．０５μｍ、および変異において長さ１．５±０．１４μｍ（Ｐ＝０．９６、ｎ＝７）を引き延ばしたことを示した（図１Ｆ、Ｈおよび図３Ａ～３Ｄ）。２種の細胞株におけるミトコンドリアの分布および数は、正常であると明らかになり、それぞれ、対照および変異細胞において平均８．４±１および６．２２±０．８であった（Ｐ＝０．１２、ｎ＝６）（図１Ｆおよび１Ｇ）。Ｋｉｒ７．１タンパク質発現を、正常な対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の頂端膜で検出したが、ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞において検出しなかった（図１Ｉおよび１Ｊ）。本発明者らは、Ｋｉｒ７．１を除き、２種の細胞株間でのタンパク質発現の差を見出さなかった（図１Ｋ）。Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ遺伝子座は、３－エクソンＫＣＮＪ１３配列の第２のエクソン内に位置する。本発明者らは、アミノ酸５３でのナンセンス置換が、ＬＣＡ１６患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥが、全長Ｋｉｒ７．１タンパク質の発現に失敗したかを説明する、切断したタンパク質産物を生じることを既に示した。
【0086】
ＰＥ細胞の鍵となる生理学的機能の１つは、再生プロセスに関与する、視細胞外節の日常的な食作用である。正常なＫｉｒ７．１タンパク質の不存在が、食作用を変化させるかどうかを試験するために、本発明者らは、蛍光標識した視細胞外節（ＰＯＳ）とともに対照とＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ 細胞培養物の両方に栄養を与えた。細胞に、ＰＯＳを４時間与え、次に、ＲＰＥ細胞によるファゴソーム消化を、さらに４８時間した。次に、本発明者らは、対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥが、ＬＣＡ１６患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥより高い割合のファゴソーム取り込みを示すことを決定した（１６９±４０対６６．５±７．４、Ｐ＝０．０４、ｎ＝４）（図１Ｌ、１Ｍおよび１Ｎ）。対照的に、細胞にＰＯＳを１日与え、ファゴソーム消化を６日間させたとき、ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞は、ＰＯＳ消化に失敗した（２００μｍ2の視野内で８０．２±１１．１対２４４．２±２７．６数、Ｐ＝０．００１、ｎ＝４）（図３Ａ～３Ｄ）。この発見は、ＬＣＡ１６において観察した色素沈着が、ＰＯＳを正常に貪食できないことに起因するようであり、それ故、罹患した個体の網膜において経時的に蓄積することを示唆する。
【0087】
本発明者らは、非機能的チャンネルが、ＬＣＡ１６表現型に関与すると仮定し、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を用いて細胞全体の電気生理学を行うことにより、この仮定を試験した。ｉＰＳＣ細胞におけるイオンチャンネルの研究における課題の１つは、それらの低レベルの発現であるか、または発現を欠くことである。本発明者らは、専門化した頂端プロセスの発生を示し、Ｋｉｒ７．１が、頂端膜に局在化することを示したので、本発明者らは、対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞において少ないが、測定可能なＫｉｒ７．１電流（－１２０．２±３７ｐＡ）を検出することができた。正常な機能を、Ｋｉｒ７．１チャンネルの特異的な特性である、Ｒｂ＋透過性（－４３９．５±１５５．７ｐＡ、ｎ＝５）における倍加増加により確認した（図２Ａおよび２Ｃ）14。しかしながら、ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞において、本発明者らは、Ｒｂ＋コンダクタンスにより仲介される電流振幅における倍加変化を検出しなかった（－９８．１±１５．７ｐＡおよび－１００．７±１５．９ｐＡ、ｎ＝９）（図２Ｂおよび２Ｃ）。電流振幅（ＲｂでＰ＝０．０００６）と細胞膜電位（－５０±５．１対－３０．６±３．７ｍＶ、Ｐ＝０．０００５；図２Ｄにおいて示す）の両方の直接比較は、盲目の原因が、切断した非機能的Ｋｉｒ７．１チャンネルであるという本発明者らの仮説を支持する。本発明者らは、マウスおよびＫｉｒ７．１チャンネルの外来性発現を使用して、非機能的チャンネルが、ＲＰＥ細胞を脱分極させることを以前に示した1、11。
【0088】
本発明者らが研究しているＬＣＡ１６変異は、アンバー停止コドン（ＵＡＧ）バリアントに対するトリプトファン（ＵＧＧ）である。真核生物におけるこのナンセンス変異は、小分子リードスルーデザイナーアミノグリコシドＮＢ８４の存在における近縁の同族アミノ酸ｔＲＮＡの取り込みにより抑制することができる（米国特許公開第２０１４０３５７５９０Ａ１号）15~17。本発明者らは、ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞におけるＫｉｒ７．１電流のＮＢ８４介在性リードスルーの機能的結果をさらに評価した。５００μＭ ＮＢ８４での処理後、本発明者らは、浸透性イオンである、Ｒｂ＋の導入の際に１０倍増強された（－１５６２．７±５４６．７ｐＡ、Ｐ＝０．００５、ｎ＝８）であった－９４．３±２４ｐＡであるＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥにおける測定可能な電流を得た（図２Ｅおよび２Ｆ）。未処理の細胞における－３０．６±３．７から処理した細胞における－５６．３±３．６ｍＶ（Ｐ＝０．０００１、ｎ＝１０）（図２Ｇ）への膜電位の有意な回復は、リードスルー薬物療法の使用をさらに正当化した。本発明者らは、細胞のサブグループが、電流振幅における有意な変化を伴わず、膜電位において救出したことを示すことができた（図４Ａ～４Ｄ）。この結果は、近縁の同族アミノ酸（ＵＡＣ－チロシン、ＵＣＧ－セリン、ＧＡＧ－グルタミン酸、またはＣＡＧ－グルタミンに対してＵＡＧ）が、Ｋｉｒ７．１タンパク質翻訳中に取り込まれるということにおそらく基づく。Ｋｉｒ７．１タンパク質の検出を最適化するために、本発明者らは、低発現レベルのＫｉｒ７．１－ＧＦＰ融合クローンを含む安定な細胞株を使用した。ＮＢ８４試験細胞において、整流した膜電位および電流と併せて、全長産物に均等なタンパク質バンドを、切断したタンパク質バンドに加えて検出した（図２Ｈ、２Ｉおよび図５Ａ～５Ｄ）。ＮＢ８４は、劣性Ｔｒｐ５３Ｔｅｒコドン変異の特定のリードスルーを増し、本発明者らは、機能的チャンネルの２５％と同等に低い救出が、膜電位とカリウム電流の両方を回避するのに十分であり、これにより、疾患表現型を救出することを見出した（図６Ａ～６Ｄ）。
【0089】
本明細書において研究した特定の変異および盲目を引き起こす他の変異は、盲目のための最近のＦＤＡ承認処置を与える、遺伝子療法の可能性のある標的である18、19。本発明者らは、ＥＦ１ａプロモーターの制御下でヒトＫｉｒ７．１オープンリーディングフレームに融合したＮ末端ＧＦＰを含むレンチウイルスベクターを設計した20。興味深いことに、レンチウイルス粒子での形質導入後、Ｋｉｒ７．１発現細胞は、正常なＫｉｒ７．１電流または対照細胞において観察したものよりわずかにだが高い振幅を提示した（－９２０．５±２２３ｐＡ、Ｐ＝０．００１、ｎ＝８）。この電流を、正常に機能するＫｉｒ７．１チャンネルについて予測した通り、Ｒｂ＋の導入によりさらに増した（－５４５２．８±９２９ｐＡ）（図２Ｊおよび２Ｋ）。Ｋ＋電流に加えて、ＬＣＡ１６ ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の膜電位を正常化した（－５７．５±５．４ｍＶ、Ｐ＝０．０００８）（図２ｌ）。さらに、新たに発現したＫｉｒ７．１は、疾患のｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の頂端膜に局在化することを示した（図２Ｍおよび２Ｎ）。したがって、ＲＰＥ細胞におけるＫｉｒ７．１機能の反転は、ＫＣＮＪ１３変異に起因する先天性盲目を有する患者における視力を改善する可能性のある介入である。
【0090】
要約すると、常染色体劣性ＬＣＡ１６において、本発明者らは、初期化したｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を使用して、ナンセンス変異と関連する固有の特性を同定した。膜電位は、疾患の細胞において脱分極し、ＰＯＳの貪食を不可能にするという知見は、網膜電図異常および網膜色素沈着などのそれらの他の臨床症状に加えて、ＬＣＡ１６患者において観察した盲目へのゆっくりとした進行と一致する。ｉＰＳＣ－ＲＰＥモデルにおける内在性発現Ｋｉｒ７．１を使用し、本発明者らは、デザイナーアミノグリコシドを介したナンセンス変異抑制を使用した両方の変異特異的な療法、および／またはレンチウイルス遺伝子増大を介したチャネル病の救出が、カリウム電流および正常な膜電位を生じることを示した（図７Ａ～７Ｄ）。したがって、本発明者らは、本明細書において、遺伝子疾患を治癒するための小児の盲目のための前臨床療法および精密医療アプローチを示す。
【0091】
方法
ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥの分化。２人の対象由来の線維芽細胞を初期化して、多能性幹細胞を誘導し、確立した方法を使用して培養した1~3。対象の一方は、ＫＣＮＪ１３遺伝子において２コピーのＴｒｐ５３Ｔｅｒ常染色体劣性変異を有するＬＣＡ１６患者であり、第二の対象は、この変異について異種性であった。ｈｉＰＳＣ株を、従前に記載されたプロトコールを使用してＲＰＥに分化させた2~5。簡単に言うと、ｈｉＰＳＣを、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上、ｉＰＳ細胞培地（ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）：Ｆ１２（１：１）、２０％ノックアウト血清、１％基礎培地（ＭＥＭ）非必須アミノ酸、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、β－メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－２）、またはｍＴｅＳＲ１培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のいずれかにおいて培養した。細胞を、酵素で持ち上げ、ＦＧＦ－２を含まないｉＰＳ培地において胚様体（ＥＢ）として成長させ、４日目に、中性誘導培地（ＮＩＭ；ＤＭＥＭ：Ｆ１２；１％ Ｎ２補充、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％Ｌ－グルタミン、２μｇ／ｍｌヘパリン）に変えるか、またはｍＴｅＳＲ１において、４日目までに徐々に移行した。これらの２つのアプローチ間でのＲＰＥ分化における差を観察しなかった。７日目に、自由に浮遊するＥｂを、ラミニンコート培養プレートに播種して、接着培養として分化を継続させた。１６日目に、３Ｄ神経構造を取り出し、培地を、網膜分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）、２％Ｂ２７補充（レチノイン酸を含まない）、１％抗生物質－抗真菌剤）に変えた。残る付着細胞を、さらに４５日間分化を継続し、続いて、マイクロダイセクションおよび従前に記載5された通り、精製した単層のＲＰＥを得るための色素ＲＰＥパッチを継代させた。ＭＥＦ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびＦＧＦ－２を、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入し、全ての他の組織培養試薬を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。
ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥの分化。２人の対象由来の線維芽細胞を初期化して、多能性幹細胞を誘導し、確立した方法を使用して培養した1~3。対象の一方は、ＫＣＮＪ１３遺伝子において２コピーのＴｒｐ５３Ｔｅｒ常染色体劣性変異を有するＬＣＡ１６患者であり、第二の対象は、この変異について異種性であった。ｈｉＰＳＣ株を、従前に記載されたプロトコールを使用してＲＰＥに分化させた2~5。簡単に言うと、ｈｉＰＳＣを、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上、ｉＰＳ細胞培地（ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）：Ｆ１２（１：１）、２０％ノックアウト血清、１％基礎培地（ＭＥＭ）非必須アミノ酸、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、β－メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－２）、またはｍＴｅＳＲ１培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のいずれかにおいて培養した。細胞を、酵素で持ち上げ、ＦＧＦ－２を含まないｉＰＳ培地において胚様体（ＥＢ）として成長させ、４日目に、中性誘導培地（ＮＩＭ；ＤＭＥＭ：Ｆ１２；１％ Ｎ２補充、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％Ｌ－グルタミン、２μｇ／ｍｌヘパリン）に変えるか、またはｍＴｅＳＲ１において、４日目までに徐々に移行した。これらの２つのアプローチ間でのＲＰＥ分化における差を観察しなかった。７日目に、自由に浮遊するＥｂを、ラミニンコート培養プレートに播種して、接着培養として分化を継続させた。１６日目に、３Ｄ神経構造を取り出し、培地を、網膜分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）、２％Ｂ２７補充（レチノイン酸を含まない）、１％抗生物質－抗真菌剤）に変えた。残る付着細胞を、さらに４５日間分化を継続し、続いて、マイクロダイセクションおよび従前に記載5された通り、精製した単層のＲＰＥを得るための色素ＲＰＥパッチを継代させた。ＭＥＦ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびＦＧＦ－２を、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入し、全ての他の組織培養試薬を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。
【0092】
ＲＴ－ＰＣＲおよび制限断片長多型（ＲＦＬＰ）。トータルＲＮＡを、製造元（Ｑｉａｇｅｎ）の指示に従い、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して、患者とキャリアの両方から成熟ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞から単離した。単離したＲＮＡの質および濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定し、ＲＮＡ２００ｎｇを、製造元（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の指示に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩファーストストランドｃＤＮＡ合成キットを使用して、ｃＤＮＡ合成のため使用した。ＰＣＲを、ＭｙＴａｑＨＳマスターミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて、最終体積２５μｌにおいて、次の条件：９５℃で５分間、続いて、９５℃で１５秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長の３５サイクルで行った。最終の伸長工程を、７２℃で１０分間行い、増幅産物を、ミドリグリーンアドバンス株（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ）を含有する２％アガロースゲルでの電気泳動により視覚化した。ＲＦＬＰアッセイのため、ＰＣＲを、全長ＫＣＮＪ１３ ｍＲＮＡに特異的なプライマー（フォワード５｀－ＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＴＴＧ－３｀（配列番号７）およびリバース５｀－ＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴ－３｀（配列番号８）を用いて、記載した通り行った。次に、ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩ制限酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により消化し、ミドリグリーンアドバンス株（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ）を含有する２％アガロースゲルでの電気泳動により視覚化した。
【0093】
透過型電子顕微鏡。トランスウエルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７０）上の単層のｈｉＰＳＣ－ＲＰＥを、０．１Ｍナトリウムリン酸緩衝液（ＰＢ）中の２．５％グルタルアルデヒド、２．０％パラホルムアルデヒドの溶液において、ｐＨ７．４で約１時間、室温（ＲＴ）で固定した。試料を、０．１Ｍ ＰＢにおいて５×５分間洗浄した。次に、洗浄した培養物を、ＰＢ中の１％四酸化オスミウム（ＯｓＯ4）、１％フェロシアン化カリウムで、１時間、ＲＴで後固定した。後固定後、試料を、前の通り、ＰＢにおいて洗浄し、続いて、蒸留水において３×５分間洗浄して、リン酸塩を透明化した。次に、試料を、酢酸ウラニルにおいて、２時間、ＲＴで一括して染色し、エタノール連続物を使用して脱水した。膜を、トランスウエル支持体から切り出し、アルミニウム秤量ディッシュに入れ、プロピレンオキシド（ＰＯ）に移行し、フレッシュＰｉｌｙＢｅｄ ８１２（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）において重合させた。超薄切片を、これらの重合化試料から調製し、処理し、その後、ＡＭＴ ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ１２（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｏｒｐ．Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）デジタルカメラを備えたＦＥＩ ＣＭ１２０透過型電子顕微鏡で画像を取得し、記載した。
【0094】
免疫細胞化学（ＩＣＣ）。患者または対照のいずれか由来の単層のｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を含むトランスウエルインサートを、次の通り固定した：トランスウエル膜を、切り出し、それを、リン酸緩衝生理食塩水中の４％パラホルムアルデヒドにおいて、１０分間、暗所で浸漬することにより固定した。次に、細胞を含む膜を、冷却したＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢＳ中の５％ヤギ血清および０．２５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するブロッキング溶液において２時間ブロッキングした。共焦点顕微鏡について、次に、細胞を、インキュベーション溶液（１×ＰＢＳで１：３に希釈したブロッキング溶液）において調製した、Ｋｉｒ７．１（マウスモノクローナルＩｇＧ、１：２５０－ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、およびＺＯ－１（ウサギポリクローナル、２．５μｇ／ｍｌ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に対して産生した１次抗体と共に、２４～４８時間インキュベーションした。１次抗体とのインキュベーション後、膜を、冷却１×ＰＢＳで３回洗浄し、インキュベーション中の結合した２次抗体（ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４およびＤＡＰＩ、１：５００）と共に、１時間、暗所でインキュベーションした。１次抗体対照を、全ての実験について含めなかった。免疫染色した試料を、Ｎｉｋｏｎ Ｃ２共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）で画像化した。
【0095】
ウエスタンブロット。タンパク質を、超音波処理と共に、放射性免疫沈降（ＲＩＰＡ）溶解バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、トランスウエル上での＞６０日齢のｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞から単離した6。溶解物のタンパク質含有量を、市販のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。試料を、均等量のタンパク質を含有するように希釈し、２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４－１２％成形後のポリアクリルアミドゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で電気泳動し、続いて、ｉＢｌｏｔ（登録商標）乾燥ブロットシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移行した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するオデッセイブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、少なくとも２時間、４℃でブロッキングした。ブロッキング後、膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するオデッセイブロッキング緩衝液において調製した適当な１次抗体においてインキュベーションした。この目的のため使用した１次抗体は、抗Ｋｉｒ７．１（マウスモノクローナル、１：１０００－Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ１（マウスモノクローナル、１：１０００－Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、抗ＲＰＥ６５（マウスモノクローナル、１：１０００－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗ＧＦＰ（マウスモノクローナル、１：１０００－ＮｅｕｒｏＭａｂ）、抗ＧＡＰＤＨ（ウサギモノクローナル、１：１０００－Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、および負荷対照としての抗β－アクチン（ウサギモノクローナル、１：１０００－Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。膜を、対照と併用して、これらの１次抗体と、一晩、４℃でインキュベーションし、次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するトリス緩衝化生理食塩水で４回洗浄し、その後、それらをさらに１時間、ブロッキングバッファー中１：２００００希釈での適当なＩＲＤｙｅ（商標）２次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベーションした。膜を、４回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）画像システムで画像化した。
【0096】
視細胞外節（ＰＯＳ）単離。新鮮なウシの目を、ほの暗い赤色の光の下で解体し、網膜を、眼杯から注意深く取り出した。単離した網膜を、冷却した均質化溶液（２０％ｗ／ｖスクロース、２０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ７．２、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭグルコース、５ｍＭタウリン）に入れ、優しく混合した。次に、懸濁液をガーゼに通して、凝集塊を取り除いた。この濾液を、２５～６０％スクロース勾配を通して、２５０００ｒｐｍで１時間、４℃で遠心分離した。ＰＯＳを含有するピンク色がかった層を取り出し、それぞれ、３０００ｇで１０分間遠心分離することにより、洗浄溶液１（２０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．２および５ｍＭタウリン）、洗浄溶液２（１０％スクロース、２０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．２および５ｍＭタウリン）ならびに洗浄溶液３（１０％スクロース、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２および５ｍＭタウリン）で洗浄し、その後、２．５％スクロースを含有するＤＭＥＭに再懸濁し、使用まで－８０℃で保存した。ＰＯＳを蛍光標識するために、未標識のアリコートを融解し、２４００ｇで５分間遠心分離した。次に、ペレットを、ＤＭＥＭ２００μｌに再懸濁した。この溶液に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（登録商標）（１ｍｇ／ｍｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と結合したＷＧＡ（Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）溶液１μｌを混合し、１０分間、３７℃でインキュベーションした。ＷＧＡとのインキュベーションの完了後、試験管を、２４００ｇで５分間、再度遠心分離し、ＰＯＳペレットを、ＤＭＥＭで２回洗浄し、その後、食作用アッセイのため使用した。
【0097】
食作用アッセイ。標識したＰＯＳを、培養培地に加え、トランスウエルにおいて成長しているｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞に栄養を与え、これは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞１５０Ωｃｍ2を有していた1。細胞に、ＰＯＳを４時間または２４時間与え、その後、貪食されなかったＰＯＳを、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄することにより、取り除いた。次に、細胞を、それぞれ、２４時間または６日間インキュベーションし、その後、画像化した。画像を取得し、Ｎｉｋｏｎ Ｃ２共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用して、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔで解析した。
【0098】
ＧＦＰ融合タンパク質の免疫沈殿および銀染色：ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、一過性に遺伝子導入して、Ｋｉｒ７．１ ＷＴタンパク質またはＫｉｒ７．１ Ｔｒｐ５３Ｔｅｒタンパク質のいずれをＧＦＰとのＮ末端融合物として外来性に発現させた。次に、Ｔｒｐ５３Ｔｅｒタンパク質発現細胞を、ＮＢ８４で処理した8。免疫沈殿を、製造元のプロトコールに従い、ＧＦＰ－Ｔｒａｐアガロースビーズ（ＣｈｒｏｍｏＴｅｋ、ドイツ）を使用して行った6。簡単に言うと、細胞を収集し、ウエスタンブロットのため、上記の通り、タンパク質を単離した。ＧＦＰ－トラップアガロースビーズを、細胞溶解物に加え、一定に混合しながら、４℃で２時間インキュベーションした。次に、混合物を、２５００ｇで２分間遠心分離して、ビーズを、２回洗浄した。ＳＤＳ試料緩衝液を、ビーズに加え、９５℃で１０分間インキュベーションし、続いて、２５００×ｇで遠心分離した。上清を４－１２％アクリルアミドゲル上で分離し、タンパク質バンドを、製造元の指示に従い、Ｐｉｅｒｃｅ銀染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、銀染色により視覚化した。
【0099】
ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ形質導入。病原体エレメントを回避するよう顧客操作し、ＥＦ１ａプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＮ末端で融合したＫＣＮＪ１３遺伝子を有する、レンチウイルスを、Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）により生成し、形質導入のため使用した9。ＬＣＡ－１６ ｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ単層に、２００のＭＯＩでｐＬＶ－ＥＦ１α Ｋｉｒ７．１－ ＧＦＰを感染させた。感染後、細胞を、４～５日間培養し、次に、免疫細胞化学およびウエスタンブロットのため使用した。
【0100】
電気生理学。単一の細胞において標準的な細胞全体のパッチクランプを、記載6される通り、行った。簡単に言うと、６．５ｍｍのトランスウエルで成長させた、堅固な単層のｈｉＰＳＣ－ＲＰＥを、次の通り、単一細胞の懸濁液に分離した：細胞を維持した培地を、完全に除去し、細胞を、０ＮａＣＭＦ溶液（１３５ｍＭ ＮＭＤＧ－Ｃｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、２ｍＭ ＥＤＴＡ－ＫＯＨ、ＮＭＤＧ遊離塩基でｐＨ７．４に調整した）で２回洗浄した。次に、細胞を、パパイン（２．５μｌ／ｍｌ）、システイン（０．３ｍｇ／ｍｌ）、グルタチオン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）およびタウリン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を含有する０ＮａＣＭＦと共に、４５分間、３７℃でインキュベーションした。細胞を、０ＮａＣＭＦ溶液で洗浄して、酵素を取り除き、ＨＥＰＥＳ－リンガー（ＨＲ）溶液［ＮａＣｌ（１３５ｍＭ）、ＫＣｌ（５ｍＭ）、ＣａＣｌ2（１．８ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、Ｄ－グルコース（１０ｍＭ）、ＮａＯＨでｐＨ７．４±０．１、ｄｄＨ2Ｏ中に調製］に再懸濁し、電気生理学的記録のため使用するまで、氷上で最大８時間維持した。
【0101】
別個の頂端プロセスを有する単一のｈｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を、従来のパッチクランプのため選択した。抵抗性３－５ｍΩを有するパッチピペットを、ピペットプラー（Ｐ－１０００（登録商標）、サッター装置）を使用して、ホウケイ酸キャピラリーから作り上げた。次に、ガラス電極を、小さな炉（ＭＦ－８３０（登録商標）、Ｎａｒｓｈｉｇｅ）を使用して、熱で磨いた。データ取得および保持電位パラメーターを、Ｃｌａｍｐｅｘ（登録商標）ソフトウエア（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して制御した。成功したパッチから記録した電流を、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００－Ｂ（登録商標）（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して増幅し、２ＫＨｚでフィルターをかけた。シグナルを、ｄｉｇｉｄａｔａ １４００Ａ（登録商標）（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデジタル化し、Ｃｌａｍｐｆｉｔ（登録商標）（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して解析した。パッチクランプ中に、ＨＲ溶液を、外部溶液として継続的に灌流した。パッチピペットに、３０ｍＭ ＫＣｌ、８３ｍＭ Ｋ－グルコ酸塩、５．５ｍＭ ＥＧＴＡ－ＫＯＨ、０．０５ｍＭ ＣａＣｌ2、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨで７．２調整したｐＨの溶液を充填し、０．２μｍのフィルターを使用して濾過した。
【0102】
統計的分析。統計的分析を、Ｏｒｉｇｉｎ（バージョン９．１）を使用して、両側スチューデントｔ検定で行い、有意差を評価した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意であるとみなした。ＡＮＯＶＡおよび事後テューキー検定も、複数の比較のため使用した。データを平均±ＳＥＭとして現す。
【0103】
方法についての参考文献
1.Singh, R. et al. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet 22, 593-607 (2013).
2.Meyer, J.S. et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 16698-703 (2009).
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4.Capowski, E.E. et al. Loss of MITF expression during human embryonic stem cell differentiation disrupts retinal pigment epithelium development and optic vesicle cell proliferation. Hum Mol Genet 23, 6332-44 (2014).
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9.Yanez-Munoz, R.J. et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med 12, 348-53 (2006).
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【0104】
方法以外の実施例１についての参考文献
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19.Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K. & Sahel, J.A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Hum Gene Ther 27, 134-47 (2016).
20.White, M., Whittaker, R., Gandara, C. & Stoll, E.A. A Guide to Approaching Regulatory Considerations for Lentiviral-Mediated Gene Therapies. Hum Gene Ther Methods 28, 163-176 (2017).
【0105】
実施例２－細胞培養モデルおよびインビボでのＫｉｒ７．１遺伝子療法
ＬＣＡ１６の細胞培養モデルにおいて遺伝子療法の有効性を試験するために、本発明者らは、Ｋｃｎｊ１３遺伝子におけるＷ５３Ｘ変異を有するＣＨＯ細胞におけるＡＡＶ－Ｋｉｒ７．１の生理学的欠損を救出する能力を試験した。図８は、野生型（左パネル）とＷ５３Ｘ変異（右パネル）安定細胞由来の細胞全体の電流と電位の関係を示す。野生型の安定な細胞における内部に整流するＫ＋電流（黒色のトレース）は、Ｒｂ＋（赤色のトレース）により優位に増加した。右側のＷ５３Ｘ変異の安定な細胞において、Ｋ＋電流もＲｂ＋電流も記録しなかった（ｐ＝１．０５Ｅ－０．５）。
ＬＣＡ１６の細胞培養モデルにおいて遺伝子療法の有効性を試験するために、本発明者らは、Ｋｃｎｊ１３遺伝子におけるＷ５３Ｘ変異を有するＣＨＯ細胞におけるＡＡＶ－Ｋｉｒ７．１の生理学的欠損を救出する能力を試験した。図８は、野生型（左パネル）とＷ５３Ｘ変異（右パネル）安定細胞由来の細胞全体の電流と電位の関係を示す。野生型の安定な細胞における内部に整流するＫ＋電流（黒色のトレース）は、Ｒｂ＋（赤色のトレース）により優位に増加した。右側のＷ５３Ｘ変異の安定な細胞において、Ｋ＋電流もＲｂ＋電流も記録しなかった（ｐ＝１．０５Ｅ－０．５）。
【0106】
図９は、Ｗ５３Ｘ変異発現ＣＨＯ細胞の遺伝子増大が、従前の電流なし（図９Ａ、黒色のトレースでのプロット）と比較して、平均内部整流Ｋ＋電流（図９Ａ、赤色のトレースにおけるＩＶプロット）の回復を有することを示す。（図９Ｂ）遺伝子増大後のＷ５３Ｘ変異発現細胞における平均のより高いＲｂ＋電流（赤色のトレース）。（図９Ｃ）Ｒｂ＋透過性における正味の増加は、遺伝子増大後にＫｉｒ７．１ チャンネルを介して増加した（青色）。（図９Ｄ）Ｗ５３Ｘ発現細胞のＡＡＶ－Ｋｉｒ７．１形質導入後の静止膜電位（ＲＭＰ）の完全な回復は、青色の四角として表した。（図９Ｅ）列Ｗ５３Ｘ＋ＡＡＶ（赤色のバンド）における遺伝子増大後の全長タンパク質産物の発現を示す、ウエスタンブロット結果。
【0107】
図１０は、ＡＡＶ－Ｋｉｒ７．１を通じて遺伝子増大後のＷ５３Ｘ変異列におけるＫｉｒ７．１発現（緑色）を示す（図１０Ａ）。（図１０Ｂ）より高い拡大率の画像は、膜マーカーＷＧＡ－Ａｌｅｘａ ５９４に並んだＫｉｒ７．１タンパク質の膜局在化を示す。より下のパネルにおいて、赤色および緑色についてのラインスキャンは、膜マーカーおよびＫｉｒ７．１共局在化を示す。
【0108】
インビボで遺伝子療法の有効性を試験するために、野生型とＫｃｎｊ１３遺伝子を欠くマウスの両方を試験した。図１１において、左の四角は、網膜下注射により、レンチ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰＫｉｒ７．１ ２μｌを受け取った野生型マウスの例である。電気生理学的結果を、注射前（黒色のトレース）ならびに注射の１週間後（青色のトレース）、２週間後（赤色のトレース）、および４週間後（緑色のトレース）で得た。図１１の左の四角において、正常なａ波およびｂ波として記録した網膜応答を、左側に示し、ＲＰＥ細胞応答ｃ波を、右側に示す。注射の１週間後においてのみ、網膜応答が低減し、それ以外は、電気生理学的結果に対する遺伝子療法の効果は極めて少なかった。図１１の右の四角において、本発明者らは、レンチ－ＥＦ１ａ－ｅＧＦＰＫｉｒ７．１ ２μｌを受け取った、Ｋｃｎｊ１３遺伝子を欠くマウスの結果を示す。右パネル上は、ｃ波のＲＰＥ応答であり、これらのマウスにおいて完全に消失し、これは、左パネルにおいて示すａ波およびｂ波におけるわずかの低減を伴った。遺伝子療法直後、本発明者らは、ｃ波応答における増加に気づき、これは、注射の１週間後に始まった（右パネルの青色のトレース）。トレースは、遺伝子療法後の２週間（赤色のトレース）および４週間（緑色）の間のｃ波においける継続的増加を示す。４匹の野生型およびＫｃｎｊ１３遺伝子を欠く４匹のマウスにおける平均測定値を、四角のプロットとして示し、これは、ｃ波における有意な回復を伴い、野生型マウスの視力に対する作用を伴わなかった。図の下の数字は、野生型およびＫｃｎｊ１３を欠くマウスにおけるａ波、ｂ波およびｃ波の実際の振幅を示す。
【0109】
さらに、図１４Ａ～Ｆは、ｃＫＯマウスモデルにおける遺伝子療法後のＫｉｒ７．１タンパク質を欠く網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の機能回復を示す。図１４Ａは、ＷＴマウスおよびｃＫＯ対照マウスにおける注射対照を示し、これは、ＰＢＳ注射の８週間後のＲＰＥ応答機能を示している。Ｋｉｒ７．１ｃＫＯマウスのＥＲＧ応答は、スクリーニング中のａ波、ｂ波およびｃ波を示さなかった（図１４Ｂ）。視細胞は、変性していなかったが、スクリーニング中に、ＲＰＥ細胞からの応答を有さなかった、ＥＦ１ａおよびＶＭＤ２プロモーターによりもたらされるｋｃｎｊ１３遺伝子を有するレンチウイルスの網膜下送達による、恒常的ＥＦ１ａプロモーターまたはＲＰＥ特異的ＶＭＤ２プロモーターのいずれかを有するレンチウイルスでのＫｉｒ７．１の送達は、ＲＰＥと視細胞の両方が、ｃＫＯマウスにおいて記録したＲＰＥの変性したｃ波であったので、重大な表現型に起因してＲＰＥ機能の救出に失敗した（図１４Ｃ）。図１４Ｄ～Ｆは、代表的な光干渉断層撮影（ＯＣＴ）画像を示し、これは、それぞれ、スクリーニング中およびレンチウイルス遺伝子送達の８週間後の、対照マウス、回復を伴わないｃＫＯマウス（ａ波、ｂ波、ｃ波なし）、およびｃ波が回復したマウス（ａ波、ｂ波だが、ｃ波なし）の網膜構造を示している。したがって、インビボデータは、ＲＰＥにおける発現しているＫｉｒ７．１が、これらの欠損マウスにおいて視力を回復させることができることを示す。
【0110】
材料および方法
動物
インビボでＲＰＥ細胞におけるＫＣＮＪ１３遺伝子の生理学的役割を明らかにするために、本発明者らは、この遺伝子を欠いている株を使用した。これらのマウスにおける視力を、膜電図検査（ＥＲＧ）を使用して測定した。マウスを収容し、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｒｏｎ大学（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で繁殖させた。
動物
インビボでＲＰＥ細胞におけるＫＣＮＪ１３遺伝子の生理学的役割を明らかにするために、本発明者らは、この遺伝子を欠いている株を使用した。これらのマウスにおける視力を、膜電図検査（ＥＲＧ）を使用して測定した。マウスを収容し、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｒｏｎ大学（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で繁殖させた。
【0111】
網膜電図検査
マウスを、ＥＲＧを行う前に、一晩、暗所に適応させた。腹膜内に注射したケタミン／キシラジン（８０：１６ｍｇ／ｋｇ）混合物で、マウスを麻酔した。ヒーティングパッドを用いて、体温を３７℃に維持しながら、マウスの瞳孔を、刺激性アミド（Ｂａｕｓｃｈ＋Ｌｏｍｂ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）の点眼で散大させた。角膜コンタクトレンズ（Ｏｃｕｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、ＭＯ）を、Ｇｏｎａｋ、２．５％ ヒプロメロース目粘滑薬溶液（ＧＯＮＩＯＶＩＳＣ、ＨＵＢ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＬＬＣ、ＣＡ）に沿って散大した目に入れることにより、ＥＲＧを、Ｅｓｐｉｏｎ記録システム（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ）を使用して行った。基準電極および外側電極を、ぞれぞれ、口と背中に入れた。ＥＲＧのプロトコールは、０．１～３０ｃｄ．ｓ．ｍ－２のフラッシュ強度および６０Ｈｚの線雑音からなる。ｃ波の測定のため、本発明者らは、２５ｃｄ．ｓ．ｍ－２強度の５ミリ秒のフラッシュを使用して、５秒間の間隔でデータを取得した。ＥＲＧ解析を、網膜下注射の前および後にマウスで行った。
マウスを、ＥＲＧを行う前に、一晩、暗所に適応させた。腹膜内に注射したケタミン／キシラジン（８０：１６ｍｇ／ｋｇ）混合物で、マウスを麻酔した。ヒーティングパッドを用いて、体温を３７℃に維持しながら、マウスの瞳孔を、刺激性アミド（Ｂａｕｓｃｈ＋Ｌｏｍｂ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）の点眼で散大させた。角膜コンタクトレンズ（Ｏｃｕｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、ＭＯ）を、Ｇｏｎａｋ、２．５％ ヒプロメロース目粘滑薬溶液（ＧＯＮＩＯＶＩＳＣ、ＨＵＢ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＬＬＣ、ＣＡ）に沿って散大した目に入れることにより、ＥＲＧを、Ｅｓｐｉｏｎ記録システム（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ）を使用して行った。基準電極および外側電極を、ぞれぞれ、口と背中に入れた。ＥＲＧのプロトコールは、０．１～３０ｃｄ．ｓ．ｍ－２のフラッシュ強度および６０Ｈｚの線雑音からなる。ｃ波の測定のため、本発明者らは、２５ｃｄ．ｓ．ｍ－２強度の５ミリ秒のフラッシュを使用して、５秒間の間隔でデータを取得した。ＥＲＧ解析を、網膜下注射の前および後にマウスで行った。
【0112】
網膜下注射
ｃ波形成を有さないＫＣＮＪ１３ノックアウトマウスを、この目的のため使用した。マウスを、強固に制御した温度（２３±５℃）、湿度（４０－５０％）および明／暗（１２／１２時間）サイクル条件下、２００ｌｕｘの光環境で維持した。注射に先立ち、マウスを麻酔し、瞳孔を、上記の通り、散大させた。ｅＧＦＰに融合し、ＥＦ１ａまたはＶＭＤ２プロモーターによりもたらされる、機能的全長ＫＣＮＪ１３遺伝子を有するレンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２μｌを、１０ｍｍの３４ゲージ針を使用した網膜下注射を介して、ＲＰＥ細胞に送達させた。本発明者らは、１０ μｌのＮａｎｏｆｉｌシリンジおよびＵＭＰ３、ＮａｎｏＦｉｌ ＲＰＥキットならびにＭｉｃｒｏ４コントローラー（Ｗｏｒｌｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を使用した。ＥＲＧを、これらのマウスにおいて、注射の１週間後、２週間後、４週間後および８週間後に行い、データを解析した。
ｃ波形成を有さないＫＣＮＪ１３ノックアウトマウスを、この目的のため使用した。マウスを、強固に制御した温度（２３±５℃）、湿度（４０－５０％）および明／暗（１２／１２時間）サイクル条件下、２００ｌｕｘの光環境で維持した。注射に先立ち、マウスを麻酔し、瞳孔を、上記の通り、散大させた。ｅＧＦＰに融合し、ＥＦ１ａまたはＶＭＤ２プロモーターによりもたらされる、機能的全長ＫＣＮＪ１３遺伝子を有するレンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２μｌを、１０ｍｍの３４ゲージ針を使用した網膜下注射を介して、ＲＰＥ細胞に送達させた。本発明者らは、１０ μｌのＮａｎｏｆｉｌシリンジおよびＵＭＰ３、ＮａｎｏＦｉｌ ＲＰＥキットならびにＭｉｃｒｏ４コントローラー（Ｗｏｒｌｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を使用した。ＥＲＧを、これらのマウスにおいて、注射の１週間後、２週間後、４週間後および８週間後に行い、データを解析した。
【0113】
導入遺伝子発現検出
単離したＲＰＥのフラットマウントを調製した後、ｅＧＦＰ蛍光を、共焦点顕微鏡を使用して検出した。ｅＧＦＰ－ＫＣＮＪ１３遺伝子を有するレンチウイルス／ＡＡＶを注射したマウスの目を、注射の１週間後に回収した。屠殺したマウスの眼球除去した目を、ＰＢＳで２回洗浄し、２８ゲージ針で鋸状縁にて穿刺を行い、角膜切開に沿って目を開いた。次に、レンズを注意深く取り出した。眼杯を平にし、これにより、中心を容易に切開し、「ヒトデ」の様子を得た。次に、網膜を、ＲＰＥ層から穏やかに分離した。分離したＲＰＥおよび網膜を、カバーガラス上にフラットマウント化し、Ｎｉｋｏｎ Ｃ２共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔで画像化した。本発明者らは、緑色の励起のため４８８ｎｍダイオードレーザーを使用し、画像を、Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＶＣ ２０Ｘ／０．７５、１ｍｍ ＷＤにおいてＬｏｗ Ｎｏｉｓｅ ＰＭＴ Ｃ２検出器により取得した。
単離したＲＰＥのフラットマウントを調製した後、ｅＧＦＰ蛍光を、共焦点顕微鏡を使用して検出した。ｅＧＦＰ－ＫＣＮＪ１３遺伝子を有するレンチウイルス／ＡＡＶを注射したマウスの目を、注射の１週間後に回収した。屠殺したマウスの眼球除去した目を、ＰＢＳで２回洗浄し、２８ゲージ針で鋸状縁にて穿刺を行い、角膜切開に沿って目を開いた。次に、レンズを注意深く取り出した。眼杯を平にし、これにより、中心を容易に切開し、「ヒトデ」の様子を得た。次に、網膜を、ＲＰＥ層から穏やかに分離した。分離したＲＰＥおよび網膜を、カバーガラス上にフラットマウント化し、Ｎｉｋｏｎ Ｃ２共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔで画像化した。本発明者らは、緑色の励起のため４８８ｎｍダイオードレーザーを使用し、画像を、Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＶＣ ２０Ｘ／０．７５、１ｍｍ ＷＤにおいてＬｏｗ Ｎｏｉｓｅ ＰＭＴ Ｃ２検出器により取得した。
【0114】
実施例３－Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のためのＡＡＶウイルスベクターの調製
ＡＡＶウイルスベクター構築
Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のためのＡＡＶベクターを、Ｃｙａｇｅｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒソフトウエアおよびＣｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのパッケージングサービスを使用して生成した。次の表１～３および図１２は、Ｋｃｎｊ１３遺伝子における生理学的欠損を首尾よく救出したＡＡＶベクターの構築を要約する。
ＡＡＶウイルスベクター構築
Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のためのＡＡＶベクターを、Ｃｙａｇｅｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒソフトウエアおよびＣｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのパッケージングサービスを使用して生成した。次の表１～３および図１２は、Ｋｃｎｊ１３遺伝子における生理学的欠損を首尾よく救出したＡＡＶベクターの構築を要約する。
【表2】
【0115】
図１６における表２および表３は、色をつけたセグメントおよびＫｉｒ７．１（配列番号９）をコードするＡＡＶベクターの配列を有する。
【0116】
ＡＡＶウイルスベクターパッケージング
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムは、インビトロおよびインビボ遺伝子送達の一般的かつ万能なツールである。ＡＡＶは、多くの哺乳類細胞タイプを形質導入する際に有効であり、アデノウイルス同様、インビボでほぼ完全に非病原性である、非常に低い免疫原性を有する。これにより、ＡＡＶを、多くの動物研究のための理想的なウイルスベクターシステムにする。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムは、インビトロおよびインビボ遺伝子送達の一般的かつ万能なツールである。ＡＡＶは、多くの哺乳類細胞タイプを形質導入する際に有効であり、アデノウイルス同様、インビボでほぼ完全に非病原性である、非常に低い免疫原性を有する。これにより、ＡＡＶを、多くの動物研究のための理想的なウイルスベクターシステムにする。
【0117】
ＡＡＶベクターを、大腸菌におけるプラスミドとしてまず構築する。次に、それを、ヘルパープラスミドと共に、パッケージング細胞に遺伝子導入し、ここで、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）間のベクターの領域を、生きたウイルスにパッケージングする。ウイルスを標的細胞に加えるとき、２本鎖直線ＤＮＡゲノムが、細胞に送達され、ここで、それは、核に進入し、宿主ゲノムに統合することなく、エピソームＤＮＡとして止まる。２つのＩＴＲ間に位置する任意の遺伝子（複数可）を、ウイルスゲノムの残りと共に標的細胞に導入する。
【0118】
ＡＡＶの主要な実際の利点は、大抵の場合で、ＡＡＶを、バイオセイフティーレベル１（ＢＳＬ１）施設において扱うことができることである。これは、固有の複製欠損であるＡＡＶに起因し、これにより、炎症をほとんど生じないか、または全く生じず、公知のヒト疾患を引き起こさない。
【0119】
ＡＡＶの多くの株が、天然で同定されている。それらを、ウイルス表面上のカプシドタンパク質の異なる抗原性に基づき、異なる血清型に分ける。異なる血清型は、ウイルスに組織指向性（すなわち、感染の組織特異性）を与えることができる。異なるＡＡＶ血清型は、異なる細胞タイプについての指向性を有し、ある種の細胞タイプは、任意の血清型により形質導入するのが困難であってもよい。例えば、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：５９～６７（２０１５）を参照。本発明者らは、ＡＡＶ２血清型を使用して、インビトロまたはインビボのいずれかで網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を有効に形質導入し得ることを見出した。例えば、実施例１および２を参照。
【0120】
実施例４－Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のためのレンチウイルスベクターの調製
レンチウイルスベクター構築
Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のためのレンチウイルスベクターを、Ｃｙａｇｅｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒソフトウエアおよびＣｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのパッケージングサービスを使用して生成した。次の表４～６および図１３は、ＫＣＮＪ１３遺伝子における生理学的欠損を首尾よく救出したレンチウイルスベクターの構築を要約する。
レンチウイルスベクター構築
Ｋｉｒ７．１タンパク質の送達のためのレンチウイルスベクターを、Ｃｙａｇｅｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒソフトウエアおよびＣｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのパッケージングサービスを使用して生成した。次の表４～６および図１３は、ＫＣＮＪ１３遺伝子における生理学的欠損を首尾よく救出したレンチウイルスベクターの構築を要約する。
【表3】
【0121】
図１７において見られる表５および６は、レンチウイルスベクターについての色素指標および配列表（配列番号１０）を提供する。
【0122】
レンチウイルスベクターパッケージング
レンチウイルスベクターシステムは、遺伝子を哺乳類細胞に永久的に導入するための高度に効率的なビークルである。レンチウイルスベクターを、レトロウイルスファミリーのメンバーである、ＨＩＶからもたらす。野生型レンチウイルスは、プラス鎖直線ＲＮＡゲノムを有する。
レンチウイルスベクターシステムは、遺伝子を哺乳類細胞に永久的に導入するための高度に効率的なビークルである。レンチウイルスベクターを、レトロウイルスファミリーのメンバーである、ＨＩＶからもたらす。野生型レンチウイルスは、プラス鎖直線ＲＮＡゲノムを有する。
【0123】
レンチウイルスベクターを、大腸菌におけるプラスミドとしてまず構築する。次に、それを、いくつかのヘルパープラスミドと共に、パッケージング細胞に遺伝子導入する。パッケージング細胞内部で、２つの末端反復配列（ＬＴＲ）間に位置するベクターＤＮＡを、ＲＮＡに転写し、ヘルパープラスミドにより発現したウイルスタンパク質は、ＲＮＡをウイルスにさらにパッケージングする。次に、生きたウイルスを、上清に放出し、それを使用して、直接または濃縮後に標的細胞に感染することができる。
【0124】
設計により、レンチウイルスベクターは、ウイルスパッケージングおよび形質導入に必要な遺伝子を欠く（これらの遺伝子を、ウイルスパッケージング中に使用したヘルパープラスミドにより代わりに運ぶ）。結果として、レンチウイルスベクターから生成したウイルスは、複製能力がないという重要な安全特性を有する（それらは、標的細胞を形質導入するが、それらにおいて複製できないことを意味する）。
【0125】
本明細書において記載されるレンチウイルスウイルスベクターは、第３世代のレンチウイルスベクターシステムからもたらされ得る。例えば、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３（１９９８）を参照。それは、大腸菌における多いコピー数の複製、生きたウイルスの高タイターのパッケージング、広範な細胞の効率的なウイルス形質導入、宿主ゲノムへの効率的なベクター統合、および高レベルの導入遺伝子発現のため最適化される。
【0126】
本明細書において記載されるレンチウイルスウイルスベクターのパッケージングシステムにより、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質をウイルス表面に加え得る。このタンパク質は、広範な指向性を有し、本発明者らは、それが、インビトロまたはインビボのいずれかで網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を形質導入するのを助け得ることを見出した。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図17-4】
【図17-5】
【図17-6】
【配列表】
【国際調査報告】