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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】抗ＣＤ１３７抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
   C07K 16/28 20060101AFI20220131BHJP
   C07K 16/46 20060101ALI20220131BHJP
   C12N 15/13 20060101ALI20220131BHJP
   C12N 15/63 20060101ALI20220131BHJP
   C12N 1/15 20060101ALI20220131BHJP
   C12N 1/19 20060101ALI20220131BHJP
   C12N 1/21 20060101ALI20220131BHJP
   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP
   A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP
   A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP
   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP
   A61K 35/12 20150101ALI20220131BHJP
   C12P 21/08 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P43/00 105
A61K35/76
A61K48/00
A61K35/12
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021521057
(86)(22)【出願日】2019-09-12
(85)【翻訳文提出日】2021-04-15
(86)【国際出願番号】 CN2019105537
(87)【国際公開番号】W WO2020078149
(87)【国際公開日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2018/111086
(32)【優先日】2018-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517179262
【氏名又は名称】ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヂャン シン
(72)【発明者】
【氏名】ポン ジェンジェン
(72)【発明者】
【氏名】フー カイ
(72)【発明者】
【氏名】マー フイ
(72)【発明者】
【氏名】パン シャオロン
(72)【発明者】
【氏名】フー シーロン
(72)【発明者】
【氏名】マー シューリー
(72)【発明者】
【氏名】ディン ジェン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA05
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB41
4C085BB42
4C085BB43
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF24
4C087AA01
4C087BB65
4C087BC83
4C087NA14
4C087ZB21
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域が1つまたは複数の突然変異を含むCD137に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片に関する。さらに、医薬品の調製における上記の抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【選択図】図１４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域VLおよび重鎖可変領域VHを有し、ここで、前記VLは、SEQ ID NO:103で表される配列と比べて、V3、A10、K44、D71およびV77からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVLアミノ酸突然変異を含む、
CD137に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記VHは、SEQ ID NO:127で表される配列と比べて、Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVHアミノ酸突然変異を含む、
請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記VLアミノ酸突然変異は、A10およびV77の位置で起きるVLアミノ酸突然変異を含む、
請求項1～2のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記VHアミノ酸突然変異は、Q13の位置で起きるVHアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～3のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記VHアミノ酸突然変異は、N78の位置で起きるVHアミノ酸突然変異をさらに含む、
請求項2～4のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記VLアミノ酸突然変異は、
1）V3、D71およびV77；
2）A10およびV77；
3）D71；
4）A10、D71およびV77；
5）D71およびV77；
6）A10およびD71；または
7）V3、A10、K44、D71およびV77
からなる群のいずれか1群の位置におけるVLアミノ酸突然変異を含む、
請求項1～5のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記VHアミノ酸突然変異は、
1）N78；
2）N78、H84、およびD86；
3）Q13、N78、H84およびD86；
4）Q13およびN78；
5）Q13、H84、D86、A90およびF97；または
6）Q13、N78、H84、D86、A90およびF97
からなる群のいずれか1群の位置におけるVHアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～6のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記VLアミノ酸突然変異と前記VHアミノ酸突然変異は、それぞれ
1）VL：V3、D71およびV77、ならびにVH：N78；
2）VL：D71、ならびにVH：N78、H84およびD86；
3）VL：D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；
4）VL：A10、D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；
5）VL：A10およびD71、ならびにVH：Q13、N78、H84およびD86；
6）VL：V3、A10、K44、D71およびV77、ならびにVH：Q13およびN78；
7）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、H84、D86、A90およびF97；または
8）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、N78、H84、D86、A90およびF97
からなる群のいずれか1群の位置におけるアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～7のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
前記V3におけるVLアミノ酸突然変異は、V3A、V3M、V3Gから選ばれる、
請求項1～8のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
前記A10におけるVLアミノ酸突然変異は、A10V、A10L、A10Iから選ばれる、
請求項1～9のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項11】
前記K44におけるVLアミノ酸突然変異は、K44T、K44Gから選ばれる、
請求項1～10のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項12】
前記D71におけるVLアミノ酸突然変異は、D71N、D71Qから選ばれる、
請求項1～11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項13】
前記V77におけるVLアミノ酸突然変異は、V77Iから選ばれる、
請求項1～12のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項14】
前記Q13におけるVHアミノ酸突然変異は、Q13K、Q13Rから選ばれる、
請求項2～13のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項15】
前記N78におけるVHアミノ酸突然変異は、N78K、N78D、N78Qから選ばれる、
請求項2～14のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項16】
前記H84におけるVHアミノ酸突然変異は、H84Q、H84Eから選ばれる、
請求項2～15のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項17】
前記D86におけるVHアミノ酸突然変異は、D86N、D86Eから選ばれる、
請求項2～16のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項18】
前記A90におけるVHアミノ酸突然変異は、A90T、A90Sから選ばれる、
請求項2～17のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項19】
前記F97におけるVHアミノ酸突然変異は、F97Y、F97Wから選ばれる、
請求項2～18のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項20】
前記VLアミノ酸突然変異は、
1）V3A、D71NおよびV77I；
2）A10VおよびV77I；
3）D71N；
4）A10V、D71NおよびV77I；
5）D71NおよびV77I；
6）A10VおよびD71N；または
7）V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77I
からなる群のいずれか1群のVLアミノ酸突然変異を含む、
請求項1～19のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項21】
前記VHアミノ酸突然変異は、
1）N78K；
2）N78K、H84QおよびD86N；
3）Q13K、N78K、H84QおよびD86N；
4）Q13KおよびN78K；
5）Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y；または
6）Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y
からなる群のいずれか1群のVHアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～20のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項22】
前記VLアミノ酸突然変異と前記VHアミノ酸突然変異は、それぞれ
1）VL：V3A、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K；
2）VL：D71N、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；
3）VL：D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；
4）VL：A10V、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；
5）VL：A10VおよびD71N、ならびにVH：Q13K、N78K、H84QおよびD86N；
6）VL：V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77I、ならびにVH：Q13KおよびN78K；
7）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y；または
8）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y
からなる群のいずれか1群のアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～21のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項23】
前記VLは、SEQ ID NO:104、106、108および110-114のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1～22のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項24】
前記VHは、SEQ ID NO:128、130、132および134-138のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1～23のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項25】
1）前記VLはSEQ ID NO:104で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:128で表されるアミノ酸配列を有し、
2）前記VLはSEQ ID NO:106で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:130で表されるアミノ酸配列を有し、
3）前記VLはSEQ ID NO:108で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:132で表されるアミノ酸配列を有し、
4）前記VLはSEQ ID NO:110で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:134で表されるアミノ酸配列を有し、
5）前記VLはSEQ ID NO:111で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:135で表されるアミノ酸配列を有し、
6）前記VLはSEQ ID NO:112で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:136で表されるアミノ酸配列を有し、
7）前記VLはSEQ ID NO:113で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:137で表されるアミノ酸配列を有し、
8）前記VLはSEQ ID NO:114で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:138で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1～24のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項26】
前記抗原結合断片は、Fab、Fab’、F（ab）2、F（ab’）2、FvおよびscFvから選ばれる、
請求項1～25のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項27】
さらに、Fcドメインを含む、
請求項1～26のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項28】
前記Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選ばれる免疫グロブリンの定常領域アミノ酸配列を有する、
請求項27に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項29】
前記Fcドメインは、前記抗体またはその抗原結合断片のC末端に位置する、
請求項28に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項30】
前記Fcドメインは、SEQ ID NO:163またはSEQ ID NO:164で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項27～29のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項31】
1本ごとに前記軽鎖可変領域VL、前記重鎖可変領域VHおよび前記VLのC末端に位置する前記Fcドメインを含有する2本のポリペプチド鎖より構成されるホモ二量体タンパク質である、
請求項27～30のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項32】
前記ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO. 152、154、156および158-162のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項31に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項33】
請求項1～32のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片であるCD137に特異的に結合する第1の結合ドメインと、CD137と異なる第2のターゲットに特異的に結合する第2の結合ドメインとを含有する、
多重特異的抗体またはその抗原結合断片。
【請求項34】
前記第2のターゲットは、腫瘍関連抗原から選ばれる、
請求項33に記載の多重特異的抗体またはその抗原結合断片。
【請求項35】
請求項1～34のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、
免疫複合体。
【請求項36】
請求項1～34のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項35に記載の免疫複合体をコードする、
単離された核酸分子。
【請求項37】
請求項36に記載の核酸分子を含む、
ベクター。
【請求項38】
請求項37に記載のベクターを含む、
細胞。
【請求項39】
請求項1～34のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項35に記載の免疫複合体、請求項36に記載の核酸分子、請求項37に記載のベクターおよび/または請求項38に記載の細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む、
医薬組成物。
【請求項40】
がんの治療のための医薬品の調製における請求項1～34のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項41】
前記がんは、黒色腫、前立腺がん、結腸直腸癌、Merkel細胞皮膚がん、膵臓がん、非ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、乳がんの群から選ばれる、
請求項40に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオメディカル分野に関して、具体的に、CD137タンパク質に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【0002】
CD137タンパク質（4-1BB、TNFRSF9などとも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーであり、タイプI膜貫通型タンパク質に属する。CD137Lは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーであり、タイプII膜貫通型タンパク質に属する。今までの検討によると、CD137Lは、主に、活性化されたAPC、例えば樹状細胞（DC）、貪食細胞およびB細胞（Pollok、KEなど、1994、Eur.J.Immunol.24：367-374）に発現し、また、T細胞は、抗原特異的シグナルを受信するとCD137の発現を誘導する（Kwon、B.S.など、1989、PNAS 86：1963-67）ことが分かった。CD137は、T細胞における機能が十分に証明されている。T細胞は、一定量のCD3抗体がある場合に、CD137のシグナルの活性化によってT細胞増殖やサイトカイン（主にIFN-γ）合成が誘導されると共に、活性化されているT細胞のアポトーシスが抑制され、寿命が長くなる。
【0003】
しかし、これまで開発された抗CD137抗体では、安定性が低く、腫瘍に対する阻害能力に限界があるため、抗CD137医薬品の新規開発が新医薬品の開発を促進するよう望まれている。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、CD137に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片およびその使用を提供する。本発明による抗CD137抗体は、1）CD137タンパク質に特異的に結合することができ、2）CD137のアゴニスト活性を有し、3）高い安定性を備え、4）高い純度を備え、5）がんの治療に使用可能であることからなる特性のうちの1種類あるいは複数種類を持つ。
【0005】
また、本発明は、軽鎖可変領域VLおよび重鎖可変領域VHを有し、ここで、上記のVLは、SEQ ID NO:103で表される配列と比べて、V3、A10、K44、D71およびV77からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVLアミノ酸突然変異を含むCD137に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0006】
ある実施形態において、上記のVHは、SEQ ID NO:127で表される配列と比べて、Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVHアミノ酸突然変異を含む。
【0007】
ある実施形態において、上記のVLアミノ酸突然変異は、A10およびV77の位置で起きるVLアミノ酸突然変異を含む。
【0008】
ある実施形態において、上記のVHアミノ酸突然変異は、Q13の位置で起きるVHアミノ酸突然変異を含む。
【0009】
ある実施形態において、上記のVHアミノ酸突然変異は、N78の位置で起きるVHアミノ酸突然変異をさらに含む。
【0010】
ある実施形態において、上記のVLアミノ酸突然変異は、1）V3、D71およびV77；2）A10およびV77；3）D71；4）A10、D71およびV77；5）D71およびV77；6）A10およびD71；または、7）V3、A10、K44、D71およびV77からなる群のいずれか1群の位置におけるVLアミノ酸突然変異を含む。
【0011】
ある実施形態において、上記のVHアミノ酸突然変異は、1）N78；2）N78、H84、およびD86；3）Q13、N78、H84およびD86；4）Q13およびN78；5）Q13、H84、D86、A90およびF97；または、6）Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群のいずれか1群の位置におけるVHアミノ酸突然変異を含む。
【0012】
ある実施形態において、上記のVLアミノ酸突然変異と上記のVHアミノ酸突然変異は、それぞれ、1）VL：V3、D71およびV77、ならびにVH：N78；2）VL：D71、ならびにVH：N78、H84およびD86；3）VL：D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；4）VL：A10、D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；5）VL：A10およびD71、ならびにVH：Q13、N78、H84およびD86；6）VL：V3、A10、K44、D71およびV77、ならびにVH：Q13およびN78；7）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、H84、D86、A90およびF97；または、8）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群のいずれか1群の位置におけるアミノ酸突然変異を含む。
【0013】
ある実施形態において、上記のV3におけるVLアミノ酸突然変異は、V3A、V3M、V3Gから選ばれる。ある実施形態において、上記のA10におけるVLアミノ酸突然変異は、A10V、A10L、A10Iから選ばれる。ある実施形態において、上記のK44におけるVLアミノ酸突然変異は、K44T、K44Gから選ばれる。ある実施形態において、上記のD71におけるVLアミノ酸突然変異は、D71N、D71Qから選ばれる。ある実施形態において、上記のV77におけるVLアミノ酸突然変異は、V77Iから選ばれる。ある実施形態において、上記のQ13におけるVHアミノ酸突然変異は、Q13K、Q13Rから選ばれる。ある実施形態において、上記のN78におけるVHアミノ酸突然変異は、N78K、N78D、N78Qから選ばれる。ある実施形態において、上記のH84におけるVHアミノ酸突然変異は、H84Q、H84Eから選ばれる。ある実施形態において、上記のD86におけるVHアミノ酸突然変異は、D86N、D86Eから選ばれる。ある実施形態において、上記のA90におけるVHアミノ酸突然変異は、A90T、A90Sから選ばれる。ある実施形態において、上記のF97におけるVHアミノ酸突然変異は、F97Y、F97Wから選ばれる。
【0014】
ある実施形態において、上記のVLアミノ酸突然変異は、1）V3A、D71NおよびV77I；2）A10VおよびV77I；3）D71N；4）A10V、D71NおよびV77I；5）D71NおよびV77I；6）A10VおよびD71N；または、7）V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77Iからなる群のいずれか1群のVLアミノ酸突然変異を含む。
【0015】
ある実施形態において、上記のVHアミノ酸突然変異は、1）N78K；2）N78K、H84QおよびD86N；3）Q13K、N78K、H84QおよびD86N；4）Q13KおよびN78K；5）Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y；または、6）Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Yからなる群のいずれか1群のVHアミノ酸突然変異を含む。
【0016】
ある実施形態において、上記のVLアミノ酸突然変異と上記のVHアミノ酸突然変異は、それぞれ、1）VL：V3A、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K；2）VL：D71N、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；3）VL：D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；4）VL：A10V、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；5）VL：A10VおよびD71N、ならびにVH：Q13K、N78K、H84QおよびD86N；6）VL：V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77I、ならびにVH：Q13KおよびN78K；7）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y；または、8）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Yからなる群のいずれか1群のアミノ酸突然変異を含む。
【0017】
ある実施形態において、上記のVLは、SEQ ID NO:104、106、108および110-114のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する。
【0018】
ある実施形態において、上記のVHは、SEQ ID NO:128、130、132および134-138のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する。
【0019】
ある実施形態において、1）上記のVLはSEQ ID NO:104で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:128で表されるアミノ酸配列を有し、2）上記のVLはSEQ ID NO:106で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:130で表されるアミノ酸配列を有し、3）上記のVLはSEQ ID NO:108で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:132で表されるアミノ酸配列を有し、4）上記のVLはSEQ ID NO:110で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:134で表されるアミノ酸配列を有し、5）上記のVLはSEQ ID NO:111で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:135で表されるアミノ酸配列を有し、6）上記のVLはSEQ ID NO:112で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:136で表されるアミノ酸配列を有し、7）上記のVLはSEQ ID NO:113で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:137で表されるアミノ酸配列を有し、8）上記のVLはSEQ ID NO:114で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、上記のVHはSEQ ID NO:138で表されるアミノ酸配列を有する。
【0020】
ある実施形態において、上記の抗原結合断片は、Fab、Fab’、F（ab）2、F（ab’）2、FvおよびscFvから選ばれる。
【0021】
ある実施形態において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、さらにFcドメインを含む。ある実施形態において、上記のFcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選ばれる免疫グロブリンの定常領域アミノ酸配列を有する。ある実施形態において、上記のFcドメインは、上記の抗体またはその抗原結合断片のC末端に位置する。ある実施形態において、上記のFcドメインは、SEQ ID NO:163またはSEQ ID NO:164で表されるアミノ酸配列を有する。
【0022】
ある実施形態において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、1本ごとに前記軽鎖可変領域VL、前記重鎖可変領域VHおよび前記VLのC末端に位置する前記Fcドメインを含有する2本のポリペプチド鎖より構成されるホモ二量体タンパク質である。
【0023】
ある実施形態において、上記のポリペプチド鎖は、SEQ ID NO:152、154、156および158-162のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する。
【0024】
一方、本発明は、さらに、上記の抗体またはその抗原結合断片であるCD137に特異的に結合する第1の結合ドメインと、CD137と異なる第2のターゲットに特異的に結合する第2の結合ドメインとを含有する多重特異的抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある実施形態において、上記の第2のターゲットは、腫瘍関連抗原から選ばれる。
【0025】
一方、本発明は、さらに、上記の抗体または抗原結合断片を含む免疫複合体を提供する。
【0026】
一方、本発明は、さらに、上記の抗体またはその抗原結合断片、あるいは上記の免疫複合体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【0027】
一方、本発明は、さらに、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。
【0028】
一方、本発明は、さらに、上記のベクターを含む細胞を提供する。
【0029】
一方、本発明は、さらに、上記の抗体またはその抗原結合断片、上記の免疫複合体、上記のリボース分子、上記のベクターおよび/または上記の細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【0030】
一方、本発明は、さらに、がんの治療のための医薬品の調製における上記の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。ある実施形態において、上記のがんは、黒色腫、前立腺がん、結腸直腸癌、Merkel細胞皮膚がん、膵臓がん、非ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、乳がんの群から選ばれる。
【0031】
当該技術分野における当業者は、以降の詳細な記載からの本開示のその他の側面や利点の把握が容易であろう。以下の詳細な記載では、本開示の例としての実施形態しか表現して記載していない。当該技術分野における当業者にとって、本開示の詳細によって、本発明に係る趣旨や範囲を逸脱しない限り、公開されている具体的な実施形態を変更しても良い。それに応じて、本発明において、図面や明細書の記載があくまでも例であり、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0032】
本発明に係る具体的な特徴は、添付の請求項のように示されたものである。本発明に係る特徴やメリットは、以下詳しく記載されている例示的実施形態や図面を参照することによって、より確実的に把握されるだろう。図面に関しては、以下のように概略的に説明する。
【0033】
【図1】図1は、本発明における突然変異した抗CD137分子の自由エネルギーおよび相同性シークエンシング結果を示す。
【図2】図2は、本発明における抗CD137抗体分子のELISA結合試験結果を示す。
【図3】図3は、本発明における抗CD137抗体分子のELISA結合試験結果を示す。
【図4】図4は、本発明における抗CD137抗体分子のFACS結合試験結果を示す。
【図5】図5は、本発明における抗CD137抗体分子のルシフェラーゼ試験結果を示す。
【図6】図6は、本発明における抗CD137抗体分子のルシフェラーゼ試験結果を示す。
【図7】図7は、本発明における抗CD137抗体分子によりT細胞のサイトカインIL-2の放出を促す試験結果を示す。
【図8】図8は、本発明における抗CD137抗体分子の加速安定実験の結果を示す。
【図9A-9B】図9A-9Bは、本発明における抗CD137抗体分子の37℃安定性試験のためのSDS-PAGE電気泳動実験結果を示す。
【図10A-10D】図10A-10Dは、本発明における抗CD137抗体分子C2-7B-FcのSEC-HPLC分析結果を示す。
【図11A-11D】図11A-11Dは、本発明における抗CD137抗体分子C2-7BN78K-FcのSEC-HPLC分析結果を示す。
【図12】図12は、本発明における抗CD137抗体分子のDSC熱安定性試験の結果を示す。
【図13】図13は、本発明における抗CD137抗体分子の薬物動態学試験結果を示す。
【図14】図14は、本発明における抗CD137抗体分子による腫瘍への阻害効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下、本願発明の実施形態を、所定の具体的な実施例によって説明するが、当業者が、本明細書に公開された内容により、本願発明のその他のメリットや効果を容易に把握することができる。本発明による抗体またはその抗原結合断片は、CD137タンパク質に特異的に結合することができ、また、CD137のアゴニスト活性を備える。具体的な実施形態において、本発明による抗体またはその抗原結合断片は、高安定性や高純度があるために、医薬組成物の調製、およびがんの治療に用いられる。
【0035】
以下、本発明をより詳しく説明するが、本発明において、特に断りのない限り、本発明に用いられる科学や技術用語は、当該技術分野における当業者が想到容易な意味を有する。また、本発明に用いられるタンパク質と、核酸化学、分子生物学、細胞ならびに組織培養、微生物学、免疫学関連用語および実験室操作ステップは、いずれも関連分野で広く使用されている用語と通常のステップである。また、本発明をよりよく把握するために、以下、関連用語の定義や解釈を提供する。
【0036】
本発明において、「抗体」という用語は、通常、所定の抗原を特異的に認識及び/又は中和することができるポリペプチド分子を指す。例えば、抗体は、ジスルフィド結合によりお互いに連結された少なくとも２本の重鎖（H）と２本の軽鎖（L）からなる免疫グロブリンを含むと共に、その抗原結合部分より構成される分子を全て含む。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、抗体断片或いは抗体誘導体を含み、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体（例えば、dAb）、一本鎖抗体（例えば、scFv）、及び抗原に結合する抗体断片（例えば、Fab、Fab’および（Fab）2断片）を含むがこれに限定されない。「抗体」という用語は、さらに、抗体のあらゆる組換え体の態様、例えば、原核細胞に発現する抗体、及び本明細書に記載の抗原に結合するいかなる抗体断片およびその誘導体を含む。重鎖は、1本ごとに重鎖可変領域（VH）と重鎖定常領域より構成されてもよい。軽鎖は、1本ごとに軽鎖可変領域（VL）と軽鎖定常領域より構成されてもよい。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれたより保存された領域に散在している相補性決定領域（CDR）と呼ばれた高可変領域に更に細分することができる。各VHおよびVLは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4といった順にアミノ末端からカルボキシ末端に配列された3つのCDRと4つのFR領域で構成されてよい。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Clq）を含む宿主組織または因子への該免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
【0037】
本発明において、「可変」という用語は、通常、抗体の可変ドメインの配列のうち、ある部分が強く変化し、各種の所定の抗体によるその所定の抗原の結合や特異性を形成するという事象を指す。しかし、可変性は、抗体の可変領域の全体にわたって均一に分配されていない。それは、軽鎖および重鎖可変領域のうち、相補性決定領域（CDR）または高可変領域（HVR）と呼ばれる3つの部分に集中している。可変領域におけるさらに保存されている部分がフレームワーク領域（FR）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ4つのFR領域を含み、大部分は、3つのCDRsで連結されたβ-プリーツシート構造を採用し、ループ連結を形成し、そして、場合によっては、該β-プリーツシート構造の一部を形成する。各鎖中のCDRsは、FR領域によって近位に保持されており、そして、他の鎖からのCDRと共に、抗体の抗原結合部位を形成する。当該技術分野において、抗体のCDRについて、いろんな方法、例えば、1）配列可変性に基づくKabatの定義（WuとKabat、J Exp Med 132:211-50、1970；Kabatら、Sequences ofProteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes ofHealth、Bethesda、Md.、1991）、2）構造的ループ領域の位置に基づくChothiaの定義（A1- Lazikaniら、JMol Biol 273:927-48、1997）、3）Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアを用いて前述のような2種類の定義のトレードオフをするAbMの定義、4）得られた複合体結晶構造分析に基づくContactの定義で指定することができる。
【0038】
これらのCDRを標識する方法は、以下の表1にまとめている。
【0039】
【表A】
【0040】
ここで、Laa-Lbbは、抗体軽鎖のN末端から、aa～bb位のアミノ酸配列を指し、Haa-Hbbは、抗体重鎖のN末端から、aa～bb位のアミノ酸配列を指す。例えば、L24-L34は、抗体軽鎖のN末端から、24～34位のアミノ酸配列を指し、H26-H35は、抗体重鎖のN末端から、26～35位のアミノ酸配列を指す。本発明では、Kabatの定義を用いて、可変ドメイン配列および完全長抗体の配列におけるアミノ酸残基を特定する。
【0041】
本発明において、「抗体結合断片」という用語は、通常、抗体において抗原に特異的に結合する機能を発揮させる1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得る。抗体の抗原結合機能は、（1）Fab断片、即ちVL、VH、CLおよびCHドメインからなる一価の断片、（2）F（ab’）2断片、即ちヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された2つのFab断片を含む二価の断片、（3）VHおよびCHドメインからなるFd断片、（4）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、（5）VHドメインからなるdAb断片（Ward et al.,（1989）Nature 341：544-546）、（6）単離相補性決定区（CDR）、並びに（7）リンカーによって任意選択で連結されることができる2つまたは2つ以上の単離CDRの組合せなどによって実現される。尚、VLおよびVHが対になって形成される一価の一本鎖分子Fv（scFv）（Bird et al（1988）Science 242：423-426；及びHustonet al.,（1988）Proc.Natl.Acad.Sci. 85：5879-5883を参照されたい）をさらに含んで良い。上記「抗原結合部分」は、更に、（1）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドと融合した結合ドメインポリペプチド、（2）ヒンジ領域と融合した免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、および（3）CH2定常領域と融合した免疫グロブリン重鎖CH3定常領域から選ばれる結合ドメインを含む、免疫グロブリン融合タンパク質より構成されて良い。本発明によるCD137に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Fab、scFv、Fab’、F（ab）2、F（ab’）2およびdAbからなる群から選ばれる。
【0042】
本発明において、「4-1BB」または「TNFRS9」とも称される「CD137タンパク質」という用語は、通常、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（TNFRS）の膜貫通タンパク質の一つであり、活性化して誘導される共刺激分子である免疫応答の重要な調節剤である。今までの検討によると、CD137作動性モノクローナル抗体が、多くのモデルに、共刺激分子発現を増加させると共に、細胞溶解性Tリンパ細胞応答を顕著に高め、抗腫瘍効果を発揮することが分かった。CD137標的指向治療法では、抗腫瘍効果が、抗マウスCD137作動性モノクローナル抗体によるマウスインビボ抗腫瘍治療効果の検討により確認された。CD137は、免疫細胞の有効な活性剤になり、また、各種の疾患を治療する重要な候補抗原である（Vinay, Dass S., and Byoung S. Kwon. "4-1BB（CD137）, an inducible costimulatory receptor, as a specific target for cancer therapy."BMB reports 47.3 （2014）:122参照）。
【0043】
本発明において、「抗体Fcドメイン」という用語は、通常、断片結晶化可能領域（Fragment crystallizable region, Fc region）とも称する抗体構造がY字型の構造である基部領域を指す。IgG、IgAおよびIgD抗体アイソフォームにおいて、Fc領域が、抗体における2本の重鎖の第2および第3の定常ドメインからの２個の同一タンパク質断片で構成されて良い。IgMおよびIgEのFc領域は、ポリペプチド鎖ごとに重鎖定常ドメインを３つ含んで良い。IgGのFc領域は、高度に保存されているN-グリコシル化部位を有する。本発明において、上記のFcドメインは、配列がSEQ ID:164で表されるIgG4のFcドメインを含んでよい。本発明において、上記のFcドメインは、さらに、ヒンジ領域におけるS228P突然変異付きの配列がSEQ ID:163で表されるIgG4のFcドメインを含んでよい。上記のS228P突然変異は、Fab断片のアーム交換を防止することができる（Silva, John-Paulら"The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation."Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015):5462-5469を参照）。本発明において、S228は、Fcドメインの位置でEUインデックスまたはEU番号付けスキームに基づき（Kabatら,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、United States Public Health Service,National Institutes of Healthを参照）付番される。EUインデックスあるいはKabatにおけるEUインデックスまたはEU番号付けスキームとは、EU抗体の番号を指す（Edelmanら,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85を参照）。
【0044】
本発明において、「腫瘍関連抗原」（tumor-associated antigen、TAA）という用語は、腫瘍の発生と進行において高く発現し、生体に免疫応答を誘起させる抗原であって、正常組織にも微量に発現する。検討によると、TAAは、多種の腫瘍、例えば肺癌、肝癌、乳がん、前立腺がん、卵巣癌、腎癌、頭頸部がん、食道がん、リンパ腫、白血病などに現れる。TAA免疫原性は、突然変異したアミノ酸配列、タンパク質の異常スプライセオソーム、成人期以降における胚性タンパク質の再発現、異常アポトーシスまたは壊死産物、細胞内タンパク質の異常分布（例えば、核タンパク質の分泌）、イントロンの配列発現、タンパク質のリン酸化及グリコシル化などの翻訳後修飾に由来する。これらのタンパク質は、異常変化により生体に免疫応答を誘起させ、対応する自己抗体を産生する（Biotechnol, C. M. (2014).腫瘍関連抗原およびその抗体の検出の悪性腫瘍診断における使用, 8(5), 376-379を参照）。
【0045】
本発明において、「免疫複合体」という用語は、通常、1つのエフェクターモジュール、少なくとも1つの抗原結合モジュールおよびFcドメインを含有可能な融合ポリペプチド分子を指す。例えば、上記の免疫複合体は、1つのエフェクターモジュール、2つの抗原結合モジュールおよびFcドメインを含む。本発明に係る具体的な免疫複合体は、基本的に、1種類または複数種類のリンカー配列により連結されている1つのエフェクターモジュール、2つの抗原結合モジュールおよびFcドメインより構成される。抗原結合モジュールおよびエフェクターモジュールは、複数種類の相互作用によって複数種類の構造でFcドメインに連結されることができる。いくつかの実施態様において、2つの抗原結合モジュールおよびFcドメインは、全免疫グロブリン分子を形成するように、以下のような構造で互いに連結されている。
【0046】
本発明において、「核酸分子」という用語は、通常、その天然環境から単離され、または人工合成された任意長さの単離形態であるヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、あるいはリボヌクレオチドまたはそのアナログを指す。本発明に記載の核酸分子は、単離されたものであって良い。例えば、それは、（i）インビトロでの増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅と、（ii）クローン組換えと、（iii）精製、例えば、酵素消化およびゲル電気泳動分画と、或いは、（iv）合成、例えば、化学合成とによって産生または合成されてよい。ある実施形態において、上記単離された核酸は、組換えDNAの技術で調製される核酸分子である。本発明において、当該技術分野における周知の様々な手法によって上記した抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を調製することができ、それらの手法が、制限断片の操作によって、または、合成オリゴヌクレオチドによる重複伸長PCRによって構築され得ることを含むがこれに限定されなく、具体的な手引きは、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y. ,1989、およびAusubeらCurrent Protocols in Molecular Biology ,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y., 1993に見出すことができる。
【0047】
本発明において、「ベクター」という用語は、通常、挿入された核酸分子を宿主細胞中および/または宿主細胞間に運搬する、適当な宿主で自己複製できる核酸分子を指す。上記ベクターは、主にDNAまたはRNAを細胞に挿入するためのベクター、主にDNAまたはRNAを複製するためのベクター、および主にDNAまたはRNAを転写および/または翻訳するための発現ベクターを含む。上記ベクターは、さらに、上記機能を複数種類有するベクターを含む。上記ベクターは、適当な宿主細胞を導入する場合、ポリペプチドに転写して翻訳することができるポリヌクレオチドでありうる。上記ベクターは、通常、上記ベクターからなる適当な宿主細胞を培養することによって、所望の発現産物を産生することができる。本発明において、上記ベクターに、上記核酸分子を1種類または複数種類含んで良い。なお、上記ベクターには、その他の遺伝子、例えば適合な宿主細胞中および適合な条件で該ベクターへの選択が許容される標識遺伝子をさらに含んで良い。なお、上記ベクターは、さらに、コード領域が適切な宿主中で正しく発現することが許容される発現調節因子を含んで良い。このような調節因子は、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写やmRNAの翻訳を調節するその他の調節因子などを含めて、当該技術分野における当業者の周知のものである。ある実施形態において、上記発現調節配列が調節可能なものである。上記発現調節配列の具体な構造は、生物種や細胞種の機能により変化するが、通常、例えばTATAボックス、キャッピング配列、およびCAAT配列などそれぞれ転写および翻訳の開始を関与する5’非転写配列並びに5’および3’非翻訳配列を含む。例えば、5’非転写発現調節配列は、機能的に連結された核酸を転写制御するためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含んで良い。本発明において、上記ベクターは、pTMベクターでありうる。
【0048】
本発明において、「細胞」という用語は、通常、本発明に記載の免疫複合体を含有することができるか、既に含有しており、または、本発明に記載の核酸分子を有するプラスミドあるいはベクターを含有することができるか、既に含有しており、または、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現することができる単独細胞、細胞株または細胞培養物を指す。上記細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）であって良く、真核細胞（例えば酵母細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞あるいは骨髄腫細胞）であっても良い。いくつかの実施形態において、上記細胞は、哺乳動物細胞である。
【0049】
本発明において、「薬学的に許容可能なアジュバント」という用語は、薬学的に許容可能な薬剤担体、溶液または薬剤の特性を向上させる添加剤を指す。このような添加剤は、当該技術分野における当業者の周知のものである。
【0050】
本発明において、「がん」という用語は、通常、細胞増殖や生存の制御不能によって代表的に特徴付けられる哺乳動物における生理状態を指すか、また記載する。本発明において、がんと呼ばれる過剰増殖性疾患は、固形腫瘍、例えば、乳腺、呼吸道、脳、生殖器官、消化管、尿道、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺に発生するがん、およびそれらの遠隔転移を含むがこれに限定されない。このような疾患は、さらに、リンパ腫、肉腫や白血病を含む。乳がんは、実施例として、浸潤性乳管がん、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管がんおよび非浸潤性小葉癌を含むがこれに限定されない。呼吸道がんは、実施例として、小細胞/非小細胞肺癌、気管支腺腫ならびに胸膜肺芽腫を含むがこれに限定されない。脳癌は、実施例として、脳幹/視床下部腺腫、小脳/大脳星細胞腫、髄芽腫、上衣腫、神経外胚葉腫瘍、および松果体腫瘍を含むがこれに限定されない。男性の生殖器官腫瘍は、前立腺/精巣癌を含むがこれに限定されない。女性の生殖器官腫瘍は、子宮内膜癌、子宮頚部癌、卵巣癌、膣癌、外陰癌、および子宮筋腫を含むがこれに限定されない。消化管腫瘍は、肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、すい臓がん、直腸癌、小腸がんおよび唾液腺癌を含むがこれに限定されない。尿道腫瘍は、膀胱癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌および尿路癌を含むがこれに限定されない。眼がんは、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫を含むがこれに限定されない。肝癌は、実施例として、肝細胞癌があるかないかの肝細胞腫瘍）、胆管癌（肝内胆管癌）および混合型肝細胞癌・胆管細胞癌を含むがこれに限定されない。皮膚癌は、扁平上皮癌、カポジ（Kaposi’s）肉腫、悪性黒色腫、Merkel細胞皮膚がんおよび非黒色腫皮膚癌を含むがこれに限定されない。頭頸部癌は、喉/下咽頭/鼻咽頭/口腔咽頭癌、口唇癌、および口腔癌を含むがこれに限定されない。リンパ腫は、エイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系リンパ腫を含むがこれに限定されない。肉腫は、軟部組織肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫を含むがこれに限定されない。白血病は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性顆粒球白血病、および有毛細胞白血病を含むがこれに限定されない。
【0051】
本発明において、「約」という用語は、通常、所定の数値の0.5%-10%以上または以下の範囲、例えば所定の数値の0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%以上または以下の範囲に変動することを意味する。
【0052】
本発明において、「含む」という用語は、通常、含むこと、備えること、含有することや、有することを指す。場合によって、「であること」、「からなる」という意味もある。
【0053】
抗体またはその抗原結合断片
1つの局面において、本発明は、軽鎖可変領域VLおよび重鎖可変領域VHを有し、ここで、前記VLは、SEQ ID NO:103で表される配列と比べて、V3、A10、K44、D71およびV77からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVLアミノ酸突然変異を含むCD137に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0054】
本発明において、上記のVLアミノ酸突然変異は、A10およびV77の位置で起きるVLアミノ酸突然変異を含んでよい。例えば、上記のVLアミノ酸突然変異は、1）V3、D71およびV77；2）A10およびV77；3）D71；4）A10、D71およびV77；5）D71およびV77；6）A10およびD71；または7）V3、A10、K44、D71およびV77からなる群のいずれか1群の位置におけるVLアミノ酸突然変異を含んでよい。
【0055】
本発明において、上記のVHは、SEQ ID NO:127で表される配列と比べて、Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVHアミノ酸突然変異を含んでよい。
【0056】
本発明において、上記のVHアミノ酸突然変異は、Q13の位置で起きるVHアミノ酸突然変異を含んでよい。本発明において、上記のVHアミノ酸突然変異は、さらに、N78の位置で起きるVHアミノ酸突然変異を含んでよい。
【0057】
例えば、上記のVHアミノ酸突然変異は、1）N78；2）N78、H84、およびD86；3）Q13、N78、H84およびD86；4）Q13およびN78；5）Q13、H84、D86、A90およびF97または6）Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群のいずれか1群の位置におけるVHアミノ酸突然変異を含む。
【0058】
又、例えば、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片において、上記のVLアミノ酸突然変異と上記のVHアミノ酸突然変異は、それぞれ、1）VL：V3、D71およびV77、ならびにVH：N78；2）VL：D71、ならびにVH：N78、H84およびD86；3）VL：D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；4）VL：A10、D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；5）VL：A10およびD71、ならびにVH：Q13、N78、H84およびD86；6）VL：V3、A10、K44、D71およびV77、ならびにVH：Q13およびN78；7）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、H84、D86、A90およびF97または8）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群のいずれか1群の位置におけるアミノ酸突然変異を含んでよい。
【0059】
本発明において、上記のV3におけるVLアミノ酸突然変異は、V3A、V3M、V3Gから選択可能である。本発明において、上記のA10におけるVLアミノ酸突然変異は、A10V、A10L、A10Iから選択可能である。本発明において、上記のK44におけるVLアミノ酸突然変異は、K44T、K44Gから選択可能である。本発明において、上記のD71におけるVLアミノ酸突然変異は、D71N、D71Qから選択可能である。本発明において、上記のV77におけるVLアミノ酸突然変異は、V77Iから選択可能である。本発明において、上記のQ13におけるVHアミノ酸突然変異は、Q13K、Q13Rから選択可能である。本発明において、上記のN78におけるVHアミノ酸突然変異は、N78K、N78Dから選択可能である。本発明において、上記のH84におけるVHアミノ酸突然変異は、H84Q、H84Eから選択可能である。本発明において、上記のD86におけるVHアミノ酸突然変異は、D86N、D86Eから選択可能である。本発明において、上記のA90におけるVHアミノ酸突然変異は、A90T、A90Sから選択可能である。本発明において、上記のF97におけるVHアミノ酸突然変異は、F97Y、F97Wから選択可能である。
【0060】
本発明において、上記のVLアミノ酸突然変異は、1）V3A、D71NおよびV77I；2）A10VおよびV77I；3）D71N；4）A10V、D71NおよびV77I；5）D71NおよびV77I；6）A10VおよびD71N；または7）V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77Iからなる群のいずれか1群のVLアミノ酸突然変異を含んでよい。
【0061】
本発明において、上記のVHアミノ酸突然変異は、1）N78K；2）N78K、H84QおよびD86N；3）Q13K、N78K、H84QおよびD86N；4）Q13KおよびN78K；または5）Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Yからなる群のいずれか1群のVHアミノ酸突然変異を含んでよい。
【0062】
例えば、上記のVLアミノ酸突然変異と上記のVHアミノ酸突然変異は、それぞれ、1）VL：V3A、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K；2）VL：D71N、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；3）VL：D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；4）VL：A10V、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；5）VL：A10VおよびD71N、ならびにVH：Q13K、N78K、H84QおよびD86N；6）VL：V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77I、ならびにVH：Q13KおよびN78K；7）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Yまたは8）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Yからなる群のいずれか1群のアミノ酸突然変異を含んでよい。
【0063】
本発明において、上記のVLは、SEQ ID NO:104-114のいずれかで表されるアミノ酸配列を含んでよい。本発明において、上記のVLは、SEQ ID NO:104、106、108および110-114のいずれかで表されるアミノ酸配列を含んでよい。
【0064】
本発明において、上記のVHは、SEQ ID NO:128-138のいずれかで表されるアミノ酸配列を含んでよい。本発明において、上記のVHは、SEQ ID NO:128、130、132および134-138のいずれかで表されるアミノ酸配列を含んでよい。
【0065】
例えば、本発明の上記の抗体において、1）上記のVLは、SEQ ID NO:104で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:128で表されるアミノ酸配列を有してよく；2）上記のVLは、SEQ ID NO:106で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:130で表されるアミノ酸配列を有してよく；3）上記のVLは、SEQ ID NO:108で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:132で表されるアミノ酸配列を有してよく；4）上記のVLは、SEQ ID NO:110で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:134で表されるアミノ酸配列を有してよく；5）上記のVLは、SEQ ID NO:111で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:135で表されるアミノ酸配列を有してよく；6）上記のVLは、SEQ ID NO:112で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:136で表されるアミノ酸配列を有してよく；7）上記のVLは、SEQ ID NO:113で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:137で表されるアミノ酸配列を有してよく；または、8）上記のVLは、SEQ ID NO:114で表されるアミノ酸配列を有してよく、かつ、上記のVHは、SEQ ID NO:138で表されるアミノ酸配列を有してよい。
【0066】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:7-10で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:11-14で表されるLFR1-4を含んでよく。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-WT-Fc、または、SEQ ID:103で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:127で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0067】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:15-18で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:19-22で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-4A-Fc、または、SEQ ID:104で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:128で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0068】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:23-26で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:27-30で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-4B-Fc、または、SEQ ID:105で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:129で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0069】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:31-34で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:35-38で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-4C-Fc、または、SEQ ID:106で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:130で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0070】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:39-42で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:43-46で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-5A-Fc、または、SEQ ID:107で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:131で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0071】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:47-50で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:51-54で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-5B-Fc、または、SEQ ID:108で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:132で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0072】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:55-58で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:59-62で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-5C-Fc、または、SEQ ID:109で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:133で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0073】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:63-66で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:67-70で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-6A-Fc、または、SEQ ID:110で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:134で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0074】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:71-74で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:75-78で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-6B-Fc、または、SEQ ID:111で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:135で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0075】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:79-82で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:83-86で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-7A-Fc、または、SEQ ID:112で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:136で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0076】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:87-90で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:91-94で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-7B-Fc、または、SEQ ID:113で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:137で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0077】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:95-98で表されるHFR1-4を含んでよく；上記の抗体またはその抗原結合断片は、配列がそれぞれSEQ ID NO:99-102で表されるLFR1-4を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-7BN78K-Fc、または、SEQ ID:114で表されるアミノ酸配列を有するVLおよび/またはSEQ ID:138で表されるアミノ酸配列を有するVHを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0078】
本発明において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片において、LCDR1のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1またはその変異体を含んでよく；LCDR2のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2またはその変異体を含んでよく；LCDR3のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:3またはその変異体を含んでよく；かつ、HCDR1のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:4またはその変異体を含んでよく；HCDR2のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:5またはその変異体を含んでよく；HCDR3のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:6またはその変異体を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-WT-Fc、C2-4A-Fc、C2-4B-Fc、C2-4C-Fc、C2-5A-Fc、C2-5B-Fc、C2-5C-Fc、C2-6A-Fc、C2-6B-Fc、C2-7A-Fc、C2-7B-Fc、C2-7BN78K-Fc、または、SEQ ID:1-3で表されるアミノ酸配列を有するLCDR1-3および/またはSEQ ID:4-6で表されるアミノ酸配列を有するHCDR1-3を含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0079】
本発明において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片のFcの配列は、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164またはその変異体を含む。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-WT-Fc、C2-4A-Fc、C2-4B-Fc、C2-4C-Fc、C2-5A-Fc、C2-5B-Fc、C2-5C-Fc、C2-6A-Fc、C2-6B-Fc、C2-7A-Fc、C2-7B-Fc、C2-7BN78K、または、SEQ ID:164で表されるアミノ酸配列を有するFcを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0080】
本発明において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片における軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間には、さらに、配列がSEQ ID NO:165またはその変異体を含有可能な連結ペプチドを含む。例えば、該連結ペプチドは、(G4S)3を含んでよい。本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片における軽鎖可変領域とFcの間には、さらに、配列がSEQ ID NO:166またはその変異体を含有可能な連結ペプチドを含んでよい。例えば、該連結ペプチドは、G4Sを含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-WT-Fc、C2-4A-Fc、C2-4B-Fc、C2-4C-Fc、C2-5A-Fc、C2-5B-Fc、C2-5C-Fc、C2-6A-Fc、C2-6B-Fc、C2-7A-Fc、C2-7B-Fc、C2-7BN78K-Fc、または、SEQ ID:165で表されるアミノ酸配列を有する連結ペプチド(G4S)3および/またはSEQ ID:166で表されるアミノ酸配列を有する連結ペプチドG4Sを含有する本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0081】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:103またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:127またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-WT-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0082】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-WT-Fcであってよい。抗体C2-WT-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:11-14で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:103で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:7-10で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:127で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0083】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:104で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:128で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-4A-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0084】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-4A-Fcであってよい。抗体C2-4A-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:19-22で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:104で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:15-18で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:128で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0085】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:105で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:129で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-4B-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0086】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-4B-Fcであってよい。抗体C2-4B-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:11-14で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:105で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:23-26で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:129で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0087】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:106で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:130で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-4C-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0088】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-4C-Fcであってよい。抗体C2-4C-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:35-38で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:106で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:31-34で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:130で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0089】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:107で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:131で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-5A-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0090】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-5A-Fcであってよい。抗体C2-5A-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:43-46で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:107で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:39-42で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:131で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0091】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:108で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:132で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-5B-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0092】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-5B-Fcであってよい。抗体C2-5B-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:51-54で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:108で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:47-50で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:132で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO.165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0093】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:109で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:133で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-5C-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0094】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-5C-Fcであってよい。抗体C2-5C-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:59-62で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:109で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:55-58で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:133で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO.165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0095】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:110で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:134で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-6A-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0096】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-6A-Fcであってよい。抗体C2-6A-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:67-70で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:110で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:63-66で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:134で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0097】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:111で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:135で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-6B-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0098】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-6B-Fcであってよい。抗体C2-6B-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:75-78で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:111で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:71-74で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:135で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO.165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0099】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:112で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:136で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-7A-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0100】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-7A-Fcであってよい。抗体C2-7A-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:83-86で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:112で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:79-82で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:136で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO.165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0101】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:113で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:137で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-7B-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0102】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-7B-Fcであってよい。抗体C2-7B-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:91-94で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:113で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:87-90で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:137で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0103】
ある実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:114で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な軽鎖可変領域を含んでよく；かつ、重鎖は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:138で表されるアミノ酸配列またはその変異体を含有可能な重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体C2-7BN78K-Fc、または、同じの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む本発明に記載の抗体を含んでよい。
【0104】
例えば、本発明に記載の抗体は、C2-7BN78K-Fcであってよい。抗体C2-7BN78K-Fcは、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表され、LFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:99-102で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:114で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO.4-6で表され、HFR1-4のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:95-98で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:138で表され、Fc配列がSEQ ID NO:163で表され、VHとVLの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3であり、VLとFcの間の連結ペプチドが配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである。
【0105】
ある場合において、上記の抗体は、C2-7BN78K-Fcであってよい。抗体C2-7BN78K-Fcは、軽鎖可変領域VLを含んでよく、ここで、上記のVLは、SEQ ID NO:103で表される配列と比べて、A10VおよびV77Iのアミノ酸突然変異を有する1つまたは複数のVLアミノ酸突然変異を含んでよい。抗体C2-7BN78K-Fcは、アミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1-3で表されるLCDR1-3を含んでよく、抗体C2-7BN78K-Fcは、アミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:99-102で表されるLFR1-4を含んでよく、抗体C2-7BN78K-FcのVLは、SEQ ID:114で表されるアミノ酸配列を含んでよい。抗体C2-7BN78K-Fcは、重鎖可変領域VHを含んでよく、ここで、上記のVHは、SEQ ID NO:127で表される配列と比べて、Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Yのアミノ酸突然変異が起きる1つまたは複数のVHアミノ酸突然変異を含んでよい。抗体C2-7BN78K-Fcは、アミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4-6で表されるHCDR1-3を含んでよく、抗体C2-7BN78K-Fcは、アミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:95-98で表されるHFR1-4を含んでよく、抗体C2-7BN78K-FcのVHは、SEQ ID:138で表されるアミノ酸配列を含んでよい。抗体C2-7BN78K-Fcは、さらに、アミノ酸配列がSEQ ID NO:163で表されるFcを含んでよい。抗体C2-7BN78K-Fcにおいて、上記のVHのC末端とVLのN末端は、配列がSEQ ID NO:165で表される（G4S）3である連結ペプチドを介して連結され、上記のVLのC末端と上記のFcのN末端は、配列がSEQ ID NO:166で表されるG4Sである連結ペプチドを介して連結される。
【0106】
本発明において、上記のアミノ酸配列の変異体は、それと基本的に同一の機能（例えば、CD137タンパク質に特異的に結合することができる）を有し、且つそれと少なくとも約85%（例えば、少なくとも約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはより高い）配列同一性を有するアミノ酸配列であってよい。ある実施形態において、上記のアミノ酸配列の変異体は、それと基本的に同一の機能（例えば、CD137タンパク質に特異的に結合することができる）を有し、且つそれに基づき1個または複数（例えば、1～2個、1～3個、1～4個、1～5個、1～6個、1～7個、1～8個、1～9個、1～10個またはより多く）のアミノ酸の付加、欠失または置換を含有するアミノ酸配列である。
【0107】
本発明において、上記の抗体またはその抗原結合断片は、さらに、Fcドメインを含んでよい。例えば、上記の抗体Fc領域は、IgGのFc領域を含んでよい。例えば、上記の抗体Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選ばれる免疫グロブリンの定常領域アミノ酸配列を含んでよい。ある実施形態において、上記のFcドメインは、SEQ ID NO:163またはSEQ ID NO:164で表されるアミノ酸配列を含んでよい。
【0108】
免疫複合体、核酸、ベクター、細胞
一方、本発明は、上記の抗体またはその抗原結合断片を含有可能な免疫複合体を提供する。
【0109】
一方、本発明は、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードすることができる1つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。本発明に記載の核酸分子は、単離されてよい。ある実施形態において、本発明は、1つの単離された核酸分子を含んでよい。例えば、scFv-Fcのような本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含んでよい。ある実施形態において、本発明は、複数の単離された核酸分子を含んでよい。本発明において、本発明に記載の核酸分子は、（i）インビトロでの増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅と、（ii）クローン組換えと、（iii）精製、例えば、酵素消化およびゲル電気泳動分画と、或いは、（iv）合成、例えば、化学合成とによって産生または合成されてよい。ある実施形態において、上記の単離された核酸は、組換えDNAの技術で調製される核酸分子である。
【0110】
一方、本発明は、本発明に記載の核酸分子を含む1つまたは複数のベクターを提供する。なお、上記のベクターには、その他の遺伝子、例えば適合な宿主細胞中および適合な条件で該ベクターへの選択が許容される標識遺伝子をさらに含んで良い。なお、上記のベクターは、さらに、コード領域が適切な宿主中で正しく発現することが許容される発現調節因子を含んで良い。このような調節因子は、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写やmRNAの翻訳を調節するその他の調節因子などを含めて、当該技術分野における当業者の周知のものである。ある実施形態において、上記発現調節配列が調節可能なものである。上記発現調節配列の具体な構造は、生物種や細胞種の機能により変化するが、通常、例えばTATAボックス、キャッピング配列、およびCAAT配列などそれぞれ転写および翻訳の開始を関与する5’非転写配列並びに5’および3’非翻訳配列を含む。例えば、5’非転写発現調節配列は、機能的に連結された核酸を転写制御するためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含んで良い。本発明に記載の1種類または複数種類の核酸分子は、上記発現調節因子と操作可能に連結されてよい。上記のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または、例えば遺伝子工学に一般的に用いられるその他のベクターを含んで良い。例えば、上記ベクターは、発現ベクターである。
【0111】
一方、本発明は、1種類または複数種類の本発明に記載のベクターを含有可能な細胞を提供する。ある実施形態において、各種類や各細胞は、1つや1種類の本発明に記載のベクターを含んでよい。ある実施形態において、各種類または各細胞は、複数（例えば、2つまたはそれ以上）または複数種類（例えば、2種類またはそれ以上）の本発明に記載のベクターを含んでよい。例えば、各細胞は、本発明に記載の核酸分子を含有可能な1つのベクターを含んでよい。例えば、各細胞には、本発明に記載の抗体または抗原結合断片をコードするヌクレオチドが融合されているベクターを含んでよい。又、例えば、各細胞には、ヒトIgG4-Fc遺伝子が融合されているベクターおよびscFv-Fc分子遺伝子が融合されているベクターを含有可能な複数のベクターを含んでよい。ある実施形態において、本発明は、例えば、本発明に記載のベクターを上記の細胞、例えば真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入することができる。例えば、上記の哺乳動物細胞は、HEK293細胞であってよい。当該技術分野における周知の方法、例えば電気穿孔、lipofectineトランスフェクト、lipofectaminトランスフェクトなどによって、本発明に記載のベクターを上記の細胞に導入することができる。
【0112】
医薬組成物および製薬の使用
一方、本発明は、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片、本発明に記載の免疫複合体、または本発明に記載の核酸分子、本発明に記載の細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含有可能な医薬組成物を提供する。上記した薬学的に許容可能なアジュバントは、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属複合体および/又は非イオン界面活性剤などを含んでよい。本発明において、上記の医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位におけるin situ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下貯蔵部による投与のために調製されることができる。
【0113】
一方、本発明は、がんの治療のための医薬品の調製における本発明に記載の抗原またはその抗原結合断片の使用を提供する。一方、本発明は、がんの治療の使用のための本発明に記載の抗原またはその抗原結合断片を提供する。一方、本発明は、本発明に記載の抗原またはその抗原結合断片を投与することを含むがんの治療の方法を提供する。
【0114】
例えば、本発明に記載の抗原またはその抗原結合断片を含む医薬品を調製することによって、定期的に皮下接種で腫瘍の成長を抑制することができる。例えば、投与は、週に2回でもよいし、１回でもよいし、3回でもよく、また、2週に１回でもよい。投与の用量は、1回約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約2.0mg/kg、約3.0mg/kg、約4.0mg/kg、約5.0mg/kgなどであってよい。ある実施形態において、上記のがんは、黒色腫、前立腺がん、結腸直腸癌、Merkel細胞皮膚がん、膵臓がん、非ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、乳がんなどからなる群から選ばれてよい。
【0115】
以下の実施例は、どんな理論にもよらず、本発明に係る抗原または抗原結合断片、ベクター、細胞および医薬組成物の作用形態を釈明することに過ぎなく、本願発明の範囲を制限するものではない。
【0116】
実施例
実施例1抗CD137抗体突然変異分子の構築
1.1 抗CD137抗体突然変異のデザイン
抗CD137抗体分子（C2-WT）のVHおよびVL（それぞれSEQIDNO.127および103で表される）の特定位置に、アミノ酸突然変異が導入され、そして、上記の抗体分子のscFv断片をFc断片に融合した。swiss-modelでC2-WT-Fcに対して相同モデリングを行うと共に、自由エネルギーを算出し、相同モデリングのモデルに基づき、VHとVLのFRを区別して点突然変異し、点突然変異された配列に対して自由エネルギーを算出し、同時にIMGTウェブサイト（http://www.imgt.org/）で突然変異された配列とヒト生殖細胞株の相同性を比較し、自由エネルギーとヒト生殖細胞株の相同性に基づき、すべての突然変異に対し整列を行い、その自由エネルギーおよび相同性整列に従って、安定性の一番高い分子を10個選び出して、その自由エネルギーおよび相同性の整列を図1に示す。上記の抗CD137抗体分子に対して行われる突然変異は、具体的に、表1および図1で表される。
【0117】
【表1】
【0118】
1.2組換えヒトCD137の発現およびEGFP細胞の調製
タンパク質データベースUniprotにおけるヒトCD137のアミノ酸配列（Q07011）に基づいて、ヒトCD137の細胞外ドメインのアミノ酸配列（すなわち、Q07011における1位の残基～186位の残基）を取得し、タンパク質データベースUniprotにおけるマウス免疫グロブリンgamma（γ）1（IgG1）の定常領域アミノ酸配列（P01868）に基づいて、マウスIgG1-Fc（muFc）のドメインのアミノ酸配列（すなわち、P01868における98位の残基～324位の残基）を取得した。DNAworksオンラインツール（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、対応するコード化DNA配列をデザインしてhCD137-muFc融合タンパク質の遺伝子を取得した。タンパク質データベースUniprotの情報に基づいて、強化型緑色蛍光タンパク質EGFPのアミノ酸配列（C5MKY7）を得て、DNAworksオンラインツール（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、対応するコード化DNA配列をデザインしてhCD137-EGFP融合タンパク質の遺伝子を取得した。人工合成により所望のDNA断片を得て、合成された遺伝子配列を、それぞれFermentas社によるHind IIIおよびEcoR Iを利用して、産業化のベクターpcDNA4/myc-HisA（Invitrogen、V863-20）に二重酵素消化によってサブクローニングして、プラスミド構築の正確性をシーケンシングによって確認し、組換えプラスミドDNA、すなわちpcDNA4-hCD137-muFcおよびpcDNA4-hCD137-EGFPを取得した。hCD137-EGFP組換えプラスミドをHEK 293（ATCC、CRL-1573TM）細胞にトランスフェクト後48時間に、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によりhCD137の発現を確認した。
【0119】
pcDNA4-hCD137-muFcは、HEK 293細胞に一過性にトランスフェクトされ、タンパク質の産生に用いられた。組換え発現プラスミドを、Freestyle 293培地で希釈しながら、転換に必要なPEI（Polyethylenimine）溶液を加えて、そして、各群のプラスミド/PEI混合物を、それぞれ細胞懸濁液に加えて、37℃、10% CO2、90 rpmで5～6日間培養後、以下の各実施例に用いるために、一過性発現培養上清液を採取し、Protein Aアフィニティークロマトグラフィー法で、最初にhCD137-muFcタンパク質サンプルを精製した。得られたタンパク質サンプルは、SDS-PAGEによって初期の検出を行われ、標的バンドがはっきり見えられた。
【0120】
1.3 抗CD137抗体の発現
便宜上、前述した実施例におけるC2-WT-Fc、C2-4B-Fc、C2-7A-Fc、C2-7B-Fc、C2-7BN78K-Fcは、以下の実施例における検出のために選択された。
【0121】
前述のように得られたアミノ酸配列は、DNAworksオンラインツール（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、対応するコード化DNA配列をデザインして、得られたDNA配列ヒトIgG4-Fc遺伝子を融合後、Fermentas社によるHind IIIおよびEcoR Iを利用して、二重酵素消化によって産業化のベクターpcDNA4にクローニングして、プラスミド構築の正確性をシーケンシングによって確認し、組換えプラスミドDNA、すなわちpcDNA4-C2-WT-Fc、pcDNA4-C2-4B-Fc、pcDNA4-C2-7A-Fc、pcDNA4-C2-7B-FcおよびpcDNA4-C2-7BN78K-Fcを取得した。分子クローニングの標準操作にしたがってプラスミド抽出を行い、以下の各実施例に用いるために、抽出されたプラスミドをHEK 293細胞に一過性に発現させ、Protein Aカラムで精製することによって、C2-WT-Fc、C2-4B-Fc、C2-7A-Fc、C2-7B-Fc、C2-7BN78K-Fcを得た。得られたタンパク質サンプルは、SDS-PAGEによって初期の検出を行われ、標的バンドがはっきり見えられた。
【0122】
実施例2抗CD137抗体分子結合能の検出
2.1抗CD137タンパク質との結合能の検出（ELISA法）：
被覆緩衝液（50mMNa2CO3, NaHCO3pH9.6）でCD137-muFcタンパク質を2μg/mlまでに希釈して、100μL/ウェルで4℃一晩した。プレートを洗浄後、3%BSA-PBS、37℃にて1時間ブロッキングした。抗CD137抗体C2-WT-Fc、C2-4A-Fc、C2-7A-FcおよびC2-7B-Fcを、それぞれ10μg/mlから、合計11つの濃度で3倍勾配希釈を施し、希釈液（1%BSA-PBS）を対照とし、37℃で2時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトIgG-HRP（Goat anti-humanIgG- HRP conjugated）を加えて、37℃で1時間インキュベートした。可溶性単一成分TMB基質発色液を添加して、室温で光のあたらない所に5-10分間発色させた。2NH2SO4を50μL/ウェルで添加して、発色反応を停止させた。MD SpectraMax Plus384マイクロプレートリーダーに移して450nm-650nmにおけるOD値を読み取り、ソフトウェアSoft Max pro v54でデータ処理および作図解析を行い、結果が図2および表2で表される。図2で表される平均値は、次式により得られた。
【0123】
【数1】
【0124】
【表2】
【0125】
結果から、C2-7B-Fc、C2-7A-FcとC2-WT-Fcの抗原結合能が同一のレベルにあり、C2-7B-FcがC2-7A-Fcよりもやや強く、C2-4B-Fcの結合能が比較的に弱かったことを示した。
【0126】
さらに、C2-7B-Fcを選び出してC2-7BN78Kと比較した。被覆緩衝液（50mM Na2CO3, NaHCO3pH9.6）でCD137タンパク質を2μg/mlまでに希釈して、100mL/ウェルで4℃一晩した。プレートを洗浄後、3%BSA-PBS、37℃にて1時間ブロッキングした。抗CD137抗体C2-7B-Fc、C2-7BN78K-Fcを、それぞれ10μg/mLから、合計11つの濃度で3倍勾配希釈を施し、希釈液（1%BSA-PBS）を対照とし、37℃で2時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトIgG-HRP（Goat anti-human IgG- HRP conjugated）を加えて、37℃で1時間インキュベートした。可溶性単一成分TMB基質発色液を添加して、室温で光のあたらない所に5-10分間発色させた。2N H2SO4を50μL/ウェルで添加して、発色反応を停止させた。MD SpectraMax Plus384マイクロプレートリーダーに移して450nm-650nmにおけるOD値を読み取り、ソフトウェアSoft Max pro v54でデータ処理および作図解析を行い、結果は、図3および表3で表される。図3で表される平均値も、前述した式により得られた。
【0127】
【表3】
【0128】
結果から、C2-7BN78K-FcがC2-7B-Fcの抗原結合能に相当することを示した。
【0129】
2.2細胞表面に発現するCD137との結合能の検出（FACS法）：
実施例構築の発現hCD137-EGFPのHEK 293細胞を取り、0.5% PBS-BSA緩衝液で再懸濁させ、抗ヒトCD137のC2-WT-Fc、C2-4B-Fc、C2-7A-FcおよびC2-7B-Fcタンパク質を入れて、hIgG Fcタンパク質を陰性対照とし、氷上で20分間インキュベートした。洗浄後、eBioscience二抗anti-hIg-PEを加えて、氷上で20分間インキュベートした。洗浄後、細胞を500 μL 0.5% PBS-BSA Buffer中で再懸濁させ、フローサイトメーターにより検出した。結果は、図4に示されたように、水平座標がEGFPの発現強度を示し、鉛直座標がa-hIg-PEの強度を示す。
【0130】
FACS法試験の結果は、ELISA法試験の結果と一致しており、C2-7B-Fc、C2-7A-FcとC2-WT-Fcの抗原結合能が同一のレベルにあるが、C2-4B-Fcの結合能が比較的に弱かった。
【0131】
実施例3抗CD137抗体分子の作動活性の検出
実験室から293T-CD137-NF-kB安定細胞株を取り、パンクレアチンを入れて2-3分間消化後、DMEM完全培地を加えて消化を停止させ、細胞を軽く吹き飛ばして、細胞懸濁液を96ウェルプレートに移して接種し、100μL/ウェルで、C2-WT-Fc、C2-4B-Fc、C2-7A-FcおよびC2-7B-Fc抗体を10μg/mLから10倍希釈し、そして、希釈された抗体およびanti-human crosslinking抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories：109-006-008）を96ウェルプレートに混合して添加すると共に、対照群を完全培地に加えて30時間後、溶解した細胞をルシフェラーゼ検出システム（Promega：E1501）で検出し、その結果は、図5および表4で表される。
【0132】
【表4】
【0133】
結果から、C2-4B-Fcのアゴニスト活性が低く、C2-7A-Fc、C2-7B-Fcの活性が突然変異していないC2-WT-Fcに近く、共に下流シグナル伝達を活性化させることを示した。
【0134】
なお、実験室から293T-CD137-NFκB安定細胞株を取り、パンクレアチンを入れて2-3分間消化後、DMEM完全培地を加えて消化を停止させ、細胞を軽く吹き飛ばして、細胞懸濁液を96ウェルプレートに移して接種し、100μL/ウェルで、scFv-Fc融合タンパク質態様のC2-WT-Fc、C2-7B-FcおよびC2-7BN78K-Fc抗体を10μg/mLから10倍希釈し、そして、希釈された抗体およびanti-human crosslinking（抗ヒト架橋）抗体（JacksonImmunoResearch Laboratories：109-006-008）を96ウェルプレートに混合して添加すると共に、対照群を完全培地に加えて30時間後、溶解した細胞をルシフェラーゼ検出システム（Promega：E1501）で検出し、その結果は、図6および表5、表6で表される。
【0135】
【表5】
【0136】
【表6】
【0137】
結果から、C2-7BN78K-Fc、C2-7B-Fcは、下流シグナルのC2-WT-Fcによる活性化の能力相当であって、両者の作動活性がほぼ同一であることを示した。
【0138】
実施例4抗CD137抗体によるT細胞増殖能の増加
末梢血単核細胞PBMCは、ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Haoyang）を用いて、密度勾配遠心分離法によって、健常人ドナーの末梢血における白血球濃厚液から分離され、RPMI完全培地に接種された。CD8+T細胞は、磁気細胞分離キット（Miltenyi Biotec：130-096-533）によって、明細書にしたがってPBMCから分離された。カウントしながらRPMI完全培地に再懸濁させ、濃度が2×106/mLになった。1μg/mLの抗-CD3および0.2μg/mLの抗-CD28により分離したCD8+T細胞を刺激することによって活性化させ、C2-7B抗体を20μg/mlから3倍希釈し、希釈された抗体およびanti-human crosslinking抗体（JacksonImmunoResearch Laboratories：109-006-008）を混合して加えて、RPMI完全培地を陰性対照とし、5日間培養後上清を取り出した。CD8+T細胞は、上清中のIL-2レベルがIL-2 ELISAアッセイキット（ebioscience）により検出され、結果は、図7で表される。結果から、抗CD137抗体C2-7B-Fcは、CD8+T細胞によるIL-2分泌の能力を向上させることができることを示した。
【0139】
実施例5抗CD137抗体の安定性検出
5.1抗CD137抗体の37℃加速安定実験純度測定
抗CD137抗体に対して、37℃で加速安定実験を行い、具体的な実験方法は、Protein Aによりシングルステップ精製された抗CD137抗体C2-WT-Fc、C2-7A-FcおよびC2-7B-FcをPBSに（pH 7.4）溶解させるとともに、2mg/mLまで濃縮し、そして、100μgの抗体を取り200μLのPCRチューブに入れて、37℃の水浴を用いて、それぞれ、0日目、7日目、14日目および21日目にサンプリングしてA280検出およびSEC-HPLC分析を行い、結果は、表7および図8で表される。
【0140】
結果から、抗体C2-WT-Fc、C2-7A-FcおよびC2-7B-Fcについて、サンプル濃度の点において、異なる時点で取得されたサンプル濃度が著しく変化していなく、サンプル純度の点において、C2-WT-Fcは、タンパク質純度が経時的に顕著に低下し、C2-7A-Fcは、純度が低下するが明らかではなく、C2-7B-Fcは、タンパク質純度がそのまま変わっていなかったことを示した。この結果から、安定的に突然変異したC2-7A-FcおよびC2-7B-Fcは、タンパク質の安定性が安定的に突然変異していないC2-WT-Fcよりも有意に高くなったことが明らかになった。
【0141】
【表7】
【0142】
なお、サンプルC2-7B-FcおよびC2-7BN78K-Fcタンパク質は、2 mg/mLまで濃縮して、タンパク質純度をサンプル抽出して検出し、そして、37℃水浴の条件下で、それぞれ0日目、7日目、14日目および21日目にサンプリングしてSDS電気泳動実験を行い、検出結果は、図9A、図9Bで表される。C2-7B-FcおよびC2-7BN78K-Fcタンパク質の純度分析結果がそれぞれ図10A-10D、図11A-11Dで表される。
【0143】
結果から、C2-7B-FcおよびC2-7BN78K-Fcは、共に高い安定性を持つことを示した。
【0144】
5.2示差走査熱量計（DSC）による抗CD137抗体の安定性検出
抗CD137抗体は、熱的安定性がDSCによって検出された。DSCによる試験を正しくするように、単一緩衝液とタンパク質付き緩衝液の走査結果を収集した。
【0145】
抗CD137抗体タンパク質を1mg/mL（PBS緩衝液）までに希釈した。データの収集は、DSCが10-110℃の走査、100℃/1時間の走査速度、毎回の走査の前における15分間の平衡で走査するように設計されているような条件に基づく。DSCサンプル室の体積は0.5mLであった。緩衝液とタンパク質の走査結果を収集した場合に、タンパク質の走査結果から緩衝液の走査結果を取り除いてよい。サンプルにおけるタンパク質の濃度を取得することによって各走査での濃度を補正し、抗CD137抗体のTm値を得て、結果が図12で表される。結果から、C2-7B-FcのTm値が59.05965℃であって、C2-WT-Fc、C2-4B-Fc、C2-7A-FcおよびC2-7B-Fcで一番高いので、C2-7B-Fcは、最も安定であったことが分かった。
【0146】
なお、DSCで抗CD137抗体の熱安定を検出した。DSCによる試験を正しくするように、単一緩衝液とタンパク質付き緩衝液の走査結果を収集した。
【0147】
抗CD137抗体タンパク質を1mg/mL（PBS緩衝液）までに希釈した。データの収集は、DSCが10-110℃の走査、100℃/1時間の走査速度、毎回の走査の前における15分間の平衡で走査するように設計されているような条件に基づく。DSCサンプル室の体積は0.5mLであった。緩衝液とタンパク質の走査結果を収集した場合に、タンパク質の走査結果から緩衝液の走査結果を取り除いてよい。サンプルにおけるタンパク質の濃度を取得することによって各走査での濃度を補正し、抗CD137抗体のTm値を得て、結果が図12で表される。結果から、C2-7B-FcとC2-7BN78K-Fcは、遷移の中央値（Tm）でも、熱的安定性でも同様であったことが分かった。
【0148】
実施例6抗CD137抗体ラット薬物動態学検出
SD、メス、2-3月齢のラットから、6匹のラットを選んで、3匹を1群として2群に平均に群分けた。そのラット全体にC2-7B-FcおよびC2-7BN78K-Fcタンパク質2.2mg（10mg/kg）を静脈注射し、投与後13つの時点でそれぞれ100μl採血した。ELISAの方法では、hCD137-muFcでプレートを被覆し、希釈度の適切な血清サンプルを加えて、そして、Goat anti-Human IgG HRP（Sigma CatNO:A0170）を加えて、TMBで発色させることによって血清中での標的タンパク質の濃度を検出した。C2-7B-FcまたはC2-7BN78K-Fcタンパク質を対応する群の標準タンパク質として、標準カーブを作った。WinNolinソフトウェアで薬物動態学のパラメータを算出した。平均C-Tカーブは、図13および表8で表される。検出によると、C2-7B-Fcのの半減期は170.8時間であり、C2-7BN78K-Fcは安定しており、インビボにおける半減期が平均的に173.52時間であり、両者のレベルがほぼ同一である。
【0149】
【表8】
【0150】
実施例7腫瘍への抗CD137抗体による阻害
腫瘍細胞が移植されたMC38およびCD137ヒト化マウス（バイオサイトジェン）腫瘍モデルを用いて、10匹を1群として4群に群分け、完全抗CD137抗体のインビボにおける効果を評価した。0日目に、1×106個のMC38細胞をCD137ヒト化マウスに皮下接種し、7日目に、用量がそれぞれ0.2mg/kg、1mg/kgおよび5mg/kgで、週に２回、合計6回で、マウスを群分けて投与し、腫瘍の形成を週に２回観察し、ノギスで腫瘍の長径および短径を計測して、腫瘍体積を算出し、腫瘍成長カーブ図を描画し、結果は、図14で表される。
【0151】
結果から、C2-7BN78K-Fcが注射されたマウスのうち、腫瘍成長が遅延したマウスが、0.2mg/kg群に1匹有り、1mg/kg群に3匹有り、腫瘍増殖が停止したマウスが5mg/kg群に5匹あったことを示し、また、結果から、C2-7BN78K-Fcタンパク質が腫瘍増殖を有意に阻害したことを示した。
【0152】
以上、解釈又は図示による説明を記載したが、添付の請求項範囲を限定するわけではない。これまで本明細書に記載の実施形態に、多様な変更などがあることが当業者に明らかであり、且つ、添付の請求項および相当する実施形態の範囲に属する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
2022512724000001.app
【手続補正書】
【提出日】2021-04-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域VLおよび重鎖可変領域VHを有し、ここで、前記VLは、SEQ ID NO:103で表される配列と比べて、V3、A10、K44、D71およびV77からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVLアミノ酸突然変異を含む、
CD137に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記VHは、SEQ ID NO:127で表される配列と比べて、Q13、N78、H84、D86、A90およびF97からなる群から選ばれる1つまたは複数の位置で起きる1つまたは複数のVHアミノ酸突然変異を含む、
請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記VLアミノ酸突然変異は、
1）V3、D71およびV77；
2）A10およびV77；
3）D71；
4）A10、D71およびV77；
5）D71およびV77；
6）A10およびD71；または
7）V3、A10、K44、D71およびV77
からなる群のいずれか1群の位置におけるVLアミノ酸突然変異を含む、
請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記VHアミノ酸突然変異は、
1）N78；
2）N78、H84、およびD86；
3）Q13、N78、H84およびD86；
4）Q13およびN78；
5）Q13、H84、D86、A90およびF97；または
6）Q13、N78、H84、D86、A90およびF97
からなる群のいずれか1群の位置におけるVHアミノ酸突然変異を含む、
請求項2または3に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記VLアミノ酸突然変異と前記VHアミノ酸突然変異は、それぞれ
1）VL：V3、D71およびV77、ならびにVH：N78；
2）VL：D71、ならびにVH：N78、H84およびD86；
3）VL：D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；
4）VL：A10、D71およびV77、ならびにVH：N78、H84およびD86；
5）VL：A10およびD71、ならびにVH：Q13、N78、H84およびD86；
6）VL：V3、A10、K44、D71およびV77、ならびにVH：Q13およびN78；
7）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、H84、D86、A90およびF97；または
8）VL：A10およびV77、ならびにVH：Q13、N78、H84、D86、A90およびF97
からなる群のいずれか1群の位置におけるアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～4のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記VLアミノ酸突然変異は、
1）V3A、D71NおよびV77I；
2）A10VおよびV77I；
3）D71N；
4）A10V、D71NおよびV77I；
5）D71NおよびV77I；
6）A10VおよびD71N；または
7）V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77I
からなる群のいずれか1群のVLアミノ酸突然変異を含む、
請求項1～5のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記VHアミノ酸突然変異は、
1）N78K；
2）N78K、H84QおよびD86N；
3）Q13K、N78K、H84QおよびD86N；
4）Q13KおよびN78K；
5）Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y；または
6）Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y
からなる群のいずれか1群のVHアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～6のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記VLアミノ酸突然変異と前記VHアミノ酸突然変異は、それぞれ
1）VL：V3A、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K；
2）VL：D71N、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；
3）VL：D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；
4）VL：A10V、D71NおよびV77I、ならびにVH：N78K、H84QおよびD86N；
5）VL：A10VおよびD71N、ならびにVH：Q13K、N78K、H84QおよびD86N；
6）VL：V3A、A10V、K44T、D71NおよびV77I、ならびにVH：Q13KおよびN78K；
7）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y；または
8）VL：A10VおよびV77I、ならびにVH：Q13K、N78K、H84Q、D86N、A90TおよびF97Y
からなる群のいずれか1群のアミノ酸突然変異を含む、
請求項2～7のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
1）前記VLはSEQ ID NO:104で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:128で表されるアミノ酸配列を有し、
2）前記VLはSEQ ID NO:106で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:130で表されるアミノ酸配列を有し、
3）前記VLはSEQ ID NO:108で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:132で表されるアミノ酸配列を有し、
4）前記VLはSEQ ID NO:110で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:134で表されるアミノ酸配列を有し、
5）前記VLはSEQ ID NO:111で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:135で表されるアミノ酸配列を有し、
6）前記VLはSEQ ID NO:112で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:136で表されるアミノ酸配列を有し、
7）前記VLはSEQ ID NO:113で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:137で表されるアミノ酸配列を有し、または
8）前記VLはSEQ ID NO:114で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、前記VHはSEQ ID NO:138で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1～8のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
前記抗原結合断片は、Fab、Fab’、F（ab）2、F（ab’）2、FvおよびscFvから選ばれる、
請求項1～9のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項11】
さらに、Fcドメインを含み、ここで、前記Fcドメインが前記抗体またはその抗原結合断片のC末端に位置する、
請求項1～10のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項12】
前記Fcドメインは、SEQ ID NO:163またはSEQ ID NO:164で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項11に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項13】
1本ごとに前記軽鎖可変領域VL、前記重鎖可変領域VHおよび前記VLのC末端に位置する前記Fcドメインを含有する2本のポリペプチド鎖より構成されるホモ二量体タンパク質であり、前記ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO. 152、154、156および158-162のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項10～12のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項14】
CD137に特異的に結合する第1の結合ドメインと、CD137と異なる第2のターゲットに特異的に結合する第2の結合ドメインとを含有し、ここで、前記第1の結合ドメインは請求項1～13のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片であり、前記第2のターゲットは腫瘍関連抗原から選ばれる、
多重特異的抗体またはその抗原結合断片。
【請求項15】
請求項1～14のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、
免疫複合体。
【請求項16】
請求項1～14のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項15に記載の免疫複合体をコードする、
単離された核酸分子。
【請求項17】
請求項16に記載の核酸分子を含む、
ベクター。
【請求項18】
請求項17に記載のベクターを含む、
細胞。
【請求項19】
請求項1～14のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項15に記載の免疫複合体、請求項16に記載の核酸分子、請求項17に記載のベクターおよび／または請求項18に記載の細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む、
医薬組成物。
【請求項20】
がんの治療のための医薬品の調製における請求項1～14のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用、ここで、前記がんは、黒色腫、前立腺がん、結腸直腸癌、Merkel細胞皮膚がん、膵臓がん、非ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、乳がんの群から選ばれる。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0029】
一方、本発明は、さらに、上記の抗体またはその抗原結合断片、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクターおよび/または上記の細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0113】
一方、本発明は、がんの治療のための医薬品の調製における本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。一方、本発明は、がんの治療の使用のための本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片を提供する。一方、本発明は、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含むがんの治療の方法を提供する。任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0114】
例えば、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬品を調製することによって、定期的に皮下接種で腫瘍の成長を抑制することができる。例えば、投与は、週に2回でもよいし、１回でもよいし、3回でもよく、また、2週に１回でもよい。投与の用量は、1回約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約2.0mg/kg、約3.0mg/kg、約4.0mg/kg、約5.0mg/kgなどであってよい。ある実施形態において、上記のがんは、黒色腫、前立腺がん、結腸直腸癌、Merkel細胞皮膚がん、膵臓がん、非ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、乳がんなどからなる群から選ばれてよい。
【国際調査報告】
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