特表 2022-512739 操作された長鎖散在反復エレメント（ＬＩＮＥ）トランスポゾンおよびそれらの使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】操作された長鎖散在反復エレメント（ＬＩＮＥ）トランスポゾンおよびそれらの使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 14/435 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/85 Z ZNA

C07K19/00

C12N15/63 Z

A61K48/00

A61K31/7105

A61P43/00

C07K14/435

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021521154

(86)(22)【出願日】2019-10-21

(85)【翻訳文提出日】2021-06-04

(86)【国際出願番号】 US2019057244

(87)【国際公開番号】W WO2020082076

(87)【国際公開日】2020-04-23

(31)【優先権主張番号】62/748,227

(32)【優先日】2018-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500039463

【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム

【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ，ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ

【住所又は居所原語表記】２１０ Ｗｅｓｔ ７ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ ７８７０１ Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】クリステンセン， ショーン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZC411

4C084ZC412

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZC41

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

操作されたトランスポゾンおよびそれらの使用方法が提供される。トランスポゾンは代表的には、ＲＮＡ成分およびタンパク質成分を含む。ＲＮＡ成分は、例えば、ＤＮＡ標的化配列、１つまたは複数のタンパク質結合モチーフ、および標的ＤＮＡに組み込まれる目的の核酸配列を含むことができる。タンパク質成分は代表的には、ＲＬＥ ＬＩＮＥエレメントタンパク質に由来し、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素、リンカードメイン、およびエンドヌクレアーゼを含み得る。細胞のゲノムに核酸配列を導入するための医薬組成物および使用方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡ標的化配列と、１つまたは複数のタンパク質結合モチーフ（ＰＢＭ）と、ＤＮＡ標的部位に組み込まれる目的の核酸配列とを含むＲＮＡ成分であって、前記ＤＮＡ標的化配列、前記タンパク質結合モチーフ、および目的の配列は、親長鎖散在反復（ＬＩＮＥ）エレメントタンパク質に由来するタンパク質成分に結合し、ｃＤＮＡに逆転写され得、前記ｃＤＮＡがＤＮＡの前記ＤＮＡ標的部位に組み込まれ得るように、作動可能に連結されている、ＲＮＡ成分。

【請求項2】

前記タンパク質成分が、ＲＮＡ結合ドメイン、リンカードメイン、逆転写酵素、ＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちの１つまたは複数を含み、前記１つまたは複数のタンパク質結合モチーフが、前記ＲＮＡ成分を、前記タンパク質成分の前記ＲＮＡ結合ドメイン、リンカードメイン、逆転写酵素、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、またはこれらの組合せに結合させる、請求項１に記載のＲＮＡ成分。

【請求項3】

親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥ骨格からのまたはそれに由来するエレメントを含み、ＲＮＡ成分の前記目的の核酸配列が、前記ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥとは異種である；
タンパク質成分が、親ＬＩＮＥからのまたはそれに由来するエレメントを含む；あるいは
それらの組合せである、
請求項１または２に記載のＲＮＡ成分。

【請求項4】

前記ＤＮＡ標的化配列が、前記親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥとは異種である、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項5】

前記目的の配列が、遺伝子、遺伝子の断片、または機能性核酸をコードする、請求項１～４のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項6】

親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥエレメントからのまたはそれに由来する３’ＰＢＭ配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項7】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓトレーサー配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド配列、またはこれらの組合せを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項8】

前記親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥエレメントからのまたはそれに由来する５’ＰＢＭ配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項9】

前記５’ＰＢＭが、非機能性ＩＲＥＳ配列を含む、請求項８に記載のＲＮＡ成分。

【請求項10】

リボザイムをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項11】

前記リボザイムが、デルタ肝炎ウイルス様リボザイムである、請求項１０に記載のＲＮＡ成分。

【請求項12】

前記親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥが、制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）ＬＩＮＥである、請求項２～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項13】

前記ＲＬＥ ＬＩＮＥが、Ｒ２ ＬＩＮＥである、請求項１０に記載のＲＮＡ成分。

【請求項14】

前記ＲＮＡ成分の前記親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥ骨格、および前記タンパク質成分の前記親ＬＩＮＥ骨格が、同じＬＩＮＥであるか、ならびに／または前記ＳＩＮＥが、前記ＬＩＮＥに由来するか、もしくは前記ＬＩＮＥの祖先である、請求項３～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分。

【請求項15】

ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素、リンカードメインおよびエンドヌクレアーゼを含むタンパク質成分であって、前記ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素、リンカードメインおよびエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的部位においてＲＮＡ成分およびＤＮＡに結合し得、前記ＲＮＡ成分からｃＤＮＡへの逆転写、および前記ＤＮＡ標的部位において、前記ＤＮＡへの前記ｃＤＮＡの組込みを助長し得るように、作動可能に連結されている、タンパク質成分。

【請求項16】

前記ＲＮＡ成分が、ＤＮＡ標的化配列と、１つまたは複数のタンパク質結合モチーフと、前記ＤＮＡ標的部位に組み込まれる目的の核酸配列とを含む、請求項１５に記載のタンパク質成分。

【請求項17】

前記ＲＮＡ成分が、親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥ骨格からのまたはそれに由来するエレメントを含み、ＲＮＡ成分の前記目的の核酸配列が、前記ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥとは異種である；
タンパク質成分が、親ＬＩＮＥからのまたはそれに由来するエレメントを含む；あるいは
それらの組合せである、
請求項１５または１６に記載のタンパク質成分。

【請求項18】

前記ＤＮＡ結合ドメインが、親ＬＩＮＥ ＤＮＡ結合ドメインと比較して変異している、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のタンパク質成分。

【請求項19】

前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記親ＬＩＮＥ ＤＮＡ結合ドメインと比較して代替ＤＮＡ結合ドメインで置換されている、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のタンパク質成分。

【請求項20】

前記ＤＮＡ結合ドメインが、別のＤＮＡ結合タンパク質からのＤＮＡ結合ドメインである、請求項１９に記載のタンパク質成分。

【請求項21】

前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヘリックスターンヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウイングドヘリックス、ウイングドヘリックスターンヘリックス、ヘリックスループヘリックス、ＨＭＧボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＯＢフォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬエフェクター、またはＲＮＡガイドドメインのうちの１つまたは複数を含む、請求項１９または２０に記載のタンパク質成分。

【請求項22】

前記ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素、リンカードメインおよびエンドヌクレアーゼのうちの１つまたは複数の配列が、前記親ＬＩＮＥエレメントタンパク質の配列と同じである、または前記親ＬＩＮＥエレメントタンパク質と比較して前記ＲＮＡ成分に対する結合もしくは酵素活性を改善するように変異している、請求項１５～２２のいずれか一項に記載のタンパク質成分。

【請求項23】

前記親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥが、制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）ＬＩＮＥである、請求項１７～２２のいずれか一項に記載のタンパク質成分。

【請求項24】

前記ＲＬＥ ＬＩＮＥが、Ｒ２ ＬＩＮＥである、請求項２３に記載のタンパク質成分。

【請求項25】

前記ＲＮＡ成分の前記親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥ骨格、および前記タンパク質成分の前記親ＬＩＮＥ骨格が、同じＬＩＮＥであるか、ならびに／または前記ＳＩＮＥが、前記ＬＩＮＥに由来するか、もしくは前記ＬＩＮＥの祖先である、請求項１７～２４のいずれか一項に記載のタンパク質成分。

【請求項26】

請求項１～１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分をコードするベクター。

【請求項27】

請求項１５～２５のいずれか一項に記載のタンパク質成分をコードするベクター。

【請求項28】

請求項１～１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分と、請求項１５～２５のいずれか一項に記載のタンパク質成分とを含む操作されたトランスポゾン。

【請求項29】

前記ＤＮＡ標的部位での組込み反応中に生産的な４方向ジャンクションが形成される、請求項２８に記載のトランスポゾン。

【請求項30】

請求項１～１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分、請求項１５～２５のいずれか一項に記載のタンパク質成分、請求項２６に記載のベクター、請求項２７に記載のベクター、請求項２８または２９に記載の操作されたトランスポゾン、またはこれらの任意の組合せを含む、医薬組成物。

【請求項31】

１つまたは複数の細胞のゲノムに目的の核酸配列を導入する方法であって、前記１つまたは複数の細胞を、（ｉ）請求項１５～２５のいずれか一項に記載のタンパク質成分もしくは請求項１７に記載のベクターと組み合わせて、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ成分もしくは請求項２６に記載のベクターと、または（ｉｉ）請求項２８もしくは２９に記載の操作されたトランスポゾンと接触させるステップを含む方法。

【請求項32】

前記細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

次いで前記細胞が対象に導入される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させる、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞における前記目的の核酸配列の発現が、疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状、または疾患もしくは障害の根底にある分子経路を改善する、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

有効数の細胞が、それを必要とする対象を処置するために修飾される、請求項３５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１０月１９日に出願した米国特許出願第６２／７４８，２２７号に基づく利益および優先権を主張するものである。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立科学財団により与えられた助成０９５０９８３の下、政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

【0003】

配列表への参照
１７，１８３バイトのサイズを有する「ＵＴＳＢ＿１８＿４７＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして提出した配列表は、連邦規則集第３７巻１条５２項（ｅ）（５）に従ってこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

【0004】

技術分野
本発明は、一般に、ゲノム修飾のための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0005】

発明の背景
ゲノム編集技術は、がん、遺伝障害およびＨＩＶ／ＡＩＤＳを含むがこれらに限定されない、様々な疾患および障害の治療に役立つ可能性がある。体細胞のゲノム編集は、治療法の開発の有望な分野であり、複合酵素編集ツールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が、ヒト胚の生殖細胞系列からヒトβグロビン（ＨＢＢ）遺伝子を除去するために使用された（Ｏｔｉｅｎｏ， （２０１５）， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｂｉｏｅｔｈ ６：２５３． ｄｏｉ： １０．４１７２／２１５５－９６２７．１０００２５３）。しかし、歴史的に、遺伝子編集技術の臨床応用は、数ある懸念の中でも特に、編集事象の低い頻度、高いオフターゲット事象、またはこれらの組合せにより、制限されてきた。

【0006】

したがって、本発明の目的は、遺伝子送達および遺伝子編集のための改善された組成物および方法を提供することである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｏｔｉｅｎｏ， （２０１５）， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｂｉｏｅｔｈ ６：２５３． ｄｏｉ： １０．４１７２／２１５５－９６２７．１０００２５３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の要旨
操作されたトランスポゾンおよびそれらの使用方法が提供される。トランスポゾンは代表的には、ＲＮＡ成分およびタンパク質成分を含む。ＲＮＡ成分は、例えば、ＤＮＡ標的化配列と、１つまたは複数のタンパク質結合モチーフと、ＤＮＡ標的部位に組み込まれる目的の核酸配列とを含み得る。ＤＮＡ標的化配列、タンパク質結合モチーフ、および目的の配列は代表的には、制限酵素様エンドヌクレアーゼ長鎖散在反復（ＲＬＥ ＬＩＮＥ）エレメントタンパク質に由来するタンパク質成分に結合し、逆転写され、生じたｃＤＮＡが、例えば細胞ゲノム内の、ＤＮＡのＤＮＡ標的部位に組み込まれるように、作動可能に連結されている。目的の配列は、例えば、遺伝子もしくはその断片、または機能性核酸をコードすることができる。

【0009】

タンパク質への結合に関与するＲＮＡセグメントであるタンパク質結合モチーフ（ＰＭＢ）は代表的には、タンパク質成分のＲＮＡ結合ドメイン（ドメイン－１）、逆転写酵素、リンカードメイン、エンドヌクレアーゼ、またはこれらの組合せに結合する。

【0010】

ＲＮＡ成分は、親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥ骨格からのまたはそれに由来するエレメントを含むことができ、ＲＮＡ成分の目的の核酸配列は、ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥとは通常は異種である。代表的な実施形態では、ＤＮＡ標的化配列は、親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥとは異種である。ＲＮＡ成分は、例えば、親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥエレメントからのまたはそれに由来する３’ＰＢＭ配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓトレーサー配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド配列、あるいはこれらの組合せ、親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥエレメント、好ましくは、いずれかのＩＲＥＳ配列が非機能性である親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥエレメント、からのまたはそれに由来する５’ＰＢＭ配列、リボザイム、例えばデルタ肝炎ウイルス様リボザイム、あるいはこれらの任意の組合せを含み得る。

【0011】

タンパク質成分は代表的には、ＲＬＥ ＬＩＮＥエレメントタンパク質に由来し、１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメイン、１つまたは複数のＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素、リンカードメイン、およびエンドヌクレアーゼを含み得る。代表的には、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素、リンカードメインおよびエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的部位においてＲＮＡ成分およびＤＮＡ（例えば、細胞ゲノムＤＮＡ）に結合し得、ＲＮＡ成分からｃＤＮＡへの逆転写、およびＤＮＡのＤＮＡ標的部位へのｃＤＮＡの組込みを助長するように、作動可能に連結されている。代表的には、ＤＮＡ結合ドメインは、親ＬＩＮＥ ＤＮＡ結合ドメインと比較して変異しているか、または親ＤＮＡ結合ドメインが代替ＤＮＡ結合ドメインで置換されている。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、別のＤＮＡ結合タンパク質からのＤＮＡ結合ドメイン、またはそのモチーフ、例えば、ヘリックスターンヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウイングドヘリックス、ウイングドヘリックスターンヘリックス、ヘリックスループヘリックス、ＨＭＧボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＯＢフォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬエフェクター、もしくはＲＮＡガイドドメインである。代表的には、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素、リンカードメインおよびエンドヌクレアーゼのうちの１つまたは複数についての配列は、ＬＩＮＥエレメントタンパク質の配列と同じであるか、または好ましくは、親ＬＩＮＥエレメントタンパク質と比較してＲＮＡ成分もしくは標的ＤＮＡに対する結合および／もしくは酵素活性を改善するように変異している。

【0012】

一部の実施形態では、ＲＮＡ成分の親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥ骨格、およびタンパク質成分の親ＬＩＮＥ骨格は、同じＬＩＮＥであるか、ならびに／またはＳＩＮＥは、ＬＩＮＥに由来するか、もしくはＬＩＮＥの祖先である。ＲＮＡ成分のＲＮＡ配列、タンパク質配列のアミノ酸配列、またはこれらの組合せは、親骨格の組換え配列および／またはバリアントであり得る。

【0013】

ＲＮＡ成分およびタンパク質成分をコードするベクター、ならびに成分、ベクター、および／またはそれらから形成される操作されたトランスポゾンを含む、医薬組成物も、提供される。好ましくは、トランスポゾンは、ＤＮＡ標的部位への組込み反応中に生産的な４方向ジャンクションを形成することができる。

【0014】

使用方法も提供される。例えば、１つまたは複数の細胞のゲノムに目的の核酸配列を導入する方法は、１つまたは複数の細胞を、（ｉ）タンパク質成分もしくはタンパク質成分をコードするベクターと組み合わせてＲＮＡ成分もしくはＲＮＡ成分をコードするベクターと、または（ｉｉ）ＲＮＡ成分とタンパク質成分の両方を含む操作されたトランスポゾンと、接触させるステップを含み得る。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができる。一部の実施形態では、次いで、ｅｘ ｖｉｖｏ修飾細胞は必要とする対象に導入される。一部の実施形態では、組成物は、それを必要とする対象に直接投与される。

【0015】

疾患および障害を処置する方法も提供される。そのような使用では、細胞における目的の核酸配列の発現は、疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状、または疾患もしくは障害の根底にある分子経路を改善することができる。好ましい実施形態では、有効数の細胞が、疾患または障害を有する対象を処置するために修飾される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】図１Ａは、Ｒ２Ｂｍ構造の略画図である。Ｒ２Ｂｍ ＲＮＡ（波線）およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）構造（囲み枠）。ＯＲＦは、既知および未知の機能の保存ドメイン：ジンクフィンガー（ＺＦ）、Ｍｙｂ（Ｍｙｂ）、逆転写酵素ドメイン（ＲＴ）、システイン－ヒスチジンリッチモチーフ（ＣＣＨＣ）、およびＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫ型制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）をコードする。Ｒ２タンパク質に結合する５’および３’非翻訳領域に存在するＲＮＡ構造にはそれぞれ、５’および３’タンパク質結合モチーフ（ＰＢＭ）と見なされる。角括弧は、本文書で使用されるＲ２Ｂｍ ＲＮＡの個々のセグメント：５’ＰＢＭ ＲＮＡ（３２０ｎｔ）、３’ＰＢＭ ＲＮＡ（２４９ｎｔ）、エレメントの５’末端のＲＮＡ（２５または４０ｎｔ）、およびＲＮＡ３’末端（２５または４０ｎｔ）を示す。

【図1B】図１Ｂは、Ｒ２Ｂｍ組込み反応の略画図である。４ステップ組込みモデルが、２８Ｓ ｒＤＮＡ（平行線）のセグメントに関して描かれている。Ｒ２タンパク質サブユニット（六角形）が、挿入部位（縦棒）の上流に結合され、Ｒ２タンパク質サブユニットが、挿入部位の下流に結合される。上流サブユニットは、３’ＰＢＭ ＲＮＡと会合するが、下流サブユニットは、５’ＰＢＭ ＲＮＡと会合する。標的ＤＮＡ上のタンパク質サブユニットのフットプリントが示されている。－４０ｂｐ～－２０ｂｐの、しかし、第１鎖ＤＮＡ切断後に挿入部位（縦線）の真上へと成長する、上流フットプリント。挿入部位の直前から＋２０ｂｐまでの下流サブユニットフットプリント（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３， ６４６１ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。組込みの４ステップは、（１）標的ＤＮＡのボトム／第１鎖のＤＮＡ切断、（２）ＴＰＲＴ、（３）標的ＤＮＡのトップ／第２鎖のＤＮＡ切断、および（４）第２鎖ＤＮＡ合成である。第４ステップは、これまでｉｎ ｖｉｔｒｏで直接観察されたことがない。実施例１～８で使用される標的部位のオーバーラップ部分が角括弧で示されている。

【0017】

【図2A】図２Ａおよび２Ｂは、非特異的４方向ジャンクション（２Ａ）および線状ＤＮＡ（２Ｂ）ＤＮＡ構築物の略図である。４方向ジャンクションの設計および配列は、（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｂｏｎｄ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２， ５４４２ （２００４））からのものであり、ｂ、ｘ、ｈおよびｒＤＮＡオリゴをアニーリングすることによりこれを形成した。結果として得られたジャンクションの各アームは、２５ｂｐであった。線状ＤＮＡは、ｘオリゴとｈオリゴの組合せであるオリゴにオリゴｂをアニーリングすることにより生成した。したがって、ジャンクションＤＮＡと線状ＤＮＡは、共通のＤＮＡオリゴ（オリゴｂ）を共有した。線状およびジャンクションＤＮＡの形成および精製の前に３２Ｐで共有ＤＮＡオリゴの５’末端を標識した（星印）。

【図2B】同上。

【0018】

【図3】図３は、いくつかの線状、３方向、および４方向分岐ＤＮＡ構築物の略図である。直線は、ＤＮＡを表し、波線は、ＲＮＡを表す。細線は、図２Ａ～２Ｂに描かれている非特異的ＤＮＡを表す。太線は、２８Ｓ ｒＤＮＡならびにＲ２エレメント由来の配列を表す。Ｒ２配列は、エレメントの５’および３’末端からのものである。２８Ｓ配列は、７ｂｐの上流ＤＮＡを加えた下流ＤＮＡ（２８Ｓｄ）である。各構築物の「アーム」は、長さ２５ｂｐである。論考のために各構築物に番号が付与されている。星印は、鎖が前の図におけるように末端標識されたことを示す。一方がＲ２ ３’アームにＤＮＡ二重鎖を有し、他方が、ＴＰＲＴの結果であるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを有する、構築物ｖの２つのバージョンを試験した。検出可能な第２鎖ＤＮＡ切断は、構築物ｉ～ｖには見られなかった。第２鎖ＤＮＡ切断は、構築物ｖｉ～ｖｉｉｉで検出することができた。

【0019】

【図4A】図４Ａは、部分的ジャンクションに対する切断について試験するための、図３からの４方向ジャンクションのいくつかの誘導体の略図である。構築物に番号を付与した。線状２８Ｓ標的ＤＮＡにおいて過去に使用した下流ＤＮＡの量（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３， ６４６１ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））と等しくするために、２８Ｓ下流（２８Ｓｄ）ＤＮＡアームを４７ｂｐ増加させた。

【図4B】図４Ｂは、図４Ａの構築物の各セットについての結合された割合（ｆ結合）の関数としての切断された割合（ｆ切断）のグラフである。ドットの直径は、Ｒ２Ｂｍによる構築物の相対切断性を描写する。

【図4C】図４Ｃは、上流２８Ｓ ＤＮＡを含む４方向ジャンクションにおけるＤＮＡ切断を試験するために設計された構築物の略図である。２８Ｓ上流（２８Ｓｕ）ＤＮＡアームは、７３ｂｐであり、線状標的ＤＮＡにおいて通常使用される上流ＤＮＡの量（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３６， １０３５ （２００４））に相当する。黒線はＤＮＡであり、細線は非特異的ＤＮＡであり、太線は、２８ＳまたはＲ２由来のＤＮＡのどちらかである。

【図4D】図４Ｄは、図４Ｃの構築物の各セットについての結合された割合（ｆ結合）の関数としての切断された割合（ｆ切断）のグラフである。ドットの直径は、Ｒ２Ｂｍによる構築物の相対的切断性を描写する。略号および記号は、前の図における通りである。

【0020】

【図5】図５は、ＤＮＡ切断（－ｄＮＴＰ）および切断と第２鎖合成（＋ｄＮＴＰ）反応についての変性ゲル分析のための４方向ジャンクションの略図である。

【0021】

【図6A】図６Ａは、すでに切断されている生成物を極近位に保持するためにおよびどのアームが鋳型として使用されるのかを試験するために設計された、構築物の略図である。５’および３’アームの長さを変えた（４０ｂｐ対２５ｂｐ）。２８Ｓ下流アームは４７ｂｐであり、２８Ｓ上流アームは７３ｂｐであった。

【図6B】図６Ｂは、上流タンパク質サブユニットが、第２鎖合成に関与する可能性が高いのか、下流タンパク質サブユニットが、第２鎖合成に関与する可能性が高いのか、を試験するために設計された構築物の略図である。

【図6C】図６Ｃは、結合された割合（ｆ結合）の関数としての合成された割合（ｆ合成）のグラフである。

【0022】

【図7】図７Ａは、Ｒ２組込みの新モデルを示す略図である。Ｒ２ ２８Ｓ標的部位が、新たなＲ２エレメントの挿入に至る第１鎖切断および第２鎖切断の位置とともに表示されている。組込み反応の最初のステップ（Ｉ、ｉｉ）は、標的部位が、図示を目的として第２鎖挿入部位付近で９０°曲げられていることを除き、図１Ｂの場合と同様である。ステップｉｉｉは、４方向ジャンクションを生成する第２鎖切断部位付近の鋳型ジャンプ／組換え事象を描写する。ステップｉｖは、第２鎖切断を描写する。最後に、ステップｖは、第２鎖ＤＮＡ合成を描写する。略号：ｕｐ（挿入部位の上流の標的配列）、ｄｗｎ（挿入部位の下流の標的配列）。 図７Ｂは、Ｌ１組込みの新モデルを示す略図である。標的部位が表示されており、エレメント挿入時に標的部位重複（ｔｓｄ）が発生するように第１鎖および第２鎖切断がずらして配置されている。これらのステップは、鋳型ジャンプが、標的のｔｓｄ領域を移動させて／融解して４方向ジャンクションを生成することを除き、Ｒ２の場合と同様である。

【0023】

【図8A】図８Ａは、Ｒ２標的部位、２８Ｓ ｒＤＮＡ、および挿入モデルを示す、略画図である。３’ＰＢＭ ＲＮＡと会合しているＲ２タンパク質は、挿入部位（縦線）の２０～４０塩基上流（２８Ｓｕ）に結合し、５’ＰＢＭ ＲＮＡと会合しているタンパク質は、挿入部位の２０塩基下流に結合する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３， ６４６１－６４６８ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３６， １０３５－１０４５ （２００４））。挿入は、５ステップで起こる：（１）上流タンパク質サブユニットエンドヌクレアーゼによる第１鎖切断。（２）上流タンパク質サブユニット逆転写酵素による第１鎖合成（ＴＰＲＴ）。（３）４方向ジャンクション分岐型構造（略図中で拡大されている）を生じさせる結果となる上流標的ＤＮＡ（２８Ｓｕ）への鋳型ジャンプ／との組換え。（４）下流タンパク質サブユニットのエンドヌクレアーゼによる第２鎖切断。（５）下流タンパク質サブユニットの逆転写酵素による第２鎖合成。

【図8B】図８Ｂは、ＲＬＥ ＬＩＮＥ（配列番号３１～４４）のリンカー領域の複数の配列および二次構造のアラインメントである。星印は、変異した残基を表し、半三角形は、推定αフィンガーおよびジンクナックル領域において生成される二重点変異体を表す。この研究のために生成した二重点変異体は、ＧＲ／ＡＤ／Ａ、Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰ、ＳＲ／ＡＩＲ／Ａ、ＳＲ／ＡＧＲ／Ａ、Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ、ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａ、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａであった。最上部の角括弧により示されているように、最初の４つの変異体は推定αフィンガー領域内にあり、最後の４つの変異体はジンクナックル領域内にある。二次構造はＡｌｉ２Ｄにより予測され、灰色棒はαヘリックスを表し、矢印はβ鎖を表す。略語：Ｒ２Ｂｍ＝Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｒ２Ｄｍ＝Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｒ２Ｄａｎａ＝Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎａｎａｓｓａｅ、Ｒ２Ｄｗｉｌ＝Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｌｌｉｓｔｏｎｉ、Ｒ２Ｄｓｉｍ＝Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｒ２Ｄｐｓｅ＝Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ、Ｒ２Ｆａｕｒｉｃ＝Ｆｏｒｆｉｃｕｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒ２Ａｍａｒ＝Ａｎｕｒｉｄａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒ２Ｎｖ－Ｂ＝Ｎａｓｏｎｉａ ｖｉｔｒｉｐｅｎｎｉｓ、Ｒ２Ｌｐ＝Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ、Ｒ２Ａｍｅｌ＝Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ、Ｒ２Ｄｒ＝Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、Ｒ８Ｈｍ－Ａ＝Ｈｙｄｒａ ｍａｇｎｉｐａｐｉｌｌａｔａ、Ｒ９Ａｖ－１＝Ａｄｉｎｅｔａ ｖａｇａ。

【0024】

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、３’（９Ａ）および５’ＰＢＭ（９Ｂ）ＲＮＡの存在下で標的ＤＮＡに結合する変異体の能力を報告する棒グラフである。野生型（ＷＴ）タンパク質活性が１に設定され、それで変異型タンパク質活性がＷＴ活性の割合（ｆＷＴ活性）として与えられている。各グラフの棒は、左から右へ、Ｒ２：ＷＴ、Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰ、Ｃ／ＳＣ、ＳＨＣを表す。

【0025】

【図10-1】図１０Ａ～１０Ｄは、αフィンガー変異型タンパク質によるＤＮＡ結合を示す棒グラフである。図１０Ａおよび１０Ｂは、線状標的ＤＮＡに結合する変異体の相対能力を報告する。ＷＴおよびＫＰＤ／Ａ ＷＴは、陽性対照としての役割を果たし、その一方で、Ｐｅｔ２８ａおよびＤＮＡのみのレーンは、陰性対象としての役割を果たした。標準偏差が棒の最上部に提示されている。図１０Ｃは、分岐型挿入中間体のアナログへの結合を報告する。基質の略図中の星印は、５’末端標識された鎖を示す。図１０Ｄは、ＲＮＡの非存在下でのαフィンガー変異型タンパク質の線状標的ＤＮＡ結合活性を報告する。各グラフの棒は、左から右へ、Ｒ２：ＫＰＤ／Ａ ＷＴ、ＧＲ／ＡＤ／Ａ、ＳＲ／ＡＩＲ／Ａ、ＳＲ／ＡＧＲ／Ａを表す。

【図10-2】同上。

【0026】

【図11】図１１は、αフィンガー変異型タンパク質による第１鎖ＤＮＡ切断活性を示す散布図である。第１鎖切断を受ける標的ＤＮＡの割合（ｆ切断）を変性ゲルから定量した。散布図は、各々のタンパク質濃度でタンパク質により結合された標的ＤＮＡの割合（ｆ結合）の関数としてプロットされた、切断された標的ＤＮＡの割合（ｆ切断）を示す。ＷＴ、ＧＲ／ＡＤ／Ａ、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａについてのデータ点が、アスタリスク、白い四角形、灰色の四角形、および黒い四角形によりそれぞれ表されている。

【0027】

【図12A】図１２Ａは、すでに切断されている標的ＤＮＡが３’ＰＢＭ ＲＮＡおよびｄＮＴＰの存在下でＲ２タンパク質とともにインキュベートされた、第１鎖合成アッセイについての実験機構の説明図である。

【図12B】図１２Ｂは、タンパク質滴定系列にわたってのＲ２タンパク質により結合されたＤＮＡの割合（ｆ結合）の関数としての合成されたＤＮＡの割合（ｆ合成）を示す散布図である。記号および略号は、前の図における通りである。

【0028】

【図13A】図１３Ａは、線状標的ＤＮＡに対するαフィンガー変異型タンパク質による第２鎖切断活性の散布図である。ＥＭＳＡゲルを使用して、Ｒ２タンパク質により結合された標的ＤＮＡの割合を計算した。変性ゲルを使用して、Ｒ２タンパク質により切断された標的ＤＮＡの割合を計算した。記号および略号は、前の図における通りである。

【図13B】図１３Ｂは、４方向ジャンクションＤＮＡに対するαフィンガー変異型タンパク質による第２鎖ＤＮＡ切断活性の散布図である。ＥＭＳＡゲルを使用して、Ｒ２タンパク質により結合された標的ＤＮＡの割合を計算した。変性ゲルを使用して、Ｒ２タンパク質により切断された標的ＤＮＡの割合を計算した。記号および略号は、前の図における通りである。

【0029】

【図14A】図１４Ａは、すでに切断されている４方向ジャンクションＤＮＡがｄＮＴＰの存在下でＲ２タンパク質とともにインキュベートされた、第２鎖合成アッセイについての実験機構の説明図である。

【図14B】図１４Ｂは、第２鎖合成活性の散布図である。記号および略号は、前の図における通りである。

【0030】

【図15A】図１５Ａは、ジンクナックル変異型タンパク質による第１鎖切断活性を示す散布図である。切断された標的ＤＮＡの割合（ｆ切断）が、各々のタンパク質濃度でタンパク質により結合された標的ＤＮＡの割合（ｆ結合）の関数としてプロットされている。

【図15B】図１５Ｂは、ジンクナックル変異型タンパク質による第１鎖合成活性を示す散布図である。グラフは、ＴＰＲＴによる第１鎖合成を経る標的ＤＮＡの割合（ｆ合成）を、タンパク質により結合されたすでに切断されている線状標的ＤＮＡの割合（ｆ結合）の関数としてプロットしている。

【図15C】図１５Ｃは、４方向ジャンクション標的ＤＮＡに対するジンクナックル変異体の第２鎖切断活性を示す散布図である。グラフは、第２鎖が切断された標的ＤＮＡ（ｆ切断）を、タンパク質により結合された４方向ジャンクションＤＮＡの割合（ｆ結合）の関数としてプロットしている。

【図15D】図１５Ｄは、結合されたＤＮＡの関数としての、線状標的ＤＮＡに対するジンクナックル変異体による第２鎖切断活性の散布図である。

【0031】

【図16】図１６は、ジンクナックル変異体の第２鎖合成活性の散布図である。実験機構は、図１４Ａの場合と同様である。

【0032】

【図17A】図１７Ａは、Ｒ２Ｂｍ、ヒト Ｌ１（Ｌ１Ｈ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｐｒｐ８のＯＲＦ構造を示す一連のドメインマップである（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７）， Ｗａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （８０－．）（２０１６） ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ６４６６；Ｂｅｒｔｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１７）；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０７．０１１；Ｑｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（２０１６）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．３２２０；Ｎｇｕｙｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ５３０， ２９８－３０２ （２０１６）；Ｇａｌｅｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１４）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｂｉ．２０１３．１２．００２；Ｂｌｏｃｋｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ １１， １４－２８ （２００５））。リンカー領域内の、アスタリスクが付いているαヘリックスの配列（丸みのある棒）は、よく整列している。色付きのαヘリックスおよびβ鎖の残部（矢印）は、構造的に類似したナックルを形成する（ことができる）。

【図17B】図１７Ｂは、Ｒ２ＢｍのＲＴおよびＲＬＥのモデルである（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７））。

【図17C】図１７Ｃは、Ｐｒｐ８の大きい断片のｃｒｙｏ－Ｅｍ構造である（Ｗａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （８０－．）． （２０１６）． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ６４６６）。

【図17D】図１７Ｄは、Ｂスプライソソーム複合体からのＰｒｐ８およびＲＮＡのｃｒｙｏ－ＥＭ構造である（Ｂｅｒｔｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１７）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０７．０１１）。スプライソソームのＲＮＡ成分により形成された分岐型構造も示されている。

【0033】

【図18A】図１８Ａは、操作されたＬＩＮＥのＲＮＡ成分の略図である。ＨＤＶ＝デルタ肝炎ウイルスリボザイム（必要に応じた）；ＰＢＭ＝タンパク質結合モチーフ（１つのエレメントからのものであることもあり、ヘテロＲＮＰを形成する場合、２つのエレメントからのものであることもある）；Ｐｒｏｍ＝ＯＲＦ発現のためのｐｏｌ ＩＩプロモーターおよび関連転写因子結合部位；ＯＲＦ＝ＴＰＲＴによってゲノムに持ち込まれる遺伝子のＯＲＦ；ｔｒａｃｒ＝トレーサーＲＮＡ；ｔｒａｃｒ／ガイド＝標準的なｃａｓ９標的化ＲＮＡ；ＴＳ＝標的配列。トレーサー、ガイド、またはトレーサー／ガイドを、ｉｎ ｃｉｓ（上記の通り）またはｉｎ ｔｒａｎｓで供給することができる。

【図18B】図１８Ｂは、操作されたＤＮＡ結合ドメインを伴うＲＬＥ ＯＲＦの略図である。Ｒ２または他のＲＬＥタンパク質発現構築物を、所期の細胞における直接産生のために細菌（使用のために精製するために）または真核生物発現系に発現させることができる。操作されたＤＢ＝ＺＦライブラリーからのＺＦ、またはｔａｌｅｎ、またはｃａｓ９（ＥＮ－）。注記：Ｒ２中のＤＢは、ＺＦおよびＭｙｂである。αＦ＝αフィンガー。

【図18C】図１８Ｃは、標的部位におけるＲＬＥ ＬＩＮＥ結合の２つの異なるモデルの略図である。

【図18D】図１８Ｄは、ＲＬＥ ＬＩＮＥ組込みの２つの異なるモデルの略図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、用語「担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の活性成分と組み合わせられる有機または無機成分である、製剤中の天然または合成不活性成分を指す。

【0035】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生物活性の有効性に干渉しない非毒性物質を意味する。

【0036】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」または「治療有効量」は、処置される障害、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状を軽減するのに十分な、またはそうでなければ所望の薬理学的および／もしくは生理的効果を提供するのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、対象に依存する可変要素（例えば、年齢、免疫系健康状態など）、処置される疾患または障害、ならびに投与される薬剤の投与経路および薬物動態などの、様々な因子によって変わることになる。

【0037】

本明細書で使用される場合、用語「予防」または「予防すること」は、疾患または障害により引き起こされる１つもしくは複数の症状のリスクがあるまたはその素因を有する対象または系に、疾患もしくは障害の特定の症状の停止、疾患または障害の１つまたは複数の症状の低減または予防、疾患または障害の重症度の低下、疾患または障害の完全な根絶、疾患もしくは障害の安定化またはその発症または進行の遅延を生じさせるために、組成物を投与することを意味する。

【0038】

本明細書で使用される場合、用語「構築物」は、１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド配列を有する組換え遺伝子分子を指す。

【0039】

本明細書で使用される場合、用語「調節配列」は、別の核酸配列の機能、例えば転写および／または翻訳、を制御および調節する核酸配列を指す。原核生物に適する制御配列は、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列および／またはリボソーム結合部位を含み得る。真核細胞がプロモーター、ターミネーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーなどの配列を利用することは公知である。調節配列は、ウイルス遺伝子の転写および複製を制御するウイルスタンパク質認識エレメントを含む。

【0040】

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、その鋳型またはメッセンジャーＲＮＡを介して、特定のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に特有のアミノ酸の配列をコードする、ＤＮＡ配列を指す。用語「遺伝子」は、ＲＮＡ産物をコードするＤＮＡ配列も指す。ゲノムＤＮＡに関して本明細書で使用される場合の遺伝子という用語は、調節配列ばかりでなく、介在する非コード領域も含み、５’および３’末端を含み得る。

【0041】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドという用語は、タンパク質およびそれらの断片を含む。ポリペプチドは、「内在性」であることもあるか、または「外来性」であることもあり、外来性とは、それらが、「異種」である、すなわち、利用される宿主細胞にとって異質であること、例えば、細菌細胞により産生されるヒトポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、本明細書ではアミノ酸残基配列として開示される。

【0042】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントを挿入して挿入されたセグメントの複製を引き起こすことができるレプリコン、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドを指す。ベクターは、発現ベクターであり得る。

【0043】

本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターを指す。

【0044】

本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクトされた」または「形質導入された」は、異種核酸分子が導入された宿主細胞または生物を指す。核酸分子は、宿主のゲノムに安定的に組み込まれていることもあるか、または核酸分子は、安定したまたは不安定な染色体外構造として存在することもある。そのような染色体外構造は、自己複製性であることもある。形質転換細胞または生物は、形質転換プロセスの最終産物ばかりでなく、そのトランスジェニック子孫も包含し得る。「非形質転換」または「非形質導入」宿主は、異種核酸分子を含有しない細胞または生物を指す。

【0045】

本明細書で使用される場合、用語「外来性」は、核酸に関しては、宿主体内に通常存在する核酸を指す。

【0046】

本明細書で使用される場合、用語「異種」は、それらが通常は見られない場所に存在するエレメントを指す。例えば、内在性プロモーターが異種核酸配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結された状態で通常は見られない配列に、連結されていることもある。プロモーターエレメントを説明するために本明細書で使用される場合、異種は、ネイティブプロモーターにおいて通常見られるものとは配列、種または数のいずれかの点で異なる、プロモーターエレメントを意味する。例えば、プロモーター配列内の異種制御エレメントは、プロモーター制御を増強するために付加される異なるプロモーターの制御／調節エレメントであることもあるか、または同じプロモーターの追加の制御エレメントであることもある。したがって、用語「異種」は、「外来性」および「非ネイティブ」エレメントも包含し得る。
ＩＩ．操作されたトランスポゾン

【0047】

長鎖散在反復エレメント（ＬＩＮＥ）は、生命の樹にわたって真核生物のゲノムに見られる自律転位因子（ＴＥ）の大量に存在する多様な群である。ＬＩＮＥはまた、非自律短鎖散在反復エレメント（ＳＩＮＥ）を動員する。ＳＩＮＥは、複製するためにＬＩＮＥのタンパク質機構を利用する。ＬＩＮＥおよびＳＩＮＥの移行は、がんへの進行に、遺伝子発現のモジュレーション、ゲノム再編成、ＤＮＡ修復を含む、ゲノム進化に、および新たな遺伝子の供給源として、関連付けられている。ＬＩＮＥは、標的ＤＮＡのニックを逆転写のプライマーとして使用してエレメントＲＮＡがＤＮＡの挿入部位に逆転写される、ターゲットプライムド逆転写（ＴＰＲＴ）と呼ばれるプロセスにより複製される（Ｌｕａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２， ５９５ （１９９３）；Ｃｏｓｔ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ ２１， ５８９９ （２００２）；Ｍｏｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ， ２００２）， ｐｐ． ８３６－８６９）。ＬＩＮＥは、挿入反応の重要なステップを実行するために使用されるタンパク質をコードする。ＬＩＮＥタンパク質は、それら自体のｍＲＮＡを結合し、標的ＤＮＡを認識し、第１鎖標的ＤＮＡ切断を実行し、ＴＰＲＴを実行する。これらのタンパク質は、第２鎖標的ＤＮＡ切断および第２鎖エレメントＤＮＡ合成も実行すると考えられているが、このことについての証拠はわずかである（Ｌｕａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２， ５９５ （１９９３）；Ｃｏｓｔ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ ２１， ５８９９ （２００２）；Ｍｏｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ， ２００２）， ｐｐ． ８３６－８６９；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）；Ｋｕｌｐａ ａｎｄ Ｍｏｒａｎ， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３， ６５５ （２００６）；Ｄｅｗａｎｎｉｅｕｘ ａｎｄ Ｈｅｉｄｍａｎｎ， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １１０， ３５ （２００５）；Ｄｏｕｃｅｔ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６０， ７２８ （２０１５）；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３， ６４６１ （２００５）；Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６）；Ｍａｒｔｉｎ， ＲＮＡ Ｂｉｏｌ ７， ６７ （２０１０）；Ｍａｒｔｉｎ， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６， ４５６２１ （２００６）；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２６， ５１６８ （２００６）；Ｚｉｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５， ７８０ （２００５）；Ｋｕｒｚｙｎｓｋａ－Ｋｏｋｏｒｎｉａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７４， ３２２ （２００７）；Ｉｃｈｉｙａｎａｇｉ， ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｏｋａｄａ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １７， ３３ （２００７）；Ｇａｓｉｏｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５７， １３８３ （２００６）；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ５， ｅ１０００４６１ （２００９）；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。

【0048】

ＬＩＮＥの初期分岐系統群は、制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）をコードするが、後期分岐ＬＩＮＥは、脱プリン脱ピリミジン部位ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）をコードする（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ａｎｄ Ｍａｌｉｋ， ｉｎ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ， Ｃｒａｉｇ， ＮＬ， Ｃｒａｉｇｉｅ， Ｒ， Ｇｅｌｌｅｒｔ， Ｍ， Ａ． Ｍ． Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， Ｅｄｓ．（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ， ２００２）， ｐｐ． １１１１－１１４６；Ｙａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６， ７８４７ （１９９９）；Ｆｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８７， ９０５ （１９９６）；Ｗｅｉｃｈｅｎｒｉｅｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２， ９７５ （２００４））。両方のタイプのエレメントは、機能的に同等の組込みプロセスによって組み込まれると考えられる（Ｍｏｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ， ２００２）， ｐｐ． ８３６－８６９；Ｈａｎ， Ｍｏｂ ＤＮＡ １， １５ （２０１０）；Ｆｕｊｉｗａｒａ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３， ＭＤＮＡ３ （２０１５）；Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３， ＭＤＮＡ３ （２０１５））。

【0049】

コードされた核酸結合、エンドヌクレアーゼ、およびポリメラーゼ機能を使用して、一連の順序付けられたＤＮＡ切断および重合事象により、複製が起こる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６）；Ｓｈｉｖｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ， １：３， １６９－１７８ （２０１１）；下記の実施例も参照されたい）。エレメントにコードされたタンパク質は、翻訳されると、それらが翻訳された転写物とともに、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）粒子を形成し、すなわち、ｃｉｓ型優先性と呼ばれるプロセスである。ＲＮＰは、標的ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ鎖の一方を切断し、標的部位の露出した３’－ＯＨをプライマーとして使用してエレメントＲＮＡをｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写する－ターゲットプライムド逆転写（ＴＰＲＴ）と呼ばれるプロセス。次いで、反対の標的ＤＮＡ鎖が切断される。ｃＤＮＡが二本鎖ＤＮＡになり、組込み事象が完了する。新たに逆転写されたＤＮＡの標的部位への組込み成功は、ＤＮＡと、ＲＮＡと、トランスポゾンのタンパク質成分と、標的部位ＤＮＡとの相互作用に依存する。

【0050】

ＬＩＮＥおよびＳＩＮＥレトロトランスポゾンからのまたはそれらに由来する配列および機構を利用する操作されたＲＮＡ成分およびタンパク質成分、ならびにそれらから形成される操作されたトランスポゾンが提供される。本明細書で使用される場合、ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥに「由来する」とは、ＲＮＡおよび／またはタンパク質成分が、そのドメインの１つまたは複数の起源を辿ると親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥの対応するＲＮＡまたはタンパク質成分に行き着くことを意味する。一部の実施形態では、操作されたＲＮＡまたはタンパク質成分は、親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥの対応するＲＮＡまたはタンパク質成分と比較して欠失された、置換された、付加されたまたは変異した１つまたは複数のドメインを有する。一部の実施形態では、操作されたＲＮＡおよび／またはタンパク質成分は、親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥの対応するＲＮＡまたはタンパク質成分の核酸またはアミノ酸配列に対して少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、８０、９５またはそれより高いパーセントの配列同一性を有する。操作されたＲＮＡおよび／またはタンパク質成分は、親ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥの対応するＲＮＡまたはタンパク質成分とは異種である配列、例えば全ドメインなど、を含むことができる。操作されたＲＮＡおよび／またはタンパク質成分は、組換え配列であることもある。

【0051】

代表的には、ゲノムに挿入／送達される目的の遺伝子を含有するＲＮＡ成分は、操作されたタンパク質成分に結合され得る。ＲＮＡは、ＤＮＡに変換され、タンパク質成分により媒介されるターゲットプライムド逆転写（第１鎖ＤＮＡ切断、遊離した標的部位３－ＯＨからのｃＤＮＡのプライミング、第２鎖切断、第２鎖合成）によりゲノムに挿入される。

【0052】

挿入部位を変えるために、アミノ末端ＺＦ／ｍｙｂ、リンカーのαフィンガー（下記の実施例を参照されたい）、およびＲＬＥ（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６））を含む、ＲＬＥ ＬＩＮＥの既存のＤＮＡ結合領域を、目的の新たな部位に結合するように、およびそれを切断するように、修飾または置換することができる。ＺＦ／ｍｙｂは、目的の新たな部位に標的化するＤＮＡ結合ドメインで置換されことになる候補である。一部の実施形態では、一般に、リンカー、ＲＴ、ＲＬＥを適所で修飾することができる。異なるＲＬＥ ＬＩＮＥ骨格を全体的におよび部分的に使用することおよび交換することができる。アミノ末端ドメインに使用するためのＤＮＡ結合モジュールの可能性のある供給源としては、ジンクフィンガーライブラリーからのジンクフィンガー、Ｔａｌｅｎ、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ、および下記でより詳細に論じられるような他のものが挙げられる。

【0053】

再標的化された遺伝子送達系を操作されたするためにトランスポゾンのコードおよび非コード核酸配列を変更する場合、系の成分部分の各々が構造的および機能的適合性を維持しつつ、所望の部位（例えば、遺伝子位置）に特異的に標的化もすることを確実にするような手順を踏まなければならない。重要な構造エレメントの設計上の考慮事項は、下記で詳細に論じられる。実施者により選択される成分部分にかかわらず、ＲＮＡ結合活性、ＤＮＡ結合活性、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性、逆転写酵素（ＲＴ）活性、および第２鎖合成による組込みの完了を完全なものにするために操作されたトランスポゾンが基本的な活動を行うことが確実にできるように注意を払うべきである。
Ａ．操作されたトランスポゾンの構造

【0054】

例示的な操作されたトランスポゾンに基づくＲＬＥ ＬＩＮＥ骨格は、図１８Ａ～１８Ｄに概要が示されている。操作されたトランスポゾンは、ＲＮＡ成分およびタンパク質成分を含む。
１．ＲＮＡ成分

【0055】

一般に、ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ成分へのタンパク質成分の結合を助長することを可能にするまたは助長するエレメント；ＤＮＡ標的部位への操作されたトランスポゾンの標的化、好ましくは結合（例えば、プライミング）、を助長することを可能にするまたは助長するエレメント；およびタンパク質成分もしくは他のエンドヌクレアーゼ、逆転写酵素もしくはｉｎ ｔｒａｎｓで提供される補助エレメントのエンドヌクレアーゼ活性、逆転写活性および組込み活性のうちの１つもしくは複数を助長することを可能にするまたは助長するエレメントを含む。最低限、その一次構造と二次構造の両方を含むＲＮＡ成分の設計は、ＤＮＡ標的部位への目的のオープンリーディングフレームの適切な組込みを妨げてはならず、好ましくは、そのような組込みに役立たなければならない。

【0056】

操作されたトランスポゾンの例示的ＲＮＡ成分は、図１８Ａで例示される。したがって、例えば、操作されたトランスポゾンのＲＮＡ成分は、標的配列（ＴＳ）、リボザイム（例えば、デルタ肝炎ウイルスリボザイム）（ＨＤＶ）、ｔｒａｃｒ配列（例えば、ｔｒａｃｒ、ガイド、またはｔｒａｃｒ／ガイド配列、例えばＣａｓ９標的化ＲＮＡ）、ＩＲＥＳ／ＰＢＭタンパク質結合モチーフドメインをコードする配列、プロモーター（例えば、ＯＲＦ発現を確実にするためのｐｏｌ ＩＩプロモーターまたは転写因子結合部位）（Ｐｒｏｍ）、標的部位に挿入するための目的の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、およびＰＢＭタンパク質結合モチーフのうちの１つまたは複数を含むことができる。トレーサー、ガイド、またはトレーサー／ガイドを、ｉｎ ｃｉｓまたはｉｎ ｔｒａｎｓで供給することができる。ＲＮＡ成分は、ＬＩＮＥトランスポゾンからのオープンリーディングをコードする配列を含む必要がなく、好ましくは含まない。

【0057】

短鎖散在反復エレメント（ＳＩＮＥ）は、ＡＰＥ ＬＩＮＥの寄生体である。ＳＩＮＥは、ＬＩＮＥのタンパク質成分を動員してゲノムに組み込まれる。そのようなＳＩＮＥは、ＬＩＮＥタンパク質を結合するためのおよびゲノムへの挿入のための最小のＲＮＡ必要要件に相当し、または少なくともほぼそれに相当する。ＲＬＥ ＬＩＮＥのＳＩＮＥは、ＳＩＤＥと呼ばれており、ＳＩＤＥは、短鎖内部欠失エレメント（Ｓｈｏｒｔ Ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ Ｄｅｌｅｔｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔ）に相当する。ＲＬＥ ＬＩＮＥ Ｒ２は、デルタ肝炎ウイルス様リボザイムと、親ＬＩＮＥエレメントの３’ＰＢＭ ＲＮＡ成分とを有する、様々なショウジョウバエ種に存在するＳＩＤＥを有する（Ｄ． Ｇ． Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｔ． Ｈ． Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｂ ＤＮＡ ３， １０ （２０１２））。

【0058】

リボザイムは、ｒＲＮＡ／Ｒ２同時転写物からエレメントＲＮＡを切断するために使用され、親Ｒ２はもちろんＳＩＤＥにも存在する（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （２０１０）；Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ ＤＮＡ ３， １０ （２０１２））。Ｒ２エレメントによりコードされるＨＤＶリボザイムの多くは、ｒＤＮＡ／Ｒ２エレメント同時転写物を、例えば、エレメントＲＮＡの５’末端に一部のリボソーム配列を残すように切断する。下記で提示される実験で説明されるように、標的配列は、存在する場合、ＴＰＲＴ後に上流標的配列にアニーリングして４方向ジャンクション組込み中間体を形成するために使用される。４方向ジャンクション組込み中間体は、組込み反応の後半への入口である。ＨＤＶが全ての標的配列を取り除くＲ２エレメントについては、鋳型ジャンプが起こって４方向ジャンクションを形成する。ＲＮＡは同時転写物として作製されないので、リボザイムは、操作されたＲＮＡにおいて必要に応じたものであり得る。しかし、リボザイム（例えば、ＨＤＶリボザイム）の存在は、細胞のＲＮＡｓｅによる分解からエレメントＲＮＡを保護するのに役立つ可能性がある。加えて、Ｒ２タンパク質は、ＨＤＶリボザイムと相互作用する可能性があり、および／または組込み反応に役立つ可能性がある。

【0059】

操作されたＲＮＡ上の標的配列の存在は、特に、そのｍＲＮＡ上に標的配列を残すことが公知であるＲ２エレメントからのタンパク質およびＲＮＡ成分を使用する場合、４方向ジャンクションの形成に役立つ可能性がある。

【0060】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを、ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ結合＋ＤＮＡ切断ドメインのどちらかとして操作されたＲＮＡタンパク質粒子（ＲＮＰ）の駆動を助長するために使用する場合には、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９系のＲＮＡ成分を操作されたＲ２「ＳＩＤＥ」ＲＮＡに含めることができる。

【0061】

３’ＰＢＭは、重要なＲＮＡエレメントである。３’ＰＢＭ ＲＮＡは、ＴＰＲＴを受けることができるＲ２タンパク質に結合するＲＮＡの唯一の構造成分であり、したがって、３’ＰＢＭ ＲＮＡは、ゲノムに組み込まれる操作されたＲＮＡにとって重要な成分であろう。操作されたＲＮＡに使用する３’ＰＢＭ ＲＮＡの配列および構造を、親ＬＩＮＥ ＲＮＡおよびそれに結合する親タンパク質とマッチさせなければならない。

【0062】

５’ＰＢＭ ＲＮＡは、ＳＩＤＥ組込みには必要とされないが、一般に、組み込まれる完全長Ｒ２エレメントの重要な成分である。その存在は、組込み可能なＲＮＡタンパク質粒子（ＲＮＰ）を形成するのに役立ち、ＲＮＡを分解から保護するのに役立ち、組込み反応の後半に入るためのタイミング機構としての機能を果たす（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６）；下記の実施例も参照されたい）。Ｒ２ ＬＩＮＥによりそのｍＲＮＡを翻訳するために使用される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）候補が、５’ＰＢＭ内に含有される。５’ＰＢＭ ＲＮＡを操作されたＲＮＡに使用する場合、ＩＲＥＳを非機能性にする（例えば、変異させる、欠失させる、排除する、など）必要があり得る。

【0063】

操作されたＲＮＡ成分内のＬＩＮＥ ＯＲＦ配列を、ゲノムに組み込むべき目的の遺伝子または調節配列で置換することができる。
２．タンパク質成分

【0064】

操作されたＲＬＥ ＬＩＮＥタンパク質は、ＲＮＡ成分に結合し、単独で、またはｉｎ ｔｒａｎｓで提供される他のエンドヌクレアーゼ、逆転写酵素または補助エレメントと相まって、目的の遺伝子の逆転写およびＤＮＡ標的部位への組込みを助長するように設計される。ＬＩＮＥに基づくタンパク質は、ＬＩＮＥトランスポゾンのオープンリーディングフレームのタンパク質ドメインの多くまたは全てを含むことができる。一般に、操作されたＬＩＮＥタンパク質は、ＲＮＡ成分に結合し、ゲノムＤＮＡに結合し、標的ＤＮＡの第１鎖を切断し、ＴＰＲＴを実行し、４方向ジャンクション中間体に結合し、４方向ジャンクションを切断し、第２鎖合成を助長するように、設計される。

【0065】

タンパク質成分は、例として一般的ＲＬＥ ＯＲＦ骨格を使用して図１８Ｂで例示される。例示されているタンパク質は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ）、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢ）、逆転写酵素（ＲＴ）、推定αフィンガー（αＦ）とジンクナックル様ＣＣＨＣモチーフとを含むリンカー、および制限酵素様ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）を含む。

【0066】

Ｒ２ＢｍにおけるＤＢは、ＺＦおよびｍｙｂを有する。Ｒ２Ｌｐ、Ｒ８ＨｍおよびＲ９Ａｖでは、それは、３つのＺＦおよび１つのｍｙｂを有する。ＮｅＳＬ－１では、それは、２つのＺＦを有する。Ｒ２Ｂｍでは、ｍｙｂは、タンパク質サブユニットを挿入部位の下流に配置することおよび５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下でそれを行うことが公知である（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。同じ部位を標的するＲ２Ｌｐでは、ｍｙｂは、標的部位の上流に結合する。ｍｙｂが挿入部位の上流に結合する配列は、下流部位の縮重パリンドロームである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ １， ２９ （２０１１））。ＮｅＳＬでは、ＺＦは、挿入部位の上流に結合し、第１鎖切断への標的化に役立つと考えられている（Ｓｈｉｖｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ Ｇｅｎｅｔ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ １， １６９ （２０１１））。Ｒ２Ｂｍにおけるジンクフィンガーは、ＮｅＳＬの場合と同様に、第１鎖ＤＮＡ切断への標的化に関与すると考えられている（Ｓｈｉｖｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ Ｇｅｎｅｔ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ １， １６９ （２０１１））。Ｒ８およびＲ９を含む、Ｒ２系統群エレメントはまた、タンパク質サブユニットの上流配列および恐らく下流配列への結合を補助するためにＺＦおよびｍｙｂを使用する（Ｓｈｉｖｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ Ｇｅｎｅｔ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ １， １６９ （２０１１））。上述の通り、Ｒ２ ＳＩＤＥは、５’ＰＢＭ ＲＮＡを欠いており、それ自体は、親ＬＩＮＥがするように下流にタンパク質サブユニットを事前に配置しない。骨格ＬＩＮＥトランスポゾンからのＤＢを適所で変異させて、または異なるＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ライブラリーからのＺＦ、もしくは別様に公知のＺＦ、もしくはｔａｌｅｎ、もしくはｃａｓ９などで置換して、新たな部位に標的化することができる。ＤＢは、Ｒ２エレメントの場合は挿入部位の上流と下流の両方と接触するが、ＮｅＳＬ－１の場合は標的配列の上流のみと接触すると考えられている。一部の事例では上流の配列に結合するように、および他の事例では上流の配列と下流の配列の両方に結合するように、操作されたタンパク質を設計することができる。

【0067】

リンカードメインは、図１８Ｂに描写されているように、αＦおよびＣＣＨＣジンクナックル様ドメインを含む（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ ＤＮＡ ８， １６ （２０１７））。下記の実施例で説明されるように、αＦおよびＣＣＨＣジンクナックルは、組込み反応の全ての段階において標的ＤＮＡを切断および合成のために適切な位置に配置する。特に、αＦは、４方向ジャンクションの結合および認識に重要である。４方向ジャンクションは、第２鎖ＤＮＡ切断および第２鎖ＤＮＡ合成への入口である。Ｒ２Ｂｍでは、挿入部位の下流の配列（すなわち、４方向ジャンクションのノースアーム）は、ＤＮＡ切断に重要であり、ＤＢにより認識される。Ｒ２ ＬＩＮＥ ＲＮＰでは、タンパク質サブユニットは、５’ＰＢＭ ＲＮＡとの会合によって下流ＤＮＡ配列にすでに結合されている。サウス、ウエストおよびイーストアームの構造および配列もタンパク質により認識される。Ｒ２ ＳＩＤＥ ＲＮＰは、タンパク質サブユニットを挿入部位の下流にではなく、上流部位にのみ事前に配置する。ＮｅＳＬのようなエレメントは、ＤＢによって挿入部位の下流の配列に結合しない可能性が高い。その代わり、４方向ジャンクションの認識およびエンドヌクレアーゼの配置は、リンカー、特にαＦ、により行われる。４方向ジャンクションの認識は、配列特異的でもあり、構造特異的でもある。αＦは、４方向ジャンクションの中心と接触すると考えられており、これは、スプリコソーム内の５’スプライス部位の多分岐型ＲＮＡに結合するＰｒｐ８のαＦに類似している（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ ＤＮＡ ８， １６ （２０１７））。下記の実験も参照されたい。したがって、新たな部位に標的化するためのＲＬＥ ＬＩＮＥタンパク質の操作は、アミノ末端ＤＮＡ結合ドメインばかりでなくリンカー、特にαＦ、の修飾も含み得る。

【0068】

標的切断特異性の多くは、ＤＢおよびリンカーに繋留されているＲＬＥに起因し得るが、エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡとの何らかの重要な接触点を作り、何らかの特異性を有するように見える（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６）および下記の実験）。したがって、新たな部位へのトランスポゾンの標的化は、ＲＬＥの修飾を含み得る。

【0069】

Ｒ２ＢｍのＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢ）は、３’ＰＢＭ ＲＮＡと５’ＰＢＭ ＲＮＡの両方に結合する（Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２， ８４０５ （２０１４））。ＲＮＡ結合ドメインは、操作されたトランスポゾンのＲＮＡに、逆転写および標的部位への組込みに至る方法で、結合することができなければならない。代表的には、親タンパク質をおよび同じ親ＬＩＮＥからのＰＢＭ ＲＮＡを使用することにより、果たすことができる。しかし、上流３’ＰＢＭ結合サブユニットに一方の親ＬＩＮＥを使用し、下流５’ＰＢＭ結合サブユニットに別の親ＬＩＮＥを使用することが有利であることもある。タンパク質およびＲＮＡ成分の操作により導入される摂動を補正するために、必要に応じてＲＮＡ結合ドメインを変異させることができる。

【0070】

図１８Ｃおよび１８Ｄは、ＲＮＡ成分に結合する操作されたトランスポゾンの２つのモデル（１８Ｃ）ならびに逆転写およびＤＮＡ標的部位への組込み（１８Ｄ）を図示する。タンパク質サブユニットは、所望の遺伝子位置に結合するように操作される。異なるＲＬＥ系列は、挿入部位の上流および下流に結合するために様々な立体配置のアミノ末端ＤＢを使用するように見えるので、タンパク質サブユニットは、同じ親ＲＬＥ起源のものであることもあるか、または異なる親ＲＬＥ起源のものであることもある。設計は、（１）Ｒ２ ＬＩＮＥ様組込みおよび（２）Ｒ２ ＳＩＤＥ様組込みという、２つの挿入モデル（図１８Ｄ）を考慮に入れることができる。

【0071】

ＤＢ、リンカーおよびＲＬＥにおける変異（例えば、点変異）は、ＤＮＡ結合および認識がこれらのドメインの各々を含むので、エレメントへの再標的化の際に必要とされる可能性が高いであろう。
Ｂ．ＲＮＡおよびタンパク質成分の配列源
１．親レトロトランスポゾン

【0072】

操作されたレトロトランスポゾンは代表的には、親ＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥ／ＳＩＤＥとも呼ばれる、既存のＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥ／ＳＩＤＥ、またはＬＩＮＥもしくはＳＩＮＥ／ＳＩＤＥ骨格から構築される。したがって、ＬＩＮＥおよびＳＩＮＥの適切な核酸配列およびアミノ酸配列を、目的の標的部位への目的の遺伝子の組込みを果たすために必要に応じて調整すること、変異させること、または別様に修飾することができる。

【0073】

例えば、既知ＲＬＥ ＬＩＮＥまたはＳＩＤＥに由来し得る、３’ＰＢＭを含むがこれらに限定されない、ＲＮＡ成分配列がある。タンパク質成分配列は代表的には、ＲＬＥ ＬＩＮＥに由来する。上記で論じられているように、ＲＮＡ成分およびタンパク質成分は、目的の遺伝子の適切な逆転写および組込みを確実にすることに適合性でなければならない。

【0074】

２つの主要ＬＩＮＥ群がある。２つの群は、共通のＲＴおよびリンカー（αＦおよびＩＡＰ／ｇａｇ様ＣＣＨＣジンクナックル）を共有する。２つの群は、エレメントＲＮＰの形成および宿主ＤＮＡへの組込みに使用される、それらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）構造、ＲＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼドメインが異なる。

【0075】

より早期の分岐群は、単一のＯＲＦを有する。ＯＲＦは、Ｎ末端ジンクフィンガーおよびＭｙｂモチーフと、ＲＴと、ｇａｇナックル様モチーフと、制限酵素様エンドヌクレアーゼ様フォールド（ＲＬＥ）を有するＩＩ型制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）とを有する多機能タンパク質をコードする（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ． ２０１５；３：ＭＤＮＡ３－００１１． ｄｏｉ： １０．１１２８／ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｓｐｅｃ．ＭＤＮＡ３－００１１－２０１４；およびＥｉｃｋｂｕｓｈ， ”Ｒ２ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｏｎ－ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ．”Ｉｎ： Ｃｒａｉｇ ＮＬ， Ｃｒａｉｇｉｅ Ｒ， Ｇｅｌｌｅｒｔ Ｍ， Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ ＡＭ， ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ： ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ；２００２． ｐ． ８１３－３５において概説されている）。ＬＩＮＥのこの群は、一般に、組込み中に部位特異的である。

【0076】

昆虫Ｒ２エレメントは、この早期分岐ＬＩＮＥ群のよく研究されている例である。Ｍｕｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ （２０１７） ８：１６ ＤＯＩ １０．１１８６／ｓ１３１００－０１７－００９７－９ｎは、Ｒ２ ＲＴの最新モデルを、ＲＴとエンドヌクレアーゼ間のリンカー領域の分析とともに提示している。ＲＴ、リンカーおよびＲＬＥの配列－構造アラインメントとともに、Ｒ２タンパク質分解データは、ＲＬＥ ＬＩＮＥが、ＲＴドメインとＲＬＥドメインとを有する高度に保存される真核生物スプライシング因子であるＰｒｐ８の大きい断片と、多数の共通点を共有することを示す。

【0077】

ＲＬＥ ＬＩＮＥおよびそれらのＳＩＤＥを、操作されたトランスポゾンのＲＮＡおよびタンパク質成分を誘導するための親骨格としてまたは基礎として使用することができる。
２．ＤＮＡ結合ドメイン源

【0078】

一部の実施形態では、ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥの１つもしくは複数のＤＮＡ結合ドメインまたはそれらのモチーフを、代替ＤＮＡ結合ドメインで修飾または置換することができる。例えば、Ｎ末端ＺＦ（および存在する場合にはＭｙｂモチーフ）は、これらのモチーフを含有する全ての部位特異的ＲＬＥ保有非ＬＴＲレトロトランスポゾンについての標的化モジュールの大部分に相当し得る。ＭｙｂおよびＺＦは、新たな部位への標的化を可能にする修飾を受けることができる。修飾中に、個々のＺＦおよびＭｙｂモチーフが獲得または喪失され得る。加えて、様々な核酸結合活性（５’ＵＴＲ ＲＮＡ結合、３’ＵＴＲ ＲＮＡ結合、上流ＤＮＡ結合、および下流ＤＮＡ結合）と触媒活性（第１鎖切断、ＴＰＲＴ、第２鎖切断、および第２鎖合成）の間の物理的／時間的関連性の構成を、エレメントが移行するにつれて、ゲノム内の新たな部位に標的化するように再構成することができる。組込みおよびリンカー領域に関する特定の考慮事項は、上記でも論じられている。

【0079】

一部の実施形態では、代用ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはそのモチーフに由来する。ＤＮＡ結合ドメインの例としては、ヘリックスターンヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウイングドヘリックス、ウイングドヘリックスターンヘリックス、ヘリックスループヘリックス、ＨＭＧボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＯＢフォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬエフェクター、ＲＮＡガイドドメイン、例えばＣａｓタンパク質中のもの、が挙げられるが、これらに限定されない。
３．導入遺伝子源

【0080】

上記で紹介された通り、ＲＮＡ成分は代表的には、本明細書では導入遺伝子とも呼ばれる目的の遺伝子、および目的のオープンリーディングフレームをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子配列は、１つまたは複数のタンパク質または機能性核酸をコードする。導入遺伝子は、モノシストロン性であることもあるか、またはポリシストロン性であることもある。一部の実施形態では、導入遺伝子は、多遺伝子性である。ＬＩＮＥは、３～７ＫＢ範囲であり、それらのＳＩＮＥ／ＳＩＤＥは、数百塩基であるので、導入遺伝子は、同様のサイズであり得る。より大きい導入遺伝子も可能であり得る。

【0081】

開示される操作されたトランスポゾンを使用して、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子導入、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異などを誘導することができる。例えば、トランスポゾンを使用して、標的ＤＮＡ配列に核酸材料を付加させる、すなわち、挿入または補充する（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどをコードする核酸を「ノックイン」する）こと、タグ（例えば、６×Ｈｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ＦＬＡＧなど）を付加させること、遺伝子に調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナルなど）を付加させること、核酸配列を修飾する（例えば、変異を導入する）ことなどができる。したがって、組成物は、例えば、遺伝子療法において、例えば、疾患を処置するためにまたは抗ウイルス、抗病原体もしくは抗がん治療薬として、使用される場合、ＤＮＡを、部位特異的、すなわち「標的化された」方法で修飾するために、例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付けなどに使用することができる。

【0082】

したがって、標的部位に組み込まれるＲＮＡ成分の配列は代表的には、本明細書では、目的の遺伝子、導入遺伝子、または目的のオープンリーディングフレームと呼ばれるが、一部の実施形態では、目的の遺伝子が完全長遺伝子でも完全長導入遺伝子でもなく、むしろ遺伝子の断片、調節エレメント、または別の非翻訳エレメントであることは理解されるであろう。
ａ．目的のポリペプチド

【0083】

導入遺伝子は、目的の１つまたは複数のポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドは、任意のポリペプチドであることができる。例えば、導入遺伝子によりコードされる目的のポリペプチドは、生物に治療もしくは予防効果を提供するポリペプチドであることもあるか、または生物の疾患もしくは障害を診断するために使用され得るポリペプチドであることもある。導入遺伝子は、遺伝性疾患または障害を代償または別様に補正することができる。導入遺伝子は、がん、自己免疫障害、寄生虫感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または他の感染症の処置において機能することができる。発現される導入遺伝子は、免疫系の細胞のリガンドもしくは受容体として機能するポリペプチドをコードすることもあるか、または生物の免疫系を刺激もしくは阻害するように機能することができるポリペプチドをコードすることもある。

【0084】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、選択可能なマーカー、例えば、真核細胞において有効である選択可能なマーカー、例えば薬物耐性選択マーカーを含む。この選択可能なマーカー遺伝子は、選択培養培地で成長する形質導入宿主細胞の生存または成長に必要な因子をコードすることができる。選択遺伝子の形質導入を受けていない宿主細胞は、培養培地で生き残らないであろう。代表的な選択遺伝子は、抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、カナマイシン、ゲンタマイシン、ゼオシンもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または培地から差し引かれた重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

【0085】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は代表的には、宿主細胞に存在も発現もされない遺伝子である。レポーター遺伝子は代表的には、何らかの表現型変化または酵素的特性を提供するタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は、Ｋ． Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２２， ４２１ （１９８８）において提供されている。好ましいレポーター遺伝子としては、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子およびＧＦＰ遺伝子が挙げられる。

【0086】

ｉＰＣ、インターロイキン、受容体、転写因子ならびにアポトーシス誘発性および抗アポトーシスタンパク質を産生するものを含む、追加の遺伝子。
ｂ．機能性核酸

【0087】

導入遺伝子は、機能性核酸をコードすることができる。機能性核酸は、特定の機能、例えば、標的分子に結合する機能または特定の反応を触媒する機能を有する、核酸分子である。機能性核酸分子は、次の非限定的なカテゴリーに分けることができる：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、および外部ガイド配列。機能性核酸分子は、標的分子が有する特定の活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーターおよび刺激因子として作用することができ、または機能性核酸分子は、いずれの他の分子とも無関係の新規活性を有することができる。

【0088】

機能性核酸分子は、任意の巨大分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは糖鎖と相互作用することができる。したがって、機能性核酸は、標的ポリペプチドのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡと相互作用することができ、またはポリペプチド自体と相互作用することができる。多くの場合、機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況では、機能性核酸分子と標的分子間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子間の配列相同性に基づかず、むしろ、特異的認識が生じるのを可能にする三次構造の形成に基づく。
ｃ．発現エレメント

【0089】

上記で紹介された通り、導入遺伝子は、標的ＤＮＡ部位に組み込まれると導入遺伝子発現を可能にする発現制御配列を含むことができ、またはそのような発現制御配列に作動可能に連結され得る。作動可能に連結は、開示される配列が、遺伝子構築物に、発現制御配列が目的の配列の発現を有効に制御するように組み入れられることを意味する。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、核酸配列分子の領域、代表的には、転写が開始する地点（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位付近）の上流１００ヌクレオチド以内の領域、で構成されている、発現制御配列である。

【0090】

一部のプロモーターは、「構成的」であり、調節の影響の非存在下で転写を指示する。一部のプロモーターは、「組織特異的」であり、１つまたは少数の組織型において排他的にまたは選択的に転写を開始する。一部のプロモーターは、「誘導性」であり、誘導因子の影響下で遺伝子転写を達成する。誘導は、例えば、生理応答、外部シグナルに対する応答、の結果として、または人工的操作の結果として、起こり得る。一部のプロモーターは、テトラサイクリンの存在に応答し、「ｒｔＴＡ」は、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子である。そのようなプロモーターは、当業者に周知である。一般に使用されるプロモーターおよびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列は、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子エレメント、例えば、ＳＶ４０起源、早期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を提供するために使用され得る。ウイルス早期および後期プロモーターは、両方が、ウイルス複製起点も含有し得る断片としてウイルスゲノムから容易に得られるため、特に有用である。哺乳動物宿主細胞における使用のための例示的な発現ベクターは、当技術分野において周知である。

【0091】

プロモーターの制御下にコード配列を置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの下流１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの間に配置することが好ましい。エンハンサーは、時間、位置およびレベルの点で発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位から様々な距離に位置するときに機能することができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流に位置することもできる。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡに転写することができ、次いで、それがコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳され得る場合、細胞内の発現制御配列に「作動可能に連結」されており、細胞内の発現制御配列の「制御下」にある。
Ｃ．設計上の考慮事項

【0092】

操作されたトランスポゾンを設計する際の重要な考慮事項は、標的部位への操作されたトランスポゾンの組込み方法である。ＲＮＡおよびタンパク質成分への修飾は、標的部位への目的の遺伝子の組込みを確実にする方法で行わなければならない。
１．４方向分岐型ＤＮＡ中間体

【0093】

第２鎖ＤＮＡ切断は、切断部位が一般にパリンドロームでないため、依然として不可解である：第２の切断部位の周囲の配列は、第１鎖部位の周囲の配列と無関係であることが多い。加えて、切断は、平滑末端化状態または位置のずれた状態を生じさせることがあり、後者は、そのエレメントの切断事象の位置のずれに依存して標的部位重複もしくは標的部位欠失のどちらかに至る。このずらして配置される切断は、数塩基離れている（例えば、Ｒ２Ｂｍでは２ｂｐ）こともあるか、またはかなり遠く離れている、例えばＲ９では１２６ｂｐ、こともある（Ｇｌａｄｙｓｈｅｖ ａｎｄ Ａｒｋｈｉｐｏｖａ， Ｇｅｎｅ ４４８， １４５ （２００９）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３６， １０３５ （２００４））。ＡＰＥ ＬＩＮＥでは、一般に、切断は、例えば挿入時にわずかな１０～２０標的部位重複を生じさせるように、ずらして配置される（Ｚｉｎｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １１０， ２５０ （２００５）；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃａ １１０， ２４５ （２００１）；Ｏｓｔｅｒｔａｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ３５， ５０１ （２００１））。ＬＩＮＥを有するＡＰＥ（ＡＰＥ ＬＩＮＥ）からのエンドヌクレアーゼは、線状標的ＤＮＡ上の第１のＤＮＡ切断部位に対して多少の特異性を有するが、第２のものに対してはそれよりはるかに低い特異性を有するように見える（Ｆｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８７， ９０５ （１９９６）， Ｚｉｎｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １１０， ２５０ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃａ １１０， ２４５ （２００１）， Ｆｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５， ２０８３ （１９９８）， Ｍａｉｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５， ３９１８ （２００７））。ＬＩＮＥを有するＲＬＥ（ＲＬＥ ＬＩＮＥ）からのエンドヌクレアーゼは、同様に標的部位認識に関与する（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６））。しかし、両方の場合、タンパク質中の未同定ＤＮＡ結合ドメインによりＤＮＡに繋留されているエンドヌクレアーゼを含む、第１鎖切断と第２鎖切断の異なる特異性を説明するために、切断のさらなる指定子が想起された。もう１つの複雑化因子は、第１の切断事象がエレメントＲＮＡの存在下で起こるはずであり、その一方で、第２の切断事象が、先験的推論によれば、エレメントＲＮＡの非存在下で起こるはずであることであるが、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実証が困難であった（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。

【0094】

第２鎖ＤＮＡ合成は、２０年より長きにわたり未解決のままであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで直接観察されたことがいまだかつてない（Ｃｏｓｔ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ ２１， ５８９９ （２００２）， Ｚｉｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５， ７８０ （２００５）， Ｈａｎ， Ｍｏｂ ＤＮＡ １， １５ （２０１０）， Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３）， Ｋａｊｉｋａｗａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５０５， ３４５ （２０１２））。第２鎖合成は、第２鎖切断事象により生成された遊離３’－ＯＨのプライマー作用が消失され、エレメントによりコードされた逆転写酵素により合成されると考えられている。標的（ｄｓ）ＤＮＡ末端が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応での第２鎖ＤＮＡ切断後に互いに遠のいたときに、どのようにして提案されたプライマー－鋳型会合が生じるのかは不明である（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。

【0095】

Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉからのＲ２エレメントであるＲ２Ｂｍは、ＬＩＮＥの挿入反応を研究するために使用されてきた多数のモデル系の１つである（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３， ＭＤＮＡ３ （２０１５））。Ｒ２エレメントは、部位特異的であり、２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の「Ｒ２部位」を標的とする（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３， ＭＤＮＡ３ （２０１５））。Ｒ２エレメントは、Ｎ末端のジンクフィンガー（ＺＦ）およびｍｙｂドメイン（Ｍｙｂ）と、中央の逆転写酵素（ＲＴ）と、制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）と、Ｃ末端のｇａｇナックル様ＣＣＨＣモチーフとを有する、単一のオープンリーディングフレームをコードする（図１Ａ）。Ｒ２Ｂｍタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に使用するために精製された。

【0096】

Ｒ２Ｂｍタンパク質およびＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、Ｒ２Ｂｍの組込みのモデル（図１Ｂ）をもたらした（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。一方がＲ２ ＲＮＡの３’タンパク質結合モチーフ（ＰＢＭ）に結合し、他方が５’ＰＢＭに結合する、Ｒ２タンパク質の２つのサブユニットが、組込み反応に関与すると考えられる。５’および３’ＰＢＭ ＲＮＡは、２つのサブユニットの役割を指示するものであり、ＴＰＲＴによるエレメント組込みを生じさせる結果となる一連のＤＮＡ切断および重合ステップを調整する（図１Ａ）。エレメントの３’ＰＢＭに結合されたタンパク質サブユニットは、Ｒ２相互作用部位の上流の２８Ｓ ｒＤＮＡ配列と相互作用する。上流サブユニットのＲＬＥは、第１の（ボトム／アンチセンス）ＤＮＡ鎖を切断する。第１鎖標的ＤＮＡ切断後、サブユニットのＲＴは、切断事象により生成された３’－ＯＨをプライマーとして使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成するＴＰＲＴを実行する。５’ＰＢＭ ＲＮＡに結合されたタンパク質サブユニットは、ＺＦおよびＭｙｂドメインによってＲ２挿入部位の下流の２８Ｓ ｒＤＮＡ配列と相互作用する。下流サブユニットのＲＬＥは、第２の（トップ／センス）ＤＮＡ鎖を切断する。しかし、第２鎖ＤＮＡ切断は、恐らく、タンパク質を「ＲＮＡ非結合」立体構造にするＴＰＲＴのプロセスにより、５’ＰＢＭ ＲＮＡがサブユニットから抜き取られてしまうまで、起こらないと考えられる。第２鎖ＤＮＡ切断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応ではＲＮＡの非存在下で起こらない。第２鎖切断は、この報告までは、狭い範囲のＲ２タンパク質、５’ＰＢＭ ＲＮＡおよび観察される目標ＤＮＡ比を必要とした（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。加えて、第２鎖切断は、上流標的－ＤＮＡを下流標的－ＤＮＡから分離するため、上流標的－ＤＮＡから下流－ＤＮＡに結合しＴＰＲＴ産物までの第２鎖ＤＮＡ合成の開始は問題が多い（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。

【0097】

ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＬＩＮＥの組込み反応において中心的な役割を果たす。早期分岐ＬＩＮＥに見られるＲＬＥは、エンドヌクレアーゼのＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫスーパーファミリーのバリアントである（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６）， Ｙａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６， ７８４７ （１９９９））。ＬＩＮＥ ＲＬＥは、古細菌ホリデイジャンクションリゾルバーゼに対して配列および構造相同性を有する（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６））。しかし、以前の研究は、Ｒ２タンパク質がホリデイジャンクションリゾルバーゼとして機能することができるのか否かについて、および挿入機構において果たし得るこの推定的機能に何らかの関連性があるのならどのような関連性があるのかについて、未解決の問題を残した。分岐型ＤＮＡに対して導入機能を果たすＲ２タンパク質の能力を下記の実施例で詳しく調査した。結果は、組込み特異的４方向ジャンクションが、組込み事象の重要な中間体であり、組込み事象の後半への入口であることを示す。この４方向ジャンクションは、構造と配列の両方によってＲＬＥタンパク質により認識される。構造および配列上の必要要件を使用して、機能性操作されたトランスポゾンの設計を助長することができる。
ａ．Ｒ２タンパク質は、一般的なホリデイジャンクションリゾルバーゼではなく、リゾルバーゼ様反応においてそれ自体の組込み中間体を切断する。

【0098】

Ｒ２タンパク質は、非特異的４方向ＤＮＡジャンクションであるホリデイジャンクションに、非特異的線状ＤＮＡよりも優先的に結合することが判明した。Ｒ２タンパク質は、マイナスＲＮＡ立体構造である場合、ジャンクションＤＮＡに結合するための大きな表面を有するように見える。これは、Ｒ２タンパク質のマイナスＲＮＡ立体構造が、第２鎖ＤＮＡ切断を行う可能性が高いので、Ｒ２組込みに関して機構的に意味がある。５’ＲＮＡの存在は、非特異的ジャンクションＤＮＡ（および一般に非特異的ＤＮＡ）への結合を消失させる。Ｒ２タンパク質のどの部分が、４方向ＤＮＡジャンクションに結合するのかは不明であり、それはエンドヌクレアーゼでない可能性もある。実際、下記の実験は、リンカー、特にリンカーのαフィンガーを、４方向ジャンクションＤＮＡ認識および結合の主要決定因子として意味づける。５’ＰＢＭ結合部位がジャンクション結合表面にオーバーラップするのかどうか、またはＲＮＡの欠如が、ひいてはジャンクション結合表面を露出させるタンパク質立体構造変化を促進するのかどうかも、不明である。５’および３’ＰＢＭ ＲＮＡについての結合表面は、Ｒ２タンパク質の大部分にわたって分布していると考えられているが、現在、唯一同定されているＲＮＡ結合エリアは、ドメイン－１およびドメイン０である（Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２， ８４０５ （２０１４））。ＣＣＨＣジンクナックルもエレメントＲＮＡに結合すると考えられているが、その真の機能は、依然として不明である。５’ＰＢＭ ＲＮＡが４方向ジャンクション様模倣体を形成するという可能性もある。ホリデイジャンクションリゾルバーゼのＤＮＡ結合表面は、大きく、高い正電荷を有し、そのため、Ｒ２タンパク質が、結合するためのこの正の表面の一部の使用を、Ｒ２ ＲＮＡへの結合に役立たせるのは理にかなったことである（Ｗｙａｔｔ ａｎｄ Ｗｅｓｔ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ６， ａ０２３１９２ （２０１４））。

【0099】

Ｒ２は、ＲＮＡの非存在下で非特異的ＤＮＡジャンクションに結合するが、次いで、これらのジャンクションを分解することができず、ＤＮＡ切断、特に、対称的ＤＮＡ切断は、起こらなかった。それ故、Ｒ２タンパク質は、厳密に言えばホリデイジャンクションリゾルバーゼではない。しかし、２８Ｓ ｒＤＮＡおよびＲ２配列を含有する、より特異的な４方向ジャンクションでは、第２／トップ鎖の２８Ｓ ｒＤＮＡ切断事象は、４方向ジャンクションに操作されたボトム／第１鎖の切断とほぼ対称であった。このＤＮＡ切断活性は、非常にホリデイジャンクションリゾルバーゼに似ている。

【0100】

鋳型ジャンプおよび二本鎖状である５’（サウス）アームの存在は、切断性について、下流２８Ｓ ｒＤＮＡ（ノース）アームにおける標的配列の存在を超えて、最も重要なジャンクション決定因子であるように見えた。一本鎖イーストアームは、さらに刺激性である。

【0101】

興味深いことに、Ｒ２タンパク質が溶液中で二量体として存在する（このことについての説得力のある証拠はない）場合を除き、結合対ＤＮＡ活性グラフは線形であり、したがって、単量体であるエンドヌクレアーゼと一致する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６））。ジャンクションの中央のＤＮＡ配列も重要であり得るが、Ｒ２特異的ジャンクションの全てが、挿入部位のどちらかの側に５～７塩基の２８Ｓ配列を含有したので、試験された構築物はこの見込みに対応しない。加えて、各ジャンクションは、少なくとも２５ｂｐのＲ２ ５’末端配列および２５ｂｐのＲ２ ３’末端配列を含有した。Ｒ２ ３’アームは、あまり重要でないように見えた。二重鎖を形成したＲ２ ３’アームを有することも阻害性であった。全てのＤＮＡバージョンにおいて、Ｒ２ ３’アームの除去は、それでもやはり、かろうじてではあるが、切断性であった。４方向ジャンクションの共有結合によって閉環した全てのＤＮＡバージョンは、Ｒ２タンパク質による切断が困難でもあったが、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドの特に５’アームにおける欠如は、切断性低下の一因となり得るので、第１鎖切断事象の存在は、切断性にも関与するように見えた。

【0102】

４方向ジャンクション内の全標的部位の存在は、ウエストアーム（すなわち、２８Ｓ上流ＤＮＡアーム）が鋳型ジャンプ構造（「フラップを伴うギャップ」）を含む場合を除き、ＤＮＡ切断に対して阻害であった。このデータは、鋳型ジャンプ由来のウエストアームが、極めて狭い安定性範囲内にあらねばならず、安定でありすぎるまたは硬すぎると阻害性であることを、さらに示す。低すぎる融解温度は、大量の一本鎖可動性領域の解離および／もしくは形成、ならびに切断忠実度の付随する低下をもたらす。
ｂ．Ｒ２Ｂｍ組込みの新モデル

【0103】

Ｒ２Ｂｍの挿入反応の後半についてより深く理解することにより、改善されたＲ２Ｂｍ組込みモデルを提示することができた（図７Ａ）。組込み反応の前半は、図１Ｂのステップ１および２と同一である。しかし、ＴＰＲＴ後、新モデルは、４方向ジャンクションを形成することになる、Ｒ２ ＲＮＡの５’末端からＲ２挿入部位の上流の２８Ｓ ｒＤＮＡのトップ鎖への鋳型ジャンプまたは組換え事象（ステップ３）を提案する。このステップは、現況ではｉｎ ｖｉｔｒｏで起こらないが、たとえそうであるにせよ、宿主因子を利用して形成することができるステップである。しかし、ｃＤＮＡの上流標的ＤＮＡとの会合は、多くの以前のデータと一致し、４方向ジャンクションは、完全長エレメント挿入に至る、５’ジャンクション形成、第２鎖ＤＮＡ切断および第２鎖ＤＮＡ合成の単純な統一機構を提示する。

【0104】

このモデルにより、Ｒ２ＢｍエレメントＲＮＡの５’末端に結合された「上流」リボソームＲＮＡ配列が完全長エレメント挿入に必要なものであると述べられた以前のｉｎ ｖｉｖｏ実験（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２， １５５５ （２００４）， Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０， ２１３ （２０００））の意味が理解される。つい最近、Ｒ２ ＲＮＡ転写物のバイオインフォマティクスおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、Ｒ２ ＲＮＡとリボソームＲＮＡは同じ大きい転写物の一部として同時転写されると判定された（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３）， Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （２０１０））。次いで、Ｒ２ ＲＮＡは、Ｒ２ ＲＮＡの５’末端付近に見られるＨＤＶ様リボザイムによって大量のリボソームＲＮＡからプロセシングされる（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３）， Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （２０１０））。しかし、多数のＲ２エレメントについては、最終的なプロセシングされたＲ２ ＲＮＡは、Ｒ２Ｂｍの場合、リボソームＲＮＡの５’末端２７ｎｔ上に多少のリボソームＲＮＡを保持する（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３））。この多量のリボソームＲＮＡを保持するエレメントについては、鋳型ジャンプは、鋳型ジャンプではなくむしろストランド侵入または組換え事象であり得る（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２， １５５５ （２００４）；Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０， ２１３ （２０００））。しかし、他のＲ２エレメントについては、リボザイムが、プロセシングされたＲ２ ＲＮＡ（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｉｍｕｌａｎｓ Ｒ２）上にリボソーム配列を残さず、図７Ａに図示されているような鋳型ジャンプが起こると予測される（Ｋｕｒｚｙｎｓｋａ－Ｋｏｋｏｒｎｉａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７４， ３２２ （２００７）， Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３）， Ｓｔａｇｅ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １０， Ｒ４９ （２００９）， Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１６， ４５９ （２００２））。ＡＰＥ ＬＩＮＥとＲＬＥ ＬＩＮＥ両方のＲＴは、相同性を一切用いずに鋳型の一方の末端からもう一方の始点にジャンプする能力があることが示された（Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１６， ４５９ （２００２））。鋳型ジャンプは、両方のタイプのエレメントの５’ジャンクション形成に関与すると長年考えられたきた（Ｋｕｒｚｙｎｓｋａ－Ｋｏｋｏｒｎｉａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７４， ３２２ （２００７）， Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３）， Ｓｔａｇｅ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １０， Ｒ４９ （２００９）， Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１６， ４５９ （２００２））。鋳型ジャンプに加えて、ＬＩＮＥ逆転写酵素は、ＤＮＡ合成中にＤＮＡとＲＮＡの両方を鋳型として使用することができ、重合中に二重鎖を移動させることができる（Ｋｕｒｚｙｎｓｋａ－Ｋｏｋｏｒｎｉａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７４， ３２２ （２００７））。

【0105】

最近報告されたＲ２ ＲＬＥの古細菌ホリデイジャンクションリゾルバーゼとの類似性は、Ｒ２が分岐型ＤＮＡに結合し、それを切断することができるか否かについての問題を提起した（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６）、Ｍｕｋｈａ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ４， ６３ （２０１３））。結局のところ、Ｒ２タンパク質は、実際、ＲＮＡの非存在下で４方向ジャンクションに結合し、それを切断することができる。第２鎖ＤＮＡ切断は、図７Ａのステップ４である。第２鎖切断は、Ｒ２特異的４方向ジャンクションにおいて第１鎖切断の真向かいで起こり、これは、ホリデイジャンクションリゾルバーゼを想起させる反応である。隣接挿入部位エリアからの配列および挿入部位の下流の配列が切断の駆動に役立ったので、第２鎖切断は、構造と配列の両方に依存する。

【0106】

サウスアーム、すなわちＲ２ ５’アームは、重要な切断決定因子であった。５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在は、非特異的４方向ジャンクションへの結合を防止し、特定のジャンクションのＤＮＡ切断を防止する。Ｒ２タンパク質は、ＲＮＡの非存在下でしか切断しない。３方向ＴＰＲＴジャンクションは、ＤＮＡ切断の良好な基質ではなかった。

【0107】

Ｒ２Ｂｍのような、５’末端にｒＲＮＡ配列を有するエレメントについては、ｃＤＮＡ鎖が図２～８Ａステップ３に描写されているジャンクションを形成している間にヘテロ二重鎖から移動したＲＮＡ鎖にまたは移動した「ボトム鎖」標的ＤＮＡフラップに何が起こるのか、および移動した鎖がＤＮＡ切断において果たす役割は、もしあるのであれば、何であるのかは、不明である。移動したＲＮＡは、Ｒ２Ｂｍ組込み４方向ジャンクション構築物に含まれず、フラップは、非特異的ＤＮＡであった。加えて、上流サブユニットのそのサブユニットが線状２８Ｓ ｒＤＮＡに結合したときに観察される最小ＤＮａｓｅフットプリントに２７ｎｔのリボソーム配列が侵入した場合、ジャンプ／組換えによって上流タンパク質サブユニットが除去されるか否かについては、また調査されていない（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３６， １０３５ （２００４））。移動した標的ＤＮＡ鎖とともに全標的配列を含有する、図４Ａおよび４Ｃの構築物は、全標的配列を有し標的ＤＮＡが移動していないジャンクションが取る挙動よりも、上流標的配列を欠いているジャンクションにはるかに近い挙動を取る。組換えられたｃＤＮＡ／標的ＤＮＡ二重鎖は、Ｒ２Ｂｍについて考えられるものとマッチするこれらの構築物中の２７ｂｐであった（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３））。

【0108】

このモデルを支持する第五および最終選択の証拠は、４方向ジャンクションの切断が第２鎖ＤＮＡ合成の天然プライマー－鋳型を生成することである。「下流結合」サブユニットは、第２鎖ＤＮＡ合成をプライミングするように見える（図７Ａ、ステップ５）。

【0109】

ｉｎ ｖｉｖｏでは、宿主因子は、ジャンクションの半分同士を、第２鎖合成をプライミングするのに十分な長さに一緒に保持し続けるのに役立ち得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、プライマー鋳型は、少なくとも上流標的ＤＮＡアームが非特異的ＤＮＡからなる場合、遊離される。
ｃ．異なる切断位置のずれを有するＬＩＮＥへのＲ２モデルの外挿

【0110】

第１鎖切断部位に対する第２鎖ＤＮＡ切断部位の位置は、種によってかなりばらつきがあり、Ｒ２系統群によってさらにいっそうばらつきが大きい。Ｒ２Ｂｍにおける第１および第２のＤＮＡ切断事象の位置のずれは、２ｂｐの小さい５’オーバーハングであり、これは、エレメントの挿入時に２ｂｐ標的部位欠失をもたらす。ショウジョウバエでは、Ｒ２エンドヌクレアーゼは、平滑末端型切断を生じさせる（Ｓｔａｇｅ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １０， Ｒ４９ （２００９））。他のＲ２エレメントは、小さい３’オーバーハングを生じさせる。図７Ａで提示されるモデルは、これらの小さい位置のずれのいずれかを有するエレメントについて同様に効果的である。４方向ジャンクションを生成するためにＴＳＤ領域の局所的融解または移動、続いての鋳型乗り換えを仮定することにより、このモデルを、適度な３’オーバーハング位置のずれを有するエレメントに適応させることができる。ＡＰＥ ＬＩＮＥは、１０～２０の範囲の適度な３’オーバーハング位置のずれを生じせる傾向がある。ＡＰＥ ＬＩＮＥが、第２鎖ＤＮＡ切断および合成を駆動するために４方向ジャンクション構造を使用するかどうかは、まだ判定されていない。完全長Ｌ１およびＡｌｕエレメントの５’ジャンクションのバイオインフォマティクス解析は、上流標的配列への鋳型ジャンプを示し、ＤＮＡ修復プロセスが挿入事象失敗のための５’ジャンクション形成への代替経路になり得ることを示す（Ｚｉｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５， ７８０ （２００５）， Ｉｃｈｉｙａｎａｇｉ， ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｏｋａｄａ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １７， ３３ （２００７）， Ｇａｓｉｏｒ ａｎｄ Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ， ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ （Ａｍｓｔ） ７， ９８３ （２００８）， Ｃｏｕｆａｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８， ２０３８２ （２０１１）， Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３， ＭＤＮＡ３ （２０１５））。

【0111】

Ｌ１のツインプライミングは、第２鎖合成に関連する、しかし異常な、現象である（Ｏｓｔｅｒｔａｇ ａｎｄ Ｋａｚａｚｉａｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １１， ２０５９ （２００１））。ｃＤＮＡと上流標的ＤＮＡ間の会合が、一部のＲ１事象について考えられている（Ｓｔａｇｅ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １０， Ｒ４９ （２００９））。リボソーム配列は、Ｒ１Ｂｍの第１鎖合成中のエレメント－ＲＮＡ／標的－ＤＮＡ相互作用ならびにいくつかの他の部位特異的ＬＩＮＥにとっても重要であるが、Ｒ２Ｂｍにとっては重要でないように見える（Ｆｕｊｉｗａｒａ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３， ＭＤＮＡ３ （２０１５）， Ａｎｚａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３， １９９３ （２００５）， Ｌｕａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６， ４７２６ （１９９６））。小数のＬＩＮＥは、非常により大きくずらされた配置を有する。Ｒ２系統群メンバーであるＲ９ Ａｖエレメントは、１２６ｂｐの位置のずれを生じさせる（Ａｒｋｈｉｐｏｖａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ ＤＮＡ ３， １９ （２０１２））。より大きく位置がずれている場合、Ｄループの開口部によって、鋳型ジャンプおよび４方向ジャンクションの形成が可能になる。
ｄ．組込みを維持するための設計上の考慮事項

【0112】

ゲノムＤＮＡ標的部位の設計、および操作されたＬＩＮＥタンパク質によりゲノムに挿入されることになる操作されたＲＮＡの設計では、組込み反応中に生産的な４方向ジャンクションが形成されるように留意しなければならない。操作されたＲＮＡの５’末端における標的配列の存在または非存在は、親ＬＩＮＥのＨＤＶが、切断されたときに標的配列を残すか否かに依存することになる。大部分のリボザイムは、標的ＤＮＡに由来する１０～２５ｎｔのＲＮＡを残す。Ｒ２Ｂｍリボザイムは、標的配列を残す。Ｒ２Ｄｍリボザイムは残さない。標的配列の残存により、４方向ジャンクションの形成方法、ジャンクションのウエストアームの安定度、ならびに第２鎖切断事象の位置および忠実度が決まる。ウエストアームの安定性（鋳型ジャンプエリアのサイズ）は、一部は、上流サブユニットの挿入部位のどれ程上流に結合するように設計されるかによって決まるように見える。Ｒ２エレメントおよびＮｅＳＬについては、この距離は、約２ターンのウエストアームヘリックスを形成するための余地を残して挿入部位の上流約１０～２０塩基である。Ｒ２ＢＭは、親ＬＩＮＥ（裏付ける生化学の大部分がこれに関して行われている）であるので、Ｒ２Ｂｍは、好ましい親ＬＩＮＥタンパク質および親ＲＮＡである。

【0113】

ＤＮＡ切断事象位置のずれによって、４方向ジャンクションのイーストアームが一本鎖状になるのか否か、または二本鎖状になるのか否かが決まる。３’オーバーハングを生じさせる結果となる位置のずれは、一本鎖イーストアームを有する４方向ジャンクションを生じさせる。一本鎖イーストアームは、第２鎖ＤＮＡ切断を刺激する。Ｒ２Ｂｍでは、位置のずれは、細胞ＲＮＡｓｅがイーストアームのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを除去するような時までイーストアームがＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖であるような位置のずれである。

【0114】

サウスアームは、４方向ジャンクションの認識および切断の主要決定因子でもあるので、操作されたＲＮＡは、サウスアームになる操作されたＲＮＡの５’末端の配列が、親ＬＩＮＥタンパク質／ＲＮＡを基準に適切な配列および特性を確実に有するようにすることによって、そのアームの配列および構造エレメントを維持することが必要となる。
２．リンカー領域

【0115】

ＬＩＮＥは、ターゲットプライムド逆転写（ＴＰＲＴ）と呼ばれるプロセスにより新たな部位に組み込まれる。エレメントによりコードされたＤＮＡエンドヌクレアーゼは、宿主クロマチンにニックを生じさせて遊離３’－ＯＨ基を露出させる。３’－ＯＨ基は、エレメントによりコードされた逆転写酵素により、挿入部位におけるエレメントＲＮＡの逆転写のためのプライマーとして使用される。ＬＩＮＥは、逆転写酵素の下流に不変ｇａｇ様ジンクナックルシステイン／ヒスチジンリッチモチーフ（ＣＸ２－３ＣＸ７－８ＨＸ４Ｃ）をコードする（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９０）． ｄｏｉ：１０．１０１６／００２２－２８３６（９０）９０３０３－４， Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２６， ５１６８－５１７９ （２００６））。ナックル内のシステインとヒスチジンの間隔は、ＬＩＮＥに見られるナックルに特有である。ジンクナックルのすぐ上流に一連の予測ヘリックスがある（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７））。

【0116】

Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｒ２Ｂｍ）からのＲ２ ＬＩＮＥは、タンパク質として生化学レベルでＬＩＮＥの組込み反応を詳細に分析するために活性形態で精製されｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用され得るモデル系として役立っている、部位特異的ＬＩＮＥである（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９０）． ｄｏｉ：１０．１０１６／００２２－２８３６（９０）９０３０３－４， Ｋｏｊｉｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．（２００６）． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｌ０６７；Ｇｌａｄｙｓｈｅｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （２００９）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｅ．２００９．０８．０１６）。Ｒ２ ＯＲＦは、ＤＮＡ結合に関与するＮ末端のジンク－フィンガー（ＺＦ）およびｍｙｂドメインと、ＲＮＡ結合（ＲＢ）ドメインと、中央の逆転写酵素（ＲＴ）と、いくつかの保存された予測ヘリックス（ＨＩＮＡＬＰモチーフ）およびｇａｇ様ジンクナックル（ＣＣＨＣモチーフ）を含有するリンカー領域と、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫ ＩＩ型制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）ドメインとを有する、多機能性タンパク質をコードする（図１Ａ）（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９０）． ｄｏｉ：１０．１０１６／００２２－２８３６（９０）９０３０３－４， Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７）， Ｂｕｒｋｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９８７）． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＭＣＢ．７．６．２２２１．Ｕｐｄａｔｅｄ， Ｙａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９６， ７８４７－５２ （１９９９）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３， ６４６１－６４６８ （２００５）， Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２， ８４０５－８４１５ （２０１４）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２５， ６６１７－６６２８ （２００５））。５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対応するＲ２ ＲＮＡ配列は、フォールディングして別個の構造になり、これらの構造は、Ｒ２タンパク質に結合することが公知であり、したがって、５’ＰＢＭおよび３’ＰＢＭとそれぞれ呼ばれる（図１Ａ）（Ｋｉｅｒｚｅｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００８）， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ１０８５， Ｋｉｅｒｚｅｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３９０， ４２８－４４２ （２００９）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０３， １７６０２－１７６０７ （２００６））。５’ＰＢＭおよび３’ＰＢＭ ＲＮＡへの結合は、タンパク質立体構造、および組込み反応における役割を制御する（図８Ｂ）（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２５， ６６１７－６６２８ （２００５））。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質成分の選択的付加により、組込み反応の別個の段階をアッセイすることが可能になる。

【0117】

３’ＰＢＭに結合されたＲ２タンパク質は、タンパク質が挿入部位を基準にして上流２８Ｓ ＤＮＡ配列（２８Ｓｕ）に結合することを可能にする立体構造をとる。２８Ｓｕと接触して上流タンパク質サブユニットを形成するＲ２タンパク質のドメインは、大部分が同定されていないままである（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４， ３２７６－３２８７ （２０１６）， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｍｅｎｔｓ １， ２９－３７ （２０１１）， Ｓｈｉｖｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． Ｇｅｎｅｔ． Ｅｌｅｍｅｎｔｓ １， １６９－１７８ （２０１１））。５’ＰＢＭに結合されたＲ２タンパク質は、タンパク質が下流２８Ｓ ＤＮＡ配列（２８Ｓｄ）に結合するのを可能にする立体構造をとる。Ｒ２タンパク質のＺＦおよびＭｙｂモチーフは、２８Ｓｄと相互作用することによって下流タンパク質サブユニットを形成することが公知である主要な残基を含む（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３， ６４６１－６４６８ （２００５））。上流および下流タンパク質サブユニットは、ＤＮＡ切断、続いてのＤＮＡ合成を各々が含む２つの半反応において、Ｒ２エレメントの組込みを触媒する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２５， ６６１７－６６２８ （２００５））。組込みの５つのステップは、（１）上流サブユニットからのエンドヌクレアーゼが、標的ＤＮＡにニックを入れて、挿入部位で３’－ＯＨを露出させるステップ、（２）露出した３’－ＯＨが、上流サブユニットの逆転写酵素によりＴＰＲＴにプライマーとして使用されるステップ、（３）逆転写されたものの５’末端からのｃＤＮＡが、上流標的ＤＮＡ配列と会合して４方向ジャンクションを形成する、鋳型ジャンプまたは組換え事象が起こるステップ、（４）下流サブユニットが、４方向ＤＮＡジャンクションを切断するステップ、（５）切断事象により生成された３’－ＯＨがエレメントの第２鎖ＤＮＡ合成にプライマーとして使用されるステップを含む。

【0118】

全てのＬＩＮＥにおいてＲＴの後に位置するリンカー領域の役割は、以前からずっと幻である（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７））。点変異をリンカーのｇａｇ様ジンクナックルおよび推定αフィンガーに導入した（図８Ｂ）。ＣＣＨＣモチーフの間隔は、ＬＩＮＥに特有である（Ｍａｌｉｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． １６， ７９３－８０５ （１９９９）， Ｆａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７）． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／１５．５．２２５１）。ＡＰＥ含有ヒトＬＩＮＥ－１エレメントを使用する以前のｉｎ ｖｉｖｏ研究では、リンカー領域のＣＣＨＣモチーフ内の最初の２つのシステインの変異は、ＬＩＮＥ－１レトロ転位を有意に低減させた（Ｍｏｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８７， ９１７－９２７ （１９９６））。ヒトＬＩＮＥ－１を用いた別のｉｎ ｖｉｖｏ研究では、最初の２つのシステインが変異したときにＲＮＰ複合体のレベル低減が観察され、これは、核酸結合に見込まれるその役割を示していた（Ｄｏｕｃｅｔ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．６， １－１９ （２０１０））。ジンクナックル構造が、セリンへの最初の３つのシステインの置換により変更されたとき、ＲＮＡ結合活性の低減がないことが、ヒトＬＩＮＥ－１エレメントについてｉｎ ｖｉｔｒｏで報告された（Ｐｉｓｋａｒｅｖａ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ ３， ４３３－４３７ （２０１３））。しかし、同じ研究で、ＲＴのＣ末端側の配列は、ＲＮＡ結合に関与することが見出された。ＬＩＮＥ－１エレメントにおける推定αフィンガーの上流の残基の変異は、ｉｎ ｖｉｖｏでレトロ転位活性を低減させた（Ｍｏｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８７， ９１７－９２７ （１９９６））。ジンクナックルそれ自体とともにジンクナックルの上流のヘリックスは、真核生物スプライシング因子であるＰｒｐ８のαフィンガーおよび非ジンクナックルとともに整列すると報告されている（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７）， Ｗａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （８０－．）． （２０１６）． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ６４６６， Ｂｅｒｔｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１７）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０７．０１１）。

【0119】

下記の実施例は、ＤＮＡ結合、第１鎖ＤＮＡ切断、第１鎖ＤＮＡ合成、第２鎖ＤＮＡ切断、および第２鎖ＤＮＡ合成について試験する条件下でＲ２Ｂｍの推定αフィンガーおよびジンクナックルの全体にわたって発生する一連の二重変異のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能に対する影響を試験する。結果は、機能性操作されたトランスポゾンの設計を助長するために使用することができる結論をもたらす。
ａ．リンカーの主な役割はエレメントＲＮＡを結合することであるように見えない。

【0120】

ＣＣＨＣ変異は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体内へのＯＲＦ２タンパク質の蓄積を低減させ、これは、エレメントＲＮＡへの結合に関与する可能性があることを含意した（Ｄｏｕｃｅｔ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．６， １－１９ （２０１０））。同様に、推定αフィンガーの上流の配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでレトロ転位活性を低減させることが判明した（Ｍｏｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８７， ９１７－９２７ （１９９６））。ヒトＬ１エレメントとマウスＬ１エレメントの間のドメイン交換実験も、ジンクナックルのすぐ上流の配列がｉｎ ｖｉｖｏでレトロ転位に重要であることを示す（Ｗａｇｓｔａｆｆ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６， （２０１１））。上流配列は、よく解明されていない複雑だがモジュール式の方法で、ジンクナックルとタンパク質の他の部分とに機能的に連結される。多数のこれらのドメイン交換が推定αフィンガーの中指に存在する。加えて、αフィンガーおよびジンクナックルの大部分を含有するＬ１ＨのＯＲＦ２のＣ末端の１８０アミノ酸を含有するポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡに非特異的に結合することが判明したが、システインの変異は、核酸結合に影響を与えなかった（Ｐｉｓｋａｒｅｖａ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ ３， ４３３－４３７ （２０１３））。

【0121】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、Ｒ２Ｂｍのジンクナックルおよびαフィンガーの変異がエレメント５’ＰＢＭ ＲＮＡまたは３’ＰＢＭ ＲＮＡへの結合を明白には低減させないことが判明した。しかし、注目すべきは、ＲＮＡ結合が、ＥＭＳＡゲルにおける明確に区別できるＤＮＡ－ＲＮＡ－タンパク質複合体の形成により推測されることである（Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４２， ８４０５－８４１５ （２０１４）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０３， １７６０２－１７６０７ （２００６））。５’ＰＢＭ ＲＮＡまたは３’ＰＢＭ ＲＮＡのどちらかとのタンパク質－ＤＮＡおよびタンパク質ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体は、ＥＭＳＡゲルにおいて固有の明確に定義された泳動パターンを有する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２５， ６６１７－６６２８ （２００５））。したがって、タンパク質－核酸複合体へのＲＮＡの組入れに影響を与えるアミノ酸を、一般的タンパク質滴定系列においてタンパク質－ＤＮＡ複合体のタンパク質－ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体に対する比の変化として検出することができる。同一のアッセイ系を使用して、ＲＴ －１およびＲＴ ０ドメインはＲＮＡ結合ドメインであると判定された（Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４２， ８４０５－８４１５ （２０１４））。ＲＮＡ結合への変化がはっきりしないため、タンパク質滴定ではなくＲＮＡ滴定も、変異のいくつかを用いて行った。とは言え、ＲＮＡ結合の役割を無視することはできない。ＲＮＡ結合表面は、あまりにも大きく、Ｒ２タンパク質の表面にわたって点突然経変異があまりにも広く分布しているので、アッセイで観察可能な差を生じさせることができない。これが、単一の点変異ではなく二重点変異が使用された理由の１つである（Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４２， ８４０５－８４１５ （２０１４））。

【0122】

ジンクナックルのコアＣＣＨＣモチーフ（Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ）へのおよび推定αフィンガーのＨＩＮＡＬＰモチーフ（Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰ）への変異は、ＥＭＳＡゲルにおいて安定なゲル泳動タンパク質－核酸複合体を形成するために不安定性をもたらすタンパク質構造の局所的破壊と一致する。明確に異なるタンパク質－ＤＮＡまたはタンパク質－ＤＮＡ－ＲＮＡバンドが観察されなかったので、これら２つの変異体でのＥＭＳＡからＲＮＡが結合されたか否かを識別できなかった。ジンクナックルおよびαフィンガー領域の全ての他の変異は、ＷＴタンパク質と同様のパターンで適切なタンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体を効率的に形成する能力を保持した。
ｂ．リンカーは組込み反応の前半の間にＲＬＥおよびＲＴに核酸を提示する。

【0123】

この研究で試験された変異体の各々についてのＤＮＡ結合、切断、および合成結果の比較要約は、下記の表２で提示される。ＣＣＨＣモチーフのコア（Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ）へのおよびＨＩＮＡＬＰモチーフのコア（Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰ）への変異は、非拘束ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および安定した上流結合タンパク質－核酸複合体の形成不能をもたらす。全ての他の変異体は、正常な上流タンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体を形成することができる。αフィンガー変異のうちの２つ（ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ）は、過度に拘束され切断されないエンドヌクレアーゼをもたらした。変異体の一方は、３’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下でＤＮＡ結合が損なわれず、他方の変異は、３’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下で標的化ＤＮＡに結合するタンパク質の能力を実際に増加させたので、第１鎖切断の実行不能は、上流ＤＮＡ配列に結合する変異体の能力に関係なかった。もっと正確に言えば、第１鎖ＤＮＡ切断のために標的ＤＮＡおよび／またはＤＮＡエンドヌクレアーゼを配置するために残基Ｒ８４９、Ｒ８５１、Ｒ８５４およびＲ８５６が使用される。

【0124】

切断されると、αフィンガーＧＲ／ＡＤ／ＡおよびＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異体は、すでにニックが入っている標的ＤＮＡでは第１鎖ｃＤＮＡ合成（ＴＰＲＴ）を実行することができなかった。これは、ＲＴおよび／または核酸成分を互いに対して配置する上での変異残基の役割を示す。実際、ＧＲ／ＡＤ／Ａ変異体は、ＴＰＲＴの実行不能および上流ＤＮＡ配列への結合のわずかな低減以外のあらゆる他の主要表現型を欠いていた。ジンクナックル変異体ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａ、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａは、第１鎖ＤＮＡ切断をわずかに低減させ、ほぼ野生型の第１鎖ＤＮＡ合成活性を保持した。上流ＤＮＡ結合は、注意深く検査されず、正常に見えた。
ｃ．リンカー領域は組込み反応の後半の鍵である。

【0125】

組込み反応の後半は、Ｒ２タンパク質が５’ＰＢＭ ＲＮＡと会合され、ひいては線状標的ＤＮＡ上の挿入部位の下流のＤＮＡ配列に結合されることから始まる。ＣＣＨＣモチーフのコア（Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ）へのおよびＨＩＮＡＬＰモチーフのコア（Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰ）への変異は、非拘束ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および安定した下流結合タンパク質－核酸複合体の形成不能をもたらす。全ての他の変異体は、線状標的ＤＮＡで正常な下流タンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体を形成することができ、線状ＤＮＡへの結合に最小限の影響しか及さないように見えた。とは言え、ＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異は、線状ＤＮＡの下流配列への結合のわずかな減少を示し、ジンクナックル変異体は定量的に試験されなかった。

【0126】

組込みの後半は、下流サブユニットが「ＲＮＡ非結合」状態であるときにのみ進行する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０３， １７６０２－１７６０７ （２００６））。第２鎖ＤＮＡ切断は、線状ＤＮＡに対して起こり得るが、これが起こるには５’ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質比の複雑なセットが必要であり、第２鎖ＤＮＡ切断は、第２鎖合成が起こらないという意味で非生産的である（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２５， ６６１７－６６２８ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０３， １７６０２－１７６０７ （２００６））。この理由から、組込み反応の後半、特に、第２鎖ＤＮＡ切断および第２鎖合成には、４方向ジャンクションの形成が機構的に必要であると今では考えらる（実施例１～８を参照されたい）。４方向ジャンクションは、ＲＮＡの非存在下でジャンクションを適切に切断し、切断生成物は、第２鎖合成の基質である（実施例１～８を参照されたい）。

【0127】

ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａ変異体を除いて、試験したジンクナックルおよびαフィンガー変異体は全て、線状ＤＮＡに対して第２鎖切断を実行することができなかった（表２）が、重要なこととして、ジンクナックル変異体は、より重要な４方向ジャンクションに対する第２鎖切断を損なわせなかった。ジンクナックルの最も近くにあるαフィンガー変異、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａは、４方向ジャンクションへの結合を大きく低減させ、第２鎖ＤＮＡ切断を消失させる。第２鎖合成は、これら２セットの変異による影響を同様に受けた。結果は、αフィンガーが４方向ジャンクションの認識にとって重要であること、ならびに結合されたＤＮＡをエンドヌクレアーゼおよび逆転写酵素に提示することを示す。ジンクナックル変異体ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａは、第２鎖合成を著しく低減させた。これは、ジンクナックル残基が、プライマー伸長のための切断されるジャンクションおよび／または逆転写酵素の配置に関与することを示す。
ｄ．ＡＰＥ ＬＩＮＥとのおよびＰｒｐ８との構造的および機能的接続

【0128】

Ｒ２Ｂｍによりコードされるタンパク質は、２つの球状ドメインからなると判定された。２つのドメインのうちの大きい方（図１７Ａ～１７Ｄにおいて着色されている）は、ＲＴ、ＲＬＥ、およびリンカーと呼ばれるこれら２つの間の領域を含有する（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７））。リンカー領域の末端は、不変ジンクナックル、およびそのジンクナックルの上流にいくつかの保存されたヘリックスを含有する。上流ヘリックスは、「推定αフィンガー」と本明細書では呼ばれ、そのＨＩＮＡＬＰモチーフがＲ２Ｂｍではαフィンガーの中心にある。ＡＰＥ ＬＩＮＥは、推定αフィンガーとＲＴを超えて位置するジンクナックルとを有する「リンカー」も含有する（図１７Ａ～１７Ｄ）。

【0129】

Ｒ２Ｂｍの大きい球状ドメインでＲＬＥ ＬＩＮＥは、真核生物スプライシング因子Ｐｒｐ８の大きな断片と配列類似性ばかりでなく構造的類似性も共有する（図１７Ａ～１７Ｄを参照されたい）。Ｐｒｐ８は、ＲＴ、ＲＬＥ、およびＲＴとＲＬＥの間のリンカー領域を有する。Ｐｒｐ８におけるリンカー領域の末端の方に、非ジンクナックル構造がある。非ジンクナックルの上流には、ＬＩＮＥにおいてジンクナックルの上流に見られるヘリックスとともに整列する一連のヘリックスがある。Ｐｒｐ８における非ジンクナックルの上流のヘリックスは、非常に有望かつ重要なαフィンガーを形成する。αフィンガーは、逆転写酵素を超えて突出している（図１７Ｃを参照されたい）（Ｂｅｒｔｒａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１７）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０７．０１１）。Ｐｒｐ８におけるαフィンガーとの類似性により、ＲＬＥ ＬＩＮＥの対応する領域は、「推定αフィンガー」と呼ばれる（Ｍａｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂ． ＤＮＡ ８， １－１５ （２０１７））。Ｐｒｐ８では、非ジンクナックル、αフィンガーおよびＲＴ親指が一緒に作用して、スプライス部位およびスプライソソームＲＮＡに結合する。非ジンクナックルおよびαフィンガーは、Ｐｒｐ８では動的であり、スプライシング領域の全ての態様にわたってタンパク質およびタンパク質－ＲＮＡ立体構造変化を受ける／促進する。Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５トリｓｎＲＮＰにおいておよびＢ複合体においてαフィンガーおよび非ジンクナックルが重要な分岐型ＲＮＡ構造に結合するという事実は、特に興味深い。

【0130】

本明細書で報告するデータは、Ｒ２Ｂｍリンカーの実際の構造がどんなものであろうと、リンカーが、４方向ジャンクション組込み中間体の認識の中核をなすことを示す。それはまた、ＥＮ、ＲＴおよび基質ＤＮＡを互いに対して正しく配置するためのタンパク質－ＤＮＡ立体構造スイッチまたはハブとして作用する。
ｅ．組込みを維持するための設計上の考慮事項

【0131】

リンカー領域は、重要なＤＮＡ結合領域およびタンパク質－核酸立体構造制御領域である。リンカー領域は、特異的または非特異的接触点を作る。αフィンガーとＩＡＰ／Ｇａｇ様ジンクナックルの両方が、ＤＮＡ切断およびＤＮＡ合成事象をモジュレートする。特に、αフィンガーは、４方向ジャンクションへの結合に関与する。αフィンガーは、５’スプライス部位の中心に位置するＰｒｐ８、多分岐ＲＮＡ構造、のαフィンガーのように、４方向ジャンクションの中心に接触すると考えられる。トランスポゾンαフィンガーも、非特異的接触点に加えて塩基特異的接触点を作る可能性が高い。リンカーはまた、ＬＩＮＥ ＲＮＡへの結合に関与すると考えられる。操作されたＬＩＮＥタンパク質、操作されたＲＮＡ、および標的ＤＮＡを設計する場合、ある特定の標的ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の間の親タンパク質接触を維持すること、または新たに所望されるＤＮＡ／ＲＮＡ接触点を作ることになるようにリンカーを変異させること、どちらかに注意を払わなければならない。
ＩＩＩ．使用方法

【0132】

開示される組成物は、目的のＤＮＡ標的部位に目的の遺伝子を導入するためにｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用することができる。例えば、好ましい実施形態では、操作されたトランスポゾンのＲＮＡ成分およびタンパク質成分が細胞に送達され、またはそうでなければ細胞に発現され、目的の遺伝子が細胞のゲノムの目的のＤＮＡ標的部位に組み込まれる。ＲＮＡ成分をＲＮＡとして送達することができ、またはＲＮＡ成分をコードするＤＮＡ（例えば、発現ベクター）として送達することができる。タンパク質成分をタンパク質として送達することができ、またはタンパク質成分をコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えば、発現ベクター）として送達することができる。一部の実施形態では、タンパク質をコードするベクターが細菌または真核生物発現系に発現され、タンパク質が回収され、標的細胞に送達される。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製され、および／またはタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳により調製される。ＲＮＡおよびタンパク質成分を同じまたは異なるベクターから発現させることができる。
Ａ．ベクターおよび宿主細胞

【0133】

操作されたトランスポゾンを調製するためのベクターおよび宿主細胞も提供される。好適な発現ベクターとしては、限定ではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウィルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来する、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。非常に多くのベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のような会社から市販されている。

【0134】

発現ベクターは、タグ配列を含むことができる。タグ配列は代表的には、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグを、ポリペプチド中の任意の場所、例えば、カルボキシル末端またはアミノ末端のどちらかなどに挿入することができる。有用なタグとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質およびプロテインＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

発現させるべき核酸を含有するベクターを宿主細胞に移入することができる。用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターを導入することができる原核および真核細胞を含むように意図される。本明細書で使用される場合、「形質転換（される／された）」および「トランスフェクト（される／された）」は、多数の技法のうちの１つによる細胞への核酸分子（例えば、ベクター）の導入を包含する。特定の技法に限定されないが、多数のこれらの技法は、当技術分野において十分に確証されている。原核細胞を、例えば電気穿孔または塩化カルシウム媒介形質転換により、核酸で形質転換することができる。核酸を、例えば、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔またはマイクロインジェクションをはじめとする技法により、哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができる。

【0136】

ポリペプチドを発現および産生させるための有用な原核細胞系および真核細胞系は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株、例えばＢＬ－２１、および培養哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。
Ｂ．細胞ゲノムの編集方法

【0137】

方法は代表的には、細胞のゲノムを修飾するために有効量の操作されたトランスポゾンと細胞を接触させるステップを含む。本明細書中で論じられるように、細胞を操作されたレトロトランスポゾンと接触させることは、ＲＮＡ成分とタンパク質成分の両方が同じ細胞内に同時に存在することを意味する。一部の実施形態では、ＲＮＡおよびタンパク質成分は、細胞との接触前に混合される。一部の実施形態では、それらを細胞と別々に接触させ、それらは細胞内で初めて複合体を形成する。一部の実施形態では、成分の一方または両方は、ＤＮＡが細胞内で発現したときに送達される。これらの実施形態のいずれも、細胞への核酸またはタンパク質の送達を助長するための、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の適切なトランスフェクション法の使用を含み得る。

【0138】

下記でより詳細に論じられるように、接触は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。好ましい実施形態では、方法は、治療結果を達成するために有効量の操作されたレトロトランスポゾンと標的細胞の集団を接触させるステップを含む。

【0139】

例えば、有効量または治療有効量は、疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状を処置、阻害もしくは軽減するのに十分な投薬量、またはそうでなければ所望の生理的効果、例えば、疾患もしくは障害の根底にある根本的な病態生理学機序の１つもしくは複数の軽減、阻害もしくは好転を提供するのに十分な投薬量であり得る。

【0140】

製剤は、投与方法に適合するように作製される。薬学的に許容される担体は、一つには、投与される特定の組成物によって決まり、その組成物を投与するために使用される特定の方法によっても決まる。したがって、核酸とタンパク質とを含有する医薬組成物の多種多様な適切な製剤がある。正確な投薬量は、様々な因子、例えば、対象に依存する可変要素（例えば、年齢、免疫系健康状態、臨床症状など）によって変わることになる。
１．ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療

【0141】

一部の実施形態では、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療は、対象における遺伝性障害を含むがこれらに限定されない、疾患または障害の処置に使用される。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療のために、細胞を対象から単離し、ｅｘ ｖｉｖｏで組成物と接触させて、挿入された導入遺伝子を含有する細胞を生じさせることができる。好ましい実施形態では、細胞は、処置される対象からまたは同系宿主（ｓｙｎｇｅｎｉｃ ｈｏｓｔ）から単離される。標的細胞は、操作されたレトロトランスポゾンとの接触の前に対象から除去される。一部の実施形態では、細胞は、造血前駆細胞または幹細胞である。好ましい実施形態では、標的細胞は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞である。ＣＤ３４＋細胞などの造血幹細胞（ＨＳＣ）は、赤血球を含む全ての血液細胞型を生じさせる多能性幹細胞である。したがって、ＣＤ３４＋細胞を、例えば、サラセミア、鎌状赤血球症またはリソソーム蓄積症を有する患者から単離し、開示される組成物および方法を使用して変異型遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏで変更または修復し、処置または治療として細胞を患者に導入し直すことができる。

【0142】

幹細胞は、当業者により単離され、濃縮されることもある。ＣＤ３４^＋および他の細胞のそのような単離および濃縮方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，９６５，２０４号、同第４，７１４，６８０号、同第５，０６１，６２０号、同第５，６４３，７４１号、同第５，６７７，１３６号、同第５，７１６，８２７号、同第５，７５０，３９７号および同第５，７５９，７９３号において開示されている。造血前駆細胞および幹細胞が濃縮された組成物に関して本明細書で使用される場合、「濃縮された」は、細胞の天然源に見られるものより高度に存在する所望のエレメントの集団（例えば、造血前駆細胞および幹細胞）を示す。細胞の組成物は、細胞の天然源よりも、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは１０、１００、２００または１０００桁濃縮され得る。

【0143】

前駆細胞または幹細胞を単離したら、それらを、任意の適切な培地で成長させることにより繁殖させることができる。例えば、前駆細胞または幹細胞を、因子の分泌に関連して骨髄もしくは肝臓から得ることができるものなどの間質細胞からの馴化培地において、または幹細胞の増殖を支持する細胞表面因子を含む培地において、成長させることができる。望ましくない細胞の除去に適切なモノクローナル抗体を利用して、造血細胞から間質細胞を取り除くことができる。

【0144】

修飾細胞を、対象への投与前に、培地で維持することまたは繁殖させることもできる。培養条件は、一般に、細胞型に依存して当技術分野において公知である。

【0145】

他の実施形態では、技術は、ＣＡＲ Ｔに基づく治療の一部として使用される。免疫細胞が回収され（例えば、Ｔ細胞）、患者の血液から採取される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、操作されたトランスポゾンを使用して細胞のゲノムの標的部位に導入される。多数のＣＡＲ Ｔ細胞を研究所で成長させ、注入により患者に投与することができる。ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、いくつかの種類のがんの処置に使用される。
２．ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療

【0146】

開示される組成物をｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のために対象に直接投与することができる。
ａ．医薬製剤

【0147】

開示される組成物は、好ましくは、治療上の使用に適切な医薬担体と組み合わせて利用することができる。そのような組成物は、有効量の組成物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。

【0148】

ｉｎ ｖｉｖｏで投与されたヌクレオチドが細胞および組織に取り込まれ、分配されることは、当業者には理解されよう（Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５５８（１－３）：６９－７３ （２００４））。例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）が、吸入されたとき、内因性サーファクタント（肺細胞により産生される脂質）に結合し、さらなる担体脂質を必要とせずに肺細胞により取り込まれることを示した（Ｎｙｃｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３８５：７２１－７２５ （１９９７））。小さい核酸は、Ｔ２４膀胱癌組織培養細胞に容易に取り込まれる（Ｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， ８：４１５－４２６ （１９９８））。

【0149】

開示される組成物は、適切な医薬担体中の局所、局所性または全身投与用の製剤中に存在することもある。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ （Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９７５）は、代表的な担体および調製方法を開示している。化合物は、細胞に標的化するための、生分解性もしくは非生分解性ポリマーもしくはタンパク質で形成された適切な生体適合性マイクロカプセル、微小粒子、ナノ粒子もしくはマイクロスフェアに、またはリポソームに封入されていることもある。そのような系は、当業者に周知であり、適切な核酸とともに使用するために最適化され得る。

【0150】

核酸送達のための様々な方法が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）において記載されている。そのような核酸送達系は、所望の核酸、例として、限定ではなく、「裸の」核酸としての「裸の」形態での核酸、または送達に適するビヒクルに、例えば、カチオン性分子もしくはリポソーム形成性脂質の複合体に配合された核酸、またはベクターの成分もしくは医薬組成物の成分としての核酸、のいずれかを含む。核酸送達系を、直接、例えば、それを細胞と接触させることにより、細胞に提供することができ、または間接的に、例えば、任意の生物学的プロセスの作用によって、細胞に提供することができる。核酸送達系を、エンドサイトーシス、受容体標的化、ネイティブもしくは合成細胞膜断片とのカップリング、電気穿孔などの物理的手段、核酸送達系とポリマー担体、例えば制御放出フィルムもしくはナノ粒子もしくは微小粒子との併用、ベクターの使用、細胞の周囲の組織もしくは流体への核酸送達系の注射、細胞膜を横断する核酸送達系の単純拡散により、または細胞膜を横断する任意の能動もしくは受動輸送機構により、細胞に提供することができる。加えて、核酸送達系を、ウイルスベクターの抗体関連標的化および抗体媒介固定化などの技法を使用して、細胞に提供することができる。

【0151】

局所投与用の製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、座薬、スプレー、液剤および粉末を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末もしくは油性基剤、または増粘剤を、所望に応じて使用することができる。

【0152】

例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路による投与などの、非経口投与に適する製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にさせる溶質を含有し得る、水性および非水性、等張性無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定剤、および保存薬を含有し得る、水性および非水性無菌懸濁液、溶液またはエマルジョンが挙げられる。注射用の製剤を、必要に応じて保存薬が添加された、例えばアンプル内または複数回投与用容器内の、単位剤形で提供することができる。組成物は、ある特定の実施形態では対象の血液と等張性であり得る、無菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンのような形態をとることができる。非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油、ラッカセイ油、ピーナッツ油、鉱物油、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル、または固定油、例えば合成モノもしくはジグリセリドなどである。水性担体としては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体などが、挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、１，３－ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、水分および栄養補給剤、ならびに電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくものなど）が挙げられる。保存薬および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなども存在することがある。加えて、滅菌固定油が溶媒または懸濁化媒体として従来利用されている。このために、合成モノまたはジグリセリドをはじめとする任意の無菌性固定油を利用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製に使用することができる。担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａで見つけることができる。当業者は、過度の実験に頼ることなく、組成物を調製および製剤化するための様々なパラメーターを容易に決定することができる。

【0153】

単独で、または他の適する成分と組み合わせて、本開示組成物を、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることもできる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）。エアロゾル製剤を、加圧された許容可能な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素および空気に、入れることができる。吸入による投与のために、化合物は、適する噴射剤を使用することで、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー押出の形態で送達される。

【0154】

一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を、製剤成分、例えば、塩、担体、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート剤、充填剤、乾燥剤、抗酸化剤、抗菌剤、保存薬、結合剤、増量剤、シリカ、可溶化剤または安定剤とともに含む。一実施形態では、核酸は、細胞取込み改善するために、Ｃ３２官能基を有する、コレステロール誘導体、ラウリン酸誘導体およびリトコール酸誘導体のような、親油基にコンジュゲートされる。例えば、コレステロールは、ｓｉＲＮＡの取込みおよび血清中安定性を増強することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｌｏｒｅｎｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １４（１９）：４９７５－４９７７ （２００４））およびｉｎ ｖｉｖｏ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４３２（７０１４）：１７３－１７８ （２００４））で実証されている。加えて、ＬＤＬなどの、血流中の種々のリポタンパク質へのステロイドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドの結合は、完全性を保護し、生体内分布を助長することが、示されている（Ｒｕｍｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５９（１１）：１４０７－１４１６ （２０００））。細胞取込みを増加させるために上記の化合物に結合またはコンジュゲートすることができる他の基としては、アクリジン誘導体；架橋剤、例えば、ソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン、およびアジドプロフラビン；人工エンドヌクレアーゼ；金属錯体、例えば、ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン－Ｆｅ（ＩＩ）；アルキル化部分；ヌクレアーゼ、例えば、アルカリホスファターゼ；ターミナルトランスフェラーゼ；抗体酵素；コレステリル部分；親油性担体；ペプチドコンジュゲート；長鎖アルコール；リン酸エステル；放射性マーカー；非放射性マーカー；炭水化物；ならびにポリリシンまたは他のポリアミンが、挙げられる。Ｌｅｖｙらの米国特許第６，９１９，２０８号にも増強送達方法が記載されている。これらの医薬製剤を、それ自体が公知である方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、研和、乳化、カプセル封入、捕捉または凍結乾燥プロセスによって、製造することができる。
ｂ．投与方法

【0155】

一般に、核酸およびタンパク質組成物を投与する方法は、当技術分野において周知である。特に、現在使用されている製剤とともに、核酸治療薬にすでに使用されている投与経路は、上記の操作されたトランスポゾンの好ましい投与および製剤化経路を提供する。好ましくは、組成物は、遺伝子治療を必要とする動物などの、遺伝子操作を受ける生物に注射される。

【0156】

本開示組成物は、経口経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、経皮経路、皮下経路、局所経路、舌下経路、直腸経路、鼻腔内経路、肺内経路を含むがこれらに限定されない多数の経路、および他の好適な手段により、投与することができる。組成物をリポソームによって投与することもできる。そのよう投与経路および適切な製剤は、一般に、当業者に公知である。

【0157】

製剤の投与は、遺伝子編集組成物がそれらの標的に到達することを可能にする任意の許容される方法により果たすことができる。

【0158】

当業者に公知の任意の許容される方法を使用して、対象に製剤を投与することができる。投与は、処置される状態に依存して、限局的（すなわち、特定の領域、生理系、組織、臓器もしくは細胞型への投与）であることもあり、全身的であることもある。

【0159】

注射は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内注射であり得る。一部の実施形態では、注射を複数の位置に投与することができる。移植は、移植可能な薬物送達系、例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリックス、ポリマー系、例えば、マトリックス浸食および／または拡散系、ならびに非ポリマー系、例えば、圧縮、融合もしくは部分融合ペレットを挿入すること含む。吸入は、吸入器内のエアロゾルとともに、単独でのまたは吸収され得る担体に結合されている組成物を、投与することを含む。全身投与については、組成物がリポソームに封入されている方が好ましいこともある。

【0160】

組成物を、薬剤および／またはヌクレオチド送達系の組織特異的取込みを可能にする方法で送達することができる。技法は、組織または臓器局在デバイス、例えば、創傷被覆材または経皮送達系の使用、侵襲的デバイス、例えば、血管または尿道カテーテルの使用、ならびに介入デバイス、例えば、薬物送達能力があり、拡張デバイスまたはステントグラフトとして構成された、ステントの使用を含む。

【0161】

製剤を、生体内分解性移植物を使用して拡散によりまたはポリマーマトリックスの分解により送達することができる。ある特定の実施形態では、製剤の投与を、ある特定の期間、例えば、数時間、数日、数週間、数箇月または数年にわたっての、組成物への連続曝露を生じさせる結果となるように、設計することができる。これは、例えば、製剤の反復投与により、または組成物が反復投与なしに長期間にわたって送達される徐放もしくは制御放出送達系により、果たすことができる。そのような送達系を使用する製剤の投与は、例えば、経口剤形、ボーラス注入、経皮パッチまたは皮下移植物により得る。一部の場合には、組成物の実質的に一定した濃度を維持する方が好ましいこともある。

【0162】

適する他の送達系としては、持続放出、遅延放出、徐放または制御放出送達系が挙げられる。このような系は、多くの場合、反復投与を回避することができ、したがって対象および医師にとっての利便性を増す。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらは、例えば、ポリ乳酸および／もしくはポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、ならびに／またはこれらの組み合わせなどの、ポリマーに基づく系を含む。核酸を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。他の例としては、脂質に基づく非ポリマー系、例えば、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸もしくは中世脂肪、例えばモノ、ジおよびトリグリセリドなど；ヒドロゲル放出系；リポソームに基づく系；リン脂質に基づく系；シラスティック系；ペプチドに基づく系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；または部分融合移植物が、挙げられる。具体的な例としては、オリゴヌクレオチドがマトリックス内の製剤に含有されている浸食系（例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６７５，１８９号、同第５，７３６，１５２号、同第４，６６７，０１３号、同第４，７４８，０３４号および同第５，２３９，６６０号に記載のもの）、または活性成分が放出速度を制御する拡散系（例えば、米国特許第３，８３２，２５３号、同第３，８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号に記載のもの）が挙げられる。製剤は、例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリックス、またはポリマー系として存在することもある。一部の実施形態では、系は、例えば、操作されたトランスポゾンを含有する製剤の拡散または浸食／分解速度の制御によって、組成物の徐放または制御放出が生じることを可能にし得る。加えて、ポンプに基づく機器である送達系を使用して、１つまたは複数の実施形態を送達することができる。

【0163】

放出が一気に起こる系の例としては、ポリマーマトリックスに封入されているリポソームに組成物が捕捉されている系；特定の刺激、例えば、温度、ｐＨ、光または分解酵素に感受性であるリポソーム；およびマイクロカプセルコア分解酵素を伴うイオンコーティングされたマイクロカプセルに組成物が封入されている系が、挙げられる。阻害剤の放出が漸進的および連続的である系の例としては、例えば、マトリックス内にある形態で組成物が含有されている浸食系、および組成物が、例えばポリマーを通って、制御された速度で浸透する、侵出系が、挙げられる。このような徐放系は、ペレットまたはカプセルの形態であり得る。

【0164】

一部の実施形態では、長期放出型移植物の使用が特に適していることがある。本明細書で使用される場合、「長期放出」は、組成物を含有する移植物が、治療有効レベルの組成物を少なくとも３０もしくは４５日間、好ましくは少なくとも６０もしくは９０日間、または一部の場合にはよりいっそう長期間、送達するように構築および構成されることを意味する。長期放出型移植物は、当業者に周知であり、上記の放出系の一部を含む。
ｃ．粘膜および肺内投与のための好ましい製剤

【0165】

活性薬剤およびその組成物を肺内または粘膜投与用に製剤化することができる。投与は、肺、鼻、経口（舌下、頬側）、膣または直腸粘膜への組成物の送達を含み得る。

【0166】

一実施形態では、化合物は、鼻腔内投与または経口吸入などの、肺内送達用に製剤化される。気道は、外気と血流の間でのガス交換に関与する構造である。肺は、ガス交換が起こる肺胞が最終端にある分岐構造である。肺胞の表面積は、呼吸器系の中で最大であり、そこで薬物吸収が行われる。肺胞は、線毛のない薄い上皮、または粘液層によって覆われており、サーファクタントであるリン脂質を分泌する。気道は、中咽頭と喉頭とを含む上気道に続いて下気道を包含し、下気道は、気管、続いて、気管支および細気管支への二分岐を含む。上および下気道は、誘導気道と呼ばれる。終末細気管支は、次いで呼吸細気管支に別れ、次いで、最終呼吸器ゾーンである肺胞、または肺の深部に至る。肺の深部、または肺胞は、全身性薬物送達のために吸入される治療用エアロゾルの一次標的である。

【0167】

低分子量薬から構成されている治療用組成物の肺内投与は、例えば、喘息を処置するためのベータ－アンドロゲンアンタゴニストに見られる。肺において活性である他の治療剤は、全身投与され、肺吸収によって標的化されている。経鼻送達は、以下の理由のため治療薬の投与のための有望な技法であると見なされる：鼻は、非常に多くの微絨毛により上皮が覆われていることから薬物吸収に利用可能な大きい表面積を有する；上皮下層は、血管に富んでいる；静脈血は、鼻から直接全身循環に進むため、肝臓における初回通過代謝による薬物の損失を回避する；経鼻送達は、より低い用量、治療薬血中レベルのより急速な到達、薬理学的活性のより迅速な開始、より少ない副作用、ｃｍ^３（多孔性上皮基底膜）当たりの高い総血流量をもたらす；および経鼻送達は、利用しやすい。

【0168】

本明細書で使用される場合のエアロゾルという用語は、溶液または懸濁液の状態であり得る、粒子の霧状ミストの任意の調製物を、それが噴射剤を使用して生成されるか否かを問わず、指す。エアロゾルは、超音波または高圧処理などの標準的技法を使用して生成することができる。

【0169】

肺用製剤のための担体は、ドライパウダー製剤のためのものと、溶液としての投与のためのものに分けることができる。治療剤を気道に送達するためのエアロゾルは、当技術分野において公知である。上気道経由での投与のための製剤を、滴剤としてのもしくはスプレーとしての鼻腔内投与のために、緩衝されたまたは未緩衝の溶液、例えば水もしくは等張食塩水に添加して製剤化すること、または懸濁液として製剤化することができる。好ましくは、そのような溶液または懸濁液は、鼻分泌物に対して等張であり、ほぼ同じｐＨ、例えば、約ｐＨ４．０～約ｐＨ７．４、またはｐＨ６．０～ｐＨ７．０の範囲のｐＨである。緩衝剤は、生理学的に適合性であるべきであり、単なる例としてリン酸緩衝液を含む。例えば、代表的な鼻充血除去薬は、約６．２のｐＨに緩衝されていると記載されている。当業者は、経鼻および／または上気道投与用の非侵害性水溶液についての適切な塩分量およびｐＨを容易に決定することができる。

【0170】

好ましくは、水溶液は、水であるか、塩および／もしくは緩衝剤を含有する生理学的に許容される水溶液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であるか、または動物もしくはヒトへの投与に許容される任意の他の水溶液である。そのような溶液は、当業者に周知であり、蒸留水、脱イオン水、純または超純水、食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含むが、これらに限定されない。他の適する水性ビヒクルとしては、リンゲル液および等張塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。水性懸濁液は、懸濁化剤、例えば、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびトラガカントゴム、ならびに湿潤剤、例えばレシチンを含み得る。水性懸濁液のための適する保存薬は、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｐ－ヒドロキシ安息香酸ｎ－プロピルを含む。

【0171】

別の実施形態では、低毒性有機（すなわち、非水性）クラス３残留溶媒である溶媒、例えば、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、エチルエーテルおよびプロパノールが、製剤に使用され得る。溶媒は、製剤を容易にエアロゾル化するその能力に基づいて選択される。溶媒は、化合物と有害に反応してはならない。化合物を溶解する、または化合物の懸濁液を形成する、適切な溶媒を使用するべきである。溶媒は、溶液または懸濁液のエアロゾルの形成を可能にするのに十分なほど揮発性であるべきである。溶液または懸濁液の揮発度を高めるために、所望に応じて、追加の溶媒またはエアロゾル化剤、例えばフレオンを添加することができる。

【0172】

一実施形態では、組成物は、少量の、当業者に周知のポリマー、界面活性剤または他の賦形剤を含有し得る。この文脈での「少量」は、肺内への化合物の取込みに影響を与え得るまたは取込みを媒介し得る賦形剤が存在しないこと、および存在する賦形剤が、肺内への化合物の取込みに悪影響を与えない量で存在することを意味する。

【0173】

ドライ脂質パウダーは、それらの疎水性のため、エタノールに直接分散させることができる。クロロホルムなどの有機溶媒中で保存する脂質については、所望される量の溶液がバイアルに入れられ、窒素を流しながらクロロホルムが蒸発されてガラスバイアルの表面に乾燥薄膜を形成する。この薄膜は、エタノールでの再構成時に容易に膨潤する。脂質分子を有機溶媒に完全に分散させるために、懸濁液が超音波処理される。脂質の非水性懸濁液を、再使用可能なＰＡＲＩ ＬＣ Ｊｅｔ＋ネブライザー（ＰＡＲＩ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｏｎｔｅｒｅｙ、ＣＡ）を使用して無水エタノールで調製することもできる。
Ｃ．処置される疾患

【0174】

本開示操作されたトランスポゾンは、単一遺伝子の変異により引き起こされる遺伝的欠損、遺伝性障害および疾患の処置に、例えば、点変異により引き起こされる遺伝的欠損、遺伝性障害および疾患の修正に、特に有用である。標的遺伝子が、遺伝性障害の原因である変異を含有する場合には、本開示組成物を、標的遺伝子のＤＮＡ配列を正常に回復させることができる変異性修復に使用することができる。標的配列は、遺伝子のコードＤＮＡ配列内にあることもあるか、またはイントロン内にあることがある。標的配列は、標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列、例えばプロモーターまたはエンハンサー配列など、の中にあることもある。本開示トランスポゾンは、加えてまたは代替的に、目的の遺伝子の野生型もしくは同等のおよび強化されたバージョンを細胞に送達することができ、または新たな（例えば、異種）遺伝子を細胞に送達することができる。したがって、この技術は、遺伝子を修復もしくは置換することができ、遺伝子を補完することができ、または新たな遺伝子を加えることができる。

【0175】

標的遺伝子が、無秩序な増殖を、例えばがん細胞において、引き起こすがん遺伝子である場合には、操作されたトランスポゾンは、遺伝子を不活性化するおよび細胞の無制御な増殖を終結または低減させる変異を引き起こすのに有用である。操作されたトランスポゾンは、増殖を抑制するその能力を喪失したリプレッサー遺伝子を活性化するための有用な抗がん剤でもある。標的遺伝子は、がんに対する宿主の免疫応答を増強するために、免疫調節因子、例えばＰＤ－１、をコードする遺伝子であることもある。したがって、操作されたトランスポゾンを、ＰＤ－１の発現を低減させるまたは防止するように設計することができ、低減させるまたは防止するのに有効な量で投与することができる。

【0176】

操作されたトランスポゾンを、例えば、ウイルスの適切な増殖または機能に必要なウイルスゲノムの特定の部分を修飾するように設計すると、抗ウイルス剤として使用することができる。

【実施例】

【0177】

Ｍｕｈｂｕｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ （２０１７） ８：１６ ＤＯＩ １０．１１８６／ｓ１３１００－０１７－００９７－９は、特に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例１）
Ｒ２タンパク質は非特異的線状ＤＮＡよりも非特異的４方向ジャンクションＤＮＡに優先的に結合する。
材料および方法
タンパク質精製

【0178】

Ｒ２Ｂｍタンパク質発現および精製は、以前に発表されたように行った（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６））。手短に述べると、Ｒ２発現プラスミドを含有するＢＬ２１細胞をＬＢブロスで成長させ、ＩＰＴＧで誘導した。誘導細胞を遠心分離によりペレット化し、再浮遊させ、リゾチームとトリトンＸ－１００とを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液で穏やかに溶解した。細胞ＤＮＡおよび破壊片を遠心沈降させ、Ｒ２Ｂｍタンパク質を含有する上清をＴａｌｏｎレジン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃６３５５０１）で精製した。Ｒ２Ｂｍタンパク質をＴａｌｏｎレジンカラムから溶出し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５と、１００ｍＭ ＮａＣｌと、５０％グリセロールと、０．１％トリトンＸ－１００と、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）とを含有するタンパク質保存用緩衝液中で保存し、－２０℃で保存した。ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で泳動させた試料のＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｓ５６９２）染色によりＲ２タンパク質を定量した後、保存のためにＢＳＡを添加した。全ての定量は、デジタル写真のＦＩＪＩソフトウェア解析（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９， ６７６ （２０１２））を使用して行った。
核酸調製

【0179】

２８Ｓ Ｒ２標的ＤＮＡ配列、非標的（非特異的）ＤＮＡ配列およびＲ２配列を含有するオリゴを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから取り寄せた。上流（２８Ｓｕ）および下流（２８Ｓｄ）標的ＤＮＡという呼称は、２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内のＲ２挿入二分染色体を基準とする。オリゴ配列を表１で報告する。

【0180】

全ての線状ＤＮＡは、長さ５０ｂｐであった。３方向および４方向ジャンクションの大部分についての各アームは、第２鎖合成生成物を観察するために２８Ｓ ＤＮＡアーム長を戦略的に変えたｃＤＮＡ合成について試験したジャンクションを除いて、長さ２５ｂｐであった。構築物の略図を主要な図において提供する。２８Ｓｄ配列を有するオリゴは、２８Ｓ ｒＤＮＡのＲ２挿入部位後の２５ｂｐまたは４７ｂｐどちらかを含有した。挿入部位に及ぶように上流配列の７塩基対もこれらの「下流」オリゴに含めた。２８Ｓｕ配列を有するオリゴは、挿入部位の前の７２ｂｐ、および２８Ｓ ｒＤＮＡのＲ２挿入部位後の５ｂｐも含有した。最大のオリゴは、２８Ｓ ｒＤＮＡの上流の７２ｂｐおよび下流の４７ｂｐを含有した。いくつかのオリゴは、３’ＲＮＡまたは５’ＲＮＡのどちらかに相補的な２５ｂｐの配列を組み込んだ。Ｒ２Ｂｍの最初および最後の２５ｂｐに対応する配列のより短いオリゴ（２５ｂｐ）も、構築物の多くに使用した。非特異的４方向ジャンクションのｘ、ｈ、ｂおよびｒ鎖についての配列は、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｂｏｎｄ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２， ５４４２ （２００４））から得た。構築物を、成分オリゴアニーリング手順により形成した：２０ｐｍｏｌの標識オリゴを６６ｐｍｏｌの各低温オリゴと混合した。プライマーをＳＳＣ緩衝液（１５ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中で、２分間９５℃で、続いて１０分間６５℃で、１０分間３７℃で、そして最後に１０分間、室温でアニーリングした。成分オリゴの１つに５’３２Ｐ末端標識を施した後、他の成分オリゴをアニーリングした。アニーリングされたジャンクションを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ゲル溶出用緩衝液（０．３Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５％ＳＤＳおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）で溶出し、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡに再浮遊させた。共通の標識オリゴを共有するジャンクションを、ＤＮＡ数が等しくなるようにし、そうでなければ精製された構築物の等体積をＲ２反応に一般に使用した。Ｒ２ ３’ＰＢＭ ＲＮＡ（２４９ｎｔ）、５’ＰＢＭ ＲＮＡ（３２０ｎｔ）、および非特異的ＲＮＡ（１８０ｎｔ）は、以前に発表されたようなｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成した（Ｇａｓｉｏｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５７， １３８３ （２００６））。
Ｒ２Ｂｍ反応および分析

【0181】

Ｒ２タンパク質および標的ＤＮＡ結合および切断反応は、主として、以前に報告されたように実行した（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６））。手短に述べると、各ＤＮＡ構築物を、５’ＰＢＭ ＲＮＡ、３’ＰＢＭ ＲＮＡおよび非特異的ＲＮＡの存在および非存在下でＲ２タンパク質に結合するおよびＤＮＡ切断を受けるその能力について試験した。全ての反応物は、過剰な低温コンペティターＤＮＡであるｄＩｄＣを含有した。反応物を分析のために電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）ゲルおよび比較変性ゲル上に負荷した。分岐型および線状ＤＮＡに結合する能力をＥＭＳＡゲルから得、ＤＮＡを切断する能力および切断位置を変性尿素ゲルから得た。切断のマッピングを補助するために変性ゲルでの反応と並行してＡ＋Ｇラダーを泳動させた。第２鎖合成アッセイは、ＲＮＡの非存在下でＤＮＡ切断反応にｄＮＴＰを加えることによって実行した。全てのゲルを乾燥させ、ホスフォイメージャースクリーンに曝露し、ホスフォイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ＳＴＯＲＭ ８４０）を使用してスキャンした。得られた１６ビットＴＩＦＦ画像を、最も強いバンドが暗灰色になるように線形補正した。補正されたＴＩＦＦファイルを、ＦＩＪＩを使用して定量した（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９， ６７６ （２０１２））。

【0182】

表１．線状およびジャンクションＤＮＡを構築するために使用したＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドを提示する表。「Ｃｏｍｐ」は、相補鎖を表す。

【表1-1】

【表1-2】

結果

【0183】

ホリデイジャンクションリゾルバーゼは、４方向ＤＮＡジャンクション（ホリデイジャンクション）に結合し、それを対称に切断し、その結果、ジャンクションを線状ＤＮＡに分解した。ホリデイジャンクションリゾルバーゼは、ＤＮＡ配列ではなくＤＮＡ構造を認識する。古細菌ホリデイジャンクションリゾルバーゼと構造相同性およびアミノ酸配列相同性を共有するＲ２ ＲＬＥは、同様のＤＮＡ結合および切断活性を提示し得る。

【0184】

４方向ＤＮＡ分岐型構造を認識し、それに結合するＲ２タンパク質の可能性を、非特異的線状および非特異的４方向ジャンクションＤＮＡに対するＲ２タンパク質の相対結合能力を－個々におよび競合的に－比較することにより試験した（図２Ａ～２Ｂ）。線状およびジャンクションＤＮＡは、相補的オリゴをアニーリングすることにより形成した。線状およびジャンクションＤＮＡは、アニーリング前に放射活性物質で標識した共通のＤＮＡオリゴを共有した。共通の標識ＤＮＡ鎖を共有することにより、放射能減衰カウントを、線状ＤＮＡとジャンクションＤＮＡ間のＤＮＡ濃度を均等化するためのプロキシとすること、および類似のＤＮＡ配列をプローブすることが可能になった。ＤＮＡ結合を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により分析した。ＲＮＡの非存在下（図２Ａ～２Ｂ）では、Ｒ２タンパク質は、タンパク質濃度系列にわたって個々に検査したときに非特異的線状ＤＮＡと非特異的４方向ジャンクションＤＮＡの両方にほぼ等しい効率で結合した。しかし、競合結合反応では、Ｒ２タンパク質は、線状ＤＮＡよりも４方向ジャンクションへの結合の明確な優先性を有した。ジャンクションＤＮＡは、より多数の全塩基対（１００ｂｐ；各アームは２５ｂｐである）を含有したが、線状ＤＮＡは、より少なかった（５０ｂｐ）ことに留意されたい。しかし、Ｒ２タンパク質は、ジャンクションＤＮＡの大部分が結合し終えるまで線状ＤＮＡに結合しなかったので、ＤＮＡ「長」の差（２倍より大きい差）が、競合反応において観察される結合親和性に対して有意な影響を与えた可能性は低い。

【0185】

線状ＤＮＡとジャンクションＤＮＡの両方についての泳動パターンは、近似していた。シグナルの一部分がウェルに詰まり、ウェルからゲル中のかすかなタンパク質－ＤＮＡ複合体へと下に延びるスメアを伴った。線状およびジャンクションＤＮＡについてのゲル泳動タンパク質－ＤＮＡ複合体は、ゲル内のほぼ同じ位置に泳動した。線状ＤＮＡの場合、スメアは、ウェルから遊離ＤＮＡまでずっと続いた。泳動パターン、特に、ジャンクションＤＮＡに結合したＲ２タンパク質の泳動パターンは、ＤＮＡ切断前にＲＮＡの非存在下でそれ自体の標的ＤＮＡに結合したＲ２タンパク質の泳動パターンと同様であった（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３６， １０３５ （２００４））。

【0186】

非特異的ＲＮＡ（ｎｓＲＮＡと略記する）の存在下で、Ｒ２タンパク質は、やはりジャンクションＤＮＡに優先的に結合し、ＲＮＡの非存在下でも同様であった。この場合もやはり、ウェルからゲル中の主要複合体へと延びるスメアがあった。ジャンクションおよび線状タンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体は、ゲル内の同様の、しかし明確に異なる位置へと泳動した。Ｒ２ ３’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下で、Ｒ２タンパク質は、ジャンクションＤＮＡに結合し、非特異的ＲＮＡに関してもほぼ同様であり、この場合もやはり、４方向ジャンクションＤＮＡの方が非特異的線状ＤＮＡより優先された。興味深いことに、５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下では、挙動が異なった（次の節を参照されたい）。
（実施例２）
３’ＰＢＭ ＲＮＡではなく５’ＰＢＭ ＲＮＡは、非特異的４方向ＤＮＡジャンクションへの結合を阻害する。

【0187】

４方向ジャンクションＤＮＡに結合するＲ２タンパク質を、非特異的ＲＮＡ、３’ＰＢＭ ＲＮＡ、および５’ＰＢＭ ＲＮＡの様々なＲＮＡ濃度にわたって直接比較するためのアッセイを設計した。各ＲＮＡ滴定セットについて、使用したタンパク質の量は、ＲＮＡを欠いている反応でジャンクションＤＮＡの大部分に結合するのに十分な量であった。一般に、３つのＲＮＡのいずれの添加も、材料をウェルから引き出し、ゲルに引き入れた。Ｒ２ ＲＮＡは、材料をウェルから引き出し、ゲルに引き入れる効率がより高かった。同様の現象は、Ｒ２タンパク質がその通常の（線状）２８Ｓ標的ＤＮＡにＲ２ ＲＮＡの存在下で結合されたときに観察される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １７６０２ （２００６）， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３６， １０３５ （２００４））。線状２８Ｓ標的ＤＮＡへの結合とは異なり、５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在は、４方向ジャンクションＤＮＡへのＲ２タンパク質の結合を大きく阻害した。５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在のみがジャンクションＤＮＡへのＲ２タンパク質の結合に大きな影響を与え、阻害は５’ＰＢＭ ＲＮＡ濃度に対応した。非特異的線状ＤＮＡおよび３方向ジャンクションへの結合は、５’ＲＮＡの存在による影響をあまり受けなかったが、それでもやはり、その存在下で低減された。この阻害は、下流２８Ｓ ｒＤＮＡ配列がＤＮＡ構築物のいずれかに存在する場合、観察されない（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３， ６４６１ （２００５）， Ｚｉｎｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １１０， ２５０ （２００５））。
（実施例３）
Ｒ２タンパク質は非特異的４方向ジャンクションＤＮＡを分解しない。

【0188】

ＲＮＡの非存在下で様々なタンパク質濃度にわたって非特異的線状および非特異的４方向ジャンクションに結合したＲ２タンパク質の反応からのＤＮＡを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＤＮＡ切断現象について分析した。ジャンクションおよび線状ＤＮＡの各鎖を、異なるＤＮＡ鎖の５’末端を逐次的に放射性同位体で標識することにより、ＤＮＡ切断事象について独立して追跡した。ランダム低強度バックグラウンド切断の複雑なパターンが、特にタンパク質過剰の場合に発生した。Ｒ２タンパク質が過剰に存在した場合、同様のバックグラウンド切断事象が、ＲＮＡの非存在下でその正常な２８Ｓ標的ＤＮＡに結合したＲ２タンパク質について発生した。非特異的ジャンクションに対するバックグラウンド切断は、同じ配列の線状ＤＮＡ内の同一の位置で切断が起こるので、構造により駆動されるものではなかった。３つのＲＮＡ（５’ＰＢＭ ＲＮＡ＞３’ＰＢＭ ＲＮＡ＞非特異的ＲＮＡ）のいずれについての存在も、ランダムバックグラウンドＤＮＡ切断を消失させた。
（実施例４）
線状標的ＤＮＡおよびＴＰＲＴ生成物は第２鎖切断の不良な基質である。

【0189】

Ｒ２Ｂｍは、２８Ｓ ｒＤＮＡの特定の部位に挿入される。挿入部位の下流の標的配列に結合されたタンパク質サブユニットが、第２鎖（すなわち、トップ鎖）ＤＮＡ切断に関与するエンドヌクレアーゼを提供することが分かった。しかし、第２鎖切断は、今に始まったことではないが達成および研究するのが難しかった。これまで、第２鎖切断は、狭い範囲の５’ＰＢＭ ＲＮＡ、Ｒ２タンパク質およびＤＮＡ比を必要とした。以前のデータは、第２鎖が切断され得る前に第１鎖ＤＮＡ切断がほぼ確実に必要とされること、下流サブユニットがＤＮＡに結合されなければならない（これは、５’ＰＢＭ ＲＮＡを必要とする）こと、および次いで、第２鎖切断が起こるために５’ＰＢＭ ＲＮＡが下流サブユニットから解離しなければならないことを示した。ｉｎ ｖｉｖｏでは、完全長Ｒ２ ＲＮＡに関して、ＴＰＲＴプロセスは、５’ＰＢＭ ＲＮＡを下流サブユニットから取り出し、その結果、下流サブユニットを「ＲＮＡ非結合」状態にし、ひいては第２鎖ＤＮＡ切断を開始させると考えられることになる。

【0190】

Ｒ２タンパク質が、ＲＮＡの非存在下で分岐型ＤＮＡに結合することができることを考慮して、ＲＮＡの非存在下でＤＮＡを切断する下流サブユニットの能力におけるＤＮＡ構造の役割を調査した。下流サブユニットに関連する活性を単離するために、ＤＮＡ構造は、上流に結合するＲ２タンパク質サブユニットの結合部位ではなく下流Ｒ２タンパク質サブユニットの結合部位を含有した。上流ＤＮＡ配列を、前の図に使用した４方向ジャンクションに由来する非特異的ＤＮＡに置き換えた。下流２８Ｓ ＤＮＡを含有する線状ＤＮＡは、第１鎖ＤＮＡ切断事象の存在または非存在にかかわらず、第２鎖切断の基質ではなかった（図２、構築物ｉｉｉおよびｉｖ）。Ｒ２タンパク質により切断され得るＴＰＲＴ後アナログ（構築物ｖ）も、基質ではなかった。ＴＰＲＴアナログは、ＴＰＲＴ反応から考えると、第１（ボトム）鎖切断部位ですでに切断されており、Ｒ２エレメントの３’末端に対応するｃＤＮＡ配列に共有結合で連結されている、下流２８Ｓ ＤＮＡを含有する３方向ジャンクションであった。構築物のｃＤＮＡ部分にアニーリングしたのは、２５ｂｐのＲ２ ＲＮＡまたは同じ２５ｂｐのＤＮＡバージョンのどちらかであった。Ｒ２Ｂｍタンパク質は、これらの３方向ジャンクションのトップ鎖を切断することができなかった。Ｒ２ ３’配列含有アームが、ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖の形態であるか、ＤＮＡ二重鎖の形態であるかは、問題ではなかった。
（実施例５）
特定の４方向ジャンクションがＲ２タンパク質により切断される。

【0191】

線状およびＴＰＲＴ－ジャンクション（図３、構築物ｉｉｉ～ｖ）ＤＮＡとは異なり、標的配列とＲ２配列とを含む４方向ジャンクションは、Ｒ２タンパク質により切断され ることが判明した（図３、構築物ｖｉｉｉ）。構築物ｖｉｉｉは、ＴＰＲＴ－ジャンクション（構築物ｖ）に類似していたが、追加のアームである５’Ｒ２アームを有した。Ｒ２ ５’アームとＲ２ ３’アームは、両方とも、長さ２５ｂｐであり、ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖からなった。構築物ｖｉｉｉは、ｃＤＮＡと標的ＤＮＡ間の提案されている会合を模倣する。Ｒ２Ｂｍ ｍＲＮＡの５’末端は、上流標的ＤＮＡに対応するｒＲＮＡ配列を含有すると考えられている（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６６４４１ （２０１３）， Ｓｔａｇｅ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １０， Ｒ４９ （２００９）， Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２， １５５５ （２００４）， Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０， ２１３ （２０００））。したがって、逆転写されたｃＤＮＡは、標的のトップ鎖とハイブリダイズして４方向ジャンクションを形成することができた。同じジャンクションの完全に共有結合によって閉環した全てのＤＮＡバージョンを、より低い程度にだが、切断することもでき（図３、構築物ｖｉを参照されたい）、Ｒ２ ３’アームを欠いている構築物を切断することもできた（構築物ｖｉｉ）。
（実施例６）
第２鎖ＤＮＡ切断のさらなる探究。

【0192】

第２鎖切断についての構造上の必要要件をさらに詳しく調査するために、図３構築物ｖｉｉｉの多数の構造バリアント（すなわち、部分的ジャンクション）を切断性について試験した（図４Ａ～４Ｂ、構築物ｉ～ｖｉｉｉ）。図３構築物ｖｉｉｉは、２８Ｓ下流アームの長さを、図３構築物ｖｉｉｉで使用した元の２５ｂｐではなく４７ｂｐに増加させたことを除き、図４Ａ構築物ｉと同一である。この調整は、図４Ａ～４Ｂ構築物中の下流ＤＮＡを、以前の公表文献（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ３２７６ （２０１６））で使用された過去の線状ＤＮＡ構築物に含まれていた下流ＤＮＡの量と一致させるためのものであった。部分的ジャンクション（図４Ａ～４Ｂ、ジャンクションｉｉ～ｖｉｉｉ）の切断性を試験した理由は、結合および切断反応において少ないが存在する夾雑部分的ジャンクションに起因した可能性がある図３で観察されたＤＮＡ切断シグナルが、あったとすれば、どの程度あるのかを判定するためであった。それは、ＲＮＡ成分の細胞による除去を模倣する構築物（例えば、細胞ＲＮａｓｅによる；構築物ｖｉ～ｖｉｉｉ）が、Ｒ２タンパク質により切断される点で無傷ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖を有する構築物より向上したのか、または悪化したのかを判定するためでもあった。部分的ジャンクション（複合体ｉｉおよびｉｉｉ）のうちのいくつかは、切断され得、したがって、完全ジャンクション（複合体ｉ）を含有する反応における全切断にある程度寄与する可能性があるように見えた。両方のＲＮＡ成分を欠いていた４方向ジャンクション（複合体ｖｉ）は、ほぼ切断不能であった。これは、二本鎖Ｒ２アームの必要性を示す。５’末端ＲＮＡを欠いてたが３’末端ＲＮＡを含有した４方向ジャンクション（構築物ｖｉｉ）も、感知可能に切断することができなかった。これは、Ｒ２ ５’アームにおけるＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖の存在の重要性を示す。３’末端ＲＮＡを欠いていたが５’末端ＲＮＡを含有した４方向ジャンクション（構築物ｖｉｉｉ）は、良好に切断した。実際、それは、構築物ｉよりも効率的に切断された。これは、Ｒ２ ３’アーム内の二重鎖の存在が、ある程度阻害性であること、しかし５’アーム内の二重鎖の存在が刺激性であることを示す。

【0193】

第２鎖ＤＮＡ切断に対する上流標的配列の相対的重要性を調査するために、７３ｂｐの上流２８Ｓ ＤＮＡを４方向ジャンクションに組み入れた（図４Ｃ～４Ｄ；構築物ｉｉ～ｉｖ）。構築物ｉｉでは、４７ｂｐの下流２８Ｓ ＤＮＡを非特異的ＤＮＡで置換し、構築物ｉｉｉは、全標的ＤＮＡ配列（７３ｂｐの上流２８Ｓ ＤＮＡおよび４７ｂｐの下流２８Ｓ ＤＮＡ）を含有した。構築物ｉｉを、前の図の場合と同様に下流標的ＤＮＡを含有したが上流のものを含有しなかった構築物ｉよりもはるかに低い効率でだが、切断することができた。構築物ｉｉを切断することができるという事実は、恐らく、構築物ｉと構築物ｉｉの両方に共通の１２ｂｐ（ＤＮＡの上流の７ｂｐおよび下流の５ｂｐ）が、ＤＮＡ切断の指示の助長に関与し得ることを示す。逆説的に、全標的配列を含有する構築物ｉｉｉは、構築物ｉｉと比べても切断される効率が低かった。鋳型ジャンプ中に起こると考えられる、フラップの付加、または鎖の移動（構築物ｉｖ）は、ジャンクションの切断性を著しく増大させた。
（実施例７）
第２鎖切断はｄＮＴＰの存在下で第２鎖合成に至る。

【0194】

第２鎖切断が第２鎖合成に進むことができるかどうかを試験するために、ｄＮＴＰをＤＮＡ切断反応に加えた。第２鎖合成について試験するために使用した構築物は、図４Ａ～４Ｂの構築物ｉであった。これは、比較的良好に切断した。様々なＲ２タンパク質濃度を使用し、変性（図５）および非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により反応を分析した。４方向ジャンクションの標識鎖は、非切断７２ｎｔであり、第２鎖ＤＮＡ切断時には長さ２４ｎｔであった（変性ゲル上にＳＳＣと記した）。第２鎖合成（ＳＳＳ）、すなわち、ＤＮＡ切断後の標識鎖の伸長は、変性ゲルで分析すると５０ｎｔ生成物を生成することになる。第２鎖ＤＮＡ合成は、変性ゲルにおいてタンパク質滴定系列の上端部でのみ観察された。この理由は、未変性（ＥＭＳＡ）ゲルで明らかになる。切断されると、４方向ジャンクションは、下流アームとＲ２ ３’アームとを含有する１つのＤＮＡ、および「上流」アームとＲ２ ５’アームとを含有する１つのＤＮＡである、２つの線状ＤＮＡに分解される。Ｒ２タンパク質は、ＤＮＡ切断後に下流２８Ｓ ＤＮＡを含有するＤＮＡに結合したままであるよう見えたが、非特異的「上流」ＤＮＡを含有するＤＮＡを伴うＤＮＡは遊離された。遊離ＤＮＡプライマー－鋳型は、タンパク質が過剰に存在する場合にのみＲ２ ＲＴにより伸長される。第２鎖切断および第２鎖合成の生成物の泳動位置をＥＭＳＡゲルの隣に示す。

【0195】

ｄＮＴＰの存在下、変性ゲル上での完全長オリゴより高いシグナルは、Ｒ２により伸長される元の完全長オリゴに起因する。ｉｎ ｃｉｓまたはｉｎ ｔｒａｎｓで鋳型を与えると、Ｒ２は、ほぼあらゆる３’末端を捕らえ、伸長させることができる（Ｂｉｂｉｌｌｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９， １４９４５ （２００４）， Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１６， ４５９ （２００２））。
（実施例８）
すでに切断されているＤＮＡ構築物における第２鎖合成。

【0196】

プライマー－鋳型は、上流ＤＮＡが４方向ジャンクションに存在しない場合、タンパク質－ＤＮＡ複合体から遊離されるが、これは、全標的配列を含有するジャンクションではｉｎ ｖｉｖｏで起こらないと考える人もいるだろう。一つには、そう考えるのは、下流サブユニットが第２鎖合成を実行すると考えられているからである（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， ６６１７ （２００５））。残念なことに、全標的配列を有するジャンクションは、あまり切断されず（図４Ｃおよび４Ｄ）、第２鎖合成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験したとき検出レベル未満である。この理由から、第２鎖切断後アナログを生成した。第２鎖切断生成物ともに繋留された状態に保つために、Ｒ２ ３’および５’末端「ＲＮＡ」を共有結合で連結させたが、ＲＮＡの代わりに便宜上ＤＮＡを使用した。第２鎖切断生成物を含有する上流２８Ｓ ＤＮＡは、繋留された立体配置でプライマー伸長（すなわち、第２鎖合成）を経ることができる。５’末端ｃＤＮＡ鎖を鋳型として使用した（図６Ａ）。

【0197】

どのＲ２タンパク質サブユニットが第２鎖合成に使用されるのかを判定するために、線状の（図６Ｂ、複合体ｉｖおよびｖ）および繋留された（図６Ｂ、複合体ｉおよびｉｉｉ）第２鎖切断後生成物を、第２鎖合成を経るそれらの相対的な能力について試験した（図６Ｃ）。結果は、第２鎖切断に関与する４方向ジャンクションに結合されたサブユニットと一致する。複合体ｉｉｉは、第２鎖合成の最も効率の高い基質であり、複合体は、最も効率の低い基質であった。
（実施例９）
ＨＩＮＡＬＰおよびＣＣＨＣモチーフのコア残基の変異は、標的ＤＮＡ結合に影響を与え、ＤＮＡ切断特異性の喪失をもたらす。
材料および方法
変異

【0198】

リンカー領域の推定αフィンガー（ＨＩＮＡＬＰモチーフ領域）およびジンクナックル（ＣＣＨＣモチーフ領域）の役割を調査するために、多数の二重点変異体を生成した（図８Ｂ）。推定αフィンガー領域の変異は、ＧＲ／ＡＤ／Ａ、ＶＨ／ＡＴＨ／Ａ、Ｈ／ＡＩＮ／ＡＬＰ、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａを含んだ。Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰおよびＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異は、野生型（ＷＴ）タンパク質と比較して回収される可溶性タンパク質を低減させる結果となった。ＶＨ／ＡＴＨ／Ａ変異は可溶性タンパク質を生じさせなかったので、それをこの研究から除外した。ジンクナックル領域の変異は、Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ、ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａ、Ｅ／ＡＴ／ＡＴ、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａであった（図８Ｂ）。Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ変異は、野生型（ＷＴ）タンパク質と比較して回収される可溶性タンパク質の大幅に低減させる結果となった。Ｅ／ＡＴ／ＡＴ変異は使用可能な量のタンパク質を生じさせなかったので、それをこの研究から除外した。
タンパク質および核酸調製

【0199】

タンパク質は、以前に発表されたように発現させ、精製した（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４， ３２７６－３２８７ （２０１６））。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＃２００５２３－５）を使用して、ＧＲ／ＡＤ／Ａ、ＳＲ／ＡＩＲ／Ａ、ＳＲ／ＡＧＲ／Ａ、Ｈ／ＡＩＮ／ＡＬＰ、Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ、ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａ、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａ変異体を生成した。５’ＰＢＭ（３２０ｎｔ）、３’ＰＢＭ（２４９ｎｔ）、線状標的ＤＮＡ、および４方向ジャンクションは、以前に発表されたように調製した（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４， ３２７６－３２８７ （２０１６））。
Ｒ２Ｂｍ反応および分析

【0200】

ＤＮＡ結合、第１および第２鎖切断、ならびに第１および第２鎖合成反応は、以前に報告されたように実行した（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４， ３２７６－３２８７ （２０１６））。

【0201】

ＤＮＡ結合アッセイのために、タンパク質を除く全ての成分を含有するマスターミックスを作製し、小分けした。データセットの中の試験する全てのタンパク質にわたって３ｕｌのタンパク質を既知の等化した濃度で添加することにより結合反応を開始させた。二重反復の反応をデータセットごとに用意し、２つの異なるデータセットを各々異なるタンパク質濃度で生成した。ＷＴおよびＷＴ ＫＰＤ／Ａタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ欠損変異についての結合活性参照および陽性対照としての役割をそれぞれ果たした。

【0202】

ＤＮＡ切断アッセイのために、タンパク質およびＤＮＡを除く全ての成分を含有するマスターミックスを作製し、小分けした。タンパク質希釈系列からのタンパク質を５分間、３７℃で放置してＲＮＡに結合させた後、標的ＤＮＡを添加して切断反応を開始させた。反応物を３０分間、３７℃でインキュベートした。反応物を氷上に保持し、次いで、５％未変性（１×Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ）ポリアクリルアミドゲルでおよび変性（８Ｍ尿素）７％ポリアクリルアミドゲルで泳動させた。

【0203】

第１および第２鎖合成反応物は、マスターミックス中の標識標的ＤＮＡを、タンパク質を除く全ての他の成分とともに含んだ。ＤＮＡ切断のない変異体を、正常な切断能力のある変異体とともに試験することができるように、すでに切断されている線状ＤＮＡを使用した。第２鎖合成アッセイのための標的ＤＮＡ基質は、第２鎖がすでに切断されている４方向ジャンクションＤＮＡであった。この基質は、第２章で説明する。切断アッセイと同様に、反応を未変性ポリアクリルアミドゲルと変性ポリアクリルアミドゲルの両方により分析した。

【0204】

全てのゲルを乾燥させ、ホスフォイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ＳＴＯＲＭ ８４０）およびＦＩＪＩ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１２）． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２０１９．Ｆｉｊｉ）を使用して定量した。
結果

【0205】

二重点変異体がＨＩＮＡＬＰ領域において４つ生成され、ジンクナックル領域において４つ生成された。Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰおよびＣ／ＳＣ／ＳＨＣ変異体は、ほぼ同一の表現型を有するように見える。変異の両方のセットは、線状ＤＮＡへのＤＮＡ結合を著しく損なわせ、線状ＤＮＡがＥＭＳＡゲルにおいて正しいＤＮＡ－ＲＮＡ－タンパク質複合体を形成する能力も著しく損なわせる（図９Ａ～９Ｂ）。ウェル複合体、およびウェルから下って遊離ＤＮＡに至る拡散スメアしか、観察されなかった（図９Ａ～９Ｂ）。この観察は、上流結合条件（すなわち、３’ＰＢＭ ＲＮＡの存在）および下流結合条件（すなわち、５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在）の両方に当てはまる。ジンクナックルモチーフのシステインおよびヒスチジン残基は、推定亜鉛配位残基である。Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ変異は、リンカーの局所的ミスフォールディングを促進し得る。Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰ変異も、リンカーのフォールディングに影響を与え得る。

【0206】

３’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下では、Ｈ／ＡＩＮ／ＡＡＬＰおよびＣ／ＳＣ／ＳＨＣ変異体は、挿入部位における第１鎖切断をほとんどまたは全く示さなかった。第２鎖ＤＮＡ切断は、５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下で同様に消失された。部位特異的ＤＮＡ切断ではなく、大量に存在する無差別な切断が、標的ＤＮＡの両方の鎖の異常な部位で観察された。
（実施例１０）
推定αフィンガーの変異は、ＤＮＡ結合、特に、特定の分岐型組込み中間体アナログへのＤＮＡ結合に影響を与える。

【0207】

推定αフィンガーが、上流および／または下流標的ＤＮＡ配列へのタンパク質の固定に関与するかどうかをより良好に判定するために、コアＨＩＮＡＬＰモチーフの周囲の変異を試験した。ＧＲ／ＡＤ／Ａ、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体を、３’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下および５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下で線状標的に結合するそれらの能力について試験した。２つの陽性対照である、ＷＴ Ｒ２タンパク質と、アラニンに変異させたＲＬＥの触媒残基（ＫＰＤ／Ａ）を有するＲ２タンパク質とを使用して、ＤＮＡ切断に影響を与えるかまたは与えないαフィンガー変異（次の節を参照されたい）を適切に制御するために、ＤＮＡ切断をノックアウトしたが、ＤＮＡ結合をノックアウトしなかった。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して、変異体のＤＮＡ結合能力を対照Ｒ２タンパク質と比較してアッセイした（図１０Ａ～１０Ｂ）。二重反復のレーンに負荷し、二重反復の結合反応を実行した。ベクター対照抽出物レーンおよび無タンパク質レーンが、陰性対照レーンとしての役割を果たした。

【0208】

上流標的ＤＮＡ結合は、ＧＲ／ＡＤ／Ａ変異によって中等度に低減（２４％）され、ＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異によって極軽度に低減（１３％）された。しかし、上流標的ＤＮＡ結合活性は、ＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体により３２％まで有意に増加された（図１０Ａ～１０Ｂ）。ＧＲ／ＡＤ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体についての下流標的ＤＮＡ結合活性は、ＷＴ活性と同様であり、約１３％の軽度の減少しか有さなかった。ＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異は、１９～２８％の範囲で結合を減少させた。３つの変異体は全て、タンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体の泳動パターンに、たとえあったとしても、大きい影響を与えないようであったが、より多くのウェル複合体形成がＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異体について観察された（図１０Ａ～１０Ｂ）。ＲＮＡの非存在下で線状標的ＤＮＡに結合する変異体の能力を図１０Ｄに提示する。

【0209】

４方向ジャンクション組込み中間体に結合する変異体の能力も試験した。４方向ジャンクションは、鋳型ジャンプステップ後に２８Ｓ ｒＤＮＡがとる分岐型構造を模倣し、２８Ｓｄ ｒＤＮＡ配列（ノースアーム）、非特異的配列（ウエストアーム）、Ｒ２ ５’末端ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖（サウスアーム）、およびＲ２ ３’末端ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖（イーストアーム）を含有する（図１０Ｃ）（実施例１～８も参照されたい）。４方向ジャンクションＤＮＡを、ウエストアームの５’末端のトップ鎖において放射性同位体で標識した。ジャンクションＤＮＡをＲＮＡの非存在下でＲ２タンパク質とともにインキュベートし、分割量をＥＭＳＡゲルで泳動させた（図１０Ｃ）。上で説明したように定量した後、２つの変異体は、４方向ジャンクションに結合するＲ２タンパク質の能力を有意に、ＳＲ／ＡＩＲ／Ａは６３％およびＳＲ／ＡＧＲ／Ａは４８％、低下させることを示したが、ＧＲ／ＡＤ／Ａ変異体の結合活性は、ＷＴ活性のものと同等であり、１２％の軽度の低下しか示さなかった。
（実施例１１）
推定αフィンガーの変異は第１鎖ＤＮＡ切断を低減させる

【0210】

第１鎖ＤＮＡ切断を実行するＧＲ／ＡＤ／Ａ、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体の能力をアッセイした。Ｒ２タンパク質を３’ＰＢＭに事前に結合させ、次いで、標的ＤＮＡとともにインキュベートした。タンパク質滴定系列を使用した（７つの１：３タンパク質希釈物）。各反応物の分割量をＥＭＳＡゲルでおよび変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲルで泳動させた。標的ＤＮＡをボトム鎖（すなわち、２８Ｓアンチセンス鎖）の５’末端において^３２Ｐで標識し、したがって、この鎖の切断を変性ゲルにおいて追跡することができた。

【0211】

ＥＭＳＡゲルのタンパク質濃度がより高いレーン（最初の２つ）において、ＲＮＡ濃度を一定に保持すると、ＲＮＡの非存在下で見られるものに対応するタンパク質－ＤＮＡ複合体が、ＷＴ、ＧＲ／ＡＤ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体について観察され、タンパク質がＲＮＡ濃度と等価に近づくと、ＤＮＡ－複合体がタンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体とともに出現し、次いで、全てがウェルに詰まった。変異は、ＷＴと比較してタンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体の泳動パターンに大きな影響を与えるようには見えなかった。変異体の各々についての切断活性を、ＥＭＳＡゲルから計算した結合したＤＮＡの割合（ｆ結合）の関数としての、尿素変性ゲルから計算した切断されたＤＮＡの割合（ｆ切断）の散布図として、報告する。ＧＲ／ＡＤ／Ａ変異体は、Ｒ２タンパク質の第１鎖切断活性に影響を与えなかったが、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体は、第１鎖ＤＮＡ切断を受ける結合されたタンパク質の能力を有意に低下させた（図１１）。Ｒ２切断部位を超えての切断は、ＷＴについても変異体についても観察されなかった。
（実施例１２）
推定αフィンガーの変異は第１鎖ｃＤＮＡ合成を低減させる

【0212】

ＨＩＮＡＬＰ領域が、ＴＰＲＴ（第１鎖ＤＮＡ合成）に影響を与えるかどうかを調査するために、第１／ボトム鎖上の挿入部位にニックを有する、すでに切断されている標的ＤＮＡを、３’ＰＢＭ ＲＮＡおよびｄＮＴＰの存在下でＲ２タンパク質とともにインキュベートした（図１２Ａ）。標的ＤＮＡをボトム鎖の５’末端において放射性同位体で標識して、ＴＰＲＴ生成物の形成を追跡した。タンパク質滴定系列にわたっての反応物の分割量を、ＥＭＳＡおよび変性ポリアクリルアミドゲルでアッセイした。Ｒ２タンパク質により結合された標的ＤＮＡの割合（ｆ結合）の関数としてのＴＰＲＴを受けた標的ＤＮＡの割合（ｆ合成）のグラフを図１２Ｂで報告する。ＧＲ／ＡＤ／ＡおよびＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異体は、ＴＰＲＴ活性を完全に消失させた一方で、ＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体は、第１鎖合成活性をおおよそ５０％低下させた（図１２Ｂ）。
（実施例１３）
推定αフィンガーの変異は第２鎖ＤＮＡ切断に影響を与える

【0213】

ＧＲ／ＡＤ／Ａ、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体が第２鎖切断に対して果たす役割を、もしあれば、判定するために、２つの異なる切断アッセイに着手した：（１）５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下での線状標的ＤＮＡに対する、および（２）ＲＮＡの非存在下での４方向ジャンクションＤＮＡに対する切断。線状ＤＮＡに対して、Ｒ２タンパク質は、５’ＰＢＭ ＲＮＡの存在下で挿入部位の下流に結合するが、ＲＮＡが複合体から解離した時点でしか切断しなかった。この解離は、ＲＮＡのタンパク質に対する比が、タンパク質滴定系列にわたって低下する（ＲＮＡを一定に保持する）と起こる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０３， １７６０２－１７６０７ （２００６））。ＥＭＳＡゲルでは、変異体のタンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体の泳動パターンは、ＷＴのものと同様であったが、主要タンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体の真下に位置する第２鎖切断生成物に対応するバンドが、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体については非存在であった。変性ゲルでは、第２鎖切断生成物のシグナルが、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体については見えなかった。非特異的切断は、変異体のいずれについても観察されなかった。ＧＲ／ＡＤ／Ａは、ＷＴ活性を示したが、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体は、Ｒ２タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性をノックアウトして線状標的ＤＮＡの第２鎖の切断を生じさせた（図１３Ａ）。

【0214】

上述の通り、４方向ジャンクション組込み中間体を使用して第２鎖切断活性も試験した（図１３Ｂ）。第２鎖ＤＮＡ切断は、タンパク質が、「ＲＮＡ非」結合状態である場合に起こると考えられており^１６、したがって、ＤＮＡ切断の適切な基質は、鋳型ジャンプにより形成される４方向ジャンクション中間体である。使用したジャンクションＤＮＡの略図を図１０Ｃに示す。ジャンクションＤＮＡをウエストアームの５’末端において放射性同位体で標識して、２８Ｓ ＤＮＡのトップ鎖に対する切断を追跡した。変異体の切断活性を、前の標的ＤＮＡ切断アッセイに関して示したように、しかしＲＮＡの非存在下で、ＷＴと対照して試験した。散布図（図１３Ｂ）に示されているように、４方向ジャンクションＤＮＡの第２鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性は、ＳＲ／ＡＩＲ／ＡおよびＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体により完全にノックアウトされたが、ＧＲ／ＡＤ／Ａ変異体は、ＷＴ切断活性またはそれより良好な活性を示した。
（実施例１４）
推定αフィンガーの変異は第２鎖合成に影響を与える

【0215】

ＨＩＮＡＬＰ変異体の第２鎖切断活性を試験することに加えて、同じ変異体を、第２鎖ＤＮＡ合成活性を試験するために設計した実験に付した。ＤＮＡ切断があまり効率的でないので、すでに切断されているＤＮＡを使用し、上流および下流末端がｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ切断後に分離するので、２つの末端を、イーストアームとサウスアームの間（すなわち、Ｒ２ ５’末端配列とＲ２ ３’末端配列の間）の共有結合性連結によって一緒に保持した（図１４Ａ～１４Ｂの略図を参照されたい）（実施例１～８も参照されたい）。この第２鎖切断後アナログは、以前の研究で開発し、報告した。ＨＩＮＡＬＰ変異体を、この構築物を使用して第２鎖ＤＮＡ合成活性について試験した（図１４Ｃ）。ウエストアームの５’末端を放射性物質で標識して、新たに合成された第２鎖を変性ゲルで可視化した（図１４Ａ～１４Ｂに黒色星印により示されている）。図１４Ｃに示されているグラフは、ＥＭＳＡおよび変性ゲルから、第１鎖合成アッセイについて前に説明したようにして得た。ＧＲ／ＡＤ／Ａ変異体は、最高タンパク質濃度で第２鎖合成量が低下することを除き、よりＷＴのように動作するようである。ＳＲ／ＡＩＲ／Ａ変異は、標的ＤＮＡの約４０％がタンパク質結合状態になるまではよりＷＴのように見えるが、タンパク質濃度の増加に伴って、第２鎖合成が有意に減少する。ＳＲ／ＡＧＲ／Ａ変異体は、図１４Ｃグラフに示されているように第２鎖を合成するＲ２タンパク質の能力を大幅に減少させる。
（実施例１５）
ジンクナックル領域の残基の変異は標的ＤＮＡ切断および第２鎖合成に影響を与える

【0216】

Ｃ／ＳＣ／ＳＨＣ変異体は、標的ＤＮＡ結合および切断に影響を与えることを示したが、ＣＣＨＣ領域の役割を、この領域の３つの追加の二重点変異体：ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａ、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａを用いて、さらに調査した（図８Ｂ）。これらの変異体を、前に説明したようにＤＮＡ切断活性および新たな鎖の合成活性についてアッセイした。

【0217】

３つの変異体全てが、挿入部位で第１鎖を切断するＲ２タンパク質の能力をほんのわずかしか低下させず（図１５Ａ）、それらは、ＴＰＲＴによる第１鎖合成活性に対していかなる影響も与えないようであった（図１５Ｂ）。ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａ、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａ変異体は、第１鎖切断および合成についてはほぼＷＴであったが、これらの変異体のうちの少なくとも２つ、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａは、線状ＤＮＡに対する第２鎖切断活性を有意に消失させた（図１５Ｄ）。挿入部位における第２鎖切断活性の低下に加えて、ＲＴ／ＡＨ／Ａ変異体のエンドヌクレアーゼが線状標的のトップ鎖を隣接部位で切断することも判明した。変異体の第２鎖切断活性も４方向ジャンクション標的ＤＮＡを使用して試験したが、３つの変異体全てがＷＴ活性を示した（図１５Ｃ）。さらにこの場合もやはり、ＲＴ／ＡＨ／Ａ変異体のエンドヌクレアーゼは、非Ｒ２特異的部位に対する追加の切断を示した。

【0218】

図１４に示されているような、すでにニックが入っている４方向ジャンクションＤＮＡを用いる第２鎖合成アッセイを、ＨＩＮＡＬＰ領域変異体について前に説明したように３つのＣＣＨＣ領域変異体について行った。図１６に示されているように、ＣＲ／ＡＡＧＣＫ／Ａについての標的ＤＮＡの結合単位当たりの第２鎖合成生成物形成は、ＷＴのものと非常によく似ていたが、ＨＩＬＱ／ＡＱ／ＡおよびＲＴ／ＡＨ／Ａについては、第２鎖合成生成物形成の劇的な減少があった。

【0219】

表２： ＤＮＡ結合、切断および合成結果の要約。

【表2】

該当なし（Ｎ．Ａ．）、試験していない（Ｎ．Ｔ．）
「＋＋」：＋３０％およびそれより高度
「＋」：＋１５％～３０％
「ＷＴ」：ＷＴ活性の１５％～－１５％：機能的にＷＴ
「－」：－１５％～－３０％：わずかな低減
「－－」：－３０％～－５０％：大幅な低減
「－－－」：－５０％～７５％：著しい低減
「φ」：７５％またはそれより高度：機能的に無効

【0220】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本開示発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に引用した公表文献、およびそれらの公表文献を引用する材料は、参照により特に組み込まれる。

【0221】

当業者は、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの均等物に気付くであろう、または常例的実験のみを使用してそのような均等物を突き止めることができるであろう。そのような均等物は、後続の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【配列表】

2022512739000001.app

【国際調査報告】