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特表2022-512742ユビキチンリガーゼアゴニストをスクリーニングする方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】ユビキチンリガーゼアゴニストをスクリーニングする方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/00 20060101AFI20220131BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220131BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/00
G01N33/50 Z
C12N9/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021521194
(86)(22)【出願日】2019-10-17
(85)【翻訳文提出日】2021-06-08
(86)【国際出願番号】 US2019056738
(87)【国際公開番号】W WO2020081815
(87)【国際公開日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】62/746,957
(32)【優先日】2018-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514104933
【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヂョン，ニン
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ，シユン
(72)【発明者】
【氏名】ハインズ，トーマス・アール
(72)【発明者】
【氏名】リー，ホン
(72)【発明者】
【氏名】マオ，ハイビン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B050
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045FB01
4B050CC07
4B050LL03
4B063QA20
4B063QQ40
(57)【要約】
ユビキチンリガーゼアゴニストを同定する方法が本明細書に開示され、本方法は、（ａ）ユビキチンリガーゼを候補アゴニスト及び新基質と接触させるステップと；（ｂ）上記候補アゴニストが、上記ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップとを含み、上記新基質への上記ユビキチン基質の結合により、上記候補アゴニストをユビキチンリガーゼアゴニストとして同定する、方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ユビキチンリガーゼアゴニストを同定する方法であって、（ａ）ユビキチンリガーゼを候補アゴニスト及び新基質と接触させるステップと；
（ｂ）前記候補アゴニストが、前記ユビキチンリガーゼを前記新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップとを含み、
前記新基質に対する前記ユビキチン基質の結合が、前記候補アゴニストをユビキチンリガーゼアゴニストとして同定する、方法。
【請求項2】
前記新基質に対する前記ユビキチンリガーゼの結合が、前記ユビキチンリガーゼ、前記アゴニスト及び前記新基質を含む複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記候補アゴニストが、前記ユビキチンリガーゼを前記新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップが、前記結合によって生成されるシグナルを観察するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ユビキチンリガーゼが、第１のレポーティング物質をさらに含み、前記基質が、第２のレポーティング物質をさらに含み、前記新基質に前記ユビキチンリガーゼが結合すると、前記第１のレポーティング物質が、前記第２のレポーティング物質と共に作用して、シグナルを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記第１のレポーティング物質を含む前記ユビキチンリガーゼが、励起状態にある場合に活性酸素種を生成するように構成されているドナービーズであり、前記第２のレポーティング物質を含む前記新基質が、前記新基質に前記ユビキチンリガーゼが結合すると活性酸素種の存在下で光を生成するように構成されているアクセプタービーズである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ドナービーズが、増感剤が励起状態にある場合に前記活性酸素種を生成するように構成されている前記増感剤を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記増感剤が、刺激電磁放射が照射された場合に前記活性酸素種を生成するように構成されている光増感剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記光増感剤がフタロシアニンである、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記アクセプタービーズが、ルミネッセンス化合物が活性酸素種の近くにある場合にルミネッセンス光を生成するように構成されている前記ルミネッセンス化合物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項10】
前記ルミネッセンス化合物が、チオキセン、アントラセン、ルブレネイン及びその組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記活性酸素種が、一重項酸素である、請求項５に記載の方法。
【請求項12】
前記候補アゴニストが、前記ユビキチンリガーゼを前記新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップが、前記結合によるシグナルの増加を観察するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ユビキチンリガーゼが、第１のレポーティング物質をさらに含み、前記新基質が、第２のレポーティング物質をさらに含み、前記新基質に前記ユビキチンリガーゼが結合すると、前記第１のレポーティング物質が、前記第２のレポーティング物質と共に作用してシグナルの増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記ユビキチンリガーゼが、マルチサブユニットＥ３ユビキチンリガーゼのカリンＲＩＮＧスーパーファミリーのメンバー、基質結合ドメインを持つＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼのメンバー、又は基質結合ドメインを持つＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼのメンバーである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記ユビキチンリガーゼが、ＫＥＡＰ１である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記新基質が、ＫＲＡＳ又はＫＲＡＳ変異体である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１７日に出願の米国特許出願第６２／７４６，９５７号の利益を主張し、特にその全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、２０１８年１０月１７日に出願の米国特許出願第６２／７４６，９５７号の利益を主張し、特にその全体を参照により本明細書に組み込む。
【0002】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙原稿の代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照によりここに組み込む。配列表を含有するテキストファイル名は、７０１５７＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｆｉｎａｌ＿２０１９－１０－１６．ｔｘｔである。テキストファイルは、２ＫＢであり；２０１９年１０月１６日に作成され；明細書の申請と共にＥＦＳ－Ｗｅｂによって提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙原稿の代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照によりここに組み込む。配列表を含有するテキストファイル名は、７０１５７＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｆｉｎａｌ＿２０１９－１０－１６．ｔｘｔである。テキストファイルは、２ＫＢであり；２０１９年１０月１６日に作成され；明細書の申請と共にＥＦＳ－Ｗｅｂによって提出されている。
【0003】
発明の背景
ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）は、真核細胞において無数のタンパク質の代謝回転を媒介することによって多様な細胞機能を調節する［Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．及びＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．Ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７巻、４２５～４７９頁、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．６７．１．４２５（１９９８年）］。分解のためにタンパク質をタグ付けするために、真核細胞は、ポリユビキチン鎖によってタンパク質を先ず共有結合的に改変し、そのポリユビキチン鎖は、プロテアソーム標的化シグナルとしての機能を果たす。この翻訳後改変（すなわちユビキチン化）は、３種類の酵素、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３の連続した作用によって達成される［Ｐｉｃｋａｒｔ，Ｃ．Ｍ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０巻、５０３～５３３頁、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．７０．１．５０３（２００１年）］。これら酵素の中で、ユビキチンＥ３リガーゼは、特定のタンパク質基質を認識し、ユビキチンコンジュゲートＥ２酵素から標的タンパク質へのユビキチンの転移を促進することにより酵素的カスケードで中心的な役割を果たす［Ｚｈｅｎｇ，Ｎ．及びＳｈａｂｅｋ，Ｎ．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８６巻、１２９～１５７頁、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｂｉｏｃｈｅｍ－０６０８１５－０１４９２２（２０１７年）］。ユビキチン化の特異性は、したがって、Ｅ３－基質界面に規定される。ヒトは、数百種もの異なるＥ３を有する。さらなるアダプタータンパク質の助けを借りて、これらＥ３リガーゼは、数千個とまではいかないが、数百種の基質タンパク質を高い特異性で認識し、ユビキチン化することができる。それでもなお、Ｅ３リガーゼの基質でないタンパク質が存在する。
ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）は、真核細胞において無数のタンパク質の代謝回転を媒介することによって多様な細胞機能を調節する［Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．及びＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．Ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７巻、４２５～４７９頁、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．６７．１．４２５（１９９８年）］。分解のためにタンパク質をタグ付けするために、真核細胞は、ポリユビキチン鎖によってタンパク質を先ず共有結合的に改変し、そのポリユビキチン鎖は、プロテアソーム標的化シグナルとしての機能を果たす。この翻訳後改変（すなわちユビキチン化）は、３種類の酵素、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３の連続した作用によって達成される［Ｐｉｃｋａｒｔ，Ｃ．Ｍ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０巻、５０３～５３３頁、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．７０．１．５０３（２００１年）］。これら酵素の中で、ユビキチンＥ３リガーゼは、特定のタンパク質基質を認識し、ユビキチンコンジュゲートＥ２酵素から標的タンパク質へのユビキチンの転移を促進することにより酵素的カスケードで中心的な役割を果たす［Ｚｈｅｎｇ，Ｎ．及びＳｈａｂｅｋ，Ｎ．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８６巻、１２９～１５７頁、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｂｉｏｃｈｅｍ－０６０８１５－０１４９２２（２０１７年）］。ユビキチン化の特異性は、したがって、Ｅ３－基質界面に規定される。ヒトは、数百種もの異なるＥ３を有する。さらなるアダプタータンパク質の助けを借りて、これらＥ３リガーゼは、数千個とまではいかないが、数百種の基質タンパク質を高い特異性で認識し、ユビキチン化することができる。それでもなお、Ｅ３リガーゼの基質でないタンパク質が存在する。
【0004】
ユビキチンリガーゼを再配線して、ユビキチン化しなければＥ３によってプロセッシングされない所望の基質をユビキチン化し、分解させ得る分子接着剤Ｅ３アゴニストを発見し、開発するのに有効な方法を確立する必要性がある。本発明は、この必要性を満たし、さらに関連する利点を提供することを試みる。
【0005】
概要
一態様において、ユビキチンリガーゼアゴニストを同定する方法が、開示される。一実施形態において、本方法は、（ａ）ユビキチンリガーゼを候補アゴニスト及び新基質と接触させるステップと；（ｂ）候補アゴニストが、ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップとを含み、新基質に対するユビキチン基質の結合が、候補アゴニストをユビキチンリガーゼアゴニストとして同定する、方法である。特定の実施形態において、新基質に対するユビキチンリガーゼの結合は、ユビキチンリガーゼ、アゴニスト及び新基質を含む複合体を形成する。
一態様において、ユビキチンリガーゼアゴニストを同定する方法が、開示される。一実施形態において、本方法は、（ａ）ユビキチンリガーゼを候補アゴニスト及び新基質と接触させるステップと；（ｂ）候補アゴニストが、ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップとを含み、新基質に対するユビキチン基質の結合が、候補アゴニストをユビキチンリガーゼアゴニストとして同定する、方法である。特定の実施形態において、新基質に対するユビキチンリガーゼの結合は、ユビキチンリガーゼ、アゴニスト及び新基質を含む複合体を形成する。
【0006】
本方法の特定の実施形態において、候補アゴニストが、ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップは、結合によって生成されるシグナルを観察するステップを含む。
【0007】
本方法の特定の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、第１のレポーティング物質をさらに含み、基質は、第２のレポーティング物質をさらに含み、新基質にユビキチンリガーゼが結合すると、第１のレポーティング物質は、第２のレポーティング物質と共に作用してシグナルを生成する。これらの実施形態のいくつかにおいて、第１のレポーティング物質を含むユビキチンリガーゼは、励起状態にある場合に活性酸素種を生成するように構成されているドナービーズであり、第２のレポーティング物質を含む新基質は、新基質にユビキチンリガーゼが結合すると活性酸素種の存在下で光を生成するように構成されているアクセプタービーズである。これら実施形態のいくつかにおいて、ドナービーズは、増感剤が励起状態にある場合に活性酸素種を生成するように構成されている増感剤を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、増感剤は、刺激電磁放射が照射された場合に活性酸素種を生成するように構成されている光増感剤である。特定の実施形態において、光増感剤はフタロシアニンである。特定の実施形態において、アクセプタービーズは、ルミネッセンス化合物が活性酸素種の近くにある場合にルミネッセンス光を生成するように構成されているルミネッセンス化合物を含む。代表的なルミネッセンス化合物には、チオキセン、アントラセン、ルブレネイン（ｒｕｂｒｅｎｅｉｎ）、及びその組合せがある。特定の実施形態において、活性酸素種は一重項酸素である。
【0008】
本方法の特定の実施形態において、候補アゴニストが、ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップは、結合によるシグナルの増加を観察するステップを含む。
【0009】
本方法の特定の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、第１のレポーティング物質をさらに含み、新基質は、第２のレポーティング物質をさらに含み、新基質にユビキチンリガーゼが結合すると、第１のレポーティング物質は、第２のレポーティング物質と共に作用してシグナルの増加をもたらす。
【0010】
本方法の特定の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、マルチサブユニットＥ３ユビキチンリガーゼのカリン（ｃｕｌｌｉｎ）ＲＩＮＧスーパーファミリーのメンバー、基質結合ドメインを持つＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼのメンバー、又は基質結合ドメインを持つＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼのメンバーである。
【0011】
本方法の特定の実施形態において、ユビキチンリガーゼはＫＥＡＰ１である。
本方法の特定の実施形態において、新基質はＫＲＡＳ又はＫＲＡＳ変異体である。
本方法の特定の実施形態において、新基質はＫＲＡＳ又はＫＲＡＳ変異体である。
【0012】
本発明の前述の態様及び付随する多数の利点は、添付の図面と併せて、それらが以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されるようにさらに容易に認識されることになる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＰＲＯＴＡＣとＥ３アゴニストである分子接着剤との比較を示す図である。
【図2】ＫＥＡＰ１とＫＲＡＳ間の相互作用を促進できる分子接着剤化合物の概略図を示す図である。
【図3】当初計画したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎに基づく一次スクリーン及びカウンタースクリーンアッセイ並びに二次スクリーンアッセイの設計を示す図である。Ｈｉｓタグ付きＫＲＡＳはアクセプタービーズに固定化されており、ビオチン化ＫＥＡＰ１は、ドナービーズに結合されている。小分子化合物がＫＥＡＰ１－ＫＲＡＳ相互作用を促進できる場合、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎにおいてシグナルが生成されることになる。ＲＢＤ－ＮＲＦ２デグロン融合タンパク質は、陽性対照として使用されることになる。
【図4】二次スクリーンとしてのＣｉｓｂｉｏ ＴＲ－ＦＲＥＴを示す図である。ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイの背後にある原理の概略図であり、このアッセイも近接性に基づくタンパク質－タンパク質相互作用アッセイである。
【図5】低親和性結合を追跡するための調整可能なプラットフォーム（ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）（ＡＰＴＬＡＢ）アッセイの設計を示す図である。本アッセイは、分子接着剤化合物によって誘導される、２つのタンパク質間の弱い相互作用を検出するために開発された。本アッセイは、ＤＮＡオリゴ間の調整可能な弱い相互作用を使用して化合物に誘導される弱いタンパク質－タンパク質相互作用を増強させる。この系において、２つのタンパク質は、一本鎖ＤＮＡと個々にコンジュゲートされ、タンパク質コンジュゲートされたＤＮＡオリゴに相補的な配列を持つより長い一本鎖ＤＮＡによって合体され得る。ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲーションは、細菌ＨＵＨタンパク質によって媒介される。細菌ＨＵＨタンパク質は、各個々のタンパク質に融合され、チロシン残基を介する特定のＤＮＡ配列に対するＨＵＨのコンジュゲーションを触媒できる。
【図6A】ＡＰＴＬＡＢに使用したＤＮＡオリゴを示す図である。ＨＵＨ特異的ＤＮＡ配列（ＡＣＣＡＧ）に加えて、ＤＮＡオリゴは、ブリッジオリゴに相補的な配列を持つ、異なる長さを特徴とする。この調整可能な特徴を使用して、ＤＮＡオリゴ間に段階的な親和性を導入することができる。
【図6B】ＡＰＴＬＡＢに使用したＤＮＡオリゴを示す図である。ＨＵＨ特異的ＤＮＡ配列（ＡＣＣＡＧ）に加えて、ＤＮＡオリゴは、ブリッジオリゴに相補的な配列を持つ、異なる長さを特徴とする。この調整可能な特徴を使用して、ＤＮＡオリゴ間に段階的な親和性を導入することができる。
【図7A】ＫＥＡＰ１及びＫＲＡＳへの一本鎖ＤＮＡオリゴのコンジュゲーションを示す図である。異なる長さを持つ２つのＤＮＡオリゴにコンジュゲートされる前後のＫＥＡＰ－ＨＵＨ及びＫＲＡＳ－ＨＵＨのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。
【図7B】ＫＥＡＰ１及びＫＲＡＳへの一本鎖ＤＮＡオリゴのコンジュゲーションを示す図である。異なる長さを持つ２つのＤＮＡオリゴにコンジュゲートされる前後のＫＥＡＰ－ＨＵＨ及びＫＲＡＳ－ＨＵＨのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。
【図8A】異なる長さを持つ３つのｓｓＤＮＡブリッジオリゴの設計を示す図である。（Ａ）３つのオリゴの特異的配列を示す図である。（Ｂ）Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩによって検出される結合シグナルを生成する３つのオリゴの活性を示す図である。（Ｃ）２つのオリゴの存在下でＯｃｔｅｔ ＢＬＩによって検出される結合シグナルに対する１つのヒット化合物の効果を示す図である。
【図8B】異なる長さを持つ３つのｓｓＤＮＡブリッジオリゴの設計を示す図である。（Ａ）３つのオリゴの特異的配列を示す図である。（Ｂ）Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩによって検出される結合シグナルを生成する３つのオリゴの活性を示す図である。（Ｃ）２つのオリゴの存在下でＯｃｔｅｔ ＢＬＩによって検出される結合シグナルに対する１つのヒット化合物の効果を示す図である。
【図8C】異なる長さを持つ３つのｓｓＤＮＡブリッジオリゴの設計を示す図である。（Ａ）３つのオリゴの特異的配列を示す図である。（Ｂ）Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩによって検出される結合シグナルを生成する３つのオリゴの活性を示す図である。（Ｃ）２つのオリゴの存在下でＯｃｔｅｔ ＢＬＩによって検出される結合シグナルに対する１つのヒット化合物の効果を示す図である。
【図9】ＡＰＴＬＡＢによって検証された１９個のヒット化合物の活性の概要である。結合開始の１０分後のＯｃｔｅｔ ＢＬＩ結合シグナルを、Ｙ軸にプロットした。
【図10】ヒット検証のためのスプリットルシフェラーゼアッセイの設計を示す図である。ＫＥＡＰ１とＫＲＡＳ間の化合物に誘導される弱い相互作用は、結合タンパク質のうちの１つに個々に融合された２つの半分のルシフェラーゼ間の相互作用を促進することができる。ヒット化合物の活性は、増強ルシフェラーゼ活性によって検出され得る。
【図11】スプリットルシフェラーゼアッセイによって検証されたヒット化合物活性の概要である。
【0014】
詳細な説明
一部の実施形態は、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）でない癌遺伝子産物と、別の方法ではその癌遺伝子産物を結合しないヒトＥ３リガーゼと、の相互作用を助長する（すなわち、分子接着剤の作用によって、リガーゼの新基質になる）小分子化合物（例えば、分子接着剤）を発見する方法に関する。
一部の実施形態は、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）でない癌遺伝子産物と、別の方法ではその癌遺伝子産物を結合しないヒトＥ３リガーゼと、の相互作用を助長する（すなわち、分子接着剤の作用によって、リガーゼの新基質になる）小分子化合物（例えば、分子接着剤）を発見する方法に関する。
【0015】
一部の実施形態は、ユビキチンリガーゼを候補アゴニスト及び新基質と接触させるステップと；候補アゴニストの存在下で新基質に対するユビキチンリガーゼの結合活性を測定するステップとを含む、ユビキチンリガーゼアゴニストをスクリーニングする方法に関する。
【0016】
本明細書では、用語「新基質」とは、所与のユビキチンリガーゼに対して本来は基質ではないタンパク質のことを指す。用語「新基質」とは、リガーゼ、アゴニスト及び新基質を含む複合体を形成するのに有効な分子接着剤としての機能を果たすアゴニストの存在下でのみ所与のユビキチンリガーゼに結合するタンパク質のことを指す。ＰＲＯＴＡＣ化合物（タンパク質標的化キメラ分子）とは対照的に、分子接着剤は、各タンパク質に対して低い親和性しか有しない又は親和性を有しないが、３者間の相互作用を促進する（図１）。ＰＲＯＴＡＣと分子接着剤の両方が、Ｅ３アゴニストであり、標的したタンパク質の分解を促進できるが、それらは機構的に異なる。ＰＲＯＴＡＣは、リンカーによって連結された２つの別々の弾頭を持つ二官能性分子である。これらの弾頭は、Ｅ３及び基質を同時に集めるのに十分高い親和性を有する必要がある。この要件は、ＰＲＯＴＡＣを本質的に大きくし、分子量で５００Ｄａを容易に超えさせる。ＰＲＯＴＡＣの基質は、弾頭の化学的部分に対する親和性を示すために、リガンドになり得るタンパク質でなければならない。ＰＲＯＴＡＣを開発する手法は、従来通りのハイスループットスクリーン方法を使用してＥ３及び基質を別々に結合できる化合物を発見するステップと、リンカー部分と一緒に２つの化合物を連結するステップとを含む。対照的に、分子接着剤化合物は、リガンドになり得ない標的であり得る基質に対して高い親和性を示す必要はない。分子接着剤化合物の予想される分子量は、典型的な小分子と同じ範囲になる。
【0017】
一部の実施形態において、候補アゴニストの分子量は、５００Ｄａ未満、２５０Ｄａ未満、２００Ｄａ未満、１７５Ｄａ未満、１２５Ｄａ未満又は１００Ｄａ未満である。一部の実施形態において、候補アゴニストは、新基質に対する親和性を実質的に持たない。一部の実施形態において、候補アゴニストは、新基質に対して親和性を持たない。一部の実施形態において、候補アゴニストは、ユビキチンリガーゼに対して親和性を実質的に持たない。一部の実施形態において、候補アゴニストは、ユビキチンリガーゼに対して親和性を持たない。一部の実施形態において、候補アゴニストは、新基質と結合する部分及びユビキチンリガーゼと結合する部分の両方を含まない（例えば、二官能性でない）。
【0018】
一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼ及び新基質の存在下における候補アゴニストの用量応答は、候補アゴニストの濃度の増加に応じたリガーゼ／新基質結合の大幅な低下を呈しない。一部の実施形態において、リガーゼ／新基質結合の程度は、リガーゼ／新基質結合の最大時の濃度より高い濃度における最大結合度の５％、１０％、１５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％より低下しない。
【0019】
一部の実施形態において、本明細書に記述される方法は、１つ又は複数のアッセイを使用して結合活性を測定するステップを含む。一部の実施形態において、スクリーニング方法は、一次アッセイを使用して結合活性を測定するステップと、検証のために１つ又は複数の二次アッセイを使用して結合活性を測定するステップとを含む。
【0020】
一部の実施形態において、アッセイは、ユビキチンリガーゼ及び新基質を含む。
一部の実施形態において、一次アッセイは、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ａｓｓａｙ）である。一部の実施形態において、二次アッセイは、ＴＲ－ＦＲＥＴ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩ結合アッセイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイから選択される。
一部の実施形態において、一次アッセイは、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ａｓｓａｙ）である。一部の実施形態において、二次アッセイは、ＴＲ－ＦＲＥＴ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩ結合アッセイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイから選択される。
【0021】
一部の実施形態において、新基質に対するユビキチンリガーゼの結合は、ユビキチンリガーゼ、アゴニスト及び新基質を含む複合体を形成する。
【0022】
一部の実施形態において、本明細書に記述される方法は、候補アゴニストをスクリーニングして、候補アゴニストが、ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップを含む。一部の実施形態において、候補アゴニストをスクリーニングするステップは、結合によって生成されるシグナルを観察するステップを含む。
【0023】
一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、第１のレポーティング物質をさらに含み、基質は、第２のレポーティング物質をさらに含み、新基質にユビキチンリガーゼが結合すると、第１のレポーティング物質は、第２のレポーティング物質と共に作用して、シグナルを生成する。
【0024】
一部の実施形態において、第１のレポーティング物質を含むユビキチンリガーゼは、励起状態にある場合に活性酸素種を生成するように構成されているドナービーズであり、第２のレポーティング物質を含む新基質は、新基質にユビキチンリガーゼが結合すると活性酸素種の存在下で光を生成するように構成されているアクセプタービーズである。
【0025】
一部の実施形態において、ドナービーズは、増感剤が励起状態にある場合に活性酸素種を生成するように構成されている増感剤を含む。
【0026】
一部の実施形態において、増感剤は、刺激電磁放射が照射された場合に活性酸素種を生成するように構成されている光増感剤である。
一部の実施形態において、光増感剤はフタロシアニンである。
一部の実施形態において、光増感剤はフタロシアニンである。
【0027】
一部の実施形態において、アクセプタービーズは、ルミネッセンス化合物が活性酸素種の近くにある場合にルミネッセンス光を生成するように構成されているルミネッセンス化合物を含む。
【0028】
一部の実施形態において、ルミネッセンス化合物は、チオキセン、アントラセン、ルブレネイン及びその組合せからなる群から選択される。
【0029】
一部の実施形態において、活性酸素種は、一重項酸素である。
一部の実施形態において、候補アゴニストが、ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップは、結合によるシグナルの増加を観察するステップを含む。
一部の実施形態において、候補アゴニストが、ユビキチンリガーゼを新基質に結合させるのに有効かどうか決定するステップは、結合によるシグナルの増加を観察するステップを含む。
【0030】
一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、第１のレポーティング物質をさらに含み、新基質は、第２のレポーティング物質をさらに含み、新基質にユビキチンリガーゼが結合すると、第１のレポーティング物質は、第２のレポーティング物質と共に作用してシグナルの獲得をもたらす。
【0031】
一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、マルチサブユニットＥ３ユビキチンリガーゼのカリンＲＩＮＧスーパーファミリーのメンバー、基質結合ドメインを持つＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼのメンバー、又は基質結合ドメインを持つＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼのメンバーである。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、基質結合ドメインを持つリガーゼのＨＥＣＴ、ＲＩＮＧ型、Ｕ－ボックス及びＰＨＤフィンガー型のメンバーである。
【0032】
一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼはＫＥＡＰ１である。一部の実施形態において、新基質はＫＲＡＳ又はＫＲＡＳ変異体である。
【0033】
スクリーニングの方法
以下は、小分子をスクリーニングして、標的化した新基質分解（ユビキチン化による）のためのユビキチンリガーゼの小分子アゴニストを同定する代表的な方法について記載する。
以下は、小分子をスクリーニングして、標的化した新基質分解（ユビキチン化による）のためのユビキチンリガーゼの小分子アゴニストを同定する代表的な方法について記載する。
【0034】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法に使用されるアッセイは、ユビキチンリガーゼ結合活性をスクリーニングするために設計される。一部の実施形態において、本明細書に記述される方法に使用されるアッセイは、ＫＥＡＰ１及びＫＲＡＳ／ＫＲＡＳ変異体結合をスクリーニングするためのものである。
【0035】
一部の実施形態において、２つ以上のアッセイが、スクリーニングに使用される。一部の実施形態において、スクリーニング方法は、一次アッセイにより候補アゴニストをスクリーニングするステップを含む。一部の実施形態において、スクリーニング方法は、結合活性を検証するために二次スクリーンアッセイにより候補アゴニストをスクリーニングするステップを含む。
【0036】
一部の実施形態において、スクリーニングに使用されるアッセイは、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイであり、このアッセイはユビキチンリガーゼ及び新基質を含む。一部の実施形態において、アッセイは、ドナービーズが結合しているユビキチンリガーゼ及び受容体ビーズに結合している新基質を含む。一部の実施形態において、アッセイは、アクセプタービーズが結合しているユビキチンリガーゼ及びドナービーズに結合している新基質を含む。一部の実施形態において、ユビキチンがユビキチンリガーゼアゴニストの存在下で新基質に結合する場合、ドナービーズ及びアクセプタービーズは相互作用してシグナルを生成する。
【0037】
一部の実施形態において、スクリーニングに使用されるアッセイは、低親和性結合を追跡するための調整可能なプラットフォームアッセイ（ＡＰＴＬＡＢ）である。一部の実施形態において、スクリーニングに使用したアッセイは、ＴＲ－ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）である。一部の実施形態において、スクリーニングに使用したアッセイは、スプリットルシフェラーゼアッセイである。
【0038】
一部の実施形態において、本明細書に記述される方法は、１つ又は複数のアッセイを使用して結合活性を測定するステップを含む。一部の実施形態において、スクリーニング方法は、一次アッセイを使用して結合活性を測定するステップと、検証のために１つ又は複数の二次アッセイを使用して結合活性を測定するステップとを含む。
【0039】
一部の実施形態において、アッセイは、ユビキチンリガーゼ及び新基質を含む。
一部の実施形態において、一次アッセイは、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイである。一部の実施形態において、アッセイは、ユビキチンリガーゼアゴニストの存在下でユビキチンリガーゼと新基質との結合を増強させるのに使用できるＤＮＡオリゴ間の調整可能な相互作用を利用する。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、第１の一本鎖ＤＮＡにコンジュゲートされ、新基質は、第２の一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートされ、第１の一本鎖ＤＮＡ及び第２の一本鎖ＤＮＡは、タンパク質コンジュゲートされた第１及び第２の一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡのより長い断片によって合体される。ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲーションは、細菌ＨＵＨタンパク質によって媒介される。細菌ＨＵＨタンパク質は、各個々のタンパク質に融合され、チロシン残基を介する特定のＤＮＡ配列に対するＨＵＨのコンジュゲーションを触媒できる。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼアゴニストの存在下でのユビキチンリガーゼと新基質との結合は、相補的ＤＮＡ間の相互作用によって増強され、結果として検出可能なシグナルを得ることができる。
一部の実施形態において、一次アッセイは、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイである。一部の実施形態において、アッセイは、ユビキチンリガーゼアゴニストの存在下でユビキチンリガーゼと新基質との結合を増強させるのに使用できるＤＮＡオリゴ間の調整可能な相互作用を利用する。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、第１の一本鎖ＤＮＡにコンジュゲートされ、新基質は、第２の一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートされ、第１の一本鎖ＤＮＡ及び第２の一本鎖ＤＮＡは、タンパク質コンジュゲートされた第１及び第２の一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡのより長い断片によって合体される。ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲーションは、細菌ＨＵＨタンパク質によって媒介される。細菌ＨＵＨタンパク質は、各個々のタンパク質に融合され、チロシン残基を介する特定のＤＮＡ配列に対するＨＵＨのコンジュゲーションを触媒できる。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼアゴニストの存在下でのユビキチンリガーゼと新基質との結合は、相補的ＤＮＡ間の相互作用によって増強され、結果として検出可能なシグナルを得ることができる。
【0040】
一部の実施形態において、二次アッセイは、ＴＲ－ＦＲＥＴ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩ結合アッセイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイから選択される。
【0041】
標的選択
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、先ず新基質を選択するステップを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、基質タンパク質を選択するステップを含む。一部の実施形態において、基質タンパク質は、ユビキチン化され、分解され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、新基質及び基質タンパク質に結合すると基質タンパク質をユビキチン化できる１つ又は複数のＥ３ユビキチンリガーゼを選択するステップを含む。一部の実施形態において、基質タンパク質及びＥ３ユビキチンリガーゼは、新基質と相互作用した後に結合することができる。従来通りの創薬とは異なり、Ｅ３リガーゼを化学的に再プログラムして新基質をユビキチン化する試みは、２つの「標的」、ユビキチンＥ３リガーゼ及び基質タンパク質を必要とする。第１のステップとして、「基質中心の」手法は、ユビキチン化され、分解される対象のタンパク質を先ず選択することによって行われた。この手法は、特定のＥ３に焦点を合わせ、異なる基質をユビキチン化するＥ３の潜在性を探査する「リガーゼ中心の」手法とは対照的である。基質が同定されたら、１つ又は複数の適当なＥ３が、以下で指定されるいくつかの基準に基づいて選択された。
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、先ず新基質を選択するステップを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、基質タンパク質を選択するステップを含む。一部の実施形態において、基質タンパク質は、ユビキチン化され、分解され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、新基質及び基質タンパク質に結合すると基質タンパク質をユビキチン化できる１つ又は複数のＥ３ユビキチンリガーゼを選択するステップを含む。一部の実施形態において、基質タンパク質及びＥ３ユビキチンリガーゼは、新基質と相互作用した後に結合することができる。従来通りの創薬とは異なり、Ｅ３リガーゼを化学的に再プログラムして新基質をユビキチン化する試みは、２つの「標的」、ユビキチンＥ３リガーゼ及び基質タンパク質を必要とする。第１のステップとして、「基質中心の」手法は、ユビキチン化され、分解される対象のタンパク質を先ず選択することによって行われた。この手法は、特定のＥ３に焦点を合わせ、異なる基質をユビキチン化するＥ３の潜在性を探査する「リガーゼ中心の」手法とは対照的である。基質が同定されたら、１つ又は複数の適当なＥ３が、以下で指定されるいくつかの基準に基づいて選択された。
【0042】
一部の実施形態において、新基質タンパク質は、新基質の非存在下でＥ３ユビキチンリガーゼに直接結合しない。多数のヒト疾患は、突然変異、異常調節又は有害な遺伝子産物によって引き起こされ、それら産物の下方調節は、疾患の増悪を減速し、病徴を軽減することができる。分子接着剤Ｅ３アゴニストの固有の長所を利用するために、ドラッガブルでなく、特にリガンドになり得ない標的が考慮された。これらの標的は、ドラッガブルでない球状ドメインを有する可能性があり又はリガンドになり得る部位のない本質的な障害がある。特にコドン１２及び６１におけるＫＲＡＳの突然変異並びに他のＲＡＳアイソフォームは、ＧＴＰアーゼを発癌性にする可能性があり、膵臓がん、肺がん及び大腸がんにしばしば見られる。そのＧＴＰ結合ポケットのため、細胞性ＧＴＰは高親和性且つ高濃度であるためＫＲＡＳ変異体はドラッガブルでない可能性がある。ＫＲＡＳは、そのヌクレオチド結合ポケットの外に小分子によって標的され得る深い表面腔をほとんど示さない。既存のＫＲＡＳ結合性化合物について報告されている最も高い親和性は、およそ１００μＭである［Ｍａｕｒｅｒ，Ｔ．ら、Ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｏｃｋｅｔ ｉｎ Ｒａｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＯＳ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９巻、５２９９～５３０４頁、ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１６５１０１０９（２０１２年）］。発癌性産物は、したがって、分子接着剤Ｅ３アゴニストによる下方調節の標的になり得る。
【0043】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＫＲＡＳ又はＫＲＡＳ変異体を結合し、ユビキチン化することができるユビキチンリガーゼを選択するステップを含む。いくつかの基準を使用して、適当なＥ３を選択することができる：（１）ユビキチンリガーゼが、ＫＲＡＳが合成され、官能化されるサイトゾル又は細胞膜に局在する；（２）作用する化合物が、異なるがん適応症について試験され得るようにユビキチンリガーゼが多数の組織において普遍的に発現される；（３）ユビキチンリガーゼが、よく特徴付けらており、モノユビキチン化又はＬｙｓ４８連結によらないポリユビキチン鎖構築の代わりに基質のポリユビキチン化及び分解を促進することが知られている；（４）ユビキチンリガーゼの内在性機能が、分子接着剤化合物によって損なわれることがないように、ユビキチンリガーゼが相当に豊富である；及び（５）ユビキチンリガーゼが、構造的に分析されており、大規模精製のために修正可能である。Ｅ３リガーゼの中で、ＫＥＡＰ１は、上に挙げた基準をすべてではないにしてもほとんど満たす候補として同定された（図２）。
【0044】
一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、サイトゾル又は細胞膜に局在する。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、新基質が官能化され、合成される場所に局在する。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、１つ又は複数の組織において発現される。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、モノユビキチン化又はＬｙｓ４８連結によらないポリユビキチン鎖構築の代わりに基質のポリユビキチン化及び分解を促進することができる。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、小分子アンタゴニストへの結合後にその内在性機能を維持するのに十分な量で存在する。一部の実施形態において、ユビキチンリガーゼは、大規模精製に適している。
【0045】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ユビキチンリガーゼに直接又は本来結合しない新基質を同定するステップを含む。
【0046】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ユビキチンリガーゼと新基質との相互作用を助長する化合物をスクリーニングするステップを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＫＥＡＰ１とＫＲＡＳとの相互作用を助長する化合物をスクリーニングするステップを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、改変タンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）アッセイを使用して候補アゴニストをスクリーニングするステップを含む。ＫＲＡＳ－ＫＥＡＰ１相互作用を助長できる化合物を同定するために、小分子ライブラリが、改変された従来のタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）アッセイを使用してスクリーニングされた。ＰＰＩ阻害性小分子を探索する一般的な「ダウン」スクリーン（「ｄｏｗｎ」 ｓｃｒｅｅｎ）の代わりに、本明細書に記載されるアッセイは、非相互作用対としてＫＲＡＳ及びＫＥＡＰ１を準備し、「アップ」スクリーン（「ｕｐ」 ｓｃｒｅｅｎ）が、陽性ＰＰＩシグナルを生じる化合物を探すために実行された。その目的は、ＫＲＡＳ－ＫＥＡＰ１相互作用の誘導において検出可能な活性を示す任意の小分子を同定することであった（図２）。ＰＰＩアップスクリーンのこの型は、以前に系統的に試験されてこなかった。アップスクリーンにおけるシグナルの増加に関連する偽陽性ヒットは、ダウンスクリーンにおける偽陽性ヒットより低い。ＫＲＡＳ及びＫＥＡＰ１は無数の方法で互いに表面を提示することができ、多数の化学物質が、これらの不完全な相互作用のうちの１つを相補して三元複合体形成を促進する機会を有する可能性がある。
【実施例】
【0047】
ハイスループットスクリーンアッセイ
一次スクリーンアッセイ
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ ＷＡ）は、ビーズに基づく、非放射性の化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイである。アッセイ系は、ドナー及びアクセプタービーズからなり、生物学的相互作用によって誘導されるそれらビーズの近接性が、大きく増幅されたシグナルを生成する化学反応カスケードを誘発することになる。使用したドナービーズは、ストレプトアビジンドナービーズ（ＰＥ＃６７６０００２ｓ）であり、使用したアクセプタービーズは、抗６×Ｈｉｓアクセプタービーズ（ＰＥ＃ＡＬ１２８Ｃ）であった。レーザー励起によってドナービーズにおける光増感剤は、環境酸素をより励起された一重項状態に変換する。一重項状態の酸素分子は、全体に拡散してアクセプタービーズ中のチオキセン誘導体と反応し、同ビーズ中に含有されるフルオロフォアをさらに活性化する３７０ｎｍのケミルミネッセンスを生成する。フルオロフォアは、５２０～６２０ｎｍの光をその後放出する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、広範囲にわたる親和性（ｐＭ～ｍＭ）を検出するのに適した極めて高い感度、小型化に対する適応性及び多重化に対する潜在性のために選択された。このＰＰＩアッセイにおいて、精製したビオチン化ＫＥＡＰ１ケルチリピートドメインをストレプトアビジンドナービーズに固定化し、８×Ｈｉｓタグ付きの全長ＳＧ１２Ｄ変異体タンパク質を抗Ｈｉｓアクセプタービーズに固定化した（図３）。２つのタンパク質は、通常お互いと相互作用しないので、２つのビーズの混合物は、いかなるＡｌｐｈａシグナルも生じなかった。
一次スクリーンアッセイ
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ ＷＡ）は、ビーズに基づく、非放射性の化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイである。アッセイ系は、ドナー及びアクセプタービーズからなり、生物学的相互作用によって誘導されるそれらビーズの近接性が、大きく増幅されたシグナルを生成する化学反応カスケードを誘発することになる。使用したドナービーズは、ストレプトアビジンドナービーズ（ＰＥ＃６７６０００２ｓ）であり、使用したアクセプタービーズは、抗６×Ｈｉｓアクセプタービーズ（ＰＥ＃ＡＬ１２８Ｃ）であった。レーザー励起によってドナービーズにおける光増感剤は、環境酸素をより励起された一重項状態に変換する。一重項状態の酸素分子は、全体に拡散してアクセプタービーズ中のチオキセン誘導体と反応し、同ビーズ中に含有されるフルオロフォアをさらに活性化する３７０ｎｍのケミルミネッセンスを生成する。フルオロフォアは、５２０～６２０ｎｍの光をその後放出する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、広範囲にわたる親和性（ｐＭ～ｍＭ）を検出するのに適した極めて高い感度、小型化に対する適応性及び多重化に対する潜在性のために選択された。このＰＰＩアッセイにおいて、精製したビオチン化ＫＥＡＰ１ケルチリピートドメインをストレプトアビジンドナービーズに固定化し、８×Ｈｉｓタグ付きの全長ＳＧ１２Ｄ変異体タンパク質を抗Ｈｉｓアクセプタービーズに固定化した（図３）。２つのタンパク質は、通常お互いと相互作用しないので、２つのビーズの混合物は、いかなるＡｌｐｈａシグナルも生じなかった。
【0048】
アッセイを、３８４ウェル白色プレート中で、室温で行った。試験溶液は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ ＢＳＡ及び１ｍＭ ＴＣＥＰを含有した。ＫＥＡＰ１及びＫＲＡＳタンパク質並びに試験化合物各１０μＬを各ウェル内で混合した。アクセプタービーズ１０μＬを添加し、混合物を暗所でインキュベートした。最後に、ドナービーズ１０μＬを混合物に添加し、インキュベートし、続いてプレートを読み取った。アッセイは、最高４％のＤＭＳＯを容易に許容することができる。ヒットカットオフとして平均＋３×標準偏差（ＳＤ）を使用すると、２－プレートパイロット試験では、ヒット率が１．５２％に達することを示した。アッセイを検証した後、１７，７７４個の化合物ライブラリによる小規模のパイロットスクリーンを実行した。平均＋３×ＳＤカットオフに基づいて、パイロットスクリーンは５７５個のヒットを生じ、ヒット率３．２％であった。
【0049】
化合物検証
二次スクリーン－Ｃｉｓｂｉｏ ＴＲ－ＦＲＥＴ
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイの非常に高い感度のため、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎに対して直交する二次スクリーンを使用して、ヒット化合物をさらに検証した。Ｃｉｓｂｉｏ ＰＰＩ技術、ＴＲ－ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）を使用して用量応答研究に基づいて最も高い潜在力を持つ化合物を確認した（図４）。
二次スクリーン－Ｃｉｓｂｉｏ ＴＲ－ＦＲＥＴ
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイの非常に高い感度のため、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎに対して直交する二次スクリーンを使用して、ヒット化合物をさらに検証した。Ｃｉｓｂｉｏ ＰＰＩ技術、ＴＲ－ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）を使用して用量応答研究に基づいて最も高い潜在力を持つ化合物を確認した（図４）。
【0050】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎによる反復用量応答研究で残り、ＴＲ－ＦＲＥＴによって試験された化合物の中から、上位２０個のヒットを、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ＫＥＡＰ１相互作用を促進する活性（ＴＲ－ＦＲＥＴによる検証でより高い潜在力）により同定した（図４）。
【0051】
二次スクリーン－ＡＰＴＬＡＢ
ＴＲ－ＦＲＥＴは、ヒット検証のための有益な二次スクリーンとして使用され得るが、その原理はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎと類似しており、ビーズに基づく近接性誘導シグナルを利用する。ヒット化合物を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ及びＴＲ－ＦＲＥＴ方法とは別の追加の方法でさらに検証した。Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、サイズ排除クロマトグラフィー及び親和性プルダウンを含めたＰＰＩを検出するための従来の方法のいくつかがいかなる陽性結果も生じなかったことは、ヒットの活性が極めて低い可能性があることを示唆した。換言すれば、これら化合物が、ＫＲＡＳ－ＫＥＡＰ１相互作用を促進できる可能性があっても、得られる三元複合体は、不安定すぎて従来の方法によって検出できない可能性がある。この問題を解決するために、新たなアッセイを設計し（低親和性結合を追跡するための調整可能なプラットフォーム、本明細書においてＡＰＴＬＡＢと称する）（図５）、様々な長さを持つ相補的ＤＮＡ鎖間の弱い相互作用を使用してＫＲＡＳとＫＥＡＰ１間の化合物誘導性低親和性結合を増強し、その低親和性結合を従来の方法によって検出可能にした。
ＴＲ－ＦＲＥＴは、ヒット検証のための有益な二次スクリーンとして使用され得るが、その原理はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎと類似しており、ビーズに基づく近接性誘導シグナルを利用する。ヒット化合物を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ及びＴＲ－ＦＲＥＴ方法とは別の追加の方法でさらに検証した。Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、サイズ排除クロマトグラフィー及び親和性プルダウンを含めたＰＰＩを検出するための従来の方法のいくつかがいかなる陽性結果も生じなかったことは、ヒットの活性が極めて低い可能性があることを示唆した。換言すれば、これら化合物が、ＫＲＡＳ－ＫＥＡＰ１相互作用を促進できる可能性があっても、得られる三元複合体は、不安定すぎて従来の方法によって検出できない可能性がある。この問題を解決するために、新たなアッセイを設計し（低親和性結合を追跡するための調整可能なプラットフォーム、本明細書においてＡＰＴＬＡＢと称する）（図５）、様々な長さを持つ相補的ＤＮＡ鎖間の弱い相互作用を使用してＫＲＡＳとＫＥＡＰ１間の化合物誘導性低親和性結合を増強し、その低親和性結合を従来の方法によって検出可能にした。
【0052】
調整可能なＤＮＡオリゴヌクレオチド相互作用を低親和性タンパク質－タンパク質相互作用、タンパク質フォールドとカップリングするために、特定の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドと反応し、共有結合的に連結されたタンパク質－ＤＮＡコンジュゲートを形成することができるＨＵＨ［Ｌｏｖｅｎｄａｈｌ，Ｋ．Ｎ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ａ．Ｎ．及びＧｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＤＮＡ Ｌｉｎｋａｇｅｓ ｉｎ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｕｓｉｎｇ ＨＵＨ－Ｔａｇｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３９巻、７０３０～７０３５頁、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．７ｂ０２５７２（２０１７年）］を利用した。ＨＵＨタンパク質を、ＫＥＡＰ１及びＫＲＡＳＧ１２ＤのＣ末端に個々に融合させ、それにより２つのキメラタンパク質が、ＨＵＨ反応性配列を含有するｓｓＤＮＡと共有結合を各々形成できるようにした（図５及び図６）。精製したＨＵＨ融合タンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＭｎＣｌ２を含有する緩衝液中に１００μＭになるように調整した。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、終濃度１２０μＭになるように添加した。室温で１時間インキュベーションした後、反応試料を、陰性対照と並べてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流して、コンジュゲーション効率を確認した。ＤＮＡにコンジュゲートされたＨＵＨ融合タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でよりゆっくり流れた。
【0053】
２つのキメラタンパク質に連結された２つのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＵＨ反応性配列に加えてそれぞれ追加の配列も含有し、その配列は、ｓｓＤＮＡブリッジオリゴヌクレオチドの片方に相補的である（図６）。ブリッジｓｓＤＮＡは、タンパク質を連結した２つのオリゴヌクレオチドとアニールすると、ＫＲＡＳ及びＫＥＡＰ１を単一複合体に物理的に合体させることになる。ブリッジｓｓＤＮＡの長さを変動させることによって、ＤＮＡ－ＤＮＡ相互作用の親和性は変化することになる。ブリッジオリゴヌクレオチドが十分に長い場合、２つのキメラタンパク質は、ＤＮＡ部分を介して互いと安定して会合することになる。得られた複合体の形成は、Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩなどの従来の方法によって検出可能である。ブリッジｓｓＤＮＡの長さを徐々に短縮すると、ＤＮＡ－ＤＮＡ相互作用の親和性は弱まり、検出不能になる。ブリッジオリゴヌクレオチドの長さを滴定することによって、特定の長さで変曲点が観察されることになる。この変曲点において、２つのキメラタンパク質間の追加の弱い相互作用は複合体の安定性を増強する潜在性を有し、その安定性を従来の方法によって検出可能にする。この手法を後押しする理論的根拠は、結合エネルギー変化と結合親和性の差異の間の非線形関係によって決まる。
ΔΔＧ＝－ＲＴ ｌｎ（Ｋｄ１／Ｋｄ２） （１）
ΔΔＧ＝－ＲＴ ｌｎ（Ｋｄ１／Ｋｄ２） （１）
【0054】
方程式（１）に基づくと、追加の結合エネルギーを少量導入することにより、２つの相互作用相手の親和性を指数関数的に増強させ得る。全体として、ＡＰＴＬＡＢは、強い相互作用を測定するのに適している従来の方法を使用して、別の弱い相互作用によって増大される弱いＰＰＩを検出するように設計されている。
【0055】
ＡＰＴＬＡＢを実施するために、ＨＵＨを融合したビオチン化ＫＥＡＰ１及びＨｉｓ－ＫＲＡＳＧ１２Ｄを調製し、ｓｓＤＮＡ及びＨＵＨコンジュゲーションアッセイを実行し、そのアッセイにおいて、２つのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＵＨと融合されたビオチン－ＫＥＡＰ１（図６Ａ）及びＨｉｓ－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図６Ｂ）へ個々に連結した。ｓｓＤＮＡ Ｒｅｃｏ－Ｃ１２連結ビオチン－ＫＥＡＰ１－ＨＵＨ、これをＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２と命名、及びｓｓＤＮＡ Ｒｅｃｏ－Ａ１８連結Ｈｉｓ－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ＨＵＨ（ＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８）を以下のＡＰＴ－ＬＡＢ試験のために選択した。
【0056】
ｓｓＤＮＡブリッジオリゴヌクレオチドを３３、２８及び２３ヌクレオチド（ｎｔ）の異なる長さで合成し（図８Ａ）、ＢＬＩによってモニターされる２つのｓｓＤＮＡ－タンパク質コンジュゲート間の複合体形成を促進する能力を試験した。最も長いｓｓＤＮＡ－ブリッジ３３ｎｔは、ＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２とＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８間の堅牢な複合体の形成を促進し、高いＢＬＩシグナルを生じた（図８Ｂ）。それに対して、ｓｓＤＮＡ－ブリッジ２８ｎｔに対する結合シグナルは有意により低く、一方最も短いブリッジオリゴヌクレオチドｓｓＤＮＡ－ブリッジ２３ｎｔによって媒介される相互作用は、弱すぎて検出できなかった。従って、ｓｓＤＮＡ－ブリッジ２８ｎｔは、変曲点ブリッジオリゴヌクレオチドであると決定され、ヒット化合物によって誘導されるＫＥＡＰ１とＫＲＡＳとの弱い結合を試験するのに潜在的に適していた。
【0057】
化合物をＤＭＳＯに溶解した。本研究に使用されるｓｓＤＮＡを表１に挙げた。ｓｓＤＮＡは、ヘアピンを回避するように注意深く設計された。ＤＮＡ－ＤＮＡ対合領域の場合、Ｒｅｃｏ－Ｃ１２は、３３．３％のＡ及び６６．７％のＣを適用し、それに対して、Ｒｅｃｏ－Ａ１８は、３３．３％のＣ及び６６．７％のＡを適用し、この差異により、ｓｓＤＮＡ－ブリッジはＲｅｃｏ－Ｃ１２及びＲｅｃｏ－Ａ１８を所望の方向で結合する。ｓｓＤＮＡ及びＨＵＨのｉｎ ｖｉｔｒｏコンジュゲーションの方法は、これまでに報告されている［Ｌｏｖｅｎｄａｈｌ，Ｋ．Ｎ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ａ．Ｎ．及びＧｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＤＮＡ Ｌｉｎｋａｇｅｓ ｉｎ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｕｓｉｎｇ ＨＵＨ－Ｔａｇｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３９巻、７０３０～７０３５頁、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．７ｂ０２５７２（２０１７年）］。コンジュゲーション後に、ｓｓＤＮＡ標識タンパク質をさらに精製して、遊離ｓｓＤＮＡ及び未標識のタンパク質を除去した。ＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２（ｓｓＤＮＡ Ｒｅｃｏ－Ｃ１２連結ビオチン－ＫＥＡＰ１－ＨＵＨ）及びＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８（ｓｓＤＮＡ Ｒｅｃｏ－Ａ１８連結Ｈｉｓ－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ＨＵＨ）を、Ｏｃｔｅｔによって検出される以下の結合アッセイに使用した。
【0058】
ＭＧなし／ありで、ｓｓＤＮＡブリッジの存在下でＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２（ビオチンタグ付き）とＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８の相互作用を、製造業者の手順に従ってＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。第１に、ストレプトアビジンコートされた光プローブを緩衝液中で水和させた。第２に、プローブに５０ｎＭ ＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２をロードして、光シグナルをおよそ１．６ｎＭにした（大部分のストレプトアビジンはＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２を結合した）。第３に、プローブを５００ｎＭビオサイチンに浸けて、プローブ上に残っている遊離ストレプトアビジンをふさいだ。第４に、プローブをベースラインのために緩衝液に入れた。第５に、プローブを試料ウェルに挿入して（化合物なし／ありの１μＭ ＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８及び８２．５ｎＭ ｓｓＤＮＡブリッジの混合物）、ＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２とＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８の会合を検出し、光シグナルの増加は結合が起こったことを示し、結合シグナルとして処理した。第６に、プローブを緩衝液に浸漬して、結合しているＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８の解離をモニターした。反応を、３０℃で維持した黒色９６ウェルプレート中で実施し、反応容量は各ウェル２００μＬであった。アッセイ緩衝液は、０．０５％ ＢＳＡを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有し、１ｍＭ ＴＣＥＰを新たに添加した。
【0059】
表１．ｓｓＤＮＡ
ｓｓＤＮＡ 配列（注：小文字の配列は、ＨＵＨによって認識される。）
Ｒｅｃｏ－Ｃ１２ ５’－ａａｇｔａｔｔａｃｃａｇＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＣ－３’
（配列番号２）
Ｒｅｃｏ－Ａ１８ ５’－ａａｇｔａｔｔａｃｃａｇＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ－３’
（配列番号３）
ｓｓＤＮＡ－ブリッジ３３ｎｔ ５’－ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧ－３’
（配列番号４）
ｓｓＤＮＡ－ブリッジ２８ｎｔ ５’－ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴ－３’
（配列番号５）
ｓｓＤＮＡ－ブリッジ２３ｎｔ ５’－ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧ－３’
（配列番号６）
ｓｓＤＮＡ 配列（注：小文字の配列は、ＨＵＨによって認識される。）
Ｒｅｃｏ－Ｃ１２ ５’－ａａｇｔａｔｔａｃｃａｇＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＣ－３’
（配列番号２）
Ｒｅｃｏ－Ａ１８ ５’－ａａｇｔａｔｔａｃｃａｇＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ－３’
（配列番号３）
ｓｓＤＮＡ－ブリッジ３３ｎｔ ５’－ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧ－３’
（配列番号４）
ｓｓＤＮＡ－ブリッジ２８ｎｔ ５’－ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴ－３’
（配列番号５）
ｓｓＤＮＡ－ブリッジ２３ｎｔ ５’－ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧ－３’
（配列番号６）
【0060】
この実験設定下で、一次スクリーンのヒット化合物のうちの１つを試験した。ＤＭＳＯのみの対照と比較して、ヒット化合物の添加は、ＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２及びＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８によるＢＬＩシグナルを有意に増加させた（図８Ｃ）。また、効果は用量依存的であり、ＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２とＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８両方の存在に依存した。これらの結果は、ヒット化合物が、おそらく２つのタンパク質間の界面で結合することによってＫＥＡＰ１－ｓｓＤＮＡ１２とＫＲＡＳＧ１２Ｄ－ｓｓＤＮＡ１８の相互作用を促進する活性を有することを強く示唆した。類似の手法を使用して、ＴＲ－ＦＲＥＴ二次スクリーンにおいて同定された２０個のヒット化合物の大多数の活性を検証した（図９）。
【0061】
二次スクリーン－スプリットルシフェラーゼアッセイ
ＡＰＴＬＡＢの開発と並行して、代替の二次スクリーンアッセイを、追加の弱い相互作用によって増大する弱い相互作用を検出するのと同じ原理を使用して開発した。スプリットルシフェラーゼアッセイは、分子酸素の存在下でフリマジンを利用して高輝度ルミネッセンスを生成することができる小さく、安定なルシフェラーゼであるアッセイに基づいて開発された（図１０）［Ｄｉｘｏｎ，Ａ．Ｓ．ら ＮａｎｏＬｕｃ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１巻、４００～４０８頁、ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００７５３ （２０１６年）］。酵素（ＰＤＢ ＩＤ：５ＩＢＯ）は２つの部分、Ｌａｒｇｅ ＢｉＴ（ＬＢｉＴ；１５９アミノ酸、１７．６ｋＤａ）及びＳｍａｌｌ ＢｉＴ（ＳＢｉＴ；１１アミノ酸）に分割され、それらは対象となる２つのタンパク質に融合され得る。これら２つの融合タンパク質を密接に近接させ得るタンパク質－タンパク質相互作用がある場合、ＬＢｉＴ及びＳＢｉＴは、機能的なＮａｎｏｌｕｃ酵素を形成して高輝度ルミネッセンスシグナルを生成することができる。ＬＢｉＴとＳＢｉＴ間の本質的な親和性は極めて弱い（Ｋｄ＝１９０μＭ）ので、この技術は、分子接着剤化合物によって誘導されるＫＥＡＰ１とＫＲＡＳＧ１２Ｄの間の相互作用など、弱いタンパク質－タンパク質相互作用を検出するのに適している。
ＡＰＴＬＡＢの開発と並行して、代替の二次スクリーンアッセイを、追加の弱い相互作用によって増大する弱い相互作用を検出するのと同じ原理を使用して開発した。スプリットルシフェラーゼアッセイは、分子酸素の存在下でフリマジンを利用して高輝度ルミネッセンスを生成することができる小さく、安定なルシフェラーゼであるアッセイに基づいて開発された（図１０）［Ｄｉｘｏｎ，Ａ．Ｓ．ら ＮａｎｏＬｕｃ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１巻、４００～４０８頁、ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００７５３ （２０１６年）］。酵素（ＰＤＢ ＩＤ：５ＩＢＯ）は２つの部分、Ｌａｒｇｅ ＢｉＴ（ＬＢｉＴ；１５９アミノ酸、１７．６ｋＤａ）及びＳｍａｌｌ ＢｉＴ（ＳＢｉＴ；１１アミノ酸）に分割され、それらは対象となる２つのタンパク質に融合され得る。これら２つの融合タンパク質を密接に近接させ得るタンパク質－タンパク質相互作用がある場合、ＬＢｉＴ及びＳＢｉＴは、機能的なＮａｎｏｌｕｃ酵素を形成して高輝度ルミネッセンスシグナルを生成することができる。ＬＢｉＴとＳＢｉＴ間の本質的な親和性は極めて弱い（Ｋｄ＝１９０μＭ）ので、この技術は、分子接着剤化合物によって誘導されるＫＥＡＰ１とＫＲＡＳＧ１２Ｄの間の相互作用など、弱いタンパク質－タンパク質相互作用を検出するのに適している。
【0062】
この設計を実施するために、ＳＢｉＴ及びＬＢｉＴを、ＫＲＡＳＧ１２ＤのＮ末端及びＫＥＡＰ１のＣ末端にそれぞれ融合させた。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ及びＫＥＡＰ１は、本来互いに相互作用しないので、２つのキメラタンパク質及びルシフェリンの混合物は、極めて低いルミネッセンスシグナルを生成した。
【0063】
スプリットルシフェラーゼアッセイを、Ｐｒｏｍｅｇａによって開発されたＮａｎｏＬｕｃ Ｂｉｎａｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのために記載されている一般的な手順に従って実行した。ＳＢｉＴ－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ及びＫＥＡＰ１－ＬＢｉＴ融合タンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ ＢＳＡ－ＦＡＦを含有する緩衝液５０μＬ中に終濃度２．５ｎＭで混合し、１時間インキュベートした。同じ反応緩衝液５０μＬを、Ｐｒｏｍｅｇａから購入したルシフェリン保存溶液２μＬと混合し、次いでそれを９６ウェル白色プレート中のタンパク質混合物溶液に添加し、その後２分間振盪した。プラスチックシートでプレートを覆って、反応の時間的経過を、ルシフェリン混合の４分間後にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｓｐｉｒｅ ２３００ Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いてモニターした。このアッセイを使用して、ＴＲ－ＦＲＥＴ二次スクリーンにおいて同定された２０個のヒット化合物の大多数を検証した（図１１）。
【0064】
タンパク質調製方法
クローニング
異なるアッセイのためのすべての構築物を、ヒトＫＥＡＰ１ケルチドメイン（残基３２０～６１２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１４１４５、以下ＫＥＡＰ１と記載する、ＰＤＢ ＩＤ：２ＦＬＵ）及び部位突然変異Ｇ１２Ｄを持つ全長ヒトＫＲＡＳ４Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１６－２）（以下ＫＲＡＳＧ１２Ｄと記載する、ＰＤＢ ＩＤ：４ＤＳＮ）の構造に基づいて設計した。
クローニング
異なるアッセイのためのすべての構築物を、ヒトＫＥＡＰ１ケルチドメイン（残基３２０～６１２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１４１４５、以下ＫＥＡＰ１と記載する、ＰＤＢ ＩＤ：２ＦＬＵ）及び部位突然変異Ｇ１２Ｄを持つ全長ヒトＫＲＡＳ４Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１６－２）（以下ＫＲＡＳＧ１２Ｄと記載する、ＰＤＢ ＩＤ：４ＤＳＮ）の構造に基づいて設計した。
【0065】
すべてのタンパク質コードＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ１５及びｐＥＴ４１から改変した１組のライゲーション非依存（ＬＩＣ）発現ベクターにクローニングした。８×Ｈｉｓ－（ＧＳ）４－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ及び８×Ｈｉｓ－（ＧＳ）４－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ－（ＧＳ）８－ＨＵＨの両方を、ｐＥＴ４１ ＬＩＣベクターに挿入した。他の構築物を、Ｎ末端６ヒスチジンタグを有するｐＥＴ１５ ＬＩＣベクターにクローニングした。Ｎ末端のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タグを使用して、１１４－（ＧＳ）８－ＫＲＡＳＧ１２Ｄの収率を改善した。
【0066】
タンパク質発現及び精製
プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に形質転換し、細胞を６００ｎｍで光学密度およそ０．５になるまで３７℃で培養し、次いで１６℃へ移した。次いで、吸光度が０．８に達したら、イソプロピル－β－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．２ｍＭになるように添加した。細胞を、１６℃で１６時間ＩＰＴＧ誘導した後に採取した。
プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に形質転換し、細胞を６００ｎｍで光学密度およそ０．５になるまで３７℃で培養し、次いで１６℃へ移した。次いで、吸光度が０．８に達したら、イソプロピル－β－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．２ｍＭになるように添加した。細胞を、１６℃で１６時間ＩＰＴＧ誘導した後に採取した。
【0067】
細胞ペレットを、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２０ｍＭイミダゾール及び１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する緩衝液に再懸濁した。マイクロ流動化装置に通すことによって溶解した後、細胞溶解物を２００００ｇで１時間遠心分離し、上清をＮｉ－ＮＴＡカラムにロードした。標的タンパク質を、同じ緩衝液中の２００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【0068】
ＫＥＡＰ１構築物の場合、Ｎ末端Ｈｉｓタグを、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼによって切断した。ビオチン化後に、ＫＥＡＰ１タンパク質をイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。Ｎｉ－ＮＴＡカラムから溶出した後、ＫＲＡＳＧ１２Ｄを、ＨｉＴｒａｐ－ＳＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。次いで、ヌクレオチド交換アッセイを実行して、均質なＧＴＰ結合ＫＲＡＳＧ１２Ｄを得、その後サイズ排除クロマトグラフィーをした。
【0069】
ビオチン化反応
ＡｖｉＴａｇＴＭ技術（Ａｖｉｄｉｔｙ）を使用して、ＫＥＡＰ１構築物をビオチン化した。ＡｖｉＴａｇ［配列：ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１）］は、大腸菌ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）酵素の基質であり、リジン残基にビオチン分子をコンジュゲートする。精製したＡｖｉＴａｇ融合ＫＥＡＰ１の濃度を１００μＭに調整した後、ＡＴＰ、塩化マグネシウム、精製したビオチンリガーゼＢｉｒＡ及びＤ－ビオチンを、それぞれ終濃度２ｍＭ、５ｍＭ、１μＭ及び２００μＭになるように添加した。試料を室温で１時間インキュベートした。ビオチン化効率を、ストレプトアビジンゲルシフトアッセイによって決定した：ビオチン化ＫＥＡＰ１試料１μＬ及び１×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液１０μＬを含有するＰＣＲ管をそれぞれ２つ用意し；両方の試料を９５℃で５分間加熱し；試料を室温まで冷ました後、試料のうち一方に１００μＭストレプトアビジン（ＩＢＡ－Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）１μＬを添加し、室温で５分間インキュベートし；両方の試料を並べてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ストレプトアビジン存在下でのＫＥＡＰ１の完全な消失は、ビオチン化反応の完了を示した。
ＡｖｉＴａｇＴＭ技術（Ａｖｉｄｉｔｙ）を使用して、ＫＥＡＰ１構築物をビオチン化した。ＡｖｉＴａｇ［配列：ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１）］は、大腸菌ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）酵素の基質であり、リジン残基にビオチン分子をコンジュゲートする。精製したＡｖｉＴａｇ融合ＫＥＡＰ１の濃度を１００μＭに調整した後、ＡＴＰ、塩化マグネシウム、精製したビオチンリガーゼＢｉｒＡ及びＤ－ビオチンを、それぞれ終濃度２ｍＭ、５ｍＭ、１μＭ及び２００μＭになるように添加した。試料を室温で１時間インキュベートした。ビオチン化効率を、ストレプトアビジンゲルシフトアッセイによって決定した：ビオチン化ＫＥＡＰ１試料１μＬ及び１×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液１０μＬを含有するＰＣＲ管をそれぞれ２つ用意し；両方の試料を９５℃で５分間加熱し；試料を室温まで冷ました後、試料のうち一方に１００μＭストレプトアビジン（ＩＢＡ－Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）１μＬを添加し、室温で５分間インキュベートし；両方の試料を並べてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ストレプトアビジン存在下でのＫＥＡＰ１の完全な消失は、ビオチン化反応の完了を示した。
【0070】
ヌクレオチド交換
ＫＲＡＳの本質的なＧＴＰアーゼ活性のため、精製したＫＲＡＳの大多数は、最終的にはＧＤＰが結合した不活性状態に転換された。ＧＴＰが結合した活性化型形態のタンパク質を調製するために、結合しているＧＤＰを、グアノシン－５’－［（β、γ）－メチレノ］三リン酸（ＧＭＰ－ＰＣＰ）などの加水分解抵抗性ＧＴＰ類似体によって置き換えた。ＫＲＡＳＧ１２Ｄの濃度を、４０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０μＭ ＺｎＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＧＭＰＰＣＰを含有する緩衝液中に１００μＭになるように調整した。セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｐ－０７６２）にコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを、１０Ｕ／ｍＬになるように添加した。穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベーションした後、反応を１０ｍＭ ＭｇＣｌ２で補充し、アルカリホスファターゼビーズを短い遠心分離回転によって除去した。ＧＴＰ結合ＫＲＡＳＧ１２Ｄをサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製して、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰを含有する緩衝液中の遊離ヌクレオチドを除去した。
ＫＲＡＳの本質的なＧＴＰアーゼ活性のため、精製したＫＲＡＳの大多数は、最終的にはＧＤＰが結合した不活性状態に転換された。ＧＴＰが結合した活性化型形態のタンパク質を調製するために、結合しているＧＤＰを、グアノシン－５’－［（β、γ）－メチレノ］三リン酸（ＧＭＰ－ＰＣＰ）などの加水分解抵抗性ＧＴＰ類似体によって置き換えた。ＫＲＡＳＧ１２Ｄの濃度を、４０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０μＭ ＺｎＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＧＭＰＰＣＰを含有する緩衝液中に１００μＭになるように調整した。セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｐ－０７６２）にコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを、１０Ｕ／ｍＬになるように添加した。穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベーションした後、反応を１０ｍＭ ＭｇＣｌ２で補充し、アルカリホスファターゼビーズを短い遠心分離回転によって除去した。ＧＴＰ結合ＫＲＡＳＧ１２Ｄをサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製して、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰを含有する緩衝液中の遊離ヌクレオチドを除去した。
【0071】
上記の参照文献を、全体として参照により組み込む。
例示的な実施形態を、例示し、記載してきたが、様々な変更が、本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ得ることはいうまでもない。
独占的財産権又は特権が主張される本発明の実施形態が、以下の通り定義される：
例示的な実施形態を、例示し、記載してきたが、様々な変更が、本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ得ることはいうまでもない。
独占的財産権又は特権が主張される本発明の実施形態が、以下の通り定義される：
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】