▶ オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】ナノ操作された治療用ステルス細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220131BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220131BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20220131BHJP
A61K 31/65 20060101ALI20220131BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220131BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20220131BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61K35/12
A61P35/00
A61P15/00
A61K48/00
A61K35/768
A61K31/65
A61K9/08
C12N5/09
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021521288
(86)(22)【出願日】2019-10-18
(85)【翻訳文提出日】2021-06-15
(86)【国際出願番号】 US2019056988
(87)【国際公開番号】W WO2020081966
(87)【国際公開日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】62/747,980
(32)【優先日】2018-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】514137997
【氏名又は名称】オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】特許業務法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ギャレゴ－ペレス，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】カーソン，ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】ドゥアルテ サンミゲール，シルビア エム．
(72)【発明者】
【氏名】イギータ－カストロ，ナタリア
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA30
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA11
4C076BB11
4C076CC27
4C076FF11
4C076FF34
4C084AA13
4C084MA01
4C084MA02
4C084MA16
4C084MA66
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA81
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA29
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA07
4C086MA16
4C086MA66
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA81
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087CA12
4C087CA20
4C087MA01
4C087MA02
4C087MA16
4C087MA66
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA81
4C087ZB26
(57)【要約】
本明細書中で開示されるのは、これらの高運動性ＧＳＣ及び／又はＭＤＳＣクローンなどの、腫瘍で見られる高運動性細胞を、脳などの体内の新しい再発病巣を探索し破壊することができる、「自己破壊性」細胞「ミサイル」（本明細書中では治療用ステルス細胞と呼ぶ）に「再プログラミング」する方法である。運動性が増強した細胞を、異種集団から選別し、次いで腫瘍溶解性ウイルスプラスミドカクテルなどの抗がん剤の決定的送達によって「自己破壊性」にすることができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療用ステルス細胞を産生する方法であって、（ａ）運動性の高い亜集団について対象から腫瘍細胞を選別し；そして
（ｂ）前記亜集団に抗がん剤を送達するように再プログラミングすることを含む、方法。
【請求項2】
前記亜集団を、化学誘引物質勾配を使用する遊走アッセイにおいて選別する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記亜集団を、ナノテクスチャー付及び／又はバイオミメティック表面を使用する遊走アッセイにおいて選別する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記亜集団を、トランスウェル遊走アッセイ又はＢｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにおいて選別する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記亜集団を、抗腫瘍タンパク質、オリゴヌクレオチド、又はその組み合わせをコード化する導入遺伝子を異種発現するように再プログラミングする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記導入遺伝子が、メタロプロテイナーゼ－３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－３）をコード化する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記亜集団を、キルスイッチシステムで再プログラミングする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記亜集団がＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏＬｙ６Ｇ＋骨髄由来サプレッサ細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記亜集団をフローサイトメトリによって選別する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって産生される複数の治療用ステルス細胞を含む、組成物。
【請求項11】
薬剤的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
対象における腫瘍を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項13】
前記腫瘍が乳がんである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる、２０１８年１０月１９日に出願された米国特許仮出願番号６２／７４７，９８０の優先権を主張する。
本願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる、２０１８年１０月１９日に出願された米国特許仮出願番号６２／７４７，９８０の優先権を主張する。
【0002】
腫瘍細胞の転移は、がん関連死の主な要因である（＞９０％）（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １２：４４２４－４４３２（２０１２）；Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：４５３－４５８（２００３）；Ｇｕｐｔａ，Ｇ．Ｐ．＆ Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ １２７：６７９－６９５（２００６））。特に、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、侵襲性の高い致死型脳腫瘍である（Ｂｅｌｌａｉｌ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３６：１０４６－１０６９（２００４））。この高悪性度の腫瘍は、明確な頭蓋内拡散パターンを示し、事前に整列された白質路に沿って単一細胞として効果的に転移する（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １２：４４２４－４４３２（２０１２）；Ｂｅｌｌａｉｌ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３６：１０４６－１０６９（２００４））。侵襲性表現型のＧＢＭが細胞運動性によって調節されることを示す証拠はますます増えている（Ｇｉｅｓｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２１：１６２４－１６３６（２００３））。さらに、再発は主に、従来の療法に対して耐性である、神経膠腫幹細胞（ＧＳＣ）として知られる、運動性の高い腫瘍開始細胞のサブセットによって引き起こされるようである（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １１：６９－８２（２００７）；Ｇｈｏｔｒａ，Ｖ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ ８５，９５５－９６２（２００９））。ＧＳＣは科学界及び医学界から大きな関心を集め続けているので、ＧＳＣが拡散して脳内での新しい腫瘍増殖巣を発生させるメカニズムをより良く理解し対抗するために、新しい分析及びエンジニアリングツールが必要である。しかしながら、ＧＳＣ運動性及び治療耐性に関する研究は、発がん性形質転換に関する継続的な取り組みと比べて限定されている。これは、一つには、ＧＳＣの特定のサブセット、又はＧＢＭニッチからの他の関心対象の細胞を、研究、診断及び／又は治療目的で特定、研究、及び操作するために有効なツールが存在しないためである。インビボ画像化による単一クローンレベルでの腫瘍の特定決定は非常に困難である（Ｉｒｉｍｉａ，Ｄ．＆ Ｔｏｎｅｒ，Ｍ．Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）１：５０６－５１２（２００９）；Ｃｏｎｄｅｅｌｉｓ，Ｊ．＆ Ｓｅｇａｌｌ，Ｊ．Ｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：９２１－９３０（２００３））。さらに、組織外植片のエクスビボ分析用の現行の技術は、面倒で限定的である傾向がある（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５：５３１－５４０（２００９））。一方、従来のインビトロアッセイ（Ｂｏｙｄｅｎ，Ｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １１５，４５３－４６６（１９６２）；Ａｌｂｉｎｉ，Ａ．＆ Ｂｅｎｅｌｌｉ，Ｒ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，５０４－５１１（２００７）；Ｒａｏ，Ｊ．Ｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３，４８９－５０１（２００３）；Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．＆ Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｃｅｌｌ １３０，６０１－６１０（２００７）；Ｌｉａｎｇ，Ｃ．Ｃ．，Ｐａｒｋ，Ａ．Ｙ．＆ Ｇｕａｎ，Ｊ．Ｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，３２９－３３３（２００７））は、生理学的に関連性がない、及び／又は高度に不均質な細胞集団のバルク挙動（ｂｕｌｋ ｂｅｈａｖｉｏｒ）にのみ注目したエンドポイント試験である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
高い転移及び治療耐性能を示すＧＳＣ及びＭＤＳＣのサブセットがある。これらの知見は、ＧＳＣ及びＭＤＳＣがモノリシック集団ではなく、特定のクローナルサブセットが著しくより「高悪性度」の表現型を示し、おそらくは疾患再発を推進する一因となり得ることを示唆する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本明細書中で開示されるのは、これらの高運動性ＧＳＣ及び／又はＭＤＳＣクローンなどの、腫瘍で見られる高運動性細胞を、脳などの体内の新しい再発病巣を探索し破壊することができる、「自己破壊性」細胞「ミサイル」（本明細書中では治療用ステルス細胞と呼ぶ）に「再プログラミング」する方法である。運動性が増強された細胞を、異種集団から選別し、次いで腫瘍溶解性ウイルスプラスミドカクテルなどの抗がん剤の決定的送達によって「自己破壊性」にすることができる。
【0005】
開示された方法は、治療用ステルス細胞を作製するために対象から細胞を選別することを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、治療される対象からの血球又は腫瘍生検など、自己由来である。しかしながら、場合によっては、細胞はアロジェニックである。
【0006】
開示された方法は、運動性の高い亜集団について対象から細胞を選別し、次に抗がん剤を送達するように当該亜集団を再プログラミングすることを含み得る。いくつかの実施形態では、亜集団は化学誘引物質勾配を使用する遊走アッセイで選別することができる。特に、化学誘引物質勾配は、治療される腫瘍によって産生されるケモカインを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、化学誘引物質はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を含む。いくつかの実施形態では、化学誘引物質は腫瘍細胞馴化培地を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、亜集団は、ナノテクスチャー付及び／又はバイオミメティック表面を使用する遊走アッセイで選別する。例えば、ＭＤＳＣは、生化学的刺激の非存在下で、事前に整列された構造的キューに反応し、これに沿って誘導することができる。したがって、いくつかの実施形態では、表面は、マイクロスケール又はナノスケールの突起／溝を含む。例えば、突起／溝の深さ及び幅は、１００ｎｍ～１μｍ、１μｍ～１０μｍ、５００ｎｍ～５μｍを含む１００ｎｍ～１０μｍの寸法を有し得る。突起／溝は、まっすぐな溝を含む様々な形状及びパターンを有し得る。
【0008】
いくつかの実施形態では、亜集団は、トランスウェル遊走アッセイ又は細胞浸潤アッセイで選別される。トランスウェル遊走アッセイは、多孔質膜を通過する細胞の数を測定し、一方、細胞浸潤アッセイは、細胞外マトリックスを介した侵襲性細胞遊走に焦点を当てる。
【0009】
亜集団が選別され、任意選択的に拡大されると、細胞は次に、抗腫瘍タンパク質、オリゴヌクレオチド、又はその組み合わせをコード化する導入遺伝子を異種発現するように再プログラミングすることができる。
【0010】
効率的な「安全スイッチ」の導入を使用して、場合によっては、重篤な移植片対宿主病のリスクを軽減することができる。したがって、いくつかの実施形態では、亜集団はまた、キルスイッチシステムで再プログラミングされる。これまでに最も広く研究されている安全スイッチは、ＨＳＶ Ｉ由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子産物である。非免疫原性安全スイッチシステムも開発されており、これは、修飾ヒトＦＫ５０６結合タンパク質と連結されたヒトアポトーシス促進分子（例えば、カスパーゼ９）（すなわち、ｉＣａｓｐ９）から構成される融合タンパク質を含む。これらの安全スイッチは、ＦＫ５０６の二つの合成変異体の二量体からなる化学二量化誘導物質（ＣＩＤ）の注射によって活性化することができる。他の誘導可能な自己破壊的キルスイッチが開発中であり、開示された治療用ステルス細胞において使用することができる。
【0011】
また、開示された方法によって産生される複数の治療用ステルス細胞を含む組成物も開示する。特定の実施形態において、組成物は薬剤的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0012】
対象における腫瘍を治療する方法であって、当該対象に有効量の開示された医薬組成物を投与することを含む方法も開示されている。開示された方法を使用して、任意の固形腫瘍を治療することができる。特定の実施形態では、腫瘍は、治療用ステルス細胞を発生させるために使用した細胞源と合致する。例えば、乳がん生検から得た高運動性ＭＤＳＣを再プログラミングして、乳がんを治療することができる。同様に、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）生検から得た高運動性ＧＳＣ／ＭＤＳＣを再プログラミングして、ＧＢＭを治療することができる。
【0013】
本発明の一つ以上の実施形態の詳細を添付の図面及び以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明、及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】図１Ａ～１Ｅは、遊走ベースの選別／「クロマトグラフィー」の結果を示す。図１Ａは、ナノテクスチャー付表面がガイドされた運動性を誘導することを示す。高運動性を有するクローンは、化学誘引によって収集チャンバー中に誘引される。図１Ｂは、ＧＳＣを用いた研究によって、高運動性クローンが抗ｍｉＲ３６３療法に対して耐性であったことが分かることを示す。図１Ｃは、ＭＤＳＣの遊走ベースの選別によって、バルクＭＤＳＣと比較して、優れた運動性を有するクローンサブセットが明らかになったことを示す。図１Ｄは、選別によって、顆粒球（Ｐ４）及び単球（Ｐ５）サブタイプを有する多様な表現型が示されたことを示す。また、低（Ｐ６）Ｌｙ６－Ｃ／Ｇ又は高（Ｐ３）Ｌｙ６－Ｃ／Ｇを示す分類されていないサブタイプも存在していた。図１Ｅは、高運動性を有するＭＤＳＣクローンがＰ４又はＰ３のいずれかであったことを示す。＊ｐ＜０．０５。
【図1B】同上。
【図1C】同上。
【図1D】同上。
【図1E】同上。
【図3】図３は、ＭＤＳＣがテクスチャー付／バイオミメティック表面上で（すなわち、ガイドされた）著しい運動性を示すことを示す。一方、ＴＣＰ上で培養されたＭＤＳＣは、限定された運動性を示す。これらの結果は、腫瘍細胞と同様に、ＭＤＳＣが、腫瘍細胞転移をインビボで増強する同じ構造的キューに反応し得ることを示唆する。＊ｐ＜０．０５。
【図4A-B】図４Ａ及び４Ｂは、ＭＤＳＣをプラットフォームの片側に選択的に播種し、走化性により一方向に遊走させる、遊走クロマトグラフィーセットアップを示す。表面ナノテクスチャーは、ガイドされた運動性に基づいたクローン分離を引き起こす。図４Ｃは、高速移動する細胞ｖｓ低速移動する細胞の速度を示す。図４Ｄ及び４Ｅは、高速移動するクローンが、低速移動するクローン（例えば、バルクＭＤＳＣ）と比較して異なる表現型を有することを示すフローサイトメトリ分析を含む。＊ｐ＜０．０５。
【図4C】同上。
【図4D】同上。
【図4E】同上。
【図5A】図５Ａ及び５Ｂは、黒色腫患者からの循環ＭＤＳＣの単一クローン運動性アッセイを示す。各患者についての速度の相違（図５Ａ）及び有効変位の相違（図５Ｂ）。結果から、ある特定の患者由来のＭＤＳＣが速度の増強を示すことが分かる。しかしながら、有効変位（すなわち、出発位置から終了位置までの幾何学的距離）を考慮する場合、低速のある特定のＭＤＳＣバッチは、有意な変位を示し、これは、より高い指向性／持続性運動性（走化性無し）を反映するものであり得る。Ｐ１：ステージＩＩＩＣ、ｔｘニボルマブ＋手術；Ｐ２：ステージＩＶ、ｔｘニボルマブ；Ｐ３：ステージＩＶ Ｖ６００Ｅ／ＢＲＡＦ、ｔｘ放射線＋ペムブロリズマブ；Ｐ４：ステージＩＶ、ｔｘニボルマブ＋イピルママブ（ｉｐｉｌｕｍａｍａｂ）；Ｐ５：ステージＩＶ、ｔｘペムブロリズマブ／イピルママブ（ｉｐｉｌｕｍａｍａｂ）／ニボルマブ；Ｐ６：ステージＩＶ Ｖ６００Ｅ／ＢＲＡＦ、ＩＮＦ－αで治療）。
【図5B】同上。
【図6A】図６Ａ及び６Ｂは、ナノテクスチャー付表面を使用して、標準的ＴＣＰで観察されない薬物感受性を明らかにできることを示す。図６Ａは、患者由来のＭＤＳＣの単一クローン運動性アッセイが、イブルチニブに反応した特定のクローンサブセット（平均速度＞４０μｍ／ｈ）の阻害を示すことを示す。図６Ｂは、ＴＣＰでの単一クローン運動性によって、ＭＤＳＣ転移に対するイブルチニブの影響は明らかにならなかったことを示す。
【図6B】同上。
【図7A】図７Ａおよび図７Ｂは、関心対象のクローンの自動的脱離を可能にするための統合型マイクロ流体を有する遊走クロマトグラフィー用装置を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、遊走ベースの分離が起こると、内在するマイクロ流体システムを使用して、所定の位置に冷水を連続的に流すことができ、ＰＩＮＩＰＡＭ層の熱作動により、関心対象のＭＤＳＣクローンの選択的脱離が促進されることを示す。
【図7B】同上。
【図7C】同上。
【図7D】同上。
【図8A】図８Ａは、ＭＤＳＣと非がん性ＭＣＦ１０Ａとを同時培養することで、ＭＣＦ１０Ａクローン群において運動性が増強されたことを示す。図８Ｂは、免疫蛍光分析によって、同時培養条件が、上皮型カドヘリンなどの上皮マーカーの発現の減少、及びある特定のクローンにおける間葉性マーカー（例えば、ビメンチン）の増加を引き起こしたことがわかることを示す。図８Ｃは、ＭＤＳＣとすでに高悪性のＭＤＡＭＢ－２３１細胞とを同時培養することによって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１集団における運動性の大きな変化が起こらなかったことを示す。●：単独培養、■：５０：５０同時培養、▲：９０：１０同時培養（ＭＤＳＣ：乳がん／組織細胞）。
【図8B】同上。
【図8C】同上。
【図9】図９は、ＭＤＳＣと乳房組織／がん細胞とを同時培養することで、特に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１と同時培養した場合に、ある特定のＭＤＳＣクローンの速度の著しい増加が起こったことを示す。これらの結果は、ＭＤＳＣ運動性が転移細胞の存在下で正に調節されて腫瘍の外側への同時転移、及び腫瘍細胞転移プロセスの間の継続した免疫保護が促進されることを潜在的に示唆する。
【図10A-B】図１０Ａ～１０Ｅは、ＭＤＳＣが整列された構造的キューに反応し、ガイドされた転移パターンを示すことを示す。図１０Ａは、それぞれ腫瘍間質を回避及び浸潤するために事前に整列された構造的キュー（例えば、再構築されたＥＣＭ、血管壁）を使用する侵襲性がん細胞及び浸潤性ＭＤＳＣを示す腫瘍微小環境の概略図である。図１０Ｂは、単一クローンレベルで構造的にガイドされたＭＤＳＣ遊走を評価するために用いられるＰＤＭＳベースのバイオミメティックテクスチャー付表面のＳＥＭ顕微鏡写真（ＭＤＳＣ実物大模型と重ね合わせたもの）である。図１０Ｃは、テクスチャー付表面ｖｓ対照／ＴＣＰ表面上で培養されたＭＤＳＣのアクチン－核染色を示す。ＭＤＳＣは、ＴＣＰと比較して、テクスチャー付表面上で、整列された／より遊走性の高い形態をとる。図１０Ｄ及び１０Ｅは、テクスチャー付表面ｖｓ対照／ＴＣＰ表面上の単一クローン転移トラック（図１０Ｄ）及びＭＤＳＣの定量化（図１０Ｅ）を示し、事前に整列された構造的キューに曝露された場合のＭＤＳＣの増強された転移能（すなわち、平均単一クローン速度及び正味トラック距離）を裏付ける。正味トラック距離は、トラッキング期間中に細胞が移動した幾何学的距離を反映したものである。＊ｐ＜０．０１及び‡ｐ＜０．０２（ｔ検定、ｎ＝４）。
【図10C】同上。
【図10D】同上。
【図11A-B】図１１Ａ～１１Ｉは、ＭＤＳＣ亜集団が、異なる転移及び遺伝子発現パターンを示すことを示す。図１１Ａ及び１１Ｂは実験計画の概略図である。ここでは、ＭＳＣ－２培養物を、フローサイトメトリによって、顆粒球ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏＬｙ６Ｇ＋）及び単球ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｈｉＬｙ６Ｇ－）、並びにＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞を含む三つの異なる亜集団に選別した。次いで、各集団を、テクスチャー付ＰＤＭＳ上での単一クローン運動性アッセイ並びに炎症誘発マーカー及び抗炎症マーカーのｑＲＴ－ＰＣＲ分析に供した。図１１Ｃは、テクスチャー付表面上で培養した異なるＭＳＣ－２サブタイプのアクチン－核染色を示す。顆粒球ＭＤＳＣはそれらのカウンターパートと比較してより整列された遊走しやすい形態を示す傾向があった。図１１Ｄは、テクスチャー付表面上での各サブタイプの単一クローン転移（すなわち、平均速度及び正味トラック距離）定量化を示す。＊ｐ＝０．００６、＊＊ｐ＜０．００１、ψｐ＝０．００１、‡ｐ＝０．０９（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４）。図１１Ｅは各集団の単一クローントラックを示す。図１１Ｆは、担癌マウス（すなわち、ヌードマウスにおいてヒト細胞から発生した同所性乳がん）に注入された（すなわち、尾静脈から）、蛍光標識されたフロー選別ＭＤＳＣｖｓ「新しい」／非選別ＭＤＳＣを示す。右側の写真は、１週から４週までの腫瘍進行／増殖を示す。図１１Ｇは、注射後２４時間のＭＤＳＣ浸潤の程度を検出するために撮像した腫瘍及び他の標的臓器を示す。図１１Ｈ及び１１Ｉは、各サブタイプの炎症誘発性遺伝子（図１１Ｈ）及び抗炎症遺伝子（図１１Ｉ）のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０００１、‡ｐ＝０．０３（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３～４）。
【図11C】同上。
【図11D】同上。
【図11E】同上。
【図11F】同上。
【図11G】同上。
【図11H】同上。
【図11I】同上。
【図12A】図１２Ａ～１２Ｇは、単一ＭＤＳＣ亜集団が、全表現型範囲にわたる補充を駆動できる表現型の可塑性を示すようであることを示す。図１２Ａは実験計画の概略図である。図１２Ｂは、単一クローン転移（すなわち、平均速度及び正味トラック距離）研究では、７日までに三つの集団すべてで有意差が示されなかったことを示す。図１２Ｃ～１２Ｅは、フローサイトメトリ分析により、全亜集団の選別後１日までは比較的純粋なままであったが、７日までに、表現型の全範囲が出発細胞集団に関係なく補充されたことが示唆されることを示す。＊ｐ＜０．０００１、‡ｐ＝０．０１、＃ｐ＝０．０３、ψｐ＝０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ／Ｔｕｋｅｙの多重比較、ｎ＝３～４）。図１２Ｆ及び１２Ｇは、選別後７日での炎症誘発性遺伝子（図１２Ｆ）及び抗炎症遺伝子（図１２Ｇ）のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。＊ｐ＝０．００６、＊＊ｐ＝０．０１（二元配置ＡＮＯＶＡ／Ｔｕｋｅｙの多重比較、ｎ＝３～６）。
【図12B】同上。
【図12C】同上。
【図12D】同上。
【図12E】同上。
【図12F】同上。
【図12G】同上。
【図13A】図１３Ａ及び１３Ｂは、黒色腫患者由来の循環ＭＤＳＣが、単一クローンレベルで異なる転移プロフィールを示すことを示す。図１３Ａ及び１３Ｂは、平均単一クローン速度（図１３Ａ）及び正味トラック距離（図１３Ｂ）が、ある特定の患者について、患者集団の残りと比較して有意に高い傾向を有していたことを示し、これは、患者のバックグラウンドを反映するものであり得る。
【図13B】同上。
【図14A】図１４Ａ～１４Ｆは、患者由来のＭＤＳＣの異なる亜集団が、異なる転移能を示すことを示す。図１４Ａ～１４Ｃは、黒色腫患者ＭＤＳＣが、フローサイトメトリにより顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１４－）及び単球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋）亜集団に選別されたことを示す。図１４Ｄ～１４Ｆは、マウスＭＤＳＣにおける観察結果と同様に、患者由来のＭＤＳＣの顆粒球亜集団も、単球サブタイプと比較して増大した転移（すなわち、平均単一クローン速度及び正味トラック距離）能力を示すことを示す。＊ｐ＝０．０００５、＊＊ｐ＝０．００２（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ、ｎ＝３）。
【図14B-C】同上。
【図14D】同上。
【図14E】同上。
【図14F】同上。
【図15A】図１５Ａ及び１５Ｂは、フローサイトメトリで選別された亜集団についての時間の関数として炎症誘発性マーカー（図１５Ａ）及び抗炎症マーカー（図１５Ｂ）の遺伝子発現の差を示す。＊ｐ＜０．０００１、‡ｐ＝０．０６（二元配置ＡＮＯＶＡ／Ｓｉｄａｋの多重比較、ｎ＝３～６）。
【図15B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本開示をさらに詳細に記載する前に、本開示は記載した特定の実施形態に限定されず、したがって、もちろん変化し得ることを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0016】
値の範囲が提示されている場合、当該範囲の上限と下限との間の、文脈上明らかに別段の記載が無い限り下限の単位の１０分の１までの各介在値、及び記載した範囲内の記載した任意の他の値又は介在する値は、本開示内に含まれると理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は独立してこのより小さな範囲内に含まれ得、記載した範囲内で特に除外される限界値がない限り、これもまた本開示の範囲内に含まれる。記載した範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれか又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
【0017】
特に別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての科学技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用できるが、ここでは好ましい方法および材料について記載する。
【0018】
本明細書で言及するすべての刊行物及び特許は、各々の刊行物又は特許が参照により本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書中に組み込まれ、言及される刊行物と関連して方法及び／又は材料を開示し説明するように参照により本明細書中に組み込まれる。任意の刊行物の言及は、出願日以前のその開示についてであり、本開示が先行開示によりそのような刊行物に先行する権利が与えられないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提示される公開日は、独立して確認される必要がある可能性がある実際の公開日とは異なる可能性がある。
【0019】
本開示を読むと当業者には明らかになるように、本明細書中で記載し図示した個々の実施形態の各々は、本開示の範囲又は主旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離することができるか又はいずれかの特徴と容易に組み合わせることができる成分及び特徴であり得る個別の成分及び特徴を有する。任意の言及される方法は、言及される事象の順序で、又は論理的に可能である任意の他の順序で実施することができる。
【0020】
本開示の実施形態は、別段の指示のない限り、当該技術分野の技術範囲内である、化学、生物学などの技術を採用する。
【0021】
以下の実施例は、如何にして本明細書中で開示され請求される方法を実施し、プローブを使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載する。数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確保するよう努めたが、多少の誤差や偏差がある。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。標準温度及び圧力は２０℃及び１気圧と定義される。
【0022】
本開示の実施形態を説明する前に、別段の指示のない限り、本開示は、変動し得るので、特定の材料、試薬、反応材料、製造プロセスなどに限定されないことを理解されたい。また、本明細書中で使用される術語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。本開示ではまた、ステップを、これが論理的に可能である異なる順で実行できることも可能である。
【0023】
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で明らかに別段の記載が明示されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【0024】
「自殺遺伝子」は、本明細書中で使用する場合、アポトーシスにより細胞を自殺させる遺伝子を指す。これらの遺伝子の活性化は多くのプロセスに起因し得るが、アポトーシスを誘導する主な細胞「スイッチ」はｐ５３タンパク質である。自殺遺伝子の刺激又は導入（遺伝子療法による）を使用して、がん細胞をより受攻性、化学療法に対してより感受性にすることによって、がん又は他の増殖性疾患を治療することができる。がん細胞において発現された遺伝子の一部は、無害な物質を腫瘍にとって有毒である物質に変換できる、哺乳動物においてみられない酵素の他の遺伝子に結合される。この感受性を媒介する自殺遺伝子は、不活性な薬物を、核酸の合成を阻害する有毒な代謝拮抗物質に変換するウイルス又は細菌酵素をコード化することができる。
【0025】
高運動性ＧＳＣ及び／又はＭＤＳＣクローンは、ナノチップ支持単一クローン運動性クロマトグラフィーなどの遊走ベースの選別によって異種集団から選別することができる。遊走ベースの細胞選別の方法は、集団の残りと比較して増強された転移能を示すクローンサブセット及び／又は細胞亜集団を特定することを含む。そのような細胞は、本質的に原発性腫瘍へのホーミング／浸潤及び／又は転移性増殖の傾向が高く、したがって、より効率的な薬物／遺伝子送達ビヒクルとしての役割を果たし得る。高転移性クローンサブセットを特定することで、様々な方法で達成することができる。
【0026】
一つの選択肢は、細胞混合物をミクロ又はナノテクスチャー付表面上にラインで播種することであり、これにより、細胞の接触でガイドされた方向性遊走が誘導される。例えば、ＭＤＳＣは、生化学的刺激の非存在下で、事前に整列された構造的キューに反応し、これに沿ってガイドすることができる。
【0027】
細胞は、細胞が遊走する特定方向を規定する化学誘引物質勾配に曝露することができ、「高速移動する」クローンは、それらが化学誘引物質に向かって遊走するにつれ、容器中に次第に収集することができる。化学誘引物質の非存在下でこの選別を実施することはまた、化学誘引物質の非存在下でさえも、単一方向運動性（すなわち、収集容器へ向かう）をより示しやすい可能性があるクローンサブセットを特定する一方法として使用することができる。これらの細胞が必ずしも最速の移動物であるとは限らなくても、それらが単一方向で持続的運動性を示す能力は、インビボで転移する能力の増強に翻訳することができ（例えば、遊走速度が高いが、方向性が欠如した細胞は、必ずしも最も有効な「浸潤物」であるとは限らない可能性がある）、これはまた、これらのクローンを、原発性腫瘍及び／又は転移性増殖への増強された薬物／遺伝子送達に望ましいものにする。
【0028】
転移能が増強した細胞を選択するための別の方法は、トランスウェルシステム（例えば、８ミクロン孔）での転位アッセイによるものであり得る。例えば、細胞をトランスウェルのトップチャンバー上に播種することができ、転移能が増強した細胞は孔を横切ってボトムチャンバーへと徐々に転位し、ボトムチャンバーで、それらをさらなる修飾（遺伝子／薬物送達適用のため）のために収集することができる。
【0029】
本明細書中で開示されるように、細胞の開示された亜集団はＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏＬｙ６Ｇ＋骨髄由来サプレッサ細胞である。したがって、いくつかの実施形態では、高運動性細胞は、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、及びＬｙ６Ｇと選択的に結合する抗体の組み合わせを使用した腫瘍由来のＧＳＣ及び／又はＭＤＳＣの細胞選別によって得られる。
【0030】
いくつかの実施形態では、細胞は、原発性腫瘍細胞由来である（例えば、ルーチンの生検から単離される）。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄由来サプレッサ細胞由来である（例えば、循環から単離される）。しかしながら、開示された方法は、がん性組織に浸潤しやすい任意の他の細胞タイプ（例えば、他の単球、Ｔ細胞など）に適用することができる。
【0031】
高播種性クローンの事前選択が完了したら、これらの細胞をまず増殖させることができ、次いで、導入遺伝子のウイルス又は非ウイルス（例えば、バルクエレクトロポレーション、組織ナノトランスフェクション）送達、及び／又はＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９で駆動される導入遺伝子挿入を含む様々な経路を介して遺伝子操作することができる。このステップの目標は、これらの細胞による抗腫瘍タンパク質、オリゴ、及び／又は他の物体（例えば、ｇｌｕｔ１、ｍｉｒ１４６、腫瘍溶解性ウイルスなど）の産生を誘導することである。これらの高運動性亜集団の遺伝子操作が完了したら、これらの細胞を次いで、がん性増殖を根絶することを目的として、全身的（例えば、血液中、リンパ系）、又は局所的（原発性腫瘍若しくは転移性腫瘍へ）のいずれかで患者に戻すことができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はメタロプロテイナーゼ－３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－３）をコード化する。
【0032】
がん用途について、これらの細胞を操作（トランスフェクションを介して）して、炎症誘発性分子（例えば、ｃｃｌ４、ｍｉｒ１４６、ｇｌｕｔ１）を発現して、腫瘍、又は抗転移成分（例えば、ｔｉｍｐ３）へのＴ細胞浸潤を促進して、がん転移を防止することができる。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣを使用して、抗炎症分子を送達するアルツハイマー病若しくは糖尿病などの他の状態、又は他の形態の脳損傷（例えば、虚血性脳卒中）での治療法を施し、この場合、ＭＤＳＣは自然にホーミングして、一旦、血管新生促進及び／若しくは前神経、又は抗炎症剤などの治療カーゴを送達できる。
【0034】
これらの自己細胞は、（患者に注射して戻す前に）薬物誘導性（例えば、ドキシサイクリン）「キルスイッチ」システムでさらに操作して、治療用細胞の作用が必要なくなったらそれらを根絶することができる。キルスイッチシステムは当該技術分野で公知であり、したがって、好適なキルスイッチシステムを選択し採用することは当業者の管轄内である。
【0035】
本発明の多数の実施形態を記載してきた。それでも、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく様々な修正をなすことができると理解される。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に含まれる。
【実施例】
【0036】
実施例１：ナノエンジニアリング治療用ステルス細胞
ＧＳＣの転移能、並びにそれらが免疫系又は標準的治療を回避する能力は、引き続き主要な致死因子であり続ける。ナノスケールツールを使用して、高い転移及び治療耐性能を示すＧＳＣの特定のサブセットを単離し研究した（図１）。
ＧＳＣの転移能、並びにそれらが免疫系又は標準的治療を回避する能力は、引き続き主要な致死因子であり続ける。ナノスケールツールを使用して、高い転移及び治療耐性能を示すＧＳＣの特定のサブセットを単離し研究した（図１）。
【0037】
また、ＭＤＳＣを用いたパイロット試験によって、ＧＳＣと同様に、顕著な転移能力を有するクローンサブセットが明らかになった（図１）。これらの知見は、ＧＳＣ及びＭＤＳＣがモノリシック集団ではないこと、そして特定のクローンサブセットが、おそらくは疾患再発を引き起こす原因となり得る、有意により「高悪性度の」表現型を示すことを示唆している。この実施例で開示するのは、高運動性ＧＳＣ及び／又はＭＤＳＣクローンを、脳内の新しい再発病巣を捜索し破壊できる「自己破壊性」細胞「ミサイル」に再プログラミングすることによって、ＧＢＭ再発を最小限に抑える、斬新なハイリスク／ハイリターンのアプローチの開発である。運動性が増強されたＧＳＣ及びＭＤＳＣを、図１に示すように、ナノチップ支持単一クローン運動性「クロマトグラフィー」によって異種集団から選別する。これらの細胞を次いで、限定されたクローン性増殖（２～５継代）に供し、続いて腫瘍溶解性ウイルスプラスミドカクテルの決定的なナノチャンネルベースの送達（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １２：３９９－４０９（２０１６））によって「自己破壊的」にする。これらのウイルスは従来型療法とは異なるメカニズムによってがん細胞を殺滅することができ、したがって、ＧＳＣを根絶するための有望な治療法の選択肢として提案されている（Ｃｒｉｐｅ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１６７７－１６８２（２００９））。
【0038】
一連のインビトロ試験を行って、長時間優れた運動性を保持しつつ、ＧＳＣ又はＭＤＳＣの選択されたサブグループが「自己破壊性」となる最適プラスミド投与量及び比率を決定する。これらの「管理」されているが高運動性のＧＳＣ／ＭＤＳＣ集団を次に、担ＧＢＭマウスに、効果的に転移させ、病変した脳全体にわたって治療用ビリオンを戦略的に放出することを目的として頭蓋内注射（一緒に、また別々に）する（図２）。
【0039】
また、再プログラミング／薬物化ＭＤＳＣの全身送達の比較実験を、これらの細胞が病変した脳にホーミングすることができ、腫瘍進行を妨害することができることを検証するために、担ＧＢＭマウスにおいて実施する。最新式画像化技術（例えば、ＩＶＩＳ、ＰＥＴ、ＭＲＩ）を使用して、治療用ＧＳＣ／ＭＤＳＣの結果をモニタリングする。細胞ベースの腫瘍溶解性ウイルス療法で、腫瘍溶解性ウイルス粒子を用いた直接治療と比較して有望な結果が以前に示されているが（Ｐｏｗｅｒ，Ａ．Ｔ．＆ Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５：６６０－６６５（２００７））、主な制限は、今までのところ研究されてきた細胞のほとんどが、特にＧＳＣの頭蓋内転移のペースと比較した場合、転移能が低減することである。一方、管理／再プログラミングされたＧＳＣ又はＭＤＳＣは、免疫系に対するステルス能力に加えて、本質的に高い頭蓋内運動性を有し得、したがって、それらをコロニー化させ、病変した脳をより効果的に監視し治療することを可能にする。
実施例２：マウスＭＤＳＣの構造的にガイドされた転移
実施例２：マウスＭＤＳＣの構造的にガイドされた転移
【0040】
最近の研究で、ＭＤＳＣは、生化学的刺激の非存在下で、事前に整列された構造的キューに反応し、事前に整列された構造的キューに沿ってガイドできることが示されている（図３～４）。これに対して、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰ）に関する単一クローン運動性アッセイで、低い転移能が明らかになり（図３）、腫瘍細胞と同様に、ＭＤＳＣ転移／浸潤はおそらくは構造的にガイドされた遊走に好ましいことを示唆している。チップ支持された遊走クロマトグラフィー研究によって、高悪性度がん性細胞に相当する、集団の残りと比較して転移能が増強されたクローンサブセットが明らかになった（図４Ａ～４Ｃ）。高速移動するクローンのフローサイトメトリ分析によって、そのような集団が主にＬｙ６－Ｇｈｉｇｈ／Ｌｙ６－Ｃｌｏｗ（顆粒球）及びＬｙ６－Ｇｈｉｇｈ／Ｌｙ６－Ｃｈｉｇｈ（未特定）であることが明らかになった。低速移動するクローンの表現型は、単球（Ｌｙ６－Ｇｌｏｗ／Ｌｙ６－Ｃｈｉｇｈ）及び顆粒球の間、並びに未特定の変異体Ｌｙ６－Ｇｌｏｗ／Ｌｙ６－Ｃｌｏｗ及びＬｙ６－Ｇｈｉｇｈ／Ｌｙ６－Ｃｈｉｇｈの間でより均等に分布していた。したがって、ＭＤＳＣは、明らかに、転移能が改善された特殊化クローンサブセットを有し、これは、おそらくは腫瘍／神経節をコロニー化して免疫抑制を発揮しやすい。そのようなクローンサブセットは、したがって、がんとの闘いにおける新しい治療標的であり得る。
実施例３：患者ＭＤＳＣの構造的にガイドされた転移
実施例３：患者ＭＤＳＣの構造的にガイドされた転移
【0041】
次に、患者由来のＭＤＳＣもまた、生化学的刺激の非存在下で構造的にガイドされた遊走を示すか否かを試験した。異なる治療法の下での、異なるステージの黒色腫患者の末梢血から単離されたＭＤＳＣを約２４時間追跡した。各患者のＭＤＳＣは独自の転移パターン／サインを示し、一部の患者は、バルク集団と比較して移動性が増強されたクローンサブセットを示し（図５）、これは２５μｍ／ｈ未満でクラスター化したままであった。特に、一部の患者は、その速度が２５μｍ／ｈ未満で全体的にクラスター化したＭＤＳＣを有し、おそらくは一見したところ「静止」集団を示すものであり、おそらくは悪性腫瘍のタイプ、及び／又は療法の様式／ステージを反映するものである。インビボ活性及び／又は疾患転帰のそれらのレベルの代理としての役割を果たし得る、これらの因子及びＭＤＳＣの単一クローン転移能／サインの間の明らかな相関関係を確立するためにさらなる研究が必要とされるが、これらのデータは、ＭＤＳＣがモノリシックではないこと、及び運動性に関連するメカニズムを調査することで、潜在的に、改善された療法だけでなく新しい診断／予後ツールの開発のための道を開くことができるという考えをさらに裏付ける。
実施例４：構造的にガイドされた遊走は薬物感受性を明らかにする
実施例４：構造的にガイドされた遊走は薬物感受性を明らかにする
【0042】
腫瘍／神経節へのＭＤＳＣ遊走／浸潤を損なうことは、免疫抑制負荷を低減するため実行可能な戦略であり得る。ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤は通常、血液がんの治療で用いられてきた。ＢＴＫは、細胞遊走を含む多くの生物学的プロセスで役割を果たす。ＭＤＳＣはＢＴＫを発現するが、イブルチニブ（ＢＴＫ－阻害剤）の存在下でのＴＣＰに関する単一クローン運動性アッセイは、遊走に対して顕著な効果を示さなかった（図６）。これに対して、バイオミメティック表面に関する運動性アッセイは、ＭＤＳＣの高運動性サブセットの選択的ターゲティングを示すようである（図５）。そのような結果は、遊走によって駆動される変化（例えば、細胞骨格アラインメント）が、ＭＤＳＣにおける薬物感受性を部分的に調節し得ることを示す。
実施例５：遊走クロマトグラフィーのバイオミメティックプラットフォーム
実施例５：遊走クロマトグラフィーのバイオミメティックプラットフォーム
【0043】
院内のナノファブリケーション専門技術（すなわち、接触／投影ベースのリソグラフィ―、及びソフトリソグラフィ―）を利用して、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から事前に整列された構造的キュー（幅約３００ｎｍ）を作製する。テクスチャー付表面を次に、アルゴンプラズマ（３０ワット、約１０００ｍｉｃｒｏＴｏｒｒ）下で熱応答性ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）で官能化する。ＰＩＮＩＰＡＭコーティングされた基体（厚さ約１００μｍ）を次に、配列されたマイクロチャンネルを有するマイクロ流体システム（幅５０μｍ、ピッチ５００μｍ、独立して操作、図７）と結合させる。これらのチャンネルを使用して、テクスチャー付ＰＤＭＳの下に冷水を選択的に流し、ＰＩＮＩＰＡＭからの熱活性化による選択的細胞脱離（すなわち、弱疎水性から高親水性へスイッチ）を促進する。ナノテクスチャー付表面は、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）によって特徴づけられる。ＰＮＩＰＡＭコーティングは、異なる温度での接触角測定、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）及びフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）により検証される。
実施例６：ＭＤＳＣ運動性
実施例６：ＭＤＳＣ運動性
【0044】
ＭＤＳＣは、標準的手順を使用してプロトコルＯＳＵ－０９１４２の下で、乳がん腫瘍患者の新たに入手した組織（すなわち、末梢血、腫瘍及びリンパ系組織）から単離する。腫瘍細胞／組織はまた、標準的手順３６を使用して収集される。遊走クロマトグラフィーは、ＧＭ－ＣＳＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）を化学誘引物質として使用してバイオミメティック表面（図４、７）上で実施される。異なるソースＭＤＳＣ（すなわち、循環ｖｓ腫瘍ｖｓリンパ組織－常在性）の単一クローン遊走は、培養チャンバーを取り付けた共焦点顕微鏡でタイムラプス顕微鏡法により記録する。画像は、２４～７２時間の間１０分ごとに収集し、Ｆｉｊｉにプラグインされたマニュアルトラッカーを使用して後処理／分析する。異なる運動性の程度を示すＭＤＳＣクローンは、プラットフォームのマイクロチャンネルを選択的に「操作」することによって単離される。細胞は、出発位置からの移動距離に応じて高運動性ｖｓ中運動性ｖｓ低運動性として区分される（図７）。これらのクローンサブセットの生物力学（すなわち、剛性及び収縮性）を次に、後述するような、単細胞の粘弾性特性を分析するためにｃｏ－Ｉ Ｇｈａｄｉａｌｉによって開発された技術である振動ＡＦＭ、及び牽引力顕微鏡法（ＴＦＭ）によって分析する。さらに、フローサイトメトリは、単球（ＣＤ１５＋／ＣＤ１４＋）及び顆粒球（ＣＤ１５＋／ＣＤ１４－）マーカー、及びそれらの組み合わせについて実施する。各クローンサブセットにおける免疫抑制活性を評価するために、ＣＦＳＥ標識されたＴ細胞を用いて（異なる濃度で）培養し、Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリによって評価する。ＲＭＰＩ培地単独、及びＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをそれぞれ負の対照及び正の対照として使用する。最後に、最強の抑制活性を有するクローンサブセットを、後述するように、単一細胞シーケンシングによってさらに分析する。
実施例７：ＢＴＫ阻害
実施例７：ＢＴＫ阻害
【0045】
高移動性及び／又は免疫抑制性クローンが異なるソースＭＤＳＣから特定されたら、ＢＴＫ阻害剤（すなわち、イブルチニブ）がガイドされた転移を妨害する程度を評価する。まず、免疫ブロット法を使用して、各クローンサブセットが０～１０μＭイブルチニブに曝露されるＢＴＫ及びリン酸化ＢＴＫ（ｐ－ＢＴＫ）のレベルを評価する。各クローンサブセットを次にナノテクスチャー付表面上に播種し（約１０３～１０４細胞／ｃｍ２）、０～１０μＭイブルチニブに曝露しつつ、ガイドされた遊走をタイムラプス顕微鏡法によってモニタリングする。画像をＦｉｊｉによって処理／分析する。ＡＣＰ－１９６（選択的かつ不可逆的ＢＴＫ阻害剤）及びＧＤＣ－０８５３（選択的かつ可逆的ＢＴＫ阻害剤）を用いた実験を比較目的で実施する。イブルチニブへの曝露後に、ＡＦＭ及びＴＦＭを再度使用して、それぞれ単一細胞剛性及び収縮性を評価する。ＭＤＳＣ運動性及び生物力学に対するＢＴＫ阻害の効果を、オープンでＯＳＵにて実施されたＯＳＵ ＣＣＣの支援を受けた臨床研究（ＯＳＵ－１８０１５）の援助のもとでイブルチニブを投与された乳がん患者でさらに評価する。インフォームドコンセントを得た後、３０ｃｃの末梢血を治療前及び療法開始後２週及び４週で採取する。ＭＤＳＣを単離し、単一クローン運動性及び生物力学（すなわち、ＡＦＭ及びＴＦＭ）を前述のように評価する。
実施例８：ＭＤＳＣ／腫瘍細胞転移の相互調節
実施例８：ＭＤＳＣ／腫瘍細胞転移の相互調節
【0046】
予備調査により、ＭＤＳＣは移動性が改善された特殊化クローンサブセットを有し、これはおそらくは、腫瘍／リンパ系組織をコロニー化するか、又は高侵襲性腫瘍細胞と共に同時転移しやすく、転移の早期に「保護的」免疫抑制を提供することが示されている。バイオミメティック表面上でのパイロット試験（図８～９）によより、ＭＤＳＣの存在によって非がん性乳房組織細胞のクローンサブセットにおいて増強された運動性上皮から間葉転移が引き起こされたことが示され（図８Ａ～８Ｂ）、ＭＤＳＣは、健常組織において潜在的ながん性変化を誘導する能力を有し得ることを示唆する。これに対して、ＭＤＳＣは、高攻撃性乳がん細胞の全運動性パターンにおいて顕著な変化を誘導するようではなかった（図８Ｃ）。興味深いことに、最も悪性度の高い瘍細胞は、ＭＤＳＣにおける単一クローン運動性で最強の変化を誘導した（図９）。ＭＤＳＣは、４０μｍ／ｈ付近／未満でクラスター化する単一クローン速度から、場合によって約１００μｍ／ｈに達し得る速度まで移動し、高悪性度腫瘍細胞からの増強されたサイトカイン／ケモカイン分泌による可能性が高い。
実施例９：単一クローンレベルでのガイドされた遊走研究によって、腫瘍関連骨髄由来サプレッサ細胞集団において興味深い治療法の可能な標的が明らかになる
実施例９：単一クローンレベルでのガイドされた遊走研究によって、腫瘍関連骨髄由来サプレッサ細胞集団において興味深い治療法の可能な標的が明らかになる
【0047】
方法
【0048】
テクスチャー付ＰＤＭＳ表面：マイクロテクスチャー付ＰＤＭＳ表面は、レプリカ成形プロセスによってフォトリソグラフィーでパターン化したケイ素マスターから作製した。突起及び溝の平行配列（幅２μｍ、高さ２μｍ、２μｍ間隔）はまず、Ｓ１８１３フォトレジストを使用した標準的ＵＶフォトリソグラフィーによってケイ素マスター上にパターン形成した。ＰＤＭＳと硬化剤の１０：１混合物を次いでマスター上にキャストし、数時間脱気させ硬化させた。ＰＤＭＳを次にマスターから脱型し、単一細胞遊走実験のためにマルチウェルプレート上に配置した。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して、表面形態を特徴づけた。
【0049】
ＭＤＳＣ培養：マウスＭＤＳＣ細胞株（ＭＳＣ－２）はＧｒｅｇｏｉｒｅ Ｍｉｇｎｏｔ氏から寄贈された。ＭＳＣ－２細胞は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％抗生物質－抗真菌剤、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを追加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。患者由来のＭＤＳＣは、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＨＬＡ－骨髄系細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して末梢血から濃縮し、続いてＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ遠心分離（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行った。ＭＤＳＣを続いて抗ＨＬＡ－ＤＲ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して１５分間４℃にてＨＬＡ－ＤＲｎｅｇ細胞の負の選択により単離し、ＭＳ－ＭＡＣＳカラムを用いて単離した。サンプルはヒト対象研究のＩＲＢ認可プロトコルの下でインフォームドコンセントを取得した。
【0050】
単一細胞遊走アッセイ：約１．５×１０５ＭＳＣ－２細胞を播種し、通常の培地中のテクスチャー付ＰＤＭＳ表面又はＴＣＰ対照上に数時間播種して接着させた。細胞は、倒立顕微鏡に取り付けた細胞培養チャンバー（Ｏｋｏｌａｂ）を用いて１６時間にわたって１０分ごとにタイムラプス顕微鏡法により撮像した。画像は、Ｆｉｊｉにプラグインしたマニュアルトラッカーを用いて分析した。単一細胞変位データを次にＭＡＴＬＡＢにより分析して、速度及び正味トラック移動距離を決定した。
【0051】
フローサイトメトリベースの分析及び選別：以下の抗体をＭＳＣ－２細胞について使用した：抗ＣＤ１１ｂ－ＦＩＴＣ、抗Ｌｙ６－Ｃ－ＡＰＣ及び抗Ｌｙ６－Ｇ－ＰＥ、すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入。患者由来のＭＤＳＣについて、我々は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した抗ＣＤ３３－ＡＰＣ、抗ＣＤ１１ｂ－ＡＰ、及び抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＰＥＣｙ７を使用した。データは、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。すべての色をそれらの各アイソタイプ対照及び染色していないサンプルに対して評価した。
【0052】
遺伝子発現分析：全ＲＮＡは、ＴＲｉｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して抽出した。逆転写反応は、スーパースクリプトＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）での２０μｌ反応において５００～１０００ｎｇのＲＮＡを使用して実施した。ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、予め指定されたプライマーを使用した定量的リアルタイムＰＣＲにより炎症誘発及び抗炎症遺伝子の発現レベルを測定した。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３リアルタイムＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍとＴａｑＭａｎ ｆａｓｔ ａｄｖａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を以下の条件で使用して実施した：９５℃で１０分、９５℃で１分、６０℃で１分、及び７２℃で１分を４０サイクル。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びＡＴＰ－６に対して正規化した。
【0053】
同所性腫瘍異種移植：免疫不全ヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、６～８週令をまず乳房脂肪体中の１００００００個のヒト乳がん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に注入して、腫瘍を生成させた。腫瘍発生の４週間後に、選別されたＭＤＳＣ亜集団を、一般的細胞膜標識用ＰＫＨ６７緑色蛍光細胞リンカーキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を、製造業者によって示唆される指示にしたがって使用して染色した。次に、担癌マウスに約２．５×１０５ＭＤＳＣを尾静脈から注入した。次に、注射の１日後にマウスを収集し、腫瘍、肺、及び脾臓をＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で特徴づけた。すべての動物実験は、オハイオ州立大学の実験室動物の管理及び使用委員会によって承認されたプロトコルにしたがって実施した。
【0054】
統計分析：全統計分析をＳｉｇｍａ Ｐｌｏｔ １２又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７で実施した。我々は、実験ごとにｎ＝３～６複製を使用した。複製数、統計試験、及び有意性のレベルに関する具体的な情報は、図の説明文で見出すことができる。
【0055】
結果及び考察
【0056】
ＭＤＳＣはトポグラフィー的キューに応答し、構造的にガイドされた転移パターンを示す。構造的にガイドされた細胞転移は、原発性腫瘍からのがん性細胞の逃避並びに末梢器官及び組織における転移性増殖の確立において役割を果たすことが知られている。高攻撃性がん細胞は、とりわけ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、白質路、血管の基底膜、及び軟膜下／腹膜下空間からの径方向に配向したフィブリルを含む、組織内の事前に整列された身体構造上の微細構造に優先的に沿って拡散する、異なる拡散性パターンを示す傾向がある（図１０Ａ）（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１２，１２：４４２４－４４３２；Ｂｅｌｌａｉｌ ＡＣ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００４，３６：１０４６－１０６９； Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，１５：５３１－５４０）。マイクロ及びナノスケールツールを使用して、これらの生理学的に関連する条件下で論理的にがん細胞の運動性をプローブするために使用することができるシステムを開発してきた（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１２，１２：４４２４－４４３２；Ｂｅｌｌａｉｌ ＡＣ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００４，３６：１０４６－１０６９；Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，１５：５３１－５４０；Ｉｒｉｍｉａ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）２００９， １：５０６－５１２；Ｄｏｙｌｅ ＡＤ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９，１８４：４８１－４９０；Ｐｅｔｒｉｅ ＲＪ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９，１０：５３８－５４９）。様々ながん性細胞において迅速かつ高度に方向性の運動性を模倣するためにトポグラフィー的又は細胞限局キューが使用されてきたが（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１２，１２：４４２４－４４３２；Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，１５：５３１－５４０；Ｉｒｉｍｉａ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）２００９，１：５０６－５１２；Ｓｉｄａｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ２００６，１１：１５１－１６３；Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ ＰＰ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ ２００６，４：３８；Ｗｏｎｇ ＩＹ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ ２０１４，１３：１０６３－１０７１）、腫瘍関連ＭＤＳＣの転移／浸潤能に対するそのようなキューの影響を検討する研究はない。次に試験したのは、ＭＤＳＣが、侵襲性がん性細胞に類似した、構造的にガイドされた転移パターンを示すことによりトポグラフィー的キューに応答するか否かであった。ネズミＭＤＳＣ細胞株であるＭＳＣ－２をモデルとして使用した（Ｓｔｉｆｆ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６， ７６：２１２５－２１３６；Ｔｒｉｋｈａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６，５：ｅ１２１４７８７）。これらの細胞を、フォトリソグラフィーにより作成したケイ素マスターからレプリカ成形を介して作製し、がん細胞転移研究で先に試験した寸法（約２μｍ×２μｍ、２μｍ間隔）を有する平行な突起及び溝の配列として設計された、マイクロテクスチャー付ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）表面（図１０Ｂ）上に配置した（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０１６，１６：５３２６－５３３２；Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１２，１２：４４２４－４４３２；Ｋｉｍ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１６，２９：２０１－２１３；Ｇｕ ＳＱ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１６，４４：５８１１－５８１９）。ＭＤＳＣ運動性を単一クローンレベルにてリアルタイムでタイムラプス顕微鏡法によりモニタリングした。標準的細胞培養表面（すなわち、組織培養ポリスチレン又はＴＣＰ）上に播種した細胞を比較目的で使用した。結果から、ＭＤＳＣが、ＴＣＰ上で単一クローンレベルにて限定された運動性を示し（図１０Ｃ～１０Ｅ）、ほとんどの細胞は丸みのある形態を示す（図１０Ｃ）ことがわかる。一方、テクスチャー付表面は、ＭＤＳＣの一部で細胞骨格及び形態学的再配列（すなわち、アラインメント）を明らかに誘導し（図１０Ｃ）、これは、運動性の増大につながった（図１０Ｄ、１０Ｅ）。平均単一クローン速度は、ＴＣＰ上の約２０μｍ／ｈと比較してテクスチャー付表面上で約４０μｍ／ｈの最大値に達した。単一クローンの有効変位の尺度である正味トラック距離は、ＴＣＰ上の＜１００ μｍと比較してテクスチャー付表面上で１６時間の期間にわたって約４００μｍの最大値に達した。特に、テクスチャー付表面上で遊走するＭＤＳＣは、転移可能性において有意なクローン間変動性を示し、細胞は、低運動性から高運動性の全領域に及んだ。これに対して、ＴＣＰ上で遊走するＭＤＳＣは、著しく低いクローン間変動性を示した。がん患者に由来する循環ＭＤＳＣに関する研究（図１３）は、顕著なクローン間変動性を示す高運動性ＭＤＳＣ集団の存在をさらに確認し、一部のクローンは、約２００μｍｈ－１までの平均ガイドされた遊走速度及び１６時間の期間にわたって１ｍｍに迫る全正味変位を示した。しかしながら、患者由来の循環ＭＤＳＣのある特定の集団は、限定された全体的運動性を示し、これは潜在的に原発悪性腫瘍の直接的反映であり得る（例えば、タイプ、ステージ、変異）及び／又は現行の治療法（表１～３）。
【表1】
【表2】
【表3】
【0057】
ＭＤＳＣ亜集団は異なる転移能を示す。運動性における明らかなクローン間変動性に基づいて、我々は、標準的ＭＤＳＣ命名法に基づいて、顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏＬｙ６Ｇ＋）及び単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｈｉＬｙ６Ｇ－）亜集団へのフローサイトメトリベースの選別によりＭＤＳＣ集団をさらに階層化しプローブした（図１１Ａ～１１Ｃ）（Ｂｒｏｎｔｅ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１６，７：１２１５０）。ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞の亜集団もまた、フローサイトメトリデータから特定され、我々の分析に含まれていた。フロー選別された亜集団を次に、炎症誘発及び抗炎症マーカーのｑＲＴ－ＰＣＲ分析に加えて、前述のように、テクスチャー付表面上での構造的にガイドされた運動性研究に供した。単一クローン転移研究は、単離でプローブされる場合、顆粒球ＭＤＳＣが単球ＭＤＳＣ及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋亜集団と比較して優れた転移能を有し（図１１Ｄ）、単一クローンは場合によっては１６時間の期間にわたって＞１００μｍ／ｈ及び約１．５ｍｍの平均速度及び正味変位に達したことを示す。そして単球ＭＤＳＣ及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋亜集団内の一部のクローンは相対的に高い平均遊走速度約５０μｍ／ｈを示すが、正味変位は相当限定され、したがって、これらの細胞は顆粒球ＭＤＳＣと比較して非常に短距離及び／又は無秩序な運動性パターンを示す傾向があることが示唆された（図１１Ｅ）。これらの観察結果は、インビボ研究によってさらに確認され（図１１Ｆ、１１Ｇ）、この研究では、担癌マウスに選別ｖｓ「新しい」／非選別ＭＤＳＣの蛍光標識された懸濁液を全身注射し、ＩＶＩＳを使用して、腫瘍ニッチｖｓ末梢器官／組織内のＭＤＳＣ蓄積を記録した。顆粒球ＭＤＳＣを注射されたマウスは、腫瘍内でより顕著な蛍光シグナル蓄積を示した（図１１Ｇ）。がん患者由来の循環ＭＤＳＣを用いた平行単一クローン運動性研究（図１４）もまた、顆粒球亜集団（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１４－）が単球亜集団（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋）と比較して増強された運動性を示すことを示唆する。炎症誘発性マーカーのＭＳＣ－２細胞遺伝子発現分析は、「新しい」（すなわち、非選別）ＭＤＳＣ集団と、精製された顆粒球、単球、及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋亜集団との間のＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ、及びＩＬ－２７の発現において統計的に有意な差はないことを示す。しかしながら、ＩＬ－６は、新しい集団ｖｓフロー選別された亜集団において有意に過剰発現された。一方、抗炎症マーカーの遺伝子発現分析により、フロー選別された顆粒球亜集団が、新しいフロー選別された単球ＭＤＳＣ及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋亜集団と比較して、アルギナーゼ及びＩＬ－１０を過剰発現する傾向を有することが示唆される。まとめると、これらの結果は、顆粒球ＭＤＳＣ亜集団が、がん性組織を拡散しコロニー化させやすいだけでなく、単球ＭＤＳＣ及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋亜集団と比較して抗炎症／抑制マーカー抗炎症／抑制マーカーを過剰発現しやすいようであることを示唆する。
【0058】
ＭＤＳＣ亜集団は、長期の培養条件下で集団ホメオスタシスを駆動する表現型の可塑性を示す。ＭＳＣ－２細胞の顆粒球ＭＤＳＣ及び単球ＭＤＳＣの異なる亜集団、並びにＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞へのフローベースの精製後に、細胞を１～７日間培養中で維持した。表現型の可塑性をフローサイトメトリにより第１日及び第７日により評価した。単一クローン運動性アッセイ及び遺伝子発現分析を第７日に実施した（図１２Ａ）。驚くべきことに、そして我々がフローベースの選別の直後に見出したものと対照的に；第７日までに三つの集団すべてにわたって転移特性において有意差は検出されなかった（図１２Ｂ）。全ての集団について平均単一クローン速度は約５０μｍｈ－１以内にとどまったが、その一方で、全体的正味トラック距離は約２００μｍ未満にとどまった。フローサイトメトリ分析によって、選別の１日後に、精製集団は依然として培養の大部分（約８０％）を構成するが、第７日までに、集団の全階層が再確立されたことが示され（図１２Ｃ～１２Ｅ）、おそらくは、ＭＤＳＣ集団における集団のホメオスタシス／異種性の維持における細胞可塑性の役割を示唆する。精製顆粒球亜集団由来の細胞培養（図１２Ｃ）は、例えば、単球ＭＤＳＣ及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞を生じさせ、単球の亜集団は、第１日～第７日で最も急な増加を示し（約７倍変化）、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋集団は、第７日までに約３倍増加を示した。一方、精製単球ＭＤＳＣ由来の培養は、顆粒球集団と比較して７日までにＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋集団を掃除させやすかった（約２．５倍増加）。最終的に、精製ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋集団由来の培養は、単球ＭＤＳＣと比較して、第７日まで顆粒球ＭＤＳＣを生じさせやすく（約３倍増加）、これは第１日と第７日との間で有意な増加を示さなかった。第７日での炎誘発性マーカー（図１２Ｆ）及び抗炎症マーカー（図１２Ｇ）の遺伝子発現プロフィールは、集団にわたってより微細な差を示し、選別／精製された亜集団と比べて「新しい」ＭＤＳＣ集団においてそれぞれ増大及び減少したｉＮＯＳ及びＩＬ－６発現を示した。しかしながら、０日（すなわち、選別／精製当日）と７日との間の発現プロフィールを比較すると、より顕著な差がみられ、三つの集団すべてについて炎症誘発性ｉＮＯＳの発現が全体的に増加し、顆粒球亜集団のみについてアルギナーゼ１及びＩｌ－１０が有意に減少した（図１５）。
【0059】
ミクロ及びナノスケールの技術は、医学的応用に細胞生物学の様々な態様を調査及び／又は調節するために広く使用されている（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０１６，１６：５３２６－５３３２；Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１２，１２：４４２４－４４３２；Ｋｉｍ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１６，２９：２０１－２１３；Ｇｕ ＳＱ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１６，４４：５８１１－５８１９；Ｍｉｎａｔａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１９，２６：１８９３－１９０５；Ｓｈｕｋｌａ ＶＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１８，３６：５４９－５６１；Ｂｅｎａｖｅｎｔｅ－Ｂａｂａｃｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ２０１４，６１：２９８－３０５；Ｆｅｉ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３，８５：１４０１－１４０７；Ｃｈａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍａｌｌ ２０１６，１２：５９７１－５９８０；Ｃｈａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１５，１５：３１４７－３１５３；Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ２０１２，１４：７７９－７８９；Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６，１２：３９９－４０９；Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１７，１２：９７４； Ｗｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍａｌｌ ２０１３，９：２３５８－２３６７；Ｚｈａｏ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，２；Ｚｈａｏ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１５，８７：３２０８－３２１５）。ミクロスケールのエンジニアリングツールを使用して、腫瘍関連ＭＤＳＣが侵襲性がん性細胞と同様に構造的にガイドされた遊走パターンを示すことを実証した。単一クローン運動性分析によって、ＭＤＳＣ集団内及び全体にわたって（すなわち、患者由来のＭＤＳＣについて）明らかな不均質性が明らかになり、ネズミ由来のＭＤＳＣ及び患者由来のＭＤＳＣの両方において転移能が増強されたクローン性サブセットの存在が確認された。ヌードマウスにおけるフローサイトメトリベースの選別、遺伝子発現分析、及び同所性腫瘍異種移植実験と合わせた運動性追跡調査研究は、顆粒球亜集団が増加した転移及び腫瘍浸潤能力、並びに増強された抗炎症活性を示しやすく、このため、この集団が、がんにおいて魅力的な治療標的となる可能性があることを示唆している。しかしながら、その後の研究は、そのようなクローンサブセットの著しく動的かつ可塑性の性質を明らかにし、精製されたＭＤＳＣ亜集団は、あらゆるＭＤＳＣ表現型を生じさせることによって迅速に集団的ホメオスタシスに達する。腫瘍常在性ＭＤＳＣの優性表現型に関して矛盾する報告があるが（すなわち、顆粒球対単球）（Ｋｕｍａｒ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６，３７：２０８－２２０；Ｈｏｓｓａｉｎ Ｆ， ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５，３：１２３６－１２４７；Ｈａｖｅｒｋａｍｐ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１，４１：７４９－７５９；Ｍａｉｒｈｏｆｅｒ ＤＧ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１５，１３５：２７８５－２７９３；Ｂｏｚｋｕｓ ＣＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１５，１９５：５２３７－５２５０）、我々の単一クローン転移及び表現型の可塑性の結果は、顆粒球ＭＤＳＣがおそらくは、腫瘍ニッチに浸潤するためにより良好に備えられる潜在的メカニズムを指摘し、このメカニズムでは、顆粒球ＭＤＳＣはその後も顆粒球のままである、及び／又は腫瘍タイプ含む複数の因子に応じて、単球ＭＤＳＣを生じさせる。興味深いことに、がん患者由来の循環ＭＤＳＣを用いた単一クローン転移は、ＭＤＳＣ運動性は、患者のバックグラウンド（例えば、がんの種類／ステージ、治療法など）に潜在的に影響を受ける可能性があり、したがって、エクスビボでの循環ＭＤＳＣの転移パターンが疾患及び／又は治療進行をモニタリングするために使用できるか否かを判定するためにさらなる研究が必要であることを示唆する。
【0060】
別段の記載がある場合を除き、本明細書中で使用するすべての科学技術用語は、開示された発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で言及する刊行物及びそこで引用される資料は参照により具体的に組み込まれる。
【0061】
当業者は、本明細書中で記載する発明の特定の実施形態の多くの均等物が分かっているか、又は慣例的な実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4A-B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図6A-B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10A-B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11A-B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図11H】
【図11I】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図12G】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B-C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図15A】
【図15B】
【国際調査報告】