特表 2022-512754 融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220131BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 39/295 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 14/11 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/115 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/18 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/15 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/145 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/175 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/165 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/08 20060101ALN20220131BHJP

   C12P 21/00 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C12N7/01

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/12

A61K39/295

A61P31/12

A61P31/04

A61P33/00

A61K48/00

C07K14/11

C07K14/115

C07K14/18

C07K14/15

C07K14/145

C07K14/175

C07K14/165

C07K14/08

C12P21/00 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021521306

(86)(22)【出願日】2019-10-16

(85)【翻訳文提出日】2021-06-14

(86)【国際出願番号】 GB2019052945

(87)【国際公開番号】W WO2020079427

(87)【国際公開日】2020-04-23

(31)【優先権主張番号】1816873.2

(32)【優先日】2018-10-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519426058

【氏名又は名称】インペリアル カレッジ イノベイションズ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＰＥＲＩＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ ＬＩＭＩＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】Ｌｅｖｅｌ １ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｃ／Ｏ Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｒｏａｄ Ｌｏｎｄｏｎ ＳＷ７ ２ＡＺ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ロビン・シャトック

(72)【発明者】

【氏名】ヨアン・アルドン

(72)【発明者】

【氏名】ポール・マッカイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG31

4B064AG32

4B065AA93X

4B065AA97X

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB33

4C084ZB35

4C084ZB38

4C085AA04

4C085BA55

4C085BA57

4C085BA61

4C085BA64

4C085BA65

4C085BA71

4C085BA74

4C085BB07

4C085BB11

4C085CC08

4C085DD62

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045DA50

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、融合タンパク質、及びウイルス感染に対するワクチン接種するための融合タンパク質（又はそのような融合タンパク質をコードする、遺伝的コンストラクト若しくはベクター）の使用に関する。本発明は、ウイルス感染を防止及び処置するための、そのような融合タンパク質又はコンストラクトを含む医薬組成物、並びにその方法及び使用に及ぶ。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原、及びパラミクソウイルス(Paramyxovirus)若しくはオルトミクソウイルス(Orthomyxovirus)の膜貫通ドメイン(TMD)、及び／又はパラミクソウイルス(Paramyxovirus)若しくはオルトミクソウイルス(Orthomyxovirus)の細胞質尾部(CT)を含む、融合タンパク質。

【請求項2】

抗原が、ウイルス抗原であり、TMD及び／又はCTが、ウイルス抗原が由来するウイルスとは異なるウイルスに由来する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

抗原が、レトロウイルス科(Retroviridae)、トガウイルス科(Togaviridae)、アレナウイルス科(Arenaviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、及びアルテリウイルス科(Arteriviridae)からなる群から選択されるエンベロープウイルスに由来する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

パラミクソウイルス(Paramyxovirus)は、ルブラウイルス(Rubulavirus)、パラインフルエンザウイルス5型(Parainfluenzavirus 5)、パラインフルエンザウイルス2型(Parainfluenzavirus 2)、パラインフルエンザウイルス3型(Parainfluenzavirus 3)、レスピロウイルス(Respirovirus)、モルビリウイルス(Morbillivirus)、ヘニパウイルス(Henipavirus)、アブラウイルス(Avulavirus)、ニューモウイルス(Pneumovirus)、及びメタニューモウイルス(Metapneumovirus)からなる群から選択され、並びに／又はオルトミクソウイルス(Orthomyxovirus)は、A型インフルエンザウイルス(influenza virus A)、B型インフルエンザウイルス(influenza virus B)、及びC型インフルエンザウイルス(influenza virus C)からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

ウイルス抗原、及びパラインフルエンザウイルス5型(Parainfluenzavirus 5)又はルブラウイルス(Rubulavirus)のTMD、及びパラインフルエンザウイルス5型(Parainfluenzavirus 5)又はルブラウイルス(Rubulavirus)のCTを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

実質的に配列番号5に記載の通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含むか、或いは、実質的に配列番号6に記載の通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

実質的に配列番号7に記載の通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含むか、或いは、実質的に配列番号8に記載の通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

ウイルス様粒子(VLP)を形成するのに適した融合タンパク質であって、パラミクソウイルス(Paramyxovirus)又はオルトミクソウイルス(Orthomyxovirus)のマトリックスタンパク質及び膜標的シグナル(MTS)を含む、融合タンパク質。

【請求項9】

マトリックスタンパク質が、ルブラウイルス(Rubulavirus)、パラインフルエンザウイルス5型(Parainfluenzavirus 5)、パラインフルエンザウイルス2型(Parainfluenzavirus 2)、パラインフルエンザウイルス3型(Parainfluenzavirus 3)、レスピロウイルス(Respirovirus)、モルビリウイルス(Morbillivirus)、ヘニパウイルス(Henipavirus)、アブラウイルス(Avulavirus)、ニューモウイルス(Pneumovirus)、及びメタニューモウイルス(Metapneumovirus)からなる群から選択されるパラミクソウイルス(paramyxovirus)のマトリックスタンパク質であるか、又はマトリックスタンパク質が、A型インフルエンザウイルス(influenza virus A)、B型インフルエンザウイルス(influenza virus B)、及びC型インフルエンザウイルス(influenza virus C)からなる群から選択されるオルトミクソウイルス(Orthomyxovirus)のマトリックスタンパク質である、請求項８に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

MTSが、配列番号9、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12、又はそのバリアント若しくは断片からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

実質的に配列番号13に記載の通りのアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むか、或いは、実質的に配列番号14、15、又は16に記載の通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる、請求項８から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

実質的に配列番号17に記載の通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含むか、或いは、実質的に配列番号18、19、又は20に記載の通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる、請求項８から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、ウイルス様粒子(VLP)。

【請求項14】

請求項１３に記載のウイルス様粒子(VLP)を製造する方法であって、宿主細胞に、請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を発現する工程を含む、方法。

【請求項15】

抗原を提示するウイルス様粒子(VLP)を形成するのに適した融合タンパク質であって、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、融合タンパク質。

【請求項16】

請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質及び請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質が、切断可能なスペーサー配列で互いに結合されている、請求項１５に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

切断可能なスペーサー配列が、自己切断ペプチドであって、場合によっては、自己切断ペプチドがフーリン／2Aペプチドである、請求項１６に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、ウイルス様粒子(VLP)であって、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質の抗原が、VLPの表面上に提示される、ウイルス様粒子(VLP)。

【請求項19】

シュードタイピングしたウイルス様粒子(VLP)を製造する方法であって、第一の態様の融合タンパク質の抗原がVLPの表面上に提示されるような条件下で、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させ、その結果シュードタイピングしたVLPを形成する工程を含む、方法。

【請求項20】

宿主細胞で発現する際に、抗原が、請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質によって形成されるVLPの外表面に指向するように、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパクが、請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と相互作用するように、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる工程が、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と宿主細胞で共発現させる工程を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ウイルス様粒子に抗原提示するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項22】

請求項１から１２又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。

【請求項23】

請求項２２に記載の核酸を含む、発現カセット。

【請求項24】

請求項２３に記載の発現カセットを含む、組換えベクター。

【請求項25】

請求項２２に記載の核酸配列、請求項２３に記載の発現カセット、又は請求項２４に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。

【請求項26】

請求項１から１２若しくは請求項１５から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸配列、請求項１３若しくは１８に記載のVLP、請求項２３に記載の発現カセット、請求項２４に記載のベクター、又は請求項２５に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。

【請求項27】

治療又は診断に使用するための、請求項１から１２若しくは請求項１５から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸配列、請求項１３若しくは１８に記載のVLP、請求項２３に記載の発現カセット、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、又は請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

原虫、細菌、又はウイルス感染の防止、改善、又は処置に使用するための、請求項１から１２若しくは請求項１５から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸配列、請求項１３若しくは１８に記載のVLP、請求項２３に記載の発現カセット、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、又は請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項29】

請求項１から１２若しくは請求項１５から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸配列、請求項１３若しくは１８に記載のVLP、請求項２３に記載の発現カセット、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、又は請求項２６に記載の医薬組成物を含む、ワクチン。

【請求項30】

対象における、免疫応答の刺激に使用するための、請求項１から１２若しくは請求項１５から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸配列、請求項１３若しくは１８に記載のVLP、請求項２３に記載の発現カセット、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、又は請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項31】

免疫応答が、原虫、細菌、ウイルス、がん、又は神経変性疾患に関連するタンパク質に対して刺激される、請求項３０に記載の使用のための、請求項１から１２若しくは請求項１５から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸配列、請求項１３若しくは１８に記載のVLP、請求項２３に記載の発現カセット、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、又は請求項２６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、融合タンパク質、特に、ウイルス感染に対するワクチン接種をするための融合タンパク質（又はそのような融合タンパク質をコードする遺伝的コンストラクト若しくはベクター）の使用に関する。本発明は、ウイルス感染を防止及び治療するための、そのような融合タンパク質又はコンストラクトを含む医薬組成物、並びにその方法及び使用にまで及ぶ。

【背景技術】

【0002】

適切な状況の中で抗原を提示して、天然の抗原性(native antigenicity)を保持又は模倣することは、関連のある全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導するのに必須であり得る。現在まで、商業的ワクチンの大部分は、効率的な液性免疫応答の誘導を通して、病原体からの保護を生じさせる(1)。弱毒生ウイルス又は死滅ウイルスをワクチンの目的で使用することができる(2)。しかしながら、いくつかのウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)及びエボラウイルスに関しては、安全性の理由から、これらの古典的な方法が除外されている(3)。そのようなウイルスに対する殺菌免疫を向上させるための主要な標的が、標的細胞への付着及び融合を媒介する(4-6)、ウイルスの表面糖タンパク質(surface glycoprotein(s); GP)であるので、抗原として、溶解性組換えGPを使用して、サブユニットワクチンを開発する努力は、かなりの努力を、これらのタンパク質を安定化して、ビリオン表面に提示されるタンパク質の天然の細胞外ドメインを厳密に模倣することに駆り立てた(7, 8)。これらの努力が、よく特徴付けられた免疫原の産生をもたらした一方で、これらのタンパク質は、ウイルス膜に提示されていない。従って、適切な状況における、ウイルスのGP抗原の提示に関する別の方法は、サブユニットワクチンの特定のタイプの使用である：ウイルス様粒子(VLP) (9-11)。

【0003】

VLPは、ウイルスの構造を再現することができ、いくつかの無エンベロープワクチン(non-enveloped vaccine)、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、及びE型肝炎ウイルス(HEV)に関して、ヒトで成功が証明されている(9)。VLPは、ウイルスと同様に、免疫系によって認識され、溶解性組換えタンパク質よりも、より関連したコンフォメーションでウイルスの免疫原を提示する。VLP方法の1つの大きな利点は、その多用途性であり、なぜならば、同じ病原体又は異なる病原体由来の複数の抗原を、共発現させて、異なる特徴を有するVLPを作ることができるからである(12, 13)。この多用途性はまた、特定の抗原の問題を克服することができるVLPの設計を可能にすることができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Plotkin SA. Correlates of protection induced by vaccination. Clin Vaccine Immunol. 2010;17:1055-1065.

【非特許文献2】Lauring AS, Jones JO, Andino R. Rationalizing the development of live attenuated virus vaccines. Nat Biotechnol. 2010;28:573-9.

【非特許文献3】Berkhout B, Verhoef K, van Wamel JL, Back NK. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 1999;73:1138-45.

【非特許文献4】Hastie, K.M., Zandonatti, M.A., Kleinfelter, L.M., Heinrich, M.L., Rowland, M.M., Chandran, K., Branco, L.M., Robinson, J.E., Garry, R.F., and Saphire, E.O. (2017). Structural basis for antibody-mediated neutralization of Lassa virus. Science 356, 923-928.

【非特許文献5】Klasse, P.J. (2012). The molecular basis of HIV entry. Cell Microbiol 14, 1183-1192.

【非特許文献6】Lee, J., Nyenhuis, D.A., Nelson, E.A., Cafiso, D.S., White, J.M., and Tamm, L.K. (2017). Structure of the Ebola virus envelope protein MPER/TM domain and its interaction with the fusion loop explains their fusion activity. Proc Natl Acad Sci U S A 114, E7987-E7996.

【非特許文献7】Sarkar, A., Bale, S., Behrens, A.J., Kumar, S., Sharma, S.K., de Val, N., Pallesen, J., Irimia, A., Diwanji, D.C., Stanfield, R.L., et al. (2018). Structure of a cleavage-independent HIV Env recapitulates the glycoprotein architecture of the native cleaved trimer. Nat Commun 9, 1956.

【非特許文献8】Sanders, R.W., and Moore, J.P. (2017). Native-like Env trimers as a platform for HIV-1 vaccine design. Immunol Rev 275, 161-182.

【非特許文献9】Gao, Y., Wijewardhana, C., and Mann, J.F.S. (2018). Virus-Like Particle, Liposome, and Polymeric Particle-Based Vaccines against HIV-1. Front Immunol 9, 345.

【非特許文献10】Mohan, T., Berman, Z., Luo, Y., Wang, C., Wang, S., Compans, R.W., and Wang, B.Z. (2017). Chimeric virus-like particles containing influenza HA antigen and GPI-CCL28 induce long-lasting mucosal immunity against H3N2 viruses. Sci Rep 7, 40226.

【非特許文献11】Storcksdieck genannt Bonsmann, M., Niezold, T., Temchura, V., Pissani, F., Ehrhardt, K., Brown, E.P., Osei-Owusu, N.Y., Hannaman, D., Hengel, H., Ackerman, M.E., et al. (2015). Enhancing the Quality of Antibodies to HIV-1 Envelope by GagPol-Specific Th Cells. J Immunol 195, 4861-4872.

【非特許文献12】Ramirez, A., Morris, S., Maucourant, S., D'Ascanio, I., Crescente, V., Lu, I.N., Farinelle, S., Muller, C.P., Whelan, M., and Rosenberg, W. (2018). A virus-like particle vaccine candidate for influenza A virus based on multiple conserved antigens presented on hepatitis B tandem core particles. Vaccine 36, 873-880.

【非特許文献13】Elsayed, H., Nabi, G., McKinstry, W.J., Khoo, K.K., Mak, J., Salazar, A.M., Tenbusch, M., Temchura, V., and Uberla, K. (2018). Intrastructural Help: Harnessing T-Helper Cells Induced by Licensed Vaccines for Improvement of HIV Env Antibody Responses to Virus-Like Particle Vaccines. J Virol.

【非特許文献14】Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Jr., Chertova, E., Lifson, J.D., Grise, H., Ofek, G.A., Taylor, K.A., and Roux, K.H. (2006). Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. Nature 441, 847-852.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、ウイルス、例えばHIVに関して、HIVビリオンは、その表面上に限られた数(<20)のエンベロープ(Env)GPを提示するが、抗体応答のための強力なB細胞受容体の関与(BCR engagement)を引き起こすための十分な価数(valency)を供さない(14)。従って、そのようなウイルスに対するワクチン接種をするためのVLPの使用は、限定的である。

【0006】

従って、ウイルス感染、例えば、より少ない数のエンベロープGPを産生するもの、例えばHIV、に対するワクチン接種をする別の方法を提供する要求が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、修飾したパラミクソウイルス(Paramyxovirus)又はオルトミクソウイルス(Orthomyxovirus)のマトリックスタンパク質(matrix protein)を利用して、その後に任意のウイルス糖タンパク質でシュードタイピングする(pseudotyped)（すなわち、修飾する）ことが可能であるVLPを製造する、新規のプラットフォーム方法を開発し、幅広い適用性を実証した。しかしながら、このプラットフォーム技術に加えて、本発明者らはまた、その他のものでは強力なB細胞受容体(BCR)の関与を引き起こすのに十分な価数を供さない、（例えば、VLP上の）ウイルス抗原の高度に効率的な提示を可能にする、新規の融合タンパク質も開発した。

【0008】

従って、本発明の第一の態様においては、抗原、並びにパラミクソウイルス若しくはオルトミクソウイルスの膜貫通ドメイン(TMD)及び／又はパラミクソウイルス若しくはオルトミクソウイルスの細胞質尾部(CT)を含む、融合タンパク質を提供する。

【0009】

一実施形態において、抗原は非ウイルス性であってもよく、例えば、病原性原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、及び三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)）と関連した抗原（例えば、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質(malaria circumsporozoite protein)のC末端及び中央反復領域）であってもよい。更なる免疫原非ウイルス性抗原は、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)、ブルーストリパノソーマ (Trypanosoma brucei)、クルーズトリパノソーマ (Trypanosoma cruzi)、ビルハルツ住血吸虫(Schistosoma haematobium)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum)、ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani)、ランブル鞭毛虫(Giardia intestinalis)、又はクリストポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)と関連していてもよい。これらの抗原は、任意のこれらの原虫の感染に対するワクチン接種として有用である可能性がある。

【0010】

別の実施形態において、非ウイルス性抗原は、細菌性免疫原であってもよく、例えば病原性グラム陽性細菌（例えば、病原性のパスツレラ種(Pasteurella species)、スタフィロコッカス種(Staphylococci species)、及びストレプトコッカス種(Streptococcus species)）並びにグラム陰性病原体（例えば、ナイセリア属(Neisseria)、エシェリキア属(Escherichia)、ボルデテラ属(Bordetella)、カンピロバクター属(Campylobacter)、レジオネラ属(Legionella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、シゲラ属(Shigella)、ビブリオ属(Vibrio)、エルシニア属(Yersinia)、サルモネラ属(Salmonella)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、ブルセラ属(Brucella)、フランシセラ属(Francisella)、バクテロイデス属(Bacterioides)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloris) 、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borelia burgdorferi)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、マイコバクテリウム種(Mycobacteria sps)（例えば、結核菌(M. tuberculosis)、アビウム菌(M. avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(M. intracellulare)、マイコバクテリウム・カンサシ(M. kansaii)、マイコバクテリウム・ゴルドネ(M. gordonae)）、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes) （A群ストレプトコッカス(Group A Streptococcus)）、ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)（B群ストレプトコッカス(Group B Streptococcus)）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）(Streptococcus (viridans group))、ストレプトコッカス・フェカリス(Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、嫌気性連鎖球菌(Streptococcus (anaerobic sps.))、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumonia)、病原性カンピロバクター種(Campylobacter sp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus sp.)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、コリネバクテリウム・ジフテリアエ(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.) 、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、ケレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、バクテロイデス属(Bacteroides sp.) 、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum) 、ストレプトバチルス・モニリホルム(Streptobacillus moniliformis)、又はトレポネーマ・パリズム(Treponema pallidium)）を含む、任意の病原性細菌と関連する（例えば、それらによって産生される及びそれらに内在する）免疫原であってもよい。これらの抗体は、任意のこれらの細菌による感染に対するワクチン接種に有用である可能性がある。

【0011】

別の実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原であってもよく、腫瘍関連抗原は、オルトミクソウイルス又はパラミクソウイルスの膜貫通ドメインに融合している。腫瘍関連抗原の全体又は一部が、融合タンパク質中に存在してもよい。典型的な腫瘍抗原は、乳がん（例えば、HER-2抗原）、膵がん（例えば、Trop2、hMSLN）、前立腺がん（PSA）、皮膚がん（例えば、MAGE-3、MAA）、肺がん（例えば、CLDN18.2）、卵巣がん（OV-TL3及びMOV18）、腎腫瘍関連抗原（例えば、G250、EGP-40）由来の抗原を含む。これらの抗原は、任意のこれらのがんに対するワクチン接種に有用である可能性がある。

【0012】

別の実施形態において、融合タンパク質は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病に関連したタンパク質、例えば、ベータアミロイド又はタウタンパク質）、自己免疫疾患（例えば、関節炎に関連したタンパク質、例えば、TNF-α、IL-1α）、アレルギー（例えば、Der p I又はDer f I）に関連したペプチド抗原を含んでもよい。これらの抗原は、任意のこれらの疾患に対するワクチン接種に有用である可能性がある。

【0013】

しかしながら、好ましい実施形態において、抗原はウイルス抗原であり、TMD及び／又はCTは、ウイルス抗原のウイルスとは異なるウイルスに由来する。好ましくは、ウイルス抗原は、レトロウイルス科(Retroviridae)（例えば、HIV-1、HIV-2）；トガウイルス科(Togaviridae)（例えば、風疹ウイルス(Rubella virus)、アルファウイルス(alphavirus)）；アレナウイルス科(Arenaviridae)（例えば、ラッサウイルス(Lassa virus)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(Lymphocytic choriomeningitis virus)）；フラビウイルス科(Flaviviridae)（例えば、デングウイルス(Dengue virus)、C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)、黄熱ウイルス(yellow fever virus)、ジカウイルス(Zika virus)）；オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)（例えば、A型インフルエンザウイルス(influenza virus A)、B型インフルエンザウイルス(influenza virus B)、C型インフルエンザウイルス(influenza virus C)、イサウイルス(isavirus)、トゴトウイルス(thogotovirus)）；パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)（例えば、麻疹ウイルス(measles virus)、ムンプスウイルス(mumps virus)、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(Rinderpest virus)、犬ジステンパーウイルス(canine distemper virus)、ニパウイルス(Nipha virus)）；ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス(California encephalitis virus)、ハンタウイルス(hantavirus)）；ラブドウイルス(Rhabdoviridae)（例えば、狂犬病ウイルス(Rabies virus)）；フィロウイルス(Filoviridae)（例えば、エボラウイルス(Ebola virus)、マールブルグウイルス(Marburg virus)）; コロナウイルス科(Coronaviridae)（例えば、コロナウイルス(Corona virus)、SARS)）；ボルナウイルス科(Bornaviridae)（例えば、ボルナ病ウイルス(Borna disease virus)）；及びアルテリウイルス科(Arteriviridae)（例えば、アルテリウイルス(Arterivirus)、馬動脈炎ウイルス(equine arteritis virus)）からなる群から選択される、エンベロープウイルスに由来する。より好ましくは、ウイルス抗原は、HIVに由来する。これらの抗原は、任意のこれらのウイルスの感染に対するワクチン接種に有用である可能性がある。

【0014】

好ましくは、ウイルス抗原は、ウイルスのエンベロープタンパク質であり、より好ましくは、ウイルス糖タンパク質である。ウイルス抗原は、好ましくは、以下のウイルスファミリー：レトロウイルス科(Retroviridae)（例えば、HIV-1、HIV-2）；フィロウイルス科(Filoviridae)（例えば、エボラウイルス(Ebola virus)、マールブルグウイルス(Marburg virus)）；オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)（例えば、A型インフルエンザウイルス(influenza virus A)、B型インフルエンザウイルス(influenza virus B)、C型インフルエンザウイルス(influenza virus C)、イサウイルス(isavirus)、トゴトウイルス(thogotovirus)）；パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)（例えば、麻疹ウイルス(measles virus)、ムンプスウイルス(mumps virus)、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(Rinderpest virus)、犬ジステンパーウイルス(canine distemper virus)、ニパウイルス(Nipha virus)）；コロナウイルス科(Coronaviridae)（例えば、コロナウイルス(Corona virus)、SARS)）によって発現される、クラスIの三量体ウイルス糖タンパク質、以下：水疱口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus (VSV))、単純ヘルペスウイルス1(herpes simplex virus 1 (HSV-1及び2))、及びエプスタイン・バール・ウイルス(Epstein-Barr Virus (EBV)) gBによって発現される、クラスIIIの三量体タンパク質、並びにフラビウイルス(Flaviviridae)（例えば、デングウイルス(Dengue virus)、C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)、黄熱ウイルス(yellow fever virus)、ジカウイルス(Zika virus)）；ブニヤウイルス(Bunyaviridae)（例えば、リフトバレー熱(Rift Valley fever)）；トガウイルス(Togaviridae)（例えば、風疹ウイルス(Rubella virus)、アルファウイルス(alphavirus)）のクラスIIの糖タンパク質である。好ましくは、ウイルス抗原は、レトロウイルス科(例えば、HIV-1、HIV-2)によって発現される、クラスIの三量体ウイルス糖タンパク質である。

【0015】

一実施形態において、TMD又はCTは、パラミクソウイルスTMD又はCTを含む。パラミクソウイルスは、ルブラウイルス(Rubulavirus)（ムンプス(Mumps)）；パラインフルエンザウイルス5型(Parainfluenza virus 5)（サルウイルス5型(Simian virus 5)とも知られている）；パラインフルエンザウイルス2型(Parainfluenza virus 2)；パラインフルエンザウイルス3型(Parainfluenza virus 3)；レスピロウイルス(Respirovirus)（例えば、センダイウイルス(Sendai virus)）；モルビリウイルス(Morbillivirus)（例えば、麻疹ウイルス(Measles virus)）；へニパウイルス(Henipavirus)（例えば、ニパウイルス(Nipah virus)）；アブラウイルス(Avulavirus)（例えば、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)）；ニューモウイルス(Pneumovirus)（例えば、ヒトRSウイルス(Human respiratory syncytial virus)）；メタニューモウイルス(Metapneumovirus)（例えば、ヒトメタニューモウイルス(Human metapneumovirus)）からなる群から選択されてもよい。

【0016】

一実施形態において、TMD又はCTは、オルトミクソウイルスTMD又はCTを含む。オルトミクソウイルスは、A型インフルエンザウイルス(influenza virus A)；B型インフルエンザウイルス(influenza virus B)；C型インフルエンザウイルス(influenza virus C)からなる群から選択されてもよい。

【0017】

好ましくは、融合タンパク質は、ウイルス抗原並びにパラミクソウイルスTMD及び／又はパラミクソウイルスCTを含む。しかしながら、最も好ましくは、融合タンパク質は、ウイルス抗原及びパラミクソウイルスTMD及びパラミクソウイルスCTを含む。

【0018】

より好ましくは、融合タンパク質は、ムンプスウイルス(MuV)又はパラインフルエンザウイルス5型(PIV5)TMD及び／若しくはCTを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、ウイルス抗原及びムンプスウイルス(MuV)TMD及びMuV CTを含む。別の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ウイルス抗原及びパラインフルエンザウイルス5型(PIV5)TMD及びPIV5 CTを含む。

【0019】

融合タンパク質は、好ましくは、抗原、好ましくは、ウイルス抗原を、ウイルス様粒子(VLP)上に提示するように作られる。好ましくは、本発明の全ての態様で記載される用語VLPは、エンベロープを有するVLP、すなわち、膜エンベロープによって包まれたVLPに関する。

【0020】

当業者は、抗原提示(antigen display)が、B細胞受容体(BCR)が関与した場合に、B細胞を活性化する、ウイルスタンパク質（すなわち、抗原）の提示に関し、ウイルスタンパク質又は抗原に特異的な抗体の産生をもたらすと理解するだろう。当業者は、抗原提示は、作製されたVLPの外表面上における、ウイルスタンパク質（最も好ましくは、糖タンパク質）の提示又は修飾に関する、用語「シュードタイピング」を包含すると理解するだろう。

【0021】

TMD及び／又はCTは、融合タンパク質内において、抗原のN末端に配置してもよい。しかしながら、TMD及び／又はCTは、好ましくは、融合タンパク質内において、抗原のC末端に配置にする。融合タンパク質がTMD及びCTを含む実施形態において、その結果、CTは、TMDのN末端をにあってもよい。しかしながら、好ましい実施形態において、CTは、TMDのC末端にある。

【0022】

一実施形態において、ムンプスウイルス(MuV)TMDのアミノ酸配列は、以下の配列番号1として、本明細書で提供される。

【0023】

【化1】

【0024】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号1に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0025】

一実施形態において、ムンプスウイルス(MuV)CTのアミノ酸配列は、以下の配列番号2として、本明細書で提供される。

【0026】

【化2】

【0027】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号2に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0028】

一実施形態において、PIV5 TMDのアミノ酸配列は、以下の配列番号3として、本明細書で提供される。

【0029】

【化3】

【0030】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号3に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0031】

一実施形態において、PIV5 CTのアミノ酸配列は、以下の配列番号4として、本明細書で提供される。

【0032】

【化4】

【0033】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号4に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0034】

以下に示すように、融合タンパク質は、HIV抗原（例えば、HIV-1 Env）に融合したMuV TMD及びCT（下線）を含んでもよい。従って、一実施形態において、融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の配列番号5として、本明細書で提供される。

【0035】

【化5】

【0036】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号5に記載される通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる。

【0037】

一実施形態において、融合タンパク質は、以下の配列番号6として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされてもよい。

【0038】

【化6】

【0039】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号6に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0040】

融合タンパク質は、HIV抗原（例えば、HIV-1 Env）に融合したPIV5 TMD及びCT（下線）を含んでもよい。従って、別の実施形態において、融合タンパク質は、以下の配列番号7として、本明細書で提供される。

【0041】

【化7】

【0042】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号7に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0043】

一実施形態において、融合タンパク質は、以下の配列番号8として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされてもよい。

【0044】

【化8】

【0045】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号8に記載される通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる。

【0046】

有利なことに、MuV又はPIV5のTMD及び／又はCTを、異なるウイルスのウイルス抗原と結合することで、本発明者らは、VLPの表面上における、最大で2000のウイルス融合抗原の提示を可能にした。これは、ウイルス抗原の表面発現、結果として、その価数を著しく増加させ、高度に有効な液性免疫応答、著しい数の抗体の作製、及び、結果として、ウイルス抗原に対する頑強なワクチン接種をもたらす。

【0047】

第二の態様において、第一の態様による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0048】

核酸は、DNA、RNA、又はDNA/RNAハイブリッド配列を含んでもよい。好ましくは、核酸は、DNA又はRNAを含む。一実施形態において、核酸は、DNA配列である。別の実施形態において、核酸は、RNA配列である。RNAは、mRNA配列又は自己複製RNA配列(saRNA)であってもよい。

【0049】

当業者は、自己増幅mRNAがmRNAの基本的な要素（キャップ、5’UTR、3’UTR、及び可変の長さのポリA末端(poly A tail)）を含むが、かなり長く（例えば、9～12kb）てもよいと理解するだろう。

【0050】

一実施形態において、自己増幅mRNAは、アルファウイルスゲノム、例えば、シンドビスウイルス(Sindbis viruse)、セムリキ森林ウイルス(Semliki Forest viruse)、又はベネズエラ馬脳炎ウイルス(Venezuelan equine encephalitis viruse)由来である。この実施形態において、RNAは、RNA依存性RNAポリメラーゼを含む非構造タンパク質に由来する、レプリカーゼ複合体を使用して、自己増幅し、有利には、同様の用量のメッセンジャーRNAよりも、目的のコードされた遺伝子のより高いタンパク質発現をもたらす。この実施形態において、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、サブゲノムプロモーターの下流に、アルファウイルスの構造遺伝子の代わりに挿入される。

【0051】

MuV及びPIV5は、表面上に最大で2000のウイルス融合抗原を提示する利点を有し、VLPは、3つのタンパク質（糖タンパク質、マトリックスタンパク質、及び核タンパク質）の共発現によって、哺乳類細胞中で以前に産生された(15-18)。しかしながら、本発明者らは、この度、修飾したMuV及びPIV5マトリックスタンパク質を使用して、VLPの表面上におけるウイルス糖タンパク質の提示のための新規プラットフォームを開発し、新規プラットフォームは、有利なことに、先行技術のシステムのようにMuV及びPIV5でシュードタイピングされたVLPを作製するための核タンパク質の必要性を回避する。

【0052】

本発明者らは、VLPの形成のためのコアタンパク質として、膜標的配列(membrane targeting sequence)に融合したパラミクソウイル科のマトリックスタンパク質を使用した。パラミクソウイル科ファミリーのマトリックスタンパク質は、膜標的配列を含まず、会合し及び真核細胞の膜から出芽するためのウイルス及び／又は宿主の因子との相互作用を必要とする。感染性のウイルスの場合、膜標的の欠如は、非感染性の空のビリオンの放出を防ぐメカニズムである。有利なことには、本発明者らは、意図的に、膜標的を操作して、効率的な作製を容易にし、又は単に膜に標的化されたマトリックスタンパク質を使用して、VLPを操作し、VLPを作製した。

【0053】

従って、本発明の第三の態様において、ウイルス様粒子(VLP)を形成するのに適した融合タンパク質であって、パラミクソウイルス又はオルトミクソウイルスのマトリックスタンパク質、及び膜標的シグナル(MTS)を含む融合タンパク質を提供する。

【0054】

当業者は、ウイルス様粒子が、抗原、好ましくは、ウイルス抗原で修飾することが可能である、任意のビヒクルを指してもよいと理解するだろう。特に、ウイルス様粒子は、野生型のウイルスの組織化及びコンフォメーションを模倣するが、ウイルスゲノムを欠如する、多タンパク質構造を指してもよい。好ましくは、VLPは、エンベロープを有するVLPである。

【0055】

好ましくは、パラミクソウイルス又はオルトミクソウイルスは、第一の態様において規定された通りである。

【0056】

好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、パラミクソウイルスのマトリックスタンパク質を含む。好ましくは、融合タンパク質は、MuV又はPIV5のマトリックスタンパク質を含む。

【0057】

MTSは、パラミクソウイルス又はオルトミクソウイルスのマトリックスタンパク質のN末端又はC末端に配置してもよい。好ましくは、パラミクソウイルス又はオルトミクソウイルスのマトリックスタンパク質及びMTSは、連続したアミノ酸配列を形成する。好ましくは、MTSは、パラミクソウイルスのマトリックスタンパク質のN末端に配置する。

【0058】

MTSは、Fyn様タンパク質キナーゼ(Fyn-like protein kinase)、Lck-M、Src、又はC-YES由来であってもよい。従って、MTSは、Fyn様タンパク質キナーゼ‐MGCVQCKDKE（配列番号9）；Lck-M‐MGCGCSSHPE（配列番号10）；Src‐MGSSKSKPKD（配列番号11）；及びC-YES‐MGCIKSKENK（配列番号12）、又はそれらのバリアント若しくは断片からなる群から選択されてもよい。

【0059】

好ましくは、MTSは、Fyn様タンパク質キナーゼに由来する。従って、一実施形態において、MTSは、以下の配列番号9として、本明細書で提供される。

【0060】

【化9】

【0061】

従って、好ましくは、MTSは、実質的に配列番号9に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0062】

以下に示すように、第三の態様の融合タンパク質は、MuVのマトリックスタンパク質（ジーンバンク：D86171）、及びFyn様タンパク質キナーゼに由来するMTS（下線）を含んでもよい。従って、一実施形態において、融合タンパク質は、以下の配列番号13として、本明細書で提供される。

【0063】

【化10】

【0064】

従って、好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号13に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0065】

一実施形態において、第三の態様の融合タンパク質は、Fynがん原遺伝子（NCBI参照配列NM_002037.5、及び下線）を含むヌクレオチド配列を有する、核酸によってコードされてもよく、以下の配列番号14として、本明細書で提供される。

【0066】

【化11】

【0067】

従って、好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号14に記載される通りの核酸配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。

【0068】

核酸配列は、ヒトにおける発現に関して、コドン最適化されていてもよい。従って、好ましい一実施形態において、融合タンパク質は、以下の配列番号15として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされていてもよい。

【0069】

【化12】

【0070】

従って、好ましくは、融合タンパク質は、実質的に配列番号15に記載される通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる。

【0071】

別の実施形態において、第三の態様の融合タンパク質は、以下の配列番号16として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされていてもよい。

【0072】

【化13】

【0073】

従って、好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号16に記載される通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされる。

【0074】

第三の態様の融合タンパク質は、PIV5のマトリックスタンパク質、及びFyn様タンパク質キナーゼ由来のMTS（下線）を含んでもよい。従って、一実施形態において、融合タンパク質は、以下の配列番号17として、本明細書で提供される。

【0075】

【化14】

【0076】

従って、好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号17に記載される通りのアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのバリアント若しくは断片を含む。

【0077】

一実施形態において、第三の態様の融合タンパク質は、以下の配列番号18として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされていてもよい。

【0078】

【化15】

【0079】

従って、好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号18に記載される通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされていてもよい。

【0080】

ヌクレオチド配列は、ヒトにおける発現に関して、コドン最適化されていてもよい。従って、一実施形態において、融合タンパク質は、以下の配列番号19として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされていてもよい。

【0081】

【化16】

【0082】

従って、好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号19に記載される通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされていてもよい。

【0083】

一実施形態において、第三の態様の融合タンパク質は、以下の配列番号20として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされていてもよい。

【0084】

【化17】

【0085】

従って、好ましくは、第三の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号20に記載される通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む核酸によってコードされていてもよい。

【0086】

第四の態様において、第三の態様による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列を提供する。

【0087】

核酸配列は、DNA、RNA、又はDNA/RNAハイブリッド配列であってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列は、DNA又はRNA配列である。一実施形態において、核酸配列は、DNA配列である。別の実施形態において、核酸配列は、RNA配列である。一実施形態において、RNAは、mRNA配列又は自己複製RNA配列であってもよい。

【0088】

第五の態様において、第三の態様による融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)を提供する。

【0089】

第三の態様のVLPの平均直径は、30nmと1000nmの間、40umと900nmの間、50nmと800nmの間、60nmと700nmの間、70nmと600nmの間、80nmと500nmの間、90nmと400nmの間、100nmと300nmの間であってもよい。好ましくは、平均直径は、30nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、40nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、50nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、60nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、70nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、80nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、90nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、100nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nmの間である。

【0090】

当業者は、VLPの直径が、ナノ粒子トラッキング解析、チューナブル抵抗パルス検出(TRPS)、又は動的光散乱法、コロイド及び／又は生体分子被験物質としてハイスループット単一粒子測定を可能にする技術を使用して、決定することができると理解するだろう。好ましくは、VLPは、エンベロープを有するVLPである。

【0091】

第六の態様において、第五の態様によるウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、宿主細胞中で、第四の態様の核酸を発現させることを含む方法を提供する。

【0092】

宿主細胞は、真核又は原核の宿主細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、真核宿主細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞、例えば、ヒト胎児腎293細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。細胞に、ウイルス様粒子(VLP)を形成するのに適した融合タンパク質、及びマトリックス-MTSタンパク質をコードするDNA配列を同時に形質導入して、上清中に分泌されるVLPを製造することができる。これは、一時的なトランスフェクションによって実施してもよく、融合タンパク質及びマトリックスMTSの両方を発現する安定細胞株の樹立を通して実施してもよい。VLPを含む上清を採取し、当業者に知られているであろう、ウイルス又はVLP精製に関する標準的な方法によって、細胞からVLPを精製することができる。

【0093】

本発明の第七の態様において、抗原を提示するウイルス様粒子(VLP)を形成するのに適した融合タンパク質であって、第一の態様の融合タンパク質及び第三の態様の融合タンパク質を含む、融合タンパク質を提供する。

【0094】

本明細書に記載される任意の融合タンパク質は、単離することができる。本明細書に記載される融合タンパク質は、好ましくは、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の純度にまで精製することができる。

【0095】

第一の態様の融合タンパク質は、第三の態様の融合タンパク質のC末端に配置してもよい。しかしながら、好ましくは、第一の態様の融合タンパク質は、第三の態様の融合タンパク質のN末端に配置される。一実施形態において、第一の態様の融合タンパク質及び第三の態様の融合タンパク質は、切断可能なスペーサー配列で互いに連結していてもよい。スペーサー配列は、分解又は切断され、それによって、別の分子として、2つの融合タンパク質を産生するように作製する。従って、スペーサー配列は、好ましくは、切断可能なペプチド、好ましくは、2Aペプチドである。

【0096】

適切な2Aペプチドは、豚テッショウウイルス1型(porcine teschovirus-1) 2A(P2A)‐ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号28）、トセア・アシグナウイルス(thosea asigna virus) 2A(T2A)‐QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号29）、馬鼻炎Aウイルス(equine rhinitis A virus) 2A(E2A)、及び口蹄疫ウイルス(Foot and mouth disease virus) 2A(F2A) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号30）を含む。好ましくは、2Aペプチドは、トセア・アシグナウイルス2A(T2A)である。

【0097】

別の実施形態において、切断可能なペプチドは、自己切断ペプチドである。好ましくは、自己切断ペプチドは、フーリン(furin)/2Aペプチドである。フーリン配列は、2A配列の3’又は5’に配置してもよい。好ましくは、フーリン配列を、2A配列の5’に配置し、好ましくは、フーリン配列と2A配列との間に配置されるGSGスペーサーとともに配置する。

【0098】

当業者は、フーリンが、特定の認識配列、規範的に‐R-X-R/K/X-R（配列番号26）において、前駆タンパク質を切断し、分泌経路に（主にゴルジ及びトランス・ゴルジ網に）存在するユビキタスなカルシウム依存性プロタンパク質転換酵素であり、最後のRの後にプロタンパク質を切断すると理解するだろう。従って、一実施形態において、フーリン配列は、R-X-R/K/X-Rである。しかしながら、好ましくは、フーリン配列は、最適化された配列RRRRRR（配列番号27）GSG配列である。別の実施形態において、フーリン配列は、R-X-X-R（配列番号35）であって、Xは任意のアミノ酸である。別の実施形態において、フーリン配列は、R-X₁-X₂-R（配列番号36）であって、X₁は任意のアミノ酸であり、X₂はR又はKである。好ましい実施形態において、フーリン配列は、R-R-R-R（配列番号37）である。好ましくは、GSGスペーサーは、フーリン配列の3’及び2A配列の5’に配置される。

【0099】

従って、好ましくは、スペーサー配列は、NCBI参照配列：ジーンバンク：AAC97195.1によって提供され、以下の配列番号21として本明細書で提供される、フーリン/T2Aである。

【0100】

【化18】

【0101】

従って、好ましくは、スペーサー配列は、実質的に配列番号17に記載される通りのアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。

【0102】

従って、一実施形態において、第五の態様の融合タンパク質は、MuVのマトリックスタンパク質、Fyn様タンパク質キナーゼ由来のMTS（太字）、HIV抗原（例えば、HIV-1 Env）に融合したMuV TMD及びCT（太字下線）、並びにフーリン/T2A配列（下線）を含んでもよく、以下の配列番号22として、本明細書で提供される。

【0103】

【化19】

【0104】

従って、好ましくは、第七の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号22に記載される通りのアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。

【0105】

一実施形態において、第七の態様の融合タンパク質は、以下の配列番号23として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされていてもよい。

【0106】

【化20】

【0107】

従って、好ましくは、第七の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号23に記載される通りのヌクレオチド配列を含む核酸、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされていてもよい。

【0108】

別の実施形態において、第七の態様の融合タンパク質は、PIV5のマトリックスタンパク質、Fyn様タンパク質キナーゼ由来のMTS（太字）、HIV抗原（例えば、HIV-1 Env）に融合したPIV5 TMD及びCT（太字下線）、並びにT2A配列（下線）を含み、以下の配列番号24として、本明細書で提供される、アミノ酸配列を有していてもよい。

【0109】

【化21】

【0110】

従って、好ましくは、第七の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号18に記載される通りのアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。

【0111】

一実施形態において、第七の態様の融合タンパク質は、以下の配列番号25として、本明細書で提供される、ヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされていてもよい。

【0112】

【化22】

【0113】

従って、好ましくは、第七の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号25に記載される通りのヌクレオチド配列を含む核酸、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされていてもよい。好ましくは、抗原は、ウイルス抗原である。

【0114】

第八の態様において、第七の態様の融合タンパク質をコードする核酸を含む核酸配列を提供する。

【0115】

核酸配列は、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド配列であってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列は、DNA又はRNA配列である。一実施形態において、核酸配列は、DNA配列である。別の実施形態において、核酸配列は、RNA配列である。RNA配列は、mRNA配列又は自己複製RNA配列であってもよい。

【0116】

本明細書に記載される任意の核酸は、単離することができる。本明細書に記載される核酸は、好ましくは、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の純度にまで精製することができる。

【0117】

本発明の第九の態様において、第一の態様による融合タンパク質及び第三の態様による融合タンパク質を含むVLPであって、第一の態様の融合タンパク質の抗原がVLPの表面上に提示されるVLPを提供する。

【0118】

抗原を提示する第九の態様のVLPは、シュードタイピングされている又は修飾されているとみなされると理解されるだろう。好ましくは、シュードタイピングされたVLPは、その外表面上に、少なくとも50の抗原分子、より好ましくは、少なくとも100、200、又は500の抗原分子を含む又は提示する。さらにより好ましくは、シュードタイピングされたVLPは、少なくとも1000、1500、2000、2500 3000、3500、4000、4500、又は5000の抗原分子を含む又は提示する。好ましくは、抗原はウイルス抗原であり、当業者は、ウイルスタンパク質（すなわち、抗原）の提示が、B細胞受容体(BCR)が関与した場合に、B細胞を活性化し、ウイルスタンパク質に特異的な抗体の産生をもたらすと理解するだろう。

【0119】

第九の態様のVLPの平均直径は、30nmと1000nmの間、40umと900nmの間、50nmと800nmの間、60nmと700nmの間、70nmと600nmの間、80nmと500nmの間、90nmと400nmの間、100nmと300nmの間であってもよい。好ましくは、平均直径は、30nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、40nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、50nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、60nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、70nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、80nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、90nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、又は100nmの間である。好ましくは、平均直径は、100nmと1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nmの間である。

【0120】

当業者は、VLPの直径が、ナノ粒子トラッキング解析、動的光散乱法、又はチューナブル抵抗パルス検出(TRPS)、コロイド及び／又は生体分子被験物質としてハイスループット単一粒子測定を可能にする技術を使用して、決定することができると理解するだろう。

【0121】

第十の態様において、シュードタイピングされたウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、第一の態様の融合タンパク質の抗原をVLPの表面上に提示するような条件下で、第一の態様の融合タンパク質を第三の態様の融合タンパク質と接触させ、それの結果、シュードタイピングされたウイルス様粒子を形成する工程を含む方法を提供する。

【0122】

接触は、好ましくは、in vitro又はex-vivoで実施してもよい。

【0123】

一実施形態において、第一の態様の融合タンパク質を第三の態様の融合タンパク質と接触させることは、第一の態様の融合タンパク質を、第三の態様の融合タンパク質から形成したVLPと接触させることであって、第一の態様の融合タンパク質を、第一の態様の融合タンパク質の抗原がVLPの外表面上に提示されるように、VLPと相互作用させることを含む。好ましくは、融合タンパク質は、互いに相互作用して、VLPをシュードタイピングすることとなる。

【0124】

一実施形態において、第一の態様の融合タンパク質を第三の態様の融合タンパク質と接触させることは、抗原が第三の態様の融合タンパク質によって形成されたVLPの外表面を指向するように、宿主細胞中に発現した際に、第一の態様の融合タンパク質が、第三の態様の融合タンパク質と相互作用するように、宿主細胞中で、第一の態様の融合タンパク質を第三の態様の融合タンパク質と共発現させ、シュードタイピングされたウイルス様粒子を形成することを含む。VLPは、上清中に分泌されてもよい。VLPを含む上清を回収し、当業者に知られているであろう、ウイルス又はVLP精製に関する標準的な方法によって、細胞からVLPを精製することができる。

【0125】

宿主細胞は、真核又は原核の宿主細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、真核宿主細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞、例えば、ヒト胎児腎293細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。共発現は、一時的なトランスフェクションによって実施してもよく、安定細胞株の樹立を通して実施してもよい。

【0126】

第十一の態様において、ウイルス様粒子上における抗原提のための第一の態様の融合タンパク質の使用を提供する。

【0127】

好ましくは、ウイルス様粒子は、第三の態様において規定される。

【0128】

好ましくは、抗原提示は、第一の態様において規定される。

【0129】

第十二の態様において、第二、第四、及び／若しくは第八の態様による核酸、又は第一、第三、及び／若しくは第七の態様の融合タンパク質をコードする核酸を含む、発現カセットを提供する。

【0130】

本発明の核酸配列は、好ましくは、組換えベクター、例えば、目的の宿主細胞に送達するための組換えベクター中に内包される。

【0131】

従って、第十三の態様において、第十二の態様による発現カセットを含む組換えベクターを提供する。

【0132】

ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージであってもよく、及び／又はウイルスベクターであってもよい。そのような組換えベクターは、本発明の送達システムにおいて、ヌクレオチド配列で細胞を形質転換するのに大いに有用である。ヌクレオチド配列は、好ましくは、DNA配列であってもよい。

【0133】

好ましくは、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターからなる群から選択されてもよい。好ましくは、ベクターは、AAVベクターである。

【0134】

組換えベクターはまた、その他の機能的要素も含んでもよい。例えば、組換えベクターは、さらに、宿主細胞へのベクターの導入後に導入遺伝子の発現を開始するための適切なプロモーターを含む、様々なその他の機能的要素を含んでもよい。例えば、ベクターは、好ましくは、宿主細胞の核内で自発的にに複製することができる。この場合、DNA複製を誘導又は制御する要素が、組換えベクター中に必要とされ得る。代替的には、組換えベクターを、宿主細胞のゲノム中に組み込まれるように設計してもよい。この場合、（例えば、相同組換えによる）標的組込みに都合が良いDNA配列が、予想される。適切なプロモーターは、例として、SV40プロモーター、CMV、EF1a、PKG、ウイルス性長末端反復、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導システム）を含み得る。カセット又はベクターはまた、ターミネーター、例えば、ベータグロビン、SV40ポリアデニル化配列、又は合成ポリアデニル化配列も含み得る。組換えベクターはまた、プロモーター又はレギュレーター又はエンハンサーを含み、必要に応じて、核酸の発現を制御することができる。組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントを使用して、特定の細胞タイプ、例えば、上皮細胞中で、核酸の発現を制御することができる。プロモーターは、構成的であってもよく誘導的であってもよい。

【0135】

ベクターはまた、クローニング過程において選択可能マーカーとして使用することができる遺伝子をコードするDNA、すなわち、トランスフェクションされた又は形質転換された細胞の選択を可能にし、異種DNAを組み入れたベクターを内包する細胞の選択を可能にするDNAを含んでもよい。例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ピューロマイシン、又はクロラムフェニコール耐性が予想される。代替的には、選択可能マーカー遺伝子は、異なるベクター中に存在し、導入遺伝子を含むベクターと同時に使用してもよい。カセット又はベクターはまた、ヌクレオチド配列の発現制御に関わるDNA、又は宿主細胞の特定の部分へ、発現するポリペプチドを標的するDNAを含んでもよい。

【0136】

精製したベクターは、適切な方法、例えば、直接エンドサイトーシス取込み(direct endocytotic uptake)によって、宿主細胞に直接挿入することができる。ベクターは、トランスフェクション、インフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、原形質融合、又は弾道撃ち込み(ballistic bombardment)によって、宿主対象の細胞（例えば、真核細胞又は原核細胞）に、直接導入することができる。代替的には、本発明のベクターは、パーティクル・ガン(particle gun)を使用して、宿主細胞に直接導入することができる。

【0137】

核酸分子は、処置する対象の細胞のDNAに組み込まれる、核酸分子であってもよい（が、必ずしもそうではない）。未分化細胞は、安定に形質転換して、遺伝子学的に修飾された娘細胞の産生をもたらし得る（その場合、対象における発現の制御が、例えば、特定の転写因子又は遺伝子活性化因子とともに必要になり得る）。代替的には、送達システムを、処置する対象における分化細胞の不安定な形質転換又は一時的な形質転換に都合がよいように設計することができる。この場合、発現の制御は、あまり重要でないことがある。なぜならば、DNA分子の発現は、形質転換した細胞が死んだ場合に終了する、又は（理想的には、必要とされる治療効果が達成された際に）タンパク質の発現を終了するからである。

【0138】

代替的には、送達システムは、核酸分子を、対象に、ベクターに組込まずに提供することができる。例えば、核酸分子を、リポソーム又はウイルス粒子内に組込むことができる。代替的には、「裸の」核酸分子を、適切な方法、例えば、直接エンドサイトーシス取込みによって、対象の細胞内に挿入することができる。

【0139】

核酸分子を、トランスフェクション、インフェクション、マイクロインジェクション、細胞融合、原形質融合、又は弾道撃ち込みによって、処置する対象の細胞に移すことができる。例えば、移動は、被覆金粒子の弾丸トランスフェクション(ballistic transfection)、核酸分子を含むリポソーム、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）、及び核酸分子の直接の適用による、直接の核酸取込み（例えば、エンドサイトーシス）を提供する方法によって、行うことができる。

【0140】

第十四の態様において、第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質をコードする核酸配列、第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列、第十二の態様の発現カセット、又は第十三の態様の組換えベクターを含む、宿主細胞を提供する。

【0141】

宿主細胞は、真核又は原核の宿主細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、真核宿主細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である。

【0142】

第十五の態様において、第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様の組換えベクター；又は第十四の態様の宿主細胞、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物を提供する。

【0143】

別の実施形態において、第二及び第四の態様の核酸配列は、医薬組成物中に存在し、且つ同じ発現カセット及びベクター中に存在する。

【0144】

別の実施形態において、第二及び第四の態様の核酸配列は、医薬組成物中に存在し、且つ異なる発現カセット又はベクター中に存在する。

【0145】

第十六の態様において、第十五による医薬組成物を製造する方法であって、第一及び／若しくは第三の態様の融合タンパク質；第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクター；又は第十四の態様の宿主細胞を、薬学的に許容されるビヒクルと接触させる工程を含む方法を提供する。

【0146】

本発明の融合タンパク質及びVLPは、治療及び診断の際に使用することができると理解される。

【0147】

従って、第十七の態様において、治療又は診断の際に使用するための、第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクター；第十四の態様の宿主細胞；又は第十五の態様の医薬組成物を提供する。

【0148】

第十八の態様において、ウイルス感染の防止、改善、又は処置の際に使用するための、第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクター；第十四の態様の宿主細胞；又は第十五の態様の医薬組成物を提供する。

【0149】

本発明の第十九の態様において、ウイルス感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療的有効量の第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクター；第十四の態様の宿主細胞；又は第十五の態様の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0150】

好ましくは、防止、改善、又は処置するウイルス感染は、HIV、エボラウイルス、マールブルグウイルス、インフルエンザ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、RSウイルス、牛疫ウイルス、ニパウイルス、ラッサウイルス、SARSコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス1、エプスタインバーウイルス、デングウイルス、C型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、ジカウイルス、リフトバレー熱ウイルス、又は、風疹ウイルス感染からなる群から選択される。好ましくは、ウイルス感染は、HIV感染である。

【0151】

本明細書に記載される融合タンパク質は、ウイルス感染に対して、対象にワクチン接種する有効な手段を提供する。

【0152】

従って、第二十の態様において、第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクター；第十四の態様の宿主細胞；又は第十五の態様の医薬組成物を含むワクチンを提供する。

【0153】

ワクチンは、タンパク質ワクチン、DNAワクチン、又はRNAワクチンであり得る。好ましくは、ワクチンは、適切なアジュバントを含む。

【0154】

一実施形態において、ワクチンは、第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質、第五若しくは第九の態様のVLPを含み得る。この実施形態において、ワクチンは、好ましくは、注射によって、血流に送達する。

【0155】

一実施形態において、ワクチンは、第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクターを含み得る。この実施形態において、ワクチンは、好ましくは、注射によって、皮膚又は筋肉に送達する。

【0156】

精製されたVLPとして投与する場合、組成物は、誘導する免疫応答の強度及び動態を高めるために、アジュバントとともに送達することができる。適切なアジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）、リピドA類似体（例えば、MPLA、RC529、GLA、E6020）、AS05 (MPL、アルミニウム塩)、エマルション（例えば、MF59、AS03、GLA-SE）、イミダゾキノリン（例えば、イミキモド、R848)、CpG ODN、サポニン（例えば、QS12）、AS)1 (MPL、QS21、リポソーム)、AS02 (MPL、QS21、エマルション)、AS15 (MPL、QS21、GpG、リポソーム)、CAF01 (TDB、カチオン性リポソーム)、ISCOMS (サポニン、リン脂質)、dsRNA類似体（例えば、Poly-IC）、フラジェリン、C型レクチン（例えば、TDB）、CD1dリガンド（例えば、α‐ガラクトシルセラミド)、IC31 (CpG、カチオン性ペプチド) 、及び組換えサイトカイン（例えば、IL-12、GM-CSF、1型インターフェロン）からなる群から選択されるアジュバントを含む。いくつかの実施形態において、サイトカインは、本発明のRNA配列内にコードすることができる。

【0157】

第二十一の態様において、対象における免疫応答を刺激する際に使用するための、第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクター；第十四の態様の宿主細胞；又は第十五の態様の医薬組成物を提供する。

【0158】

例えば、第一の態様に規定される抗原のように、免疫応答は、原虫、細菌、ウイルス、がん、又は神経変性疾患と関連するタンパク質に対して刺激することができる。

【0159】

第一、第三、若しくは第七の態様の融合タンパク質；第二、第四、若しくは第八の態様の核酸配列；第五若しくは第九の態様のVLP；第十二の態様の発現カセット；第十三の態様のベクター；第十四の態様の宿主細胞；又は第十五の態様の医薬組成物（本明細書において、活性物質として知られる）を、ウイルス感染を処置、改善、又は防止するための、単剤療法として使用することができる、医薬中で使用することができる。代替的には、本発明による活性物質は、ウイルス感染を処置、改善、又は防止するための既知の治療への付加物として、又は既知の治療と組合せて使用することができる。例えば、適切な抗ウイルス剤は、侵入阻害剤（例えば、抗HIV薬のマラビロク）；脱殻阻害剤（例えば、インフルエンザに有効である、アマンタジン及びリマンタジン）；逆転写阻害剤（例えば、当業者に知られているであろう、ヘルペスウイルス感染に対する、抗ウイルス剤、アシクロビル、ヌクレオシド類似体、並びにHIVに対して使用される広範囲のヌクレオシド類似体及び非ヌクレオシド類似体；インテグラーゼ阻害剤（例えば、ラルテグラビル、ドルテグラビル、若しくはエルビテグラビル；又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、HIVに対するロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、若しくはサキナビル）を含み得る。

【0160】

本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物は、特に、組成物を使用する方法に応じて、多くの異なる形態を有する組成物中に組合せることができる。従って、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態、又は処置を必要とするヒト又は動物に投与することができる任意のその他の適切な形態であり得る。本発明による医薬のビヒクルは、それを与える対象が良好な耐容性を示すものであるべきであると理解される。

【0161】

本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物は、徐放デバイス又は遅延放出デバイス中に組込むこともできる。そのようなデバイスを、例えば、皮膚上又は皮膚の下に挿入してもよく、医薬を、数週間又はさらには数か月にわたって、放出することができる。デバイスは、少なくとも処置部位に隣接した箇所に設置することができる。そのようなデバイスは、遺伝的コンストラクト又は組換えベクターを用いた長期にわたる処置が必要であり、通常、頻繁な投与が（例えば、少なくとも毎日の注射）が必要であるだろう場合に、特に有利であり得る。

【0162】

好ましい実施形態において、しかしながら、本発明による医薬は、対象に、注射によって、血流、筋肉、皮膚に投与することができる、又は処置を必要とする部位に直接投与することができる。注射は、静脈注射（ボーラス投与若しくは点滴）又は皮下注射（ボーラス投与若しくは点滴）又は皮内注射（ボーラス投与若しくは点滴）であってもよい。

【0163】

必要とされる融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物の量は、生物学的活性及びバイオアベイラビリティによって決定し、そして、その量は、投与の方法、融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物の生理化学的特性、及び単剤療法として使用するか又は併用療法で使用するかによって、決定する。投与の頻度はまた、処置する対象内における、活性物質の半減期の影響を受ける。投与する最適な用量は、当業者が決定することができ、使用する特定の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物、医薬組成物の強度、投与の方法、並びにウイルス感染の種類及び進展によって様々である。対象の年齢、体重、性別、食事、投与の時間を含む、処置する特定の対象によって決まる更なる因子は、用量を調整する必要性を生じさせる。

【0164】

一般に、本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物の、0.001μg/kg体重と10mg/kg体重の間の一日用量、又は0.01μg/kg体重と1mg/kg体重の間の一日用量を、使用する活性物質次第で、ウイルス感染を処置、改善、又は防止するために使用することができる。

【0165】

融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物は、ウイルス感染の発症の前、発症の間、又は発症の後に投与することができる。一日用量は、単回投与（例えば、1日1回の注射、スプレー式点鼻薬の吸入）として与えることができる。代替的には、融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物は、1日の間に2回又はそれより多くの投与を必要としてもよい。例として、融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物は、0.07μgと700mgの間（すなわち、70kgの体重と仮定）の1日2回（又は処置するウイルス感染の重症度次第ではそれより多くの回数）の投与量として、投与することができる。処置を受ける対象は、起床直後に最初の1回分の薬を服用し、次いで、夕方に又はその後3時間若しくは4時間間隔で2回目の薬を服用し得る。代替的には、徐放デバイスを使用して、最適な用量の本発明による融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物を、反復投与する必要なく、対象に、提供することができる。

【0166】

既知の方法、例えば、製薬業界で従来使用される方法（例えば、in vivo実験、臨床試験など）を使用して、本発明による融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクターの特定の製剤、及び精密な治療計画（例えば、薬剤の一日用量及び投与の頻度）を形成することができる。

【0167】

「対象」は、脊椎動物、哺乳類、又は家畜であり得る。従って、本発明による組成物及び医薬は、任意の哺乳類、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを処置するために使用することができ、又はその他の獣医学的用途に使用することができる。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。

【0168】

融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物の「治療的有効量」は、対象に投与された際に、ウイルス感染を改善、防止、又は処置するのに必要である上述のものの量である、任意の量である。

【0169】

例えば、本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物は、約0.01mgから約800mg、好ましくは、約0.01mgから約500mgで使用することができる。融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物の量は、約0.1mgから約250mgであることが好ましく、最も好ましくは、約0.1mgから約20mgの量である。

【0170】

本明細書で称される「薬学的に許容されるビヒクル」は、当業者に、医薬組成物を製剤するのに有用であると知られている、任意の既知の化合物又は既知の化合物の組合せである。

【0171】

一実施形態において、薬学的に許容されるビヒクルは、固体であってよく、組成物は、粉末又は錠剤の形態であってよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、フィラー、流動促進剤、圧縮補助剤(compression aid)、不活性結合剤、甘味料、保存料、染料、コーティング剤、又は錠剤崩壊剤としても作用することができる1つ又は複数の物質を含み得る。ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。粉末において、ビヒクルは、微細化した本発明による活性物質との混合物中に存在する、微細化された個体である。錠剤において、活性物質（例えば、本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、又は組換えベクター）を、適切な割合で必須の圧縮特性を有するビヒクルと混合し、所望の形及びサイズに圧縮することができる。粉末及び錠剤は、好ましくは、最大で99%の活性物質を含む。適切な固体ビヒクルは、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン(polyvinylpyrrolidine)、低融点ワックス、及びイオン交換樹脂を含む。別の実施形態において、医薬的ビヒクルは、ゲルであってよく、組成物は、クリーム等の形態であってよい。

【0172】

しかしながら、医薬的ビヒクルは、液体であってもよく、医薬組成物は、溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル剤、及び加圧組成物の調製の際に使用することができる。本発明による融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、又は組換えベクターは、薬学的に許容される液体ビヒクル、例えば、水、有機溶剤、両方の混合物、又は薬学的に許容される油若しくは脂肪中に、溶解又は懸濁することができる。液体ビヒクルは、その他の適切な医薬的添加剤、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定化剤、又は浸透圧調節剤を含むことができる。経口又は非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例は、水（上述の添加材、例えば、セルロース誘導体、好ましくは、カルボキシメチルセルロースナトリウムを部分的に含む）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えば、グリコールを含む）及びそれらの誘導体、並びに油（例えば、分画ヤシ油及び落花生油）を含む。非経口投与に関して、ビヒクルは、油性エステル、例えば、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルであることも可能である。滅菌した液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素又はその他の薬学的に許容されるプロペラントであることも可能である。

【0173】

滅菌溶液又は懸濁液である、液体の医薬組成物は、例えば、筋内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、及び特に、皮下注射によって、使用することができる。本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、又は組換えベクターは、投与時に、滅菌した水、生理食塩水、又はその他の適切な滅菌した注射可能な媒体を使用して、溶解又は懸濁することができる、滅菌した固体組成物として調製することができる。

【0174】

本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、又は医薬組成物は、その他の溶質又は懸濁化剤（例えば、等張液を作るのに十分な塩又はグルコース）、胆汁塩、アカシアゴム、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート80（エチレンオキシドと共重合した、ソルビトール及びその無水物のオレイン酸エステル）などを含む、滅菌した溶液又は懸濁液の形態で、経口投与することができる。本発明の融合タンパク質、VLP、核酸配列、発現カセット、組換えベクター、及び本発明による医薬組成物はまた、液体又は固体組成物の形態のいずれかで、経口投与することができる。経口投与に適した組成物は、固体形態（例えば、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、及び粉末）並びに液体形態（例えば、溶液、シロップ、エリキシル、及び懸濁液）を含む。非経口投与に有用な形態は、滅菌した溶液、エマルション、及び懸濁液を含む。

【0175】

本発明は、バリアント又は断片を含む、本明細書に記載される実質的にアミノ酸又は核酸配列の任意の配列を含む、任意の核酸又はペプチド又はそのバリアント、誘導体若しくは類似体に及ぶと理解される。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「バリアント」、及び「断片」は、本明細書に記載されるアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列の任意の配列の1つと少なくとも40%の配列同一性を有する配列（例えば、配列番号1～34などとして識別される配列と40%同一）であり得る。

【0176】

記載される任意の配列と、65%超、より好ましくは70%超、さらにより好ましくは75%超、よりさらにより好ましくは80%超の配列同一性である、配列同一性を有する、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた、想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、記載される任意の配列と少なくとも85%の同一性、より好ましくは、少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも92%の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも97%の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも98%の同一性、最も好ましくは、本明細書に記載される任意の配列と少なくとも99%の同一性を有する。

【0177】

当業者は、2つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の間のパーセンテージ同一性を計算する方法を理解するだろう。2つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の間のパーセンテージ同一性を計算するために、2つの配列のアラインメントをまず用意し、続いて、配列同一性の値の計算をしなければならない。2つの配列に関するパーセンテージ同一性は、(i)配列をアラインメントするために使用する方法、例えば、（異なるプログラムで実行される）ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman、又は3D比較に由来する構造アラインメント、(ii)アラインメント方法、例えば、ローカルアラインメント及びグローバルアラインメント(local vs global alignment)によって使用するパラメータ、使用するペアスコアマトリックス(pair-score matrix)（例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnetなど）、並びにギャップペナルティ(gap-penalty)、例えば、関数形式(functional form)及び定数(constants)によって、異なる値を取り得る。

【0178】

アラインメントを作製したら、2つの配列間のパーセンテージ同一性を計算する多くの異なる方法がある。例えば、同一性の数を、(i)最も短い配列の長さ、(ii)アラインメントの長さ、(iii)配列の平均の長さ、(iv)ギャップのない位置(non-gap positions)の数、又は(v)オーバーハングを除いた、同等の位置(equivalenced positions)の数で、割ることができる。さらに、パーセンテージ同一性はまた、強く、長さ依存的であると理解される。従って、配列の対が短いほど、偶然に起きると予測され得る配列同一性は高くなる。

【0179】

従って、タンパク質又はDNA配列の正確なアラインメントは、複雑な方法であると理解される。よく知られている多重アラインメントプラグラムのClustalW（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882）は、本発明に従ってタンパク質又はDNAの多重アラインメントを作製するのに好ましい方法である。ClustalWに関する適切なパラメータは、以下の通りであり得る。DNAアラインメントに関して：ギャップオープンペナルティ(Gap Open Penalty) = 15.0、ギャップエクステンションペナルティ(Gap Extension Penalty) = 6.66、及びマトリックス(Matrix) = 同一性(Identity)。タンパク質アラインメントに関して：ギャップオープンペナルティ(Gap Open Penalty) = 10.0、ギャップエクステンションペナルティ(Gap Extension Penalty) = 0.2、及びマトリックス(Matrix) = Gonnet。DNA及びタンパク質アラインメントに関して：ENDGAP = -1、及びGAPDIST = 4。当業者は、これら及び最適な配列アラインメントのためのパラメータを変化させるが必要であり得ると理解している。

【0180】

好ましくは、2つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性の計算は、従って、(N/T)*100のようなアラインメントから計算することができる（Nは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Tは、ギャップを含み、オーバーハングを含む又は含まない、比較する位置の総数である）。好ましくは、オーバーハングは、計算中に含む。従って、2つの配列間のパーセンテージ同一性を計算する最も好ましい方法は、(i)パラメータの適切なセット（例えば、上記に示したように）を使用して、ClustalWプログラムを用いて、配列アラインメントを用意する工程；及び(ii)N及びTの値を、以下の式：配列同一性＝(N/T)*100に挿入する工程を含む。

【0181】

類似する配列を同定する別の方法は、当業者に知られている。例えば、非常に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下において、DNA配列又はその相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、およそ45℃の3×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中で、フィルターバインディングしたDNA又はRNA(filter-bound DNA or RNA)にハイブリダイズし、その後、およそ20～65℃の0.2×SSC／0.1% SDSで少なくとも1回洗浄することを、本発明者らは、意味する。代替的には、非常に類似するポリペプチドは、少なくとも1個のアミノ酸、しかし5、10、20、50、又は100個未満のアミノ酸が、例えば配列番号3に示される配列と異なっていてもよい。

【0182】

遺伝学的コードの縮退により、本明細書に記載される任意の核酸配列を、それよってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく、変化又は変更して、その機能的バリアントを提供することができることが明らかである。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内において同じアミノ酸をコードする、異なるコドンの置換によって変更された配列を有し、その結果、サイレント（同義）変化をもたらすバリアントである。その他の適切なバリアントは、置換するアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする、異なるコドンの置換によって変更された、相同なヌクレオチド配列を有するが、配列の全て又は配列の一部を含み、保存的変化をもたらすバリアントである。例えば、小さい、非極性の、疎水性のアミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンを含む。大きい、非極性の、疎水性のアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。極性の、中性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンを含む。負に電化した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。従って、どのアミノ酸が、同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸と置き換えることができるかは理解され、当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っている。

【0183】

本明細書に記載される（任意の添付の請求項、要約書、及び図面を含む）全ての特性、及び／又は開示される任意の方法若しくはプロセスの全ての工程は、そのような特性及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せにおける任意の上述の態様と組合せることができる。

【0184】

本発明のよりよい理解のため、及び本発明の実施形態がどのように実施することができるかを示すために、例として、添付の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0185】

【図1】図１は、MTS-M、HIV Env-Fキメラ、及びウイルス様粒子(VLP)構造を示す。（Ａ）HIV-1のエンベロープ(Env)の細胞外ドメイン、並びにシュードタイピングしたVLPのためのムンプス又はPIV5の膜貫通ドメイン(TMD)及び細胞質尾部(CT)を使用した、Env-Fキメラタンパク質を示す略図。（Ｂ）左の図に関しては3つのタンパク質、及び右の図に関しては2つのタンパク質を使用した、VLPの略式の構造。M、NP、及びMTS-Mは、PIV-5又はムンプスに由来する。

【図2】図２は、MTS-Matrix（マトリックス）+ Env-Fキメラが、VLPを産生するのに十分であることを示す。（Ａ）異なる割合(w:w)のEnv-F 1086C-MuV；M, マトリックス(matrix)；NP；核タンパク質；pcDNA3 empty（空ベクター）を発現するプラスミド（左の表を参照）を使用して、HEK293T.17細胞中で産生したムンプスVLPのウェスタンブロット解析。濃度測定解析を実施して、Env特異的シグナルに関する結果を中央のパネルに、n=2で、表した。AU：任意の単位。（Ｂ）異なる割合(w:w)のMTS-M（膜標的シグナル‐マトリックス）MuV及びEnv-F 1086C-MuVを使用し、（Ａ）と同様である(n=1)。（Ｃ）PIV5及びMuVでシュードタイピングしたVLPのウェスタンブロット解析。ConSOSL.UFO.PIV5 (ConS.PIV5)を、PIV5由来のマッチングしたM+NP又はMTS-M、並びにMTS-M MuV、並びにpcDNA3 empty（空ベクター）と組合せて試験した。（Ｄ）（Ｃ）のVLPのウェスタンブロットからの、Env特異的及びPIV5 matrix（マトリックス）特異的シグナルの濃度測定解析。n=3。エラーバーは、平均±SEMを表す。

【図3】図３は、MuV MTS-Matrixは、天然のHIV-1のトランケートEnvを有するVLPを産生することができることを示す。VLPを、異なる割合(w:w)のプラスミドEnv (ConSOSL.UFO.750)及びMTS-M MuVを使用して、産生した。濃度測定によってウェスタンブロットを解析し、Env特異的シグナル及びMTS-M特異的シグナルをプロットして、1:1の割合の条件に標準化した。n=1実験。

【図4】図４は、Env-Fキメラが、元のHIV-1 Env細胞外ドメイン構造を保存することを示す。（A）Env-Fキメラ1086C-PIV5及び1086C-MuV、又はマッチングした野生型の712位でトランケートされた1086C clade C HIV-1 Env (1086C.712)、又はフルレングスのEnv (1086C gp160)でトランスフェクションしたHEK293T.17細胞のフローサイトメトリー解析。細胞を、Envの異なるドメインに対して特異的なモノクローナル抗体(mAb)のパネルで染色した。ネガティブコントロールを含んだ(pcDNA3 empty)。（B）選択的に広域中和抗体に結合する、安定化HIV-1 Env (ConSOSL.UFO.750)を使用してシュードタイピングしたEnv-Fのフローサイトメトリー解析。平均蛍光強度の値を、2G12 mAbに標準化した。mAbを、x軸上に置き、Envドメイン特異性によって構造化した。ConS.MuV_T2A_MTS.M.MuVは、ConSOSL.UFO.MuVを、同じ転写産物由来のMTS-Matrix MuVとともに共発現し、2つのタンパク質は、ウイルス由来(T2A)自己切断ペプチドによって分離されている。

【図5】図５は、Envの定量化及びVLP上のEnv-Fの抗原プロファイルを示す。（Ａ）異なるタイプのVLPを表す略図。赤いEnvは、ConSOSL.UFO.750を示す。Env-F及びMTS-M（内側の単純な円）は、MuVに関しては紫、PIV5に関しては黄色である。2つのベクターを使用する場合にHEK293T.17細胞のトランスフェクションのために使用する割合(w:w)は、括弧内に示す。（Ｂ）捕捉のためのGNLを使用してキャプチャーELISA(capture ELISA)による、VLP1-4の表面上のEnvの定量化、及び基準としてのConSOSL.UFO.664 gp140 Envタンパク質。（Ｃ）VLP1-4に関する、GNLキャプチャーELISAによる、VLP Env抗原性の評価。各タイプのVLPに関する10E9のVLPを捕捉し、Envに対して特異的なモノクローナル抗体を10μg/mLで使用した。（Ｄ）VLPのサイズ分布及び数を、ナノ粒子トラッキング解析を使用して、Nanosight機器で特性を明らかにした。各タイプのVLPの平均直径を、表示される測定値に示した。（Ｅ）VLP1、VLP2、VLP4、及びVLP5、並びに（pcDNA3空ベクターをトランスフェクションした細胞由来の）エクソソームを、6つの三層のT-175フラスコのトランスフェクションしたHEK293T.17細胞から、20%スクロースクッションを通した超遠心分離法によって、精製し、Nanosight上で、サイズ解析をした。nmでの、粒子サイズ平均（黒の棒グラフ）及びモード（白の棒グラフ）を示す。エラーバーは、VLPに関してはn≧3、エクソソームに関してはn=2を有する、平均±SEMを表す。（Ｆ）（Ｅ）と同じ産出に由来する、VLP及びエクソソームの総産出量をプロットする。エラーバーは、VLPに関してはn≧3、エクソソームに関してはn=2を有する、平均±SEMを表し、ウェルチのt検定(Welch’s t-test)の*p<0.05を伴う。

【図6】図６は、VLPは、アジュバントなしで免疫原性であり、マウスモデルにおいてTh2タイプの応答を誘導することを示す。サブパートのＡ～Ｃにおいて、n=5のマウスの群を、VLP1からVLP4を用いて、3週間間隔で3回、異なるVLPの用量（10E8、10E9、10E10、及び20E10粒子／注射）で、筋肉注射で免疫付与した。各注射の前、及び動物を処分する前に、血清サンプルを回収した。（Ａ）Evn特異的IgGの力価は、マッチングしたConSOSL.UFO.664 gp140 Envタンパク質を使用したELISAによって決定した。（Ｂ）Env特異的IgG1及びIgG2a応答は、ELISAによって評価し、Tヘルパー応答を決定する代わりとして、IgG2a:IgG1として本明細書に記載した。（Ｃ）マトリックスPIV5及びマトリックスMuVに対する、血清特異的IgG応答を、VLP2、VLP3、及びVLP4で免疫付与した動物に対するELISAによって、決定した。（Ｄ）n=5のマウスの群を、VLP1（10E8、10E9、及び10E10粒子）とAddaVaxアジュバント（1:1、v:v比）を用いて、3週間間隔で3回、筋肉注射で免疫付与した。破線：VLP1+AddaVax；実線：VLP1、アジュバントなし。

【図7】図７は、IgGサブタイプの応答が、Env、MTS-Matrix、又はEnv-T2A-MTS-Matrix DNAプライム‐VLPブーストレジメン(DNA prime-VLP boost regimen)によって様々であることを示し、MTS-Matrix DNAのプライムを受けた群からの構造内支援のエビデンスを示す。n=5のマウスの9つの群を、Env（溶解性：Env 664；膜結合：Env 750）、MTS-M MuV、MTS-M PIV5、又はEnv-F-T2A-MTS-M（PIV5若しくはMuVでシュードタイピングされた）を発現する異なるDNAプラスミドを用いて、2回、0週目及び3週目にプライムし、次いで、合計で3回のConS.MuV-T2A-MTS-M MuV による注射をした一群を除いて、6週目及び9週目にVLPブースト（10E10粒子+AddaVaxアジュバント）を受けさせた（（Ｂ）の免疫付与スケジュールを参照）。（Ａ）図６Ａのように、カラーコードによる異なるVLPの略図。（Ｂ）Env特異的応答に関するIgG2a:IgG1の割合を示す。IgG2a:IgG1の割合を、免疫付与スケジュールの全体を通して、異なるレジメンによって誘導されるTヘルパー型応答の測定の代わりとして使用する。（Ｃ）ELISAによって決定した、Env特異的IgGの力価。（Ｄ）MuVに対するマトリックス特異的IgGの応答（群3、4、6、7、及び9）、及びPIV5に対するマトリックス特異的IgGの応答（群5及び6）。（Ｅ）IFNg特異的なEnv ELISpost。単離した脾細胞を、Envペプチドプールを用いて、16時間、刺激した。（Ｆ）IFNg特異的なマトリックスの応答。単離した脾細胞を、MuVマトリックスペプチドのプール又はPIV5マトリックスペプチドのプールのいずれかを用いて、16時間、刺激した。灰色の矢印：免疫付与。（Ｇ）1注射後の、100kDa MWCOカラム(VLP1 100kDa) (10E10粒子+AddaVax)で精製したVLP1と、超遠心分離法によって精製したVLP1 (VLP1 UC) (10E10粒子+AddaVax)によって誘導される、Env特異的IgGの応答の比較（左のパネル）。残りの4つパネルは、VLP1 UC、VLP2 UC、VLP4 UC、又はVLP5 UC (10E10粒子+AddaVax)の1注射によって誘導される、Env特異的IgGの力価と比較した、1回目のVLP注射後の群3 (Gp 3)、4 (Gp 4)、及び5 (Gp 5)のEnv IgGの力価を示す。同じバッチのVLP UCを、DNAプライム‐VLPブースト試験及びVLP UC + AddaVax免疫付与試験に使用した。箱ひげ、最小から最大。*p<0.05、**p<0.01、ns=有意でない(non significant)を伴う、マン・ホイットニー検定(Mann-Whitney test) 。

【図8】図８は、VLPを、Env-F及びMTS-Matrixをコードする別々の発現ベクターを混合することによって産生することができることを示し、VLPを、Env-F及びMTS-Matrixの両方を有する遺伝子をコードする単一のpDNA (pDNA Env-F-T2A-MTS-Matrix)から産生することができることも示す。pDNA Env-F-T2A-MTS-Matrixの利点は、Env-F及びMTS-Matrixの両方をコードする配列を有する1つの転写産物を産生し、翻訳されると、自己切断して、Env-FからMTS-Matrixが遊離することである。これは、核酸ワクチンとして送達されると、両方のタンパク質は、同じ細胞で発現し、別々には決して発現しないことを確かにする。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0186】

材料及び方法
プラスミドDNAベクター
HIV-1 Envコンストラクト、Env-F MuVキメラ、Env-F PIV5キメラ、MuVのマトリックス(matrix)、PIV5のマトリックス、核タンパク質(NP) MuV、NP PIV5、MTS-Matrix MuV、及びMTS-Matrix PIV5を発現する、プラスミドDNA (pDNA)を、ホモサピエンス発現に関してコドン最適化し、公開された配列を使用して作製するか又はin silicoで設計して、GeneArt遺伝子合成サービス(ThermoFisher Scientific)を使用して、pcDNA3.1(+)にクローニングした。異なるpDNAを、ケミカルコンピテントのone shot TOP10 E. coli又はDH5α細菌（Invitrogen社）に形質転換した。100mLのマキシプレップ(maxiprep)培養物を、溶原培地(lysogeny broth; LB)で、+37℃、215rpmで、一晩、増大させた。次いで、pDNAを、メーカーの説明に従って、Plasmid Plus Maxi kit（Qiagen社）を使用して、抽出した。pDNAを分子生物学グレード水HyClone（GE LifeSciences社）を使用して、キアゲンカラムから溶出した。NanoDrop機器（Thermo Fisher Scientific）で、濃度を測定し、-20℃でpDNAを保存した。

【0187】

HIV-1モノクローナル抗体(mAb)
mAbを、その生産者から入手、商用供給業者から購入、又は自作した。2G12、PG9、PG16、b12、447-52D、5F3、4E10、2F5、及びF240は、Polymun Scientific社（Austria）から入手し、17bは、James Robinson氏に提供いただき、35O22は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手し、39F, 19b, 3BC176, PGT121, PGT135, PGT145, F105、b6の発現ベクターは、IAVI Neutralizing Ab Consortiumから入手及び自作し、VRC01及びPGT151の発現ベクターは、自作した。自作のmAbは、HEK293T.17細胞(ATCC)中で産生し、メーカー説明に従って、HiTrap プロテインA HP カラム（GE LifeSciences社）で精製した。

【0188】

フローサイトメトリー
HIV-1 Envコンストラクト及びEnv-Fキメラの表面発現は、HEK293T.17細胞中で評価した。抗生物質及びウシ胎児血清を有さない、DMEM（Sigma社）＋2mMのグルタミン(GIBCO社)中で1:3 pDNA:PEI比 (w:w)のPEIを使用して、一晩のトランスフェクションする30時間前に、細胞を完全培地に蒔いた。一晩のインキュベーション後、トランスフェクション培地を除去し、293 FreeStyle培地（GIBCO社）に置き換えた。48時間後、細胞を1×PBSで洗浄し、細胞解離緩衝液(cell dissociation buffer)（GIBCO社）で解離し、次いで、FACSバッファー（1×PBS中に、2.5% FBS、1mM EDTA、25mM HEPES）で洗浄し、5分間、600×gで、沈殿させた。細胞をFACSバッファー中に再懸濁し、トリパンブルーを使用して、血球計算盤でカウントした。次に、細胞をフィルターにかけ（70umのフィルター）、暗中で、室温(RT)で、20分間、アクアバイアビリティ染料(aqua viability dye)(1:400)を用いて染色し、FACSバッファーで2回洗浄し、残りの染色工程のために、U底96ウェルプレートに移した。100mLのFACSバッファー中に10ug/mLのヒトIgGの抗Env 一次mAbを使用して、1ウェルあたり1×10⁶個の細胞を、暗中で、RTで、30分間、染色した。次いで、細胞を、125uLのFACSバッファーを用いて、2回洗浄し、10⁶個の細胞あたり0.1ugのPEをコンジュゲートした、2次F(ab’)2-ヤギの抗ヒトIgG Fc（Invitrogen社）を、100uLのFACSバッファー中の細胞に添加した。細胞を、暗中で、20分間、インキュベーションし、2回洗浄し、100uLのPBS中に再懸濁し、更に100uLの3%パラホルムアルデヒド（Polysciences社）を用いて、終濃度1.5%にして、固定した。サンプルを、FACSDiva（BD社）を使用して、LSRFortessa FC（BD社）で取得し、FlowJo v.10.1ソフトウェア（Treestar社）を使用して、データを解釈した。生細胞をゲーティングし、データをトレースとして表すか又はmAb:2G12比として報告して、生細胞の平均蛍光強度(MFI)値を使用してデータを標準化した。2G12mAbは、ConSOSL.UFO.750 HIV-Envの様式で、最も高い結合シグナルを与える。pcDNA3空ベクターをトランスフェクションしたHEK293T.17細胞コントロールを各実験に含め、各mAbのバックグラウンドの除去を可能にした（これらのmAbの大部分はバックグラウンドを有さない）。

【0189】

ウイルス様粒子(VLP)の産生
HEK293T.17細胞を、トランスフェクションの30分前に蒔き、トランスフェクション時に80～90%コンフルエンスに達成させた。細胞を、DMEM+2mMグルタミン中で、1:3 DNA:PEI比(w:w)で、PEIを使用して、MuV及びPIV5 VLPのシュードタイピングのためのHIV-1 Env-F:Matrix:NP、Env-F:MTS-Matrix比の組合せを用いて共トランスフェクションした。トランスフェクション培地を、一晩、+37℃で、細胞上に残し、16～17時間後に、FreeStyle（商標）293培地（GIBCO社）で置き換えた。VLPを含む上清を回収し、細胞残屑を、5分間、2000×gで沈殿させ、上清を0.45μmのPESメンブレンフィルター（Corning社）を使用して、フィルターにかけた。

【0190】

第一のVLPに関して、産生（図２）は、T-75フラスコのトランスフェクションに由来した。これらのVLPを、3000×gで、300kDa MWCO Vivaspin（Sartorius社）カラムを用いて濃縮した。VLPの上清の容積が1mL未満に達したら、VLPを5mLの1×PBSで洗浄し、さらに100μLに至るまで濃縮した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを、回収した分画に添加し、VLPを-80℃で保存した。その後、100kDa MWCO Vivaspin（Sartorius社）カラムを使用して、VLPを濃縮し、T-75フラスコ（図３）及び第一の動物実験で使用した三層のT-175フラスコ（図６）から、VLPを産生した。最終的に、高純度に達するために、さらに、100kDa MWCO Vivaspinで濃縮したVLPを、20%のスクロースクッション超遠心分離を使用して、精製した。+4℃で、4時間、90000×gで、ベックマン・コールター社のtype 70 Tiローターを使用して、ポリカーボネート厚肉管（Beckman Coulter社）で、VLPを超遠心分離した。上清及びスクロースクッションを、次いで、慎重に除去し、沈殿物を、5mLの1×PBSを用いて洗浄し、その後、200～500uLの1×PBS中に再懸濁した。VLPを再懸濁した直後に、5uLのVLPを使用して、Nanosightで粒子を解析及びカウントした。次いで、VLPを分注し、-80℃で保存した。これらのVLPを、DNAプライム‐VLPブースト実験に使用した（図７）。

【0191】

HIV-1 Envの溶解性三量体及びMTS-Matrix HIS標識されたタンパク質
ConSOSL.UFO.664 HIV-1 Envの溶解性三量体を、1:3 DNA:PEI (w:w)比で、トランスフェクションのためのポリエチレンイミン(PEI)（Polysciences社）を使用して、HEK293T.17細胞で産生した。トランスフェクションした細胞の上清を、トランスフェクションの48時間後に回収し、回転して細胞残屑を沈殿させ、その後、フィルターにかけた（0.22um）。溶解性HIV-1 Env三量体を、100kDaの分画分子量(MWCO)のアミコン(Amicon)限外濾過カラム（Merck Millipore社）を使用して、濃縮し、1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に移した。更なる精製工程は、Enrich SEC 650カラム（BioRad社）を使用して、NGC中圧液体クロマトグラフィー(MPLC)システム（BioRad社）で、2回のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を含み、三量体ピークからタンパク質を単離した。三量体を、次いで、分注して-80℃で保存した。

【0192】

MTS-Matrix MuV HIS標識されたタンパク質、及びMTS-Matrix PIV5 HIS標識されたタンパク質を、ConSOSL.UFO.664についてと同じDNA:PEI比及びトランスフェクション条件を用いて産生した。細胞残屑を沈殿させ、次に、上清をフィルターにかけた(0.45um)。上清を10kDa MWCO Vivaspinカラム（Sartorius社）で濃縮して、アフィニティーカラムへの流入容積を減少させた。0.02%のTween20 (v:v)を、濃縮した上清に添加し、メーカーの説明に従って、HisTrap HP 1 mLカラムで、タンパク質を精製し、0.02%のTween20 (v:v)をバッファーに添加して、カラムを平衡化した。4000×gで、10kDa MWCO Vivaspinを使用して、溶出した分画を濃縮し、タンパク質を1×PBSに移した。濃度は、NanoDrop機器を使用して決定し、タンパク質を-20℃で保存した。

【0193】

VLPの特性評価
1.ナノ粒子トラッキング解析
SCMOSカメラを備えるNanoSight LM10機器（Malvern Instruments社、UK）を用いて、VLPのサイズを明らかにした。VLPサンプルを1×PBS中に希釈して、正確な測定のための推奨濃度範囲の10⁸から10⁹粒子/mLにした。NanoSight NTA 3.0ソフトウェア（Malvern Instruments社、UK）を使用して、速度10の自動シリンジポンプを用いて、データを取得した。スライダーシャッター(slider shutter)を470、スライダーゲイン(slider gain)を350に設定した。60秒の動画を各サンプルについて3回録画し、温度も記録した。次いで、画像を、スクリーンゲイン(screen gain) 10、「ブラー」(blur)機能をオフにした検出閾値5を用いて解析した。

【0194】

2.キャプチャーELISAによるエンベロープの定量化
MaxiSorp高結合ELISAプレートを、1×PBS中に1ウェルあたり100uLで5ug/mLのスノードロップレクチン(Galanthus Nivalis Lectin; GNL)（Sigma社）を用いて、+4℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを空にして、分取して乾燥させ(tap dry)、200uLの1×PBSで3回洗浄した。VLPを、50uL/ウェルの0.5×カゼインバッファー(1/2CB)（Thermo Scientific社）で、10⁷、10⁸、10⁹、及び10¹⁰に希釈した。VLPをGNLコーティングプレートにロードし、並びに50uL/ウェルの1/2CB中の10ug/mLから始まるConSOSL.UFO.664 gp140標準（1/5希釈系列）もロードした。プレートを+37℃で、1時間、インキュベーションし、200uL/ウェルの1×PBSで2回洗浄し、次にmAb 2G12を100uL/ウェルの1/2CB中に2.5ug/mLで添加した。+37℃での1時間のインキュベーション後、プレートを200uL/ウェルの1×PBSで2回洗浄し、ヤギの抗ヒトIgG Fcビオチン化二次抗体（Southern Biotech社）を100uL/ウェルの1/2CB中に1:10000で、+37℃で、30分、プレートに添加した。次に、プレートを以前の洗浄のように2回洗浄し、100uL/ウェルの1/2CB中に1:10000で希釈したポリ‐HRP40（Fitzgerald）を+37℃で、20分間、添加した。次いで、プレートを200uL/ウェルの1×PBSで3回洗浄し、分取して乾燥し、50uL/ウェルのTNB（KPL社）を使用して発色させ、50uL/wellのStop solution（Insight Biotechnologies社、UK）を用いて反応を停止した。吸光度を、KC4分光光度計を用いて450nmで（BioTek社）読み取った。

【0195】

3.VLP Envの抗原性
10ug/mLのGNLを、MaxiSorp高結合ELISAプレートにコーティングした。「キャプチャーELISAによるエンベロープの定量化」と同じプロトコルに従って、50uL/wellの1/2CBあたり10⁹個の粒子を、コーティングしたプレートにロードした。次いで、Envの細胞外ドメインに対して特異的な異なるmAbを、100uL/ウェルの1/2CB中に10ug/mLで添加し、その後、二次Ab、ポリ‐HRP40を添加し、発色を行った。

【0196】

ウェスタンブロッティング
SDSサンプルバッファー（Invitrogen社）+ DTTを使用して、還元条件で、サンプルを調製し、+95℃で、5分間、ボイルし、+4℃で手短に冷却し、その後、ポリアクリルアミド Novexトリス‐グリシンゲル（Invitrogen社）にロードした。ゲルを、SDSランニングバッファー（Invitrogen社）において、225Vで、40分間、泳動した。次いで、その後タンパク質を、10%メタノールを含むトランスファーバッファーにおいて、10Vで、80分間、ニトロセルロースメンブレン（Invitrogen社）に移した。メンブレンを、チューブローラー上で、ブロッキングバッファー（1×PBS中に、2% (w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)（Sigma社）、0.05%のTween20 (v/v)）で、室温で、1時間、ブロッキングした。次いで、メンブレンを、15mLの1×PBS + 0.05%のTween20 (v/v)を用いて、10分、3回洗浄した。次いで、一次抗体：1:2000のHIV-1 Envに特異的なマウスの抗体 b13 (0.5 μg/mL)、マウスの抗PIV5 NP (Ab 214)及び／若しくは抗マトリックス(Matrix) (Ab 198)（セント・アンドリューズ大学(St Adrews University)、UKのRichard Randall氏によって提供された)、又はマウスの抗マトリックス(Matrix) MuV (1:3000)を、ブロッキングバッファーに添加した。メンブレンを、チューブローラー上で、+4℃で、一晩、一次抗体とインキュベーションした。次いで、メンブレンを、3回洗浄し、ブロッキングバッファーに、1:15000でヤギの抗マウスIgG Fcビオチン化二次Ab（Southern Biotech社）を添加した。もう一度の洗浄工程の後、メンブレンを、ストレプトアビジン-HRP 1:500（R&D Systems社）とインキュベーションし、その後、3回洗浄し、乾燥させ、WB Luminata（登録商標）Classico（Merck Millipore社）を適用して、最終的にAmersham Hyperfilm ECL（GE LifeSciences社）で発色させた。Image Studio Liteソフトウェアv5.2.5を使用して、濃度測定解析を実施し、GraphPad Prism v7.0を使用して、プロットした。

【0197】

動物及び免疫付与
動物を扱い、方法は、英国内務省のOffice Animals (Scientific Procedures) Act 1986の下で与えられるプロジェクトライセンスの条項に従って実施した。

【0198】

100kDa MWCOで濃縮したVLPを使用した第一の免疫原性試験において、n=5の雌のBALB/cマウスの4つの群に、50uLの1×PBS中のアジュバントを含まない、10⁸、10⁹、10¹⁰、又は2×10¹⁰個の粒子用量のVLP1、VLP2、VLP3、又はVLP4を、3週間間隔で3回、大腿四頭筋に筋肉注射した。第二の試験において、n=5の雌のBALB/cマウスの群に、50uL中のAddaVaxアジュバントを含む、10⁸、10⁹、及び10¹⁰個の粒子用量のVLP1（1:1の比率、v:v）を、筋肉注射した。DNAプライム‐VLPブースト試験において、一群あたりn=5のマウスの9つの群を、50uLの1×PBS中の20ugのpDNA（図７を参照）で、3週間間隔で2回免疫付与し、その後、ECM 830方形波エレクトロポレーションシステム(BTX)を用いて、5mmの電極を使用して、エレクトロポレーション(EP)した（それぞれ100Vの3パルスの後に、異極性(opposite polarity)の3パルスが続き、各パルス(P_ON)は50ms持続し、パルス間(P_OFF)間隔は50ms）。3週後、第3のDNA注射を受ける群9を除いて、マウスに、図７の異なる群に従って、50uLの10¹⁰個の粒子用量の超遠心分離で精製した異なるVLP及びAddaVaxアジュバント（1:1の比、v:v）を用いて、ブーストした。VLPブーストを3週間後に繰り返し、マウスを12週目に殺した。全ての動物に関して、各免疫付与時に、血清サンプルを回収し、脾臓を第3の免疫付与試験から回収及び処理した。

【0199】

IFN-γ ELISpot
IFN-γ T細胞応答を、メーカーの説明に従って、マウスIFN-γ ELISpotPLUSキット（Mabtech社）を用いて評価した。簡潔には、抗IFN-γでプレコーティングしたプレートを、2時間、DMEM + 10%のFBSでブロッキングし、その後、細胞を、2.5×10⁶細胞／ウェルで加えた。ネガティブコントロールのウェルは、培地のみを有し、Envに特異的なウェルは、HIV-1 Env ConSOSL.UFO.750ペプチドプール(2.5μg/mL)、マトリックス(Matrix)に特異的なウェルは、1ウェルあたり200μLの終容積中にMTS-Matrix MuV又はMTS-Matrix PIV5ペプチドプールのいずれかを有した。ポジティブコントロールのウェルは、5μg/mLのConAを有する、1ウェルあたり200μLの終容積中に5×10⁵細胞／ウェルを含んだ。プレートを5% CO₂、+37℃のインキュベーターで、一晩、インキュベーションし、メーカーの説明の通りに発色させた。乾燥させ、プレートを、AID ELISpot reader ELR03及びAID ELISpot READERソフトウェア（Autoimmun Diagnostika GmbH社、Ger）を使用して、読み取った。

【0200】

抗原に特異的なELISA
HIV-1 Envに特異的なELISA
MaxiSorp高結合プレートを、1×PBSで、100uL/ウェル、1ug/mLのConSOSL.UFO.664タンパク質でコーティングし、ヤギのキャプチャー抗カッパ及び抗ラムダをそれぞれ1:1000希釈で使用して、標準のウェルをコーティングした（Southern Biotech社）。+4℃で、一晩のインキュベーション後、プレートを、1×PBS - 0.05%のTween20を用いて、4回洗浄し、その後、200uL/ウェルのELISAバッファー（1×PBS中に、1%のBSA + 0.05%のTween20）でブロッキングし、37℃で1時間、インキュベーションした。次いで、プレートを、上述のように洗浄し、ELISAバッファーで1:100、1:1000、及び1:10000で希釈したサンプルとインキュベーションし、標準IgG、IgG1、及びIgG2aを標準のウェルに添加した（1ug/mLから始まり、その後は1:5希釈系列）。+37℃で1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、1:2000のヤギの二次抗IgG-HRP、IgG1-HRP、又はIgG2a-HRP（Southern Biotech社）と、+37℃で、1時間、インキュベーションした。最後に、プレートを洗浄し、50uL/ウェルのTMB基質を用いて発色し、その後50uLのStop solutionで停止し、分光光度計で読み取った。

【0201】

マトリックス(Matrix)に特異的なELISA
プレートを調製し、プレートをコーティングする抗原がMTS-Matrix MuV HIS標識タンパク質(1ug/mL)又はMTS-Matrix PIV5 HIS標識タンパク質(1ug/mL)であることを除いて、上記のように処理した。

【0202】

実施例1
ウイルス糖タンパク質でシュードタイピングしたVLPの製造の可能性を実証するために、本発明者らは、HIV Env GPの外側のドメイン（ウイルスの膜の外側にあり、抗体応答の重要な標的である部分）を使用した。本発明者らは、MuV及びPIV5 TMD+CT融合キメラ(Env-F)の可能性を、HIV Env細胞外ドメインエピトープの特性を保持すると評価した（図１Ａ）。VLPをHEK293T.17細胞で産生し、ウェスタンブロット、ELISA、及びナノ粒子トラッキング解析によって特性を明らかにした（図１Ｂ）。さらに、別々のプラスミドに送達したマトリックス及び糖タンパク質成分を有するDNAベクター、又はマトリックス及び糖タンパク質成分をT2A切断配列（RRRRRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP 配列番号19）によって分けた、同じ配列上にコードしたDNAベクターのいずれかにコードした場合に、VLPを産生することができる。

【0203】

MuV TMDは、

【0204】

【化23】

【0205】

を含むヌクレオチド配列を有する核酸によってコードすることができる。

【0206】

MuV CTは、

【0207】

【化24】

【0208】

を含むヌクレオチド配列を有する核酸によってコードすることができる。

【0209】

PIV5 TMDは、

【0210】

【化25】

【0211】

を含むヌクレオチド配列を有する核酸によってコードすることができる。

【0212】

PIV5 CTは、

【0213】

【化26】

【0214】

を含むヌクレオチド配列を有する核酸によってコードすることができる。

【0215】

本発明者らは、MuV/PIV5 MTS-M + Env-Fが、VLPを産生するのに十分であることを示した（図２）。さらに、本発明者らは、MuV MTS-Mが、PIV5 Env-Fキメラと共発現、並びにアミノ酸750でトランケートされたHIV Env GPと共発現した場合に、VLPを産生することができると示した（図３）。さらに、高度に特性が明らかにされた抗HIV Env抗体のパネルを使用して、本発明者らは、野生型のEnv配列を使用して設計したキメラHIV Env（図４Ａ）、並びに発明者らが開発した安定化Env配列（図４Ｂ）が、マッチングするHIV Envの四次構造及び広域中和抗体(bNAb)結合プロファイルを保持することを見出した。

【0216】

実施例2
次いで、本発明者らは、各VLP様式上に発現するEnvの量を定量化し、よく特性を明らかにした抗HIV Env抗体のパネルを用いて抗原プロファイルを解析した（図５Ｂ及びＣ）。全てのVLP様式が、HIVビリオン上で見られるレベルよりも非常に高い、組換えHIV Envタンパク質の高いレベルを発現し、天然のウイルスを超える明確な利点を実証した。本発明者らはまた、Nanosight機器を用いて実施されるナノ粒子トラッキング解析を利用して、VLPのサイズ分布を明らかにした（図５Ｄ）。5種類のVLPに関して、測定した粒子の90%超(>90%)が、90～250nmの間の直径を有し、平均直径は120～150nmであった。これらのデータは、粒子が形成されて、HIVのビリオンと同様のサイズを有することを実証する。

【0217】

実施例3
本発明者らは、次に、マウスモデルにおける、VLP1から4の免疫原性を評価し、VLPが、10E9個の粒子の用量から、別個のアジュバントの追加なしに、免疫原性であることを示した（図６Ａ、Ｃ）。MTS-M成分を含むVLPは、Envに関するよりも1log低いように見える応答である、マトリックスに対する増加した抗体応答を示した。これらのVLPは、非常に低いIgG2a:IgG1の比が見られたのとともに、優勢なTh2応答を誘導した（図６Ｂ）。加えて、本発明者らは、従来のアジュバントと組合せて、マトリックスを含まないVLP1の可能性を評価した。血清IgG応答は、予想通りに、効率よくブーストされた（図６Ｄ）。これらのデータは、本発明者らの製造方法を使用して作製したVLPの高い免疫原性の可能性を実証する。

【0218】

本発明者らは、さらに、DNAプライム‐VLPブーストレジメンにおける、VLP免疫原性を試験した（図７）。本発明者らは、膜結合Envを発現するDNAを用いたプライムは、VLP1ブースト後に維持されるTh1応答を誘導することを見出した。興味深いことに、溶解性Envを発現するDNAを用いたプライムは、IgG2a:IgG1が、VLP1ブースト後に若干増加するが、元に戻らず、Th1応答とバランスをとらない、強力なTh2偏向(skew)を誘導した。DNA MTS-Mでプライムした群は、バランスのとれたTh1/Th2応答、又はVLP2、3、及び4ブーストによるTh2偏向応答のいずれかを示した。さらに、共発現ベクターのConSOSL.UFO.MuV-T2A-MTS-M MuVを用いたDNAプライムは、VLP2及びVLP5の免疫付与後に維持される、Th1偏向応答又はTh1/Th2のバランスのとれた応答を誘導した。反対に、PIV5型のこのDNAベクターは、Th2偏向応答を誘導した。際立って、DNAプライムにEnvを使用しない場合、Env IFN-γ応答は見られず（群3、4、及び5‐図７Ｆ）、一方で、DNA 溶解性Envを用いたプライム（群2）と大いに対照的に、DNA 膜結合Envを用いたプライム（群1）は、強力な応答を与えた。興味深いことに、本発明者らは、第一のブースト後に、VLP1+AddaVaxと比較して、群3において、Env血清IgGの力価の増加を観察し、特定の理論に縛られることなく、VLP2ブーストを用いて呼び戻すことができる可能性がある、DNAプライムによって誘導されるMTS-M特異的Tヘルパー細胞からの構造内支援を示唆する（図７Ｅ）。さらに、VLP2は、表面にVLP1よりも少ないEnvを提示し、動物に、EnvではなくVLPの数に標準化したVLPを注射した。

【0219】

考察
市販のワクチンの大部分は、保護性の抗体の誘導を通して、感染性ウイルスに対する保護を作り出す。これらの保護性抗体は、典型的には、ウイルス粒子の表面に配列されるウイルス糖タンパク質（ウイルススパイク）を標的とする。これらの表面糖タンパク質の正しい提示は、正しい種類の保護性の抗体を引き起こすのに有利であると考えられる。潜在的なワクチン内におけるウイルス全体（感染性及び不活性）の包含を避けるために、研究者らは、ウイルスと同じ微粒子の構造を提供するが、非感染性である、操作した「ウイルス様粒子」すなわちVLPを、益々使用しようとしている。しかしながら、これは通常、各ワクチンに関して、個々のウイルスを改変することによって実施される（すなわち、HIV用のVLP、エボラ用の異なるVLPなど）。従って、本発明者らは、広範囲の異なるウイルス由来のウイルス糖タンパク質を含むことができるVLPを産生するための、包括的なプラットフォームを作製した。この多用途性は、現在のウイルス特異的な手法を超える、確かな利点を提供する。本発明は、2つの技術的イノベーション、すなわち(i)VLPを作製するコア技術、及び(ii)本発明者が選択したウイルス糖タンパク質を、操作したVLPの膜表面に組込む技術、の組合せによる。

【0220】

VLPを作製するコア技術は、ムンプスウイルスのマトリックスタンパク質を改変して、非感染性VLPを作製することに基づく。ムンプスウイルスのマトリックスタンパク質自体は、VLPを形成することができない。しかしながら、膜標的配列(membrane targeting sequence; MTS)の組込みは、非常に効率的なウイルス粒子の放出をもたらす。MTSは、Fyn様タンパク質キナーゼ(Fyn-like protein kinase)として知られる別のタンパク質に由来する(19)。特定の理論に縛られることなく、本発明者らは、VLPを作製する明確な意向を持って、ムンプスのマトリックスタンパク質と併用する、この配列の使用が、進歩性があると思っています。本発明者らは、2番目に密接に関連したウイルスである、パラインフルエンザウイルス5型(PIV5)のマトリックスタンパク質を、同じ膜標的配列によって同様に修飾して、効率的にVLPを作製することができると示した。

【0221】

選択したウイルス糖タンパク質を、作製したVLPに組込むための技術（「シュードタイピング」として知られている）は、選択した標的糖タンパク質の外側のウイルス糖タンパク質配列（例えば、HIV、エボラ、狂犬病など）を、ウイルス粒子内に自分自身を組込む（又は挿入する）ムンプスウイルスの糖タンパク質のタンパク質の配列（「膜貫通ドメイン」として知られている）に融合することによって、媒介される。これは、VLPの外表面が、選択した糖タンパク質の外側のドメインを曝すが、一般的なムンプス膜貫通ドメイン及び細胞質尾部の包含によってVLPにつながれることを意味する。本発明者らは、ムンプス及びPIV5の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部が、この目的において、互換可能であることを示した。

【0222】

本発明の融合タンパク質はTMDを含むことができるが、これは、出芽VLPへの受動的な組込みを経て、細胞膜でマトリックスタンパク質の会合と共局在する、任意の膜タンパク質の共発現によって達成することができる。これは、典型的にはウイルス性だが、一般に、細胞質尾部を有する又は有さない、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質に適用することができる。この例は、HIVエンベロープタンパク質（ConSOSL.UFO.750）の、ムンプスマトリックスタンパク質への組込みである（図５Ａ(VLP2)及び図５Ｂ）。この手法の変形は、WTのエンベロープタンパク質の膜貫通ドメインを、パラミクソウイルスの膜貫通ドメインに交換することである。これの例は、図式的に図１Ａに示されている。この手法をサポートする実験データは、図５に示されている。元々のタンパク質が、マトリックス由来のVLPと自然に会合しない場合、WTの膜貫通ドメインをマトリックスタンパク質にマッチするパラミクソウイルスの膜貫通ドメインに交換することは、VLPの組込みを最大化するのに有利であり得る。この手法は、広範囲のウイルス糖タンパク質、例えば、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、SARSコロナウイルス、ラッサ熱ウイルス、及びエボラウイルスなどに容易に適用することが可能である。

【0223】

それにもかかわらず、及び特定の理論に縛られないことには、本手法は、膜貫通ドメインをコードするタンパク質に限定せず、任意のタンパク質のパラミクソウイルスの糖タンパク質膜貫通ドメインへの結合は、マトリックス由来VLPへの組込みという結果をもたらす。

【0224】

これらの2つの工程の組合せは、選択したウイルス糖タンパク質の多数のコピーを提示するVLPの製造を可能にする。これらは、後に注射用のワクチンを形成するVLPを、製造するための哺乳類細胞培養プラットフォームを使用して製造することができる。従って、本発明者らは、ムンプス又はPIV5のマトリックスタンパク質のいずれかを含むが、選択した、例えば、HIV又はその他のウイルスのウイルス糖タンパク質を提示するVLPを、産生することができる。ワクチンとして使用する場合、これは、ウイルス糖タンパク質を標的とする抗体の誘導を容易にする。本発明者らはまた、その後に注射した組織（典型的には皮膚又は筋）内において、別々のコンストラクトで送達されたマトリックス若しくは糖タンパク質成分、又はT2A切断配列によって分けられる一続きの1つの配列として送達されるマトリックス及び糖タンパク質成分のいずれかによって、VLPを作製するワクチンとして注射することができる、必要な配列を、DNA又はRNAワクチンとして、コードすることも可能である。これは、ワクチンの送達に関する、代替的なメカニズムを提供する。

【0225】

参照：
(1) Plotkin SA. Correlates of protection induced by vaccination. Clin Vaccine Immunol. 2010;17:1055-1065.
(2) Lauring AS, Jones JO, Andino R. Rationalizing the development of live attenuated virus vaccines. Nat Biotechnol. 2010;28:573-9.
(3) Berkhout B, Verhoef K, van Wamel JL, Back NK. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 1999;73:1138-45.
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】