▶ ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】自殺スイッチを有するＴ細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220131BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220131BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220131BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20220131BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220131BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61K35/17 Z
A61P37/06
A61P35/02
A61P7/06
C12N5/0783
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021522055
(86)(22)【出願日】2019-10-29
(85)【翻訳文提出日】2021-06-21
(86)【国際出願番号】 US2019058664
(87)【国際公開番号】W WO2020092440
(87)【国際公開日】2020-05-07
(31)【優先権主張番号】62/753,688
(32)【優先日】2018-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510274452
【氏名又は名称】ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ， シャオオウ リネット
(72)【発明者】
【氏名】ショー， ジョアン ルイーズ
(72)【発明者】
【氏名】フォスター， アーロン エドワード
(72)【発明者】
【氏名】アヌムラ， マダビ
(72)【発明者】
【氏名】コリンソン－パウツ， マシュー アール．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZA55
4C087ZB08
4C087ZB27
(57)【要約】
本発明者らは、自殺スイッチを含む遺伝子改変Ｔ細胞の組成物の様々な改善を開示する。例えば、この組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比は２未満である。本発明者らは、２つの有利な特性を有する遺伝子改変Ｔ細胞を提供する。第１に、それらはこれまでに使用されているＴ細胞（遺伝子改変Ｔ細胞を含む）よりＧＶＨＤを発生させる頻度がより低いことが示されている。第２に、それらは自殺スイッチのトリガーを投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで容易にかつ急速に除去される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞および遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む遺伝子改変Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）前記遺伝子改変Ｔ細胞が自殺スイッチを発現し；
（ｉｉ）前記遺伝子改変Ｔ細胞の約２５％～６０％がナイーブＴ細胞である、組成物。
【請求項2】
前記遺伝子改変Ｔ細胞の約３０～６０％がナイーブＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記遺伝子改変Ｔ細胞の約４２～４９％がナイーブＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比が２未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％が最終分化エフェクターメモリーＴ細胞であり、および／または前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の５８％以下がナイーブＴ細胞である、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも３０％が最終分化エフェクターメモリーＴ細胞であり、前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の５０％以下がナイーブＴ細胞である、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞表面トランスジーンマーカーの所定範囲の発現レベルを示し、前記範囲が少なくとも１０倍であり、前記発現レベルがフローサイトメトリーによって測定され、および前記発現レベルが平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として測定される、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
前記範囲が少なくとも１００倍である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、トリガー分子に対して所定範囲の感受性を示し、特定の濃度の前記トリガー分子に対する細胞の曝露が、前記細胞の少なくとも１０％の死に至るが前記細胞の少なくとも１０％の生存を可能にする、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比が０．５未満である、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
前記自殺スイッチがカスパーゼ－９を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項12】
前記自殺スイッチが、ＦＫＢＰ１２領域、ＦＫＢＰ１２バリアント領域、ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）またはＦＲＢバリアント領域を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項13】
前記トリガー分子が、ラパマイシン、ラパログ、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、またはＡＰ１５１０である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域が、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンからなる群から選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域が、２コピーのＦＫＢＰ１２ｖ３６を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項16】
前記遺伝子改変Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項17】
（ｉ）前記遺伝子改変Ｔ細胞が、ΔＣＤ１９マーカーに連結され、レトロウイルス形質導入によってＴ細胞のゲノムに挿入されたｉＣａｓｐ９自殺スイッチを発現し；（ｉｉ）前記遺伝子改変Ｔ細胞が、フローサイトメトリーによって測定したΔＣＤ１９細胞表面マーカーの発現レベルの少なくとも１０倍の範囲を有し；（ｉｉｉ）前記組成物が、前記ＣＤ４＋遺伝子改変Ｔ細胞より多い数の前記ＣＤ８＋遺伝子改変Ｔ細胞を含み；（ｉｖ）前記組成物が、遺伝子改変最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、遺伝子改変エフェクターメモリーＴ細胞、および遺伝子改変セントラルメモリーＴ細胞を含み；（ｖ）前記遺伝子改変Ｔ細胞の５０％未満がナイーブＴ細胞であり；（ｖｉ）前記Ｔ細胞が、ヒトドナーから得られ、同種細胞枯渇ステップに供されなかった、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項18】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項19】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～７の平均ＶＣＮを有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約２～６の平均ＶＣＮを有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項21】
遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、前記遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞が約２０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞および約６０％～約８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、（ｉ）前記改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、
（ａ）約２５％～約４５％のナイーブ細胞、
（ｂ）約１５％～約３０％のセントラルメモリーＴ（ＣＭ）細胞、
（ｃ）約１５％～約３０％のエフェクターメモリーＴ（ＥＭ）細胞、
（ｄ）約２％～約１５％の最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）細胞を含み；
（ｉｉ）改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が、
（ａ）約２０％～約６０％のナイーブ細胞、
（ｂ）約１％～約１０％のＣＭ細胞、
（ｃ）約１％～約１５％のＥＭ細胞、および
（ｄ）約１０％～約１５％のＴＥＭＲＡ細胞を含む、組成物。
【請求項22】
遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約２０％～４０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞であり；
（ｉｉ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞であり；
（ｉｉｉ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞であり；
（ｉｖ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約５％～４０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物。
【請求項23】
前記組成物中の前記Ｔ細胞の約２０％～３０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞である、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞である、請求項２２～２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項26】
前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１０％～３０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、請求項２２～２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項27】
遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約５％～２０％がＣＤ４＋ナイーブ細胞であり；
（ｉｉ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＣＭ細胞であり；
（ｉｉｉ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞であり；
（ｉｖ）前記組成物中の前記Ｔ細胞の約１％～５％がＣＤ４＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物。
【請求項28】
前記Ｔ細胞の５％～１５％がＣＤ４＋ナイーブ細胞である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項29】
前記Ｔ細胞の１％～７％がＣＤ４＋ＣＭ細胞である、請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項30】
前記Ｔ細胞の１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞である、請求項２７～２９のいずれかに記載の組成物。
【請求項31】
対象を処置する方法であって、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子改変Ｔ細胞の組成物を前記対象に導入するステップを含む、方法。
【請求項32】
対象に薬物を投与するステップを含む、前記対象を処置する方法であって、（ｉ）前記対象が、先行請求項のいずれかに記載の遺伝子改変Ｔ細胞の注入を以前に受けたことがあり；
（ｉｉ）前記薬物が自殺スイッチを誘発し；
（ｉｉｉ）前記薬物が、前記対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％を殺滅するために十分に高いが前記対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％が生存するために十分に低い用量で送達される、方法。
【請求項33】
遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死に至ることができる自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ナイーブＴ細胞と比較して、最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／またはエフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利な条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセス。
【請求項34】
ナイーブＴ細胞と比較して最終分化エフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死に至ることができる自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の富化に有利な条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセス。
【請求項36】
遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）活性化濃度のＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体の存在下でドナーＴ細胞を培養するステップ；（ｉｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｉｉｉ）一定期間培養後、自殺スイッチおよび選択可能マーカーの両方をコードするＤＮＡをＴ細胞に導入するステップ；（ｉｖ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖ）前記選択可能マーカーを発現する細胞を選択するステップ；（ｖｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖｉｉ）前記遺伝子改変Ｔ細胞を採取するステップを含み；但し、ステップ（ｉｖ）および（ｖｉ）が必要に応じたステップである、プロセス。
【請求項37】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～１０の平均ＶＣＮを有する、請求項３３～３６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項38】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～７の平均ＶＣＮを有する、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項39】
ステップ（ｉ）がプロセスの開始時（１日目）に起こる、請求項３６に記載のプロセス。
【請求項40】
ステップ（ｉｖ）がプロセスの３日目に起こる、請求項３６に記載のプロセス。
【請求項41】
ステップ（ｖｉ）がプロセスの６日目に起こる、請求項３６に記載のプロセス。
【請求項42】
前記プロセスの終了時、前記細胞の少なくとも５０％が形質導入されて生存している、請求項３６～４１のいずれかに記載のプロセス。
【請求項43】
前記プロセスの終了時、前記細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存している、請求項３６～４１のいずれかに記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、その内容の全体が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１０月３１日に提出された米国仮出願第６２／７５３，６８８号の出願日の利益を主張する。
本出願は、その内容の全体が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１０月３１日に提出された米国仮出願第６２／７５３，６８８号の出願日の利益を主張する。
【0002】
技術分野
本発明は、細胞移植、および例えば移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発症した場合にレシピエントにおいて移植したＴ細胞を除去するために有用な技術の分野にある。
本発明は、細胞移植、および例えば移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発症した場合にレシピエントにおいて移植したＴ細胞を除去するために有用な技術の分野にある。
【背景技術】
【0003】
背景
ＨＳＣＴの際に、同種造血幹細胞（ＨＳＣ）は、健康なドナーに由来し、患者に移植される。この処置は、悪性および非悪性の状態の場合では潜在的に治癒的であり得る。しかし、残念なことに、ＨＳＣＴは、特に基礎となる悪性疾患の長期間の処置後およびＴ細胞枯渇移植片の使用後では、持続的な移植後免疫不全に関連し得る。特に加齢または以前の治療により胸腺がその機能のほとんどを失っている場合、Ｔ細胞およびＢ細胞区画が完全に再生するにはかなりの時間（約１～２年）が必要である。ＧＶＨＤおよびその防止のために使用される免疫抑制薬もまた、免疫再構築をかなり遅らせ得る。加えて、再発は、一致した血縁者間または非血縁者間の同種ＨＣＴが失敗する最も一般的な原因である。
ＨＳＣＴの際に、同種造血幹細胞（ＨＳＣ）は、健康なドナーに由来し、患者に移植される。この処置は、悪性および非悪性の状態の場合では潜在的に治癒的であり得る。しかし、残念なことに、ＨＳＣＴは、特に基礎となる悪性疾患の長期間の処置後およびＴ細胞枯渇移植片の使用後では、持続的な移植後免疫不全に関連し得る。特に加齢または以前の治療により胸腺がその機能のほとんどを失っている場合、Ｔ細胞およびＢ細胞区画が完全に再生するにはかなりの時間（約１～２年）が必要である。ＧＶＨＤおよびその防止のために使用される免疫抑制薬もまた、免疫再構築をかなり遅らせ得る。加えて、再発は、一致した血縁者間または非血縁者間の同種ＨＣＴが失敗する最も一般的な原因である。
【0004】
再発を処置および防止するために、ＨＳＣＴまたはＨＣＴ後にドナーリンパ球の投与または注入がしばしば使用される。しかし、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を例外として、特に移植後最初の１２カ月以内に再発が起こる場合、ドナーリンパ球注入の有効性は血液腫瘍では不良である。患者に免疫再構築および保護を提供することに加えて、アロ反応性Ｔ細胞は強力な抗がん処置の効果を提供することができるが、これらのＴ細胞はレシピエントにおいてＧＶＨＤの重篤なリスクを呈する。
【0005】
ＧＶＨＤが発生すると、注入回数および注入される細胞数を制限し得るか、または当然の結果として免疫抑制治療が行われ得る。これは、高率の移植後感染症合併症および高頻度の疾患再発をもたらし得る。さらに、これはがんの再発を処置するための治療的細胞の有効性を低減させる。したがって、付随するＧＶＨＤおよび他の合併症を生じることなく治療的細胞の免疫および抗腫瘍潜在性を利用するためのよりよい戦略が必要である。
【0006】
そのような１つの戦略は、ＧＶＨＤなどの合併症が生じた場合に細胞を除去するために使用することができる自殺遺伝子スイッチを含有する遺伝子改変ドナーＴ細胞の使用である。そのような１つの治療は、「ＢＰＸ－５０１」または「リボジェンレクルーセル（ｒｉｖｏｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）」として公知である。ＢＰＸ－５０１は、リミドゥシド（以前は、ＡＰ１９０３として公知）に曝露された場合にｉｎ ｖｉｖｏでアロ反応性Ｔ細胞のアポトーシスを誘発する誘導型カスパーゼ９（「ＣａｓｐａＣＩＤｅ（登録商標）」安全スイッチ）を含有するように改変されたドナーＴ細胞に基づく。
【0007】
しかし、自殺スイッチを使用する必要性が低減されるように、ＧＶＨＤ発生率が低い治療細胞を提供することが必要である。加えて、反応性のＧＶＨＤを引き起こす細胞を除去するが非反応性の細胞を除去しない機構を有することも有益である。そのような改善は、細胞の活性および治療潜在性を増加させるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
要旨
本発明者らは、２つの有利な特性を有する遺伝子改変Ｔ細胞を提供する。第１に、それらはこれまでに使用されているＴ細胞（遺伝子改変Ｔ細胞を含む）よりＧＶＨＤを発生させる頻度がより低いことが示されている。第２に、それらは自殺スイッチのトリガーを投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで容易にかつ急速に除去される。
本発明者らは、２つの有利な特性を有する遺伝子改変Ｔ細胞を提供する。第１に、それらはこれまでに使用されているＴ細胞（遺伝子改変Ｔ細胞を含む）よりＧＶＨＤを発生させる頻度がより低いことが示されている。第２に、それらは自殺スイッチのトリガーを投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで容易にかつ急速に除去される。
【0009】
本発明者らは、遺伝子改変Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が自殺スイッチを発現し、および（ｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞の約２５％～６０％がナイーブＴ細胞である、組成物を提供する。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の約３０％～６０％がナイーブＴ細胞である。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の約３０％～６０％がナイーブＴ細胞である。理想的には、組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比は２未満、または１未満、または０．５未満である。ある特定の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％が、最終分化エフェクターメモリーＴ細胞(terminal effector memory T cells)であり、および／もしくは遺伝子改変Ｔ細胞の５８％以下がナイーブＴ細胞であるか、または遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも３０％が最終分化エフェクターメモリーＴ細胞であるか、および／もしくは遺伝子改変Ｔ細胞の５０％以下がナイーブＴ細胞である。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞表面トランスジーンマーカーの所定範囲の発現レベルを示し、その範囲は少なくとも１０倍であり、発現レベルはフローサイトメトリーによって測定され、発現レベルは平均蛍光強度（ＭＦＩ）値によって測定される。ある特定の実施形態では、範囲は少なくとも１００倍である。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞が特定の濃度のトリガー分子に曝露された場合に、細胞の少なくとも１０％の死に至るが細胞の少なくとも１０％の生存を可能にするように、トリガー分子に対して所定範囲の感受性を示す。自殺スイッチはカスパーゼ－９を含み得る。ある特定の実施形態では、自殺スイッチはＦＫＢＰ１２領域、ＦＫＢＰ１２バリアント領域、ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）、またはＦＲＢバリアント領域を含む。ある特定の実施形態では、トリガー分子は、ラパマイシン、ラパログ、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、またはＡＰ１５１０である。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンからなる群から選択される３６位でのアミノ酸置換を有する。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、２コピーのＦＫＢＰ１２ｖ３６を含む。遺伝子改変Ｔ細胞は、ヒト細胞であり得る。ある特定の実施形態では、（ｉ）遺伝子改変Ｔ細胞は、レトロウイルス形質導入によってＴ細胞のゲノムに挿入されたΔＣＤ１９マーカーに連結されたｉＣａｓｐ９自殺スイッチを発現し；（ｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによって測定したΔＣＤ１９細胞表面マーカーの少なくとも１０倍の範囲の発現レベルを有し；（ｉｉｉ）組成物は、ＣＤ４＋遺伝子改変Ｔ細胞より多数のＣＤ８＋遺伝子改変Ｔ細胞を含み；（ｉｖ）組成物は、遺伝子改変最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、遺伝子改変エフェクターメモリーＴ細胞、および遺伝子改変セントラルメモリーＴ細胞を含み；（ｖ）遺伝子改変Ｔ細胞の５０％未満がナイーブＴ細胞であり；（ｖｉ）Ｔ細胞がヒトドナーから得られ、同種細胞枯渇ステップに供されない。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞あたり約１～１０個の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞あたり約１～７個の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞あたり約２～６個の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する。
【0010】
同様に、本明細書において遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞が、約２０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞および約６０％～約８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、（ｉ）改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が（ａ）約２５％～約４５％のナイーブ細胞、（ｂ）約１５％～約３０％のセントラルメモリーＴ（ＣＭ）細胞、（ｃ）約１５％～約３０％のエフェクターメモリーＴ（ＥＭ）細胞、（ｄ）約２％～約１５％の最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）細胞を含み；（ｉｉ）改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が、（ａ）約２０％～約６０％のナイーブ細胞、（ｂ）約１％～約１０％のＣＭ細胞、（ｃ）約１％～約１５％のＥＭ細胞、および（ｄ）約１０％～約１５％のＴＥＭＲＡ細胞を含む組成物も提供される。
【0011】
同様に、本明細書において遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）組成物中のＴ細胞の約２０％～４０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞であり；（ｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞であり；（ｉｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞であり；（ｉｖ）組成物中のＴ細胞の約５％～４０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物も提供される。ある特定の実施形態では、組成物中のＴ細胞の約２０％～３０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞である。ある特定の実施形態では、組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞である。ある特定の実施形態では、組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞である。ある特定の実施形態では、組成物中のＴ細胞の約１０％～３０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である。
【0012】
同様に、遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）組成物中のＴ細胞の約５％～２０％がＣＤ４＋ナイーブ細胞であり；（ｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＣＭ細胞であり；（ｉｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞であり；（ｉｖ）組成物中のＴ細胞の約１％～５％がＣＤ４＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物も提供される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の５％～１５％がＣＤ４＋ナイーブ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の１％～７％がＣＤ４＋ＣＭ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞である。
【0013】
同様に、上記の特許請求の範囲のいずれかの組成物を対象に導入するステップを含む、対象を処置する方法も本明細書において提供される。
【0014】
同様に本明細書において、対象を処置する方法であって、対象に薬物を投与するステップを含み、（ｉ）対象が上記組成物のいずれかに従う遺伝子改変Ｔ細胞の注入を以前に受けたことがあり；（ｉｉ）薬物が自殺スイッチを誘発し；（ｉｉｉ）薬物が、対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％を殺滅するために十分に高いが対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％が生存するために十分に低い用量で送達される、方法も提供される。
【0015】
同様に、本明細書において遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死をもたらし得る自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ナイーブＴ細胞と比較して最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／またはエフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利な条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセスも提供される。ある特定の実施形態では、方法は、ナイーブＴ細胞と比較して最終分化エフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利である。
【0016】
同様に、本明細書において遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死をもたらし得る自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の富化に都合がよい条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセスも提供される。
【0017】
同様に、本明細書において、遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）活性化濃度のＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体の存在下でドナーＴ細胞を培養するステップ；（ｉｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｉｉｉ）一定期間培養後、自殺スイッチおよび選択可能マーカーの両方をコードするＤＮＡをＴ細胞に導入するステップ；（ｉｖ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖ）選択可能マーカーを発現する細胞を選択するステップ；（ｖｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞を採取するステップを含み；但しステップ（ｉｖ）および（ｖｉ）が必要に応じたステップである、プロセスも提供される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞あたり約１～１０の平均ＶＣＮを有する。ある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞あたり約１～７の平均ＶＣＮを有する。ある特定の実施形態では、ステップ（ｉ）は、プロセスの開始時（１日目）に起こる。ある特定の実施形態では、ステップ（ｉｖ）はプロセスの３日目に起こる。ある特定の実施形態では、ステップ（ｖｉ）はプロセスの６日目に起こる。ある特定の実施形態では、プロセスの終了時、細胞の少なくとも５０％が形質導入されて生存している。ある特定の実施形態では、プロセスの終了時、細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存している。
【0018】
本発明者らはまた、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が自殺スイッチを発現し；（ｉｉ）遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１％～約３０％が最終分化エフェクターメモリーＴ細胞であり、および／または遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の５８％以下がナイーブＴ細胞である、組成物も提供する。
【0019】
本発明者らはまた、遺伝子改変Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が自殺スイッチおよび細胞表面トランスジーンマーカーを発現し；（ｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が細胞表面トランスジーンマーカーの所定範囲の発現レベルを示し、その範囲が少なくとも１０倍である、組成物も提供する。発現レベルはフローサイトメトリーによるＭＦＩ値として測定される。この組成物中のＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比は、好ましくは２未満である。
【0020】
本発明者らはまた、遺伝子改変Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞がトリガー分子に曝露された場合に、細胞死をもたらし得る自殺スイッチを発現し；（ｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞が特定の濃度のトリガー分子に曝露された場合に、細胞の少なくとも１０％の死に至るが細胞の少なくとも１０％の生存を可能にするように、トリガー分子に対して所定範囲の感受性を示す、組成物も提供する。
【0021】
一部の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞あたり約１～１０、または細胞あたり約１～８、または細胞あたり約１～７、または約１～５の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する。
【0022】
一部の実施形態では、自殺スイッチは、ＦＫＢＰ１２領域、ＦＫＢＰ１２バリアント領域、ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）、またはＦＲＢバリアント領域を含む。一部の実施形態では、ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンから選択される３６位でのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、トリガー分子は、ラパマイシン、ラパログ、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、またはＡＰ１５１０である。
【0023】
本発明者らはまた、遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）活性化濃度のＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体の存在下でドナーＴ細胞を培養するステップ；（ｉｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｉｉｉ）一定期間培養後、自殺スイッチおよび選択可能マーカーの両方をコードするＤＮＡをＴ細胞に導入するステップ；（ｉｖ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖ）選択可能マーカーを発現する細胞を選択するステップ；（ｖｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞を採取するステップを含み；但しステップ（ｉｖ）および（ｖｉ）が必要に応じたステップである（しかし好ましくは、１つまたはより好ましくは両方が実施される）、プロセスも提供する。採取されたＴ細胞は、本明細書で開示されるように使用することができる。
【0024】
本発明者らはまた、遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死をもたらし得る自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ナイーブＴ細胞と比較して最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／またはエフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利な条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセスも提供する。好ましくは、方法は、ナイーブＴ細胞と比較して最終分化エフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利である。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）はその順序で実施する必要はなく、ステップ（ｉ）は、ステップ（ｉｉ）の最中に起こり得る。
【0025】
本発明者らはまた、遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死をもたらし得る自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の富化に有利である条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセスも提供する。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、その順序で実施する必要はなく、ステップ（ｉ）はステップ（ｉｉ）の最中に起こり得る。
【0026】
本発明者らはまた、対象を処置する方法であって、上記の遺伝子改変Ｔ細胞の組成物を対象に導入するステップを含む、方法も提供する。同様に、本発明者らは、（ａ）対象の処置に使用するための、上記の遺伝子改変Ｔ細胞の組成物、および（ｂ）対象を処置するための医薬の製造における上記の遺伝子改変Ｔ細胞の組成物の使用を提供する。対象は、理想的にはヒト対象であり、通常、ＨＣＴまたはＨＳＣＴに関連して細胞を投与される。
【0027】
本発明者らはまた、対象を処置する方法であって、対象に薬物を投与するステップを含み、（ｉ）対象が本明細書に記載される遺伝子改変Ｔ細胞の注入を以前に受けたことがあり；（ｉｉ）薬物が自殺スイッチを誘発し；（ｉｉｉ）薬物が対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％を殺滅するために十分に高いが対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％が生存するために十分に低い用量で送達される、方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【発明を実施するための形態】
【0057】
詳細な説明
ドナーからのＴ細胞を遺伝子改変した後、レシピエント（例えば、ＨＣＴまたはＨＳＣＴの一部として）に投与し、それらに自殺スイッチを提供することができる。Ｔ細胞がレシピエントにおいて合併症（例えば、ＧＶＨＤ）を引き起こす場合、自殺スイッチを誘発し、遺伝子改変細胞の根絶をもたらすことができる。
Ｔ細胞
ドナーからのＴ細胞を遺伝子改変した後、レシピエント（例えば、ＨＣＴまたはＨＳＣＴの一部として）に投与し、それらに自殺スイッチを提供することができる。Ｔ細胞がレシピエントにおいて合併症（例えば、ＧＶＨＤ）を引き起こす場合、自殺スイッチを誘発し、遺伝子改変細胞の根絶をもたらすことができる。
Ｔ細胞
【0058】
本明細書に開示されるように遺伝子改変されたＴ細胞は、ドナーリンパ球投与によって利益を得ることができる対象に投与するために有用である。これらの対象は典型的にはヒトであり、そのため本発明は典型的にはヒトＴ細胞を使用して実施される。
【0059】
Ｔ細胞は、任意の健康なドナーに由来し得る。ドナーは一般的に成人（少なくとも１８歳）であるが、子供もまたＴ細胞ドナーとして適している（例えば、Styczynski 2018, Transfus Apher Sci 57(3):323-330を参照されたい）。
【0060】
ドナーからＴ細胞を得るための適したプロセスは、Di Stasi et al. (2011) N Engl J Med 365:1673-83（「プロトコール」）を伴う公表されたプロトコールに記載されている。一般的にＴ細胞は、ドナーから得られ、遺伝子改変および選択に供され、次いでレシピエント対象に投与することができる。Ｔ細胞の有用な起源はドナー末梢血である。末梢血試料は一般的に、ロイコフェレーシスに供され、白血球に関して富化された試料を提供する。この富化された試料（ロイコパック（leukopak）としても公知である）は、単球、リンパ球、血小板、血漿、および赤血球を含む多様な血液細胞で構成され得る。ロイコパックは典型的には、静脈穿刺またはバフィーコート産物と比較してより高濃度の細胞を含有する。
【0061】
試料を、同種細胞枯渇（「プロトコール」において考察したように）に供してもよいが、試料を同種細胞枯渇に供しないことが好ましい。このため、好ましい試料は、Zhou et al. (2015) Blood 125:4103-13に考察されるように、同種細胞を備えている（alloreplete）。これらの集団は、ドナー細胞の治療上の利点を提供するためのより頑強なＴ細胞レパートリーを提供する。このため、本発明の好ましい組成物は、同種細胞が枯渇されたＴ細胞ではなく、同種細胞枯渇ステップに供されていない。
【0062】
ドナーＴ細胞を、一般的に培養した（通常、例えば抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を使用して、必要に応じてＩＬ－２を伴う活性化条件で）後、遺伝子改変する。このステップは、改変プロセスの終了時により高い収量のＴ細胞を提供する。
【0063】
Ｔ細胞を、目的の自殺スイッチ（以下を参照されたい）をコードするウイルスベクターを使用して形質導入することができる。適した形質導入技術は「プロトコール」に開示されており、フィブロネクチン断片ＣＨ－２９６を伴い得る。ウイルスベクターを使用する形質導入の代替として、例えばリン酸カルシウム、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ）、磁気ビーズ、電気穿孔および市販の脂質に基づく試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）およびＦｕｇｅｎｅ（商標）を使用して、例えば目的の自殺スイッチおよび目的の細胞表面トランスジーンマーカーをコードするＤＮＡを、当技術分野で公知の任意の適した方法によって細胞にトランスフェクトすることができる。形質導入／トラスフェクションステップの１つの結果は、様々なドナーＴ細胞が、今や目的の自殺スイッチを発現することができる遺伝子改変Ｔ細胞であるということである。
【0064】
形質転換のための好ましいウイルスベクターは、Tey et al. (2007) Biol Blood Marrow Transpl 13:913-24および上記のDi Stasi et al. (2011)に開示されているレトロウイルスベクターである。このベクターは、ｉＣａｓｐ９自殺スイッチおよびΔＣＤ１９細胞表面トランスジーンマーカー（以下をさらに参照されたい）をコードするテナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ－Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスに基づく。これは、上記のTey et al.(2007)によって考察されているようにＰＧ１３パッケージング細胞株において産生することができる。所望のタンパク質をコードする他のウイルスベクターもまた使用することができる。レトロウイルスベクター、特に細胞あたりの高コピー数のプロウイルス組み込み体を提供することができるベクターが好ましい。
【0065】
形質導入／トランスフェクション後、細胞を、形質導入／トランスフェクション材料から分離して再度培養し、遺伝子改変Ｔ細胞を増大させることができる。Ｔ細胞は、例えば「プロトコール」に開示されるように所望の最少数の遺伝子改変Ｔ細胞が達成されるように増大させることができる。
【0066】
次いで遺伝子改変Ｔ細胞を、得られている細胞集団から選択することができる。自殺スイッチは通常、所望のＴ細胞の正の選択にとって適していないため、遺伝子改変Ｔ細胞はまた、目的の細胞表面トランスジーンマーカーも発現すべきであることが好ましい（以下を参照されたい）。この表面マーカーを発現する細胞を、例えば免疫磁気技術を使用して選択することができる。例えば、目的の細胞表面トランスジーンマーカーを認識するモノクローナル抗体にコンジュゲートされた常磁性ビーズを、例えば「プロトコール」に開示されているように、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）を使用して使用することができる。
【0067】
代替の手順では、遺伝子改変Ｔ細胞を、形質導入ステップ後に選択し、培養した後、供給する。このように、形質導入、供給、および選択の順序は変更することができる。
【0068】
これらの手順の結果は、遺伝子改変されて、このように目的の自殺スイッチ（および典型的には目的の細胞表面トランスジーンマーカー）を発現することができるドナーＴ細胞を含有する組成物である。これらの遺伝子改変Ｔ細胞を、レシピエントに投与することができるが、通常は、凍結保存後に（必要に応じてさらに増大後に）投与される。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞
【0069】
組成物は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得るが、理想的には、組成物内の遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を含む。ロイコパック中のＣＤ４＋細胞のＣＤ８＋細胞に対する比は、典型的には２を超えているが、一部の実施形態では、本発明の組成物中の遺伝子改変ＣＤ４＋細胞の遺伝子改変ＣＤ８＋細胞に対する比は、２未満、例えば１．５未満である。理想的には、組成物中の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞より多く存在し、すなわちＣＤ４＋細胞のＣＤ８＋細胞に対する比は、１未満、例えば０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、または好ましくはさらに０．５未満である。このように、ドナー細胞から始まって遺伝子改変Ｔ細胞を産生する手順全体が、理想的にはＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋細胞Ｔ細胞に関して富化する。好ましくは遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも６０％がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、より好ましくは少なくとも６５％がＣＤ８＋Ｔ細胞である。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞集団内でのＣＤ８＋Ｔ細胞の好ましい範囲は、５５～７５％の間、例えば６３～７３％である。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーによって容易に評価することができる。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を選別および計数する方法は当技術分野で慣例である。
メモリーＴ細胞サブセット（Mahnke et al. (2013) Eur J Immunol 43:2797-809を参照されたい）
メモリーＴ細胞サブセット（Mahnke et al. (2013) Eur J Immunol 43:2797-809を参照されたい）
【0070】
組成物内の遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団は、最終分化エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－細胞；「ＴＥＭＲＡ」として定義される）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－細胞；「ＥＭ」として定義される）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋細胞；「ＣＭ」として定義される）、およびナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋細胞として定義される）を含み得る。これらの細胞は、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯおよびＣＣＲ７マーカーを使用して評価することができる。ＣＣＲ７を認識し、ＣＤ４５ＲＡとＣＤ４５ＲＯアイソフォームの間を識別することができる標識された試薬が、市販の供給元から容易に入手可能である。
【0071】
平均的なロイコパックは典型的には、最終分化エフェクターおよびエフェクターメモリーＴ細胞の各々を約２０％含有する。ドナー細胞から遺伝子改変Ｔ細胞までの手順全体が、エフェクターメモリーＴ細胞と比較して最終分化エフェクターメモリーＴ細胞を富化し得る。
【0072】
一部の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の６０％未満、例えば５８％未満、好ましくは５５％未満、およびより好ましくは５０％未満がナイーブＴ細胞である。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞集団内で、ナイーブＴ細胞の好ましい範囲は、３０～６０％の間、より好ましくは４２～４９％の間、および最も好ましくは４３～４６％の間である。ナイーブＴ細胞のこの割合は、Ｔ細胞レシピエントにおける有利なアウトカムと相関することが認められている。ナイーブＥＭ細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡ／ＲＯおよびＣＣＲ７マーカーを使用して評価することができる。
【0073】
一部の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも２３％が、最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）Ｔ細胞である。そのような実施形態では、ＴＥＭＲＡ Ｔ細胞の画分は、好ましくは少なくとも２７％、より好ましくは少なくとも３０％、および最も好ましくは少なくとも３３％である。一部の実施形態では、３８％より多くの画分のＴＥＭＲＡ Ｔ細胞が観察されている。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団において、ＴＥＭＲＡ Ｔ細胞の好ましい範囲は、２３～４０％の間、例えば２８～４０％の間、または好ましくは３３～３９％である。ＴＥＭＲＡ細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡ／ＲＯおよびＣＣＲ７マーカーを使用して評価することができる。
【0074】
一部の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の１７％以下がエフェクターメモリー（ＥＭ）Ｔ細胞である。そのような実施形態では、ＥＭ Ｔ細胞の画分は、好ましくは１６％未満、より好ましくは１５％未満、および最も好ましくは１４％未満である。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団において、ＥＭ Ｔ細胞の好ましい範囲は７～１７％の間、例えば７～１５％、または好ましくは８～１３％である。ＥＭ細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡ／ＲＯおよびＣＣＲ７マーカーを使用して評価することができる。
【0075】
遺伝子改変Ｔ細胞の集団において、ＴＥＭＲＡ、ＥＭ、およびナイーブＴ細胞に加えて、セントラルメモリーＴ細胞の割合は、一般的に１０％未満である。
【0076】
遺伝子改変Ｔ細胞のＣＤ８＋集団をより詳しく調べると、一部の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１％～約３０％が最終分化エフェクターメモリーＴ細胞である。他の実施形態では、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の５８％以下がナイーブＴ細胞である。好ましくは、少なくとも５％のＴＥＭＲＡ細胞および５８％以下のナイーブＴ細胞が存在する。他の実施形態では、少なくとも５％のＴＥＭＲＡ細胞および少なくとも約２５％～５８％以下のナイーブＴ細胞が存在する。他の実施形態では、少なくとも１０％のＴＥＭＲＡ細胞、および少なくとも約２５％～５８％以下のナイーブＴ細胞が存在する。他の実施形態では、少なくとも２０％のＴＥＭＲＡ細胞、および少なくとも約２５％～５８％以下のナイーブＴ細胞が存在する。他の実施形態では、少なくとも５％のＴＥＭＲＡおよび少なくとも約３０％～５８％以下のナイーブＴ細胞が存在する。平均的なロイコパックは典型的に、約２５％のＴＥＭＲＡ ＣＤ８＋Ｔ細胞および約６０％のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。このように、ドナー細胞から始まって遺伝子改変Ｔ細胞を産生する手順全体が、理想的にはＣＤ８＋画分においてナイーブＴ細胞と比較してメモリーＴ細胞を富化する。
【0077】
遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の３０％以上がＴＥＭＲＡ細胞である場合、少なくとも３５％のＴＥＭＲＡ、より好ましくは少なくとも４０％のＴＥＭＲＡ、および最も好ましくは少なくとも４５％のＴＥＭＲＡが存在することが好ましい。一部の実施形態では、５０％より多くの画分のＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ Ｔ細胞さえ観察されている。遺伝子改変ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団において、ＴＥＭＲＡ Ｔ細胞の好ましい範囲は、３０～６０％の間、例えば３５～５５％、または好ましくは４０～５５％である。
【0078】
遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の５８％以下がナイーブＴ細胞である場合、５０％未満のナイーブＴ細胞、およびより好ましくは４８％未満のナイーブＴ細胞が存在することが好ましい。遺伝子改変ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団において、ナイーブＴ細胞の好ましい範囲は、２５％～５８％の間、例えば３０％～５５％、または３５～５５％、好ましくは３８～５２％、および最も好ましくは４０～４８％である。
【0079】
遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団において、ＴＥＭＲＡ、ＥＭ、およびナイーブＴ細胞に加えて、セントラルメモリーＴ細胞の割合は一般的に４％未満である。
【0080】
一部の実施形態では、組成物内の遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団は、約１０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞および約６０％～約９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団は、約１５％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞および約６０％～約８５％のＣＤ８＋Ｔ細胞、より好ましくは約２０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞および約６０％～約８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。一部の実施形態では、改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、約２０％～約５０％のナイーブ細胞、約１５％～４０％のＣＭ細胞、約１５％～４０％のＥＭ細胞、および約２％～約１５％のＴＥＭＲＡ細胞を含む。一部の実施形態では、改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、約２５％～約４５％のナイーブ細胞、約１５％～３０％のＣＭ細胞、約１５％～３０％のＥＭ細胞、および約２％～約１５％のＴＥＭＲＡ細胞を含む。一部の実施形態では、改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、約２０％～約６０％のナイーブ細胞、約１％～２０％のＣＭ細胞、約１％～２０％のＥＭ細胞、および約１０％～約４０％のＴＥＭＲＡ細胞を含む。一部の実施形態では、改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、約２０％～約６０％のナイーブ細胞、約１％～１０％のＣＭ細胞、約１％～１５％のＥＭ細胞、および約１０％～約４０％のＴＥＭＲＡ細胞を含む。
【0081】
一部の実施形態では、組成物内の遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団は、約２０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞および約６０％～約８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、約２５％～約４５％のナイーブ細胞、約１５％～３０％のＣＭ細胞、約１５％～３０％のＥＭ細胞、および約２％～約１５％のＴＥＭＲＡ細胞を含み；改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、約２０％～約６０％のナイーブ細胞、約１％～１０％のＣＭ細胞、約１％～１５％のＥＭ細胞、および約１０％～約４０％のＴＥＭＲＡ細胞を含む。
【0082】
一部の実施形態では、本発明は、遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、組成物中のＴ細胞の約２０％～４０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８ ＥＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約５％～４０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、組成物中のＴ細胞の約２０％～３０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１０％～３０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物を提供する。
【0083】
一部の実施形態では、本発明は、遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、組成物中のＴ細胞の約５％～２０％がＣＤ４＋ナイーブ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＣＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～５％がＣＤ４＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、組成物中のＴ細胞の約５％～１５％がＣＤ４＋ナイーブ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～７％がＣＤ４＋ＣＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞であり、組成物中のＴ細胞の約１％～５％がＣＤ４＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物を提供する。
自殺スイッチ
自殺スイッチ
【0084】
本発明の遺伝子改変Ｔ細胞は、自殺スイッチ（当技術分野で誘導型自殺遺伝子または安全スイッチとしても公知である）を発現し、これは例えばＧＶＨＤを発症する場合に、所望の場合はｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞を根絶するために使用することができる。これらのスイッチは、Ｔ細胞を根絶することが望ましい場合に供給され、細胞死に至る（例えば、壊死またはアポトーシスを誘発することによって）トリガー、例えば薬物に反応する。これらの薬剤は、毒性の遺伝子産物の発現をもたらし得るが、遺伝子改変Ｔ細胞が薬剤に応答して毒性型に切り替えられるタンパク質を既に発現する場合には、より迅速な応答を得ることができる。
【0085】
好ましい自殺スイッチは、化学的二量体化誘導剤を対象に投与することによって誘発することができるアポトーシスタンパク質に基づく。アポトーシスタンパク質を、化学的二量体化誘導剤に結合するポリペプチド配列に融合すると、この化学的誘導剤またはリガンドを送達することによって、２つのアポトーシスタンパク質が近位となり得て、アポトーシスを誘発する。例えば、カスパーゼ－９を、薬剤リミドゥシドに応答して二量体化を誘導することができる改変ヒトＦＫ結合タンパク質に融合させることができる。したがって、リミドゥシドを対象に送達すると、カスパーゼ－９スイッチを発現するＴ細胞のアポトーシスを誘発することができる。
【0086】
そのようなカスパーゼ－９スイッチは、上記のDi Stasi et al. (2011)に記載されており、同様にYagyu et al. (2015) Mol Ther 23(9):1475-85, Rossigloni et al. (2018) Cancer Gene Ther doi.org/10.1038/s41417-018-0034-1, Jones et al. (2014) Front Pharmacol doi.org/10.3389/fphar.2014.00254、米国特許第９，９３２，５７２号、米国特許第９，９１３，８８２号、米国特許第９，３９３，２９２号、および米国特許出願公開第２０１５／０３２８２９２号も参照されたい。ＦａｓまたはＨＳＶチミジンキナーゼに基づく自殺スイッチもまた当技術分野で周知である。ヒトタンパク質、例えばカスパーゼ－９に基づく自殺スイッチは、これによって、スイッチを発現する細胞がヒト対象の免疫系によって異物と認識されるリスクが最小限となることから好ましい。
【0087】
スイッチのリガンド誘導剤の例としては、例えばKopytek, S.J., et al., Chemistry & Biology 7:313-321 (2000)およびGestwicki, J.E., et al., Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10:667-675 (2007); Clackson T (2006) Chem Biol Drug Des 67:440-2; Clackson, T., in Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design (Schreiber, s., et al., eds., Wiley, 2007)に考察されるスイッチが挙げられる。
【0088】
安全スイッチに組み込まれるリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６改変ＦＫＢＰ１２ポリペプチド、またはＡＰ１９０３に結合するバリアントポリペプチドを含む他の適したＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド、または他の合成ホモ二量体化剤、例えばＡＰ２０１８７またはＡＰ２０１５を含み得る。バリアントは、例えばバリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンからなる群から選択される３６位でのアミノ酸置換を有するＦＫＢＰ領域を含み得る（Clackson T, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:10437-10442）。リミドゥシドとしても公知のＡＰ１９０３（ＣＡＳインデックス名：２－ピペリジンカルボン酸、１－［（２Ｓ）－１－オキソ－２－（３，４，５－トリメトキシフェニル）ブチル］－，１，２－エタンジイルビス［イミノ（２－オキソ－２，１－エタンジイル）オキシ－３，１－フェニレン［（１Ｒ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ－［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］－（９ＣＩ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－６３－７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０、分子量：１４１１．６５）は、健康なボランティアにおいて安全であることが証明されている合成分子である（Iuliucci JD, et al., J Clin Pharmacol. 2001, 41:870-879）。
【0089】
安全スイッチは、改変活性、例えばホモ二量体化リガンドの非存在下で低減された基礎活性を有する改変カスパーゼ－９ポリペプチドを含み得る。改変カスパーゼ－９ポリペプチドは、例えば米国特許第９，９１３，８８２号、および上記の米国特許出願公開第２０１５－０３２８２９２号において考察され、例えば３３０位でのアミノ酸置換（例えば、Ｄ３３０ＥまたはＤ３３０Ａ）、または例えば４５０位でのアミノ酸置換（例えば、Ｎ４０５Ｑ）、または例えばＤ３３０Ｅ－Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑを含むその組合せを含み得る。より低い基礎活性を有するカスパーゼ－９ポリペプチドは、例えば米国特許第９，４３４，９３５号、第９，９３２，５７２号、および第９，９１３，８８２号、ならびに米国特許出願第６２／６６８，２２３号、第６２／７５６，４４２号、第６２／８１６，７９９号、第１５／９０１，５５６号、第１５／８８８，９４８号において以前に記載されている。
【0090】
本発明と共に使用するための最も好ましい自殺スイッチは、上記のDi Stasi et al. (2011)によって開示されるｉＣａｓｐ９であり、これはＳＧＧＧＳリンカーを通してその内因性のカスパーゼ活性化および動員ドメインを欠如する改変ヒトカスパーゼ９（ＣＡＳＰ９）に接続された、Ｆ３６Ｖ突然変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）の配列からなる。Ｆ３６Ｖ突然変異は、ＦＫＢＰ１２の、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７およびＡＰ１９０３（リミドゥシド）に対する結合親和性を増加させる。
【0091】
細胞死またはアポトーシスを誘導するために有用な安全スイッチ、および発現構築物を含む細胞死またはアポトーシスを誘導する関連する方法、ベクターを構築する方法、活性または機能に関するアッセイ、誘導型キメラポリペプチドを発現する細胞にｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でキメラポリペプチドの多量体化領域に結合する多量体化合物またはその薬学的に許容される塩を接触させることによるキメラポリペプチドの多量体化、本明細書に記載される発現ベクター、細胞、または多量体化合物、またはその薬学的に許容される塩の対象への投与、ならびに本明細書に記載される多量体化合物またはその薬学的に許容される塩の、誘導型キメラポリペプチドを発現する細胞を投与されている対象への投与の非制限的な例もまた、以下の特許および特許出願において見出すことができ、その各々は全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。２０１１年５月２０日に提出された米国特許出願第１３／１１２，７３９号、表題「METHODS FOR INDUCING SELECTIVE APOPTOSIS」、２０１１年１１月２４日に米国特許出願公開第２０１１－０２８６９８０－Ａ１号として公開され、２０１５年７月２８日に米国特許第９，０８９，５２０号として発行されたもの；Ｓｐｅｎｃｅｒらによって２０１３年３月１０日に提出された米国特許出願第１３／７９２，１３５号、表題「MODIFIED CASPASE POLYPEPTIDES AND USES THEREOF」、２０１４年９月１１日に米国特許出願公開第２０１４－０２５５３６０－Ａ１号として公開され、２０１６年９月６日に米国特許第９，４３４，９３５号として発行されたもの；２０１４年３月７日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４号、２０１４年１０月９日にＷＯ２０１４／１６４３８号として公開されたもの；Ｓｌａｗｉｎらによって２０１４年６月４日に提出された米国特許出願第１４／２９６，４０４号、表題「METHODS FOR INDUCING PARTIAL APOPTOSIS USING CASPASE POLYPEPTIDES」、２０１６年６月２日に米国特許出願公開第２０１６－０１５１４６５－Ａ１号として公開されたもの；Ｓｌａｗｉｎらによって２０１４年６月４日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４０９６４号、２０１５年２月５日にＷＯ２０１４／１９７６３８号として公開されたもの；２０１５年３月６日に提出された米国特許出願第１４／６４０，５５３号、表題「CASPASE POLYPEPTIDES HAVING MODIFIED ACTIVITY AND USES THEREOF」、２０１５年１１月１９日に米国特許出願公開第２０１５－０３２８２９２－Ａ１号として公開されたもの；Ｓｐｅｎｃｅｒらによって２０１５年３月６日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９１８６号、２０１５年９月１１日にＷＯ２０１５／１３４８７７号として公開されたもの；Ｓｐｅｎｃｅｒらによって２０１５年１２月１４日に提出された米国特許出願第１４／９６８，７３７号、表題「METHODS FOR CONTROLLED ELIMINATION OF THERAPEUTIC CELLS」、２０１６年６月１６日に米国特許出願公開第２０１６－０１６６６１３－Ａ１号として公開されたもの；Ｓｐｅｎｃｅｒらによって２０１５年１２月１４日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５６２９号、２０１６年６月２３日にＷＯ２０１６／１００２３６号として公開されたもの；Ｓｐｅｎｃｅｒらによって２０１５年１２月１４日に提出された米国特許出願第１４／９６８，８５３号、表題「METHODS FOR CONTROLLED ACTIVATION OR ELIMINATION OF THERAPEUTIC CELLS」、２０１６年６月２３日に米国特許出願公開第２０１６－０１７５３５９－Ａ１号として公開されたもの；Ｓｐｅｎｃｅｒらによって２０１５年１２月１４日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５６４６号、２０１６年９月１５日にＷＯ２０１６／１００２４１号として公開されたもの；Ｂａｙｌｅらによって２０１６年１２月１３日に提出された米国特許出願第１５／３７７，７７６号、表題「DUAL CONTROLS FOR THERAPEUTIC CELL ACTIVATION OR ELIMINATION」、２０１７年６月１５日に米国特許出願公開第２０１７－０１６６８７７－Ａ１号として公開されたもの；およびＢａｙｌｅらによって２０１６年１２月１３日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６６３７１号、２０１７年６月２２日にＷＯ２０１７／１０６１８５号として公開されたもの、これらは全ての本文、表、および図面を含むその各々の全体が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に記載される多量体化合物またはその薬学的に許容される塩は、本質的にこれらの刊行物に提供される実施例および本明細書に提供される他の実施例において考察されるように使用され得る。
【0092】
様々な実施形態では、本明細書において企図される組成物および方法は、任意のその間の百分率を含む、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の形質導入効率を有する。
【0093】
様々な実施形態では、本明細書において企図される組成物および方法では、平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）は、少なくとも約１～少なくとも約１０．０、少なくとも約１～少なくとも約９、少なくとも約１～少なくとも約８、少なくとも約１．０～少なくとも約７、少なくとも約１．０～少なくとも約５、または少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３．０、少なくとも約３．５、少なくとも約４．０、少なくとも約４．５、または少なくとも約５．０である。
【0094】
「ベクターコピー数」または「ＶＣＮ」は、細胞のゲノムにおけるベクターまたはその部分のコピー数を指す。平均ＶＣＮは、細胞集団または個々の細胞コロニーから決定され得る。ＶＣＮを決定する例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびフローサイトメトリーを含む。
【0095】
様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチによって形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも５０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。
【0096】
一部の実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は、約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。
【0097】
様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～８の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～７の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～５の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。
細胞表面トランスジーンマーカー
細胞表面トランスジーンマーカー
【0098】
上記のように、自殺スイッチの発現は通常、所望の遺伝子改変Ｔ細胞の正の選択にとって適していないため、これらの細胞は目的の細胞表面マーカーを発現すべきであることが好ましい。このマーカーは、細胞表面トランスジーンマーカーに基づく細胞の選択がまた、自殺スイッチを発現することができる細胞の選択ももたらすように、自殺スイッチと共に送達されるトランスジーンから発現されるべきである。
【0099】
理想的には、マーカーは、ドナーＴ細胞によって発現されないポリペプチドでなければならない。その上、理想的には、マーカーはヒトタンパク質に基づき、これによってマーカーを発現する細胞がヒト対象の免疫系によって異物として認識されるリスクが最小限となる。例えば、Ｔ細胞によって天然に発現されないヒトＣＤタンパク質をこの目的のために使用することができる。
【0100】
本発明と共に使用するために最も好ましい細胞表面トランスジーンマーカーは、上記のDi Stasi et al.(2011)によって開示される切断型ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）であり、これはアミノ酸３３３位で切断されたヒトＣＤ１９からなり、細胞質内ドメインのほとんどを除去する。細胞外ＣＤ１９ドメインはなおも認識され得るものの（例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、またはＭＡＣＳによって）、細胞内シグナル伝達を誘発する潜在性は最小限となる。ＣＤ１９は通常、Ｔ細胞ではなくてＢ細胞によって発現されるが、ＣＤ１９＋Ｔ細胞を選択することにより、遺伝子改変Ｔ細胞を非改変ドナーＴ細胞から分離することが可能となる。
【0101】
本発明者らは、細胞表面トランスジーンの発現レベル（および形質導入後のベクターコピー数）が、遺伝子改変Ｔ細胞内で広く異なり得ることを見出した。その上、細胞の薬物動態および薬力学特性は、マーカーのその発現レベルに応じて異なる。
【0102】
遺伝子改変Ｔ細胞は、マーカーの発現レベルの少なくとも１０倍の範囲を示すことができ、すなわち最高レベルのマーカーを発現する細胞より少なくとも１０倍低い細胞表面マーカーを示す一部の細胞を含む。これらの発現レベルは、トランスジーンマーカーが細胞表面上に存在することから、フローサイトメトリーを使用して、例えば平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として評価することができる。このように、ＦＡＣＳ実験におけるマーカーに関して認められた蛍光シグナルは、少なくとも１０の範囲を有する。実際に、１０よりかなり高い範囲、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、またはさらには１０００またはそれよりも高い範囲を達成することができる。
【0103】
発現レベルは典型的には、少なくとも１０の範囲にわたって連続的に変化する（例えば、ｘおよび１０ｘの発現レベルを有する２群ではなくて）。このため、発現レベルの分布が存在し、集団は、そのマーカーの発現レベルが、観察される最高発現レベルの１／１０である一部の細胞を含み、多様な発現レベルがその範囲内で分布する（および、典型的にはより低い発現レベルを有する一部の細胞も）。このため、細胞表面マーカーの発現に関するＦＡＣＳ細胞数ヒストグラムは、少なくとも１０倍変化するレベルを含み、典型的には、多様な異なる発現レベルがその範囲にわたって分布する。
【0104】
一定範囲の細胞表面トランスジーンマーカーの発現レベルを有する細胞を含めることによって、自殺スイッチの所定範囲の発現レベルもまた存在する。本発明者らは、自殺スイッチの高い発現レベルを有するＴ細胞が、自殺スイッチが誘発された場合により迅速かつより完全にｉｎ ｖｉｖｏで根絶されるが、低い発現レベルを有するＴ細胞はより長く生存し得ることを示した。その上、本発明者らは、Ｔ細胞が活性化されるとマーカーの発現レベルが増加することを見出した。理論に拘束されたくはないが、遺伝子改変Ｔ細胞が所定範囲の発現レベルを有することによって、ドナーＴ細胞を供給するという利益をなおも提供することができる一部の遺伝子改変Ｔ細胞を保持しながら、問題のある細胞（例えば、ＧＶＨＤの際に）を除去することが可能であるように思われる。言い換えれば、発現レベルの範囲があることによって、ＧＶＨＤに対するその関与にもかかわらず、全てのドナーＴ細胞を除去することによるのではなく、活性化した問題がある細胞に対してＴ細胞除去を標的化することが可能となる。
【0105】
このように、本発明の組成物内の遺伝子改変Ｔ細胞は、リミドゥシドなどのトリガー分子に対して所定範囲の感受性を示し得る。このように、トリガー分子を使用してＴ細胞のごく一部（例えば、少なくとも１０％）を根絶してもよく、一方、Ｔ細胞の一部（例えば、少なくとも１０％）は生存する。トリガー分子の濃度は、細胞死と生存の所望のバランスに従って選択することができ、例えばより高い割合のＴ細胞の根絶が望ましい場合にはより高濃度を送達する。これらの濃度は、単純な用量設定実験によって、トリガー分子に応答した細胞死のレベルのモニタリングによって決定することができる。投与される濃度は、標的Ｔ細胞の少なくとも１０％を除去するために十分に高くなければならないが、それらの９０％より多くを殺滅するほど高くはない。生存率は、１０～９０％生存のこの範囲内のいずれかであるように選択することができる。
自殺スイッチと細胞表面トランスジーンマーカーの同時発現
自殺スイッチと細胞表面トランスジーンマーカーの同時発現
【0106】
上記のように、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞は、マーカーを発現するＴ細胞の選択がまた、自殺スイッチを発現する細胞の選択ももたらすように、自殺スイッチと細胞表面トランスジーンマーカーの両方を発現しなければならない。
【0107】
理想的には、遺伝子改変Ｔ細胞は、自殺スイッチと細胞表面トランスジーンマーカーの固定された比を発現する。自殺スイッチと細胞表面トランスジーンマーカーが確実に共に発現されるためには、それらを単一の遺伝子から発現させることが好ましく、その翻訳されたポリペプチドを切断して両方の成熟ポリペプチドを個別に提供する。これを達成する１つの方法は、２つのポリペプチド配列を、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルスに由来する２Ａ様配列によって連結することである。これは、自殺スイッチと細胞表面マーカーの発現の本質的に固定された化学量論比（２つの成熟ポリペプチドが単一の２Ａ様配列によって連結されている場合には１：１比）を提供する。コードする遺伝子の５’末端で自殺スイッチをコードすることによって、自殺スイッチを有しない（例えば、翻訳の早期終止による）細胞を選択するリスクが最小限となる。このように、細胞表面トランスジーンマーカーおよび自殺スイッチの発現は並行して起こる。
【0108】
一部の実施形態では、自殺スイッチおよび細胞表面トランスジーンマーカーは、同じ成熟ポリペプチドであり得るが、実際問題としてそれらが個別のポリペプチドであるほうがより単純であると想像される。したがって好ましい遺伝子は、５’から３’の順に：Ｆ３６Ｖ突然変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）、これにＳＧＧＧＳリンカーを通して、その内因性カスパーゼ活性化および動員ドメインを欠如する改変ヒトカスパーゼ９（ＣＡＳＰ９）が接続され、これに２Ａ様配列を通してΔＣＤ１９マーカーが接続されたものをコードする（上記のDi Stasi et al. (2011)の図１Ｃを参照されたい）。さらに、上記のように、この遺伝子は、テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ－Ｖ）に基づいて上記のDi Stasi et al. (2011)によっても開示されるようにレトロウイルスベクターによってコードされることが好ましい。この系は、本明細書において、遺伝子改変Ｔ細胞を選択するためのおよびヒトにおいてｉｎ ｖｉｖｏでそのアポトーシスを制御するための効率的な系を提供することが示されている。
【0109】
様々な実施形態では、本明細書において企図される組成物および方法は、その間の任意の百分率を含む、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の形質導入効率を有する。
【0110】
様々な実施形態、本明細書において企図される組成物および方法では、平均ＶＣＮは、少なくとも約１～少なくとも約１０．０、少なくとも約１～少なくとも約９、少なくとも約１～少なくとも約８、少なくとも約１．０～少なくとも約７、少なくとも約１．０～少なくとも約５、または少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３．０、少なくとも約３．５、少なくとも約４．０、少なくとも約４．５、または少なくとも約５．０である。
【0111】
様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも５０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。
【0112】
一部の実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は、約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。
【0113】
様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～８の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～７の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載される自殺スイッチを形質導入され、組成物中のＴ細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存しており、遺伝子改変Ｔ細胞は約１～５の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有することが企図される。
処置の方法
処置の方法
【0114】
本発明の遺伝子改変Ｔ細胞は、それを必要とするヒト対象を処置するための方法において使用することができ、そのような対象を処置するための薬剤を調製するために使用することができる。細胞は通常、注入によってレシピエント対象に送達される。対象に関するＴ細胞の典型的な用量は、細胞１０５～１０７個／ｋｇの間である。小児患者は一般的に、およそ細胞１０６個／ｋｇの用量を投与され、成人患者はより高用量、例えば細胞３×１０６個／ｋｇを投与される。
【0115】
一般的に言えば、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞は、公知のドナー白血球注入（ＤＬＩ）と同じ方法で使用することができるが、自殺スイッチという追加の利益を有する。
【0116】
遺伝子改変Ｔ細胞を投与される対象はまた、典型的には、同種ドナーからの他の組織を投与され、例えば対象に、造血細胞および／または造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を投与することができる。この同種移植片組織および遺伝子改変Ｔ細胞は、理想的には同じドナーに由来し、そのためそれらは遺伝的に一致する。さらに、ドナーおよびレシピエントは好ましくはハプロタイプ一致であり、例えば一致した非血縁ドナーまたは適したファミリーメンバーである。例えば、ドナーは、レシピエントの親または子供であり得る。対象が遺伝子改変Ｔ細胞を必要とすると同定される場合、適したドナーをＴ細胞ドナーとして同定することができる。
【0117】
遺伝子改変Ｔ細胞を造血細胞および／または造血幹細胞と共に使用する場合、遺伝子改変Ｔ細胞は一般的に、後の時点で、例えば２０～１００日後の間に投与される。レシピエントが遺伝子改変Ｔ細胞の投与後に合併症を発症する（例えば、レシピエントがＧＶＨＤを発症する）場合、例えばリミドゥシドをレシピエントに投与することによって自殺スイッチを誘発することができる。
【0118】
Ｔ細胞を除去するために必要なリミドゥシドの最低用量は、レシピエントに存在する遺伝子改変Ｔ細胞の数に依存するであろう。この最低値を超える用量を投与することができるが、通常の薬学的原理に従って、過剰な投薬は回避すべきである。本発明者らは、０．４ｍｇ／ｋｇの用量が細胞１．５×１０７個／ｋｇの用量で注入された細胞を除去することができることを見出した。一般的に、０．１～５ｍｇ／ｋｇの間のリミドゥシドの用量が投与され、通常、０．１～２ｍｇ／ｋｇまたは０．１～１ｍｇ／ｋｇで十分であり、好ましい用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。リミドゥシドの一連の複数用量を投与することができるが、例えば初回用量が全ての遺伝子改変Ｔ細胞を除去しないことが見出される場合、第２の用量を投与することができる等である。
【0119】
本明細書に示されるように、高レベルの細胞表面トランスジーンマーカー発現を発現する細胞は、自殺スイッチトリガーに対してより感受性がある。これらの細胞はまた、ＧＶＨＤにとって最も問題でもあり得る。このように一部の実施形態では、最も感受性が高い細胞を殺滅するトリガー（例えば、リミドゥシド）の第１の用量を投与し、次により感受性が低い細胞を殺滅する第２の用量（第１の用量より高い用量）を投与する。さらなる用量（必要に応じて漸増する）を必要に応じて投与することができる。このように、問題があるＴ細胞を一度に全てではなく、順に枯渇させることが可能である。
【0120】
レシピエントに、遺伝子改変Ｔ細胞を投与する前に（および同種移植片を投与する前に）骨髄破壊的条件付けを行ってもよい。このように、レシピエント自身のα／βＴ細胞（およびＢ細胞）を枯渇させた後に、遺伝子改変Ｔ細胞を投与する（および同種移植片を投与する）ことができる。同様に、レシピエントに投与される造血（幹）細胞を、α／β細胞に関して枯渇してもよい。これに対し、レシピエントに投与される遺伝子改変ドナーＴ細胞は、好ましくはα／β細胞に関して枯渇されない。
【0121】
レシピエントは、子供、例えば年齢０～１６歳、または０～１０歳の子供であり得る。一部の実施形態では、レシピエントは成人である。
【0122】
レシピエントは、血液のがん（例えば、処置不応性血液がん）または遺伝性血液障害を有し得る。例えば、レシピエントは急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット－アルドリッチ症候群（ＷＡ）、ファンコニ貧血、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、または多発性骨髄腫を有し得る。
【0123】
遺伝子改変Ｔ細胞は、レシピエントが同種移植片の移植後、移植関連感染症を制御するために役立ち得る。
ＡＯＳ－１
ＡＯＳ－１
【0124】
本発明と共に使用するために最も好ましいＴ細胞集団は、本明細書に開示される「ＡＯＳ－１」細胞である。これらの好ましい遺伝子改変Ｔ細胞は、以下の特徴の１つまたは複数（および最も好ましくは全て）を有する：
（ａ）それらは、上記で考察されたようにレトロウイルス形質導入によってゲノムに挿入されたΔＣＤ１９マーカーに連結されたｉＣａｓｐ９自殺スイッチを発現する。
（ｂ）それらは、フローサイトメトリーによって測定したΔＣＤ１９マーカーの発現レベルの少なくとも１０倍の範囲を有する。
（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞より多数存在する。
（ｄ）最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、およびセントラルメモリーＴ細胞が存在する。
（ｅ）Ｔ細胞の６０％未満であるが、少なくとも２５％がナイーブＴ細胞である。
（ｆ）それらがヒトドナーから得られ、同種細胞枯渇ステップに供されなかった。
これらの細胞は、本明細書に開示される方法を使用して得ることができる。
全般
（ａ）それらは、上記で考察されたようにレトロウイルス形質導入によってゲノムに挿入されたΔＣＤ１９マーカーに連結されたｉＣａｓｐ９自殺スイッチを発現する。
（ｂ）それらは、フローサイトメトリーによって測定したΔＣＤ１９マーカーの発現レベルの少なくとも１０倍の範囲を有する。
（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞より多数存在する。
（ｄ）最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、およびセントラルメモリーＴ細胞が存在する。
（ｅ）Ｔ細胞の６０％未満であるが、少なくとも２５％がナイーブＴ細胞である。
（ｆ）それらがヒトドナーから得られ、同種細胞枯渇ステップに供されなかった。
これらの細胞は、本明細書に開示される方法を使用して得ることができる。
全般
【0125】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または追加の何か、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【0126】
数値ｘに関連する用語「約」は、必要に応じてであり、例えばｘ±１０％を意味する。
【0127】
２つの値に関連する用語「の間」は、それらの２つの値を含み、例えば１０ｍｇと２０ｍｇ「の間」の範囲は、中でも１０、１５、および２０ｍｇを包含する。
【0128】
数、パーセント、または他の値に関連する用語「少なくとも「Ｘ」」は、用語「「Ｘ」またはそれより多く」と互換的であり、例えば「少なくともＸ％」は、「Ｘまたはそれより多く」と互換的である。
【実施例】
【0129】
（実施例１）
ＡＯＳ－１細胞の調製
上記のDi Stasi et al. (2011)は、自殺スイッチを有する遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法を開示している。ＡＯＳ－１細胞は、異なるプロセスから得られたが、本質的に以下の通りであった：
・ 細胞をロイコフェレーシスによってドナーの末梢血試料から得て、白血球に関して富化する。単核球を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する密度勾配分離によって富化し、－１３０℃での貯蔵のために凍結保存する。
・ 遺伝子改変細胞を調製する場合、それらをドライバス内で融解した後（１日後）、Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）装置において培養バッグ中、３７℃および５％ＣＯ２で培養する。細胞を培養培地に細胞１～３×１０６個／ｍＬで播種する。培地は、Ｔ細胞を維持する（トランスフェリン、アルブミン、およびインスリンを含有する）無血清培地であり、これに１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２、０．２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３ ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＯＫＴ３）、および０．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８ ｍＡｂを添加したものである。これらの条件はＴ細胞を活性化する。
・ ３日目に、培養物に新鮮な１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２および３３％の追加の新鮮な培地を供給する。
・ ５日目に、細胞をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティングＡＣバッグに移し、上記のTey et al. (2007)および上記のDi Stasi et al. (2011)によって開示されるｉＣａｓｐ９自殺スイッチをコードするＧａｌ－Ｖレトロウイルスベクターを形質導入する。ＩＬ－２を２００Ｕ／ｍＬで添加する。
・ ６日目、細胞を処理して、残存しているレトロウイルス粒子（上清）を除去し、培地中に細胞１０６個／ｍＬで２００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２と共に再懸濁させた。培養を３７℃、５％ＣＯ２で継続する。
・ ８日目、形質導入した細胞を、再度Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）システムを使用してＣＤ１９発現に基づいてＭＡＣＳによって選択する。ＣＤ１９＋細胞を上記と同様にバッグ中で、さらなるＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍＬ）と共に細胞１０６個／ｍＬで培養する。
・ ９日目、細胞を採取し、遠心分離機においてＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（Rizoli (2011) J Trauma 70(5 Suppl) S17-8）によって洗浄し、同種レシピエントによって必要とされるまで－１３０℃での貯蔵のために凍結保存培地中に再懸濁する。
・ しかし、９日目で細胞数が適切でなかった場合（例えば、意図される処置にとって細胞が少なすぎる場合）、培養を最大１５日まで継続した後、採取することができる。
ＡＯＳ－１細胞の調製
上記のDi Stasi et al. (2011)は、自殺スイッチを有する遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法を開示している。ＡＯＳ－１細胞は、異なるプロセスから得られたが、本質的に以下の通りであった：
・ 細胞をロイコフェレーシスによってドナーの末梢血試料から得て、白血球に関して富化する。単核球を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する密度勾配分離によって富化し、－１３０℃での貯蔵のために凍結保存する。
・ 遺伝子改変細胞を調製する場合、それらをドライバス内で融解した後（１日後）、Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）装置において培養バッグ中、３７℃および５％ＣＯ２で培養する。細胞を培養培地に細胞１～３×１０６個／ｍＬで播種する。培地は、Ｔ細胞を維持する（トランスフェリン、アルブミン、およびインスリンを含有する）無血清培地であり、これに１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２、０．２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３ ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＯＫＴ３）、および０．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８ ｍＡｂを添加したものである。これらの条件はＴ細胞を活性化する。
・ ３日目に、培養物に新鮮な１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２および３３％の追加の新鮮な培地を供給する。
・ ５日目に、細胞をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティングＡＣバッグに移し、上記のTey et al. (2007)および上記のDi Stasi et al. (2011)によって開示されるｉＣａｓｐ９自殺スイッチをコードするＧａｌ－Ｖレトロウイルスベクターを形質導入する。ＩＬ－２を２００Ｕ／ｍＬで添加する。
・ ６日目、細胞を処理して、残存しているレトロウイルス粒子（上清）を除去し、培地中に細胞１０６個／ｍＬで２００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２と共に再懸濁させた。培養を３７℃、５％ＣＯ２で継続する。
・ ８日目、形質導入した細胞を、再度Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）システムを使用してＣＤ１９発現に基づいてＭＡＣＳによって選択する。ＣＤ１９＋細胞を上記と同様にバッグ中で、さらなるＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍＬ）と共に細胞１０６個／ｍＬで培養する。
・ ９日目、細胞を採取し、遠心分離機においてＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（Rizoli (2011) J Trauma 70(5 Suppl) S17-8）によって洗浄し、同種レシピエントによって必要とされるまで－１３０℃での貯蔵のために凍結保存培地中に再懸濁する。
・ しかし、９日目で細胞数が適切でなかった場合（例えば、意図される処置にとって細胞が少なすぎる場合）、培養を最大１５日まで継続した後、採取することができる。
【0130】
このように、Di Stasi et al. (2011)、上記と比較して重要な差は、細胞がかなり早期に活性化されること、例えばＩＬ－２および抗ＣＤ３が５日目ではなくて１日目に培養に添加される点である。その上、抗ＣＤ２８抗体を１日目に使用する。
【0131】
このプロセスによって得られた細胞は、最初のドナー細胞よりかなり低いＣＤ４＋／ＣＤ８＋比を有し（ＣＤ４＋細胞の大多数からＣＤ８＋細胞の大多数への変化）、このためプロセスはＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋細胞に関して富化する。その上、それらは以前のｉｎ ｖｉｖｏ試験において観察された頻度より少ない頻度で同種移植レシピエントにおいてＧＶＨＤを生じることが見出されている。理論に拘束されたくはないが、このリスクの低減は、ＧＶＨＤとＣＤ４＋細胞との間の連結が報告されているため（例えば、Coghill et al. (2011) Blood 117:3268-76）および／またはＴ細胞の調製プロセスがｉｎ ｖｉｖｏでさらに増大するその潜在性を制限するｉｎ ｖｉｔｒｏでの増大を伴うためであり得る。
（実施例２）
同種Ｔ細胞におけるｉＣ９の示差的発現はリミドゥシドに対する曝露後の活性化Ｔ細胞の選択的枯渇を可能にし、ｉｎ ｖｉｖｏでの同種細胞枯渇を可能にする。
（実施例２）
同種Ｔ細胞におけるｉＣ９の示差的発現はリミドゥシドに対する曝露後の活性化Ｔ細胞の選択的枯渇を可能にし、ｉｎ ｖｉｖｏでの同種細胞枯渇を可能にする。
【0132】
実施例１において調製したＡＯＳ－１細胞は、幹細胞移植後のウイルスおよび腫瘍特異的免疫を提供することができる。ＧＶＨＤの場合、リミドゥシドによるｉＣ９の活性化は、同種反応性Ｔ細胞の急速な殺滅およびＧＶＨＤの寛解をもたらす。しかし、遺伝子改変Ｔ細胞は宿主において再度増大することができる。本実施例は、同種ｉＣ９改変Ｔ細胞によって処置した患者における示差的アポトーシスを理解するために、Ｔ細胞サブセットを評価し、トランスジーン発現とリミドゥシド感受性との間の関連を評価する。
【0133】
結果は、ｉＣ９によるＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇が、Ｔ細胞の活性化状態によって調節されるトランスジーン発現レベルに依存することを示している。高度に活性化された同種反応性Ｔ細胞は、ｉＣ９のより高いレベルを発現し、これによってそれらはリミドゥシド誘導アポトーシスに対してより感受性となり、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞を選択的に枯渇するが宿主自身のＴ細胞を保存するように作用する。これらの結果は、十分なｉＣ９トランスジーン発現が、リミドゥシドによって誘導されるアポトーシスを誘発するための重要なエレメントであることを示している。同様に、アポトーシスは、ｉＣ９発現の強度に相関することも観察された。最高のトランスジーン発現細胞を選択することによって、完全な二量体化剤依存的除去を達成することができるであろう。除去は、Ｔ細胞活性化によって増強することができる。ｉＣ９トランスジーン発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再活性化によってアップレギュレートすることができ、このように、リミドゥシドの存在下でアポトーシスの誘発を可能にする。低いｉＣ９を有する集団は、ＴＣＲ活性化によって除去されるより大きい効力を有する。このことは、ＡＯＳ－１が高度に活性化される場合、リミドゥシドによってさらに除去される可能性があることを示している。
プラスミド、レトロウイルス、およびレトロウイルス形質導入
プラスミド、レトロウイルス、およびレトロウイルス形質導入
【0134】
安全スイッチシステムは、カスパーゼ－９および切断型ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）に連結し、遺伝子改変Ｔ細胞（ＳＦＧ－ｉＣ９－ΔＣＤ１９）の選択を可能にする突然変異したＦＫＢＰ１２結合タンパク質である。リミドゥシドに対する曝露は、タンパク質の二量体化を引き起こし、改変Ｔ細胞のアポトーシスが起こる。ＳＦＧ－ｉＣ９－ΔＣＤ１９は、Ｔ細胞活性化および増大方法、ならびにＳＦＧ－ｉＣ９－ΔＣＤ１９構築物を導入するためのレトロウイルス形質導入法と共に、以前に記載されている（上記のDi Stasi et al. (2011)；上記のTey et al. (2007)）。
免疫表現型解析、スペクトル型決定、ウェスタンブロット、およびＰＣＲ
免疫表現型解析、スペクトル型決定、ウェスタンブロット、およびＰＣＲ
【0135】
リミドゥシド誘導アポトーシスの感受性に対するトランスジーン発現レベルの効果を評価するために、ＡＯＳ－１ Ｔ細胞を抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３によって染色し、ＣＤ１９染色の強度に基づいて３つの等しい集団に選別した（ＣＤ１９ｈｉｇｈ、ＣＤ１９ｍｅｄ、およびＣＤ１９ｌｏｗ）。アポトーシスを測定するために、細胞５×１０５個を４８ウェルに播種し、４時間アッセイにおいてリミドゥシドを１０ｎＭの濃度で添加した。表現型解析および機能的アッセイ（例えば、アポトーシス）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を使用してＴ細胞再活性化の前後でフローサイトメトリー、ｑＰＣＲ、およびウェスタンブロットによって実施した。細胞の表現型を、フローサイトメトリー解析のために抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ４５ＲＯ、および抗ＣＣＲ７抗体によって細胞を染色することによって決定した。最終分化エフェクターメモリー細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－として定義される。エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－として定義される。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋として定義される。ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋として定義される。Ｔ細胞受容体レパートリーの多様性を、フローサイトメトリーによって評価した。
Ｉｎ Ｖｉｖｏ試験
Ｉｎ Ｖｉｖｏ試験
【0136】
ルシフェラーゼを同時発現する対照または遺伝子改変Ｔ細胞のＮＳＧマウスへのｉ．ｖ．注射によって、ｉｎ ｖｉｖｏ試験を実施した。１×１０７個のＥＧＦＰｌｕｃ＋ｉＣ９－Ｔ細胞を、ＮＳＧマウスに注入した。Ｔ細胞の生物発光を、注入の２および２４時間後に測定し、その後滴定用量のリミドゥシドまたはプラセボ（対照薬）のｉ．ｐ．注射を行った。動物に、対照薬（テムシロリムス；１ｍｇ／ｋｇ）、リミドゥシド（０．００１～１ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクルのいずれかを投与した。残存しているＴ細胞の生物発光を薬物投与の６、２４、および４８時間後に測定した。生物発光イメージングおよびフローサイトメトリーを実施して、ｉＣ９活性化後のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を評価した。
結果
結果
【0137】
形質導入およびＣＤ１９選択後のＡＯＳ－１細胞の純度は、９５％であった（図１Ａ）。ＣＤ１９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づくＡＯＳ－１細胞の選別によって、ＣＤ１９ ｈｉｇｈ、ｍｅｄｉｕｍ、およびｌｏｗ選別集団に関してそれぞれ、７３、４６、および２２のＣＤ１９ ＭＦＩを得た（図１Ｂ）。図２は、これらの細胞におけるＣＤ８およびＣＤ４区画の％に有意差がなかったことを示している。図３は、ｉＣ９－ΔＣＤ１９ｌｏｗ発現細胞がｉＣ９－ΔＣＤ１９ｈｉｇｈより少ない最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）細胞およびｉＣ９－ΔＣＤ１９ｈｉｇｈより多くのナイーブ様の細胞（それぞれ、２８±６％対３９±８％（ＴＥＭＲＡ）、および５７±９％対４２±１２％（ナイーブ）、Ｐ＜０．０５）を含有したことを示す。これはＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの間で一貫した（図４）。
【0138】
４時間アポトーシスアッセイにおいて、殺滅効率は、ｉＣ９－ΔＣＤ１９ｌｏｗにおいて、非選別またはｉＣ９－ΔＣＤ１９ｈｉｇｈ細胞と比較して有意に減損した（それぞれ、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１）。図５は、ＣＤ１９細胞の高いＭＦＩの９５％より多くが４時間以内にアポトーシスを経験したことを示しており、殺滅有効性の中央値は選別されたｈｉｇｈ、ｍｅｄｉｕｍ、およびｌｏｗ細胞において９２％、８７％、および６９％である。図６および７は、アポトーシスがｉＣ９－ΔＣＤ１９トランスジーン発現の強度と相関することを示している。図８は、ｉＣ９－ΔＣＤ１９ｌｏｗ細胞がまた、ウェスタンブロットによって測定した場合により少ないカスパーゼ－９タンパク質も発現し、カスパーゼ－９タンパク質のレベルがリミドゥシド感受性の減少と相関することを示している。このように、ｉＣ９の十分な発現は、アポトーシスを誘発するために必須である。低いＣＤ１９発現集団は、より低いカスパーゼ－９タンパク質を有し、ＣＤ１９発現がアポトーシスを誘発するための重要なエレメントであるｉＣ９タンパク質レベルと相関することを示している。図９は、アポトーシスが、ｉＣ９－ΔＣＤ１９トランスジーン発現の強度と相関することを示している。加えて、ゲノムＤＮＡ １μｇあたりのベクターコピー数（ＶＣＮ）には、ｈｉｇｈおよびｍｅｄｉｕｍ ＣＤ１９＋集団の間で統計学的な差が存在し（＊Ｐ＝０．０４７）、より高いＣＤ１９ ＭＦＩを有するｉＣ９発現細胞は、図１０に示すようにより大きいＶＣＮを有するように思われ、これは異なる細胞サブセットにおいてｑＰＣＲによって測定したゲノムＤＮＡ １μｇあたりのＶＣＮを示す。
【0139】
動物試験から、０．００１ｍｇ／ｋｇリミドゥシドによって処置したマウスにおいてさえもＣＤ１９のＭＦＩの用量依存的な減少が示され、ｉＣ９－ΔＣＤ１９ｈｉｇｈＴ細胞の優先的殺滅およびｉＣ９－ΔＣＤ１９ｌｏｗＴ細胞の保存を実証した（図１６～１８）。しかし、ｉＣ９－ΔＣＤ１９トランスジーン発現は、レトロウイルスＬＴＲプロモーターによって調節され、Ｔ細胞の活性化状態に対して感受性であることから、本発明者らは、ＣＤ２５、ＣＤ２９、およびＰＤ－１マーカーを使用してＴＣＲ架橋後の活性化状態、およびＣＤ１９を使用してトランスジーンレベルを測定した。図１１は、ｅｘ ｖｉｖｏ刺激時のＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＰＤ－１のアップレギュレーションを示す。図１２は、ｅｘ ｖｉｖｏ刺激時のＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＰＤ－１のアップレギュレーションを示す。図１３Ａ～Ｃは、非刺激ｉＣ９－ΔＣＤ１９がトランスジーン発現に基づいて示差的な殺滅を示したが（ｈｉｇｈ、ｍｅｄｉｕｍ、およびｌｏｗ ｉＣ９－ΔＣＤ１９に関してそれぞれ、８６％、７６％、および５０％）、再活性化は、リミドゥシドに曝露すると、トランスジーンＭＦＩを増加させ、全ての画分におけるアポトーシスを９０％より多く増加させた。ｌｏｗ－ＣＤ１９選別細胞では、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化後、ＣＤ１９＋特異的殺滅は４６％から９７％に増加し（図１３Ａおよび１３Ｂ）、ＣＤ１９の平均ＭＦＩは８倍増加した（図１３Ｃ）。これは、カスパーゼ－９タンパク質レベルと一貫し、トランスジーン発現を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再活性化されるとアップレギュレートすることができ、これはリミドゥシドの存在下でアポトーシスの誘発を可能にする（図１４Ａ）。図１４Ａはまた、細胞を活性化した場合のｉＣ９レベルの増加が抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ－２の発現の減少と相関することも示している。図１４Ｂは、活性化時のナイーブおよびメモリー集団の転換を示す。併せて考慮すると、これらの結果は、Ｔ細胞活性化とトランスジーン発現との関係を確認する。
【0140】
図１５～１７は、ｉＣ９－ＥＧＦＰＴ細胞が、薬物投与の６時間後に効率的に除去されたこと、および細胞が低用量群（０．０１ｍｇ／ｋｇ）において２４時間および４８時間でさらに枯渇されたことを示している。処置の２４時間および４８時間後に、１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、および０．０１ｍｇ／ｋｇを投与したマウスにおいてＢＬＩの有意な減少を認める（Ｐ＜０．００１）。１ｍｇ／ｋｇのリミドゥシドを投与したマウスにおけるｉＲＣ９－Ｔ細胞の相対的な全光子束は、６時間、２４時間、および４８時間でそれぞれ、９６％、９８．１％、および９８．１％低減された。０．１ｍｇ／ｋｇリミドゥシドによって処置したマウスでは、６時間、２４時間、および４８時間でそれぞれ、９２．５％、９５．５％、および９５．３％の低減が観察された。０．０１ｍｇ／ｋｇリミドゥシドによって処置したそれらのマウスでは、６時間、２４時間、および４８時間でそれぞれ、８２．５％、９０．５％、および９０．５％の低減が観察された（Ｐ＜０．００１）。リミドゥシドによって誘導された殺滅スイッチの最大の除去効果は、薬物の投与後２４時間で達成された。平均輝度の値を、以下の式を使用して各マウスにおける最初の輝度に対して正規化した：Ｄ平均輝度＝１００＊［時点「Ｘ」の輝度］／［時点「０」の輝度］。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して、異なる時点での複数の群間のＴ細胞輝度の差の統計学的有意性を評価した。
【0141】
図１８は、ｉＣ９が最も高度に発現する、最も高度に形質導入されたＴ細胞を選択的に除去したことを示す。図１８は、薬物処置の４８時間後の脾臓から採取した細胞のフローサイトメトリー解析を描写する。左のパネルは、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞（ｉＣ９＋Ｔ細胞）が、ビヒクル群と比較して０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇリミドゥシドによる処置後に有意に除去されたことを実証する（ｐ＜０．００１）。各群においてそれぞれ、９９．６％、９８．６％、および８９．６％の低減が観察された。図１８の右のパネルは、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞におけるＣＤ１９のＭＦＩを示す。以前のデータと一貫して、処置した群の各々においてＣＤ１９のＭＦＩの用量依存的減少が観察された。
（実施例３）
骨髄悪性疾患の処置のためにハプロタイプ同一の幹細胞移植を受けた子供における養子移入後のｉｃ９を発現する同種Ｔ細胞の特徴付け
（実施例３）
骨髄悪性疾患の処置のためにハプロタイプ同一の幹細胞移植を受けた子供における養子移入後のｉｃ９を発現する同種Ｔ細胞の特徴付け
【0142】
同種ドナーＴ細胞の養子移入は、腫瘍細胞上の白血病関連抗原（ＬＡＡ）の認識またはアロ反応性を通した血液悪性疾患の有効な処置であり得る。しかし、同種反応性Ｔ細胞はまた、ＧｖＨＤを引き起こし得ることから、免疫療法としてのその使用が制限される。ＧｖＨＤを最小限にしながら同種Ｔ細胞の抗腫瘍効果を利用するために、本発明者らは、リミドゥシドに対する曝露後にアポトーシスを誘導するｉＣ９安全スイッチを有するドナーＴ細胞を遺伝子改変した。本明細書において、本発明者らは、これらのＡＯＳ－１細胞が、骨髄悪性疾患の処置のためにα／βＴＣＲおよびＣＤ１９を枯渇させたハプロタイプ同一のＨＳＣＴを受けた子供において持続し、増大し、および機能的ＬＡＡ特異的Ｔ細胞を含有することを示している。
【0143】
結果は、ｉＣ９安全スイッチによって操作された同種ＡＯＳ－１Ｔ細胞がハプロＨＳＣＴを受けた患者への養子移入後に生着して増大し、長期間の存続を実証することを示している。ＡＯＳ－１産物内のＬＡＡ特異的Ｔ細胞およびアロ反応性Ｔ細胞は、注入後の末梢血において検出可能であり、おそらく骨髄悪性疾患の除去に寄与する。その上、高レベルのＣＤ１９トランスジーンマーカーを発現する細胞は、低レベルを発現する細胞よりｉｎ ｖｉｖｏでより急速に除去されることが示された。
方法
方法
【0144】
注入前産物（ＡＯＳ－１：ｉＣ９および切断型ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）をコードするバイシストロニックレトロウイルスベクターによって改変されたドナーＴ細胞）および患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、α／βＴ細胞およびＣＤ１９ Ｂ細胞を枯渇したハプロ－ＨＳＣＴ後にＡＯＳ－１（細胞１×１０６個／ｋｇ）を投与した患者１２人（ＡＭＬ（１０）、ＭＤＳ（１）、ＪＭＭＬ（１））から分析した。ｉＣ９およびΔＣＤ１９をコードするレトロウイルスベクターによって改変したＴ細胞を、実施例１に記載するように調製した。
【0145】
ドナー改変Ｔ細胞の生着および存続を、フローサイトメトリーによってＣＤ３およびＣＤ１９の同時発現によって測定した。内因性および遺伝子改変Ｔ細胞をまた、ＣＤ４：ＣＤ８比、メモリー細胞組成（ＴＮ、ＴＣＭ、ＴＥＭ、ＴＥＭＲＡ；ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ）、およびＴ細胞受容体Ｖβ多様性に関して表現型解析する。ＡＯＳ－１産物および処置後試料を、１０ｎＭリミドゥシドに曝露しておよび曝露せずに、ＷＴ１、ＰＲＡＭＥ、ＭＡＧＥ（Ａ１、Ｃ１、Ｃ３）、ＮＥおよびＰＲ３に由来するペプチドプールに対するＩＦＮ－γＥＬＩｓｐｏｔを使用してＬＡＡ特異的Ｔ細胞に関して特徴付けし（５ａａが重複した１５ａａ）、ＡＯＳ－１の抗白血病の関与を決定した。
細胞の調製
細胞の調製
【0146】
ＰＢＭＣを、予め加温した（３７℃）細胞培養培地と共に混合し、４００×ｇ ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。細胞を再懸濁させ、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して計数した。次いで、細胞を再度、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、細胞を培養培地に１×１０６個／ｍＬの濃度で再懸濁させ、各ウェルあたり１００μＬを添加した。
ペプチドおよびＰＨＡの調製
ペプチドおよびＰＨＡの調製
【0147】
２×ペプチドストックまたはＰＨＡ １００μＬを、所望のウェルに添加した。プレートを２分間軽く混合した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２を含むインキュベーターに移し、１８～２４時間インキュベートした。
ＥＬＩＳｐｏｔプレートの調製および顕色
ＥＬＩＳｐｏｔプレートの調製および顕色
【0148】
捕捉抗ＩＦＮγ抗体１００μＬをＰＢＳによって予め湿らせた各ウェルに添加した。次いでプレートを４±３℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＤ－ＰＢＳ ２００μＬによって３回洗浄した。非結合部位を、１０％培養培地を含有するＤ－ＰＢＳ １００μＬによってＢＳＣ中、室温で１２０±１５分間ブロックした。次いでプレートをＤ－ＰＢＳ ２００μＬによって３回洗浄した。Ｄ－ＰＢＳ ２００μＬをウェルに添加した。プレートを、細胞の準備ができるまで室温で放置した。
【0149】
細胞の準備ができた後、プレートをインキュベーターから取り出し、ウェルを水道水で２回すすいだ。次いで、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＤ－ＰＢＳによって５回洗浄した。ウェルおよびウェルの底を蒸留水ですすいだ。１μｇ／ｍｌビオチン－抗ＩＦＮγ抗体１００μＬを添加し、３７℃のインキュベーターにおいて１時間インキュベートした。次いでプレートを上記のように洗浄した。Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－アルカリホスファターゼ１００μＬを各ウェルに添加し、７５分間インキュベートした。次いでプレートを水道水、洗浄緩衝液、および蒸留水で洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液１００μＬを各ウェルに添加し、室温で５～１０分間インキュベートした。プレートを水道水ですすぐことによって反応を停止させた。プレートを室温で風乾させた後、ＥＬＩＳｐｏｔリーダー上で読み取った。
結果
結果
【0150】
ＡＯＳ－１をＨＳＣＴ後２２．５日の中央値で注入した（範囲１２～３４日、患者１人は８９日目に注入し、患者１人は１４７日目に注入した）。ＡＯＳ－１細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９＋）は、患者１２人全てにおいて注入の１～２週間後に末梢血中で検出可能であり、注入の２カ月後に、総ＣＤ３＋Ｔ細胞の２４±１７％のピーク増大存在比率の中央値、および絶対細胞数６６．９±３５．６個／μＬに達し、これは最大２４カ月まで検出することができた（図１９Ａ）。
【0151】
ＡＯＳ－１Ｔ細胞は、ＣＤ８偏向表現型を示したが、内因性のＴ細胞は、よりバランスのとれたＣＤ４：ＣＤ８比を示した（図１９Ｂ、２０、および２１）。ＡＯＳ－１細胞は、ＡＯＳ－１注入の４カ月後に最大絶対数に達した。ＡＯＳ－１は主にそれぞれ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－セントラルおよびエフェクターメモリーＴ細胞であった（図１９Ｂ）。図２０は、ＨＳＣＴの４カ月後のＣＤ３＋ＣＤ１９－Ｔ細胞の平均絶対数が細胞６９７±３９６個／μＬより多く、ＣＤ４＋ＣＤ１９－Ｔ細胞の平均絶対数が、ＨＳＣＴの５カ月後で３０１±７７個／μＬであることを示している。ＣＤ４：ＣＤ８ ＣＤ３＋ＣＤ１９－Ｔの比は、５、６、および１２カ月後でそれぞれ、１．８５、１．６７、および１．４であった。内因性のＴ細胞再構築の時間枠と一致して、絶対ＡＯＳ－１細胞は、ＨＳＣＴ後３～４カ月で最大増大に到達したが、内因性のＴ細胞はなおも回復中であり、ＡＯＳ－１細胞からの抗ウイルスおよび抗腫瘍免疫の有益な効果がウイルス感染症の保護および再発にとってより重要である（図２１）。図２２は、ＨＳＣＴ後の内因性のＮＫおよびＢ細胞の再構築を示す。
【0152】
ＡＯＳ－１産物において、本発明者らは、ＷＴ１、ＰＲＡＭＥ、ＭＡＧＥ、ＮＥ、およびＰＲ３に対して重複するペプチドプールを使用してＥＬＩｓｐｏｔによって、Ｔ細胞注入の２～５カ月後に得た末梢血試料においてＬＡＡ特異的Ｔ細胞を検出した（図２３）。重要なことに、ＬＡＡ反応性は、ｉＣ９活性化リミドゥシドに対する曝露によって大きく減損した（図２３）。さらに、ＴＣＲ Ｖβの使用を測定し、ＡＯＳ－１Ｔ細胞では、ＨＳＣＴの６カ月後に内因性のＴ細胞と比較して高度に偏向したＴＣＲレパートリーが観察され、ＴＣＲクローンの選択および増大を示している（図２５および２６）。ＡＯＳ－１を移植した患者３人を、ＧｖＨＤを制御するためにリミドゥシドによって処置し、末梢血中のＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の急激な減少（６２±１２％）が起こった。リミドゥシドによって処置した患者では、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞は、ＧｖＨＤのさらなる症例なく回復し、ｉＣ９を使用してアロ反応性のＴ細胞クローンがｉｎ ｖｉｖｏで枯渇されたことを示唆している。
【0153】
さらなる実験は、リミドゥシドの投与後のｌｏｗ－ＣＤ１９、ｍｅｄｉｕｍ－ＣＤ１９、およびｈｉｇｈ－ＣＤ１９集団の除去の速度を調べた。図２７は、ＣＤ１９－ｈｉｇｈ細胞（■）が３０分以内に除去され；ＣＤ１９－ｍｅｄｉｕｍ細胞（▲）のレベルが１時間以内にほぼゼロへと低下したが；ＣＤ１９－ｌｏｗ細胞（▼）のレベルはよりゆっくりと低下したことを示している。この効果は、細胞の絶対数（図２７Ａ）および各個別の集団の開始濃度に従って正規化した数（図２７Ｂ）の両方について認められた。
（実施例４）
ベクターコピー数（ＶＣＮ）分析
（実施例４）
ベクターコピー数（ＶＣＮ）分析
【0154】
ベクターコピー数（ＶＣＮ）は、細胞治療産物の臨床的製造からの重要な品質属性の１つであり、実施例１に記載されるように調製したＡＯＳ－１細胞に関して評価した。
方法
方法
【0155】
多重ｑＰＣＲアッセイを設計し、実施例１に記載されるように形質導入した細胞産物特異的トランスジーンおよび参照遺伝子を検出した。比較ΔΔＣＴ法を、特徴付けされたキャリブレーターと共に使用して、試料ＣＴ値を細胞あたりのベクターコピー数に変換する。
【0156】
アッセイを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムにおいて９６ウェルプレートフォーマットで、細胞産物特異的トランスジーンの同時増幅のための適格なプライマー／プローブの組合せを使用し、ｉカスパーゼ９特異的、ＦＡＭ標識、および参照ＴＦＲＣ遺伝子を使用し、ＨＥＸ標識ＴａｑＭａｎプローブを使用してｄｕｐｌｅｘアッセイにおいて実行した。全てのｑＰＣＲ試料を調製し、ＰＣＲワークステーションまたはＢＳＣ内のｑＰＣＲ ９６ウェル反応プレートに移した。
【0157】
非形質導入および形質導入試料から単離したＤＮＡを、ｉカスパーゼ９およびＴＦＲＣ参照遺伝子の検出のために設計された適格なトランスジーンプライマー／プローブの組合せを使用して６回の反復実験でマルチプレックスｑＰＣＲアッセイによって分析する。既知のトランスジーンコピー数を有する特徴付けされたキャリブレーター細胞から単離したＤＮＡを、ＰＣおよびＴＡ試料と共に分析し、これをＶＣＮ計算の参照点とする。各ｑＰＣＲ反応は、５ｎｇの試料ＤＮＡを含有する。ＰＣ試料から単離したＤＮＡを、ｑＰＣＲアッセイの陰性対照とする。
結果
結果
【0158】
実施例１に記載されるように調製したＡＯＳ－１細胞のＶＣＮを分布で示す（図２８）。近似正規分布（正規分布の２つの混合物）は、４．０に近い平均値を有し、範囲は１～７である。変動に関して、これは３標準偏差の分布であり、このことは正規分布の場合、分布から引き出された値の９９．７％が３標準偏差内であることを意味する。外れ値は同定されていない。
（実施例５）
ＡＯＳ－１細胞のＩＦＮγ効力
（実施例５）
ＡＯＳ－１細胞のＩＦＮγ効力
【0159】
実施例１に記載されるように調製したこれらのＡＯＳ－１細胞の機能性を、抗ＣＤ３による刺激時の異なるＩＦＮγ分布を介して測定した。この試験のデータは、カスパーゼ９レトロウイルスベクターによるドナーＴ細胞の形質導入が、日和見感染に対する免疫を提供するその能力を変更しないことを実証している。これはまた、ＡＯＳ－１細胞内に含有されるＴ細胞の機能が正常であることを示唆している。
方法
方法
【0160】
実施例１に記載されるように得たＴ細胞を再懸濁させ、ＣＤ３に対する抗体を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで２４時間活性化した。
【0161】
分泌されたサイトカインを含有する細胞培養上清をアッセイの準備ができるまで－２０℃で凍結し、ＥＬＩＳＡを使用してサイトカイン濃度を決定した。両方のアッセイは、製造元の推奨に従って実施した。
【0162】
Ｃｏｒｎｉｎｇの抗ＣＤ３抗体プレコート９６ウェルフォーマットをＴ細胞活性化のために使用した。プレートを２～８μｇ／ｃｍ２（または０．６４～２．５６μｇ／ウェル）の抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１）によってコーティングした。
【0163】
２つの異なるＡＯＳ－１細胞試料（１Ａおよび１Ｂ）を、１×１０６、０．５×１０６、０．２５×１０６、０．１２５×１０６、および０．０６×１０６個／ｍＬの異なる播種密度で２００μＬ／ウェルで播種し、２４時間活性化した。分泌されたＩＦＮγを含有する上清を収集し、新しい９６ウェル組織培養処置プレートに移し、－２０℃で少なくとも１日凍結した。収集した上清を融解し、細胞培養上清中のＩＦＮγの量を定量するためにＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【0164】
【0165】
Ａ１．遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞および遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む遺伝子改変Ｔ細胞を含む組成物であって、（ｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が自殺スイッチを発現し；（ｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞の約２５％～６０％がナイーブＴ細胞である、組成物。
【0166】
Ａ２．遺伝子改変Ｔ細胞の約３０～６０％がナイーブＴ細胞である、実施形態Ａ１に記載の組成物。
【0167】
Ａ３．遺伝子改変Ｔ細胞の約４２～４９％がナイーブＴ細胞である、実施形態Ａ１に記載の組成物。
【0168】
Ａ４．組成物中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比が２未満である、実施形態Ａ１に記載の組成物。
【0169】
Ａ５．遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％が最終分化エフェクターメモリーＴ細胞であり、および／または遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の５８％以下がナイーブＴ細胞である、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0170】
Ａ６．遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも３０％が最終分化エフェクターメモリーＴ細胞であり、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の５０％以下がナイーブＴ細胞である、実施形態Ａ５に記載の組成物。
【0171】
Ａ７．遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞表面トランスジーンマーカーの所定範囲の発現レベルを示し、範囲が少なくとも１０倍であり、発現レベルがフローサイトメトリーによって測定され、発現レベルが平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として測定される、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0172】
Ａ８．範囲が少なくとも１００倍である、実施形態Ａ７に記載の組成物。
Ａ９．遺伝子改変Ｔ細胞が、トリガー分子に対して所定範囲の感受性を示し、特定の濃度のトリガー分子に対する細胞の曝露が、細胞の少なくとも１０％の死に至るが細胞の少なくとも１０％の生存を可能にする、実施形態Ａ７またはＡ８に記載の組成物。
Ａ９．遺伝子改変Ｔ細胞が、トリガー分子に対して所定範囲の感受性を示し、特定の濃度のトリガー分子に対する細胞の曝露が、細胞の少なくとも１０％の死に至るが細胞の少なくとも１０％の生存を可能にする、実施形態Ａ７またはＡ８に記載の組成物。
【0173】
Ａ１０．組成物中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比が０．５未満である、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0174】
Ａ１１．自殺スイッチがカスパーゼ－９を含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0175】
Ａ１２．自殺スイッチが、ＦＫＢＰ１２領域、ＦＫＢＰ１２バリアント領域、ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）またはＦＲＢバリアント領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0176】
Ａ１３．トリガー分子が、ラパマイシン、ラパログ、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、またはＡＰ１５１０である、実施形態Ａ９～Ａ１２のいずれか１つに記載の組成物。
【0177】
Ａ１４．ＦＫＢＰ１２バリアント領域が、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンからなる群から選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ａ１２に記載の組成物。
Ａ１５．ＦＫＢＰ１２バリアント領域が、２コピーのＦＫＢＰ１２ｖ３６を含む、実施形態Ａ１３に記載の組成物。
Ａ１５．ＦＫＢＰ１２バリアント領域が、２コピーのＦＫＢＰ１２ｖ３６を含む、実施形態Ａ１３に記載の組成物。
【0178】
Ａ１６．遺伝子改変Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0179】
Ａ１７．（ｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が、ΔＣＤ１９マーカーに連結され、レトロウイルス形質導入によってＴ細胞のゲノムに挿入されたｉＣａｓｐ９自殺スイッチを発現し；（ｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞が、フローサイトメトリーによって測定したΔＣＤ１９細胞表面マーカーの発現レベルの少なくとも１０倍の範囲を有し；（ｉｉｉ）組成物が、ＣＤ４＋遺伝子改変Ｔ細胞より多くのＣＤ８＋遺伝子改変Ｔ細胞を含み；（ｉｖ）組成物が、遺伝子改変最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、遺伝子改変エフェクターメモリーＴ細胞、および遺伝子改変セントラルメモリーＴ細胞を含み；（ｖ）遺伝子改変Ｔ細胞の５０％未満がナイーブＴ細胞であり；（ｖｉ）Ｔ細胞が、ヒトドナーから得られ、同種細胞枯渇ステップに供されなかった、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0180】
Ａ１８．遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～１０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【0181】
Ａ１９．遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～７の平均ＶＣＮを有する、実施形態Ａ１８に記載の組成物。
【0182】
Ａ２０．遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約２～６の平均ＶＣＮを有する、実施形態Ａ１８に記載の組成物。
【0183】
Ａ２１．遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞が約２０％～約４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞および約６０％～約８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、
（ｉ）改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、
（ａ）約２５％～約４５％のナイーブ細胞、
（ｂ）約１５％～約３０％のセントラルメモリーＴ（ＣＭ）細胞、
（ｃ）約１５％～約３０％のエフェクターメモリーＴ（ＥＭ）細胞、
（ｄ）約２％～約１５％の最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）細胞
を含み；
（ｉｉ）改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が、
（ａ）約２０％～約６０％のナイーブ細胞、
（ｂ）約１％～約１０％のＣＭ細胞、
（ｃ）約１％～約１５％のＥＭ細胞、および
（ｄ）約１０％～約１５％のＴＥＭＲＡ細胞
を含む、組成物。
（ｉ）改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、
（ａ）約２５％～約４５％のナイーブ細胞、
（ｂ）約１５％～約３０％のセントラルメモリーＴ（ＣＭ）細胞、
（ｃ）約１５％～約３０％のエフェクターメモリーＴ（ＥＭ）細胞、
（ｄ）約２％～約１５％の最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）細胞
を含み；
（ｉｉ）改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が、
（ａ）約２０％～約６０％のナイーブ細胞、
（ｂ）約１％～約１０％のＣＭ細胞、
（ｃ）約１％～約１５％のＥＭ細胞、および
（ｄ）約１０％～約１５％のＴＥＭＲＡ細胞
を含む、組成物。
【0184】
Ａ２２．遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、
（ｉ）組成物中のＴ細胞の約２０％～４０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞であり；
（ｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞であり；
（ｉｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞であり；
（ｉｖ）組成物中のＴ細胞の約５％～４０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物。
（ｉ）組成物中のＴ細胞の約２０％～４０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞であり；
（ｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞であり；
（ｉｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～２０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞であり；
（ｉｖ）組成物中のＴ細胞の約５％～４０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物。
【0185】
Ａ２３．組成物中のＴ細胞の約２０％～３０％がＣＤ８＋ナイーブ細胞である、実施形態Ａ２２に記載の組成物。
【0186】
Ａ２４．組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＣＭ細胞である、実施形態Ａ２２またはＡ２３に記載の組成物。
【0187】
Ａ２５．組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ８＋ＥＭ細胞である、実施形態Ａ２２～Ａ２４のいずれかに記載の組成物。
【0188】
Ａ２６．組成物中のＴ細胞の約１０％～３０％がＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞である、実施形態Ａ２２～Ａ２５のいずれかに記載の組成物。
【0189】
Ａ２７．遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む組成物であって、
（ｉ）組成物中のＴ細胞の約５％～２０％がＣＤ４＋ナイーブ細胞であり；
（ｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＣＭ細胞であり；
（ｉｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞であり；
（ｉｖ）組成物中のＴ細胞の約１％～５％がＣＤ４＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物。
（ｉ）組成物中のＴ細胞の約５％～２０％がＣＤ４＋ナイーブ細胞であり；
（ｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＣＭ細胞であり；
（ｉｉｉ）組成物中のＴ細胞の約１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞であり；
（ｉｖ）組成物中のＴ細胞の約１％～５％がＣＤ４＋ＴＥＭＲＡ細胞である、組成物。
【0190】
Ａ２８．Ｔ細胞の５％～１５％がＣＤ４＋ナイーブ細胞である、実施形態Ａ２７に記載の組成物。
【0191】
Ａ２９．Ｔ細胞の１％～７％がＣＤ４＋ＣＭ細胞である、実施形態Ａ２７またはＡ２８に記載の組成物。
【0192】
Ａ３０．Ｔ細胞の１％～１０％がＣＤ４＋ＥＭ細胞である、実施形態Ａ２７～Ａ２９のいずれかに記載の組成物。
【0193】
Ａ３１．対象を処置する方法であって、先行実施形態のいずれかに記載の遺伝子改変Ｔ細胞の組成物を対象に導入するステップを含む、方法。
【0194】
Ａ３２．対象に薬物を投与するステップを含む、対象を処置する方法であって、（ｉ）対象が、先行実施形態のいずれかに記載の遺伝子改変Ｔ細胞の注入を以前に受けたことがあり；（ｉｉ）薬物が自殺スイッチを誘発し；（ｉｉｉ）薬物が、対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％を殺滅するために十分に高いが対象に存在する遺伝子改変Ｔ細胞の少なくとも１０％が生存するために十分に低い用量で送達される、方法。
【0195】
Ａ３３．遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死に至ることができる自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ナイーブＴ細胞と比較して、最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／またはエフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利な条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセス。
【0196】
Ａ３４．ナイーブＴ細胞と比較して最終分化エフェクターメモリーＴ細胞の富化に有利である、実施形態Ａ３３に記載の方法。
【0197】
Ａ３５．遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）細胞がトリガー分子に曝露された場合に細胞死に至ることができる自殺スイッチの発現を指示できる核酸を、ドナー対象からのＴ細胞に導入するステップ；および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の富化に有利な条件下でＴ細胞を培養するステップを含む、プロセス。
【0198】
Ａ３６．遺伝子改変Ｔ細胞を調製するプロセスであって、（ｉ）活性化濃度のＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体の存在下でドナーＴ細胞を培養するステップ；（ｉｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｉｉｉ）一定期間培養後、自殺スイッチおよび選択可能マーカーの両方をコードするＤＮＡをＴ細胞に導入するステップ；（ｉｖ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖ）選択可能マーカーを発現する細胞を選択するステップ；（ｖｉ）一定期間培養後、さらなるＩＬ－２を添加するステップ；（ｖｉｉ）遺伝子改変Ｔ細胞を採取するステップを含み；但し、ステップ（ｉｖ）および（ｖｉ）が必要に応じたステップである、プロセス。
【0199】
Ａ３７．遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～１０の平均ＶＣＮを有する、実施形態Ａ３３～Ａ３６のいずれか１つに記載のプロセス。
【0200】
Ａ３８．遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞あたり約１～７の平均ＶＣＮを有する、実施形態Ａ３７に記載のプロセス。
【0201】
Ａ３９．ステップ（ｉ）がプロセスの開始時（１日目）に起こる、実施形態Ａ３６に記載のプロセス。
【0202】
Ａ４０．ステップ（ｉｖ）がプロセスの３日目に起こる、実施形態Ａ３６に記載のプロセス。
【0203】
Ａ４１．ステップ（ｖｉ）がプロセスの６日目に起こる、実施形態Ａ３６に記載のプロセス。
【0204】
Ａ４２．プロセスの終了時、細胞の少なくとも５０％が形質導入されて生存している、実施形態Ａ３６～Ａ４１のいずれかに記載のプロセス。
【0205】
Ａ４３．プロセスの終了時、細胞の少なくとも９０％が形質導入されて生存している、実施形態Ａ３６～Ａ４１のいずれかに記載のプロセス。
【0206】
本発明者らの研究は、単なる例として上記で記載されており、本発明の範囲および精神内に留まりながらそれらに改変を行うことができると理解される。
【0207】
本明細書において参照した各々の特許、特許出願、刊行物、および文書の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。上記の特許、特許出願、刊行物、および文書の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることを認めたわけではなく、これらの刊行物または文書の内容または日付に関するいかなる承認も構成しない。その引用は関連する開示の検索を示すものではない。文書の日付または内容に関する全ての声明は、利用可能な情報に基づいており、その精度または正確性を認めたわけではない。
【0208】
本技術の基本的態様から逸脱することなく、前述に改変を行ってもよい。本技術を、１つまたは複数の特定の実施形態を参照して実質的に詳細に記載してきたが、当業者は、本出願に具体的に開示される実施形態に変更を行ってもよく、それでもなおこれらの改変および改善が本技術の範囲および精神に含まれることを認識するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【国際調査報告】