▶ バイオインベント インターナショナル アクティエボラーグの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】新規アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220131BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220131BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220131BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220131BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220131BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220131BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220131BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220131BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/18
C07K16/46
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N7/01
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P31/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K48/00
A61K35/12
A61K35/76
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021523957
(86)(22)【出願日】2019-11-01
(85)【翻訳文提出日】2021-04-30
(86)【国際出願番号】 EP2019080004
(87)【国際公開番号】W WO2020089474
(87)【国際公開日】2020-05-07
(31)【優先権主張番号】18203993.3
(32)【優先日】2018-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520031025
【氏名又は名称】バイオインベント インターナショナル アクティエボラーグ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100185856
【弁理士】
【氏名又は名称】朝倉 栄二
(72)【発明者】
【氏名】ビョルン フレンデウス
(72)【発明者】
【氏名】イングリッド テイゲ
(72)【発明者】
【氏名】リンダ モルテンソン
(72)【発明者】
【氏名】ペトラ ホルムコビスト
(72)【発明者】
【氏名】モニカ センリヒ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB311
4C084ZB312
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB44
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG04
4C085GG06
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA04
4C087CA09
4C087CA12
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB31
4C087ZC75
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA40
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
標的細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合し、それによってＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２への結合を遮断するとともにＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断する新規アンタゴニスト抗体分子が記載され、この抗体分子はＦｃ領域を介してＦｃ受容体にも結合する。癌または細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療におけるそのような抗体分子の使用も記載されている。
【選択図】図８
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合し、それによってＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２への結合を遮断するとともにＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断するアンタゴニスト抗体分子であって、前記抗体分子がそのＦｃ領域を介してＦｃγ受容体にも結合する、アンタゴニスト抗体分子。
【請求項2】
前記抗体が、抑制性Ｆｃγ受容体よりも活性化Ｆｃγ受容体に対してより高い親和性で結合する、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項3】
前記抗体分子のＴＮＦＲ２への前記結合が、病変組織におけるＴＮＦＲ２発現細胞の数および／または頻度の変化をもたらす、請求項１または２に記載の抗体分子。
【請求項4】
前記抗体分子のＴＮＦＲ２への前記結合が、病変組織へのＴ細胞および／もしくは骨髄性細胞の浸潤ならびに／または病変組織におけるＴ細胞および／もしくは骨髄性細胞の組成の変化をもたらす、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項5】
前記抗体分子が、フルサイズ抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびＦｃ領域を介してＦｃ受容体に結合する能力を保持するそれらの抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項6】
ヒトＴＮＦＲ２（ｈＴＮＦＲ２）に、および／またはカニクイザルＴＮＦＲ２（ｃｍＴＮＦＲ２）に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項7】
前記抗体分子が、ヒトＩｇＧ抗体分子、ヒト化ＩｇＧ抗体分子およびヒト由来のＩｇＧ抗体分子からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項8】
前記抗体分子がヒトＩｇＧ１抗体である、請求項７に記載の抗体分子。
【請求項9】
前記抗体分子が、活性化Ｆｃガンマ受容体への結合を改善するように操作されている、請求項７または８に記載の抗体分子。
【請求項10】
前記抗体分子がモノクローナル抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項11】
前記抗体分子が、配列ＫＣＳＰＧを含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合しない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項12】
前記抗体分子が、ＣＤＲであるＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３のうちの１～６個を含む抗体分子からなる群から選択され、存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１、９および１７からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号２、１０および１８からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号３、１１および１９からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号４、１２および２０からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号５、１３および２１からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号６、１４および２２からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項13】
前記抗体分子が、以下のＣＤＲ：（ｉ）配列番号１、配列番号２および配列番号３、もしくは
（ｉｉ）配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９を含む可変重鎖（ＶＨ）を含み、かつ／または、前記抗体分子が、以下のＣＤＲ：
（ｉ）配列番号４、配列番号５および配列番号６、もしくは
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項14】
前記抗体分子が、配列番号７、１５および２３からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列を含み、かつ／または、前記抗体分子が、配列番号８、１６および２４からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項15】
前記抗体分子が、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体分子と、ＴＮＦＲ２への結合について競合することができる抗体分子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項16】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項17】
請求項１６に記載のヌクレオチド配列を含む、プラスミド。
【請求項18】
請求項１６に記載のヌクレオチド配列または請求項１７に記載のプラスミドを含む、ウイルス。
【請求項19】
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載のウイルス。
【請求項20】
請求項１６に記載のヌクレオチド配列、請求項１６に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のウイルスを含む、細胞。
【請求項21】
医薬において使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１６に記載のヌクレオチド配列、請求項１７に記載のプラスミド、請求項１８もしくは１９に記載のウイルス、および／または請求項２０に記載の細胞。
【請求項22】
癌または細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療において使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１６に記載のヌクレオチド配列、請求項１７に記載のプラスミド、請求項１８もしくは１９に記載のウイルス、および／または請求項２０に記載の細胞。
【請求項23】
治療される患者が、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者である、請求項２２に記載の使用のための抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞。
【請求項24】
癌の治療において、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、と組み合わせて使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１６に記載のヌクレオチド配列、請求項１７に記載のプラスミド、請求項１９に記載のウイルス、および／または請求項２０に記載の細胞。
【請求項25】
癌もしくは細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療において使用するための薬学的組成物を製造するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１６に記載のヌクレオチド配列、請求項１７に記載のプラスミド、請求項１８に記載のウイルス、および／または請求項２０に記載の細胞の使用。
【請求項26】
前記薬学的組成物が、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者における癌または感染の治療に使用するためのものである、請求項２５に記載の使用。
【請求項27】
前記薬学的組成物が、前記癌の治療に使用するためのものであり、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、と組み合わせて投与される、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項28】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１６に記載のヌクレオチド配列、請求項１７に記載のプラスミド、請求項１８もしくは１９に記載のウイルス、および／または請求項２０に記載の細胞、ならびに、任意選択的に、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクルおよび／または賦形剤を含むかまたはそれらからなる薬学的組成物。
【請求項29】
癌または細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療において使用するための、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項30】
前記癌の治療において、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、を含む薬学的組物と組み合わせて使用するための、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項31】
患者における癌または細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１６に記載のヌクレオチド配列、請求項２０に記載のプラスミド、請求項２１または２２に記載のウイルス、請求項２３に記載の細胞、または請求項２９に記載の薬学的組成物の治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項32】
前記患者が、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
また、治療有効量のチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、が前記患者に投与される、請求項３１または３２に記載の癌の治療方法。
【請求項34】
前記チェックポイント抑制剤がＰＤ－１である、請求項２４に記載の使用のための抗体分子、請求項２４に記載の使用のためのヌクレオチド配列、請求項２４に記載の使用のためのプラスミド、請求項１９に記載のウイルス、請求項２４に記載の使用のためのウイルス、請求項２４に記載の使用のための細胞、請求項２７に記載の使用、請求項３０に記載の薬学的組成物、または請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記チェックポイント抑制剤がＰＤ－Ｌ１である、請求項２４に記載の使用のための抗体分子、請求項２４に記載の使用のためのヌクレオチド配列、請求項２４に記載の使用のためのプラスミド、請求項１９に記載のウイルス、請求項２４に記載の使用のためのウイルス、請求項２４に記載の使用のための細胞、請求項２７に記載の使用、請求項３０に記載の薬学的組成物、または請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
前記癌が固形癌である、請求項２２、２３、２４、３４もしくは３５に記載の使用のための抗体分子、請求項２２、２３、２４、３４もしくは３５に記載の使用のためのヌクレオチド配列、請求項２５、２６、３４もしくは３５に記載の使用のためのプラスミド、請求項２５、２６、３４もしくは３５に記載の使用のためのウイルス、請求項２２、２３、２４、３４もしくは３５に記載の使用のための細胞、請求項２５、２６、２７、３４もしくは３５に記載の使用、請求項２９、３０、３４もしくは３５に記載の薬学的組成物、または請求項３１、３２、３３、３４もしくは３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的細胞上の腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）に特異的に結合し、それによりリガンドＴＮＦ－αがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断し、またＴＮＦＲ２シグナル伝達も遮断する新規アンタゴニスト抗体分子であって、当該抗体分子がＦｃ領域を介してＦｃ受容体にも結合する、新規アンタゴニスト抗体分子に関する。本発明はまた、癌または細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療などの医薬におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）およびＣＤ１２０ｂとしても既知である、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体２（ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ－２またはＴＮＦＲＩＩ）は、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－αまたはＴＮＦα）に結合する膜受容体である。すなわち、Ｔ細胞、単球およびマクロファージの表面に見られ、核因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）を介してＴＮＦＲ２受容体発現細胞の増殖を活性化することができる。特に、ＴＮＦＲ２は、癌、特に腫瘍浸潤免疫細胞（制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋細胞傷害性エフェクターＴ細胞など）およびさまざまな骨髄性細胞亜集団において高度に上方制御される。
【0003】
ＴＮＦＲ２は、癌免疫療法の有望な標的として議論されており、腫瘍内Ｔｒｅｇおよび多くのヒト腫瘍細胞の表面で高度に発現していると説明されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＳ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７（４２）：６８２７８－６８２９１；Ｖａｎａｍｅｅ ＥＳ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７，ｖｏｌ．２３，ｉｓｓｕｅ １１，１０３７－１０４６，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１７｜Ｖｏｌｕｍｅ ８｜Ａｒｔｉｃｌｅ １４８２，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１８ Ｊａｎ ２；１１（５１１）。
【0004】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞、ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇと呼ばれることもあり、以前は抑制性（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）Ｔ細胞または抑制性制御性Ｔ細胞として既知であった）は、通常の免疫環境下および病理学的な免疫環境下で他の免疫細胞を抑制することが可能であるＴ細胞の亜集団を構成する。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４陽性細胞（ＣＤ４＋細胞）である。Ｔｒｅｇではない他のＣＤ４＋Ｔ細胞があるが、ただし、非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞は、ＦＯＸＰ３陰性（ＦＯＸＰ３－）であるのに対し、ＴｒｅｇはまたＦＯＸＰ３陽性（ＦＯＸＰ３＋）であるという点で、Ｔｒｅｇは非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞から分離できる。また、非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋またはＣＤ２５＋ＣＤ１２７＋のいずれかであるのに対し、ＴｒｅｇはまたＣＤ２５＋ＣＤ１２７陰性／低であるという点で、Ｔｒｅｇは非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞から分離できる。
【0005】
ＴＮＦＲ２はまた、自己免疫疾患（Ｆａｕｓｔｍａｎ ＤＬ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：４７８，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６ Ｊａｎ ８；５（１）：Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６ Ｍａｙ ４；３６（１８）：５１２８－４３）および炎症性疾患（Ａｉｔ－Ａｌｉ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００８ Ｊｕｎ；１４９（６）：２８４０－５２，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６ Ｓｅｐ ７；６：３２８３４）に関連して論じられている。
【0006】
さまざまな特性を有する異なるタイプの抗ＴＮＦＲ２抗体も以前に記載されている。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｏｃｔ １８；７（４２）：６８２７８－６８２９１）は、リガンド遮断およびリガンド非遮断アゴニスト抗体の両方について記載している。
【0007】
ＷＯ２０１４／１２４１３４は、ＣＤ４＋ＣＤ２５高Ｔｒｅｇに富む組成物のインビトロ産生のためのアゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体および／またはＮＦ－κＢアクチベーターなどのＴＮＦＲ２アゴニストの使用を開示している。この組成物は、患者の免疫障害または感染症の治療に有用であると言われている。ＷＯ２０１４／１２４１３４はさらに、ＴＮＦＲ２の１つまたは２つのエピトープに結合することができるＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体を開示している。これらのエピトープの最初のエピトープは配列ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣを含み、２番目のエピトープはヒトＴＮＦＲのアミノ酸における１つの特定の位置に１つの特定のアミノ酸を含んでいた。この２番目のエピトープは配列ＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦを含み得る。このようなＴＮＦＲ２アンタゴニストは、リンパ球が豊富で、Ｔｒｅｇが枯渇した組成物を製造するのに有用であると言われている。このＰＣＴ出願に由来する登録された米国特許第９，８２１，０１０号において、アンタゴニスト抗体は、配列ＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦを含むエピトープなどの配列ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ内のエピトープに選択的に結合するものとして特定されている。ＴＮＦＲ２アンタゴニスト、およびＴＮＦＲ２アンタゴニストを使用して製造される組成物は、癌または感染症などの増殖性障害の治療に有用であると言われている。
【0008】
ＷＯ２０１６／１８７０６８は、ＴＮＦＲ２などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーに拮抗することができる抗体を開示している。抗体は、増殖性障害および感染症の治療のための免疫療法などで、Ｔｒｅｇを調節するのに有用であると言われている。特に、ＷＯ２０１６／１８７０６８は、ヒトＴＮＦＲ２の特定のエピトープに結合するアンタゴニストＴＮＦＲ２抗体を開示し、かつ、そのような抗体のいくつかの特定のＣＤＲ配列を提示している。ＷＯ２０１６／１８７０６８のデータは、アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体のＦａｂ領域のＴＮＦＲ２への特異的結合が、これらの抗体のＦｃ領域の非特異的結合ではなく、Ｔｒｅｇ細胞増殖の調節に関与している可能性が高いことを示していると言われている。
【0009】
ＷＯ２０１７／０４０３１２は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を促進し、Ｔｒｅｇの増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に影響を与えることができる抗ＴＮＦＲ２抗体、特にアゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体を開示している。ＷＯ２０１７／０４０３１２は、配列ＫＣＳＰＧを含むエピトープに特異的に結合するが、配列ＫＣＲＰＧを含むエピトープには結合しない（したがって上記ＵＳ９，８２１，０１０の抗体は除外される）、あるいは別のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーには結合しない抗体を開示している。アゴニスト抗体は免疫疾患の治療に有用であると言われている。ＷＯ２０１７／０４０３１２はさらに、ヒトＴＮＦＲ２の完全な配列を提示している。
【0010】
ＷＯ２０１７／０８３５２５は、抗ＴＮＦＲ２抗体を含む薬理学的組成物、および癌などのＴＮＦ－αおよび／またはＴＮＦＲ２に関連する障害の治療におけるそれらの使用について論じている。ＷＯ２０１７／０８３５２５は、Ｆｃγ受容体への結合がヌルであるヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体、およびＴｒｅｇの増殖の抑制についてさらに論じている。
【0011】
ＷＯ２０１７／１９７３３１は、特定の配列を有する相補性決定領域重鎖３を含むアンタゴニストＴＮＦＲ２抗体を開示し、Ｔｒｅｇの増殖の低減もしくは抑制および／またはＴエフェクター細胞の増殖の促進について論じている。
【0012】
Ｆｃ受容体は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、およびナチュラルキラー細胞、およびＢリンパ球などの免疫エフェクター細胞の細胞表面に見られる膜タンパク質である。この名称は、抗体のＦｃ領域へのそれらの結合特異性に由来する。Ｆｃ受容体は細胞膜に見られ、原形質膜または細胞質膜としても既知である。Ｆｃ受容体は、活性化ＦｃγＲと抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）ＦｃγＲに細分することができ、これらは、凝集した免疫グロブリンＧ Ｆｃの結合により細胞の活性化を協調的に制御し、細胞内ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭモチーフを介して活性化または抑制性シグナルを細胞に伝達することが知られている。凝集した免疫グロブリンまたは免疫複合体のＦｃＲ結合は、細胞への抗体の内在化を介在し、抗体介在性食作用、抗体依存性細胞介在性細胞傷害、または抗原提示もしくは交差提示をもたらす可能性がある。ＦｃＲは、抗体に結合した細胞表面受容体の架橋を介在または増強することも知られている。このような架橋は、標的細胞におけるシグナル伝達を活性化する、いくつかの（Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１１．‘Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１０３０－４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７：１７５４－６３）、しかしすべてではない（Ｒｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０１４．‘Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｓ ｐｏｔｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ＦｃＲ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ’，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３：ｅ２８６１０）抗体の能力に必要であることが知られており、治療効果を達成するために必要な場合と必要でない場合がある。
【0013】
Ｆｃ受容体のサブグループは、ＩｇＧ抗体に特異的なＦｃγ受容体（Ｆｃ－ガンマ受容体、ＦｃガンマＲ、ＦｃγＲ）である。Ｆｃγ受容体には、活性化Ｆｃγ受容体（活性化Ｆｃγ受容体とも表される）、および抑制性Ｆｃγ受容体の２種類がある。活性化受容体および抑制性受容体は、それぞれ、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）または免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を介して、それらのシグナルを伝達する。ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）は、抑制性Ｆｃγ受容体であり、一方ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、活性化Ｆｃγ受容体である。ＦｃγｇＲＩＩＩｂは、好中球上で発現するＧＰＩ結合受容体であり、ＩＴＡＭモチーフが欠如しているが、脂質ラフトをクロスリンクし、他の受容体と結合するその能力によっても活性化とみなされる。マウスにおいて、活性化受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶである。
【0014】
抗体がＦｃγ受容体との相互作用を介して免疫細胞活性を調節し得ることは、公知である。具体的には、抗体免疫複合体が免疫細胞の活性化をどのように調節するかは、活性化Ｆｃγ受容体および抑制性Ｆｃγ受容体の相対的な関与によって判定される。異なる抗体アイソタイプは、異なる親和性で活性化Ｆｃγ受容体および抑制性Ｆｃγ受容体に結合し、結果として異なるＡ：Ｉ比率（活性化：抑制の比率）をもたらす（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５ Ｄｅｃ ２；３１０（５７５３）：１５１０－２）。
【0015】
抑制性Ｆｃγ受容体に結合することにより、抗体は、エフェクター細胞機能を抑制、遮断、および／または下方調節することができる。抑制性ＦｃγＲに結合することにより、抗体は、標的細胞上の抗体標的シグナル伝達受容体の凝集により細胞の活性化をさらに刺激することができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１０３０－４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７：１７５４－６３；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１４．‘Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ ｃａｎ ｂｅ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９３：１８２８－３５）。
【0016】
活性化Ｆｃγ受容体に結合することにより、抗体は、エフェクター細胞の機能を活性化し、それによって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン放出、および／または抗体依存性エンドサイトーシス、ならびに好中球の場合、ネトーシス（すなわち、ＮＥＴ（好中球細胞外トラップ）の活性化および放出）などの機構を誘発することができる。活性化Ｆｃγ受容体に結合する抗体も、ＣＤ４０、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ３８、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６などの特定の活性化マーカーの増加を引き起こすことができる。
【0017】
特に、本発明者らによって発表された最近のデータは、治療効果のために、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲにそれぞれ結合するためのＣＤ８ Ｔ細胞アゴニスト抗体およびＴｒｅｇ枯渇抗４－１ＢＢ抗体の重要かつ特異的な依存性を示している（Ｂｕｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，‘Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４－１ＢＢ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ Ｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ’，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１８ ４９（５）：９５８－９７０）。さらに、そして決定的に、ＣＤ８ Ｔ細胞アゴニスト抗体およびＴｒｅｇ枯渇抗４－１ＢＢ抗体の同時投与は、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲそれぞれへの結合に最適化され、治療活性を低下させた。これらのデータは、別個の作用機序を有する抗体の治療活性を最大化するために、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲの適切かつ調整された結合を伴う抗体を開発することが決定的に重要であることを示している。同時に、これらのデータは、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲの結合が最適でないと、治療効果を著しく低減させる可能性があることを示している。
【0018】
これらのデータは、他のＴＮＦＳＲメンバーに対する抗体、特に免疫刺激性抗ＣＤ４０抗体に関する所見とは対照的であり、活性化ＦｃγＲではなく、抑制性ＦｃγＲの結合が絶対的に必要であることを示していたために、驚くべきものであった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１０３０－４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７：１７５４－６３）。まとめると、これらの結果は、ＦｃγＲ依存性が、同じ受容体スーパーファミリーの異なる標的に対する抗体間で、さらには同じ標的に対する異なるタイプの抗体間でさえ、容易には予測できない様式で変化する可能性があるが、治療的使用の抗体を開発する際に理解して利用することが重要である場合があることを示している。
【発明の概要】
【0019】
本発明および並行する発明に至る研究において、強力な治療活性、ならびに異なる特徴および作用機序を有する抗ＴＮＦＲ２抗体の２つの主要な異なるグループが同定された。
【0020】
本発明者らは、ＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２受容体への結合を遮断するアンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体の強力な治療活性を最初に同定した。そのような抗体の活性は、インビボ治療活性について、ＦｃγＲ相互作用、特に活性化ＦｃγＲへの結合に依存することが示された。強力な抗ＴＮＦＲ２治療試薬のこのグループまたはカテゴリーは、１）ＴＮＦ－α（リガンド）誘導性ＴＮＦＲ２シグナル伝達の顕著な遮断および抑制、ならびに２）ＦｃγＲ結合に依存する活性を特徴とし、抑制性ＦｃγＲよりも活性化ＦｃγＲに結合することから最も強く恩恵を受けることが見出された。
【0021】
次に、本発明者らは、インビボで同等に強力な治療活性を有するが、多くの点でその特徴が第１のグループおよび本発明を構成するアンタゴニスト遮断型のＴＮＦＲ２抗体の特徴と反対である抗ＴＮＦＲ２抗体の別個のグループを同定した。この第２のグループの抗ＴＮＦＲ２抗体は、治療活性について、ＴＮＦ－α遮断またはＴＮＦＲ２シグナル伝達の抑制に依存せず、むしろＴＮＦＲ２シグナル伝達の強力な活性化を特徴とする。第１のグループの遮断抗体とはさらに対照的に、第２のグループのアゴニスト抗体は、それらの活性がＦｃγＲ：結合抗体変異体で改善されるとしても、抗体：ＦｃγＲ結合への絶対的な依存を示さない。第１のグループのアンタゴニスト遮断抗体とはさらに対照的に、第２のグループのアゴニスト抗体は、抑制性ＦｃγＲ対活性化ＦｃγＲへの結合が改善された抗体変異体において最大の活性を示す。
【0022】
本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体の第１のグループ、すなわち、ＴＮＦＲ２に特異的に結合することにより、ＴＮＦ－αがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断するとともにＴＮＦＲ２シグナル伝達も遮断するアンタゴニスト抗体分子に関する。これらの抗体分子はまた、Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域を有し、これは、例えばＴｒｅｇの枯渇または腫瘍関連マクロファージの調節などの、ＴＮＦＲ２陽性細胞のＦｃγＲ依存性排除または機能的調節を与えるのに有用である。
【0023】
第２のグループに属するアゴニスト抗体は、本発明のアンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２抗体分子と比較するために、以下の実施例において使用される。実施例では、以下でさらに説明するように、第１または第２のグループのいずれかまたは両方のものと同様のいくつかの特徴を有する他の抗体も比較のために使用される。
【0024】
標的細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合し、それによってＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２への結合を遮断するとともにＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断するアンタゴニスト抗体分子であって、当該抗体分子がそれらのＦｃ領域を介してＦｃγ受容体にも結合する、アンタゴニスト抗体分子に関する。
【0025】
本発明はまた、そのような新規アンタゴニスト遮断抗ＴＮＦＲ２抗体分子の特定の例に関する。
【0026】
本発明はまた、上記抗体分子のうちの少なくとも１つをコードする単離されたヌクレオチド配列に関する。
【0027】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むプラスミドに関する。
【0028】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列またはプラスミドのうちの少なくとも１つを含むウイルスに関する。
【0029】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列のうちの１つ、または上記プラスミドのうちの１つ、または上記ウイルスのうちの１つを含む細胞に関する。
【0030】
本発明はまた、医薬において使用するための上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞に関する。
【0031】
本発明はまた、癌もしくは細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療において使用するための、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞に関する。
【0032】
本発明はまた、癌もしくは細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療において使用するための、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞に関する。
【0033】
本発明はまた、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞のうちの少なくとも１つ、ならびに、任意選択的に、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクルおよび／または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。そのような薬学的組成物は、癌または細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療に使用することができる。
【0034】
本発明はまた、患者における癌または細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療方法であって、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物のうちの少なくとも１つの治療有効量を患者に投与することを含む、方法に関する。
【0035】
本発明はまた、添付の説明、実施例および／または図を参照して本明細書に記載される、抗体分子、使用のための抗体分子、単離されたヌクレオチド配列、使用のための単離されたヌクレオチド配列、プラスミド、使用のためのプラスミド、ウイルス、使用のためのウイルス、細胞、使用のための細胞、使用、薬学的組成物および治療方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0036】
標的細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合し、それによってＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２への結合を遮断するとともにＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断するアンタゴニスト抗体分子であって、当該抗体分子がそれらのＦｃ領域を介してＦｃγ受容体にも結合する、アンタゴニスト抗体分子に関する。
【0037】
本明細書に開示されるアンタゴニスト抗体分子は、ＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２への結合およびＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断する。アンタゴニスト抗体分子がＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２への結合を遮断するということは、本明細書では、受容体ＴＮＦＲ２に結合する抗体分子がリガンドＴＮＦ－αの同じ受容体への結合を妨げることを意味する。これは、実施例３でより詳細に示されている。本明細書に開示されるアンタゴニスト抗体分子がＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断するということは、それらがＴＮＦＲ２介在性細胞活性化を遮断することを意味する。ＴＮＦＲ２を介したＴＮＦ－α介在性シグナル伝達は、核転写因子ＮＦκＢの活性化で終わるシグナル伝達カスケードを開始することが明確に示されている（Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １－ａｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦｋａｐｐａＢ”．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ ３１；３８（３）：２８１－９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＮＦ－ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ Ｓｉｇｎａｌ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ａｐｒ １９；９：７８４）。これにより、細胞が活性化され、いくつかの炎症誘発性因子が合成される。そのうちの１つは、ＮＫ細胞のＩＦＮ－γである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．“ＮＦ－κＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒ．２０１７；２．ｐｉｉ：１７０２３；Ｔａｔｏ ｅｔ ａｌ．“Ｏｐｐｏｓｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ”．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ａｐｒ；１８（４）：５０５－１３）。本明細書では、ＴＮＦＲ２シグナル伝達およびＴＮＦＲ２活性化という用語は交換可能に使用される。
【0038】
抗体分子は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する。抗体が定義された標的分子または抗原に特異的に結合するか、またはそれと相互作用すること、および、これは、抗体が、標的ではない分子ではなく、その標的に優先的かつ選択的に結合することを意味することはよく知られている。「ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子」または「ＴＮＦＲ２特異的抗体分子」とは、用量依存的にＴＮＦＲ２タンパク質に結合するが、無関係のタンパク質には結合しない抗体を意味する。加えて、同じ抗体はＴＮＦＲ２を内因的に発現する細胞に結合し、この結合は同じ細胞を市販のポリクローナルＴＮＦＲ２抗体試薬とプレインキュベーションすることによって遮断することができる。これは、ＴＮＦＲ２がポリクローナル試薬でマスクされている際に非特異性結合を検出できることを示している。これを実施例２に示す。
【0039】
ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子（または抗ＴＮＦＲ２抗体分子）は、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体分子を指す。細胞表面抗原およびエピトープは、免疫学または細胞生物学の当業者によって容易に理解される用語である。
【0040】
タンパク質の結合を評価する方法は、生化学および免疫学の当業者には既知である。当業者であれば、それらの方法を使用して、抗体の標的への結合および／または抗体のＦｃ領域のＦｃ受容体への結合、ならびにそれらの相互作用の相対的な強度、もしくは特異性、もしくは抑制、もしくは防止、もしくは低減を評価することができることを理解するであろう。タンパク質の結合を評価するために使用され得る方法の例は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）がある（抗体特異性に関する考察については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３３２～３３６頁（１９８９）を参照されたい）。
【0041】
本発明に従って遮断抗体が結合するＴＮＦＲ２を発現する標的細胞としては、上記および下記のような免疫細胞および／または腫瘍細胞が挙げられる。本発明によるアンタゴニスト抗体分子のＴＮＦＲ２への結合の効果は、病変組織における細胞の組成変化であり得る。この組成変化は、病変組織におけるＴＮＦＲ２発現細胞の数および／または頻度の変化を通じて起こり得る。例えば、癌における効果としては、腫瘍内Ｔ細胞数の増加、ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇの比率の増加（すなわち、Ｔｒｅｇの数に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の数）、および／または、腫瘍促進特徴とは反対の抗腫瘍特徴に関連する骨髄性細胞数の増加が挙げられる。これは実施例５に示されている。いくつかの実施形態において、これらの効果は、組織Ｔｒｅｇ数の減少、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数の増加、および組織骨髄性細胞サブセットの組成変化をもたらす。本発明によるアンタゴニスト抗体分子の代理（３－Ｆ１０）を用いたインビボ治療発明後の、組織におけるＴＮＦＲ２発現細胞の調節は、実施例５に詳細に示されている。本発明によるヒトアンタゴニスト抗体分子の同様の効果を試験するために、マウスＴＮＦＲ２が欠失し、ヒトＴＮＦＲ２についてトランスジェニックにされたマウスで類似の実験を実施することができる。あるいは、および好ましくは、かなりの時間およびリソースを必要とするが、ヒトＴＮＦＲ２およびヒトＦｃγＲについてトランスジェニックな動物を、以前にＣＤ４０およびｈＦｃγＲについて記載されたものと比較して類似の方法で生成することができる（Ｄａｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６．‘Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＦｃｇａｍｍａＲ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ’，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２９：８２０－３１）。次に、そのようなヒト化ＴＮＦＲ２ ＦｃγＲマウスを同様に使用して、本発明によるヒトアンタゴニスト抗体分子の同様の効果について試験することができる。
【0042】
この文脈において、病変組織とは、腫瘍組織（すなわち、腫瘍細胞、免疫細胞、内皮細胞および間質細胞を含む、腫瘍微小環境内のすべての細胞）または細胞内病原体に感染した組織のいずれかを意味する。
【0043】
抗体分子がＴＮＦＲ２へのリガンド結合を遮断するか否かを判定するために、ＴＮＦＲ２特異的抗体の存在下で固定化されたＴＮＦＲ２受容体に結合したＴＮＦ－αリガンドの量を決定するＥＬＩＳＡアッセイを使用することが可能である。遮断抗体は、リガンドであるＴＮＦ－αが固定化された受容体ＴＮＦＲ２に結合するのを妨げる。これは、以下の実施例３においてより詳細に示され、説明されている。
【0044】
本発明による遮断抗体分子は完全遮断剤であり、さらにＴＮＦＲ２シグナル伝達に拮抗することができる。
【0045】
完全遮断剤は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を９８％超、すなわち最大１００％低減する抗体分子として本明細書で定義される。アイソタイプ対照抗体は、研究中のアッセイにおいていかなる形態でも存在しないタンパク質または他の構造に対して産生された抗体である。アイソタイプ対照は、理想的には、比較する抗体と同じフレームワークであるが、少なくとも同じＦｃ部分を有する。これは当業者には公知である。本明細書で説明する例では、アイソタイプ対照は同じフレームワーク、同じＦｃ部分を有し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に特異的であった。いくつかの実施形態において、完全遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を９９．５％超低減する。
【0046】
他のタイプの遮断剤は、部分遮断剤および弱い遮断剤である。本明細書で使用される場合、部分遮断剤は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を６０～９８％（例えば、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７または９８％、およびその間のすべての少数）低減する抗体分子であり、弱い遮断剤は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を６０％未満、例えば５０～５９．９％（例えば、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または５９．９％、およびその間のすべての少数）低減する抗体分子である。
【0047】
反対に、非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を５０％未満低減する抗体分子である。いくつかの実施形態において、これは、実施例３および図６および７に示されるように、高用量のワンポイントＥＬＩＳＡまたは用量漸増（ｄｏｓｅ－ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡにおいて決定される。
【0048】
部分遮断抗体、弱い遮断抗体および非遮断抗体は、本発明のアンタゴニスト遮断抗体分子と比較するために、実施例において使用される。
【0049】
いくつかの特性および特徴が、抗体の生物学的活性の根底にあり、それを（共）決定することができる。リガンドが受容体に結合するのを遮断する能力に加えて、そのような重要な特性としては、受容体シグナル伝達を調節する、すなわち受容体シグナル伝達を作動させる（ａｇｏｎｉｚｅ）かまたはそれに拮抗する抗体の能力、および治療活性を与えるためのＦｃγＲ相互作用への抗体依存性が含まれる。
【0050】
最初に、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を調節する完全遮断抗体、部分遮断抗体および非遮断抗体の能力を特徴付けた。２つの極端な例（ｅｘｔｒｅｍｅｓ）が同定された。
【0051】
最初の極端な例として、ＴＮＦＲ２へのリガンド結合を完全に遮断し、ＴＮＦ－αが誘導するＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断し、細胞内因的に発現するＴＮＦＲ２に結合してもそれら自体はシグナル伝達を誘導しない抗体を同定した。このグループのリガンド遮断アンタゴニスト抗体は、本発明の基礎を形成する。
【0052】
もう一方の極端な例として、ＴＮＦＲ２へのリガンド結合を遮断しないが、ＴＮＦＲ２に結合すると、内因的に発現する細胞が受容体を作動させる抗体を同定した。この第２のグループの抗体は、別個の発明を構成し、比較のために本明細書に含まれる。
【0053】
部分遮断アゴニスト、部分遮断非アゴニスト、および完全遮断非アンタゴニストによって定義される抗体およびカテゴリーがさらに同定され、抗ＴＮＦＲ２抗体の複雑な生物学および大きな不均一性を示し、本発明の抗体が特有のグループを形成することを明確に示している。
【0054】
抗体がアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するか否かを決定するために、実施例４に記載されるようにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞アッセイを使用することが可能である。簡潔に言うと、ＮＫ細胞はＩＬ－２およびＩＬ－１２刺激に応答してＩＦＮ－γを分泌することが報告されている。可溶性ＴＮＦ－αは内因的に産生され、ＴＮＦＲ２シグナル伝達に対して堅牢であるが最適以下の濃度（約２０～１００ｐｇ／ｍｌ）で存在する。これは、ＩＦＮ－γがＴＮＦＲ２シグナル伝達の調節によって増減する可能性があることを意味する。結果として、ＴＮＦＲ２シグナル伝達の最適濃度でのＴＮＦ－αの外因的添加は、アゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体とのインキュベーションと同様、このアッセイにおけるＩＦＮ－γ濃度を高める（図８Ｃ）。逆に、抗ＴＮＦ－α抗体または本明細書に記載のリガンド遮断アンタゴニスト抗体との共インキュベーションは、このアッセイにおけるＩＦＮ－γ放出を減少させる。したがって、このアッセイを使用して、抗ＴＮＦＲ２抗体のアゴニストまたはアンタゴニスト活性、またはそれらの欠如を同定することができる。（ＴＮＦα Ａｕｇｍｅｎｔｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ ＩＦＮγ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＮＦＲ２．Ａｌｍｉｓｈｒｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．２０１６；８：６１７－６２９）結果として、この実験装置では、アンタゴニスト抗体は、ＴＮＦＲ２発現細胞におけるＴＮＦ－α誘導性シグナル伝達を防ぎ、ＴＮＦＲ２受容体に結合しても、それ自体はＴＮＦＲ２受容体を刺激しない。具体的には、このアッセイにおけるアンタゴニスト抗体は、上記ＮＫ細胞に結合したときにＩＦＮ－γの放出を増加させるのではなく、ＩＦＮ－γの放出を抑制する。図８に示すように、本発明に記載の完全遮断抗体は、このＴＮＦ－α含有ＮＫ細胞アッセイにおいて、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を誘導するのではなく、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を低下させ、その結果、放出されるＩＦＮ－γの量が低減した。したがって、図８、実施例４に示されるように、本発明の抗体は、リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体として分類することができる。培養物中の基礎ＴＮＦ－αレベルが少なくとも２０ｐｇ／ｍｌであることを考慮すると、このアッセイを使用して、アンタゴニスト抗体は、ＩＦＮ－γ放出を＞３０％（例えば、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％）低減する抗体として定義される。このアッセイはＰＢＭＣドナーからの一次細胞を使用するため、少なくとも４体のドナーを含める必要があり、平均値はすべてのドナーから計算すべきである。平均の計算に含まれる各ドナーからの細胞は、アイソタイプ対照での治療と比較して＞１００％（＞２倍）増加したＩＦＮ－γレベルで陽性対照（可溶性ＴＮＦ－α）治療に応答したはずである。
【0055】
アンタゴニスト活性は、ＩＬ－２を介したメモリーＴ細胞の活性化を使用して実証することもできる。ここでの活性化は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５の上方制御によって測定される。このアッセイを使用して、非遮断アゴニストＴＮＦＲ２抗体の添加は、ＣＤ２５発現をさらに上方制御するが、本発明による遮断アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体は、アイソタイプ対照と比較して、ＣＤ２５発現を低減する。これは、本発明のヒト抗体ならびにマウス代理抗体に当てはまり、実施例４に示されている。
【0056】
ＴＮＦＲ２に結合し、それによってＴＮＦ－αの結合およびシグナル伝達を遮断することに加えて、本発明による抗体分子はまた、Ｆｃγ受容体に結合する。治療効果のための本発明の抗体のＴＮＦ－α遮断アンタゴニスト群に属する抗ＴＮＦＲ２抗体のＦｃγＲ相互作用への絶対的な依存が、ＦｃγＲ結合と生産的に結合する、または生産的に結合しない抗体変異体を使用するマウス癌実験モデルにおいて実証された。インビボ治療活性のためのそのようなリガンド遮断アンタゴニスト抗体の絶対的な依存、および最大のインビボ治療活性のための抑制性ＦｃγＲを上回る活性化ＦｃγＲのそれらの優先的結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）／結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）が実施例５に示されている。アゴニスト非遮断抗ＴＮＦＲ２抗体のＦｃγＲ非依存性インビボ活性、および最大の治療活性のための活性化ＦｃγＲを上回る抑制性ＦｃγＲのそれらの異なる優先的結合を実証するデータは、比較および対照目的のためにのみこの実施例に含まれる。まとめると、我々のデータは、いくつかのタイプの抗ＴＮＦＲ２抗体を生成できることを示している。さらに、我々のデータは、どの抗体変異体が治療上最も効果的であるか、それらが遮断アゴニストまたはアンタゴニスト（外因性または内因性）特性に依存するか否か、およびそれらがＦｃγＲ－結合に依存するのか、または活性化または抑制性Ｆｃガンマ受容体への優先的／強力な結合に関連する抗体形式で最も効果的であるのかは些細なことではなく、予測できなかったことを示している。
【0057】
マウスＦｃγＲシステムとヒトＦｃγＲシステムとの間の比較的高い相同性は、種間の保存されたＦｃγＲ介在性メカニズムの一般的な側面の多くを説明している。しかしながら、マウスおよびヒトのＩｇＧサブクラスは、それらの同種のＦｃγＲに対する親和性が異なるため、マウスシステムでのＦｃγＲを介した観察をヒトＩｇＧベースの治療法に変換する際には、抗体、抗体サブクラスおよび／または操作されたサブクラスの変異体を選択することが重要であり、これは、ヒト活性化ＦｃγＲ対抑制性ＦｃγＲへの適切な結合を示している。個々のヒトＦｃγ受容体に対するヒト抗体分子の親和性および／または結合力は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、抑制性Ｆｃγ受容体よりも活性化Ｆｃγ受容体に対してより高い親和性で結合する。抑制性Ｆｃγ受容体よりも活性化Ｆｃγ受容体への親和性が高いため、抑制性Ｆｃγ受容体と比較して、活性化Ｆｃγ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに高い親和性で結合する変異体という意味を含む。
【0058】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、抗体分子のＦｃ領域とＦｃγ受容体との間の通常の相互作用を介してＦｃγ受容体へ結合し得るＩｇＧである。
【0059】
いくつかの実施形態では、アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、ヒトＩｇＧ１である。ヒトＩｇＧ１は、活性化ヒトＦｃγＲＩに対しては高い親和性で結合し、ヒト活性化Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対して、およびヒト抑制性ＦｃγＲＩＩＢに対してはより低い親和性および類似した親和性で結合することがよく知られている。これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して実証されている。
【0060】
いくつかの実施形態において、アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、１つまたはいくつかの活性化Ｆｃ受容体への結合の改善を示す、および／または１つまたはいくつかの活性化Ｆｃγ受容体への結合を改善するために操作された、および／または抑制性Ｆｃγ受容体に対する活性化Ｆｃγ受容体への相対的結合を改善するために操作された、ＩｇＧ抗体分子である。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、Ｆｃ操作されたヒトＩｇＧ１抗体である。そのような操作された抗体変異体の例としては、ＦｃγＲＩＩＩＡへの選択的に改善された抗体結合を有する非フコシル化抗体、および抑制性ＦｃγＲＩＩＢと比較して、１つまたはいくつかの活性化Ｆｃγ受容体への結合の改善をもたらす、指向性、突然変異性、または他の手段のアミノ酸置換によって操作された抗体が含まれる（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．２００８．‘Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ’，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，７：２５１７－２７；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．２００６．‘Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ’，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０３：４００５－１０）。
【0061】
いくつかの実施形態において、活性化Ｆｃガンマ受容体への結合を改善するために操作されたヒトＩｇＧ抗体は、そのＦｃ部分に、２つの突然変異Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ、または３つの突然変異Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌ、ならびに／またはＧ２３６Ａ突然変異を有するヒトＩｇＧ抗体であり得る。いくつかの実施形態において、活性化Ｆｃガンマ受容体への結合を改善するために操作されたヒトＩｇＧ抗体は、非フコシル化されたヒトＩｇＧ抗体であり得る。
【0062】
本発明のアンタゴニスト遮断抗体分子のＦｃ領域が結合するＦｃγ受容体は、上記のように免疫エフェクター細胞を発現するＦｃγ受容体であり得る。
【0063】
ＴＮＦＲ２特異的抗体分子の標的細胞上のＴＮＦＲ２表面受容体への結合、および同じ細胞または近接した免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲの共結合は、抗体分子が結合するＴＮＦＲ２陽性標的細胞の枯渇または機能的調節をもたらす可能性がある。細胞の除去とは、本明細書では、細胞の物理的クリアランスを介した細胞の除去、欠失または排除を指す。
【0064】
細胞の枯渇は、ＡＤＣＣ、すなわち抗体依存性細胞媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害、および／またはＡＤＣＰ、すなわち抗体依存性細胞食作用を介して達成され得る。これは、本明細書に記載の抗体分子がヒトなどの患者に投与されると、それがＴｒｅｇなどの細胞の表面に発現されるＴＮＦＲ２に特異的に結合し、この結合が細胞の枯渇をもたらすことを意味する。一般に、高発現細胞は低発現細胞と比較してより効果的に欠失される。実施例５、図１４に示すように、Ｔｒｅｇは腫瘍環境で最も発現量の多い細胞である。
【0065】
ＡＤＣＣは、Ｆｃ受容体を有するエフェクター細胞が、腫瘍由来の抗原、すなわちこの場合はＴＮＦＲ２、を表面に発現している－－抗体でコーティングされた標的細胞を認識して死滅させる（すなわち、枯渇させる）ことができる免疫機構である。ＡＤＣＰも同様の機構であるが、細胞傷害性ではなく食作用によって標的細胞を死滅させる（すなわち、枯渇させる）。
【0066】
さらに、抗体分子のＦｃ領域のＦｃγ受容体への結合の改善は、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを介したＦｃ受容体依存性死による標的細胞の枯渇も改善する可能性がある。これは、活性化Ｆｃγ受容体への結合が改善された抗体分子に特に関係がある。
【0067】
抗体分子がＴＮＦＲ２陽性細胞に枯渇効果を有するということは、ヒトなどの患者に投与すると、そのような抗体分子がＴＮＦＲ２陽性細胞の表面に発現するＴＮＦＲ２に特異的に結合し、この結合がそのような標的細胞の枯渇をもたらすことを意味する。
【0068】
枯渇する細胞は、標的細胞が何であるかについての議論に関連して上で説明したような、いくつかの異なる細胞であり得る。一般に、枯渇するのはＴＮＦＲ２の発現が最も高い細胞である。ＴＮＦＲ２も発現しているがそれほど高くない他の細胞も枯渇する可能性があるが、ＴＮＦＲ２の発現が最も高い細胞と比較してわずかである。
【0069】
上記のように、ＴＮＦＲ２は、様々な癌患者の腫瘍に見られるＴｒｅｇ上で高度に発現され、そのような患者において、本発明の抗体分子は、Ｔｒｅｇに優先的に結合し、したがって、Ｔｒｅｇを枯渇させる。Ｔｒｅｇは、ＣＤ８陽性（ＣＤ８＋）細胞などの他の免疫細胞の増殖、活性化および細胞傷害性能力を抑制する効果があるため、Ｔｒｅｇの枯渇は、少なくとも間接的に、ＣＤ８＋細胞の増殖、活性化および場合によっては遊走の増加、したがって腫瘍内ＣＤ８＋細胞の数の増加をもたらす。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞の免疫介在性クリアランスに不可欠である（ＭｃＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ｄｅｃ；４３：７４－８０；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００６ Ｊｕｎ；２１１：２１４－２４；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ－Ｍｉｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２００５；３１（１）：１３－２４）。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、活性化および細胞傷害性能力の増加は、癌患者にとって非常に有益であり、癌の根絶につながる可能性がある。
【0070】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、活性化および細胞傷害性能力の増加はまた、細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療にも非常に有益である。細胞内病原体からの抗原は、通常、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に役立つＭＨＣＩ分子に提示される。これにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞は感染細胞を認識して溶解し、病原体を破壊する。
【0071】
ＴＮＦＲ２特異的抗体分子の結合およびＴＮＦ－αシグナル伝達の遮断はまた、細胞表現型の機能的調節、例えば、腫瘍促進性骨髄性細胞の殺腫瘍性を有する骨髄性細胞への調節をもたらし得る。
【0072】
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２陽性細胞は、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）細胞、すなわち、ＣＤ４を発現する細胞である。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２陽性細胞は、ＣＤ４＋およびＦＯＸＰ３＋の両方であり、すなわち、ＣＤ４およびＦＯＸＰ３の両方を発現する。これらの細胞はＴｒｅｇである。ＣＤ８＋Ｔ細胞もＴＮＦＲ２を発現するが、図１４、実施例５に示されるように、ＴｒｅｇはＣＤ８陽性Ｔ細胞よりも有意に高いレベルのＴＮＦＲ２を発現する。これにより、Ｔｒｅｇは、発現の少ないＣＤ８＋細胞と比較して枯渇しやすくなる。
【0074】
状況によっては、ＴＮＦＲ２は腫瘍微小環境の免疫細胞（腫瘍浸潤細胞、ＴＩＬＳ）に優先的に発現する。
【0075】
いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇは、腫瘍微小環境ではＴＮＦＲ２の発現が最も高い細胞となり、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子（または抗ＴＮＦＲ２抗体分子）がＴｒｅｇ枯渇効果を有することとなる。これについては、以下、例えば実施例５で、図１３および１５に関連して詳しく説明する。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２陽性細胞は、固形腫瘍におけるＴｒｅｇである。そのようなＴｒｅｇは、ＴＮＦＲ２の非常に高い発現を有するため、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子を投与すると、そのようなＴｒｅｇの枯渇を優先的にもたらす。
【0077】
抗体分子が、本明細書で言及されるようにＴＮＦＲ２陽性細胞に対する枯渇効果を有する抗体分子であるかどうかを決定するために、ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルでのインビボ試験を使用することが可能である。このインビボ試験は、本明細書ではＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルと呼ばれる、ＰＢＭＣマウスおよびＮＯＧ／ＳＣＩＤマウスの併用に基づいている。ＮＯＧマウスおよびＳＣＩＤマウスの両方が当業者に知られており（Ｉｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，（２００２） ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ ｍｏｕｓｅ：ａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １００（９）：３１７５－３１８２；Ｂｏｓｍａ ＧＣ ｅｔ ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ．１９８３ Ｆｅｂ １０；３０１（５９００）：５２７－３０；Ａ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ）、ＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルも知られている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒａｉ１ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｄｅｃ ２３；８（１２）：ｅ８２９４４．；ａｎｄ Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．“Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α ａｎｄ ＣＤ８０／ＣＤ８６ ｆｏｒ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．”Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１７２（２）：３００－１０．）。ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおけるインビボ試験は、次の９つの連続したステップで構成される。
１）ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、７５×１０６細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁される。
２）ＮＯＧマウスに、ステップ１）からの細胞懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｖ．（静脈内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１５×１０６細胞／マウスに相当する。
３）注射後、適切な時期に例えば２週間、ＮＯＧマウスから脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にするステップ。任意選択で、単一細胞懸濁液から少量の試料を採取して、ＴＮＦＲ２の発現を確認するために、ＦＡＣＳによってヒトＴ細胞上のＴＮＦＲ２の発現を決定する。
４）ステップ３）の細胞懸濁液を滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、５０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁される。任意選択のＴＮＦＲ２発現決定がステップ３に含まれている場合、残りの細胞懸濁液はステップ４で再懸濁される。
５）ＳＣＩＤマウスに、ステップ４からの懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｐ．（腹腔内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１０×１０６細胞／マウスに相当する。
６）ステップ５）の注射後、適切な時間、例えば１時間、ＳＣＩＤマウスを、試験される抗体分子、陽性対照抗体（例えば、Ｔｒｅｇを枯渇させることが知られている抗ＣＤ２５抗体）またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体のいずれかの適切な量、例えば１０ｍｇ／ｋｇで処理するステップ。
７）処理されたＳＣＩＤマウスの腹腔内液を、ステップ６）の処理後、適切な時間例えば２４時間で収集するステップ。
８）ヒトＴ細胞サブセットを、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５および／またはＣＤ１２７のマーカーを使用してＦＡＣＳによって同定および定量化するステップ。ヒトＴｒｅｇは、ヒトＰＢＭＣ集団において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／－として区別できることは十分に確立されている。
９）試験された抗体分子で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果を、陽性対照抗体で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果、ならびにアイソタイプ対照モノクローナル抗体で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果と比較するステップ。アイソタイプ対照で処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数が少ないことは、この抗体分子がＴＮＦＲ２陽性Ｔｒｅｇに対する枯渇効果を有すること示している。
１）ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、７５×１０６細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁される。
２）ＮＯＧマウスに、ステップ１）からの細胞懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｖ．（静脈内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１５×１０６細胞／マウスに相当する。
３）注射後、適切な時期に例えば２週間、ＮＯＧマウスから脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にするステップ。任意選択で、単一細胞懸濁液から少量の試料を採取して、ＴＮＦＲ２の発現を確認するために、ＦＡＣＳによってヒトＴ細胞上のＴＮＦＲ２の発現を決定する。
４）ステップ３）の細胞懸濁液を滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、５０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁される。任意選択のＴＮＦＲ２発現決定がステップ３に含まれている場合、残りの細胞懸濁液はステップ４で再懸濁される。
５）ＳＣＩＤマウスに、ステップ４からの懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｐ．（腹腔内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１０×１０６細胞／マウスに相当する。
６）ステップ５）の注射後、適切な時間、例えば１時間、ＳＣＩＤマウスを、試験される抗体分子、陽性対照抗体（例えば、Ｔｒｅｇを枯渇させることが知られている抗ＣＤ２５抗体）またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体のいずれかの適切な量、例えば１０ｍｇ／ｋｇで処理するステップ。
７）処理されたＳＣＩＤマウスの腹腔内液を、ステップ６）の処理後、適切な時間例えば２４時間で収集するステップ。
８）ヒトＴ細胞サブセットを、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５および／またはＣＤ１２７のマーカーを使用してＦＡＣＳによって同定および定量化するステップ。ヒトＴｒｅｇは、ヒトＰＢＭＣ集団において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／－として区別できることは十分に確立されている。
９）試験された抗体分子で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果を、陽性対照抗体で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果、ならびにアイソタイプ対照モノクローナル抗体で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果と比較するステップ。アイソタイプ対照で処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数が少ないことは、この抗体分子がＴＮＦＲ２陽性Ｔｒｅｇに対する枯渇効果を有すること示している。
【0078】
このアッセイは、図１５と組み合わせて、以下の実施例５でより詳細に示されている。
【0079】
上記のように、癌細胞などの他の細胞もＴＮＦＲ２を発現する可能性がある。いくつかの実施形態において、抗体分子は、癌細胞上に発現されるＴＮＦＲ２に優先的に結合し、次いで、その結合は、癌細胞の枯渇を直接もたらす。
【0080】
抗体は、免疫学および分子生物学分野の当業者には公知である。通常は、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）と、２つの軽鎖（Ｌ）と、を含む。本明細書では、時には、この完全な抗体分子をフルサイズ抗体または完全長抗体と称する。抗体の重鎖は、１つの可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含み、抗体分子の軽鎖は、１つの可変領域（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を含む。可変領域（時にＦＶ領域と総称される）は、抗体の標的、または抗原に結合する。各可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つのループを含み、これらのループが標的の結合に関与する。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、ヒトでは、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分割される。
【0081】
抗体の別の部分は、Ｆｃ領域（あるいはフラグメント結晶化可能ドメインとしても既知である）であり、抗体の重鎖の各々に２つの定常ドメインを含む。上で言及されるように、Ｆｃ領域は抗体とＦｃ受容体との間の相互作用に関与する。
【0082】
本明細書で用いる場合、抗体分子という用語は、完全長抗体またはフルサイズ抗体、ならびに完全長抗体の機能的フラグメントおよびこのような抗体分子の誘導体を包含する。
【0083】
フルサイズ抗体の機能的フラグメントは、対応するフルサイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有し、対応するフルサイズ抗体と同じ可変ドメイン（すなわち、ＶＨ配列およびＶＬ配列）および／または同じＣＤＲ配列のいずれかを含む。 機能的フラグメントは、対応するフルサイズ抗体の６個のＣＤＲのすべてを常に含有するわけではない。３つ以下のＣＤＲ領域（場合によっては、単一のＣＤＲだけまたはその一部）を含有する分子は、そのＣＤＲ（複数可）に由来する抗体の抗原結合活性を保持することが可能であることが理解される。例えば、全ＶＬ鎖（３個のＣＤＲをすべて含む）がその基質に対して高い親和性を有することが、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２３８９～９３に記載されている。
【0084】
２つのＣＤＲ領域を含有する分子については、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ＆ Ｓｏｌｌａｚｚｏ ２００１，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４：４１７～４３０に記載されている。４１８頁（右欄－３（Ｏｕｒ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ））に、フレームワーク領域内に散在するＨ１およびＨ２ ＣＤＲ超可変領域のみを含むミニボディについて記載されている。ミニボディは、標的に結合することが可能であると記載されている。Ｐｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３６７～９、およびＢｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３６：６４９～５９は、Ｖａｕｇｈａｎ ＆ Ｓｏｌｌａｚｚｏによって参照され、Ｈ１およびＨ２ミニボディ、ならびにその特性についてより詳細に記載している。Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：９２１～９では、２つの結合されたＣＤＲからなる分子が抗原に結合することが可能であることが示されている。Ｑｕｉｏｃｈｏ １９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２９３～４は、「ミニボディ」技術の概要を提供している。Ｌａｄｎｅｒ ２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：８７５～７は、２個のＣＤＲを含有する分子が抗原結合活性を保持することが可能であると見解を述べている。
【0085】
単一のＣＤＲ領域を含有する抗体分子については、例えば、Ｌａｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＪＢＣ，２７２：３０９３７～４４に記載されており、ここでは、ＣＤＲに由来する一連のヘキサペプチドが抗原結合活性を示すことが実証され、完全な単一のＣＤＲの合成ペプチドが強力な結合活性を示すことが留意されている。Ｍｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＪＢＣ，２７４：３７８９～９６では、様々な１２量体ペプチドおよび関連するフレームワーク領域が、抗原結合活性を有することが示されており、ＣＤＲ３様ペプチド単独で抗原に結合することが可能であると見解を述べている。Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６：１７９１～１８００では、「マイクロ抗体」（単一のＣＤＲを含有する分子）は抗原に結合することが可能であることが報告されており、抗ＨＩＶ抗体からの環状ペプチドが、抗原結合活性および機能を有することが示されている。Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３：１８８２～９１では、単一のＣＤＲが、そのリゾチーム抗原に対する抗原結合活性および親和性を付与し得ることが示されている。
【0086】
したがって、５個、４個、３個またはそれ以下のＣＤＲを有する抗体分子は、それらが由来する完全長抗体の抗原結合特性を保持することが可能である。
【0087】
抗体分子は、完全長抗体の誘導体またはそのような抗体のフラグメントであってもよい。ただし、そのような誘導体またはフラグメントがＦｃγ受容体結合能力を保持している場合に限る。誘導体が、対応するフルサイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有するということは、フルサイズ抗体と同じ標的上のエピトープに結合することを意味する。
【0088】
したがって、本明細書で用いる場合、「抗体分子」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、組換えで産生された抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト由来抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗体重鎖、抗体重鎖のホモ二量体、抗体重鎖のヘテロ二量体、および抗体軽鎖のヘテロ二量体を含む、すべてのタイプの抗体分子、ならびにそれらの機能的フラグメントおよびそれらの誘導体を含む。
【0089】
さらに、本明細書で用いる場合、「抗体分子」という用語は、特に明記しない限り、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む、すべてのクラスの抗体分子および機能的フラグメントを含む。
【0090】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、ヒト抗体分子、ヒト化抗体分子またはヒト由来の抗体分子である。いくつかのそのような実施形態において、抗体分子は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体分子は、最適な方法で活性化Ｆｃ受容体に結合するアイソタイプのものである。いくつかの実施形態において、抗体分子は、ＩｇＧ１抗体である。
【0091】
当業者は、マウスＩｇＧ２ａおよびヒトＩｇＧ１が、活性化Ｆｃγ受容体と結合し、例えばＡＤＣＰおよびＡＤＣＣによる、活性化Ｆｃγ受容体を担持する免疫細胞の活性化により、標的細胞の欠失を活性化する能力を共有していることを認識する。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、マウスまたはヒト化マウスＩｇＧ２ａ抗体である。
【0092】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒトＩｇＧ２抗体分子である。
【0093】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２と交差反応性であるマウス抗体である。
【0094】
上記の概略のように、抗体分子の異なる種類および形態は本発明に包含され、免疫学分野の当業者には既知であろう。治療目的に使用される抗体は、多くの場合、抗体分子の特性を修正する追加の構成成分を用いて改変されることが公知である。
【0095】
したがって、本明細書に記載される抗体分子または本明細書に記載されるように使用される抗体分子（例えば、モノクローナル抗体分子、および／またはポリクローナル抗体分子、および／または二重特異性抗体分子）は、検出可能な部分および／または細胞傷害性部分を備える場合を含む。
【0096】
「検出可能な部分」とは、酵素、放射性原子、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分で構成される群からの１つ以上を含む。検出可能な部分により、抗体分子をインビトロ、および／またはインビボ、および／またはエクスビボで視覚化することが可能になる。
【0097】
「細胞傷害性部分」とは、放射性部分および／または酵素が挙げられ、例えば、酵素はカスパーゼおよび／または毒素であり、例えば毒素は細菌毒素または毒液であり、細胞傷害性部分は細胞溶解を誘導することが可能である。
【0098】
さらに、抗体分子は、単離された形態および／または精製された形態であってよく、ならびに／またはＰＥＧ化されてもよいことを含む。ＰＥＧ化は、その挙動を改変する、例えば、その流体力学的サイズを増加させ、腎クリアランスを予防することでその半減期を延ばすように、ポリエチレングリコールポリマーを抗体分子または誘導体などの分子に付加する方法である。
【0099】
上述のように、抗体のＣＤＲは、抗体標的に結合する。本明細書に記載の各ＣＤＲへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．１９９１、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２，ｐｐ ｘｖ－ｘｖｉｉによる定義に従う。
【0100】
当業者が認識するように、アミノ酸を各ＣＤＲに割り当てるための他の方法も存在する。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ（商標））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／およびＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１により出版のＬｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ”ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ）。
【0101】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒト抗体である。
【0102】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒト由来の抗体、すなわち、本明細書に記載されるように改変されたヒト由来の抗体である。
【0103】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒト化抗体、すなわち、ヒト抗体に対する類似性を高めるように改変された非ヒト由来の抗体である。ヒト化抗体は、例えば、マウス抗体またはラマ抗体であってよい。
【0104】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、モノクローナル抗体である。
【0105】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ポリクローナル抗体である。
【0106】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＨ－ＣＤＲ１配列のうちの１つを含む。
【0107】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＨ－ＣＤＲ２配列のうちの１つを含む。
【0108】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＨ－ＣＤＲ３配列のうちの１つを含む。
【0109】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＬ－ＣＤＲ１配列のうちの１つを含む。
【0110】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＬ－ＣＤＲ２配列のうちの１つを含む。
【0111】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＬ－ＣＤＲ３配列のうちの１つを含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号１、２、３、４、５および６を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子、配列番号９、１０、１１、１２、１３および１４を有する６つのＣＤＲを含む抗体分子、または配列番号１７、１８、１９、２０、２１および２２を有する６つのＣＤＲを含む抗体分子である。
【0113】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号１、２、３、４、５および６を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子である。
【0114】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７、１５および２３からなる群から選択されるＶＨを含む抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0115】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号８、１６および２４からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0116】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７を有するＶＨを含む抗体分子である。
【0117】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号８を有するＶＬを含む抗体分子である。
【0118】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７を有するＶＨおよび配列番号８を有するＶＨを含む。
【0119】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号２１７を有するＣＨを含む。
【0120】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号２１８を有するＣＬを含む。
【0121】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７を有するＶＨ、配列番号８を有するＶＨ、配列番号２１７を有するＣＨおよび配列番号２１８を有するＣＬを含む。
【表1】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【0122】
本発明の抗体分子の特徴を決定するかまたは示すために、ＴＮＦ－αリガンドがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断しない抗体分子とそれらを比較した。このような抗体を表３に示す。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【0123】
上記表１、２および３の配列はすべてヒト由来であり、実施例１で詳細に説明されているように、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ライブラリに由来する。
【0124】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子はまた、以下の表４に示される定常領域（ＣＨおよび／またはＣＬ）の一方または両方を含み得る。
【表4】
【0125】
上記表４の最初のＣＨ（配列番号２１７）および最初のＣＬ（配列番号２１８）配列は、ヒト由来のものである。表４の２番目のＣＨ（配列番号２１９）および３番目のＣＨ（配列番号２２０）は両方ともマウスＩｇＧ２ａに由来し、その違いは、３番目のＣＨ配列（配列番号２２０）にＮ２９７Ａ突然変異が含まれている点である。２番目のＣＬ配列（配列番号２２１）は、マウスラムダ軽鎖定常領域に由来する。これらのマウス配列は、代理抗体の例で使用されている。
【0126】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、ヒトＴＮＦＲ２（ｈＴＮＦＲ２）に結合する。
【0127】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、ｈＴＮＦＲ２およびカニクイザルＴＮＦＲ２（ｃｍＴＮＦＲ２またはｃｙｎｏＴＮＦＲ２）の両方に結合することが有利である。カニクイザル（ｃｒａｂ－ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅまたはＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）とも呼ばれるカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の細胞に発現するＴＮＦＲ２との交差反応性は、特に忍容性に焦点を当てた代理抗体を使用せずに抗体分子の動物試験を可能にするため、有利である可能性がある。
【0128】
いくつかの実施形態では、マウスの関連するインビボモデルにおいて抗体分子の機能的活性を試験するには、代理抗体を使用する必要がある。ヒトにおける抗体分子の効果とマウスにおける代理抗体のインビボ結果との間の比較可能性を確実にするために、ヒト抗体分子と同じインビトロ特性を有する機能的に同等の代理抗体を選択することが不可欠である。
【0129】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、配列ＫＣＳＰＧを含むか、またはそれからなるＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合しない。
【0130】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子または本発明に従って使用される抗体分子は、ＴＮＦＲ２への結合について、本明細書で提供される特定の抗体と競合することができる、例えば、配列番号７、１５および２３からなる群から選択されるＶＨ、ならびに／または配列番号８、１６および２４からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子と競合することができる抗体分子である。
【0131】
「競合することができる」とは、競合する抗体が、本明細書で定義される抗体分子の特定の標的ＴＮＦＲ２への結合を少なくとも部分的に抑制またはその他の方法で妨害する能力があることを意味する。
【0132】
例えば、そのような競合抗体分子は、本明細書に記載のアンタゴニスト遮断抗体分子の結合を、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約１００％抑制する能力があり得、および／あるいは特定の標的リガンドＴＮＦ－αへのＴＮＦＲ２の結合を防止もしくは低減する本明細書に記載の抗体の結合能力を少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％抑制することが可能であり得る。
【0133】
競合結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの当業者に公知の方法によって決定することができる。
【0134】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、エピトープ修飾抗体または遮断抗体を評価することができる。競合抗体を同定するために好適な追加の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅに開示されている（例えば、５６７～５６９頁、５７４～５７６頁、５８３頁、および５９０～６１２頁、１９８８，ＣＳＨＬ，ＮＹ，ＩＳＢＮ０－８７９６９－３１４－２を参照されたい）。
【0135】
いくつかの実施形態において、抗体分子自体ではなく、そのような抗体分子をコードするヌクレオチド配列を使用することを目的とする。したがって、本発明は、上記アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ－２抗体分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【0136】
上記アンタゴニスト遮断抗体分子およびヌクレオチド配列は、医薬において使用することができ、そして、そのような抗体分子および／またはヌクレオチド配列は、以下でさらに論じられるように、薬学的組成物に含まれ得る。
【0137】
上記アンタゴニスト遮断抗体分子、ヌクレオチド配列および／または薬学的組成物は、以下でさらに論じられるように、癌の治療に使用することができる。
【0138】
上記アンタゴニスト遮断抗体分子、ヌクレオチド配列および／または薬学的組成物は、以下でさらに論じられるように、細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療に使用することができる。
【0139】
上記アンタゴニスト遮断抗体分子および／またはヌクレオチド配列は、癌の治療に使用するための薬学的組成物の製造に使用することができる。
【0140】
上記アンタゴニスト遮断抗体分子および／またはヌクレオチド配列は細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療に使用するための薬学的組成物の製造に使用することができる。
【0141】
上記アンタゴニスト遮断抗体分子および／または薬学的組成物は、治療有効量の抗体分子または薬学的組成物が患者に投与される、患者における癌の治療方法で使用することができる。
【0142】
上記アンタゴニスト遮断抗体分子および／または薬学的組成物は、治療有効量の抗体分子または薬学的組成物が患者に投与される、患者における細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療方法で使用することができる。
【0143】
癌の治療に関連するいくつかの実施形態において、癌は、固形または白血病癌である。固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない異常な組織の塊である。固形腫瘍は良性（癌ではない）または悪性（癌である）の場合がある。悪性固形腫瘍は、本明細書では固形癌と呼ばれる。さまざまなタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプにちなんで名付けられている。固形腫瘍または癌の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。
【0144】
固形癌のより具体的な例は、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、脳癌、中枢神経系癌、黒色腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、胃癌、リンパ腫および骨癌である。
【0145】
白血病性癌のより具体的な例は、急性リンパ性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、急性非リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ増殖性疾患である。
【0146】
ウイルスまたは細菌などの細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療に関するいくつかの実施形態において、細胞内病原体の特定の例は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｏｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ、侵襲性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン・バーウイルスまたはライノウイルスである。
【0147】
癌の治療に関するいくつかの実施形態において、上記アンタゴニスト遮断抗体分子は、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子と組み合わせて使用することができる。あるいは、アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２抗体分子をコードする上記ヌクレオチド配列は、チェックポイント抑制剤または共刺激アゴニスト抗体に特異的に結合する抗体分子と組み合わせて使用することができる。チェックポイント抑制剤に対する抗体としては、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ７を標的とする抗体が挙げられる。共刺激アゴニスト抗体の例は、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＲＡＮＫ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴおよびＢ７－Ｈ６を標的とする抗体である。あるいは、上記アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、チェックポイント抑制剤または共刺激アゴニストに特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列と組み合わせて使用することができる。あるいは、アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２抗体分子をコードする上記ヌクレオチド配列は、チェックポイント抑制剤または共刺激アゴニストに特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列と組み合わせて使用することができる。いくつかのそのような実施形態において、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子は、抗ＰＤ－１抗体である。ＰＤ－１（または、ＰＤ１）抗体は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞においてＰＤ－Ｌ１を介した抑制性シグナルを遮断すると考えられている。これにより、Ｔ細胞介在性抗腫瘍応答の増加が可能になる。Ｔｒｅｇ枯渇アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体は、別のメカニズムにより機能し、抗腫瘍反応を増加させる。したがって、これらの治療は互いに相乗効果を発揮する可能性がある。同じことが他のチェックポイント抑制剤およびアゴニスト共刺激抗体にも当てはまる。
【0148】
さらに、上記アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、化学療法（ドキソルビシン、パラプラチン、シクロホスファミド、パクリタキセル、ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ムタマイシン、エピルビシンおよびメトトレキサートなどであるが、これらに限定されない）、小分子チロシンキナーゼまたはセリン／スレオニンキナーゼ抑制剤（イブルチニブ、イマチニブ、スンチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、バンデタニブ、ミドスタウリン、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、トラメチニブまたはアレクチニブなどであるが、これらに限定されない）、成長因子受容体を標的とする抑制剤（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲ２／ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ３／ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ ＨＧＦＲ、ＲＥＴ、インスリン様成長因子受容体ＩＧＦＲ、ＦＧＦＲを標的とする薬剤などであるが、これらに限定されない）、抗血管新生薬（ベバシズマブ、エベロリムス、レナリドマイド、サリドマイド、ジブアフリベルセプトなどであるが、これらに限定されない）または照射などの他の抗癌治療と組み合わせて使用することができる。通常、上記抗癌剤はすべて癌細胞死を引き起こし、これがネオ抗原の露出と炎症につながる。ネオ抗原が露出し、腫瘍に炎症細胞が流入すると、抗癌剤の相乗効果が起こり、アンタゴニストリガンド遮断ＴＮＦＲ２抗体を加えて、Ｔｒｅｇを枯渇させ、それにより、免疫系をさらに強化することができる。
【0149】
例えば、薬剤が体に吸収される速度を変更するように、薬剤は、異なる添加物で改変することができ、例えば身体への特定の投与経路を可能にするように異なる形態で改変することができることは、医薬当業者には既知であろう。
【0150】
したがって、本明細書に記載されるアンタゴニスト遮断抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞を、薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントと組み合わせて薬学的組成物にすることができることを含む。この文脈において、薬学的組成物という用語は、薬学的調製物、薬学的製剤、治療組成物、治療調製物、治療製剤、および治療実体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｔｉｔｙ）という用語と交換可能に使用することができる。
【0151】
本明細書に記載の薬学的組成物は、抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスまたは細胞を含み得るか、またはいくつかの実施形態ではそれらからなる。
【0152】
本明細書に記載の薬学的組成物は、いくつかの実施形態では、上記の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むかまたは上記のヌクレオチド配列を含む、プラスミドからなるか、またはそれを含み得る。
【0153】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、細胞またはウイルスゲノムまたはビリオーム（ｖｉｒｉｏｍｅ）に組み込まれた、本明細書に記載の抗体分子の一部または完全な抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。そして、薬学的組成物は、本発明の抗体の送達ビヒクル（または本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列の送達ビヒクル）としての細胞またはウイルスを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、本明細書に記載される抗体分子の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む治療的腫瘍溶解性ウイルスの形態であってよい。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、完全長ヒトＩｇＧ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0154】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列または本発明のプラスミドを含むウイルスに関する。好ましくは、ウイルスは、治療的腫瘍溶解性ウイルスなどの腫瘍溶解性ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスは、医薬およびウイルス学の当業者に既知である。
【0155】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0156】
一例として、抗体００１－Ｈ１０をコードするヌクレオチド配列は、表５に示されている通りである可能性がある。
【表5】
【0157】
一部の腫瘍溶解性ウイルスは、完全長のヒト抗体配列の統合に対応するのに十分な大きさのＤＮＡ挿入を受け入れるする能力を持っている。弱毒化ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスは、完全長のＩｇＧ抗体配列の組み込みを可能にする程ゲノムが十分に大きい治療用腫瘍溶解性ウイルスの例である（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４．‘Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ’，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ，１：１１９－４１；Ｂｏｍｍａｒｅｄｄｙ．ｅｔ ａｌ ２０１８．‘Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８：４９８－５１３）。完全長ＩｇＧ抗体は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにうまく組み込まれ、ウイルス感受性宿主細胞、例えば癌細胞の感染時に完全長ＩｇＧ抗体の発現と細胞外放出（産生）をもたらす。（Ｋｌｅｉｎｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．‘Ｖｅｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａ Ｆａｂ ａｎｄ ａ ｓｃＦｖ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ －１ （ＰＤ－１） ａｌｌｏｗｓ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｕｍｏｒ－ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ’，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５：ｅ１２２０４６７）。アデノウイルスはまた、細胞感染時に機能的に産生および分泌される完全長ＩｇＧ抗体をコードするように操作することもできる（Ｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１７．‘Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｌｏｃａｌ ｉｎｔｒａ－ｔｕｍｏｕｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ’，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１２：ｅ０１７７８１０）。
【0158】
本発明はまた、上記の腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、ならびに薬学的に許容される希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントを含む薬学的組成物を包含する。
【0159】
本発明はまた、抗体薬物コンジュゲート、融合タンパク質などの他の治療法、または薬物の「形状」、およびそのような治療法を含む薬学的組成物を含む。
【0160】
本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物は、抗酸化剤、および／もしくはバッファー、および／もしくは静菌剤、および／もしくは、意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有し得る水性および／もしくは非水性滅菌注射溶液；ならびに／または懸濁剤および／もしくは増粘剤を含み得る水性および／もしくは非水性滅菌懸濁液を含み、非経口投与に好適であり得る。本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、細胞および／または薬学的組成物は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル内に存在させてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。
【0161】
即時注射液および懸濁液剤は、前述の種類の滅菌散剤、および／または顆粒剤、および／または錠剤から調製され得る。
【0162】
ヒト患者への非経口投与では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子の１日投与量レベルは通常、患者の体重で１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、あるいは場合によっては、最大１００ｍｇ／ｋｇを単回または分割用量で投与するであろう。特別な状況下、例えば長期投与と組み合わせて、より低い用量を使用してもよい。いずれにしても、医師は個々の患者に最も好適であろう実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重、および反応によって変動するであろう。上述の投与量は平均的な場合の例示である。当然ながら、より高いかまたはより低い投与量範囲が妥当である個々の症例があり得、それらも本発明の範囲内に含まれる。
【0163】
典型的には、抗体分子を含む本明細書に記載される薬学的組成物（または医薬品）は、約２ｍｇ／ｍｌ～１５０ｍｇ／ｍｌまたは約２ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＴＮＦＲ２抗体分子を含有するであろう。
【0164】
一般に、ヒトでは、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物の経口または非経口投与が好ましい経路であり、最も便利である。獣医学的使用のために、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物は、通常の獣医学的診療に従って適宜許容される薬剤処方として投与され、獣医師は、ある特定の動物にとって最も適切であろう投与計画および投与経路を決定するであろう。したがって、本発明は、（上述および以下でさらに説明する）さまざまな状態を治療するのに有効な、本発明の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞の量を含む薬学的製剤を提供する。好ましくは、本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物は、静脈内（ＩＶまたはｉ．ｖ．）、筋肉内（ＩＭまたはｉ．ｍ．）、皮下（ＳＣまたはｓ．ｃ．）を含む群から選択される経路による送達に適合される。
【0165】
本発明はまた、本発明の標的結合分子または部分の薬学的に許容される酸または塩基付加塩を含む、本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物を含む。本発明で有用な前述の塩基化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用される酸は、とりわけ、非毒性の酸付加塩、すなわち塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、およびパモエート、［すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３ナフトエート）］塩などの薬理学的に許容可能なアニオンを含有する塩を形成するものである。また、薬学的に許容可能な塩基付加塩を使用して、本発明に従った薬剤の、薬学的に許容可能な塩の形態を生成してもよい。本質的に酸性である本薬剤の薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と非毒性塩基塩を形成するものである。そのような非毒性塩基塩には、これらに限定されないが、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えばカリウムおよびナトリウム）およびアルカリ土類金属カチオン（例えばカルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えばＮ－メチルグルカミン－（メグルミン）、および低級アルカノールアンモニウム、ならびに他の薬学的に許容される有機アミンの塩基塩などのそのような薬理学的に許容されるカチオンに由来するものが挙げられる。本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞は、保存のために凍結乾燥され、使用前に適切な担体中で再構成することができる。任意の好適な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）、および／または再構成技法を用いてもよい。凍結乾燥および再構成によって、抗体活性低下の程度の変動に至る場合があり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性が大きく低下する傾向を有する）、使用レベルを上方調整して補う必要があり得ることを当業者は理解するであろう。一実施形態において、凍結乾燥（フリーズドライ）ポリペプチド結合部分は、再水和されるとき、（凍結乾燥前の）その活性のうちの約２０％未満、または約２５％未満、または約３０％未満、または約３５％未満、または約４０％未満、または約４５％未満、または約５０％未満を損失する。
【0166】
本明細書に記載される抗ＴＮＦＲ２抗体分子、ヌクレオチド配列および薬学的組成物は、対象または患者における癌の治療での使用に、使用することができる。本明細書では、対象および患者という用語は交換可能に使用される。
【0167】
「患者」（または対象）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の疾患を有すると診断された、ヒトを含む動物を指す。
【0168】
いくつかの実施形態において、患者（または対象）は、癌を有すると診断された、および／または癌の症状を呈する、ヒトを含む動物である。
【0169】
いくつかの実施形態において、患者（または対象）は、病原体によって引き起こされる感染を有すると診断された、および／または病原体によって引き起こされる感染の症状を呈する、ヒトを含む動物である。
【0170】
いくつかの実施形態において、患者（または対象）は、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者である。この文脈において、高（い）発現は、対応する健康な組織と比較して、より高いレベルのＴＮＦＲ２発現を意味する。通常、このような比較に使用される健康な組織は、１または数体の健康な個体の健康な組織から収集された参照組織（または標準参照）である。発現レベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）またはｍＲＮＡ発現測定などの標準的な技法で測定できる。
【0171】
患者は、哺乳類または非哺乳類であり得る場合を含む。好ましくは、哺乳類患者は、ヒト、馬、牛、羊、豚、ラクダ、犬または猫である。最も好ましくは、哺乳類患者はヒトである。
【0172】
「癌の症状を呈する」とは、対象が、癌症状および／もしくは癌診断マーカーを表すこと、ならびに／または癌症状および／もしくは癌診断マーカーを測定、および／または評価、および／または定量化できる場合を含む。
【0173】
医薬当業者であれば、癌症状および癌診断マーカーがどのようなものであるか、ならびに癌症状の重症度に低減または増加があるかどうか、または癌診断マーカーに低減もしくは増加があるかどうかを測定および／もしくは評価および／もしくは定量化する方法、ならびに癌症状および／もしくは癌診断マーカーを使用して、癌に関する予後診断を形成することができる方法は、容易に明らかであろう。
【0174】
癌治療は、多くの場合、一連の治療として投与される、すなわち治療剤は、ある期間にわたって投与される。一連の治療の時間の長さは、他の理由のなかでもとりわけ、投与される治療薬の種類、治療される癌の種類、治療される癌の重症度、ならびに患者の年齢および健康状態を含むいくつかの要因に依存する。
【0175】
「治療中」とは、患者が現在、一連の治療を受けていること、および／または治療薬を受けていること、および／または一連の治療薬を受けている場合を含む。
【0176】
いくつかの実施形態において、本発明に従って治療される癌は、固形腫瘍である。
【0177】
上述の癌のいずれもが公知であり、症状および癌診断マーカーは、それらの癌を治療するのに使用される治療剤であるため、十分に説明されている。したがって、上記の種類の癌を治療するために用いられる症状、癌診断マーカーおよび治療剤は、医薬当業者には既知であろう。
【0178】
大多数の癌の診断、予後診断、進行の臨床的定義は、ステージ分類として既知である、ある特定の分類による。それらのステージ分類システムは、多くの異なる癌診断マーカーおよび癌症状を照合して、癌の診断、および／または予後診断、および／または進行の概要を提供するように機能する。ステージ分類システムを使用して、癌の診断、および／または予後診断、および／または進行を評価する方法、ならびにそのためにどの癌診断マーカーおよび癌症状を使用すべきかということは、腫瘍学当業者には既知であろう。
【0179】
「癌のステージ分類」とは、ステージ０、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含む、Ｒａｉステージ分類、ならびに／またはステージＡ、ステージＢ、およびステージＣを含むＢｉｎｅｔステージ分類、ならびに／またはステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含む、Ａｎｎ Ａｒｂｏｕｒステージ分類が挙げられる。
【0180】
癌は、細胞の形態に異常を引き起こし得ることが既知である。これらの異常は、多くの場合、ある特定の癌で再現性よく生じ、これは形態におけるこれらの変化の検査（あるいは組織学的検査としても既知である）が、癌の診断または予後診断に使用することができることを意味する。細胞の形態を検査するために試料を視覚化し、視覚化用に試料を準備するための技法は、例えば、光学顕微鏡法または共焦点顕微鏡法など、当技術分野で公知である。
【0181】
「組織学的検査」とは、小さな成熟リンパ球の存在、および／または細胞質の境界が狭い小さな成熟リンパ球の存在、識別可能な核小体が欠如する密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、および／または細胞質の境界が狭く、識別可能な核小体が欠如する密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、および／または異型細胞、および／もしくは切断細胞、および／もしくは前リンパ球の存在が挙げられる。
【0182】
癌は、細胞のＤＮＡの変異の結果であり、これによって細胞の細胞死回避、または制御不能な増殖に至り得ることは公知である。したがって、これらの変異の検査（細胞遺伝学的検査としても既知である）は、癌の診断および／または予後診断を評価するための有用なツールであり得る。この例は、慢性リンパ球性白血病の特徴である染色体上の位置１３ｑ１４．１の欠失である。細胞内の変異を検査するための技法は、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）など、当技術分野で公知である。
【0183】
「細胞遺伝学的検査」とは、細胞内のＤＮＡ、具体的には染色体の検査を含む。細胞遺伝学的検査を使用して、難治性癌および／または再発した癌の存在に関連し得る、ＤＮＡの変化を同定することができる。そのようなものとしては、１３番染色体の長腕の欠失、および／または染色体位置１３ｑ１４．１の欠失、ならびに／または１２番染色体のトリソミー、および／または１２番染色体の長腕の欠失、ならびに／または１１番染色体の長腕の欠失、および／または１１ｑの欠失、ならびに／または６番染色体の長腕の欠失、および／または６ｑの欠失、ならびに／または１７番染色体の短腕の欠失、および／または１７ｐの欠失、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または抗原遺伝子受容体再配列、ならびに／またはＢＣＬ２再配列、ならびに／またはＢＣＬ６再配列、ならびに／またはｔ（１４：１８）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または（３：ｖ）転座、ならびに／または（８：１４）転座、ならびに／または（８：ｖ）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）および（ｑ１３：ｑ３２）転座を挙げることができる。
【0184】
癌患者は、ある特定の身体症状を呈することが既知であり、これは多くの場合、癌が身体に負担をかけている結果である。これらの症状は、多くの場合、同じ癌で再発するため、疾患の診断、および／または予後診断、および／または進行の特徴であり得る。医薬当業者であれば、どの身体症状がどの癌に関連しているか、ならびにそれらの身体系の評価が疾患の診断、および／または予後診断、および／または進行とどのように相関し得るかを理解するであろう。「身体的症状」としては、肝腫大および／または脾腫が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0185】
以下の実施例では、次の図を参照している。
【0186】
【図1】本発明の抗体がＴＮＦＲ２に結合することを示している。図１Ａ～Ｄ：ヒト抗体が用量依存的にヒトＴＮＦＲ２タンパク質に結合し、異なるＥＣ５０値を生成することが、ＥＬＩＳＡにより示された。図１Ｅ：マウス抗体３－Ｆ１０および５－Ａ０５は同様の親和性でｍＴＮＦＲ２に結合する。
【図2】ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示している。ヒト血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ａ～Ｄ）およびマウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ｅ）は、ＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で活性化された。活性化細胞に対するＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の親和性を、０．００２～２６７ｎＭ（ヒト）および０．００００３～１３３ｎＭ（マウス）の範囲の濃度でＦＡＣＳによって分析した。曲線は、アイソタイプ対照バックグラウンドを差し引いた後の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している（図２Ａ（完全遮断剤および部分遮断剤）、図２Ｂ（部分遮断剤）、図ＣおよびＤ（非遮断剤）、図２Ｅ（マウス完全遮断剤（３－Ｆ１０）および非遮断剤（５－Ａ０５））。 ヒトＴＮＦＲ２抗体はインビトロで活性化されたＣＤ４ｓに異なる親和性で結合するが（ＥＣ５０値は０．５９～５３ｎＭの範囲）、マウスＴＮＦＲ２抗体は同様の親和性で結合する（ＥＣ５０値は０．０７２～０．１１ｎＭの範囲）。
【図3】ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がＴＮＦＲ２に特異的に結合することを示している。ヒト血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（図３Ａ）およびマウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（図３Ｂ）は、組換えＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズで３日間活性化された。インビトロで活性化された細胞を、ポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（灰色の線）で遮断するか、ＰＢＳ（黒色の線）に３０分間放置した後、最適以下の濃度の異なるＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照（破線）で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、ＡＰＣ結合二次抗体（ＡＰＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と３０分間インキュベートした後、フローサイトメトリーで分析した。 すべての抗体はポリクローナルＴＮＦＲ２抗体によって遮断される可能性があるため、ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体（ヒトおよびマウス）がＴＮＦＲ２に特異的であることを示している。
【図4】カニクイザルに対するヒトＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の交差反応性を示している。ＣＤ４＋Ｔ細胞をカニクイザルの血液から単離し、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激した。２日後、細胞を０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照で標識した後、ＡＰＣ結合二次α－ヒト抗体とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。この図は、アイソタイプ対照に対する個々の抗体のＴＮＦＲ２＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している。結果は、２～３回の個別実験から得られた平均値とＳＤである。 ほとんどのＴＮＦＲ２抗体は、カニクイザル細胞への交差反応性結合を示す。
【図5】本明細書に記載されたＴＮＦｒ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がすべて、ＴＮＦＲ２クローンＭＲ２－１以外のＴＮＦＲ２タンパク質上の他のエピトープに結合することを示している。ヒト血液由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｒｈＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズで２～３日刺激した。活性化細胞を４０μｇ／ｍｌＭＲ２－１抗体（図５Ａ、黒いバー）で遮断するか、ＰＢＳ（図５Ａ、灰色のバー）を使用して３０分放置した後、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ポリクローナルＴＮＦＲ２（ｐＴＮＦＲ２）を添加し、細胞を１５分間インキュベートした。結合したＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の割合（％）を、ＡＰＣ結合二次抗体とのインキュベーション後にＦＡＣＳで分析した。図５Ｂでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を４０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ｐＴＮＦＲ２（黒いバー）で遮断するか、ＰＢＳ（灰色のバー）を使用して放置した後、ＰＥ結合ＭＲ２－１抗体と１５分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳで分析した。 ＭＲ２－１抗体はＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の結合を妨害せず、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は活性化細胞へのＭＲ２－１の結合に影響を与えず、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がすべて、ＭＲ２－１抗体以外のＴＮＦＲ２タンパク質の他のドメインに結合することを示している。
【図6】抗ヒトＴＮＦＲ２抗体のリガンド遮断活性を示している。ｈＴＮＦＲ２に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂを用いて遮断ＥＬＩＳＡを実施して、リガンド遮断特性を評価した。図６Ａ：すべての抗体を１０μｇ／ｍｌでインキュベートした。続いて、アイソタイプ対照を用いて達成されたシグナルを５０％超（点線で示されている）低減するすべての抗体を投与して、リガンド遮断の可能性をさらに調査した。図６Ｂは完全遮断ｍＡｂを示し、図６ＣおよびＤは部分遮断ｍＡｂを示し、図６Ｅは弱い遮断ｍＡｂを示す。他のすべてのｍＡｂは、非遮断ｍＡｂとみなされる。
【図7】抗マウスＴＮＦＲ２抗体のリガンド遮断活性を示している。ｍＴＮＦＲ２に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂを用いて遮断ＥＬＩＳＡを実施して、リガンド遮断特性を評価した。図７Ａ：すべての抗体を１０μｇ／ｍｌでインキュベートした。続いて、アイソタイプ対照を用いて達成されたシグナルを５０％超（点線で示されている）低減するすべての抗体を投与して、リガンド遮断の可能性をさらに調査した。図７Ｂは完全遮断ｍＡｂを示し、図７ＣおよびＤは部分遮断ｍＡｂを示し、図７Ｅは弱い遮断ｍＡｂを示す。他のすべてのｍＡｂは、非遮断ｍＡｂとみなされる。これに基づいて、抗体３－Ｆ１０および５－Ａ０５を選択して、それぞれ完全遮断抗体および非遮断抗体を表した。
【図8】ＴＮＦＲ２シグナル伝達を作動させる／に拮抗するそれらの能力およびＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２への結合を遮断する能力に応じたＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の分類。ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がＩＦＮ－γ産生を増強または減少させる能力を、ＩＬ－２およびＩＬ－１２で刺激されたＮＫ細胞を使用して監視し、上記のようにＴＮＦ－αリガンドのＴＮＦＲ２への結合を遮断する抗体能力の関数としてプロットした。図８Ａ：ヒト血液由来ＮＫ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２および２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－１２で刺激し、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体、アイソタイプ対照または１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦ－αを２４時間添加した。培養上清中のＩＦＮ－γの量を、ＭＳＤを使用して測定した。ＩＦＮ－γの量はアイソタイプ対照（図中、アイソタイプ対照のＩＦＮ－γ値＝１）に対して正規化され、図８Ａに示されている。インビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞に対して２５ｎＭよりも高いＥＣ５０値を示したヒト抗体は分析に含まれていない。図８Ｂ：ヒトＮＫ細胞もこれらの培養物においてＴＮＦ－αを産生する（データは２体のドナーの平均ＴＮＦ－αレベルを示している）。細胞培養物の上清を収集し、産生されたＩＦＮ－γの量を、ＭＳＤを使用して分析した。結果は、アイソタイプ対照に対して正規化されている。ＩＦＮ－γの結果は、２回の独立した実験における３体のドナーの平均値である。結果は、１）完全遮断およびアンタゴニスト特性を有する抗体、および２）アゴニスト非遮断特性を有する抗体それぞれを特徴とする２つの極端なグループを明らかにしている。アゴニスト非遮断抗体はアゴニスト性であり、サイトカイン刺激ＮＫ細胞からのＩＦＮ－γ産生を増強するが、遮断抗体はアンタゴニスト性であり、ＩＦＮ－γ放出を抑制する。図８Ｃは、可溶性ＴＮＦ－αの中和によりＩＦＮ－γが減少し、外因性ＴＮＦ－αを添加するとＩＦＮ－γが増加するため、ＩＦＮ－γの放出がＴＮＦ－αに依存することを示している。図８Ｄは、遮断抗ＴＮＦ－α抗体を添加すると、可溶性ＴＮＦ－αが用量依存的に中和されることを示している。１μｇ／ｍｌの用量では、上清中に可溶性ＴＮＦ－αは検出されない。
【図9】非遮断アゴニストであるが遮断アンタゴニストではないＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋細胞の割合を増加させることを示している。ヒト血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（図９Ａ）およびマウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（図９Ｂ）は、組換えＩＬ－２およびＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体、アイソタイプ対照または組換えＴＮＦ－αで活性化された。培養の３日後、細胞をＣＤ２５およびＣＤ４５ＲＯ（ヒト）／ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ（マウス）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。結果は、アイソタイプ対照を用いた培養物において回収されたＣＤ２５＋細胞のパーセンテージに対する、メモリー上のＣＤ２５発現細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋細胞（ヒト）／ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－（マウス））集団のパーセンテージを示す。結果は、７体のドナー（図９Ａ、ヒト）と３匹のマウス（２回の独立した実験、図９Ｂ）の平均値とＳＥＭである。ヒトおよびマウスの両方の培養物において、非遮断ＴＮＦＲ２抗体はＣＤ２５＋メモリー細胞のパーセンテージを誘導したが、遮断抗体はメモリー集団にそのような影響を与えなかった。ヒト培養物（図９Ａ）とマウス（図９Ｂ）の両方について、外因性ＴＮＦ－αの添加は、ＣＤ２５＋メモリーＴ細胞集団を増加させる。＊＝ｐ＜０．０５（一元配置分散分析により計算）。
【図10】Ａは、リガンド遮断アンタゴニスト抗体が、活性化Ｆｃ受容体に優先的に結合するアイソタイプであるｍＩｇＧ２ａとして最も顕著な抗腫瘍効果を有することを示している。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１×１０６個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。８日後、３×３ｍｍの平均腫瘍サイズで、図に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇ抗体で週２回、腹腔内処置した。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。上の図はアイソタイプ対照で処置されたマウスの腫瘍成長を示し、下の２つの図は、左のパネルにおいて、ＦｃγＲ欠損Ｉｇ形式のアンタゴニストリガンド遮断剤抗体（中央の図）およびアゴニスト非リガンド遮断抗体（下の図）を示している。中央のパネルは、主に活性化ＦｃγＲに結合するマウスＩｇＧ２ａ形式の同じ抗体を示し、右のパネルは、主に抑制性ＦｃγＲＩＩｂに結合するマウスＩｇＧ１形式の抗体を示している。図１０Ｂの場合、生存マウスを７０日間追跡した。図に見られるように、遮断アンタゴニスト抗体は、主に活性化ＦｃγＲに結合するＩｇＧ２ａ形式での腫瘍治療として最も効果的であり、ＦｃγＲ結合が欠損した形式では効果がない。他方、非遮断アゴニスト抗体は、抑制性ＦｃγＲに優先的に結合するＩｇＧ１形式での腫瘍治療として最も効果的である。加えて、アゴニスト抗体は、Ｎ２９７Ａ形式を使用して見られるように、本質的でＦｃγＲに依存しない抗腫瘍効果を有する。＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ログランクマンテル・コックス検定によって計算されたアイソタイプ対照と比較）
【図11】リガンド遮断アンタゴニスト抗体が抗ＰＤ１と組み合わせて抗腫瘍治療として有効であることを示している。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１×１０６個のＭＣ３８細胞を皮下注射した。３×３ｍｍの平均腫瘍サイズで、図に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇ抗体で週２回、腹腔内処置した。この図は、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。図１１Ａ：アイソタイプ対照、図１１Ｂ：ＰＤ－１標的抗体、図１１Ｃ：３－Ｆ１０抗体（代理抗体、リガンド遮断剤、アンタゴニスト）、図１１Ｄ：３－Ｆ１０とＰＤ１との組み合わせ。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。図１１Ｅは、４つの異なる処置群の生存曲線を示している。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ログランクマンテル・コックス検定によって計算されたアイソタイプ対照と比較）。
【図12】遮断アンタゴニスト抗体が抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせて抗腫瘍治療として有効であることを示している。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１×１０６個のＭＣ３８細胞を皮下注射した。５×５ｍｍの平均腫瘍サイズで、マウスを、アイソタイプ対照抗体もしくは３Ｆ１０で２回（１日目および４日目）処置するか、抗ＰＤ－Ｌ１で４日連続処置し、２日後に５回目の注射を行う（１、２、３、４、および７日目の合計５回の注射）か、または両方を組み合わせて行った。すべての抗体を、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。図は、平均腫瘍成長＋／－ＳＥＭ、ｎ＝１０／群を示している。＊＝＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（一元配置分散分析を使用して計算）。
【図13】：Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１×１０６Ｂ１６．Ｆ１０細胞を皮下注射した。図に示すように、３日後、マウスに週２回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内処置した。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。図１３Ａ：アイソタイプ対照、図１３Ｂ：３－Ｆ１０抗体（代理抗体、リガンド遮断剤、アンタゴニスト）。図１３Ｃは、２つの異なる処置群の生存曲線を示している。＊＝ｐ＜０．０５（ログランクマンテル・コックス検定によって計算されたアイソタイプ対照と比較）
【図14】リガンド遮断アンタゴニスト代理抗体３Ｆ１０が、腫瘍の免疫細胞組成を変化させることを示している。記載されているようにマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、腫瘍が約７×７ｍｍのサイズに達したら、示されたように抗体を注射した。３回の注射後、処置開始後８日目にマウスを犠牲にし、腫瘍を採取した。腫瘍単一細胞懸濁液をＦＡＣＳによって免疫細胞含有量について分析した。Ｆｉｇ．１４Ａ：リガンド遮断アンタゴニスト代理抗体３Ｆ１０はＴｒｅｇの枯渇を引き起こし、Ｆｉｇ．１４Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞の流入または増殖を引き起こす。これにより、図１４Ｃに示すようにＣＤ８＋／ＴｒｅｇＴ細胞比がシフトする。図１４Ｄは、Ｔ細胞数だけでなく骨髄性細胞数も示している。ここでは、腫瘍関連マクロファージの数（ＴＡＭ、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＭＨＣＩＩ＋と定義されているが、Ｌｙ６ＧとＬｙ６Ｃについてはいずれも陰性）が非常に大幅に低減する。リガンド非遮断アゴニスト代理抗体５Ａ０５もＴＡＭ数を調節するが、それでもリガンド遮断抗体３Ｆ１０とは大きく異なる。
【図15】ヒト腫瘍のＴ細胞が、ＰＢＭＣ再構成ＮＯＧマウスから回収されたＴ細胞と同様のレベルのＴＮＦＲ２を発現することを示している。簡単に言うと、ＮＯＧマウスに、１５～２０×１０６個のＰＢＭＣ細胞を静脈内注射した。１０～１２日後、脾臓をマウスから取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、ＴＮＦＲ２発現をＦＡＣＳで評価した。かつて、ＴＮＦＲ２の発現は、それぞれ３または９体の癌患者の血液および腫瘍サンプルから回収されたＴ細胞で評価されていた。図に示すように、ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＮＦＲ２発現は、ＮＯＧマウスにおけるインビボで成長および活性化されたヒトＴ細胞と、ヒト腫瘍由来のＴ細胞との間で非常に類似している。
【図16】リガンド遮断アンタゴニスト抗体１－Ｈ１０がＦｃγＲ依存的にインビボでＴｒｅｇを枯渇させることを示している。ＮＯＧマウスに、１５～２０×１０６個のＰＢＭＣ細胞を静脈内注射した。１０～１２日後、脾臓をマウスから取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射した（１０－１５×１０６個／マウス）。１時間後、マウスを１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内処置し、抗体注射の２４時間後、腹腔内液をマウスから収集し、液中の細胞を、ＦＡＣＳを使用して分析した。図１６Ａは、ヒトＣＤ４５＋集団からの染色されたＴｒｅｇ（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／陰として定義）の平均パーセンテージを示し、Ｔｒｅｇが遮断抗体１－Ｈ１０によって有意に枯渇されていることを示している。図１６Ｂは、ヒトＣＤ４５＋のうちのＣＤ８＋Ｔの平均パーセンテージを示し、１－Ｈ１０がＣＤ８＋Ｔ細胞集団を有意に増加させることを示している。図１６Ｃは、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率が１－Ｈ１０によって大幅に増加していることを示している。図１６Ａ～Ｃのデータは、各ドットが１匹のマウスを表す４つの異なる実験の平均として示されている。Ｙｅｒｖｏｙおよび市販の抗ＣＤ２５抗体を陽性対照として使用した。すべてのデータはアイソタイプ対照に対して正規化されているため、図１６ＡおよびＢではアイソタイプ対照は１００％に設定され、図１６Ｃでは１％に設定されている。図１６Ｄは、ＦｃγＲ結合欠損１－Ｈ１０ ＩｇＧ１Ｎ２９７Ｑ抗体を使用して（図では１－Ｈ１０ＮＱと指定）、Ｔｒｅｇ枯渇に対するＦｃγＲ結合の依存性を評価した別の実験を示している。図に示すように、枯渇は、Ｆｃ欠損形式（１－Ｈ１０ＮＱ）と比較して、野生型ＩｇＧ１形式（１－Ｈ１０）で最も効果的である。
【図17】アンタゴニストリガンド非遮断ＴＮＦＲ２抗体がインビトロでサイトカイン放出を誘発しないことを示している。さまざまなＴＮＦＲ２特異的抗体によって誘導されるＩＦＮ－γ放出を、３つの異なるインビトロシステムで測定した。陽性対照として、および抗ＣＤ３抗体＝ＯＫＴ３、抗ＣＤ５２抗体＝アレムツズマブ、および抗ＣＤ２８抗体を使用した。アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。各ドットは、１体のヒトドナーからのＰＢＭＣを表す。図１７Ａは、高密度細胞培養物からの結果を示す。ＰＢＭＣを１×１０７細胞／ｍｌで培養した。４８時間後、１０μｇ／ｍｌの抗体を加え、２４時間インキュベートした。図に見られるように、アレムツズマブおよびＯＫＴ３の両方が有意なＩＦＮ－γ放出を誘導したが、ＴＮＦＲ２特異的抗体はいずれも誘導しなかった。図１７Ｂは、ＰＢＭＣを添加する前に９６ウェルプレートのウェルを抗体でコーティングすることによって行われた固相インビトロ培養を示している。この場合も、アレムツズマブおよびＯＫＴ３の両方が、いくつかのＴＮＦＲ２特異的抗体とともに有意なＩＦＮ－γ放出を誘導した。しかしながら、完全遮断抗体１－Ｈ１０は、アイソタイプ対照抗体を超えるサイトカイン放出を誘導しなかった。図１７Ｃは、抗体による全血の刺激を示している。ここでは、アレムツズマブは有意なＩＦＮ－γ放出を誘導したが、ＴＮＦＲ２特異的抗体はいずれも誘導しなかった。
【図18】アンタゴニストリガンド非遮断ＴＮＦＲ２抗体がインビボでサイトカイン放出を誘発しないことを示している。ＮＯＧマウスに、２５～ｘ１０６個のＰＢＭＣ細胞を静脈内注射した。１４日後、マウスの血液が約４０％のヒトＴ細胞からなることが示されたら、マウスを１０μｇの抗体で処置した。注射の１時間後に体温を測定した（図１８Ａ）。注射の５時間後に実験を終了し、ＩＦＮ－γ（図１８Ｂ）またはＴＮＦ－α（図１８Ｃ）の含有量について血液を分析した。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１および＊＊＝ｐ＜０．０１（一元配置分散分析で計算）。
【図19】個々のドメインを欠くＴＮＦＲ２変異体への結合を示している。ＨＥＫ細胞で発現したＴＮＦＲ２変異体への抗体結合を、フローサイトメトリーアプローチで試験した。ドメイン１および２の欠如は結合に有意な影響を与えないが（図１９ＡおよびＢ）、３および部分的に４は、抗体とＴＮＦＲ２との間の相互作用を完全に無効にする（図１９ＣおよびＤ）。同様に、ドメイン１＋３の欠如は、すべての抗体（１Ｆ０６を除く）の結合を完全に防ぎ（図１９Ｅ）、ドメイン２＋４の欠如は、アゴニスト抗体（１Ｆ０２、１Ｆ０６、４Ｅ０８）への結合を完全に無効にし、アンタゴニスト（１Ｈ１０、４Ｈ０２、５Ｂ０８）への結合も大幅に低減する（図１９Ｆ）。濃い灰色は陽性対照を示し、白色は陰性対照抗体を示す。
【図20】ＴＮＦＲ２のヒト（Ｈ－Ｄ３）およびマウス（Ｍ－Ｄ３）のドメイン３のアミノ酸配列の比較を示している。類似のアミノ酸は白色で示され、差異は灰色で示されている。以下の５つの配列は、抗体が試験される５つの異なるコンストラクトを表している。ヒトからマウスへの配列の交換には下線が引かれているが、下線が引かれていない配列は完全にヒトである。ドメイン１、２および４はヒトであり、置換も突然変異も含有していない。
【図21】野生型ヒトおよびマウスＴＮＦＲ２への結合を示す（左のパネル）。突然変異したｈＴＮＦＲ２コンストラクト（ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４）を使用して、さまざまな抗ｈＴＮＦＲ２抗体に対する結合部位を絞り込んだ。フローサイトメトリー分析により、ａａ１１９～１３２の突然変異は抗体結合に影響を与えないが、ａａ１５１～１６０の突然変異はすべての抗体の結合を完全に無効にすることが明らかになった。１３４～１４４の突然変異は、遮断アンタゴニスト抗体への結合のみを破壊し、アゴニスト抗体には大きな影響を与えない。濃い灰色のバーは、陽性対照の抗体を示し、白色は陰性対照の抗体を示す。破線は、陰性対照抗体のレベルである。
【実施例】
【0187】
ここで、本発明のいくつかの態様を具体的に示す、特定の非限定的な実施例を説明する。
【0188】
多くの例、特にインビボの例では、抗体３－Ｆ１０が使用されている。これは、本明細書に開示されるヒト抗体の代理抗体であるマウス抗体である。この抗体は、マウスＴＮＦＲ２に結合するその能力、ＴＮＦＲ２に結合するマウスＴＮＦ－αリガンドのその遮断に基づき、かつ実施例４に記載されるようなマウスＴ細胞活性化アッセイにおけるそのアンタゴニスト活性に基づいて選択された。いくつかの例では、３－Ｆ１０抗体を試験し、抑制性Ｆｃガンマ受容体（ｍＩｇＧ２ａ）よりも活性化Ｆｃガンマ受容体への強力かつ優先的な結合、マウス抑制性ＦｃγＲ（ｍＩｇＧ１）への強力かつ優先的な結合、またはマウスＦｃγＲ（ｍＩｇＧ２ａＮ２９７Ａ）への結合の欠損に関連するさまざまな抗体形式で比較した。
【0189】
いくつかの例では、抗体５－Ａ０５が使用されている。これは、参照および比較の理由で本明細書に含まれるヒト抗ＴＮＦＲ２非遮断アゴニスト抗体に対するマウス代理抗体である。５－Ａ０５は、マウスＴＮＦＲ２に結合するその能力、ＴＮＦＲ２に結合するマウスＴＮＦ－αリガンドに対する遮断効果の欠如に基づき、かつ実施例４に記載されるようなマウスＴ細胞活性化アッセイにおけるそのアンタゴニスト活性に基づいて選択された。いくつかの例では、５－Ａ０５抗体を試験し、抑制性Ｆｃガンマ受容体（ｍＩｇＧ２ａ）よりも活性化Ｆｃガンマ受容体への強力かつ優先的な結合、活性化ＦｃγＲ（ｍＩｇＧ１）を上回るマウス抑制性ＦｃγＲへの強力かつ優先的な結合、またはマウスＦｃγ（Ｎ２９７Ａ）への結合の欠損に関連するさまざまな抗体形式で比較した。
【0190】
いくつかの例および図では、抗体クローンのわずかに異なる名称が使用されている。例えば、クローン００１－Ｈ１０は１－Ｈ１０または１Ｈ１０に短縮される場合があり、００５－Ｂ０８は５－Ｂ０８または５Ｂ０８に短縮される場合がある。
【0191】
実施例１－ＴＮＦＲ２特異的抗体の生成
（図１およびこの図の上記説明も参照のこと。）
ｓｃＦｖ抗体フラグメントの単離
ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリ（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ Ｅ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８（８）：８５２－６）を使用して、ヒトまたはマウスＴＮＦＲ２を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントを単離した。
（図１およびこの図の上記説明も参照のこと。）
ｓｃＦｖ抗体フラグメントの単離
ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリ（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ Ｅ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８（８）：８５２－６）を使用して、ヒトまたはマウスＴＮＦＲ２を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントを単離した。
【0192】
ファージライブラリは、組換えヒトまたはマウスタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対する３回の連続パニングで使用された。ファージのインキュベーション後、細胞を洗浄して未結合のファージを除去した。結合ファージをトリプシンで溶出し、Ｅ．ｃｏｌｉで増幅した。得られたファージストックをｓｃＦｖフォーマットに変換した。Ｅ．ｃｏｌｉをｓｃＦｖ保有プラスミドで形質転換し、個々のｓｃＦｖクローンを発現させた。
【0193】
特有のＴＮＦＲ２結合ｓｃＦｖの同定
３回目のパニングからの変換されたｓｃＦｖを、ホモジニアスＦＭＡＴ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ヒトもしくはマウスＴＮＦＲ２または非関連タンパク質を発現するトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞への結合についてアッセイした。
３回目のパニングからの変換されたｓｃＦｖを、ホモジニアスＦＭＡＴ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ヒトもしくはマウスＴＮＦＲ２または非関連タンパク質を発現するトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞への結合についてアッセイした。
【0194】
簡単に説明すると、トランスフェクトされた細胞を、発現プレートからのｓｃＦｖ含有上清（１：７に希釈）、マウス抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体（０．４μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＡＰＣ結合ヤギ抗マウス抗体（０．２μｇ／ｍｌ、カタログ番号１１５－１３６－１４６、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに透明底プレートに添加した。ＦＭＡＴプレートを室温で９時間インキュベートした後、読み取った。ＴＮＦＲ２でトランスフェクトされた細胞に結合するが、非関連タンパク質でトランスフェクトされた細胞には結合しない細菌クローンは、活性物質として分類し、９６ウェルプレートにチェリーピックした。
【0195】
ＥＬＩＳＡにおけるＴＮＦＲ２へのＩｇＧの結合
９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、１ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトまたはマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で、一晩４℃でコーティングした。洗浄後、２０μｇ／ｍｌ～０．１ｎｇ／ｍｌ（１３３ｎＭ～１ｐＭ）の漸増させた用量（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ）の抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂを１時間結合させた。次にプレートを再度洗浄し、結合した抗体を５０ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＦ（ａｂ）－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、１ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトまたはマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で、一晩４℃でコーティングした。洗浄後、２０μｇ／ｍｌ～０．１ｎｇ／ｍｌ（１３３ｎＭ～１ｐＭ）の漸増させた用量（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ）の抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂを１時間結合させた。次にプレートを再度洗浄し、結合した抗体を５０ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＦ（ａｂ）－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
【0196】
表６および図１Ａ～Ｄに示されているデータは、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体がすべてヒトＴＮＦＲ２タンパク質に結合することを示している。ＥＣ５０値は、１－Ｃ０８の０．０８２ｎＭから１－Ａ０９の４．４ｎＭまでの範囲である。
加えて、マウス抗体代理クローン３－Ｆ１０および５－Ａ０５もｍＴＮＦＲ２タンパク質に結合する。これらの２つのクローンは、非常に類似した親和性で結合する（表６および図１Ｅ）。
加えて、マウス抗体代理クローン３－Ｆ１０および５－Ａ０５もｍＴＮＦＲ２タンパク質に結合する。これらの２つのクローンは、非常に類似した親和性で結合する（表６および図１Ｅ）。
【表6】
【0197】
実施例２－抗体の特異性
（図２～５およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
ヒトバフィーコートおよびカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）全血由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントを使用して単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ヒト）またはＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、非ヒト霊長類（カニクイザル）（いずれもＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用した磁気セルソーティングによってＰＢＭＣから単離した。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（マウス）を用いて脾臓から単離した。
（図２～５およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
ヒトバフィーコートおよびカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）全血由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントを使用して単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ヒト）またはＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、非ヒト霊長類（カニクイザル）（いずれもＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用した磁気セルソーティングによってＰＢＭＣから単離した。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（マウス）を用いて脾臓から単離した。
【0198】
ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の滴定
細胞上に発現したＴＮＦＲ２に結合するＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の能力および親和性は、インビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して得られた。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００２～２６７ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－ヒトＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。得られた滴定曲線を図２Ａ～Ｄに示す。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００００３～１３３ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－マウスＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。滴定曲線を図２Ｅに示す。滴定曲線のＥＣ５０値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで計算され、表７に示されている。ヒト抗体の場合、ＥＣ５０値は０．６ｎＭ（４－Ｈ０２）から５２．７ｎＭ（１－Ｃ０３）まで異なっていた。マウス抗体は、同様の親和性（０．０７２ｎＭ（３－Ｆ１０）および０．１１ｎＭ（５－Ａ０５））でインビトロで活性化された細胞に結合した。
細胞上に発現したＴＮＦＲ２に結合するＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の能力および親和性は、インビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して得られた。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００２～２６７ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－ヒトＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。得られた滴定曲線を図２Ａ～Ｄに示す。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００００３～１３３ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－マウスＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。滴定曲線を図２Ｅに示す。滴定曲線のＥＣ５０値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで計算され、表７に示されている。ヒト抗体の場合、ＥＣ５０値は０．６ｎＭ（４－Ｈ０２）から５２．７ｎＭ（１－Ｃ０３）まで異なっていた。マウス抗体は、同様の親和性（０．０７２ｎＭ（３－Ｆ１０）および０．１１ｎＭ（５－Ａ０５））でインビトロで活性化された細胞に結合した。
【0199】
ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の特異性
ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦＲ２抗体の特異性は、市販のポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄシステム）を用いたＦＡＣＳ遮断実験で得られた。ＣＤ４＋Ｔ細胞（マウスおよびヒト）を、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（ヒト）／１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（マウス）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８で２～３日間刺激して、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を行い、４０μｇ／ｍｌポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で３０分間遮断し、直後にＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照と１５分間インキュベートした。使用したｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の濃度は、個々のＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の滴定曲線に基づいており、各抗体の最適以下の濃度を選択した。次に、細胞を洗浄し、ＡＰＣ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と３０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）。図３に示すように、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体（ヒトとマウスの両方）のすべての結合は、ポリクローナルＴＮＦＲ２抗体によって遮断され得た。これらの結果は、ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合することを確認している。
ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦＲ２抗体の特異性は、市販のポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄシステム）を用いたＦＡＣＳ遮断実験で得られた。ＣＤ４＋Ｔ細胞（マウスおよびヒト）を、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（ヒト）／１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（マウス）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８で２～３日間刺激して、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を行い、４０μｇ／ｍｌポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で３０分間遮断し、直後にＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照と１５分間インキュベートした。使用したｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の濃度は、個々のＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の滴定曲線に基づいており、各抗体の最適以下の濃度を選択した。次に、細胞を洗浄し、ＡＰＣ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と３０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）。図３に示すように、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体（ヒトとマウスの両方）のすべての結合は、ポリクローナルＴＮＦＲ２抗体によって遮断され得た。これらの結果は、ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合することを確認している。
【0200】
ＴＮＦＲ２抗体クローンＭＲ２－１に対するＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のエピトープマッピング
ＴＮＦＲ２抗体クローンＭＲ２－１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＴＮＦＲ２タンパク質の特定のドメインに結合する。ＭＲ２－１と同じドメインに結合したＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がＦＡＣＳ遮断実験によって試験された場合。
ＴＮＦＲ２抗体クローンＭＲ２－１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＴＮＦＲ２タンパク質の特定のドメインに結合する。ＭＲ２－１と同じドメインに結合したＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がＦＡＣＳ遮断実験によって試験された場合。
【0201】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）で２～３日間刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化を行った。活性化された細胞を、４０μｇ／ｍｌＭＲ２－１（図５Ａの黒いバー）またはＰＢＳ（図５の灰色のバー）で遮断した。３０分間のインキュベーション後、細胞をＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはポリクローナルＴＮＦＲ２（ｐＴＮＦＲ２）で１５分間直ちに染色した。ＡＰＣ結合二次抗ヒトＩｇＧ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ）とのインキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。図５Ｂでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を４０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはｐＴＮＦＲ２（黒いバー）で遮断するか、ＰＢＳ（灰色のバー）を使用して放置した後、ＰＥ結合ＭＲ２－１抗体と１５分間インキュベートした。また、次に、細胞をＦＡＣＳで分析した。ＭＲ２－１＋細胞のパーセンテージは、遮断されていない細胞と遮断されたｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）で同じであり（図５Ｂ）、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の結合はＭＲ２－１遮断の有無にかかわらず同じであった（図５Ａ）。これらのデータは、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体が、ＭＲ２－１抗体以外のＴＮＦＲ２タンパク質の他のエピトープに結合することを示している。
【0202】
ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のカニクイザルへの結合
カニクイザルに対するＴＮＦＲ２抗体の交差反応性を検証するために、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および１００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で２日間刺激して、ＴＮＦＲ２の上方制御を行った。細胞を３つの異なる濃度（０．１、１、および１０μｇ／ｍｌ）のＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体とインキュベートし、次にＡＰＣ結合二次ａ－ヒトＩｇＧ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した結果、ヒトＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のほとんどがカニクイザルＴＮＦＲ２に結合できることが示された。個々の抗体の結果を図４に示す。
カニクイザルに対するＴＮＦＲ２抗体の交差反応性を検証するために、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および１００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で２日間刺激して、ＴＮＦＲ２の上方制御を行った。細胞を３つの異なる濃度（０．１、１、および１０μｇ／ｍｌ）のＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体とインキュベートし、次にＡＰＣ結合二次ａ－ヒトＩｇＧ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した結果、ヒトＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のほとんどがカニクイザルＴＮＦＲ２に結合できることが示された。個々の抗体の結果を図４に示す。
【0203】
要約すると、実施例２のデータは、ヒト抗体が、ヒト免疫細胞上で内因的に発現されるＴＮＦＲ２に特異的に結合することを示している。さらに、データは、ＴＮＦＲ２に対するポリクローナル市販抗体を添加することによってこの結合を遮断できることを示している。これは、ＴＮＦＲ２に対する非常に高い特異性を示している。同じことが、マウスＴＮＦＲ２を発現するマウス細胞に関する代理クローン３Ｆ１０および５Ａ０５にも当てはまる。また、ヒトクローンの結合は、ＭＲ２－１と比較して異なるエピトープ特異性を示すＭＲ２－１抗体の影響を受けない。
【表7】
【0204】
実施例３－リガンド遮断特性の試験
（図６～７およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＥＬＩＳＡ法
９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡコーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中２．５ｐｍｏｌ／ウェルのｈＴＮＦＲ２（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号１０４１４－Ｈ０８Ｈ）またはｍＴＮＦＲ２（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０１２８ Ｍ０８Ｈ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した後、プレートをゆっくりと撹拌しながら室温で１時間、１０μｇ／ｍｌ（１回投与ＥＬＩＳＡ）または３３ｎＭのｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂとインキュベートし、その後、０．４５％フィッシュゼラチンを含有する遮断バッファーで１：２希釈（滴定ＥＬＩＳＡ）した。続いて、組換えｈＴＮＦ－α－ｂｉｏ（Ｒ＆Ｄカタログ番号ＢＴ２１０）またはｍＴＮＦ－α（Ｇｉｂｃｏカタログ番号ＰＭＣ３０１４）をそれぞれ５ｎＭおよび２ｎＭの最終濃度で添加し、さらに１５分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄した。ヒトＥＬＩＳＡの場合、遮断バッファーで１：２０００に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号０１６－０３０－０８４）を添加し、室温で１時間再度インキュベートした後、最初にＥＬＩＳＡバッファーで、次にＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９．８）で洗浄した。次いで、基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（カタログ番号３７０６９））を製造元の指示に従って希釈し、ウェルに加え、暗所で１０分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａで読み取った。マウスＥＬＩＳＡの場合、ウサギ抗ｍＴＮＦ－α（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０３４９－ＲＰ０２）を１μｇ／ｍｌに希釈したものを加え、室温で１時間インキュベートさせた。洗浄後、遮断バッファーで１：１００００に希釈した抗ウサギ－ＨＲＰを添加し、再び室温で１時間インキュベートした。基質の添加および読み取りを上記のように行った。
（図６～７およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＥＬＩＳＡ法
９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡコーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中２．５ｐｍｏｌ／ウェルのｈＴＮＦＲ２（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号１０４１４－Ｈ０８Ｈ）またはｍＴＮＦＲ２（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０１２８ Ｍ０８Ｈ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した後、プレートをゆっくりと撹拌しながら室温で１時間、１０μｇ／ｍｌ（１回投与ＥＬＩＳＡ）または３３ｎＭのｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂとインキュベートし、その後、０．４５％フィッシュゼラチンを含有する遮断バッファーで１：２希釈（滴定ＥＬＩＳＡ）した。続いて、組換えｈＴＮＦ－α－ｂｉｏ（Ｒ＆Ｄカタログ番号ＢＴ２１０）またはｍＴＮＦ－α（Ｇｉｂｃｏカタログ番号ＰＭＣ３０１４）をそれぞれ５ｎＭおよび２ｎＭの最終濃度で添加し、さらに１５分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄した。ヒトＥＬＩＳＡの場合、遮断バッファーで１：２０００に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号０１６－０３０－０８４）を添加し、室温で１時間再度インキュベートした後、最初にＥＬＩＳＡバッファーで、次にＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９．８）で洗浄した。次いで、基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（カタログ番号３７０６９））を製造元の指示に従って希釈し、ウェルに加え、暗所で１０分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａで読み取った。マウスＥＬＩＳＡの場合、ウサギ抗ｍＴＮＦ－α（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０３４９－ＲＰ０２）を１μｇ／ｍｌに希釈したものを加え、室温で１時間インキュベートさせた。洗浄後、遮断バッファーで１：１００００に希釈した抗ウサギ－ＨＲＰを添加し、再び室温で１時間インキュベートした。基質の添加および読み取りを上記のように行った。
【0205】
【0206】
遮断の定義
●完全遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を９８％超低減するものと定義されている
●部分遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０～９８％低減するものと定義されている
●弱い遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０％未満低減するものと定義されている
●非遮断抗体は、図６Ａおよび７Ａに示すように、高用量のワンポイントＥＬＩＳＡで５０％遮断を超えないものとして定義されている
●完全遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を９８％超低減するものと定義されている
●部分遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０～９８％低減するものと定義されている
●弱い遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０％未満低減するものと定義されている
●非遮断抗体は、図６Ａおよび７Ａに示すように、高用量のワンポイントＥＬＩＳＡで５０％遮断を超えないものとして定義されている
【0207】
この例に示されているデータは、リガンドＴＮＦ－αの結合を完全に抑制する抗体から、リガンドの遮断をまったく抑制しない抗体まで、さまざまな抗体が生成されていることを示している。これは、ヒト抗体とマウス代理抗体の両方に当てはまる。
【0208】
実施例４－抗体のインビトロ機能性
（図８～９およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
サイトカイン刺激ＮＫ細胞ＩＦＮ－γ産生を調節するＴＮＦＲ２抗体の能力
ＴＮＦＲ２特異的抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性は、Ａｌｍｉｓｈｒｉらによって記載されたＮＫ細胞アッセイを使用して評価された（ＴＮＦα Ａｕｇｍｅｎｔｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ ＩＦＮγ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＮＦＲ２．Ａｌｍｉｓｈｒｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．２０１６；８：６１７－６２９）。
（図８～９およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
サイトカイン刺激ＮＫ細胞ＩＦＮ－γ産生を調節するＴＮＦＲ２抗体の能力
ＴＮＦＲ２特異的抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性は、Ａｌｍｉｓｈｒｉらによって記載されたＮＫ細胞アッセイを使用して評価された（ＴＮＦα Ａｕｇｍｅｎｔｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ ＩＦＮγ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＮＦＲ２．Ａｌｍｉｓｈｒｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．２０１６；８：６１７－６２９）。
【0209】
手短に言えば、ヒトＮＫ細胞を、「ＮＫ単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したＭＡＣＳによってヒトＰＢＭＣから単離した。Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェルＴＣ処理マイクロプレート、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）において、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的抗体、１０μｇ／ｍｌアイソタイプ対照または１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒に、１００μｌのＮＫ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－１２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに培養した。２４時間後に上清を回収し、産生されたＩＦＮ－γの量をＭＳＤで評価した。
【0210】
対照として、ＴＮＦ－αを中和する抗ＴＮＦ－α抗体（カタログ番号ＡＦ－２１０－ＮＡ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれていた。図８Ｄに見られるように、１μｇ／ｍｌの用量は可溶性ＴＮＦ－αを完全に中和し、この用量はまたＩＦＮ－γ放出を低下させた。
【0211】
ヒトの非遮断ＴＮＦＲ２抗体は、ＩＬ－２およびＩＬ－１２で刺激されたＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生を明確に増強したが（アイソタイプ対照の２～３倍のＩＦＮ－γ）、一方、アンタゴニスト抗体（ここでは完全遮断剤で示されている）は、ＮＫ細胞に対するアンタゴニスト効果を示し、ＩＦＮ－γ産生を低減した（図８Ａ）。
【0212】
この試験は、マウス培養物で内因的に産生されたＴＮＦ－αがなく、マウスＮＫ細胞では抑制性ＦｃγＲが発現する一方で、ヒト対応物では活性化ＦｃγＲのみが発現するため、マウス代理抗体で実施するのは代表的ではないと考えられた。代わりに、以下に記載されるようなメモリーＴ細胞活性化アッセイ（ＣＤ２５の誘導）を使用して、マウス代理抗体のアゴニストまたはアンタゴニスト特性に対処した。
【0213】
ＴＮＦＲ２抗体によるＣＤ２５発現メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導
ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性をさらに理解するために、ＣＤ２５発現メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を増強するそれらの能力を評価した。
ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性をさらに理解するために、ＣＤ２５発現メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を増強するそれらの能力を評価した。
【0214】
簡単に説明すると、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製の「ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット」を使用して、ＭＡＣＳによってＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４ｓを、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的抗体または指定量のｒｈＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに培養した。３日後、メモリー細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）でのＣＤ２５の発現をＦＡＣＳで分析した（図９Ａ）。
【0215】
同様に、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を、「ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＭＡＣＳによって脾臓から単離し、１０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的抗体または指定量のｒｍＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに培養した。メモリー細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－細胞）上のＣＤ２５の発現を、３日後にＦＡＣＳによって分析した（図９Ｂ）。
【0216】
ＣＤ２５発現細胞のパーセンテージが、ヒトとマウスの両方で、非遮断ＴＮＦＲ２で刺激されたメモリー細胞培養物において増強された。しかしながら、遮断抗体による刺激はこれらの培養物でＣＤ２５発現を増大させず、むしろこれを低減した。
【0217】
要約すると、実施例４のデータは、いくつかの方法によってインビトロで測定されるように、リガンド遮断抗体がアンタゴニストであることを示している：ＮＫ細胞介在ＩＦＮ－γ放出の抑制、およびＣＤ２５発現によって測定されるＣＤ４＋メモリー細胞の活性化。アンタゴニストリガンド遮断抗体が本発明に従って示され、アゴニストリガンド非遮断抗体が比較のために含まれている。
【0218】
実施例５－代理リガンド遮断、アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂはインビボ抗腫瘍効果を有する
（図１０～１６およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
さまざまな腫瘍モデルにおける治療効果
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果を評価するために、３Ｆ１０と呼ばれるマウス代理を、異なるアイソタイプ形式を使用して、単独で、または以下に説明する抗ＰＤ－１と組み合わせて、異なる腫瘍モデルでインビボで調査した。
（図１０～１６およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
さまざまな腫瘍モデルにおける治療効果
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果を評価するために、３Ｆ１０と呼ばれるマウス代理を、異なるアイソタイプ形式を使用して、単独で、または以下に説明する抗ＰＤ－１と組み合わせて、異なる腫瘍モデルでインビボで調査した。
【0219】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。６～８週齢の雌のＢａｌｂＣおよびＣ５７／ＢＬ６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で維持した。ＣＴ２６、ＭＣ３８およびＢ１６．Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳを添加したグルタマックス緩衝ＲＰＭＩで成長させた。細胞が半コンフルエントになったとき、それらをトリプシンで剥離させ、１０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。マウスに１×１０６細胞／マウスに相当する１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射した。モデルに応じて注射の３～８日後、マウスを、図に示されているように週２回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内処置した（アイソタイプ対照、３－Ｆ１０または５－Ａ０５）。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。
【0220】
リガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ３－Ｆ１０は、３つの異なる腫瘍モデルで治療的抗腫瘍効果を示し（図１０～１３）、より治療感受性の高いＣＴ２６では治療効果を示し（図１０）、かつ、より治療抵抗性の高いＭＣ３８およびＢ１６では腫瘍成長抑制効果を示す（図１１～１３）。
【0221】
リガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂの抗腫瘍効果は、Ｆｃ：ＦｃγＲに依存する。
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２マウス代理ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果に対するＦｃＦｃγＲ相互作用の重要性を評価するために、この抗体のさまざまなＦｃ形式を、以下に記載するようにＣＴ２６腫瘍モデルにおいてインビボで調査した。
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２マウス代理ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果に対するＦｃＦｃγＲ相互作用の重要性を評価するために、この抗体のさまざまなＦｃ形式を、以下に記載するようにＣＴ２６腫瘍モデルにおいてインビボで調査した。
【0222】
マウスは、上記のように飼育され維持された。ＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）を上記のように成長させ、注射した。腫瘍が３×３ｍｍに達したとき、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇの抗体（アイソタイプ対照、３－Ｆ１０ ＩｇＧ１、３－Ｆ１０ ＩｇＧ２ａ、または３－Ｆ１０－Ｎ２９７Ａ（Ｆｃ欠損）で週２回腹腔内処置した。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。
【0223】
Ｆｃ欠損３－Ｆ１０－Ｎ２９７Ａは、アイソタイプ対照と比較して最低の治療活性を示すか、または全く治療効果を示さず、Ｆｃ結合が、このリガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂの治療効果にきわめて重要であることを示している（図１０ＡおよびＢ）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方の形式が、有意な治療効果を示す。しかしながら、活性化Ｆｃγ受容体に優先的に結合するＩｇＧ２ａ形式は、Ｔｒｅｇの枯渇／食作用を示す優れた治療効果が、このリガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂの１つの重要な作用機序であることを示している（図１０Ａ～Ｂ）。これは、Ｆｃ欠損形式ではいくらかの活性を示し、抑制性ＦｃγＲに優先的に結合することが知られているマウスＩｇＧ１形式で最高の活性を示す非遮断アゴニスト代理抗体５Ａ０５とは対照的である。リガンド遮断アンタゴニスト抗体（３Ｆ１０）は本発明によるものであり、リガンド非遮断アゴニスト抗体（５Ａ０５）は参考のために含まれている。
【0224】
抗ＰＤ－１ｍＡｂとの併用効果
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ、抗ＰＤ－１を用いたマウス代理（３－Ｆ１０）のインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するようにＭＣ３８腫瘍モデルにおいて治療の組み合わせをインビボで調査した。
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ、抗ＰＤ－１を用いたマウス代理（３－Ｆ１０）のインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するようにＭＣ３８腫瘍モデルにおいて治療の組み合わせをインビボで調査した。
【0225】
マウスは、上記のように飼育され維持された。ＭＣ３８細胞（ＡＴＣＣ）を上記のように成長させ、注射した。注射の８日後、マウスを、図１１Ａ～Ｅに示すように、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体（アイソタイプ対照、抗マウスＰＤ－１、３－Ｆ１０、または抗マウスＰＤ－１と３－Ｆ１０との組み合わせ）で腹腔内処置した。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。
【0226】
抗マウスＰＤ－１およびリガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ３－Ｆ１０はいずれも、ＭＣ３８モデルで実際に腫瘍成長抑制治療効果を示す（図１１Ａ～Ｅ）。抗ＰＤ１とアンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ３－Ｆ１０を組み合わせると、治療抵抗性のＭＣ３８で腫瘍が治癒する（図１１Ｄ～Ｅ）。
【0227】
抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂとの併用効果
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するように、ＭＣ３８腫瘍モデルでの治療のためにマウス代理（３Ｆ１０）を抗ＰＤ－Ｌ１とさらに組み合わせた。
リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するように、ＭＣ３８腫瘍モデルでの治療のためにマウス代理（３Ｆ１０）を抗ＰＤ－Ｌ１とさらに組み合わせた。
【0228】
マウスは、上記のように飼育され維持された。ＭＣ３８細胞（サウサンプトン大学のＭ．Ｃｒａｇｇ博士から入手）を上記のように成長させ、注射した。注射の６日後、マウスを、アイソタイプ対照抗体もしくは３Ｆ１０で２回（１日目および４日目）処置するか、抗ＰＤ－Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）で４日連続処置し、２日後に５回目の注射を行う（１、２、３、４、および７日目の合計５回の注射）か、または両方を組み合わせて行った。すべての抗体を、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。腫瘍は、２０００ｍｍ３の体積に達するまで、週２回ノギスで測定し、その後マウスを断命した。
【0229】
抗マウスＰＤ－Ｌ１およびリガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ３－Ｆ１０はいずれも、ＭＣ３８モデルで実際に腫瘍成長抑制治療効果を示す（図１２）。抗ＰＤ－Ｌ１とアンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ３－Ｆ１０を組み合わせると、抗腫瘍効果がさらに高まる（図１２）。
【0230】
インビボでの免疫細胞調節
インビボでの腫瘍における免疫細胞での効果を調査するために、ＢａｌｂＣマウスに上記のようにＣＴ２６細胞を接種した。腫瘍が約７×７ｍｍに達した後、図に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内投与して治療した。マウスを１、４、７日目に処置し、８日目に断命した。腫瘍を解剖し、機械的に小片に分割し、コラゲナーゼ１００μｇ／ｍｌのリベラーゼおよび１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅの混合物を使用して、３７℃で２×５分間、ボルテックスを間にいれて消化した。７０μｍのフィルタを通して濾過した後、細胞懸濁液を、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄した（４００ｇで１０分間）。その後、細胞をＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ２５またはＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇを染色する抗体パネルで染色した。染色する前に、１００μｇ／ｍｌのＩＶＩＧ（精製された静脈内免疫グロブリン）を使用して非特異的結合について細胞を遮断した。ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅを使用して細胞を分析した。マウスＴｒｅｇをＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋として定量化し、ＴＡＭをＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ－Ｆ４／８０＋ＭＨＣＩＩ＋として定量化した。結果を図１４に示す。
インビボでの腫瘍における免疫細胞での効果を調査するために、ＢａｌｂＣマウスに上記のようにＣＴ２６細胞を接種した。腫瘍が約７×７ｍｍに達した後、図に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内投与して治療した。マウスを１、４、７日目に処置し、８日目に断命した。腫瘍を解剖し、機械的に小片に分割し、コラゲナーゼ１００μｇ／ｍｌのリベラーゼおよび１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅの混合物を使用して、３７℃で２×５分間、ボルテックスを間にいれて消化した。７０μｍのフィルタを通して濾過した後、細胞懸濁液を、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄した（４００ｇで１０分間）。その後、細胞をＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ２５またはＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇを染色する抗体パネルで染色した。染色する前に、１００μｇ／ｍｌのＩＶＩＧ（精製された静脈内免疫グロブリン）を使用して非特異的結合について細胞を遮断した。ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅを使用して細胞を分析した。マウスＴｒｅｇをＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋として定量化し、ＴＡＭをＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ－Ｆ４／８０＋ＭＨＣＩＩ＋として定量化した。結果を図１４に示す。
【0231】
図１４に見られるように、リガンド遮断／アンタゴニストＴＮＦＲ２抗体による処置は、腫瘍のＴｒｅｇを枯渇させる。ＣＤ８＋Ｔ細胞流入の増加への弱い傾向も見られる。同時に、これにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇとの比率が大幅に改善される（図１４Ｃ）。加えて、アンタゴニスト抗体は、腫瘍関連マクロファージの数を低減することによって骨髄性コンパートメントを調節する（図１４Ｄ）。
【0232】
ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデル
リガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２代理ｍＡｂの枯渇活性に関するインビボ所見を確認するために、以下に説明するように、ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおけるリガンド遮断アンタゴニスト抗ヒトＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｈ１０の枯渇能力をインビボで分析した。
リガンド遮断アンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２代理ｍＡｂの枯渇活性に関するインビボ所見を確認するために、以下に説明するように、ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおけるリガンド遮断アンタゴニスト抗ヒトＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｈ１０の枯渇能力をインビボで分析した。
【0233】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。８週齢の雌のＳＣＩＤおよびＮＯＧマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で維持した。ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤ（初代ヒト異種移植）モデルの場合、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを用いて単離し、洗浄した後、細胞を７５×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＯＧマウスに、１５×１０６細胞／マウスに相当する２００μｌの細胞懸濁液を静脈内注射した。注射の２週間後、脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にした。その後、少量の試料を採取して、ＦＡＣＳによってヒトＴ細胞におけるＴＮＦＲ２の発現を測定した（図１５）。このＦＡＣＳは、ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＮＦＲ２発現が、ＮＯＧマウスにおけるインビボで成長および活性化されたヒトＴ細胞と、ヒト腫瘍由来のＴ細胞との間で非常に類似していることを示した。細胞の大部分は、５０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＳＣＩＤマウスに、１０×１０６細胞／マウスに相当する２００μｌの懸濁液を腹腔内注射した。１時間後、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＹｅｒｖｏｙ、抗ＣＤ２５、１－Ｈ１０、１－Ｈ１０－Ｎ２９７Ｑ（１－Ｈ１０のＦｃ欠損バージョン）またはアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかで処置した。マウスの腹腔内液を２４時間後に収集した。ヒトＴ細胞サブセットは、以下のマーカー：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用するＦＡＣＳによって同定および定量化された。
【0234】
１－Ｈ１０のＴｒｅｇ枯渇活性はＹｅｒｖｏｙおよび１－Ｈ１０Ｎ２９７Ｑよりも優れており（図１６）、リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｈ１０がＴｒｅｇを枯渇させ、Ｆｃ相互作用がこの枯渇に関与していることを確認した（図１６Ｄ）。
【0235】
要約すると、実施例５は次のことを示している。
１．アンタゴニストリガンド遮断抗体は、いくつかの腫瘍モデルにわたって強力な抗腫瘍効果を発揮する可能性がある。
２．この効果は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせることで高めることができる。
３．この効果は、活性化ＦｃγＲの結合に依存する。
４．アンタゴニストリガンド遮断代理抗体による処置は、腫瘍のＴ細胞組成を大幅に変化させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ比を増加させ、腫瘍関連マクロファージを減少させる。
５．ヒト腫瘍では、ＴＮＦＲ２を最も発現している細胞はＴｒｅｇである。
６．腫瘍ＴＮＦＲ２発現がＴ細胞で模倣されるヒト異種移植モデルでは、ヒトＴｒｅｇが欠失し（ｄｅｌａｔｅｄ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルが増加する。
７．このＴｒｅｇ欠失は、抗体が活性化ＦｃγＲに結合できる場合に最も顕著になる。
１．アンタゴニストリガンド遮断抗体は、いくつかの腫瘍モデルにわたって強力な抗腫瘍効果を発揮する可能性がある。
２．この効果は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせることで高めることができる。
３．この効果は、活性化ＦｃγＲの結合に依存する。
４．アンタゴニストリガンド遮断代理抗体による処置は、腫瘍のＴ細胞組成を大幅に変化させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ比を増加させ、腫瘍関連マクロファージを減少させる。
５．ヒト腫瘍では、ＴＮＦＲ２を最も発現している細胞はＴｒｅｇである。
６．腫瘍ＴＮＦＲ２発現がＴ細胞で模倣されるヒト異種移植モデルでは、ヒトＴｒｅｇが欠失し（ｄｅｌａｔｅｄ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルが増加する。
７．このＴｒｅｇ欠失は、抗体が活性化ＦｃγＲに結合できる場合に最も顕著になる。
【0236】
実施例６－アンタゴニストリガンド遮断抗体は大量の炎症誘発性サイトカインを誘導しない
（図１７～１８およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
大量の炎症誘発性サイトカインの放出は、患者の治療に使用される免疫調節抗体の考えられる副作用の１つである。したがって、ここでは、２つの異なる方法を使用して、アンタゴニストリガンド遮断抗体によって誘導されるサイトカイン放出を測定した。１つ目は、インビトロ培養での抗体刺激に基づいており、２つ目は、免疫不全マウスへのヒト免疫細胞の異種移植に基づいている。インビトロでは、培養設定がサイトカインの放出に大きな影響を与えることが示されている（Ｖｅｓｓｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｓｅｐ；４２４：４３－５２）。方法論の違いを説明するために、最近の出版物に従って、３つの異なるインビトロ培養設定が使用された。
（図１７～１８およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
大量の炎症誘発性サイトカインの放出は、患者の治療に使用される免疫調節抗体の考えられる副作用の１つである。したがって、ここでは、２つの異なる方法を使用して、アンタゴニストリガンド遮断抗体によって誘導されるサイトカイン放出を測定した。１つ目は、インビトロ培養での抗体刺激に基づいており、２つ目は、免疫不全マウスへのヒト免疫細胞の異種移植に基づいている。インビトロでは、培養設定がサイトカインの放出に大きな影響を与えることが示されている（Ｖｅｓｓｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｓｅｐ；４２４：４３－５２）。方法論の違いを説明するために、最近の出版物に従って、３つの異なるインビトロ培養設定が使用された。
【0237】
高密度細胞培養（ＨＤＣ）サイトカイン放出アッセイ（ＣＲＡ）のために、ＰＢＭＣを２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシンを補充した無血清ＣＴＬ－試験培地（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に１×１０７細胞／ｍｌで培養した。２ｍｌの細胞培養物を１２ウェルプレートにプレーティングした。４８時間後、１０μｇ／ｍｌの抗体を９６ウェル平底プレート内の１×１０５個のプレインキュベートしたＰＢＭＣに添加し、２４時間インキュベートした。
【0238】
ＰＢＭＣ固相（ＳＰ）ＣＲＡは、９６ウェルプレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗体で１時間コーティングすることにより実施した。プレートをＰＢＳで洗浄した後、２００μｌの完全培地中の１×１０５個のＰＢＭＣをウェルごとに添加し、４８時間インキュベートした。
【0239】
サイトカイン放出は、２００μｌの全血を５μｇ／ｍｌの抗体で４８時間刺激した後にも測定された。
【0240】
インキュベーション期間の終わりに、プレートを遠心分離し、培養上清を採取して－２０℃で保存した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－８およびＴＮＦ－αの濃度は、カスタムメイドのＭＳＤプレートを使用して、製造元の指示（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＵＳＡ）に従って測定した。
【0241】
要約すると、遮断アンタゴニスト抗体は、インビトロ設定のいずれにおいても有意なサイトカイン放出を誘発しなかった。陽性対照抗体であるアレムツズマブおよびＯＫＴ３はサイトカインを誘導し、すべてのうち最も顕著なのはＩＦＮ－γであったが、図１７に示すように、１Ｈ１０抗体はアイソタイプ対照抗体を上回ってＩＦＮ－γを誘導しなかった。他のサイトカインは１Ｈ１０によって上昇しなかった（データは示さず）。
【0242】
ＰＢＭＣ－ＮＯＧ忍容性モデル
リガンド遮断アンタゴニスト抗ヒトＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｈ１０の忍容性を調査するために、以下に説明するように、ＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルでのインビボサイトカイン放出を分析した。
リガンド遮断アンタゴニスト抗ヒトＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｈ１０の忍容性を調査するために、以下に説明するように、ＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルでのインビボサイトカイン放出を分析した。
【0243】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。８週齢の雌のＮＯＧマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で維持した。ＰＢＭＣ－ＮＯＧ（初代ヒト異種移植）モデルの場合、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを用いて単離し、洗浄した後、細胞を１２５×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＯＧマウスに、２５×１０６細胞／マウスに相当する２００μｌの細胞懸濁液を静脈内注射した。注射の２週間後、血液サンプルを採取して、ＮＯＧマウスの血液中のヒト細胞の量を意味する「ヒト化」のレベルを分析した。血液は約４０％のヒトＴ細胞で構成され、マウスはヒト化されているとみなした。次に、マウスを１０μｇのＹｅｒｖｏｙ、抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）、１－Ｈ１０またはアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかで処置した。抗体注射前と注射後１時間で体温を測定した、図１８Ａ。図１８Ａに見られるように、陽性対照抗体ＯＫＴ３は、以前に発表されたように、そしてこの抗体を用いた臨床実習（ｃｌｉｎｉｃ）で見られた毒性に従って、体温の劇的な低下を誘導した。対照的に、１－Ｈ１０は体温に全く影響を与えなかった。抗体の注射の５時間後に実験を終了しサイトカイン放出（ＭＳＤ）の分析のために血液を採取した。測定されたサイトカインは、ヒトＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ１βであった。これらのうち、ＩＦＮ－γとＴＮＦ－αは信頼できるほど高いレベルで定量化された。図１８ＢおよびＣに見られるように、陽性対照抗体ＯＫＴ３は有意なＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α放出の両方を誘導したが（この抗体を用いた臨床実習で見られた毒性に従って）、１Ｈ１０処置マウスには有意なＩＦＮ－γ放出がなかった。しかしながら、ＯＫＴ３ほど有意ではなく劇的ではないが、ＴＮＦ－α放出が増大する傾向があった。
【0244】
要約すると、実施例６は、ここでは１－Ｈ１０と呼ばれる抗体で例示されるＴＮＦＲ２リガンド遮断抗体が、以前に発表されたいくつかの方法によって測定されるように、実質的なレベルのサイトカイン放出を誘導しないことを示す。サイトカイン放出はいくつかの免疫調節抗体の臨床開発の制限要因であるため、これは、この点で許容できる安全性プロファイルを示している。
【0245】
実施例７－生成されたＴＮＦＲ２標的化抗体のエピトープ
ドメインコンストラクトのノックアウト
最初の一連の実験では、表１０に記載されている４つの細胞外ドメインのうちの１つ以上が欠落しているＴＮＦＲ２のさまざまな変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。実験の第２のセットでは、表１１に記載されているように、ドメイン３の異なる部分が対応するマウス部分と交換されたＴＮＦＲ２の変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。いずれの抗体もマウスＴＮＦＲと交差反応しないため、後者が可能である。どちらの場合も、コンストラクトはＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から購入した。コンストラクトは、ＣＭＶプロモーターおよびプラスミド複製のＯｒｉＰ由来を含有する発現ベクターにクローン化され、懸濁液に適合されたＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞で一過性に発現された。
ドメインコンストラクトのノックアウト
最初の一連の実験では、表１０に記載されている４つの細胞外ドメインのうちの１つ以上が欠落しているＴＮＦＲ２のさまざまな変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。実験の第２のセットでは、表１１に記載されているように、ドメイン３の異なる部分が対応するマウス部分と交換されたＴＮＦＲ２の変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。いずれの抗体もマウスＴＮＦＲと交差反応しないため、後者が可能である。どちらの場合も、コンストラクトはＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から購入した。コンストラクトは、ＣＭＶプロモーターおよびプラスミド複製のＯｒｉＰ由来を含有する発現ベクターにクローン化され、懸濁液に適合されたＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞で一過性に発現された。
【表10】
【表11】
【0246】
フローサイトメトリーベースの結合分析
ＨＥＫ－２９３－Ｅ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を使用してＴＮＦＲ２変異体のそれぞれのｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、示された抗体で３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、表面に結合した抗体をＡＰＣに結合した二次抗ＩｇＧで染色した。ＢＤ－Ｖｅｒｓｅフローサイトメーターでフローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を洗浄し、生／死を染色した。
ＨＥＫ－２９３－Ｅ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を使用してＴＮＦＲ２変異体のそれぞれのｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、示された抗体で３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、表面に結合した抗体をＡＰＣに結合した二次抗ＩｇＧで染色した。ＢＤ－Ｖｅｒｓｅフローサイトメーターでフローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を洗浄し、生／死を染色した。
【0247】
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリーベースの結合実験は、ドメイン１とドメイン２がこれらの細胞に対する抗体の結合に影響を与えない（ドメイン１）か、わずかに影響を与える（ドメイン２）ことを明確に示した。陽性対照として、ポリクローナル抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を使用した。陽性対照抗体は、試験したすべてのコンストラクトに対して高い結合を示したが、陰性抗体は結合を示さなかった（図１９）。試験したすべての抗体は、ドメイン３を欠くＴＮＦＲ２への結合の完全な欠如を示した。同様に、ドメイン４が欠落している場合、ほとんどの抗体はＴＮＦＲ２に結合できなかった。すべてのアンタゴニスト抗体（１Ｈ１０、４Ｈ０２および５Ｂ０８）は、ＴＮＦＲ２Δ１およびＴＮＦＲ２Δ２への結合と比較して、５０％を超えるＴＮＦＲ２Δ４への結合の劇的な低減を示した。同様に、ＴＮＦＲ２からの２つのドメインの除去は、ドメイン３または４がないと、アゴニスト抗体１Ｆ０６を除いて、試験したすべての抗体のＴＮＦＲ２への結合が大幅に無効になり、ドメイン４がないと、アゴニスト抗体の結合が無効になり、アンタゴニスト抗体の結合が大幅に低減することを明確に示した。（図１９ＥおよびＦ）。
【0248】
マウス－ヒトキメラＴＮＦＲ２への結合
結合部位をさらに絞り込み、エピトープを定義するために、ヒトＴＮＦＲ２ドメイン３の一部を対応するマウス配列に置き換えた。すべての抗体はマウスＴＮＦＲ２に対してほとんど交差反応性を示さないため、特定のコンストラクトへの結合が失われると、結合エピトープを精製することができる。図２０は、さまざまなマウス－ヒトキメラＴＮＦＲ２コンストラクトを示している。ヒト配列からの１４（ｍ１）、１２（ｍ２）、１０（ｍ３）または１６（ｍ４）アミノ酸のいずれかを、対応するマウス配列と交換する４つの異なる置換が行われた。他の３つのドメイン（１、２、４）には、ヒトの配列のみが含有されている。
結合部位をさらに絞り込み、エピトープを定義するために、ヒトＴＮＦＲ２ドメイン３の一部を対応するマウス配列に置き換えた。すべての抗体はマウスＴＮＦＲ２に対してほとんど交差反応性を示さないため、特定のコンストラクトへの結合が失われると、結合エピトープを精製することができる。図２０は、さまざまなマウス－ヒトキメラＴＮＦＲ２コンストラクトを示している。ヒト配列からの１４（ｍ１）、１２（ｍ２）、１０（ｍ３）または１６（ｍ４）アミノ酸のいずれかを、対応するマウス配列と交換する４つの異なる置換が行われた。他の３つのドメイン（１、２、４）には、ヒトの配列のみが含有されている。
【0249】
次に、これらのコンストラクト（３に変異があるＴＮＦＲ２ドメイン１～４）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、フローサイトメトリーアプローチを使用して抗体の結合を試験した。陽性対照として、マウスＴＮＦＲ２およびヒトＴＮＦＲ２に対するポリクローナル抗体を使用した。予想通り、配列の類似性により、両方のポリクローナル対照抗体は有意な交差反応性を示し、ヒトとマウスの両方のＴＮＦＲ２を認識した。明らかに、抗体を目的の標的に一致させると、最良のシグナルが得られた。
【0250】
我々のモノクローナル抗体は、ヒトＴＮＦＲ２に強い結合を示したが、マウスＴＮＦＲ２には結合しないか、ほとんど結合しなかった（図２１の左パネル）。低減がほとんどない同様の結合が、ａａ１１９～１３２に変異があるｈＴＮＦＲ２ｍ１コンストラクトへのすべてのクローンで観察された。これは、どの抗体もその領域内のエピトープに結合しないことを示している。しかしながら、ａａ１３４～１４４（ｈＴＮＦＲ２ｍ２コンストラクト）の変異は、アンタゴニスト抗体１－Ｈ１０、４－Ｈ０２、５－Ｂ０８に対応する、試験した抗体の半分の結合を完全に無効にし、これは、抗体がこの領域内で少なくとも部分的に結合することを示している。１－Ｇ１０は部分的な遮断剤であり、この置換の影響も強く受ける。注目すべきことに、アゴニスト抗体（１－Ｆ０２、１－Ｆ０６および４－Ｅ０８）は、コンストラクト２を使用して結合を保持し、アンタゴニスト抗体と比較して異なるエピトープを強く示唆している。興味深いことに、すべての抗体は、ａａ１５１～１６０に突然変異があるｈＴＮＦＲ２ｍ３コンストラクトへの結合を喪失した。これは、アゴニストとアンタゴニストの両方のすべての抗体が、少なくとも、その配列内に部分的なエピトープを有していることを示している。ａａ１３０～１４４に突然変異があるわずかに大きいコンストラクトｈＴＮＦＲ２ｍ４を試験すると、コンストラクトｈＴＮＦＲ２ｍ２と同様の結合が示された。
【0251】
エピトープ結合についての結論
抗体をそれらの機能的役割にグループ化すると、アゴニスト抗体（１－Ｆ０２、１－Ｆ０６および４－Ｅ０８）は、ａａ１５１～１６０を包含するドメイン３の非常に遠位のＣ末端部分に結合し、おそらくはドメイン４のより大きな部分に広がるようであるのに対し、アンタゴニスト（１－Ｈ１０、５－Ｂ０８、および４－Ｈ０２）のエピトープは、ａａ１３４～１６０を包含するドメイン３の中心に向かってシフトし、おそらくはドメイン４のより小さな部分をカバーする。しかしながら、それにもかかわらず、それらのエピトープはある程度重複しているようである。
抗体をそれらの機能的役割にグループ化すると、アゴニスト抗体（１－Ｆ０２、１－Ｆ０６および４－Ｅ０８）は、ａａ１５１～１６０を包含するドメイン３の非常に遠位のＣ末端部分に結合し、おそらくはドメイン４のより大きな部分に広がるようであるのに対し、アンタゴニスト（１－Ｈ１０、５－Ｂ０８、および４－Ｈ０２）のエピトープは、ａａ１３４～１６０を包含するドメイン３の中心に向かってシフトし、おそらくはドメイン４のより小さな部分をカバーする。しかしながら、それにもかかわらず、それらのエピトープはある程度重複しているようである。
【0252】
ドメイン３、ａａ１１９～１３４のＮ末端部分に結合する抗体はない。ドメイン４への結合部位はすべての抗体である可能性が高いが、完全には同定されていない。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】