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特表2022-512930進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２（ＰＦＩＣ２）の治療のためのコドン最適化ＡＢＣＢ１１導入遺伝子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２（ＰＦＩＣ２）の治療のためのコドン最適化ＡＢＣＢ１１導入遺伝子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/52 20060101AFI20220131BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220131BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220131BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220131BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220131BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220131BHJP
C07K 14/015 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12N15/52 Z ZNA
C12N15/864 100Z
C12N7/01
C12N5/10
A61K48/00
A61P1/16
A61K31/7088
A61K35/76
A61K35/12
C07K14/015
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021524228
(86)(22)【出願日】2019-11-06
(85)【翻訳文提出日】2021-07-06
(86)【国際出願番号】 EP2019080341
(87)【国際公開番号】W WO2020094693
(87)【国際公開日】2020-05-14
(31)【優先権主張番号】18306458.3
(32)【優先日】2018-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521151360
【氏名又は名称】ヴィヴェ テラピューティクス
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ゴンサレス アセギノラサ，グロリア
(72)【発明者】
【氏名】スメルドゥ，クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】パロモ ディアズ，ラウラ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA27
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA75
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA75
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA75
4H045AA10
4H045AA20
4H045CA01
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２の治療に使用する遺伝子治療ベクターに関する。より具体的には、本発明は、ＰＦＩＣ２の治療のためのＢＳＥＰをコードするコドン最適化配列を含むアデノ随伴ウイルスベクターに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＢＳＥＰをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物であって、前記導入遺伝子が配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列である、核酸構築物。
【請求項2】
さらに、肝臓特異的プロモーター、好ましくはα－１－アンチトリプシンプロモーターまたは胆汁酸塩誘導性プロモーターを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項3】
さらに、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を含む、請求項１または２に記載の核酸構築物。
【請求項4】
配列番号３の核酸配列または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列の核酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
【請求項6】
上記発現ベクターがウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項7】
ウイルス粒子であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項５もしくは６に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
【請求項8】
ＡＡＶ粒子であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項５もしくは６に記載の発現ベクターを含み、好ましくは、ＡＡＶ３タイプＡ、ＡＡＶ３タイプＢ、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、ＬＫ０３、ＡＡＶ３－ＳＴ、Ａｎｃ８０およびＡＡＶ８血清タイプからなる群より選択されるカプシドタンパク質などのアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ粒子。
【請求項9】
宿主細胞であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項５もしくは６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞、または、
請求項７もしくは８に記載のウイルス粒子で形質導入された、宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項５もしくは６に記載の発現ベクター、請求項７もしくは８に記載のウイルス粒子、または請求項９に記載の宿主細胞、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項11】
それを必要とする対象者における薬剤としてのその使用のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項５もしくは６に記載の発現ベクター、請求項７もしくは８に記載のウイルス粒子、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項12】
それを必要とする対象者における進行性家族性肝内胆汁鬱滞２タイプ（ＰＦＩＣ２）の予防および／または治療のためのその使用のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項５もしくは６に記載の発現ベクター、請求項７もしくは８に記載のウイルス粒子、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項13】
対象者が、新生児、乳児、小児または成人、好ましくは新生児、乳児または小児、より好ましくは新生児または乳児である、それを必要とする対象者における進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２（ＰＦＩＣ２）の予防および／または治療のためのその使用のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項５もしくは６に記載の発現ベクター、請求項７もしくは８に記載のウイルス粒子、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
請求項７または８に記載のウイルス粒子の製造方法であって、ａ）請求項９に記載の核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞を培養培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程と、
を含む、方法。
【請求項15】
キットであって、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項５もしくは６に記載の発現ベクター、請求項７もしくは８に記載のウイルス粒子、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器中に含みを、１つ以上の容器中に含むキットであって、随意的に、さらに、取扱説明書またはパッケージング材料を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【0001】
本開示は、進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２の治療に使用する遺伝子治療ベクターに関する。より具体的には、本発明がＰＦＩＣ２の治療のためのＢＳＥＰをコードするコドン最適化配列を含むアデノ随伴ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２（ＰＦＩＣ２）は、分子量約１６０ｋＤａの１，３２１アミノ酸蛋白質である胆汁酸トランスポーター（ＢＳＥＰ）を発現する、ＡＢＣＢ１１遺伝子の変異と関連する遺伝病である（Ｋｕｂｉｔｚ Ｒ．ら ２０１２； Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｇａｓ ３６（６）：５３６－５５３）。ＢＳＥＰは主に肝細胞の細胆管膜に発現し、これらの細胞から胆汁への胆汁酸塩の輸送に関与している（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ．Ｅ．２０１２Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｇａｓ ３６ Ｓｕｐｐｌ １： Ｓ２６－Ｓ３５）。ＰＦＩＣ２の徴候および症状は、典型的には肝疾患のみに関連している。ＰＦＩＣ２の患者は、生後数年以内に肝不全へと発展することがしばしばある。さらに、罹患者は肝細胞癌を発症するリスクが高い。ＰＦＩＣ２は、胆汁酸を肝臓に蓄積させ、胆汁酸排出の減少、したがって肝細胞への蓄積を引き起こす（肝内胆汁鬱滞）。細胞の胆汁蓄積は、肝細胞死、血中への胆汁放出、重度のそう痒、門脈圧亢進症への進展、肝不全および肝硬変をもたらし、未治療の患者を最終的には死に至らしめる。ＰＦＩＣ２は希少疾病であり、正確な有病率は不明であるが、推定発症率は出生１００，０００人あたり１人とされている（Ｇｏｎｚａｌｅｓ Ｅ．ら ２０１４．Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２２（４））。この疾患は両性に等しく発症し、世界中から報告されている。
【0003】
現在、ＰＦＩＣ２の治療法は存在せず、したがって、満たされていない医療ニーズは非常に高い。ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）療法は一部の患者の症状を改善する可能性があるが、肝移植以外では現在のところＰＦＩＣ２に対する治癒的治療法はない。（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｅｒｄ、Ｗ．Ｌら Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１７；２３（５）：７６３－７７５）。胆道変更術という形での外科的介入は、患者の転帰を改善する。しかし、感染症などの術後合併症やストーマ袋の問題は患者のＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）に影響を及ぼす一方で、肝硬変や肝癌のリスクは依然として残っている。肝臓移植は有効な治療であるが、そのような複雑な処置に伴う危険性、ならびに状態の再発の可能性を伴う。現在利用可能な治療にもかかわらず、ＰＦＩＣ２患者のＱＯＬと平均余命はまだ限られている。
【0004】
疾患発生の原因となる欠陥遺伝子を修正する遺伝子治療は、多くの疾患に対する有望な治療法である。しかしながら、この技術は依然として研究中である。進行性家族性肝内胆汁鬱滞２（ＰＦＩＣ２）のような肝臓状態を、ＡＢＣＢ１１を含む種々の潜在的治療遺伝子を用いて治療するＲＮＡ療法は、ＷＯ２０１７／１００５５１においてのみ示唆された。したがって、安定かつ長期の導入遺伝子発現を可能にする遺伝子治療法を開発する必要性が依然として存在する。
【0005】
ここでは、ベクターとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いることにより、ＡＢＣＢ１１遺伝子のコドン最適化バージョンの肝臓への送達に基づくＰＦＩＣ２の新しいタイプの治療法について述べる。
【発明の概要】
【0006】
驚くべきことに、本発明者らは、野生型ヒトＢＳＥＰコード遺伝子（ＢＳＥＰ）とは対照的に、ＢＳＥＰコード遺伝子のコドン最適化配列が、インビボで投与された場合、肝細胞の小管膜において特異的に効率的な発現を示したことを見出した。ＰＦＩＣ２症状の大部分を再現するＡｂｃｂ１１－／－ノックアウトマウスにおいて、ＢＳＥＰをコードするコドンを最適化したｃＤＮＡバージョンをコードするＡＡＶの投与は、トランスアミナーゼの有意な減少および胆汁への胆汁酸塩の分泌の回復のような治療効果を達成する。
【0007】
したがって、本開示の第１の態様はＢＳＥＰをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物に関し、該導入遺伝子は、配列番号１によって表されるか、または配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列である。
【0008】
特定の実施形態では、前記核酸構築物はさらに、宿主細胞への導入時に導入遺伝子発現を開始するプロモーター、好ましくは肝臓特異的プロモーター、より好ましくはα－１－アンチトリプシンプロモーターまたは胆汁酸塩誘導性プロモーターを含む。
【0009】
特定の実施形態では、前記核酸構築物はさらに、５’ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）および３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、特にＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を含む。
【0010】
より特定の実施形態では、前記核酸構築物は、配列番号３の核酸配列または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0011】
別の態様では、前記核酸構築物が、発現ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはＡＡＶベクターに含まれる。
【0012】
本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含み、好ましくは、ＡＡＶタイプ３ａ、ＡＡＶタイプ３ｂ、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、ＬＫ０３、ＡＡＶ３－ＳＴ、Ａｎｃ８０およびＡＡＶ８血清タイプからなる群より選択されるカプシドタンパク質などのアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子に関する。
【0013】
本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞、または、本発明のウイルス粒子で形質導入された宿主細胞に関する。
【0014】
本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、またはウイルス粒子を、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物に関する。
【0015】
本発明はまた、それを必要とする対象者における進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２の予防および／または治療などの薬剤として使用するための、本発明の生成物に関する。特定の実施形態では、対象者が、新生児、乳児、小児または成人、好ましくは新生児、乳児または小児、より好ましくは新生児または小児である。
【0016】
また、本明細書には、
ａ）上記のような宿主細胞を培養培地中で培養する工程、および、
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程
を含む、上記のようなウイルス粒子を製造するためのプロセスが開示される。
ａ）上記のような宿主細胞を培養培地中で培養する工程、および、
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程
を含む、上記のようなウイルス粒子を製造するためのプロセスが開示される。
【0017】
本開示はまた、上述したような、核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、ウイルス粒子、または薬学的組成物を、１つ以上の容器中に含み、随意的に、さらに、取扱説明書またはパッケージング材料を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】実験で使用した、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰおよびＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベクターの図。Ａ１ＡＴ Ｐｒ．： Ａ１ＡＴプロモーター、ＩＴＲ：末端逆位反復配列、ｐＡ：合成ポリアデニル化配列
【図2】ｈＢＳＥＰを発現するＡＡＶプラスミドでトランスフェクションされた細胞の免疫蛍光法検査である。Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ２細胞をＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰおよびｐＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰベクターでトランスフェクションし、７２時間後に特異的抗ｈＢＳＥＰ抗体を用いた免疫蛍光法によって分析した。核をＤＡＰＩで染色した。拡大培率：４００倍。
【図3】Ａｂｃｂ１１－／－およびＡｂｃｂ１１＋／＋マウスにおける、ＡＡＶＡｎｃ８０の肝臓への形質導入。示された遺伝子型を有する雌マウスには、２×１０１３ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰ、または同量の生理食塩水を与えた。１ヶ月後にマウスを屠殺し、ＡＡＶウイルスＤＮＡ（Ａ）またはｈＢＳＥＰ ｍＲＮＡレベル（Ｂ）を、それぞれｑＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲによって肝臓抽出物中で定量した。ΔＣｔは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｔ－Ａ１ＡＴプロモーター配列のＣｔ（Ａ）、またはハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｔ－ヒトＡＢＣＢ１１コドンを最適化または非コドン最適化遺伝子（Ｂ）のＣｔに相当する。
【図4】インビボでのｈＢＳＥＰ発現。４週齢の雌Ａｂｃｂ１１－／－マウスに、２×１０１３ ｖｇ／ｍＬのＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰまたはＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰを投与し、１ヶ月後に免疫組織化学によって発現を分析した。雌Ａｂｃｂ１１＋／＋マウスを、ｈＢＳＥＰ染色の陽性対照として使用した（左パネル）。ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを受けた雌Ａｂｃｂ１１－／－マウスは中央パネル内である。矢印は、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰを投与されたマウスにおいて検出された、非常に少数のｈＢＳＥＰ陽性細胞の１つを示す（右パネル）。各群の２匹のマウスからの代表的な写真を示す。
【図5】Ａｂｃｂ１１－／－マウスおよびＡｂｃｂ１１＋／＋マウスにおける血清マーカーである。示された齢（月齢）のＡｂｃｂ１１－／－（ＫＯ）およびＡｂｃｂ１１＋／＋（ＷＴ）マウス（すべてのグループにおいてｎ＞５）における血清中のＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびビリルビン血清バイオマーカーを、ＣＯＢＡＳ分析器（ロッシュ）を用いて分析した。統計解析はＭａｎＷｈｉｔｎｅｙ試験を用いて行った（ＫＯバー上の符号は同齢および同性のＷＴマウスとの比較を示す。水平のバーは同齢の雌雄のＫＯ間の比較を示す）。＊， ｐ＜０．０５； ＊＊、ｐ＜０．０１； ＊＊＊、ｐ＜０．００１； ｎｓ、有意ではない； Ｕ／Ｌ、単位／Ｌ
【図6】ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ治療後のＡｂｃｂ１１－／－マウスにおけるＡＬＰ、トランスアミナーゼ、およびビリルビンレベルである。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－マウスを、６×１０１３ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ（＋ＢＳＥＰ）で処置するか、または未処置のままにし（ｎｔ）、示されたマウスの月齢（すべてのグループにおいてｎ＞７）における、血清中のＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびビリルビンのレベルを測定した。空のバーは、処置マウスにおける基礎レベルに対応する。統計解析は、ＭａｎＷｈｉｔｎｅｙ試験を用いて行った。＊、 ｐ＜０．０５； ＊＊、ｐ＜０．０１； ｎｓ、有意ではない。
【図7】ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ治療１ヶ月後のＡｂｃｂ１１－／－マウスにおける胆汁酸塩濃度である。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－マウス（ｎ＝３または４）を６ｘ１０１３ ｖｇ／ｋｇで処置するか、未処置のままにした。１ヶ月後、マウスを屠殺し、胆汁中の胆汁酸塩の濃度をＣＯＢＡＳ分析器（ロッシュ）で測定し、同齢のＡｂｃｂ１１＋／＋マウスと比較した。統計解析は、ＭａｎＷｈｉｔｎｅｙ検定を用いて行った。＊、 ｐ ＜０．０５。
【図8】ＢＳＥＰを発現するＡＡＶベクターで処置されたＡｂｃｂ１１－／－マウスにおける血清マーカーである。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－（ＫＯ）マウスを６×１０１３ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ（ＡＡＶＡｎｃ８０－ＢＳＥＰ）、ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ（ＡＡＶ８－ＢＳＥＰ）で処置、あるいは未処置（無処置）のままにした。示された齢（月齢、すべてのグループにおいてｎ＞４）における血清中のＡＳＴ（Ａ）およびビリルビン（Ｂ）のレベルを、ＣＯＢＡＳ分析器（ロッシュ）を用いて測定した。無処置Ａｂｃｂ１１＋／＋マウス（ＷＴ）を対照として用いた。空のバーは、処置マウスにおける基礎レベルに対応する。統計解析は、ＭａｎＷｈｉｔｎｅｙ試験を用いて、同齢の処置ＫＯマウスと無処置ＫＯマウスを比較した。＊、 ｐ ＜０．０５； ＊＊、 ｐ ＜０．０１； ＊＊＊、 ｐ＜０．００１ Ｕ／Ｌ、単位／Ｌ。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、胆汁酸トランスポーター（ＢＳＥＰ）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３７３３．２）をコードするコドン最適化配列を含む導入遺伝子に関するものである。ＢＳＥＰ遺伝子とも呼ばれるＡＢＣＢ１１遺伝子によってコードされる膜関連タンパク質は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体のスーパーファミリーのメンバーである。この遺伝子は、胆汁酸塩の腸肝循環に必須の役割を果たす肝臓内在トランスポーター蛋白質をコードする。この遺伝子の突然変異は進行性家族性肝内胆汁鬱滞の一形態を引き起こすが、これは乳児期早期から重度の胆汁鬱滞性肝疾患を伴う遺伝性疾患の一群である。
【0020】
本明細書中で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする外因性ＤＮＡまたはｃＤＮＡをいう。遺伝子産物は、ＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質であり得る。遺伝子産物のコード領域に加えて、導入遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、レポーターエレメント、インシュレーターエレメント、ポリアデニル化シグナルおよび／または他の機能的エレメントのような、発現を促進または増強するための１つ以上のエレメントを含み得るか、またはそれと関連し得る。本発明の実施形態は、任意の公知の適切なプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、レポーターエレメント、インシュレーターエレメント、ポリアデニル化シグナルおよび／または他の機能エレメントを利用し得る。適切なエレメントおよび配列は、当業者に周知である。
【0021】
〔核酸構築物〕
より詳細には、本発明は、ＢＳＥＰをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物に関し、該導入遺伝子は配列番号１もしくは２によって表されるか、または配列番号１もしくは２と少なくとも８０％の同一性を有する。
より詳細には、本発明は、ＢＳＥＰをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物に関し、該導入遺伝子は配列番号１もしくは２によって表されるか、または配列番号１もしくは２と少なくとも８０％の同一性を有する。
【0022】
用語「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、モノマーヌクレオチドから構成されるか、またはモノマーヌクレオチドを含む任意の分子を指すために、互換的に使用され得る。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾されていても、人工的であってもよい。ヌクレオチド配列には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらの配列の各々は、分子の骨格への変更によって、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオエート型ヌクレオチドが使用されてもよい。他のデオキシヌクレオチドアナログには、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’－ホスホラミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートならびにそれらの２’－０－アリルアナログおよび２’－０－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが含まれ、これらは本発明のヌクレオチドに使用することができる。
【0023】
「核酸構築物」という用語は、本明細書中で使用される場合、組み換えＤＮＡ技術の使用から生じる人工核酸分子をいう。核酸構築物は核酸配列のセグメントを含むように修飾された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子であり、これらはさもなければ天然には存在しない様式で組み合わされ、そして並置される。核酸構築物は通常、「ベクター」、すなわち、外因的に作製されたＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される核酸分子である。
【0024】
本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列のアラインメントからの位置における一致（同一の核酸残基）の数をいう。配列同一性は配列ギャップを最小限にしながら、重複および同一性を最大限にするようにアラインメントされた場合の配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに依存して、多数の数学的グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。同様の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントさせるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；４８（３）：４４３－５３）を使用してアラインメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ．；９１（２）：３７９－８０）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；２５（１７）：３３８９－４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．；２１（８）：１４５１－６））を使用してアラインメントされる。核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の範囲内である様々な方法で、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／のようなインターネットウェブサイト上で利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを行うために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書中の目的のために、％核酸配列同一性値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作製するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成される値をいい、ここで、全ての検索パラメーターはデフォルト値、すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープン＝１０およびエンドギャップ伸長＝０．５に設定される
本明細書中で使用される場合、前記核酸構築物は、本発明によるＢＳＥＰをコードする導入遺伝子、および前記コード配列の発現に必要な１つ以上の制御配列を含む。一般に、核酸構築物は、コード配列および選択された遺伝子産物の発現に必要なコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含む。したがって、核酸構築物は、典型的にはプロモーター配列、コード配列、および通常ポリアデニル化部位および／または転写ターミネーターを含む３’非翻訳領域を含む。核酸構築物はまた、さらなる調節エレメント（例えば、エンハンサー配列、ベクター内のＤＮＡフラグメントの挿入を容易にするポリリンカー配列および／またはスプライシングシグナル配列）を含み得る。
本明細書中で使用される場合、前記核酸構築物は、本発明によるＢＳＥＰをコードする導入遺伝子、および前記コード配列の発現に必要な１つ以上の制御配列を含む。一般に、核酸構築物は、コード配列および選択された遺伝子産物の発現に必要なコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含む。したがって、核酸構築物は、典型的にはプロモーター配列、コード配列、および通常ポリアデニル化部位および／または転写ターミネーターを含む３’非翻訳領域を含む。核酸構築物はまた、さらなる調節エレメント（例えば、エンハンサー配列、ベクター内のＤＮＡフラグメントの挿入を容易にするポリリンカー配列および／またはスプライシングシグナル配列）を含み得る。
【0025】
一実施形態では、核酸構築物はプロモーターを含む。前記プロモーターは、宿主細胞への導入時に導入遺伝子発現を開始する。本明細書で使用する「プロモーター」という用語はそれが作動可能に連結されている核酸の転写を指示する調節エレメントを指す。プロモーターは、作動可能に連結された核酸の転写の速度および効率の両方を調節することができる。プロモーターはまた、核酸のプロモーター依存性転写を増強する（「エンハンサー」）または抑制する（「リプレッサー」）他の調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。これらの調節エレメントは、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するために直接的または間接的に作用することが当業者に公知のヌクレオチドの任意の他の配列（例えば、アテニュエーター、エンハンサー、およびサイレンサーを含む）を含むが、これらに限定されない。プロモーターは、作動可能に連結されている遺伝子またはコード配列の転写開始部位の近く、ＤＮＡ配列の同じ鎖および上流（センス鎖の５’領域に向かって）に位置する。プロモーターは、約１００～１０００塩基対の長さであり得る。プロモーター中の位置は、特定の遺伝子についての転写開始部位に対して指定される（すなわち、上流の位置は－１から数えて負の数であり、例えば、－１００は１００塩基対上流の位置である）。
【0026】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、機能的関係にあるポリヌクレオチド（またはポリペプチド）素子の連結をいう。核酸がそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたは転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結された手段は連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続していることである；２つのタンパク質コード領域を連結しなければならない場合、それらは連続しており、リーディングフレームにある。
【0027】
特定の実施形態において、本発明の核酸構築物はさらに、本発明の導入遺伝子に作動可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む。本発明との関連において、「肝臓特異的プロモーター」は、身体の任意の他の組織よりも肝臓においてより活性であるプロモーターである。典型的には、肝臓特異的プロモーターの活性は、他の組織よりも肝臓においてかなり大きい。例えば、このようなプロモーターは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも１０倍活性であり得る（例えば、他の細胞または組織における発現を駆動する能力と比較して、所定の組織における発現を駆動する能力によって決定される）。したがって、肝臓特異的プロモーターはそれに連結された遺伝子の肝臓における活性発現を可能にし、他の細胞または組織におけるその発現を妨げる。
【0028】
１つの実施形態において、肝臓特異的プロモーターは、α１－アンチトリプシン遺伝子プロモーター（ＡＡＴまたはＡ１ＡＴ）（配列番号６）、胆汁酸塩誘導性プロモーター（配列番号６または７）、またはアルブミン遺伝子エンハンサー要素（Ｅａｌｂ）と結合したα１－アンチトリプシン遺伝子プロモーター配列（ＡＡＴまたはＰａ１ＡＴ）を含むキメラプロモーター配列ＥａｌｂＰａ１ＡＴを含む。これらのプロモーター配列はすべて肝臓特異的プロモーターの性質をもっている。
【0029】
これらの核酸構築物の実施形態の各々はまた、ポリアデニリル化シグナル配列を、他の任意のヌクレオチド素子と共に、または他の任意のヌクレオチド素子と共に含まなくてもよい。本明細書中で使用される、用語「ポリアデニル化シグナル」または「ポリ（Ａ）シグナル」は遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の特異的認識配列を意味し、これは前駆体ｍＲＮＡ分子に転写され、遺伝子転写の終結を誘導する。ポリ（Ａ）シグナルは、新たに形成された前駆体ｍＲＮＡの３’末端でのエンドヌクレアーゼによる切断、およびアデニン塩基のみからなるＲＮＡ伸長部分のこの３’末端への付加のシグナルとして作用する（ポリアデニル化プロセス；ポリ（Ａ）尾部）。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの核輸送、翻訳、および安定性に重要である。本発明との関連において、ポリアデニル化シグナルは、哺乳動物細胞における哺乳動物遺伝子および／またはウイルス遺伝子のポリアデニル化を指示し得る認識配列である。
【0030】
ポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、ａ）プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）の３’末端切断およびポリアデニル化の両方に必要であること、ならびに下流転写終結を促進することが示されているコンセンサス配列ＡＡＵＡＡＡ、および、ｂ）ポリ（Ａ）シグナルとしてのＡＡＵＡＡＡの利用効率を制御するＡＡＵＡＡの上流および下流のさらなる素子からなる。哺乳類の遺伝子では、これらのモチーフにかなりのばらつきがある。
【0031】
１つの実施形態において、必要に応じて、上記または下記の様々な実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせて、本発明の核酸構築物のポリアデニリル化シグナル配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子のポリアデニリル化シグナル配列である。適当なポリアデニル化シグナルには、とりわけ、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ ＥＩｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、インシリコ設計ポリアデニル化シグナル（合成）などが含まれる。
【0032】
特定の実施形態において、核酸構築物のポリアデニリル化シグナル配列は、ウサギβグロビン遺伝子に基づく合成ポリ（Ａ）シグナル配列、より詳細には配列番号８の配列を有する合成ポリ（Ａ）である。
【0033】
〔発現ベクター〕
本発明の核酸構築物は、発現ベクターに含まれ得る。本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」は遺伝物質を転写するための、そして特に、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞中に核酸を送達するためのビヒクルとして使用される核酸分子をいう。発現ベクターはまた、このような配列に適合する宿主細胞または宿主生物において遺伝子（導入遺伝子）の発現を達成することができる核酸分子をいう。発現ベクターは、典型的には少なくとも適切な転写調節配列および場合により３’転写終結シグナルを含む。正確な誘導シグナル（内因性またはキメラ転写因子）に応答することができる発現エンハンサーエレメント、または特定の細胞、器官または組織に特異的な発現エンハンサーエレメントのような、発現を達成するのに必要または役立つさらなる因子も存在し得る。ベクターにはプラスミド、ファスミド、コスミド、転移因子、ウイルス、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のベクターは、遺伝子または細胞治療における使用に適したベクターであり、特に肝細胞を標的とするのに適している。
本発明の核酸構築物は、発現ベクターに含まれ得る。本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」は遺伝物質を転写するための、そして特に、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞中に核酸を送達するためのビヒクルとして使用される核酸分子をいう。発現ベクターはまた、このような配列に適合する宿主細胞または宿主生物において遺伝子（導入遺伝子）の発現を達成することができる核酸分子をいう。発現ベクターは、典型的には少なくとも適切な転写調節配列および場合により３’転写終結シグナルを含む。正確な誘導シグナル（内因性またはキメラ転写因子）に応答することができる発現エンハンサーエレメント、または特定の細胞、器官または組織に特異的な発現エンハンサーエレメントのような、発現を達成するのに必要または役立つさらなる因子も存在し得る。ベクターにはプラスミド、ファスミド、コスミド、転移因子、ウイルス、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のベクターは、遺伝子または細胞治療における使用に適したベクターであり、特に肝細胞を標的とするのに適している。
【0034】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＶ、ＭＰＳＶまたはＳＮＶ、レンチウイルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）またはウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシ乳頭腫ウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハルビーマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳房腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【0035】
当技術分野で知られているように、使用すると考えられる特定のウイルスベクターに応じて、機能的ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター用のＡＡＶ ＩＴＲ、またはレンチウイルスベクター用のＬＴＲを得るために、本発明のベクターに適切な配列を導入すべきである。特定の実施形態では、前記ベクターはＡＡＶベクターである。
【0036】
ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療のための潜在的ベクターとしてかなりの関心が生じている。このウイルスの好ましい特性の中には、あらゆるヒト疾患との関連性がないこと、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力があること、感染可能な異なる組織に由来する広範囲の細胞株があることが挙げられる。ＡＡＶゲノムは、４６８１個の塩基を含む線状の一本鎖ＤＮＡ分子から構成される（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ、１９８７、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）３２：２４３－３０７）。ゲノムは両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはＤＮＡ複製の起点としてシスで機能し、ウイルスのパッケージングシグナルとして機能する。ＩＴＲの長さは約１４５ｂｐである。ゲノムの内部非反復部分には２つの大きなオープンリーディングフレームがあり、それぞれＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子として知られている。これらの遺伝子は、ビリオンの複製とパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードしている。特に、少なくとも４つのウイルスタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２およびＲｅｐ ４０から合成され、それらの見かけの分子量に従って命名される。ＡＡＶｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の少なくとも３つのタンパク質をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．１９９２ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ＭｉｃｒｏｂｉｏｌおよびＩｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９を参照のこと。
【0037】
したがって、一実施形態では、本発明の導入遺伝子を含む核酸構築物または発現ベクターは、さらに、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を含む。
【0038】
本明細書中で使用される場合、用語「逆方向末端反復（ＩＴＲ）」は、ウイルスの５’末端（５’ＩＴＲ）に位置するヌクレオチド配列、およびウイルスの３’末端（３’ＩＴＲ）に位置するヌクレオチド配列をいい、これは、パリンドローム配列を含み、そしてＤＮＡ複製の開始の間にプライマーとして機能するＴ型ヘアピン構造を形成するように折り畳まれ得る。これらは、ウイルスゲノムの宿主ゲノムへの組み込み、宿主ゲノムからのレスキュー、ウイルス核酸の成熟ビリオンへのカプシド封入にも必要である。ＩＴＲはベクターゲノムの複製とウイルス粒子へのパッケージングにシスで必要である。
【0039】
本発明のベクターにおける使用のためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有し得るか、または挿入、欠失もしくは置換によって改変され得る。ＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）の血清型は、任意の公知のヒトまたは非ヒトＡＡＶ血清型から選択され得る。特定の実施形態では、核酸構築物またはウイルス発現ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在知られているまたは後に発見された任意の他のＡＡＶ血清型を含む任意のＡＡＶ血清型のＩＴＲを用いることによって実施され得る。
【0040】
一実施形態では、核酸構築物はさらに、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。
【0041】
特定の実施形態において、本発明の核酸構築物は、配列番号３もしくは４を含むか、またはそれらからなるか、または配列番号３もしくは４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。
【0042】
一実施形態では、本発明による核酸構築物またはＡＡＶベクターゲノムは、組み換えバキュロウイルスゲノムに含まれる。本明細書中で使用される「組み換えバキュロウイルスゲノム」という用語は、バキュロウイルス感染および複製を許容する宿主細胞（典型的には昆虫細胞）中での組み換えバキュロウイルスゲノムの自律的複製のためのバキュロウイルス遺伝要素を含む核酸を意味する。明らかに、「組み換えバキュロウイルスゲノム」という用語は、バキュロウイルスに異種性である核酸を含むゲノムを含む。同様に、「組み換えバキュロウイルスゲノム」という用語は、ゲノムが感染サイクルの完了のために必要ではないウイルス配列を欠いていてもよいので、必ずしも完全なバキュロウイルスゲノムを意味しない。特に、組み換えバキュロウイルスゲノムは、ｒＡＡＶ生成に有用な異種ＡＡＶ遺伝子および／または遺伝子治療に使用するためにｒＡＡＶにカプシド封入されるコドン最適化したＢＳＥＰ ｃＤＮＡなどの導入遺伝子を含み得る。本開示において使用するバキュロウイルス遺伝子エレメントは、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）から得られることが好ましい。
【0043】
特定の実施形態では、前記第１および第２のバキュロウイルスゲノム中のバキュロウイルスカテプシンおよびキチナーゼをコードする遺伝子が破壊または欠失される。特に、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスの遺伝子ｖ－ｃａｔｈ（Ａｃ１２７）およびｃｈｉＡ（Ａｃ１２６）は、対応するカテプシンまたはキチナーゼが発現されないか、または不活性型として発現される（すなわち、酵素カテプシンまたはキチナーゼ活性を有さない）ように破壊または欠失され得る。特定の実施形態において、前記組み換えバキュロウイルスゲノムは、少なくともｐ２４遺伝子（Ａｃ１２９）、好ましくは３つのバキュロウイルス遺伝子ｐ１０（Ａｃ１３７）、ｐ２４およびｐ２６（Ａｃ１３６）についてさらに破壊または欠失される。特定の実施形態では、前記組み換えバキュロウイルスゲノムは、機能的ｐ７４バキュロウイルス遺伝子（Ａｃ１３８）を含む（すなわち、前記遺伝子は欠失または破壊されていない）。
【0044】
一方、本発明の核酸構築物または発現ベクターは、合成的５’ＩＴＲおよび／または３’ＩＴＲを使用することによって；ならびに異なる血清型のウイルスに由来する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを使用することによっても実施され得る。ウイルスベクター複製に必要な他の全てのウイルス遺伝子は、以下に記載されるように、ウイルス生成細胞（パッケージング細胞）内にトランスで提供され得る。したがって、ウイルスベクターへのそれらの包含は任意である。
【0045】
一実施形態では、本発明の核酸構築物またはウイルスベクターは、ウイルスの５’ＩＴＲ、ψパッケージングシグナル、および３’ＩＴＲを含む。「ψパッケージングシグナル」はウイルスゲノムのシス作用性ヌクレオチド配列であり、いくつかのウイルス（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス…）では、複製中にウイルスゲノムをウイルスカプシドにパッケージングするプロセスに不可欠である。
【0046】
組み換えＡＡＶウイルス粒子の構築は当該分野で一般に公知であり、そして例えば、ＵＳ ５，１７３，４１４およびＵＳ ５，１３９，９４１；ＷＯ ９２／０１０７０、ＷＯ ９３／０３７６９、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ、ＢＪ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ（１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７－１２９；およびＫｏｔｉｎ、ＲＭ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１に記載されている。
【0047】
〔ウイルス粒子〕
本発明の核酸構築物または発現ベクターは、「ウイルスベクター粒子」とも呼ばれる「ウイルス粒子」を生成するためにウイルスカプシドにパッケージングされてもよい。特定の実施形態では、本発明の核酸構築物または発現ベクターは、「アデノ随伴ウイルス粒子」または「ＡＡＶ粒子」を生成するためにＡＡＶ由来カプシドにパッケージングされる。本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含み、好ましくはアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含むウイルス粒子に関する。
本発明の核酸構築物または発現ベクターは、「ウイルスベクター粒子」とも呼ばれる「ウイルス粒子」を生成するためにウイルスカプシドにパッケージングされてもよい。特定の実施形態では、本発明の核酸構築物または発現ベクターは、「アデノ随伴ウイルス粒子」または「ＡＡＶ粒子」を生成するためにＡＡＶ由来カプシドにパッケージングされる。本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含み、好ましくはアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含むウイルス粒子に関する。
【0048】
ＡＡＶベクター粒子という用語は、遺伝子操作された任意の組み換えＡＡＶベクター粒子または突然変異体ＡＡＶベクター粒子を包含する。組み換えＡＡＶ粒子は、同じまたは異なる血清型のＡＡＶに対応する天然または突然変異体Ｃａｐタンパク質によって形成されるウイルス粒子上に、特定のＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲを含む核酸構築物またはウイルス発現ベクターをカプシド封入することによって調製され得る。
【0049】
アデノ随伴ウイルスのウイルスカプシドのタンパク質には、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３がある。様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質配列の相違は、細胞侵入のための異なる細胞表面受容体の使用をもたらす。これは、別の細胞内プロセシング経路と組み合わせて、各ＡＡＶ血清型に対して異なる組織親和性を生じる。
【0050】
天然に存在するＡＡＶウイルス粒子の構造的および機能的特性を改変および改善するために、いくつかの技術が開発されている（Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈら Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２００８；１０：７１７－７３３；Ｐａｕｌｋら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１８．２６（１）：２８９－３０３；Ｗａｎｇ Ｌら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１５．２３（１２）１８７７－８７；Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１６．２４（６）：１０４２－１０４９；Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１５；１２（６）：１０５６－６８）。
【0051】
したがって、本開示によるＡＡＶウイルス粒子において、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲを含む核酸構築物またはウイルス発現ベクターは、例えば、以下のようにパッケージングされ得る：
ａ）同一または異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ５カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡｎｃ８０カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質）に由来するカプシドタンパク質で構成されるウイルス粒子；
ｂ）異なるＡＡＶ血清型または突然変異体由来のカプシドタンパク質の混合物で構成されるモザイクウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）；
ｃ）異なるＡＡＶ血清型または変異体（例えば、ＡＡＶ３ドメインを有するＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）間のドメインスワッピングにより切断されたカプシドタンパク質で構成されるキメラウイルス粒子。
ａ）同一または異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ５カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡｎｃ８０カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質）に由来するカプシドタンパク質で構成されるウイルス粒子；
ｂ）異なるＡＡＶ血清型または突然変異体由来のカプシドタンパク質の混合物で構成されるモザイクウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）；
ｃ）異なるＡＡＶ血清型または変異体（例えば、ＡＡＶ３ドメインを有するＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）間のドメインスワッピングにより切断されたカプシドタンパク質で構成されるキメラウイルス粒子。
【0052】
当業者は、本開示によるＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４（Ｐａｕｌｋら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８．２６（１）：２８９－３０３）、ＬＫ０３（Ｗａｎｇ Ｌら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５（１２）：１８７７－８７）、ＡＡＶ３－ＳＴ（Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６．２４（６）：１０４２－１０４９）、Ａｎｃ８０（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１５；１２（６）：１０５６－６８）および現在知られているまたは後に発見された他のＡＡＶ血清型を含む任意のＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含み得ることを認識するであろう。
【0053】
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、肝細胞への送達に、より適したＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群より選択される血清型由来のカプシドタンパク質を含む（Ｎａｔｈｗａｎｉら、Ｂｌｏｏｄ ２００７；１０９：１４１４－１４２１；Ｋｉｔａｊｉｍａら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００６；１８６：６５－７３）。
【0054】
特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、肝臓、筋肉および網膜を標的とするための非常に強力な遺伝子治療ベクターとして挙動する、ウイルスＡＡＶ血清型１、２、８および９の予測される祖先であるＡｎｃ８０由来のカプシドタンパク質を含む（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ．２０１５；１２（６）：１０５６－６８）。より特定の実施形態では、ウイルス粒子は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３カプシドタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＫＴ２３５８０４）を含む。
【0055】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含み、そして好ましくはＡｎｃ８０およびＡＡＶ８血清型、より好ましくはＡＡＶ８血清型由来のカプシドタンパク質のようなアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子に関する。
【0056】
特定の実施形態では、ウイルス粒子は、組み換えバキュロウイルスに含まれるＡＡＶベクターゲノムを含む。したがって、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐを含む第２の組み換えバキュロウイルスゲノムが、ＡＡＶウイルス粒子を生成するために使用される。特定の実施形態において、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、異なるバキュロウイルス後期プロモーターから、好ましくは逆方向で発現される。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、第２のバキュロウイルスゲノムは、ｒｅｐタンパク質、例えば、バキュロウイルス多面体（ＰＰｈ）プロモーターの転写制御下にあるＡＡＶ２由来のｒｅｐタンパク質をコードする異種核酸を含む。他の実施形態では、第２のバキュロウイルスゲノムは、ｐ１０バキュロウイルスプロモーターの転写制御下でｃａｐタンパク質をコードする異種核酸を含む。昆虫細胞における適切な発現のための、および／またはＶＰおよびビリオンの収率を増加させるための、またはビリオンの親和性を変化させるかまたは抗原性を減少させるための、野生型ＡＡＶ配列の他の改変もまた、当該分野で公知である。ＡＡＶ血清型のｒｅｐ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）および異なる血清型ＡＡＶのｃａｐ ＯＲＦをコードするヘルパーバキュロウイルス構築物を用いることにより、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲに隣接するベクターを、異なる血清型の構造カプシドタンパク質から集合したビリオンにパッケージングすることが可能である。モザイクベクター、キメラベクターまたは標的ベクターをパッケージングすることも、この同じ手順によって可能である。
【0057】
ウイルス－グリカン相互作用は宿主細胞侵入の重要な決定因子である。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は１つ以上のアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質を含み、ここで、この置換は、ＡＡＶカプシドタンパク質に新しいグリカン結合部位を導入する。より特定の実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＡＶ２中のアミノ酸２６６、アミノ酸４６３～４７５およびアミノ酸４９９～５０２、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡｎｃ８０およびＡｎｃ８０Ｌ６５を含む任意の他のＡＡＶ血清型中の対応するアミノ酸位置にある。
【0058】
導入された新しいグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位［例えば、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）またはフコース（ｆｕｃ）結合部位］；シアル酸（Ｓｉａ）結合部位［例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＳＡｃ）またはＮ－グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＳＧｃ）などのＳｉａ残基］；または二糖類結合部位であってよく、二糖類は例えば、Ｓｉａ（α２，３）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌの形態でガラクトースに結合したシアル酸である。ＡＡＶ血清型からの新しい結合部位を別の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質に導入するための詳細なガイダンスは、国際特許公開ＷＯ２０１４１４４２２９およびＳｈｅｎら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０１３；２８８（４０）：２８８１４－２８８２３）に記載されている。特定の実施形態において、ＡＡＶ９由来のＧａｌ結合部位は、ＡＡＶ２ ＶＰ３骨格に導入され、細胞侵入のためにＨＳおよびＧａｌ受容体の両方を使用することができる二重グリカン結合ＡＡＶ歪を生じる。好ましくは、前記二重グリカン結合ＡＡＶ歪はＡＡＶ２Ｇ９である。Ｓｈｅｎらは、ＡＡＶ９ ＶＰ３カプシドタンパク質サブユニット上のＧａｌ認識部位に直接関連するまたは直接隣接するアミノ酸残基を、ＡＡＶ９ ＶＰ３サブユニットコード領域上の対応する残基に置き換えることによって、ＡＡＶ２Ｇ９を生成した（ＡＡＶ２ ＶＰ３番号Ｑ４６４Ｖ、Ａ４６７Ｐ、Ｄ４６９Ｎ、Ｉ４７０Ｍ、Ｒ４７１Ａ、Ｄ４７２Ｖ、Ｓ４７４Ｇ、Ｙ５００ＦおよびＳ５０１Ａ）。
【0059】
別の実施形態では、本開示による使用のためのウイルス粒子は、Ａｄ５ウイルス粒子などのアデノウイルス粒子であってもよい。ＡＡＶウイルス粒子の場合のように、Ａｄウイルス粒子のカプシドタンパク質はまた、それらの親和性および細胞標的化特性を改変するように操作され得、代替のアデノウイルス血清型もまた使用され得る。
【0060】
〔ウイルス粒子の製造プロセス〕
上記に開示される発現ウイルスベクターを保有するウイルス粒子の生成は、従来の方法およびプロトコールによって実施され得、これらは生成されるべきベクターの発現ベクターおよびウイルス粒子の実際の実施形態のために選択される構造的特徴を考慮して選択される。
上記に開示される発現ウイルスベクターを保有するウイルス粒子の生成は、従来の方法およびプロトコールによって実施され得、これらは生成されるべきベクターの発現ベクターおよびウイルス粒子の実際の実施形態のために選択される構造的特徴を考慮して選択される。
【0061】
簡潔には、ウイルス粒子は、宿主細胞、より詳細には、ヘルパーベクターまたはウイルスまたは他のＤＮＡ構築物の存在下で、パッケージングされる核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクションされる特異的ウイルス生成細胞（パッケージング細胞）において生成され得る。
【0062】
本明細書中で使用される用語「パッケージング細胞」は、本発明の核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクションされ得る細胞または細胞株をいい、そしてウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングに必要とされる全ての欠失した機能をトランスで提供する。典型的には、パッケージング細胞は、構成的または誘導可能な様式で、１つ以上の前記欠失ウイルス機能を発現する。前記パッケージング細胞は、接着細胞または懸濁細胞であり得る。
【0063】
典型的には、ウイルス粒子の製造プロセスは、以下の工程を含む：
ａ）上記の核酸構築物または発現ベクターを含むパッケージング細胞を培養培地中で培養する工程；および、
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程。
ａ）上記の核酸構築物または発現ベクターを含むパッケージング細胞を培養培地中で培養する工程；および、
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程。
【0064】
従来の方法を使用して、本発明の導入遺伝子を保有する核酸構築物または発現ベクター（例えば、プラスミド）；ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を保有しない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；ならびにＡＡＶ複製に必要なアデノウイルス機能を提供する第３の核酸構築物（例えば、プラスミド）との一過性細胞同時トランスフェクションにて存在するＡＡＶウイルス粒子を生成し得る。ＡＡＶ複製に必要なウイルス遺伝子はここではウイルスヘルパー遺伝子と称する。典型的には、ＡＡＶ複製に必要な前記遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、またはＶＡ ＲＮＡなどのアデノウイルスヘルパー遺伝子である。好ましくは、アデノウイルスヘルパー遺伝子は、Ａｄ５またはＡｄ２血清型のものである。
【0065】
本開示によるＡＡＶ粒子の大規模製造はまた、例えば、組み換えバキュロウイルスの組み合わせを用いた昆虫細胞の感染によって実施され得る（Ｕｒａｂｅら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００２；１３：１９３５－１９４３）。ＳＦ９細胞を、ＡＡＶｒｅｐ、ＡＡＶｃａｐおよびパッケージングされるべきＡＡＶベクターをそれぞれ発現する２つまたは３つのバキュロウイルスベクターに同時感染させる。組み換えバキュロウイルスベクターは、ウイルス複製および／またはパッケージングに必要なウイルスヘルパー遺伝子機能を提供する。Ｓｍｉｔｈら ２００９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｖｏｌ．１７、ｎｏ．１１、ｐｐ １８８８－１８９６）はさらに、昆虫細胞におけるＡＡＶ粒子の大規模製造のための二重バキュロウイルス発現系を記載している。
【0066】
適切な培養培地は、当業者に公知である。このような培地を構成する成分は、培養される細胞のタイプに依存して異なり得る。栄養組成物に加えて、浸透圧およびｐＨは、培養培地の重要なパラメーターと考えられる。細胞増殖培地は、アミノ酸、ビタミン、有機塩および無機塩、炭水化物の供給源、脂質、微量元素（ＣｕＳ０４、ＦｅＳ０４、Ｆｅ（Ｎ０３）３、ＺｎＳ０４…）を含む、当業者に周知の多くの成分を含み、各成分は、インビトロでの細胞の培養（すなわち、細胞の生存および増殖）を支持する量で存在する。成分はまた、緩衝物質（重炭酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓなど）、酸化安定剤、機械的ストレスを打ち消すための安定剤、プロテアーゼインヒビター、動物成長因子、植物加水分解物、凝集防止剤、消泡剤などの種々の補助物質を含んでもよい。細胞増殖培地の特性および組成は、特定の細胞要件に応じて異なる。市販の細胞増殖培地の例は、ＭＥＭ（最小必須培地）、ＢＭＥ（基礎培地Ｅａｇｌｅ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏにより改変したＥａｇｌｅ培地）、Ｉｓｃｏｖｅｓ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの培地のＩｓｃｏｖｅによる改変）、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５、ＭｃＣｏｙ’ｓ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｈａｍ（Ｈａｍの培地）Ｆ１０および誘導体、Ｈａｍ Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などである。
【0067】
本開示による使用のためのウイルスベクターの構築および製造についてのさらなるガイダンスは、遺伝子治療のためのウイルスベクター、方法およびプロトコールに見出すことができる。シリーズ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７３７．ＭｅｒｔｅｎおよびＡｌ－Ｒｕｂｅａｉ（編）；２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍ． Ｇｉａｃｃａ．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ ＲおよびＷｅｇｅｒ Ｓ．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９７；Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（編）．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；ｐｐ．１４３－１７０；Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｒ．Ｏ．ＳｎｙｄｅｒおよびＰ．Ｍｏｕｌｌｌｉｅｒ（編）。２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈら Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００８；１０：７１７－７３３；；アデノウイルス：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍ． ＣｈｉｌｌｏｎおよびＡＢｏｓｃｈ（編）；Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ２０１４ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
【0068】
〔宿主細胞〕
別の態様において、本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。より詳細には、本発明による宿主細胞は、ヘルパーベクターまたはウイルスまたは他のＤＮＡ構築物の存在下で、本発明による当該核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクションされ、ウイルス粒子の完全な複製およびパッケージングに必要とされる全ての欠失した機能をトランスで提供する、パッケージング細胞とも呼ばれる特異的ウイルス生成細胞である。前記パッケージング細胞は、接着細胞または懸濁細胞であり得る。
別の態様において、本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。より詳細には、本発明による宿主細胞は、ヘルパーベクターまたはウイルスまたは他のＤＮＡ構築物の存在下で、本発明による当該核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクションされ、ウイルス粒子の完全な複製およびパッケージングに必要とされる全ての欠失した機能をトランスで提供する、パッケージング細胞とも呼ばれる特異的ウイルス生成細胞である。前記パッケージング細胞は、接着細胞または懸濁細胞であり得る。
【0069】
例えば、前記パッケージング細胞は真核細胞、例えば、哺乳動物細胞（サル、ヒト、イヌおよびげっ歯類細胞を含む）であり得る。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ０１／３８３６２）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ ＬＣ２）および胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ１６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）またはＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）である。齧歯類細胞の例は、ハムスター細胞、例えばＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはＣＨＯ細胞である。
【0070】
哺乳動物供給源の代替として、ウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジなどのトリ供給源に由来し得る。鳥類細胞株の例には、鳥類胚幹細胞（ＷＯ０１／８５９３８およびＷＯ０３／０７６６０１）、不死化アヒル網膜細胞（ＷＯ２００５／０４２７２８）、およびニワトリ細胞（ＷＯ２００６／１０８８４６）を含む鳥類胚幹細胞由来細胞、またはＥＢ６６細胞株（ＷＯ２００８／１２９０５８およびＷＯ２００８／１４２１２４）などのアヒル細胞が含まれる。
【0071】
別の実施形態において、細胞は、バキュロウイルス感染および複製パッケージング細胞を許容する任意の細胞であり得る。特定の実施態様において、前記細胞は昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）または高い Ｆｉｖｅ（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）である。
【0072】
したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は以下のものを含む：
・本発明によるＢＳＥＰをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物または発現ベクター（例えば、本発明によるＡＡＶベクター）、
・核酸構築物、例えば、ＩＴＲ配列を保有しないＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、および／または、
・ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物、例えばプラスミドまたはウイルス。
・本発明によるＢＳＥＰをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物または発現ベクター（例えば、本発明によるＡＡＶベクター）、
・核酸構築物、例えば、ＩＴＲ配列を保有しないＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、および／または、
・ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物、例えばプラスミドまたはウイルス。
【0073】
別の態様において、本発明は本発明のウイルス粒子で形質導入された宿主細胞に関し、そして本明細書中で使用される用語「宿主細胞」は、目的のウイルスによる感染に感受性であり、そしてインビトロでの培養に従順である任意の細胞株をいう。
【0074】
本発明の宿主細胞は、生体外遺伝子治療目的のために使用され得る。このような実施形態において、細胞は、本発明のウイルス粒子で形質導入され、その後、患者または対象者に移植される。移植された細胞は、自家性、同種性または異種性の起源を有し得る。臨床使用のために、細胞単離は一般的にＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）条件下で実施される。移植の前に、細胞の質および微生物または他の汚染物質の不在を典型的にチェックし、放射線および／または免疫抑制処理などによる肝臓のプレコンディショニングを行うことができる。さらに、宿主細胞は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの、細胞増殖および／または分化を刺激するための成長因子とともに移植されてもよい。
【0075】
特定の実施形態において、宿主細胞は、肝臓への生体外遺伝子治療のために使用される。好ましくは、前記細胞は、ヒト、類人猿、チンパンジー、サル、およびオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌおよびネコを含む飼育動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜、または限定されないがマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種などの真核細胞であるが、これらに限定されない。当業者は、移植される患者または対象者に従って、より適切な細胞を選択する。
【0076】
前記宿主細胞は、幹細胞または誘導多能性幹細胞などの自己再生および多能性特性を有する細胞であってもよい。幹細胞は、好ましくは間葉幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または筋細胞の少なくとも１つに分化することができ、任意のタイプの組織から単離することができる。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、または末梢血から単離される。それらを得るための方法は、当業者に周知である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても知られる）は、成体細胞から直接生成できる多能性幹細胞の一種である。Ｙａｍａｎａｋａらは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子をマウスおよびヒト線維芽細胞に移入し、そして細胞に遺伝子を強制的に発現させることによって、ｉＰＳ細胞を誘導した（ＷＯ ２００７／０６９６６６）。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、続いて、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの代わりにＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を使用してヒトｉＰＳ細胞を生成した（ＷＯ ２００８／１１８８２０）。
【0077】
前記宿主細胞はまた、肝細胞であってもよい。細胞単離およびその後のヒトまたはマウスレシピエントへの移植を含む肝細胞移植手順は例えば、ＦｉｌｉｐｐｉおよびＤｈａｗａｎ、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２０１４，１３１５ １３１５ ５０－５５；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９６，１１１：１６５４－１６６０；Ｉｒａｎｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１、３：３、３０２－３０９；およびＶｏｇｅｌら Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１４、３７：１６５－１７６に記載されている。ウイルス粒子の肝細胞への生体外形質導入のための方法は例えば、Ｍｅｒｌｅら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００６、４１：８、９７４－９８２に記載されている。
【0078】
〔薬学的組成物〕
本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、または宿主細胞を、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて含む薬学的組成物に関する。
本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、または宿主細胞を、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて含む薬学的組成物に関する。
【0079】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能である」は、動物および／またはヒトにおける使用のために、規制当局によって承認されたか、または欧州薬局方のような認知されたことを意味する。用語「賦形剤」は、それと治療剤とが一緒に投与されるような、希釈剤、補助剤、担体、またはビヒクルをいう。
【0080】
任意の適切な薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤が、薬学的組成物の調製において使用され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ ＲＧｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｐｒｉｌ １９９７を参照のこと）。薬学的組成物は典型的には無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定である。薬学的組成物は、溶液（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液、または他の薬学的に受容可能な滅菌流体）、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い生成物濃度を収容するのに適した他の秩序だった構造（例えば、微粒子またはナノ粒子）として処方され得る。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持される。多くの場合に、等張剤、例えば糖質、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。
【0081】
注射可能な組成物の延長された吸収は組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。本発明の生成物は、制御放出製剤で、例えば、注入およびマイクロカプセル化送達システムを含む、生成物を急速放出から保護する徐放性ポリマーまたは他の担体を含む組成物で投与され得る。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸／ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ）などの生分解性および生体適合性ポリマーを使用することができる。好ましくは、前記薬学的組成物は、溶液として、より好ましくは、任意に緩衝化された生理食塩水溶液として製剤化される。補足的な活性化合物もまた、本発明の薬学的組成物に組み込むことができる。追加の治療薬の同時投与に関するガイダンスは例えば、カナダ薬学者協会の医薬品専門部会（ＣＰＳ）に見出すことができる。
【0082】
一実施形態では、薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内投与に適した組成物を含む非経口薬学的組成物である。これらの薬学的組成物は、例示的なものにすぎず、他の非経口および非経口投与経路に適した薬学的組成物を限定するものではない。本明細書中に記載される薬学的組成物は、単一の単位用量形態または複数の用量形態でパッケージングされ得る。
【0083】
一実施形態では、薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内投与に適した組成物を含む非経口薬学的組成物である。これらの薬学的組成物は、例示的なものにすぎず、他の非経口および非経口投与経路に適した薬学的組成物を限定するものではない。本明細書中に記載される薬学的組成物は、単一の単位用量形態または複数の用量形態でパッケージングされ得る。
【0084】
〔治療的用途〕
さらなる態様において、本発明は、それを必要な対象者における薬剤として使用するための、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、それを必要な対象者における薬剤として使用するための、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物に関する。
【0085】
本明細書で使用される「対象者」または「患者」という用語は哺乳動物を指す。開示された治療方法から恩恵を受けることができる哺乳動物種には、ヒト、類人猿、チンパンジー、サル、およびオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌおよびネコを含む飼育動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜、または限定されないがマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記対象者は、新生児、乳児、または小児、より具体的には新生児または乳児である。本明細書で使用される「新生児」は２８日未満の乳児を指し、本明細書で使用される「乳児」は、２９日から２年の間の子供を指す。
【0086】
さらなる態様において、本発明は、肝疾患、特にそれを必要とする対象者における進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ２（ＰＦＩＣ２）の処理における使用のための、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物に関する。
【0087】
本明細書中で使用される場合、用語「処理」は、疾患の治療、予防、予防法および遅延のような、患者の健康状態を改善することが意図される任意の行為をいう。特定の実施形態では、このような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。本発明によれば、ＰＦＩＣ２に関連する症状の例は、肝細胞死、肝細胞内部および血液中での胆汁酸塩の蓄積並びに胆汁流の減少、重度のそう痒症、永続的な黄疸、門脈圧亢進症への進展、肝不全、並びに肝硬変である。他の実施形態では、この用語は、このような疾患を有する対象者への１つ以上の治療薬の投与から生じる疾患の広がりまたは悪化を最小限にすることを指す。
【0088】
特定の実施形態では、肝疾患は、ＰＦＩＣ２、ＢＲＩＣ－２（良性反復性胆汁鬱滞２タイプ）またはＩＣＰ（肝内妊娠胆汁鬱滞）、薬物誘発性胆汁鬱滞、および一過性新生児胆汁鬱滞からなる群より選択される。
【0089】
より特定の実施形態では、前記肝疾患は、ＰＦＩＣ２である。
【0090】
関連する態様において、本発明は、肝疾患の処理において使用するための、好ましくは家族性タイプ２胆汁鬱滞（ＰＦＩＣ２）の処理において使用するための薬剤の調製における、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物の使用に関する。
【0091】
さらなる態様において、本発明は、治療有効量の本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または薬学的組成物を対象者に投与することを含む、それを必要とする対象者における肝疾患、好ましくはＰＦＩＣ２を治療および／または予防する方法に関する。
【0092】
本発明との関連において、「有効量」は、治療有効量を意味する。
本明細書において使用される場合、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間において有効な量をいい、例えば、例えば、胆汁酸塩の胆汁への分泌の改善または回復をいう。本発明の生成物、またはそれを含む薬学的組成物の治療有効量は、個々の疾患状態、年齢、性別、および重量、ならびに個々において所望の応答を誘発する生成物または薬学的組成物の能力などの因子に従って異なり得る。用量・用法は、最適の治療応答を提供するために調節してよい。治療有効量はまた、典型的には、生成物または薬学的組成物の任意の毒性または有害な効果を治療上有益な作用が上回る量である。
本明細書において使用される場合、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間において有効な量をいい、例えば、例えば、胆汁酸塩の胆汁への分泌の改善または回復をいう。本発明の生成物、またはそれを含む薬学的組成物の治療有効量は、個々の疾患状態、年齢、性別、および重量、ならびに個々において所望の応答を誘発する生成物または薬学的組成物の能力などの因子に従って異なり得る。用量・用法は、最適の治療応答を提供するために調節してよい。治療有効量はまた、典型的には、生成物または薬学的組成物の任意の毒性または有害な効果を治療上有益な作用が上回る量である。
【0093】
本発明の生成物による治療は、ＰＦＩＣ２の１つまたは複数の症状の重篤度を緩和、改善、または軽減低減することができる。例えば、治療により、胆汁への胆汁酸塩の分泌を増加および／または回復させ；肝臓および血液中の胆汁酸塩の量を減少させ、そう痒症を減少させ、血清中のトランスアミナーゼレベルを低下させる肝障害を減少させる可能性があり、その結果、疾患の重篤度を緩和、改善、または軽減低減しうる。
【0094】
本発明の生成物は、典型的には、薬学的組成物または薬剤中に含まれ、場合により薬学的担体、希釈剤および／またはアジュバントと組み合わせて含まれる。このような組成物または薬剤は、所望の治療効果を提供するのに十分な有効量の本発明の生成物、および薬学的に受容可能な担体または賦形剤を含む。
【0095】
１つの実施形態において、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、またはその治療用途のための薬学的組成物は、非経口経路によって、特に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内経路によって、対象者または患者に投与される。
【0096】
１つの実施形態において、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、またはその治療用途のための薬学的組成物は間質経路によって、すなわち、組織の間隙への、またはその中への注入によって投与される。組織標的は、特異的であってもよく、例えば肝臓組織であってもよく、またはいくつかの組織、例えば筋肉組織および肝臓組織の組み合わせであってもよい。例示的な組織標的は、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着物、腎臓、肺、血管内皮、上皮および／または造血細胞を含み得る。好ましい実施形態において、それは、肝内注入、すなわち、肝組織の間質空間への注入によって投与される。
【0097】
対象者または患者に投与される本発明の生成物の量は、個体の年齢、性別、および体重；疾患の性質および段階、疾患の攻撃性；投与経路；および／または対象者または患者に処方された併用薬を含む、個々の対象者または患者の特定の状況に依存して異なり得る。用量・用法は、最適の治療応答を提供するために調節してよい。
【0098】
任意の特定の対象者について、特定の用量・用法は、個々の必要性、および組成物を投与するまたは投与を監督する人の専門的判断に従って、経時的に調節され得る。本明細書に記載される用量範囲は単に例示的なものであり、医師によって選択され得る用量範囲を限定するものではない。
【0099】
一実施形態において、本発明によるＡＡＶウイルス粒子は、ＰＦＩＣ２病の治療のために、５×１０１１～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ（ｖｇ：ウイルスゲノム；ｋｇ：対象者または患者の体重）の範囲内に含まれる量または用量で対象者または患者に投与することができる。より特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの範囲内に含まれる量で投与される。より特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、少なくとも２×１０１３ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは３．５×１０１３ ｖｇ／ｋｇ、より好ましくは５×１０１３ ｖｇ／ｋｇ、より好ましくは６×１０１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0100】
〔キット〕
別の態様において、本発明はさらに、１つ以上の容器中に本発明の核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、ウイルス粒子または薬学的組成物を含むキットに関する。キットは、キット内に含まれる核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物を患者に投与する方法を記載する取扱説明書またはパッケージング材料を含み得る。キットの容器は任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属など、および任意の適切なサイズ、形状、または構成であり得る。特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液形態の本発明の生成物を含有する１つ以上のアンプルまたはシリンジを含み得る。
別の態様において、本発明はさらに、１つ以上の容器中に本発明の核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、ウイルス粒子または薬学的組成物を含むキットに関する。キットは、キット内に含まれる核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物を患者に投与する方法を記載する取扱説明書またはパッケージング材料を含み得る。キットの容器は任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属など、および任意の適切なサイズ、形状、または構成であり得る。特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液形態の本発明の生成物を含有する１つ以上のアンプルまたはシリンジを含み得る。
【0101】
以下の実施例は例示のために提供され、そしてそれらは本発明を限定することを意図しない。さらに、本発明は、本明細書に記載される特定の好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。
【0102】
〔実施例〕
〔α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターの下流にヒトＡＢＣＢ１１ ｃＤＮＡを有するＡＡＶベクターゲノムを含むプラスミドの分子工学〕
胆汁酸トランスポーター（ｈＢＳＥＰ）遺伝子とも呼ばれるヒトＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１１（ＡＢＣＢ１１）遺伝子ｃＤＮＡ配列（３，９６３ｂｐ）を用いて、野生型ｈＢＳＥＰ ｃＤＮＡまたはそのコドン最適化バージョンのいずれかを有する、さらなるＡＡＶ粒子製造を可能にする２つのプラスミドを作製した。両プラスミドについて、ｃＤＮＡ配列をＡ１ＡＴプロモーターの下流にクローニングし、この発現カセットを、ｐＡＡＶ２プラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いてＡＡＶ２ ＤＮＡ骨格にさらに挿入した。
〔α－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターの下流にヒトＡＢＣＢ１１ ｃＤＮＡを有するＡＡＶベクターゲノムを含むプラスミドの分子工学〕
胆汁酸トランスポーター（ｈＢＳＥＰ）遺伝子とも呼ばれるヒトＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１１（ＡＢＣＢ１１）遺伝子ｃＤＮＡ配列（３，９６３ｂｐ）を用いて、野生型ｈＢＳＥＰ ｃＤＮＡまたはそのコドン最適化バージョンのいずれかを有する、さらなるＡＡＶ粒子製造を可能にする２つのプラスミドを作製した。両プラスミドについて、ｃＤＮＡ配列をＡ１ＡＴプロモーターの下流にクローニングし、この発現カセットを、ｐＡＡＶ２プラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いてＡＡＶ２ ＤＮＡ骨格にさらに挿入した。
【0103】
ｃｏ－ｈＢＳＥＰ担持プラスミドを生成するために、ヒトＡＢＣＢ１１タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００３７３３．２）に基づくコドン最適化ｈＢＳＥＰ ｃＤＮＡ配列の上流に、Ａ１ＡＴプロモーターを含有する合成ＤＮＡカセットを生成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。次いで、このカセットを、ＡＡＶ２プラスミド骨格（ｐＡＡＶ２）の２つの内部末端反復配列（ＩＴＲ）の間に挿入し、ｐＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを生成した。得られたＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベクターゲノムは４，７３４ｂのサイズを有し、これは、ＡＡＶ粒子のパッケージング限界内である。ｐＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを、配列決定および制限酵素分析によって制御した。このプラスミドは、任意の血清型またはカプシド変異体のＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベクターの生成を可能にする。
【0104】
ｐＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰにおいて、ｃｏ－ｈＢＳＥＰ ｃＤＮＡを含むＳａｌ Ｉ－Ｎｄｅ Ｉ断片（４，００４ｂｐ）をｗｔ－ｈＢＳＥＰ ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列： ＮＭ＿００３７４２．４）を含む同一長の配列で置換することによって、野生型ｈＢＳＥＰ（ｗｔ－ｈＢＳＥＰ）ｃＤＮＡ担持プラスミドを生成した。残りの配列も合成し（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）、ｐＡＡＶ２プラスミドにクローニングした。このクローニングは困難を示し、３７℃ではなく３０℃で細菌コロニーを増殖させることによってのみ達成され得たが、これは、この前者の温度（３７℃）が望ましくないプラスミド再配列をもたらしたためである。得られた、ＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰベクター配列（４，７３４ ｐｂ）を含有するｐＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰプラスミドを、配列決定および制限分析によって検証した。このプラスミドは、任意の血清型またはカプシド変異体のＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰベクターの生成を可能にする。
【0105】
（同じ長さの）２つのＡＡＶＡｎｃ８０ベクターを示す図を図１に示す。
【0106】
〔ヒト肝細胞におけるＢＳＥＰ発現の分析〕
Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ２細胞を、リポフェクタミン２０００を用いてプラスミドｐＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰおよびｐＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰでトランスフェクションした。細胞を４８～７２時間で固定し、ヒトＢＳＥＰを、ＢＳＥＰに特異的なマウス一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ－７４５００；作業希釈１：１５００）を使用する免疫蛍光によって検出した（図２）。ロバ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ－４８８結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ ｒｅｆ．Ａ２１２０２；作業希釈１：１，０００）を検出に使用した。図２に示すように、両方のプラスミドは両方の細胞株において特異的ｈＢＳＥＰを発現することができ、ほとんどの細胞はタンパク質の膜局在を示す。
Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ２細胞を、リポフェクタミン２０００を用いてプラスミドｐＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰおよびｐＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰでトランスフェクションした。細胞を４８～７２時間で固定し、ヒトＢＳＥＰを、ＢＳＥＰに特異的なマウス一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ－７４５００；作業希釈１：１５００）を使用する免疫蛍光によって検出した（図２）。ロバ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ－４８８結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ ｒｅｆ．Ａ２１２０２；作業希釈１：１，０００）を検出に使用した。図２に示すように、両方のプラスミドは両方の細胞株において特異的ｈＢＳＥＰを発現することができ、ほとんどの細胞はタンパク質の膜局在を示す。
【0107】
〔ｈＢＳＥＰを発現するＡＢＣＢ１１ ｃＤＮＡを含有するＡＡＶＡｎｃ８０ウイルス粒子の産生〕
本発明者らは、インシリコで設計されたＡＡＶ祖先配列Ａｎｃ８０に基づいてＡＡＶベクターを作製した（Ｚｉｎｎ、Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５； １２：１０５６－１０６８）。ＡＡＶＡｎｃ８０ウイルス粒子（ＶＰ）を生成するために、融合性の（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞単層を含む３０個の１５０ｃｍ２フラスコを、ｐδＦ６、ｐＡｎｃ８０－ＡＡＰ２およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してパッケージングされるべきベクター配列を含む選択されたＡＡＶプラスミド（ＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰまたはＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰ））で同時トランスフェクションした。７２時間のインキュベーション後、記載されているように、イオジキサノール勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用する超遠心分離によって、上清および細胞からＡＡＶ粒子を精製した（Ｍｕｒｉｌｌｏ、Ｏ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１６；６４：４１９－４２６）。最後に、精製ウイルスを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ－Ｕｌｔｒａｃｅｌ １００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、Ａ１ＡＴプロモーターに特異的なオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧ－３’（配列番号９）；リバースプライマー：５’－ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＧＴＡＴＴＴ－３’（配列番号１０））を使用するｑＰＣＲによって滴定した。
本発明者らは、インシリコで設計されたＡＡＶ祖先配列Ａｎｃ８０に基づいてＡＡＶベクターを作製した（Ｚｉｎｎ、Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５； １２：１０５６－１０６８）。ＡＡＶＡｎｃ８０ウイルス粒子（ＶＰ）を生成するために、融合性の（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞単層を含む３０個の１５０ｃｍ２フラスコを、ｐδＦ６、ｐＡｎｃ８０－ＡＡＰ２およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してパッケージングされるべきベクター配列を含む選択されたＡＡＶプラスミド（ＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰまたはＡＡＶ－ｗｔ－ｈＢＳＥＰ））で同時トランスフェクションした。７２時間のインキュベーション後、記載されているように、イオジキサノール勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用する超遠心分離によって、上清および細胞からＡＡＶ粒子を精製した（Ｍｕｒｉｌｌｏ、Ｏ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１６；６４：４１９－４２６）。最後に、精製ウイルスを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ－Ｕｌｔｒａｃｅｌ １００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、Ａ１ＡＴプロモーターに特異的なオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧ－３’（配列番号９）；リバースプライマー：５’－ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＧＴＡＴＴＴ－３’（配列番号１０））を使用するｑＰＣＲによって滴定した。
【0108】
各ベクターについていくつかのバッチを作製した。バッチの力価を表１に示す。予想外にも、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰは製造が非常に困難であり、６つのストックのうち、インビボ適用に適合する十分な力価（５×１０１１ ｖｇ／ｍＬを超える）を有して生成されたのは１つのみであった。反対に、１４中１２のバッチのＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰが、予想される収率および力価内で製造され、５×１０１１ ｖｇ／ｍＬ未満の力価を示すのは２つのバッチのみであった。
【0109】
【表1】
【0110】
〔ＡＡＶＡｎｃ８０粒子を注射したＡｂｃｂ１１－／－マウスにおけるＢＳＥＰ発現の評価〕
インビボでｈＢＳＥＰの発現を試験するために、本発明者らは、ＢＳＥＰを発現しないＡｂｃｂ１１遺伝子のＣ５７ＢＬ／６ノックアウトマウスモデル（ｂｃｂ１１－／－マウス）を用いた（Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｙ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、２８７：２４７８４－２４７９４）。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－マウスに、２×１０１３ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰ（ｎ＝２）、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ（ｎ＝３）、または等量の生理食塩水（ｎ＝３）を、後眼窩経路を用いて静脈内注射した。野生型マウス（Ａｂｃｂ１１＋／＋）に同量のベクターを接種し、Ａｂｃｂ１１－／－とＡｂｃｂ１１＋／＋マウスとの間のＡＡＶベクターの形質導入効果を比較した。１ヶ月後、マウスを屠殺し、肝臓サンプルを得た。肝臓ホモジネートを用いて、それぞれ定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）と逆転写（ＲＴ）－ｑＰＣＲとにより、各マウスのウイルスゲノムおよびｈＢＳＥＰ ｍＲＮＡの量を測定した。第１の場合において、ＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ組織精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って抽出した。そして、Ａ１ＡＴプロモーター配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いてｑＰＣＲを行った（前節のプライマー配列を参照のこと）。両ＡＡＶベクターはＡｂｃｂ１１＋／＋マウスにおいて同レベルのＡＡＶ ＤＮＡを示したが、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰベクターは、Ａｂｃｂ１１－／－マウスにおいてＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰよりも低いレベルのＡＡＶ ＤＮＡを有していた（図３Ａ）。ｈＢＳＥＰ ｍＲＮＡ発現のレベルを決定するために、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＬＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ組織キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って肝臓サンプルからＲＮＡを抽出した。この場合、最初にランダムプライマーを用いてＲＴ反応を行い、続いてコドン最適化または野生型ＡＢＣＢ１１遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを用いてｑＰＣＲを行った（ｗｔ－ｈＢＳＥＰ： ５’－ＴＣＡＴＣＣＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＴ－３’（配列番号１１）および５’ＣＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡ－３’（配列番号１２）；ｃｏ－ｈＢＳＥＰ ５’－ＴＡＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧ－３’（配列番号１３）および５’－ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＧＴＧＧＡ－３’（配列番号１４）のプライマー）。２つのベクターの各々を特異的に増幅するために使用されるプライマーのセットにおける差異のために、両ベクターについての結果は直接比較することができないが、それぞれのベクターについてＡｂｃｂ１１－／－マウスと比較して、ｍＲＮＡレベルはＡｂｃｂ１１＋／＋マウスにおいて５～１０倍高かった（図３Ｂ）。両方の場合において、使用されたプライマーは、ＡＡＶベクターを与えられなかったマウスで得られた非常に低いシグナルによって示されるように、マウスＡｂｃｂ１１ ｍＲＮＡを検出しなかった。
インビボでｈＢＳＥＰの発現を試験するために、本発明者らは、ＢＳＥＰを発現しないＡｂｃｂ１１遺伝子のＣ５７ＢＬ／６ノックアウトマウスモデル（ｂｃｂ１１－／－マウス）を用いた（Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｙ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、２８７：２４７８４－２４７９４）。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－マウスに、２×１０１３ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰ（ｎ＝２）、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ（ｎ＝３）、または等量の生理食塩水（ｎ＝３）を、後眼窩経路を用いて静脈内注射した。野生型マウス（Ａｂｃｂ１１＋／＋）に同量のベクターを接種し、Ａｂｃｂ１１－／－とＡｂｃｂ１１＋／＋マウスとの間のＡＡＶベクターの形質導入効果を比較した。１ヶ月後、マウスを屠殺し、肝臓サンプルを得た。肝臓ホモジネートを用いて、それぞれ定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）と逆転写（ＲＴ）－ｑＰＣＲとにより、各マウスのウイルスゲノムおよびｈＢＳＥＰ ｍＲＮＡの量を測定した。第１の場合において、ＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ組織精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って抽出した。そして、Ａ１ＡＴプロモーター配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いてｑＰＣＲを行った（前節のプライマー配列を参照のこと）。両ＡＡＶベクターはＡｂｃｂ１１＋／＋マウスにおいて同レベルのＡＡＶ ＤＮＡを示したが、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰベクターは、Ａｂｃｂ１１－／－マウスにおいてＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰよりも低いレベルのＡＡＶ ＤＮＡを有していた（図３Ａ）。ｈＢＳＥＰ ｍＲＮＡ発現のレベルを決定するために、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＬＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ組織キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って肝臓サンプルからＲＮＡを抽出した。この場合、最初にランダムプライマーを用いてＲＴ反応を行い、続いてコドン最適化または野生型ＡＢＣＢ１１遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを用いてｑＰＣＲを行った（ｗｔ－ｈＢＳＥＰ： ５’－ＴＣＡＴＣＣＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＴ－３’（配列番号１１）および５’ＣＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡ－３’（配列番号１２）；ｃｏ－ｈＢＳＥＰ ５’－ＴＡＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧ－３’（配列番号１３）および５’－ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＧＴＧＧＡ－３’（配列番号１４）のプライマー）。２つのベクターの各々を特異的に増幅するために使用されるプライマーのセットにおける差異のために、両ベクターについての結果は直接比較することができないが、それぞれのベクターについてＡｂｃｂ１１－／－マウスと比較して、ｍＲＮＡレベルはＡｂｃｂ１１＋／＋マウスにおいて５～１０倍高かった（図３Ｂ）。両方の場合において、使用されたプライマーは、ＡＡＶベクターを与えられなかったマウスで得られた非常に低いシグナルによって示されるように、マウスＡｂｃｂ１１ ｍＲＮＡを検出しなかった。
【0111】
最後に、ｈＢＳＥＰ発現を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ－７４５００）と結合したＢＳＥＰ特異的抗体を用いた免疫組織化学によって肝臓試料中で分析した。この分析により、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベクターを与えられたＡｂｃｂ１１－／－マウスにおける強いｈＢＳＥＰ発現が示され、対照として使用したＡｂｃｂ１１＋／＋マウスと同様に、明瞭な小管の染色が観察された（図４、左および中央パネル）。そして、対照的に、予想外にも、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｗｔ－ｈＢＳＥＰを接種したＡｂｃｂ１１－／－マウスは、ＢＳＥＰを発現する細胞をほとんど示さず、さらに、ＢＳＥＰを発現する細胞は、非常に弱い染色を有し（図４、右パネル）、このｃＤＮＡ配列がインビボでのｈＢＳＥＰ発現に効率的に適合していないことが示された。
【0112】
〔Ａｂｃｂ１１－／－マウスにおけるＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰの治療効果〕
当実験のために、発明者らは患者で観察されたＰＦＩＣ２症状の大部分を再現し、雄と比較して雌でより重度の表現型を有するＡｂｃｂ１１－／－マウスを使用した。これらのマウスはトランスアミナーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、胆汁鬱滞マーカー）、ビリルビンの上昇を示し、肝線維症を発症する（Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｙ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、２８７： ２４７８４－２４７９４）（図５）。これらの症状は雌では２ヶ月齢以降に発現するが、雄動物では最大６ヶ月を要する。患者とは対照的に、Ａｂｃｂ１１－／－マウスでは胆汁酸塩は上昇しない（データは示さず）。さらに、雄および雌の両方のＡｂｃｂ１１－／－マウスは、１ヶ月齢という早い時期に、胆汁酸塩の劇的な低下を示す（図７）。
当実験のために、発明者らは患者で観察されたＰＦＩＣ２症状の大部分を再現し、雄と比較して雌でより重度の表現型を有するＡｂｃｂ１１－／－マウスを使用した。これらのマウスはトランスアミナーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、胆汁鬱滞マーカー）、ビリルビンの上昇を示し、肝線維症を発症する（Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｙ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、２８７： ２４７８４－２４７９４）（図５）。これらの症状は雌では２ヶ月齢以降に発現するが、雄動物では最大６ヶ月を要する。患者とは対照的に、Ａｂｃｂ１１－／－マウスでは胆汁酸塩は上昇しない（データは示さず）。さらに、雄および雌の両方のＡｂｃｂ１１－／－マウスは、１ヶ月齢という早い時期に、胆汁酸塩の劇的な低下を示す（図７）。
【0113】
４週齢のＡｂｃｂ１１－／－雌および雄マウスに、６×１０１３ ｖｇ／ｋｇ ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを、後眼窩経路を用いて静脈内注射した。無処置マウスを対照として使用した。処置後１、２、３、４カ月後にマウスから採血し、血清中のＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、胆汁酸塩、コレステロール、ビリルビンを測定した。胆汁酸塩及びコレステロールについては、本モデルで予想されるような有意な変化は認められなかった（データは示さず）。ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを投与された雌Ａｂｃｂ１１－／－マウスは、処置後１ヶ月および２ヶ月でＡＬＴおよびＡＳＴの有意な低下を示し、処置後２ヶ月でビリルビンの有意な低下を示した（図６）。雄Ａｂｃｂ１１－／－処置マウスの場合、トランスアミナーゼおよびビリルビンレベルは無処置マウスのものと同様であったが、この齢では、これらのマーカーは健常マウスの正常範囲内であった（Ａｂｃｂ１１＋／＋マウスの平均：ＡＬＴ＝４７．５Ｕ／Ｌ； ＡＳＴ＝８３．２５Ｕ／Ｌ；ビリルビン：０．０８ｍｇ／ｄＬ）。全てのマウスで加齢とともにＡＬＰレベルは減少し、処置２か月後の処置雌で観察された減少は、無処置雌（２．２倍）と比較して高かった（３倍）。Ａｂｃｂ１１－／－マウスのＡＬＰ値はＡｂｃｂ１１＋／＋マウスと比較してわずかに上昇するだけであることに注目することが重要である（図５）。最後に、処置したＡｂｃｂ１１－／－マウスは、処置の１ヶ月後に、ＰＦＩＣ２患者の主要なバイオマーカーであり、ＢＳＥＰ活性の生理学的救済を示す胆汁酸塩濃度が有意に増加し（図７）、胆汁への胆汁酸塩の分泌が部分的に回復した。
【0114】
〔ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰで処置したＡｂｃｂ１１－／－雌マウスの長期追跡〕
当研究において、雌のマウスのみが患者において観察されるＰＦＩＣ２症状を再現するため、本発明者らは、Ａｂｃｂ１１－／－雌マウスを使用した（図５を参照）。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－雌マウスに、６×１０１３ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを、後眼窩経路を用いて静脈内注射した。処置後１か月（ｎ＝６）、３か月（ｎ＝６）、５か月（ｎ＝１０）で、マウスを屠殺した。また、処置の１、２、３および５ヶ月後に、マウスを採血した（処置の１および３ヶ月後に屠殺したマウスは、これらの時点までのみ採血した）。無処置Ａｂｃｂ１１－／－およびＡｂｃｂ１１＋／＋マウスを、それぞれ陰性および陽性対照として使用した。ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを与えられたＡｂｃｂ１１－／－は、無処置Ａｂｃｂ１１－／－マウスと比較した場合、処置後５ヶ月まで、ＡＳＴおよびビリルビンのような血清バイオマーカーの有意な減少を示した（図８Ａ～Ｂ）。さらに、処置されたＡｂｃｂ１１－／－マウスはまた、全ての測定時間において、処置されていないＡｂｃｂ１１－／－マウスと比較して、肝臓重量および肝臓／体比の有意な減少も示した（図９Ａ～Ｂ）。これらのデータは、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベースの治療がＡｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて疾患の進行を制御できることを示した。治療効果が肝細胞から胆汁への胆汁酸塩分泌の回復に起因するかどうかを決定するために、本発明者らは、処置したＡｂｃｂ１１－／－の胆汁および小腸中の胆汁酸塩の量を、処置後１ヶ月で測定した。図１０に示すように、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰでの処置は、Ａｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて、胆汁酸塩分泌を部分的に回復させることができ、Ａｂｃｂ１１＋／＋マウスの胆汁および小腸中でそれぞれ検出された胆汁酸塩濃度の約２２％および２５％に相当するレベルに達した。さらに、処置したＡｂｃｂ１１－／－マウスにおいて検出された胆汁酸塩濃度は、無処置のＡｂｃｂ１１－／－マウスの胆汁および腸において見出される胆汁酸塩濃度よりもそれぞれ約４倍および５．４倍高かった。
当研究において、雌のマウスのみが患者において観察されるＰＦＩＣ２症状を再現するため、本発明者らは、Ａｂｃｂ１１－／－雌マウスを使用した（図５を参照）。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－雌マウスに、６×１０１３ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを、後眼窩経路を用いて静脈内注射した。処置後１か月（ｎ＝６）、３か月（ｎ＝６）、５か月（ｎ＝１０）で、マウスを屠殺した。また、処置の１、２、３および５ヶ月後に、マウスを採血した（処置の１および３ヶ月後に屠殺したマウスは、これらの時点までのみ採血した）。無処置Ａｂｃｂ１１－／－およびＡｂｃｂ１１＋／＋マウスを、それぞれ陰性および陽性対照として使用した。ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを与えられたＡｂｃｂ１１－／－は、無処置Ａｂｃｂ１１－／－マウスと比較した場合、処置後５ヶ月まで、ＡＳＴおよびビリルビンのような血清バイオマーカーの有意な減少を示した（図８Ａ～Ｂ）。さらに、処置されたＡｂｃｂ１１－／－マウスはまた、全ての測定時間において、処置されていないＡｂｃｂ１１－／－マウスと比較して、肝臓重量および肝臓／体比の有意な減少も示した（図９Ａ～Ｂ）。これらのデータは、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベースの治療がＡｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて疾患の進行を制御できることを示した。治療効果が肝細胞から胆汁への胆汁酸塩分泌の回復に起因するかどうかを決定するために、本発明者らは、処置したＡｂｃｂ１１－／－の胆汁および小腸中の胆汁酸塩の量を、処置後１ヶ月で測定した。図１０に示すように、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰでの処置は、Ａｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて、胆汁酸塩分泌を部分的に回復させることができ、Ａｂｃｂ１１＋／＋マウスの胆汁および小腸中でそれぞれ検出された胆汁酸塩濃度の約２２％および２５％に相当するレベルに達した。さらに、処置したＡｂｃｂ１１－／－マウスにおいて検出された胆汁酸塩濃度は、無処置のＡｂｃｂ１１－／－マウスの胆汁および腸において見出される胆汁酸塩濃度よりもそれぞれ約４倍および５．４倍高かった。
【0115】
〔ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰはまた、Ａｂｃｂ１１－／－／雌マウスにおいて治療効果を誘導することができる〕
本発明者らは、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰがＡｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて治療効果を誘導し得ることを示すとすぐに、これらの効果が同じ導入遺伝子（ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ）を発現する血清型８を有するＡＡＶベクターを使用することによっても達成され得るかどうかを評価した。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－雌マウスにＡＡＶ８ｃｏ－ｈＢＳＥＰの６×１０１３ ｖｇ／ｋｇを静脈内注射し、前節で説明したように定期的に採血した。処置後１か月（ｎ＝４）と５か月（ｎ＝６）で、マウスを屠殺した。無処置Ａｂｃｂ１１－／－およびＡｂｃｂ１１＋／＋マウスをそれぞれ陰性および陽性対照として用いた。ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ処置マウスの場合と同様に、ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを与えられたマウスは、無処置Ａｂｃｂ１１－／－マウスと比較して、処置後５ヶ月まで、ＡＳＴおよびビリルビンのような血清バイオマーカーの減少を示した（図８Ａ～Ｂ）。さらに、無処置Ａｂｃｂ１１－／－マウスと比較した場合、ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ処置マウスにおいて肝腫脹の有意な減少が観察された（図９Ａ～Ｂ）。最後に、ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰによる治療はまた、Ａｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて胆汁酸塩分泌を部分的に回復させることができ、Ａｂｃｂ１１＋／＋マウスの胆汁および小腸中でそれぞれ検出された胆汁酸塩濃度の約２５％および９８％に相当するレベルに達した（図１０）。さらに、処置したＡｂｃｂ１１－／－マウスにおいて見出された胆汁酸塩濃度は、処置していないＡｂｃｂ１１－／－マウスの胆汁および小腸中において見出された胆汁酸塩濃度よりも、それぞれ約４．４倍および２１倍高かった。
本発明者らは、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰがＡｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて治療効果を誘導し得ることを示すとすぐに、これらの効果が同じ導入遺伝子（ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ）を発現する血清型８を有するＡＡＶベクターを使用することによっても達成され得るかどうかを評価した。４週齢のＡｂｃｂ１１－／－雌マウスにＡＡＶ８ｃｏ－ｈＢＳＥＰの６×１０１３ ｖｇ／ｋｇを静脈内注射し、前節で説明したように定期的に採血した。処置後１か月（ｎ＝４）と５か月（ｎ＝６）で、マウスを屠殺した。無処置Ａｂｃｂ１１－／－およびＡｂｃｂ１１＋／＋マウスをそれぞれ陰性および陽性対照として用いた。ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ処置マウスの場合と同様に、ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰを与えられたマウスは、無処置Ａｂｃｂ１１－／－マウスと比較して、処置後５ヶ月まで、ＡＳＴおよびビリルビンのような血清バイオマーカーの減少を示した（図８Ａ～Ｂ）。さらに、無処置Ａｂｃｂ１１－／－マウスと比較した場合、ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ処置マウスにおいて肝腫脹の有意な減少が観察された（図９Ａ～Ｂ）。最後に、ＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰによる治療はまた、Ａｂｃｂ１１－／－雌マウスにおいて胆汁酸塩分泌を部分的に回復させることができ、Ａｂｃｂ１１＋／＋マウスの胆汁および小腸中でそれぞれ検出された胆汁酸塩濃度の約２５％および９８％に相当するレベルに達した（図１０）。さらに、処置したＡｂｃｂ１１－／－マウスにおいて見出された胆汁酸塩濃度は、処置していないＡｂｃｂ１１－／－マウスの胆汁および小腸中において見出された胆汁酸塩濃度よりも、それぞれ約４．４倍および２１倍高かった。
【0116】
＜結論＞
これらの結果から、本発明者らは、ＰＦＩＣ２疾患の臨床的に重要な動物モデルにおいて長期間持続する治療効果をもたらす、Ａｎｃ８０または８血清型のいずれかを有するＡＡＶベクターからのヒトＢＳＥＰ遺伝子のコドン最適化バージョンの肝臓送達を結論付けることができる。具体的には、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰおよびＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベクターはいずれも、肝臓からの胆汁酸塩分泌を部分的に回復させることができ、その結果、トランスアミナーゼおよびビリルビンレベルの制御、ならびに処置マウスにおける肝増殖をもたらした。
これらの結果から、本発明者らは、ＰＦＩＣ２疾患の臨床的に重要な動物モデルにおいて長期間持続する治療効果をもたらす、Ａｎｃ８０または８血清型のいずれかを有するＡＡＶベクターからのヒトＢＳＥＰ遺伝子のコドン最適化バージョンの肝臓送達を結論付けることができる。具体的には、ＡＡＶＡｎｃ８０－ｃｏ－ｈＢＳＥＰおよびＡＡＶ８－ｃｏ－ｈＢＳＥＰベクターはいずれも、肝臓からの胆汁酸塩分泌を部分的に回復させることができ、その結果、トランスアミナーゼおよびビリルビンレベルの制御、ならびに処置マウスにおける肝増殖をもたらした。
【0117】
〔本発明を実施する際に使用するための配列〕
本発明を実施する際に使用するための配列を以下に記載する：
〔ＢＳＥＰ（ｃｏ－ＢＳＥＰ）をコードするコドン最適化配列：（配列番号１）〕
ＡＴＧＡＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＡＧＣＧＡＴＡＡＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＣＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＡＴＣＧＧＡＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＣＣＴＡＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＴＣＣＡＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＣＧＡＣＣＣＴＴＧＣＧＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＣＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＡＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＧＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＧＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＡＴＣＧＴＧＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＧ
〔ＢＳＥＰ ＃２（ｃｏ－ＢＳＥＰ－２）をコードするコドン最適化配列（配列番号２）〕
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〔ＢＳＥＰ （ｒＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ）をコードするコドン最適化配列を含む組換えＡＡＶベクター（配列番号３）〕
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〔ＢＳＥＰ ＃２（ｒＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ－２）をコードするコドン最適化配列を含む組換えＡＡＶベクター（配列番号４）〕
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＴＴＧＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＡＧＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＡＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＡＣＡＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＡＣＣＴＡＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＴＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＡＴＧＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＡＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＴＴＧＴＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＣＴＡＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＡＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＣＡＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧ
〔α１アンチトリプシンプロモーター（配列番号５）〕
ＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡ
〔ヒト最小胆汁酸トランスポーター（ＡＢＣＢ１１）遺伝子プロモーター（配列番号６）〕
ＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴ
〔マウス最小胆汁塩胆汁酸トランスポーター（ＡＢＣＢ１１）遺伝子プロモーター（配列番号７）〕
ＧＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣ
〔合成ポリＡ配列（配列番号８）〕
ＡＡＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣ
本発明を実施する際に使用するための配列を以下に記載する：
〔ＢＳＥＰ（ｃｏ－ＢＳＥＰ）をコードするコドン最適化配列：（配列番号１）〕
ＡＴＧＡＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＡＧＣＧＡＴＡＡＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＣＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＡＴＣＧＧＡＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＣＣＴＡＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＴＣＣＡＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＣＧＡＣＣＣＴＴＧＣＧＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＣＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＡＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＧＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＧＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＡＴＣＧＴＧＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＧ
〔ＢＳＥＰ ＃２（ｃｏ－ＢＳＥＰ－２）をコードするコドン最適化配列（配列番号２）〕
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〔ＢＳＥＰ （ｒＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ）をコードするコドン最適化配列を含む組換えＡＡＶベクター（配列番号３）〕
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〔ＢＳＥＰ ＃２（ｒＡＡＶ－ｃｏ－ｈＢＳＥＰ－２）をコードするコドン最適化配列を含む組換えＡＡＶベクター（配列番号４）〕
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＴＴＧＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＡＧＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＡＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＡＣＡＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＡＣＣＴＡＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＴＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＡＴＧＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＡＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＴＴＧＴＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＣＴＡＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＡＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＣＡＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧ
〔α１アンチトリプシンプロモーター（配列番号５）〕
ＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡ
〔ヒト最小胆汁酸トランスポーター（ＡＢＣＢ１１）遺伝子プロモーター（配列番号６）〕
ＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴ
〔マウス最小胆汁塩胆汁酸トランスポーター（ＡＢＣＢ１１）遺伝子プロモーター（配列番号７）〕
ＧＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣ
〔合成ポリＡ配列（配列番号８）〕
ＡＡＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】