特表 2022-512942 癌を治療するためのプラスミド構築体および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】癌を治療するためのプラスミド構築体および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/85 20060101AFI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/85 Z ZNA

A61K48/00

A61K31/711

A61P35/00

A61K9/08

C12N15/62 Z

C12N15/12

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021524360

(86)(22)【出願日】2019-11-27

(85)【翻訳文提出日】2021-05-07

(86)【国際出願番号】 US2019063590

(87)【国際公開番号】W WO2020112987

(87)【国際公開日】2020-06-04

(31)【優先権主張番号】62/771,928

(32)【優先日】2018-11-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/826,439

(32)【優先日】2019-03-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518211048

【氏名又は名称】オンコセック メディカル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】トゥイッティ， クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】ムコパデャイ， アナンダループ

(72)【発明者】

【氏名】カントン， デイビッド エー．

(72)【発明者】

【氏名】ハン， ミア

(72)【発明者】

【氏名】ブラウニング， エリカ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076BB11

4C076CC27

4C084AA13

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB26

(57)【要約】

ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＣＸＣＬ９、およびＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする発現カセットについて記載される。記載される発現カセットは、対象における癌を治療するために使用することができる。直接的な腫瘍内注射およびエレクトロポレーションによって発現カセットを腫瘍に送達する方法も記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

発現カセットであって、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、前記ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖおよび膜貫通ドメインを含み、前記膜貫通ドメインは、前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されている、発現カセット。

【請求項2】

前記第１のヌクレオチド配列は、プロモーターに操作可能に連結されている、請求項１に記載の発現カセット。

【請求項3】

前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ｍＰＧＫ、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される、請求項２に記載の発現カセット。

【請求項4】

前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＯＫＴ３（ムロモナブ－ＣＤ３）、１４５－２Ｃ１１、１７Ａ２、ＳＰ７、またはＵＣＨＴ１抗体のＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ領域を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項5】

前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＯＫＴ３（ムロモナブ－ＣＤ３）、１４５－２Ｃ１１、１７Ａ２、ＳＰ７、もしくはＵＣＨＴ１、またはそれらのヒト化型のＶＦおよびＶＬドメインを含む、請求項４に記載の発現カセット。

【請求項6】

前記膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲα膜貫通ドメインおよびＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項7】

前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６０、６２、７４、もしくは７６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項8】

前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３、もしくは７５と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項9】

ＩＬ－１２をコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項10】

前記ＩＬ－１２をコードする第２のヌクレオチド配列は、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードする第１のコード配列およびＩＬ－１２ ｐ４０をコードする第２のコード配列を含む、請求項９に記載の発現カセット。

【請求項11】

前記発現カセットは、以下によって表される式を含み、
Ｐ － Ａ － Ｔ － Ｂ － Ｔ － Ｂ’
式中、Ｐは、プロモーターであり、Ａは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、翻訳修飾エレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする、請求項１０に記載の発現カセット。

【請求項12】

Ｔは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドからなる群から選択される２Ａペプチドをコードする、請求項１１に記載の発現カセット。

【請求項13】

Ａは、配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６０、６２、７４、もしくは７６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂは、配列番号３１もしくは５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３１もしくは５３と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂ’は、配列番号３３もしくは５６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３３もしくは５６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードする、請求項１２に記載の発現カセット。

【請求項14】

Ａは、配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂは、配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列、または配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂ’は、配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列、または配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１２に記載の発現カセット。

【請求項15】

前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号６４、６６、７８、もしくは８０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６４、６６、７８、もしくは８０と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項16】

前記発現カセットは、配列番号６３、６５、７７、もしくは７９の配列、または配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項17】

前記発現カセットは、前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結されたタグ配列をさらにコードする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項18】

前記タグ配列は、ＨＡタグおよびＭｙｃタグからなる群から選択される少なくとも１つのタグ配列を含む、請求項１７に記載の発現カセット。

【請求項19】

請求項１～１８のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを発現するための、プラスミド。

【請求項20】

膜貫通ドメインに融合した抗ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ。

【請求項21】

癌の治療における使用のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項１９に記載のプラスミド。

【請求項22】

以下によって表される式を含む発現カセットであって、
Ｐ － Ｂ － Ｔ － Ｂ’ － Ｔ － Ａ
式中、Ｐは、プロモーターであり、Ａは、ＣＸＣＬ９をコードし、Ｔは、翻訳修飾エレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする、発現カセット。

【請求項23】

Ｔは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドからなる群から選択される２Ａペプチドを含む、請求項２２に記載の発現カセット。

【請求項24】

Ａは、配列番号３５もしくは５８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３５もしくは５７と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂは、配列番号３１もしくは５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３１もしくは５３と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂ’は、配列番号３３もしくは５６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３３もしくは５６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードする、請求項２２もしくは２３に記載の発現カセット。

【請求項25】

Ａは、配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列、または配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂは、配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列、または配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂ’は、配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列、または配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項26】

前記発現カセットは、配列番号６８もしくは８２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６８もしくは８２と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードする、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項27】

前記発現カセットは、配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列、または配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項28】

ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２を発現するためのプラスミドであって、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、プラスミド。

【請求項29】

癌の治療における使用のための、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項２８に記載のプラスミド。

【請求項30】

癌の治療における使用のための、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットおよびＣＸＣＬ９をコードする発現カセットであって、前記発現カセットは、腫瘍内エレクトロポレーション療法のために製剤化される、発現カセット。

【請求項31】

腫瘍を有する対象を治療する方法であって、有効用量の請求項１９または２８に記載の少なくとも１つのプラスミドを前記腫瘍に注射することと、エレクトロポレーション療法を前記腫瘍に投与することと、を含む、方法。

【請求項32】

前記エレクトロポレーション療法は、約１００マイクロ秒～約１ミリ秒の持続時間にわたる少なくとも１個の電圧パルスの投与を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記エレクトロポレーション療法は、１～６個の電圧パルスの投与を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記１～１０個の電圧パルスは、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの場強度を有する、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

前記少なくとも１つのプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、１日目と、５±２日目と、８±２日目と、に投与される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

（ｇ）請求項１９に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、１日目と、５±２日目と、に投与され、請求項２８に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、８±２日目に投与され、
（ｈ）請求項１９に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、１日目と、８±２日目と、に投与され、請求項２８に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、５±２日目に投与され、
（ｉ）請求項１９に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、５±２日目と、８±２日目と、に投与され、請求項２８に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、１日目に投与され、
（ｊ）請求項２８に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、１日目と、５±２日目と、に投与され、請求項１９に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、８±２日目に投与され、
（ｋ）請求項２８に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、１日目と、８±２日目と、に投与され、請求項１９に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、５±２日目に投与され、
（ｉ）請求項２８に記載のプラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、５±２日目と、８±２日目と、に投与され、請求項１９に記載の前プラスミドは、前記腫瘍に注射され、前記エレクトロポレーション療法は、１日目に投与される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記対象に少なくとも１つの追加の療法を投与することをさらに含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記方法は、腫瘍浸潤リンパ球の増加、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化および／または増殖の増加、治療される腫瘍の退行、ならびに１つ以上の未治療腫瘍の退行のうちの１つ以上を生じる、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記少なくとも１つの追加の療法は、ＩＴ－ＥＰ抗ＣＬＴＡ－４ ｓｃＦｖ療法を投与することを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

腫瘍を有する対象を治療する治療のための方法であって、有効用量の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする少なくとも１つのプラスミドを前記腫瘍に注射することと、エレクトロポレーション療法を前記腫瘍に投与することと、を含む、方法。

【請求項41】

前記方法は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法、およびＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２療法のうちの１つ以上をさらに含む、請求項４０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／７７１，９２８号、および２０１９年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，４３９号の優先権を主張し、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列リスト
ファイル５２２６３１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５に記述された配列リストは、サイズが１４３キロバイトであり、２０１９年１１月２２日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

癌免疫エディティングは、腫瘍を排除し、腫瘍が免疫破壊から逃れた後に、免疫適格宿主に最終的に形成される腫瘍の免疫原性表現型を形作る役割を果たす。免疫系－腫瘍相互作用は、排除、平衡、および逃避の３つの連続した段階で発生すると想定される。排除は、Ｔリンパ球による腫瘍細胞の破壊を伴う。平衡では、免疫抵抗性腫瘍細胞の集団が出現する。逃避の際に、腫瘍は免疫検出または破壊を回避するための戦略を発達させている。逃避は、腫瘍抗原の喪失または効果のない提示、抑制性サイトカインの分泌、または主要組織適合複合体分子の下方調節を通じて発生し得る。

【0004】

癌免疫療法は、癌の退行をもたらす効果的なＴ細胞応答を引き出すことを目的としている。だが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による腫瘍抗原の提示、腫瘍を成功裏に標的化して浸潤するプライムＴ細胞、ならびに浸潤性Ｔ細胞とＭＨＣＩペプチド複合体との結合を増強して細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化することなど、エフェクターＴ細胞応答を活性化するために様々な努力がなされている。

【0005】

研究によって、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在に関連する延命効果が示されている。ＩＬ－１２などの免疫刺激性サイトカインが、固形腫瘍における免疫細胞浸潤を増加させることができるという証拠がある。ただし、ＩＬ－１２の全身投与は治療指数が狭く、許容できないレベルの有害事象をしばしば伴う。ＩＬ－１２の全身投与の制限は、ＩＬ－１２をコードするプラスミドの腫瘍内エレクトロポレーションなど、ＩＬ－１２の局所的発現をもたらす治療によって克服することができる。

【0006】

ＩＬ－１２はＴＩＬの数を増加させることができるが、腫瘍における腫瘍特異的Ｔ細胞の存在および数を増加させることが依然として必要とされる。ＣＤ３（表面抗原分類３）Ｔ細胞共受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）、そしてまたＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方を活性化するのに役立つ。Ｔ細胞応答の活性化におけるその役割により、抗ＣＤ３抗体は免疫抑制療法として使用するために探索されている。ＣＤ３および癌抗原（腫瘍マーカー）を標的とする二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）を含む二重特異性抗体は、Ｔ細胞を癌細胞に標的化するために開発されている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖプラスＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、およびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥプラスＩＬ－１２をコードする発現カセットが記載される。記載の発現カセットは、癌の治療に有用である。癌および転移性癌を含む腫瘍を治療するために記載の発現カセットを使用する方法も記載される。記載の発現カセットは、エレクトロポレーションなどによって腫瘍に送達されると、コードされたタンパク質の局所的な腫瘍発現を生じ、Ｔ細胞の動員および抗腫瘍活性をもたらす。いくつかの実施形態において、本方法はまた、遠達効果、すなわち、１つ以上の未治療腫瘍の退行をもたらす。いくつかの実施形態において、退行は、固形腫瘍の減量を含む。

【0008】

ＣＸＣＬ９をコードする発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９をコードする発現カセットは、ＩＬ－１２をさらにコードする。記載のＣＸＣＬ９発現カセットは、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節内、皮内、および／または筋肉内に送達させることができる。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９およびＩＬ１２コード配列は、単一プロモーターから多シストロン性発現カセットで発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離される。いくつかの実施形態において、２Ａエレメントは、Ｐ２Ａエレメントである。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）サブユニットおよびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）サブユニットの両方を有するヘテロ二量体サイトカインである。コードされたＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合タンパク質（ＩＬ１２ ｐ７０）をコードする融合構築体を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ ｐ３５およびｐ４０コード配列は、単一プロモーターの多シストロン性発現カセットから発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントによって分離される。いくつかの実施形態において、２Ａエレメントは、Ｐ２Ａエレメントである。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントによって分離されるＣＸＣＬ９、ＩＬ１２ ｐ３５、およびＩＬ－１２ ｐ４０コード領域を含む、多シストロン性発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、２Ａエレメントは、Ｐ２Ａエレメントである。

【0009】

抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする発現カセットが記載される。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、抗ＣＴＬＡ－４単鎖可変フラグメントを含む。記載される抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットは、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節内、皮内、および／または筋肉内に送達させることができる。リンパ節は、流入領域リンパ節であり得る。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットはまた、腫瘍と流入領域リンパ節との間の腫瘍周囲領域に送達させることができる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットの腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節、皮内、および／または筋肉内送達の各々について、送達は、エレクトロポレーションによって促進することができる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットの直接的な発現は、抗ＣＴＬＡ－４抗体の全身投与と比較した場合、より少ない副作用および／または毒性をもたらし得る。記載される抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットは、局所的であるが有効な用量の抗ＣＴＬＡ－４の送達を容易にする。

【0010】

ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットが記載される。ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）に融合した抗ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットは、シグナルペプチドをさらにコードする。コードされたシグナルペプチドは、抗ＣＤ３単鎖可変フラグメントコード配列の５’末端に操作可能に連結することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットは、ＩＬ－１２をさらにコードする。記載されるＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットは、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節内、皮内、および／または筋肉内に送達させることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３およびＩＬ１２コード配列は、単一プロモーターから多シストロン性発現カセットで発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離される。いくつかの実施形態において、２Ａエレメントは、Ｐ２Ａエレメントである。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）サブユニットおよびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）サブユニットの両方を有するヘテロ二量体サイトカインである。コードされたＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合タンパク質（ＩＬ１２ ｐ７０）をコードする融合構築体を含有することができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ ｐ３５およびｐ４０コード配列は、単一プロモーターの多シストロン性発現カセットから発現され、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離される。いくつかの実施形態において、２Ａエレメントは、Ｐ２Ａエレメントである。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳまたは２Ａ翻訳修飾エレメントによって分離されたＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＩＬ１２ ｐ３５、およびＩＬ－１２ ｐ４０コード領域を含む、多シストロン性発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、２Ａエレメントは、Ｐ２Ａエレメントである。

【0011】

記載されるのは、対象に、治療有効量の記載された発現カセットのうちの１つ以上を含む組成物を、腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）によって投与することを含む、癌を治療する方法である。組成物は、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に注射され、エレクトロポレーション療法が、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に適用される。エレクトロポレーション療法は、当技術分野で知られている任意の好適なエレクトロポレーションシステムによって適用され得る。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションは、約６０Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの場強度で、約１０マイクロ秒～約２０ミリ秒の持続時間である。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションは、電気化学的インピーダンススペクトロスコピー（ＥＩＳ）を組み込む。対象は哺乳動物であり得る。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、またはウマであり得るが、これらに限定されない。

【0012】

いくつかの実施形態において、本方法は、対象に治療効果量の免疫刺激性サイトカインを投与することをさらに含む。免疫刺激性サイトカインは、ＩＴ－ＥＰによって送達される免疫刺激性サイトカインをコードする発現カセットであり得る。免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－１２であり得るが、これに限定されない。免疫刺激性サイトカインは、記載されるＣＸＣＬ９、ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、およびＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットのうちの１つ以上の前、後、または同時に送達することができる。

【0013】

いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上の追加の治療法の投与をさらに含む。１つ以上の追加の治療法は、免疫チェックポイント療法であり得るが、これに限定されない。免疫チェックポイント療法は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の投与であり得るが、これに限定されない。「免疫チェックポイント」分子は、Ｔ細胞の機能不全またはアポトーシスを誘発する免疫細胞表面受容体／リガンドの群を指す。これらの免疫抑制標的は、過剰な免疫反応を弱め、自己寛容を確実にする。腫瘍細胞は、これらのチェックポイント分子の抑制効果を利用する。免疫チェックポイント標的分子には、細胞障害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム死１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３（ＴＩＭ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＭＲ）、Ｂ－およびＴ－リンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、ならびにヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。「免疫チェックポイント阻害剤」には、免疫チェックポイント分子の効果を遮断することによって免疫抑制を防ぐ分子が含まれる。チェックポイント阻害剤には、抗体および抗体フラグメント、ナノボディ、二重特異性抗体、チェックポイント分子の可溶性結合パートナー、小分子治療薬、およびペプチドアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストであり得るが、これらに限定されない。ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり得るが、これらに限定されない。抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体には、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、およびアテゾリズマブが挙げられるが、これらに限定されない。

【0014】

記載されるのは、対象における腫瘍を治療する方法であり、この方法は、対象に、少なくとも１つの治療サイクルを投与することを含み、サイクルは、腫瘍に、ＩＴ－ＥＰによって、治療有効量の記載されるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２（すなわち、ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９）、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖプラスＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥプラスＩＬ－１２（すなわち、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２）発現カセットのうちの１つ以上を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、サイクルは３週間サイクルである。いくつかの実施形態において、サイクルは、４、５、または６週間サイクルである。組成物は、サイクルの１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、または６日目に、ＩＴ－ＥＰによって投与することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、各サイクルの１日目に、ＩＴ－ＥＰによって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、各サイクルの１日目および５±２日目に、ＩＴ－ＥＰによって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、各サイクルの１日目および８±２日目に、ＩＴ－ＥＰによって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、各サイクルの１日目、５±２日目、および８±２日目に、ＩＴ－ＥＰによって投与される。サイクルは、対象を治療するために必要であるたびごとに繰り返すことができる。いくつかの実施形態において、サイクルは、追加の治療薬の投与をさらに含む。追加の治療薬は、免疫チェックポイント療法であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント療法は、サイクルの１、２、または３日目に対象に投与される。

【0015】

いくつかの実施形態において、対象は、記載の発現カセットのうちの１つ以上を用いたＩＴ－ＥＰ療法の１回以上のサイクルによって治療される。上記のサイクルのいずれも、後続のサイクルで繰り返すことができる。後続のサイクルは、連続サイクルまたは交互サイクルであり得る。交互サイクルは、代替療法（例えば、免疫チェックポイント療法）の治療のない１つ以上の介在サイクルを有することができる。例えば、記載される発現カセットのいずれも、交互サイクル（例えば、必要に応じてサイクル１、３、５など）の１日目、５±２日目、および８±２日目に投与することができ、代替療法は、例えば、連続サイクルの１日目、２日目、または３日目（たとえば、必要に応じてサイクル１、２、３、４、５など）に投与することができる。

【0016】

いくつかの実施形態において、対象は、免疫チェックポイント阻害剤療法の有無にかかわらずに記載されるＣＸＣＬ９、ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットのいずれかのＩＴ－ＥＰと、免疫チェックポイント阻害剤療法との交互サイクルが投与される。言い換えれば、対象は、治療有効量の記載されるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖプラスＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥプラスＩＬ－１２発現カセットのうちの１つ以上を含む組成物が、ＩＴ－ＥＰによって投与され得、任意選択的に免疫チェックポイント阻害剤療法が奇数サイクル（サイクル１、３など）で投与され得、免疫チェックポイント阻害剤療法が偶数サイクル（サイクル２、４など）で投与され得る。あるいは、患者は、免疫チェックポイント阻害剤療法が奇数サイクル（サイクル１、３など）で投与され得、治療有効量の記載されるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖプラスＩＬ－１２、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥプラスＩＬ－１２発現カセットのうちの１つ以上を含む組成物が、ＩＴ－ＥＰによって投与され得、任意選択的に免疫チェックポイント阻害剤療法が偶数サイクル（サイクル２、４など）で投与され得る。

【0017】

本発現カセットおよび方法を使用して、進行した転移性の治療抵抗性腫瘍を有する対象を治療することができる。治療抵抗性腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍、ホルモン抵抗性腫瘍、放射線抵抗性腫瘍、および化学療法抵抗性腫瘍であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象は、免疫チェックポイント阻害剤療法の少なくとも１つのコースに応答していない。いくつかの実施形態において、対象は、限定されないが、チェックポイント阻害剤療法などの１つ以上の抗癌療法で進行しているか、または進行したことがある。

【0018】

本発現カセットおよび方法を使用して、１つ以上の抗癌療法に抵抗性であるか、または応答しないと予測される腫瘍を有する対象を治療することができる。いくつかの実施形態において、対象は、少ない腫瘍浸潤リンパ球、少ない部分的な細胞傷害性リンパ球、または枯渇したＴ細胞を有する。いくつかの実施形態において、対象は、１つ以上の前の癌治療で進行したことがある。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】ｍＣＸＣＬ９～ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣＸＣＬ９－ＰＴＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ）、ｍＣＸＣＬ９、ｍＩＬ１２－２Ａ（ｍＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｍＩＬ－１２ ｐ４０）、ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９（ｍＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｍＩＬ－１２ ｐ４０－Ｐ２Ａ－ｍＣＸＣＬ９）に関する発現構築体の図である。

【図1B】ｈＣＸＣＬ９、ｈＩＬ１２－２Ａ（ｈＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｈＩＬ－１２ ｐ４０）、ｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９（ｈＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｈＩＬ－１２ ｐ４０－Ｐ２Ａ－ｈＣＸＣＬ９）に関する発現構築体の図である。

【図2】ｍＩＬ１２－２Ａ、ｍＣＸＣＬ９、およびｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞における、（Ａ）ｍＩＬ１２ ｐ７０タンパク質発現、および（Ｂ）ｍＣＸＣＬ９タンパク質発現を示すグラフである。

【図3】マウスＩＬ－１２またはマウスＩＬ－１２－ＣＸＣ構築体によって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのｍＩＬ－１２ ｐ７０に対する用量反応を示すグラフである。両構築体ともに生物学的に活性なＩＬ－１２をコードする。

【図4A】５．０ミクロン孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ３４２１）を通る、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化（１μｇ／ｍＬで２４時間、回復７２時間）ＯＴ－Ｉ脾細胞の、トランスフェクション由来マウスＣＸＣＬ９誘導化走化性を示すグラフである。遊走指数は、３７°Ｃで２．５時間後に観察された走化性細胞の数として定義され、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性コントロールにおいて膜を通って受動的に遊走した細胞の数に基準化される。走化性の抑止は、抗ｍＣＸＣＬ９中和モノクローナル抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ ＢＥ０３０９）のプレインキュベーションで観察された。

【図4B】５．０ミクロン孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ３４２１）を通る、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化（２１μｇ／ｍＬで４時間、回復７２時間）ＯＴ－Ｉ脾細胞の、トランスフェクション由来（ＨＥＫ２９３）ヒトＣＸＣＬ９誘導化走化性を示すグラフである。遊走指数は、３７°Ｃで２時間後に観察された走化性細胞の数として定義され、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性コントロールに対して膜を通って受動的に遊走した細胞の数に基準化される。

【図4C】５．０ミクロン孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ３４２１）を通る、ヒト末梢単核細胞（凍結保存から解凍、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地で２４時間休止）の、トランスフェクション由来（ＨＥＫ２９３）ヒトＣＸＣＬ９誘導化走化性を示すグラフである。遊走指数は、３７°Ｃで２時間後に観察された走化性細胞の数として定義され、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性コントロールに対して膜を通って受動的に遊走した細胞の数に基準化される。

【図5】エレクトロポレーションの４８時間後、ＣＴ２６腫瘍担持マウスからの腫瘍溶解物における、ｍＣＸＣＬ９用のＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ３９２）を使用するｍＣＸＣＬ９の腫瘍内発現を示すグラフである（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、ウェルチ補正を伴うＴ検定）。

【図6】未治療マウス、および対照ベクター、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａ単独、またはＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９と組み合わせたＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａで治療されたマウスのカプランマイヤー曲線を示すグラフである（＊＊Ｐ＜０．００５、ログランク（マンテル・コックス）検定）。

【図7】コントロールプラスミドでのＩＬ－１２療法単独と比較して、ｍＩＬ１２－２ＡプラスｍＣＸＣＬ９を用いたＩＴ－ＥＰ療法によって治療された腫瘍担持マウスにおける、（Ａ）腫瘍体積の減少、および（Ｂ）対側（未治療）腫瘍体積の減少を示すグラフである。

【図8】０日目にＩＴ－ＥＰ ｐＵＭＣＶ３またはＩＬ１２－２Ａ、４日目および７日目にＩＴ－ＥＰ ｐＵＭＶＣ３またはｍＣＸＣＬ９で治療されたマウスからの脾細胞のフローサイトメトリー分析である。

【図9】コントロールベクター（ｐＵＭＣ３）、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２（ＩＬ－１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ＩＬ－１２ ｐ４０）、またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２プラスＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９で治療されたマウス腫瘍におけるＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加倍率を示すグラフである。３～５匹／群によるＮ＝２の独立した実験。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、一元配置分散分析。

【図10】（Ａ）ｈＩＬ１２－２ＡおよびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるｈＩＬ－１２タンパク質発現、ならびに（Ｂ）ｈＣＸＣＬ９およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるｈＣＸＣＬ９タンパク質発現を示すグラフである。

【図11】組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ１２、陽性コントロール）、またはｈＩＬ１２－２Ａ発現ベクターを発現する細胞から産生されたｈＩＬ１２を使用する、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞におけるＳＴＡＴ４経路の活性化を示すグラフである。

【図12A】ＨＡ－２Ｃ１１－Ｍｙｃ ｓｃＦｖ、ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ、および２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２に関するマウスＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットのイラストである。

【図12B】ＨＡ－ＯＫＴ３－Ｍｙｃ ｓｃＦｖ、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２、およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２に関するヒトＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットのイラストである。

【図13】（Ａ）ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの発現、および（Ｂ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターでトランスフェクトされたＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥの発現を示すウエスタンブロットである。

【図14A-C】ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよびＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの表面発現を示すフローサイトメトリーである。

【図14D-E】（Ｄ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターでトランスフェクトされたＢ１６－Ｆ１０細胞における抗ＣＤ３ｓｃＦｖの表面発現を示すフローサイトメトリーである。（Ｅ）ｍＩＬ１２－２Ａ、ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターによるトランスフェクション後のＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＩＬ１２ ｐ７０発現を示すグラフである。

【図15】ｈＩＬ１２－２Ａ、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２、およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞におけるＩＬ１２ ｐ７０発現を示すグラフである。

【図16A-B】（Ａ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖの腫瘍内エレクトロポレーション後のインビボでのＢ１６Ｆ１０黒色腫または４Ｔ１乳癌細胞におけるＣＤ３ｓｃＦｖの発現を示すウエスタンブロットである。（Ｂ）ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖの腫瘍内エレクトロポレーション後のインビボでの４Ｔ１乳癌細胞におけるＣＤ３ｓｃＦｖの表面発現のフロー分析である。

【図16C】ｍＩＬ１２－２ＡおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターの腫瘍内エレクトロポレーション後のＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＩＬ１２ ｐ７０発現を示すグラフである。

【図17】ナイーブマウス脾細胞を、組換えマウスＩＬ１２の添加もしくは無添加でコントロールベクター（ＥＶコントロール）、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクターによってインビトロでトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０細胞とともに、またはプレート結合抗ＣＤ３（陽性コントロール）とともに、共培養した後のＩＮＦγ発現の誘導を示すグラフである。

【図18】ナイーブマウス脾細胞を、組換えマウスＩＬ１２の添加もしくは無添加でコントロールベクター（Ｔｆｘコントロール）、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクターによってインビトロでトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０細胞とともに、またはプレート結合抗ＣＤ３（陽性コントロール）とともに、共培養した後のＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞の増殖のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。

【図19】２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰまたは陰性コントロールで治療されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスのＤＬＮにおけるインビボでのＯＴ－１およびポリクローナルＴ細胞増殖を示すグラフである。

【図20】２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰまたは陰性コントロールで治療されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスのＴＩＬにおけるＣＤ４５．１＋生細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示すグラフである。

【図21】２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰまたは陰性コントロールで治療されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスのＴＩＬにおける抗原特異的（ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示すグラフである。

【図22】陰性トランスフェクトコントロールと比較して、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰによって治療されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍含有マウスにおけるＯＶＡ_{２５７～２６４}ペプチド提示ＣＦＳＥ細胞の溶解の増加を示す、ＯＶＡ_{２５７～２６４}ペプチドを提示する（Ｈｉ）か、または提示しない（Ｌｏ）スキャンＣＦＳＥ細胞のＦＡＣＳ分析である。

【図23】ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで治療されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍含有マウスにおける養子移入したＯＶＡ_{２５７～２６４}－提示ＣＦＳＥ細胞の溶解の増加を示すグラフである。Ｔ細胞殺傷能力の増加が、脾臓および駆動リンパ節の両方で観察された。

【図24】ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで治療されたマウスにおけるＯＶＡ発現細胞の腫瘍特異的死滅の増加を示すＣＦＳＥ細胞のＦＡＣＳ分析である。

【図25】コントロール、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１２プラスＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ ＩＴ－ＥＰ療法で治療された黒色腫モデルマウスにおける治療された腫瘍の腫瘍進行を示すグラフである。

【図26A-B】（Ａ）コントロール、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１２プラス２Ｃ１１ ＩＴ－ＥＰ療法によって治療された乳癌モデルマウスにおける腫瘍進行を示すグラフである。（Ｂ）コントロール、ＩＬ１２－２Ａ、またはＩＬ１２－２Ａプラス２Ｃ１１ ＩＴ－ＥＰ療法によって治療された４Ｔ１乳癌モデルマウスにおける肺転移結節を示すグラフである。（Ｃ）コントロール、ＩＬ１２－２Ａ、またはＩＬ１２－２Ａプラス２Ｃ１１ ＩＴ－ＥＰ療法によって治療された４Ｔ１乳癌モデルマウスにおける末梢血１μＬあたりのエフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７－ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ３＋）の絶対数を示すグラフである。

【図26C】同上。

【図27】ｈＩＬ１２－２Ａ、ｈＣＸＣＬ９、およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターによるトランスフェクト後のＨＥＫ２９３細胞における、（Ａ）ｈＩＬ１２ ｐ７０タンパク質分泌、および（Ｂ）ｈＣＸＣＬ９タンパク質分泌を示すグラフである。ＥＬＩＳＡによって検出されたタンパク質、ｎ＝５。

【図28A】示された遺伝子におけるｐ値およびｌｏｇ２倍率変化の変化を表すボルケーノプロットである。差次的遺伝子発現を、ｍＣＸＣＬ９単独で治療されたマウス（上のパネル）およびＩＬ１２と組み合わせたｍＣＸＣＬ９で治療されたマウス（下のパネル）で試験した。水平線は、偽発見率（ＦＤＲ）閾値を示す。

【図28B】「細胞傷害性免疫細胞」の細胞型スコアを示すグラフである。各細胞型のスコア（Ｌｏｇ２スケール）は、平均が０になるように中央に配置されている。

【図29A】１日目、５日目、および８日目に１０μｇもしくは１００μｇのＩＬ１２－２Ａ（ＴＡＶＯ）、または、１日目、５日目、および８日目の各々で１００μｇのＩＬ１２～ＣＸＣＬ９もしくはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２（ＳＰＡＲＫ）による治療後、エレクトロポレーションの４８時間後におけるＢ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスからの腫瘍溶解物中のＩＬ１２ ｐ７０発現を表すグラフを示す（ｎ＝８匹の動物、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ４１９）。

【図29B-C】１日目、５日目、および８日目に１０μｇもしくは１００μｇのＩＬ１２－２Ａ（ＴＡＶＯ）、または、１日目、５日目、および８日目の各々で１００μｇのＩＬ１２～ＣＸＣＬ９もしくはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２（ＳＰＡＲＫ）による治療後、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウスにおける一次（Ｂ）および二次（Ｃ）腫瘍増殖を表すグラフである。（０日目と１２日目の各々について左から右へ：１０μｇのＩＬ１２－２Ａ、ＳＰＡＲＫ、１００μｇのＩＬ１２－２Ａ）。

【図30】（Ａ）組換えｍＣＴＬＡ－４／Ｆｃに結合する抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖトランスフェクション上清、および（Ｂ）ＲＥＮＣＡ腫瘍溶解物での抗ＣＬＴＡ－４ｓｃＦｖの検出を表すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0020】

Ｉ．定義
「核酸」は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。ＲＮＡおよびＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、縮合核酸、カチオン性脂質で製剤化された核酸、ペプチドまたはカチオン性ポリマーで製剤化された核酸、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。核酸には、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡも含まれる。

【0021】

「発現カセット」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡコード配列、または発現産物（例えば、ペプチド（複数可）（すなわち、ポリペプチド（複数可）またはタンパク質（複数可））またはＲＮＡ）をコードするＲＮＡもしくはＤＮＡのセグメントを指す。発現カセットは、プラスミド中に存在することができる。発現カセットは、哺乳動物細胞などの細胞において１つ以上のポリペプチドを発現することができる。発現カセットは、コードされた発現産物の発現のために必要である１つ以上の配列を含み得る。発現カセットは、ＤＮＡコード配列に操作可能に連結されたエンハンサー、プロモーター、ターミネーター、およびポリＡシグナルのうちの１つ以上を含み得る。

【0022】

「プラスミド」という用語は、哺乳動物細胞で発現することができるポリペプチド（記載される発現カセットのいずれかなど）をコードする少なくとも１つの配列を含む核酸を指す。プラスミドは、閉じた環状ＤＮＡ分子であり得る。様々な配列をプラスミドに組み込んでコード配列の発現を変化させることができ、細胞におけるプラスミドの複製を促進するためである。転写、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性、ＲＮＡプロセシング、または翻訳の効率に影響を与える配列を使用することができる。かかる配列には、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、プロモーター、イントロン、および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が含まれるが、これらに限定されない。プラスミドは、大スケールの量かつ／または高収率で製造することができる。プラスミドは、ｃＧＭＰ製造を使用してさらに製造することができる。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌を形質転換することができる。ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物対象への注射のために安全で有効であるように製剤化することができる。

【0023】

「タンパク質」、「ペプチド」、または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続的なストリングを含む。「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、「ポリペプチド配列」、または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドにおける一連の２つ以上のアミノ酸を指す。

【0024】

「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子、ＲＮＡ、またはＤＮＡの配列中の情報を顕在化することを可能にするか、または引き起こすことを指し、例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に含まれる細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生する。ＤＮＡ配列は、細胞において、または細胞によって発現され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質などの発現産物を生成する。発現産物それ自体も細胞によって発現されるとも言うことができる。

【0025】

「操作可能に連結された」とは、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の近接した配置を指し、それによって、両成分は正常に機能し、成分のうちの少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに加えられる機能を媒介することができる実現性を可能にする。例えば、コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、コード配列のｍＲＮＡを含む、ＲＮＡへのＲＮＡポリメラーゼ仲介性転写を指示し、次にスプライシングされ得（それがイントロンを含む場合）、任意選択的に、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳され得る。コード配列は、１つ以上の転写または翻訳制御配列に「操作可能に連結される」ことができる。遺伝子に操作可能に連結されたターミネーター／ポリＡシグナルは、遺伝子のＲＮＡへの転写を終結させ、ポリＡシグナルのＲＮＡへの付加を指示する。

【0026】

「プロモーター」は、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに結合して（例えば、直接的に、または他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）、コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、エンハンサーを含むがそれに限定されない、転写開始速度に影響を与える１つ以上の追加の領域またはエレメントを含み得る。プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得るが、これらに限定されない。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができる。プロモーターには、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫ、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターであり得るが、これらに限定されない。ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ヒトＣＭＶプロモーター、マウスＣＮＶプロモーター、およびサルＣＭＶプロモーターであり得るが、これらに限定されない。

【0027】

「翻訳修飾エレメント」は、単一の転写物から２つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする。翻訳修飾エレメントには、ｍＲＮＡの内部領域から翻訳の開始を可能にする配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、およびリボソームにエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をスキップさせるピコルナウイルスに由来する２Ａペプチドが含まれる。翻訳調節エレメントの組み込みは、単一の多シストロン性ｍＲＮＡからの２つ以上のポリペプチドの共発現をもたらす。２Ａモジュレーターには、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。２Ａモジュレーターには、ＰＧ／Ｐ切断部位が含まれる。

【0028】

「相同的」配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）は、既知の参照配列と同一か、または実質的に同様である配列を指し、それは、既知の参照配列と、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。配列同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソン）におけるＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを、デフォルトのギャップパラメーターを使用するか、またはｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ（精査）、およびｂｅｓｔ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（最善のアラインメント）（すなわち、比較ウィンドウ幅にわたって最も高い配列類似性の割合をもたらす）によって使用して、配列を整列させることによって決定することができる。配列同一性のパーセントは、比較ウィンドウ幅にわたって２つの最適配列された配列を比較することと、同一残基が両方の配列に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得ることと、一致した位置の数を、比較のウィンドウ幅（すなわち、ウィンドウ幅サイズ）におけるギャップを計数しない一致および不一致の位置の全数によって除することと、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを得ることと、によって計算される。特に明記されていない限り、２つの配列間の比較のウィンドウ幅は、２つの配列のうち短い方の全長によって定められる。

【0029】

「免疫刺激性サイトカイン」には、ウイルス、細菌、または腫瘍抗原を含む外来抗原に対する免疫応答を媒介または増強するサイトカインが含まれる。免疫刺激性サイトカインには、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ ｐ３５、ＩＬ－１２ ｐ４０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－２１、およびＴＧＦβが挙げられるが、これらに限定されない。

【0030】

「癌」という用語は、一般に、不適切な細胞増殖、異常または過剰な細胞増殖を特徴とする無数の疾患を含む。癌の例には、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、脳癌、または肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0031】

「治療抵抗性の癌」は、少なくとも１つの前の治療に応答しないか、または応答していない癌である。いくつかの実施形態において、治療に関して、治療抵抗性は、治療に対する不十分な応答、または治療に対する部分的または完全な応答の欠如を示す。例えば、患者は、少なくとも２回投薬の治療を受けた後、少なくとも部分的な応答を示さない場合、治療（例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害剤療法などのチェックポイント阻害剤療法）に抵抗性であると見なされ得る。

【0032】

「腫瘍微小環境」は、腫瘍の周囲の環境を指し、腫瘍に酸素、成長因子、および栄養素をもたらすこと、もしくは腫瘍に対する免疫応答を阻害することなどによって、腫瘍の成長および／または生存を助ける非悪性の血管および間質組織を含む。腫瘍微小環境には、腫瘍が存在する細胞環境が含まれ、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子、および細胞外マトリックスなどが含まれる。

【0033】

「腫瘍縁」または「縁組織」は、腫瘍のすぐ近くまたは周囲の視覚的に正常な組織である。通常、縁組織は、組織の０．１～２ｃｍ以内の視覚的に正常な組織である。腫瘍が外科的に切除されるとき、腫瘍縁組織がしばしば除去される。

【0034】

「治療」という用語は、癌細胞の増殖の阻害もしくは低減、癌細胞の破壊、癌細胞の増殖の防止、悪性細胞の開始の防止、悪性疾患に形質転換される前悪性細胞の進行の停止もしくは反転、または疾患の改善、のための薬品または治療を含むが、これらに限定されない。

【0035】

「エレクトロポレーション」という用語は、プラスミド、核酸、または薬剤などの生体分子の細胞への侵入を促進するためのエレクトロポレーションパルスの使用を指す。

【0036】

「流入領域リンパ節」は、特定の領域または器官からリンパ液をろ過するリンパ節である。腫瘍および腫瘍治療との関連で、流入領域リンパ節は腫瘍のすぐ下流にある。

【0037】

「エピトープタグ」は、高親和性抗体が結合する短いアミノ酸配列（または短いアミノ酸配列をコードする核酸配列）である。例示的なエピトープタグには、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｓｐｏｔタグ、Ｔ７タグ、およびＮＥタグが挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグは、免疫検出を容易にするために使用され得る。

【0038】

ＩＩ．ＣＸＣＬ９
Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）は、ＣＸＣケモカインファミリーに属する小さいサイトカインである。ＣＸＣＬ９は、ガンマインターフェロン（ＭＩＧ）によって誘発されるモノカインとしても知られている。ＣＸＣＬ９は、Ｔ細胞化学誘引物質であり、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の走化性動員を促進する。マウスおよびヒトのＣＸＣＬ９アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３５および配列番号５８によって表される。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９は、（ａ）配列番号３５もしくは５８のアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物、あるいは（ｂ）配列番号３５もしくは５８のアミノ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。

【0039】

ＩＩＩ．抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ
抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインに親和性を有し、かつ／またはＣＴＬＡ－４シグナル伝達を阻害する、抗ＣＴＬＡ－４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、短いリンカーペプチドで接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を含む。例示的なマウス抗ＣＴＬＡ－４重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３９および４３によって表される。例示的なマウス抗ＣＴＬＡ－４軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３７および４１によって表される。

【0040】

抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ファージディスプレイから同定することができる。抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖはまた、ハイブリドーマなどからの既知の抗ＣＴＬＡ－４抗体から、ＶＨおよびＶＬをサブクローニングすることによって生成することができる。既知の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、とりわけ、２０１９／００４８０９６、２０１３／０１３６７４９、２０１２／０１４８５９７、２０１４／００９９３２５、２０１５／０１０４４０９、２０１１／０２９６５４６、および２００８／０２３３１２２に記載されている。既知の抗ＣＴＬＡ－４抗体には、イピリムマブおよびトレメリムマブが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖのＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒト化することができる。ヒト化抗体（または抗体フラグメントまたはドメイン）は、タンパク質配列が、ヒトで自然に生成される抗体変異体に対するそれらの類似性を高めるために改変されている、非ヒト種に由来する抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、抗ＣＴＬＡ－４抗体の関連する相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域（ＨＶＲ）とも呼ばれる）をヒトＶＨおよびＶＬドメインスキャホルドに挿入することによって作製することができる。

【0041】

抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＶＨ鎖のＣ末端をＶＬのＮ末端と連結することによって形成され得る。あるいは、ＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結することができる。ペプチドリンカーは、約１０から約２５個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、グリシンに富む。ｓｃＦｖペプチドリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｘであり、ｘは、２～５（両端を含む）の整数であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、連結されたｓｃＦｖペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（すなわち、［（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ］_３、（Ｇ_４Ｓ）_３、またはＧ_４Ｓ（×３）とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、Ｇ_４Ｓ（×３）からなる。いくつかの実施形態において、コードされた抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖポリペプチドは、Ｉｇκシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含む。例示的な抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖアミノ酸配列は、配列番号７０および７２によって表される。いくつかの実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、（ａ）配列番号７０もしくは７２のアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物、あるいは（ｂ）配列番号７０もしくは７２のアミノ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。

【0042】

ＩＶ．ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ
ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）に融合した抗ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、短いリンカーペプチドで接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を含む。例示的な抗ＣＤ３重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８および４７によって表される。例示的なマウス抗ＣＤ３軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１１および５０によって表される。

【0043】

抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ファージディスプレイから同定することができる。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖはまた、ハイブリドーマなどからの既知の抗ＣＤ３抗体からＶＨおよびＶＬをサブクローニングすることによって生成することができる。既知の抗ＣＤ３抗体は、例えば、ＵＳ２０１８／０１１７１５２、ＵＳ２０１４／０１９３３９９、ＵＳ２０１０／０１８３５５４、およびＵＳ２００６／０１７７８９６に記載されている。既知の抗ＣＤ３抗体には、ＯＫＴ３（ムロモナブ－ＣＤ３）、１４５－２Ｃ１１、１７Ａ２、ＳＰ７、およびＵＣＨＴ１も含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒト化することができる。ヒト化抗体（または抗体フラグメントまたはドメイン）は、タンパク質配列が、ヒトで自然に生成される抗体変異体に対するそれらの類似性を高めるために改変されている、非ヒト種に由来する抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、抗ＣＤ３抗体の関連する相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域（ＨＶＲ）とも呼ばれる）をヒトＶＨおよびＶＬドメインスキャホルドに挿入することによって作製することができる。

【0044】

抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＶＨ鎖のＣ末端をＶＬのＮ末端と連結することによって形成され得る。あるいは、ＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結することができる。ペプチドリンカーは、約１０～約２５個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、グリシンに富む。ｓｃＦｖペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）_ｘであり、ｘは、２～５（両端を含む）の整数であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（すなわち、［（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ］_３、（Ｇ_４Ｓ）_３、またはＧ _４Ｓ（×３）とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、Ｇ_４Ｓ（×３）からなる。

【0045】

膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、生物学的脂質二重層（膜）に挿入され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを膜に固定することができるポリペプチドを含む。ＴＭは当技術分野で知られており、典型的には非極性アミノ酸から主になる。膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインまたはＰＤＧＦＲα膜貫通ドメインであり得るが、これらに限定されない（ＰＤＧＦＲは血小板由来成長因子受容体である）。いくつかの実施形態において、スペーサーが、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間に含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＭドメインは、ＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ（配列番号２５）、ＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＬＷＱＫＫＰＲ（配列番号２７）、ＰＤＧＦＲβ：ＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＶＩＳＬＩＩＬＩ（配列番号８３）、ＰＤＧＦＲβ：ＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩ（配列番号８４）、ＰＤＧＦＲα：ＡＡＶＬＶＬＬＶＩＶＩＩＳＬＩＶＬＶＶＩＷ（配列番号８５）、およびＰＤＧＦＲα：ＡＡＶＬＶＬＬＶＩＶＩＶＳＬＩＶＬＶＶＩＷ（配列番号８６）を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＭドメインは、ｇｔｇｇｇｃｃａｇｇａｃａｃｇｃａｇｇａｇｇｔｃａｔｃｇｔｇｇｔｇｃｃａｃａｃｔｃｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃａｔｇｃｔｔｔｇｇｃａｇａａｇａａｇｃｃａｃｇｔ（配列番号２４）、ｇｃｔｇｔｇｇｇｃｃａｇｇａｃａｃｇｃａｇｇａｇｇｔｃａｔｃｇｔｇｇｔｇｃｃａｃａｃｔｃｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃａｔｇｃｔｔｔｇｇｃａｇａａｇａａｇｃｃａｃｇｔ（配列番号２６）、ＰＤＧＦＲβ：ｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃ（配列番号８７）、ＰＤＧＦＲβ：ｇｔｇｇｔｇａｔｃｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃａｔｃ（配列番号８８）、ＰＤＧＦＲα：ｇｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｇａｔｃａｔｃｔｃａｃｔｔａｔｔｇｔｃｃｔｇｇｔｔｇｔｃａｔｔｔｇｇａａ（配列番号８９）を含む群から選択される核酸配列によってコードされる。

【0046】

いくつかの実施形態において、コードされた抗ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドは、Ｉｇκシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含む。

【0047】

例示的なＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥアミノ酸配列は、配列番号６０、６２、７４、および７６によって表される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、（ａ）配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列、またはそれらの機能的同等物、あるいは（ｂ）配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。

【0048】

Ｖ．発現カセット
記載されるポリペプチド、ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ、およびＩＬ－１２のいずれも、核酸でコードされ得る。核酸は、発現カセットであり得るが、これに限定されない。発現カセットは、プラスミドにあることができる。「プラスミド」という用語は、細菌ベクター、ウイルスベクター、エピソームプラスミド、組み込みプラスミド、またはファージベクターを含む任意の核酸ベクターを含む。本明細書で使用される場合、発現カセットの送達は、発現カセットを含むプラスミドまたは核酸ベクター（「発現ベクター」または「ベクター」と呼ばれる）の送達を含む。

【0049】

コードされるポリペプチドは、発現カセットにおいて、第２のポリペプチドをコードする配列に連結され得る。いくつかの実施形態において、発現カセットは、融合タンパク質をコードする。「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合または他の化学結合によって一緒に連結される２つ以上のペプチドを含むタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、２つのポリペプチドを含む一本鎖ポリペプチドとして組換えによって発現される。２つ以上のポリペプチドは、直接的に、または１つ以上のアミノ酸を含むリンカーを介して連結され得る。

【0050】

発現カセットまたはプラスミドは、多シストロン性発現カセットを含み得る。多シストロン性発現カセットは、同じｍＲＮＡから２つ以上の別々のタンパク質を発現し、１つ以上の翻訳修飾エレメントを含む。

【0051】

いくつかの実施形態において、記載される発現カセットは、単一のプロモーターから発現される２つまたは３つのポリペプチドを、１つ以上の翻訳修飾エレメントとともにコードし、２つまたは３つのポリペプチドが単一のｍＲＮＡから発現されることを可能にする。いくつかの実施形態において、発現カセットは、以下を含み、
ａ） Ｐ－Ａ－Ｔ－Ｂ，
ｂ） Ｐ－Ｂ－Ｔ－Ａ，
ｃ） Ｐ－Ｂ－Ｔ－Ｂ’
ｃ） Ｐ－Ａ－Ｔ－Ｂ－Ｔ－Ｂ’、または
ｄ） Ｐ－Ｂ－Ｔ－Ｂ’－Ｔ－Ａ
式中、Ｐは、プロモーターであり、Ａは、ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、ＢおよびＢ’は、サイトカインまたはサイトカインサブユニットをコードし、Ｔは、翻訳修飾エレメントである。

【0052】

プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得るが、これらに限定されない。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができる。プロモーターには、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫ、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターであり得るが、これらに限定されない。ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ヒトＣＭＶプロモーター、マウスＣＮＶプロモーター、およびサルＣＭＶプロモーターであり得るが、これらに限定されない。

【0053】

いくつかの実施形態において、Ｔは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントまたはリボソームスキッピングモジュレーターである。リボソームスキッピングモジュレーターは、２Ａエレメント（２Ａペプチドまたは２Ａ自己切断ペプチドとも呼ばれる）であり得るが、これらに限定されない。２Ａエレメントは、Ｐ２Ａ（配列番号２９）、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａエレメントであり得るが、これらに限定されない。

【0054】

ＣＸＣＬ９は、マウスＣＸＣＬ９もしくはヒトＣＸＣＬ９、またはそれらの機能的同等物であり得るが、これらに限定されない。

【0055】

ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－膜貫通ドメイン（ＴＭ）、エピトープタグ（ＥＴ）－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＥＴ－ＴＭ、ＥＴ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭ、抗－ＣＤ３、ｓｃＦｖ－ＥＴ－ＴＭ、ＨＡ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｍｙｃ－ＴＭ、ＨＡ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭ、抗ＣＤ３、ｓｃＦｖ－Ｍｙｃ－ＴＭ、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭ、または抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＴＭであり得るが、これらに限定されない。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、抗マウスＣＤ３ ｓｃＦｖまたは抗ヒトＣＤ３ ｓｃＦｖであり得る。これらの各々は、シグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、Ｉｇκシグナルペプチドであり得るが、これに限定されない。ＴＭは、ＰＤＧＦＲ ＴＭであり得るが、これに限定されない。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、２Ｃ１１またはＯＫＴ３であり得るが、これらに限定されない。

【0056】

いくつかの実施形態において、サイトカインは、免疫刺激性サイトカインである。いくつかの実施形態において、免疫刺激性サイトカインは、インターロイキンである。サイトカインには、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、およびＴＧＦ－βが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｂおよび／またはＢ’は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２ ｐ３５、またはＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドをコードする。ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２ ｐ３５、またはＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドは、マウスまたはヒトＩＬ－１２、ＩＬ －１２ ｐ３５－ＩＬ－１２ ｐ４０融合、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２ ｐ３５、またはＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0057】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、ＣＸＣＬ９をコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0058】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、ヒトＣＸＣＬ９をコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0059】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、マウスＣＸＣＬ９をコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0060】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、Ｉｇκ－ＨＡ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0061】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、Ｉｇκ－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0062】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、Ｉｇκ－ＨＡ－２Ｃ１１－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0063】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、Ｉｇκ－２Ｃ１１－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0064】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、Ｉｇκ－ＨＡ－ＯＣＴ３－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0065】

いくつかの実施形態において、Ｐは、ＣＭＶプロモーターであり、Ａは、Ｉｇκ－ＯＫＴ３－ＰＤＧＦＲ ＴＭ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。

【0066】

いくつかの実施形態において、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、そしてＢ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。いくつかの実施形態において、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｔは、ＩＲＥＳエレメントであり、そしてＢ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得るが、これに限定されない。

【0067】

いくつかの実施形態において、配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号６０、６２、７４、または７６のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドの機能的活性を保持する。

【0068】

いくつかの実施形態において、配列番号６４、６６、７８、もしくは７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６４、６６、７８、もしくは７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号６４、６６、７８、または７０のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能的活性を保持する。

【0069】

いくつかの実施形態において、配列番号３５もしくは５８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３５もしくは５８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号３５または５８のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドは、ＣＸＣＬ９ポリペプチドの機能的活性を保持する。

【0070】

いくつかの実施形態において、配列番号６８もしくは８２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６８もしくは８２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号６８または８２のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドは、ＣＸＣＬ９ポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能的活性を保持する。

【0071】

いくつかの実施形態において、配列番号７０もしくは７２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号７０もしくは７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７０または７２のアミノ酸配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖポリペプチドの機能的活性を保持する。

【0072】

いくつかの実施形態において、配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号５９、６１、７３、または７５のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有する配列を含み、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに操作可能に連結されている。

【0073】

いくつかの実施形態において、配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列、または配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号６３、６５、７７、または７９のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有する配列を含み、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列、または配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに操作可能に連結されている。

【0074】

いくつかの実施形態において、配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列、または配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号３４または５７のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有する配列を含み、ＣＸＣＬ９ポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列、または配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに操作可能に連結されている。

【0075】

いくつかの実施形態において、配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列、または配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号６７または８１のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有する配列を含み、ＣＸＣＬ９ポリペプチドおよびＩＬ－１２ポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列、または配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに操作可能に連結されている。

【0076】

いくつかの実施形態において、配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列、または配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現カセットが記載される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号６９または７１のヌクレオチド配列と７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の同一性を有する配列を含み、ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列、または配列番号６９もしくは７１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに操作可能に連結されている。

【0077】

ＶＩ．治療の方法
記載されるのは対象における腫瘍の治療のための方法であり、この方法は、有効用量のＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、またはＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ発現カセットのうちの１つ以上の含む組成物を、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に投与することと、エレクトロポレーション療法を腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に投与する（ＩＴ－ＥＰ療法）ことと、を含む。ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットは、さらにＩＬ－１２をコードし得る。

【0078】

治療される腫瘍は、皮膚腫瘍、皮下腫瘍、または内臓腫瘍であり得る。腫瘍は、癌性または非癌性であり得る。腫瘍は、固形腫瘍、表面病変、非表面病変、体表面から１５ｃｍ以内の病変、または内臓病変であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、記載される方法および発現ベクターを使用して、原発腫瘍ならびに遠隔（すなわち、未治療）腫瘍および転移を治療することができる。いくつかの実施形態において、記載される方法は、腫瘍のサイズを低減もしくは腫瘍の成長を阻害し、癌細胞の増殖を阻害し、転移を阻害もしくは低減し、転移性癌の発生を低減もしくは阻害し、かつ／または癌を有する対象における癌の再発を低減することを提供する。腫瘍は、特定のタイプの腫瘍または癌に限定されない。

【0079】

いくつかの実施形態において、本方法は、有効用量の免疫刺激性サイトカインを投与することをさらに含む。免疫刺激性サイトカインは、サイトカインをコードする発現カセットのＩＴ－ＥＰによって投与することができる。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットにコードされる。いくつかの実施形態において、サイトカインは、第２の発現ベクターにコードされ、ＩＴ－ＥＰによって癌性腫瘍に送達される。いくつかの実施形態において、サイトカインはＩＬ－１２である。いくつかの実施形態において、発現カセットは、Ｂ－Ｔ－Ｂ’を含み、式中、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｔは、Ｐ２Ａエレメントであり、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする。サイトカインは、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前、同時、または後に投与され得る。

【0080】

ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法または治療は、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に、有効用量のＣＸＣＬ９をコードする記載の発現カセットを注射し、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することを含む。

【0081】

ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法または治療は、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に、有効用量のＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２をコードする記載の発現カセットを注射し、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することを含む。

【0082】

ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法または治療は、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に、有効用量のＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする記載の発現カセットを注射し、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することを含む。

【0083】

ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２または治療療法は、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に、有効用量のＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ－１２をコードする記載の発現カセットを注射し、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することを含む。

【0084】

ＩＴ－ＥＰ抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ療法または治療は、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に、有効用量の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする記載の発現カセットを注射し、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することを含む。

【0085】

ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２の治療または治療は、腫瘍、腫瘍微小環境、および／または腫瘍縁組織に、有効用量のＩＬ－１２をコードする発現カセットを注射し、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２をコードする発現カセットは、ＩＬ１２－２Ａ（ｍＩＬ１２－２ＡおよびｈＩＬ１２－２Ａ、図１）を含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、記載される発現カセット、記載される発現カセットを含有するプラスミド、および方法を使用して、１つ以上の腫瘍、腫瘍細胞、または腫瘍病変を治療することができる。腫瘍細胞は、癌細胞であり得るが、これに限定されない。「癌」という用語は、一般に不適切な細胞増殖、異常または過剰な細胞増殖を特徴とする無数の疾患を含む。癌は、固形癌、肉腫、癌腫、およびリンパ腫であり得るが、これらに限定されない。癌はまた、膵臓、皮膚、脳、肝臓、胆嚢、胃、リンパ節、乳房、肺、頭頸部、喉頭、咽頭、唇、喉、心臓、腎臓、筋肉、結腸、前立腺、胸腺、精巣、子宮、卵巣、皮膚、および皮下の癌であり得るが、これらに限定されない。皮膚癌は、黒色腫および基底細胞癌であり得るが、これらに限定されない。乳癌は、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ陰性乳癌、およびトリプルネガティブ乳癌であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、記載される方法を使用して、細胞増殖性障害を治療することができる。「細胞増殖性障害」という用語は、形態学的および遺伝子型的の両方で周囲の組織とは異なるようにしばしば出現する悪性ならびに非悪性の細胞集団を意味する。いくつかの実施形態において、記載される方法を使用して、ヒトを治療することができる。いくつかの実施形態において、記載される方法を使用して、非ヒト動物または哺乳動物を治療することができる。非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、およびウマであり得るが、これらに限定されない。

【0087】

記載される発現カセットおよび方法は、癌または他の非癌性（良性）増殖に苦しむ対象での使用が企図される。本実施形態の方法で治療される腫瘍は、非侵襲性、侵襲性、表在性、乳頭状、平坦、転移性、限局性、単中心性、多中心性、低悪性度、および高悪性度の腫瘍のいずれかであり得る。これらの増殖は、病変、ポリープ、新生物（乳頭状尿路上皮新生物）、乳頭腫、悪性腫瘍、腫瘍（例えば、クラトスキン腫瘍、肺門腫瘍、非浸潤性乳頭状尿路上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、ユーイング腫瘍、アスキン腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍）レイディグ細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、セルトリ細胞腫瘍）、肉腫、癌腫（卵形細胞癌、閉鎖上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌、胆管癌、肝細胞癌、浸潤性乳頭状尿路上皮癌、扁平尿路上皮癌）、しこり、または任意の他のタイプの癌性もしくは非癌性の増殖のタイプのいずれかとして現れ得る。発現カセットおよび方法を使用して、進行性、転移性、または治療抵抗性の癌を治療することができる。

【0088】

本明細書に記載の発現カセットおよび方法は、例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌（例えば、末梢癌（ｐｅｒｉｐｈｉｌａｒ）、遠位胆管癌、肝内胆管癌）膀胱癌、良性および癌性骨癌（例えば、骨腫、骨様骨腫、骨芽細胞腫、骨慢性腫、血管腫、軟骨粘液性線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨大細胞腫瘍、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳および中枢神経系癌（例えば、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、神経節神経膠腫、シュワンノーマ、胚芽腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉腺癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房症）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）食道癌、胆嚢癌（例えば、粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、喉頭および下咽頭癌、肝臓癌（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔および傍鼻副鼻腔癌（例えば、鼻腔神経芽細胞腫、正中線肉芽腫）、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔および口腔咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多型細胞型横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌、黒色腫および非黒色腫皮膚癌の両方）、胃癌、精巣癌（例えば、精上皮腫、非精上皮腫胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞癌、未分化癌、低分化癌、髄質甲状腺癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰部癌、および子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）における使用が企図される。

【0089】

いくつかの実施形態において、対象は、低腫瘍浸潤性のリンパ球（ＴＩＬ）、および／または損なわれた腫瘍ＩＦＮγシグナル伝達を有する。

【0090】

記載される方法を使用して、腫瘍の炎症化、腫瘍または腫瘍微小環境へのＴ細胞浸潤の誘導（腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数の増加）、全身Ｔ細胞応答の増強、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化の誘発、抗原特異的Ｔ細胞応答の増加、抗原特異的Ｔ細胞の増殖の増加、ポリクローナルＴ細胞応答の増加、既治療および／または未治療腫瘍に対する免疫応答の増強、Ｔ細胞枯渇の減少、１つ以上の既治療または未治療の腫瘍におけるリンパ球および単球細胞表面マーカーの増加、１つ以上の既治療または未治療の腫瘍におけるＩＮＦγ調節遺伝子の腫瘍内レベルの増加、対象の血液中の増殖エフェクター記憶Ｔ細胞の増加、対象の血液中の短命エフェクター細胞の増加、癌性腫瘍における活性化されたナチュラルキラー細胞に存在する遺伝子の発現の増加、癌性腫瘍における抗原提示で機能する遺伝子の発現の増加、癌性腫瘍におけるＴ細胞生存およびＴ細胞媒介性細胞傷害性において機能する遺伝子の発現の増加、既治療および／または未治療腫瘍の退行の誘発、既治療および／または未治療腫瘍の減量の誘発、および免疫チェックポイント阻害剤療法などであるがこれに限定されない第２の療法への応答の改善、のうちの１つ以上を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、腫瘍に対する免疫反応の増強は、対象の生存の増加をもたらす。

【0091】

いくつかの実施形態において、記載される方法は、癌性腫瘍を有する対象を治療することを含み、癌性腫瘍に有効用量のＣＸＣＬ９をコードするプラスミドを注射することと、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、記載される方法は、癌性腫瘍を有する対象を治療することを含み、癌性腫瘍に有効用量のＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードするプラスミドを注射することと、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、記載される方法は、癌性腫瘍を有する対象を治療することを含み、癌性腫瘍に有効用量の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードするプラスミドを注射することと、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、エレクトロポレーション治療と実質的に同時に投与される。「実質的に同時に」という用語は、分子およびエレクトロポレーション治療が、時間に関して互いに適度に接近して、すなわち、細胞における電気パルスの効果が減少する前に、投与されることを意味する。

【0092】

いくつかの実施形態において、記載される方法は、腫瘍または腫瘍微小環境におけるＮＫ細胞およびＴ細胞集団の増加をもたらす。ＣＸＣＬ９、ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２、および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥのＩＴ－ＥＰは、腫瘍特異的Ｔ細胞の腫瘍へのホーミングを増加させ、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化および／もしくは増殖を増加させ、かつ／または、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞の腫瘍微小環境への動員を増加させる。Ｔ細胞の活性化は、活性化されたＴ細胞による腫瘍細胞の死滅の増加をもたらすことができる。

【0093】

いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰによるＩＬ－１２療法の投与は、腫瘍のＴ細胞浸潤を増強する。その後の腫瘍におけるＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥの発現は、Ｔ細胞を活性化させ、抗原特異的Ｔ細胞の集団を増強する。

【0094】

いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、腫瘍特異的リンパ球の有効な輸送の増加をもたらすＩＬ－１２効果を増強する。

【0095】

いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、腫瘍または腫瘍微小環境における血管新生を阻害する。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９をＩＬ－１２療法と組み合わせて、腫瘍特異的リンパ球の腫瘍への輸送を増加させる。

【0096】

いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９をコードする発現カセットの腫瘍内エレクトロポレーションは、他の治療実体とともに投与することができる。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＬ－１２療法と組み合わされる。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前、同時、および／または後に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前および同時に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前および後に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法と同時および後に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前、同時、および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＬ－１２療法の前、同時、および／または後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＬ－１２療法の前および同時に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＬ－１２療法の前および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＬ－１２療法と同時および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＬ－１２療法の前、同時、および後に生じ得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２療法は、ＩＬ－１２をコードする発現カセットのＩＴ－ＥＰによって投与される。ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２は、単一の発現カセットもしくはプラスミドから、または複数の発現カセットもしくはプラスミドから発現させることができる。いくつかの実施形態において、同時療法であるＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９－ＩＬ１２療法では、ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２は、単一の発現カセットまたはプラスミドから発現される。

【0097】

いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットの腫瘍内エレクトロポレーションは、他の治療実体とともに投与することができる。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＬ－１２療法と組み合わされる。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前、同時、および／または後に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前および同時に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前および後に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法と同時および後に生じ得る。ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前、同時、および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＬ－１２療法の前、同時、および／または後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＬ－１２療法の前および同時に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＬ－１２療法の前および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＬ－１２療法と同時および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＬ－１２療法の前、同時、および後に生じ得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２療法は、ＩＬ－１２をコードする発現カセットのＩＴ－ＥＰによって投与される。ＣＤ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ－１２は、単一の発現カセットもしくはプラスミドから、または複数の発現カセットもしくはプラスミドから発現させることができる。いくつかの実施形態において、同時療法であるＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２療法では、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよびＩＬ－１２は、単一の発現カセットまたはプラスミドから発現される。

【0098】

いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法と組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＬ－１２療法と組み合わされる。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前、同時、および／または後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前および同時に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法と同時および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法の前、同時、および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前、同時、および／または後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前および同時に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法と同時および後に生じ得る。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法の前、同時、および後に生じ得る。ＣＸＣＬ３またはＣＤ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法のいずれかは、それぞれＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２、またはＣＤ３－ｈａｌｌｆ－ＢｉＴｅおよびＩＬ－１２の両方をコードする発現カセットまたはプラスミドのＩＴ－ＥＰ（すなわち、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９およびＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２療法）などによって、ＩＬ－１２療法と組み合わせることができる。

【0099】

いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２療法は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法、およびＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ ＣＸＣＬ９療法のうちの１つ以上と同時投与することができる。

【0100】

いくつかの実施形態において、記載される発現カセットは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わされる。薬学的に許容される賦形剤（複数可）は、医薬品有効成分（ＡＰＩ、治療薬）以外の物質であり、ＡＰＩ（分子）とともに意図的に含有される。賦形剤は、意図された投与量で治療効果を発揮しないか、または発揮することが意図されていない。賦形剤は、ａ）製造の際にＡＰＩの処理を助け、ｂ）ＡＰＩの安定性、生物学的利用能、もしくは対象の許容性を保護、支援、もしくは増強し、ｃ）製品の識別を補助し、および／またはｄ）保存もしくは使用の際にＡＰＩの全体的な安全性、有効性、送達の任意の他の属性を増強するように作用し得る。薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質である得るか、またはそうではないことがある。賦形剤には、吸収促進剤、付着防止剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、送達促進剤、送達ポリマー、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香料、流動促進剤、保湿剤、潤滑剤、油、ポリマー、保存剤、生理食塩水、塩、溶剤、糖、懸濁剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、張性剤、ビヒクル、撥水剤、および湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0101】

ＶＩＩ．治療計画／サイクル
記載されるＩＴ－ＥＰ療法は、例えば、腫瘍の性質、対象の状態、分子のサイズおよび化学的特性、ならびに分子の半減期などの要因に応じて、様々な間隔で投与することができる。

【0102】

いくつかの実施形態において、腫瘍を治療するための方法が記載され、この方法は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法を投与し、続いてＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９および／またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法を投与することを含む。ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬまたはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法は、腫瘍または腫瘍微小環境への腫瘍特異的Ｔ細胞の動員を増加させ、かつ／またはＴ細胞の活性化を増加させることができる。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は、０日目（±１日）に腫瘍に与えられ、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法は、４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に与えられる。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は、０日目に腫瘍に与えられ、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法は、４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に与えられる。

【0103】

いくつかの実施形態において、腫瘍を治療するための方法が記載され、この方法は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法を投与し、続いてＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥおよび／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２療法を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は、０日目（±１日）に腫瘍に与えられ、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に与えられる。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は、０日目に腫瘍に与えられ、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２療法は、４日目（±２日）および７日目（±２日）に腫瘍に与えられる。

【0104】

いくつかの実施形態において、腫瘍を治療するための方法が記載され、この方法は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法、続いてＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬもしくはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法、および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥもしくはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２療法を含む。

【0105】

いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は、最初に投与されて腫瘍浸潤リンパ球を増加させる。その後、腫瘍は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９もしくはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥもしくはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２療法で治療される。

【0106】

治療サイクルは、１～６回のＩＴ－ＥＰ治療を含むことができる。いくつかの実施形態において、治療サイクルは、１、２、または３回のＩＴ－ＥＰ治療を含む。サイクルは、約１週間～約６週間、または約２週間～約５週間であり得る。いくつかの実施形態において、サイクルは約３週間である。

【0107】

いくつかの実施形態において、サイクルは、１～３回のＩＴ－ＥＰ治療を含む。治療は、１日目（±２日）、５日目（±２日）および／または８日目（±２日）（すなわち、０日目（±２日）、４日目（±２日）および／または７日目（±２日））に生じ得る。各治療は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ２、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２、およびＩＴ－ＥＰ 抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖのうちの１つ以上を含むことができる。

【0108】

いくつかの実施形態において、腫瘍を治療するための方法が記載され、この方法は、サイクルの１日目にＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法を投与し、サイクルの５日目（±２日）および８日目（±２日）にＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９を投与することを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍を治療するための方法が記載され、この方法は、サイクルの１日目にＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法を投与し、サイクルの５日目（±２日）および８日目（±２日）にＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２を投与することを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍を治療するための方法が記載され、この方法は、サイクルの１日目にＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法を投与し、サイクルの５日目（±２日）および８日目（±２日）にＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ、およびＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２のうちの１つ以上を投与することを含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、腫瘍を治療するための方法が記載され、この方法は、ａ）第１のサイクルでＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法を投与することと、ｂ）第２のサイクルでＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法を投与することと、ｃ）第３のサイクルでＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２療法を投与することと、を含む。各サイクルは、対応するＩＴ－ＥＰ療法の１～３回の投与を含むことができる。

【0110】

ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法および／またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法と組み合わせたＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法の投与を含む投与計画が記載される。また、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法をＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２療法とともに投与することを含む投薬計画が記載される。療法は、同時に、連続して、または別々に投与され得る、いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は第１のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法は第２のサイクルで投与される。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は、第１のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２療法は、第２のサイクルで投与される。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法は第１のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法またはＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９－ＩＬ１２療法は第２のサイクルで投与され、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ－ＩＬ１２療法は第３のサイクルで投与される。ＩＴ－ＥＰ療法は、各サイクルの１日目に送達され得る。サイクルのうちの１つ以上は、必要に応じて繰り返えされ得る。サイクル内で、ＩＴ－ＥＰ療法はサイクルの少なくとも１日目、２日目、または３日目に投与され得る。例えば、所与の発現カセットは、１日目、５日目（±２日）、および／または８日目（±２日）に投与され得る。

【0111】

いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの１日目、５±２日目、および８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖまたは抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖプラスＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの１日目、５±２日目、および８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥプラスＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの１日目、５±２日目、および８±２日目に投与される。

【0112】

いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２発現カセット（例えば、ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９）は、１日目および５±２日目に投与され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセット（例えば、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２）は、サイクルの８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２発現カセットは、１日目に投与され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの５±２日目および８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２発現カセットは、１日目および８±２日目に投与され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ＋ＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの５±２日目に投与される。

【0113】

いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥプラスＩＬ－１２発現カセットは、１日目および５±２日目に投与され、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９ プラスＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ プラスＩＬ－１２発現カセットは、１日目に投与され、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９プラスＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの５±２日目および８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥプラスＩＬ－１２発現カセットは、１日目および８±２日目に投与され、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ９ プラスＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの５±２日目に投与される。

【0114】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットは、１日目およびに投与され、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２－ＣＸＣＬ９発現カセットは、サイクルの５±２日目および８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットは、１日目および５±２日目に投与され、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９発現カセットは、サイクルの８±２日目に投与される。

【0115】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットは１日目に投与され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの５±２日目および８±２日目に投与される。 いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットは、１日目および５±２日目に投与され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの８±２日目に投与される。

【0116】

いくつかの実施形態において、ＩＬ１２－２Ａ発現カセットは１日目に投与され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットは、５±２日目に投与され、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９発現カセットは、サイクルの８±２日目に投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２－２Ａ発現カセットは１日目に投与され、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９発現カセットは、５±２日目に投与され、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥまたはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ－１２発現カセットは、サイクルの８±２日目に投与される。

【0117】

いくつかの実施形態において、対象は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９療法またはＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２療法のいずれかが０日目、４日目（±２日）および７日目（±２日）に投与されるが、ただし対象は、少なくとも１回のＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９を用いたＩＴ－ＥＰ治療および１回のＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２を用いたＩＴ－ＥＰ治療を受ける。

【0118】

いくつかの実施形態において、治療は、すべてのサイクルまたはサイクルおきに投与することができる。２回以上のサイクルが対象に投与されるように、サイクルを繰り返し得る。繰り返されるサイクルは、連続して投与されるか、１つ以上の異なる治療サイクルと交互にされるか、または１つ以上の異なる治療サイクルと同時に実行され得る。上記に記載の治療法のいずれも、他の癌療法と組み合わせることができる。たとえば、ＩＴ－ＥＰサイクルは、チェックポイント阻害剤療法と組み合わせることができる。

【0119】

ＶＩＩＩ．併用療法
いくつかの実施形態において、治療法は、併用療法を含む。併用療法は、治療用分子または治療の組み合わせを含む。治療処置には、電気パルス（すなわち、エレクトロポレーション）、放射線、抗体療法、チェックポイント阻害剤療法、および化学療法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、併用療法の投与は、エレクトロポレーションのみによって達成される。いくつかの実施形態において、併用療法の投与は、エレクトロポレーションおよび全身送達の組み合わせによって達成される。いくつかの実施形態において、併用療法の投与は、エレクトロポレーションおよび放射線の組み合わせによって達成される。いくつかの実施形態において、併用療法の投与は、エレクトロポレーションおよび経口投薬の組み合わせによって達成される。治療的エレクトロポレーションは、１つ以上の追加の治療処置と組み合わせるか、または一緒に投与することができる。１つ以上の追加の治療薬は、全身送達、腫瘍内注射、エレクトロポレーションを伴う腫瘍内注射、および／または放射線によって送達することができる。１つ以上の追加の治療薬は、ＣＸＣＬ９および／またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥエレクトロポレーション療法の前、同時、または後に投与することができる。

【0120】

いくつかの実施形態において、記載されるような癌を治療する方法は、ＩＴ－ＥＰ療法は、１日目、１日目および５日目（±２日）、１日目および８日目（±２日）、または１日目、５日目（±２日）、および８日目（±２日）に投与し、追加の治療処置は、３～６週間サイクルの１日目に投与すること含む。いくつかの実施形態において、記載されるような癌を治療する方法は、ＩＴ－ＥＰ療法は、１サイクルおき（すなわち、６週間ごと）の１日目、１日目および５日目（±２日）、１日目および８日目（±２日）、または１日目、５日目（±２日）、８日目（±２日）に投与し、追加の治療処置は、各３週間サイクルの１日目（すなわち、３週間ごと）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、追加の治療処置は、チェックポイント阻害剤を含む。

【0121】

ＩＸ．エレクトロポレーション（ＥＰ）療法
エレクトロポレーション療法は、少なくとも１個のエレクトロポレーションパルスを細胞、組織、または腫瘍に投与することを含む。エレクトロポレーション療法は、哺乳動物対象における使用に好適である任意の既知のエレクトロポレーションデバイスを使用して実施することができる。記載される発現カセットは、電気パルスの投与前、投与中、または投与後に対象に投与することができる。発現カセットは、対象における腫瘍に、またはその近辺に投与することができる。記載される発現カセットは、皮下注射針を使用して腫瘍に注射することができる。

【0122】

いくつかの実施形態において、エレクトロポレーション療法は、１個以上の電圧パルスの投与を含む。生成される電場の性質は、組織の性質、選択される組織のサイズ、およびその位置によって決定される。腫瘍に送達することができる電圧パルスは、約１００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍであり得る。いくつかの実施形態において、電圧パルスは、約７００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態において、電圧パルスは、約６００Ｖ／ｃｍ、６５０Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、７５０Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、８５０Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、９５０Ｖ／ｃｍ、１０００Ｖ／ｃｍ、１０５０Ｖ／ｃｍ、１１００Ｖ／ｃｍ、１１５０Ｖ／ｃｍ、１２００Ｖ／ｃｍ、１２５０Ｖ／ｃｍ、１３００Ｖ／ｃｍ、１３５０Ｖ／ｃｍ、１４００Ｖ／ｃｍ、１４５０Ｖ／ｃｍ、または１５００Ｖ／ｃｍであり得る。いくつかの実施形態において、電圧パルスは、約１０Ｖ／ｃｍ～７００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態において、電気は、約１００Ｖ／ｃｍ、１５０Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、２５０Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、３５０Ｖ／ｃｍ、または４００Ｖ／ｃｍ、４５０Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、５５０Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、６５０Ｖ／ｃｍ、または７００Ｖ／ｃｍである。

【0123】

エレクトロポレーションパルスのパルス持続時間は、１０μ秒～１秒であり得る。いくつかの実施形態において、パルス持続時間は、約１０μ秒～約１００ミリ秒（ｍｓ）である。いくつかの実施形態において、パルス持続時間は、１００μ秒、１ｍｓ、１０ｍｓ、または１００ｍｓである。パルスセット間の間隔は、１秒などの任意の所望の時間であり得る。波形、電場強度、およびパルス持続時間はまた、細胞のタイプおよびエレクトロポレーションを介して細胞に入る分子のタイプに依存し得る。

【0124】

パルス発生器によって提供される電気信号の波形は、指数関数的に減衰するパルス、方形パルス、単極振動パルス列、双極振動パルス列、またはこれらの形態のいずれかの組み合わせであり得る。方形波エレクトロポレーションシステムは、設定電圧まで急速に上昇し、設定時間（パルス長）の間そのレベルに留まり、その後直ちにゼロに低下する制御された電気パルスを送達する。

【0125】

１～１００個のパルスが、投与され得る。いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のパルスが、投与される。いくつかの実施形態において、６個のパルスが投与される。いくつかの実施形態において、６×０．１ｍ秒のパルスが投与される。いくつかの実施形態において、６個のパルスが投与される。いくつかの実施形態において、６×０．１ｍ秒のパルスは、１３００～１５００Ｖ／ｃｍで投与される。いくつかの実施形態において、８個のパルスが、投与される。いくつかの実施形態において、８×１０ｍ秒のパルスが、投与される。いくつかの実施形態において、８×１０ｍ秒のパルスは、３００～５００Ｖ／ｃｍで投与される。

【0126】

エレクトロポレーションデバイスは、単一の針電極、一対の針電極、または複数またはアレイの針電極を含むことができる。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションデバイスは、皮下注射針または同等物を含む。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションデバイスは、ユーザ制御およびパルスパラメータの入力に基づいて、アレイ内の電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成することができる動電学的デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含むことができる。

【0127】

記載される化合物、組成物、および方法とともに使用するために好適であるエレクトロポレーションデバイスには、米国特許第７２４５９６３号、同第５４３９４４０号、同第６０５５４５３号、同第６００９３４７号、同第９０２０６０５号、および同第９０３７２３０号、ならびに米国特許公開第２００５／００５２６３０号、同第２０１９／０１１７９６４号、および特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３０４３７号および米国特許出願第１６／２６９，０２２号に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。

【0128】

実施形態のリスト：
１．発現カセットであって、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖおよび膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのＣ末端に連結されている、発現カセット。

【0129】

２．第１のヌクレオチド配列は、プロモーターに操作可能に連結されている、実施形態１に記載の発現カセット。

【0130】

３．プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ｍＰＧＫ、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される、実施形態２に記載の発現カセット。

【0131】

４．抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＯＫＴ３（ムロモナブ－ＣＤ３）、１４５－２Ｃ１１、１７Ａ２、ＳＰ７、またはＵＣＨＴ１抗体のＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ領域を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0132】

５．抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＯＫＴ３（ムロモナブ－ＣＤ３）、１４５－２Ｃ１１、１７Ａ２、ＳＰ７、もしくはＵＣＨＴ１、またはそれらのヒト化型のＶＦおよびＶＬドメインを含む、実施形態４に記載の発現カセット。

【0133】

６．膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲα膜貫通ドメインおよびＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインからなる群から選択される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0134】

７．第１のヌクレオチド配列は、配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６０、６２、７４、もしくは７６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、実施形態１～６のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0135】

８．第１のヌクレオチド配列は、配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３、もしくは７５と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0136】

９．ＩＬ－１２をコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２～８のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0137】

１０．ＩＬ－１２をコードする第２のヌクレオチド配列は、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードする第１のコード配列およびＩＬ－１２ ｐ４０をコードする第２のコード配列を含む、実施形態９に記載の発現カセット。

【0138】

１１．発現カセットは、以下によって表される式を含み、
Ｐ － Ａ － Ｔ － Ｂ － Ｔ － Ｂ’
式中、Ｐは、プロモーターであり、Ａは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードし、Ｔは、翻訳修飾エレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする、実施形態１０に記載の発現カセット。

【0139】

１２．Ｔは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドからなる群から選択される２Ａペプチドをコードする、実施形態１１に記載の発現カセット。

【0140】

１３．Ａは、配列番号６０、６２、７４、もしくは７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６０、６２、７４、もしくは７６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂは、配列番号３１もしくは５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３１もしくは５３と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂ’は、配列番号３３もしくは５６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３３もしくは５６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードする、実施形態１２に記載の発現カセット。

【0141】

１４．Ａは、配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列、または配列番号５９、６１、７３、もしくは７５のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂは、配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列、または配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂ’は、配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列、または配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、実施形態１２に記載の発現カセット。

【0142】

１５．第１のヌクレオチド配列は、配列番号６４、６６、７８、もしくは８０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６４、６６、７８、もしくは８０と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0143】

１６．発現カセットは、配列番号６３、６５、７７、もしくは７９の配列、または配列番号６３、６５、７７、もしくは７９のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0144】

１７．発現カセットは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結されたタグ配列をさらにコードする、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0145】

１８．タグ配列は、ＨＡタグおよびＭｙｃタグからなる群から選択される少なくとも１つのタグ配列を含む、実施形態１７に記載の発現カセット。

【0146】

１９．実施形態１～１８のいずれか１つに記載の発現カセットを含む、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを発現するための、プラスミド。

【0147】

２０．膜貫通ドメインに融合した抗ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ。

【0148】

２１．癌の治療における使用のための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の発現カセットまたは実施形態１９に記載のプラスミド。

【0149】

２２．以下によって表される式を含む発現カセットであって、
Ｐ － Ｂ － Ｔ － Ｂ’ － Ｔ － Ａ
式中、Ｐは、プロモーターであり、Ａは、ＣＸＣＬ９をコードし、Ｔは、翻訳修飾エレメントであり、Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ３５をコードし、Ｂ’は、ＩＬ－１２ ｐ４０をコードする、発現カセット。

【0150】

２３．Ｔは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドからなる群から選択される２Ａペプチドを含む、実施形態２２に記載の発現カセット。

【0151】

２４．Ａは、配列番号３５もしくは５８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３５もしくは５７と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂは、配列番号３１もしくは５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３１もしくは５３と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードし、Ｂ’は、配列番号３３もしくは５６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３３もしくは５６と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードする、実施形態２２もしくは２３に記載の発現カセット。

【0152】

２５．Ａは、配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列、または配列番号３４もしくは５７のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂは、配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列、または配列番号３０、５１、もしくは５２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含み、Ｂ’は、配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列、または配列番号３２、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、実施形態２２～２４のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0153】

２６．発現カセットは、配列番号６８もしくは８２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６８もしくは８２と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、をコードする、実施形態２２～２５のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0154】

２７．発現カセットは、配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列、または配列番号６７もしくは８１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するヌクレオチド配列、を含む、実施形態２２～２６のいずれか１つに記載の発現カセット。

【0155】

２８．ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２を発現するためのプラスミドであって、実施形態２２～２７のいずれか１つに記載の発現カセットを含む、プラスミド。

【0156】

２９．癌の治療における使用のための、実施形態２２～２７のいずれか１つに記載の発現カセットまたは実施形態２８に記載のプラスミド。

【0157】

３０．癌の治療における使用のための、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする発現カセットおよびＣＸＣＬ９をコードする発現カセットであって、発現カセットは、腫瘍内エレクトロポレーション療法のために製剤化される、発現カセット。

【0158】

３１．腫瘍を有する対象を治療する方法であって、有効用量の実施形態１９または２８に記載の少なくとも１つのプラスミドを腫瘍に注射することと、エレクトロポレーション療法を腫瘍に投与することと、を含む、方法。

【0159】

３２．エレクトロポレーション療法は、約１００マイクロ秒から約１ミリ秒の持続時間にわたる少なくとも１個の電圧パルスの投与を含む、実施形態３１に記載の方法。

【0160】

３３．エレクトロポレーション療法は、１～６個の電圧パルスの投与を含む、実施形態３２に記載の方法。

【0161】

３４．１～１０個の電圧パルスは、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの場強度を有する、実施形態３２または３３に記載の方法。

【0162】

３５．少なくとも１つのプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、１日目と、５±２日目と、８±２日目と、に投与される、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の方法。

【0163】

３６．
（ａ）実施形態１９に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、１日目と、５±２日目と、に投与され、実施形態２８に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、８±２日目に投与され、
（ｂ）実施形態１９に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、１日目と、８±２日目と、に投与され、実施形態２８に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、５±２日目に投与され、
（ｃ）実施形態１９に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、５±２日目と、８±２日目と、に投与され、実施形態２８に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、１日目に投与され、
（ｄ）実施形態２８に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、１日目と、５±２日目と、に投与され、実施形態１９に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、８±２日目に投与され、
（ｅ）実施形態２８に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、１日目と、８±２日目と、に投与され、実施形態１９に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、５±２日目に投与され、
（ｆ）実施形態２８に記載のプラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、５±２日目と、８±２日目と、に投与され、実施形態１９に記載の前プラスミドは、腫瘍に注射され、エレクトロポレーション療法は、１日目に投与される、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の方法。

【0164】

３７．対象に少なくとも１つの追加の療法を投与することをさらに含む、実施形態３１～３６のいずれか１つに記載の方法。

【0165】

３８．本方法は、腫瘍浸潤リンパ球の増加、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化および／または増殖の増加、治療される腫瘍の退行、ならびに１つ以上の未治療腫瘍の退行のうちの１つ以上を生じる、実施形態３１～３７のいずれか１つに記載の方法。

【0166】

３９．少なくとも１つの追加の療法は、ＩＴ－ＥＰ抗ＣＬＴＡ－４ ｓｃＦｖ療法を投与することを含む、実施形態３７に記載の方法。

【0167】

４０．腫瘍を有する対象を治療する治療のための方法であって、有効用量の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖをコードする少なくとも１つのプラスミドを腫瘍に注射することと、エレクトロポレーション療法を腫瘍に投与することと、を含む、方法。

【0168】

４１．本方法は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２療法、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９療法、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２～ＣＸＣＬ９療法、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法、およびＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２療法のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態４０に記載の方法。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【0169】

本発明は、理解を明確にする目的で詳細に説明されているが、特定の修正は、添付の特許請求の範囲内で実施され得る。本出願で引用されるすべての刊行物、登録番号、ウェブサイト、特許文書などは、各々がそのように個別に示された場合と同じ範囲まで、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。異なる情報が異なる時点での引用に関連付けられる範囲まで、情報は、本出願の有効な出願日のものとして提供される。文脈から他に明らかでない限り、本発明の任意の要素、実施形態、ステップ、特徴、または態様は、他のものと組み合わせて実行することができる。

【実施例】

【0170】

ＣＸＣＬ９
実施例１．ＣＸＣＬ９プラスミド構築。マウスＣＸＣＬ９（ｍＣＸＣＬ９）またはヒトＣＸＣＬ９（ｈＣＸＣＬ９）核酸配列は、標準的な分子生物学技術を使用して発現ベクターにクローニングした。あるいは、ｍＣＸＣＬ９またはｈＣＸＣＬ９をマウス（ｍＩＬ１２－２Ａ）またはヒト（ｈＩＬ１２－２Ａ）ＩＬ１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２ ｐ４０の下流にクローニングして、ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９を得た（図１Ａ～Ｂ＿。ＩＬ１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２ ｐ４０構築体は、基本的にＷＯ２０１７／１０６７９５またはＷＯ２０１８／２２９６９６に記載されるように作製された。

【0171】

得られたプラスミドは、ＩＬ－１２ ｐ３５、ＩＬ－１２ ｐ４０、ＣＸＣＬ９を含み、すべて同じプロモーターから発現され、エクソンスキッピング（Ｐ２Ａ）モチーフが介在して、３つのタンパク質すべてを単一の多シストロン性メッセージから発現させることを可能にした。同様の方法を使用して、ｍＣＸＣＬ９～ｍＣｈｅｒｒｙを作製した。

【0172】

実施例２．タンパク質発現。ｍＩＬ１２－２Ａ、ｍＣＸＣＬ９、およびｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターをインビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、上清を収集し、ＩＬ１２およびＣＸＣＬ９タンパク質発現をＥＬＩＳＡによってアッセイした。図２に示される結果は、発現が、ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされた細胞において減少したが、検出可能なレベルのＩＬ１２およびＣＸＣＬ９の両方が産生されたことを示す。図２７は、ｈＩＬ－１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされた細胞における高レベルの分泌されたｈＩＬ１２およびｈＣＸＣＬ９を示す。

【0173】

同様に、ｈＩＬ１２－２Ａ、ｈＣＸＣＬ９、およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターをインビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、上清を収集し、ＩＬ１２およびＣＸＣＬ９タンパク質発現をＥＬＩＳＡでアッセイした。ｈＩＬ１２は、ｈＩＬ１２－２Ａ（１．５９μｇ／ｍＬ）およびｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９（１．３７μｇ／ｍＬ）発現ベクターの両方からほぼ等しく発現された（図１０Ａ）。ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされた細胞（５．１９μｇ／ｍＬ）と比較して、減少したが、それでもかなりのレベルのｈＣＸＣＬ９がｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされた細胞（１．７５μｇ／ｍＬ）で発現された（図１０Ｂ）。

【0174】

ｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターから産生されたｍＩＬ１２タンパク質をさらに活性について試験した。ｍＩＬ１２－２ＡまたはｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされた細胞から産生されたｍＩＬ１２を、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞とともにインキュベートした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を使用して、生物活性のあるヒトおよびマウスＩＬ－１２を検出する。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を使用して、組換えネイティブまたは操作されたヒトまたはマウスＩＬ－１２の機能を検証する。機能的なＩＬ－１２は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞におけるＩＬ－１２受容体に結合し、ＳＴＡＴ－４経路およびＳＴＡＴ４誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を活性化する。次に、ＳＥＡＰ発現をアッセイする。応答比は、治療された細胞の６３０ｎｍでのＯＤを、未治療の細胞の６３０ｎｍでのＯＤで除することによって計算した。図３に示される結果は、ｍＩＬ１２－２ＡまたはｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターのいずれかから産生されたＩＬ－１２は、機能的であることを実証する。

【0175】

同様に、ｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターから産生されたｈＩＬ１２タンパク質もまた、活性について試験した。ｈＩＬ１２～ｈＣＸＣＬ９発現ベクターでトランスフェクトされた細胞から産生されたｈＩＬ１２を、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞とともにインキュベートした。図１１に示される結果は、ｈＩＬ１２－２Ａ発現ベクターから産生されたＩＬ－１２が、機能的であることを実証する。

【0176】

実施例３．インビトロでのＴ細胞のＣＸＣＬ９誘導性遊走。哺乳動物（ＨＥＫ２９３）細胞をＣＸＣＬ９発現ベクター（ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２～ＣＸＣＬ９）によってトランスフェクトした。ＯＴ－Ｉマウス脾細胞に１μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを２４時間パルスし、次いで７２時間回復させた。次に、ＣＸＣＬ９をトランスフェクトした細胞を、５．０ミクロンの孔を有するポリカーボネート膜に通してＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化ＯＴ－Ｉ脾細胞の走化性の誘導についてアッセイした。遊走指数は、観察された走化性細胞の数として定義され、ＯｐｔｉＭＥＭ陰性コントロールにおいて膜を通って受動的に遊走した細胞の数に基準化した。結果を図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃに示す。ｍＣＸＣＬ９およびｍＩＬ１２～ｍＣＸＣＬ９発現ベクターから産生されたｍＣＸＣＬ９は、走化性細胞においてそれぞれ約７倍および約３倍の増加を引き起こした。走化性の増加は、ＣＸＣＬ９中和抗体の添加によって阻害され、効果がｍＣＸＣＬ９に依存していることを示した。

【0177】

実施例４．ｍＣＸＣＬ９のインビトロ発現。ＣＴ－２６（結腸癌腫）腫瘍をマウスに移植した。その後、腫瘍をＩＴ－ＥＰｐＵＭＣＶ３コントロールベクターまたはＩＴ－ＥＰ ｍＣＸＣＬ９発現ベクターで治療した。ＩＴ－ＥＰの４８時間後、腫瘍をホモジナイズし、ＥＬＩＳＡによってＣＸＣＬ９発現についてアッセイした（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ３９２、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、ウェルチ補正を伴うＴ検定）。図５の結果は、ＩＴ－ＥＰで治療された腫瘍が、ＣＸＣＬ９を発現したことを示す。

【0178】

実施例５．ｍＩＬ１２－２ＡおよびｍＣＸＣＬ９で治療されたマウスの腫瘍退行。マウスに腫瘍細胞を移植した。麻酔をかけたマウスに、細胞を右および／または左脇腹に皮下注射した。腫瘍の成長は、平均腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に達するまで、デジタルノギス測定によってモニタリングした。

【0179】

腫瘍は、０日目にＩＴ－ＥＰコントロールベクターまたはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａ発現ベクターによって、４日目および７日目にＩＴ－ＥＰコントロールベクターまたはＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９（任意選択的にｍｃｈｅｒｒｙレポートタンパク質を添加）によって、治療された。腫瘍体積および生存率をモニタリングした。一次および対側の総腫瘍量が２０００ｍｍ^３に達したとき、マウスを安楽死させた。

【0180】

図６に示されるデータは、ＩＴ－ＥＰ ｍＩＬ１２－２ＡプラスｍＣＸＣＬ９療法で治療されたマウスが、未治療のマウス、コントロールビヒクルで治療されたマウス、またはＩＴ－ＥＰｍＩＬ１２－２Ａのみで治療されたマウスと比較して、生存率の増加を示したことを示す。ＩＴ－ＥＰ ｍＩＬ１２－２ＡプラスｍＣＸＣＬ９～ｍＣｈｅｒｒｙ療法で治療された腫瘍担持マウスも、一次（既治療）および対側（未治療）の腫瘍進行の減少を示した（図７Ａ～Ｂ）。

【0181】

実施例６．ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａ＋ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９は、抗原特異的ＣＤ８および短命エフェクター細胞（ＳＬＥＣ）の全身拡張を促進する。－８日目に、マウスに上記のように腫瘍を移植した。０日目に、腫瘍はＩＴ－ＥＰ ｍＩＬ１２－２Ａで治療された。４日目と７日目に、マウスを上記のようにＩＴ－ＥＰを使用してコントロールプラスミドまたはｍＣＸＣＬ９（ｎ＝３／群）で治療した。９日目に脾臓を採取し、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞をＦＡＣＳによって分析した。図８は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞集団が、ＩＬ１２－２Ａ＋ＣＸＣＬ９によって治療されたマウスにおいて有意に増加したことを示す。ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加倍率を図９に示す。

【0182】

実施例７．腫瘍内ＣＸＣＬ９はＩＬ－１２と相乗作用して、腫瘍の微小環境を調節し、抗原特異的Ｔ細胞を拡張し、コントロール対側の腫瘍増殖を制御する。マウスモデルを使用して、エレクトロポレーション後の腫瘍内発現を評価した。

【0183】

ＣＴ２６腫瘍は、－７日目にマウスに移植した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析およびフローベースアッセイでは、単一の腫瘍モデルを使用した。マウスは、１日目に最適以下の用量のＩＬ１２－２ＡによるＩＴ－ＥＰで治療し、続いて４日目および７日目に１００μｇのｍＣＸＣＬ９またはｐＵＭＶＣ３のいずれかを使用するＩＴ－ＥＰで治療された。次に、腫瘍および免疫応答をモニタリングした。腫瘍および脾細胞は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇおよびフローベースの分析のために、最後のＥＰの２日後（つまり、９日目）に採取された。あるいは、腫瘍体積は、退行／生存試験のために、週に３回測定された。エレクトロポレーションしたＣＴ２６病変における遺伝子発現の変化は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）テクノロジーによって評価された。ｍＣＸＣＬ９の腫瘍内発現は、ＣＴ２６腫瘍担持マウスからの腫瘍溶解物における、エレクトロポレーションの４８時間後のｍＣＸＣＬ９について、ＥＬＩＳＡを使用して確認した（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、ウェルチ補正を伴うＴ検定）。

【0184】

各遺伝子のｐ値およびｌｏｇ２倍率変化を表すボルケーノプロットは、ＣＸＣＬ９単独またはＩＬ１２－２Ａと組み合わせたＣＸＣＬ９で治療されたマウスで生成された（図２８Ａ）。細胞型スコアの分析は、ＣＸＣＬ９またはＩＬ１２－２Ａのいずれかによる治療に応答して、細胞傷害性免疫細胞の増加を示した。ＣＸＣＬ９をＩＬ１２－２Ａと組み合わせて投与した場合、細胞傷害性免疫細胞スコアにおける相乗的な増加がさらに認められた。「細胞傷害性免疫細胞」細胞型スコアを図２８Ｂに示す。

【0185】

フローサイトメトリー分析を使用して、治療されたマウスにおける脾細胞を分析した。抗原特異的ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、テトラマー分析（Ｉｍｍｕｄｅｘ）を介して測定された。細胞は、シングレット＜生存＜ＣＤ３＋ＣＤ４－脾細胞でゲーティングされる（図８）。ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞数における増加倍率を、空ベクターコントロールと比較した（３～５匹／群でのＮ＝２の独立した実験、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、一元配置分散分析）。コントロールプラスミドのみで治療されたマウスでは、ＡＨ１テトラマーの０．７９％はＣＤ８＋であった。ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａで治療されたマウスでは、ＡＨ１テトラマーの１．４３％はＣＤ８＋であった。ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２ＡおよびＣＸＣＬ９で治療されたマウスでは、ＡＨ１テトラマーの３．２２％はＣＤ８＋であった。ＡＨ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加倍率を図９に示す。

【0186】

結果は、ＩＴ－ＥＰ ＣＸＣＬ９が、最適以下の用量のＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａで前に治療された動物の抗腫瘍免疫応答を実質的に増強することができることを示す。

【0187】

ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ
実施例８．Ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ発現カセットは、ＣＸＣＬ９プラスミドの生成について上記されたものと同様の方法で作製された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。

【0188】

実施例９．タンパク質発現。ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよび２Ｃ１１ ｓｃＦｖ、発現ベクターを、インビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２を、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、上清を収集し、タンパク質をゲル電気泳動によって分離した。ＣＤ３ ｓｃＦｖ、カドヘリン（膜タンパク質）、およびＨｓｐ９０は、ウエスタンブロット分析によって検出した。図１３に示される結果は、発現ベクターがＣＤ３ ｓｃＦｖタンパク質を発現したことを示す。ＣＤ３ ｓｃＦｖタンパク質は、主に膜画分に局在した。発現ベクター

【0189】

ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターを、インビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＦＡＣＳで分析してＣＤ３ ｓｃＦｖを検出した（図１４Ａ～Ｃ）。ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターを、Ｂ１６－Ｆ１０細胞にトランスフェクトした。細胞をＦＡＣＳによって分析して、ＣＤ３ ｓｃＦｖの表面発現を検出した（図１４Ｄ）。ＩＬ１２－２ＡおよびＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｍＩＬ１２発現ベクターからのＩＬ１２の発現を図１４Ｅに示す。

【0190】

ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターを、インビトロでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞の上清を収集し、ＩＬ１２ ｐ７０についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果によって、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２およびＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２発現ベクターでトランスフェクトされた細胞が、ｈＩＬ１２ ｐ７０を発現して分泌することが確証される（図１５）。

【0191】

インビボ発現：マウスを、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞または４Ｔ１乳癌細胞によって－７日目に接種した。０日目に、腫瘍を、ＩＴ－ＥＰ ＨＡ－２Ｃ１１ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２で治療された（図１６）。図１６Ａ～Ｂは、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥが、ＩＴ－ＥＰ後に、黒色腫および乳癌腫瘍の表面に発現されることを示す。図１６Ｃは、ＨＡ－ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ～ｈＩＬ１２のＩＴ－ＥＰ後に、発現ベクターはＩＬ－１２も発現することを示す。

【0192】

実施例１０．インビトロ機能アッセイ。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、組換えマウスＩＬ１２の添加または無添加で、コントロールベクターおよび２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクターによってインビボでトランスフェクトした。次に、トランスフェクトしたＢ１６Ｆ１０細胞を、ナイーブマウス脾細胞とともに２３、４８、または７２時間共培養した。共培養後、上清をＩＦＮγについてアッセイし、細胞増殖をＦＡＣＳによって評価した。プレートに結合した抗ＣＤ３を、陽性コントロールとして使用した。図１７に示される結果は、脾細胞が２Ｃ１１ ｓｃＦｖを発現するＢ１６Ｆ１０と共培養された場合、ＩＦＮγ発現が実質的に増加したことを示す。ＦＡＣＳ分析を実施して、ナイーブマウス脾細胞を、組換えマウスＩＬ１２の添加もしくは無添加でコントロールベクター（Ｔｆｘコントロール）、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクターによってインビボでトランスフェクトしたＢ１６Ｆ１０細胞とともに、またはプレート結合抗ＣＤ３（陽性コントロール）とともに共培養した後に、ＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞の増殖を分析した（図１８）。

【0193】

実施例１１．インビボ機能アッセイ。－９日目に、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞をマウスに移植した（ｎ＝８／群）。０日目に、腫瘍は、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ発現ベクターまたは空ベクター（陰性コントロール）を用いたＩＴ－ＥＰによって治療された。０日目に、マウスにまた、ＯＴ－１（ＧＦＰ）ＣＤ８^＋細胞Ｔ細胞およびナイーブマウスリンパ球の１：１混合物とともに、養子移入によって移植した。５日目に、脾臓および流入領域リンパ節（ＤＬＮ）における養子移入Ｔ細胞の増殖を、ＦＡＣＳによって試験した。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）における内因性Ｔ細胞集団およびＳＩＩＮＦＥＫＬ発現も、ＦＡＣＳによって試験した。ＤＬＮにおけるポリクローナルＴ細胞増殖の増加が、ＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１ ｓｃＦｖで治療されたマウスで観察された（図１９）。ＯＴ－１およびポリクローナルＴ細胞集団の増加も、ＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１ ｓｃＦｖで治療されたマウスの脾細胞で観察された。ＴＩＬ中のＣＤ４５．１＋生細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰで治療されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスで観察された（図２０）。ＴＩＬにおける抗原特異的（ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が、図２１、２Ｃ１１ ｓｃＦｖ ＩＴ－ＥＰで治療されたＢ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルマウスで観察された。結果は、２Ｃ１１を用いたＩＴ－ＥＰが、ポリクローナルＴ細胞の増殖、および腫瘍における増強された腫瘍特異的Ｔ細胞応答をもたらすことを示す。

【0194】

実施例１２．インビボ細胞傷害性Ｔ細胞死滅化アッセイ。リンパ球をナイーブマウスから採取し、ＣＦＳＥで標識した。次に、標識リンパ球をＯＶＡペプチドによってパルスしてＴ細胞を活性化するか（ＣＦＳＥ^ｈｉ、治療済み）、または未治療のままにした（ＣＦＳＥ^ｌｏ、未パルス化）。ＣＦＳＥ^ｈｉおよびＣＦＳＥ^ｌｏのリンパ球を、腫瘍担持マウスへの投与のために約１：１の比で混合した。

【0195】

－７日目に、マウスは、Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍細胞（オボアルブミンを発現するＢ１６黒色腫細胞）を、ｃ５７／ｂｌ／６マウスの脇腹に移植した。１日目に、マウスを、ＩＴ－ＥＰ抗２Ｃ１１ ｓｃＦｖまたは空ベクター（ｐＵＭＶＣ３）で治療した。２日目に、マウスに、養子移入によって、パルス化標的細胞（１μＭ ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル）で標識された２μｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドによってパルスされた細胞）および非パルス化細胞を、養子移入によって投与した。養子移入の１８時間後、脾臓および流入領域リンパ節を採取して分析した。

【0196】

ウエスタンブロット分析は、腫瘍がＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを発現したことを示した。３日目に、養子移入の１８時間後、ＤＬＮを単離した。次いで、ＤＬＮは、ＣＦＳＥ^ｌｏおよびＣＦＳＥ^ｈｉ細胞の存在についてＦＡＣＳによって分析された。図２２に示される結果は、ＣＦＳＥ^ｈｉ細胞数の実質的な減少を示し、ＯＶＡペプチドを提示する細胞の抗原特異的死滅を示した。減少は、以下の式を使用して定量化された。

【数1】

【数2】

結果は図２３に示され、脾細胞（ＳＰ）およびＤＬＮの両方におけるＣＦＳＥ^ｈｉ細胞の溶解における増加を示す。ＣＦＳＥ細胞のＦＡＣＳ分析を図２４に示す。コントロールマウスでは、ＣＦＳＥ^ｈｉ細胞の溶解率は５４．６３±１２．７９％であった。ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法を受けているマウスでは、ＣＦＳＥ^ｈｉ細胞の溶解率は８２．４４±１１．３５％であった。ＯＶＡ発現細胞は、ＩＴ－ＥＰ ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで治療されたマウスにおいて特異的に死滅し、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答の増強を示した。活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥを発現する腫瘍において優先的に保持された。したがって、ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥをコードする核酸のエレクトロポレーションは、有効な腫瘍治療を提供する。

【0197】

ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥのＩＴ－ＥＰは、Ｔ細胞による腫瘍細胞標的化の増加をもたらした。

【0198】

脾臓および流入領域リンパ節からの細胞のフローサイトメトリー分析は、ＩＴ－ＥＰ抗ＣＤ３（２Ｃ１１）群における有意な抗原特異的死滅を示す（図２３および２６）。

【0199】

実施例１３．腫瘍退行。
Ａ．黒色腫：－７日目に、マウスにＢ１６黒色腫細胞を移植した。０日目に、マウスを、空ベクター、ＩＬ１２－２Ａをコードする発現ベクターを用いたＩＴ－ＥＰによって治療された。４日目と７日目に、マウスをＩＴ－ＥＰコントロールベクターまたはＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１（ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ）発現ベクターによって治療した。腫瘍の進行は、３日ごとにモニタリングされた。結果は、ＩＬ１２－２Ａ単独による治療と比較して、ＩＬ１２－２ＡプラスＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥで治療されたマウスにおける改善された対側（未治療）腫瘍退行を示す（図２５Ａおよび２５Ｂ）。

【0200】

Ｂ．乳癌：－７日目に、マウスに４Ｔ１乳癌細胞を移植した。０日目に、マウスを、コントロールベクターを用いたＩＴ－ＥＰ、またはＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２Ａによって治療した。４日目と７日目に、マウスを、コントロールベクターを用いたＩＴ－ＥＰまたはＩＴ－ＥＰ ２Ｃ１１（ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ）発現ベクターによって治療した。腫瘍の進行は、３日ごとにモニタリングされた。結果は、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ１２－２ＡをＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法と組み合わせると、乳癌腫瘍の退行を向上することを示す（図２６Ａ）。ＩＬ１２－２ＡプラスＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ療法は、４Ｔ１乳癌モデルマウスの肺転移結節を治療する上でも有効であった（図２６Ｂ）。４Ｔ１乳癌モデルマウスにおける末梢血１μＬあたりのエフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７－ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ３＋）の絶対数を、図２６Ｃに示す。

【0201】

ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ併用療法
実施例１４．ＣＸＣＬ９プラスＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ併用療法。Ｂ１６．Ｆ１０担癌マウスを、１０μｇのＩＬ－１２発現プラスミド、１００μｇのＩＬ－１２発現プラスミド、または１００μｇのＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２を用いたＩＴ－ＥＰ（１日目、５日目、および８日目）で治療した。ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２について、ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９またはＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２のいずれかが１日目、５日目、および８日目の各々で投与されるが、ただし、対象は少なくとも１回のＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９を用いたＩＴ－ＥＰ治療および１回のＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２を用いたＩＴ－ＥＰ治療を受ける。ＩＬ－１２の腫瘍内発現が、ＩＴ－ＥＰの４８時間後に腫瘍溶解物（ｎ＝８匹の動物）において確証された（ＥＬＩＳＡ）。ＩＬ１２ ７０発現を図２９Ａに示す。一次（エレクトロポレーションした病変）および対側（非エレクトロポレーション病変）のＢ１６．Ｆ１０病変の増殖を、ＩＴ－ＥＰ療法の１２日後に測定した（図２９Ｂ～Ｃ）。ＩＬ１２ ｐ７０発現に関して、１０μｇのＩＬ１２－２Ａを用いたＩＴ－ＥＰによって治療された動物は、１００μｇのＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２で治療された動物と同じ量のＩＬ１２を発現した（図２９Ａ）。対側の腫瘍は、ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２で治療された動物では、１０μｇのＩＬ１２－２Ａで治療されたマウスと比較して有意に小さく（動物８～１０匹／群、二元配置分散分析を使用して統計学的有意性を決定、＊ｐ＜０．０５）、ＩＴ－ＥＰ ＩＬ－１２～ＣＸＣＬ９／ＣＤ３ ｈａｌｆ－ＢｉＴＥ～ＩＬ１２療法を使用して腫瘍退行の増強を示した。

【0202】

ＣＬＴＡ－４ ｓｃＦｖ
実施例１５．抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの腫瘍内発現。マウスＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ（ａｂ１３３０４５）をＲＥＮＣＡ腫瘍溶解物について実施し、抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの腫瘍内発現を定量化した。抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの発現は、腫瘍でのみ検出され、血清では検出されず、腫瘍内エレクトロポレーションでの抗体の局所発現を際立たせた。

【0203】

組換えＣＴＬＡ４タンパク質に結合した抗ＣＴＬＡ４ｓｃＦｖをコードするプラスミド。トランスフェクションに由来する分泌型抗ＣＴＬＡ４（ｓｃＦｖ）について、それらのＣＴＬＡ－４との結合能を評価した。組換えマウスＣＴＬＡ－４／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、９６ウェルプレート（１もしくは５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ウェルもしくは２５０μｇ／ウェル）に室温で１８時間固定した。ウェルをＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。９Ｈ１０－ｓｃＦｖ（１６８ｎｇ／ｍＬ）または９Ｄ９－ｓｃＦｖ（１３０ｎｇ／ｍＬ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、０．２μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ウェルを再び３回洗浄し、ＨＲＰ基質試薬（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で展開して、停止溶液である２Ｎ硫酸（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で停止した。各ウェルの光学密度は、４５０ｎｍで測定された。各条件群における平均ＯＤ値のグラフ表示は、プラスミドに由来する抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの組換えＣＴＬＡ４タンパク質との結合を示すように表される（図３０Ａ）。

【0204】

マウスＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ（ａｂ１３３０４５）をＲＥＮＣＡ腫瘍溶解物について実施し、抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの腫瘍内発現を定量化した。抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖの発現が、腫瘍中で検出された（図３０Ｂ）。統計学的に有意なレベルの抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖは、血清中では観察されず、腫瘍内エレクトロポレーションでの抗体の局所発現を示した。

【0205】

本発明は、実施例のみとして上記で記載されていることが理解されよう。実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。以下の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、様々な修正および実施形態を行うことができる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14A-C】

【図14D-E】

【図15】

【図16A-B】

【図16C】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A-B】

【図26C】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B-C】

【図30】

【配列表】

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【国際調査報告】