特表 2022-512968 Ｔ細胞操作のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】Ｔ細胞操作のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220131BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220131BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12N5/0783

A61P43/00

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/15

A61K35/17

A61K35/28

C12N15/12 ZNA

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021525058

(86)(22)【出願日】2019-11-01

(85)【翻訳文提出日】2021-07-06

(86)【国際出願番号】 CN2019114939

(87)【国際公開番号】W WO2020088631

(87)【国際公開日】2020-05-07

(31)【優先権主張番号】201811297174.3

(32)【優先日】2018-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201811535338.1

(32)【優先日】2018-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201811549651.0

(32)【優先日】2018-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201910492882.0

(32)【優先日】2019-06-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/101651

(32)【優先日】2019-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521194507

【氏名又は名称】グレイセル・バイオテクノロジーズ（シャンハイ）カンパニー・リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】521194518

【氏名又は名称】スーチョウ・グレイセル・バイオテクノロジーズ・カンパニー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100122644

【弁理士】

【氏名又は名称】寺地 拓己

(72)【発明者】

【氏名】ワン，シンシン

(72)【発明者】

【氏名】ジン，タオ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，チュンフイ

(72)【発明者】

【氏名】シー，チョンドン

(72)【発明者】

【氏名】リウ，リーピン

(72)【発明者】

【氏名】スン，ジン

(72)【発明者】

【氏名】チウ，シュイ

(72)【発明者】

【氏名】ツァオ，ウェイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087BB37

4C087BB44

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本開示は、操作された免疫細胞およびその使用に関する。本開示は、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを含む操作された免疫細胞を提供し、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインを含むことができる。本開示の操作された免疫細胞は、対象に投与された場合、宿主免疫細胞、例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞などを阻害することができ、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの当該操作された免疫細胞の生存率および持続性を高めることができ、それにより、より効果的な腫瘍殺活性を示すことができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作された免疫細胞であって、
（ｉ）前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分および（ｉｉ）誘導性細胞死部分を含むキメラポリペプチドであって、前記誘導性細胞死部分が、前記キメラポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると前記操作された免疫細胞の死を生じさせることができ、前記エンハンサー部分が、前記誘導性細胞死部分に連結されている、キメラポリペプチドと、
結合部位を含む１つまたは複数のキメラポリペプチド受容体（ＣＰＲ）であって、前記結合部位が、（ｉ）対象に投与されたときに前記操作された免疫細胞に対する前記対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、前記１つまたは複数のＣＰＲの個々のＣＰＲが、（ｉ）前記第１の抗原結合性ドメイン、（ｉｉ）前記第２の抗原結合性ドメイン、または（ｉｉｉ）前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインの両方を含み、前記１つまたは複数のＣＰＲの各ＣＰＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラポリペプチド受容体（ＣＰＲ）と
を含む、操作された免疫細胞。

【請求項2】

前記１つまたは複数のＣＰＲが、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項3】

前記第１の抗原結合性ドメインが、免疫細胞抗原に結合する、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項4】

前記操作された免疫細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子が不活性化されており、前記内因性表面マーカーが、発現されたときに前記第１の抗原結合性ドメインに結合することができる、請求項２に記載の操作された免疫細胞。

【請求項5】

前記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されている、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項6】

前記内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子が不活性化され、それにより、前記内因性ＴＣＲが不活性化されている、請求項５に記載の操作された免疫細胞。

【請求項7】

前記サブユニットをコードする前記遺伝子が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである、請求項６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項8】

前記キメラポリペプチドが、前記エンハンサー部分および前記誘導性細胞死部分が隣接する任意の自己切断性ペプチドを含まない、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項9】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の前記１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項10】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている、請求項９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項11】

前記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路が、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である、請求項１０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項12】

前記エンハンサー部分が、自己オリゴマー化によって自己活性化性である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項13】

前記エンハンサー部分が、自己二量体化によって自己活性化性である、請求項１２に記載の操作された免疫細胞。

【請求項14】

前記キメラポリペプチドが、分泌タンパク質である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項15】

前記キメラポリペプチドが、細胞内タンパク質である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項16】

前記キメラポリペプチドが、膜貫通タンパク質である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項17】

前記エンハンサー部分または前記誘導性細胞死部分が、前記膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれる、請求項１６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項18】

前記エンハンサー部分または前記誘導性細胞死部分が、前記膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれる、請求項１６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項19】

（ｉ）前記エンハンサー部分が、前記膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれ、ならびに（ｉｉ）前記誘導性細胞死部分が、前記膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれる、請求項１６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項20】

（ｉ）前記エンハンサー部分が、前記膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれ、ならびに（ｉｉ）前記誘導性細胞死部分が、前記膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれる、請求項１６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項21】

前記エンハンサー部分が、サイトカインまたはサイトカイン受容体である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項22】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項23】

前記エンハンサー部分が、ｔｒａｎｓ活性化因子またはｃｉｓ活性化因子として機能する、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項24】

前記誘導性細胞死部分が、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項25】

前記誘導性細胞死部分が、ＥＧＦＲｔであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項２４に記載の操作された免疫細胞。

【請求項26】

前記誘導性細胞死部分が、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＧＣＶである、請求項２４に記載の操作された免疫細胞。

【請求項27】

前記誘導性細胞死部分が、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＡＰ１９０３である、請求項２４に記載の操作された免疫細胞。

【請求項28】

前記細胞死アクティベーターが、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項29】

前記１つまたは複数のＣＰＲの前記個々のＣＰＲが、前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインの両方を含む、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項30】

前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインが、リンカーによって連結されている、請求項２９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項31】

前記リンカーが、自己切断性ペプチドを含まない、請求項３０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項32】

前記第１の抗原結合性ドメインまたは前記第２の抗原結合性ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項33】

前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、
（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２；
（ｉｉ）ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２；
（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１；
（ｉｖ）ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１；
（ｖ）ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２；
（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２；
（ｖｉｉ）ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１；または
（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１；
として配置され、
ＶＨ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである、
請求項２９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項34】

前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、
（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１；
（ｉｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１；
（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２；
（ｉｖ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２；
（ｖ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１；
（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１；
（ｖｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２；または
（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２
として配置され、
ＶＨ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである、
請求項２９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項35】

前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインが、前記免疫細胞抗原および前記疾患関連抗原に結合する、請求項３０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項36】

前記１つまたは複数のＣＰＲの前記個々のＣＰＲが、前記第１の抗原結合性ドメインのみを含み、ならびに前記１つまたは複数のＣＰＲの別の個々のＣＰＲが、前記第２の抗原結合性ドメインのみを含む、請求項２９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項37】

前記免疫細胞抗原が、免疫細胞の表面タンパク質または分泌タンパク質である、請求項３０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項38】

ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、または顆粒球である、請求項３７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項39】

末梢血、臍帯血から得られるか、あるいは幹細胞に由来する、請求項３７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項40】

前記免疫細胞抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される、請求項３７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項41】

前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項42】

前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲｌ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ノッチ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、またはＴＲＯＰ－２である、請求項４１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項43】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される免疫細胞抗原に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項44】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ３に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項４３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項45】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ７に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項４３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項46】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１３７に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項４３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項47】

前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現が、元のままである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項48】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現が、元のままである、請求項４７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項49】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現が、元のままである、請求項４７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項50】

前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現が、上方調節されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項51】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現が、上方調節されている、請求項５０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項52】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方の発現が阻害されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項53】

内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方をコードする遺伝子が、不活性化されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項54】

前記操作された免疫細胞のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇが、過剰発現されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項55】

前記操作された免疫細胞のＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＳＬ、および／またはＰＤ－１が、過剰発現されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項56】

Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１～５５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項57】

前記Ｔ細胞が、αβＴ細胞またはγδＴ細胞である、請求項５６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項58】

幹細胞に由来する、請求項１～５５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項59】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項５８に記載の操作された免疫細胞。

【請求項60】

自己細胞または同種異系細胞である、請求項１～５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項61】

ある状態を有する対象から得られる、請求項１～５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項62】

健康なドナーから得られる、請求項１～５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項63】

（ａ）結合部位を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記結合部位が、免疫細胞抗原に結合することができる第１の抗原結合性ドメインと疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、前記１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；
（ｂ）前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分と
を含む操作された免疫細胞であって、
前記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されており、ならびに、
前記操作された免疫細胞が、（ａ）における前記１つまたは複数のＣＡＲを含むが（ｂ）における前記エンハンサー部分を含まない別の操作された免疫細胞と比較して、（ｉ）前記操作された免疫細胞に対して異種である細胞の存在下において少なくとも約２０日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約１０倍の増殖の増強、または（ｉｉｉ）前記免疫細胞抗原または前記疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強を示す、
操作された免疫細胞。

【請求項64】

（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの２つ以上を示すことによって特徴付けられる、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項65】

（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）が、任意の外因性エンハンサー部分の非存在下において測定される、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項66】

前記免疫細胞抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項67】

前記免疫体抗原がＣＤ７である、請求項６６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項68】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の前記１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項69】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている、請求項６８に記載の操作された免疫細胞。

【請求項70】

前記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路が、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である、請求項６９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項71】

前記エンハンサー部分が、自己オリゴマー化によって自己活性化性である、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項72】

前記エンハンサー部分が、自己二量体化によって自己活性化性である、請求項７１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項73】

前記エンハンサー部分が、サイトカインまたはサイトカイン受容体である、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項74】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項75】

前記内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子が不活性化され、それにより、前記内因性ＴＣＲが不活性化されている、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項76】

前記サブユニットをコードする前記遺伝子が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである、請求項７５に記載の操作された免疫細胞。

【請求項77】

さらに、誘導性細胞死部分を含み、誘導性細胞死部分は、細胞死アクティベーターとの接触において前記操作された免疫細胞の自殺を生じさせる、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項78】

前記誘導性細胞死部分が、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される、請求項７７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項79】

前記誘導性細胞死部分が、ＥＧＦＲｔであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項７８に記載の操作された免疫細胞。

【請求項80】

前記誘導性細胞死部分が、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＧＣＶである、求項７８に記載の操作された免疫細胞。

【請求項81】

前記誘導性細胞死部分が、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＡＰ１９０３である、請求項７８に記載の操作された免疫細胞。

【請求項82】

前記細胞死アクティベーターが、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項７７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項83】

前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現が、元のままである、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項84】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現が、元のままである、請求項８３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項85】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現が、元のままである、請求項８３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項86】

前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現が、上方調節されている、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項87】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現が、上方調節されている、請求項８６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項88】

前記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方の発現が阻害されている、請求項６３～８２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項89】

内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方をコードする遺伝子が、不活性化されている、請求項６３～８２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項90】

前記操作された免疫細胞のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇが、過剰発現されている、請求項６３～８２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項91】

前記操作された免疫細胞のＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＳＬ、および／またはＰＤ－１が、過剰発現されている、請求項６３～８２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項92】

前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項93】

前記第１の抗原結合性ドメインまたは前記第２の抗原結合性ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項94】

前記操作された免疫細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子が不活性化されており、前記内因性表面マーカーが、発現されたときに前記第１の抗原結合性ドメインに結合することができる、請求項６３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項95】

前記内因性表面マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である、請求項９４に記載の操作された免疫細胞。

【請求項96】

Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項６３～９５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項97】

幹細胞に由来する、請求項６３～９５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項98】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項９７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項99】

自己細胞または同種異系細胞である、請求項６３～９５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項100】

ある状態を有する対象から得られる、請求項６３～９５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項101】

健康なドナーから得られる、請求項６３～９５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項102】

請求項１～１０１のいずれか一項に記載の前記操作された免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、疾患を治療するための医薬組成物。

【請求項103】

対象の疾患を治療または診断する方法であって、前記対象に、請求項１０２に記載の前記医薬組成物を投与する工程を含む方法。

【請求項104】

前記医薬組成物中の前記操作された免疫細胞が、同種異系免疫細胞に由来する、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記同種異系免疫細胞に由来する前記操作された免疫細胞が、前記対象において移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記医薬組成物中の前記操作された免疫細胞が、自家免疫細胞に由来する、請求項１０３に記載の方法。

【請求項107】

前記医薬組成物中の前記操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲが、機能的に不活性である、請求項１０３～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記操作された免疫細胞が、機能的に活性なＴＣＲを有する別の免疫細胞と比較して、前記対象においてＧｖＨＤを減少させる、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記疾患が、がんである、請求項１０２～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

前記がんが、リンパ腫または白血病である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

機能的に不活性なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記１つまたは複数のＣＡＲの個々の各ＣＡＲが、結合部分を含み、結合部位が、（ｉ）対象に投与されたときに前記操作された免疫細胞に対する前記対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合する第２の抗原結合性ドメインとを含み、ならびに前記１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と
を含む細胞。

【請求項112】

前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインが、リンカーによって連結されている、請求項１１１に記載の細胞。

【請求項113】

前記リンカーが、自己切断性ペプチドを含まない、請求項１１２に記載の細胞。

【請求項114】

前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、
（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２；
（ｉｉ）ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２；
（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１；
（ｉｖ）ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１；
（ｖ）ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２；
（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２；
（ｖｉｉ）ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１；または
（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１、
として配置され、
ＶＨ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである、
請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項115】

前記第１の抗原結合性ドメインおよび前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、
（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１；
（ｉｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１；
（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２；
（ｉｖ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２；
（ｖ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１；
（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１；
（ｖｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２；または
（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２、
として配置され、
ＶＨ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、前記第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである、
請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項116】

前記細胞の内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子が不活性化され、それにより、前記機能的に不活性なＴＣＲが生成されている、請求項１１１～１１５のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項117】

前記サブユニットをコードする前記遺伝子が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである、請求項１１６に記載の細胞。

【請求項118】

前記第１の抗原結合性ドメインが、免疫細胞抗原に結合する、請求項１１１～１１７のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項119】

前記免疫細胞抗原が、免疫細胞の表面タンパク質または分泌タンパク質である、請求項１１８に記載の細胞。

【請求項120】

前記免疫細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、または顆粒球である、請求項１１９に記載の細胞。

【請求項121】

前記免疫細胞抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である、請求項１１８～１２０のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項122】

前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１１１～１２１のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項123】

前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲｌ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ノッチ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、またはＴＲＯＰ－２である、請求項１２２に記載の細胞。

【請求項124】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される免疫細胞抗原に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項１１１に記載の細胞。

【請求項125】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ３に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項１２４に記載の細胞。

【請求項126】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ７に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項１２４に記載の細胞。

【請求項127】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１３７に結合し、ならびに前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９に結合する、請求項１２４に記載の細胞。

【請求項128】

さらに、エンハンサー部分を含み、エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高める、請求項１１１～１２７のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項129】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の前記１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている、請求項１２８に記載の細胞。

【請求項130】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている、請求項１２８に記載の細胞。

【請求項131】

前記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路が、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である、請求項１２８に記載の細胞。

【請求項132】

前記エンハンサー部分が、サイトカインまたはサイトカイン受容体である、請求項１３１に記載の細胞。

【請求項133】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２８～１３２のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項134】

細胞死アクティベーターに接触すると前記細胞の死を生じさせることができる誘導性細胞死部分をさらに含む、請求項１１１～１３３のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項135】

前記誘導性細胞死部分が、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される、請求項１３４に記載の細胞。

【請求項136】

前記誘導性細胞死部分が、ＥＧＦＲｔであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１３５に記載の細胞。

【請求項137】

前記誘導性細胞死部分が、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＧＣＶである、請求項１３５に記載の細胞。

【請求項138】

前記誘導性細胞死部分が、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＡＰ１９０３である、請求項１３５に記載の細胞。

【請求項139】

前記細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子が不活性化されており、前記内因性表面マーカーは、発現された場合に前記第１の抗原結合性ドメインに結合することができる、請求項１１１～１３８のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項140】

前記内因性表面マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である、請求項１３９に記載の細胞。

【請求項141】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の配列を含む核酸分子であって、前記ＣＡＲが、結合部分を含み、結合部位は、（ｉ）（ｉｉ）に関連する対象に投与されたときに前記操作された免疫細胞に対する前記対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、ならびに前記１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、
核酸分子。

【請求項142】

前記第１の抗原結合性ドメインが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１４１に記載の核酸分子。

【請求項143】

前記第２の抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲｌ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ノッチ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、またはＴＲＯＰ－２に結合する、請求項１４１または１４２に記載の核酸分子。

【請求項144】

さらに、エンハンサー部分をコードする第２の配列を含み、エンハンサー部分が、細胞において発現されたときに前記ＣＡＲの１つまたは複数の活性を高める、請求項１４１～１４３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項145】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４４に記載の核酸分子。

【請求項146】

さらに、誘導性細胞死部分をコードする第２の配列を含み、誘導性細胞死部分が、細胞において発現された場合、細胞死アクティベーターに接触すると前記細胞の死を生じさせる、請求項１４１～１４３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項147】

前記誘導性細胞死部分が、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される、請求項１４６に記載の核酸分子。

【請求項148】

さらに、前記第１の配列および前記第２の配列が隣接する第３の配列を含み、前記第３の配列は、切断可能なリンカーをコードする、請求項１４１～１４７のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項149】

前記切断可能なリンカーが、自己切断性ペプチドである、請求項１４８に記載の核酸分子。

【請求項150】

さらに、前記第１の配列および／または前記第２の配列の発現を調節する調節配列を含む、請求項１４１～１４９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項151】

請求項１４１～１５０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むキット。

【請求項152】

操作された細胞を生成する方法であって、（ａ）請求項１４１～１５０のいずれか一項に記載の核酸分子を細胞に送達する工程と；（ｂ）前記細胞において前記核酸分子を発現させ、それにより、前記操作された細胞を生成する工程とを含む方法。

【請求項153】

操作された免疫細胞であって、
前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分と；
ＣＤ７に特異的に結合する抗原結合性ドメインを含み、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と
を含み、
前記操作された免疫細胞において内因性ＣＤ７が不活性化されている、
操作された免疫細胞。

【請求項154】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、およびＴＧＦＲβ、その受容体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５３に記載の操作された免疫細胞。

【請求項155】

前記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されている、請求項１５３または１５４に記載の操作された免疫細胞。

【請求項156】

さらに、誘導性細胞死部分を含むポリペプチドであって、前記誘導性細胞死部分が、前記ポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると前記操作された免疫細胞の死を生じさせることができる、ポリペプチドを含む、請求項１５３～１５５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項157】

前記エンハンサー部分が、前記ポリペプチドの一部である、請求項１５６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項158】

前記エンハンサー部分が、前記ＣＡＲの一部ではない、請求項１５３～１５７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項159】

前記エンハンサー部分が、前記ＣＡＲの一部である、請求項１５３～１５７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項160】

Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１５３～１５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項161】

幹細胞に由来する、請求項１５３～１５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項162】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１６１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項163】

自己細胞または同種異系細胞である、請求項１５３～１５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項164】

ある状態を有する対象から得られる、請求項１５３～１５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項165】

健康なドナーから得られる、請求項１５３～１５９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項166】

請求項１５３～１６５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）前記エンハンサー部分および（ｉｉ）前記ＣＡＲをコードする１つまたは複数の核酸分子を免疫細胞に送達する工程と；（ｂ）前記免疫細胞において前記１つまたは複数の核酸分子を発現させ、それにより、前記操作された免疫細胞を生成する工程とを含む方法。

【請求項167】

単一の核酸分子が、（ｉ）前記エンハンサー部分および（ｉｉ）前記ＣＡＲをコードする、請求項１６６に記載の方法。

【請求項168】

前記単一の核酸分子が、（ｉ）前記エンハンサー部分および（ｉｉ）前記ＣＡＲが隣接する自己切断性ペプチドを含む、請求項１６７に記載の方法。

【請求項169】

前記単一の核酸分子が、（ｉ）前記エンハンサー部分および（ｉｉ）前記ＣＡＲが隣接するいかなる自己切断性ペプチドも含まない、請求項１６７に記載の方法。

【請求項170】

（ｉ）第１の核酸分子が、前記エンハンサー部分をコードし、ならびに（ｉｉ）第２の核酸分子が、前記ＣＡＲをコードする、請求項１６６に記載の方法。

【請求項171】

対象における状態を治療または診断する方法であって、請求項１５３～１６５のいずれか一項に記載の前記操作された免疫細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。

【請求項172】

前記操作された免疫細胞が、前記対象の自家免疫細胞に由来する、請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

前記操作された免疫細胞が、同種異系免疫細胞に由来する、請求項１７１に記載の方法。

【請求項174】

前記状態が、がんである、請求項１７１～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項175】

（ｉ）ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含む単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
を含む操作された免疫細胞であって、
内因性ＣＤ７をコードする遺伝子が、前記操作された免疫細胞において不活性化されている、
操作された免疫細胞。

【請求項176】

さらに、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分を含む、請求項１７５に記載の操作された免疫細胞。

【請求項177】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、およびＴＧＦＲβ、その受容体、ならびにその組合せからなる群から選択される、請求項１７６に記載の操作された免疫細胞。

【請求項178】

前記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されている、請求項１７５～１７７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項179】

さらに、誘導性細胞死部分を含むポリペプチドであって、前記誘導性細胞死部分が、前記ポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると前記操作された免疫細胞の死を生じさせることができる、ポリペプチドを含む、請求項１７５～１７８のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項180】

前記エンハンサー部分が、前記ポリペプチドの一部である、請求項１７９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項181】

Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項182】

幹細胞に由来する、請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項183】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１８２に記載の操作された免疫細胞。

【請求項184】

自己細胞または同種異系細胞である、請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項185】

ある状態を有する対象から得られる、請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項186】

健康なドナーから得られる、請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項187】

請求項１７５～１８６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を生成する方法であって、（ａ）前記単一のＣＡＲをコードする１つまたは複数の核酸分子を免疫細胞に送達する工程と；（ｂ）前記免疫細胞において前記１つまたは複数の核酸分子を発現させ、それにより、前記操作された免疫細胞を生成する工程とを含む方法。

【請求項188】

単一の核酸分子が、前記単一のＣＡＲをコードする、請求項１８７に記載の方法。

【請求項189】

対象における状態を治療または診断する方法であって、請求項１７５～１８６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。

【請求項190】

前記操作された免疫細胞が、前記対象の自家免疫細胞に由来する、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

前記操作された免疫細胞が、同種異系免疫細胞に由来する、請求項１８９に記載の方法。

【請求項192】

前記状態が、がんである、請求項１８９～１９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項193】

操作された免疫細胞の集団をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、同種異系細胞療法を送達する方法であって、前記集団の個々の操作された免疫細胞が、
（ａ）結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記結合部分が、免疫細胞抗原に結合することができる第１の抗原結合性ドメインと、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、第１の抗原結合性ドメインが、前記対象に投与されたときに前記操作された免疫細胞に対する対象の免疫反応を抑制するかまたは低減する、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（ｂ）前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分と
を含み、
前記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されており、ならびに、
前記操作された免疫細胞が、（ａ）における前記１つまたは複数のＣＡＲを含むが（ｂ）における前記エンハンサー部分を含まない別の操作された免疫細胞と比較して、（ｉ）前記操作された免疫細胞に対して異種である細胞の存在下において少なくとも約２０日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約１０倍の増殖の増強、または（ｉｉｉ）前記免疫細胞抗原または前記疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強を示す、
方法。

【請求項194】

追加の増殖剤を使用しない前記操作された免疫細胞の前記集団のみを投与する前記工程が、（ｉ）前記操作された免疫細胞に対して異種である細胞の存在下において少なくとも約２０日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約１０倍の増殖の増強、または、（ｉｉｉ）前記免疫細胞抗原または前記疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強をもたらす、請求項１９３に記載の方法。

【請求項195】

前記追加の増殖剤が、サイトカインである、請求項１９４に記載の方法。

【請求項196】

前記１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記第１の抗原結合性ドメインが、対象に投与されたときに前記操作された免疫細胞に対する前記対象の免疫反応を抑制または低減する、請求項１９３～１９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項197】

前記個々の操作された免疫細胞の内因性ＣＤ７が、不活性化されている、請求項１９３～１９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項198】

前記免疫体抗原がＣＤ７である、請求項１９３～１９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項199】

前記エンハンサー部分が、前記個々の操作された免疫細胞の前記１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている、請求項１９３～１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項200】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている、請求項１９３～１９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項201】

前記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路が、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である、請求項２００に記載の方法。

【請求項202】

前記エンハンサー部分が、自己オリゴマー化によって自己活性化性である、請求項１９３～２０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項203】

前記エンハンサー部分が、自己二量体化によって自己活性化性である、請求項１９３～２０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項204】

前記エンハンサー部分が、サイトカインまたはサイトカイン受容体である、請求項１９３～２０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項205】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９３～２０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項206】

前記内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子が不活性化され、それにより、前記内因性ＴＣＲが不活性化されている、請求項１９３～２０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項207】

前記サブユニットをコードする前記遺伝子が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである、請求項２０６に記載の方法。

【請求項208】

前記個々の操作された免疫細胞が、さらに、誘導性細胞死部分を含み、誘導性細胞死部分が、細胞死アクティベーターとの接触において前記操作された免疫細胞の自殺を生じさせる、請求項１９３～２０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項209】

前記誘導性細胞死部分が、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される、請求項２０８に記載の方法。

【請求項210】

前記誘導性細胞死部分が、ＥＧＦＲｔであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項２０９に記載の方法。

【請求項211】

前記誘導性細胞死部分が、ＨＳＶ ＴＫであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＧＣＶである、請求項２０９に記載の方法。

【請求項212】

前記誘導性細胞死部分が、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＡＰ１９０３である、請求項２０９に記載の方法。

【請求項213】

前記細胞死アクティベーターが、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項２０８に記載の方法。

【請求項214】

前記個々の操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現が、元のままである、請求項１９３～２１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項215】

前記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現が、元のままである、請求項２１４に記載の方法。

【請求項216】

前記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現が、元のままである、請求項２１４に記載の方法。

【請求項217】

前記個々の操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現が、上方調節されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項218】

前記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現が、上方調節されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項219】

前記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方の発現が阻害されている、請求項１９３～２１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項220】

内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方をコードする遺伝子が、不活性化されている、請求項１９３～２１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項221】

前記操作された免疫細胞のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇが、過剰発現されている、請求項１９３～２１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項222】

前記操作された免疫細胞のＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＳＬ、および／またはＰＤ－１が、過剰発現されている、請求項１９３～２１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項223】

前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１９３～２２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項224】

前記第１の抗原結合性ドメインまたは前記第２の抗原結合性ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１９３～２２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項225】

前記個々の操作された免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１９３～２２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項226】

前記個々の操作された免疫細胞が、幹細胞に由来する、請求項１９３～２２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項227】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２２６に記載の方法。

【請求項228】

前記個々の操作された免疫体が、同種異系細胞である、請求項１９３～２２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項229】

前記個々の操作された免疫細胞が、健康なドナーから得られる、請求項１９３～２２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項230】

（ａ）結合部位を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記結合部位が、免疫細胞抗原に結合することができる抗原結合性ドメインを含み、前記１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；
（ｂ）前記細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分と
を含む細胞であって、
前記細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されている、
細胞。

【請求項231】

前記エンハンサー部分が、前記細胞の１つまたは複数の活性を高める、請求項２３０に記載の細胞。

【請求項232】

前記エンハンサー部分が、前記細胞の前記１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている、請求項２３０に記載の細胞。

【請求項233】

前記エンハンサー部分が、前記細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている、請求項２３０に記載の細胞。

【請求項234】

前記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路が、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である、請求項２３０に記載の細胞。

【請求項235】

前記エンハンサー部分が、サイトカインまたはサイトカイン受容体である、請求項２３０に記載の細胞。

【請求項236】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３０に記載の細胞。

【請求項237】

細胞死アクティベーターと接触すると前記細胞の死を生じさせることができる誘導性細胞死部分をさらに含む、請求項２３０～２３６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項238】

前記誘導性細胞死部分が、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される、請求項２３７に記載の細胞。

【請求項239】

前記誘導性細胞死部分が、ＥＧＦＲｔであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項２３７に記載の細胞。

【請求項240】

前記誘導性細胞死部分が、ＨＳＶ ＴＫであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＧＣＶである、請求項２３７に記載の細胞。

【請求項241】

前記誘導性細胞死部分が、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＡＰ１９０３である、請求項２３７に記載の細胞。

【請求項242】

前記細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子が不活性化されており、前記内因性表面マーカーが、発現されたときに前記第１の抗原結合性ドメインに結合することができる、請求項２３０～２４１のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項243】

前記内因性表面マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である、請求項２４２に記載の細胞。

【請求項244】

リンパ性悪性疾患を治療する方法であって、操作された免疫細胞の集団をそれを必要とする患者に投与する工程を含み、前記集団の個々の操作された免疫細胞が、
（ａ）結合部位を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記結合部位が、免疫細胞抗原に結合することができる抗原結合性ドメインを含み、ならびに前記１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；
（ｂ）前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分と
を含み、
前記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されており、
（ｉ）末梢血の病的細胞の数または骨髄の病的細胞の数が、前記操作された免疫細胞に対する最後の投薬の後３週間以内に少なくとも５０％減少され、ならびに（ｉｉ）末梢血の自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数が、前記操作された免疫細胞の最後の投薬の後３週間以内に増加し始める、
方法。

【請求項245】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高める、請求項２４４に記載の方法。

【請求項246】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の前記１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている、請求項２４４に記載の方法。

【請求項247】

前記エンハンサー部分が、前記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている、請求項２４４に記載の方法。

【請求項248】

前記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路が、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である、請求項２４４に記載の方法。

【請求項249】

前記エンハンサー部分が、サイトカインまたはサイトカイン受容体である、請求項２４４に記載の方法

【請求項250】

前記エンハンサー部分が、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２４４に記載の方法。

【請求項251】

前記操作された免疫細胞が、細胞死アクティベーターと接触すると前記細胞の死を生じさせることができる誘導性細胞死部分をさらに含む、請求項２４４～２５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項252】

前記誘導性細胞死部分が、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される、請求項２５１に記載の方法。

【請求項253】

前記誘導性細胞死部分が、ＥＧＦＲｔであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項２５１に記載の方法。

【請求項254】

前記誘導性細胞死部分が、ＨＳＶ －ＴＫであり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＧＣＶである、請求項２５１に記載の方法。

【請求項255】

前記誘導性細胞死部分が、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに前記細胞死アクティベーターが、ＡＰ１９０３である、請求項２５１に記載の方法。

【請求項256】

前記細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子が不活性化されており、前記内因性表面マーカーが、発現されたときに前記第１の抗原結合性ドメインに結合することができる、請求項２４４～２５５のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項257】

前記内因性表面マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である、請求項２５６に記載の方法。

【請求項258】

末梢血における病的細胞の数または骨髄における病的細胞の数が少なくとも５０％減少する前に、末梢血における自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数が増加し始める、請求項２４４に記載の方法。

【請求項259】

末梢血における病的細胞の数または骨髄における病的細胞の数が少なくとも５０％減少した後に、末梢血における自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数が増加し始める、請求項２４４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
[0001]本願は、２０１８年１１月０１日に出願された中国特許出願公開第２０１８１１２９７１７４．３号；２０１８年１２月１４日に出願された中国特許出願公開第２０１８１１５３５３３８．１号；２０１８年１２月１８日に出願された中国特許出願公開第２０１８１１５４９６５１．０号；２０１９年６月０６日に出願された中国特許出願公開第２０１９１０４９２８８２．０号；および２０１９年８月２０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０１６５１号に対する優先権を主張するものであり、なお、これらの特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。

【背景技術】

【0002】

[0002]キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるための遺伝子修飾による腫瘍特異的Ｔリンパ球の生成は、強力な抗腫瘍効果を生じる形態の合成生物学におけるとしての魅力を獲得している。当該特異性は、抗体断片によって付与されるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＨＣ拘束性ではなく、したがって、ＭＨＣマッチングを必要とするＴ細胞受容体に基づくアプローチと比べてより実用的である。

【0003】

[0003]がんの治療において得られた早期のＣＡＲ－Ｔ細胞臨床データは、有望な結果を示していたが、患者に対するリスクはより高く、ならびに一部の患者のＴ細胞は、ＴＣＲまたはＣＡＲリダイレクション後でさえ、有効である。治療も、十分に効果的ではなく、このため、同種異系ドナーＴ細胞の改変が促進されている。しかしながら、注入された同種異系Ｔ細胞上の内因性αβＴ細胞受容体は、レシピエントにおいて一次および二次組織適合抗原を認識することができ、結果として、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を生じる。その結果、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞注入を使用するほとんどの現在の臨床試験は、正常な組織のＴＣＲ媒介性有害認識と、その後の養子細胞移入を防ぐために、免疫寛容を頼りにしている。このアプローチは、早くに臨床的成功を達成したが、患者特異的Ｔ細胞産物を製造する時間および費用によって制限される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

[0004]本明細書において、同種異系細胞療法のために免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を遺伝子修飾するための組成物および方法に対する必要性が認識される。さらに、本明細書において、患者特異的Ｔ細胞産物を作製する時間および費用を避けつつ、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を修飾する方法の必要性も認識される。

【課題を解決するための手段】

【0005】

[0005]ある態様において、本開示は、操作された免疫細胞であって、（ｉ）当該操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分と（ｉｉ）誘導性細胞死部分とを含むキメラポリペプチドであって、当該誘導性細胞死部分が、キメラポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると当該操作された免疫細胞の死を生じさせることができ、当該エンハンサー部分が、誘導性細胞死部分に連結されている、キメラポリペプチドと、結合部位を含む１つまたは複数のキメラポリペプチド受容体（ＣＰＲ）であって、当該結合部位が、（ｉ）対象に投与されたときに当該操作された免疫細胞に対する当該対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、当該１つまたは複数のＣＰＲの個々のＣＰＲが、（ｉ）第１の抗原結合性ドメイン、（ｉｉ）第２の抗原結合性ドメイン、または（ｉｉｉ）第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインの両方を含み、当該１つまたは複数のＣＰＲの各ＣＰＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラポリペプチド受容体（ＣＰＲ）とを含む、操作された免疫細胞を提供する。

【0006】

[0006]いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数のＣＰＲは、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原に結合する。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子は、不活性化されており（例えば、発現抑制されているか、またはノックアウトされており）、当該内因性表面マーカーは、発現された場合に第１の抗原結合性ドメインに結合することができる。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲの機能は、阻害剤によって阻害されている。いくつかの実施形態において、上記内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子は、不活性化されており、それにより、上記内因性ＴＣＲは不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記サブユニットをコードする上記遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである。いくつかの実施形態において、上記キメラポリペプチドは、上記エンハンサー部分および上記誘導性細胞死部分が隣接する任意の自己切断性ペプチドを含まない。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、自己オリゴマー化によって自己活性化性である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、自己二量体化によって自己活性化性である。いくつかの実施形態において、上記キメラポリペプチドは、分泌タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記キメラポリペプチドは、細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記キメラポリペプチドは、膜貫通タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分または上記誘導性細胞死部分は、膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれる。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分または上記誘導性細胞死部分は膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）上記エンハンサー部分は、膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれ、（ｉｉ）上記誘導性細胞死部分は、膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）上記エンハンサー部分は、膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれ、（ｉｉ）上記誘導性細胞死部分は、膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれる。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、前記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ｔｒａｎｓ活性化因子またはｃｉｓ活性化因子として機能する。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＥＧＦＲｔであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＧＣＶである。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、上記細胞死アクティベーターは、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数のＣＰＲの個々のＣＰＲは、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインの両方を含む。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、リンカーによって連結されている。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、自己切断性ペプチドを含まない。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインまたは上記第２の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２；（ｉｉ）ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２；（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１；（ｉｖ）ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１；（ｖ）ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２；（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２；（ｖｉｉ）ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１；または（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１、として配置され、ＶＨ１は、第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１；（ｉｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１；（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２；（ｉｖ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２；（ｖ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１；（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１；（ｖｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２；または（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２、として配置され、ＶＨ１は、第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原および疾患関連抗原に結合する。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数のＣＰＲの個々のＣＰＲは、第１の抗原結合性ドメインのみを含み、ならびに当該１つまたは複数のＣＰＲの別の個々のＣＰＲは、第２の抗原結合性ドメインのみを含む。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞抗原は、免疫細胞の表面タンパク質または分泌タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、生来のリンパ球、マクロファージ、または顆粒球である。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は、末梢血、臍帯血から得られるか、あるいは幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態において、上記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲｌ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ノッチ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、またはＴＲＯＰ－２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、およびＣＤ１３７からなる群から選択される免疫細胞抗原に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ３に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ７に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１３７に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現は、上方調節されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、上方調節されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方の発現は、阻害されている。いくつかの実施形態において、内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方をコードする遺伝子は、不活性化されてい

る。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇは、過剰発現されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞のＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＳＬ、および／またはＰＤ－１は、過剰発現されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、自己細胞または同種異系細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、ある状態を有する対象から得られる。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、健康なドナーから得られる。

【0007】

[0007]別の態様において、本開示は、（ａ）結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、当該結合部分が、免疫細胞抗原に結合することができる第１の抗原結合性ドメインと、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、当該１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分とを含む操作された免疫細胞であって、当該操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されており、ならびに（ａ）における１つまたは複数のＣＡＲを含むが（ｂ）における前記エンハンサー部分を含まない別の操作された免疫細胞と比較して、（ｉ）当該操作された免疫細胞に対して異種である細胞の存在下において少なくとも約２０日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約１０倍の増殖の増強、または、（ｉｉｉ）当該免疫細胞抗原または前記疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強を示す、操作された免疫細胞を提供する。

【0008】

[0008]いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの２つ以上を示すことによって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）は、任意の外因性エンハンサー部分の非存在下において測定される。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＳ１、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記免疫体抗原はＣＤ７である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記個々の操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、自己オリゴマー化によって自己活性化性である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、自己二量体化によって自己活性化性である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子は不活性化されており、それにより、前記内因性ＴＣＲは不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記サブユニットをコードする遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、さらに、誘導性細胞死部分を含み、誘導性細胞死部分は、細胞死アクティベーターとの接触において当該操作された免疫細胞の自殺を生じさせる。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＥＧＦＲｔであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＧＣＶである。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、上記細胞死アクティベーターは、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現は、上方調節されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、上方調節されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方の発現は、阻害されている。いくつかの実施形態において、内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方をコードする遺伝子は、不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇは、過剰発現されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞のＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＳＬ、および／またはＰＤ－１は、過剰発現されている。いくつかの実施形態において、上記疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインまたは上記第２の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子は、不活性化されており、上記内因性表面マーカーは、発現された場合に前記第１の抗原結合性ドメインに結合することができる。いくつかの実施形態において、上記内因性表面マーカーは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、自己細胞または同種異系細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、ある状態を有する対象から得られる。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、健康なドナーから得られる。

【0009】

[0009]別の態様において、本開示は、疾患を治療するための医薬組成物であって、本明細書において説明される操作された免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。別の態様において、本開示は、対象の疾患を治療または診断する方法であって、対象に上記組成物を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記医薬組成物中の上記操作された免疫細胞は、同種異系免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記同種異系免疫細胞に由来する上記操作された免疫細胞は、対象において移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。いくつかの実施形態において、上記医薬組成物中の上記操作された免疫細胞は、自家免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記医薬組成物中の上記操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲは、機能的に不活性である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、機能的に活性なＴＣＲを有する別の免疫細胞と比較して、対象においてＧｖＨＤを減少させる。いくつかの実施形態において、上記疾患は、がんである。いくつかの実施形態において、上記がんは、リンパ腫または白血病である。

【0010】

[0010]別の態様において、本開示は、機能的に不活性なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、当該１つまたは複数のＣＡＲの個々の各ＣＡＲが、結合部分を含み、結合部位が、（ｉ）対象に投与されたときに当該操作された免疫細胞に対する当該対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合する第２の抗原結合性ドメインとを含み、ならびに当該１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを含む細胞を提供する。

【0011】

[0011]いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、リンカーによって連結されている。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、自己切断性ペプチドを含まない。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２；（ｉｉ）ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２；（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１；（ｉｖ）ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１；（ｖ）ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２；（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２；（ｖｉｉ）ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１；または（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１として配置され、ＶＨ１は、第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１；（ｉｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１；（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２；（ｉｖ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２；（ｖ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１；（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１；（ｖｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２；または（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２として配置され、ＶＨ１は、第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態において、上記細胞の内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子は、不活性化されており、結果として、上記機能的に不活性なＴＣＲを生成する。いくつかの実施形態において、上記サブユニットをコードする遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原に結合する。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞抗原は、免疫細胞の表面タンパク質または分泌タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、または顆粒球である。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である。いくつかの実施形態において、上記疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態において、上記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲｌ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ノッチ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、またはＴＲＯＰ－２である。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される免疫細胞抗原に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ３に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ７に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１３７に結合し、ならびに上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、さらに、エンハンサー部分を含み、エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高める。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、さらに、細胞死アクティベーターに接触すると当該細胞の死を生じさせることができる誘導性細胞死部分を含む。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＥＧＦＲｔであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、抗体またはＥＧＦＲｔに結合するその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＧＣＶである。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＡＰ１９０３である。

【0012】

[0012]別の態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の配列を含む核酸分子であって、当該ＣＡＲが、結合部分を含み、結合部位は、（ｉ）対象に投与されたときに当該操作された免疫細胞に対する当該対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）（ｉ）が連結されている、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、ならびに当該１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。

【0013】

[0013]いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される抗原に結合する。いくつかの実施形態において、上記第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲｌ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ノッチ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、またはＴＲＯＰ－２に結合する。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、さらに、エンハンサー部分をコードする第２の配列を含み、エンハンサー部分は、細胞において発現されたときに上記ＣＡＲの１つまたは複数の活性を高める。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、さらに、誘導性細胞死部分をコードする第２の配列を含み、誘導性細胞死部分は、細胞において発現された場合、細胞死アクティベーターに接触すると当該細胞の死を生じさせる。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、さらに、第１の配列および第２の配列が隣接する第３配列を含み、当該第３の配列は、切断可能なリンカーをコードする。いくつかの実施形態において、上記切断可能なリンカーは、自己切断性ペプチドである。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、さらに、上記第１の配列および／または上記第２の配列の発現を調節する調節配列を含む。

【0014】

[0014]別の態様において、本開示は、本明細書において説明される核酸分子を含むキットを提供する。
[0015]別の態様において、本開示は、操作された細胞を生成する方法であって、（ａ）本明細書において説明される核酸分子を細胞内に送達する工程と；（ｂ）当該細胞において当該核酸分子を発現させ、それにより、操作された細胞を生成する工程とを含む方法を提供する。

【0015】

[0016]別の態様において、本開示は、操作された免疫細胞であって、当該操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分と；ＣＤ７に特異的に結合する抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを含み、当該ＣＡＲがさらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、当該操作された免疫細胞において内因性ＣＤ７が不活性化されている、操作された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、およびＴＧＦＲβ、その受容体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、さらに、誘導性細胞死部分を含むポリペプチドであって、当該誘導性細胞死部分が、当該ポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると当該操作された免疫細胞の死を生じさせることができる、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記ポリペプチドの一部である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記ＣＡＲの一部ではない。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記ＣＡＲの一部である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、自己細胞または同種異系細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、ある状態を有する対象から得られる。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、健康なドナーから得られる。

【0016】

[0017]別の態様において、本開示は、本明細書において説明される操作された免疫細胞を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）上記エンハンサー部分と（ｉｉ）上記ＣＡＲとをコードする１つまたは複数の核酸分子を免疫細胞内へ送達する工程と；（ｂ）当該免疫細胞において１つまたは複数の核酸分子を発現させ、それにより、当該操作された免疫細胞を生成する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、単一の核酸分子が、（ｉ）上記エンハンサー部分および（ｉｉ）上記ＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態において、上記単一の核酸分子は、（ｉ）上記エンハンサー部分（ｉｉ）上記ＣＡＲが隣接する自己切断性ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記単一の核酸分子は、（ｉ）上記エンハンサー部分（ｉｉ）上記ＣＡＲが隣接するいかなる自己切断性ペプチドも含まない。いくつかの実施形態において、（ｉ）第１の核酸分子は、上記エンハンサー部分をコードし、ならびに（ｉｉ）第２の核酸分子は、上記ＣＡＲをコードする。

【0017】

[0018]別の態様において、本開示は、対象の状態を治療または診断する方法であって、本明細書において説明される操作された免疫細胞を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、対象の自家免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、同種異系免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記状態は、がん（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞悪性腫瘍）である。

【0018】

[0019]別の態様において、本開示は、単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む操作された免疫細胞であって、当該単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（ｉ）ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、内因性ＣＤ７をコードする遺伝子が、当該操作された免疫細胞において不活性化されている、操作された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、さらに、当該操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分を含む。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、およびＴＧＦＲβ、その受容体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、さらに、誘導性細胞死部分を含むポリペプチドであって、当該誘導性細胞死部分が、当該ポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると当該操作された免疫細胞の死を生じさせることができる、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記ポリペプチドの一部である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、自己細胞または同種異系細胞である。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、ある状態を有する対象から得られる。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、健康なドナーから得られる。

【0019】

[0020]別の態様において、本開示は、上記操作された免疫細胞を生成する方法であって、（ａ）上記単一のＣＡＲをコードする１つまたは複数の核酸分子を免疫細胞に送達する工程と；（ｂ）当該免疫細胞において１つまたは複数の核酸分子を発現させ、それにより、当該操作された免疫細胞を生成する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、単一の核酸分子が、上記単一のＣＡＲをコードする。

【0020】

[0021]別の態様において、本開示は、対象の状態を治療または診断する方法であって、上記操作された免疫細胞を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、対象の自家免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞は、同種異系免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記状態は、がん（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞悪性腫瘍）である。

【0021】

[0022]別の態様において、本開示は、操作された免疫細胞の集団をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、同種異系細胞療法を送達する方法であって、当該集団の個々の操作された免疫細胞が、（ａ）結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、当該結合部分が、免疫細胞抗原に結合することができる第１の抗原結合性ドメインと、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、第１の抗原結合性ドメインが、対象に投与されたときに当該操作された免疫細胞に対する当該対象の免疫反応を抑制または低減する、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；（ｂ）当該操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分とを含み、当該操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、不活性化されており、ならびに当該操作された免疫細胞が、（ｉ）当該操作された免疫細胞に対して異種である細胞の存在下において少なくとも約２０日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約１０倍の増殖の増強、または（ｉｉｉ）当該免疫細胞抗原または前記疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強を示す、方法を提供する。

【0022】

[0023]いくつかの実施形態において、追加の増殖剤を使用しない上記操作された免疫細胞の集団のみを投与する上記工程は、（ｉ）当該操作された免疫細胞に対して異種である免疫細胞の存在下において少なくとも約２０日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約１０倍の増殖の増強、または（ｉｉｉ）当該免疫細胞抗原または前記疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強を生み出す。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、上記第１の抗原結合性ドメインは、対象に投与されたときに当該操作された免疫細胞に対する当該対象の免疫反応を抑制または低減する。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞の内因性ＣＤ７は、不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記免疫体抗原はＣＤ７である。

【0023】

[0024]いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記個々の操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、自己オリゴマー化によって自己活性化性である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、自己二量体化によって自己活性化性である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子は、不活性化されており、それにより、上記内因性ＴＣＲが不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記サブユニットをコードする遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞は、さらに、誘導性細胞死部分を含み、誘導性細胞死部分は、細胞死アクティベーターとの接触において当該操作された免疫細胞の自殺を生じさせる。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＥＧＦＲｔであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、抗体またはＥＧＦＲｔに結合するその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＧＣＶである。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、上記細胞死アクティベーターは、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、元のままである。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現は、上方調節されている。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、上方調節されている。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方の発現は、阻害されている。いくつかの実施形態において、内因性ＨＬＡ－Ｉ、内因性ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方をコードする遺伝子は、不活性化されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞のＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇは、過剰発現されている。いくつかの実施形態において、上記操作された免疫細胞のＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＳＬ、および／またはＰＤ－１は、過剰発現されている。

【0024】

[0025]いくつかの実施形態において、上記疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態において、上記第１の抗原結合性ドメインまたは上記第２の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞は、幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫体は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態において、上記個々の操作された免疫細胞は、健康なドナーから得られる。

【0025】

[0026]ある態様において、本開示は、（ａ）結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、当該結合部位が、免疫細胞抗原に結合することができる抗原結合性ドメインを含み、当該１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；（ｂ）細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分とを含む細胞であって、当該細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、不活性化されている、細胞を提供する。

【0026】

[0027]いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記細胞の１つまたは複数の活性を高める。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、当該方法は、細胞死アクティベーターと接触すると上記細胞の死を生じさせることができる上記誘導性細胞死部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＥＧＦＲｔであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、抗体またはＥＧＦＲｔに結合するその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＧＣＶである。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、上記細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子は、不活性化されており、当該内因性表面マーカーは、発現された場合に第１の抗原結合性ドメインに結合することができる。いくつかの実施形態において、上記内因性表面マーカーは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である。

【0027】

[0028]ある態様において、本開示は、リンパ性悪性疾患を治療する方法であって、操作された免疫細胞の集団をそれを必要とする患者に投与する工程を含み、当該集団の個々の操作された免疫細胞が、（ａ）結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、当該結合部位が、免疫細胞抗原に結合することができる抗原結合性ドメインを含み、ならびに当該１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；（ｂ）操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分とを含み、当該操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、不活性化されており、（ｉ）末梢血の病的細胞の数または骨髄の病的細胞の数が、当該操作された免疫細胞に対する最後の投薬の後３週間以内に少なくとも５０％減少され、ならびに（ｉｉ）末梢血の自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数が、当該操作された免疫細胞の最後の投薬の後３週間以内に増加し始める、方法を提供する。

【0028】

[0029]いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高める。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成されている。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、上記操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、上記エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記操作された免疫細胞が、さらに、誘導性細胞死部分が細胞死アクティベーターに接触すると当該細胞の死を生じさせることができる当該誘導性細胞死部分を含む。

【0029】

[0030]いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＥＧＦＲｔであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、抗体またはＥＧＦＲｔに結合するその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＧＣＶである。いくつかの実施形態において、上記誘導性細胞死部分は、ｉＣａｓｐ９であり、ならびに上記細胞死アクティベーターは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、上記細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子は、不活性化されており、当該内因性表面マーカーは、発現された場合に第１の抗原結合性ドメインに結合することができる。いくつかの実施形態において、上記内因性表面マーカーは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７である。いくつかの実施形態において、末梢血における病的細胞の数または骨髄における病的細胞の数が少なくとも５０％減少する前に、末梢血における自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数は、増加し始める。いくつかの実施形態において、末梢血における病的細胞の数または骨髄における病的細胞の数が少なくとも５０％減少した後に、末梢血における自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数は、増加し始める。

【0030】

[0031]本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的実施形態のみが示され説明される以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなるであろう。認識されるであろうように、本開示は、他の実施形態および異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することのなく、様々な明白な点において変更が可能である。したがって、図および説明は、あくまで説明として見なされるべきであり、限定として見なされるものではない。

【0031】

[0032]参照による組み入れ
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
参照により組み入れられた刊行物および特許もしくは特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書は、そのようなあらゆる相反する材料に取って代わりおよび／または優先することが意図される。

【0032】

[0033]本発明の新規な特徴は、添付の請求項に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、およびその添付図面（本明細書では「図（Figure）」および「図（FIG.）」もまた）を参照することによって得られる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】[0034]ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲの例示的な構造を示す図である。

【図2】[0035]ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９普遍的ＣＡＲ－Ｔの一例の調製プロセスを示す図である。

【図3】[0036]パラレルＣＡＲ（ＦＭＣ６３－ＯＫＴ３）およびｔＥＧＦＲスイッチの発現を示す図である。

【図4】[0037]パラレルＣＡＲおよびループＣＡＲの発現を示す図である。

【図5A】[0038]図５Ａは、ＵＣＨＴ１およびＯＫＴ３を比較する実験データを示す図である。

【図5B】図５Ｂは、ＵＣＨＴ１およびＯＫＴ３を比較する実験データを示す図である。

【図5C】図５Ｃは、ＵＣＨＴ１およびＯＫＴ３を比較する実験データを示す図である。

【図6A】[0039]図６Ａは、パラレルＵＣＨＴ１の抗がん機能を示す図である。

【図6B】図６Ｂは、パラレルＵＣＨＴ１の抗がん機能を示す図である。

【図6C】図６Ｃは、パラレルＵＣＨＴ１の抗がん機能を示す図である。

【図7A】[0040]図７Ａは、パラレルＣＡＲ対ループＣＡＲの抗がん機能を比較する実験データを示す図である。

【図7B】図７Ｂは、パラレルＣＡＲ対ループＣＡＲの抗がん機能を比較する実験データを示す図である。

【図8A】[0041]図８Ａは、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が皮下腫瘍モデルにおいて増殖欠損を示すことを示す図である。

【図8B】図８Ｂは、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が皮下腫瘍モデルにおいて増殖欠損を示すことを示す図である。５ｅ５のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を皮下注射によりＮＯＧマウスに移植した。１ｅ６ ＷＴ、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ移植マウスに注入（ＩＶ）した。腫瘍負荷は、実際の腫瘍サイズのキャリパー測定によって評価された。いずれもＲａｊｉベースの腫瘍を有するモデルであるが、皮下モデルは固形腫瘍を生成し、静脈モデルよりも腫瘍を制御するためのＣＡＲ－Ｔ細胞増殖に対する要求がはるかに高い。ＴＣＲ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して増殖欠損を示し、それらの腫瘍制御効果と一致した。

【図9A】[0042]図９Ａは、がん細胞による複数回の刺激後に異なるエンハンサーを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および殺傷有効性を示す図である。

【図9B】図９Ｂは、がん細胞による複数回の刺激後に異なるエンハンサーを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および殺傷有効性を示す図である。

【図9C】図９Ｃは、がん細胞による複数回の刺激後に異なるエンハンサーを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および殺傷有効性を示す図である。

【図10A】[0043]図１０Ａは、がん細胞による複数回の刺激後の異なるエンハンサーを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示す図である。

【図10B】図１０Ｂは、がん細胞による複数回の刺激後の異なるエンハンサーを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示す図である。

【図11】[0044]ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるエンハンサーのｉｎ ｖｉｖｏ比較を示す図である。５ｅ５ Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を静脈内（ＩＶ）注射によりＮＯＧマウスに移植した。ＷＴ、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をエンハンサーの有無にかかわらず、Ｒａｊｉ移植マウスに注入（ＩＶ）した。腫瘍負荷は生物発光強度（ＢＬＩ）により評価した。

【図12】[0045]ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるエンハンサーのｉｎ ｖｉｖｏ比較を示す図である。

【図13】[0046]ＣＤ７ ｍＲＮＡの組織分布の例を示す図である。

【図14】[0047]ＣＤ２ ｍＲＮＡの組織分布の例を示す図である。

【図15】[0048]ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔの一例の調製を示す図である。

【図16】[0049]ＣＤ７ ｇＲＮＡスクリーニングの実験データを示す図である。

【図17】[0050]ＣＡＲ７、ＣＡＲ７－ｍｂ１５およびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの例示的な構造を示す図である。

【図18】[0051]ＣＡＲ７、ＣＡＲ７－ｍｂ１５、ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒおよび対照ＣＡＲ１９のＣＡＲ発現、ＩＬ１５ＲａおよびＣＤ３４の発現、ならびにＣＤ７およびＣＤ３のノックアウト効率の実験データを示す図である。

【図19】[0052]ＵＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性化の実験データを示す図である。ＩＬ－２の添加は、ＣＡＲ７ Ｔ細胞のＳＴＡＴ５を活性化し、ＩＬ－２の除去は、ｐＳＴＡＴ５レベルを有意に減少させた。ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒにおいて、ｐＳＴＡＴ５のレベルは、外因性ＩＬ－２の有無にかかわらず、高レベルであった。

【図20】[0053]ＣＣＲＦ－ＣＥＭ－ｌｕｃ細胞系におけるＵＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷作用の実験データを示す図である。

【図21】[0054]同種異系反応性Ｔ（同種異系Ｔ）細胞におけるＵＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷作用の実験データを示す図である。

【図22】[0055]２４時間におけるＮＫ９２細胞系におけるＵＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷作用を示す図である。

【図23A】[0056]図２３Ａは、エンハンサーを発現するＵＣＡＲ－Ｔ細胞がより長く生存した、いくつかのＵＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の実験データを示す図である。

【図23B】図２３Ｂは、ＩＬ－２を除去した後のＣＣＲＦ－ＣＥＭ腫瘍細胞におけるそれらの殺傷作用の比較の実験データを示す図である。

【図24A】[0057]図２４Ａは、いくつかのＵＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の実験データを示す図である。

【図24B】図２４Ｂは、ＩＬ－２を除去し、ＣＣＲＦ－ＣＥＭと共培養した後のＣＣＲＦ－ＣＥＭ腫瘍細胞における殺傷作用を複数回にわたって比較した実験データを示す図であり、エンハンサーを発現するＵＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍抗原の刺激下でより強い増殖を示した。

【図25】[0058]ＣＣＲＦ－ＣＥＭ腫瘍を担持する免疫不全マウスにおけるエンハンサーを発現するＵＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖の実験データを示す図である。

【図26】[0059]マウスにおけるＣＣＲＦ－ＣＥＭ腫瘍に対するエンハンサーを発現するＵＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷作用の実験データを示す図である。

【図27】[0060]ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるエンハンサーのｉｎ ｖｉｖｏ比較を示す図である。

【図28A】[0061]図２８Ａは、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるエンハンサーのｉｎ ｖｉｖｏでの比較を示す図である。

【図28B】図２８Ｂは、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるエンハンサーのｉｎ ｖｉｖｏでの比較を示す図である。

【図29】[0062]ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７ＲおよびＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ７の例示的な構造を示す図である。

【図30】[0063]Ｅ３：構成的活性ＩＬ７Ｒαベースのエンハンサー＋安全スイッチの設計を示す図である。

【図31】[0064]ＣＡＲおよびエンハンサーの発現を示す図である。

【図32】[0065]図３２Ａは、ＣＡＲ－Ｔ機能の試験を示す図である。図３２Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ機能の試験を示す図である。

【図33A】[0066]図３３Ａは、エンハンサー機能の試験を示す図である。

【図33B】図３３Ｂは、エンハンサー機能の試験を示す図である。

【図34A】[0067]図３４Ａは、エンハンサー機能の試験を示す図である。

【図34B】図３４Ｂは、エンハンサー機能の試験を示す図である。

【図34C】図３４Ｃは、エンハンサー機能の試験を示す図である。

【図35A】[0068]図３５Ａは、ＡＤＣＣによる安全スイッチの試験を示す図である。

【図35B】図３５Ｂは、ＡＤＣＣによる安全スイッチの試験を示す図である。

【図35C】図３５Ｃは、ＡＤＣＣによる安全スイッチの試験を示す図である。

【図36A】[0069]図３６Ａは、反復刺激後のＡＤＣＣによる安全スイッチの試験を示す図である。

【図36B】図３６Ｂは、反復刺激後のＡＤＣＣによる安全スイッチの試験を示す図である。

【図37】[0070]ＣＤ７－ＣＤ１９二重ＣＡＲの設計の例を示す図である。Ｌ７１９は、ループ－ＣＡＲ、ＬＨＬＨ＝ＶＬＶＨ－ＶＬＶＨ、ＨＬＨＬ＝ＶＨＶＬ－ＶＨＶＬを表し；Ｔ１９７およびＴ７１９は、タンデム－ＣＡＲであり、ＥＡＡＡＫは、２つのＬＨの間のリンカーである。ＳＰ：シグナルペプチド、Ｈ：ヒンジ、ＴＭ：膜貫通ドメイン。

【図38A】[0071]図３８Ａは、異なる抗体のｓｃＦｖおよびＣＤ７／ＣＤ３（ＴＲＡＣ）のノックアウト効率を用いて構築されたＣＤ７単一ＣＡＲの発現を示す図である。

【図38B】図３８Ｂは、ＣＤ７＋細胞におけるＣＡＲの殺傷作用の実験データを示す図である。ＬＨはＶＬＶＨを表し、ＨＬはＶＨＶＬを表す。

【図39】[0072]ループ－ＣＡＲおよびタンデム－ＣＡＲの発現の実験データを示す図である。ＣＡＲ７およびＣＡＲ１９は単一のＣＡＲ対照であり、模擬Ｔは陰性対照である。

【図40】[0073]ＣＤ７およびＣＤ３（ＴＲＡＣ）のノックアウト効率、ならびにＣＡＲによるＣＤ７＋細胞の除去の実験データを示す図である。

【図41】[0074]ループ－ＣＡＲおよびタンデムＣＡＲによるＨｅＬａ－ＣＤ１９＋細胞の除去の実験データを示す図である。

【図42A】[0075]ＣＤ７単一ＣＡＲおよびＣＤ７－ＣＤ１９二重ＣＡＲによるＮＫの完全な殺傷の実験データを示す。図４２Ａは、異なるＣＡＲによるｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖末梢血ＮＫ除去効率の実験データを示す。

【図42B】図４２Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖されたＮＫの実験データが約８０％のＣＤ７＋細胞を含み；Ｌ７１９－ＬＨＬＨおよびＴ１９７－ＬＨＬＨによる殺傷後、残りのＮＫ細胞はＣＤ７－細胞であることを示す。

【図43】[0076]ＣＤ７単一ＣＡＲおよびＣＤ７－ＣＤ１９二重ＣＡＲによる同種異系Ｔ細胞の迅速な殺傷の実験データを示す図である。

【図44】[0077]二重ＣＡＲのｉｎ ｖｉｖｏ機能の実験データを示す図である。ループＣＡＲおよびタンデムＣＡＲはいずれも、Ｒａｊｉ腫瘍細胞において強力な殺傷作用を示した。

【図45A】[0078]２つのタンデムＣＡＲを比較する実験データを示す図である。図４５Ａは、スクリーニングの標準対照としてＬ７１９：Ｌ７１９－ＬＨＬＨ、および他の対照としてＣＡＲ７、ＣＡＲ１９および模擬Ｔを用いた実験データを示す図である。

【図45B】図４５Ｂは、ＣＤ７ノックアウト後の異なるＣＡＲによる残りのＣＤ７＋細胞の除去の実験データを示す図である。

【図46】[0079]Ｌ７１９と同様に、ＨｅＬａ－ＣＤ１９＋細胞における同様の除去効果を示す２つのタンデムＣＡＲの実験データを示す図である。

【図47A】[0080]図４７Ａは、Ｌ７１９と同様に、同種異系Ｔ細胞における同様の除去効果を示す２つのタンデムＣＡＲの実験データを示す図である。

【図47B】図４７Ｂは、Ｌ７１９と同様に、ＮＫ細胞における同様の除去効果を示す２つのタンデムＣＡＲの実験データを示す図である。

【図48】[0081]図４８は、二重ＣＡＲのｉｎ ｖｉｖｏ機能的スクリーニングの実験データを示す図である。ループおよびタンデム二重ＣＡＲはいずれも、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＣＲＦ－ＣＥＭ腫瘍細胞において強力な殺傷作用を示した。

【図49】[0082]図４９は、ｒａｐａＣ、Ｌ７１９－Ｃ７Ｒ、およびＬ７１９－Ｅ３の構造を示す図である。

【図50A】[0083]図５０Ａは、二重ＣＡＲの機能におけるサイトカインシグナル伝達の効果の実験データを示す。Ｌ７１９およびＬ７１９－Ｃ７Ｒ二重ＣＡＲの発現の実験データを示す図である。

【図50B】図５０Ｂは、ＨｅＬａ－ＣＤ７＋細胞における二重ＣＡＲの殺傷作用の実験データを示す図である。

【図50C】図５０Ｃは、ＨｅＬａ－ＣＤ１９＋細胞における二重ＣＡＲの殺傷作用の実験データを示す図である。

【図50D】図５０Ｄは、Ｌ７１８二重ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるエンハンサーおよびＣＤ７の発現の実験データを示す図である。

【図50E】図５０Ｅは、Ｌ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性の実験データを示す図である。

【図50F】図５０Ｆは、Ｌ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性の実験データを示す図である。

【図50G】図５０Ｇは、Ｌ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５およびエンハンサーの発現の実験データを示す図である。

【図50H】図５０Ｈは、Ｌ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖の実験データを示す図である。

【図50I】図５０Ｉは、ＨｅＬａ－ＣＤ１９＋細胞における二重ＣＡＲの殺傷作用の実験データを示す図である。

【図50J】図５０Ｊは、ＨｅＬａ－ＣＤ７＋細胞における二重ＣＡＲの殺傷作用の実験データを示す図である。

【図51】[0084]ＣＤ１３７ ｍＲＮＡの例示的な組織分布を示す図である。

【図52】[0085]ＣＤ１３７－ＣＤ１９ ＡＡＣ／ＣＡＲの例示的な構造図を示す図である。

【図53】[0086]ＣＤ１３７－ＣＤ１９普遍的ＣＡＲ－Ｔの調製プロセスの例を示す図である。

【図54A】[0087]ＴＣＲノックアウト自家ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖における欠陥を示す実験データを示す。図５４Ａは、注入前および注入後のＴＣＲ＋細胞の画分を示すＦＡＣＳデータを示す図である。

【図54B】図５４Ｂは、図５４Ａ中のＦＡＣＳデータの棒グラフを示す図である。

【図54C】図５４Ｃは、ＴＣＲを伴うまたは伴わないＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖差の比較を示す図である。

【図55A】[0088]ＴＣＲノックアウト（ＫＯ）ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＵＣＡＲＴ７細胞またはＣＡＲ７細胞とも呼ばれるＣＤ７を標的とするＣＡＲを有するＣＡＲ－Ｔ細胞）の増殖および持続におけるＣ７Ｒの効果を示す実験データを示す。図５５Ａは、エンハンサーＣ７Ｒを伴うまたは伴わないＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ増殖データを示す図である。

【図55B】図５５Ｂは、エンハンサーを伴うまたは伴わないＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖データを示す図である。

【図56A】[0089]エンハンサーＣ７ＲまたはＥ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化、細胞持続性および細胞毒性を示す実験データを示す。図５６Ａは、エンハンサーを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の画分の実験データを示す図である。

【図56B】図５６Ｂは、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。

【図56C】図５６Ｃは、ＩＬ２の非存在下におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖データを示す図である。

【図56D】図５６Ｄは、エンハンサーを発現し、リン酸化ＳＴＡＴ５を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の画分の実験データを示す図である。

【図56E】図５６Ｅは、図５６Ｄのリン酸化ＳＴＡＴ５の平均蛍光指数（ＭＦＩ）の棒グラフを示す図である。

【図57A】[0090]ＵＣＡＲ－Ｔ ＧＣ１９７細胞（例えば、ＣＤ１９とＣＤ７の両方を標的とするＣＡＲを有する多特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞）の増殖および持続性を示す実験データを示す。図５７Ａは、がん抗原刺激の存在下で２つの異なるドナー由来のエンハンサーＣ７Ｒを発現するＵＣＡＲ－Ｔ ＧＣ１９７細胞の増殖データを示す図である。

【図57B】図５７Ｂは、ＩＬ２または抗原刺激の非存在下でエンハンサーＣ７Ｒを発現するＵＣＡＲ－Ｔ ＧＣ１９７細胞の増殖データを示す図である。

【図58A】[0091]ＵＣＡＲ－Ｔ ＧＣ１９７細胞の増殖および持続性を示す実験データを示す。図５８Ａは、ＣＤ７およびエンハンサーＣ７ＲまたはＥ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の画分を示す実験データを示す図である。

【図58B】図５８Ｂは、エンハンサーＣ７ＲまたはＥ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＵＣＡＲ－Ｔ ＧＣ１９７細胞の増殖データを示す図である。

【図58C】図５８Ｃは、がん抗原刺激の存在下でエンハンサーＣ７ＲまたはＥ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＵＣＡＲ－Ｔ ＧＣ１９７細胞の増殖データを示す図である。

【図59A】[0092]Ｋ５６２－ＣＡＲ１９プロファイリングおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞殺傷アッセイの実験データを示す。図５９Ａは、ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ１９またはＣＤ１９を標的とするＣＡＲ）およびエンハンサーＣＤ４７またはＥ４（ＣＤ４７＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＫ５６２細胞の画分の実験データを示す図である。

【図59B】図５９Ｂは、エンハンサーＣＤ４７またはＥ４（ＣＤ４７＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＫ５６２－ＣＡＲ１９に対するＮＫ細胞の細胞毒性の実験データを示す図である。

【図60A】[0093]ＵＣＡＲＴ１９細胞（例えば、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを有するＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ１９細胞とも呼ばれる）のＳＴＡＴ５リン酸化および細胞持続性を示す実験データを示す。図６０Ａは、リン酸化ＳＴＡＴ５およびＣＡＲ１９を有するＴＣＲ ＫＯ ＣＡＲ１９細胞の画分の実験データを示す図である。

【図60B】図６０Ｂは、エンハンサーＣ７Ｒ、ＣＤ４７またはＥ４（ＣＤ４７＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲの増殖データを示す図である。

【図61A】[0094]図６１Ａは、Ｌ７１９－Ｅ３細胞におけるＥ３の安全スイッチ機能を示す図である。

【図61B】図６１Ｂは、Ｌ７１９－Ｅ３細胞におけるＥ３の安全スイッチ機能を示す図である。

【図62A】[0095]図６２は、補体依存性細胞傷害アッセイ（ＣＤＣアッセイ）によってＣＡＲ７－Ｅ３およびＬ７１９－Ｅ３において試験されたＥ３の安全スイッチ機能を示す図である。

【図62B】図６２は、補体依存性細胞傷害アッセイ（ＣＤＣアッセイ）によってＣＡＲ７－Ｅ３およびＬ７１９－Ｅ３において試験されたＥ３の安全スイッチ機能を示す図である。

【図63A】[0096]図６３は、サイトカインシグナル伝達増強を伴わない、またはｍｂＩＬ１５、Ｃ７Ｒ、もしくはＥ３発現を伴うＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウトＣＡＲ７細胞におけるＩＬ２およびＩＦＮγの発現を示す図である。

【図63B】[0096]図６３は、サイトカインシグナル伝達増強を伴わない、またはｍｂＩＬ１５、Ｃ７Ｒ、もしくはＥ３発現を伴うＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウトＣＡＲ７細胞におけるＩＬ２およびＩＦＮγの発現を示す図である。

【図64】[0097]図６４は、サイトカインシグナル伝達増強を伴わない、またはＣ７ＲもしくはＥ３発現を伴うＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウトＣＤ１９／ＣＤ７二重ノックアウトＣＡＲ－Ｌ７１９細胞におけるＩＬ２およびＩＦＮγの発現を示す図である。

【図65】[0098]図６５は、ＣＤ２ ｇＲＮＡスクリーニングを示す図である。

【図66A】[0099]図６６は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴとＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を比較するｉｎ ｖｉｖｏ ＧｖＨＤ研究を示す図である。

【図66B】[0099]図６６は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴとＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を比較するｉｎ ｖｉｖｏ ＧｖＨＤ研究を示す図である。

【図66C】[0099]図６６は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴとＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を比較するｉｎ ｖｉｖｏ ＧｖＨＤ研究を示す図である。

【図67A】[00100]図６７は、Ｔ－急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者を治療するためのＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの臨床データを示す図である。

【図67B】[00100]図６７は、Ｔ－急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者を治療するためのＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの臨床データを示す図である。

【図67C】[00100]図６７は、Ｔ－急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者を治療するためのＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの臨床データを示す図である。

【図67D】[00100]図６７は、Ｔ－急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者を治療するためのＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの臨床データを示す図である。

【図67E】[00100]図６７は、Ｔ－急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者を治療するためのＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの臨床データを示す図である。

【図68】[00101]ＣＡＲ７およびＣＡＲ７－Ｅ３ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性のＢＬＩイメージングを示す図である。

【図69】[00102]Ｌ７１９およびＬ７１９－Ｃ７Ｒ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性のＢＬＩイメージングを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

[00103]本明細書において、本発明の様々な実施形態が示され説明されるが、そのような実施形態は単なる一例として提供されるに過ぎないということは、当業者に明かであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、および置換を思いつき得る。本明細書において説明される本発明の実施形態に対する様々な代替策を用いてもよいことは、理解されるべきである。

【0035】

[00104]用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書において使用される場合、決定された特定の値または組成に対する、許容範囲内の値または組成を意味し、それらは、いくらかは、値または組成がどのように測定されるか、または測定された値または組成に応じて、すなわち、特定システムの限界に依存するであろう。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当技術分野において１回の実施あたり１標準偏差以内または１標準偏差超を意味し得る。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、最高で２０％まで、最高で１０％まで、最高で５％まで、または最高で１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特に明記されない限り、本明細書および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、当該用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該特定の値に対する、想定されるべき許容可能な誤差の範囲内であることを意味する。

【0036】

[00105]用語「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、本明細書において使用される場合、任意の様々な方法および送達システム、例えば、注射または注入による、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、腹腔内経路、脊髄経路、または非経口投与の他の経路などを使用して、本開示の産物を対象内へと物理的に導入することを意味する。

【0037】

[00106]用語「抗原」は、本明細書において使用される場合、選択的結合剤が結合することのできる分子またはその断片を意味する。一例として、抗原は、受容体などの選択的結合剤が結合することができるリガンドであり得る。別の例として、抗原は、免疫学的タンパク質（例えば、抗体）などの選択的結合剤が結合することのできる抗原分子であり得る。抗原は、その抗原に結合することができる抗体を産生するために動物において使用することができる分子またはその断片も意味することができる。場合により、抗原は、基質（例えば、細胞膜）に結合し得る。あるいは、抗原は、基質（例えば、分泌された分子、例えば、分泌されたポリペプチドなど）に結合し得ない。

【0038】

[00107]用語「抗体（Ａｂ）」は、本明細書において使用される場合、これらに限定されるわけではないが、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリンまたはその抗原を包含する。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、定常ドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超変異性領域に分けることができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、においてアミノ末端からカルボキシ末端へと配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

【0039】

[00108]用語「ヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、概して、塩基－糖－リン酸組み合わせ物を意味する。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチド類似物を含むことができる。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体ユニットであり得る。用語ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体などを包含することができる。そのような誘導体は、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰおよび７－デアザ－ｄＡＴＰ、ならびにそれらを含む核酸分子にヌクレアーゼ抵抗性を付与するヌクレオチド誘導体を含むことができる。用語ヌクレオチドは、本明細書において使用される場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を意味し得る。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の具体例は、これらに限定されるわけではないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを含み得る。ヌクレオチドは、標識されなくてもよく、または周知の技術によって検出可能に標識することもできる。標識化は、量子ドットによっても実施することができる。検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識を含み得る。ヌクレオチドの蛍光標識は、これらに限定されるわけではないが、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’－ジメトキシ－４’５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、および５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含み得る。蛍光標識されたヌクレオチドの具体例は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、フォスター、カルフォルニア州から入手可能な、［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、アーリントンハイツ、イリノイ州から利用可能な、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ デオキシリボヌクレオチド、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｆｌｕｏｒ Ｘ－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、インディアナ州から入手可能な、フルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、およびフルオレセイン－１５－２’－ｄＡＴＰ；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州から入手可能な、染色体標識されたヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン５ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを含み得る。ヌクレオチドは、化学修飾によっても標識またはマーク付けすることができる。化学修飾された単一のヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化されたｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例は、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、バイオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、およびビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）を含み得る。

【0040】

[00109]用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態、単鎖、二本鎖、または多鎖形態のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのどちらかまたはそれらの類似物を意味するために相互互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞に対して外因性または内因性であり得る。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在することができる。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知のまたは知られていない任意の機能を実施することができる。ポリヌクレオチドは、１種または複数種の類似物（例えば、変更された主鎖、糖、または核酸塩基）を含み得る。存在する場合、当該ヌクレオチド構造に対する変更を、高分子の組み立ての前または後に付与することができる。類似物のいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロホア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基類似物、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化されたヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ケウオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、相補的ＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離された任意の配列のＤＮＡ、単離された任意の配列のＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれていてもよい。

【0041】

[00110]用語「遺伝子」は、本明細書において使用される場合、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡなどのＤＮＡ）、およびＲＮＡ転写物をコードすることに関与するその対応するヌクレオチド配列を意味する。当該用語は、ゲノムＤＮＡに関して本明細書において使用される場合、介在領域、非コード領域、および調節領域を含み、ならびに５’および３’末端を含み得る。いくつかの使用において、当該用語は、５’および３’非翻訳領域（５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ）、エクソン、およびイントロンを含む転写配列を包含する。いくつかの遺伝子において、当該転写領域は、ポリペプチドをコードする「オープンリーディングフレーム」を含むであろう。当該用語のいくつかの使用において、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするために必要なコード配列（例えば、「オープンリーディングフレーム」または「コード領域」のみを含む。場合によって、遺伝子は、ポリペプチド、例えば、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子をコードしない。場合によって、用語「遺伝子」は、転写配列のみを含むのではなく、さらに、上流および下流の調節領域、エンハンサー、およびプロモーターを含む非転写領域も含む。遺伝子は、有機体のゲノムでのその本来の位置における「内因性遺伝子」または天然遺伝子を意味することができる。遺伝子は、「外因性遺伝子」または非天然遺伝子を意味することができる。非天然遺伝子は、宿主有機体において通常は見出されないが遺伝子導入によって当該宿主有機体に導入された遺伝子を意味することができる。非天然遺伝子は、有機体のゲノムでのその天然の位置ではない遺伝子も意味することができる。非天然遺伝子は、変異、挿入、および／または欠失を含んだ天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（例えば、非天然配列）も意味することができる。

【0042】

[00111]用語「内因性」は、本明細書において使用される場合、通常は細胞または組織において発現される核酸分子またはポリペプチドを意味する。
[00112]用語「外因性」は、本明細書において使用される場合、細胞内に内因的には存在しないかまたは過剰発現において得られる機能効果を達成するのに十分なレベルにおいて存在する核酸分子またはポリペプチドを意味する。したがって、用語「外因的」は、細胞において発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチド、例えば、外来性の、異種の、および過剰発現された、核酸分子およびポリペプチドを含む。

【0043】

[00113]用語「Ｔ細胞およびＮＫ細胞コンセンサスマーカー」は、本明細書において使用される場合、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上に共存するマーカー、例えば、これらに限定されるわけではないが、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＣＤ１６１、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ３１４などを意味する。

【0044】

[00114]用語「Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のマーカー」は、本明細書において使用される場合、それぞれＴ細胞またはＮＫ細胞に存在するマーカー、またはＴ細胞およびＮＫ細胞の両方に存在するマーカー、例えば、これらに限定されるわけではないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＳＬＡＭＦ７などを意味する。

【0045】

[00115]用語「機能的に不活性化する」または「機能的不活性化」は、本明細書において使用される場合、機能的遺伝子または当該遺伝子の産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質など、が阻まれるかまたは阻害されることを意味する。不活性化は、発現が生じないような遺伝子またはそれらのプロモーターの欠失、追加、または置換によって、あるいはｍＲＮＡまたはタンパク質などの遺伝子産物が不活性となるような遺伝子のコード配列の変異によって、達成され得る。機能的不活性化は、完全または部分的であってもよい。遺伝子の不活性化は、遺伝子サイレンシング、ノックアウト、阻害、および妨害を含む、全ての程度の不活性化を包含することができる。いくつかの実施形態において、機能的不活性化は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによって導入される。

【0046】

[00116]用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、および「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトなどを意味するために、本明細書において相互互換的に使用される。哺乳動物としては、これらに限定されるわけではないが、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、および愛玩動物が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて得られた、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養された、生物学的存在の組織、細胞、およびそれらの後代も包含される。

【0047】

[00117]用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書において使用される場合、有益なまたは所望の結果、例えば、これらに限定されるわけではないが、治療効果および／または予防効果などを得るためのアプローチを意味する。例えば、治療は、本明細書において開示されるシステムまたは細胞集団を投与する工程を含むことができる。治療効果は、治療下において１つまたは複数の状態（例えば、疾患または症状）における任意の治療的に関連する改善、または当該状態に対する治療的に関連する効果を意味する。予防効果の場合、まだ特定の状態が生じ得ていない場合でも、当該状態を生じるリスクにある対象、または疾患の生理学的症状の１つまたは複数を報告する対象、に組成物を投与することができる。

【0048】

概要
[00118]ＣＡＲは、細胞外抗原認識領域、例えば、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）、膜貫通領域、および細胞内共刺激シグナル領域を含むことができる。ＣＡＲの細胞外ドメインは、特定の抗原を認識することができ、当該シグナルを細胞内ドメインによって伝達することができ、それにより、Ｔ細胞活性化および増殖、細胞溶解毒性、およびサイトカインの分泌を生じさせることができ、それにより、標的細胞を消失させることができる。最初に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、患者の自己Ｔ細胞（または異種ドナー）を単離し、活性化し、ならびに遺伝子操作することができ、次いで、当該ＣＡＲ－Ｔ細胞を、その患者に注入することができる。この方法において、移植片対宿主反応病の確率が減少され得、当該抗原は、非ＭＨＣ拘束性の方式においてＴ細胞によって認識され得る。さらに、ＣＡＲ－Ｔは、当該抗原を発現する全てのがんを治療することができる。

【0049】

[00119]本開示は、細胞、例えば、免疫細胞を操作するための組成物および方法を提供し、それにより、当該細胞は、二重特異的ＣＡＲまたは多価ＣＡＲによって、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍細胞マーカー）および免疫細胞抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ７、またはＣＤ１３７）の両方を標的にすることができる。例えば、本開示は、腫瘍細胞マーカーおよび免疫細胞抗原、例えば、ＣＤ３などを標的にすることができる操作された免疫細胞を提供する。内因性ＴＣＲは、不活性化（例えば、妨害、阻害、ノックアウト、またはサイレンシング）することができる。腫瘍細胞マーカーおよび免疫細胞抗原を標的にする本開示のＣＡＲ－Ｔは、陽性腫瘍細胞を消失させることができ、ならびに宿主免疫細胞抗原陽性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を除去することができ、それにより、宿主拒絶反応（ＨＶＧ）を回避することができる。本開示において、当該操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲは、ノックアウトすることができ、ならびに植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防することができ、それにより、汎用的または普遍的ＣＡＲ－Ｔ（ＵＣＡＲ－Ｔ）細胞を調製することができる。当該操作された免疫細胞は、自己Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞に由来し得る。

【0050】

[00120]その上、当該操作された免疫細胞は、細胞自殺要素（例えば、誘導性細胞死部分）を含むことができ、ならびに当該ＣＡＲ－Ｔは、副作用を減じるために、いつでも不活性化／除去することができる。場合によって、当該操作された免疫細胞は、さらに、エンハンサー部分を含むことができる。当該エンハンサー部分は、当該操作された免疫細胞が対象に投与された場合に当該操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を調節することができる。例えば、エンハンサー部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－５またはＩＬ－７）、またはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－５ＲまたはＩＬ－７Ｒ）であり得る。当該エンハンサー部分は、当該操作された免疫細胞内のシグナル伝達経路、例えば、ＳＴＡＴ５シグナル伝達経路を増強することができる。いくつかの実施形態において、当該操作された免疫細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ３の両方を標的にする二重特異的ＣＡＲを含む。この例において示される当該操作された免疫細胞は、さらに、誘導性細胞死部分、例えば、トランケートされた上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔまたはｔＥＧＦＲ、これらは、本明細書において相互股間的に使用することができる；米国特許第９４４７１９４Ｂ２号および国際公開第２０１８０３８９４５号を参照されたい）などを含むことができる。

【0051】

[00121]当該誘導性細胞死部分または当該エンハンサー部分は、別々の発現ベクターによって免疫細胞に導入することができる。場合によって、当該誘導性細胞死部分および当該エンハンサー部分は、両方の部分をコードする配列を含む発現ベクターによって免疫細胞に導入してもよい。場合によって、当該誘導性細胞死部分および当該エンハンサー部分は連結され、キメラポリペプチドとして発現される。

【0052】

[00122]細胞療法における本明細書において提供される操作された免疫細胞の適用は、患者の疾患（例えば、がん）を治療することができ、ＧＶＨＤおよびＨｖＧを回避するために予めラージスケールにおいて調製することができ、治療コストを減らすことができ、必要であればいつでもＣＡＲ－Ｔを不活性化することができ、免疫療法の副作用を減らすことができ、ならびに製品安全性を確保することができる。本明細書において提供される操作された免疫細胞は、普遍的ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＵＣＡＲ－Ｔ細胞）と呼ぶことができる。

【0053】

キメラ抗原受容器（ＣＡＲ）
[00123]本明細書において提供される細胞（例えば、免疫細胞または操作された免疫細胞）は、１種または複数種のＣＡＲを含むことができる。当該ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。細胞外ドメインは、標的特異的結合性要素（抗原結合性ドメインとしても知られる）を含むことができる。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびゼータ（ζ）鎖部分を含み得る。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を意味する。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要であり得る抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。当該ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または当該ＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間には、スペーサードメインが組み込まれ得る。本明細書において使用される場合、用語「スペーサードメイン」は、概して、膜貫通ドメインを、細胞外ドメインかまたはポリペプチド鎖の細胞質ドメインのどちらかに連結させるために機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最高で３００までのアミノ酸、好ましくは１０から１００のアミノ酸、最も好ましくは２５から５０のアミノ酸を含み得る。

【0054】

[00124]膜貫通ドメインに関して、当該ＣＡＲは、当該ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。一実施形態において、当該ＣＡＲのドメインの１つに天然に関連付けられた膜貫通ドメインが使用される。場合によって、当該膜貫通ドメインは、受容体複合体の他の膜との相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するように選択され得るかまたはアミノ酸置換によって修飾され得る。

【0055】

[00125]膜貫通ドメインは、天然源または合成源のどちらかに由来し得る。当該源が天然の場合、当該ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示における特定の使用の膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはＩｇＧ４などの免疫グロブリンに由来し得る（例えば、その少なくとも膜貫通領域を含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは、合成してもよく、その場合、当該ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性基を支配的に含むであろう。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各端部に見出されるであろう。任意選択により、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２から１０の間の長さのアミノ酸が、当該ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特定の好適なリンカーを提供する。

【0056】

[00126]本開示のＣＡＲの細胞質ドメインか、そうでなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが入れられている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担うことができる。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊機能を意味する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、特殊機能を実施するために、エフェクター機能シグナルを伝達して細胞に送るタンパク質の一部分を意味する。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。当該細胞内シグナル伝達ドメインにおけるトランケートされた一部分が使用される限りにおいて、そのようなトランケートされた一部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全な鎖の代わりに使用してもよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインなる用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、当該細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた一部分を含むことを意味する。

【0057】

[00127]本開示のＣＡＲでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、初期シグナル伝達とその後の抗原受容体エンゲージメントと協力して作用するＴＣＲおよび共受容体の細胞質配列、ならびに、これらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する合成配列が挙げられる。

【0058】

[00128]ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化にとっては不十分であり得、二次または共刺激シグナルを含ませてもよい。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲによって抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および二次または共刺激シグナルを提供するために抗原非依存性の方式において機能するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）、によって媒介されると言える。

【0059】

[00129]一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の方法または抑制性の方法のどちらかにおいて、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節することができる。刺激性の方法において機能する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン系活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナルモチーフを含み得る。本開示において特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。本開示のＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子が、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことは、特に好ましい。

【0060】

[00130]いくつかの実施形態において、当該ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体によってＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように設計することができ、または本開示のＣＡＲとの関連において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。当該共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を意味する。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要であり得る抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。したがって、本開示は、場合によって、共刺激シグナル伝達要素としての４－１ＢＢで例示されるが、他の共刺激要素も、本開示の範囲内である。

【0061】

[00131]本開示のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにおいてまたは指定された順序においてお互いに連結され得る。任意選択により、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２から１０の間の長さのアミノ酸が、当該結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特定の好適なリンカーを提供する。

【0062】

[00132]いくつかの実施形態において、当該細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインとＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。別の実施形態において、当該細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインと４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。さらなる別の実施形態において、当該細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインとＣＤ２８および４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。

【0063】

[00133]本明細書において提供されるＣＡＲは、１つまたは複数の抗原結合性ドメインを含むことができる。場合によって、本明細書において提供されるＣＡＲは、免疫細胞抗原（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の殺活性を阻害するため）および疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）の両方を標的にすることができる抗原結合性ドメインを含む。例えば、免疫細胞抗原およびがん抗原の両方を標的にする抗原結合性ドメインとしては、これらに限定されるわけではないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６１、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、およびＴＣＲが挙げられる。

【0064】

[00134]場合によって、本明細書において提供されるＣＡＲは、２つの抗原結合性ドメインを含み、それにより、１つの個々のＣＡＲは、２つの異なる抗原を標的にする二重特異的ＣＡＲである。二重特異的ＣＡＲの場合、一方の抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原を標的にすることができ、他方の抗原結合性ドメインは、疾患関連抗原を標的にすることができる。二重特異的ＣＡＲの２つの抗原結合性ドメインは、タンデム構造、並列構造、またはループ構造を有することができる。

【0065】

[00135]例えば、ＣＡＲは、腫瘍細胞マーカーおよびＣＤ３を標的にすることができる。当該ＣＡＲは、式Ｉ：Ｌ－ｓｃＦｖ１－Ｉ－ｓｃＦｖ２－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（Ｉ）、の構造を有することができ、この場合、各「－」は、独立して、リンカーペプチドまたはペプチド結合であり；Ｌは、任意選択により、シグナル伝達ペプチド配列であり；Ｉは、柔軟なリンカーであり；Ｈは、任意選択により、ヒンジ領域であり；ＴＭは、膜貫通ドメインであり；Ｃは、共刺激ドメインであり；ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達配列であり；ｓｃＦｖ１およびｓｃＦｖ２の一方は、腫瘍細胞マーカーを標的にする抗原結合性ドメインであり；もう一方は、ＣＤ３を標的にする抗原結合性ドメインである。当該ＣＡＲは、式ＩＩまたはＩＩ’：Ｌ－ＶＬ－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（ＩＩ）、Ｌ－ＶＨ－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（ＩＩ’）、の構造を有することができ、この場合、各「－」は、独立して、リンカーペプチドまたはペプチド結合であり；要素Ｌ、Ｈ、ＴＭ、Ｃ、およびＣＤ３ζは、上記において説明される通りであり；ｓｃＦｖは、腫瘍細胞マーカーを標的にする抗原結合性ドメインであり；ＶＨは、抗ＣＤ３抗体重鎖可変領域であり；ＶＬは、抗ＣＤ３抗体軽鎖可変領域であり；またはｓｃＦｖは、ＣＤ－３を標的にする抗原結合ドメインであり；ＶＨは、抗腫瘍細胞マーカー抗体重鎖可変領域であり；ＶＬは、抗腫瘍細胞マーカー抗体軽鎖可変領域である。

【0066】

[00136]場合によって、ＣＡＲは、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３ｓｃＦｖ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ヒンジ－ＴＭ－ＣＤ２８／４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、の構造を含むことができ、この場合、ＥＧＦＲｔは、安全スイッチとしての、トランケートされたＥＧＦＲであり（例えば、誘導性細胞死部分）、ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＧＳリンカーによって連結されたモノクローナル抗体ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１の重鎖および軽鎖可変領域のｓｖＦＣｖ断片であり、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ断片は、ＧＳリンカーによって連結されたモノクローナルＦＭＣ６３抗体の重鎖および軽鎖可変領域である。当該ＣＡＲの構造はさらに、ヒンジ、膜貫通領域、ＣＤ２８または４１ＢＢの共刺激シグナル伝達領域、および／またはＣＤ３ζ細胞内ドメインを含むことができる。本開示において、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ヒンジ－ＴＭ－ＣＤ２８／４１ＢＢ－ＣＤ３ζの核酸コンストラクトは、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に挿入することができる。当該ベクターは、２９３Ｔ細胞にパッケージすることができる。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから選別することができ、ならびに活性化後、ＴＣＲおよびＰＤ－１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術によってノックアウトすることができる。次いで、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現させるために当該ベクターに感染させられ得る。調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによってＣＡＲの感染効率および遺伝子編集効率を検出するために使用することができる。

【0067】

[00137]上記実施例の免疫細胞マーカー、例えば、ＣＤ３は、他の免疫細胞マーカー、例えば、ＣＤ７およびＣＤ１３７など、で置き換えることができる。
[00138]場合によって、２つの抗原結合性ドメインを含むＣＡＲが、タンデム形態において配置される。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１；（ｉｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１；（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２；（ｉｖ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２；（ｖ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１；（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１；（ｖｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２；または（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２として配置され、ＶＨ１は、上記第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、上記第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、上記第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、上記第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。例えば、当該ＣＡＲは、下記式ＩＶまたはＩＶ’：Ｌ３－ｓｃＦｖ１－Ｒ－ｓｃＦｖ２－Ｈ３－ＴＭ３－Ｃ３－ＣＤ３ζ（ＩＶ）；Ｌ３－ｓｃＦｖ２－Ｒ－ｓｃＦｖ１－Ｈ３－ＴＭ３－Ｃ３－ＣＤ３ζ（ＩＶ’）、によって表される構造を有することができ、この場合、各「－」は、独立して、リンカーペプチドまたはペプチド結合であり；Ｌは、任意選択のシグナルペプチド配列であり；ｓｃＦｖ１は、腫瘍細胞マーカーを標的にする抗原結合性ドメインであり；Ｒは、剛直なジョイントまたは柔軟なジョイントであり；ｓｃＦｖ２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞コンセンサスマーカーを標的にする抗原結合性ドメイン（例えば、抗体単鎖可変領域配列）であり；Ｈ３は、任意選択のヒンジ領域であり；ＴＭ３は、膜貫通ドメインであり；Ｃ３は、共刺激ドメインであり；ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達配列である。

【0068】

[00139]場合によって、２つの抗原結合性ドメインを含むＣＡＲは、ループ形態において配置される。場合によって、上記第１の抗原結合性ドメインおよび上記第２の抗原結合性ドメインは、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２；（ｉｉ）ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２；（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１；（ｉｖ）ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１；（ｖ）ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２；（ｖｉ）ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２；（ｖｉｉ）ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１；または（ｖｉｉｉ）ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１として配置され、ＶＨ１は、上記第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、上記第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、上記第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。例えば、当該ＣＡＲは、下記式ＶＩ、ＶＩ’、ＶＩ’’、またはＶＩ’’’：Ｌ８－ＶＬ１－ＶＨ２－Ｉ－ＶＬ２－ＶＨ１－Ｈ８－ＴＭ８－Ｃ８－ＣＤ３ζ（ＶＩ）；Ｌ８－ＶＨ１－ＶＬ２－Ｉ－ＶＨ２－ＶＬ１－Ｈ８－ＴＭ８－Ｃ８－ＣＤ３ζ（ＶＩ’）；Ｌ８－ＶＬ２－ＶＨ１－Ｉ－ＶＬ１－ＶＨ２－Ｈ８－ＴＭ８－Ｃ８－ＣＤ３ζ（ＶＩ’’）、Ｌ８－ＶＨ２－ＶＬ１－Ｉ－ＶＨ１－ＶＬ２－Ｈ８－ＴＭ８－Ｃ８－ＣＤ３ζ（ＶＩ’’’）、の構造を有し得、この場合、各「－」は、独立して、リンカーペプチドまたはペプチド結合であり；Ｌ８は、任意選択のシグナルペプチド配列であり；ＶＨ１は、抗腫瘍細胞マーカー抗体重鎖可変領域であり；ＶＬ１は、抗腫瘍細胞マーカー抗体軽鎖可変領域であり；ＶＨ２は、抗Ｔ細胞およびＮＫ細胞コンセンサスマーカー（例えば、ＣＤ７またはＣＤ２など）抗体重鎖可変領域であり；ＶＬ２は、抗Ｔ細胞およびＮＫ細胞コンセンサスマーカー（例えば、ＣＤ７またはＣＤ２など）抗体軽鎖可変領域であり；Ｉは、柔軟なジョイントであり；Ｈ８は、任意選択のヒンジ領域であり；ＴＭ８は、膜貫通ドメインであり；Ｃ８は、共刺激ドメインであり；ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達配列である。

【0069】

[00140]場合によって、２つの抗原結合性ドメインを含むＣＡＲは、並列形態において配置される。当該並列形態は、第２の抗原結合性ドメインを有する第２のＣＡＲの完全コンストラクトに連結された第１の抗原結合性ドメインを有する第１のＣＡＲの完全コンストラクトを含むことができる。並列形態の例は、ｔＥＧＦＲ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－ＣＤ３ｓｃＦｖ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζであり、ここに示されるｔＥＧＦＲは、安全スイッチとして機能することができ、当該安全スイッチは、本開示において説明されるような他の安全スイッチで置き換えることができる。本明細書において説明されるように、ＣＤ１９ ｓｃＦｖおよびＣＤ３ ｓｃＦｖは、抗原結合性ドメインの２つの例であり、それらは、本開示において説明されるような様々な抗原結合性ドメインで置き換えてもよい。ＣＤ２８は、膜貫通ドメインの例であり、本明細書において説明される他の膜貫通ドメインで置き換えることができる。４１ＢＢは、共刺激ドメインの例であり、本明細書において説明される他の共刺激ドメインで置き換えることができる。場合によって、リンカーが、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲとを連結するために使用される。当該リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。当該切断可能なリンカーは、自己切断性ペプチド、例えば、２Ａ自己切断性ペプチドなど、であり得る。

【0070】

[00141]さらに、ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲをコードする核酸分子も本開示において想到される。当該核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の配列を含むことができ、当該ＣＡＲは、結合部位を含むことができ、結合部位は、（ｉ）対象に投与されたときに当該操作された免疫細胞に対する当該対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）（ｉ）が連結されている、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含み、ならびに当該１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲは、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。当該第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択される免疫細胞抗原を標的にすることができる。当該第２の抗原結合性ドメインは、疾患関連抗原、例えば、ＣＤ１９などを標的にすることができる。疾患関連抗原の他の非限定的な例としては、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ｃｄ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３；ＰＭＳＡ、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＤ１５１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、メソテリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＴＣＲａ、ＴＣＲｐ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ＣＤ７９ｂ、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒおよびノッチ－１－４が挙げられる。

【0071】

[00142]当該核酸分子は、さらに、エンハンサー部分をコードする第２の配列を含むことができ、エンハンサー部分は、細胞において発現されたときに当該ＣＡＲの１つまたは複数の活性を高めることができる。当該エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。当該核酸分子は、さらに、誘導性細胞死部分をコードする第２の配列を含むことができ、誘導性細胞死部分は、細胞において発現された場合、細胞死アクティベーターに接触すると当該細胞の死を生じさせることができる。当該誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択することができる。

【0072】

[00143]当該核酸分子は、さらに、第１の配列と第２の配列とが隣接する第３の配列を含むことができ、この場合、当該第３の配列は、切断可能なリンカーをコードすることができる。当該切断可能なリンカーは、自己切断性ペプチドであり得る。

【0073】

[00144]当該核酸分子は、さらに、第１の配列および／または第２の配列の発現を調節する調節配列を含むことができる。
[00145]さらに、本明細書において説明される核酸分子を含むキットも本開示において想到される。

【0074】

[00146]場合によって、本明細書において説明されるＣＡＲをコードする当該核酸は、操作された細胞を生じるために、当該ＣＡＲの発現のために免疫細胞中へ送達することができる。

【0075】

供給源細胞
[00147]本開示は、操作された細胞、例えば、操作された免疫細胞などを提供する。当該操作された免疫細胞は、対象から得られる試料から単離された細胞（例えば、免疫細胞）から調製することができる。当該操作された免疫細胞は、細胞株細胞から調製することができる。当該操作された免疫細胞を調製するために使用される免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはマクロファージであり得る。当該操作された免疫細胞を調製するために使用される免疫細胞は、生来のリンパ球（ＩＬＣ）であり得る。

【0076】

[00148]当該操作された免疫細胞を調製するために使用される免疫細胞は、幹細胞であり得る。当該幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。

【0077】

[00149]当該免疫細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み得る。当該ＴＣＲは、当該免疫細胞の内因性ＴＣＲであり得る。場合によって、当該内因性ＴＣＲは、不活性化することができる。例えば、当該ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子を不活性化することができる。例えば、当該免疫細胞は、損なわれたＴＣＲを伴うαβＴ細胞であり得、それにより、当該免疫細胞は、ＧＶＨＤを避けることができる。別の例としては、当該内因性ＴＣＲの機能は、阻害剤、例えば、ＴＣＲ由来ペプチド、様々なウイルスの融合タンパク質領域および他のタンパク質領域のアミノ酸配列に由来するペプチド、抗体、および小分子阻害剤など、によって阻害することができる。ＴＣＲを阻害するペプチドが由来するウイルスとしては、これらに限定されるわけではないが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＶＳ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ラッサ熱ウイルス（ＬＡＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｍｏｐｅｉａ（モペイア）（ＭＯＰＶ）、タカリベウイルス（ＴＡＣＶ）、フレンドマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）；ヒトＴリンパ球性ウイルス１型、（ＨＴＬＶ－１）；ヘルペスウイルスアテレス（ＨＶＡ）；マルブルグウイルス（ＭＡＲＶ）；スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）；およびザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）が挙げられる。

【0078】

[00150]場合によって、当該免疫細胞は、ＧＶＨＤ反応を生じ得ないＴＣＲを含有するＴ細胞であり得る。例えば、当該免疫細胞は、特異的抗原、例えば、ウイルス特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）などを認識することができるＴＣＲを伴うαβＴ細胞であり得る。さらなる別の例として、当該免疫細胞は、γδＴ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞であり得る。別の例として、当該免疫細胞は、抗原特異的Ｔ細胞（例えば、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞）から作製された誘導された多分化能性幹細胞であり得る。当該免疫細胞は、臍帯血Ｔ細胞であり得る。

【0079】

[00151]当該免疫細胞は、細胞表面マーカーを含んでもよい。当該細胞表面マーカーは、免疫細胞抗原であり得る。操作された免疫細胞を調製するために使用される免疫細胞の免疫細胞抗原をコードする遺伝子は、不活性化することができる。免疫細胞抗原の例としては、これらに限定されるわけではないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７が挙げられる。例えば、場合によって、当該免疫細胞のＣＤ７をコードする遺伝子が不活性化される。場合によって、当該免疫細胞のＣＤ３をコードする遺伝子が不活性化される。場合によって、当該免疫細胞のＣＤ１３７をコードする遺伝子が不活性化される。

【0080】

[00152]当該免疫細胞は、対象からの試料から単離することができる。当該対象は、健康なドナーであり得る。当該対象は、ある状態（例えば、がんなどの疾患）を有し得る。当該試料は、体液または組織、例えば、これらに限定されるわけではないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、ひ臓組織、および腫瘍など、であり得る。場合によって、試料は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆細胞を含む。例えば、場合によって、当該試料は、臍帯血液試料、末梢血液試料（例えば、単核細胞画分）、または多能性細胞を含む対象からの資料である。いくつかの態様において、対象からの試料を培養することにより、誘導された多分化能幹（ｉＰＳ）細胞を生成することができ、これらの細胞を使用して、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞を作製することができる。細胞試料は、対象から直接的に培養してもよく、または使用前に凍結保存してもよい。いくつかの態様において、細胞試料を得る工程は、細胞試料を収集する工程を含む。他の態様において、試料は、第三者から得られる。さらなる態様において、対象からの試料を処理することにより、当該試料中のＴ細胞またはＴ細胞の前駆細胞を精製または濃縮することができる。例えば、当該試料を勾配精製、細胞培養選択、および／または細胞選別（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって）することができる。

【0081】

[00153]当該免疫細胞は、ＮＫ細胞であり得る。当該ＮＫ細胞は、末梢血、臍帯血、または本明細書において説明される他の供給源から得ることができる。当該ＮＫ細胞は、誘導された多分化能性幹細胞に由来し得る。

【0082】

[00154]いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法において用いることができる細胞は、所定の因子に関して陽性または陰性であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法において利用される細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３－細胞、ＣＤ５＋細胞、ＣＤ５－細胞、ＣＤ７＋細胞、ＣＤ７－細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４－細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ８－細胞、ＣＤ１０３＋細胞、ＣＤ１０３－細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｂ－細胞、ＢＤＣＡ１＋細胞、ＢＤＣＡ１－細胞、Ｌ－セレクチン＋細胞、Ｌ－セレクチン－細胞、ＣＤ２５＋、ＣＤ２５－細胞、ＣＤ２７＋、ＣＤ２７－細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ２８－細胞、ＣＤ４４＋細胞、ＣＤ４４－細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６－細胞、ＣＤ５７＋細胞、ＣＤ５７－細胞、ＣＤ６２Ｌ＋細胞、ＣＤ６２Ｌ－細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ６９－細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ－細胞、ＣＤ１２７＋細胞、ＣＤ１２７－細胞、ＣＤ１３２＋細胞、ＣＤ１３２－細胞、ＩＬ－７＋細胞、ＩＬ－７－細胞、ＩＬ－１５＋細胞、ＩＬ－１５－細胞、レクチン様受容体Ｇ１陽性細胞、レクチン様受容体Ｇ１陰性細胞、またはそれらの分化または脱分化された細胞であり得る。細胞によって発現される因子の例は、限定的であることが意図されず、当業者は、細胞が当技術分野において既知の任意の因子に関して陽性または陰性であり得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、細胞は、２つ以上の因子に関して陽性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、２つ以上の因子に関して陰性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ２５－、ＣＤ４４－、およびＣＤ６９－であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、１つまたは複数の因子に関して陽性で有り得、ならびに１つまたは複数の因子に関して陰性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８－であり得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される細胞マーカーは、細胞の集団を選択、濃縮、または枯渇するために利用することができる。いくつかの態様において、濃縮工程は、単球画分を選択する工程を含む。いくつかの態様において、濃縮工程は、単球画分から免疫細胞の集団を選別する工程を含む。いくつかの実施形態において、当該細胞は、１つまたは複数の所定の因子を有するためにまたは有しないために選択され得る（例えば、細胞は、１つまたは複数の因子の存在または非存在に基づいて分離され得る）。いくつかの実施形態において、選択された細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形質導入および／または増殖させることもできる。選択された細胞は、注入の前にｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖させることができる。いくつかの実施形態において、選択された細胞は、本明細書において提供されるベクターによって形質導入することができる。本明細書において開示される方法のいずれかにおいて使用される細胞は、本明細書において開示される細胞のいずれかの混合物（例えば、２種以上の異なる細胞）であってもよいことは理解されるべきである。例えば、本開示の方法は、細胞を含み得、当該細胞は、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との混合物である。別の実施例において、本開示の方法は、細胞を含み得、当該細胞は、ＣＤ４＋細胞とナイーブ細胞との混合物である。場合によって、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ－７Ｒα＋で構成される幹メモリーＴＳＣＭ細胞（ｓｔｅｍ ｍｅｍｏｒｙ ＴＳＣＭ ｃｅｌｌ）であり得、幹メモリー細胞（ｓｔｅｍ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌ）は、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ－１も発現することができ、ならびに幹メモリー細胞に特有の多数の機能的属性を示すことができる。本明細書において提供される細胞は、Ｌ－セレクチンおよびＣＣＲ７を含むセントラルメモリーＴＣＭ細胞（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ ＴＣＭ ｃｅｌｌ）でもあり得、当該セントラルメモリー細胞は、例えば、ＩＬ－２を分泌することができるが、ＩＦＮγまたはＩＬ－４は分泌することができない。細胞は、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクターメモリーＴＥＭ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ ＴＥＭ ｃｅｌｌ）でもあり得、ならびに、例えば、エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ－４などを産生することができる。場合によって、細胞の集団を対象に導入することができる。例えば、細胞の集団は、Ｔ細胞とＮＫ細胞との組み合わせであり得る。他の場合において、集団は、ナイーブ細胞とエフェクター細胞との組み合わせであり得る。細胞の集団は、ＴＩＬであり得る。

【0083】

[00155]供給源の免疫細胞は、Ｔ細胞であり得る。当該Ｔ細胞は、αβＴ細胞またはγδＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、多数の供給源、例えば、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、ひ臓組織、および腫瘍など、から得ることができる。本開示のある特定の実施形態において、様々なＴ細胞株が、使用され得る。本開示のある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当業者に既知の様々な技術、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などを使用して対象から採取された血液のユニットから得ることができる。いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球、例えば、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板などを含む。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿画分を除去するため、および後続の処理工程のために、当該細胞を適切な緩衝液または培地中に置くために洗浄され得る。本開示のいくつかの実施形態において、当該細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態において、当該洗浄溶液はカルシウムを含まず、ならびに、マグネシウムを含み得ないか、または全てではないが多くの二価のカチオンを含み得ない。カルシウムの非存在下での初期活性化工程は、増加された活性化につながり得る。洗浄工程は、製造元の取扱説明書に従って、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞処理機、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）の使用などの方法によって実行され得る。洗浄後、当該細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ^２＋不含、Ｍｇ^２＋不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝剤の有無における他の生理食塩水など、に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去され得、当該細胞は、培養培地に直接再懸濁され得る。

【0084】

[00156]別の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解させならびに単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって、または対向流遠心溶出法（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によって、末梢血リンパ球から単離される。さらに、Ｔ細胞の特定のサブ集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって単離することができる。例えば、一実施形態において、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞のポジティブ選択にとって十分な期間において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）結合ビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標） Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔを伴うインキュベーションによって単離される。一実施形態において、当該期間は、約３０分である。さらなる実施形態において、当該期間は、３０分から３６時間またはそれ以上ならびにその間に存在する全ての整数値に及ぶ。さらなる実施形態において、当該期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらなる別の好ましい実施形態において、当該期間は、１０時間から２４時間である。いくつかの実施形態において、当該インキュベーション期間は、２４時間である。白血病患者からのＴ細胞の単離の場合、より長いインキュベーション時間、例えば、２４時間など、の使用は、細胞収量を増加させることができる。より長いインキュベーション時間は、他の細胞タイプと比較してＴ細胞が少ないような任意の状況において、Ｔ細胞を単離するために使用され得る。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲の効率を増加させることができる。したがって、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することができる当該時間を単に短くまたは長くすることによって、ならびに／あるいはＴ細胞に対するビーズの比率を増加または減少させることによって（本明細書において詳細に説明されるように）、Ｔ細胞のサブ集団を、培養開始時または当該プロセスの他の時点において、優先的に選択または淘汰することができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、Ｔ細胞のサブ集団を、培養開始時または他の所望の時点において、優先的に選択または淘汰することができる。場合によって、複数回の選択を使用することもできる。ある特定の実施形態において、それは、選択手順を実施すること、ならびに活性化プロセスおよび増殖プロセスにおいて「非選択」細胞を使用することは、有用であり得る。「非選択」細胞に、さらなる選択を実施することもできる。

【0085】

[00157]ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせによって実行することができる。例示的方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択であり得る。例えば、ＣＤ４＋細胞をネガティブ選択によって濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を典型的に発現する調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を濃縮することまたはポジティブ選択することは、望ましくあり得る。あるいは、ある特定の実施形態において、調節性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５結合ビーズ（ａｎｔｉ－Ｃ２５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｂｅａｄ）または他の同様の選択の方法によって枯渇される。

【0086】

[00158]ポジティブ選択またはネガティブ選択による細胞の所望の集団の単離のため、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変更することができる。ある特定の実施形態において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことは望ましくあり得る。例えば、一実施形態において、２０億の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態において、１０億の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億超の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、１億の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万の細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度の使用は、結果として、細胞収量の増加、細胞活性化、および細胞増殖をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原を弱く発現させ得る細胞、例えば、ＣＤ２８－ネガティブＴ細胞など、のより効率的な捕獲、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織）からのより効率的な捕獲を可能にする。細胞のそのような集団は、治療的価値を有し得、ならびに得ることが望ましいであろう。例えば、細胞の高濃度の使用は、通常においてより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。

【0087】

[00159]関連する実施形態態様において、細胞のより低い濃度を使用してもよい。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を著しく希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小に抑えられる。この方法は、当該粒子に結合する多量の所望の抗原を発現する細胞を選択することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルにおいてＣＤ２８を発現し、希釈濃度においてＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。いくつかの実施形態において、使用される細胞の濃度は、５×１０^６／ｍｌである。他の実施形態において、使用される細胞の濃度は、約１×１０^５／ｍｌから１×１０^６／ｍｌならびにその間の任意の整数値であり得る。他の実施形態において、当該細胞は、２～１０℃または室温のどちらかにおいて、可変速度で時間の長さを変えて、撹拌機においてインキュベートされ得る。

【0088】

[00160]刺激のためのＴ細胞は、洗浄工程の後に凍結させることもできる。理論に束縛されることを望むわけではないが、凍結およびその後の解凍工程は、細胞集団における顆粒球とある程度の単球とを除去することによって、より一様な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程の後、当該細胞は、凍結溶液に懸濁され得る。多くの凍結溶液およびパラメータが、当技術分野において既知であり、この文脈で有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、あるいは、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、あるいは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、あるいは、例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地、の使用を伴い、次いで、当該細胞は、１分間に１℃の速度において－８０℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵される。制御された他の凍結の方法、ならびに－２０℃または液体窒素において即座に非制御凍結も使用され得る。

【0089】

[00161]いくつかの実施形態において、凍結保存された細胞は、本明細書において説明されるように解凍および洗浄され、ならびに、室温において１時間休ませた後、本開示の方法を使用して活性化される。

【0090】

[00162]いくつかの実施形態において、当該細胞は、様々な関連治療法、例えば、これらに限定されるわけではないが、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、などの薬剤による治療、化学療法、放線、免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、および、ＦＫ５０６など、抗体、または免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８など、ならびに放射線照射、の前に、対象からの血液試料から、またはアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（サイクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または成長因子誘導シグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら， Ｃｅｌｌ ６６：８０７～８１５， １９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら， Ｉｍｍｕｎ． ７３：３１６～３２１， １９９１；Ｂｉｅｒｅｒら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎ． ５：７６３～７７３， １９９３）。さらなる実施形態において、当該細胞は、患者から単離され、骨髄または幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤のいずれかを使用するＴ細胞切除治療、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、あるいは、ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体、との併用において（例えば、その前に、同時に、またはその後に）、後の使用のために凍結される。別の実施形態において、当該細胞は、事前に単離され、治療とその後のＢ細胞切除治療、例えば、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなど、のための、後の使用のために凍結することができる。

【0091】

操作された免疫細胞
[00163]本明細書で提供される操作された免疫細胞は、腫瘍細胞に対して増強された活性を示すことができるが、ＧＶＨＤのような低減された副作用を伴う。操作された免疫細胞は、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原、または腫瘍細胞マーカー）を標的とし、同時に宿主免疫細胞を抑制することができる。操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性遺伝子（例えば、ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子、または細胞表面マーカーをコードする遺伝子）は、不活性化され得る。場合によって、操作された免疫細胞は、それぞれが異なる抗原を標的とする第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む。場合によって、操作された免疫細胞は、第１の抗原結合性ドメインと第２の抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを含む。

【0092】

[00164]操作された免疫細胞は、結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。結合部分は、免疫細胞抗原に結合することができる第１の抗原結合性ドメインと、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含むことができる。１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。また、操作された免疫細胞は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分を含むことができる。操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化され得る。場合によって、操作された免疫細胞は、１つまたは複数のＣＡＲを含むが、エンハンサー部位を含まない別の操作された免疫細胞と比較して、（ｉ）操作された免疫細胞に対して異種である細胞の存在下において少なくとも約２０日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約１０倍の増殖の増強、または（ｉｉｉ）免疫細胞抗原または疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強を示すことができる。場合によって、操作された免疫細胞は、（ｉ）持続の増強、（ｉｉ）増殖の増強、および（ｉｉｉ）細胞傷害性の増強のうち２つ以上を示すことによって特徴付けることができる。（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）の特性は、外因性サイトカインのような外因性エンハンサー部位の非存在下において測定することができる。

【0093】

[00165]操作された免疫細胞は、多特異性ＣＡＲを含むことができる。場合によって、操作された免疫細胞は、免疫細胞抗原および疾患関連抗原を標的とする二重特異性ＣＡＲを含む。二重特異性ＣＡＲの２つの抗原結合性ドメインは、本開示に記載されているような任意の形態、例えば、パラレル形態、ループ形態、およびタンデム形態で配置することができる。例えば、本明細書に記載の操作された免疫細胞は、（ｉ）ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含む単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。様々な場合では、内因性ＣＤ７をコードする遺伝子は、操作された免疫細胞において不活性化（例えば、サイレンシングまたはノックアウト）され得る。

【0094】

[00166]免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択され得る。場合によって、免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６１、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲαまたはＴＣＲβである。場合によって、免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、またはＣＤ１３７である。場合によって、免疫細胞抗原はＣＤ７である。エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成され得る。エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成され得る。１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路であり得る。エンハンサー部分は、自己オリゴマー化によって自己活性化性であり得る。エンハンサー部分は、自己二量体化によって自己活性化性であり得る。

【0095】

[00167]エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体であり得る。エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0096】

[00168]場合によって、操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子を、内因性ＴＣＲが不活性化されるように不活性化してもよい。サブユニットをコードする遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζであり得る。

【0097】

[00169]操作された免疫細胞は、さらに、誘導性細胞死部分を含み、誘導性細胞死部分は、細胞死アクティベーターとの接触において操作された免疫細胞の自殺を生じさせ得る。誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択され得る。場合によって、誘導性細胞死部分はＥＧＦＲｔであり、ならびに細胞死アクティベーターはＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合断片である。場合によって、誘導性細胞死部分はＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに細胞死アクティベーターはＧＣＶである。場合によって、誘導性細胞死部分はｉＣａｓｐ９であり、ならびに細胞死アクティベーターはＡＰ１９０３である。細胞死アクティベーターは、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。

【0098】

[00170]操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現は、元のままでもよい。場合によって、操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現は、元のままでもよい。操作された免疫細胞の内因性のＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は元のままでもよい。

【0099】

[00171]操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現は、上方調節され得る。場合によって、操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、上方調節される。

【0100】

[00172]操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現は、ノックアウトされてもよく、または部分的にノックアウトされてもよい。例えば、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方がノックアウトされ得る。場合によって、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－２、またはその両方が部分的にノックアウトされ得る。場合によって、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩが部分的にノックアウトされ得る。場合によって、Ｔ細胞殺活性を低下させ、しかし抗ＮＫキラー機能は維持するために内因性ＨＬＡがノックアウトされ得る。例えば、ＨＬＡ－Ａ／Ｂはノックアウトされ、一方でＨＬＡ－Ｃ／Ｅを操作された免疫細胞に残すことができる。場合によって、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはその両方がノックアウトされる。場合によって、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、またはその両方が元のままである。場合によって、操作された免疫細胞のキラー／食細胞阻害剤は過剰発現され得る。他の場合によって、キラー／食細胞阻害剤の共発現により、内因性ＨＬＡはノックアウトされ得る。例えば、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、またはその両方は、キラー／食細胞阻害剤の共発現とともにノックアウトされ得る。キラー／食細胞阻害剤は、操作された免疫細胞に対する免疫反応を抑制する場合がある。キラー／食細胞阻害剤は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＦＡＳＬ、ＰＤＬ１、またはそれらの機能的ドメインを含むが、これらに限定されない。

【0101】

[00173]本明細書に記載の疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原であり得る。第１の抗原結合性ドメインまたは第２の抗原結合性ドメインは、抗体またはその断片であり得、例えば、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体であり得る。

【0102】

[00174]操作された免疫細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子は不活性化されていることがあり、内因性表面マーカーは、発現されたときに第１の抗原結合性ドメインに結合することができる。内因性表面マーカーは、ＣＡＲが標的とする抗原であり得る。様々な実施形態では、操作された免疫細胞のＣＡＲが、操作された免疫細胞によって内因性に発現される抗原を標的とする場合、内因性抗原またはそのような抗原をコードする遺伝子は、不活性化（例えば、破壊、阻害、サイレンシングまたはノックアウト）されていてもよい。本明細書に記載の様々な遺伝子編集法が使用され得る。内因性表面マーカーは、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＳＬＡＭＦ７であり得る。

【0103】

[00175]本明細書で提供される操作された免疫細胞は、（ｉ）操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分および（ｉｉ）誘導性細胞死部分を含むキメラポリペプチドであって、誘導性細胞死部分が、キメラポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると操作された免疫細胞の死を生じさせることができ、エンハンサー部分が、誘導性細胞死部分に連結されている、キメラポリペプチドを含むことができる。場合によって、エンハンサー部分と誘導性部分がリンカーによって連結されていてもよい。リンカーは、例えば、自己切断性ペプチドなどの切断可能なリンカーであり得る。操作された免疫細胞は、結合部分を含む１つまたは複数のキメラポリペプチド受容体（ＣＰＲ）であって、結合部分が、（ｉ）対象に投与されたときに操作された免疫細胞に対する対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含む、１つまたは複数のキメラポリペプチド受容体（ＣＰＲ）をさらに含むことができる。１つまたは複数のＣＰＲの個々のＣＰＲは、（ｉ）第１の抗原結合性ドメイン、（ｉｉ）第２の抗原結合性ドメイン、または（ｉｉｉ）第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインの両方を含むことができる。１つまたは複数のＣＰＲのＣＰＲは、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。場合によって、操作された免疫細胞の１つまたは複数のＣＰＲは、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。場合によって、操作された免疫細胞は、ＣＡＲおよび操作されたＴＣＲの両方を含む。操作されたＴＣＲは、ＴＣＲ融合タンパク質であり得る。例えば、ＴＣＲ融合タンパク質は、ＴＣＲ複合体の１つまたは複数のサブユニットに融合された異種抗原結合性ドメインを含むことができる。場合によって、ＴＣＲ融合タンパク質は、ＴＣＲ細胞外ドメインおよびＴＣＲ細胞内ドメインの少なくとも一部を含むＴＣＲサブユニット、ならびに抗原結合性ドメインを含む抗体ドメインを含むことができ、ＴＣＲサブユニットおよび抗体ドメインは連結されている。ＴＣＲ融合タンパク質は、Ｔ細胞で発現させると、ＴＣＲ複合体に組み込むことができる。場合によって、ＴＣＲ融合タンパク質は、ＴＣＲ膜貫通ドメインをさらに含むことができる。ＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ細胞内ドメイン、またはＴＣＲ膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３ζに由来することができる。場合によって、操作されたＴＣＲを含む操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲは不活性化される。場合によって、不活性化された内因性ＴＣＲを含む操作された免疫細胞は、ＧＶＨＤを引き起こさない場合がある。例えば、内因性ＴＣＲサブユニットをコードする遺伝子は不活性化され得る。別の例として、内因性ＴＣＲサブユニットをコードする遺伝子は、内因性ＴＣＲが形成されないように変異していてもよい。

【0104】

[00176]本明細書で提供される操作された免疫細胞は、（ｉ）操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分および（ｉｉ）誘導性細胞死部分を含むキメラポリペプチドであって、誘導性細胞死部分が、キメラポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると操作された免疫細胞の死を生じさせることができる、キメラポリペプチドを含むことができる。場合によっては、エンハンサー部分は、誘導性細胞死部分に連結されている。１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、結合部分を含むことができる。結合部分は、（ｉ）対象に投与されたときに操作された免疫細胞に対する対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含むことができる。場合によって、１つまたは複数のＣＡＲの個々のＣＡＲは、（ｉ）第１の抗原結合性ドメインまたは（ｉｉ）第２の抗原結合性ドメインを含む。場合によって、１つまたは複数のＣＡＲの個々のＣＡＲは、第１抗原結合性ドメインおよび第２抗原結合性ドメインの両方を含む。場合によって、１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。

【0105】

[00177]操作された免疫細胞の第１抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原に結合することができる。場合によって、操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化される。様々な方法を用いて、内因性ＴＣＲを不活性化することができる。例えば、内因性ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子は、内因性ＴＣＲが不活性化されるように不活性化され得る。サブユニットをコードする遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζであり得る。

【0106】

[00178]キメラポリペプチドは、エンハンサー部分および誘導性細胞死部分が隣接する任意の自己切断性ペプチドを含んでいてもいなくてもよい。エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成され得る。エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成され得る。１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路であり得る。エンハンサー部分は、自己オリゴマー化によって自己活性化性であり得る。エンハンサー部分は、自己二量体化によって自己活性化性であり得る。

【0107】

[00179]本明細書に記載のキメラポリペプチドは、分泌タンパク質であり得る。キメラポリペプチドは、細胞内タンパク質であり得る。キメラポリペプチドは、膜貫通タンパク質であり得る。エンハンサー部分または誘導性細胞死部分は、膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれ得る。エンハンサー部分または誘導性細胞死部分は、膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれる。エンハンサー部分は膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれ、ならびに誘導性細胞死部分は膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれ得る。エンハンサー部分は膜貫通タンパク質のエクトドメインに含まれ、ならびに誘導性細胞死部分は膜貫通タンパク質のエンドドメインに含まれ得る。エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体であり得る。例えば、エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択され得る。場合によって、誘導性細胞死部分はＥＧＦＲｔであり、ならびに細胞死アクティベーターはＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合断片である。場合によって、誘導性細胞死部分はＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに細胞死アクティベーターはＧＣＶである。場合によって、誘導性細胞死部分はｉＣａｓｐ９であり、ならびに細胞死アクティベーターはＡＰ１９０３である。細胞死アクティベーターは、核酸、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、酵素、リボゾーム、プロテアソーム、それらのバリアント、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。

【0108】

[00180]操作された免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞マーカーおよびＣＤ３を標的とするＣＡＲを発現することができる。内因性ＣＤ３遺伝子の発現は、ＣＡＲ－Ｔ細胞においてサイレンシングされ得る。ＣＡＲは、腫瘍細胞マーカーおよびＣＤ３を標的とする単一ＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、腫瘍細胞マーカーを標的とする第１のＣＡＲと、ＣＤ３を標的とする第２のＣＡＲとを含むことができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、以下の特性の１つまたは複数を有することができる：（ａ）ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＰＤ－１遺伝子の発現がサイレンシングされている；（ｂ）ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＴＣＲ遺伝子の発現がサイレンシングされている；（ｃ）ＣＡＲ－Ｔ細胞が外因性の細胞自殺エレメント（例えば、誘導性細胞死部分）を発現している。

【0109】

[00181]操作された免疫細胞は、ＣＡＲおよび／または外因性ＴＣＲを発現することができ、ＣＡＲおよび／または外因性ＴＣＲは、腫瘍細胞マーカーを標的とする。操作された免疫細胞は、増強されたサイトカイン関連シグナル伝達経路を含むことができる。サイトカイン関連シグナル伝達経路は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、またはそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインの関連シグナル伝達経路を含むことができる。サイトカイン関連シグナル伝達経路を増強することは、サイトカインおよび／またはその受容体をコードする遺伝子を導入すること、サイトカインおよび／またはその受容体をコードする遺伝子を上方調節すること、またはサイトカイン、導入されたサイトカインの受容体、またはそれらの組合せを外因的に添加することを含むことができる。操作された免疫細胞は、（ａ）内因性ＴＣＲの遺伝子発現がサイレンシングされていること、（ｂ）細胞自殺のためのエレメントを発現していること、（ｃ）内因性ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ遺伝子が正常に発現していること、（ｄ）内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇが正常に発現または過剰発現していること、からなる群から選択される１つまたは複数の特性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。

【0110】

[00182]操作された免疫細胞は、腫瘍細胞マーカーを標的とするＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを含むことができる。操作された免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を標的とする物質を含むことができる。例えば、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を標的とするＣＡＲを含むことができる。操作された免疫細胞は、（ｉ）腫瘍細胞マーカーと、（ｉｉ）Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞マーカーの両方を標的とする二重特異性ＣＡＲを含むことができる。場合によって、物質は抗体である。Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を標的とする抗体は、Ｈ－６９、３Ａ１ｅ、３Ａ１ｆ、Ｔ３－３Ａ１、ＲＦＴ２、ＳＤＺ２１４－３８０（ＳＤＺＣＨＨ３８０）、ＣＤ７－６Ｂ７、１２４－１Ｄ１、４Ｈ９、ＲＰＡ－２．１０、ＴＳ１／８、ＯＫＴ１１、ＡＢ７５、３Ｅ１１、ＢＨ１、またはＬｏ－ＣＤ２ａであり得る。

【0111】

[00183]本明細書で提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、普遍的なＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞マーカーを標的とするキメラ抗原受容体ＣＡＲを発現することができ、Ｔ細胞受容体のＰＤ－１への結合が阻害される。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞マーカーと、ＣＤ２またはＣＤ７のような免疫細胞マーカーを標的とすることができる。本明細書で提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ＴＣＲの発現は、遺伝子編集技術によってノックアウトされ得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞の内因性ＴＣＲをノックアウトすると、同種異系注入の過程で正常な細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞に認識されず、殺されない場合がある。ＧＶＨＤ反応は抑制される場合がある。さらに、ＣＤ１９を介して腫瘍細胞を標的としつつ、ＣＤ２またはＣＤ７を介して宿主のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を消失させることで、宿主対移植片（ＨＶＧ）および／またはＮＫの殺傷を回避し、レシピエントにおける同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率および抗腫瘍効果を改善することができる。ＣＡＲ－Ｔは、自殺遺伝子スイッチ（例えば、誘導性細胞死部分）をさらに含むことができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の副作用を軽減するために、自殺遺伝子スイッチをオンにする（例えば、誘導性細胞死部分へのアクティベーターの結合）ことによって、不活性化または除去され得る。例えば、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ７ ｓｃＦｖ－Ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ２８／４１ＢＢ－ＣＤ３ζの構造を有することができ、ＣＤ７ ｓｃＦｖ断片はモノクローナル３Ａ１ｅ抗体であり、重鎖可変領域および軽鎖可変領域はＧＳリンカーによって結合され、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ断片はＧＳリンカーによって連結されたモノクローナルＦＭＣ６３抗体の重鎖および軽鎖可変領域である。また、ＣＡＲは、タンデムに並んだヒンジ領域と膜貫通領域、ヒトＣＤ２８および／または４１ＢＢの細胞内共刺激エレメント、ならびにヒトＣＤ３の細胞内ドメインを含むことができる。本開示の場合によっては、ＣＡＲ構築物ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ７ ｓｃＦｖ－Ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ２８／４１ＢＢ－ＣＤ３ζの遺伝子断片は、レンチウイルスベクターに挿入され、組換えベクターは２９３Ｔ細胞のウイルス粒子にパッケージされ得る。普遍的ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するために、Ｔ細胞は末梢血単核細胞から単離され、活性化後、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術のような遺伝子編集技術により、いくつかの内因性遺伝子（例えば、ＣＤ７、ＴＣＲおよびＰＤ－１遺伝子）はノックアウトされ得る。次に、Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲ構築物を含むウイルス粒子によって感染され、ＣＡＲを発現することができる。調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによってＣＡＲの感染効率および遺伝子編集効率を検出するために使用することができる。

【0112】

[00184]操作された免疫細胞は、本明細書に記載される以下の１つまたは複数の特性を有していてもよい：（ａ）操作された免疫細胞の内因性ＣＤ７遺伝子またはＣＤ２遺伝子の発現がサイレンシングされている；（ｂ）操作された免疫細胞のＰＤ－１遺伝子の発現がサイレンシングされている；（ｃ）操作された免疫細胞のＴＣＲ遺伝子の発現がサイレンシングされている；（ｄ）操作された免疫細胞がサイトカインまたはサイトカイン受容体複合体を発現し、ｐＳＴＡＴ５シグナル伝達レベルが上方調節されている；（ｅ）操作された免疫細胞が外因性誘導性細胞死部分を発現する；（ｆ）操作された免疫細胞における第１のＣＡＲ、および／または第２のＣＡＲが、誘導性細胞死部分と共発現する。

【0113】

[00185]操作された免疫細胞は、２つの異なるＣＡＲを含んでいてもよく、それぞれが異なる抗原を標的とする異なる抗原結合性ドメインを有する。操作された免疫細胞は、単一のＣＡＲを含んでいてもよく、それが２つの異なる抗原を標的とする２つの抗原結合性ドメインをさらに含む。場合によって、第１のＣＡＲ、および／または第２のＣＡＲは、自己切断エレメントによって誘導性細胞死部分および／またはエンハンサー部分に連結されている。場合によって、エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン複合体である。サイトカインまたはサイトカイン複合体の例としては、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、膜結合ＩＬ１５（ｍｂＩＬ１５またはｍｂ１５）、およびＩＬ７受容体（Ｃ７Ｒ）のような構成的活性化サイトカイン受容体が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ｍｂＩＬ」および「ｍｂ」は、膜結合インターロイキン因子、例えば、ｍｂＩＬ７またはｍｂ７、およびｍｂＩＬ１７またはｍｂ１７を表すために同じ意味で使用される。

【0114】

[00186]本明細書に記載の操作された免疫細胞は、以下の特性を有していてもよい：（ａ）操作された免疫細胞は、ＣＡＲおよび／または外因性ＴＣＲを発現し、ＣＡＲおよび／または外因性ＴＣＲは、腫瘍細胞マーカーを標的とする；（ｂ）サイトカイン関連シグナル伝達経路が増強されている。操作された免疫細胞は、（ｉ）キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）；（ｉｉ）キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）；または（ｉｉｉ）外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）であってもよい。操作された免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、好ましくは普遍的ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＵＣＡＲ－Ｔ細胞）であり得る。本明細書で使用される場合、「サイトカイン関連シグナル伝達経路」とは、サイトカインが対応する受容体に結合することによって開始されるシグナル伝達経路を表し、細胞外シグナルを細胞内シグナルに変換し、シグナル伝達カスケードによって増幅、分散、および制御される。一連の細胞応答が生成され得る。場合によって、サイトカイン関連シグナル伝達経路は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、２５、またはそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインの関連シグナル伝達経路を含む。

【0115】

[00187]操作された免疫細胞は、二重特異性ＣＡＲ（または二重ＣＡＲ）を含むことができる。例えば、二重特異性ＣＡＲは、第１の抗原結合性ドメインと第２の抗原結合性ドメインの両方を含むことができる。第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインは、リンカーを介して連結され得る。リンカーは、自己切断性ペプチドを含んでいなくてもよい。第１の抗原結合性ドメインまたは第２の抗原結合は、ｓｃＦｖであり得る。

【0116】

[00188]第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインは、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２、（ｉｉ）ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２、（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１、または（ｉｖ）ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１として配置されることが可能であり、ＶＨ１は、第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。

【0117】

[00189]第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインは、アミノ酸末端からカルボキシル末端へと、（ｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１、（ｉｉ）ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１、（ｉｉｉ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２、または（ｉｖ）ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ１として配置されることが可能であり、ＶＨ１は、第１の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は、第１の抗原結合性ドメインの軽鎖可変軽鎖ドメインであり、ＶＨ２は、第２の抗原結合性ドメインの重鎖可変ドメインであり、ならびにＶＬ２は、第２の抗原結合性ドメインの軽鎖可変ドメインである。第１の抗原結合性ドメインおよび第２抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原および疾患関連抗原に結合することができる。

【0118】

[00190]場合によって、操作された免疫細胞は、二重特異性ＣＡＲを含んでいなくてもよい。例えば、操作された免疫細胞の個々のＣＡＲは、第１の抗原結合性ドメインのみを含み、操作された免疫細胞の別の個々のＣＡＲは、第２の抗原結合性ドメインのみを含むことができる。

【0119】

[00191]免疫細胞抗原は、免疫細胞の表面タンパク質または分泌タンパク質であり得る。免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージまたは顆粒球であり得る。免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７からなる群から選択され得る。

【0120】

[00192]疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原であり得る。腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９または本明細書に記載の他の抗原であり得る。場合によって、第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７およびＣＤ１３７からなる群から選択される免疫細胞抗原に結合することができ、ならびに第２抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合することができる。場合によって、第１の抗原結合性ドメインはＣＤ３に結合することができ、ならびに第２の抗原結合性ドメインはＣＤ１９に結合することができる。場合によって、第１の抗原結合性ドメインはＣＤ７に結合することができ、ならびに第２の抗原結合性ドメインはＣＤ１９に結合することができる。場合によって、第１の抗原結合性ドメインはＣＤ１３７に結合することができ、ならびに第２の抗原結合性ドメインはＣＤ１９に結合することができる。操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現は、元のままであり得る。操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現は、元のままであり得る。操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は、元のままであり得る。操作された免疫細胞の１つまたは複数の内因性ＨＬＡ遺伝子の発現は、上方調節され得る。操作された免疫細胞の内因性ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の発現は上方調節され得る。

【0121】

[00193]様々な実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞である。場合によって、操作された免疫細胞は、幹細胞に由来する。幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。

【0122】

[00194]本明細書で提供される細胞（例えば、操作された免疫細胞）は、結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができ、結合部分は、免疫細胞抗原に結合することができる抗原結合性ドメインを含むことができる。１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。細胞は、細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分をさらに含むことができ、ここで、細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が不活性化されてもよい。

【0123】

[00195]エンハンサー部分は、細胞の１つまたは複数の活性を高めることができる。エンハンサー部分は、細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成され得る。エンハンサー部分は、細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成され得る。例えば、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路であり得る。エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体であり得る。エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0124】

[00196]細胞は、細胞死アクティベーターと接触すると細胞の死を生じさせることができる誘導性細胞死部分をさらに含むことができる。誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択され得る。例えば、誘導性細胞死部分はＥＧＦＲｔであり、ならびに細胞死アクティベーターはＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合断片であり得る。別の例では、誘導性細胞死部分はＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに細胞死アクティベーターはＧＣＶであり得る。別の例では、誘導性細胞死部分はｉＣａｓｐ９であり、ならびに細胞死アクティベーターはＡＰ１９０３であり得る。

【0125】

[00197]内因性表面マーカーが、発現されたときに第１の抗原結合性ドメインに結合することができる可能性がある場合、細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子を不活性化してもよい。内因性表面マーカーは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２，ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβまたはＳＬＡＭＦ７、であり得る。

【0126】

抗原結合性ドメイン
[00198]操作された免疫細胞は、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインを含むことができる。場合によって、操作された免疫細胞の単一または個々のＣＡＲは、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインの両方を含む。場合によって、操作された免疫細胞の２つのＣＡＲは、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインを含み、各ＣＡＲは１つの抗原結合性ドメインのみを含む。場合によって、２つの操作された免疫細胞は、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインを含み、操作された免疫細胞の各々は１つのタイプの抗原結合性ドメインのみを含む。場合によって、第１抗原結合性ドメインは免疫細胞抗原を標的とし、ならびに第２抗原結合性ドメインは疾患関連抗原を標的とすることができる。抗原結合性ドメインは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、ダルピン（ｄａｒｐｉｎ）、または抗原結合特異性を有する他のポリペプチドであり得る。

【0127】

[00199]抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原を標的とすることができる。免疫細胞抗原の例としては、これらに限定されないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００，ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβおよびＳＬＡＭＦ７が挙げられる。場合によって、免疫細胞抗原は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方に発現する細胞マーカーであり、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１６１、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃおよびＣＤ３１４を含むがこれに限定されるものではない。

【0128】

[00200]ＣＤ３はＴリンパ球の表面に存在するマーカーである。ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γの３つのサブタイプがある。ＣＤ３δおよびＣＤ３εは分子量２０ｋＤａ、ＣＤ３γは分子量２６ｋＤａであり、Ｔリンパ球、胸腺細胞、ＮＫ細胞の膜の表面に発現する。ＣＤ３は、正常な末梢血リンパ球の６１％～８５％、胸腺細胞の６０％～８５％に発現され得る。ＣＤ３は免疫グロブリンスーパーファミリーに属している。ＣＤ３は、Ｔリンパ球受容体（ＴＣＲ）複合体の構成要素であり、α－βおよびγ／δＴリンパ球受容体（ＴＣＲ）と複合体を形成し、ＴＣＲがペプチド／ＭＨＣに結合した際にＴＣＲのシグナルを伝導するための主要な膜タンパク質となり得る。ＴＣＲは、細胞表面での発現、抗原認識、シグナル伝達に不可欠である。ＣＤ３は、Ｔリンパ球の表面特異的な分子であり、これを介して殺傷作用のあるＴリンパ球が漸加され得る。ＣＤ３に対するモノクローナル抗体は、Ｔリンパ球の活性化を誘導または阻止することができる。抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ２８抗体またはＩＬ－２の存在下で、Ｔリンパ球のアポトーシスを誘導する。ＣＤ３は、末梢血中の成熟Ｔリンパ球のマーカーの１つである。免疫不全（Ｔリンパ球欠損症）、白血病、リンパ腫（Ｔリンパ球型）の分類診断の評価のためのＣＤ３＋Ｔリンパ球の測定。抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、臓器移植や骨髄移植における免疫抑制療法に使用可能であり、重度の自己免疫疾患におけるＴリンパ球を除去する免疫調節療法にも使用され得る。

【0129】

[00201]場合によって、抗原結合性ドメインは、ＣＤ７を標的とすることができる。ＣＤ７は、膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ７タンパク質は、成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞、ならびにそれらの前駆細胞の表面に発現している。ＣＤ７は、そのリガンドであるＫ１２／ＳＥＣＴＭ１と結合し、Ｔ細胞の活性化における共刺激エフェクターとして機能する。マウスでは、ＣＤ７をノックアウトしたＴ細胞前駆体は、Ｔ細胞のエフェクター機能にわずかな影響を与えるだけで、正常なＴ細胞に成長することができる。また、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）の９０％以上がＣＤ７を発現できることから、ＣＤ７はＴ－ＡＬＬのマーカーとなり得る。さらに、ＣＤ７は、ＮＫリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫／白血病、慢性骨髄性白血病、急性ミエロイド白血病、およびリンパ球リッチ胸腺腫でも発現され得る。ＣＤ７発現の組織分布の例を図１３に示す。

【0130】

[00202]場合によって、抗原結合性ドメインは、ＣＤ２を標的とすることができる。ＣＤ７と同様に、ＣＤ２接着分子は、すべての末梢血Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞に発現している可能性があるが、Ｂリンパ球には発現していない。ＣＤ２の細胞外ドメインには、ホモ二量体化を媒介する免疫グロブリン様ドメインが含まれている。ＣＤ２がＣＤ５８（ＬＦＡ－３）またはＣＤ４８と結合することで、Ｔ細胞が抗原提示細胞に接着し、抗原結合のためのＴ細胞受容体のシグナル伝達が誘発されることを助けることができる。ＣＤ２の機能は、他のＴ細胞共刺激受容体（ＣＤ２８など）と同様である可能性がある。ＣＤ２のノックアウトマウスは、正常な免疫機能を持つことができる。Ｔ－ＡＬＬ、Ｔ細胞リンパ腫／白血病、急性前骨髄球性白血病（微小粒子バリアント）、全身性肥満細胞症、肥満細胞疾患、胸腺腫、ならびに急性ミエロイドリンパ腫およびＮＫ細胞白血病の細胞におけるＣＤ２の発現。ＣＤ２発現の組織分布の例を図１４に示す。

【0131】

[00203]抗原結合性ドメインは、ＣＤ１３７を標的とすることができる。ＣＤ１３７は、４－１ＢＢとしても知られており、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ１３７タンパク質は、活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、顆粒細胞、および他の免疫細胞タイプ、ならびにある種の腫瘍細胞において広く発現され得る、活性化誘導型の共刺激受容体であり得る。ＣＤ１３７の発現は、活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞に見られ、ナイーブＴ細胞や不活性化されたＴ細胞やＮＫ細胞にはほとんど見られなかった。Ｔ細胞において、ＣＤ１３７は、ＴＲＡＦ２を介してＮＦ－κＢ経路を開始し、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの分泌、抗アポトーシスに関与する。臨床的用途では、ＣＤ１３７は反応性Ｔ細胞のマーカーとして使用され得る。ＣＤ１３７の天然リガンドまたはアゴニスト抗体を用いてＣＤ１３７のシグナル伝達経路を活性化すると、サイトカインの分泌が増加し、細胞傷害性リンパ球の抗腫瘍活性が高まり得る。特異的な阻害性ＣＤ１３７抗体を用いて反応性Ｔ細胞を阻害することにより、移植拒絶における自己拒絶を軽減すること、または同種異系起源の自己反応性Ｔ細胞に起因するＧＶＨＤ反応を軽減することができる。ＣＤ１３７の発現は、ＴＣＲシグナル伝達とサイトカインＩＬ－２／ＩＬ－１５の下流シグナル伝達によって制御され得る。ＣＤ１３７分子をノックアウトしても、非活性化状態の成熟Ｔ細胞の機能には影響しない場合がある。操作された免疫細胞の内因性ＣＤ１３７をノックアウトすることで、兄弟殺しを回避することができる。ＧＶＨＤを防ぐために、操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲは不活性化され得る。ＣＤ１３７発現の組織分布の例を図５１に示す。

【0132】

[00204]抗原結合性ドメインは、疾患関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原を標的とすることができる。腫瘍関連抗原の例としては、これらに限定されないが、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ｃｄ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３；ＰＭＳＡ、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３ ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＤ１５１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、メソセリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＴＣＲａ、ＴＣＲｐ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ＣＤ７９ｂ、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、およびノッチ－１－４が挙げられる。場合によって、腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ，ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ，ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイス、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲｌ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ノッチ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸塩受容体α、葉酸塩受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－ＲまたはＴＲＯＰ－２を含む。

【0133】

[00205]場合によって、腫瘍関連抗原はＣＤ１９である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞の表面に存在する９５ｋＤａの糖タンパク質で、Ｂ細胞の発生初期から形質細胞に分化するまでの間に発現を開始する。ＣＤ１９は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞表面シグナル伝達複合体の構成要素の一つとして、Ｂ細胞受容体のシグナル伝達過程の制御に関与している。ＣＤ１９欠損マウスモデルでは、末梢リンパ組織中のＢ細胞数が著しく減少し、ワクチンやマイトジェンに対する反応も低下し、血清Ｉｇ値の低下を伴うことがある。一般に、ＣＤ１９の発現はＢ細胞系統に限定され、多能性造血幹細胞の表面には発現しないと考えられ得る。また、ＣＤ１９は、ほとんどのＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ヘアリーセル白血病、および一部の急性ミエロイド白血病細胞の表面に発現することができる。ＣＤ１９は、白血病／リンパ腫の治療における免疫療法の標的となり得る。ＣＤ１９は、多能性造血幹細胞を含む、Ｂ細胞以外のほとんどの正常な細胞表面には発現しない場合がある。この特徴により、ＣＤ１９は、不可逆的な骨髄毒性損傷のリスクを最小限に抑えることができるため、自己免疫疾患の安全な治療標的となり得る。

【0134】

[00206]本明細書で提供される抗原結合性ドメインは、Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｈとして示される構造を有することができ、Ｖ_Ｈは抗体の重鎖可変領域であり、Ｖ_Ｌは抗体の軽鎖可変領域であり、「－」はリンカーペプチド（または可動性リンカー）またはペプチド結合である。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、腫瘍関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９を標的とする抗原結合性ドメインは、モノクローナルＦＭＣ６３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、リンカーペプチドまたは可動性リンカーの配列は、２～６個、好ましくは３～４個の連続した（ＧＧＧＧＳ）アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｖ_Ｌ１のアミノ酸配列は、配列番号８７に示されている通りであり、Ｖ_Ｈ１のアミノ酸配列は、配列番号８８に示されている。ＣＤ１９を標的とするＣＡＲのアミノ酸配列の例は、配列番号８９に示されている。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、免疫細胞抗原を標的とする。一部の実施形態では、免疫細胞抗原は、ＣＤ７を標的とする。一部の他の実施形態では、免疫細胞抗原は、ＣＤ２を標的とする。一部の実施形態では、ＣＤ７のモノクローナル抗体は、ＴＨ－６９、３Ａ１ｅ、３Ａ１ｆ、Ｔ３－３Ａ１、ＲＦＴ２、ＣＤ７－６Ｂ７、１２４－１Ｄ１、４Ｈ９、ＳＤＺ２１４－３８０、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の他の実施形態では、ＣＤ２に対するモノクローナル抗体は、ＲＰＡ－２．１０、ＴＳ１／８、ＯＫＴ１１、ＡＢ７５、３Ｅ１１、ＢＨ１、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は、配列番号９０に示されている通りであり、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は、配列番号９１に示されている。

【0135】

エンハンサー部分
[00207]本明細書で提供される操作された免疫細胞は、エンハンサー部分を含むことができる。エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を制御することができ、例えば、１つまたは複数のシグナル伝達経路を増強または上方調節して、操作された免疫細胞のエフェクター機能を増強または上方調節することができる。シグナル伝達経路は、サイトカイン関連シグナル伝達経路であり得る。エンハンサー部分は、サイトカインであり得る。エンハンサー部分は、サイトカイン受容体であり得る。

【0136】

[00208]サイトカイン関連シグナル伝達経路は、サイトカインの関連シグナル伝達経路を含むことができる。サイトカインの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ２５が挙げられるが、これらに限定されない。場合によって、サイトカイン関連シグナル伝達経路は、２つ以上のサイトカインの関連シグナル伝達経路を含み、サイトカインは、ＩＬ－２およびＩＬ－７、ＩＬ－２およびＩＬ－１５、ＩＬ－７およびＩＬ－１５、ＩＬ１５およびＩＬ２１を含む。細胞応答は、下流の遺伝子発現の制御、細胞内酵素活性の変化、細胞骨格構造の変化、ＤＮＡ合成の変化、遺伝子転写の促進、免疫細胞の分化、増殖の調節、および細胞死への抵抗性を含む。場合によって、サイトカイン関連シグナル伝達経路は、サイトカインおよび／またはその受容体をコードする遺伝子を導入または上方調節すること、サイトカインを外因的に添加すること、サイトカイン受容体に導入されること、またはそれらの組合せを含み、増強される。場合によって、サイトカインおよび／またはその受容体をコードする遺伝子を上方調節することは、コードする遺伝子の転写および／または翻訳のレベルを上方調節することを含む。場合によって、増強されたサイトカイン関連シグナル伝達経路は、以下の方法、免疫細胞内でサイトカインおよび／またはその受容体をコードする遺伝子を発現させること、免疫細胞内でサイトカインおよび／またはその受容体をコードする遺伝子のコピー数を増加させること、コードする遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター）を操作して転写速度（例えば、転写開始速度）を向上させること、コードされた遺伝子を有するメッセンジャーＲＮＡの翻訳制御領域を改変して翻訳強度を向上させること、コードされた遺伝子自体を改変してｍＲＮＡの安定性、タンパク質の安定性を向上させ、タンパク質のフィードバック阻害を解除すること、の１つまたは複数によって達成することができる。

【0137】

[00209]サイトカイン関連シグナル伝達経路は、サイトカインおよびその受容体の膜発現、サイトカインの分泌、サイトカインおよび／またはその受容体の転写制御の増強、またはそれらの組合せによって増強され得る。膜発現されたサイトカインおよびその受容体には、ＩＬ－１５およびその受容体（例えば、ｍｂＩＬ１５融合タンパク質）、ＩＬ－７およびその受容体（例えば、ｍｂＩＬ７融合タンパク質）、ＩＬ－１７およびその受容体（例えば、ｍｂＩＬ１７融合タンパク質）、ＩＬ－２およびその受容体（例えば、ｍｂＩＬ２融合タンパク質）、ＩＬ－２１およびその受容体（例えば、ｍｂＩＬ２１融合タンパク質）、活性化されたＩＬ－７受容体（Ｃ７Ｒ）を構成するもの、またはそれらの組合せを含むことができる。場合によって、操作された免疫細胞に含まれるエンハンサー部分は、分泌性サイトカインである。分泌性サイトカインは、様々なメカニズムで機能することができ、例えば、分泌性サイトカインは、ｔｒａｎｓ活性化因子またはｃｉｓ活性化因子であり得る。分泌性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、またはそれらの組合せを含むことができる。場合によって、エンハンサーは、ｍｂＩＬ１５、ｍｂＩＬ７、ｍｂＩＬ２１およびｍｂＩＬ２のような膜結合タンパク質である。場合によって、エンハンサー部分は、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３のような構成的に活性なサイトカイン受容体下流シグナル伝達タンパク質である。場合によって、エンハンサー部分は、構成的に活性なＩＬ－７受容体（Ｃ７Ｒ）またはその誘導体のような構成的に活性なサイトカイン受容体である。例えば、構成的に活性なサイトカイン受容体は、Ｃ７Ｒのエクトドメインが安全スイッチで置換された操作されたタンパク質（例えば、本開示では「Ｅ３」と呼ばれる）、例えば、ＥＧＦＲｔまたはヒト上皮増殖因子受容体２の短縮型（Ｈｅｒ２ｔ；米国特許出願公開第２０１７０２６７７４２（Ａ１）号を参照）、または本開示に記載される他のペプチドであり得る。別の例として、構成的に活性なサイトカイン受容体は、Ｃ７Ｒのエクトドメインが免疫細胞阻害剤で置換された操作されたタンパク質（例えば、本開示では「Ｅ４」と呼ばれる）、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ２４、またはキラーもしくは食細胞免疫細胞の機能を阻害して治療細胞（例えば、本明細書に記載の操作された免疫細胞）を保護する他のペプチドであり得る。場合によって、サイトカインは、ＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９のようなケモカインであり得る。使用することができるケモカインの他の非限定的な例としては、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬｌｌ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２３、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、およびＣＸＣＬ７が挙げられる。場合によって、エンハンサー部分はＣＣＲ７のリガンドであり、これはＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞の浸潤を促進するように機能することができる。ＣＣＲ７のリガンドは、ＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９を含むがこれに限定されるものではない。場合によって、エンハンサー部分は、リンパ腫または他の固形腫瘍を治療するための治療用途のために、ケモカインＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９の共発現を含む。

【0138】

[00210]状況によって、操作された免疫細胞は液性腫瘍を治療するための治療剤として使用され、そのような状況では、エンハンサー部分は、本明細書に記載されているような任意の形態の任意のサイトカインを含むことができる。状況によって、操作された免疫細胞は固形腫瘍を治療するための治療剤として使用され、そのような状況では、エンハンサー部分は、任意の形態の任意のサイトカインを含み、さらに１つまたは複数のケモカインを含むことができる。

【0139】

[00211]場合によって、ＩＬ－２とＩＬ－７、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－７とＩＬ－１５、およびＩＬ１５とＩＬ２１を含む、２つのサイトカインを使用して、操作された免疫細胞のサイトカイン関連シグナル伝達経路を増強する場合がある。サイトカイン関連シグナル伝達経路の増強は、ｍｂＩＬ融合タンパク質、構成的に活性なＩＬ－７受容体（Ｃ７Ｒ）、インターロイキン、またはそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドの発現を含むことができる。

【0140】

[00212]本明細書に記載のエンハンサー部分は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）またはＩＬ－１５受容体であり得る。ＩＬ－１５は、１１４個のアミノ酸からなる１４～１５ｋＤｓの糖タンパク質であり、４ヘリックスバンドルサイトカインのファミリーに属している。ＩＬ－１５は、インターロイキン２（ＩＬ－２）と構造的に相同性がある。ＩＬ－１５受容体は、高親和性のＩＬ－１５受容体α鎖、ＩＬ２／１５受容体β鎖、および共通のγ鎖を含む。したがって、ＩＬ－１５は、Ｔ細胞の活性化や増殖を促したり、ＮＫ細胞の殺細胞活性を高めたり、Ｂ細胞の免疫グロブリン産生を促進するなど、ＩＬ－２と同様の機能を持つ可能性がある。最近の研究では、ＩＬ－１５が、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、腸管上皮細胞の分化、増殖、活性化に関与している可能性があることがわかってきた。ＩＬ－１５とＩＬ－１７は、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の制御に役割を果たしている可能性がある。また、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５α鎖受容体を発現する細胞が、ＩＬ－１５β鎖と共通のガンマ鎖を発現する細胞にＩＬ－１５を提示するというメカニズムにより、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の増殖やＮＫ細胞の生存サイクルを制御することができることを研究が示している。また、ＩＬ－１５は、骨格筋の同化の制御など、非免疫系においても役割を果たしている可能性がある。本明細書に記載のエンハンサー部分は、インターロイキン７（ＩＬ－７）であり得る。ＩＬ－７は、プレＢ細胞、プロＢ細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞の成長を促進することができる。また、Ｂ細胞およびＴ細胞の成長および抗アポトーシスを促進することができる。ＩＬ－７は、胸腺の初期分化と増殖、樹状細胞の発生と分化に役割を果たすことができる。しかし、ＩＬ－７は、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の殺活性を高める効果はない可能性がある。まず胸腺から末梢血に移行し、次いで胸腺細胞または末梢血リンパ球にリンホカインの産生を誘導し、ＬＡＫ細胞のリンホカイン活性化キラー細胞活性を活性化し、高めることができる。ＣＤ８＋部分集団は、ＩＬ－７の主なエフェクター細胞であり、ＩＬ－７はメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖と生存を支持することができる。ＩＬ－７は骨髄組織の生成を促進することができる。ＩＬ－７は、ミエロイド前駆細胞および巨核球を刺激してコロニー形成単位および血小板を産生するだけでなく、シクロホスファミドによる免疫抑制から身体を回復させることができる。また、高濃度では、マクロファージを増強する細胞傷害性を誘導し、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞、活性化単球の産生の相乗因子として機能し、単球－マクロファージに各種サイトカインを分泌させ、マクロファージ炎症性タンパク質α（ＭＩＰ－α）、ＭＩＰ－β、ＩＬ－８、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）等の炎症性因子の発現を促進することができる。炎症細胞が産生する多数の炎症性因子を活性化することで、ＩＬ－７は、炎症プロセスの構成要素間の相互作用を制御できるだけでなく、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５のような炎症性サイトカイン受容体（ＣＣＲ）を増強することができる。さらに、ＩＬ－７は免疫反応の誘導に役割を果たすことができる。ＩＬ－７は、タイプＩの免疫反応を誘導し、ＩＦＮ－γおよびＩＬ２の産生を増加させることができる。ＩＬ－７はＩＬ１２と相乗効果を発揮してＩＦＮ－γおよびＴ細胞の増殖を誘導する。ＩＬ－７および形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）は、調節的な役割を果たし、免疫調節メカニズムの一部となり得る。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の免疫再構成を促進するだけでなく、Ｔ細胞周期およびＢＣＬ－２発現の上方調節を誘導することができ、循環するＴ細胞受容体プールの多様性と持続性を広げ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させる。さらに、ＨＩＶ抗原に対しては、増殖したＴ細胞はＩＬ２およびＩＦＮ－γを分泌することもでき、良好な抗ウイルス機能を有する。したがって、ＩＬ－７は、ＨＩＶ特異的Ｔリンパ球の増殖、サイトカインの分泌、細胞機能の不具合を回復させることができる。

【0141】

[00213]エンハンサー部分は、転写因子５（ＳＴＡＴ５）媒介シグナル伝達経路のシグナルトランスデューサーとアクティベーターを制御（例えば、活性化）することができる。ＳＴＡＴ５は、細胞質に広く存在し得る。サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５およびＩＬ２１）がサイトカイン受容体に結合すると、受容体に結合したＪＡＫが活性化され、それによりＳＴＡＴ５タンパク質のＣ末端のＴｙｒ残基がリン酸化される。リン酸化されたＳＴＡＴ５は、そのＳＨ２領域を介して、相同または異種の二量体を形成することができる。相同のまたは異種二量体は、核に移行し、標的遺伝子に結合することで、細胞調節因子および抗アポトーシス遺伝子を含む標的遺伝子の発現を制御することができる。ＳＴＡＴ５の活性化は、正常な細胞機能を維持し、細胞の増殖および分化を制御する役割を果たすことができる。したがって、ＳＴＡＴ５シグナル伝達経路の活性を制御することで、本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の生存および持続を制御することができると可能性がある。

【0142】

[00214]エンハンサー部分は、エンハンサー部分をコードする核酸分子を細胞に送達することにより、細胞（例えば、免疫細胞または操作された免疫細胞）に導入され得る。核酸分子は、ベクターであり得る。エンハンサー部分は、融合構築物の一部であり得る。融合タンパク質または対応する核酸構築物は、以下の、Ｓ－２Ａ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ－２Ａ－Ｌ２－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒａ（Ａ）、Ｓ－２Ａ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ－２Ａ－Ｌ２－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒａ－２Ａ－Ｌ３－ＩＬ７（Ｂ）、Ｓ－２Ａ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ－２Ａ－Ｌ２－Ｃ７Ｒ（Ｃ）、Ｓ－２Ａ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ－２Ａ－Ｌ２－ＩＬ７－ＩＬ７Ｒａ（Ｄ）であり、ここで「－」の各々は独立してリンカーペプチドまたはペプチド結合である、Ｓは安全スイッチである、２Ａは任意の自己切断性ペプチドである、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の各々は独立してヌルまたはシグナルペプチド配列である、Ｃ７Ｒは上記の通りである、ｓｃＦｖは抗原結合性ドメインである、Ｈはヌルまたはヒンジ領域である、ＴＭは膜貫通ドメインである、Ｃは共刺激シグナル伝達分子である、ＣＤ３ζはＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列である、ＩＬ１５はインターロイキン１５である、ＩＬ１５ＲａはＩＬ－１５受容体ａである、ＩＬ７はインターロイキン７である、ＩＬ７ＲａはＩＬ－７受容体ａである、Ｃ７Ｒは構成的に活性化されたＩＬ－７受容体である、から選択される式によって示されるような構造を有することができる。

【0143】

[00215]エンハンサー部分は、キメラポリペプチドの一部であり得る。例えば、エンハンサー部分は、誘導性細胞死部分に連結され得る。エンハンサー部分は、リンカーによって誘導性細胞死部分に連結され得る。リンカーは、切断されていなくてもよい。リンカーは、自己切断性ペプチドを含んでいなくてもよい。他の場合によって、エンハンサー部分および誘導性細胞死部分は、同一の核酸分子から細胞内で発現され、切断されて２つのポリペプチドを形成することができる。

【0144】

誘導性細胞死部分
[00216]本明細書に記載の操作された免疫細胞は、誘導性細胞死部分を含んでもよく、「自殺遺伝子スイッチ」、「自殺スイッチ」、「安全スイッチ」、または「細胞自殺エレメント」とも呼ばれる。誘導性細胞死部分は、外因性因子（例えば、薬物）の作用下で、ｉｎ ｖｉｖｏで操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を効果的に除去するために使用され得る。本明細書に記載の誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＣＤ２０（およびそのミモトープ）、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｔ、ＨＳＶ－ＴＫ、ｍＴＭＰＫなどであってもよい。ｉＣａｓｐ９、ＣＤ２０（およびそのミモトープ）、ＲＱＲ８、およびＨＳＶ－ＴＫは、Ｔ細胞を除去する能力が同じであるが、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＲＱＲ８、およびＣＤ２０（およびそのミモトープ）は、ＨＳＶ－ＴＫと比較して高速である場合がある。

【0145】

[00217]場合によって、誘導性細胞死部分は、細胞死アクティベーターと接触すると前記細胞の死を生じさせることができる。誘導性細胞死部分は、例えば、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、またはＥＧＦＲｔであり得る。場合によって、誘導性細胞死部分はＥＧＦＲｔであり、ならびに前記細胞死アクティベーターはＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合断片である。場合によって、誘導性細胞死部分はＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに前記細胞死アクティベーターはＧＣＶである。場合によって、誘導性細胞死部分はｉＣａｓｐ９であり、ならびに前記細胞死アクティベーターはＡＰ１９０３である。

【0146】

[00218]誘導性細胞死部分は、エンハンサー部分に連結することができ、上述のようにキメラポリペプチドとして細胞内で共発現され得る。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
[00219]悪性疾患や感染性疾患の治療用の「既製」の同種異系Ｔ細胞を調製するために、Ｔ細胞の注入による細胞療法は、病原体や悪性腫瘍に対する免疫を再確立するように設計され得る。十分な数の腫瘍標的特性を有するＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するのに必要な時間は、一般的に患者の治療域とは相容れないことがある。さらに、疾患が進行した患者の自己Ｔ細胞は、機能が低下している可能性があり、所望の抗原に対して耐性がある。

【0147】

[00220]これらの問題に対処するために、患者に同種異系Ｔ細胞を投与することができるが、注入された細胞上の異なる主要または副組織適合性抗原を認識することにより、宿主Ｔ細胞による免疫媒介性拒絶を防止する必要がある。ＴＣＲαおよびβ鎖、ならびにＨＬＡ－Ａ分子を発現していないＴ細胞を注入しても、ＧＶＨＤやＨＶＧを引き起こさない場合がある。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いて編集されＴＣＲα鎖とＨＬＡ－Ａ分子を削除したＴ細胞は、普遍的エフェクターのドナー細胞の供給源としての機能を果たし得る。

【0148】

[00221]しかし、β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のノックダウンは、ドナーＣＡＲ－Ｔ細胞が宿主Ｔ細胞に攻撃されるのを防ぐ場合がある。ドナーＣＡＲ－Ｔ細胞は、宿主のＮＫ細胞によって攻撃され、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存に影響を与える場合がある。したがって、本開示は、腫瘍細胞および宿主Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を標的とする操作された免疫細胞を提供する。本明細書に記載の操作された免疫細胞は、宿主Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を捕捉し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存、持続および増殖能力を高めることができ、それによって腫瘍細胞に対してより効果的である。

【0149】

遺伝子編集
[00222]本開示では、ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ干渉技術、ＴＡＬＥＮ（転写アクティベーター様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ）、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）を含む、様々な遺伝子編集方法を用いて、操作された免疫細胞を作ることができる。

【0150】

[00223]場合によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、免疫細胞の遺伝子を編集する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、Ｔ細胞療法のための操作された免疫細胞を生成するために、免疫細胞の内因性ＴＣＲまたは細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ７）をノックアウトすることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ＣＲＩＳＰＲ関連）系は、原核生物に特有の自然免疫系であり、ウイルスや外来のプラスミドにも耐性がある。ＴｙｐｅＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、直接ゲノム志向ゲノム編集ツールとして、多くの真核生物および原核生物に適用されてきた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の開発は、人々がＤＮＡ配列を編集し、標的遺伝子の発現レベルを制御する能力に革命をもたらし、生物の正確なゲノム編集のための強力なツールを提供した。簡略化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡを含むことができる。作用原理は、ｇＲＮＡが自身のＣａｓ９ハンドルを介してＣａｓ９タンパク質とＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体を形成し、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中のｇＲＮＡの塩基相補性ペアリング配列が、塩基相補性ペアリングの原理により標的遺伝子の標的配列とペアリングされるというものである。Ｃａｓ９は、自身のエンドヌクレアーゼ活性を用いて標的ＤＮＡ配列を切断する。従来のゲノム編集技術と比較して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系には、使いやすさ、簡便さ、低コスト、プログラム可能、複数の遺伝子を同時に編集可能、などの明確な利点がある。

【0151】

医薬組成物
[00224]本開示はまた、本明細書に記載の操作された免疫細胞、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は液体組成物である。医薬組成物は、例えば、注射によって、対象に投与され得る。調製物中の操作された免疫細胞の濃度は、少なくとも約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、またはそれ以上の細胞／ｍｌであり得る。場合によって、調製物中の操作された免疫細胞の濃度は、１×１０^３～１×１０^８細胞／ｍｌ、または１×１０^４～１×１０^７細胞／ｍｌであり得る。

【0152】

[00225]本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されているような操作された免疫細胞を、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでいてもよい。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化物質、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化されてもよい。

【0153】

[00226]本開示の医薬組成物は、治療（または予防）すべき疾患に適した方法で投与されてもよい。投与量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定されてもよい。

【0154】

[00227]「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、または「治療量」が示されている場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個人差を考慮して医師によって決定され得る。一般に、本明細書に記載の操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む医薬組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、または場合によって、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与されてもよく、それらの範囲内のすべての整数値を含むと述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、注入技術を用いて投与され得る。特定の患者に対する最適な投与量および治療レジメンは、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって容易に決定され得る。

【0155】

[00228]対象となる組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、インプラント術または移植を含む、任意の都合のよい方法で実施してもよい。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内で患者に投与してもよい。一部の実施形態では、本開示のＴ細胞組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。一部の他の実施形態では、本開示のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注入されてもよい。

【0156】

治療
[00229]本開示は、本明細書に記載される発現カセットをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入された操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を用いた治療用途を提供する。形質導入されたＴ細胞またはＮＫ細胞は、腫瘍細胞マーカー（ＣＤ１９など）および活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のコンセンサスマーカー（ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１３７など）を標的とすることができる。操作された免疫細胞は、同種異系の腫瘍治療に使用され、大規模に調製され得る。

【0157】

[00230]その結果、本開示はまた、本開示の操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を対象に投与する工程を含む、対象（例えば、哺乳動物）の標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫反応を刺激する方法を提供する。

【0158】

[00231]一部の実施形態では、本開示は、本開示の操作された普遍的ＣＡＲ－Ｔ細胞を、それを必要とする患者に直接投与することを含む一種の細胞療法を提供する。本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、遺伝子編集技術によって細胞内で内因性ＴＣＲの発現がノックアウトされているか、またはサイレンシングされていてもよい。内在性ＴＣＲを不活性化することで、同種異系注入中にＴＣＲによる正常細胞の殺傷を防ぐことができる。ＧＶＨＤ反応は防止される場合がある。腫瘍細胞マーカー（ＣＤ１９など）ならびに活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のマーカー（ＣＤ１３７など）を標的としたＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞を捕捉しつつ、活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を除去することができる。さらに、宿主対移植片の反応（ＨＶＧ）も防止され得る。また、本明細書で提供される細胞療法は、対象における同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率および抗腫瘍効果を向上させることができる。

【0159】

[00232]一部の実施形態では、対象の疾患を治療または診断する方法であって、前記対象に、本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。
[00233]前記医薬組成物中の操作された免疫細胞は、同種異系免疫細胞に由来するものであってもよい。前記同種異系免疫細胞に由来する操作された免疫細胞は、前記対象に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない場合がある。また、前記医薬組成物中の操作された免疫細胞は、自家免疫細胞に由来するものであってもよい。

【0160】

[00234]前記医薬組成物中の前記操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲは、機能的に不活性であってもよい。操作された免疫細胞は、機能的に活性なＴＣＲを有する別の免疫細胞と比較して、前記対象においてＧＶＨＤを減少させることができる。疾患は、がんであり得る。がんは、例えば、リンパ腫または白血病であり得る。

【0161】

[00235]本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでの頑強な細胞増殖を受けることができ、伸展することができる。ＣＡＲ媒介免疫反応は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞がＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに特異的な免疫反応を誘発することができる養子免疫療法のステップの一部であり得る。例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発現する細胞に対して特異的な免疫反応を誘発する。

【0162】

[00236]本明細書で提供される操作された免疫細胞は、がんの治療に使用され得る。治療され得るがんは、血管形成する腫瘍だけでなく、血管形成していない、またはまだ実質的に血管形成していない腫瘍を含む。がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫など）を含んでもよく、または固形腫瘍を含んでもよい。本開示のＣＡＲで治療するがんの種類には、癌腫、芽細胞腫、および肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍例えば肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／がん、および小児の腫瘍／がんも含まれる。

【0163】

[00237]血液性のがんは、血液または骨髄のがんである。血液性（または血行性）のがんの例としては、急性白血病（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤血球性白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病、骨髄異形成を含む白血病が挙げられる。

【0164】

[00238]固形腫瘍は、通常、嚢胞や液状領域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプ（肉腫、癌腫、およびリンパ腫など）に応じて命名される。肉腫や癌腫のような固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫や混合神経膠腫など）、膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワンノーマ頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、および脳転移など）が挙げられる。

【0165】

[00239]一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの抗原結合部分は、特定のがんを治療するように設計されている。例えば、ＣＤ１９を標的とするように設計されたＣＡＲは、プレＢ ＡＬＬ（小児適応）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種異系骨髄移植後のサルベージなどを含むがこれらに限定されないがんおよび障害を治療するために使用され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を治療するためにＣＤ２２を標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、がんおよび障害は、プレＢ ＡＬＬ（小児適応）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種異系骨髄移植後のサルベージなどを含むが、これらに限定されず、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＲＯＲ１を標的とするＣＡＲの組合せを使用して治療され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、中皮腫、膵臓がん、卵巣がんなどを治療するためにメソセリンを標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、急性骨髄性白血病を治療するためにＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａを標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、トリプルネガティブ乳がん、非小細胞肺がんなどを治療するためにｃ－Ｍｅｔを標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、前立腺がんなどを治療するためにＰＳＭＡを標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、前立腺がんなどを治療するために糖脂質Ｆ７７を標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、膠芽腫などを治療するためにＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、神経芽細胞腫、黒色腫などを治療するためにＧＤ－２を標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、骨髄腫、肉腫、黒色腫などを治療するためにＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを標的とするように設計され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、骨髄腫、肉腫、黒色腫などを治療するためにＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲを標的とするように設計され得る。

【0166】

[00240]本開示は、本明細書に開示された抗原標的および疾患のみに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本開示は、ＣＡＲが疾患の治療に使用され得る疾患に関連する任意の抗原標的を含むと解釈されるべきである。

【0167】

[00241]本明細書に開示された細胞療法は、１つまたは複数の追加の治療剤、例えば、１つまたは複数の抗がん剤、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤、ホルモン治療、ワクチン、および／または他の免疫療法と共同で製剤化し、および／または共同で投与され得る。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、手術、放射線、冷凍手術、および／または温熱療法を含む他の治療的治療モダリティと組み合わせて投与される。このような併用療法では、投与される治療剤の量が少なくて済むため、様々な単剤療法に伴う毒性や合併症の可能性を回避することができる。

【0168】

[00242]特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、１つまたは複数の抗体分子、化学療法、他の抗がん療法（例えば、標的抗がん療法、または腫瘍溶解性薬）、細胞毒性剤、免疫ベースの療法（例えば、サイトカイン）、外科手術および／または放射線手法と組み合わせて投与される。組み合わせて投与され得る例となる細胞毒性剤は、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、挿入剤、シグナル伝達経路を妨害できる薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、プロテアソーム阻害剤、および放射線（例えば、局所または全身照射）を含む。

【0169】

[00243]特定の実施形態では、併用療法は、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射用（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙ－ｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射用（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン）、ダウノルビシン塩酸塩（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射用（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、フルダラビンリン酸エステル（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５－フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ－アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６－メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ナブパクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロサン２０とカルムスチンの併用インプラント（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、タモキシフェンクエン酸塩（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、トポテカン塩酸塩注射用（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含むがこれらに限定されない、標準的ながん治療の化学療法剤と組み合わせて使用される。

【0170】

[00244]アルキル化剤の例としては、限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソウレア、トリアゼン）、ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、パイポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、およびダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））などが挙げられる。追加の例示的なアルキル化剤としては、限定されないが、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）としても知られる）；メルファラン（Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）としても知られる）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても知られる）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても知られる）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱとしても知られる）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）としても知られる）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても知られる）；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌムスチン（Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ）；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン、メクロレタミン塩酸塩、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）としても知られる）；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）としても知られる）；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、およびベンダムスチン塩酸塩（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられる。

【0171】

[00245]アントラサイクリン系薬剤の例としては、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（Ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、およびルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンリポソーム（クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、ＩｄａｍｙｃｉｎＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンが挙げられる。

【0172】

[00246]本明細書に記載の細胞療法と組み合わせて使用することができるビンカアルカロイドの例としては、ビノレルビン酒石酸塩（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標））；ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ－ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標）としても知られる）、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0173】

[00247]本明細書に記載の細胞療法と組み合わせて使用することができるプロテアソーム阻害剤の例としては、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ－１７１－００７、（Ｓ）－４－メチル－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－４－メチル－１－（（Ｒ）－２－メチルオキシラン－２－イル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－１－オキソ－３－フェニルプロパン－２－イル）－２－（（Ｓ）－２－（２－モルホリノアセタミド）－４－フェニルブタンアミド）－ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ－００５２）；イキサゾミブクエン酸エステル（ＭＬＮ－９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）；Ｏ－メチル－Ｎ－［（２－メチル－５－チアゾリル）カルボニル］－Ｌ－セリル－Ｏ－メチル－Ｎ－［（１Ｓ）－２－［（２Ｒ）－２－メチル－２－オキシラニル］－２－オキソ－１－（フェニルメチル）エチル］－Ｌ－セリンアミド（ＯＮＸ－０９１２）；ダノプレビル（ＲＧ７２２７、ＣＡＳ８５０８７６－８８－９）；イクサゾミブ（ＭＬＮ２２３８、ＣＡＳ１０７２８３３－７７－２）；および（Ｓ）－Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－ロイシル－Ｎ－（１－ホルミル－３－メチルブチル）－Ｌ－ロイシンアミド（ＭＧ－１３２、ＣＡＳ１３３４０７－８２－６）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0174】

[00248]一部の実施形態では、細胞療法は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤）と組み合わせて使用することができる。例示的なチロシンキナーゼ阻害剤には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）経路阻害剤（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤（例えば、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、ＶＥＧＦＲ－１阻害剤、ＶＥＧＦＲ－２阻害剤、ＶＥＧＦＲ－３阻害剤））、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）経路阻害剤（例えば、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤（例えば、ＰＤＧＦＲ－β阻害剤））、ＲＡＦ－１阻害剤、ＫＩＴ阻害剤、およびＲＥＴ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ヘッジホッグ阻害剤と組み合わせて使用される抗がん剤は、以下の、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、ボスチニブ（ＳＫＩ－６０６）、セジラニブ（ＲＥ－ＣＥＮＴＩＮ、ＡＺＤ２１７１）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、ＢＭＳ－３５４８２５）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＣＧＰ５７１４８Ｂ、ＳＴＩ－５７１）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１）、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、セマキサニブ（セマキシニブ、ＳＵ５４１６）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（登録商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７、ＰＴＫ／ＺＫ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳ－ＴＩＮ（登録商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭ－ＰＡＴＨ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ＥＮＭＤ－２０７６、ＰＣＩ－３２７６５、ＡＣ２２０、ドビチニブ乳酸塩（ＴＫＩ２５８、ＣＨＩＲ－２５８）、ＢＩＢＷ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ＳＧＸ５２３、ＰＦ－０４２１７９０３、ＰＦ－０２３４１０６６、ＰＦ－２９９８０４、ＢＭＳ－７７７６０７、ＡＢＴ－８６９、ＭＰ４７０、ＢＩＢＦ １１２０（ＶＡＲＧＡＴＥＦ（登録商標））、ＡＰ２４５３４、ＪＮＪ－２６４８３３２７、ＭＧＣＤ２６５、ＤＣＣ－２０３６、ＢＭＳ－６９０１５４、ＣＥＰ－１１９８１、チボザニブ（ＡＶ－９５１）、ＯＳＩ－９３０、ＭＭ－１２１、ＸＬ－１８４、ＸＬ－６４７、ＸＬ２２８、ＡＥＥ７８８、ＡＧ－４９０、ＡＳＴ－６、ＢＭＳ－５９９６２６、ＣＵＤＣ－１０１、ＰＤ１５３０３５、ペリチニブ（ＥＫＢ－５６９）、バンデタニブ（ザクティマ）、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ＡＢＴ－８６９（リニファニブ）、ＡＥＥ７８８、ＡＰ２４５３４（ポナチニブ）、ＡＶ－９５１（チボザニブ）、アキシチニブ、ＢＡＹ ７３－４５０６（レゴラフェニブ）、ブリバニブアラニネート（ＢＭＳ－５８２６６４）、ブリバニブ（ＢＭＳ－５４０２１５）、セジラニブ（ＡＺＤ２１７１）、ＣＨＩＲ－２５８（ドビチニブ）、ＣＰ ６７３４５１、ＣＹＣ１１６、Ｅ７０８０、Ｋｉ８７５１、マシチニブ（ＡＢ１０１０）、ＭＧＣＤ－２６５、モテサニブ二リン酸塩（ＡＭＧ－７０６）、ＭＰ－４７０、ＯＳＩ－９３０、パゾパニブ塩酸塩、ＰＤ１７３０７４、ソラフェニブトシル酸塩（Ｂａｙ４３－９００６）、ＳＵ５４０２、ＴＳＵ－６８（ＳＵ６６６８）、バタラニブ、ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９、ＥＸＥＬ－２８８０）からなる群から選択される。ヘッジホッグ阻害剤のさらなる例としては、ビスモデギブ（２－クロロ－Ｎ－［４－クロロ－３－（２－ピリジニル）フェニル］－４－（メチルスルホニル）ベンズアミド、ＧＤＣ－０４４９）；１－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－３－（（３－（４－フルオロフェニル）－３，４－ジヒドロ－４－オキソ－２－キナゾリニル）メチル）ウレア（ＣＡＳ ３３０７９６－２４－２）；Ｎ－［（２Ｓ，３Ｒ，３’Ｒ，３ａＳ，４’ａＲ，６Ｓ，６’ａＲ，６’ｂＳ，７ａＲ，１２’ａＳ，１２’ｂＳ）－２’，３’，３ａ，４，４’，４’ａ，５，５’，６，６’，６’ａ，６’ｂ，７，７’，７ａ，８’，１０’，１２’，１２’ａ，１２’ｂ－エイコサヒドロ－３，６，１１’，１２’ｂ－テトラメチルスピロ［フロ［３，２－ｂ］ピリジン－２（３Ｈ），９’（１’Ｈ）－ナフト［２，１－ａ］アズレン］－３’－イル］－メタンスルホンアミド（ＩＰＩ９２６、ＣＡＳ １０３７２１０－９３－７）；および４－フルオロ－Ｎ－メチル－Ｎ－［１－［４－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－１－フタラジニル］－４－ピペリジニル］－２－（トリフルオロメチル）－ベンズアミド（ＬＹ２９４０６８０、ＣＡＳ １２５８８６１－２０－９）；およびエリスモデギブ（ＬＤＥ２２５）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。選択されたチロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはソラフェニブエルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｎ－［４－（３－アミノ－１Ｈ－インダゾール－４－イル）フェニル］－Ｎ’－（２－フルオロ－５－メチルフェニル）ウレア、ＡＢＴ８６９としても知られ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能）；スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（４－［（２，４－ジクロロ－５－メトキシフェニル）アミノ］－６－メトキシ－７－［３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロポキシ］キノリン－３－カルボニトリル、ＳＫＩ－６０６としても知られており、米国特許第６，７８０，９９６号に記載されている）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；ザクティマ（ＺＤ６４７４）；およびイマチニブまたはイマチニブメシル酸塩（Ｇｉｌ－ｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））から選択される。

【0175】

[00249]特定の実施形態では、細胞療法は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤と組み合わせて使用することができ、これには、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、アキシチニブ（Ｉｎｌｙｔａ（登録商標））；ブリバニブアラニネート（ＢＭＳ－５８２６６４、（Ｓ）－（（Ｒ）－１－（４－（４－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－インドール－５－イルオキシ）－５－メチルピロロ［２，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－イルオキシ）プロパン－２－イル）２－アミノプロパノエート）；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；セジラニブ（ＡＺＤ２１７１、ＣＡＳ ２８８３８３－２０－１）；バルガテフ（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ ９２８３２６－８３－４）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９）；テラチニブ（ＢＡＹ５７－９３５２、ＣＡＳ ３３２０１２－４０－５）；アパチニブ（ＹＮ９６８Ｄ１、ＣＡＳ ８１１８０３－０５－１）；イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））；ポナチニブ（ＡＰ２４５３４、ＣＡＳ ９４３３１９－７０－８）；チボザニブ（ＡＶ９５１、ＣＡＳ ４７５１０８－１８－０）；レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３－４５０６、ＣＡＳ ７５５０３７－０３－７）；バタラニブ二塩酸塩（ＰＴＫ７８７、ＣＡＳ ２１２１４１－５１－０）；ブリバニブ（ＢＭＳ－５４０２１５、ＣＡＳ ６４９７３５－４６－６）；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標）またはＡＺＤ６４７４）；モテサニブ二リン酸塩（ＡＭＧ７０６、ＣＡＳ ８５７８７６－３０－３、Ｎ－（２，３－ジヒドロ－３，３－ジメチル－１Ｈ－インドール－６－イル）－２－［（４－ピリジニルメチル）アミノ］－３－ピリジンカルボキサミド、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０６６４７０）；ドビチニブ二乳酸（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ ８５２４３３－８４－２）；リニファニブ（ＡＢＴ８６９、ＣＡＳ ７９６９６７－１６－３）；カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ ８４９２１７－６８－１）；レスタウルチニブ（ＣＡＳ １１１３５８－８８－４）；Ｎ－［５－［［［５－（１，１－ジメチルエチル）－２－オキサゾリル］メチル］チオ］－２－チアゾリル］－４－ピペリジンカルボキサミド（ＢＭＳ３８７０３、ＣＡＳ ３４５６２７－８０－７）；（３Ｒ，４Ｒ）－４－アミノ－１（（４－（（３－メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－５－イル）メチル）ピペリジン－３－オール（ＢＭＳ６９０５１４）；Ｎ－（３，４－ジクロロ－２－フルオロフェニル）－６－メトキシ－７－［［（３ａα，５β，６ａα）－オクタヒドロ－２－メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール－５－イル］メトキシ］－４－キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ ７８１６１３－２３－８）；４－メチル－３－［［１－メチル－６－（３－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－４－イル］アミノ］－Ｎ－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］－ベンズアミド（ＢＨＧ７１２、ＣＡＳ ９４０３１０－８５－０）；アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0176】

[00250]一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞療法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて使用することができる。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームおよびガンマアイソフォームの阻害剤であり得る。ＰＩ３Ｋ阻害剤の例としては、４－［２－（１Ｈ－インダゾール－４－イル）－６－［［４－（メチルスルホニル）ピペラジン－１－イル］メチル］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル］モルホリン；２－メチル－２－［４－［３－メチル－２－オキソ－８－（キノリン－３－イル）－２，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］フェニル］プロピオニトリル；４－（トリフルオロメチル）－５－（２，６－ジモルホリノピリミジン－４－イル）ピリジン－２－アミン；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ－０４５７、ＣＡＳ ６３９０８９－５４－６）；（５Ｚ）－５－［［４－（４－ピリジニル）－６－キノリニル］メチレン］－２，４－チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ ９５８８５２－０１－２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）－５－（アセチルオキシ）－１－［（ジ－２－プロペニルアミノ）メチレン］－４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ－オクタヒドロ－１１－ヒドロキシ－４－（メトキシメチル）－４ａ，６ａ－ジメチル－シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２－ｃ］ピラン－２，７，１０（１Ｈ）－トリオン（ＰＸ８６６、ＣＡＳ ５０２６３２－６６－８）；８－フェニル－２－（モルホリン－４－イル）－クロメン－４－オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ １５４４４７－３６－６）；２－アミノ－８－エチル－４－メチル－６－（１Ｈ－ピラゾール－５－イル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＳＡＲ ２４５４０９またはＸＬ ７６５）；１，３－ジヒドロ－８－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－３－メチル－１－［４－（１－ピペラジニル）－３－（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン、（２Ｚ）－２－ブテンジオエート（１：１）（ＢＧＴ ２２６）；５－フルオロ－３－フェニル－２－［（１Ｓ）－１－（９Ｈ－プリン－６－イルアミノ）エチル］－４（３Ｈ）－キナゾリノン（ＣＡＬ１０１）；２－アミノ－Ｎ－［３－［Ｎ－［３－［（２－クロロ－５－メトキシフェニル）アミノ］キノキサリン－２－イル］スルファモイル］フェニル］－２－メチルプロパンアミド（ＳＡＲ ２４５４０８またはＸＬ １４７）；および（Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボン酸２－アミド１－（｛４－メチル－５－［２－（２，２，２－トリフルオロ－１，１－ジメチル－エチル）－ピリジン－４－イル］－チアゾール－２－イル｝－アミド）（ＢＹＬ７１９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0177】

[00251]一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞療法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、以下の、ラパマイシン、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＡＺＤ８０５５、ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＸＬ７６５、ＰＦ－４６９１５０２、ＧＤＣ０９８０、ＳＦ１１２６、ＯＳＩ－０２７、ＧＳＫ１０５９６１５、ＫＵ－００６３７９４、ＷＹＥ－３５４、パロミド５２９（Ｐ５２９）、ＰＦ－０４６９１５０２、またはＰＫＩ－５８７；リダフォロリムス（正式名称：デフェロリムス、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られており、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０６４３８３に記載されている）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；セマピモド（ＣＡＳ １６４３０１－５１－３）；エムシロリムス、（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２－アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ １０１３１０１－３６－４）；およびＮ２－［１，４－ジオキソ－４－［［４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モルホリニウム－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アスパルチルＬ－セリン、内部塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ ９３６４８７－６７－１）、（１ｒ，４ｒ）－４－（４－アミノ－５－（７－メトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）イミダゾ［１，５－ｆ］［１，２，４］トリアジン－７－イル）シクロヘキサンカルボン酸（ＯＳＩ－０２７）；およびＸＬ７６５、の１つまたは複数から選択される１つまたは複数のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用することができる。

【0178】

[00252]一部の実施形態では、細胞療法は、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、ＧＳＫ２１１８４３６、ＲＧ７２０４、ＰＬＸ４０３２、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ４７２０、およびソラフェニブトシル酸塩（Ｂａｙ４３－９００６）と組み合わせて使用することができる。さらなる実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３－４５０６、ＣＡＳ ７５５０３７－０３－７）；ツビザニブ（ＡＶ９５１、ＣＡＳ ４７５１０８－１８－０）；ベムラフェニブ（Ｚｅｌ－ｂｏｒａｆ（登録商標）、ＰＬＸ－４０３２、ＣＡＳ ９１８５０４－６５－１）；エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８としても知られている）；１－メチル－５－［［２－［５－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－４－ピリジニル］オキシ］－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェニル－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－アミン（ＲＡＦ２６５、ＣＡＳ ９２７８８０－９０－８）；５－［１－（２－ヒドロキシエチル）－３－（ピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－２，３－ジヒドロインデン－１－オンオキシム（ＧＤＣ－０８７９、ＣＡＳ ９０５２８１－７６－７）；５－［２－［４－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］－５－（４－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－オンオキシム（ＧＳＫ２１１８４３６またはＳＢ５９０８８５）；（＋／－）－メチル（５－（２－（５－クロロ－２－メチルフェニル）－１－ヒドロキシ－３－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１－イル）－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル）カルバメート（ＸＬ－２８１およびＢＭＳ９０８６６２としても知られている）およびＮ－（３－（５－クロロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－カルボニル）－２，４－ジフルオロフェニル）プロパン－１－スルホンアミド（ＰＬＸ４７２０としても知られている）を含むが、これらに限定されない。

【0179】

[00253]一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞療法は、ＭＥＫ阻害剤と組み合わせて使用することができる。任意のＭＥＫ阻害剤は、セルメチニブ（５－［（４－ブロモ－２－クロロフェニル）アミノ］－４－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１－メチル－１Ｈ－ベンズイミダゾール－６－カルボキサミド、ＡＺＤ６２４４またはＡＲＲＹ１４２８８６としても知られている）；ＡＲＲＹ－１４２８８６、トラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ－１１２０２１２、ＣＡＳ １２０４５３１－２５－８０）；Ｇ０２４４２１０４（ＧＳＫ１１２０２１２としても知られている）、ＲＤＥＡ４３６；Ｎ－［３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－６－メトキシフェニル］－１－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロピル］－シクロプロパンスルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９またはＢＡＹ８６９７６６としても知られている）；ＲＤＥＡ１１９／ＢＡＹ８６９７６６、ＡＳ７０３０２６；Ｇ０００３９８０５（ＡＺＤ－６２４４またはセルメチニブとしても知られる）、ＢＩＸ０２１８８；ＢＩＸ０２１８９；２－［（２－クロロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－Ｎ－（シクロプロピルメトキシ）－３，４－ジフルオロ－ベンズアミド（ＣＩ－１０４０またはＰＤ１８４３５２としても知られる）；ＣＩ－１０４０（ＰＤ－１８４３５２）、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１としても知られている）；ＰＤ０３２５９０１２’－アミノ－３’－メトキシフラボン（ＰＤ９８０５９としても知られており、Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，ＫＧ、Ｇｅｒｍａｎｙより入手可能）；ＰＤ９８０５９、２，３－ビス［アミノ［（２－アミノフェニル）チオ］メチレン］－ブタンジニトリル（Ｕ０１２６としても知られている）；Ｕ０１２６、ＸＬ－５１８（ＧＤＣ－０９７３としても知られている、Ｃａｓ番号１０２９８７２－２９－４、ＡＣＣ Ｃｏｒｐ．より入手可能）；ＧＤＣ－０９７３（メタノン、［３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］フェニル］［３－ヒドロキシ－３－（２５）－２－ピペリジニル－１－アゼチジニル］－）、Ｇ－３８９６３；およびＧ０２４４３７１４（ＡＳ７０３２０６としても知られている）、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含むが、これらに限定されない組合せで使用することができる。ＭＥＫ阻害剤のさらなる例としては、ベニメチニブ（６－（４－ブロモ－２－フルオロフェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシエトキシ）－アミド、ＭＥＫ１６２としても知られている、ＣＡＳ １０７３６６６－７０－２）；２，３－ビス［アミノ［（２－アミノフェニル）チオ］メチレン］－ブタンジニトリル（Ｕ０１２６としても知られており、米国特許第２，７７９，７８０号に記載される）；（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）－１４－（エチルアミノ）－８，９，１６－トリヒドロキシ－３，４－ジメチル－３，４，９，１９－テトラヒドロ－１Ｈ－２－ベンゾオキサシクロテトラデシン－１，７（８Ｈ）－ジオン］（Ｅ６２０１としても知られている）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ－４０３２、ＣＡＳ ９１８５０４－６５－１）；（Ｒ）－３－（２，３－ジヒドロキシプロピル）－６－フルオロ－５－（２－フルオロ－４－ヨードフェニルアミノ）－８－メチルピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－４，７（３Ｈ，８Ｈ）－ジオン（ＴＡＫ－７３３、ＣＡＳ １０３５５５５－６３－５）；ピマセルティブ（ＡＳ－７０３０２６、ＣＡＳ １２０４５３１－２６－９）；２－（２－フルオロ－４－ヨードフェニルアミノ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド（ＡＺＤ ８３３０）；および３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－５－［（３－オキソ－［１，２］オキサジナン－２－イル）メチル］ベンズアミド（ＣＨ ４９８７６５５またはＲｏ ４９８７６５５）を含むが、これらに限定されない。

【0180】

[00254]一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞療法は、ＪＡＫ２阻害剤、例えば、ＣＥＰ－７０１、ＩＮＣＢ１８４２４、ＣＰ－６９０５５０（タソシチニブ）と組み合わせて使用することができる。ＪＡＫ阻害剤の例としては、ルキソリチニブ（Ｊａｋａｆｉ（登録商標））；トファシチニブ（ＣＰ６９０５５０）；アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６、ＣＡＳ ３１９４６０－８５－０）；５－クロロ－Ｎ２－［（１Ｓ）－１－（５－フルオロ－２－ピリミジニル）エチル］－Ｎ４－（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－ｙ）－１２，４－ピリミジンジアミン（ＡＺＤ１４８０、ＣＡＳ ９３５６６６－８８－９）；（９Ｅ）－１５－［２－（１－ピロリジニル）エトキシ］－７，１２，２６－トリオキサ－１９，２１，２４－トリアザテトラシクロ［１８．３．１．１２，５．１１４，１８］－ヘキサコサ－１（２４），２，４，９，１４，１６，１８（２５），２０，２２－ノナエン（ＳＢ－１５７８、ＣＡＳ ９３７２７３－０４－６）；モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）；バリシチニブ（ＩＮＣＢ－０２８０５０またはＬＹ－３００９１０４）；パクリチニブ（ＳＢ１５１８）；（１６Ｅ）－１４－メチル－２０－オキサ－５，７，１４，２７－テトラアザテトラシクロ［１９．３．１．１２，６．１８，１２］ヘプタコサ－１（２５），２，４，６（２７），８，１０，１２（２６），１６，２１，２３－デカエン（ＳＢ １３１７）；ガンドチニブ（ＬＹ ２７８４５４４）；およびＮ，Ｎ－シシクロプロピル－４－［（１，５－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）アミノ］－６－エチル－１，６－ジヒドロ－１－メチル－イミダゾ［４，５－ｄ］ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－７－カルボキサミド（ＢＭＳ９１１５４３）を含むが、これらに限定されない。

【0181】

[00255]一部の実施形態では、本明細書で開示される併用療法は、パクリタキセルまたはパクリタキセル剤、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）、タンパク質結合パクリタキセル（例えば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））を含む。例示的なパクリタキセル剤としては、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸ－ＡＮＥ、Ａｂｒｘｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが販売）、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル（ＤＨＡ－パクリタキセル、タキソプレキシン、Ｐｒｏｔａｒｇａが販売）、ポリグルタミン酸結合パクリタキセル（ＰＧ－パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメックス、ＣＴ－２１０３、ＸＹＯＴＡＸ、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃが販売）、腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）、ＡＮＧ１０５（パクリタキセル３分子に結合したＡｎｇｉｏｐｅｐ－２、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ販売）、パクリタキセル－ＥＣ－１（ｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ－１に結合したパクリタキセル；Ｌｉら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００７）８７：２２５－２３０を参照のこと）、およびグルコースコンジュゲートパクリタキセル（例えば、２’－パクリタキセルメチル２－グルコピラノシルコハク酸塩）を含むが、これらに限定されない。

【0182】

方法
[00256]本開示は、操作された細胞を生成する方法を提供する。一部の態様では、方法は、（ａ）キメラポリペプチドを発現する核酸分子を細胞内に送達する工程と；（ｂ）細胞において核酸分子を発現させ、それにより、操作された細胞を生成する工程とを含み得る。キメラポリペプチドは、本明細書に記載のキメラ抗原受容体であり得る。

【0183】

[00257]本開示はまた、本明細書に記載の操作された細胞を投与する方法を提供する。操作された細胞は、操作された免疫細胞であり得る。操作された免疫細胞は、Ｔ細胞であり得る。操作された免疫細胞は、自家Ｔ細胞に由来することができる。操作された免疫細胞は、同種異系Ｔ細胞に由来することができる。

【0184】

[00258]一部の態様では、操作された免疫細胞を投与する方法であって、（ｉ）操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分および（ｉｉ）誘導性細胞死部分を含むキメラポリペプチドであって、誘導性細胞死部分が、キメラポリペプチドを細胞死アクティベーターに接触させると操作された免疫細胞の死を生じさせることができる、キメラポリペプチドを含む方法が本明細書で提供される。エンハンサー部分は、誘導性細胞死部分に連結され得る。操作された免疫細胞は、結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含むことができる。結合部分は、第１の抗原結合性ドメインを含むことができ、この第１の抗原結合性ドメインは、対象に投与されたときに、操作された免疫細胞に対する対象の免疫反応を抑制または低減する。結合部分は、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインをさらに含むことができる。１つまたは複数のＣＡＲの個々のＣＡＲは、（ｉ）第１の抗原結合性ドメイン、（ｉｉ）第２の抗原結合性ドメイン、または（ｉｉｉ）第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインの両方を含むことができる。１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。

【0185】

[00259]一部の態様では、結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、操作された免疫細胞を投与する方法が本明細書で提供される。結合部分は、免疫細胞抗原に結合することができる第１の抗原結合性ドメインと、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含むことができる。１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。操作された免疫細胞は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分をさらに含むことができる。場合によって、操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化され得る。操作された免疫細胞は、１つまたは複数のＣＡＲを含むがエンハンサー部分を含まない別の操作された免疫細胞と比較して、（ｉ）操作された免疫細胞に対して異種である細胞（例えば、がん細胞、免疫細胞、またはその両方）の存在下において少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００日間、またはそれ以上の日数、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生存可能のままになることによる持続の増強、（ｉｉ）１５日以内において少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、またはそれ以上の増殖の増強、または（ｉｉｉ）免疫細胞抗原または疾患関連抗原を含む標的細胞に対する細胞傷害性の増強を示すことができる。場合によって、操作された免疫細胞は、３０日以内に少なくとも約５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、またはそれ以上の増殖の増強を示すことができる。場合によって、操作された免疫細胞は、６０日以内に少なくとも約１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、２，０００倍、３，０００倍、４，０００倍、５，０００倍、６，０００倍、７，０００倍、８，０００倍、９，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、３０，０００倍、４０，０００倍、５０，０００倍、６０，０００倍、７０，０００倍、８０，０００倍、９０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、３００，０００倍、４００，０００倍、５００，０００倍、６００，０００倍、７００，０００倍、８００，０００倍、９００，０００倍、１，０００，０００倍、またはそれ以上の増殖の増強を示すことができる。刺激、例えば、がん抗原やがん細胞による刺激の存在下で、生存率または増殖は測定され得る。複数回の刺激または繰り返し刺激の存在下で、生存率または増殖は測定され得る。

【0186】

[00260]一部の態様では、機能的に不活性なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む細胞（例えば、操作された免疫細胞）を投与する方法が本明細書で提供される。細胞は、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含むことができる。１つまたは複数のＣＡＲの個々のＣＡＲのそれぞれは、結合部分を含むことができる。結合部分は、（ｉ）対象に投与されたときに、操作された免疫細胞に対する対象の免疫反応を抑制または低減する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合する第２の抗原結合性ドメインとを含むことができる。１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。

【0187】

[00261]一部の態様では、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分を含むことができる、操作された免疫細胞を投与する方法が本明細書で提供される。操作された細胞は、ＣＤ７に特異的に結合する抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含むことができる。ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。操作された免疫細胞の内因性ＣＤ７は、不活性化され得る。一部の実施形態では、操作された細胞は、免疫細胞抗原を特異的に結合する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを含むことができる。免疫細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＳＬＡＭＦ７、のような本明細書に記載の任意の免疫細胞抗原であり得る。抗原結合性ドメインが結合する操作された細胞の内因性免疫細胞抗原は、操作された細胞において不活性化され得る。

【0188】

[00262]一部の態様では、（ｉ）ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗原結合性ドメインと、（ｉｉ）疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインとを含む単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む操作された免疫細胞を投与する方法が本明細書で提供される。ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。内因性ＣＤ７をコードする遺伝子は、操作された免疫細胞において不活性化され得る。

【0189】

[00263]本開示はまた、対象の疾患を治療または診断する方法を提供する。場合によって、方法は、操作された免疫細胞を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。医薬組成物中の操作された免疫細胞は、同種異系免疫細胞に由来することができる。同種異系免疫細胞に由来する操作された免疫細胞は、対象において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさない場合がある。医薬組成物中の操作された免疫細胞は、自家免疫細胞に由来することができる。場合によって、医薬組成物中の操作された免疫細胞の内因性ＴＣＲは、機能的に不活性である。操作された免疫細胞は、機能的に活性なＴＣＲを有する免疫細胞と比較して、対象においてＧＶＨＤを減少させることができる。疾患は、がんであり得る。例えば、がんは、リンパ腫または白血病であり得る。

【0190】

[00264]本開示はまた、操作された免疫細胞の集団を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、同種異系細胞療法を送達する方法を提供する。集団の個々の操作された免疫細胞は、結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。結合部分は、免疫細胞抗原に結合することができる第１の抗原結合性ドメインを含むことができる。結合部分は、疾患関連抗原に結合することができる第２の抗原結合性ドメインをさらに含むことができる。第１の抗原結合性ドメインは、対象に投与されたときに、操作された免疫細胞に対する対象の免疫応答を抑制するかまたは低減することができる。操作された免疫細胞は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分をさらに含むことができる。操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化され得る。例えば、ＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子は不活化され得る。本明細書に記載の様々な遺伝子編集方法を使用して、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲを不活性化することができる。

【0191】

[00265]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞の集団の活性化を含むことができる。場合によって、操作された免疫細胞を調製するために使用される細胞は、操作された免疫細胞を調製する前に活性化され得る。場合によって、操作された免疫細胞は活性化され得る。本明細書で使用される活性化とは、細胞が静止状態から活性状態に移行するプロセスを表すことができる。このプロセスは、抗原への応答、遊走、および／または機能的に活性な状態への表現型の変化もしくは遺伝子変化を含むことができる。一部の態様では、活性化は、Ｔ細胞活性化の段階的なプロセスを表すことができる。場合によって、Ｔ細胞は活性になるために１つまたは複数のシグナルを必要とすることができる。例えば、Ｔ細胞は、完全に活性になるために少なくとも２つのシグナルを必要とすることができる。第１のシグナルは、抗原－ＭＨＣ複合体によるＴＣＲのエンゲージメント後に生じることができ、第２のシグナルは、共刺激分子のエンゲージメントによって生じることができる。抗ＣＤ３抗体（またはその機能的バリアント）は第１のシグナルを模倣し、抗ＣＤ２８抗体（またはその機能的バリアント）は第２のシグナルを模倣することがｉｎ ｖｉｔｒｏで可能である。

【0192】

[00266]一部の態様では、本明細書で提供される方法は、細胞の集団の活性化を含むことができる。活性化は、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激することができる薬剤と、細胞の表面上の共刺激分子を刺激することができるリガンドとを付着させた表面に細胞の集団を接触させることによって行うことができる。特に、Ｔ細胞集団は、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、抗ＣＤ２抗体との接触、または時にはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼＣアクティベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触などにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子を共刺激するためには、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用され得る。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激することができる条件下で、細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。場合によって、４－１ＢＢを用いて細胞を刺激することができる。例えば、細胞は、４－１ＢＢおよびＩＬ－２１または他のサイトカインで刺激され得る。ＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞のいずれかの活性化のために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。例えば、シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあっても、固相表面に結合していてもよい。細胞に対する粒子の比率は、標的細胞に対する粒子サイズに依存してもよい。さらなる実施形態では、Ｔ細胞のような細胞を、薬剤をコーティングしたビーズと組み合わせることができ、その後、ビーズと細胞を分離し、任意に培養することができる。各ビーズは、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体のいずれか、または場合によって、その２つの組み合わせでコーティングされ得る。別の実施形態では、培養の前に、薬剤をコーティングしたビーズと細胞を分離せず、一緒に培養する。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を付着させることができる常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をコンジュゲートすることができる。一実施形態では、細胞とビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズを１：１の比率で使用）を、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（例えば、カルシウムおよびマグネシウムのような二価のカチオンを含まない）などの緩衝液に組み合わせて入れる。任意の細胞濃度を使用してもよい。混合物は、約数時間（例えば、約３時間）から約１４日まで、またはその間の任意の時間の整数値で培養してもよい。別の実施形態では、混合物は、約２１日間、または最大で約２１日間培養してもよい。Ｔ細胞の培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦα、または細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含有する場合のある適切な培地（例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＭｅｄｉａまたはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０または、Ｘ－ｖｉｖｏ５、（Ｌｏｎｚａ））を含むことができる。細胞の成長のための他の添加物としては、界面活性剤、プラスマネート、およびＮ－アセチルシステインおよび２－メルカプトエタノールのような還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、ＲＰＭＩ １６４０、Ａ１ Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒに、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加した、無血清または適切な量の血清（または血漿）もしくは定義された一連のホルモン、および／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインを補充したものを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的な培養にのみ含めることができ、対象に注入される細胞の培養には含まれない可能性がある。標的細胞は、適切な温度（例えば、３７℃）および気体（例えば、空気＋５％ＣＯ_２）など、成長をサポートするのに必要な条件で維持され得る。場合によっては、様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を示す場合がある。場合によって、ヒトＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、またはそれらの任意の組合せに対する可溶性単一特異性四量体抗体が使用されてもよい。一部の実施形態では、活性化は、活性化部分、共刺激剤、およびそれらの任意の組合せを利用することができる。一部の態様では、活性化部分は、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体に結合し、および／または、共刺激を提供する。一部の態様では、活性化部分は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体のいずれか１つである。一部の態様では、固相は、ビーズ、プレート、および／またはマトリックスのうちの少なくとも１つである。一部の態様では、固相はビーズである。あるいは、またはそれに加えて、活性化部分は、基質とコンジュゲートしていなくてもよく、例えば、活性化部分は、培地中で自由に浮遊していてもよい。

【0193】

[00267]場合によって、組織または細胞との共培養により、細胞の集団は活性化または増殖され得る。細胞は、抗原提示細胞であり得る。人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｔ細胞受容体および共刺激分子のためのリガンドを発現することができ、場合によってはその有効性および機能を向上させながら、移植のためにＴ細胞を活性化および増殖させることができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化のための任意の遺伝子を発現するように操作され得る。ａＡＰＣは、Ｔ細胞増殖のための任意の遺伝子を発現するように操作され得る。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカイン、またはそれらの組合せであり得る。ａＡＰＣは、ゲノム移植を受けてもよい細胞集団にシグナルを送達することができる。例えば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル、２、シグナル３、または任意の組合せを送達することができる。シグナル１は、抗原認識シグナルであり得る。例えば、シグナル１は、ペプチド－ＭＨＣ複合体によるＴＣＲのライゲーション、またはＣＤ３シグナル伝達複合体の活性化につながることができるＣＤ３に向けられたアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル２は、共刺激シグナルであり得る。例えば、共刺激シグナルは、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ７０、および４－１ＢＢＬにそれぞれ結合する、抗ＣＤ２８、誘導性共刺激物質（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）であり得る。シグナル３は、サイトカインのシグナルであり得る。サイトカインは、任意のサイトカインであり得る。サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの任意の組合せであり得る。場合によっては、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用して、細胞集団を活性化および／または増殖させてもよい。場合によっては、人工抗原提示細胞は、同種抗原特異性を誘導しなくてもよい。ａＡＰＣは、場合によってはＨＬＡを発現しなくてもよい。ａＡＰＣは、活性化および／または刺激に用いることができる遺伝子を安定的に発現するように遺伝子修飾されてもよい。場合によっては、Ｋ５６２細胞は活性化に使用されてもよい。また、Ｋ５６２細胞は増殖に使用されてもよい。Ｋ５６２細胞は、ヒト赤白血病細胞系であり得る。Ｋ５６２細胞は、目的の遺伝子を発現するように操作されていてもよい。Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、またはＣＤ１ｄ分子を内因的に発現しないが、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ－３（ＣＤ５８）を発現してもよい。Ｋ５６２は、Ｔ細胞にシグナル１を送達するように操作されてもよい。例えば、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現するように操作されてもよい。場合によって、Ｋ５６２細胞は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、トランケート型ＣＤ１９、または任意の組合せのような追加の分子を発現するように操作されてもよい。場合によって、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、膜状の抗ＣＤ３ ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３を発現することができる。場合によって、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、膜状の抗ＣＤ３ ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３、膜状の抗ＣＤ２８ ｍＡｂを発現することができる。

【0194】

[00268]ａＡＰＣは、ビーズであり得る。球形のポリスチレンビーズは、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でコーティングされ、Ｔ細胞の活性化に使用され得る。ビーズは任意のサイズであり得る。場合によって、ビーズは、約３および６マイクロメートルであり得る。ビーズは、約４．５マイクロメートルのサイズであり得る。ビーズは、任意の細胞／ビーズ比で利用され得る。例えば、１ミリリットルあたり１００万個の細胞で３対１のビーズ対細胞比が使用され得る。ａＡＰＣは、剛性で球形の粒子、ポリスチレンラテックスのマイクロビーズ、磁気ナノ粒子またはマイクロ粒子、ナノサイズの量子ドット、４、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）の微小球、非球形の粒子、５、カーボンナノチューブバンドル、６、楕円体のＰＬＧＡ微小粒子、７、ナノワーム（ｎａｎｏｗｏｒｍ）、流動性脂質二重層含有システム、８、２Ｄ支持脂質二重層（２Ｄ－ＳＬＢ）、９、リポソーム、１０、ＲＡＦＴソーム／マイクロドメインリポソーム、１１、ＳＬＢ粒子、またはこれらの任意の組合せ、でもあり得る。場合によって、ａＡＰＣはＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させることができる。例えば、ａＡＰＣは、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４ Ｔ細胞の抗原処理および提示経路を模倣するように操作され得る。Ｋ５６２は、ＨＬＡ－Ｄ、ＤＰα、ＤＰβ鎖、Ｉｉ、ＤＭα、ＤＭβ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはそれらの任意の組合せを発現するように操作され得る。例えば、ＨＬＡ拘束性抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させるために、操作されたＫ５６２細胞はＨＬＡ拘束性ペプチドでパルスされ得る。場合によって、ａＡＰＣの使用は、Ｔ細胞の活性化、増殖、または任意の組合せのために外因性に導入されたサイトカインと組み合わせることができる。また、ゲノム的に移植された細胞を対象に投与した後、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、対象の血液中で細胞は増殖し得る。

【0195】

[00269]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞の集団の形質導入を含むことができる。一部の実施形態では、方法は、キメラ抗原受容体および／またはＴ細胞受容体のような細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。場合によって、細胞のトランスフェクションは実行され得る。

【0196】

[00270]一部の実施形態では、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲのような細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルス上清が生成される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよび／またはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。パッケージング細胞を使用して、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成することができる。そのような細胞は、２９３細胞、（例えば、アデノウイルスをパッケージングするための）、およびＰｓｉ２細胞またはＰＡ３１７細胞（例えば、レトロウイルスをパッケージングするための）を含むことができる。ウイルスベクターは、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする細胞系を製造することによって生成することができる。ベクターは、パッケージングおよびその後の宿主への統合に必要な最小限のウイルス配列を含むことができる。ベクターは、発現すべきポリヌクレオチドのための発現カセットで置換された他のウイルス配列を含むことができる。欠けているウイルスの機能は、パッケージング細胞系によってｉｎ ｔｒａｎｓで供給され得る。例えば、ＡＡＶベクターは、パッケージングおよび宿主ゲノムへの統合に必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列を含むことができる。ウイルスＤＮＡは、ＩＴＲ配列を欠く一方で、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含むことができる細胞系においてパッケージされ得る。細胞系はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染することができる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができる。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。細胞への核酸の送達のための追加の方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＵＳ２００３００８７８１７に記載されているように、使用され得る。

【0197】

[00271]一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つまたは複数のベクターで一過性または非一過性にトランスフェクトされ得る。細胞は、対象に天然に存在する状態でトランスフェクトされ得る。細胞は、対象から採取される、または対象に由来することができ、トランスフェクトされ得る。細胞は、細胞系など、対象から採取した細胞に由来することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のベクターでトランスフェクトした細胞を使用して、１つまたは複数のベクター由来の配列を含む新しい細胞系を確立する。真核生物宿主細胞用のベクターの非限定的な例としては、以下の、ｐＢｓ、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４Ｏ、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物：ｐＷＬ－ｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）。また、その他のプラスミドやベクターについても、選択した宿主で複製および生存可能なものであれば、どのようなものでも使用可能である。任意のベクターおよび市販されているもの（およびそのバリアントまたは誘導体）は、本方法で使用するために、１つまたは複数の組換え部位を含むように操作され得る。そのようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓなどから入手され得る。目的の他のベクターとしては、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ－Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、およびｐＫＫ２３２－８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、ならびにｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａ－ｃＨｉｓＡ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ１１１、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３ ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）、ならびにそれらのバリアントまたは誘導体のような真核生物発現ベクターが挙げられる。その他のベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、Ｐ１（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ－５、ｐＥＴ－９、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０およびｐＳＹＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が挙げられる。また、目的の追加のベクターとしては、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａ－ｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（－）／Ｍｙｃ－Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡ０８１Ｓ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅ－Ｂａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒ０１．１、ｐＺＥｒＯ－２．１、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１－Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手；Ｘ ＥｘＣｅｌｌ、Ｘｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＧＥＸ－１Ｘ Ｔ、ｐＧＥＸ－２Ｔ、ｐＧＥＸ－２ＴＫ、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＧＥＸ－４Ｔ－２、ｐＧＥＸ－４Ｔ－３、ｐＧＥＸ－３Ｘ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－５Ｘ－２、ｐＧＥＸ－５Ｘ－３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２－８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手；ｐＳＣＲＥＥＮ－ｌｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－２、ｐＣＩＴＥ－４－ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ－２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ－３２Ｌ１Ｃ、ｐＥＴ－３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ－２ｃｐ ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ－２ｃｐＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－２ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－２、Ｘ ＳＣＲＥＥＮ－１、Ｘ Ｂ１ｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ－３ａｂｃｄ、ｐＥＴ－７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ ａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＥＴ－１６ｂ、ｐＥＴ－１７ｂ－ｐＥＴ－１７ｘｂ、ｐＥＴ－１９ｂ、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ－２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ－１、ｐＢＡＣｇｕｓ－１、ｐＢＡＣ４ｘ－１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ－１、ｐＢＡＣ－３ ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ－２ ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ－１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ－Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ－Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ－Ｇｐｔ、Ｎｏｖａｇｅｎから入手；ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２－１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ ＧＬ、ｐＧＡＤ ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ－１、ｐＥＧＦＰＮ、ｐＥＧＦＰ－Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ－ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２－Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２－Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２－Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＩ３ｇａｌ－Ｂａｓｉｃ、ｐｌ３ｇａｌ－Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＩ３ｇａｌ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＩ３ｇａｌ－Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ－Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ－Ｏｎ、ｐＴＫ－Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ－ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ－ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ－１／２／３、ｐＹＥＸ－Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ－Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、２Ｘｇｔ１０、Ｘｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびＸ ＴｒｉｐｌＥｘ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手；Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋／－、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／－、ｐＡＤ－ＧＡＬ４、ｐＢＤ－ＧＡＬ４ Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ ＦＩＸ ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｇｔ Ａｍｐ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／－、ｐＢＣ ＫＳ＋／－、ｐＢＣ ＳＫ＋／－、Ｐｈａｇ－ｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＣＡＬ－ｎ，ｐＣＡＬ－ｃ、ｐＣＡＬ－ｋｃ、ｐＥＴ－３ａｂｃｄ、ｐＥＴ－ｌｌａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ ３ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ｐＭＣｌｎｅｏ Ｐｏｌｙ Ａ、ｐＯＧ４４，ｐ０Ｇ４５、ｐＦＲＴＩ３ＧＡＬ、ｐＮＥ０Ｉ３ＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手；ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１－３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２－１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ－ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ－ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ－１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４－５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ、ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは、小環状ベクターであり得る。本明細書で提供されるベクターを使用して、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲをコードするポリペプチドを送達することができる。

【0198】

[00272]形質導入および／またはトランスフェクションは、非ウイルストランスフェクション、微粒子銃、化学的トランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、ヒートショックトランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジェクション、またはウイルストランスフェクションのいずれか１つによって実施され得る。一部の実施形態では、提供される方法は、ウイルス形質導入を含み、ウイルス形質導入は、レンチウイルスを含む。ウイルス粒子を使って、細胞受容体をコードするポリペプチド配列を含むウイルスベクターを、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞内に送達することができる。場合によって、本明細書で開示されるウイルスベクターは、ｐｆｕ（プラーク形成単位、ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）として測定されてもよい。場合によって、本開示の組成物および方法の組換えウイルスまたはウイルスベクターのｐｆｕは、約１０^８～約５×１０^１０ｐｆｕであってもよい。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、および５×１０^１０ｐｆｕである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、および５×^１０ｐｆｕである。一部の態様では、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定されてもよい。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０^１０～３×１０^１２ベクターゲノム、または１×１０^９～３×１０^１３ベクターゲノムまたは１×１０^８～３×１０^１４ベクターゲノム、または、少なくとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、および１×１０^１８のベクターゲノムであるか、または１×１０^８～３×１０^１４のベクターゲノムであるか、または最大で約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、および１×１０^１８のベクターゲノムである。場合によって、本明細書で提供されるウイルスベクターは、感染多重度（ＭＯＩ）を用いて測定され得る。場合によって、ＭＯＩは、核酸が送達される細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比、または多重を表す場合がある。場合によって、ＭＯＩは１×１０^６であってもよい。場合によって、ＭＯＩは１×１０^５～１×１０^７であってもよい。場合によって、ＭＯＩは１×１０^４～１×１０^８であってもよい。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、および１×１０^１８ＭＯＩである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０^８～３×１０^１４ＭＯＩであるか、または、最大で約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、および１×１０^１８ＭＯＩである。場合によって、ウイルスベクターは、細胞あたり約１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７から、または約９×１０^９までのゲノムコピー／ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で導入される。

【0199】

[00273]本明細書に記載の核酸送達プラットフォームのいずれかを用いた細胞のトランスフェクション効率、例えば、形質導入は、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９％以上であり得る。一部の実施形態では、方法は、細胞の集団を含む組成物に感染剤を添加する工程を含むことができる。感染剤は、ポリブレンを含むことができる。一部の態様では、感染剤は、ウイルス感染の効率を高めることができる。感染剤は、ウイルスの感染力を約１００～１，０００倍に高めることができる。ポリブレンは、１ｍｌあたり約５μｇから１０μｇの濃度で組成物に添加され得る。

【0200】

[00274]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞受容体を細胞に導入する非ウイルス性アプローチを含むことができる。非ウイルス性アプローチには、以下のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ａｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼを含むことができるが、これらに限定されない。ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼ、遺伝子修飾されたヌクレアーゼ、および／または組換えヌクレアーゼであり得る。トランスポゾンベースのシステム（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）を用いて非ウイルス性アプローチは実施され得る。

【0201】

[00275]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＰｉｇｇｙＢａｃシステムを利用して、外因性ポリペプチドを細胞に導入することができる。ＰｉｇｇｙＢａｃシステムは、トランスポゾンとトランスポザーゼの２つの構成要素を含む。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、ゲノム中にランダムに分散している「ＴＴＡＡ」部位にトランスポゾンを特異的に統合することを容易にする。ゲノム中の「ＴＴＡＡ」の予測される頻度は、ＤＮＡ配列の２５６塩基対に約１個である。また、他のトランスポゾンと異なり、ＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンを完全にシームレスに切除することができ、配列や変異を残すことはない。さらに、ＰｉｇｇｙＢａｃは、上限が知られていない大きな積荷運搬容量（２００ｋｂ以上が実証されている）を提供する。ＰＢの性能レベルは、コドン最適化戦略、突然変異、欠失、付加、置換、およびそれらの任意の組合せによって向上させることができる。場合によって、ＰＢは、より大きな積荷（約９．１～１４．３ｋｂ）、より高い転位活性を有することができ、その痕跡を残さない特性は、遺伝子編集ツールとして魅力的であり得る。一部の態様では、ＰＢは、高効率の転位、大きな積荷、長期にわたる安定した発現、トランス遺伝子が１コピーとして統合されること、ＰＣＲなどの従来の方法の代わりに、非侵襲的なマークで標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで追跡すること、統合部位の決定が容易であること、およびそれらの組合せなどの特徴を含むことができる。

【0202】

[00276]一部の態様では、本明細書で提供される方法は、細胞受容体をコードするポリペプチドを細胞に導入するためにＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）システムを利用することができる。ＳＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの進化によってサケ科のゲノム内で見つかった古代のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンの化石から、操作を加えることで作製された。ＳＢ ＩＴＲ（２３０ｂｐ）には、トランスポザーゼの認識シグナルとして機能する長さ３２ｂｐの不完全な直列反復配列（ＤＲ）が含まれている。ＩＴＲ内のＤＲエレメント間の結合親和性と間隔が、転位活性に関与している。ＳＢトランスポザーゼは、ＤＮＡ結合ポリペプチド、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、および触媒ドメインを有する３９ｋＤａのタンパク質であり得、保存されたアミノ酸モチーフ（ＤＤＥ）を特徴とする。ＳＢトランスポザーゼの一次アミノ酸配列を変異させた様々なスクリーニングにより、トランスポザーゼの活性が高い型が得られた。場合によって、改変されたＳＢを利用することができる。改変されたＳＢは、元のＳＢトランスポゾンのＩＴＲ内の変異、欠失および付加を含むことができる。改変されたＳＢは、ｐＴ２、ｐＴ３、ｐＴ２Ｂ、ｐＴ４、ＳＢ１００Ｘ、およびそれらの組合せを含むことができる。改変ＳＢの非限定的な例は、以下の、ＳＢ１０、ＳＢ１１（ＳＢ１０より３倍高い）、ＳＢ１２（ＳＢ１０より４倍高い）、ＨＳＢ１－ＨＳＢ５（ＳＢ１０より１０倍まで高い）、ＨＳＢ１３～ＨＳＢ１７（ＨＳＢ１７はＳＢ１０より１７倍高い）、ＳＢ１００Ｘ（ＳＢ１０より１００倍高い）、ＳＢ１５０Ｘ（ＳＢ１０より１３０倍高い）、およびそれらの任意の組合せ、から選択することができる。場合によって、ＳＢ１００Ｘは、元々復活したトランスポザーゼ（ＳＢ１０）と比較して１００倍高活性である。一部の態様では、ＳＢ転位の切除は、積荷部位に痕跡（３ｂｐ）を残す。統合はゲノムのＴＡジヌクレオチドに起こり、宿主の修復機構によって標的部位の重複が生成される。場合によって、ＳＢはほぼ偏りのない、ランダムに近い統合プロファイルを持っているように見える。野生型システムでは、トランスポゾンの統合は人為的に所定のゲノム遺伝子座に１０％程度の効率で標的とすることができるが、本明細書で提供するキメラシステムでは、ＳＢトランスポゾンの統合は１０％超の効率で所定の遺伝子座に向けることができる。

【0203】

[00277]一部の態様では、細胞の集団に外因性ポリ核酸を導入するために、非ウイルス性アプローチが取られてもよい。一部の態様では、非ウイルス性ベクターまたは核酸は、ウイルスを使用せずに送達されてもよく、核酸の量に応じて測定されてもよい。一般に、任意の適切な量の核酸は、本開示の組成物および方法とともに使用され得る。場合によって、核酸は、少なくとも約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ，７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇであってもよい。場合によって、核酸は、最大で約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ，７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇであってもよい。

【0204】

[00278]一部の実施形態では、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ配列を細胞に導入する非ウイルス性アプローチは、エレクトロポレーションを含むことができる。エレクトロポレーションは、例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行うことができる。エレクトロポレーションのパラメーターは、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために調整される場合がある。エレクトロポレーションデバイスは、指数関数的減衰、時定数、方形波のような、複数の電気波形パルス設定が可能である。すべての細胞タイプには、適用されるパルスパラメーター（電圧、静電容量、抵抗など）に依存する固有の最適電界強度（Ｅ）がある。最適な電界強度を適用すると、膜貫通電圧の誘導による電気透過性化（ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が起こり、核酸が細胞膜を通過できるようになる。場合によって、エレクトロポレーションパルス電圧、エレクトロポレーションパルス幅、パルス数、細胞密度、チップの種類を調整することで、トランスフェクション効率および／または細胞生存率が最適化される場合がある。

【0205】

[00279]一部の実施形態では、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパルス電圧を変化させてもよい。場合によって、エレクトロポレーション電圧は、約５００ボルト未満であってもよい。場合によって、エレクトロポレーション電圧は、少なくとも約５００ボルト、少なくとも約６００ボルト、少なくとも約７００ボルト、少なくとも約８００ボルト、少なくとも約９００ボルト、少なくとも約１０００ボルト、少なくとも約１１００ボルト、少なくとも約１２００ボルト、少なくとも約１３００ボルト、少なくとも約１４００ボルト、少なくとも約１５００ボルト、少なくとも約１６００ボルト、少なくとも約１７００ボルト、少なくとも約１８００ボルト、少なくとも約１９００ボルト、少なくとも約２０００ボルト、少なくとも約２１００ボルト、少なくとも約２２００ボルト、少なくとも約２３００ボルト、少なくとも約２４００ボルト、少なくとも約２５００ボルト、少なくとも約２６００ボルト、少なくとも約２７００ボルト、少なくとも約２８００ボルト、少なくとも約２９００ボルト、または少なくとも約３０００ボルトであってもよい。場合によって、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要なエレクトロポレーションパルス電圧は、細胞の種類に特異的であってもよい。例えば、１９００ボルトのエレクトロポレーション電圧は、マクロファージ細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。別の例では、約１３５０ボルトのエレクトロポレーション電圧は、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＴ細胞のようなヒト初代細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。場合によって、所与の細胞の種類に対して、さまざまなエレクトロポレーション電圧が最適となる場合がある。例えば、約１０００ボルトから約１３００ボルトの間のエレクトロポレーション電圧が、ヒト５７８Ｔ細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。場合によって、初代細胞は初代リンパ球であり得る。場合によって、初代細胞の集団は、リンパ球の集団であり得る。

【0206】

[00280]一部の実施形態では、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパルス幅を変化させてもよい。場合によって、エレクトロポレーションパルス幅は、約５ミリ秒未満であってもよい。場合によって、エレクトロポレーション幅は、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約６ミリ秒、少なくとも約７ミリ秒、少なくとも約８ミリ秒、少なくとも約９ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１１ミリ秒、少なくとも約１２ミリ秒、少なくとも約１３ミリ秒、少なくとも約１４ミリ秒少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約１６ミリ秒、少なくとも約１７ミリ秒、少なくとも約１８ミリ秒、少なくとも約１９ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約２１ミリ秒、少なくとも約２２ミリ秒、少なくとも約２３ミリ秒、少なくとも約２４ミリ秒、少なくとも約２５ミリ秒、少なくとも約２６ミリ秒。少なくとも約２７ミリ秒、少なくとも約２８ミリ秒、少なくとも約２９ミリ秒、少なくとも約３０ミリ秒、少なくとも約３１ミリ秒、少なくとも約３２ミリ秒、少なくとも約３３ミリ秒、少なくとも約３４ミリ秒、少なくとも約３５ミリ秒、少なくとも約３６ミリ秒、少なくとも約３７ミリ秒、少なくとも約３８ミリ秒。少なくとも約３９ミリ秒、少なくとも約４０ミリ秒、少なくとも約４１ミリ秒、少なくとも約４２ミリ秒、少なくとも約４３ミリ秒、少なくとも約４４ミリ秒、少なくとも約４５ミリ秒、少なくとも約４６ミリ秒、少なくとも約４７ミリ秒、少なくとも約４８ミリ秒、少なくとも約４９ミリ秒、または少なくとも約５０ミリ秒であってもよい。場合によって、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要なエレクトロポレーションパルス幅は、細胞の種類に特異的であってもよい。例えば、３０ミリ秒のエレクトロポレーションパルス幅は、マクロファージ細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。別の例では、約１０ミリ秒のエレクトロポレーション幅は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。場合によって、所与の細胞の種類に対して、さまざまなエレクトロポレーション幅が最適となる場合がある。例えば、約２０ミリ秒から約３０ミリ秒の間のエレクトロポレーション幅が、ヒト５７８Ｔ細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。

【0207】

[00281]一部の実施形態では、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパルス数を変化させてもよい。場合によって、エレクトロポレーションは、単一パルスを含んでもよい。場合によって、エレクトロポレーションは、１回以上のパルスを含んでもよい。場合によって、エレクトロポレーションは、２パルス、３パルス、４パルス、５パルス、６パルス、７パルス、８パルス、９パルス、または１０以上のパルスを含んでもよい。場合によって、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要なエレクトロポレーションパルスの数は、細胞の種類に特異的であってもよい。例えば、単一パルスのエレクトロポレーションは、マクロファージ細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。別の例では、３パルスのエレクトロポレーションは、初代細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。場合によって、所与の細胞の種類に対して、さまざまなエレクトロポレーション幅が最適となる場合がある。例えば、約１パルスから約３パルスの間のエレクトロポレーションが、ヒト細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。

【0208】

[00282]一部の実施形態では、エレクトロポレーションのための開始細胞密度は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために変化させてもよい。場合によって、エレクトロポレーションのための開始細胞密度は、約１×１０^５細胞未満であってもよい。場合によって、エレクトロポレーションのための開始細胞密度は、少なくとも約１×１０^５細胞、少なくとも約２×１０^５細胞、少なくとも約３×１０^５細胞、少なくとも約４×１０^５細胞、少なくとも約５×１０^５細胞、少なくとも約６×１０^５細胞、少なくとも約７×１０^５細胞、少なくとも約８×１０^５細胞、少なくとも約９×１０^５細胞、少なくとも約１×１０^６細胞、少なくとも約１．５×１０^６細胞、少なくとも約２×１０^６細胞、少なくとも約２．５×１０^６細胞、少なくとも約３×１０^６細胞、少なくとも約３．５×１０^６細胞、少なくとも約４×１０^６細胞、少なくとも約４．５×１０^６細胞、少なくとも約５×１０^６細胞、少なくとも約５．５×１０^６細胞、少なくとも約６×１０^６細胞、少なくとも約６．５×１０^６細胞、少なくとも約７×１０^６細胞、少なくとも約７．５×１０^６細胞、少なくとも約８×１０^６細胞、少なくとも約８．５×１０^６細胞、少なくとも約９×１０^６細胞、少なくとも約９．５×１０^６細胞、少なくとも約１×１０^７細胞、少なくとも約１．２×１０^７細胞、少なくとも約１．４×１０^７細胞、少なくとも約１．６×１０^７細胞、少なくとも約１．８×１０^７細胞、少なくとも約２×１０^７細胞、少なくとも約２．２×１０^７細胞、少なくとも約２．４×１０^７細胞、少なくとも約２．６×１０^７細胞、少なくとも約２．８×１０^７細胞、少なくとも約３×１０^７細胞、少なくとも約３．２×１０^７細胞、少なくとも約３．４×１０^７細胞、少なくとも約３．６×１０^７細胞、少なくとも約３．８×１０^７細胞、少なくとも約４×１０^７細胞、少なくとも約４．２×１０^７細胞、少なくとも約４．４×１０^７細胞、少なくとも約４．６×１０^７細胞、少なくとも約４．８×１０^７細胞、または少なくとも約５×１０^７細胞であってもよい。場合によって、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要なエレクトロポレーションのための開始細胞密度は、細胞の種類に特異的であってもよい。例えば、１．５×１０^６細胞のエレクトロポレーションのための開始細胞密度は、マクロファージ細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。別の例では、５×１０^６細胞のエレクトロポレーションのための開始細胞密度は、ヒト細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。場合によって、所与の細胞の種類に対して、さまざまなエレクトロポレーションのための開始細胞密度が最適となる場合がある。例えば、５．６×１０^６細胞から５×１０^７細胞の間のエレクトロポレーションのための開始細胞密度が、Ｔ細胞のようなヒト細胞に最適（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供）である場合がある。

【0209】

[00283]リンパ性悪性腫瘍を治療する方法が提供される。方法は、それを必要とする患者に、操作された免疫細胞の集団を投与することを含むことができる。集団の個々の操作された免疫細胞は、結合部分を含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、結合部分が、免疫細胞抗原に結合することができる抗原結合性ドメインを含み、ならびに１つまたは複数のＣＡＲの各ＣＡＲが、さらに、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。集団の個々の操作された免疫細胞は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができるエンハンサー部分をさらに含むことができる。操作された免疫細胞の内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、不活性化されていてもよい。場合によって、患者の末梢血の病的細胞の数または骨髄の病的細胞の数は、操作された免疫細胞の最後の投薬の後の期間（例えば、３週間）以内に少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上減少され得る。場合によって、操作された免疫細胞の最後の投与後の期間は、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれ以上であり得る。患者の末梢血の自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数は、操作された免疫細胞の最後の投薬の後の期間（例えば、３週間）以内に増加し始めることができる。場合によって、操作された免疫細胞の最後の投与後の期間は、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれ以上であり得る。

【0210】

[00284]エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を高めることができる。エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の活性を構成的に高めるように構成され得る。エンハンサー部分は、操作された免疫細胞の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路を構成的に上方調節するように構成され得る。１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路は、１つまたは複数のサイトカインシグナル伝達経路であり得る。エンハンサー部分は、サイトカインまたはサイトカイン受容体であり得る。エンハンサー部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１２２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＡＬ－４、ＴＩＭ－３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９、ＴＧＦＲβ、その受容体、それらの機能性断片、それらの機能性バリアント、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。

【0211】

[00285]操作された免疫細胞は、細胞死アクティベーターと接触すると細胞の死を生じさせることができる誘導性細胞死部分をさらに含むことができる。誘導性細胞死部分は、ｒａｐａＣａｓｐ９、ｉＣａｓｐ９、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、Ｈｅｒ２ｔ、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲｔからなる群から選択され得る。例えば、誘導性細胞死部分はＥＧＦＲｔであり、ならびに細胞死アクティベーターはＥＧＦＲｔに結合する抗体またはその抗原結合断片であり得る。別の例では、誘導性細胞死部分はＨＳＶ－ＴＫであり、ならびに細胞死アクティベーターはＧＣＶであり得る。別の例では、誘導性細胞死部分はｉＣａｓｐ９であり、ならびに細胞死アクティベーターはＡＰ１９０３であり得る。

【0212】

[00286]細胞の内因性表面マーカーをコードする遺伝子は、不活性化され得る。内因性表面マーカーは、発現されたときに第１の抗原結合性ドメインに結合することができる可能性がある。内因性表面マーカーは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２２，ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ２１８、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２７９、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３０５、ＣＤ３３５（ＮＫＰ４６）、ＣＤ３３７、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβまたはＳＬＡＭＦ７、であり得る。

【0213】

[00287]末梢血における病的細胞の数または骨髄における病的細胞の数が少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上減少する前に、患者の末梢血における自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数が増加し始めてもよい。末梢血における病的細胞の数または骨髄における病的細胞の数が少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上減少した後に、末梢血における自家Ｔ細胞、顆粒球、およびＮＫ細胞のうちの任意の１つまたは複数の数が増加し始めてもよい。

【実施例】

【0214】

実施例１ ＴＣＲノックアウトを伴うＣＤ３＋ＣＤ１９二重ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔスイッチを発現するＵ－ＣＡＲ Ｔ細胞の研究
一般的な材料および方法
[00288]ドナー血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離およびＴ細胞の増殖
[00289]末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を介してＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてドナー血液から単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリングさせた磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0215】

[00290]細胞系およびＰＢＭＣの培養
[00291]Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫細胞、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ８６）；
[00292]Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ２４３）；
[00293]Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系（ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスでトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞をスクリーニングすることにより得られる）
[00294]２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ３２１６）。

【0216】

[00295]Ｒａｊｉ細胞、Ｋ５６２細胞およびＲａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭの両方に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム補足した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0217】

[00296]Ｔ細胞および得られたＣＡＲ－Ｔ細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５培地（５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含む）中で培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の培地にはさらに、ｒｈＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終濃度３００ＩＵ／ｍｌで２日ごとに補足した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0218】

１．１ ＣＡＲの設計およびウイルスのパッケージ
[00297]キメラ抗原受容体の構造は、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－Ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（タンデム）、ｔＥＧＦＲ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ（パラレル）、ｔＥＧＦＲ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ４１ＢＢ－ＣＤ３ζ（タンデム）、およびＣＤ１９ＶＬ－ＣＤ３ＶＬ－ＣＤ３ＶＨ－ＣＤ１９ＶＨ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ（ループ）であり、ＥＧＦＲｔ（またはｔＥＧＦＲ）はスイッチとしてのトランケート型ＥＧＦＲであり、ＣＤ３ ｓｃＦｖ断片は、モノクローナル抗体ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１の重鎖および軽鎖可変領域（ＧＳリンカーにより連結されている）であり、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ断片は、ＣＡＲ検出用のビーコン配列を含むモノクローナル抗体ＦＭＣ６３の重鎖および軽鎖可変領域（ＧＳリンカーにより連結されている）であり、ヒンジ領域、膜貫通領域、ヒトＣＤ２８細胞内共刺激エレメント、およびヒトＣＤ３ζ細胞内領域もまたタンデムで含む。キメラ抗原受容体の例示的な構築物を図１に示す。

【0219】

[00298]ＥＧＦＲｔ－ＯＫＴ３－ＦＭＣ６３－ＣＤ２８ｚ（配列番号１）のアミノ酸配列は、下記の通りである。
[00299]MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGSTSGGGSGGGSGGGGSSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAADYKDDDDKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00300]ＥＧＦＲｔ－ＯＫＴ３－ＣＤ２８ｚアミノ酸配列において、下線部分は安全スイッチシグナルペプチド領域であり、イタリック部分はｔＥＧＦＲであり、イタリック下線部分はｔＥＧＦＲ ＴＭであり、曲線部分はＰ２Ａであり、イタリック曲線下線部分はＣＡＲシグナルペプチドであり、ボールド部分はＯＫＴ３ ＶＨであり、破線の下線部分は連結ペプチドであり、ボールド下線部分はＯＫＴ３ ＶＬであり、ボールドイタリック部分はＦＭＣ６３ ＶＬであり、ボールドイタリック下線部分はＦＭＣ６３ ＶＨであり、囲まれた部分はＣＤ２８ヒンジ領域の膜貫通領域および共刺激ドメインであり、囲まれたイタリック部分はＣＤ３ｚである。

【0220】

[00301]ＥＧＦＲｔ－ＯＫＴ３－ＦＭＣ６３－ＣＤ２８ｚのヌクレオチド酸配列は、配列番号２に記載される通りである。
[00302]配列番号２：
ATGTTGCTCCTTGTGACGAGCCTCCTGCTCTGCGAGCTGCCCCATCCAGCCTTCCTCCTCATCCCGCGGAAGGTGTGCAATGGCATAGGCATTGGCGAGTTTAAAGATTCTCTGAGCATAAATGCTACGAATATTAAGCATTTCAAGAATTGTACTTCTATTAGTGGCGACCTCCATATTCTTCCGGTTGCCTTCAGGGGTGACTCTTTCACCCACACACCTCCATTGGATCCACAAGAACTTGACATCCTGAAGACGGTTAAAGAGATTACAGGCTTCCTCCTTATCCAAGCGTGGCCCGAGAACAGAACGGACTTGCACGCCTTTGAGAACCTCGAAATAATACGGGGTCGGACGAAGCAACACGGCCAATTTAGCCTTGCGGTTGTTAGTCTGAACATTACTTCTCTCGGCCTTCGCTCTTTGAAAGAAATCAGCGACGGAGATGTCATCATTAGTGGAAACAAGAACCTGTGCTACGCGAACACAATCAACTGGAAGAAGCTCTTCGGTACTTCAGGCCAAAAGACAAAGATTATTAGTAACAGAGGAGAGAATAGCTGTAAGGCTACCGGACAAGTTTGTCACGCCTTGTGTAGTCCAGAGGGTTGCTGGGGACCGGAACCAAGGGATTGCGTCAGTTGCCGGAACGTGAGTCGCGGACGCGAGTGTGTGGATAAGTGCAATCTTCTGGAAGGGGAACCGCGAGAGTTTGTAGAAAATTCCGAATGTATACAGTGTCATCCCGAGTGTCTTCCACAAGCAATGAATATCACATGTACAGGGAGGGGTCCTGATAACTGTATCCAATGTGCACACTACATAGATGGTCCTCACTGTGTAAAGACGTGCCCCGCCGGAGTAATGGGTGAAAACAACACCCTCGTGTGGAAGTACGCCGATGCCGGGCATGTCTGTCATTTGTGTCATCCCAACTGCACATATGGCTGTACCGGTCCTGGATTGGAGGGCTGTCCAACAAACGGGCCGAAAATACCGAGTATCGCAACAGGCATGGTGGGAGCACTTTTGCTTCTCCTCGTTGTCGCCCTGGGCATCGGCTTGTTCATGCGAGCTAAACGAGGCTCAGGCGCGACGAACTTTAGTTTGCTGAAGCAAGCTGGGGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCCATGGCCCTTCCAGTGACAGCCTTGTTGTTGCCACTTGCTCTGCTGCTCCACGCTGCGCGGCCACAGGTCCAGTTGCAGCAGTCAGGCGCCGAATTGGCGCGACCAGGGGCAAGCGTAAAGATGAGCTGTAAGGCATCCGGGTACACGTTCACTCGCTATACCATGCATTGGGTTAAACAACGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGGTATATCAACCCATCCCGGGGCTACACTAACTATAATCAAAAGTTTAAAGATAAAGCAACCCTTACGACCGACAAATCATCTTCTACCGCATACATGCAGCTCAGCTCCCTCACCAGTGAAGATTCTGCCGTTTATTATTGTGCACGATACTATGACGATCACTATTGCCTGGACTACTGGGGTCAAGGCACCACACTTACTGTCAGTTCCGGAAGTACCAGTGGGGGAGGTTCTGGCGGTGGCAGCGGGGGTGGGGGTAGCTCACAAATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCTATCATGAGCGCCTCCCCAGGGGAAAAGGTGACGATGACATGCTCAGCCAGCTCCAGTGTATCCTACATGAATTGGTATCAACAGAAGAGTGGGACGTCACCCAAAAGATGGATTTATGACACCAGCAAATTGGCCAGCGGAGTACCAGCGCATTTCAGAGGCAGTGGGAGTGGAACATCTTATTCTCTCACCATTAGCGGCATGGAAGCAGAGGATGCAGCAACGTACTATTGTCAACAATGGAGCTCTAATCCCTTTACGTTCGGCAGCGGCACTAAGCTCGAAATTAATAGGGGTGGCGGCGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCTGGAGGTGGGGGCAGTGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
[00303]ＥＧＦＲｔ－ＵＣＨＴ１－ＦＭＣ６３－ＣＤ２８ｚ（配列番号３）のアミノ酸配列は、下記の通りである。

【0221】

[00304]MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITAAADYKDDDDKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00305]ＥＧＦＲｔ－ＵＣＨＴ１－ＦＭＣ６３－ＣＤ２８ｚのアミノ酸配列において、下線部分は安全スイッチシグナルペプチド（ＧＭＣＳＦＲ－Ｌ）であり、イタリック部分はｔＥＧＦＲ、イタリック下線部分はｔＥＧＦＲ ＴＭであり、曲線下線部分はＰ２Ａであり、イタリック曲線下線部分はＣＡＲシグナルペプチド（ＣＤ８ Ｌ）であり、ボールド部分はＵＣＨＴ１ ＶＬであり、破線の下線部分は連結ペプチドであり、ボールド下線部分はＵＣＨＴ１ ＶＨであり、ボールドイタリック部分はＦＭＣ６３ ＶＨ、ボールドイタリック下線部分はＦＭＣ６３ ＶＬ、囲まれた部分はＣＤ２８ヒンジ領域膜貫通領域および共刺激ドメインであり、および囲まれたイタリック部分はＣＤ３ｚである。

【0222】

[00306]ＥＧＦＲｔ－ＵＣＨＴ１－ＦＭＣ６３－ＣＤ２８ｚのヌクレオチド酸配列は、配列番号４に記載される通りである。
[00307]配列番号４：
ATGCTGCTGCTCGTGACATCCCTCTTATTATGCGAACTCCCTCACCCCGCTTTTCTGCTGATCCCCAGAAAGGTGTGCAACGGCATCGGCATTGGAGAGTTCAAGGATTCTTTAAGCATCAACGCTACCAACATCAAACATTTCAAGAACTGTACCTCCATTTCCGGCGATTTACACATCCTCCCCGTTGCCTTTCGTGGCGATAGCTTCACACACACACCCCCTCTGGACCCTCAAGAACTGGACATTTTAAAGACCGTGAAGGAGATCACTGGTTTTTTACTGATCCAAGCTTGGCCCGAAAATAGGACAGATCTCCACGCTTTCGAGAATTTAGAGATCATTCGTGGCAGAACCAAGCAGCACGGACAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAATATCACCTCTTTAGGTTTAAGATCTTTAAAAGAGATCAGCGATGGCGACGTCATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGTTACGCCAACACCATTAATTGGAAAAAGCTGTTTGGCACCTCCGGACAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGCGAGAACAGCTGCAAAGCTACCGGCCAAGTTTGCCACGCTCTGTGTAGCCCCGAAGGCTGCTGGGGACCCGAACCTCGTGACTGTGTGAGCTGTAGGAACGTGTCTCGTGGTCGTGAGTGTGTGGATAAGTGCAATTTACTCGAGGGCGAGCCCAGAGAGTTTGTGGAAAATAGCGAGTGCATCCAGTGCCACCCCGAATGTCTGCCCCAAGCTATGAACATTACTTGTACTGGTCGTGGCCCCGATAACTGTATCCAGTGCGCTCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACATGCCCCGCTGGCGTGATGGGAGAAAACAACACACTGGTGTGGAAGTATGCCGATGCCGGCCACGTCTGTCATCTGTGCCACCCTAACTGTACCTACGGCTGTACCGGACCCGGACTGGAGGGCTGTCCCACCAACGGACCCAAGATCCCTAGCATCGCCACCGGCATGGTGGGAGCCTTACTGCTGTTACTGGTGGTGGCTCTGGGCATTGGTTTATTCATGAGGGCCAAGAGAGGATCCGGCGCCACCAACTTTTCTTTACTGAAACAAGCTGGAGACGTCGAGGAAAACCCCGGACCCATGGCTCTCCCCGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTCGCTTTATTACTGCACGCCGCTAGGCCCGATATTCAGATGACCCAAAGCCCTAGCTCTTTATCCGCCAGCGTCGGAGATAGAGTCACAATCACTTGTAGAGCCAGCCAAGATATTCGTAATTATCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGTAAAGCCCCCAAGCTGCTCATCTATTACACCTCTCGTCTGGAGAGCGGCGTGCCTTCCAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTATACACTCACCATTAGCTCTTTACAGCCCGAAGATTTCGCTACCTACTACTGCCAGCAAGGTAATACTTTACCTTGGACCTTCGGCCAAGGTACCAAGGTCGAAATCAAGGGCGGCGGCGGATCCGGCGGCGGTGGATCTGGTGGCGGCGGCTCCGAAGTCCAGCTGGTCGAATCCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCCGGTGGATCCCTCAGACTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTATTCCTTCACCGGCTACACCATGAACTGGGTGAGACAAGCTCCCGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGCCCTCATCAACCCCTACAAGGGCGTGTCCACATATAATCAAAAGTTTAAGGACAGATTCACCATCAGCGTCGACAAGTCCAAGAACACCGCTTATTTACAGATGAACTCTTTAAGAGCTGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGGTCCGGCTACTACGGCGACAGCGACTGGTATTTTGACGTCTGGGGACAAGGTACCCTCGTGACAGTGAGCAGCGGCGGTGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGCTCCGGAGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAAGAAAGCGGACCCGGTCTCGTGGCTCCCTCCCAATCTTTATCCGTGACTTGTACCGTGTCCGGAGTCTCTTTACCCGACTACGGCGTGAGCTGGATTAGACAGCCCCCCAGAAAAGGTTTAGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGATCCGAGACCACATACTACAACAGCGCTTTAAAGTCTCGTCTGACAATCATCAAAGACAATTCCAAAAGCCAAGTTTTCCTCAAGATGAACTCTTTACAGACCGACGACACAGCCATTTACTACTGCGCCAAGCATTATTACTACGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGTACAAGCGTCACAGTGAGCTCCGGCAGCACATCCGGAAGCGGAAAGCCCGGCAGCGGAGAGGGCAGCACAAAGGGAGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCTTTAAGCGCCTCTTTAGGAGATAGGGTGACCATTAGCTGCAGAGCCTCCCAAGACATCAGCAAGTATCTCAATTGGTACCAGCAAAAGCCCGATGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCTCTCGTCTCCATTCCGGCGTGCCCAGCAGATTTAGCGGAAGCGGATCCGGAACAGACTATTCTTTAACAATCAGCAATTTAGAGCAAGAAGACATCGCCACATATTTCTGCCAACAAGGTAACACTTTACCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGATTACAGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
[00308]ＣＡＲ遺伝子をＥＦ１α（ＥＦ－１α）のプロモーター下でＦＵＷレンチウイルスベクター骨格にクローニングし、Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲを形成した。Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲ、レンチウイルスエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２５９）およびレンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２６０）を、全レンチウイルス発現ベクターを調製するためにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上清を４８時間および７２時間で回収し、濃縮のために超遠心分離（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。濃縮されたウイルスはＴ細胞のトランスフェクションのために準備された。

【0223】

[00309]結果は、レンチウイルスベクターの構築に成功し、ＥＧＦＲｔおよびＣＤ１９＋ＣＤ３ ＣＡＲの発現がともに予想どおりに検出されたことを示す。
１．２ ＣＲＩＳＰＲの設計および構築
[00310]最初に、ＴＣＲ保存領域の最初のエクソンを標的とするｇＲＮＡ配列をｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで設計し、スコアが８０を超える２つのｇＲＮＡ配列をより高いノックアウト効率のために選択した。ｇＲＮＡプライマーについては、フォワードプライマーは、Ｔ７プロモーター、続いて２０ｂｐの標的配列を含み、逆プライマーは、２０ｂｐの相補配列を有する。ｐＸ３３０プラスミドをＰＣＲ鋳型として使用した。精製後、Ｔ７－ＰＣＲ産物をさらにＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キットの鋳型として使用してＲＮＡを得た。ＲＮＡをＭＥＧＡｃｌｅａｒカラムで精製し、ＲＮＡ不含水で溶出した。Ｃａｓ９プラスミドはＡｄｄｇｅｎｅから購入した。

【0224】

[00311]ｇＲＮＡ標的配列は、以下の通りである：
[00312]TRAC-gRNA：TGTGCTAGACATGAGGTCTA、配列番号５；
[00313]一方、ｇＲＮＡのノックアウト効率をサーベイヤーアッセイ、ＴＩＤＥにより分析した。

【0225】

１．３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
[00314]細胞の単離および活性化
[00315]アフェレーシス後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて密度勾配遠心分離により単球を単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリングした磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0226】

[00316]５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含むＸ－ｖｉｖｏ１５をＣＡＲ－Ｔ細胞培地として使用した。細胞をインキュベートし、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0227】

[00317]ＣＤ１９を発現する細胞系：Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ８６）；Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ２４３）；Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系は、ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスをトランスフェクトしたＲａｊｉ細胞をスクリーニングすることによって得られた。

【0228】

[00318]ＣＤ３を発現する細胞系：Ｊｕｒｋａｔ細胞
[00319]すべての細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ３２１６）をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭの両方に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足した。

【0229】

[00320]エレクトロポレーション
[00321]Ｔ細胞を富化および活性化した２日後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズおよび細胞を管に回収し、３００ｇで５分間の遠心分離に供し、次にＤＰＢＳで２回洗浄し、１～３×１０^８／ｍｌの細胞密度でＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に再懸濁した。必要とされるｃａｓ９／ｇＲＮＡの量は、細胞密度に基づいて計算され、各々３０μｇ／ｍｌであった。Ｃａｓ９とｇＲＮＡを１：１に混合し、室温で１０分間インキュベートし、次にエレクトロポレーション緩衝液に移し、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムＮ（Ｌｏｎｚａ）システムによるエレクトロポレーションのために細胞とさらに混合した。次に、細胞を予め加温した培地中に１～２×１０^６／ｍｌの密度になるように再懸濁し、プレートに移し、続いて、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーター中で培養した。

【0230】

[00322]レンチウイルストランスフェクション
[00323]エレクトロポレーションの１日後、細胞を２～８のＭＯＩでレンチウイルスベクターでトランスフェクトし、フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0231】

[00324]細胞増殖およびＣＡＲ陽性率の検出
[00325]トランスフェクションの３日後に、細胞数およびＣＡＲ陽性細胞を検出し、Ｔ細胞におけるＣＡＲの陽性率を計算した。ＣＤ３とＰＤ１の陽性率もまた、ノックアウト効率を決定するために検出された。次に、細胞をインキュベーター内で連続的に培養し、培地の半分を２～３日ごとに置換し、細胞が凍結保存のために準備される１４日目まで行った。一例のワークフローを図２に示す。

【0232】

[00326]図３は、特定のマーカーの有無にかかわらず、二重ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞または対照細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。例えば、ＣＤ３は、内因性ＴＣＲノックアウト効率を示すマーカーであり得、３ＣＡＲ（ＣＤ３を標的とするＣＡＲ）は、ＣＤ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を示すマーカーであり得、１９ＣＡＲ（ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ）は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を示すマーカーであり得、ＥＧＦＲは、ＣＡＲ－Ｔ発現ＥＧＦＲｔを示すマーカーであり得る。図４は、特定のマーカーの有無にかかわらず、二重ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞または対照細胞の画分の別のフローサイトメトリーデータを示す。図４では、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲはモノクローナル抗体ＦＭＣ６３のｓｃＦｖであり、ＣＤ３を標的とするＣＡＲはモノクローナル抗体ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１のｓｃＦｖであった。結果は、調製したＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、ＥＧＦＲとＣＡＲの陽性率およびＣＤ３の陰性率が高かったことを示し、安全スイッチ（例えば、ＥＧＦＲｔ）を有する遺伝子ノックアウト二重ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、パラレルＥＧＦＲｔ）が首尾よく調製されたことを示す。

【0233】

１．４ サイトカインの放出
[00327]実施例１．３で調製した二重ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＤ１９陽性腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）、ＣＤ３陽性腫瘍細胞（Ｊｕｒｋａｔ）または初代同種異系ＰＢＭＣの各々１００μｌを、１：１の比で各細胞について１×１０^６／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ培地に混合し、次に９６ウェルプレート中で一晩培養した。次に、培地を回収し、遠心分離に供し、放出されたサイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－２をサイトカインビーズアレイキット（ＣＢＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。

【0234】

[00328]結果は、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ、Ｊｕｒｋａｔまたは初代同種異系ＰＢＭＣとの共インキュベートが、多量のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２を産生することを示し、ＣＤ１９陽性またはＣＤ３陽性標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔの機能を示す。

【0235】

１．５ ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺活性
[00329]ルシフェラーゼ遺伝子を標的細胞に導入し、次にスクリーニングすることにより、安定にトランスフェクトされた細胞系を得た。フルオレセインを添加後、ルシフェラーゼはフルオレセインと反応して蛍光を生成することができた。蛍光の強度を検出することにより、ルシフェラーゼの活性を測定し、細胞の生存を検出して、ＣＡＲＴ細胞の殺傷作用を評価することができる。

【0236】

[00330]図５Ａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、モノクローナル抗体ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１のｓｃＦｖを有するＣＤ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ１９およびＣＤ３を標的とする二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞（パラ１９３－Ｏおよびパラ１９３－Ｕ）、内因性ＴＣＲをノックアウトしたＣＤ１９ ＣＡＲ（ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ）、および内因性ＴＣＲをノックアウトしたＴ細胞対照（ＴＣＲ ＫＯ Ｔ細胞対照）の、それぞれ６時間および２４時間の１：１のＥ：Ｔ（エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞対標的がん細胞）でのＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６－Ｌｕｓ細胞およびＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ細胞に対する細胞毒性の棒グラフを示す。図５Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で共培養した場合、１日目から３日目までに測定したＪｕｒｋｅｔ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図５Ｃは、ＮＡＬＭ６細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の１：１のＥ：Ｔ比での共培養の１日目から３日目までに測定されたＣＤ３を発現するＴ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す。

【0237】

[00331]ＣＤ１９およびＣＤ３を標的とする二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、モノクローナル抗体ＵＣＨＴ１：ＧＣ１９３－ｐａｒａ－ＵからのｓｃＦｖとパラレル形態での二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞）の細胞毒性もまたＮＡＬＭ６－ＬｕｃＧ、Ｊｕｒｋａｔ－ＬｕｃＧ、Ｒａｊｉ、同種異系ＮＴ細胞（非処理Ｔ細胞）、および自家ＮＴ細胞に対して試験された。図６Ａは、異なるエフェクター：標的比でのＮＡＬＭ６細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の４０時間の細胞毒性を示す。図６Ｂは、異なるエフェクター：標的比でのＪｕｒｋａｔ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の６時間の細胞毒性を示す。図６Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ、同種異系ＮＴ細胞、自家ＮＴ細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＮＡＬＭ６細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の４０時間の細胞毒性を示す。図７Ａは、ＮＡＬＭ６細胞に対する二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞のパラレルまたはループ形態の１６時間の細胞毒性を示す。ＣＤ１９－ＣＤ３二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、単一のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の抗腫瘍有効性を示した。図７Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対してパラレルまたはループ形態での二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の１６時間の細胞毒性を示す。ＣＤ１９－ＣＤ３二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、単一のＣＤ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の抗腫瘍有効性を示した。結果は、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、Ｎａｌｍ６、Ｒａｊｉ、Ｊｕｒｋａｔおよび初代同種異系ＰＢＭＣを有意に殺傷したことを示し、ＣＤ１９陽性またはＣＤ３陽性標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔの機能、およびＣＤ１９＋がん細胞とＣＤ３＋キラーＴ細胞の両方を同時に標的とするそれらの能力を示す。

【0238】

[00332]１．６ ｉｎ ｖｉｖｏ有効性
[00333]６～１２週齢のＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ（ＮＰＧ）マウスを選択し、２×１０^５個のＲａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞またはＪｕｒｋａｔ－ｆｆｌｕｃ細胞、５０μＬのＤＰＢＳおよび５０μＬのマトリゲルマトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を腹腔内注射した。２日後、マウスの腫瘍移植片負荷を測定し、腫瘍負荷に基づいてマウスを４群に分けた。その１日後、それぞれ２００μＬのＤＰＢＳ、５×１０^６個のＮＴ細胞および５×１０^６個のＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに注射した。ＣＡＲ－Ｔ治療の７日後に、マウスの腫瘍負荷をさらに評価した。次に、各マウスに３ｍｇのｄ－ルシフェリンを４分間反応のために腹腔内注射し、その後、３０秒曝露のＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて写真撮影した。

【0239】

[00334]結果は、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔが、Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞とＪｕｒｋａｔ－ｆｆｌｕｃ細胞の両方による腫瘍について、ＮＴ細胞と比較して、腫瘍負荷を有意に減少させることを示し、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔがｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１９陽性またはＣＤ３陽性の標的細胞を除去し得ることを示す。

【0240】

１．７ Ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＶＨＤ研究
[00335]マウスを最初に亜致死量（１７５ｃＧｙ）の照射で全身的に治療した。次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、治療されたマウスの胸部に注射した。体重減少、アーチバック、活性、被毛の質感、および皮膚の完全性を含むＧＶＨＤ臨床基準を用いて、マウスを週２～３回観察した。

【0241】

[00336]結果は、ＴＣＲノックアウトを伴わないマウスがＧＶＨＤ症状を示したが、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ＋ＴＣＲ二重ノックアウト群ではＧＶＨＤは検出されなかったことを示す。

【0242】

[00337]図６６は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ対ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を比較するｉｎ ｖｉｖｏのＧｖＨＤ研究を示す。２ｅ７個のＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、各Ｒａｊｉ腫瘍を有するＮＯＧマウスに注入して、ＧｖＨＤ応答を比較した。ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ群のマウスは、ＴＣＲ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、重度の体重減少（＞２０％）、アーチバック、波状毛皮、および早期死亡とともに有意なＣＡＲ－Ｔ増殖を示した。いずれのＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ注入マウスでもＧＶＨＤは検出されなかった。

【0243】

１．８ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＶＧ研究
[00338]ＥＧＦＲｔ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ＋ＴＣＲノックアウトおよびＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ＋ＴＣＲ／Ｂ２Ｍ二重ノックアウト細胞を、アポトーシスおよびサイトカイン放出（ＩＦＮ－γ）を検出するために、ＮＫ細胞とともに一晩１：１でインキュベートした。

【0244】

[00339]結果は、対照群と比較して、ＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ＋ＴＣＲノックアウト群はほとんどアポトーシスを示さず、サイトカイン放出は有意に少ないことを示し、本開示の生成物がＮＫ細胞によるＨＶＧ反応を引き起こさないことを示す。一方、ＴＣＲ／Ｂ２Ｍ二重ノックアウト細胞は、ＮＫ細胞により有意に殺傷され、長期生存はできなかった。

【0245】

[00340]ＨＶＧはまた、ＨＬＡ無傷のＣＡＲ－Ｔ細胞に対して同種異系Ｔ細胞を誘導することができる。図６Ｃは、二重ＣＡＲ－Ｔ細胞が４０時間以内に同種異系Ｔ細胞を標的とすることができ、通常７２時間を要する宿主同種異系Ｔ細胞によるＣＡＲ－Ｔ拒絶を妨げることを示す。

【0246】

１．９ ＥＧＦＲｔ遺伝子媒介ＣＡＲ－Ｔ細胞の除去
[00341]ＮＫ細胞をエフェクター細胞としてＰＢＭＣから単離し、最終濃度１０μｇ／ｍＬのセツキシマブの有無にかかわらず、ＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲＴまたはＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔと１：１で共培養した。４時間後および２４時間後に、ＣＤ３およびＣＡＲの発現をフローサイトメトリーにより検出した。

【0247】

[00342]ＡＤＣＣパーセンテージ＝（１－モノクローナル抗体群ＣＡＲ陽性率／抗体群ＣＡＲ陽性率なし）×１００％
[00343]結果は、セツキシマブの存在下で、４時間後と２４時間後に、ＮＫ細胞がＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を有意に除去したが、ＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲＴを除去しなかったことを示す。セツキシマブなしでは、ＮＫは、いずれの細胞も殺傷しなかった。このことは、セツキシマブがＥＧＦＲｔ－ＣＤ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔに結合する安全スイッチとして機能し、ＮＫがＡＤＣＣ機能を媒介してＣＡＲＴ細胞を除去することを可能にすることを示す。

【0248】

実施例２ ＣＡＲ１９を発現するＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＣＲノックアウトを伴うエンハンサーの研究
[00344]この実施例では、５×１０^５個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を皮下注射によりＮＯＧマウスに移植し、１００ｍｍ^３に達するまで増殖させた。１×１０^６個の野生型またはＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ移植マウスに静脈内注入（ＩＶ）した。腫瘍負荷は、実際の腫瘍サイズのキャリパー測定によって評価された。末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリー分析により測定した。図８ＡはＣＡＲ－Ｔ治療後の腫瘍負荷を示す。ＴＣＲ無傷のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍を消失させることができたが、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴはＲａｊｉ腫瘍成長を制御することができなかった。いずれもＲａｊｉベースの腫瘍を有するモデルであるが、皮下モデルは固形腫瘍を生成し、静脈モデルよりも腫瘍を制御するためのＣＡＲ－Ｔ細胞増殖に対する要求がはるかに高い。図８Ｂは末梢血中のＣＡＲ－Ｔ増殖を示す。ＴＣＲ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して増殖欠損を示し、ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖のピークは、ＷＴ細胞のそれよりもはるかに弱く、これはそれらの腫瘍制御効果と一致する。

【0249】

[00345]図９Ａ－９Ｃは、ＴＣＲノックアウトを伴うＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示す。図９Ａは、ＮＡＬＭ６細胞による反復刺激および残存腫瘍細胞の測定の実験タイムラインを示す。図９Ｂは、ＴＣＲノックアウトを伴うＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖データおよび異なるエンハンサーの発現を、ＴＣＲノックアウトを伴わないＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＣＲノックアウトを伴うが、エンハンサーの発現を伴わないＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して示す。ＮＡＬＭ６細胞の添加は、図９Ａ中の実験的トリムラインに従って矢印で示される。図９Ｂは、図９Ａ中の実験タイムラインに従って示された日に測定された残存腫瘍細胞の量によって示される種々のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の除去活性を示す。ＮＡＬＭ６細胞による複数回のまたは反復刺激下で、ＴＣＲノックアウトおよびＣ７ＲまたはＩＬ７を伴うＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本実験で試験された他の細胞と比較して、持続的な増殖および高められた増殖能力を示した。

【0250】

[00346]図１０Ａおよび１０Ｂは、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力を比較する追加の増殖データを示す。図１０Ａは、ＴＣＲノックアウトおよび２つの異なるエンハンサー（Ｃ７ＲおよびＩＬ２）を伴うＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖データを、エンハンサーの発現を伴わない細胞と比較して示す。結果は、ＮＡＬＭ６細胞による複数回のまたは反復刺激下で、ＴＣＲノックアウトおよびＣ７ＲまたはＩＬ２を伴うＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、いずれのエンハンサーの発現も有さない細胞と比較して、持続的な増殖および高められた増殖能力を示すことを示した。図１０Ｂは、ＴＣＲノックアウトおよび２つの異なるエンハンサー（Ｃ７ＲおよびｍｂＩＬ１５）を有するＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖データを、エンハンサーの発現を伴わない細胞と比較して示す。結果は、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞による複数回のまたは反復刺激下で、ＴＣＲノックアウトおよびＣ７ＲまたはｍｂＩＬ１５を伴うＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、いずれのエンハンサーの発現も有さない細胞と比較して、持続的な増殖および高められた増殖能力を示した。Ｃ７Ｒの発現を有する細胞は、ｍｂＩＬ１５を発現する細胞よりも良好な増殖能力を示した。

【0251】

[00347]図１１は、ＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるエンハンサーのｉｎ ｖｉｖｏ比較の例を示す。この例では、５×１０^５個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を静脈内（ＩＶ）注射によりＮＯＧマウスに移植し、５日間増殖させた。エンハンサーの有無にかかわらずＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＣＲノックアウトを伴うＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞）ならびにビヒクルおよびＴ細胞対照を、Ｒａｊｉ移植マウスに静脈内注入（ＩＶ）した。腫瘍負荷を生物発光強度（ＢＬＩ）により評価した。エンハンサーＣ７Ｒを発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、ＩＬ７は、エンハンサーの発現を伴わない細胞、またはｍｂＩＬ１５の発現を伴う細胞、または他の対照細胞と比較して、良好な腫瘍制御を示した。図１２は、ＢＬＩにより評価された腫瘍負荷を示すＮＯＧマウスの対応する画像を示す。

【0252】

実施例３ ＣＡＲ７を発現するＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにＴＣＲおよびＣＤ７の二重ノックアウトを伴うエンハンサー、ならびにＣＤ２ ＣＡＲを発現するＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびＴＣＲおよびＣＤ２の二重ノックアウトを伴うエンハンサーの研究
一般的な材料および方法
[00348]ドナー血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離およびＴ細胞の増殖
[00349]末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を介してＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてドナー血液から単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリンさせた磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0253】

[00350]Ｔ細胞の細胞系および培養
[00351]ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（Ｔリンパ芽球、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１１９（商標））；
[00352]ＣＣＲＦ－ＣＥＭ－ｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスでトランスフェクトされたＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞をスクリーニングすることによって得られる）；
[00353]Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ２４３）；
[00354]２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ３２１６）；
[00355]ＮＫ９２細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ２４０７）。

【0254】

[00356]ＣＣＲＦ－ＣＥＭ－ｌｕｃ細胞系をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭの両方に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0255】

[00357]ＮＫ９２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡ、０．１ｍＭメルカプトエタノールおよび２００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。

【0256】

[00358]Ｔ細胞および得られたＣＡＲ－Ｔ細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５培地（５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含む）中で培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の培地にはさらに、ｒｈＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終濃度３００ＩＵ／ｍｌで２日ごとに補足した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0257】

３．１ ＣＲＩＳＰＲの設計および構築
[00359]遺伝子編集のためのＣＤ７およびＴＣＲ ｇＲＮＡは、遺伝子編集効率およびオフターゲットリスクを評価した後、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ、ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍおよびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍで選択した。本開示で使用されるｇＲＮＡおよびＨｉＦｉ－Ｃａｓ９タンパク質は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＩＤＴ）から購入された。

【0258】

[00360]遺伝子編集のために、３μｇのＣａｓ９タンパク質および１．５μｇのｇＲＮＡを２０μｌで混合し、３７℃または室温で１５分間インキュベートしてリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次に、ＲＮＰをＬｏｎｚａ ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒによりＴ細胞にトランスフェクトした。遺伝子ノックアウト効率は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出する場合、タンパク質を発現する細胞の比によって決定された。

【0259】

[00361]本発明者らの以前の研究は、ＴＲＡＣ－ｇＲＮＡ１がＴＣＲに対してより高いノックアウト効率を有することを示した（配列は配列番号２０に記載される）。ＣＤ７のｇＲＮＡおよびＴＲＡＣ－ｇＲＮＡを一緒に用いて、同時にＣＤ７およびＴＣＲをノックアウトした場合、４つのＣＤ７－ｇＲＮＡのうち３つが高い効率を示した（図１６に示される）。ＣＤ７－ｇＲＮＡ１（配列番号３４）が、ＣＤ７をノックアウトするためのｇＲＮＡとして選択された。

【0260】

[00362]TRAC-gRNA1: TTCGGAACCCAATCACTGAC、配列番号２０；
[00363]CD7-gRNA1: GAGGTCAATGTCTACGGCTC、配列番号２５。
[00364]ＣＤ２のｇＤＮＡは以下のように設計され、ＣＤ２ ｇＲＮＡ２は最も高いＣＤ２ノックアウト効率を示した（図６５に示される）。

【0261】

[00365]CD2-gRNA1: CAAAGAGATTACGAATGCCT
[00366]CD2-gRNA2: GTGCCACAAAGACCATCAAG
[00367]CD2-gRNA3: AGAGGGTCATCACACACAAG
[00368]CD2-gRNA4: CTTGTAGATATCCTGATCAT
３．２ ＣＡＲおよびサイトカインの設計ならびにウイルスのパッケージ
[00369]キメラ抗原受容体およびサイトカインの構造は、ＣＡＲ７、ＣＡＲ７－ｍｂ１５およびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒである（図１７に示される）。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号３５～４０として記載される。

【0262】

[00370]ＣＡＲ７（配列番号３５）：
[00371]atggcactccctgtaactgcacttcttttgccacttgccttgctcctgcacgcagcgcggccggacatcgagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagcctgggcgaggagatcaccctgacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgcactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagctgctgatctacagcaccagcaacctggccagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccttctacagcctgaccatcagcagcgtggaggccgaggacgccgccgactactactgccaccagtggagcagctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagaggggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgaagctgcaggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgagctgggtgaggcagacccccgagaagaggctggagtgggtggccaccatcagcagcggcggcagctacacctactaccccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaggagcgaggacaccgccatgtactactgcgccaggcaggacggctactaccccggctggttcgccaactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagctccggaacaacgacaccagcaccacggccacccactcctgctccgacaattgcgtctcagcccctttcccttcgacccgaagcttgtcgccctgctgcgggaggagcggtccacacgcgcgggcttgacttcgcttgcgacatctacatttgggcacccttggccgggacatgcggcgtcttgctcctgagtctggttataacgctgtattgtaagcgaggtcggaagaagcttttgtatatctttaaacagccctttatgaggcccgtacaaaccacacaagaggaggatgggtgctcatgcagatttcctgaagaggaagagggcggttgcgaacttagagtcaaattcagccgctccgcagatgcacctgcttataaacagggtcagaatcaattgtataatgaacttaatctcgggaggcgcgaggagtatgatgtgctggacaagcgacggggtcgagacccagagatgggcggtaaaccccgccgaaagaacccccaggagggactgtataatgagctgcaaaaggacaaaatggcagaagcctattccgaaatagggatgaagggagagcggcggcgaggtaagggacatgacggtctttatcaaggtcttagtactgcaactaaggacacctatgacgcgctgcatatgcaggctctcccacctagataa
[00372]ＣＡＲ７（配列番号３６）：
[00373]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00374]ＣＡＲ７－ｍｂ１５（配列番号３７）：
[00375]atggcactccctgtaactgcacttcttttgccacttgccttgctcctgcacgcagcgcggccggacatcgagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagcctgggcgaggagatcaccctgacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgcactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagctgctgatctacagcaccagcaacctggccagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccttctacagcctgaccatcagcagcgtggaggccgaggacgccgccgactactactgccaccagtggagcagctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagaggggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgaagctgcaggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgagctgggtgaggcagacccccgagaagaggctggagtgggtggccaccatcagcagcggcggcagctacacctactaccccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaggagcgaggacaccgccatgtactactgcgccaggcaggacggctactaccccggctggttcgccaactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagctccggaacaacgacaccagcaccacggccacccactcctgctccgacaattgcgtctcagcccctttcccttcgacccgaagcttgtcgccctgctgcgggaggagcggtccacacgcgcgggcttgacttcgcttgcgacatctacatttgggcacccttggccgggacatgcggcgtcttgctcctgagtctggttataacgctgtattgtaagcgaggtcggaagaagcttttgtatatctttaaacagccctttatgaggcccgtacaaaccacacaagaggaggatgggtgctcatgcagatttcctgaagaggaagagggcggttgcgaacttagagtcaaattcagccgctccgcagatgcacctgcttataaacagggtcagaatcaattgtataatgaacttaatctcgggaggcgcgaggagtatgatgtgctggacaagcgacggggtcgagacccagagatgggcggtaaaccccgccgaaagaacccccaggagggactgtataatgagctgcaaaaggacaaaatggcagaagcctattccgaaatagggatgaagggagagcggcggcgaggtaagggacatgacggtctttatcaaggtcttagtactgcaactaaggacacctatgacgcgctgcatatgcaggctctcccacctagacgagctaaacgaggctcaggcgcgacgaactttagtttgctgaagcaagctggggatgtagaggaaaatccgggtcccatggattggacttggattttgttcctcgttgccgcagcgactcgcgtccatagtaattgggtgaacgtaattagtgacttgaaaaaaattgaggaccttatacaaagtatgcatatcgatgcaacactgtacacggagtccgacgtgcacccaagctgcaaggtcaccgcaatgaaatgctttttgctcgaattgcaagttatctcacttgagtcaggggacgcttcaatccatgatactgtggagaatttgataatcctggcgaacaatagccttagttcaaatggcaacgtcactgagtcaggctgcaaggaatgtgaggaattggaagaaaaaaatatcaaggaatttttgcaatcttttgttcacatagttcagatgttcattaacactagttccgggggcggcagtggaggtggcggtagcggcgggggtggctctggtggaggcggctctgggggcggaagtctgcagataacatgccccccacctatgagtgttgaacatgctgatatctgggttaaatcttactccctttacagtcgagaaaggtacatttgcaactccggctttaaacgcaaagccgggactagttcactgactgaatgtgtattgaataaagcgacaaatgtcgcacactggactaccccttccctcaaatgcattcgcgatcctgccttggtgcatcagcgaccagcaccgccgtccacggtaactaccgcaggagtaacaccgcagcccgagagcctttccccctcaggcaaagagccggccgcatcctccccatcttccaataataccgcagctaccaccgcagcaatcgtacccggatcccagctgatgcccagcaaaagtccgagtactggaacgactgaaatctccagtcacgagtcttctcatggaactccgagtcaaactacagcaaagaattgggagctgactgcttccgcttcacaccagccgccaggcgtttatcctcagggacactcagataccacggtggcgattagcacaagcaccgtcctcctgtgtgggctgagtgcagtgtcacttctcgcctgctaccttaagtccagacagacaccccctttggcaagcgttgaaatggaagccatggaagccttgcctgtcacatgggggacttcatcccgcgatgaagacttggagaactgctcacaccatctt
[00376]ＣＡＲ７－ｍｂ１５（配列番号３８）：
[00377]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
[00378]ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ（配列番号３９）：
[00379]atggcactccctgtaactgcacttcttttgccacttgccttgctcctgcacgcagcgcggccggacatcgagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagcctgggcgaggagatcaccctgacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgcactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagctgctgatctacagcaccagcaacctggccagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccttctacagcctgaccatcagcagcgtggaggccgaggacgccgccgactactactgccaccagtggagcagctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagaggggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgaagctgcaggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgagctgggtgaggcagacccccgagaagaggctggagtgggtggccaccatcagcagcggcggcagctacacctactaccccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaggagcgaggacaccgccatgtactactgcgccaggcaggacggctactaccccggctggttcgccaactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagctccggaacaacgacaccagcaccacggccacccactcctgctccgacaattgcgtctcagcccctttcccttcgacccgaagcttgtcgccctgctgcgggaggagcggtccacacgcgcgggcttgacttcgcttgcgacatctacatttgggcacccttggccgggacatgcggcgtcttgctcctgagtctggttataacgctgtattgtaagcgaggtcggaagaagcttttgtatatctttaaacagccctttatgaggcccgtacaaaccacacaagaggaggatgggtgctcatgcagatttcctgaagaggaagagggcggttgcgaacttagagtcaaattcagccgctccgcagatgcacctgcttataaacagggtcagaatcaattgtataatgaacttaatctcgggaggcgcgaggagtatgatgtgctggacaagcgacggggtcgagacccagagatgggcggtaaaccccgccgaaagaacccccaggagggactgtataatgagctgcaaaaggacaaaatggcagaagcctattccgaaatagggatgaagggagagcggcggcgaggtaagggacatgacggtctttatcaaggtcttagtactgcaactaaggacacctatgacgcgctgcatatgcaggctctcccacctagaggctcaggcgcgacgaactttagtttgctgaagcaagctggggatgtagaggaaaatccgggtcccatgttggtgcgccgaggcgcacgagcaggacctcggatgccgcgaggctggacagccctctgtctcctctctttgcttccatccgggttcatgagtctcgacaataatggtacggcaaccccggaactcccgacccaaggaacctttagtaacgtttcaaccaatgtgtcctatcaggagacaacaaccccttctacactgggcagtaccagcttgcatcccgtcagccaacacggcaacgaggcaacaactaacatcacagagactacggtcaagtttactagtacttccgtaatcacgtctgtgtacgggaatacaaattcatcagttcagagtcaaacgtcagttatatctacagtcttcactactcccgcgaatgtatccaccccagaaaccaccctcaaaccttctcttagtccaggaaatgttagcgatttgtcaacgacgagcacgagtttggcgactagtccaacgaaaccgtacacttccagcagtcccatactgtccgacattaaggcagaaataaaatgttctgggatcagggaggtcaagcttacgcagggaatatgtcttgagcaaaataagacgtcctcatgcgcagaattcaagaaagatcgcggcgaaggtctggccagagtcctctgtggagaggagcaggcggatgctgacgcaggagcgcaggtttgtagtctcctgctcgcgcaaagtgaagttaggccccaatgtctcttgttggtactggctaaccgaactgaaattagcagcaagcttcaactcatgaaaaaacaccagagtgatttgaaaaaacttgggatacttgacttcacggagcaagacgttgcgtctcaccaatcctactcacagaaaaccccgatactgttgacatgccccaccatatcaatcttgtctttcttcagtgtggctcttctggtgatcttggcgtgcgtgctgtggaaaaaaaggattaaaccgatcgtttggcctagtctgccggatcacaaaaagacactggagcacctctgcaagaagccacgaaaaaacctgaatgtgagctttaaccccgagtcttttttggactgtcagatacaccgagtcgacgatatacaggcaagagatgaggttgagggtttcctgcaagacacattcccgcaacaactcgaagaatccgagaaacagcgccttggtggagatgtccagtctccgaactgtccgagcgaggacgtagtaattaccccagaaagcttcggtcgagatagtagccttacgtgtctcgccgggaacgtgtcagcgtgtgacgcgcctattctttcaagttcacgcagtttggactgtcgagaatcagggaaaaacggacctcacgtgtatcaggatctccttctcagcctgggcacgacaaacagtaccttgcctcctccgttttccctgcagtcaggtattctgacgctcaatccagtcgcacaagggcaacctatcctgacctccttgggttctaaccaggaagaggcatacgtcactatgtccagcttctatcagaatcag
[00380]ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ（配列番号４０）：
[00381]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
[00382]単一または二重ＣＡＲに構築された２つのＣＤ２ ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、以下の通りである：
[00383]ＣＤ２ ｓｃＦｖ１ ＶＨ：
QLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTRYWIHWVKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATEDLYYAMEYWGQGTSVTVSS
[00384]ＣＤ２ ｓｃＦｖ１ ＶＬ：
[00385]DIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMTCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAVYYCHQYLSSHTFGGGTKLEIKR
[00386]ＣＤ２ ｓｃＦｖ２ ＶＨ：
[00387]QVQLQQPGTELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWVNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFTDKAISTIDTSSNTAYMQLSTLTSDASAVYYCSRSPRDSSTNLADWGQGTLVTVSS
[00388]ＣＤ２ ｓｃＦｖ２ ＶＬ：
[00389]DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGAGTKLELRR
[00390]ＣＡＲ遺伝子をＥＦ１α（ＥＦ－１α）プロモーター下でＦＵＷレンチウイルスベクター骨格にクローン化して、Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲを形成した。Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲ、レンチウイルスエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２５９）およびレンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２６０）を、全レンチウイルス発現ベクターを調製するためにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上清を４８時間および７２時間で回収し、濃縮のために超遠心分離（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。

【0263】

３．３ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
[00391]全調製プロセスを図１５に示す。
[00392]細胞の単離および活性化
[00393]アフェレーシス後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて密度勾配遠心分離により単球を単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリングさせた磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0264】

[00394]５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含むＸ－ｖｉｖｏ１５をＵＣＡＲ－Ｔ細胞培地として使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、培養した。

【0265】

[00395]エレクトロポレーションおよびレンチウイルス感染
[00396]Ｔ細胞を富化および活性化した２日後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズを除去し、細胞を管に回収し、３００ｇで５分間遠心分離し、次にＤＰＢＳで２回洗浄し、細胞密度５０×１０^６／ｍｌでＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に再懸濁した。必要とされるｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの量は、細胞の密度に基づいて計算され、次に、細胞と混合し、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムＮ（Ｌｏｎｚａ）システムによってエレクトロポレーションのために移した。次に、細胞を予め加温した培地中に２×１０^６／ｍｌの密度になるように再懸濁した。さらに、細胞を２～８のＭＯＩでレンチウイルストランスフェクションに供し、フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0266】

[00397]細胞増殖およびＣＡＲ陽性率の検出
[00398]トランスフェクションの３日後に、細胞数およびＣＡＲ陽性細胞を検出し、Ｔ細胞におけるＣＡＲの陽性率を計算した。ノックアウト効率を決定するために、ＴＣＲ（またはＣＤ３）およびＣＤ７の陽性率も検出した。次に、細胞をインキュベーター内で１０日間連続的に培養し、続いて、細胞が凍結保存のために準備された。

【0267】

[00399]結果は、（図１８）ＣＡＲ、ＩＬ１５ＲαまたはＣ７Ｒ（ＣＤ３４）の発現が、ＣＡＲ７、ＣＡＲ７－ｍｂ１５およびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒについてのフローサイトメトリーにより首尾よく検出され、陽性率は３０％より高かったことを示す。ＣＤ３／ＣＤ７の陰性率は最大約９８％であり、ＴＣＲノックアウトが促進され、普遍的ＵＣＡＲ－Ｔ細胞がうまく調製されたことを示す。

【0268】

[00400]図１９に示されるように、外因性ＩＬ－２を除去した後、ＣＡＲ７のｐＳＴＡＴ５レベルは基底レベルまで低下した。しかしながら、ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ Ｔ細胞（ＣＤ３４＋細胞）または外因性ＩＬ２が添加されたＣＡＲ７－Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５のレベルは非常に高レベルであり、Ｃ７Ｒの発現および外因性に添加されたＩＬ－２はいずれもＳＴＡＴ５シグナル伝達経路の活性化を増強し得ることを示す。

【0269】

３．４ ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷作用
[00401]安定にトランスフェクトされたＣＣＲＦ－ＣＥＭ－ｌｕｃ細胞系は、ルシフェラーゼ遺伝子を標的細胞ＣＣＲＦ－ＣＥＭに導入し、その後スクリーニングすることによって得られた。フルオレセイン添加後、ルシフェラーゼはフルオレセインと反応して蛍光を生成した。蛍光の強度を検出することにより、ルシフェラーゼの活性を測定することができ、細胞の生存を検出することができ、それによりＵＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷作用を評価することができる。

【0270】

[00402]実施例３．３で調製されたＵＣＡＲ－Ｔ細胞が、１：１の比で、各細胞について１×１０^６／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ培地にＣＤ－７陽性Ｔ細胞ＣＣＲＦ－ＣＥＭ－ｌｕｃと各１００μｌで混合され、次に９６ウェルプレート中で特定の期間、培養された。次に、培地を回収し、遠心分離に供し、サイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－２をサイトカインビーズアレイキット（ＣＢＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。さらに、ＵＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷作用を検出するために、フルオレセイン基質を細胞培養物に添加した。結果は、ＵＣＡＲ－Ｔは、２４時間以内にＣＣＲＦ－ＣＥＭ腫瘍において有意な殺傷作用を有することを示す（図２０）。

【0271】

[00403]同種異系Ｔ細胞におけるＵＣＡＲ－Ｔの殺傷作用：同種異系Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、所定の期間ＣＡＲ－Ｔとともにインキュベートした。次に、ＣＦＳＥ陽性細胞数の変化をフローサイトメトリーにより分析した。結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞は２４時間以内に同種異系Ｔ細胞を効率的に殺傷し、これは同種異系Ｔ細胞媒介ＨＶＧが起こる時間よりもはるかに短く、したがってＣＡＲ７はＣＡＲ－Ｔ細胞を同種異系Ｔ細胞殺傷から効果的に保護することができることを示す（図２１）。

【0272】

[00404]ＮＫ腫瘍細胞系（ＮＫ９２）におけるＵＣＡＲ－Ｔの２４時間殺傷作用：ＮＫ９２をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＵＣＡＲ－Ｔとともに所定の期間インキュベートした。次に、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ陽性細胞数の変化を分析し、ＮＫ９２腫瘍細胞系におけるＵＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷作用を計算した（図２２）。

【0273】

３．５ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖
[00405]ＩＬ－２をＣＡＲ－Ｔから除去した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を２週間連続培養し、増殖を測定するために週２回カウントした。

【0274】

[00406]図２３Ａおよび２３Ｂの結果は、ＣＡＲ７－ｍｂ１５およびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＡＲ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強い増殖率を有し、ＩＬ－２の非存在下では、２週間以内の生存率は依然として高かったことを示す。ＣＡＲ７－Ｃ７ＲはＣＡＲ７－ｍｂ１５より良好な生存を示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイは、ＵＣＡＲ－Ｔ細胞が７時間以内にＴ－ＡＬＬ細胞系ＣＣＲＦ－ＣＥＭに対して優れた殺傷作用を有することを示す。

【0275】

３．６ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の再活性化
[00407]ＩＬ－２をＵＣＡＲ－Ｔから除去した。ＣＣＲＦ－ＣＥＭを１：１のエフェクター：標的比で週２回添加し、週２回カウントして増殖を測定した。

【0276】

[00408]図２４Ａおよび２４Ｂは、ＣＣＲＦ－ＣＥＭを添加した後、ＣＡＲ７－ｍｂ１５およびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－ＴおよびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に強い増殖を示し、ＣＡＲ７－ｍｂＩＬ１５ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好に増殖したことを示す。反復刺激後、ＵＣＡＲ－Ｔ細胞は、依然として、腫瘍細胞を除去する有意な能力を示し、反復抗原刺激後に、サイトカイン関連シグナル伝達経路が高められたＵＣＡＲ－Ｔ細胞は、より高い増殖率を有し、より良好に生存できることを示す。

【0277】

３．７ 腫瘍を有するマウスにおけるＵＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および有効性
[00409]６～１２週齢のＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスを選択し、２×１０^６個のＣＣＲＦ－ＣＥＭ－ｌｕｃ細胞を腹腔内注射した。２日後、マウスの腫瘍移植片負荷を測定し、腫瘍負荷に基づいてマウスを５群に分けた。腫瘍移植の６日後、１×１０^６個のＵＣＡＲ－Ｔまたは対照を各マウスに静脈内注射し、１～２週間ごとに腫瘍負荷をさらに評価した。各マウスに３ｍｇのＤ－ルシフェリンを４分間反応のために腹腔内に注射し、次に、３０秒曝露（ＢＬＩ）でＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて撮影した。末梢血中のＵＣＡＲ－Ｔ細胞数を毎週カウントした。

【0278】

[00410]図２５は、ＣＡＲ７－ｍｂ１５およびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ ＵＣＡＲ－Ｔが有意な増殖を有し、ＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－Ｔは有意な増殖を示さなかったことを示す。図２６は、ＢＬＩイメージングの結果を示し、ＣＡＲ７－ｍｂ１５およびＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞よりも腫瘍除去において良好な効果を有することを示す。

【0279】

[00411]図２７は、ビヒクル対照、またはＴＣＲノックアウトを伴うＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞で処理され、エンハンサーの発現の有無で処理されたマウスのＢＬＩイメージングを示す。ＴＣＲノックアウトを伴うＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣ７ＲまたはｍｂＩＬ１５の発現は、いずれのエンハンサーの発現も伴わずに、ビヒクル対照およびＴＣＲ ＫＯ ＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、腫瘍除去においてより良好な効率を示した。Ｃ７Ｒを発現するＣＡＲ７細胞は、ｍｂＩＬ１５を発現するものより良好な腫瘍制御およびマウス生存を示した。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ７」、「ＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－Ｔ」、または「ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ」は、ＣＤ７を標的とするＣＡＲを含む操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を示すために互換的に使用することができる。

【0280】

[00412]図２８Ａ ＢＬＩイメージングは、腫瘍細胞の除去におけるＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能を示す。発現Ｃ７ＲまたはｍｂＩＬ１５を有するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、いずれのエンハンサーも発現せずに、ビヒクル対照およびＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、腫瘍除去に対してより良好なｉｎ ｖｉｖｏ効率を示した。図２８Ｂは、エンハンサーおよびビヒクル対照の発現を伴うまたは伴わないＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔで処理されたＮＯＧマウスの動物生存データを示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞注入後の日数に対して生存マウスのパーセンテージを測定した。Ｃ７ＲまたはｍｂＩＬ１５の発現を伴うＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔで処理されたマウスは、発現エンハンサーまたはビヒクル対照を伴わないＣＡＲ－Ｔ細胞で処理されたマウスと比較して、より良好な生存率を有した。Ｃ７Ｒを発現するＣＡＲ７細胞は、ｍｂＩＬ１５を発現するものより良好な腫瘍制御およびマウス生存を示した。

【0281】

[00413]図５５Ａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖データを示す。Ｃ７Ｒを発現する新しく調製されたＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｃ７Ｒまたは任意のエンハンサー発現を有さない対照細胞と比較して、ＩＬ２または抗原刺激を補足しないＴ細胞培地中で培養し、Ｃ７Ｒを発現するＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より良好な増殖を維持し、培養中で持続された。図５５Ｂは、刺激の存在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示す。ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ（またはＵＣＡＲＴ７）、ｍｂＩＬ１５またはＣ７Ｒを発現するＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＣＤ７＋Ｔ－ＡＬＬ細胞）によって繰り返し刺激された。Ｃ７Ｒを発現するＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔが最も良好な持続性および増殖を示した。刺激６回目（ＣＣ６）に抗原刺激を除いた場合、ｍｂＩＬ１５／Ｃ７Ｒを発現するＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔは増殖を停止した。「ＣＣ」は、本明細書で使用される場合、がん細胞との共培養を示す。

【0282】

３．８ Ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＶＨＤ研究
[00414]マウスを最初に亜致死量（１７５ｃＧｙ）の照射で全身的に治療した。次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、治療されたマウスの胸部に注射した。体重減少、アーチバック、活性、被毛の質感、および皮膚の完全性を含むＧＶＨＤ臨床基準を用いて、マウスを週２～３回観察した。

【0283】

[00415]結果は、ＴＣＲノックアウトを伴わない群のマウスはすべてＧＶＨＤの症状を示したが、しかしながら、ＴＣＲノックアウト群ではＧＶＨＤは検出されなかったことを示す。

【0284】

３．９ ＴＣＲノックアウトの影響
[00416]図５４Ａ～Ｃは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲノックアウトの効果を示す。治験責任医師により開始された臨床試験において、メソテリンＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現は、ＴＣＲ関連有害事象を回避するために障害された。しかしながら、ＴＣＲ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者への注入後、予想外に有意な増殖欠損を示した。図５４Ａは、自家メソテリン（ＭＳＬＮ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞（左）および患者の末梢血ＣＡＲ－Ｔ細胞における注入１３日後のＣＡＲ＋Ｔ細胞（右）におけるＴＣＲ ＫＯ効率の例を示す。図５４Ｂは、自家ＭＳＬＮ ＣＡＲ－Ｔ生成物におけるＴＣＲ破壊効率が非常に有効であり、５％未満のＴＣＲ＋細胞が生成物中に残存したことを示す。しかしながら、患者への注入後、末梢血中に検出されたＣＡＲ－Ｔ細胞の大部分はＴＣＲ＋細胞であった。図５４Ｃは、がん患者においてＴＣＲ＋細胞がＴＣＲ－細胞より４０～１０００倍増殖することを示す。したがって、同種異系キラー細胞からの細胞生存および増殖圧がない自家ＣＡＲ－Ｔ用途においてさえ、ＴＣＲ破壊はＣＡＲ－Ｔ細胞増殖を劇的に障害した。

【0285】

３．１０ 構造設計の順序
[00417]ＣＤ７ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５構築物設計：ＣＤ７ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５アミノ酸配列（ｍｂＩＬ１５＝ＩｇＥシグナルペプチド＋ＩＬ１５＋ＩＬ１５Ｒα）
[00418]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
[00419]ＣＤ７ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ構築物設計：ＣＤ７ＣＡＲ－Ｃ７Ｒアミノ酸配列（Ｃ７Ｒ＝ＣＤ３４エクトドメイン＋恒常的活性なＩＬ７Ｒα）
[00420]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
実施例４ 安全スイッチとともにエンハンサーを発現するＵ－ＣＡＲ Ｔ細胞の研究
４．１ ＣＡＲの設計およびウイルスのパッケージ
[00421]キメラ抗原受容体の構造は、以下のとおりである：
[00422]１）ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５；
[00423]２）ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＩＬ７；
[00424]３）ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ；
[00425]４）ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ｍｂＩＬ７；
[00426]ＲＱＲ８は安全スイッチであり、ＣＤ１９ＣＡＲ断片がモノクローナル抗体ＦＭＣ６３の重鎖および軽鎖可変領域（ＧＳリンカーによって連結されている）であり、また、ヒンジ領域および膜貫通領域、ヒトＣＤ２８細胞内共刺激エレメント、ならびにヒトＣＤ３ζ細胞内領域もタンデムで含まれる；ｍｂＩＬ１５は、タンデムでＩＬ１５＋ＩＬ１５Ｒαからなり；Ｃ７Ｒは、ＣＤ３４細胞外ドメインおよびＩＬ７受容体膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインからなる恒常的に活性化されたＩＬ７受容体であり；ＩＬ７は、ＩＬ７シグナルペプチドおよび成熟ペプチドからなり；ｍｂＩＬ７は、タンデムでＩＬ７＋ＩＬ７Ｒａからなる。本明細書に記載される構築物の例を図２９に示す。

【0286】

[00427]ＲＱＲ８のアミノ酸配列は、下記の通りである（配列番号７）：
[00428]MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
[00429]ＲＱＲ８のＤＮＡ配列は、下記の通りである（配列番号８）：
[00430]ATGGGCACCTCTCTGCTGTGCTGGATGGCTCTGTGTCTGCTGGGCGCTGACCATGCTGATGCTTGCCCCTATTCCAACCCCTCTCTGTGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGAACTGCCTACCCAAGGCACCTTCAGCAACGTGTCCACCAACGTGAGCCCCGCTAAGCCTACCACCACCGCTTGCCCTTACTCCAATCCCAGCCTCTGCTCCGGAGGCGGAGGATCCCCCGCCCCCAGACCTCCTACACCCGCTCCCACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGACCCGAAGCTTGCAGACCCGCTGCCGGAGGAGCTGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGTGGCGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATTACACTGTACTGCAACCATAGAAATAGAAGAAGGGTGTGCAAGTGTCCCAGACCCGTGGTGGGCAGCGGAGAAGGAAGAGGCTCTCTGCTGACATGCGGAGACGTGGAAGAGAACCCCGGCCCC
[00431]ＣＤ１９ＣＡＲのアミノ酸配列は、下記の通りである（配列番号９）：
[00432]MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAADYKDDDDKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00433]ＣＤ１９ＣＡＲのＤＮＡ配列は、下記の通りである（配列番号１０）：
[00434]ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
[00435]ｍｂＩＬ１５のアミノ酸配列は、下記の通りである（配列番号１１）。

【0287】

[00436]MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
[00437]ｍｂＩＬ１５のアミノ酸配列において、下線部分はシグナルペプチド領域であり、イタリック部分はＩＬ－１５であり、ボールド部分は連結領域であり、破線の下線部分はＩＬ－１５受容体αである。

【0288】

[00438]ｍｂＩＬ１５のＤＮＡ配列は、下記の通りである（配列番号１２）：
[00439]ATGGATTGGACTTGGATTTTGTTCCTCGTTGCCGCAGCGACTCGCGTCCATAGTAATTGGGTGAACGTAATTAGTGACTTGAAAAAAATTGAGGACCTTATACAAAGTATGCATATCGATGCAACACTGTACACGGAGTCCGACGTGCACCCAAGCTGCAAGGTCACCGCAATGAAATGCTTTTTGCTCGAATTGCAAGTTATCTCACTTGAGTCAGGGGACGCTTCAATCCATGATACTGTGGAGAATTTGATAATCCTGGCGAACAATAGCCTTAGTTCAAATGGCAACGTCACTGAGTCAGGCTGCAAGGAATGTGAGGAATTGGAAGAAAAAAATATCAAGGAATTTTTGCAATCTTTTGTTCACATAGTTCAGATGTTCATTAACACTAGTTCCGGGGGCGGCAGTGGAGGTGGCGGTAGCGGCGGGGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGCTCTGGGGGCGGAAGTCTGCAGATAACATGCCCCCCACCTATGAGTGTTGAACATGCTGATATCTGGGTTAAATCTTACTCCCTTTACAGTCGAGAAAGGTACATTTGCAACTCCGGCTTTAAACGCAAAGCCGGGACTAGTTCACTGACTGAATGTGTATTGAATAAAGCGACAAATGTCGCACACTGGACTACCCCTTCCCTCAAATGCATTCGCGATCCTGCCTTGGTGCATCAGCGACCAGCACCGCCGTCCACGGTAACTACCGCAGGAGTAACACCGCAGCCCGAGAGCCTTTCCCCCTCAGGCAAAGAGCCGGCCGCATCCTCCCCATCTTCCAATAATACCGCAGCTACCACCGCAGCAATCGTACCCGGGTCCCAGCTGATGCCCAGCAAAAGTCCGAGTACTGGAACGACTGAAATCTCCAGTCACGAGTCTTCTCATGGAACTCCGAGTCAAACTACAGCAAAGAATTGGGAGCTGACTGCTTCCGCTTCACACCAGCCGCCAGGCGTTTATCCTCAGGGACACTCAGATACCACGGTGGCGATTAGCACAAGCACCGTCCTCCTGTGTGGGCTGAGTGCAGTGTCACTTCTCGCCTGCTACCTTAAGTCCAGACAGACACCCCCTTTGGCAAGCGTTGAAATGGAAGCCATGGAAGCCTTGCCTGTCACATGGGGGACTTCATCCCGCGATGAAGACTTGGAGAACTGCTCACACCATCTTTGA
[00440]ＩＬ７のアミノ酸配列は、下記の通りである（配列番号１３）：
[00441]MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
[00442]ＩＬ７のＤＮＡ配列は、下記の通りである（配列番号１４）。

【0289】

[00443]GAATTCGGCAGCGGCGTCAAGCAGACACTGAACTTCGATCTGCTGAAGCTGGCCGGAGACGTCGAGAGCAACCCCGGCCCTATGTTCCACGTGAGCTTTAGATACATCTTCGGACTGCCCCCTCTGATTCTGGTGCTGCTGCCCGTGGCCAGCAGCGACTGCGATATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTATGAGTCCGTGCTGATGGTCTCCATCGATCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTTTTCAAGAGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTTCTGTTTAGAGCCGCTAGAAAGCTGAGGCAGTTTCTGAAGATGAACAGCACCGGCGACTTTGATCTGCATCTGCTGAAAGTGAGCGAGGGCACCACCATTCTGCTGAACTGCACCGGCCAAGTGAAAGGAAGAAAGCCCGCCGCTCTGGGCGAGGCTCAGCCTACCAAGTCTCTGGAAGAGAACAAGTCTCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTCAACGATCTGTGCTTCCTCAAGAGGCTGCTGCAAGAGATCAAGACATGCTGGAACAAGATCCTCATGGGCACCAAGGAACACTG
[00444]Ｃ７Ｒのアミノ酸配列は、下記の通りである（配列番号１５）。

【0290】

[00445]MLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
[00446]恒常的に活性化されたＩＬ－７受容体（Ｃ７Ｒ）のアミノ酸配列において、下線部分はＣＤ３４細胞外領域であり、イタリック部分はＩＬ－７受容体α膜貫通領域であり、ボールド部分はＩＬ－７受容体α細胞内領域である。

【0291】

[00447]Ｃ７ＲのＤＮＡ配列は、下記の通りである（配列番号１６）：
[00448]GGAAGCGGCGCCACAAACTTTTCTCTGCTGAAGCAAGCCGGCGACGTCGAAGAGAACCCCGGCCCTATGCTGGTGAGGAGAGGCGCTAGGGCTGGACCCAGAATGCCCAGAGGCTGGACCGCTCTGTGTCTGCTGTCTCTGCTGCCCAGCGGCTTCATGAGCCTCGATAATAACGGCACCGCTACCCCCGAGCTGCCCACACAAGGCACCTTCTCCAATGTGAGCACCAACGTGTCCTACCAAGAGACCACCACCCCTTCCACACTGGGAAGCACATCTCTGCATCCCGTCTCCCAGCACGGCAATGAAGCCACCACAAACATCACCGAGACCACCGTGAAGTTCACCAGCACCTCCGTCATTACCAGCGTGTACGGCAACACCAATAGCTCCGTGCAAAGCCAGACATCCGTGATTTCCACCGTGTTTACCACCCCCGCCAATGTCAGCACACCCGAGACAACACTGAAACCTTCTCTGTCCCCCGGAAACGTGAGCGATCTGAGCACAACCAGCACCAGCCTCGCCACCAGCCCCACAAAGCCTTACACAAGCAGCAGCCCCATTCTGAGCGACATCAAGGCCGAAATCAAGTGCTCCGGAATTAGAGAGGTCAAGCTGACCCAAGGAATCTGTCTGGAGCAGAATAAGACCAGCAGCTGCGCCGAGTTCAAGAAAGACAGAGGCGAAGGACTGGCCAGAGTGCTCTGCGGCGAGGAACAAGCCGATGCCGATGCCGGAGCTCAAGTGTGCAGCCTCCTCCTCGCTCAGAGCGAGGTCAGACCCCAATGTCTGCTGCTCGTGCTGGCCAATAGGACCGAGATCTCCTCCAAACTGCAGCTGATGAAGAAGCACCAGAGCGACCTCAAGAAGCTCGGCATCCTCGACTTTACCGAGCAAGACGTGGCCTCCCATCAATCCTATAGCCAGAAGACCCCCATTCTGCTGACATGTCCCACAATCAGCATCCTCAGCTTCTTCAGCGTCGCTCTGCTCGTCATTCTGGCTTGTGTGCTGTGGAAGAAGAGGATCAAGCCTATTGTGTGGCCCTCTCTGCCCGACCACAAGAAGACCCTCGAACACCTCTGCAAGAAACCTAGAAAGAACCTCAACGTGAGCTTCAACCCCGAGTCCTTTCTGGACTGTCAAATCCATAGGGTGGATGACATCCAAGCTAGAGACGAGGTCGAGGGCTTTCTGCAAGACACCTTCCCTCAGCAGCTGGAAGAAAGCGAGAAGCAAAGACTGGGCGGAGATGTGCAGTCCCCTAATTGCCCCTCCGAGGACGTGGTGATTACCCCCGAGAGCTTCGGAAGAGACAGCTCTCTGACATGTCTGGCCGGAAATGTGTCCGCTTGCGATGCCCCTATTCTGAGCAGCTCCAGATCTCTGGACTGCAGAGAGTCCGGCAAGAACGGCCCTCATGTGTACCAAGATCTGCTGCTGTCTCTGGGAACCACAAACTCCACACTGCCTCCCCCCTTTAGCCTCCAGTCCGGCATTCTGACACTGAACCCCGTGGCTCAAGGCCAACCTATCCTCACATCCCTCGGCTCCAATCAAGAGGAAGCCTACGTGACCATGAGCTCCTTCTATCAGAACCAGTGA
[00449]ｍｂＩＬ７のアミノ酸配列は、下記の通りである（配列番号１７）：
[00450]MALPVTALLLPLALLLHAARPDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
[00451]ｍｂＩＬ７のアミノ酸配列において、下線部分はシグナルペプチド領域であり、イタリック部分はＩＬ－７であり、ボールド部分は連結領域であり、破線の下線部分はＩＬ－７受容体αである。

【0292】

[00452]ｍｂＩＬ７のＤＮＡ配列は、下記の通りである（配列番号１８）：
[00453]ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACTGTGACATCGAGGGCAAAGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAAATCGGCAGCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAAGAAGGCATGTTCCTGTTCAGAGCCGCCAGAAAGCTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACAGCACCGGCGACTTCGACCTGCATCTGCTGAAAGTGTCTGAGGGCACCACCATCCTGCTGAATTGCACCGGCCAAGTGAAGGGCAGAAAGCCTGCTGCTCTGGGAGAAGCCCAGCCTACCAAGAGCCTGGAAGAGAACAAGTCCCTGAAAGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTCTGCTTCCTGAAGCGGCTGCTGCAAGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAAGAGCACGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGAGGCGGTAGCGGTGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGATCTGAATCTGGCTACGCCCAGAACGGCGACCTGGAAGATGCCGAGCTGGACGACTACAGCTTCAGCTGCTACAGCCAGCTGGAAGTGAACGGCAGCCAGCACTCTCTGACCTGCGCCTTTGAAGATCCCGACGTGAACATCACCAACCTTGAGTTCGAGATTTGTGGCGCCCTGGTGGAAGTCAAGTGCCTGAATTTCCGGAAGCTGCAAGAAATCTACTTTATCGAGACAAAGAAGTTCCTGCTGATCGGCAAGAGCAACATCTGTGTGAAAGTGGGCGAGAAAAGCCTGACCTGCAAGAAGATCGACCTGACCACCATCGTGAAGCCCGAGGCTCCTTTCGATCTGAGCGTGGTGTATAGAGAGGGCGCCAACGACTTCGTGGTCACCTTCAACACCAGCCACCTCCAAAAGAAATACGTGAAGGTGCTGATGCACGACGTGGCCTACCGGCAAGAGAAGGACGAGAACAAATGGACCCACGTGAACCTGAGCAGCACCAAGCTGACCCTGCTGCAGAGAAAACTGCAGCCTGCCGCTATGTACGAGATCAAAGTGCGGAGCATCCCCGACCACTACTTTAAAGGCTTTTGGAGCGAGTGGTCCCCTAGCTACTACTTCAGAACCCCTGAGATCAACAACTCCAGCGGCGAGATGGACCCCATTCTGCTGACAATCAGCATCCTGAGCTTTTTCAGCGTGGCCCTGCTGGTCATCCTGGCCTGTGTGCTGTGGAAGAAGCGGATCAAGCCCATCGTGTGGCCCAGCCTGCCTGACCACAAGAAAACCCTGGAACACCTGTGCAAGAAGCCCCGGAAAAACCTGAACGTGTCCTTCAATCCCGAGAGCTTCCTGGACTGCCAGATCCACAGAGTGGACGACATCCAGGCCAGGGACGAAGTGGAAGGATTTCTGCAGGACACATTCCCTCAGCAGCTCGAAGAGAGCGAGAAGCAAAGACTCGGAGGCGACGTGCAGAGCCCTAATTGCCCTTCTGAGGACGTGGTCATCACCCCAGAGAGCTTCGGCAGAGATAGCAGCCTGACATGTCTGGCCGGCAATGTGTCCGCCTGTGATGCCCCTATCCTGTCCTCTAGCAGAAGCCTGGATTGCAGAGAGAGCGGCAAGAACGGCCCTCACGTGTACCAGGATCTGCTCCTGTCTCTGGGCACCACAAACAGCACACTGCCTCCACCATTCAGCCTGCAGAGCGGCATCCTGACACTGAACCCTGTTGCTCAGGGCCAGCCTATCCTGACAAGCCTGGGCAGCAATCAAGAAGAGGCCTACGTCACCATGAGCAGCTTCTACCAGAACCAG
[00454]上記ＣＡＲ遺伝子をＥＦ１α（ＥＦ－１α）のプロモーター下でＦＵＷレンチウイルスベクター骨格にクローニングし、Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲを形成した。Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲ、レンチウイルスエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２５９）およびレンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２６０）を、全レンチウイルス発現ベクターを調製するためにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上清を４８時間および７２時間で回収し、濃縮のために超遠心分離（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。濃縮されたウイルスはＴ細胞のトランスフェクションのために準備された。

【0293】

[00455]結果は、ＲＱＲ８、ＣＡＲ、ＩＬ１５ＲａまたはＣ７Ｒの発現が、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ細胞についてのフローサイトメトリーにより首尾よく検出され；ＩＬ－７の分泌はＥＬＩＳＡによって検出された。レンチウイルスベクターの構築に成功した。すべての構造は、互いに干渉することなく同時に発現させることができた。
４．２ ＣＲＩＳＰＲの設計および構築
[00456]最初に、ＴＣＲ保存領域のエクソンを標的とするｇＲＮＡ配列をｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで設計し、スコアが８０を超える２つのｇＲＮＡ配列をより高いノックアウト効率のために選択した。ｇＲＮＡプライマーについては、フォワードプライマーは、Ｔ７プロモーター、続いて２０ｂｐの標的配列を含み、リバースプライマーは、２０ｂｐの相補配列を有する。プラスミドをＰＣＲ鋳型として使用した。精製後、Ｔ７－ＰＣＲ生成物をさらにＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キットの鋳型として使用してＲＮＡを得た。ＲＮＡをＭＥＧＡｃｌｅａｒカラムで精製し、ＲＮＡ不含水で溶出した。Ｃａｓ９プラスミドはＡｄｄｇｅｎｅから購入した。

【0294】

[00457]ｇＲＮＡ標的配列は以下の通りである：
[00458]TRAC-gRNA: TGTGCTAGACATGAGGTCTA、配列番号５
[00459]一方、ｇＲＮＡのノックアウト効率をＴ７Ｅ１、ＴＩＤＥおよびフローサイトメトリーにより分析した。

【0295】

[00460]結果は、ＴＣＲ遺伝子が９０％より高いノックアウト効率で首尾よくノックアウトされたことを示す。
４．３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
[00461]細胞の単離および活性化
[00462]アフェレーシス後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて密度勾配遠心分離により単球を単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリングさせた磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0296】

[00463]５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含むＸ－ｖｉｖｏ１５をＣＡＲ－Ｔ細胞培地として使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、培養した。

【0297】

[00464]ＣＤ１９を発現する細胞系：Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ８６）；Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ２４３）；Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系を、ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスをトランスフェクトしたＲａｊｉ細胞をスクリーニングすることによって得た。

【0298】

[00465]すべての細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ３２１６）をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭの両方に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足した。

【0299】

[00466]エレクトロポレーション
[00467]Ｔ細胞の富化および活性化の２日後に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズを除去し、細胞を管に回収した。必要に応じてＣａｓ９およびｇＲＮＡを混合し、室温でインキュベートし、次にエレクトロポレーション緩衝液に移し、さらに４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムＮ（Ｌｏｎｚａ）システムによるエレクトロポレーションのために細胞と混合した。次に、細胞を予め加温した培地中に１～２×１０^６／ｍｌの密度になるように再懸濁し、プレートに移し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0300】

[00468]レンチウイルストランスフェクション
[00469]エレクトロポレーションの１日後、細胞を２～８のＭＯＩでレンチウイルスベクターによりトランスフェクトし、フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0301】

[00470]細胞増殖およびＣＡＲ陽性率の検出
[00471]トランスフェクションの３日後、細胞数およびＣＡＲ陽性細胞を検出し、Ｔ細胞におけるＣＡＲの陽性率を計算した。ＣＤ３の陽性率もまた、ノックアウト効率を決定するために検出された。次に、細胞をインキュベーター内で連続的に培養し、細胞が凍結保存のために準備される１４日目まで、培地の半分を２～３日ごとに交換した。

【0302】

[00472]結果は、ＲＱＲ８、ＣＡＲ、ＩＬ１５ＲａまたはＣ７Ｒの発現が、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔについてのフローサイトメトリーによって首尾よく検出され；ＩＬ－７の分泌がＥＬＩＳＡによって検出されたことを示す。ＣＤ３陰性率は９０％より高く、高められたサイトカイン関連シグナル伝達経路を伴うＴＣＲノックアウトＣＡＲ－Ｔおよび安全スイッチの構築に成功し、各エレメントは互いに干渉しないことを示す。

【0303】

４．４ サイトカインの放出
[00473]実施例３で調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＤ１９陽性腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、ＮＡＬＭ６）の各１００ｕｌを、１：１の比で各細胞について１×１０^６／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ培地に混合し、次に９６ウェルプレート中で一晩培養した。培地を回収し、遠心分離に供し、サイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－２をサイトカインビーズアレイキット（ＣＢＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。

【0304】

[00474]結果は、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ、ＮＡＬＭ６とのインキュベーションが、多量のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２を産生したことを示し、サイトカイン関連シグナル伝達経路の機能がＣＤ１９陽性標的細胞に対するＣＡＲＴを高め、サイトカイン関連シグナル伝達経路によるサイトカインの分泌が高められたＣＡＲＴが従来のＣＡＲ－Ｔと比較して増加したことを示す。

【0305】

４．５ ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞の共培養後のＣＤ１０７ａの発現
[00475]２×１０^５ＣＡＲ－Ｔ／ＮＴ細胞および２×１０^５標的細胞（Ｒａｊｉ、ＮＡＬＭ６）／対照細胞（Ｋ５６２）をｖ底９６ウェルプレートに添加し、ＩＬ－２を含まない２００μｌのＸ－ＶＩＶＯ完全培地中に再懸濁した。１μｌのＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（モネシン含有）を各１ｍｌの培地に添加し、２μｌのＣＤ１０７ａ抗体（１：５０）を各ウェルに添加した。次に、細胞を３７℃で４時間培養し、さらに回収に供した。

【0306】

[00476]試料を遠心分離して培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄し、次に４００ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上清を除去し、特異的な表面抗体ＣＡＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８を各管に添加した。次に、細胞を１００μｌ中に再懸濁し、暗所で３０分間氷上に置いた。

【0307】

[00477]各管を３ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、次にサンプルを４００ｇで５分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。ＣＡＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ１０７ａをフローサイトメトリーにより検出した。

【0308】

[00478]結果は、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ、ＮＡＬＭ６のインキュベーションが大量のＣＤ１０７ａを産生したことを示し、サイトカイン関連シグナル伝達経路の機能がｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１９陽性標的細胞に対するＣＡＲＴを高めたことを示す。

【0309】

４．６ ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺活性
[00479]ルシフェラーゼ遺伝子を標的細胞に導入し、続いてスクリーニングすることにより、安定にトランスフェクトされた細胞系を得た。実施例３で調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なるエフェクター：標的比でＣＤ１９陽性腫瘍細胞（Ｒａｊｉ－ｌｕｃ、ＮＡＬＭ６－ｌｕｃ）と混合した。フルオレセイン添加後、ルシフェラーゼはフルオレセインと反応して蛍光を生成した。蛍光の強度を検出することにより、ルシフェラーゼの活性を測定することができ、細胞の生存を検出して、ＣＡＲＴ細胞の殺傷作用を評価することができる。

【0310】

[00480]結果は、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＲａｊｉとＮＡＬＭ６を有意に殺傷し、サイトカイン関連シグナル伝達経路が高められたＣＡＲＴがより有意な殺傷作用を示し、これはエフェクター：標的比と相関した。

【0311】

４．７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖
[00481]ＩＬ－２をＣＡＲ－Ｔから除去した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を２週間連続培養し、週２回カウントし、増殖を測定した。

【0312】

[00482]結果は、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔよりも強い増殖率を有していたことを示す。ＣＦＳＥは、特定の増殖を示し、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔは２週間後に生存できなかった。

【0313】

４．８ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の再活性化
[00483]ＩＬ－２をＣＡＲ－Ｔから除去し、Ｋ５６２－ＣＤ１９を２：１エフェクター：標的比で週２回添加した。細胞を２週間培養し、週２回カウントし、細胞増殖を測定した。

【0314】

[00484]結果は、Ｋ５６２－ＣＤ１９、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔより有意に強い増殖率を示したことを示す。刺激後、細胞生存率はＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔより高く、サイトカイン関連シグナル伝達経路が高められたＣＡＲＴはより高い増殖率を示し、より良好に生存できることを示した。

【0315】

４．９ ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
[00485]６～１２週齢のＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇヌル（ＮＯＧ）マウスを選択し、２×１０^５個のＲａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞、５０μＬのＤＰＢＳおよび５０μＬマトリゲルマトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を腹腔内注射した。２日後、マウスの腫瘍移植片負荷を測定し、腫瘍負荷に基づいてマウスを４群に分けた。１日後、２００μＬのＤＰＢＳ、５×１０^６個のＮＴ細胞、５×１０^６個のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ－Ｔ細胞を各マウスにそれぞれ注射した。ＣＡＲ－Ｔ治療の７日後に、マウスの腫瘍負荷をさらに評価した。各マウスに３ｍｇのｄ－ルシフェリンを４分間反応のために腹腔内注射し、次に、３０秒間曝露したＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて撮影した。

【0316】

[00486]結果は、２週間後に、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７およびＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＴおよびＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して有意に腫瘍負荷を減少させ、Ｔ細胞はまだ末梢血中に検出され得たことを示す。サイトカイン関連シグナル伝達経路のマウスは、ＣＡＲＴ群の全生存期間を高めた。

【0317】

４．１０ ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＶＨＤ研究
[00487]マウスを最初に亜致死量（１７５ｃＧｙ）の照射で全身的に治療した。次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、治療されたマウスの胸部に注射した。体重減少、アーチバック、活性、被毛の質感、および皮膚の完全性を含むＧＶＨＤ臨床基準を用いて、マウスを週２～３回観察した。

【0318】

[00488]結果は、ＴＣＲノックアウトを伴わない群のマウスはすべて、ＧＶＨＤ反応の症状を示し、ＴＣＲ単一ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞群ではＧＶＨＤ反応は検出されなかったことを示す。

【0319】

４．１１ １１個のＲＱＲ８遺伝子媒介ＣＡＲ－Ｔ細胞の除去
[00489]ＮＫ細胞をエフェクター細胞としてＰＢＭＣから単離し、最終濃度１０μｇ／ｍＬでリツキシマブ（ルチキシマブ）の有無にかかわらずＣＡＲ－Ｔと１：１共培養した。４時間後および２４時間後に、発現ＣＡＲをフローサイトメトリーにより検出した。

【0320】

[00490]ＡＤＣＣパーセンテージ＝（１－モノクローナル抗体群ＣＡＲ陽性率／抗体群ＣＡＲ陽性率なし）×１００％
[00491]結果は、４時間後および２４時間後に、ＮＫ細胞がルチキシマブの存在下でＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５、ＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－ＭＢＩＬ１５－ＩＬ７およびＲＱＲ８－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｃ７Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞を有意に除去したが、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔを除去できなかったことを示す。ルチキシマブなしでは、ＮＫは細胞のいずれも殺傷できなかった。このことは、ルチキシマブがＲＱＲ８に結合する安全スイッチとして機能し、ＮＫがＣＡＲＴ細胞を除去するようにＡＤＣＣ機能を媒介することを可能にすることを示す。

【0321】

実施例５ Ｅ３を発現するＵ－ＣＡＲ Ｔ細胞の研究
[00492]図３０は、エンハンサーＥ３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の例示的な設計を示す。Ｅ３において、Ｃ７Ｒのエクトドメインは、ＥＧＦＲｔまたはＨｅｒ２ｔなどの安全スイッチ、または本開示に記載される他のペプチドによって置換されている。

【0322】

[00493]図３１は、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびエンハンサーＣ７ＲまたはＥ３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。
[00494]図３２Ａおよび３２Ｂは、ＣＤ１９抗原を発現するＨｅＬａ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺活性を示す。図３２Ａは、標的のみまたはＴ細胞対照と比較して、Ｃ７ＲまたはＥ３を発現するＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺活性を示す。この実験におけるエフェクター：標的比は５：１である。図３２Ｂは、標的のみまたはＴ細胞対照と比較して、Ｃ７ＲまたはＥ３を発現するＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺活性を示す。この実験におけるエフェクター：標的比は１：１である。

【0323】

[00495]図３３Ａおよび３３Ｂは、試験された操作細胞において、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）およびＣＤ１９ ＣＡＲの発現を示す。図３３Ａは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびｐＳＴＡＴ５を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。図３３Ｂは、図３３Ａ中のデータのｐＳＴＡＴ５の対応する平均蛍光指数（ＭＦＩ）を示す。

【0324】

[00496]図３４Ａ－Ｃは、エンハンサーなしのＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔと比較して、Ｃ７ＲまたはＥ３を発現するＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖データを示す。図３４Ａは、３つの異なる細胞のサイトカイン非依存性増殖を示す。図３４Ｂは、反復ＮＡＬＭ６刺激下で増殖を示す。図３４Ｃは、ＮＡＬＭ６による刺激前後のＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージを示す。ＣＡＲ刺激はＣＡＲ＋細胞を富化した。

【0325】

[00497]図３５Ａは、セツキシマブ（ＣＴＸ、抗ＥＧＦＲ抗体）の存在下または非存在下、異なるエフェクター：標的比でＮＫ細胞と共培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。データは、ＣＴＸの存在下で、Ｅ３を発現するＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴがＮＫ細胞によりＮＫ細胞媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して効果的に殺傷することを示し、Ｅ３が効果的な安全スイッチとして機能し、効果的にオフにされていることを示す。図３５Ｂは、他の細胞に対するＮＫ細胞の全殺活性を示す。図３５ＣはＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の殺活性を示す。

【0326】

[00498]図３６Ａおよび３６Ｂは、反復刺激後のＡＤＣＣによる安全スイッチの試験を示す。図３６Ａは、ＣＴＸの存在下または非存在下、異なるエフェクター：標的比でＮＫ細胞と共培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。この実施例に示された細胞は、反復刺激された。図３６ＢはＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の殺活性を示す。

【0327】

[00499]図５６Ａは、細胞培養の１２日目におけるＣＤ７ ＣＡＲおよびエンハンサーＣ７ＲまたはＥ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。図５６Ｂは、ＣＤ７ ＣＡＲを発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞に対するエンハンサーＣ７ＲまたはＥ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）の６時間細胞毒性を示す。この実験で試験されたエフェクター：標的比は５：１および１：１である。図５６Ｃは、Ｃ７ＲまたはＥ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＩＬ２を補足しないＴ細胞培養培地中で培養し、細胞増殖の倍数についてモニターした。結果は、Ｃ７ＲまたはＥ３を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲＴ細胞が、対照Ｔ細胞よりも良好な細胞増殖および細胞安定性を示したことを示した。Ｅ３（ＥＧＦＲｔ＋ＩＬ７Ｒα）は、より良好なエンハンサー発現を有し、したがって、Ｃ７Ｒより良好な細胞持続性および増殖を維持した。図５６Ｄは、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）およびＣ７ＲまたはＥ３を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。ｐＳＴＡＴ５は、Ｃ７ＲまたはＥ３を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞において高度に上方調節された。ｐＳＴＡＴ５の陽性対照として、ＣＡＲ１９＋ＩＬ２刺激を用いた。図５６Ｅは、図５６Ｄ中のデータのｐＳＴＡＴ５の対応する平均蛍光指数（ＭＦＩ）を示す。

【0328】

[00500]構築物設計の配列：Ｃ７Ｒのエクトドメインは、トランケート型ＥＧＦＲまたはトランケート型Ｈｅｒ２などの安全スイッチで置換され得る。
[00501]ＣＤ７ＣＡＲ－Ｅ３アミノ酸配列（Ｅ３＝ＥＧＦＲｔ＋恒常的活性型ＩＬ７ＲαＴＭおよびエンドドメイン）
[00502]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
[00503]ＣＤ７ＣＡＲ－Ｅ３（Ｅ３＝Ｈｅｒ２ｔ＋恒常的活性ＩＬ７ＲαＴＭおよびエンドドメイン）
[00504]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTGGGSGGGSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
[00505]図６８は、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（Ｔ－ＡＬＬ）マウス異種移植モデルにおけるＣＡＲ７およびＣＡＲ７－Ｅ３ ＵＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｖｏ有効性のＢＬＩイメージングを示す。各マウスに３×１０^５個のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を静脈内接種した。４日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注入した（１×１０^６細胞／マウス）。ＢＬＩイメージングは、ＣＡＲ７－Ｅ３ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＡＲ７ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞よりも腫瘍除去に対して良好な効果を有することを示す。

【0329】

実施例６ 二重ＣＡＲを発現するＵ－ＣＡＲ Ｔ細胞の研究
一般的な材料および方法
[00506]ドナー血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離およびＴ細胞の増殖
[00507]末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を密度勾配遠心分離を介してＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてドナー血液から単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８と結合した磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0330】

[00508]ＰＢＭＣの細胞系および培養
[00509]Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫細胞、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ８６）；
[00510]Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ２４３）；
[00511]Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系（ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスでトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞をスクリーニングすることによって得られる）；
[00512]２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ３２１６）；
[00513]ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＣＬ１１９）；
[00514]ＰＢＮＫ：ＣＤ５６マイクロビーズを用いてＰＢＭＣから選別し、ＮＫ無血清培地キットＩＩ（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１０％ＦＢＳ＋９００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で培養した末梢血ＮＫ；
[00515]ＮＫ９２細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ２４０７）；
[00516]ＮＫ９２－ｆｆｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスでトランスフェクトされたＮＫ９２細胞をスクリーニングすることによって得られる）；
[00517]Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系、およびＫ５６２細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭの両方に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0331】

[00518]ＮＫ９２細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡ、０．１ｍＭメルカプトエタノールおよび２００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。

【0332】

[00519]Ｔ細胞および得られたＣＡＲ－Ｔ細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５培地（５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含む）中で培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の培地にさらに、ｒｈＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終濃度３００ＩＵ／ｍｌで２日ごとに添加した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0333】

６．１ ＣＲＩＳＰＲの設計および構築
[00520]遺伝子編集のためのＣＤ７、ＣＤ２、ＴＣＲ ｇＲＮＡは、遺伝子編集効率とオフターゲットリスクを評価した後にウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ、ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍおよびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ．で選択された。本開示で使用されるｇＲＮＡは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＩＤＴ）によって合成されるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製された（Ｓｈｉら、２０１７、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．ｄｏｉ：１０．３７９１／５５２６７を参照されたい）。ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９をＩＤＴから購入した。

【0334】

[00521]遺伝子編集のために、３μｇのＣａｓ９タンパク質および１．５μｇのｇＲＮＡを２０μｌ中で混合し、３７℃または室温で１５分間インキュベートして、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次に、ＲＮＰをＬｏｎｚａ ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒによりＴ細胞にトランスフェクトした。遺伝子ノックアウト効率は、フローサイトメトリーによって検出する場合、タンパク質を発現する細胞の比によって決定された。

【0335】

[00522]使用されるｇＲＮＡ標的配列は、以下の通りである：
[00523]TRAC-gRNA1: TTCGGAACCCAATCACTGAC、配列番号２０
[00524]TRAC-gRNA2: TCAGGGTTCTGGATATCTGT、配列番号２１
[00525]TRAC-gRNA3: AAGTTCCTGTGATGTCAAGC、配列番号２２
[00526]CD7-gRNA1: GAGGTCAATGTCTACGGCTC、配列番号２５
[00527]CD7-gRNA2: ATCACGGAGGTCAATGTCTA、配列番号２６
[00528]CD7-gRNA3: GTAGACATTGACCTCCGTGA、配列番号２７
[00529]CD7-gRNA4: GGAGCAGGTGATGTTGACGG、配列番号２８
[00530]CD2-gRNA1: CAAAGAGATTACGAATGCCT、配列番号２９
[00531]CD2-gRNA2: GTGCCACAAAGACCATCAAG、配列番号３０
[00532]CD2-gRNA3: AGAGGGTCATCACACACAAG、配列番号３１
[00533]CD2-gRNA4: CTTGTAGATATCCTGATCAT、配列番号３２
[00534]スクリーニング後、各遺伝子について高いノックアウト効率を有するｇＲＮＡが見出され、２つの遺伝子、ＴＣＲ／ＣＤ７またはＴＣＲ／ＣＤ２をノックアウトした場合、高効率も観察され、ＴＲＡＣ－ｇＲＮＡ２およびＣＤ７－ｇＲＮＡ１は高いノックアウト効率を有するｇＲＮＡである。図１６は、ＴＲＡＣ－ｇＲＮＡ１を有する異なるＣＤ７－ｇＲＮＡを用いることによるＣＤ７ノックアウトの効率を示し、ＣＤ７－ｇＲＮＡ１およびＣＤ７－ｇＲＮＡ４は明らかに良好であり、その後の実験ではＣＤ７－ｇＲＮＡ１を用いた。

【0336】

６．２ ＣＤ７ ＣＡＲの設計およびウイルスのパッケージ
[00535]ＣＤ７単一ＣＡＲのｓｃＦｖは、ＴＨ６９、３Ａ１ｅおよびＳＤＺＣＨＨ３８０抗体に由来する。ＣＡＲ内のｓｃＦｖは、３Ａ１ｅ－ＬＨ、ＴＨ６９－ＬＨ、ＳＤＺ－ＬＨ、ＳＤＺ－ＨＬとして設計される。ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号７５～７８に記載される通りである。

【0337】

[00536]３Ａ１ｅ－ＬＨ（配列番号７５）
[00537]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00538]ＴＨ６９－ＬＨ（配列番号７６）
[00539]MALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00540]ＳＤＺ－ＬＨ（配列番号７７）
[00541]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWTTPPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYADDFKGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRGYYYGSRYGAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00542]ＳＤＺ－ＨＬ（配列番号７８）
[00543]MALPVTALLLPLALLLHAARPQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYADDFKGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRGYYYGSRYGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWTTPPWTFGGGTKLEIKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00544]ＣＡＲ遺伝子をＥＦ１α（ＥＦ－１α）のプロモーター下でＦＵＷレンチウイルスベクター骨格にクローニングし、Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲを形成した。Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲ、レンチウイルスエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２５９）およびレンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２６０）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００またはＰＥＩを用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、発現ベクター全体を調製した。上清を４８時間および７２時間で回収し、濃縮のために超遠心分離（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。濃縮されたウイルスはＴ細胞のトランスフェクションのために準備された。

【0338】

６．３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
[00545]細胞の単離および活性化
[00546]アフェレーシス後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて密度勾配遠心分離により単球を単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリングさせた磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0339】

[00547]５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含むＸ－ｖｉｖｏ１５をＣＡＲ－Ｔ細胞培地として使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、培養した。

【0340】

[00548]ＣＤ１９を発現する細胞系：Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ８６）；Ｋ５６２（ＡＴＣＣ－ＣＣＬ２４３）；Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃおよびＮＫ９２細胞系を、ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスをトランスフェクトした細胞をスクリーニングすることによって得た。

【0341】

[00549]ＣＤ７およびＣＤ２を発現する細胞系：Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＣＲＦ－ＣＥＭおよびＮＫ９２細胞。
[00550]すべての細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ３２１６）をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭの両方に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足した。

【0342】

[00551]エレクトロポレーションおよびレンチウイルス感染
[00552]Ｔ細胞を富化および活性化した２日後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズを除去し、細胞を管に回収し、３００ｇで５分間遠心分離に供し、次にＤＰＢＳで２回洗浄し、細胞密度５０×１０^６／ｍｌでＯｐｉｔ－ＭＥＭ中に再懸濁した。必要とされるｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの量は、細胞の密度に基づいて計算され、次に、細胞と混合し、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムＮ（Ｌｏｎｚａ）システムによってエレクトロポレーションのために移した。次に、細胞を予め加温した培地中に１～２×１０^６／ｍｌの密度になるように再懸濁した。さらに、細胞を２～８のＭＯＩでレンチウイルストランスフェクションに供し、フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0343】

[00553]細胞増殖およびＣＡＲ陽性率の検出
[00554]トランスフェクションの３日後に、細胞数およびＣＡＲ陽性細胞を検出し、Ｔ細胞におけるＣＡＲの陽性率を計算した。ノックアウト効率を決定するために、ＴＣＲ（またはＣＤ３）およびＣＤ７の陽性率も検出した。次に、細胞をインキュベーター内で連続的に培養し、細胞が凍結保存の準備ができた１０日目まで、培地の半分を２～３日ごとに交換した。

【0344】

６．４ ＣＤ７ ＣＡＲ構造のスクリーニング
[00555]図３８Ａに示されるように、抗ＣＤ７ ＣＡＲの発現が首尾よく検出され、その中でＴＨ６９－ＬＨが最も強く発現し、続いて３Ａ１ｅ－ＬＨ、次にＳＤＺ－ＬＨ、およびＳＤＺ－ＨＬであった。機能面では、図３８Ｂに示されるように、３Ａ１ｅ－ＬＨ、ＣＡＲは全てＣＤ７陽性Ｔ細胞において最良の殺傷作用を示したが、ＴＨ６９－ＬＨ、ＳＤＺ－ＬＨおよびＳＤＺ－ＨＬＣＡＲは効果が低かった。したがって、３Ａ１ｅのｓｃＦｖは、二重ＣＡＲにおいてＣＤ７ ＣＡＲのために選択された。

【0345】

６．５ ＣＤ１９－ＣＤ７二重ＣＡＲ構造の設計
[00556]ＣＤ１９およびＣＤ７を標的とするＣＤ１９－ＣＤ７二重ＣＡＲの構造は、図３７および以下に示される通りである：
[00557]ループ：Ｌ７１９－ＬＨＬＨおよびＬ７１９－ＨＬＨＬ、配列番号７９および８０に記載される配列；
[00558]Ｌ７１９－ＬＨＬＨ（配列番号７９）
[00559]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00560]Ｌ７１９－ＨＬＨＬ（配列番号８０）
[00561]MALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00562]タンデム：Ｔ１９７－ＬＨＬＨ、Ｔ１９７－ＬＨＬＨ－ＥＡＡＡＫ３（３つの連結されたＥＡＡＡＫを有するリンカーを用いることによる）、Ｔ７１９－ＬＨＬＨ、Ｔ７１９－ＬＨＨＬ、配列番号８１～８４に示される配列；
[00563]Ｔ１９７－ＬＨＬＨ（配列番号８１）
[00564]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00565]Ｔ１９７－ＬＨＬＨ－（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号８２）
[00566]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSEAAAKEAAAKEAAAKDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00567]Ｔ７１９－ＬＨＬＨ（配列番号８３）
[00568]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00569]Ｔ７１９－ＬＨＨＬ（配列番号８４）
[00570]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00571]恒常的に活性化されたＩＬ７受容体Ｃ７Ｒ：Ｌ７１９－Ｃ７Ｒ、配列番号８５に記載されるアミノ酸配列に連結されたループ二重ＣＡＲ。

【0346】

[00572]Ｌ７１９－Ｃ７Ｒ（配列番号８５）
[00573]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ*
６．６ 二重ＣＡＲ構造－１の試験
[00574]１）二重ＣＡＲの発現およびノックアウト効率
[00575]２つのループＣＡＲ（Ｌ７１９－ＬＨＬＨおよびＬ７１９－ＨＬＨＬ）と２つのタンデムＣＡＲ（Ｔ１９７－ＬＨＬＨおよびＴ１９７－ＬＨＬＨ－（ＥＡＡＡＫ３）３）を比較した。ＣＡＲ７およびＣＡＲ１９を単一ＣＡＲ対照として使用し、模擬Ｔを陰性対照とした。図３９に示されるように、２つのループ二重ＣＡＲの発現は対角分布しており、二重ＣＡＲの発現が成功したことを示す。タンデム二重ＣＡＲのＣＤ１９ ＣＡＲは強い発現を示したが、しかしながら、ＣＤ７ ＣＡＲは弱く検出された。図４０は、ＣＤ７およびＣＤ３（ＴＲＡＣ）のノックアウト効率を示し、模擬ＴおよびＣＡＲ１９ではノックアウト効率が９８％までであったことが見てとれる。ＣＤ７単一ＣＡＲおよびＣＤ７／ＣＤ１９二重ＣＡＲを含む他の２群では、ＣＤ７＋細胞の比率は模擬ＴおよびＣＡＲ１９群よりも有意に低く、ＣＤ７ ＣＡＲの機能を示した。

【0347】

[00576]２）ＣＤ１９＋細胞およびＣＤ７＋細胞における二重ＣＡＲのｉｎ ｖｉｔｒｏロ殺傷作用
[00577]最初に、ＣＤ１９標的における異なるＣＡＲの殺傷作用を比較した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＴＣＡ）実験は、２つのループＣＡＲおよび２つのタンデムＣＡＲの両方が、ＣＤ１９単一ＣＡＲ（ＣＡＲ１９）と同様に、ＨｅＬａ－ＣＤ１９＋細胞に対して強力な殺傷作用を有することを示した（図４１）。

【0348】

[00578]続いて、本発明者らは末梢血由来のＣＤ７＋ＮＫ細胞における異なるＣＡＲの殺傷作用を比較した（図４２Ａ）。ｉｎ ｖｉｖｏで増殖させたＰＢＮＫ細胞（ＣＤ７＋細胞の比率は約８０％であった）をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＣＡＲ－Ｔ細胞と１日間インキュベートした。次に、細胞をフローサイトメトリーに供し、ＣＦＳＥ陽性細胞の比率の変化を分析した。図４２Ａは、二重ＣＡＲおよびＣＤ７単一ＣＡＲがＮＫ細胞において有意な殺傷作用を有し、ＣＤ１９単一ＣＡＲおよび模擬Ｔは、いずれの殺傷作用も示さなかったことを示す。図４２Ｂは、ＮＫ中のＣＤ７＋細胞が、二重ＣＡＲ（Ｌ７１９－ＬＨＬＨおよびＴ１９７－ＬＨＬＨ）との共培養後にほとんど消失したことを示し、ＣＡＲ７および二重ＣＡＲがＮＫ中のＣＤ７＋細胞を完全に殺傷したことを示した。

【0349】

[00579]さらに、本発明者らは、同種異系Ｔ細胞（ＣＤ７＋）における異なるＣＡＲの殺傷作用を比較した（図４３）。結果は、同種異系Ｔ細胞がＣＡＲ７および二重ＣＡＲによって完全に殺傷されたが、ＣＡＲ１９は同種異系Ｔ細胞において殺傷作用を示さなかったことを示す。

【0350】

[00580]３）二重ＣＡＲによるＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ除去
[00581]各マウスに３×１０^５個の腫瘍細胞を静脈内接種した。６日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注入した（マウスあたり３×１０^６細胞）。ＢＬＩイメージングは、ループＣＡＲとタンデムＣＡＲの両方がある程度までＲａｊｉ腫瘍を除去し、Ｌ７１９－ＬＨＬＨが最良のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍対照を示したことを示す（図４４）。

【0351】

６．７ 二重ＣＡＲ構造の試験－２
[00582]他の２つのタンデム二重ＣＡＲ構造：Ｔ７１９－ＬＨＬＨおよびＴ７１９－ＬＨＨＬを設計し、ループＣＡＲ（Ｌ７１９－ＬＨＬＨ、Ｌ７１９とも呼ばれる）と比較した。

【0352】

[00583]図４５Ａおよび４５Ｂは、新しいタンデム二重ＣＡＲが首尾よく発現され（図４５Ａ）、また遺伝子ノックアウト後の残りのＣＤ７＋細胞における有意な殺傷作用も有した（図４５Ｂ）ことを示す。

【0353】

[00584]Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＴＣＡ）は、（図４６）タンデム二重ＣＡＲがＬ７１９と同様にＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞における同様の殺傷作用を有したことを示す。

【0354】

[00585]図４７Ａおよび４７Ｂは、タンデム二重ＣＡＲが２４時間にわたりＬ７１９として同種異系Ｔ細胞およびＮＫ細胞において同様の強い殺傷作用を有したことを示す。
[00586]図４８は、Ｌ７１９およびタンデム（Ｔ７１９－ＬＨＬＨおよびＴ７１９－ＬＨＨＬ）二重ＣＡＲがともにｉｎ ｖｉｖｏ（ＮＯＧマウスにおけるＣＣＲＦ－ＣＥＭ静脈内モデル）でＣＣＲＦ－ＣＥＭ腫瘍を大いに除去したことを示す。

【0355】

６．８ サイトカインの放出
[00587]実施例６．３で調製した二重ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびＣＤ１９陽性腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）、ＣＤ７陽性腫瘍細胞（Ｊｕｒｋａｔ）または初代同種異系ＰＢＭＣもしくはＮＫの各１００μｌを、１：１の比で各細胞について１×１０^６／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ培地に混合し、次に９６ウェルプレート中で一晩培養した。次に、培地を回収し、遠心分離に供し、放出されたサイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－２をサイトカインビーズアレイキット（ＣＢＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。

【0356】

[00588]結果は、ＣＤ１９－ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ、Ｊｕｒｋａ、初代同種異系ＰＢＭＣまたはＮＫ細胞とともにインキュベートすると、大量のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２が産生されることを示し、ＣＤ１９陽性またはＣＤ７陽性標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔの機能を示すことを示す。

【0357】

６．９ ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＶＨＤ研究
[00589]マウスを最初に亜致死量の照射（１７５ｃＧｙ）で全身的に治療した。次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、治療されたマウスの胸部に注射した。体重減少、アーチバック、活性、被毛の質感、および皮膚の完全性を含むＧＶＨＤ臨床基準を用いて、マウスを週２～３回観察した。

【0358】

[00590]結果は、ＴＣＲノックアウトを伴わないマウスがＧＶＨＤ症状を示したが、しかしながら、ＣＤ７－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ＋ＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウト群ではＧＶＨＤは検出されなかったことを示す。

【0359】

６．１０ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＶＧ研究
[00591]ＣＤ７ ＣＡＲはＣＤ７＋細胞を効果的および迅速に除去することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、同種異系Ｔ細胞がＣＤ７ ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞に対して有意な拒絶反応を示さないが、ＣＡＲ１９のみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞に対して強い拒絶反応を示すことを示した。

【0360】

[00592]同種異系ＮＫ細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞に対して、ＣＤ７ ＣＡＲなしのＣＡＲ－Ｔ細胞より有意に低い拒絶反応を示した。
６．１１ ＡＰ１９０３またはラパマイシンによるＣＡＲ－Ｔ細胞の除去
[00593]１０ｎＭのＡＰ１９０３またはラパマイシンを、ｒａｐａＣａｓｐ９－Ｌ７１９ ＣＡＲ－Ｔ（配列番号８６に記載される配列）細胞の培地に添加した。１、６および２４時間後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシスおよび生存をフローサイトメトリーにより検出した。

【0361】

[00594]結果は、ＡＰ１９０３およびラパマイシンがｒａｐａＣａｓｐ９－Ｌ７１９ＣＡＲ－Ｔ細胞を迅速に除去したが、ＣＤ１９対照ＣＡＲＴを除去できないことを示し、安全スイッチの特異性を示す。

【0362】

[00595]ｒａｐａＣ９－Ｌ７１９（配列番号８６）
[00596]MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKLEYSGGGSLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGGSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00597]Ｌ７１９－Ｅ３細胞におけるＥ３の安全スイッチ機能を２４時間補体依存性細胞傷害アッセイ（ＣＤＣアッセイ）により測定した。簡単に説明すると、ＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウトＬ７１９－Ｅ３細胞またはＬ７１８－Ｅ２細胞を、０％、５％または２５％ドナー血清を含む培地中でインキュベートした。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（ＣＴＸ）を５または５０μｇ／ｍｌ添加することにより２４時間ＣＤＣ効果を調べた。ＣＤ２０を標的とするＲｉｔｕｘｉｍａｂ（ＲＴＸ）を陰性対照として使用した。図６１に示されるように、Ｌ７１９－Ｅ３細胞を、血清の存在下でセツキシマブにより特異的に溶解し（図６１Ａ）、ＥＧＦＲｔまたはＣＤ２０細胞外ドメインを伴わないＬ７１９－Ｅ２細胞ではＣＤＣ効果は観察されなかった（図６１Ｂ）。

【0363】

[00598]ＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウトＣＡＲ７－Ｅ３細胞またはＬ７１９－Ｅ３細胞におけるＥ３の安全スイッチ機能を、補体依存性細胞傷害アッセイ（ＣＤＣアッセイ）によってさらに決定した。細胞を、０％、５％または２５％のモルモット血清を含む培地中でインキュベートした。次に、ＣＤＣ効果を５μｇ／ｍｌのセツキシマブの存在下で検出した。図６２Ａに示されるように、ＣＤＣ効果は血清（補体）濃度に対応し、ＣＡＲ７－Ｅ３細胞を発現するＥ３に特異的であったが、対照Ｔ細胞には特異的ではなかった。ＣＤＣ効果もまた、５μｇ／ｍｌのセツキシマブまたはハーセプチンのいずれかの存在下でＬ７１９－Ｅ３細胞に対して調べた。図６２Ｂに示されるように、ＣＤＣ効果はセツキシマブの存在下でのみ観察された。

【0364】

６．１２ サイトカイン受容体Ｃ７ＲまたはＥ３は二重ＣＡＲの機能を高めた
[00599]ｉｎ ｖｉｖｏで普遍的ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存をさらに増強させるために、構成的シグナル因子ＩＬ７受容体（Ｃ７Ｒ）またはＥ３を２ＡによりＬ７１９二重ＣＡＲに連結させ、ｐＳＴＡＴ５シグナル伝達経路を活性化した。図５０Ａは、Ｌ７１９およびＬ７１９－Ｃ７Ｒ二重ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ１９およびＣＤ７抗原結合性ドメインの発現を示す。図５０Ｂは、ＣＤ７（ＨｅＬａ－ＣＤ７）を発現するＨｅＬａ細胞に対するＣ７Ｒ発現の有無にかかわらず、Ｌ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図５０Ｃは、ＣＤ１９（ＨｅＬａ－ＣＤ１９）を発現するＨｅＬａ細胞に対して、Ｃ７Ｒ発現の有無にかかわらず、Ｌ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図５０Ｂおよび５０Ｃにおいて試験されたエフェクター：標的比は４：１である。図５０Ｂおよび５０Ｃは、Ｌ７１９およびＬ７１９－Ｃ７Ｒの両方がＨｅＬａ－ＣＤ７およびＨｅＬａ－ＣＤ１９を効果的に殺傷したことを示す。図５０Ｄは、エンハンサー（Ｃ７ＲまたはＥ３）およびＣＤ７の両方を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。図５０Ｅは、ＮＡＬＭ６細胞に対するＣ７ＲまたはＥ３を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の６時間細胞毒性データを示す。この実験で試験されたエフェクター：標的比は５：１および１：１である。図５０Ｆは、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞に対するＣ７ＲまたはＥ３を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の６時間細胞毒性データを示す。この実験で試験されたエフェクター：標的比は５：１および１：１である。図５０Ｇは、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）およびＣ７ＲまたはＥ３を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。ｐＳＴＡＴ５は、Ｃ７ＲまたはＥ３を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞において高度に上方調節された。ｐＳＴＡＴ５の陽性対照として、ＣＡＲ１９＋ＩＬ２刺激を用いた。ｐＳＴＡＴ５の陰性対照として、非操作Ｔ細胞を使用した。図５０Ｈは、ＩＬ－２除去後にＣ７ＲまたはＥ３を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＡＬＭ６細胞による２回の刺激で処理した。

【0365】

[00600]図５０Ｉは、ＣＤ１９を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＣＤ１９）に対するＥ３（Ｌ７１９－Ｅ３）を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す。Ｌ７１９－Ｅ３細胞を標的細胞のみ、非形質導入ＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウト細胞（ＮＴ－ＤＫＯ）、およびＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む対照群と比較し、Ｌ７１９－Ｅ３はＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞に対してより良好な細胞毒性を示した。この実験で試験したエフェクター：標的比は５：１である。図５０Ｊは、ＣＤ７を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＣＤ７）に対するＥ３（Ｌ７１９－Ｅ３）を発現するＬ７１９二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を示す。Ｌ７１９－Ｅ３細胞を標的細胞のみ、非形質導入ＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウト細胞（ＮＴ－ＤＫＯ）、およびＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む対照群と比較し、Ｌ７１９－Ｅ３はＨｅＬａ－ＣＤ７細胞に対してより良好な細胞毒性を示した。この実験で試験したエフェクター：標的比は５：１である。

【0366】

[00601]図６３は、サイトカインシグナル伝達増強を伴わない、またはｍｂＩＬ１５、Ｃ７Ｒ、またはＥ３発現を伴うＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウトＣＡＲ７細胞におけるＩＬ２およびＩＦＮ－γの発現を示す。細胞を１：１エフェクター：標的細胞比でＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞により２４時間刺激した。上清を回収し、サイトカインビーズアレイによりＩＬ１２およびＩＦＮγ発現について測定した。図６３に示されるように、Ｃ７ＲおよびＥ３を発現するＣＡＲ７細胞は、高められたＩＬ－２産生を示した。

【0367】

[00602]図６４は、サイトカインシグナル伝達増強を伴わない、またはＣ７ＲまたはＥ３発現を伴うＴＣＲ／ＣＤ７二重ノックアウトＣＤ１９／ＣＤ７二重ＣＡＲ－Ｌ７１９細胞におけるＩＬ２およびＩＦＮ－γの発現を示す。

【0368】

[00603]細胞を１：２のエフェクター：標的細胞比でＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞により２４時間刺激した。上清を回収し、サイトカインビーズアレイによりＩＬ１２およびＩＦＮγ発現について測定した。図６４に示されるように、Ｃ７Ｒを発現するＣＡＲ７細胞は、高められたＩＬ－２産生を示した。

【0369】

６．１３ 本明細書に記載されるＣＡＲを構築するために使用される追加の配列
[00604]ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ Ｖ_Ｌ（配列番号８７）
[00605]DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
[00606]ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ Ｖ_Ｈ（配列番号８８）
[00607]EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
[00608]ＦＭＣ６３ ＣＤ１９ＣＡＲ（配列番号８９）
[00609]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00610]３Ａ１ｅ ＣＤ７ ｓｃＦｖ Ｖ_Ｌ（配列番号９０）
[00611]DIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKR
[00612]３Ａ１ｅ ＣＤ７ ｓｃＦｖ Ｖ_Ｈ（配列番号９１）
[00613]QVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSS
６．１４ ＣＤ１９およびＣＤ７二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖
[00614]図５７Ａは、Ｃ７Ｒを発現するＣＤ１９およびＣＤ７二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＣ１９７－Ｃ７Ｒ）の増殖を示す。操作された二重特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を２人の異なるＴ細胞ドナーから調製した。両ドナー由来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、反復性がん抗原刺激に応答して優れた持続性および増殖を示した。図５７Ｂは、刺激なしでＧＣ１９７－Ｃ７Ｒ細胞の増殖を示す。新しく調製されたＧＣ１９７－Ｃ７Ｒを、対照Ｔ細胞と比較して、ＩＬ２または抗原刺激を補足しないＴ細胞培養培地中で培養し、ＧＣ１９７－Ｃ７Ｒは、より良好な増殖を維持し、培養中で持続した。

【0370】

[00615]図５８Ａは、細胞培養１２日目のＧＣ１９７－Ｃ７ＲおよびＧＣ１９７－Ｅ３におけるＣＤ７ ＣＡＲおよびエンハンサーの発現を示す。図５８Ｂは、刺激なしにＣ７ＲまたはＥ３を発現するＧＣ１９７細胞（ＧＣ１９７－Ｃ７Ｒ）（ＧＣ１９７－Ｅ３）の増殖を示す。ＧＣ１９７－Ｃ７ＲまたはＧＣ１９７－Ｅ３細胞を、ＩＬ２を補足しないＴ細胞培養培地中で培養し、細胞増殖および持続の倍数についてモニターした。図５８Ｃは、抗原刺激の存在下でＧＣ１９７－Ｃ７ＲおよびＧＣ１９７－Ｅ３の増殖を示す。細胞をＮａｌｍ６（ＣＤ１９＋Ｂ－ＡＬＬ細胞系）によって反復刺激し、細胞増殖の倍数についてモニターした。データから、ＧＣ１９７－Ｃ７Ｒ／Ｅ３が、サイトカインまたは抗原刺激の有無にかかわらず、比較的優れた細胞増殖および細胞安定性を示すことが示された。

【0371】

６．１５ ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
[00616]図６９は、Ｎａｌｍ６（Ｂ－ＡＬＬ）マウス異種移植モデルにおけるＬ７１９およびＬ７１９－Ｃ７Ｒ ＵＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｖｏ有効性のＢＬＩイメージングを示す。各マウスに１×１０^６個のＮａｌｍ６細胞を静脈内接種した。４日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注入した（高用量：マウスあたり１×１０^６細胞または低用量：マウスあたり３×１０^５細胞）。ＢＬＩイメージングは、Ｌ７１９－Ｃ７Ｒ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞がＬ７１９ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞よりも腫瘍除去に対して良好な効果を有したことを示す。
実施例７ ＣＤ１３７およびＣＤ１９二重ＣＡＲを用いたＵ－ＣＡＲ Ｔ細胞の研究
一般的な材料および方法
[00617]ドナー血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離およびＴ細胞の増殖
[00618]末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離を介してＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてドナー血液から単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリングさせた磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0372】

[00619]ＰＢＭＣおよび末梢血初代ＮＫ（ＰＢＮＫ）細胞の細胞系および培養
[00620]Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫細胞、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ８６）；
[00621]Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞系、ＡＴＣＣ－ＣＣＬ２４３）；
[00622]Ｒａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系（ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスでトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞をスクリーニングすることにより得られる）
[00623]２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ３２１６）；
[00624]ＮＫ９２細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ２４０７）；
[00625]ＮＫ９２－ｆｆｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを有するレンチウイルスでトランスフェクトされたＮＫ９２細胞をスクリーニングすることによって得られる）
[00626]Ｒａｊｉ細胞、Ｋ５６２細胞およびＲａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞系をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭの両方に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0373】

[00627]ＮＫ９２細胞およびＮＫ９２－ｆｆｌｕｃ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡ、０．１ｍＭメルカプトエタノールおよび２００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＰＢＮＫをＣＤ５６マイクロビーズを用いてＰＢＭＣから選別し、次に上記培地中で培養し、４－１ＢＢＬ－ｍｂＩＬ１５を発現するＫ５６２の刺激下で増殖させた。

【0374】

[00628]Ｔ細胞および得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｘ－ｖｉｖｏ１５培地（５％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含む）中で培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の培養培地にｒｈＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終濃度３００ＩＵ／ｍｌで２日ごとに補足した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。

【0375】

７．１ ＣＤ１９－ＣＤ１３７二重ＣＡＲの設計およびウイルスのパッケージング
[00629]ＣＤ１９ ＣＡＲの構造は、ＳＰ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＶＨ－ヒンジ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζである；二重ＣＡＲを標的とするＣＤ１９およびＣＤ１３７（ＣＤ１９－ＣＤ７二重－ＣＡＲ）は、ＳＰ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＶＬ－リンカー－ ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ ＶＨ－リンカー－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ ＶＬ－リンカー－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＶＨ－ヒンジ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζである（図５２に示される）。ＣＤ１９－ＣＤ１３７－ループＣＡＲのヌクレオチド配列は、配列番号４１として記載される。

【0376】

[00630]ＣＤ１９－ＣＤ１３７－ループＣＡＲ（配列番号４１）：
[00631]ATGGCACTCCCTGTAACTGCACTTCTTTTGCCACTTGCCTTGCTCCTGCACGCAGCGCGGCCGGATATTCAAATGACACAAACTACCAGCTCCCTTTCAGCATCTTTGGGCGATAGAGTAACTATAAGTTGCCGCGCGTCCCAAGACATCTCTAAGTACCTTAACTGGTATCAACAAAAACCGGACGGGACGGTCAAACTGTTGATCTATCACACATCCAGATTGCACTCAGGCGTGCCGAGCAGGTTCAGTGGGAGTGGGTCAGGAACGGATTACAGCTTGACGATTAGTAACCTGGAGCAAGAAGACATTGCCACCTACTTCTGCCAGCAAGGTAACACTCTCCCATATACGTTCGGGGGTGGCACCAAGCTGGAAATCACTGGCGGCGGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAGGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCAGCACCTACTGGATCAGCTGGGTGAGGCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAAGATCTACCCCGGCGACAGCTACACCAACTACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGGGCTACGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCAGCACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCATGAGCTACGAGCTGACCCAGCCCCCCAGCGTGAGCGTGAGCCCCGGCCAGACCGCCAGCATCACCTGCAGCGGCGACAACATCGGCGACCAGTACGCCCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCGTGCTGGTGATCTACCAGGACAAGAACAGGCCCAGCGGCATCCCCGAGAGGTTCAGCGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCAGCGGCACCCAGGCCATGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCACCTACACCGGCTTCGGCAGCCTGGCCGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGGGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCCGGGCCCGGTCTCGTGGCACCTTCCCAGTCACTGTCCGTGACCTGCACCGTATCTGGGGTAAGTCTGCCGGATTATGGGGTTTCATGGATCCGGCAACCTCCGAGGAAAGGGTTGGAATGGCTGGGAGTCATCTGGGGAAGCGAGACAACTTATTATAATTCTGCTTTGAAGAGCCGCTTGACGATAATCAAGGACAACAGTAAGAGTCAGGTTTTCTTGAAGATGAATTCTCTTCAGACAGATGACACCGCTATTTATTATTGTGCAAAACATTATTATTACGGAGGATCCTACGCGATGGACTATTGGGGACAGGGTACCTCTGTTACGGTGTCCTCATCCGGAACAACGACACCAGCACCACGGCCACCCACTCCTGCTCCGACAATTGCGTCTCAGCCCCTTTCCCTTCGACCCGAAGCTTGTCGCCCTGCTGCGGGAGGAGCGGTCCACACGCGCGGGCTTGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCCGGGACATGCGGCGTCTTGCTCCTGAGTCTGGTTATAACGCTGTATTGTAAGCGAGGTCGGAAGAAGCTTTTGTATATCTTTAAACAGCCCTTTATGAGGCCCGTACAAACCACACAAGAGGAGGATGGGTGCTCATGCAGATTTCCTGAAGAGGAAGAGGGCGGTTGCGAACTTAGAGTCAAATTCAGCCGCTCCGCAGATGCACCTGCTTATAAACAGGGTCAGAATCAATTGTATAATGAACTTAATCTCGGGAGGCGCGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGCGACGGGGTCGAGACCCAGAGATGGGCGGTAAACCCCGCCGAAAGAACCCCCAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAAAAGGACAAAATGGCAGAAGCCTATTCCGAAATAGGGATGAAGGGAGAGCGGCGGCGAGGTAAGGGACATGACGGTCTTTATCAAGGTCTTAGTACTGCAACTAAGGACACCTATGACGCGCTGCATATGCAGGCTCTCCCACCTAGATAA
[00632]ＣＡＲ遺伝子をＥＦ１α（ＥＦ－１α）のプロモーター下でＦＵＷレンチウイルスベクター骨格にクローニングし、Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲを形成した。Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＣＡＲ、レンチウイルスエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２５９）およびレンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２６０）を、全レンチウイルス発現ベクターを調製するためにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上清を４８時間および７２時間で回収し、濃縮のために超遠心分離（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。濃縮されたウイルスはＴ細胞のトランスフェクションのために準備された。

【0377】

[00633]結果は、レンチウイルスベクターが首尾よく構築され、二重ＣＡＲの抗ＣＤ１９および抗ＣＤ１９／ＣＤ１３７の発現が期待通りに検出されたことを示す。
７．２ ＣＲＩＳＰＲの設計および構築
[00634]遺伝子編集のためのＣＤ１３７およびＴＣＲ ｇＲＮＡは、遺伝子編集効率およびオフターゲットリスクをｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ、ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍおよびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍで評価した後に選定された。本開示で使用されるｇＲＮＡは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＩＤＴ）によって合成された。ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９はＩＤＴから購入した。

【0378】

[00635]遺伝子編集のために、３μｇのＣａｓ９タンパク質および１．５μｇのｇＲＮＡを２０μｌ中で混合し、３７℃または室温で１５分間インキュベートしてリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次に、ＲＮＰをＬｏｎｚａ ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒによりＴ細胞にトランスフェクトした。遺伝子ノックアウト効率は、フローサイトメトリーによって検出する場合、タンパク質を発現する細胞の比によって決定された。
使用される
[00636]使用したｇＲＮＡ標的配列は、以下の通りである：
[00637]TRAC-gRNA1：TTCGGAACCCAATCACTGAC、配列番号２０
[00638]TRAC-gRNA2：TCAGGGTTCTGGATATCTGT、配列番号２１
[00639]TRAC-gRNA3：AAGTTCCTGTGATGTCAAGC、配列番号２２
[00640]CD137-gRNA1: AACGTGGCATCTGTCGACCC、配列番号４５
[00641]CD137-gRNA2: GCGCTGGAGAAACTATTTGG、配列番号４６
[00642]CD137-gRNA3: ACATTTAACGATCAGAAACG、配列番号４７
[00643]CD137-gRNA4: GGTCCTTTGTCCACCTGCGC、配列番号４８
[00644]CD137-gRNA5: GAGAAACTATTTGGAGGACA、配列番号４９
[00645]CD137-gRNA6: GGAGAAACTATTTGGAGGAC、配列番号５０
[00646]スクリーニング後、高ノックアウト効率のｇＲＮＡが各遺伝子で見出され、また、２つの遺伝子、ＴＣＲ／ＣＤ１３７をノックアウトした場合、高効率が観察された。

【0379】

７．３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
[00647]細胞の単離および活性化
[00648]アフェレーシス後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて密度勾配遠心分離により単球を単離した。次に、Ｔ細胞を富化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とカップリングさせた磁気ビーズによって活性化し、培養し、増殖させた。

【0380】

[00649]５％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび３００ＩＵ／ｍｌｒｈＩＬ２を含むＸ－ｖｉｖｏ１５をＣＡＲ－Ｔ細胞培地として使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、培養した。

【0381】

[00650]同種異系Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズを用いて活性化した。
[00651]同種異系ＰＢＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞をＰＢＮＫと共培養することによって活性化された。

【0382】

[00652]活性化前後の細胞表面上のＣＤ１３７の発現をフローサイトメトリーにより決定した。
[00653]エレクトロポレーションおよびレンチウイルス感染
[00654]Ｔ細胞を富化および活性化した２日後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズを除去し、細胞を管に回収し、３００ｇで５分間遠心分離に供し、次にＤＰＢＳで２回洗浄し、５０×１０^６／ｍｌの細胞密度でＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に再懸濁した。必要とされるｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの量は、細胞の密度に基づいて計算され、次に、細胞と混合し、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムＮ（Ｌｏｎｚａ）システムによってエレクトロポレーションのために移した。次に、細胞を予め温めた培地中に１～２×１０^６／ｍｌの密度になるように再懸濁した。細胞をさらに２～８のＭＯＩでレンチウイルストランスフェクションに供し、次にフラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーター中で培養した。

【0383】

[00655]細胞増殖およびＣＡＲ陽性率の検出
[00656]トランスフェクションの４日後に、細胞数およびＣＡＲ陽性細胞を検出し、Ｔ細胞におけるＣＡＲの陽性率を計算した。ノックアウト効率を決定するために、ＴＣＲ（またはＣＤ３）およびＣＤ１３７の陽性率も検出した。次に、細胞をインキュベーター内で連続的に培養し、細胞が凍結保存のために準備される１０日目まで、培地の半分を２～３日ごとに交換した。一例のワークフローを図５３に示す。

【0384】

[00657]結果は、調製したＣＤ１９－ＣＤ１３７ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＣＡＲの陽性率とＣＤ３の陰性率の両方が高かったことを示す。
７．４ ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷作用およびサイトカインの放出
[00658]実施例７．３で調製した二重ＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにＣＦＳＥ標識ＣＤ１９陽性腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）およびＣＤ１３７陽性細胞（活性化同種異系Ｔ細胞または活性化同種異系ＰＢＮＫもしくはＮＫ９２）の各１００ｕｌを、１：１の比で各細胞について１×１０^６／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ培地に混合し、次に９６ウェルプレート中で一晩から１週間培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＦＳＥ標識された標的細胞の数をフローサイトメトリーにより検出し、それにより共培養中のＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞の間の殺傷作用を決定した。さらに、培養培地もまた回収し、遠心分離に供し、放出されたサイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－２をサイトカインビーズアレイキット（ＣＢＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。

【0385】

[00659]結果は、ＣＤ１９－ＣＤ１３７ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ、ａｌｌｏ－Ｔまたはａｌｌｏ－ＮＫ細胞とのインキュベーションが大量のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２を産生することを示し、ＣＤ１９陽性またはＣＤ１３７陽性標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔの機能を示す。また、フローサイトメトリーの結果は、ＣＤ１９－ＣＤ１３７二重ＣＡＲ Ｔ細胞におけるａｌｌｏ－Ｔおよびａｌｌｏ－ＮＫの殺傷作用が、ＣＤ１９単一ＣＡＲ Ｔ細胞に対するものよりも有意に低かったことを示す。

【0386】

[00660]さらなる実験は、ＣＤ１９－ＣＤ１３７二重ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＤ１３７陽性細胞およびＮＫ細胞のみを除去するが、ＣＤ１３７陰性不活化Ｔ細胞またはＮＫ細胞において有意な殺傷作用を示さないことを示し、ＣＤ１３７ ＣＡＲの特異性を示す。

【0387】

７．５ ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
[00661]６～１２週齢のＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスを選択し、２×１０^５個のＲａｊｉ－ｆｆｌｕｃ細胞とａｌｌｏ－Ｔ細胞を静脈内注射した。５日後、マウスの腫瘍移植片負荷を測定し、腫瘍負荷に基づいてマウスを４群に分けた。１日後、２００μＬのＤＰＢＳ、０．５×１０^６個のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、および０．５×１０^６個のＣＤ１９－ＣＤ１３７ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ各マウスに注射した。ＣＡＲ－Ｔ治療後７日ごとにマウスの腫瘍負荷をさらに評価した。各マウスに３ｍｇのｄ－ルシフェリンを４分間反応のために腹腔内注射し、次に３０秒間曝露したＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて撮影した。

【0388】

[00662]結果は、ＣＤ１９－ＣＤ１３７ ＣＡＲ－ＴがＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して有意に腫瘍負荷を減少させ、ＣＤ１９－ＣＤ１３７ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に良好なｉｎ ｖｉｖｏ増殖を示したことを示し、ＣＤ１９－ＣＤ１３７ ＣＡＲ－Ｔ細胞が良好に生存し、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１９陽性腫瘍細胞を除去するより強い能力を有することを示す。

【0389】

７．６ ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＶＨＤ研究
[00663]マウスを最初に亜致死量の照射（１７５ｃＧｙ）で全身的に治療した。次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、治療されたマウスの胸部に注射した。体重減少、アーチバック、活性、被毛の質感、および皮膚の完全性を含むＧＶＨＤ臨床基準を用いて、マウスを週２～３回観察した。

【0390】

[00664]結果は、ＴＣＲノックアウトを伴わないマウスはすべてＧＶＨＤ症状を示したが、しかしながら、ＴＣＲ／ＣＤ１３７二重ノックアウトＣＤ１９－ＣＤ１３７ＣＡＲ－Ｔ細胞群ではＧＶＨＤは検出されなかったことを示す。

【0391】

７．７ 本明細書に記載されるＣＡＲを構築する際に使用されるさらなる配列
[00665]４－１ＢＢ－Ｌ（配列番号５１）
[00666]MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
[00667]４－１ＢＢ ＰＦ－０５０８２５６６ ｓｃＦｖ ＶＨ（配列番号５２）
[00668]EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSS
[00669]４－１ＢＢ ＰＦ－０５０８２５６６ ｓｃＦｖ ＶＬ（配列番号５３）
[00670]MSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL
[00671]４－１ＢＢ ＢＭＳ－６６３５１３ ｓｃＦｖ ＶＨ（配列番号５４）
[00672]QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQS PEKGLEWIGE INHGGYVTYNPSLESRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDYG PGNYDWYFDLWGRGTLVTVSS
[00673]４－１ＢＢ ＢＭＳ－６６３５１３ ｓｃＦｖ ＶＬ（配列番号５５）
[00674]EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPALTF CGGTKVEIKR
[00675]ＡＡＣ ＶＬ－ＶＨ（配列番号５６）
[00676]MALPVTALLLPLALLLHAARPMSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[00677]ＡＡＣ ＤＮＡ配列ＶＬ－ＶＨ（配列番号５７）
[00678]ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCATGAGCTACGAGCTGACCCAGCCCCCCAGCGTGAGCGTGAGCCCCGGCCAGACCGCCAGCATCACCTGCAGCGGCGACAACATCGGCGACCAGTACGCCCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCGTGCTGGTGATCTACCAGGACAAGAACAGGCCCAGCGGCATCCCCGAGAGGTTCAGCGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCAGCGGCACCCAGGCCATGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCACCTACACCGGCTTCGGCAGCCTGGCCGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAGGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCAGCACCTACTGGATCAGCTGGGTGAGGCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAAGATCTACCCCGGCGACAGCTACACCAACTACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGGGCTACGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCAGCGGCACCACCACCCCCGCCCCCAGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGTGA
[00679]ＡＡＣ ＶＨ－ＶＬ（配列番号５８）
[00680]ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAGGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCAGCACCTACTGGATCAGCTGGGTGAGGCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAAGATCTACCCCGGCGACAGCTACACCAACTACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGGGCTACGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCATGAGCTACGAGCTGACCCAGCCCCCCAGCGTGAGCGTGAGCCCCGGCCAGACCGCCAGCATCACCTGCAGCGGCGACAACATCGGCGACCAGTACGCCCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCGTGCTGGTGATCTACCAGGACAAGAACAGGCCCAGCGGCATCCCCGAGAGGTTCAGCGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCAGCGGCACCCAGGCCATGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCACCTACACCGGCTTCGGCAGCCTGGCCGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGAGCGGCACCACCACCCCCGCCCCCAGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGTGA
[00681]ＦＭＣ６３ ＶＨ（配列番号５９）
[00682]EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
[00683]ＦＭＣ６３ ＶＬ（配列番号６０）
[00684]DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
[00685]ＦＭＣ６３ ＣＤ１９ ＣＡＲ（配列番号６１）
[00686]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
実施例８ Ｅ４を発現するＵ－ＣＡＲ Ｔ細胞の研究
[00687]図５９Ａは、エンハンサーＣＤ４７またはＥ４を発現するＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ１９－ＣＤ４７）（ＣＡＲ１９－Ｅ４）の画分のフローサイトメトリーデータを示す。Ｅ４設計では、Ｃ７Ｒのエクトドメインは、キラーまたは食細胞性免疫細胞機能を阻害し、治療細胞を保護するＣＤ４７、ＣＤ２４または他のペプチドなどの免疫細胞阻害剤からのエクトドメインによって置換されている。ＣＡＲ１９－ＣＤ４７またはＣＡＲ１９－Ｅ４は、ＭＨＣＩ／ＩＩ発現を欠き、ＭＨＣ発現の欠如によるＮＫ細胞殺傷に対して非常に感受性であるＫ５６２細胞において発現される。ＣＡＲ１９およびＣＤ４７の発現をフローサイトメトリーにより分析した。図５９Ｂは、ＣＡＲ１９－ＣＤ４７およびＣＡＲ１９－Ｅ４細胞に対するＮＫ細胞殺活性を示す。ＣＤ４７とＥ４はともに、Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞殺傷の程度を低下させることができた。データは、Ｅ４が、ＭＨＣＩ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の保護に使用され得るＮＫ細胞による殺傷からＭＨＣＩ陰性細胞を保護し得ることを示す。

【0392】

[00688]図６０Ａは、ＣＤ１９およびリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の画分のフローサイトメトリーデータを示す。ＣＡＲ１９－ＣＤ４７またはＣＡＲ１９－Ｅ４は、ＴＣＲノックアウトＴ細胞において発現され、ＣＡＲ発現およびＳＴＡＴ５リン酸化のためにアクセスされた。ＣＡＲ１９－Ｅ２およびＣＡＲ１９－ＣＤ４７＋ＩＬ２刺激を陽性対照として用いた。Ｅ４はｐＳＴＡＴ５の上方調節を媒介する。図６０Ｂは、エンハンサーＣＤ４７（ＣＡＲ１９－ＣＤ４７）またはＥ４（ＣＡＲ１９－Ｅ４）を発現するＴＣＲ ＫＯ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示す。ＣＡＲ１９－ＣＤ４７、ＣＡＲ１９－Ｅ４、ＣＡＲ１９－Ｃ７Ｒを発現するＴＣＲノックアウトＴ細胞を、ＩＬ１２補足を伴わない細胞増殖および細胞生存について比較した。Ｅ４は、より強い細胞増殖、ならびに培養培地中でＩＬ２を除去した後の細胞数の維持を媒介することができる。Ｅ４は、ＩＬ２を添加することなく、より良好なＣＡＲ－Ｔ細胞安定性を維持する。Ｅ４は、ＨＬＡ－Ｉ ＫＯを有する細胞などの治療用細胞を、ＮＫ細胞殺傷、または食細胞およびＴキラー細胞による殺傷から保護し得る。

【0393】

[00689]構築物設計の配列：Ｃ７Ｒのエクトドメインは、キラーまたは食細胞性免疫細胞機能を阻害し、ＣＡＲ－Ｔ／ＮＫ細胞が患者の免疫系に付着するのを防ぐことができる、トランケート型ＣＤ４７、ＣＤ２４などの免疫細胞阻害剤で置換することができる。

【0394】

[00690]ＣＤ７ＣＡＲ－Ｅ４アミノ酸配列：
[00691]MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNEPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
実施例９ Ｔ－急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者の治療のためのＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの臨床データ
[00692]この実施例は、ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒを用いた臨床試験設計および臨床データを提供する。登録時には、骨髄細胞の３８．２％がＴ－ＡＬＬ細胞であるという腫瘍負荷を有する患者が登録された。ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ細胞を注入する前に、患者を前条件レジメンで治療した。前条件レジメンでは、リンパ球除去に対してフルダラビン、シクロホスファミドおよびエトポシドなどの化学療法剤を使用した。前条件レジメンは、より良好なＣＡＲ－Ｔ生着および腫瘍除去をもたらすことができる。リンパ球除去レジメン完了の２日後に、ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ細胞を１．５×１０^７／ｋｇで患者に静脈内注入した。ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒは、がん細胞（Ｔ－ＡＬＬ細胞）を迅速に消失させ、顆粒球および単球などの自然免疫細胞サブセットに影響することなく、約７～１０日でピークにまで増殖した。一旦、末梢血と骨髄の両方においてがん細胞が完全に除去されると、ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ細胞は、極めて迅速に最小レベルに戻り、これにより、患者自身の免疫系が、がん細胞除去直後に回復を開始することを可能にする。次に、Ｔ細胞およびＮＫ細胞は徐々に正常レベルに回復する。

【0395】

[00693]図６７は、Ｔ－急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）患者の治療に関するＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの臨床データ示す。臨床研究で使用されるＣＡＲ７－Ｃ７Ｒの構築物を図１７に示す。図６７Ａは、末梢血中のＴ－ＡＬＬ消失の動態を示す。Ｔ－ＡＬＬ細胞は、７～１０日以内に速やかに消失した。末梢血中のＴ－ＡＬＬ細胞濃度をフローサイトメトリーにより測定した。図６７ＢおよびＣは、ＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ細胞増殖動態を示し、図６７Ｂは、末梢血中のＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ細胞濃度を示し、図６７Ｃは、末梢血細胞のＣＡＲ７－Ｃ７Ｒ ＤＮＡコピー／μｇ ＤＮＡを示す。図６７ＤおよびＥは、骨髄および末梢血中の顆粒球およびリンパ球（Ｔ細胞およびＮＫ細胞）の回復を示す。

【0396】

[00694]本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には自明である。本発明は、明細書内に提供される特定の実施例によって限定されることを意図しない。本発明を上述の明細書を参照して説明したが、本明細書における実施形態の説明および例証は、限定的な意味で解釈されるものではない。ここで、本発明から逸脱することなく、当業者に多くの変形、変化、および置換が起こる。さらに、本発明の全ての態様は、種々の条件および変数に依存する、本明細書に記載される特定の図示、構成または相対比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、このような選択肢、修飾、変形例又は均等物をもカバーすることが企図される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造が、それによってカバーされることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図34C】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図36A】

【図36B】

【図37】

【図38A】

【図38B】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42A】

【図42B】

【図43】

【図44】

【図45A】

【図45B】

【図46】

【図47A】

【図47B】

【図48】

【図49】

【図50A】

【図50B】

【図50C】

【図50D】

【図50E】

【図50F】

【図50G】

【図50H】

【図50I】

【図50J】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54A】

【図54B】

【図54C】

【図55A】

【図55B】

【図56A】

【図56B】

【図56C】

【図56D】

【図56E】

【図57A】

【図57B】

【図58A】

【図58B】

【図58C】

【図59A】

【図59B】

【図60A】

【図60B】

【図61A】

【図61B】

【図62A】

【図62B】

【図63A】

【図63B】

【図64】

【図65】

【図66A】

【図66B】

【図66C】

【図67A】

【図67B】

【図67C】

【図67D】

【図67E】

【図68】

【図69】

【配列表】

2022512968000001.app

【国際調査報告】