特表 2022-512974 生体内ＣＲＩＳＰＲ超抑制因子による合成免疫調節

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】生体内ＣＲＩＳＰＲ超抑制因子による合成免疫調節

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220131BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220131BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

A61P31/04 ZNA

A61K35/76

A61K48/00

A61P7/00

G01N33/53 P

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021525082

(86)(22)【出願日】2019-11-07

(85)【翻訳文提出日】2021-07-12

(86)【国際出願番号】 US2019060285

(87)【国際公開番号】W WO2020097344

(87)【国際公開日】2020-05-14

(31)【優先権主張番号】62/899,584

(32)【優先日】2019-09-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/757,679

(32)【優先日】2018-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504318142

【氏名又は名称】アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ アリゾナ ステート ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100136249

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 貴光

(72)【発明者】

【氏名】キアニ サミラ

(72)【発明者】

【氏名】エブラヒムカニ モ レザ

(72)【発明者】

【氏名】モガダム ファルザネ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA06

4C084NA14

4C084ZA511

4C084ZA512

4C084ZB351

4C084ZB352

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA06

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZB35

(57)【要約】

本明細書では、ＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系、ならびに敗血症、対象における有害な免疫応答およびワルダンストロムマクログロブリン血症を治療するための合成抑制系を使用する方法および組成物が提供される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一のアンプリコンを含む、骨髄分化一次応答８８（ＭｙＤ８８）発現を生体内で抑制するための合成抑制系であって、
（ａ）（ｉ）ＭｙＤ８８の一部に相補的なガイド配列および（ｉｉ）ＲＮＡ結合タンパク質に特異的なアプタマー標的部位を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｂ）１つ以上の抑制ドメインに融合した前記アプタマーＲＮＡ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）多機能性Ｃａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、を含み、
前記単一のアンプリコンが、ＤＮＡベースのウイルス送達のためにベクターにパッケージされている、合成抑制系。

【請求項2】

前記ｇＲＮＡガイド配列のヌクレオチド長が１５以下である、請求項１に記載の合成抑制系。

【請求項3】

前記ｇＲＮＡガイド配列が、ＭｙＤ８８のＴＡＴＡボックス領域の上流１００塩基対（ｂｐ）以内を標的とする、請求項１に記載の合成抑制系。

【請求項4】

ｇＲＮＡガイド配列が、配列番号１～４からなる群から選択される、請求項１に記載の合成抑制系。

【請求項5】

前記アプタマー標的部位が、ＭＳ２アプタマー標的部位であり、前記ＲＮＡ結合タンパク質が、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である、請求項１に記載の合成抑制系。

【請求項6】

前記ｇＲＮＡが前記ＭＳ２アプタマー標的部位を含み、前記ガイド配列のヌクレオチド長が１５以下である、請求項５に記載の合成抑制系。

【請求項7】

前記抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ独立３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン含有タンパク質２（ＭＢＤ２Ｂ）のｎ末端短縮、タンパク質ホスファターゼ１の核阻害因子（ＮＩＰＰ１）、およびヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）からなる群から選択される、請求項５に記載の合成抑制系。

【請求項8】

（ｂ）の前記ヌクレオチドが、少なくとも２つの抑制ドメインに融合したＭＳ２をコードする、請求項７に記載の合成抑制系。

【請求項9】

抑制ドメインに融合したＭＳ２をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号５５、５９、６１、および６３からなる群から選択される配列を含む、請求項８に記載の合成抑制系。

【請求項10】

前記アプタマーＲＮＡ結合タンパク質および抑制ドメインに融合した多機能性Ｃａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の合成抑制系。

【請求項11】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたは化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１に記載の合成抑制系。

【請求項12】

前記ベクターが、ＡＡＶ２／１送達ベクターである、請求項１に記載の合成抑制系。

【請求項13】

請求項１に記載の合成抑制系、および薬学的に許容される送達ビヒクルを含む、薬学的組成物。

【請求項14】

敗血症の対象に、治療有効量の請求項１３に記載の組成物を投与することを含む、敗血症の対象を治療する方法。

【請求項15】

免疫関連マーカーＩｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４のレベルが、前記対象への投与後に減少する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４からなる群から選択される少なくとも１つの免疫関連マーカーの前記レベルを監視するステップと、前記少なくとも１つの免疫関連マーカーのレベルが低減するまで前記対象に追加用量の前記合成抑制系組成物を投与するステップと、を追加的に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

血清乳酸が投与後に前記対象において減少する、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

対象において有害な免疫応答を予防する方法であって、ＡＡＶベクターを基本とするの遺伝子治療薬を対象に投与する前、または同時に、治療有効量の請求項１３に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４からなる群から選択される免疫関連マーカーの前記レベルが、前記ＡＡＶベクターを基本とするの遺伝子治療薬を受けているが前記治療的合成抑制系組成物を受けていない対象と比較して前記対象において低減する、方法。

【請求項19】

前記対象が、少なくとも１つのＡＡＶベクターを基本とするの遺伝子治療薬を以前に受けた、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４からなる群から選択される少なくとも１つの免疫関連マーカーの前記レベルを監視するステップと、前記少なくとも１つの免疫関連マーカーの前記レベルが低減するまで前記対象に追加用量の前記合成抑制系組成物を投与するステップと、を追加的に含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

治療を必要とする被験者におけるワルデンシュトレームマクログロブリン血症を治療する方法であって、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の対象に、治療有効量の請求項１３に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項22】

Ｌ２６５遺伝子座でＭｙＤ８８を切断するように構成されたｇＲＮＡおよび前記Ｌ２６５遺伝子座で野生型ＭｙＤ８８の一部をコードする相同性指向修復テンプレートを含む組成物を前記対象に投与することをさらに含み、それによって内因性Ｌ２６５Ｐ変異体ＭｙＤ８８のレベルが前記対象で低下する、請求項２１に記載の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月８日出願の米国仮出願第６２／７５７，６７９号および２０１９年９月１２日出願の米国仮出願第６２／８９９，５８４号に対する優先権を主張し、これらの仮出願のそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府の資金提供を受けた研究に関する陳述
この発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ ＥＢ０２４５６２およびＤＡＲＰＡによって授与されたＨＲ００１ＩＬ６－２３６５７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

ＥＦＳ－ＷＥＢ経由で提出された配列リストの参照
「１１２６２４＿０ｌｌ３５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の４８．４ｋｂのサイズのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列リストの内容は、２０１９年１１月７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本出願とともに電子的に提出され、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

一般的な遺伝子送達方法と比較して、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、様々な種類の組織を高効率で標的とする驚くべき能力により、治療用遺伝子送達に幅広い可能性を有している。ＡＡＶベクターは、現在、臨床で使用されている一般的なタイプのＤＮＡウイルスである。慢性疾患の治療には、ＡＡＶで達成される導入遺伝子の長期的かつ安定した発現が必要である。しかしながら、ＡＡＶベクターまたは送達された導入遺伝子が適応免疫応答を引き起こし、ウイルスのカプシドまたは導入遺伝子を発現する細胞に対する抗体の産生および細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こすことが示されている。その後、この適応宿主免疫応答は、導入遺伝子の効果的な発現を危うくし、生体内でのＡＡＶ媒介性遺伝子治療において大きな課題となっている。

【0005】

並行して、クラスター化された規則的に間隔をあけた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ９系は、遺伝子編集と遺伝子調節を促進することにより、遺伝子治療に前例のない機会を提供している。非常に有望であるが、これまでに研究されたＣＲＩＳＰＲの最も一般的な形態であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ－Ｃａｓ９）由来のＣａｓ９タンパク質は、潜在的な免疫応答およびゲノム特異性を含む、臨床移行に関する多くの課題に直面している。ヒト試料に関する最近の研究は、試験された患者のサブセットにおけるＳｐ－Ｃａｓ９に対する既存の体液性および細胞性免疫応答を示唆しており、Ｃａｓ９タンパク質が新しい患者でも細胞性および体液性免疫応答を誘発する可能性があるという考えを提起している。さらに、細胞内のＣａｓ９発現の一時的な制限は、ゲノム内のＣＲＩＳＰＲのオフターゲット活性を減らすのに有益であることが実証されている。まとめると、これらの証拠は、ＣＲＩＳＰＲとその送達媒体（ＡＡＶウイルスを含む）の悪影響をオンデマンドで調節する戦略が、臨床移行の安全性にとって非常に重要であることを示唆している。

【発明の概要】

【0006】

第１の態様では、（ａ）（ｉ）ＭｙＤ８８の一部に相補的なガイド配列と、（ｉｉ）ＲＮＡ結合タンパク質に特異的なアプタマー標的部位と、を含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｂ）１つ以上の抑制ドメインに融合したアプタマーＲＮＡ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｃ）多機能性Ｃａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、を含む単一のアンプリコンを含み、単一のアンプリコンが、ＤＮＡベースのウイルス送達のためにベクターにパッケージされている、骨髄分化一次応答８８（ＭｙＤ８８）発現を生体内で抑制するための合成抑制系が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡガイド配列は、１４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡガイド配列は、ＭｙＤ８８のＴＡＴＡボックス領域の上流１００塩基対（ｂｐ）以内を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡガイド配列は、配列番号１～４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アプタマー標的部位は、ＭＳ２アプタマー標的部位であり、ＲＮＡ結合タンパク質は、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはＭＳ２アプタマー標的部位を含み、ガイド配列は１４ヌクレオチド長である。

【0007】

いくつかの実施形態において、抑制ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ非依存性３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン含有タンパク質２のｎ末端切断（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、およびヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、（ｂ）のヌクレオチドは、少なくとも２つの抑制ドメインに融合したＭＳ２をコードする。いくつかの実施形態において、抑制ドメインに融合したＭＳ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５、５９、６１、および６３からなる群から選択される配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、系は、アプタマーＲＮＡ結合タンパク質および抑制ドメインに融合された多機能性Ｃａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ ヌクレアーゼまたは化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ベクターはＡＡＶ２／１送達ベクターである。

【0009】

第２の態様において、本明細書に記載される合成抑制系および薬学的に許容される送達ビヒクルを含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。

【0010】

第３の態様では、敗血症の対象に、本明細書に記載の合成抑制系を含む組成物の治療有効量を投与することを含む。敗血症の対象を治療する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、免疫関連マーカーＩｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４のレベルは、投与後の対象において減少する。いくつかの実施形態において、方法は、Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４からなる群から選択される少なくとも１つの免疫関連マーカーのレベルをモニターするステップと、および少なくとも１つの免疫関連マーカーのレベルが低減するまで合成抑制系組成物の追加用量を対象に投与するステップと、を追加的に含む。いくつかの実施形態において、対象において、投与後に血清乳酸が減少する。

【0011】

第４の態様では、対象にＡＡＶベクターを基本とするの遺伝子治療薬の投与前または投与と同時に、本明細書に記載の合成抑制系を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における有害な免疫応答を予防する方法であって、Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４からなる群から選択される免疫関連マーカーのレベルが、ＡＡＶベクターに基づく遺伝子治療を受けたが、治療用合成抑制系組成物を受けなかった対象と比べて対象において低減する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１つのＡＡＶベクターを基本とするの遺伝子治療を以前に受けた。いくつかの実施形態において、この方法は、Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、Ｎｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４からなる群から選択される少なくとも１つの免疫関連マーカーのレベルをモニターするステップと、少なくとも１つの免疫関連マーカーのレベルが低減するまで、合成抑制系組成物の追加用量を対象に投与するステップと、を追加的に含む。

【0012】

第５の態様において、ワルデンストレームマクログロブリン血症を有する対象に、本明細書に記載の合成抑制系を含む組成物の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象においてワルデンストレームマクログロブリン血症を治療する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、方法は、Ｌ２６５遺伝子座でＭｙＤ８８を切断するように構成されたｇＲＮＡ、およびＬ２６５遺伝子座で野生型ＭｙＤ８８の一部をコードする相同性指向修復テンプレートを含む組成物を対象に投与することを追加的に含み、それにより対象において内因性Ｌ２６５Ｐ突然変異体ＭｙＤ８８のレベルが低減する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A-1H】インビトロおよび生体内でのＣＲＩＳＰＲベースの標的化されたＭｙｄ８８抑制を示し、ＡＡＶベースの遺伝子治療に対する宿主応答の調節における有効性を実証している。（図１Ａ）上部：Ｍｙｄ８８遺伝子座のプロモーターを標的としたｇＲＮＡ結合部位の模式図。下部：マウス神経芽細胞腫（Ｎ２Ａ）細胞株に、ＭｙＤ８８ ｇＲＮＡ対またはｍｏｃｋ ｇＲＮＡ対照をＣａｓ９ヌクレアーゼおよび、ＭＳ２－ＫＲＡＢまたはＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢカセットとともにトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を１０μｇ／ｍｌの濃度のリポ多糖（Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ、血清型０１１１：Ｂ４）で処理してＭｙｄ８８発現を誘導した。（図１Ｂ）ＬＰＳ処理後のＭｙｄ８８発現ｍＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析。倍率変化は、非標的化Ｍｏｃｋ ｇＲＮＡを受けた細胞の発現レベルに対して定量化された（Ｎ＝４独立したトランスフェクション）。（図１Ｃ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼトランスジェニックマウスへのＡＡＶ－ＭｙＤ８８またはＭｏｃｋリプレッサーの眼窩後注射を含む実験の概略図。（図１Ｄ）ＭＳ２－ＨＰ１ａ－ＫＲＡＢまたはＭＳ２－ＫＲＡＢを有するＡＡＶ／Ｍｙｄ８８またはＡＡＶ／Ｍｏｃｋベクターの１Ｅ＋１２ＧＣの眼窩後注射の３週間後のＣａｓ９トランスジェニックマウスの肺、血液、および骨髄におけるＭｙｄ８８発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（注射されたグループの場合はＮ＝４～５、注射されていないグループの場合はＮ＝２）。倍率変化は、ユニバーサルコントロールに対する（図１Ｅおよび１Ｆ）ユニバーサルコントロールに対するＩｃａｍ－１（図１Ｅ）およびＴｎｆα（図１Ｆ）ｍＲＮＡの発現レベルの倍率変化である。（注射されたグループの場合はＮ＝４～５、および注射されていないグループの場合はＮ＝２）。ユニバーサルコントロールは、ＡＡＶ注射を受けなかった注射されていないマウスから収集された血液試料中の所望の転写物のレベルである。＊＊Ｐ＜０．０１および＊Ｐ＜０．０５は、スチューデントのｔ検定によって測定された統計的有意性を示す。（図１Ｇ）Ｍｙｄ８８－Ｍｓ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ対Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＫＲＡＢで処置したマウスから採取した骨髄試料間の差次的に発現する遺伝子の有意性対発現を示すボルケーノプロット。点線より上の点は、遺伝子が有意に上方および下方に調節されている（調整されたｐ値＜０．０５）ことを表している。ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢの存在下で高度に下方抑制された遺伝子は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖のファミリーである。（図（１Ｈ）ＥＬＩＳＡによって測定された抗ＡＡＶ１ ＩｇＧ２Ａ抗体の分析は、ＡＡＶ１特異的抗体がＭｙｄ８８前処置で著しく抑制されることを明らかにする。＊＊Ｐ＜０．０１および＊Ｐ＜０．０５は、スチューデントのｔ検定によって測定された統計的有意性を示す。

【図2A-2H】宿主炎症性応答のＣＲＩＳＰＲベースの調節がＬＰＳ媒介性敗血症の後に保護を与えることを示す。（図２Ａ）敗血症におけるＣＲＩＳＰＲ媒介性ＭｙＤ８８抑制の保護効果を評価するための実験の概略図。１Ｅ＋１２ＧＣのＡＡＶベクターを、後眼窩注射を介してＣａｓ９発現マウスに注射し、約３週間後、それらはＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ）により腹腔内で治療された。ＬＰＳ注射の６時間後、マウスを屠殺した。（１］図２Ｂ～２Ｄ）炎症性遺伝子の内因性抑制。ＬＰＳ注射後のユニバーサルコントロールに対する生体内Ｍｙｄ８８（図２Ｂ）、Ｔｎｆα（図２Ｃ）、およびＩｃａｍ－１（図２Ｄ）の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析（注射されたグループの場合はＮ＝５～６、注射されていないグループの場合はＮ＝２）。（図２Ｅ）多重ＥＬＩＳＡアッセイを用いた血漿および肺における炎症性サイトカインのパネルの測定。測定された濃度を１０を底とする対数として値をヒートマップに表示する。（図２Ｆ）ＬＰＳ注射の６時間後にマウスから採取した血漿試料中の循環Ｌ－乳酸（Ｎ＝４）。（１］図２Ｇ）ＬＰＳ注射の６時間後の肝臓試料における生体内Ｍｙｄ８８発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。倍率変化の発現レベルは、ユニバーサルコントロールと比較して定量化された（注射されたグループの場合はＮ＝４～６、注射されていないグループの場合はＮ＝２）。（図２Ｈ）コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＡＬＴの血漿濃度（Ｎ＝３～４）。「ユニバーサルコントロール」は、ＡＡＶ注射を受けていない非注射マウスから採取した血液試料中の目的転写物のレベルである。２Ｂ～Ｄおよび２Ｃについては、「非注射」マウスのデータも図１Ｄ～Ｆに報告されていることに注意されたい。＊＊Ｐ＜０．０１および＊Ｐ＜０．０５は、スチューデントのｔ検定によって測定された統計的有意性を示す。

【図3A-3B】インビトロでのアプタマー媒介性ＣＲＩＳＰＲ抑制を示す。（図３Ａ）リプレッサードメインのＣＲＩＳＰＲ複合体へのアプタマー媒介性動員の概略図。（図３Ｂ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ複合体へのリプレッサードメインのアプタマー媒介性動員後の標的遺伝子のｍＲＮＡ発現。倍率変化は、ｄＣａｓ９のみの対象群と比較して定量化された。Ｎ＝３独立したトランスフェクション。

【図4】異なる組織に対するＡＡＶ２／１指向性の生体内分析を示す。ＡＡＶ２／１－ＧＦＰは、後眼窩注射を介してＣ５７ＢＬ／６マウスに送達された。ＧＦＰ発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって様々な組織で評価された。平均倍率変化発現レベルは、各グループの上に示され、注射されていないマウスと比較して定量化されている（注射されていないグループの場合はＮ＝３、ＡＡＶ－ＧＦＰグループの場合はＮ＝４～６）。

【図5A-5C】ＡＡＶ－Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫｒａｂ対ＡＡＶ－Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－Ｋｒａｂで処置されたマウスから収集された骨髄試料のＲＮＡ配列分析を示す。（図５Ａ）Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ対Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＫＲＡＢからの骨髄の２つの複製における遺伝子の発現を比較する散布図（１００万のマップされたリード当たりの転写物のキロベース当たりのフラグメント、ＦＰＫＭ）。Ｍｙｄ８８、Ｉｌ１ｂ、ＩｃａｍＩ、Ｔｎｆα、およびＩＬ６は赤で強調表示され、ＭｙＤ８８－ＭＳ２－ＫＲＡＢと比較してＭｙｄ８８－Ｍｓ２－ＨＰ１ａ－ＫＲＡＢグループで最も下方抑制された遺伝子はシアンで強調表示されている。（図５Ｂ）ＡＡＶ－Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫｒａｂ対ＡＡＶ－Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－Ｋｒａｂで処置したマウスから採取した骨髄試料を比較するＧＯ富化ヒストグラム。ＧＯ富化分析で有意に濃縮された上位２０の項が表示される。＊は、ｐａｄｊ値＜０．０５および有意性。ＨＰ１ａＫＲＡＢを使用した場合、Ｍｙｄ８８シグナル伝達に関連する細菌に対する防御応答などの経路は、ほとんどが下方抑制されていることに注意されたい。（図５Ｃ）Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ対Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＫＲＡＢのＢＭ試料を比較しているＲｅａｃｔｏｍｅデータベースの上位２０の富化された遺伝子を表示するＲｅａｃｔｏｍｅ富化の棒グラフ。＊有意性ｐａｄｊ値＜０．０５および有意性。

【図6】ＬＰＳ損傷後の一連の免疫関連転写産物の分析を示す。肺、血液、および骨髄におけるＮｃｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎγ、およびＩｌ１ｂ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＬＰＳ注射後のユニバーサルコントロールと比較して定量化した（注射されたグループの場合はＮ＝５～６、注射されていないグループの場合はＮ＝２）。ユニバーサルコントロールは、注射されていないＣａｓ９トランスジェニックマウスから収集された血液試料中の所望の転写物のレベルである。＊Ｐ＜０．０５、有意

【図7】ＬＰＳ注射後の肺および骨髄における免疫関連遺伝子パネルのレベルの評価を示す。肺および骨髄へのＬＰＳ注射後のユニバーサルコントロールと比較した、生体内ＣＤ６８（マクロファージマーカー）、Ｉｎｆα、Ｉｎｆβ、ＣＤ４、Ｃｘｃｌ１、およびＳｔａｔ４のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。（注射されたグループの場合はＮ＝５～６、注射されていないグループの場合はＮ＝２）。「ユニバーサルコントロール」は、注射されていないＣａｓ９トランスジェニックマウスから収集された血液試料中の目的転写物のレベルである。＊Ｐ＜０．０５、有意

【図8A-8C】Ｍｙｄ８８遺伝子座の異なる領域を標的とするｇＲＮＡのセットの抑制効率の評価を示す。（図８Ａ）Ｍｙｄ８８遺伝子座のプロモーターを標的とするｇＲＮＡ結合部位の模式図。（図８Ｂ）Ｎ２Ａ細胞に、示されたｇＲＮＡおよびＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢカセットを含むＣＲＩＳＰＲ機構の他の成分をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後にｑＲＴ－ＰＣＲによってＭｙｄ８８抑制のレベルを分析した（Ｎ＝２）。倍率変化は、ｇＲＮＡを受けていないグループに対する（ガイドなし）。（図８Ｃ）ＡＡＶの後眼窩注射の３週間後の生体内Ｍｙｄ８８発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。遺伝子発現の倍率変化は、ユニバーサルコントロールに対して定量化された（注射されたグループの場合はＮ＝４～６、注射されていないグループの場合はＮ＝２）。ユニバーサルコントロールは、注射されていないＣａｓ９トランスジェニックマウスから収集された血液試料中の所望の転写物のレベルである。（図８Ｃ）ＡＡＶ－Ｍｏｃｋ－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢおよびＡＡＶ－Ｍｙｄ８８ｓｅｔ１－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢデータに関する注記も図１Ｄに報告されている。＊Ｐ＜０．０５、有意

【図9】ＬＰＳ損傷後に損傷を受けた血清マーカーの分析を示す。腎臓への損傷のマーカーである血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、ＬＰＳ損傷後に血清中で増加し、Ｍｙｄ８８抑制によりそのような増加が防止された。ＬＰＳ治療とＭｙｄ８８抑制は、一般的に膵臓の損傷を示す血清リパーゼレベルに有意な影響を与えなかった。＊Ｐ＜０．０５、有意

【図10A-10C】Ｃｘｃｒ４の内因性抑制を示す。（図１０Ａ）Ｃｘｃｒ４遺伝子座のプロモーターを標的とするｇＲＮＡ結合部位の模式図。（図１０Ｂ）未処理の２６４．７細胞に、ＡＡＶ－Ｃａｓ９とともにＡＡＶ－ＣＸＣＲ４を形質導入した。Ｃｘｃｒ４ ｍＲＮＡの発現レベルは、形質導入の５日後にｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析された。倍率変化は、同じ用量のＡＡＶ－Ｍｏｃｋを受けた細胞の発現レベルに対して定量化された。（Ｎ＝２）。（図１０Ｃ）Ｃａｓ９トランスジェニックマウスへのＡＡＶ注射の３週間後の肺試料における生体内Ｃｘｃｒ４発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。倍率変化発現レベルは、同じ用量のＡＡＶ－Ｍｏｃｋを受けたマウスに対して定量化された。（Ｎ＝４）＊Ｐ＜０．０５、有意。

【図11】ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢとＣａｓ９－ＨＰ１ａＫＲＡＢとの違いを示す。データは、Ｃａｓ９とＭＳ２融合ＨＰ１ａ－ＫｒａｂリプレッサーおよびＨＰ１ａ－Ｋｒａｂと融合したＣａｓ９を使用した同様のレベルの抑制を示している。

【図12】Ｍｙｄ８８および下流サイトカインの抑制とそれに続く野生型マウスへのＣＲＩＳＰＲ送達を示す。

【図13】Ｍｙｄ８８および下流サイトカインの抑制とそれに続くＬＰＳを注射した野生型マウスへのＣＲＩＳＰＲ送達を示す。

【図14】異なる遺伝子座を標的とする１４ｎｔ対２０ｎｔのｇＲＮＡガイド配列を有するＣａｓ９の抑制効率の比較を示す。データは、１４ｎｔ ｇＲＮＡまたは２０ｎｔ ｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９＋ＭＳ２－ＨＰ１ａ－Ｋｒａｂリプレッサーを使用した同様のレベルの抑制を示している。

【図15】ＣＲＩＳＰＲ送達２４時間後の生体内Ｍｙｄ８８発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。マウスは２．５ｍｇ／ｋｇＬＰＳを受けた。ＬＰＳ注射の２時間後、マウスはｐｅｐｊｅｔを使用してＣＲＩＳＰＲ合成抑制系を受けた。Ｍｙｄ８８発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、肺、肝臓、および骨髄におけるＭｙｄ８８のレベルの低下を示している。

【図16】ＩＤＥＸＸ肝臓パネルのデータを示している。マウスは２．５ｍｇ／ｋｇＬＰＳを受けた。ＬＰＳ注射の２時間後、マウスはｐｅｐｊｅｔを使用してＣＲＩＳＰＲ合成抑制系を受けた。

【0014】

参照による組み込み
本明細書に記載されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、および特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本開示は、骨髄性分化一次応答８８（ＭｙＤ８８）の発現を生体内で抑制するための組成物および方法を記載する。本明細書に記載の組成物の使用および方法は、アデノ随伴ウイルスベクターおよびＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集構築物の投与に関連する免疫応答を治療または予防するのに有益である。さらに、本明細書に記載の組成物および方法は、敗血症に関連する異常な免疫応答を治療または予防するのに有用である。

【0016】

本明細書において提供されるＣＲＩＳＰＲ合成リプレッサー系は、ＭｙＤ８８の転写を阻害するように構成されている。ＭｙＤ８８は、自然免疫応答および適応免疫応答における重要なノードであり、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびインターロイキン（ＩＬ）－１ファミリーのシグナル伝達を含む多くのシグナル伝達経路の必須アダプター分子として機能する。多機能性ＣａｓヌクレアーゼとｇＲＮＡアプタマーを使用して開発された合成リプレッサー系は、生体内で内因性ＭｙＤ８８レベルを調節し、標的細胞の自然免疫応答および適応免疫応答の免疫調節に貢献する。例えば、標的細胞に多機能性Ｃａｓヌクレアーゼを（ｉ）ＭｙＤ８８に相補的なｇＲＮＡ－ＭＳ２アプタマー結合標的複合体および（ｉｉ）ＭＳ２に結合した抑制ドメインとともに導入することにより、合成リプレッサー系はＭｙＤ８８の転写を減少させ、ＭｙＤ８８機能に関連するシグナル伝達経路を下方抑制し、細菌およびウイルスなどの異物に対する細胞性免疫応答に関係している。

【0017】

したがって、本明細書において提供されるいくつかの態様は、ＭｙＤ８８の生体内発現を調節するための合成抑制系である。特定の実施形態において、系は、（ａ）（ｉ）ＭｙＤ８８遺伝子の少なくとも一部に相補的である１５ヌクレオチド長（ｎｔ）以下であるガイド配列と、（ｉｉ）ＲＮＡ結合タンパク質に特異的なアプタマー標的部位と、を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｂ）抑制ドメインに融合したアプタマーＲＮＡ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｃ）多機能性Ｃａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡヌクレオチド、抑制ドメインヌクレオチド、およびＣａｓヌクレアーゼヌクレオチドは、単一のアンプリコンを含む。特定の実施形態において、単一アンプリコンは、ＤＮＡベースのウイルス送達のためにベクターにパッケージされる。

【0018】

好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系は、エキソソーム、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、またはナノ粒子などの送達ベクターを使用して哺乳動物細胞に生体内送達するためにパッケージングできる単一のアンプリコンである。特定の実施形態において、単一のアンプリコン中に、場合によっては抑制ドメインに融合される多機能性Ｃａｓヌクレアーゼ、および１４ヌクレオチド長のガイド配列を含むｇＲＮＡを含む合成調節系であって、哺乳類細胞において切断および／または転写を調節する合成調節系が、本明細書において提供される。

【0019】

本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）は、標的遺伝子に少なくとも一部に相補的なガイド配列、およびＣａｓヌクレアーゼを標的遺伝子に動員する二次構造および一次配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）を提供する足場配列を含むヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ヘアピンループ、テトラループ、ステムループ、およびそれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない二次構造要素を含む。ｇＲＮＡ配列および構造のバリエーションは、当技術分野で知られている。当業者は、開示された合成抑制系に適した、Ｃａｓ９媒介性抑制に適用可能なｇＲＮＡ配列の変動耐性を認識するであろう。ｇＲＮＡ標的遺伝子はまた、標的遺伝子の標的部位のすぐ下流に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も含む。ＰＡＭ配列の例は既知である（例えば、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（５）：８９１～８９９，２０１３を参照）。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、アーキテクチャで使用されるＣａｓヌクレアーゼの種に依存する。

【0020】

いくつかの実施形態において、標的遺伝子の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡのガイド配列は、約２０ヌクレオチド（ｎｔ）の配列である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡのガイド配列は、１５以下のヌクレオチド（ｎｔ）の切断されたガイド配列である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、１５ｎｔのガイド配列、１４ｎｔのガイド配列、または１３ｎｔのガイド配列を含む。特定の製造者ニズム、理論、または作用機序に拘束されることなく、本明細書に記載の合成抑制系は、ヌクレアーゼが２０ｎｔのガイド配列ではなく１４ｎｔのガイド配列を有するｇＲＮＡに結合すると、Ｃａｓヌクレアーゼ活性の除去を利用する。Ｃａｓ複合体を標的遺伝子の標的部位に動員することにより、ヌクレアーゼ活性を阻害するが、Ｃａｓ複合体は標的遺伝子を切断せず、標的遺伝子の発現を阻害および抑制する。停止したＣａｓ複合体への抑圧ドメインのさらなる動員は、標的遺伝子の抑圧を増強する。

【0021】

特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、１つ以上の内因性遺伝子を標的とするように構成される。例として、抑制の対象となる内因性遺伝子には、成長因子、サイトカイン、相同組換え修復に関与する遺伝子、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する遺伝子、代謝酵素、細胞周期進行酵素、および創傷治癒と組織修復の経路に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、内因性遺伝子はＭｙＤ８８である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＭｙＤ８８の転写開始部位の上流または下流２００塩基対（ｂｐ）以内を標的とするように構成される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＭｙＤ８８遺伝子におけるＴＡＴＡボックス領域の１００ｂｐ上流以内を標的とするように構成される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号１～４からなる群から選択される。

【0022】

遺伝子抑制の有効性とシステムのスケーラビリティを向上させるために、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、場合によっては、ＲＮＡ結合タンパク質に特異的なヘアピンアプタマー標的部位を含むように操作されている場合がある。場合によっては、アプタマーの標的部位は、ｇＲＮＡのテトラループとステムループに付加される。ＲＮＡ認識モチーフは当技術分野で知られており、例えば、限定するものではないが、ＭＳ２結合モチーフ、ＣＯＭ結合モチーフ、または特定のタンパク質、ＭＳ２コートタンパク質、ＣＯＭ、またはＰＰ７がそれぞれ結合するＰＰ７結合モチーフなどである。場合によっては、アプタマーの標的部位は、二量体化したＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に結合することができる。ＰＰ７は、バクテリオファージＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのＲＮＡ結合コートタンパク質である。ＰＰ７は、ＭＳ２と同様に、特定のＲＮＡ配列と二次構造に結合する。ＰＰ７ ＲＮＡ認識モチーフは、ＭＳ２のモチーフのものとは異なる。その結果、ＰＰ７とＭＳ２を多重化して、異なるゲノム遺伝子座で異なる効果を同時に仲介することができる。

【0023】

いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下で発現される。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、Ｕ６およびＨ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例には、レトロウイルスＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ応答プロモーターが使用される。本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲ応答性プロモーター」という用語は、真核生物プロモーター、ならびに調節された遺伝子発現のための合成遺伝子調節装置および回路を包含する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ応答性プロモーターは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。ＣＲＩＳＰＲ応答性プロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ抑制性プロモーター（ＣＲＰ）またはＣＲＩＳＰＲ活性化プロモーター（ＣＡＰ）であり得る。

【0024】

ｇＲＮＡおよび短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現に使用されているＵ６およびＨ１などの標準的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、下流遺伝子の空間的または時間的制御を許可しない。ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡの空間的制限には、特にヒトの治療に関して、いくつかの重要な利点がある：１）ｇＲＮＡの発現を目的の組織／細胞型に制限し、これにより、送達ツールがＣＲＩＳＰＲコーディングカセットを全身に送達するという懸念がなくなる。２）生殖細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性に対する懸念を排除することにより、生殖細胞変異を回避する。３）隣接細胞またはクロストーク細胞における差次的な遺伝子編集／調節；異なる細胞型特異的プロモーターによるｇＲＮＡ調節により、科学者は異なる細胞型における異なる遺伝子セットの発現を調節することができる。したがって、特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子回路は、細胞型特異的プロモーターを使用してガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現を駆動するように構成される。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子回路は、合成プロモーターの代わりに内因性または細胞型特異的プロモーターを含むように構成される。例えば、合成ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩまたはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、細胞型またはコンテキスト固有のプロモーターと交換でき、細胞内シグナル伝達と連動して、多段階のセンシングと細胞挙動の調節を可能にする。場合によっては、転写抑制カスケードは、相互接続された２、３、または４つのＣＲＩＳＰＲ転写抑制回路（ＮＡＮＤ論理ゲート）で構成される。

【0025】

一般に、プロモーターは、産物をコードする核酸の転写を開始する核酸の領域である。プロモーターは、産物をコードする核酸の転写開始部位から上流（例えば、０ｂｐから－１００ｂｐ、－３０ｂｐ、－７５ｂｐ、または－９０ｂｐ）に位置するか、または転写開始部位がプロモーター内に位置する場合がある。プロモーターは、１００～１０００ヌクレオチド塩基対長または５０～２０００ヌクレオチド塩基対長を有し得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、少なくとも２キロベース（例えば、２～５ｋｂ、２～４ｋｂ、または２～３ｋｂ）の長さを有する。

【0026】

特定の実施形態において、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターからのｇＲＮＡ発現は、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ媒介性切断を使用して調節することができる。場合によっては、Ｃｓｙ４によって処理される単一のコーディング領域から複数のｇＲＮＡがタンデムに配置される。場合によっては、２０ｎｔのｇＲＮＡ標的部位がＵ６プロモーター部位とｇＲＮＡの本体の両方に挿入されている改変されたＵ６駆動型１４ｎｔ ｇＲＮＡカセットを使用することにより、高いオン／オフ比が達成される。この構造は、インビトロ、生体内、およびエキソビボで２０ｎｔのｇＲＮＡの発現時に１４ｎｔのｇＲＮＡカセットの完全な破壊を可能にする、第二世代キルスイッチを形成する。場合によっては、そのようなキルスイッチは、例えば、遺伝子治療の標的となることが多く、免疫寛容原性環境である組織などにおいて、生体内で発現する。本明細書に記載の合成リプレッサー系での使用に適したＣａｓ媒介性キルスイッチの追加の実施形態は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／００５８５６号に記載されており、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0027】

場合によっては、ｇＲＮＡに組み込まれたアプタマー標的部位に特異的なＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＳ２、ＣＯＭ、またはＰＣＰ）は、例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインなどの抑制ドメインに融合される。他の好適な抑制ドメインは当技術分野で知られており、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ非依存性３転写レギュレーターファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ－結合ドメイン含有タンパク質２のｎ－末端切断（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、およびヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＫＲＡＢおよび少なくとも１つの追加の抑制ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質ＭＳ２は、ＫＲＡＢおよび少なくとも１つの追加の抑制ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、ＭＳ２は、ＫＲＡＢおよびＨＰ１Ａに融合される。いくつかの実施形態において、ＭＳ２は、ＫＲＡＢおよびＭＥＣＰ２に融合される。いくつかの実施形態において、ＭＳ２は、ＭＥＣＰ２、ＫＲＡＢ、およびＭＢＤ２Ｂに融合される。いくつかの実施形態において、ＭＳ２は、ＭＢＤ２ＢおよびＨＰ１Ａに融合される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質－抑制ドメイン融合は、操作された核酸によってコードされる。

【0028】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質および少なくとも１つの抑制ドメインは、多機能性Ｃａｓヌクレアーゼに融合される。いくつかの実施形態において、多機能性Ｃａｓヌクレアーゼは、操作された核酸からコードされる。例えば、特定の実施形態において、転写修飾因子は、部位特異的転写修飾を可能にするために多機能性Ｃａｓヌクレアーゼに融合される。このような融合分子を操作するためには、様々な戦略を使用できる。場合によっては、転写調節因子が多機能性Ｃａｓヌクレアーゼに直接融合される。他の場合には、調節因子はＣａｓ／ｇＲＮＡ／ＤＮＡ複合体に動員するために、調節因子はＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質などの別のＲＮＡ結合タンパク質に融合される。

【0029】

場合によっては、多機能性Ｃａｓヌクレアーゼは抑制ドメインに融合される。他の場合では、抑制ドメインを使用せずに、Ｃａｓヌクレアーゼ媒介性立体障害によって抑制が達成される。抑制ドメインは、例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインなどの抑制ドメインに融合したＲＮＡ結合タンパク質（例えばＭＳ２）を含むことができる。他の適切な抑制ドメインは、本明細書に記載されている。

【0030】

本明細書に記載の合成抑制系の構成要素は、単一のアンプリコン中に提供されることが好ましい。しかし、場合によっては、成分は２つ以上のポリヌクレオチド配列の形であり得る。このような場合、合成抑制系は、ＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の構成要素を含む３つのカセットを単一細胞に導入することを含むことができ、第１のカセットは多機能性Ｃａｓ９ヌクレアーゼのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、第２のカセットはｇＲＮＡ構築物を含み、第３のカセットは、ＲＮＡ結合タンパク質－抑制ドメイン融合をコードする。いくつかの実施形態において、合成抑制系は、ＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の構成要素を含む２つのカセットを単一細胞に導入することを含み、第１のカセットは、抑制ドメインに融合した多機能性Ｃａｓ９ヌクレアーゼのポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、第２のカセットは、ｇＲＮＡ構築物を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のカセットは、誘導性プロモーターの制御下にあり得る。場合によっては、多機能性Ｃａｓ９ヌクレアーゼをレポーターポリペプチドまたは目的の他のポリペプチド（例えば、治療用タンパク質）に融合することが有利である。レポーターポリペプチドは、近赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）などの蛍光ポリペプチドであり得る（Ｃａｓ９タンパク質動態を監視するため）。

【0031】

場合によっては、誘導性プロモーターのアクチベーターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／００５８５６号に記載されているもののような、安全構築物を含むカセットによって提供される。アクチベーターは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体へのポリメラーゼ機構の動員を仲介または促進できる。アクチベーターは、ＶＰ１６転写活性化ドメインまたはＶＰ６４転写活性化ドメインなどの活性化ドメインに融合したジンクフィンガータンパク質であり得る。特定の実施形態において、ＭＳ２などの直交的に作用するタンパク質結合ＲＮＡアプタマーは、アプタマーを介したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体へのアクチベーターの動員に使用される。例えば、ＭＳ２－ＶＰＲ融合タンパク質は、アプタマーを介したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体へのアクチベーターの動員により、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ／１４－ｎｔ ｇＲＮＡ媒介性遺伝子活性化を助けるために使用することができる。インデューサーの存在下では、安全な２０ｎｔ ｇＲＮＡが発現し、１４ｎｔｇ ＲＮＡカセットが破壊される。合成調節回路は、操作されたポリヌクレオチドであってもよい。

【0032】

本明細書で使用される「操作された核酸」および「操作されたポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、当技術分野で既知のインビトロ技術を使用して設計および作製された核酸を指す。いくつかの実施形態において、本明細書において回路とも呼ばれる操作されたポリヌクレオチドは、生物のゲノムから単離されていない核酸である。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、細胞、複数の細胞、器官または生物に導入され、多様な機能を実行する（例えば、細胞の分化、細胞内のセンサーとして、センサーとして機能するように細胞をプログラムする、および選択的な細胞ベースの治療剤の送達）。

【0033】

いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的または細胞型特異的プロモーターなどの１つ以上のプロモーターを含む。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境要因、または特定の生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在、または複製中の細胞のみにおいて調節することができる。場合によっては、細胞型特異的プロモーターは、例えば、ホスホグリセレートキナーゼ２（Ｐｇｋ２）プロモーターなどの生殖細胞特異的プロモーターである。誘導性プロモーターおよび誘導性系は知られており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを含むがこれらに限定されない様々な商業的供給源から入手できる。多くの他の系が説明されており、当業者は容易に選択することができる。外部から供給されたプロモーターによって制御される誘導プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］、エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６～３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９、５５４７～５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導性系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６～１７６９ （１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２～５１８（１９９８）も参照されたい］、ＲＵ４８６誘導性系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９～２４３（１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２～４４１（１９９７）］およびラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５～２８７２（１９９７）］が含まれる。この文脈において有用であり得る、さらに他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製中の細胞のみにおいて調節されるものである。制御要素の非限定的な例には、プロモーター、アクチベーター、リプレッサー要素、インシュレーター、サイレンサー、応答要素、イントロン、エンハンサー、転写開始部位、終結シグナル、リンカーおよびポリ（Ａ）テールが含まれる。そのような制御要素の任意の組み合わせが本明細書で企図される（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）。

【0034】

いくつかの実施形態において、プロモーターは肺特異的プロモーターである。適切な肺特異的プロモーターは当技術分野で知られており、アルブミンプロモーターおよびヒトα－１抗トリプシンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは血液特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは骨髄特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＤ１１Ｂなどのマクロファージ特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＤ１９などのＢ細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＤ１１Ｃなどの樹状細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＤ４およびＣＤ８などのＴ細胞特異的プロモーターである。

【0035】

ＣＲＩＳＰＲ系は、異なる繰り返しパターン、遺伝子のセット、および種の範囲を有する異なるクラスに属する。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、通常、Ｉ型またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ酵素である。ＣＲＩＳＰＲ系は、有利にはタイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ系から誘導される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ酵素であり得る。「Ｃａｓ」および「ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。Ｃａｓ酵素は、任意の天然ヌクレアーゼ、ならびに任意のキメラ、突然変異体、ホモログ、またはオルソログであり得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の要素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳＰ）ＣＲＩＳＰＲ系またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）ＣＲＩＳＰＲ系などの内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物に由来する。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９または触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。Ｃａｓタンパク質の他の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘｌ２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが含まれる。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的な概説は、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０に提示されている。これまでに少なくとも４１のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが記述されている。

【0036】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、細胞内で天然に存在しない、すなわち、操作された、または細胞に対して外因性であることが理解される。本明細書で言及されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、細胞に導入されている。細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を導入する方法は当技術分野で知られており、本明細書の他の場所でさらに説明されている。本発明によるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が導入された細胞は、機能的ＣＲＩＳＰＲ複合体を確立し、標的ＤＮＡ配列を改変（例えば切断）することができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の個々の構成要素を含むか、または発現することができる。したがって、本明細書で言及されるように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む細胞は、標的ＤＮＡ配列を改変（例えば切断）できる機能的ＣＲＩＳＰＲ複合体を確立するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の個々の構成要素を含む細胞であり得る。あるいは、本明細書で言及されるように、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む細胞は、細胞で発現され得、標的ＤＮＡ配列を改変（例えば切断）できる、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の個々の構成要素をコードする１つ以上の核酸分子を含む細胞であり得る。

【0037】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の合成ＣＲＩＳＰＲベースの抑制系は、生物系（例えば、ウイルス、原核細胞または真核細胞、接合体、胚、植物、または動物、例えば、非ヒト動物）に導入され得る。原核細胞は細菌細胞であり得る。真核細胞は、例えば、真菌（例えば、酵母）、無脊椎動物（例えば、昆虫、虫）、植物、脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類）の細胞であり得る。哺乳動物細胞は、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒト細胞であり得る。細胞は、任意の種類、組織層、組織、または器官起源であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、リンパ球またはマクロファージなどの免疫系細胞、または線維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、上皮細胞、または内皮細胞であり得る。細胞は、培養中で無限に増殖することができる不死化哺乳動物細胞株であり得る細胞株のメンバーであり得る。

【0038】

複数の遺伝子の内因性抑制を達成するために、抑制ドメインは複数のｇＲＮＡに含まれている。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定のタンパク質（ＭＳ２コートタンパク質、ＣＯＭ、またはＰＣＰ）が結合するＭＳ２、ＣＯＭ、またはＰＰ７などの１つ以上のアプタマーをさらに含む。抑制ドメインはアプタマー結合タンパク質に融合され、したがって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体に動員されて、内因性遺伝子の転写の抑制を達成する。ＰＰ７は、バクテリオファージＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのＲＮＡ結合コートタンパク質である。ＰＰ７は、ＭＳ２と同様に、特定のＲＮＡ配列および二次構造に結合する。ＰＰ７ ＲＮＡ認識モチーフは、ＭＳ２のモチーフのものとは異なる。その結果、ＰＰ７とＭＳ２を多重化して、異なる遺伝子座で異なる効果を同時に仲介することができる。

【0039】

場合によっては、ＳＭＡＳｈまたは別の分解／不安定化ドメインは、本明細書に記載のＣａｓ９ヌクレアーゼまたは他のタンパク質融合体に融合される。一般に、不安定化ドメインは小さなタンパク質ドメインであり、リガンドの非存在下では不安定で分解さるが、その安定性は高親和性の細胞透過性リガンドに結合することによって救援される。不安定化ドメインを目的のタンパク質に遺伝子融合すると、融合体全体が分解される。不安定化ドメインにリガンドを付加すると、融合体が分解から保護され、このようにして、目的のタンパク質にリガンド依存性の安定性が追加される。

【0040】

場合によっては、ウイルスまたはプラスミドベクター系が、本明細書に記載の合成ＣＲＩＳＰＲベースの抑制系の送達に使用される。好ましくは、ベクターは、レンチウイルスまたはバキュロウイルス、または好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターであるが、他の送達手段も知られており（酵母系、マイクロベシクル、遺伝子銃／金ナノ粒子へのベクター付着手段など）、提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスまたはプラスミドベクターの１つ以上は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、または遺伝子銃を介して送達され得る。特定の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの抑制系またはその構成要素（例えば、ｇＲＮＡ）は、１つ以上のウイルス送達ベクターで細胞に送達するためにパッケージ化される。適切なウイルス送達ベクターには、アデノウイルス／アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）ベクターが含まれるが、これらに限定されない。例えば、合成ＣＲＩＳＰＲベースの抑制系は、１つ以上の単純ヘルペスアンプリコンベクターに導入することができる。

【0041】

いくつかの実施形態において、合成ＣＲＩＳＰＲベースの抑制系は、１つ以上のＡＡＶベクターに導入される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２／１ベクターである。本明細書で使用される「ＡＡＶ２／１ベクター」は、ＡＡＶ２末端逆位反復およびＡＡＶ１ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターを指す。他の適切なＡＡＶベクターは、当技術分野で知られており、例えば、ＡＡＶ１などであるが、これに限定されない。

【0042】

ウイルスベクターとウイルス粒子は、遺伝子治療に一般的に使用されるウイルス送達プラットフォームである。したがって、より迅速な臨床移行のために、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子回路は、埋め込まれたキルスイッチを使用して構築し、単純ヘルペスアンプリコンベクターに組み込むことができる。好ましくは、単一の担体ベクターを使用して、すべての合成遺伝子成分の標的細胞へのトランスフェクションを達成する。特定の理論または作用機序に拘束されるものではないが、２０ｎｔのｇＲＮＡを切断することだけを追加することでＣＲＩＳＰＲ機能を制御する能力は、ｇＲＮＡの小さなＤＮＡフットプリントとウイルス粒子の限られたペイロード容量のため、理想的な安全キルスイッチメカニズムを提供すると考えられている。場合によっては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）送達系が操作されたポリヌクレオチドの送達に使用できる。他の場合には、非ウイルス粒子が送達に使用できる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子回路の制御された空間的トランスフェクションおよび／または破壊は、すべてのＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子回路要素を、大きなペイロード容量（１５０ｋｂ）を持ち、複数の標的細胞に感染することができるＨＳＶ－１アンプリコンベクターに組み立ててパッケージ化することによって達成される。

【0043】

別の態様において、方法が単一細胞に２つのＡＡＶベクターを導入することを含む、共ウイルス（ｃｏ－ｖｉｒｕｓ）戦略が本明細書において提供される。第１のベクターは、（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）本明細書に記載の遺伝子調節のために構成されたｇＲＮＡを運ぶ。場合によっては、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがレポーターポリペプチドに融合している。レポーターポリペプチドは、近赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）などの蛍光ポリペプチドであり得る（Ｃａｓ９タンパク質動態を監視するため）。第２のベクターは「安全ベクター」であり、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／００５８５６号に記載されているように（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、２０ｎｔの制御可能なｇＲＮＡを運ぶ。第１のウイルスによって運ばれるＣａｓ９－ｉＲＦＰ融合ポリペプチドの発現が両方のＡＡＶベクターが導入された細胞でのみ起こることを確実にするために、融合ポリペプチドの発現は誘導性プロモーターの制御下にある。場合によっては、誘導性プロモーターのアクチベーターが安全なウイルスによって運ばれる。アクチベーターは、Ｐｏｌ ＩＩ機構のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体への動員を媒介または促進できる。アクチベーターは、ＶＰ１６転写活性化ドメインまたはＶＰ６４転写活性化ドメインなどの活性化ドメインに融合したジンクフィンガータンパク質であり得る。特定の実施形態において、ＭＳ２などの直交的に作用するタンパク質結合ＲＮＡアプタマーは、アクチベーターのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体へのアプタマー媒介性動員に使用される。例えば、第２のウイルス（安全なウイルス）は、アプタマーのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体へのアクチベーターの動員により、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳおよび１４－ｎｔ ｇＲＮＡ媒介性遺伝子活性化を支援するＭＳ２－ＶＰＲ融合タンパク質を運ぶことができる。インデューサーの存在下では、安全な２０ｎｔのｇＲＮＡが発現し、１４ｎｔのｇＲＮＡカセットが破壊される。

【0044】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子回路の用途には、様々な細胞型における慢性および急性状態を治療するための生体内ＣＲＩＳＰＲベースの精密遺伝子治療、ＣＲＩＳＰＲ細胞分類子のプラットフォームは、様々な治療および／または予防適用のために、様々な細胞、組織、または器官に適用できる、ＣＲＩＳＰＲ媒介性内因性遺伝子活性化を含む、ＣＲＩＳＰＲアクチベーターおよびリプレッサーを使用した内因性遺伝子の生体内調査、が含まれるが、これらに限定されない。例として、治療的適用には、対象における敗血症の治療、対象における免疫応答の予防または治療、およびワルデンストレームマクログロブリン血症の治療が含まれるが、これらに限定されない。

【0045】

特定の態様において、敗血症を治療する方法、対象における免疫応答を治療または予防する方法、およびワルデンストレームマクログロブリン血症を治療する方法が本明細書に提供される。本明細書に記載の治療または予防の方法は、治療有効量の本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系、または本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系をコードするポリヌクレオチドおよびベクターを含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本明細書で使用される「薬学的組成物」という用語は、哺乳動物への投与に適した化学的または生物学的組成物を指す。そのような組成物は、典型的に、活性剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」には、薬学的投与に適合する生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。そのような治療用途に適した組成物の例には、非経口、皮下、経皮、皮内、筋肉内、冠動脈内、心筋内、腹腔内、静脈内または動脈内（例えば、注射可能な）、または無菌懸濁液、乳液、およびエアロゾルなどの気管内投与用の製剤が含まれる。場合によっては、治療用途に適した薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または滅菌水、生理食塩水、グルコースなどの担体と混合されてもよい。例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物は、担体溶液を含む薬学的組成物として対象に投与することができる。

【0046】

製剤は、経口、直腸、鼻、全身、局所または経粘膜（頬側、舌下、眼、膣および直腸を含む）および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、腹腔内、髄腔内、眼内、および硬膜外を含む）投与のために設計または意図され得る。一般に、水性および非水性の液体またはクリーム製剤は、非経口、経口または局所経路によって送達される。他の実施形態において、組成物は、任意の経路、例えば、経口、局所、口腔、舌下、非経口、エアロゾル、皮下デポーまたは腹腔内または筋肉内デポーなどのデポー剤による投与に適した、水性または非水性液体製剤または固体製剤として存在し得る。場合によっては、薬学的組成物は凍結乾燥される。他の場合には、本明細書で提供される薬学的組成物は、投与経路および所望の調製に応じて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、防腐剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含む。薬学的組成物は、従来の製薬慣行に従って製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｅｄ．ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．ＳｗａｒｂｒｉｃｋおよびＪＣ Ｂｏｙｌａｎ，１９８８－１９９９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、非経口投与用の組成物は無菌でなければならず、注射しやすいように処方されるべきである。組成物は、製造および保管条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物による汚染から保護されていなければならない。

【0047】

いくつかの実施形態において、非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。調剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに封入することができる。患者または治療を行う医師の便宜のために、用量製剤は、一連の治療（例えば、７日間の治療）に必要なすべての装置（例えば、薬のバイアル、希釈剤のバイアル、注射器および針）を含むキットで提供することができる。

【0048】

無菌の注射用溶液は、必要に応じて、活性化合物を適切な溶媒中に必要な量で、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせを組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を無菌ビヒクルに組み込むことによって調製され、分散液は、基本的な分散媒と、上に列挙した必要な他の成分を含む。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、典型的な調製方法には、真空乾燥および凍結乾燥が含まれ、これにより、その事前に無菌濾過した溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を得ることができる。

【0049】

好ましい経路は、例えば、対象の病的状態または年齢、または治療に対する対象の反応、または状況に適したものによって異なり得る。製剤は、２つ以上の経路によって投与することもでき、その場合、送達方法は本質的に同時であるか、組成物が対象に投与される時間に時間的重複がほとんど、または全くない本質的に連続的であり得る。

【0050】

初回投与およびさらなる用量または連続投与に適した投与レジメンも可変であり、初回投与とそれに続くその後の投与を含み得るが、それでもなお、当業者は本開示、本明細書に引用する文書、本技術分野の知識から確認することができる。

【0051】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物は、注入、局所適用、外科的移植、または移植を使用して、それを必要とする対象に投与される。例示的な実施形態において、投与は全身的である。このような場合、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物は、対象への静脈内投与に適合した薬学的組成物中で、それを必要とする対象に提供することができる。通常、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液の溶液である。このような緩衝液および希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。必要に応じて、組成物は注射部位の痛みを緩和するために局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、成分は、例えば活性剤の量を示すアンプルなどの密閉容器内の凍結保存濃縮物として、個別に、または単位剤形で一緒に混合して供給される。組成物が注入によって投与される場合、無菌の製薬グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投与することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合できるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。場合によっては、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物は、投与前に凍結乾燥される。

【0052】

一実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物は、静脈内投与される。例えば、本技術の薬剤は、急速静脈内ボーラス注射によって投与され得る。いくつかの実施形態において、本技術の薬剤は、一定速度の静脈内注入として投与される。

【0053】

本技術の薬剤は、経口、局所、鼻腔内、筋肉内、皮下、または経皮的に投与することもできる。一実施形態において、経皮投与はイオントフォレーシスによるものであり、帯電した組成物は電流によって皮膚を通って送達される。

【0054】

他の投与経路には、頭蓋室内、脳室内、またはくも膜下腔内が含まれる。脳室内とは、脳の脳室系への投与を指す。髄腔内とは、脊髄のくも膜下の空間への投与を指す。したがって、いくつかの実施形態において、中枢神経系の器官または組織に影響を与える疾患および状態に対して、脳室内またはくも膜下腔内投与が使用される。

【0055】

全身、脳室内、くも膜下腔内、局所、鼻腔内、皮下、または経皮投与の場合、本技術の薬剤の製剤は、従来の希釈剤、担体、または賦形剤など、当技術分野で既知のものを利用して現在の技術の薬剤を送達する。例えば、製剤は、以下の１つ以上を含んでもよい：安定剤、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、および任意選択で塩および／または緩衝剤。本技術の薬剤は、水溶液の形態、または凍結乾燥形態で送達することができる。

【0056】

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物の治療上有効な量が、それを必要とする対象に投与される。有効な用量または量は、有益なまたは望ましい臨床結果をもたらすのに十分な量である。本発明の方法に関して、１回または複数回の投与で投与できる有効用量または量は、薬剤が投与される対象において治療効果を引き出すのに十分な、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物の量である。本明細書に記載の用量範囲は例示であり、限定を意図するものではない。本技術の薬剤の用量、毒性、および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（人口の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（人口の５０％で治療上有効な用量）を決定するために決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。

【0057】

細胞培養アッセイと動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための用量の範囲を処方する際に使用できる。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本明細書に記載の方法で使用される本技術の任意の薬剤について、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量を処方することができる。このような情報は、ヒトの有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

【0058】

典型的には、治療効果または予防効果を達成するのに十分な、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物の有効量は、約１×１０⁹ゲノムコピー（ＧＣ）／キログラム（ｋｇ）体重～約１×１０¹⁴ＧＣ／ｋｇ体重の範囲である。いくつかの実施形態において、用量範囲は、約１×１０⁹ＧＣ／ｋｇ体重／日～約１×１０¹⁴ＧＣ／ｋｇ体重／日である。例えば、約１×１０⁹ＧＣ／ｋｇ体重～約１×１０¹⁴ＧＣ／ｋｇ体重の用量は、毎日、２日ごと、または３日ごと、または１×１０⁹ＧＣ／ｋｇ体重～約１×１０¹⁴ＧＣ／ｋｇ体重の範囲内で毎週、２週間ごとまたは３週間ごとに投与され得る。一実施形態において、本技術の薬剤の単回用量は、１×１０⁹ＧＣ／ｋｇ体重～約１×１０¹⁴ＧＣ／ｋｇ体重の範囲である。例示的な治療レジメンは、１日１回または１週間に１回の投与を伴う。治療用途では、疾患の進行が軽減または終息するまで、または対象が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要になる場合がある。その後、患者に予防的なレジメンを投与することができる。投与スケジュールは、標的組織における治療濃度を維持するために、毎日一回または毎週の投与などによって最適化されるが、連続投与も含まれる（例えば、非経口注入または経皮適用）。

【0059】

当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、一般的な健康状態および／または対象の年齢、および他の病気の存在を含むがこれらに限定されない、特定の要因が対象を効果的に治療するために必要な用量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、本明細書に記載の治療有効量の治療組成物による対象の治療は、単一の治療または一連の治療を含むことができる。

【0060】

いくつかの態様において、対象における敗血症を治療するための方法が本明細書において提供される。敗血症を治療する方法は、敗血症を有する、または敗血症の危険性がある対象に、治療有効量の、本明細書に記載され、ＭｙＤ８８の抑制に特異的なＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物を投与することを含む。自然免疫および適応免疫におけるその役割により、ＭｙＤ８８の抑制によって、敗血症に関連する異常な免疫応答が減少をもたらす。本明細書に記載の組成物で治療された対象は、治療前の免疫関連マーカーのレベルと比較して免疫関連マーカーＩｃａｍ－１、Ｔｎｆα、ＮＣｆ、およびＩｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４のレベルが低減する可能性がある。いくつかの実施形態において、免疫関連マーカーＩｃａｍ－１、Ｔｎｆα、ＮＣｆ、およびＩｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４のレベルは、内部または外部対照または参照標準と比較される。本明細書に記載の組成物で治療された対象は、治療前のサイトカインのレベルと比較して、肺および血清のサイトカインのレベルが低下する可能性がある。明細書に記載の組成物で治療された対象は、治療前に測定されたレベルと比較して、血清乳酸レベルが低減する可能性がある。

【0061】

いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスベクター遺伝子治療またはＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子治療を受けている対象における有害な免疫応答を治療または予防する方法が、本明細書において提供される。対象における有害な免疫応答を防止する方法は、対象へのＡＡＶベクター療法の投与前に、治療有効量の、本明細書に記載され、ＭｙＤ８８の抑制に特異的なＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物を対象に投与することを含む。本明細書に記載の組成物は、ＡＡＶベクター療法の前に、または同時に投与することができる。いくつかの実施形態において、対象は、複数コースのＡＡＶベクター療法処置を受けた、または受ける予定であり、本明細書に記載の組成物は、ＡＡＶベクター療法の前、直後、または同時に投与される。本明細書に記載の組成物で治療される対象は、免疫関連マーカーＩｃａｍ－１、Ｔｎｆα、ＮＣｆ、Ｉｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４のレベルが、本明細書に記載された、ＭｙＤ８８の抑制に特異的なＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物ではないＡＡＶベクター療法を受けた対象で観察された免疫関連マーカーのレベルと比較して低減している可能性がある。本明細書に記載の組成物で治療された対象は、本明細書に記載され、ＭｙＤ８８の抑制に特異的なＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系組成物ではなく、ＡＡＶベクター療法を受けた対象で観察された免疫関連マーカーのレベルと比較して、肺および血清サイトカインのレベルが低減している可能性がある。

【0062】

いくつかの実施形態において、治療方法は、Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、ＮＣｆ、１１６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４からなる群から選択される少なくとも１つの免疫関連マーカーのレベルをモニタリングし、少なくとも１つのマーカーのレベルが減少するか、対象がＡＡＶベクター治療を受ける前、または対象が敗血症を患う以前のレベルに戻るまで、対象に、本明細書に記載され、ＭｙＤ８８の抑制に特異的なＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物を対象に再投与することを含む。

【0063】

いくつかの態様において、ワルダンストロムマクログロブリン血症の治療方法が本明細書において提供される。ワルダンストロムマクログロブリン血症は、リンパ球増殖とマクログロブリン産生が抑制されないことを特徴とする非ホジキンリンパ腫の一種である。Ｍｙｄ８８突然変異Ｌ２６５Ｐは、ＮＦ－κＢシグナル伝達を通じて悪性増殖をサポートし、その阻害は癌細胞の生存率の低下に関連している。対象のウォルダンストロムマクログロブリン血症を治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載され、ＭｙＤ８８の抑制に特異的なＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系は、内因性の突然変異体ＭｙＤ８８発現を抑制し、Ｌ２６５Ｐ突然変異を修正するために相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用するように設計されている。いくつかの実施形態において、組成物は、ＭｙＤ８８のＬ２６５遺伝子座付近のＣａｓヌクレアーゼ切断に特異的なｇＲＮＡをさらに含み、Ｌ２６５遺伝子座で正しい野生型配列をコードするＨＤＲテンプレートを含む。

【0064】

本明細書で提供される組成物、方法、およびシステムをより容易に理解できるように、特定の用語を定義する：

【0065】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数形を含む。本明細書における「または」への言及は、特に明記しない限り、「および／または」を包含することを意図する。

【0066】

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加的、非列挙されたメンバー、要素、または方法のステップを排除しない。本明細書で使用される表現および用語は、説明を目的としており、限定と見なされるべきではない．「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびそのバリエーションは、その後にリストされた項目および追加の項目を含むことを意味する。クレームの要素を修飾するための請求項における「第１」、「第２」、「第３」などのような序語の使用は、それ自体は、ある請求項要素の別の請求項要素に対する優先度、優先度、または順序、または方法の行為が実行される時間的順序を暗示しない。序語は、請求項要素を区別するために、単にある名称を有する請求項要素を同じ名称を有する別の要素と区別するためのラベルとして使用される（序語として使用するのではなく）。

【0067】

本明細書で使用される「合成」および「操作された」という用語は交換可能に使用され、人の手によって操作されたという態様を指す。

【0068】

本明細書で使用される場合、１つ以上の標的核酸配列を「改変する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）」（「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」）は、（１つ以上の）標的核酸配列のすべてまたは一部を変更することを指し、標的核酸配列の全部または一部の切断、導入（挿入）、置換、および／または欠失（除去）を含む。標的核酸配列のすべてまたは一部は、本明細書で提供される方法を使用して、完全にまたは部分的に改変することができる。例えば、標的核酸配列の改変には、標的核酸配列のすべてまたは一部を１つ以上のヌクレオチド（例えば、外因性核酸配列）で置換すること、または標的核酸配列のすべてまたは一部（例えば、１つ以上のヌクレオチド）を除去または削除することが含まれる。１つ以上の標的核酸配列を改変することは、１つ以上のヌクレオチド（例えば、外因性配列）を１つ以上の標的核酸配列内へ（ｉｎｔｏ）内に（ｗｉｔｈｉｎ）導入または挿入することも含む。

【0069】

別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む本開示で使用されるすべての用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。

【0070】

この説明は特定の態様または実施形態に言及しているが、そのような態様または実施形態は、本質的に例示であり、網羅的ではない。本開示を検討すると、当業者は、多数の他の可能な変形または代替の構成または態様が可能であり、本開示の範囲内で企図されることを容易に認識し、理解するであろう。

【0071】

実施例１
ここで説明する実施形態は、ＣＲＩＳＰＲベースの合成抑制系を使用して、インビトロおよび生体内で内因性ＭｙＤ８８発現を抑制することを実証している。

【0072】

ここに記載されている実施形態は、以前に報告されたＣＲＩＳＰＲ多機能性の概念を使用する（それぞれが参照により本明細書に取り組まれる、Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．”Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１１５９（２０１５）、およびＫｉａｎｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． ”Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １２，１０５１（２０１５）を参照されたい）。単一のＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ依存性機能と非依存性機能を切り替える能力は、遺伝子編集とエピジェネティックな操作を組み合わせる刺激的な可能性を提供する。発明者らは、５’末端からのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の切断により、遺伝子の転写調節のためのヌクレアーゼコンピテントＣａｓ９タンパク質の適用が可能になることを以前に報告した。Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．は最近、遺伝子の転写活性化のための生体内でのこのシステムの有用性を示した。（Ｌｉａｏ，Ｈ．－Ｋ． ｅｔ ａｌ．”Ｉｎ ｖｉｖｏ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓ－ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ １７１，１４９５－１５０７．ｅ１４１５（２０１７）。しかしながら、転写抑制またはＤＮＡ切断／転写の同時変調、および臨床的に関連する条件におけるこの概念のより広範な有用性は、まだ調査されていない。この開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの生体内治療の安全性と制御可能性の文脈でこの概念を利用する技術について説明する。

【0073】

骨髄分化一次応答８８（ＭｙＤ８８）は、自然免疫応答および適応免疫応答における重要なノードであり、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびインターロイキン（ＩＬ）－１ファミリーのシグナル伝達を含む多くのシグナル伝達に不可欠なアダプター分子として作用している。自然免疫および適応免疫におけるＭｙＤ８８シグナル伝達の中心的な役割を考慮して、発明者らは、発明者が生体内で内因性Ｍｙｄ８８レベルの調節を通じて合成免疫調節を達成できるかどうかを決定することに着手した。

【0074】

本発明者らは、強化されたＣＲＩＳＰＲベースの転写抑制因子が、インビトロで、触媒的に死んだＣａｓ９タンパク質（ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ２またはＨＰ１ａ）に対して調節因子のセットの直接融合によって発現したことを以前に報告した。本発明者らは、ＭＳ２コートタンパク質（ここではＭＳ２と呼ぶ）に融合し、ｇＲＮＡアプタマー結合によってＣＲＩＳＰＲ複合体に動員された場合に効率的な転写抑制をもたらすことができる、我々が以前に報告した候補から抑制ドメインを決定する実験を最初に考案した（図３Ａ）。ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３ＦＴ）細胞における一連の標的遺伝子の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析により、ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ［ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１ａ）－クルッペルｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）］が発明者らが試験した遺伝子にわたって効率的な抑制を可能にすることを立証した（図３Ｂ）。

【0075】

これらの知見を生体内に移行するために、本発明者らは、ヌクレアーゼコンピテントＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）－Ｃａｓ９タンパク質および切断されたｌ４ｎｔ ｇＲＮＡを、生体内でのＭｙｄ８８の転写抑制のために利用することに着手した。本発明者らは、最初に、ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢを介した内因性マウスＭｙｄ８８レベルの抑制をインビトロで調べ、一般的に使用されるＫＲＡＢベースの転写抑制と効率を比較した。本発明者らは、内因性マウスＭｙｄ８８遺伝子座のＴＡＴＡボックス領域の１００ｂｐ上流内を標的とする２つの１４ｎｔのｇＲＮＡを合理的に設計するか、以前に報告された非標的化ｍｏｃｋ ｇＲＮＡを対照として使用した（図１Ａ）。Ｍｙｄ８８のｑＲＴ－ＰＣＲは、ｇＲＮＡのインビトロ機能性と、内因性Ｍｙｄ８８の抑制におけるＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢの優位性を実証する。（図１Ｂ）。

【0076】

これらのリプレッサーを生体内で試験するために、本発明者らは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内にｇＲＮＡおよびＭＳ２抑制カセットをパッケージングすることによる送達を追求した。ＡＡＶの血清型は、ＣＲＩＳＰＲを生体内で送達するために使用され、最も一般的な血清型はＡＡＶ９であり、多数の実質細胞集団に対して高い親和性がある。ここで、本発明者らは、ＡＡＶ２末端逆位反復からなる組換えＡＡＶベクターであるＡＡＶ２／１と、ＡＡＶ１ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を使用した。ＡＡＶ１は、免疫系の構成要素、および樹状細胞および内皮細胞などの非実質細胞の形質導入に効果的であることが示されている。さらに、ＡＡＶ１キャプシドは、宿主のＡＡＶに対する免疫経路の一部としてＭｙＤ８８シグナル伝達を誘導できる。ＡＡＶ２／１組織親和性の我々の評価は、血液、肺および骨髄において最も高い発現を明らかにした（図４）。その後、本発明者らは、ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢまたはＭＳ２－ＫＲＡＢカセットを有するＡＡＶ／Ｍｙｄ８８ ｇＲＮＡまたは対照ＡＡＶ／Ｍｏｃｋ ｇＲＮＡの、Ｃａｓ９ヌクレアーゼトランスジェニックマウスへの全身送達を実施した（図１Ｃ）。Ｍｙｄ８８のＣＲＩＳＰＲを介した転写抑制が、ＡＡＶに対する免疫応答に生理学的に関連する効果を生み出すことができるかどうかを試験するために、発明者らは、Ｃａｓ９の送達に関連する潜在的な交絡効果を排除できるので、Ｃａｓ９発現マウスを特に選択した。注射から３週間後、血液、肺、骨髄を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＭｙｄ８８の発現を評価した（図１Ｄ）。注射されていない対照と比較して、ＡＡＶベクターの送達は、発明者が試験した異なる組織にわたってＭｙｄ８８の増加をもたらした。ＨＰ１ａＫＲＡＢで内因性Ｍｙｄ８８を抑制するＣＲＩＳＰＲによる治療は、ｍｏｃｋ ｇＲＮＡ治療グループと比較して、血液（約８４％）、肺（約７５％）、および骨髄（約６３％）におけるＭｙｄ８８のレベルの有意な減少につながった。これらの組織に対するＡＡＶ２／１の高い親和性と一致している。ＫＲＡＢドメインのみの投与により、肺（約５２％）、血液（約５９％）、および骨髄（約３４％）におけるＭｙｄ８８の抑制はそれほど顕著ではなく、試験した動物間でわずかに高いばらつきがあった（図１Ｄおよび表１）。

【0077】

【表1】

【0078】

下流の遺伝子調節ネットワークの変化における抑制の効力を評価するために、発明者らは、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）および細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）のレベルを評価し、２つのシグナル伝達経路はＭｙＤ８８シグナル伝達経路により直接調節された。ＭＳ２－ＨＰ１ａ－ＫＲＡＢによるＭｙｄ８８ターゲティングにより複数の組織にわたるＩｃａｍ－１およびＴｎｆαの発現が顕著に低減したが、ＭＳ２－ＫＲＡＢによる標的化では同様の一貫した効果をもたらさなかった（図１Ｅ－１Ｆおよび表１）。

【0079】

ＭＳ２－ＫＲＡＢと比較したＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ系の抑制効率の全身評価を行うために、発明者らは、これらの構築物で処置したマウスの骨髄で次世代ＲＮＡシーケンシングを行った。ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ処置マウスは、ＭＳ２－ＫＲＡＢ処置マウスと比較して低いＭｙＤ８８レベルを発現し（図５Ａ）、Ｉｌ１βなどの下流シグナル伝達経路の変化を伴う。注目すべきことに、ＧＯ富化分析により、Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ処置マウスは、Ｍｙｄ８８機能に関連する経路である外来生物および細菌に対する免疫および防御応答に関与するシグナル伝達経路の有意な下方抑制を有することが明らかになった（図５Ｂ）。同様に、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースは、ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢの存在下で下方抑制される非常に重要な経路の１つとしてＴＬＲ経路を明らかにした（図５Ｃ）。この証拠は、Ｍｙｄ８８およびその下流の免疫経路の調節が、生体内でのＭＳ２－ＨＰ１ａ ＫＲＡＢリプレッサーで最も効果的であることを示唆している。

【0080】

興味深いことに、差異的に発現する遺伝子のボルケーノプロットにより、免疫グロブリンＧ１およびＧ２（Ｉｇｈｇ１およびＩｇｈｇ２ｂ）の重鎖の定常領域、および他の免疫グロブリン関連重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域が、ＫＲＡＢと比較してＨＰ１ａ ＫＲＡＢで最も下方抑制されていることが明らかになった（図１Ｇ）。

【0081】

以前の研究は、ウイルスＤＮＡがＴＬＲ（すなわち、ＴＬＲ９）を刺激し、次にＭｙＤ８８を活性化し、適応免疫およびＡＡＶに対する抗体産生につながる下流のシグナル伝達イベントを開始することを実証している。以前の証拠および免疫グロブリン経路の抑制が観察されたことに照らして、本発明者らは、Ｍｙｄ８８抑制群においてＡＡＶ特異的体液性応答が減少したかどうかを調べた。本発明者らは、ＡＡＶ１キャプシドに対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）応答を測定した。非注射対照と比較して、本発明者らは、ＡＡＶ／Ｍｏｃｋ処置動物におけるＡＡＶ１に対する血漿ＩｇＧ２ａレベルの１１倍の増加を検出した。しかし、ＡＡＶ／Ｍｙｄ８８を受けた患者は、ＡＡＶ－１に対して血漿ＩｇＧ２ａが有意に低かった（６０％）（図１Ｈ）。この発見は、現在のＡＡＶベースの遺伝子治療における重要な課題である、ＡＡＶに対する体液性免疫を調節する刺激的な機会を提示し、同時に遺伝子編集（ヌクレアーゼコンピテントＣＲＩＳＰＲ）を実行するのに本質的に適したツールを提示する。

【0082】

ＭｙＤ８８の転写調節のためのより強力なＣＲＩＳＰＲリプレッサーを特定したので、本発明者らは、次に、敗血症などで全身の転写反応が増強された場合に、この抑制が下流の宿主反応を調節し、保護を与えるのに十分かどうかを調べた。さ敗血症は、抗生物質耐性の出現と慢性疾患に苦しむ患者の延命により、差し迫った医学的問題である。らに、敗血症による高い死亡率は、依然として戦場での外傷後の医学的課題であり、新しい予防戦略の必要性を浮き彫りにしている。

【0083】

本発明者らは、Ｃａｓ９マウスをＡＡＶ／Ｍｙｄ８８－ＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢまたはＡＡＶ／Ｍｏｃｋで前処理し、３週間後に全身性リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１２７：Ｂ８から）で処理した。ＬＰＳ治療の６時間後、本発明者らは肺、血液および骨髄を採取し、Ｍｙｄ８８および主要な炎症性サイトカインの転写レベルを評価した（図２Ａ）。本発明者らは、ＡＡＶ／Ｍｏｃｋ処置マウスと比較して、肺（６１％）、血液（８０％）および骨髄（７６％）におけるＭｙｄ８８の有意な抑制を観察した（図２Ｂ）。ＬＰＳに応答して、Ｍｙｄ８８の抑制は、Ｉｃａｍ－１、Ｔｎｆα、ＮＣｆ、およびＩｌ６、Ｉｆｎ－α、Ｉｆｎ－β、Ｉｆｎ－γ、およびＳｔａｔ４などのＭｙｄ８８シグナル伝達の直接的または間接的に下流にある広範囲の炎症および免疫関連マーカーの上方調節を妨げた（図２Ｃ～２Ｄ、図６、および図７）。定量的ＥＬＩＳＡベースの化学発光アッセイを使用した血清および肺のサイトカインレベルの分析により、Ｍｙｄ８８抑制マウスにおけるサイトカインのレベルの低下が明らかになった（図２Ｅ）。さらに、敗血症および組織損傷に関連する全身マーカーである血清乳酸レベルは、ＬＰＳ曝露前にマウスをＡＡＶ／Ｍｙｄ８８抑制カセットで前処理した場合に有意に低く、全身損傷の低減を示した（図２Ｆ）。

【0084】

次に、本発明者らは、Ｍｙｄ８８プロモーターの異なる領域を標的とすることにより、Ｍｙｄ８８抑制レベルを調査した。本発明者らは、転写開始部位の１００ｂｐ上流内を標的とするｇＲＮＡを構築し（セット２）、以前のｇＲＮＡセット（セット１）と比較して優れたインビトロ効力を検出した（図８Ａ～８Ｂ）。驚くべきことに、新しいＭｙｄ８８ ｇＲＮＡは、以前のｇＲＮＡセットと比較した場合、肝臓で優れた抑制をもたらしたが、ｇＲＮＡの以前のセットと比べて血液、肺、および骨髄であまり優れないＭｙｄ８８の抑制をもたらした（図８Ｃ）。これは、ＬＰＳ損傷後にも観察され（図２Ｇ）、内因性プロモーター内のｇＲＮＡ標的部位の潜在的な器官および細胞型特異的効果を示している。次に、本発明者らは、このＣＲＩＳＰＲベースのＭｙＤ８８抑制が、ＬＰＳ誘発性損傷後に病態生理学的に関連する表現型を誘発するのに十分であるかどうかを調べた。全身性炎症反応および肝臓の組織損傷の血清マーカーの分析は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｓｅｔ ２による前処理がＬＰＳ注射の有害な影響を弱めることを示した（図２Ｈ）。特に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、ＬＰＳ治療後に増加して全身のＬＰＳを排除し、組織を損傷から保護し、ＭｙＤ８８シグナル伝達に関連付けられていることが示された。これに従って、本発明者らは、ＬＰＳがＨＤＬ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、およびｍｏｃｋ治療群においてコレステロールの上昇を誘発したが、ＭｙＤ８８抑制下では誘発しないことを見出した。さらに、ＭｙＤ８８抑制は、肝細胞損傷のマーカーであるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の上昇と、急性腎障害のマーカーである血中尿素窒素（ＢＵＮ）の上昇を抑制し、これはＭｙＤ８８抑制が敗血症後に肺および全身組織損傷を緩和することをさらに示唆する（図２Ｈおよび図９）。最後に、本発明者らは、インビトロおよび生体内でのＣＸＣＲ４などの他の免疫学的に関連する遺伝子座の合成制御に対するＭＳ２－ＨＰ１ａＫＲＡＢ超抑制の拡張性を示した（図１０Ａ－１０Ｃ）。

【0085】

要約すると、本発明者らは、内因性Ｍｙｄ８８に対して新たに開発されたＣＲＩＳＰＲベースの転写超抑制因子を使用して、生体内で免疫応答を合成制御するための組成物、システム、および方法を提供する。本発明者らは、このシステムが下流シグナル伝達層の調節に有効であり、生体内で目に見える保護表現型を作り出すことができることを示している。この概念は、生体内でより小さな細胞集団を標的とすることが知られているあまり一般的ではないＡＡＶ血清型（ＡＡＶ２／１）を使用した送達の場合に特に魅力的である（例えば非実質細胞）。

【0086】

本発明者らは、Ｍｙｄ８８－／－動物における抗原特異的ＩｇＧ２ａ応答の生成の失敗に関する以前の報告と一致して、ＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲでＭｙｄ８８遺伝子座を標的化すると、ＡＡＶ１ に対して生成されるＩｇＧ２ａが減少し、一般的な免疫グロブリン発現パターンが調節されたことを実証する。さらに、ＡＡＶ－１は樹状細胞を標的にできることが示されており、これらの細胞におけるＭｙｄ８８シグナル伝達は、ＡＡＶ に対する適応免疫応答を開始するために重要であった。この経路は、生体内でのＡＡＶ２／１だけではなく多くのＡＡＶ血清型に対する体性免疫を誘導する重要なノードであることが実証さているので、ＣＲＩＳＰＲベースの合成リプレッサーを使用してＭｙｄ８８レベルを制御する能力は、ＡＡＶベースの臨床遺伝子治療に関連する一般的な課題に照らして重要である。この研究でヌクレアーゼコンピテントＣａｓ９と切断されたｇＲＮＡを採用すると、免疫応答を調節しながら標的遺伝子編集にＣＲＩＳＰＲを同時に適用する機会が開かれ、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子抑制がｓｈＲＮＡなどの以前に使用されていたシステムに対して優位になる。

【0087】

この戦略は、（ＬＰＳ）誘発性内毒血症に対する全身性炎症反応の調節にも効果的であった。Ｍｙｄ８８ の ＣＲＩＳＰＲ媒介性内因性抑制は、広範囲の炎症マーカーの上方抑制を防ぎ、保護的表現型を付与した。この概念は、炎症状態を調節し、敗血症から保護するための容易にプログラム可能なツールとして、ＣＲＩＳＰＲ ベースの転写調節の用途に有望である。最後に、Ｍｙｄ８８（Ｌ２６５Ｐ）の体細胞変異の活性化は、チェックされていないリンパ球増殖とマクログロブリン産生を特徴とする非ホジキン リンパ腫の一種であるワルデンストレームマクログロブリン血症に関係している。Ｍｙｄ８８突然変異は、ＮＦ－κＢシグナル伝達を通じて悪性増殖をサポートし、その阻害は癌細胞の生存率の低下に関連している。したがって、この研究で示されているようにＭｙｄ８８（および ＣＸＣＲ４）を全身的に抑制する能力は、このグループの患者に刺激的な治療の機会を提供することができる。

【0088】

方法
ＭＳ２融合リプレッサー－ＭＳ２融合転写リプレッサーを構築するために、対象の特定のドメインは、我々のグループで以前に公開されたベクターから増幅され、続いてｐｃＤＮＡ３－ＭＳ２－ＶＰ６４バックボーン（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＩＤ：７９３７１）¹⁰にクローンされた。ｐｃＤＮＡ３－ＭＳ２－ＶＰ６４ベクターをＮｏｔＩおよびＡｇｅＩで消化してＶＰ６４ドメインを除去し、増幅されたリプレッサーをギブソンアセンブリ法によってこのバックボーンにクローニングした。

【0089】

Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＭＳ２プラスミド－これらのプラスミドを生成するために、ｇＲＮＡの１４ｂｐまたは２０ｂｐのスペーサーを、ゴールデンゲート反応を介してＢｂｓＩ部位においてｓｇＲＮＡ－ＭＳ２クローニング骨格（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミドＩＤ：６１４２４）に挿入した。すべてのｇＲＮＡシーケンスを以下に示す。

【0090】

ＡＡＶベクター－ｇＲＮＡをＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＭＳ２骨格にクローニングした後、Ｕ６－ｇＲＮＡコード領域をこのベクターから増幅し、ゴールデンゲート反応を使用してゲートウェイエントリーベクター内に挿入した。同じ方法を使用して、リプレッサードメインとｓｈｅｆ１ａプロモーターをゲートウェイエントリーベクターにクローニングした。設計された安全スイッチｓｇＲＮＡ配列は、ｇｂｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたゲートウェイエントリーベクター（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＩＤ＃６２０８４）に挿入された。ＬＲ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介してこれらすべての成分をＡＡＶ骨格にさらにサブクローニングして、ＡＡＶベクターを作成した。すべてのプライマーとｇＲＮＡ シーケンスを以下に示す。

【0091】

ＡＡＶのパッケージングと精製－構築されたＡＡＶベクターをＳｍａＩ消化によって消化し、ウイルス生成の前にＩＴＲ領域の完全性を試験した。検証済みのＡＡＶベクターを使用して、ＰａｃｋＧｅｎｅ（登録商標）、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬＬＣ製のＡＡＶ２／１－Ｍｙｄ８８、ＡＡＶ２／１－ＣＸＣＲ４、ＡＡＶ２／ＤＪ－ＴＴＮ、ＡＡＶ２／ＤＪ－Ｃａｓ９、およびＡＡＶ２／１－Ｃａｓ９を生成した。ウイルス力価は、線形化された親ＡＡＶベクターを使用して、標準曲線に対して１．５Ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌでリアルタイム ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ によって定量化した。

【0092】

【化1】

【化2】

【化3】

【0093】

【化4】

【化5】

【化6】

【0094】

【化7】

【化8】

【化9】

【0095】

内因性標的抑制のための細胞培養－ＨＥＫ２９３ＦＴ、Ｎｅｕｒｏ－２ａ、およびＲａｗ２６４．７細胞株（ＡＴＣＣから購入）を、３７℃および５％ＣＯ₂のインキュベーター中、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのグルタミン、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持した。

【0096】

インビトロ培養細胞のトランスフェクション－ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を２４ウェルプレートのウェルあたり約５０，０００細胞に播種し、翌日にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は、トランスフェクショ対照（２５ｎｇ）としてｇＲＮＡ（１０ｎｇ）、ｄＣａｓ９（２００ｎｇ）、ＭＳ２融合リプレッサー（１００ｎｇ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（５０ｎｇ）、およびエンハンスブルー蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）をコードするプラスミドＤＮＡでコトランスフェクトした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション複合体は、製造元の指示に従って調製した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を０．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ－ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）で処理した。トランスフェクションの７２時間後に細胞を収集し、ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から全ＲＮＡを収集した。

【0097】

Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞を２４ウェルプレートに１ウェルあたり約５０，０００個の細胞で播種し、翌日にトランスフェクトした。細胞に、ｇＲＮＡ（１００ｎｇ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（７０ｎｇ）、およびトランスフェクション対照としてのＥＢＦＰ（２５ｎｇ）、およびピューロマイシン耐性遺伝子（５０ｎｇ）をコードするプラスミドをコトランスフェクトした。プラスミドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを使用してＮｅｕｒｏ－２ａ細胞に送達した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を０．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ－ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）で処理した。５日後、細胞を１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処理し、５時間後、ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から全ＲＮＡを収集した。

【0098】

ＣＸＣＲ４抑制のために、未処理の２６４．７細胞を２４ウェルプレートのウェル当たり約５０，０００セル２４で播種し、翌日に形質導入した。細胞培養培地を除去し、２５０マイクロリットルの培地中、１Ｅ＋９ＧＣ／細胞でＡＡＶを培養に加えた。形質導入の１２時間後に培地を更新した。５日後、細胞を０．１ｕｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで５時間処理し、ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを回収した。

【0099】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析－細胞または組織を溶解し、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）またはｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡを抽出し、続いてＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）またはｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して実施した。すべての分析は１８ｓ ｒＲＮＡ（ΔＣｔ）に対して正規化され、インビトロ実験では非トランスフェクト対照またはＣａｓ９のみのグループ、生体内実験ではＡＡＶ－ＧＦＰ注射グループに対して倍率変化が計算された（２^-ΔΔCt）。ｑＰＣＲのプライマー配列を以下に示す。

【0100】

ＤＮＡの分離とリアルタイム組織におけるＡＡＶゲノムのＰＣＲコピー－組織からのＤＮＡ単離は、ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って行った。ｑＰＣＲ反応は、製造者のプロトコルに従って、各サンプルからの１００ｎｇのテンプレートＤＮＡと、プローブベースのｑＰＣＲマスターミックス（ＩＤＴ）を使用したウイルス末端逆位反復（ＩＴＲ）のプライマーおよびプローブからなる。データは、マウスＡｃｖｒ２ｂ対照遺伝子に対して正規化された。

【0101】

ＥＬＩＳＡベースの化学発光アッセイ－マウスを採取した後、血漿サンプルを収集し、－８０°Ｃで１回分を保存した。肺サンプルは、１ｘ細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１ｍｌのバッファーに対する１００ｍｇの組織の比率）を使用して溶解し、その後、溶解組織のホモジナイゼーションと超音波処理を行った。アッセイは製造者のプロトコルに従って、Ｑ－Ｐｌｅｘ（商標）マウスサイトカイン－スクリーン（１６－Ｐｌｅｘ）キット（Ｑｕａｎｓｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。簡単に言うと、サンプルまたはキャリブレーターを、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦαを捕捉する分析物特異的抗体が配列された９６ウェルプレートのウェルに追加した。プレートを洗浄し、ビオチン化分析物特異的抗体を加えた。洗浄後、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＨＲＰ）を加えた。さらに洗浄した後、化学発光基質を添加して、アレイの各位置に残っているＳＨＲＰの量を測定した。

【0102】

抗体ＥＬＩＳＡ－ウイルス粒子当たり２×１０⁹含有する１×コーティング緩衝液（１３ｍＭの炭酸ナトリウム、３５ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．２）で希釈したＡＡＶ粒子５０マイクロリットルを、Ｍｉｃｒｏｌｏｎ（登録商標）高タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の各ウェルに添加した。ウェルを１ｘトリス緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ、Ｂｅｔｈｙｌ）で３回洗浄し、１ｘトリス緩衝生理食塩水＋１％ＢＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ）で１時間室温でブロックした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄した。標準曲線は、精製されたマウス宿主ＩｇＧ２ａ抗ＡＡＶ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）抗体を使用して、ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ＋１：５００陰性コントロールマウス血清で２倍に希釈し、１０，０００ｎｇ／ｍｌノＡＡＶ１抗体の濃度から始めて作成した。標準をプレートに加え、続いて血清サンプルを１：５００の希釈度で加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ抗体を１：５００の濃度で加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄バッファーで４回洗浄し、ＴＭＢ基質をウェルに加えた。標準曲線の作成後（１５分）、０．１８ＭのＨ２ＳＯ４を添加して反応を終了させた。最後に、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、４５０波長での吸光度を測定した。吸光度の結果はエクスポートされ、Ｅｘｃｅｌで分析した。

【0103】

乳酸アッセイ－血液サンプルは、ＥＤＴＡコーティングされたチューブを使用して収集した。サンプルを１，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。血漿を採取し、－８０℃で保存した。乳酸アッセイは、製造者のプロトコル（Ｌ－乳酸アッセイキット、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に従って行った。簡単に言えば、０．５Ｍ ＭＰＡを添加することにより試料からタンパク質を取り除いた。タンパク質をペレット化した後、上澄み液を炭酸カリウムに加え、４℃、１０，０００ｘｇで５分間遠心分離した。サンプルを４倍に希釈し、指定されたウェルに加えた。次に、アッセイ緩衝液補因子混合物、蛍光基質、および酵素混合物を各ウェルに加えた。プレートを室温で２０分間インキュベートし、励起波長５３０～５４０ｎｍおよび発光波長５８５～５９５ｎｍを使用して蛍光を測定した。製造者のプロトコルに従って、吸光度の結果をエクスポートし、Ｅｘｃｅｌで分析した。

【0104】

ＬＰＳ注射後の肝損傷の検査－血漿サンプルをＩＤＥＸＸ研究所に送り、ＡＬＴ、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＢＵＮ、リパーゼを含む組織損傷マーカーのパネルを測定した。

【0105】

動物－動物を使ったすべての実験は、アリゾナ州立大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、施設のガイドラインに従って実施されている。すべての実験は、グループごとに６～８週齢の少なくとも３匹のマウスで行われた。雄と雌の両方が各実験に含まれた。各グループのサンプルサイズは、各図の凡例に示されている。すべてのマウスは同等に扱われた。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＪＡＸストック番号：０００６６４）は、ＡＡＶ２／１－ＧＦＰ、様々な臓器への向性、およびＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ活性化実験の研究に使用した。雄と雌のＲｏｓａ２６－Ｃａｓ９ノックインマウス（ＪＡＸスック番号０２６１７９）をＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ抑制実験に使用した。

【0106】

眼窩後注射－ＡＡＶ粒子は、静脈洞の眼窩後注射によってマウスに送達した。動物を３％イソフルランで麻酔し、ウイルス粒子を左眼に１００マイクロリットルのＡＡＶ溶液（Ｃａｓ９発現マウスを用いた実験ではマウスあたり１Ｅ１１～１Ｅ１２ゲノムコピーおよび－Ｃ５７ＢＬ／６マウスの場合は合計１．０１Ｅ＋１２ＧＣ ＡＡＶ－ＴＴＮおよびＡＡＶ－Ｃａｓ９（１００：１比））を注射した。

【0107】

組織収集－マウスを注射後の３週間目にＣＯ₂吸入によって安楽死させた。肝臓、脾臓、肺、精巣、骨髄、および血液から採取した組織サンプルをＲＬＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で収集するか、ＲＮＡ分析用に急速凍結した。

【0108】

ＩｎｖｉｖｏＬＰＳ誘導－ＬＰＳ誘導では、マウスを、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したリポ多糖（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１２７：Ｂ８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，ＵＳＡ）から）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって処理した。ＣＯ₂吸入によりＬＰＳ注射の６時間後にマウスを安楽死させた。

【0109】

ＲＮＡシーケンシングおよびデータ分析－ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してマウス骨髄サンプルから抽出され、続いてＧＬＯＢＩＮｃｌｅａｒ（商標）キット、マウス／ラットキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してグロビンｍＲＮＡを枯渇させた。Ｎｏｖｏｇｅｎｅ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＩｎｃ．で方向性のないライブラリの準備を行い、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用したペアエンド１５０ラン（２×１５０塩基）を使用してＲＮＡシーケンシングを行った。カバレッジは、サンプルあたり最低２，５００万回の読み取りであった。次に、ＳＴＡＲソフトウェアを使用してＦＡＳＴＱファイルをマウスゲノムシーケンスにアラインメントし、独自にマップされたリードカウントをＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）で視覚化した。遺伝子発現レベルは、マップされたリードの数によって計算した。各サンプルの全遺伝子発現レベル（ＲＰＫＭまたはＦＰＫＭ）から、グループ間のサンプルの相関係数を算出した。遺伝子発現解析から得られたリードカウントは、示差的発現分析に使用され、異なるグループの示差的発現分析は、ＤＥＳｅｑ２ Ｒパッケージを使用して実行した。すべての比較グループ内で、ｌｏｇ１０（ＦＰＫＭ＋１）の結合差次的発現遺伝子の階層的クラスタリング分析を行った。ＧＯ富化、ＤＯ富化、ＫＥＧＧ富化、Ｒｅａｃｔｏｍｅ富化などの富化分析には、ＣｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアを使用した。

【0110】

統計分析－統計分析は図の凡例に含まれている。すべてのデータは、平均±平均値の標準偏差または平均±標準偏差として表示される。Ｎ＝インビトロ実験のためのトランスフェクションの数、Ｎ＝生体内実験のための動物の数。統計分析は、ｐｒｉｍｓ ７ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して行った。本発明者は、両側のスチューデントのｔ検定を行った。ｐ＜０．０５の値は有意と見なした。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）またはｎ．ｓ．（有意差なし）として表される

【0111】

【表2】

【0112】

【表3】

【0113】

【表4】

【0114】

【表5】

【0115】

【化10】

【0116】

【化11】

【0117】

【化12】

【0118】

【化13】

【図1A】

【図1B-1D】

【図1E-1F】

【図1G-1H】

【図2A-2C】

【図2D-2E】

【図2F-2H】

【図3A-3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8A-8C】

【図9】

【図10A-10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【配列表】

2022512974000001.app

【国際調査報告】