特表 2022-512994 ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する２遺伝子ベクターおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する２遺伝子ベクターおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220131BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/33

C12N5/10

C07K16/28

C07K14/725

C07K14/47

C07K14/005

A61K35/17 Z

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/04

C12N5/0783

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021525298

(86)(22)【出願日】2019-11-14

(85)【翻訳文提出日】2021-06-21

(86)【国際出願番号】 US2019061549

(87)【国際公開番号】W WO2020102589

(87)【国際公開日】2020-05-22

(31)【優先権主張番号】62/767,069

(32)【優先日】2018-11-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521199007

【氏名又は名称】メディシックス セラピューティクス ピーティーイー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】イスマイール，リサール

(72)【発明者】

【氏名】リー，ユンチン

(72)【発明者】

【氏名】ロビンソン，マレー

(72)【発明者】

【氏名】タン，イン，シム

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA05

4C087ZB02

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、抗ＣＤ７キメラ活性化受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドおよび抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーをコードするポリヌクレオチドを含む２遺伝子レトロウイルスベクター組成物を提供する。製造する方法およびそのような組成物を癌療法において使用する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

バイシストロン性レトロウイルスベクターであって、
（ａ）配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、
（ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）またはリボソームコドンスキッピング部位をコードする第２のポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号２４～２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする第３のポリヌクレオチドと、を含み、
前記第１のポリヌクレオチドは、前記第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、バイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項2】

前記抗ＣＤ７ ＣＡＲが、配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項3】

前記抗ＣＤ７ ＰＥＢＬが、配列番号２４～２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター組成物。

【請求項4】

前記抗ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記抗ＣＤ７ ＰＥＢＬが配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター組成物。

【請求項5】

前記抗ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号３１のアミノ酸配列を含み、前記抗ＣＤ７ ＰＥＢＬが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター組成物。

【請求項6】

前記ＩＲＥＳが脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはエンテロウイルスに由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項7】

前記リボソームコドンスキッピング部位が２Ａ自己切断ペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項8】

前記２Ａ自己切断ペプチドが、Ｆ２Ａペプチド（口蹄疫ウイルス２Ａペプチド）、Ｅ２Ａペプチド（ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド）、Ｐ２Ａペプチド（ブタテッショウウイルス－１２Ａペプチド）、およびＴ２Ａペプチド（トーセアアシグナウイルス２Ａ）からなる群から選択される、請求項７に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項9】

配列番号１２の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項10】

配列番号１３の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１～５および６のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項11】

配列番号１３の核酸配列を含む、請求項１０に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項12】

プロモーターエレメントをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項13】

前記プロモーターエレメントが、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびＰＧＫプロモーターからなる群から選択される、請求項１２に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項14】

前記プロモーターエレメントが、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１３に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項15】

前記プロモーターエレメントが、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項16】

配列番号１４～１６からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項17】

配列番号１４～１６からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項18】

前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１～１８のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクター。

【請求項19】

請求項１～１８のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクターを含む操作された免疫細胞。

【請求項20】

前記操作された免疫細胞が同種異系のＴ細胞である、請求項１９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項21】

前記操作された免疫細胞が自己Ｔ細胞である、請求項２０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項22】

前記操作された免疫細胞が、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、前記抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する、請求項２０または２１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項23】

薬学的組成物であって、請求項１９に記載の操作された免疫細胞および薬学的に有効な担体を含む、薬学的組成物。

【請求項24】

対象の癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項１９～２１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項２３に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【請求項25】

操作された免疫細胞を産生する方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクターで免疫細胞に形質導入することと、前記操作された免疫細胞を回収することと、を含む、方法。

【請求項26】

前記免疫細胞が、末梢血単核細胞、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞、分離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、および分離されたＣＤ３＋Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記操作された免疫細胞が、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、前記抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

組換えレトロウイルスベクターであって、
（ａ）配列番号２８または配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターエレメントと、
（ｂ）配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターエレメントと、を含む、組換えレトロウイルスベクター。

【請求項29】

前記抗ＣＤ７ ＣＡＲが、配列番号２８または配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項30】

前記抗ＣＤ７ ＰＥＢＬが、配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項２８または２９に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項31】

前記第１のプロモーターエレメントおよび／または前記第２のプロモーターエレメントが、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびＰＧＫプロモーターからなる群から選択される、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項32】

前記第１のプロモーターエレメントおよび／または前記第２のプロモーターエレメントが、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項33】

前記第１のプロモーターエレメントおよび／または前記第２のプロモーターエレメントが、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項34】

前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが９５％未満の配列同一性を共有する、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項35】

前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記第１のプロモーターエレメントが、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記第２のプロモーターエレメントの５’である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項36】

前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記第２のプロモーターエレメントが、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記第１のプロモーターエレメントの５’である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項37】

配列番号１８～２３からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項38】

前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクター。

【請求項39】

操作された免疫細胞であって、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクターを含む、操作された免疫細胞。

【請求項40】

前記操作された免疫細胞が同種異系のＴ細胞である、請求項３９に記載の操作された免疫細胞。

【請求項41】

前記操作された免疫細胞が自己Ｔ細胞である、請求項４０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項42】

前記操作された免疫細胞が、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、前記抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する、請求項４０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項43】

薬学的組成物であって、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞および薬学的に有効な担体を含む、薬学的組成物。

【請求項44】

対象の癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項３９～４１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項４３に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【請求項45】

操作された免疫細胞を産生する方法であって、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の組換えレトロウイルスベクターで免疫細胞に形質導入することと、前記操作された免疫細胞を回収することと、を含む、方法。

【請求項46】

前記免疫細胞が、末梢血単核細胞、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞、分離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、および分離されたＣＤ３＋Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記操作された免疫細胞が、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、前記抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する、請求項４５または４６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１４日に出願された米国仮出願第６２／７６７，０６９号の利益を主張する。その全体における開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。この配列表は２０１９年１１月１４日に作成され、サイズが１３９，２６４バイトの「１１９４１９－５００７－ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルが付けられている。

【背景技術】

【0003】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞をリダイレクトして、腫瘍細胞を特異的に認識して死滅させることができる。ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達分子に連結された抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）で構成される人工的な多分子タンパク質である。ｓｃＦｖがその同族抗原をライゲーションすると、シグナル伝達がトリガーされ、ＣＡＲ発現細胞傷害性Ｔリンパ球による腫瘍細胞の死滅を引き起こす（Ｅｓｈｈａｒ Ｚ，Ｗａｋｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．９０（２）：７２０－７２４，１９９３、Ｇｅｉｇｅｒ ＴＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９３１－５９３９，１９９９、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．９（３）：２７９－２８６，２００３、Ｃｏｏｐｅｒ ＬＪ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０１（４）：１６３７－１６４４，２００３，Ｉｍａｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１８：６７６－６８４，２００４）。ＣＡＲ発現自己Ｔリンパ球を用いた臨床試験では、Ｂ細胞難治性白血病およびリンパ腫の患者で陽性反応が示されている（例えば、Ｔｉｌｌ ＢＧ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１９（１７）：３９４０－３９５０，２０１２、Ｍａｕｄｅ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７１（１６）：１５０７－１５１７，２０１４）。

【0004】

Ｔ細胞悪性腫瘍を標的とするＣＡＲ技術の開発は、Ｂ細胞の対応するものの進歩に大きく遅れをとっている。Ｔ細胞悪性腫瘍の新しい療法が必要であるが、これまでの進歩は遅かった。特に、効果的な免疫療法の選択肢が不足しており、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）の治療は、集中的な化学療法および造血幹細胞移植に依存している。重大な罹患率に関連する積極的な治療計画にもかかわらず、これらのアプローチによる結果は決して満足のいくものではない。

【0005】

ＣＡＲ－Ｔの標的抗原自体がＣＡＲ－Ｔ細胞で発現されるＣＡＲ－Ｔ細胞が最近開発された（Ｐｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１７，１（２５）：２３４８－２３６０，ＷＯ２０１８／０９８３０６）。自殺（例えば、フラトリサイド）を回避するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞はまた、ＣＡＲ－Ｔの細胞表面上の標的抗原の発現を減少させるのに役立つＰＥＢＬを発現する。生存可能なＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するために、最初にタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）タンパク質を発現させて、その後のＣＡＲの発現の前に、標的タンパク質に結合して隔離した。得られた操作されたＴ細胞の細胞表面上に標的抗原がすでに存在するため、ＣＡＲおよびＰＥＢＬの同時発現はフラトリサイドをもたらした。特に、既存の細胞表面標的抗原は、新たに発現されたＰＥＢＬタンパク質による隔離の影響を受けず、新たに発現されたＣＡＲタンパク質によって認識および標的化される。

【0006】

同時発現の代わりに、順次発現が行われ得る。ただし、Ｔ細胞でのＰＥＢＬおよび続いてのＣＡＲの連続発現は、ＰＥＢＬ ＣＡＲ－Ｔ細胞の臨床実施にいくつかの課題をもたらす。まず、Ｔ細胞の連続操作において、１つはＰＥＢＬ用、もう１つはＣＡＲ用の別個のウイルスベクターを別々に製造および投与する必要がある。これにより、コストおよび時間が増加するだけでなく、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための実験操作が複雑になる。さらに、Ｔ細胞の連続操作は、最終的な臨床産生物において操作された細胞の複雑な混合をもたらし、産生物の特性評価、均一性、および有効性に関する課題を生み出す。Ｔ細胞のごく一部のみが各操作ステップで導入された遺伝子を統合するため、最終産生物（操作Ｔ細胞）は、ＰＥＢＬ遺伝子のみを受け取った一部の細胞、ＣＡＲ遺伝子のみを受け取った一部の細胞、および両方の遺伝子を受け取った一部の細胞を含む。

【0007】

要約していえば、Ｔ細胞悪性腫瘍の患者のために新しい治療オプションが著しく満たされていないために必要である。さらに、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を産生し、ＣＡＲを介したＴ細胞の自殺またはフラトリサイドを排除するための方法が必要である。

【発明の概要】

【0008】

いくつかの態様において、本発明は、バイシストロン性レトロウイルスベクターであって、（ａ）配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）またはリボソームコドンスキッピング部位をコードする第２のポリヌクレオチドと、（ｃ））配列番号２４～２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする第３のポリヌクレオチドと、を含み、第１のポリヌクレオチドは、第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、バイシストロン性レトロウイルスベクターを提供する。

【0009】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４～２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはエンテロウイルスに由来する。

【0014】

いくつかの実施形態において、リボソームコドンスキッピング部位は、２Ａ自己切断ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｆ２Ａペプチド（口蹄疫ウイルス２Ａペプチド）、Ｅ２Ａペプチド（ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド）、Ｐ２Ａペプチド（ブタテッショウウイルス－１２Ａペプチド）、およびＴ２Ａペプチド（トーセアアシグナウイルス２Ａ）からなる群から選択される。

【0015】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性レトロウイルスベクターは、配列番号１２の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性レトロウイルスベクターは、配列番号１３の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、バイシストロン性レトロウイルスベクターは、配列番号１３の核酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性レトロウイルスベクターは、プロモーターエレメントをさらに含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、プロモーターエレメントは、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびＰＧＫプロモーターからなる群から選択される。

【0019】

いくつかの実施形態において、プロモーターエレメントは、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、プロモーターエレメントは、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性レトロウイルスベクターは、配列番号１４～１６からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性レトロウイルスベクターは、配列番号１４～１６からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含む。

【0023】

いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。

【0024】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に概説されるバイシストロン性レトロウイルスベクターのいずれか１つを含む操作された免疫細胞である。

【0025】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、同種異系のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、自己Ｔ細胞である。

【0026】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0027】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれかおよび薬学的に有効な担体を含む薬学的組成物である。

【0028】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、治療有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれかまたはその薬学的組成物を投与することを含む、対象の癌を治療する方法である。

【0029】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイシストロン性レトロウイルスベクターのいずれか１つで免疫細胞に形質導入することと、操作された免疫細胞を回収することとを含む、操作された免疫細胞を産生する方法である。

【0030】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、末梢血単核細胞、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞、分離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、および分離されたＣＤ３＋Ｔ細胞からなる群から選択される。

【0031】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0032】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、（ａ）配列番号２８または配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターエレメントと、（ｂ）配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターエレメントと、を含む、組換えレトロウイルスベクターである。

【0033】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８または配列番号３０のアミノ酸配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターエレメントおよび／または第２のプロモーターエレメントは、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびＰＧＫプロモーターからなる群から選択される。

【0036】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターエレメントおよび／または第２のプロモーターエレメントは、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。

【0037】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターエレメントおよび／または第２のプロモーターエレメントは、配列番号６～１０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含む。

【0038】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、９５％未満の配列同一性を共有する。

【0039】

いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターエレメントは、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターエレメントの５’である。

【0040】

いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターエレメントは、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターエレメントの５’である。

【0041】

いくつかの実施形態において、組換えレトロウイルスベクターは、配列番号１８～２３からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。

【0042】

いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。

【0043】

本明細書に記載の組換えレトロウイルスベクターのいずれか１つを含む操作された免疫細胞も提供される。

【0044】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、同種異系のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、自己Ｔ細胞である。

【0045】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0046】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれかおよび薬学的に有効な担体を含む薬学的組成物である。

【0047】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、治療有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれかまたはその薬学的組成物を投与することを含む、対象の癌を治療する方法である。

【0048】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の組換えレトロウイルスベクターのいずれか１つで免疫細胞に形質導入することと、操作された免疫細胞を回収することと、を含む、操作された免疫細胞を産生する方法である。

【0049】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、末梢血単核細胞、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞、分離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、および分離されたＣＤ３＋Ｔ細胞からなる群から選択される。

【0050】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較してＣＤ７表面発現を減少させており、抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1A-1B】フローサイトメトリー（図１Ａ）およびウエスタンブロット（図１Ｂ）による、形質導入された初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＰＥＢＬの発現を示す。初代Ｔ細胞に示されたレトロウイルス（例えば、ＰＥＢＬ、ＣＡＲ、ＰＥＢＬおよびＣＡＲを順次、ＰＥＢＬ－ＩＲＥＳ－ＣＡＲ、およびＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＰＥＢＬ）で形質導入し、ＣＤ７およびＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーで分析した。示されたレトロウイルスで形質導入された初代Ｔ細胞からの細胞溶解物を、β－アクチン、Ｍｙｃタグ付きＰＥＢＬ、ＣＡＲおよび内因性ＣＤ３ζ発現についてウエスタンブロットによって分析した。

【図2A-2F】バイシストロン性プロモーター１－ＣＡＲ－プロモーター２－ＰＥＢＬレンチウイルス構築物の例示的な概略図を提供する。図２Ａは、配列番号１９のものなどの、ＭＳＣＶ－プロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦＳプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なデュアルプロモーター構築物の概略図を示す。図２Ｂは、配列番号１８のものなどの、ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なデュアルプロモーター構築物の概略図を示す。図２Ｃは、配列番号２３のものなどの、ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦＳプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なデュアルプロモーター構築物の概略図を示す。図２Ｄは、配列番号２２のものなどの、ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なデュアルプロモーター構築物の概略図を示す。図２Ｅは、配列番号２０のものなどの、ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なデュアルプロモーター構築物の概略図を示す。図２Ｆは、配列番号２１のものなどの、ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬを含む例示的なデュアルプロモーター構築物の概略図を示す。

【図3】フローサイトメトリーによる、形質導入された初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＣＤ７の発現を示す。初代Ｔ細胞に示されたデュアルプロモーターレンチウイルスを形質導入し、形質導入の５日後および１４日後にフローサイトメトリーで分析した。

【図4A-4C】バイシストロン性ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＰＥＢＬレンチウイルス構築物の例示的な概略図を提供する。図４Ａは、配列番号１４のものなどの、ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なバイシストロン性構築物の概略図を示す。図４Ｂは、配列番号１５のものなどの、ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なバイシストロン性構築物の概略図を示す。図４Ｃは、配列番号１６のものなどの、ＥＦＳプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なバイシストロン性構築物の概略図を示す。

【図5】ＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入され、形質導入の３日後、６日後、および９日後にフローサイトメトリーによって分析された初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＣＤ７の発現を示す。

【図6】フローサイトメトリーによる、形質導入された初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＣＤ７の発現を示す。初代Ｔ細胞に、示されたバイシストロン性ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬおよびＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスで形質導入し、形質導入の５日後および１４日後にフローサイトメトリーで分析した。

【図7A-7B】フローサイトメトリー（図７Ａ）およびウエスタンブロット（図７Ｂ）による、形質導入された初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＰＥＢＬの発現を示す。初代Ｔ細胞に、２つの独立して産生されたロットのＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入し、フローサイトメトリーでＣＤ７およびＣＡＲの発現を分析した。形質導入された細胞からの細胞溶解物を、β－アクチン、Ｍｙｃタグ付きＰＥＢＬ、ＣＡＲおよび内因性ＣＤ３ζ発現についてウエスタンブロットによって分析した。

【図8】フローサイトメトリーによる、形質導入された初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＣＤ７の発現を示す。バルクＰＢＭＣ、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞、およびＣＤ３^＋正の選択Ｔ細胞は、ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＴｒａｎｓＡｃｔのいずれかで活性化され、ＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入された。形質導入の４日後、７日後、および１０日後にフローサイトメトリーによって細胞を分析した。

【図9A】ＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入し、無血清ＴｅｘＭＡＣＳ培地または３％ヒトＡＢ血清を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養した初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＣＤ７の発現を示す。

【図9B】活性化後１１日での形質導入細胞の総増殖倍率を示す（生物学的複製の平均±ＳＥＭ）。

【図10A-10B】活性化後１１日での形質導入細胞のＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合（図１０Ａ）および総増殖倍率（図１０Ｂ）（生物学的複製の平均±ＳＥＭ）を示す。初代Ｔ細胞を無血清ＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養し、活性化の１、２、３、または４日後にＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入した。

【図11】フローサイトメトリーによる、形質導入された初代Ｔ細胞によるＣＡＲおよびＣＤ７の発現を示す。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋正の選択Ｔ細胞は、ＴｒａｎｓＡｃｔにより活性化され、示された感染多重度（ＭＯＩ）でＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入された。形質導入の３日後および９日後にフローサイトメトリーによって細胞を分析した。

【図12A-12B】活性化後１１日での形質導入細胞のＣＡＲ＋Ｔ細胞（図１２Ａ）の割合および導入遺伝子ベクターコピー数（ＶＣＮ）（図１２Ｂ）（生物学的複製の平均）を示す。初代Ｔ細胞を無血清ＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養し、ＭＯＩ３、５、または１０でＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってＣＡＲ発現について分析した。形質導入された細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって導入遺伝子ＶＣＮを決定した。

【図13A-13E】活性化後１１日でのＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入された初代Ｔ細胞上の様々な表面マーカーの発現を示す。形質導入された細胞は、ＣＡＲおよびＣＤ７（図１３Ａ）、ＣＤ３およびＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ５６（図１３Ｂ）、ＣＤ４およびＣＤ８（図１３Ｃ）、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７（図１３Ｄ）、ならびにＰＤ－１およびＴｉｍ－３（図１３Ｅ）についてフローサイトメトリーによって分析された。三重分析は、ＭＯＩ１０においてＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入された３つの特異なドナーからの初代Ｔ細胞についてのものである。

【図14A-14B】ＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで生成されたＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の、ＩＦＮγ分泌（図１４Ａ）および細胞傷害性（図１４Ｂ）によるＣＤ７＋Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＣＤ７－Ｎａｌｍ６細胞に対する機能的応答を示す。ＩＦＮγ分泌は、ＪｕｒｋａｔまたはＮａｌｍ６細胞と２４時間示されたＥ：Ｔ比（技術的複製の平均±ＳＤ）で共培養されたＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の培養上清で測定された。ＰＥＢＬ－ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性は、ＪｕｒｋａｔまたはＮａｌｍ６細胞との４時間の共培養後に、示されたＥ：Ｔ比（技術的複製の平均±ＳＤ）で測定された。

【図15】ＣＰＰＴ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＧＫ－ＧＦＰ－ＷＰＲＥ（配列番号１）の核酸配列を示す。ＣＰＰＴは太字で、ＣＭＶプロモーターは一重下線が引かれ、ＰＧＫプロモーターは二重下線が引かれ、ＧＦＰは太字／一重下線が引かれ、ＷＰＲＥエレメントは太字／二重下線が引かれている。

【図16】抗体ＴＨ６９（配列番号２）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは位置１から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ｍｙｃ－ＫＤＥＬペプチドは二重下線が引かれ、停止コドンは配列を終了する。

【図17】抗体３Ａ１Ｆ（配列番号３）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは位置１から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ｍｙｃ－ＫＤＥＬペプチドは二重下線が引かれ、停止コドンは配列を終了する。

【図18】抗体ＴＨ６９（配列番号４）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＣＡＲの核酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは位置１から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインは二重下線が引かれ、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインはＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間にあり、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは太字／二重下線が引かれ、停止コドンは配列を終了する。

【図19】抗体３Ａ１Ｆ（配列番号５）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＣＡＲの核酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは位置１から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインは二重下線が引かれ、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインはＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間にあり、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは太字／二重下線が引かれ、停止コドンは配列を終了する。

【図20】例示的なＣＭＶプロモーター（配列番号６）の核酸配列を示す。

【図21】例示的なＥＦ１αプロモーター（配列番号７）の核酸配列を示す。

【図22】例示的なＥＦＳプロモーター（配列番号８）の核酸配列を示す。

【図23】例示的なＭＳＣＶプロモーター（配列番号９）の核酸配列を示す。

【図24】例示的なＰＧＫプロモーター（配列番号１０）の核酸配列を示す。

【図25】抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ－ＩＲＥＳ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ（配列番号１１）を含む例示的なバイシストロン性構築物の核酸配列を示す。抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは通常のフォントであり、ＩＲＥＳは太字であり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは二重下線が引かれている。

【図26】抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＩＲＥＳ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１２）を含む例示的なバイシストロン性構築物の核酸配列を示す。抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは通常のフォントであり、ＩＲＥＳは太字であり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは一重下線が引かれている。

【図27】抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１３）を含む例示的なバイシストロン性構築物の核酸配列を示す。抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは通常のフォントであり、Ｐ２Ａは太字であり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは一重下線が引かれている。

【図28A-28B】ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１４）を含む例示的なバイシストロン性構築物の核酸配列を示す。ＭＳＣＶプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位およびコザック配列はＭＳＣＶプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、Ｐ２Ａは通常のフォントであり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは一重下線が引かれている。

【図29A-29B】ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１５）を含む例示的なバイシストロン性構築物の核酸配列を示す。ＥＦ１αプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位およびコザック配列はＥＦ１αプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、Ｐ２Ａは通常のフォントであり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは一重下線が引かれている。

【図30A-30B】ＥＦＳプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１６）を含む例示的なバイシストロン性構築物の核酸配列を示す。ＥＦＳプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位およびコザック配列はＥＦＳプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、Ｐ２Ａは通常のフォントであり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは一重下線が引かれている。

【図31A-31B】ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１７）を含む例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列を示す。ＭＳＣＶプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＭＳＣＶプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、制限酵素部位（イタリック体）はＣＡＲとＰＧＫプロモーターとの間にあり、ＰＧＫプロモーターは一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＰＧＫプロモーターとＰＥＢＬとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）は配列を終了する。

【図32A-32B】ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１８）を含む例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列を示す。ＭＳＣＶプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＭＳＣＶプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、制限酵素部位（イタリック体）はＣＡＲとＥＦ１ａプロモーターとの間にあり、ＥＦ１ａプロモーターは一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＥＦ１ａプロモーターとＰＥＢＬとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれている。

【図33A-33B】ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦＳプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号１９）を含む例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列を示す。ＭＳＣＶプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＭＳＣＶプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、制限酵素部位（イタリック体）はＣＡＲとＥＦＳプロモーターとの間にあり、ＥＦＳプロモーターは一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＥＦＳプロモーターとＰＥＢＬとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれている。

【図34A-34B】ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号２０）を含む例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列を示す。ＰＧＫプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＰＧＫプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲは太字であり、制限酵素部位（イタリック体）はＣＡＲとＥＦ１ａプロモーターとの間にあり、ＥＦ１ａプロモーターは一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＥＦ１ａプロモーターとＰＥＢＬとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれている。

【図35A-35B】ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬ（配列番号２１）を含む例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列を示す。ＰＧＫプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＰＧＫプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、制限酵素部位（イタリック体）はＣＡＲとＥＦ１ａプロモーターとの間にあり、ＥＦ１ａプロモーターは一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＥＦ１ａプロモーターとＰＥＢＬとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれている。

【図36A-36C】ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号２２）を含む例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列を示す。ＰＧＫプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＰＧＫプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、制限酵素部位（イタリック体）はＣＡＲとＥＦ１ａプロモーターとの間にあり、ＥＦ１ａプロモーターは一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＥＦ１ａプロモーターとＰＥＢＬとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれている。

【図37A-37B】ＰＧＫプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦＳプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ（配列番号２３）を含む例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列を示す。ＰＧＫプロモーターは二重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＰＧＫプロモーターとＣＡＲとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲは太字であり、制限酵素部位（イタリック体）はＣＡＲとＥＦＳプロモーターとの間にあり、ＥＦＳプロモーターは一重下線が引かれ、制限酵素部位（イタリック体）およびコザック配列はＥＦＳプロモーターとＰＥＢＬとの間にあり、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれている。

【図38】抗体ＴＨ６９（配列番号２４）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＰＥＢＬのアミノ酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは１位から始まり、かつ通常のタイプであり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ｍｙｃ－ＫＤＥＬペプチドには二重下線が引かれている。

【図39】抗体ＴＨ６９（配列番号２５）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＰＥＢＬ変異体のアミノ酸配列を示す。Ｎ末端プロリンはイタリック体であり、ＣＤ８シグナルペプチドは２位から始まり、かつ通常のタイプであり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ｍｙｃ－ＫＤＥＬペプチドは二重下線が引かれている。

【図40】抗体３Ａ１Ｆ（配列番号２６）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＰＥＢＬのアミノ酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは１位から始まり、かつ通常のタイプであり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ｍｙｃ－ＫＤＥＬペプチドには二重下線が引かれている。

【図41】抗体３Ａ１Ｆ（配列番号２７）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＰＥＢＬ変異体のアミノ酸配列を示す。Ｎ末端プロリンはイタリック体であり、ＣＤ８シグナルペプチドは２位から始まり、かつ通常のタイプであり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ｍｙｃ－ＫＤＥＬペプチドは二重下線が引かれている。

【図42】抗体ＴＨ６９（配列番号２８）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＣＡＲのアミノ酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは１位から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインは二重下線が引かれ、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインはＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間にあり、かつ通常のタイプであり、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは太字／二重下線が引かれている。

【図43】抗体ＴＨ６９（配列番号２９）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＣＡＲ変異体のアミノ酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは１位から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインは二重下線が引かれ、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインはＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間にあり、かつ通常のタイプであり、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは太字／二重下線が引かれ、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのＣ末端のアミノ酸はＰ２Ａ部位でのリボソームスキッピングを介して発生する。

【図44】抗体３Ａ１Ｆ（配列番号３０）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＣＡＲのアミノ酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは１位から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインは二重下線が引かれ、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインはＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間にあり、かつ通常のタイプであり、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは太字／二重下線が引かれている。

【図45】抗体３Ａ１Ｆ（配列番号３１）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＣＡＲ変異体のアミノ酸配列を示す。ＣＤ８シグナルペプチドは１位から始まり、抗ＣＤ７ ＶＬドメインは太字であり、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは一重下線が引かれ、抗ＣＤ７ ＶＨドメインは太字／一重下線が引かれ、ＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインは二重下線が引かれ、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインはＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間にあり、かつ通常のタイプであり、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは太字／二重下線が引かれ、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのＣ末端のアミノ酸はＰ２Ａ部位でのリボソームスキッピングを介して発生する。

【図46】抗体ＴＨ６９に基づく抗体ＴＨ６９－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７ ＰＥＢＬ（配列番号９５）に基づく例示的な抗ヒトＣＤ７ ＣＡＲのアミノ酸配列を示す。ＣＤ７ ＣＡＲは通常のフォントであり、Ｐ２Ａは二重下線が引かれ、ＣＤ７ ＰＥＢＬは太字／一重下線が引かれている。

【発明を実施するための形態】

【0052】

導入
本発明は、Ｔ細胞抗原を標的とする生存可能なＣＡＲ発現細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＡＲ－Ｔ）をもたらす、Ｔ細胞におけるフラトリサイド誘導キメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）およびフラトリサイド予防タンパク質（例えば、ＰＥＢＬ）の同時発現のための方法を提供する。

【0053】

単一の構築物から２つ以上の遺伝子を発現させることができるウイルスベクターが作製されている。典型的には、これらのベクターは、バイシストロンエレメントまたは２プロモーター構成のいずれかを使用する。バイシストロン性ベクターの場合、単一のメッセンジャーＲＮＡから２つのタンパク質の翻訳を可能にする配列エレメントが２つの遺伝子の間に導入される。例としては、内部リボソーム侵入部位配列（ＩＲＥＳ）およびウイルス由来の「コドンスキッピング」ペプチド配列（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａなど）が含まれる。２つのプロモーターで設計されたベクターの場合、各プロモーターがその近位に連結された遺伝子のｍＲＮＡを転写するように、別々のプロモーターエレメントが各遺伝子の上流に構成される。いくつかの実施形態において、発現ベクター（例えば、構築物）は、ＣＡＲに作動可能に連結された第１のプロモーターおよびＰＥＢＬに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。

【0054】

２つの異なる遺伝子（例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子、およびＰＥＢＬをコードする遺伝子）の発現のための様々なバイシストロン性ベクターおよび２プロモーター設計ベクターを作製および試験するための方法が、本明細書に記載されている。予期せぬことに、特定の２つの遺伝子ベクターが、得られた操作されたＴ細胞が生き残り、増殖し、標的細胞を死滅させることができるように、Ｔ細胞におけるＰＥＢＬおよびＣＡＲタンパク質の両方の発現を指示できることが発見された。同定された２つの遺伝子ベクターにおける各遺伝子の発現の相対的なタイミングおよびレベルにより、ＣＡＲが操作されたＴ細胞に過度のフラトリサイドを引き起こし得る前に、標的抗原の下方調節が可能になった。

【0055】

ＣＤ７に対して向けられたＣＡＲを発現するフラトリサイド耐性ＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書に記載されており、そのようなＣＡＲ－Ｔ細胞には、ＣＤ７の表面発現が減少しているか、またはまったくない。本発明は、部分的に、バイシストロン性ウイルスベクターなどのバイシストロン性構築物を使用する、ＣＤ７に対して向けられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるＣＤ７に対して向けられたタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）の共発現に基づく。一態様において、本発明は、抗ＣＤ７ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列および抗ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチド配列を含むバイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞（例えば、操作されたＴ細胞）に関する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ７に特異的に結合する抗体（例えば、一本鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ）を含む。本発明のＣＤ７ ＣＡＲは、本明細書では「抗ＣＤ７－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ」と呼ばれることがある。いくつかの実施形態において、ＣＡＲはまた、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬは、ＣＤ７および細胞内局在化配列に特異的に結合する抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬは、ＣＤ７、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびに細胞内局在化配列に特異的に結合する抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。

【0056】

ＣＤ７は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、Ｔ細胞悪性腫瘍の主要なマーカーであり、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ－ＡＬＬ）を含むＴ細胞ＡＬＬのすべての症例で高発現している。抗ＣＤ７ ＣＡＲは、Ｔ細胞を誘導してＴ細胞の悪性腫瘍に対して特異的な細胞傷害性を発揮させることができる。さらに、エフェクターＴ細胞でのＣＤ７発現の下方調節と組み合わせて抗ＣＤ７ ＣＡＲを使用した場合、Ｔ細胞の細胞傷害性が著しく増加することが示されている。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬの発現を介したＴ細胞におけるＣＤ７の下方調節（例えば、排除、減少、および／または再局在化）は、対応する抗ＣＤ７ ＣＡＲによって発揮されるフラトリサイド効果を防止した。これにより、標的抗原（例えば、ＣＤ７）を保持した細胞と比較して、ＣＡＲ発現後のＴ細胞の回復が促進され、Ｔ白血病／リンパ腫細胞に対する細胞傷害性がより効果的になった。

【0057】

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載されている。本発明を説明および請求する際に、以下の用語が使用される。

【0058】

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0059】

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「エレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメントまたは複数のエレメントを意味する。

【0060】

参照数値に関連する「約」という用語およびその文法的同等表現、ならびに本明細書で使用されるその文法的同等表現は、その値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含むことができる。例えば、「約１０」の量には、９～１１の量が含まれる。参照数値に関連する「約」という用語はまた、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の値の範囲を含むことができる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、複数のヌクレオチドモノマー（例えば、リボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」には、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子が含まれる。核酸分子は、天然に存在する、組換え、または合成のものであり得る。さらに、核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であり得る。特定の実施形態において、核酸分子は修飾され得る。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子の一方または両方の鎖を指し得る。本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは交換可能である。

【0062】

核酸に関する「ヌクレオチド配列」という用語は、リン結合（例えば、ホスホジエステル、アルキルおよびアリールホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル結合）、および／または非リン結合（例えば、ペプチドおよび／またはスルファミン酸結合）などの共有結合によって結合された連続する一連のヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、例えば、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、異種配列（例えば、異なる種または細胞型起源の遺伝子）である。

【0063】

「ヌクレオチド」および「ヌクレオチドモノマー」という用語は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、ならびに天然に存在しない誘導体およびそれらの類似体を指す。したがって、ヌクレオチドには、例えば、天然に存在する塩基（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、またはデオキシシチジン）を含むヌクレオチド、および当技術分野で既知の修飾塩基を含むヌクレオチドが含まれ得る。

【0064】

「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は、同じリーディングフレーム内にある。

【0065】

「配列同一性」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、２つのヌクレオチド配列または２つのアミノ酸配列が、少なくとも例えば７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性またはこれ以上を共有することを意味する。配列比較では、典型的には、１つの配列が参照配列（例えば、親配列）として機能し、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。

【0066】

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索により、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピュータ化された実装により、または目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）により行われ得る。配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公開されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ＮＣＢＩインターネットサーバーから公開されている）。典型的には、デフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実行できるが、カスタマイズされたパラメータも使用することができる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）を使用する。

【0067】

当業者によって理解されるように、いくつかの態様において、核酸はプラスミド配列をさらに含む。プラスミド配列は、例えば、プロモーター配列、選択マーカー配列、または標的遺伝子組換え配列の１つ以上の配列を含み得る。

【0068】

本明細書で使用される「プロモーター」または「プロモーターエレメント」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。

【0069】

「レトロウイルスベクター」という用語は、ガンマレトロウイルスベクターを指し得る。レトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１つ以上（例えば、２つ）の長い末端反復（ＬＴＲ）、および関心対象のポリヌクレオチド、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドを含み得る。レトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどのウイルス構造遺伝子を欠いている可能性がある。例示的なレトロウイルス（例えば、ガンマレトロウイルス）ベクターには、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾臓焦点形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、および骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、およびこれらに由来するベクターが含まれる。他のガンマレトロウイルスベクターについては、例えば、Ｍａｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１１；３（６）：６７７－７１３に記載されている。

【0070】

「バイシストロン性発現」という用語は、典型的には、本明細書に記載のポリヌクレオチドをプロモーターに作動可能に連結し、バイシストロン性構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、複製および統合真核生物に適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含む。核酸は、多くの種類のベクターにクローン化され得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローン化され得る。特に関心対象となるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。

【0071】

「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給することができる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれている）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で既知のすべてのものが含まれる。

【0072】

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、ならびに他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号）を含む。

【0073】

追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であるため、エレメントが互いに反転または移動した場合にプロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を離して５０ｂｐまで増加し得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協調的または独立して機能して、転写を活性化し得る。例示的なプロモーターには、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＦ－１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれる。それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列を使用することができる。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バールウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにこれらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バールウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーター、ならびにこれらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターであり、そのような発現が所望される場合に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

【0074】

本明細書で使用される場合、「抗体」は、修飾または操作された無損傷抗体または抗原結合フラグメントを含む、またはヒト抗体である、無損傷抗体または抗体の抗原結合フラグメントを意味する。修飾または操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重パラトピック抗体（例えば、二重パラトピック抗体）、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）および二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）が含まれる。

【0075】

「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という用語は、タンパク質またはペプチドを指す場合、多くの場合、不均質なタンパク質およびその他の生物製剤の集団における、タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍を超えて特定のタンパク質に結合する。このような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性のために選択された抗体が必要である。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応し、他のタンパク質に対しては免疫反応しないポリクローナル抗体のみを取得するように選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を減じることによって達成され得る。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（特定の免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明のためには、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。

【0076】

特定の実施形態において、ＣＤ７に結合する抗体は、一本鎖可変フラグメント抗体（「ｓｃＦｖ抗体」）である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。当業者によって理解されるように、様々な適切なリンカーは、当該技術分野において提供され、本明細書に開示されるように、最適な機能のために設計および試験され得る。

【0077】

本明細書で使用される場合、「操作された」免疫細胞は、天然に存在する免疫細胞と比較して遺伝子組換えされた免疫細胞を含む。例えば、本発明の方法に従って産生された操作されたＴ細胞は、本明細書に例示される核酸など、それが由来するＴ細胞において天然に存在しないヌクレオチド配列を含む核酸を担持する。

【0078】

本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、それが天然に存在する状態に通常関連している他の細胞型から分離された細胞を指す。いくつかの例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均質な集団を指す。他の例において、この用語は単に、天然な状態に自然に関連している細胞から分離された細胞を指す。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロで培養される。他の実施形態において、細胞はインビトロで培養されない。

【0079】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性」Ｔ細胞は、ヒトＣＤ７に対するキメラ抗原受容体を発現し、内因性ＣＤ７の表面発現が低いかまたは全くないＴ細胞を指す。いくつかの実施形態において、内因性ＣＤ７の表面発現が低いかまたは全くないのは、内因性ＣＤ７タンパク質がＴ細胞の表面に移動するのを防止または妨害するヒトＣＤ７に対するＰＥＢＬの発現による。いくつかの例において、ＣＤ７の表面発現は、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、またはＦＡＣＳなどであるがこれらに限定されない、当業者に知られている標準的な方法を使用して決定することができる。

【0080】

本明細書で使用される「自己の」という用語およびその文法的同等表現は、同じ存在から由来することを指し得る。例えば、試料（例えば、細胞）は、除去され、処理され、後に同じ対象（例えば、患者）に戻され得る。自己プロセスは、ドナーおよびレシピエントが異なる対象である同種異系プロセスとは区別される。

【0081】

「同種異系」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。

【0082】

本明細書で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、臨床的に許容される基準に従って、医学的状態が改善される程度まで、医学的状態（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍に関係する状態）に対抗することを指す。

【0083】

本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス）を指す。特定の実施形態において、対象はヒトである。「治療を必要とする対象」とは、Ｔ細胞を誘導して悪性腫瘍Ｔ細胞に対して特異的な細胞傷害性を発揮することにより治療（例えば、改善、寛解、予防）することができる疾患または状態を、有するかまたは発症するリスクがある対象（例えば、患者）を指す。

【0084】

本明細書で定義されるように、「治療量」とは、対象に投与されると、投与条件下で対象において所望の治療効果を達成する（Ｔ細胞悪性腫瘍に関係する状態を治療する）のに十分である量を指す。投与される薬剤の有効量は、本明細書で提供されるガイダンスおよび当技術分野で知られている他の方法を使用して、および例えば、選択された特定の薬剤、対象の年齢、感受性、薬物に対する耐性および全体的な健康状態を含むいくつかの要因に依存して、通常の技能の臨床医が決定できる。

【0085】

発明を実施するための形態
以下で詳細に説明するように、抗ＣＤ７ ＣＡＲ（「ＣＤ７ ＣＡＲ」とも呼ばれる）は、ＴＨ６９抗体に基づいてＣＤ７を標的とする抗原結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、３Ａ１Ｆ抗体に基づく。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｔ３－３Ａ１抗体に基づく。いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択されるものと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、本発明の操作された免疫細胞は、配列番号２８のＣＤ７ ＣＡＲを含む。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号２９のＣＤ７ ＣＡＲを含む。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択されるものと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、本発明の操作された免疫細胞は、配列番号２４のＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの例において、本発明の操作された免疫細胞は、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２４のＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２６のＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２７のＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２４のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２８のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２４のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３０のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、少なくとも９０％の配列同一性配列番号２４を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび少なくとも９０％の配列同一性配列番号３０を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２６のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２８のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、少なくとも９０％の配列同一性配列番号２６を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび少なくとも９０％の配列同一性配列番号２８を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２６のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３０８のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、少なくとも９０％の配列同一性配列番号２６を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび少なくとも９０％の配列同一性配列番号３０を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２５のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２９のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、少なくとも９０％の配列同一性配列番号２５を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび少なくとも９０％の配列同一性配列番号２９を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２５のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３１のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、少なくとも９０％の配列同一性配列番号２５を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび少なくとも９０％の配列同一性配列番号３１を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２７のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２９のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、少なくとも９０％の配列同一性配列番号２７を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび少なくとも９０％の配列同一性配列番号２９を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、配列番号２７のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３１のＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、少なくとも９０％の配列同一性配列番号２７を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび少なくとも９０％の配列同一性配列番号３１を有するＣＤ７ ＣＡＲを含む。

【0088】

特定の実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物を宿す操作された免疫細胞は、ＰＢＭＣから生成される。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物を宿す操作された免疫細胞は、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞から生成される。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物を宿す操作された免疫細胞は、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞から生成される。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物を宿す操作された免疫細胞は、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞および精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞の集団から生成される。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物を宿す操作された免疫細胞は、精製されたＣＤ３＋Ｔ細胞を含む細胞の集団から生成される。

【0089】

バイシストロン性発現構築物
本明細書に記載されるように、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドを含む組換えバイシストロン性ウイルス構築物またはベクターが本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、組換えバイシストロン性ウイルス構築物は、ＣＡＲの核酸配列とＰＥＢＬの核酸配列との間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えバイシストロン性ウイルス構築物は、ＣＡＲの核酸配列とＰＥＢＬの核酸配列との間にリボソームコドンスキッピング部位配列（２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列とも呼ばれる）を含む。バイシストロン性構築物のいくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列の上流（５’末端）に位置し、ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳの下流（３’末端）に位置する。場合によっては、ＣＡＲをコードする核酸配列はＩＲＥＳ配列に作動可能に連結され、ＩＲＥＳ配列はＰＥＢＬをコードする核酸配列に操作可能に連結される。場合によっては、ＰＥＢＬをコードする核酸配列は、ＩＲＥＳ配列に作動可能に連結され、ＩＲＥＳ配列は、ＣＡＲをコードする核酸配列に作動可能に連結される。

【0090】

バイシストロン性構築物のいくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流（５’末端）に位置し、ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドは、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流（３’末端）に位置する。場合によっては、ＣＡＲをコードする核酸配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結され、これは、ＰＥＢＬをコードする核酸配列に作動可能に連結される。場合によっては、ＰＥＢＬをコードする核酸配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結され、これは、ＣＡＲをコードする核酸配列に作動可能に連結される。

【0091】

２Ａペプチド配列を介したリボソームコドンスキッピングのメカニズムは、１つの転写物から２つのタンパク質を生成するのに有用であり、通常のペプチド結合は２Ａ配列で損なわれ、１つの翻訳イベントから２つの不連続なタンパク質フラグメントをもたらす。自己切断２Ａペプチド（例えば、２Ａ切断部位）については、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１１，６（４）：ｅ１８５５６に記載されている。

【0092】

いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、エンテロウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳ配列の核酸配列は、配列番号６２に示されている（例えば、表１を参照されたい）。

【0093】

いくつかの実施形態において、リボソームコドンスキッピング部位は、２Ａ自己切断ペプチドに基づく（例えば、表２を参照されたい）。いくつかの実施形態において、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＴ２Ａからなる群から選択される。いくつかの例において、Ｐ２Ａペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６７のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、Ｅ２Ａペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、Ｆ２Ａペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、Ｔ２Ａペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0094】

いくつかの実施形態において、ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物）は、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＴ２Ａからなる群から選択される２Ａ自己切断ペプチド（例えば、２Ａペプチド切断部位）をコードする核酸配列を含み、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードする核酸配列とＰＥＢＬをコードする核酸配列を連結する。言い換えれば、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードする核酸配列とＰＥＢＬをコードする核酸配列との間にある。上記のように、いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、ＣＡＲをコードする核酸配列と、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列と、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列と、Ｅ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列と、Ｆ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列と、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、本明細書に記載の任意のＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。

【0095】

いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、ＣＡＲをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、Ｅ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、ＣＡＲをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、Ｆ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、ＣＡＲをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、構築物は、５’末端から３’末端までの、ＰＥＢＬをコードする核酸配列と、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、ＣＡＲをコードする核酸配列と、を含むか、またはそれらからなる。

【0096】

いくつかの実施形態において、Ｐ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｐ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６３の核酸を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６４の核酸を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６５の核酸を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａをコードする核酸配列は、配列番号６６の核酸を含むか、またはそれからなる。

【0097】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬをコードする核酸配列は、ＣＡＲをコードする核酸配列の５’に配置される（例えば、位置する）。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、ＰＥＢＬをコードする核酸配列の５’に配置される。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの：（ａ１）配列番号４、配列番号６３、および配列番号２；（ａ２）配列番号４、配列番号６３、および配列番号３；（ａ３）配列番号５、配列番号６３、および配列番号２；（ａ４）配列番号５、配列番号６３、および配列番号３；（ｂ１）配列番号４、配列番号６４、および配列番号２；（ｂ２）配列番号４、配列番号６４、および配列番号３；（ｂ３）配列番号５、配列番号６４、および配列番号２；（ｂ４）配列番号５、配列番号６４、および配列番号３；（ｃ１）配列番号４、配列番号６５、および配列番号２；（ｃ２）配列番号４、配列番号６５、および配列番号３；（ｃ３）配列番号５、配列番号６５、および配列番号２；（ｃ４）配列番号５、配列番号６５、および配列番号３；（ｄ１）配列番号４、配列番号６６、および配列番号２；（ｄ２）配列番号４、配列番号６６、および配列番号３；（ｄ３）配列番号５、配列番号６６、および配列番号２；（ｄ４）配列番号５、配列番号６６、および配列番号３；（ｅ１）配列番号２、配列番号６３、および配列番号４；（ｅ２）配列番号３、配列番号６３、および配列番号４；（ｅ３）配列番号２、配列番号６３、および配列番号５；（ｅ４）配列番号３、配列番号６３、および配列番号５；（ｆ１）配列番号２、配列番号６４、および配列番号４；（ｆ２）配列番号３、配列番号６４、および配列番号４；（ｆ３）配列番号２、配列番号６３、および配列番号５；（ｆ４）配列番号３、配列番号６４、および配列番号５；（ｇ１）配列番号２、配列番号６５、および配列番号４；（ｇ２）配列番号３、配列番号６５、および配列番号４；（ｇ３）配列番号２、配列番号６５、および配列番号５；（ｇ４）配列番号３、配列番号６５、および配列番号５；（ｈ１）配列番号２、配列番号６６、および配列番号４；（ｈ２）配列番号３、配列番号６６、および配列番号４；（ｈ３）配列番号２、配列番号６６、および配列番号５；または（ｈ４）配列番号３、配列番号６６、および配列番号５を含むか、またはそれらからなる。

【0098】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１６の配列、配列番号６３、および図１８の配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１６の配列、配列番号６３～６６のうちのいずれか１つ、および図１９の配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１７の配列、配列番号６３～６６のうちのいずれか１つ、および図１８の配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１７の配列、配列番号６３～６６のうちのいずれか１つ、および図１９の配列を含むか、またはそれらからなる。

【0099】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１８の配列、配列番号６３～６６のうちのいずれか１つ、および図１６の配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１９の配列、配列番号６３～６６のうちのいずれか１つ、および図１６の配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１８の配列、配列番号６３～６６のうちのいずれか１つ、および図１７の配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図１９の配列、配列番号６３～６６のうちのいずれか１つ、および図１７の配列を含むか、またはそれらからなる。

【0100】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６７のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６８のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、および図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号６９のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号２８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４２のＣＤ７（ＴＨ６７）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２４のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図３８のＣＤ７（ＴＨ６７）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、配列番号３０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号２６のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイシストロン性構築物は、５’末端から３’末端までの、図４４のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７０のＰ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図４０のＣＤ７（３Ａ１Ｆ）ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドと、を含むか、またはそれらからなる。

【0101】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ部位の５’（上流）に配置され、ＩＲＥＳ部位は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列の５’に配置される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ部位の５’に配置され、ＩＲＥＳ部位は、ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチド配列の５’に配置される。

【0102】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチド配列は、リボソームコドンスキッピング部位の５’（上流）に配置され、リボソームコドンスキッピング部位は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列の５’に配置される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、リボソームコドンスキッピング部位の５’に配置され、リボソームコドンスキッピング部位は、ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチド配列の５’に配置される。

【0103】

いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、および配列番号６６からなる群から選択される１つ以上の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む組換えバイシストロン性構築物である。いくつかの実施形態において、組換えバイシストロン性構築物は、配列番号６３の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、組換えバイシストロン性構築物は、配列番号６４の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、組換えバイシストロン性構築物は、配列番号６５の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、組換えバイシストロン性構築物は、配列番号６６の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、組換えバイシストロン性構築物は、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、および配列番号６６からなる群から選択されるものの核酸配列を含む。

【表1】

【表2】

【0104】

本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかが挿入されている発現ベクターなどのベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来する。このようなベクターは、外因性ポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の長期的で安定した組み込みおよび娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成するための適切なツールである。マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターとは異なり、レンチウイルスベクターは非増殖細胞に形質導入し得る。レンチウイルスベクターも免疫原性が低い。他の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクターである。特定の実施形態において、ベクターは、プラスミドである。

【0105】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーターは、配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物のいずれかは、配列番号６のＣＭＶプロモーターを含むか、またはそれからなる。

【0106】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＥＦ１αプロモーターは、配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーターは、配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物のいずれかは、配列番号７のＥＦ１αプロモーターを含むか、またはそれからなる。

【0107】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦＳプロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦＳプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＥＦＳプロモーターは、配列番号８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーターは、配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物のいずれかは、配列番号８のＥＦＳプロモーターを含むか、またはそれからなる。

【0108】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＭＳＣＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＣＶプロモーターは、配列番号９の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物のいずれかは、配列番号９のＭＳＣＶプロモーターを含むか、またはそれからなる。

【0109】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）に対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＰＧＫプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＰＧＫプロモーターは、配列番号１０の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物のいずれかは、配列番号１０のＰＧＫプロモーターを含むか、またはそれからなる。

【0110】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１１の核酸配列を含むか、またはそれからなる。そのような配列の例示的な実施形態が図２５に示されている。いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１１の配列に対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。バイシストロン性ベクターは、５’末端から３’末端までの、ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列、ＩＲＥＳ配列、およびＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列を含む核酸配列、ならびに任意選択的に５’末端における、ＣＭＶプロモーター（例えば、配列番号６または図２０）、ＥＦ１ａプロモーター（例えば、配列番号７または図２１）、ＥＦＳプロモーター（例えば、配列番号８または図２２）、ＭＳＣＶプロモーター（例えば、配列番号９または図２３）、およびＰＧＫプロモーター（例えば、配列番号１０または図２４）からなる群から選択されるプロモーター、を含む。

【0111】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１２の配列に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。そのような配列の例示的な実施形態が図２６に示されている。バイシストロン性ベクターは、５’末端から３’末端までの、ＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列、ＩＲＥＳ配列、およびＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列を含む核酸配列、任意選択的に５’末端における、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびＰＧＫプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、を含む。

【0112】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１３の核酸配列を含む。そのような配列の例示的な実施形態が図２７に示されている。いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１３の配列に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。バイシストロン性ベクターは、５’末端から３’末端までの、ＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列、およびＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列を含む核酸配列、任意選択的に５’末端における、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびＰＧＫプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、を含む。

【0113】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１４の配列に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。バイシストロン性ベクターは、５’末端から３’末端までの、プロモーター、ＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列、Ｐ２Ａ配列、およびＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列、を含む核酸配列を含む。いくつかの例において、バイシストロン性ベクターは、５’末端から３’末端までの、ＭＳＣＶプロモーター、ＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列、およびＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列、を含む核酸配列を含む。そのような配列の例示的な実施形態が図２８Ａ～図２８Ｂに示されている。

【0114】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１５の配列に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの例において、バイシストロン性ベクターは、５’末端から３’末端までの、ＥＦ１αプロモーター、ＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列、およびＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列、を含む核酸配列を含む。そのような配列の例示的な実施形態が図２９Ａ～図２９Ｂに示されている。

【0115】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、バイシストロン性ベクターは、配列番号１６の配列に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの例において、バイシストロン性ベクターは、５’末端から３’末端までの、ＥＦＳプロモーター、ＣＤ７ ＣＡＲをコードする核酸配列、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列、およびＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列、を含む核酸配列を含む。そのような配列の例示的な実施形態が図３０Ａ～図３０Ｂに示されている。

【0116】

デュアルプロモーターレトロウイルス構築物
Ｔ細胞などの細胞においてＣＡＲおよびＰＥＢＬを同時に発現させるための組換えレトロウイルス構築物（またはベクター）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、レトロウイルス構築物は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、および本明細書に記載のＰＥＢＬのいずれかをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのプロモーターおよびＰＥＢＬのプロモーターは、９０％未満の配列同一性、例えば、９０％未満の同一性、８０％未満の同一性、７５％未満の配列同一性、７０％未満の配列同一性、６５％未満の配列同一性、６０％未満の配列同一性、５５％未満の配列同一性などを共有する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのプロモーターおよびＰＥＢＬのプロモーターは、８０％以下の配列同一性、例えば、８０％の同一性、７５％の配列同一性、７０％の配列同一性、６５％の配列同一性、６０％の配列同一性、５５％の配列同一性などを共有する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのプロモーターおよびＰＥＢＬのプロモーターは、少なくとも５０％の配列同一性、例えば、５０％の配列同一性、５５％の配列同一性、６０％の配列同一性、６５％の配列同一性、７０％の配列同一性、７５％の配列同一性、８０％の配列同一性。８５％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、またはそれ以上の配列同一性を共有する。

【0117】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲのプロモーター（第１のプロモーターと呼ばれる）は、ＰＥＢＬのプロモーター（第２のプロモーターと呼ばれる）とは異なる。第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは同じ配列を有することができる。他の例において、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは異なる配列を有する。

【0118】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーターは、配列番号６の配列を含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＥＦ１αプロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＥＦ１αプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＥＦ１αプロモーターは、配列番号７の配列を含む。

【0120】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＥＦＳプロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＥＦＳプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＥＦＳプロモーターは、配列番号８の配列を含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＭＳＣＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＣＶプロモーターは、配列番号９の配列を含む。

【0122】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターに対して少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、ＰＧＫプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＰＧＫプロモーターは、配列番号１０の配列を含む。

【0123】

いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端までのレトロウイルス構築物は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターおよびＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。様々な実施形態において、５’から３’までのレトロウイルス構築物は、ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターおよびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む。

【0124】

いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは、第２のプロモーターの上流に位置する。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦＳプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦＳプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＰＧＫプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦＳプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＰＧＫプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＰＧＫプロモーターであり、第２のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＰＧＫプロモーターであり、第２のプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＰＧＫプロモーターであり、第２のプロモーターはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦ１αプロモーターであり、第２のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦ１αプロモーターであり、第２のプロモーターはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦ１αプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦＳプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦ１αプロモーターであり、第２のプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦ１αプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦＳプロモーターであり、第２のプロモーターはＭＳＣＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦＳプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦＳプロモーターであり、第２のプロモーターはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦＳプロモーターであり、第２のプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターはＥＦＳプロモーターであり、第２のプロモーターはＥＦＳプロモーターである。

【0125】

いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号１７に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号１７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号１８に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号１８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号１９に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号１９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２０に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２１に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２２に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２３に対して、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のレトロウイルス構築物は、配列番号２３の核酸配列を含む。

【0126】

ＣＤ７に結合する抗体
特定の実施形態において、ＴＨ６９抗体に基づく抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号３２および３３にそれぞれ示されるＶＨ配列およびＶＬ配列に対して、各々が少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、可変重鎖（重鎖可変領域またはＶＨ）および可変軽鎖（軽鎖可変領域またはＶＬ）を含む。重鎖可変領域は、配列番号３２のＶＨ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号３３のＶＬ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。いくつかの例において、重鎖可変領域は、配列番号３２に示される配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の例において、重鎖可変領域は、配列番号３２に示される配列において１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）置換を含む。いくつかの例において、軽鎖可変領域は、配列番号３３に示される配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の例において、軽鎖可変領域は、配列番号３３に示される配列において１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）置換を含む。本明細書に記載のアミノ酸置換のいずれも、同類置換または非同類置換であり得る。

【0127】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号４４（ＳＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮ）のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４５（ＹＴＳＳＬＨＳ）のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号４６（ＱＱＹＳＫＬＰＹＴ）のＶＬ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号４７（ＳＹＡＭＳ）のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４８（ＳＩＳＳＧＧＦＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号４９（ＤＥＶＲＧＹＬＤＶ）のＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号４４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４５のＶＬ ＣＤＲ２、配列番号４６のＶＬ ＣＤＲ３、配列番号４７のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４８のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号４９のＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0128】

いくつかの実施形態において、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号３８に示される核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。他の実施形態において、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号３９に示される核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0129】

特定の実施形態において、３Ａ１Ｆ抗体に基づく抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号３４および３５にそれぞれ示される配列ＶＨおよびＶＬ配列に対して各々が少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する配列を有する可変重鎖（重鎖可変領域またはＶＨ）および可変軽鎖（軽鎖可変領域またはＶＬ）を含む。重鎖可変領域は、配列番号３４のＶＨ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号３５のＶＬ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。いくつかの例において、重鎖可変領域は、配列番号３４に示される配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の例において、重鎖可変領域は、配列番号３４に示される配列において１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）置換を含む。場合によっては、軽鎖可変領域は、配列番号３５に示される配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合において、重鎖可変領域は、配列番号３５に示される配列において１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）置換を含む。本明細書に記載のアミノ酸置換はいずれも、同類置換または非同類置換であり得る。

【0130】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号５０のＶＬ ＣＤＲ１（ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ）、配列番号５１のＶＬ ＣＤＲ２（ＳＡＳＱＳＩＳ）、および配列番号５２のＶＬ ＣＤＲ３（ＱＱＳＮＳＷＰＹＴ）を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号５３（ＳＹＷＭＨ）のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５４（ＫＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳ）のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号５５（ＧＧＶＹＹＤＬＹＹＹＡＬＤＹ）のＶＨ ＣＤＲ３を含む。様々な実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号５０のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５１のＶＬ ＣＤＲ２、配列番号５２のＶＬ ＣＤＲ３、配列番号５３のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５４のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号５５のＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0131】

いくつかの実施形態において、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号４０に示される核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。他の実施形態において、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号４１に示される核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0132】

特定の実施形態において、Ｔ３－３Ａ１抗体に基づく抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号３６および３７にそれぞれ示される配列ＶＨおよびＶＬ配列に対して各々が少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する配列を有する可変重鎖（重鎖可変領域またはＶＨ）および可変軽鎖（軽鎖可変領域またはＶＬ）を含む。重鎖可変領域は、配列番号３６のＶＨ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号３７のＶＬ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。いくつかの例において、重鎖可変領域は、配列番号３６に示される配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の例において、重鎖可変領域は、配列番号３６に示される配列において１３個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３）置換を含む。場合によっては、軽鎖可変領域は、配列番号３７に示される配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合において、重鎖可変領域は、配列番号３７に示される配列において５個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）置換を含む。本明細書に記載のアミノ酸置換はいずれも、同類置換または非同類置換であり得る。

【0133】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号５６のＶＬ ＣＤＲ１（ＲＡＳＫＳＶＳＡＳＧＹＳＹＭＨ）、配列番号５７のＶＬ ＣＤＲ２（ＬＡＳＮＬＥＳ）、および配列番号５８のＶＬ ＣＤＲ３（ＱＨＳＲＥＬＰＹＴ）を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号５９のＶＨ ＣＤＲ１（ＳＦＧＭＨ）、配列番号６０のＶＨ ＣＤＲ２（ＹＩＳＳＧＳＳＴＬＨＹＡＤＴＶＫＧ）、および配列番号６１のＶＨ ＣＤＲ３（ＷＧＮＹＰＨＹＡＭＤＹ）を含む。様々な実施形態において、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、配列番号５６のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５７のＶＬ ＣＤＲ２、配列番号５８のＶＬ ＣＤＲ３、配列番号５９のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号６０のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号６１のＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0134】

いくつかの実施形態において、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号４２に示される核酸配列セットに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。他の実施形態において、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号４３に示される核酸配列セットに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0135】

いくつかの実施形態において、本発明のｓｃＦｖは、抗ＣＤ７抗体の可変重鎖配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、本発明のｓｃＦｖは、ＣＤ７抗体の可変軽鎖配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。例えば、抗ＣＤ７抗体は、当業者によって認識されるものであればどれでもよい。

【表3】

【表4】

【0136】

ＣＤ７ ＰＥＢＬを介した細胞内ＣＤ７の下方調節
本明細書に記載されるように、Ｔ細胞の細胞傷害性は、抗ＣＤ７ ＣＡＲがエフェクターＴ細胞上のＣＤ７発現の下方調節と組み合わせて使用された場合に著しく増加することが示された。本明細書に示されるように、ＣＤ７の下方調節（例えば、排除、減少、および／または再局在化）は、対応する抗ＣＤ７ ＣＡＲによって発揮されるフラトリサイド効果を防ぎ、標的抗原（例えば、ＣＤ７）を保持する細胞と比較して、ＣＡＲ発現後のより大きなＴ細胞回復、およびＴ白血病／リンパ腫細胞に対するより効果的な細胞傷害性を可能にする。当業者が理解するように、エフェクターＴ細胞上のＣＤ７発現の下方調節は、例えば、ＣＤ７対するタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）（ＷＯ２０１６／１２６２１３に記載される）、ＣＤ７に対するＲＮＡｉを含む様々な既知の方法、または、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどの遺伝子編集方法に従って達成することができる。本発明においては、標的抗原に結合し、標的抗原を細胞の細胞質に隔離するＰＥＢＬが記載される。標的抗原が合成され、細胞内でＰＥＢＬに結合する。

【0137】

特定の実施形態において、本明細書に提供されるのは、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ＣＤ７抗原結合ドメイン）を含むＰＥＢＬをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。いくつかの例において、ＰＥＢＬは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ７抗原結合ドメイン、任意選択的なドメインリンカー、および細胞局在化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬは、ＣＤ７抗原結合ドメインのＮ末端に融合されたシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７抗原結合ドメインは、ＶＬドメイン、ドメインリンカー、およびＶＨドメインを含む。ＰＥＢＬの例示的な実施形態は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１８／０１７９２８０の図３Ｅおよび図１７に示されている。

【0138】

本明細書で使用される場合、タンパク質発現ブロッカーの文脈における「連結」は、１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に隣接するフレーム内で直接（例えば、リンカーなしで）標的結合分子をコードする遺伝子を指す。あるいは、標的結合分子をコードする遺伝子は、例えば、ＷＯ２０１６／１２６２１３に記載されているように、リンカー配列を介して、１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に接続され得る。当業者によって理解されるように、そのようなリンカー配列およびそのようなリンカー配列の変異体は、当技術分野で知られている。リンカー配列を組み込む構築物を設計する方法、および機能性を評価する方法は、当業者に容易に利用可能である。

【0139】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬの局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ保持配列、またはプロテアソーム局在化配列を含む。特定の実施形態において、局在化ドメインは、表５の小胞体（ＥＲ）保持ペプチドを含む。特定の実施形態において、局在化ドメインは、表５に示されるプロテアソーム局在化配列を含む。局在化ドメインは、アプリケーションに応じて、ゴルジもしくは小胞体、プロテアソーム、または細胞膜などの特定の細胞内コンパートメントにＰＥＢＬを向けることができる。

【0140】

いくつかの実施形態において、プロテアソーム局在化は、ｓｃＦｖ配列を、２１（ＴＲＩＭ２１）標的化ドメイン配列を含む三者モチーフに連結し、ヒトＴＲＩＭ２１ Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質をコードする配列を共発現することによって達成される。ＴＲＩＭ２１は、抗体のＦｃドメインに高い親和性で結合し、ユビキチン－プロテオソーム複合体を動員して、抗体に結合した分子（例えばタンパク質およびペプチド）を分解することができる。ＴＲＩＭ２１標的化ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４などのヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）遺伝子の群から選択されるアミノ酸配列をコードし、ｓｃＦｖおよびＦｃドメインを含む融合タンパク質を形成するために使用される。この実施形態において、外因的に発現されたＴＲＩＭ２１タンパク質は、標的タンパク質（例えば、ＣＤ７）に結合したｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質に結合し、分解のために複合体をプロテアソームに向ける。

【0141】

ヒトＴＲＩＭ２１ Ｅ３リガーゼタンパク質のアミノ酸配列の詳細は、ＮＣＢＩタンパク質データベースでは、例えば、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００３１３２．２に見出すことができる。ヒトＴＲＩＭ２１ Ｅ３リガーゼタンパク質をコードする核酸配列の詳細については、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００３１４１．３に見出すことができる。

【0142】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬはまた、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来するヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬは、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ８βのヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３４のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ４のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＦｃεＲＩγのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ１６のヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、ＯＸ４０のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３εのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３γのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３δのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＴＣＲαのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３２のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ６４のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＶＥＧＦＲ２のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＦＡＳのヒンジおよび膜貫通ドメイン、およびＦＧＦＲ２Ｂのヒンジおよび膜貫通ドメインからなる群から選択されるヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。

【0143】

特定の実施形態において、ＰＥＢＬは、表５に示される１つ以上の構成要素を含む。

【表5】

【0144】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、およびＶＨ－ＶＬリンカーを含むＣＤ７抗原結合ドメインを含む。ＶＨ－ＶＬリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーであり得、式中、ｎは、１～６、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る。一実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３３に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号３２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３３に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。

【0145】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３４のアミノ酸配列、配列番号３５のアミノ酸配列、およびＶＨ－ＶＬリンカーを含むＣＤ７抗原結合ドメインを含む。ＶＨ－ＶＬリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーであり得、式中、ｎは、１～６の範囲、例えば、１、２、３、４、５、または６であり得る。一実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３４のアミノ酸配列、配列番号３５のアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５のアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３４のアミノ酸配列、配列番号３５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３４に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列を有するアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。

【0146】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３６のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびＶＨ－ＶＬリンカーを含むＣＤ７抗原結合ドメインを含む。ＶＨ－ＶＬリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーであり得、式中、ｎは、１～５、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る。一実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３６のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３６に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３６のアミノ酸配列、配列番号３７に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３６に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３７に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列を有するアミノ酸配列、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む。

【0147】

いくつかの例において、ＣＤ７ ＰＥＢＬはまた、配列番号７２～７７に示されるいずれか１つの配列から選択される局在化ドメインを含む。場合によっては、ＣＤ７ ＰＥＢＬはまた、配列番号８０に示されるＣＤ８αシグナルペプチドなどであるがこれに限定されないＣＤ８αシグナルペプチドを含む。他の場合において、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、配列番号７８に示されるＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインなどであるがこれらに限定されない、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。

【0148】

一実施形態において、本明細書に記載のバイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４の配列およびＮ末端にプロリンを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２５の配列を含む。Ｎ末端プロリン残基は２Ａ切断から生じる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２６の配列およびＮ末端にプロリンを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２７の配列を含む。

【0149】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＰＥＢＬが配列番号２４の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２５の配列を含むように、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＰＥＢＬが配列番号２４の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２５の配列を含むように、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２５の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ３＋Ｔ細胞であり、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２５の配列を含む。

【0150】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＰＥＢＬが配列番号２６の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２７の配列を含むように、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２６の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２７の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２６の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２７の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ３＋Ｔ細胞であり、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２６の配列およびＮ末端にプロリンまたは配列番号２７の配列を含む。

【0151】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２４の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬは、ＣＤ７に結合し、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２６の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬは、ＣＤ７に結合し、配列番号２６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。

【0152】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチドは、表６に示される１つ以上の核酸配列を含む。

【0153】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号３８に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号３９に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号３８に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号３９に対して、またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。

【0154】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４１のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４０に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４１に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４０に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４１に対して、またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。

【0155】

いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４３のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４２に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４３に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４２に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４３に対して、またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。

【表6】

【0156】

本発明の特定の態様において、ＰＥＢＬは、糖タンパク質のＣＤ１ファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９９、ＣＤ１２７、およびＣＤ１３７を含むがこれらに限定されない細胞の表面で発現される分子に結合することができる。

【0157】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0158】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0159】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性ベクター構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ３＋Ｔ細胞である。また、そのような細胞を含む集団も本明細書に提供される。

【0160】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性ベクター構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ３＋Ｔ細胞である。また、そのような細胞を含む集団も本明細書に提供される。

【0161】

ＣＤ７に結合するキメラ抗原受容体
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ７に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ）を含む。本発明のＣＤ７ ＣＡＲは、本明細書では「抗ＣＤ７－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ」と呼ばれることがある。いくつかの実施形態において、ＣＡＲはまた、配列番号８４のアミノ酸配列などであるがこれに限定されない、ＣＤ８αヒンジドメインおよび膜貫通ドメインも含む。

【0162】

当業者が理解するように、特定の実施形態において、様々な成分のアミノ酸配列（例えば、ｓｃＦｖ、細胞内シグナル伝達ドメイン、リンカー、およびそれらの組み合わせ）のいずれかが、本明細書に開示される特定の対応する配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。例えば、特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメイン４－１ＢＢは、所望の機能を有する限り、配列番号８５に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。特定の実施形態において、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0163】

別の例として、特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメイン４－１ＢＢは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２などの共刺激分子からの別の細胞内シグナル伝達ドメインに置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。

【0164】

別の例として、特定の例において、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２などの共刺激分子からの別の細胞内シグナル伝達ドメイン（またはその一部）も含み得る。いくつかの実施形態において、追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。他の実施形態において、追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインフラグメントに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0165】

別の例として、特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζは、所望の機能を有する限り、配列番号８６に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。特定の実施形態において、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0166】

いくつかの例において、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＨ２－Ｋｂに対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。

【0167】

特定の実施形態において、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、ヒンジドメインおよび／または膜貫通ドメインをさらに含む。本発明での使用に適したヒンジおよび膜貫通ドメインは当該技術分野で知られており、例えば、参照によりその全体が組み込まれる刊行物ＷＯ２０１６／１２６２１３において提供されている。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７ ＣＡＲのヒンジおよび膜貫通ドメインは、ＣＤ８β、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ、または別の膜貫通タンパク質からのシグナル伝達ドメイン（例えば、ヒンジおよび膜貫通ドメイン）を含む。

【0168】

特定の実施形態において、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、ＣＤ８αシグナルペプチドをさらに含む。本明細書に記載の実施形態を含む抗ＣＤ７ ＣＡＲの概略図は、ＵＳ２０１８／０１７９２８０の図１７に示されている。

【0169】

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、糖タンパク質のＣＤ１ファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９９、ＣＤ１２７、およびＣＤ１３７を含むがこれらに限定されない、細胞の表面上で発現される分子に結合され得る。

【0170】

特定の実施形態において、本発明の分離されたポリヌクレオチドは、表７によるＣＡＲをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表７によるＣＡＲの構成要素をコードする核酸配列を含む。

【表7】

【0171】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲは、ＣＤ７抗原結合ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ならびに（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーなどであるがこれらに限定されないＶＨ－ＶＬリンカーを含み、式中、ｎは、１～６、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ７抗原結合ドメイン、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0172】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。本発明のＣＤ７ ＣＡＲの例示的な実施形態は、図４２～４５に示されている。

【0173】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含み、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２９の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞であり、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２９の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞であり、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２９の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ３＋Ｔ細胞であり、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２９の配列を含む。また、そのような細胞を含む集団が本明細書で提供される。

【0174】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含み、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３０の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３１の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞であり、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３０の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３１の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞であり、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３０の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３１の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、バイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ３＋Ｔ細胞であり、その結果、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３０の配列、および２Ａ自己切断ペプチドの切断によって生成されるＮ末端での追加のアミノ酸残基を含むか、またはＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３１の配列を含む。また、そのような細胞の集団が本明細書で提供される。

【0175】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号２８の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号２８の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号２８の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号２８の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイシストロン性ベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号３０の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号３０の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号３０の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲが配列番号３０の配列を含むように、デュアルプロモーターベクターによってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ３＋Ｔ細胞である。また、そのような細胞の集団が本明細書で提供される。

【0176】

特定の実施形態において、本発明のＣＤ７ ＣＡＲの分離されたポリヌクレオチドは、表８の１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸配列は、表８に示されるように、ＣＡＲの１つ以上の構成要素をコードする配列を含む。

【表8】

【0177】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ７に結合する抗原結合ドメインの核酸配列、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインの核酸配列、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインの核酸配列、およびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはまた、ＣＤ８シグナルペプチドの核酸配列を含む。

【0178】

特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨ配列は、配列番号３８の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を含み、ＶＬ配列は、配列番号３９の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を含む。

【0179】

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨ配列は、配列番号４０の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を含み、ＶＬ配列は、配列番号４１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨ配列は、配列番号４２の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を含み、ＶＬ配列は、配列番号４３の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を含む。

【0180】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端まで、ＣＤ７に結合する抗原結合ドメインの核酸配列、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号９８を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端まで、配列番号８１、ＣＤ７に結合する抗原結合ドメインの核酸配列、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号９８を含む。

【0181】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号４に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0182】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号５に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、ＣＤ７に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７ ＰＥＢＬは、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0183】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、配列番号４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲの核酸配列を含むバイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物によってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性ベクター構築物またはデュアルプロモーター構築物によってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ３＋Ｔ細胞である。また、そのような細胞を含む集団も本明細書に提供される。

【0184】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲの核酸配列を含むバイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物によってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性ベクター構築物によってコードされるＣＤ７ ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬの核酸配列を含むバイシストロン性構築物によってコードされるＣＤ７ ＰＥＢＬを含むＣＤ３＋Ｔ細胞である。また、そのような細胞を含む集団も本明細書に提供される。

【0185】

バイシストロン性ベクターを発現する操作された免疫細胞
特定の実施形態において、バイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞であって、本明細書に例示されるように、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドであって、ＣＡＲが、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子がＣＤ７に結合する抗原結合ドメインであり、局在化ドメインが小胞体保留配列を含む、ポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）２Ａ自己切断ペプチドまたはＩＲＥＳ配列をコードする核酸配列と、を含む、免疫細胞が提供される。

【0186】

特定の実施形態において、ＣＡＲとの関連で、ならびにＣＤ７に対する抗原結合ドメインとの関連で、ＣＤ７に結合する抗原結合ドメインは、配列番号３２に示されるＶＨ配列および配列番号３３に示されるＶＬ配列、配列番号３４に示されるＶＨ配列および配列番号３５に示されるＶＬ配列、または配列番号３６に示されるＶＨ配列および配列番号３７に示されるＶＬ配列を含む。本明細書に記載されるように、特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、それぞれ配列番号３２および３３、それぞれ配列番号３４および３５、またはそれぞれ配列番号３６および３７に示されるＶＨおよびＶＬ配列に対して、各々が少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む配列を有するＶＨおよびＶＬを含む。特定の実施形態において、ＣＡＲとの関連でＣＤ７に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるように、標的結合分子（タンパク質発現ブロッカーまたはＰＥＢＬ）との関連でＣＤ７に結合する抗体とは異なり得る。

【0187】

いくつかの実施形態において、核酸構築物を含むバイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞は、５’末端から３’末端までの、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ７ ＰＥＢＬ）であって、標的結合分子がＣＤ７に結合する、ポリヌクレオチドと、ＩＲＥＳ配列と、およびＣＤ７に対するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ７ ＣＡＲ）と、を含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１１を含む核酸構築物を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号１１を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号１１を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号１１を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0188】

いくつかの実施形態において、核酸構築物を含むバイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞は、５’末端から３’末端までの、ＣＤ７に対するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドと、ＩＲＥＳ配列と、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子がＣＤ７に結合する、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ７に対するＰＥＢＬ）と、を含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１２または図２６に示される配列を含む核酸構築物を含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１２または図２６に示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１２または図２６に示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１２または図２６に示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0189】

いくつかの実施形態において、核酸構築物を含むバイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞は、５’末端から３’末端までの、ＣＤ７に対するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ７ ＣＡＲ）と、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、標的結合分子がＣＤ７に結合する局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ７ ＰＥＢＬ）と、を含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１３または図２７に示される配列を含む核酸構築物を含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１３または図２７に示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１３または図２７に示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１３または図２７に示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0190】

いくつかの実施形態において、核酸構築物を含むバイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞は、５’末端から３’末端までの、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子がＣＤ７に結合する、ポリヌクレオチドと、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、ＣＤ７に対するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドと、を含む。

【0191】

いくつかの実施形態において、核酸構築物を含むバイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞は、５’末端から３’末端までの、プロモーターと、ＣＤ７に対するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ７ ＣＡＲ）と、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子がＣＤ７に結合する、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ７ ＰＥＢＬ）と、を含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１４～１６の核酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を含む核酸構築物を含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１４～１６の核酸配列のうちのいずれか１つを含む核酸構築物を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号１４に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を含む核酸構築物を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号１５に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を含む核酸構築物を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号１６に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を含む核酸構築物を含む。

【0192】

いくつかの実施形態において、核酸構築物を含むバイシストロン性構築物を含む操作された免疫細胞は、５’末端から３’末端までの、プロモーターと、ＣＤ７に対するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドと、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列と、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子がＣＤ７に結合する、ポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの例において、プロモーターは、ＭＳＣＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、およびＥＦＳプロモーターから選択される。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１４または図２８Ａ～２８Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１４または図２８Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１４または図２８Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１４または図２８Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0193】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１５を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１５または図２９Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１５または図２９Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１５または図２９Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１５または図２９Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0194】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１６または図３０Ａ～Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１６または図３０Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１６または図３０Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１６または図３０Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0195】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作された免疫細胞またはその集団は、少なくとも１０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも１５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも２０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも２５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも３０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも３５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも４０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも４５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも５０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも５５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも６０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも６５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも７０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも７５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも８０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも８５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９６％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９７％のＣＤ７ ＣＡＲ＋ ／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９８％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９９％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、または１００％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に概説される操作された免疫細胞は、実質的に精製されたＣＤ７ ＣＡＲ／ＣＤ７陰性Ｔ細胞の集団を含み、そのような細胞は、記載されたバイシストロン性構築物のうちのいずれか１つを発現する。

【0196】

デュアルプロモーターベクターを発現する操作された免疫細胞
いくつかの実施形態において、（ａ）本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれかをコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、（ｂ）本明細書に記載のＰＥＢＬのうちのいずれかをコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターと、を含む組換えレトロウイルスベクターを含む操作された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＡＲ発現を駆動するプロモーターおよびＰＥＢＬ発現を駆動する別のプロモーターを含む、本明細書に記載の組換えレトロウイルスベクターのうちのいずれかを含む。

【0197】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号１７に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む組換えレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号１８に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む組換えレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号１９に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む組換えレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２０に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む組換えレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２１に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む組換えレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２２に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む組換えレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２３に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む組換えレトロウイルスベクターを含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団またはそれを含む集団である。いくつかの例において、操作された免疫細胞は、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団またはそれを含む集団である。

【0198】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１７または図３１Ａ～Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１７または図３１Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１７または図３１Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１７または図３１Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0199】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１８を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１８または図３２Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１８または図３２Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１８または図３２Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0200】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号１９または図３３Ａ～Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１９または図３３Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１９または図３３Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号１９または図３３Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0201】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２０または図３４Ａ～Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２０または図３４Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２０または図３４Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２０または図３４Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0202】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２１または図３５Ａ～Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２１または図３５Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２１または図３５Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２１または図３５Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0203】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２２または図３６Ａ～Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２２または図３６Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２２または図３６Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２２または図３６Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0204】

いくつかの例において、操作された免疫細胞は、配列番号２３または図３７Ａ～Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２３または図３７Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２３または図３７Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはその集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号２３または図３７Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞またはその集団である。

【0205】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作された免疫細胞またはその集団は、少なくとも１０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも１５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも２０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも２５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも３０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも３５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも４０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも４５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも５０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも５５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも６０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも６５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも７０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも７５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも８０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも８５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９０％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９６％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９７％のＣＤ７ ＣＡＲ＋ ／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９８％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、少なくとも９９％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞、または１００％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７陰性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に概説される操作された免疫細胞は、実質的に精製されたＣＤ７ ＣＡＲ／ＣＤ７陰性Ｔ細胞の集団を含み、そのような細胞は、記載されたデュアルプロモーター構築物のうちのいずれか１つを発現する。

【0206】

内因性ＣＤ７の発現が減少したＣＤ７ ＣＡＲ＋操作された免疫細胞
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作された免疫細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲを発現し、操作されていない免疫細胞と比較して、内因性ＣＤ７発現が減少しているか、または全くない。このような操作された免疫細胞は、免疫細胞の表面でＣＤ７の内因性発現を最小化または排除するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７の発現の減少は、細胞による表面ＣＤ７の下方調節または部分的な下方調節を指す。場合によっては、発現低下には、野生型または非操作細胞の発現レベルと比較して、発現レベルにおいて少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２４％、２５％、２８％、４０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の減少が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に概説される操作された免疫細胞は、実質的に精製されたＣＤ７ ＣＡＲ／ＣＤ７陰性Ｔ細胞の集団を含む。

【0207】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作された免疫細胞は、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現する。

【0208】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作された免疫細胞は、配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0209】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作された免疫細胞は、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作された免疫細胞は、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0210】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現し、配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現し、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0211】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0212】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現し、配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＰＥＢＬを発現し、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ７ ＣＡＲを発現する。

【0213】

特定の実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞である。本明細書に記載の操作された細胞のいずれか１つの集団も提供される。

【0214】

いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、少なくとも約５０％（例えば、約５０％、５５％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７１％、７３％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）のＣＤ７ ＣＡＲ陽性細胞、内因性ＣＤ７陰性細胞を含む操作された免疫細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、少なくとも約５０％（例えば、約５０％、５５％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７１％、７３％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）のＣＤ７ ＣＡＲ陽性細胞、内因性ＣＤ７陰性ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む操作された免疫細胞の集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、少なくとも約５０％（例えば、約５０％、５５％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７１％、７３％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）のＣＤ７ ＣＡＲ陽性細胞、内因性ＣＤ７陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む操作された免疫細胞の集団である。このような細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞、または精製ＣＤ４＋Ｔ細胞および精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む集団から産生され得る。

【0215】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作された免疫細胞は、内因性ＣＤ７の発現が減少した高純度のＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を生成するために培養される。純度のレベルは、少なくとも約７５％（例えば、約７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の、ＣＤ７の表面発現のないＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。発現レベルＣＤ７は、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、およびＦＡＣＳ分析を含むがこれらに限定されない、当業者に知られている標準的な方法に従って決定され得る。

【0216】

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＣＲ７陰性細胞を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、セントラルメモリーＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、エフェクターＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ナイーブＴ細胞を含む。

【0217】

いくつかの例において、操作された免疫細胞の集団は、エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびナイーブＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞の集団は、エフェクターＴ細胞およびナイーブＴ細胞よりも高い割合のエフェクターメモリーＴ細胞およびセントラルメモリーＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞の集団は、約４０％以上のエフェクターメモリーＴ細胞を含む。

【0218】

いくつかの例において、操作された免疫細胞の集団は、ＰＤ１陰性細胞を含む。いくつかの例において、操作された免疫細胞の集団は、ＴＩＭ－１陰性細胞を含む。いくつかの実施形態において、集団は、約６０％以上のＰＤ１陰性細胞、ＴＩＭ－１陰性細胞を含む。いくつかの実施形態において、集団は、約４％～約２０％のＰＤ１陽性細胞、ＴＩＭ－１陽性細胞を含む。

【0219】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、免疫応答を生成し、インターフェロン－γを分泌する。操作された免疫細胞は、ＣＤ７発現癌細胞などの癌細胞に応答してＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する。

【0220】

いくつかの実施形態において、バイシストロン性発現ベクターを含む本明細書に記載の細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞の集団を生成するために使用され得る。ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞は、時間の経過とともに増殖および濃縮され得る。ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞は、バルクＰＢＭＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む精製Ｔ細胞、ならびに精製ＣＤ３＋Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない細胞から生成され得る。ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞は、Ｔ_ＥＭ細胞、Ｔ_ＣＭ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、ナイーブＴ細胞を含むＴ細胞の様々なサブセットを産生するために使用され得る。

【0221】

別の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、および操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）を産生するための方法も提供され、この方法は、本発明のバイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物のいずれかを免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、療法として操作された免疫細胞を受け取る対象から得られた免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ドナーから得られた免疫細胞に由来し、得られた操作された免疫細胞は、療法として対象に投与される。

【0222】

様々な態様において、本明細書に記載の操作された免疫細胞を産生するためのキットも提供される。本キットは、例えば、抗ＣＤ７ ＣＡＲ媒介性細胞傷害性活性を有する同種異系または自己Ｔ細胞を産生するために使用され得る。いくつかの実施形態において、キットは、抗ＣＤ７ ＣＡＲ媒介性細胞傷害性活性を有する同種異系エフェクターＴ細胞を産生するために有用である。特定の実施形態において、キットは、抗ＣＤ７ ＣＡＲ媒介性細胞傷害性活性を有する自己エフェクターＴ細胞を産生するために有用である。

【0223】

したがって、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のバイシストロン性構築物またはデュアルプロモーター構築物のいずれか１つを含むキットである。

【0224】

特定の実施形態において、バイシストロン性構築物は、例えば、クローニングおよび／または発現を可能にする配列（例えば、プラスミドまたはベクター配列）をさらに含む。例えば、ヌクレオチド配列は、例えば、トランスフェクション、形質導入、または細胞（免疫細胞）へのエレクトロポレーションのために、他のプラスミドおよび／またはベクター（発現ベクターまたはウイルス発現ベクター）へのクローニングを容易にするためのプラスミドの一部として提供され得る。

【0225】

典型的には、キットは使いやすさのために区画化されており、試薬が入った１つ以上の容器を含むことができる。特定の実施形態において、キットの構成要素はすべて一緒に包装される。あるいは、キットの１つ以上の個別の構成要素を、他のキットの構成要素とは別のパッケージで提供できる。キットには、キットの構成要素を使用するための指示も含まれ得る。

【0226】

操作された免疫細胞の投与
他の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する治療量の操作された免疫細胞を対象に投与し、それによってそれを必要とする対象の癌を治療することを含む、それを必要とする対象の癌を治療する方法も提供される。

【0227】

特定の実施形態において、この方法は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよびＰＥＢＬをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むバイシストロン性ウイルス構築物を含む治療量の操作された免疫細胞を投与することを含む。様々な実施形態において、この方法は、（ａ）本明細書に概説されるＣＤ７キメラ抗原受容体（ＣＤ７ ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、（ｂ）本明細書に概説されるＣＤ７タンパク質発現ブロッカー（ＣＤ７ ＰＥＢＬ）をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターと、を含む組換えレトロウイルスベクターを含む、本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれか１つの治療量を投与することを含む。

【0228】

いくつかの実施形態において、配列番号１１または図２５に示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１２または図２６に示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１３または図２７に示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１４または図２８Ａ～２８Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１５または図２９Ａ～２９Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１６または図３０Ａ～３０Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１７または図３１Ａ～３１Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１８または図３２Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号１９または図３３Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号２０または図３４Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号２１または図３５Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含む治療量の操作された免疫細胞またはその集団（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、もしくは操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）または配列番号２２または図３６Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含むその集団が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）または配列番号２３または図３７Ａ～Ｂに示される配列を含む核酸構築物を含むその集団が、癌を有する対象に投与される。

【0229】

いくつかの実施形態において、配列番号２５のＣＤ７ ＰＥＢＬを含む治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号２７のＣＤ７ ＰＥＢＬを含む治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。

【0230】

いくつかの実施形態において、配列番号２９のＣＤ７ ＣＡＲを含む治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号３１のＣＤ７ ＣＡＲを含む治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。

【0231】

いくつかの実施形態において、配列番号２５のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２９のＣＤ７ ＣＡＲを含む、治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号２７のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号２９のＣＤ７ ＣＡＲを含む、治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。

【0232】

いくつかの実施形態において、配列番号２５のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３１のＣＤ７ ＣＡＲを含む、治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態において、配列番号２７のＣＤ７ ＰＥＢＬおよび配列番号３１のＣＤ７ ＣＡＲを含む、治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与される。

【0233】

いくつかの実施形態において、治療量の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団が、癌を有する対象に投与され、操作された免疫細胞は、配列番号９５を含む。

【0234】

特定の実施形態において、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍、例えば、Ｔ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫、例えば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、原発性皮膚ガンマデルタＴ細胞リンパ腫、特に明記されていない末梢性Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫である。特定の実施形態において、Ｔ細胞悪性腫瘍は、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ－ＡＬＬ）である。

【0235】

いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、治療、例えば、癌治療を必要とする対象に対して自己由来である。他の実施形態において、操作された免疫細胞は、治療を必要とする対象に対して同種異系である。

【0236】

特定の実施形態において、操作された免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍母地の灌流、人工スキャフォールドにおける腫瘍部位での移植、髄腔内投与、ならびに眼内投与によって対象に投与される。

【0237】

特定の実施形態において、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞（例えば、同種異系または自己免疫細胞）を注入する方法は、当技術分野で知られている。病気の症状を改善するために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、１０^７～１０^１０個の細胞の投与量、例えば、１０^９個の細胞の投与量が、で１回の設定で注入される。注入は、１回の１０^９個の細胞用量として、または数回に分けた１０^９個の細胞の投与量として投与される。注入の頻度は、毎日、２～３０日ごと、または必要に応じて、または必要ならばより長い間隔にすることができる。注入の量は、一般に、対象ごとに少なくとも１回の注入であり、好ましくは、許容されるように、または疾患の症状が改善されるまで、少なくとも３回の注入である。細胞は、５０～２５０ｍｌ／時間の速度で静脈内に注入することができる。他の適切な投与様式には、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与が含まれる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者に容易に利用可能である。

【0238】

特定の実施形態において、本発明による癌を治療する方法は、少なくとも１つの他の既知の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、または他の免疫療法と組み合わされる。

【0239】

また、他の態様において、提供されるのは、癌を治療するための本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかを有する操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用である。特定の実施形態において、癌はＴ細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態において、Ｔ細胞悪性腫瘍は、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ－ＡＬＬ）である。

【0240】

特定の実施形態において、操作された免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位での移植、および髄腔内投与によって対象に投与される。

【実施例】

【0241】

例１：キメラ抗原受容体Ｔ細胞におけるＣＤ７発現の遮断のためのバイシストロン性発現ベクターの使用
この例は、バイシストロン性発現構築物を使用した抗ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ７発現の遮断を示している。

【0242】

方法
細胞培養
２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。ＪｕｒｋａｔクローンＥ６－１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）およびＮＡＬＭ６クローンＧ５細胞（ＣＲＬ－３２７３）は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に維持された。

【0243】

レンチウイルスの産生
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２９３Ｔ細胞にレンチウイルストランスファーベクターおよびＶｉｒａｐｏｗｅｒパッケージングプラスミドミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：３の比率でコトランスフェクトした。トランスフェクション培地は、トランスフェクションの６時間後に１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む新鮮なＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。４８時間後に、ウイルス上清を収集し、０．４５μＭフィルターに通し、次いでＬｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して１００倍に濃縮した。濃縮レンチウイルスストックは、使用するまで－１５０℃で保存した。

【0244】

レトロウイルスの産生
Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、２９３Ｔ細胞にレトロウイルストランスファーベクターとｐＥＱおよびｐＲＤＦパッケージングプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクション培地は、トランスフェクションの６時間後に１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む新鮮なＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。２４時間後および４８時間後に、ウイルス上清を収集し、０．４５μＭフィルターに通した。レトロウイルスは新鮮な状態で使用するか、または使用するまで－１５０℃で保存した。

【0245】

２９３Ｔ細胞でのレンチウイルス滴定
５μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下の異なる量のレンチウイルスで、２９３Ｔ細胞を形質導入した。１５時間一晩培養した後、形質導入培地を除去し、細胞を新鮮な培地中の１０Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で３７℃において１５分間処理した。次いで、さらなる培養のために、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭと培地を交換した。形質導入の≧７２時間後に、形質導入された細胞を分析のために採取した。ウイルス力価を、フローサイトメトリーおよびＲＴ－ｑＰＣＲを使用して決定した。

【0246】

形質導入ユニット（ＴＵ）力価を、等式：［ＴＵ／ｍＬ＝（試料あたりの２９３Ｔ細胞の数×％ＣＡＲ＋細胞）÷ウイルス量（ｍＬ）］を使用してフローサイトメトリーデータから計算した。ＴＵ力価は、％ＣＡＲ＋細胞およびウイルス量の線形範囲内の試料を使用して計算した。

【0247】

積分単位（ＩＵ）力価は、等式：［ＩＵ／ｍｌ＝（試料あたりの２９３Ｔ細胞数×ゲノムあたりのプロウイルス遺伝子コピー数）÷ウイルス量（ｍＬ）］を使用して、ゲノムＤＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲデータから計算した。ＩＵ力価は、プロウイルス遺伝子のコピー数とウイルス量との線形範囲内の試料を使用して計算した。

【0248】

Ｊｕｒｋａｔ細胞のレンチウイルス形質導入
レンチウイルスは、８μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の有無にかかわらずＪｕｒｋａｔ細胞に直接添加された。培養物からレンチウイルスを除去するために、２日後に完全な培地交換を実行した。形質導入された細胞を、形質導入の≧２日後に分析のために採取した。

【0249】

初代Ｔ細胞培養
凍結したヒト初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＡＴＣＣカタログ番号ＰＣＳ－８００－０１１およびＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号７００２５）を解凍し、一晩回収し、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１ｘのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）、３％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、または無血清ＴｅｘＭＡＣＳ培地中で１００万細胞／ｍＬに維持した。培地には、２～３日ごとに１２０ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した。

【0250】

ＰＢＭＣを、さらに選択せずに大量に培養するか、または一晩回収した後にＴ細胞用に精製した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ３ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分離した。

【0251】

Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）またはＴ細胞増殖および活性化のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）のいずれかで活性化した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ビーズ対細胞の比率が１：１になるように添加した。ビーズを４日後に枯渇させた。

【0252】

初代Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
初代Ｔ細胞は、活性化の１～４日後に形質導入された。レンチウイルスをＴ細胞に直接添加する静的形質導入を実行した。培養物からレンチウイルスを除去するために、２日後に完全な培地交換を実行した。形質導入された細胞を、形質導入の≧３日後にフローサイトメトリーによって分析した。

【0253】

初代Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入
レトロネクチンベースのレトロウイルス形質導入を、初代Ｔ細胞で実行した。未処理の組織培養プレートを、製造元の推奨に従って、２．５μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （Ｔａｋａｒａ）でコーティングした。レトロウイルスの上清をレトロネクチンでコーティングしたプレートに添加し、３２℃において２時間１０００ｘｇで遠心分離した。次いで、ウイルス上清をウェルから除去した。Ｔ細胞を添加する前に、ウェルを培地ですすいだ。形質導入された細胞を、形質導入の≧３日後にフローサイトメトリーによって分析した。

【0254】

フローサイトメトリー
抗体の染色および洗浄を、染色バッファー（１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４、０．２％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）を用いて実行する。細胞を氷の上で抗体とともに１５分間インキュベートし、３回洗浄した。次の抗体を染色に使用した：抗マウスＦ（ａｂ’）２－ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ １１５－０６６－０７２）、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ０１６－１３０－０８４）、抗ヒトＣＤ７－ＰＥ（ＢＤ ５５５３６１）、抗ヒトＣＤ３ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４７－００３７－４２）。抗マウスＦ（ａｂ’）２－ビオチンで染色された細胞は、残りの抗体を添加する前に、３μｇのマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）で５分間ブロックされた。ＤＡＰＩを、生／死の識別のために１μｇ／ｍＬで使用した。染色された細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターで収集し、ＦｌｏｗＪｏｖ１０ソフトウェアで分析した。

【0255】

リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮａｓｅ Ａ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ＭＮ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ｍａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡを合成した。すべてのキットを、製造元の推奨に従って使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、実行した。

【0256】

使用したプライマーは次のとおりである。
ＲＰＰＨ１－Ｆ：５’－ＧＡＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧ－３’（配列番号８７）
ＲＰＰＨ１－Ｒ：５’－ＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣ－３’（配列番号８８）
ＷＰＲＥ－Ｆ：５’－ＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴ－３’（配列番号８９）
ＷＰＲＥ－Ｒ：５’－ＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡ－３’（配列番号９０）
ＴＨ６９ＣＤ７ＣＡＲ－Ｆ：５’－ＧＣＡＧＣＣＴＴＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧ－３’（配列番号９１）
ＴＨ６９ＣＤ７ＣＡＲ－Ｒ：５’－ＴＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＡＴＴＡ－３’（配列番号９２）
ＴＨ６９ＣＤ７ＰＥＢＬ－Ｆ：５’－ＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＡ－３’（配列番号９３）
ＴＨ６９ＣＤ７ＰＥＢＬ－Ｒ：５’－ＣＣＡＣＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＧＴ－３’（配列番号９４）
すべてのアッセイプライマーは、９０％～１１０％のプライマー効率を有した。

【0257】

すべての遺伝子の倍率変化は、等式［倍率変化＝２＾－（Ｃｔ（標的遺伝子）－Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子））］を使用してハウスキーピング遺伝子に対して正規化された。標的遺伝子のコピー数は、２９３Ｔ細胞におけるＲＮａｓｅＰのゲノムコピー数に対して正規化された。

【0258】

ウエスタンブロット
細胞をＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解した。細胞溶解物のタンパク質定量を、製造元の推奨に従って、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。ウエスタンブロットを、１２－２３０ｋＤａのＷｅｓ分離モジュールとともに自動ウエスタンブロットシステムであるＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｅｓ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）と使用して実行した。以下の一次抗体を使用した：抗β－アクチン、クローン１３Ｅ５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；抗Ｍｙｃ－Ｔａｇ、クローン７１Ｄ１０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；および抗ＣＤ３ζポリクローナル抗体、カタログ番号ａｂ２２６４７５（Ａｂｃａｍ）。Ｗｅｓ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅの二次抗体を使用した。データを、Ｃｏｍｐａｓｓ ｆｏｒ Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎソフトウェアを使用して分析した。

【0259】

ＩＦＮγ分泌
エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞は、１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁され、ウェルあたり１００，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞を９６ウェル丸底プレートに播種された。標的細胞を、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した。２４時間後、細胞をスピンダウンし、上清を収集して－１５０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を製造元の推奨に従って使用して、上清をＩＦＮγ分泌について評価した。

【0260】

細胞傷害性アッセイ
標的細胞は、１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁され、０．４μｇ／ｍｌのカルセイン赤橙色ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が１０分間添加された（ｌｏａｄｅｄ）。次に、添加された細胞を３回洗浄して、過剰なカルセインを除去した。ウェルあたり１００，０００個の標的細胞を９６ウェル丸底プレートに播種した。標的細胞は、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養された。４時間後、ＤＡＰＩをすべてのウェルに添加し、細胞をフローサイトメーターで収集した。残りの生きた標的細胞の数がすべてのウェル内で計数された。細胞傷害性の割合が、次式で計算された：
細胞傷害性の割合＝［（Ｓ－Ｅ）／Ｓ］＊１００％
Ｓ＝標的細胞のみ対照ウェル内の残りの生きた標的細胞
Ｅ＝実験ウェル内でのエフェクターＴ細胞と共培養した後の残りの生きた標的細胞

【0261】

結果
初代Ｔ細胞に（１）ＰＥＢＬ、（２）ＣＡＲ、（３）ＰＥＢＬおよびＣＡＲを順番に、（４）ＰＥＢＬ－ＩＲＥＳ－ＣＡＲ、または（５）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＰＥＢＬを発現する様々なレトロウイルスが形質導入された。形質導入された細胞を、ＣＤ７およびＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって分析した（図１Ａ）。示されたレトロウイルスで形質導入された初代Ｔ細胞からの細胞溶解物を、β－アクチン、Ｍｙｃタグ付きＰＥＢＬ、ＣＡＲおよび内因性ＣＤ３ζ発現についてウエスタンブロットによって分析した（図１Ｂ）。

【0262】

デュアルプロモーターレンチウイルス構築物は、単一のベクターから抗ＣＤ７ ＣＡＲおよび抗ＣＤ７ ＰＥＢＬを発現するように調製された。図２Ａ～図２Ｆに示されるように、５’末端から３’末端までのデュアルプロモーター構築物の一般的なフォーマットは、第１のプロモーター－抗ＣＤ７ ＣＡＲ－第２のプロモーター－抗ＣＤ７ ＰＥＢＬを含んでいた。試験されたプロモーターには、ＭＳＣＶプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＰＧＫプロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターが含まれる。例示的なデュアルプロモーター構築物の核酸配列は、配列番号１９～２３として提供され、図３３Ａ～３３Ｂ、図３４Ａ～３４Ｂ、図３５Ａ～３５Ｂ、図３６Ａ～３６Ｂ、および図３７Ａ～３７Ｂに示される。そのような構築物は、ＴＨ６９抗体に基づく抗ＣＤ７ ＣＡＲおよび３Ａ１Ｆ抗体に基づく抗ＣＤ７ ＣＡＲを含む抗ＣＤ７ ＣＡＲ、ならびにＴＨ６９抗体に基づく抗ＣＤ７ ＰＥＢＬおよび３Ａ１Ｆ抗体に基づく抗ＣＤ７ ＰＥＢＬを含む抗ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードした。

【0263】

デュアルプロモーターレンチウイルスベクターを細胞に形質導入して、表面ＣＤ７発現の部分的な下方調節および抗ＣＤ７ ＣＡＲの低発現を伴う細胞を産生した。ＣＡＲを発現する細胞の割合は、延長された時間培養した後も低いままであった。図３は、形質導入後５日目および形質導入後１４日目の細胞におけるＣＡＲの発現（ｙ軸）およびＣＤ７の発現（ｘ軸）を示している。図は、例示的なデュアルプロモーター構築物で形質導入された細胞（例えば、健康なドナーリンパ球を含む健康なドナー細胞）の発現が配列番号１８～２３として提供され、かつ図３２Ａ～３２Ｂ、３３Ａ～３３Ｂ、図３４Ａ～３４Ｂ、図３５Ａ～３５Ｂ、図３６Ａ～３６Ｂ、および図３７Ａ～３７Ｂに示されることを示している。一例として、ＭＳＣＶプロモーター－ＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－ＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含むデュアルプロモーターレンチウイルスベクターで形質導入された細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－陰性細胞（５２．８％）、ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞（２．９８％）、ＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞（４０．４％）、および形質導入の５日後にＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞（３．８４％）を含む細胞の集団を産生した。形質導入の１４日後に、ＭＳＣＶプロモーター－ＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－ＥＦ１ａプロモーター－ＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ形質導入細胞には、ＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－陰性細胞（４２．６％）、ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞（０．１４％）、ＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞（５４．９％）、およびＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞（２．３７％）を含む細胞の集団が含まれていた。

【0264】

ＣＤ７ ＣＡＲおよびＣＤ７ ＰＥＢＬの単一プロモーターの発現を最適化するために、バイシストロン性レンチウイルス構築物が生成された。そのような構築物の例示的な概略図が、図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃに提供されている。図４Ａは、配列番号１４のものなどの、ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なバイシストロン性構築物の概略図を示す。図４Ｂは、配列番号１５のものなどの、ＥＦ１ａプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なバイシストロン性構築物の概略図を示す。図４ｃは、配列番号１６のものなどの、ＥＦＳプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬを含む例示的なバイシストロン性構築物の概略図を示す。

【0265】

ＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入された細胞は、ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ－陰性Ｔ細胞の集団を生成した。図５は、形質導入の０～９日後にＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞の増殖および集積を示している。例えば、０日目に、細胞の１０．９％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－陰性細胞、０．０１６％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞、８７．９％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７ ＋細胞、および１．２１％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞であった。３日目に、細胞の２４．１％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－陰性細胞、１７．７％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞、５３．８％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞、および４．３３％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞であった。６日目に、細胞の２７．５％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－陰性細胞、６３．７％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞、６．２５％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞、および２．５７％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞であった。９日目に、細胞の１６．１％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－陰性細胞、８３．７％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞、０．０１２％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞、および０．０９５％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞であった。

【0266】

異なるプロモーターを有する抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬバイシストロン性レンチウイルスベクターで形質導入された細胞は、経時的に培養が集積されるＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞を産生した。図６は、形質導入の５日後および形質導入の１４日後にＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞の割合の増加を示す。例えば、ＥＦＳプロモーター抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬレンチウイルスベクターで形質導入された細胞は、６７．３％のＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－細胞を産生し、３１．２％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞であり、０．４４％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞であり、形質導入の５日後に１．０６％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞であった。形質導入の１４日後までに、２５．０％のＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７－細胞、７３．８％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞であり、０．８０％がＣＤ７ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞であり、０．４６％がＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋細胞であった。対照として、形質導入の５日後に抗ＣＤ１９ ＣＡＲの上流にＥＦ１ａプロモーターを含むレンチウイルスベクターを細胞に形質導入し、細胞の３４．７％がＣＤ１９ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋であり、６０．１％がＣＤ１９ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋であり、４．５８％が二重陰性であり、０．６８％がＣＤ１９ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性であった。また、形質導入の１４日後に、細胞の４７．５％がＣＤ１９ ＣＡＲ＋／ＣＤ７＋であり、５０．４％がＣＤ１９ ＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋であり、１．０１％が二重陰性であり、１．０６％がＣＤ１９ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性であった。したがって、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の集積は時間の経過とともにほとんど検出されなかった。

【0267】

単一プロモーターバイシストロン性ベクターの一貫性および再現性を評価するために、細胞に２つの独立したロットのＭＳＣＶプロモーター－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬレンチウイルスを形質導入した。ＣＤ７ ＰＥＢＬはｍｙｃタグ付けされ、ウエスタンブロットによって検出された。ＣＤ７ ＣＡＲも検出された（図７Ｂ）。図７Ａは、形質導入された細胞におけるＣＤ７ ＣＡＲおよびＣＤ７発現のフローサイトメトリー分析を示す。最初のロットは、５３．８％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞および４６．１％のＣＤ７－陰性／ＣＤ７－陰性細胞を含む形質導入細胞の集団を産生した。２番目のロットは、６５．５％のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性細胞および３４．５％のＣＤ７－陰性／ＣＤ７－陰性細胞を含む形質導入細胞の集団を産生した。形質導入されていない細胞には、９８．６％のＣＡＲ－陰性／ＣＤ７＋細胞が含まれていることが注目された。

【0268】

本明細書に記載の単一プロモーターバイシストロン性ベクターが、バルクＰＢＭＣ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む精製Ｔ細胞、および精製ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む異なる開始細胞からＣＤ７ ＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するために首尾よく使用されたことに留意されたい。さらに、Ｔ細胞増殖および活性化のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）およびＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含む様々なＴ細胞活性化試薬を使用した。図８は、抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－抗ヒトＣＤ７（ＴＨ６９）ＰＥＢＬ形質導入細胞が経時的に培養された場合のＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞の割合の増加を示す。ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞の同等の増殖が、異なる開始細胞タイプ間および２つの活性化試薬間で検出された。

【0269】

本明細書に記載の細胞（例えば、ＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞）は、無血清ＴｅｘＭＡＣＳ培地または３％ヒトＡＢ血清を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地のいずれかにおいて培養された精製ＣＤ４＋正の選択およびＣＤ８＋正の選択Ｔ細胞から生成された。Ｔ細胞にＭＯＩ１０でＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスを形質導入してＣＤ７－ＣＡＲ＋Ｔ細胞を生成した。細胞活性化の１１日後に形質導入された細胞の総倍率変化は、血清補充培地でより高かった（図９Ａおよび図９Ｂ）。

【0270】

活性化後の異なる日（１日～４日）にＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入された精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋選択Ｔ細胞は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の純度の高い集団を生成した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。異なる日に形質導入された細胞は、製造プロセス中に拡大および増殖した。図１０Ｂは、細胞が活性化後１、２、３、または４日目で形質導入された場合に、形質導入されたＴ細胞が平均して約５倍～１０倍の増殖を示したことを示す。

【0271】

ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスの異なるＭＯＩで形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲおよび内因性ＣＤ７の発現をＦＡＣＳによって測定した。より低いＭＯＩで形質導入されたＴ細胞は、形質導入プロセスの初期にはＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞の割合が低かったが、より高いＭＯＩの形質導入で得られたＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞の割合と一致するように増加した（例えば、図１１を参照されたい）。例えば、ＭＯＩが３のレンチウイルスで形質導入されたドナー１のＴ細胞において、形質導入の３日後にＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞が９．７６％であり、９日後にＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性Ｔ細胞が６９．９％であった。ＭＯＩが１０のレンチウイルスで形質導入されたドナー１のＴ細胞において、形質導入の３日後にＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性が１７．７％であり、形質導入の９日後にＣＤ７ ＣＡＲ＋／ＣＤ７－陰性が８３．７％であった。

【0272】

３つの独特なドナー由来の精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に、２つの個別のウェルにおいて表わされたＭＯＩでＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスを形質導入した。ＣＡＲ＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析した。細胞ペレットを収集し、ゲノムＤＮＡを抽出して、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析によってベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定した。より高いＭＯＩはより高いＶＣＮと相関した（図１２Ｂ）が、ＣＤ７ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合はＭＯＩ５および１０で類似していた（図１２Ａ）。

【0273】

様々な表面マーカーの発現は、活性化の１１日後にＭＳＣＶ－ＣＤ７ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ＰＥＢＬレンチウイルスで形質導入された初代Ｔ細胞で測定された。図１３Ａは、３人の異なるドナー由来の形質導入された細胞におけるＣＤ７ ＣＡＲおよび内因性ＣＤ７発現を示す。ＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ５６と比較したＣＤ３の発現を図１３Ｂに示す。ＣＤ４およびＣＤ８の発現を図１３Ｃに示す。形質導入された細胞が、Ｔ_ＥＭ細胞、ＴＣＭ細胞、Ｔ_ｅｆｆ細胞、およびＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７発現によって決定されるナイーブＴ細胞を含むＴ細胞の異なるサブセットを生成したことを、図１３Ｄは示す。図１３Ｄは、形質導入されたＴ細胞におけるＰＤ－１およびＴＩＭ－３の発現を示す。

【0274】

ＣＤ７＋Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＣＤ７陰性Ｎａｌｍ６細胞に対する形質導入されたＰＥＢＬ－ＣＡＲ Ｔ細胞の応答は、ＩＦＮγ分泌（図１４Ａ）および細胞傷害性（図１４Ｂ）によって決定された。２４時間示されたＥ：Ｔ比でＪｕｒｋａｔ細胞またはＮａｌｍ６細胞と共培養されたＰＥＢＬ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上清において、ＩＦＮ－ｇ分泌が測定された（技術的複製についての平均±ＳＤ）。ＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｎａｌｍ６細胞とではなくＣＤ７＋Ｊｕｒｋａｔ細胞と培養する場合に、ＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞によってＩＦＮγが分泌されるため、標的特異的な機能的反応を示した。さらに、ＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＤ７＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を死滅させたが、細胞傷害性アッセイではＣＤ７－陰性Ｎａｌｍ６細胞は死滅させなかった。

【0275】

この例は、ＣＤ７ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ７ ＰＥＢＬバイシストロン性レンチウイルスベクターを使用して産生されたＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成および増殖を示している。このような細胞は、ＩＦＮγ分泌およびＣＤ７＋標的細胞株に対する特異的毒性などの抗原特異的なＴ細胞の機能的反応を示した。ＰＥＢＬ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ７陰性のＣＡＲ＋Ｔ細胞の純度が高いことを示した。

【0276】

本明細書で引用されたすべての特許、公開された出願および参考文献の教示は、その全体が参照により組み込まれる。

【0277】

本発明をその例示的な実施形態を参照して特に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることを当業者は理解するであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図35A】

【図35B】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図37A】

【図37B】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【配列表】

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【国際調査報告】