▶ ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システムの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】自殺遺伝子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/28 20060101AFI20220131BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20220131BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220131BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20220131BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20220131BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220131BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20220131BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20220131BHJP
C07K 14/525 20060101ALN20220131BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20220131BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20220131BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20220131BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20220131BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20220131BHJP
C07K 14/715 20060101ALN20220131BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12N15/28
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/26
C12N15/24
C12N5/10
C12N15/63 Z
A61K48/00
A61K38/19
A61K38/00
A61K35/17 Z
A61K35/28
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K47/68
A61K35/761
A61K35/76
A61P37/00
A61P25/02
A61K39/395 N
C07K14/525 ZNA
C12N15/867 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/861 Z
C07K19/00
C07K14/725
C07K14/715
C07K16/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021527926
(86)(22)【出願日】2019-11-18
(85)【翻訳文提出日】2021-07-16
(86)【国際出願番号】 US2019062009
(87)【国際公開番号】W WO2020106619
(87)【国際公開日】2020-05-28
(31)【優先権主張番号】62/769,405
(32)【優先日】2018-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/773,372
(32)【優先日】2018-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/791,464
(32)【優先日】2019-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500039463
【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ，ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
【住所又は居所原語表記】２１０ Ｗｅｓｔ ７ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ ７８７０１ Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】レズヴァニ、ケイティ
(72)【発明者】
【氏名】シュポール、エリザベス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE59
4C084AA13
4C084BA44
4C084DA14
4C084DA25
4C084DA45
4C084NA06
4C084ZA201
4C084ZB131
4C084ZB261
4C084ZC022
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4C085CC23
4C087BB65
4C087CA12
4C087NA06
4C087ZA20
4C087ZB13
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA22
4H045DA50
4H045DA51
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 細胞療法のための安全機構の解決策を提供する。
【解決手段】 本開示の実施形態は、非分泌型かつ膜結合性であり、それにより、突然変異体を発現する細胞における阻害のための標的を提供する、特定のＴＮＦ－α突然変異体を包含する。特定の実施形態では、ＴＮＦ－α突然変異体は、個体に対する養子細胞療法に使用される細胞において自殺遺伝子として利用され、所望の時点で、膜結合ＴＮＦ－αに結合し、細胞に対する補体依存性細胞傷害性を誘発する１つ以上の抗ＴＮＦ－α抗体が個体に提供される。ＴＮＦ－α突然変異体は、形質導入された細胞をインビボで追跡する方法としても使用され得る。
【選択図】 図２Ａ
【解決手段】 本開示の実施形態は、非分泌型かつ膜結合性であり、それにより、突然変異体を発現する細胞における阻害のための標的を提供する、特定のＴＮＦ－α突然変異体を包含する。特定の実施形態では、ＴＮＦ－α突然変異体は、個体に対する養子細胞療法に使用される細胞において自殺遺伝子として利用され、所望の時点で、膜結合ＴＮＦ－αに結合し、細胞に対する補体依存性細胞傷害性を誘発する１つ以上の抗ＴＮＦ－α抗体が個体に提供される。ＴＮＦ－α突然変異体は、形質導入された細胞をインビボで追跡する方法としても使用され得る。
【選択図】 図２Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ以上の改変非分泌型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α突然変異ポリペプチドをコードする核酸及び１つ以上の治療用遺伝子産物をコードする核酸を含む形質導入細胞を含む、組成物。
【請求項2】
前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドが、配列番号８と比較して以下の：アミノ酸残基１及びアミノ酸残基１２；
アミノ酸残基１及びアミノ酸残基１３；
アミノ酸残基１～１２；
アミノ酸残基１～１３；又は
アミノ酸残基－１～１３
の欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記治療用遺伝子産物が改変受容体である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記改変受容体が、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン受容体、ホーミング受容体又はケモカイン受容体である、請求項１、２又は３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記改変受容体が癌抗原を標的とする、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項6】
前記改変受容体が、１つ以上の同時刺激ドメインを含むＣＡＲである、請求項３～５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記１つ以上の同時刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０又はそれらの組み合わせの同時刺激ドメインを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドをコードする核酸及び前記治療用遺伝子産物をコードする核酸が同じ核酸分子である、請求項１～７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドをコードする核酸及び前記治療用遺伝子産物をコードする核酸が異なる核酸分子である、請求項１～７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記核酸分子がベクターである、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項11】
前記ベクターがウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記非ウイルスベクターが、プラスミド、脂質又はトランスポゾンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項14】
前記細胞が免疫細胞又は幹細胞である、請求項１～１３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項15】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞又は間葉系間質細胞である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号３９又は配列番号４１を含む、請求項１～１５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項17】
前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号３８又は配列番号４０を含む配列によってコードされる、請求項１～１６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項18】
前記細胞が、外来から提供されるサイトカインを発現する、請求項１～１７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項19】
前記サイトカインが、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１又はそれらの組み合わせである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記サイトカインが、前記ＴＮＦ－α突然変異体遺伝子と同じベクターからコードされる、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記サイトカインが、前記ＴＮＦ－α突然変異体とは別個のポリペプチド分子として、及び前記細胞の改変受容体とは別個のポリペプチド分子として発現される、請求項１８～２０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項22】
前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドが、ＴＮＦ受容体への前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドの結合を妨げる１つ以上のさらなる突然変異を欠く、請求項１～２１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項23】
改変非分泌型ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドを発現する形質導入細胞に対して死を誘導する方法であって、前記形質導入細胞上の前記ＴＮＦ－α突然変異体に結合する少なくとも１つの薬剤の有効量を提供する段階を含む、方法。
【請求項24】
ＴＮＦ－αに結合する薬剤が、抗体、小分子、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞が改変受容体をさらに発現する、請求項２３～２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記改変受容体がＴ細胞受容体又はＣＡＲである、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記改変受容体が癌抗原を標的とする、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
医学的状態を有する個体においてインビボで行われ、前記個体に、複数の形質導入細胞を含む前記医学的状態のための治療が提供される、請求項２３～２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記医学的状態が癌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記薬剤が、前記治療からの１つ以上の有害事象の発症時に前記個体に提供される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項32】
前記個体が、サイトカイン放出症候群、神経毒性、アナフィラキシー／アレルギー及び／又はオンターゲット／オフ腫瘍毒性の１つ以上の症状を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記個体に、前記医学的状態のためのさらなる治療が提供されたことがある、提供されている、及び／又は提供されるであろう、請求項２９～３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドが、ＴＮＦ受容体への前記ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドの結合を妨げる、又は逆シグナル伝達を妨げる１つ以上のさらなる突然変異を欠く、請求項２３～３３の何れか１項に記載の方法。
【請求項35】
非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体を発現する細胞を用いた細胞療法を受けたことがある及び／又は受けている個体におけるサイトカイン放出症候群の影響を軽減する方法であって、前記突然変異体に結合して、前記個体において、（ａ）前記細胞療法の細胞の少なくとも一部の排除；及び（ｂ）可溶性ＴＮＦ－αのレベルの低下を引き起こす１つ以上の薬剤の有効量を提供する段階を含む、方法。
【請求項36】
個体に対する細胞療法の毒性のリスクを低下させる、方法であって、非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体を発現するように前記細胞療法の細胞を修飾する段階を含む、方法。
【請求項37】
前記細胞療法が癌のためである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記細胞療法が、抗原を標的とする改変受容体を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項39】
非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体をコードし、そして改変受容体をコードする配列を含む、ベクター。
【請求項40】
請求項３９に記載のベクターであって、前記非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体及び前記改変受容体が、別個のポリペプチドとして前記ベクターからコードされる、ベクター。
【請求項41】
前記非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体をコードするベクターの配列及び前記改変受容体をコードするベクターの配列が、２Ａエレメント又はＩＲＥＳエレメントによって前記ベクター上で分離される、請求項３９又は４０に記載のベクター。
【請求項42】
前記改変受容体がＣＡＲである、請求項３９～４１の何れか１項に記載のベクター。
【請求項43】
サイトカインをさらにコードする、請求項３９～４２の何れか１項に記載のベクター。
【請求項44】
前記サイトカインが、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８又はＩＬ－２１である、請求項４３に記載のベクター。
【請求項45】
請求項４３又は４４に記載のベクターであって、前記サイトカインが、ＴＮＦ－α突然変異体及び前記改変受容体とは別個のポリペプチドとして前記ベクターから発現される、ベクター。
【請求項46】
組成物として、配列番号１５を含む核酸配列。
【請求項47】
組成物として、配列番号１６を含む核酸配列。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６２／７６９，４０５号；２０１８年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７７３，３７２号；及び２０１９年１月１１日出願の米国仮特許出願第６２／７９１，４６４号の優先権を主張し、これら出願は全て、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表）
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。２０１９年１１月１３日作成のＡＳＣＩＩコピーの名称はＵＴＦＣ＿Ｐ１１５１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１０８，１３０バイトである。
（技術分野）
本願は、２０１８年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６２／７６９，４０５号；２０１８年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７７３，３７２号；及び２０１９年１月１１日出願の米国仮特許出願第６２／７９１，４６４号の優先権を主張し、これら出願は全て、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表）
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。２０１９年１１月１３日作成のＡＳＣＩＩコピーの名称はＵＴＦＣ＿Ｐ１１５１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１０８，１３０バイトである。
（技術分野）
【0002】
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学、細胞療法及び医学の分野を包含する。
【背景技術】
【0003】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入Ｔ細胞を用いた養子細胞療法は、サイトカイン放出症候群及び神経毒性、並びにオンターゲット／オフ腫瘍毒性などの重篤な有害事象の報告に関連している。養子細胞療法で処置を受ける患者数が増加しているので、毒性に直面する養子注入された細胞の選択的欠失を可能にする安全機構の組み込みは有用である。
【0004】
本開示は、細胞療法のための安全機構の技術分野における長年にわたるニーズ対する解決策を提供する。
【発明の概要】
【0005】
本開示の実施形態は、細胞療法を制御するための安全機構を含む、細胞療法に関連する系、方法及び組成物に関する。特定の実施形態では、その使用を制御し、所望の事象及び／又は時間での細胞療法の制御可能な終了を可能にするために、何らかの種類の細胞療法とともにユニークな自殺遺伝子を利用する。自殺遺伝子は、必要に応じて形質導入細胞に対して死を誘導する目的で形質導入細胞において使用される。特定の実施形態では、自殺／枯渇遺伝子は、ＴＮＦ－α変換酵素（ＴＡＣＥとも呼ばれる）などの自然界でＴＮＦを切断する標準的な酵素によって切断不可能な腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α変異体である。従って、ＴＮＦ－α変異体は、特定の実施形態では、膜結合型であり、不活性であり、非分泌型である。本開示のＴＮＦ－α変異体は、細胞の表面上のＴＮＦ－α変異体への薬剤の結合後に細胞が死滅するように、少なくとも１つの抗体を含む変異体に結合する１つ以上の薬剤によって標的化可能である。本開示の実施形態によって、ＴＮＦ－α変異体を、それを発現する細胞に対するマーカーとして利用することが可能になる。
【0006】
本開示の実施形態は、１つ以上の改変非分泌型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α変異ポリペプチドをコードする核酸及び１つ以上の治療用遺伝子産物をコードする核酸を含む形質導入細胞を含む組成物を含む。特定の実施形態では、ＴＮＦ－α変異ポリペプチドは、配列番号８に対して以下の欠失を含む：アミノ酸残基１及びアミノ酸残基１２；アミノ酸残基１及びアミノ酸残基１３；アミノ酸残基１～１２；アミノ酸残基１～１３；又はアミノ酸残基１～１４。本組成物の治療用遺伝子産物は、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン受容体、ホーミング受容体又はケモカイン受容体などの改変受容体であってもよいし、又はそうでなくてもよい。改変受容体の何れも、癌抗原などの抗原を標的としてもよいし、又はしなくてもよい。改変受容体がＣＡＲである場合、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２又はその両方などの１つ以上の同時刺激ドメインを含んでもよいし、又は含まなくてもよい。
【0007】
ＴＮＦ－α変異ポリペプチドをコードする核酸及び治療用遺伝子産物をコードする核酸は異なる核酸分子であり得るものの、特定の実施形態では、ＴＮＦ－α変異ポリペプチドをコードする核酸及び治療用遺伝子産物をコードする核酸は同じ核酸分子である。何れの場合も、核酸分子は、ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター）又は非ウイルスベクター、例えばプラスミド、脂質、トランスポゾン又はそれらの組み合わせを含むものなど、を含むベクターであり得る。
【0008】
本開示の組成物の形質導入細胞は、例えば免疫細胞又は幹細胞であり得る。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞又は間葉系間質細胞が挙げられる。細胞は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１又はそれらの組み合わせなどの１つ以上の外から提供されるサイトカインを発現してもよいし、又はしなくてもよい。サイトカインは、ＴＮＦ－α変異遺伝子と同じベクターからコードされてもよいし、又はコードされなくてもよい。特定の場合には、サイトカインは、ＴＮＦ－α変異体として、及び細胞の改変された受容体として、別個のポリペプチド分子として発現される。
【0009】
本開示の特定の実施形態では、ＴＮＦ－α変異ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号３９を含む。ＴＮＦ－α変異ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号３８を含む配列によってコードされ得る。特定の態様では、ＴＮＦ－α変異ポリペプチドは、ＴＮＦ受容体へのＴＮＦ－α変異ポリペプチドの結合を妨げる１つ以上のさらなる変異を欠く。
【0010】
本開示の実施形態は、少なくとも改変非分泌型ＴＮＦ－α変異ポリペプチドを発現し、任意選択により、改変受容体などの治療用遺伝子を発現する形質導入細胞に対して死を誘導する方法であって、形質導入細胞上のＴＮＦ－α変異体に結合する有効量の少なくとも１つの薬剤を提供する段階を含む方法を含む。ＴＮＦ－αに結合する薬剤は、例えば、抗体、小分子、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせであり得る。薬剤が抗体である場合、抗体は、少なくともモノクローナル抗体を含むあらゆる種類のものであり得る。本方法では、細胞は、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン受容体、ホーミング受容体又はケモカイン受容体を含む、改変受容体をさらに発現し得る。改変受容体の何れも、癌又は他の抗原に結合し得る。具体的な場合において、本方法は、医学的状態を有する個体において、また、個体に、複数の形質導入細胞を含む医学的状態のための治療剤が提供されている場合、インビボで行われる。医学的状態はあらゆる種類であり得るが、特定の場合には、医学的状態は癌である。本薬剤は、治療からの１つ以上の有害事象の発症時、又は有害事象の発生が疑われるときに、個体に提供され得る。個体は、サイトカイン放出症候群、神経毒性、アナフィラキシー／アレルギー及び／又はオンターゲット／オフ腫瘍毒性の１つ以上の症状を示し得る。いくつかの場合において、個体には、医学的状態のためのさらなる治療剤が提供されたことがある、提供される及び／又は提供されるであろう。本開示の特定の態様では、ＴＮＦ－α変異ポリペプチドは、ＴＮＦ受容体へのＴＮＦ－α変異ポリペプチドの結合を妨げるか又は逆シグナル伝達を妨げる、１つ以上のさらなる変異を欠くか又は含む。
【0011】
本開示の実施形態は、非分泌型ＴＮＦ－α変異体を発現する細胞を用いた細胞療法を受けたことがある及び／又は受けている個体におけるサイトカイン放出症候群の影響を軽減する方法であって、変異体に結合して、個体において（ａ）細胞療法の細胞の少なくとも一部の排除；及び（ｂ）可溶性ＴＮＦ－αレベルの低下を引き起こす、有効量の１つ以上の薬剤を提供する段階を含む方法を含む。
【0012】
本開示の実施形態は、非分泌型ＴＮＦ－α変異体を発現するように細胞療法の細胞を修飾する段階を含む、個体に対する細胞療法の毒性リスクを低下させる方法を含む。細胞療法は、例えば癌に対するものであり得る。細胞療法は、抗原を標的とする改変受容体を含み得る。
【0013】
特定の実施形態は、非分泌型ＴＮＦ－α変異体をコードする、及び改変受容体をコードする配列を含むベクターを含む。非分泌型ＴＮＦ－α変異体及び改変受容体は、別個のポリペプチドとしてベクターからコードされてもよいし、又はコードされなくてもよい。特定の場合には、非分泌型ＴＮＦ－α変異体をコードするベクターの配列及び改変受容体をコードするベクターの配列は、２Ａエレメント又はＩＲＥＳエレメントによってベクター上で分離される。ベクターは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－７又はＩＬ－２１などのサイトカインをさらにコードしてもよいし、又はコードしなくてもよい。サイトカインは、ＴＮＦ－α変異体及び改変受容体として別個のポリペプチドとしてベクターから発現され得る。
【0014】
本開示の実施形態は、配列番号１５又は配列番号１６を含む核酸配列を含む物質の組成物を含む。
【0015】
本発明の一実施形態に関して論じられる何らかの限定は、本発明の何らかの他の実施形態に適用され得ることが特に企図される。さらに、本発明の何れの組成物も、本発明の何れかの方法で使用され得、本発明の何れの方法も、本発明の何れかの組成物を作製又は利用するために使用され得る。実施例で記載される実施形態の態様はまた、要約、詳細な説明、特許請求の範囲及び図面の簡単な説明など、異なる実施例の他の場所又は本願の他箇所で論じられる実施形態の文脈で実施され得る実施形態でもある。
【0016】
続く発明を実施するための形態がより良好に理解され得るように、前述の説明で本開示の特性及び技術的な長所をかなり広く概説してきた。本明細書中の特許請求の範囲の主題を形成するさらなる特性及び利点を以下で説明する。当業者により当然認識されるはずであるが、開示される概念及び具体的な実施形態は、本設計の同じ目的を遂行するための他の構造を修飾又は設計するための基礎として、容易に利用され得る。当業者によりまた理解されるはずであるが、このような同等の構築は、添付される特許請求の範囲に記載のような精神及び範囲から逸脱しない。添付の図面と関連付けて考える場合、次の記載から、さらなる目的及び長所と一緒に、操作のその機構及び方法の両方に関して、本明細書中で開示される設計の特徴であると考えられる新規特性がより良好に理解されよう。しかし、例示及び記載の目的でのみ、図面のそれぞれが提供され、本開示の制限の定義として意図するものではないことが明らかに理解されるはずである。
【0017】
本開示のより完全な理解のために、ここで、添付の図面と組み合わせて解釈される次の記載を参照する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１は、膜切断部位を除去するためにＴＮＦ－αを変異させる実験計画の一例である。Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）は、ＴＮＦ－αの細胞外部分の１位のバリン及び１２位のプロリンの欠失の結果、生物学的に活性であるが切断不可能なＴＮＦ－αをもたらすことを報告した。左パネルの下線付きヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の２２９～２７９位に対応する変異誘発中の欠失ヌクレオチドを示す。野生型プライマーＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧは配列番号４２であり、Ｄｅｌ ＶＡＬ１変異プライマーＴＣＧ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＧＧ－３は配列番号４３であり、ＣＰ４９６オリゴヌクレオチドＴＧＡ ＴＣＴ ＴＧＣ ＣＴＧは配列番号４４である。野生型プライマーＴＡＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＡＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＴは配列番号４５であり、Ｄｅｌ ＰＲＯ １２変異プライマーＴＡＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＧＧ ＧＧＴは配列番号４６であり、ＣＰ４９８オリゴヌクレオチドＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＣは配列番号４７である。Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）配列ＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣは配列番号４８であり、配列ＱＡＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡは配列番号４９である。
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
本開示は、２０１８年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６２／７６９，４１４号明細書；２０１８年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７７３，３９４号明細書；及び２０１９年１月１１日出願の米国仮特許出願第６２／７９１４９１号を参照により本明細書中に組み込む。
【0031】
本明細書中で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という特定は１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合、「含む」という語と組み合わせて使用するとき、「ａ」又は「ａｎ」という語は１つ又は複数を意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも第２又はそれを超える意味であり得る。具体的な実施形態では、本開示の態様は、例えば本開示の１つ以上の配列「から本質的になり」得るか又はそれら「からなり」得る。本発明の一部の実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法段階及び／若しくは方法からなり得るか又はそれらから本質的になり得る。本明細書中に記載のあらゆる方法又は組成物が本明細書中に記載の何らかの他の方法又は組成物に関して実行され得ることが企図される。本願の範囲は、本明細書中に記載の工程、機構、製造、組成物、手段、方法及び段階の特定の実施形態に限定されるものではない。本明細書で使用される場合、「又は」及び「及び／又は」という用語は、互いに組み合わせて又は排他的に複数の構成要素を説明するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ及び／又はｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ及びｚ、」「（ｘ及びｙ）若しくはｚ」、「ｘ若しくは（ｙ及びｚ）」又は「ｘ若しくはｙ若しくはｚ」を指し得る。ｘ、ｙ又はｚは、実施形態から具体的に除外され得ることが特に企図される。
【0032】
本願を通して、「約」という用語は、値が値を決定するために使用されている装置又は方法に対する誤差の標準偏差を含むことを示すために、細胞及び分子生物学の領域におけるその明白であり通常の意味に従って使用される。
【0033】
本明細書中で使用される場合、「改変される」という用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクターなどを含む、人の手によって作製される実体を指す。少なくともいくつかの場合、改変実体は合成であり、天然には存在しないか、又は本開示で利用されるように構成されていない要素を含む。
【0034】
本明細書を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」若しくは「さらなる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載される特定の特性、構造又は特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の様々な箇所における前述の語句の出現は、必ずしも全て、同じ実施形態に言及するわけではない。さらに、特定の特性、構造又は特徴は、１つ以上の実施形態において何らかの適切な形式で組み合わせられ得る。
【0035】
Ｉ．一般的な実施形態
【0036】
本開示の実施形態は、細胞療法の終了をもたらす方法及び組成物に関する。本開示は、２６ｋｄのＴＮＦ－αの切断不可能な変異体に基づいて、細胞療法のためのマーカー部分及び自殺／枯渇部分の両方を提供する。ＴＮＦ－α変異体は切断不可能であり、膜に結合したままであり、分泌不可能である。切断不可能なＴＮＦ－α変異体を発現する細胞は、例えば、病院で現在、エタネルセプト、インフリキシマブ又はアダリルマブなどの、ＦＤＡ承認済みＴＮＦ－α抗体を使用することを含む、選択的欠失を標的とし得る。変異ＴＮＦ－αポリペプチドは、ＴＣＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子などの１つ以上の治療導入遺伝子と同時発現され得る。さらに、ＴＮＦ－α変異体発現細胞は、膜結合ＴＮＦ－αタンパク質の生物学的活性が介在する腫瘍標的に対して優れた活性を有する。
【0037】
ＩＩ．ＴＮＦ－α変異体
【0038】
本開示は、特定の細胞におけるその発現が、変異体に結合する薬剤により変異ＴＮＦが標的化されるようになることを可能にし、それにより、特定のＴＮＦ－α変異体を有する細胞に対して死滅を引き起こす、ＴＮＦ－αの変異体を包含する。特定の実施形態では、変異ＴＮＦ－αポリペプチドは、１つ以上の変異のために切断不可能かつ分泌不可能であり、そのような切断不可能かつ分泌不可能なポリペプチドは、変異ＴＮＦ－αを膜結合型にする。細胞における膜結合ＴＮＦ－αの会合は、膜結合ＴＮＦ－αが、阻害剤を含む、それに直接又は間接的に結合する薬剤によって標的化される場合に、細胞を死滅させることを可能にする。ＴＮＦ－α阻害剤が抗体である実施形態では、細胞は補体依存性細胞傷害によって死滅し得、ＴＮＦ－α阻害剤が抗体ではない実施形態では、細胞はアポトーシスなどの別の機序によって死滅し得る。
【0039】
従って、変異体の特定の実施形態では、膜切断部位が除去され、それによって細胞上の表面発現が保持され、細胞が破壊に対する標的となることが可能になる。従って、本開示は、形質導入された細胞の選択的欠失のための自殺遺伝子としての変異体膜結合ＴＮＦ－αを企図する。
【0040】
ＴＮＦ－αは、２６ｋＤの膜貫通形態及び１７ｋＤの分泌成分を有する。本明細書中の図１（Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）からの右パネル）は、本開示により包含されるいくつかの変異体を示す。特定の実施形態では、本開示のＴＮＦ－α変異体の例は、１７ｋＤのＴＮＦに対して少なくとも以下を含む：（１）Ｖａｌ１の欠失及びＰｒｏｌ１２の欠失；（２）Ｖａｌ１３の欠失；（３）Ｖａｌ１の欠失及びＶａｌ１３の欠失；（４）Ｖａｌ１～Ｐｒｏｌ１２までの欠失及びまたＶａｌ１３の欠失（１３個のａａ欠失）；（５）Ａｌａ－３～Ｖａｌ１３までの欠失（１６個のａａ欠失）；（６）Ａｌａ－１～Ｖａｌ１３までの欠失（１４個のａａ欠失）。特定の実施形態では、ＴＮＦ－α変異体は、－３、－２、－１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又はそれらの組み合わせの位置の個々のアミノ酸の欠失を含む。特定の組み合わせには、－３～１３まで；－３～１２まで；－３～１１まで；－３～１０まで；－３～９まで；－３～８まで；－３～７まで；－３～６まで；－３～５まで；－３～４まで；－３～３まで；－３～２まで；－３～１まで；－３～－１まで；－３～－２まで；－２～１３まで；－２～１２まで；－２～１１まで；－２～１０まで；－２～９まで；－２～８まで；－２～７まで；－２～６まで；－２～５まで；－２～４まで；－２～３まで；－２～２まで；－２～１まで；－２～－１まで；－１～１３まで；－１～１２まで；－１～１１まで；－１～１０まで；－１～９まで；－１～８まで；－１～７まで；－１～６まで；－１～５まで；－１～４まで；－１～３まで；－１～２まで；－１～１まで；１～１３まで；１～１２まで；１～１１まで；１～１０まで；１～９まで；１～８まで；１～７まで；１～６まで；１～５まで；１～４まで；１～３まで；１～２までなどの位置での欠失が含まれる。
【0041】
ＴＮＦ－α変異体は、何らかの適切な方法によって作製され得るが、特定の実施形態では、これらは部位特異的変異誘発によって作製される。いくつかの場合、ＴＮＦ－α変異体は、タンパク質を切断不能にする変異以外の変異を有し得る。特定の場合において、ＴＮＦ－α変異体は、Ｖａｌ１、Ｐｒｏ１２及び／若しくはＶａｌ１３又はそれらの間の領域における欠失以外の１、２、３個又はそれを超える変異を有し得る。変異体を分泌不可能にするもの以外の変異は、アミノ酸置換、欠失、付加、逆位などのうち１つ以上であり得る。さらなる変異がアミノ酸置換である場合、置換は、例えば保存的アミノ酸に対するものであってもよいし又はそうでなくてもよい。いくつかの場合、１、２、３、４、５個又はそれを超えるさらなるアミノ酸が、タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に存在し得る。いくつかの場合、ＴＮＦ－α変異体は、（１）変異体を非分泌型にする１つ以上の変異；（２）変異体に対するアウトサイドインシグナル伝達を妨げる１つ以上の変異；並びに／又は（３）変異体のＴＮＦ受容体１及び／若しくはＴＮＦ受容体２への結合を妨害し、それらを不活性にする１つ以上の変異を有する。
【0042】
ＴＮＦ－α変異体ｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌＰｒｏｌ１２アミノ酸配列
【0043】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQARSSSRTPSDKVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号1)
【0044】
ＴＮＦ－α変異体ｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌＰｒｏｌ１２核酸配列
【0045】
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcaagatcatcttctcgaaccccgagtgacaaggtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg(配列番号2)
【0046】
ＴＮＦ－α変異体ｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌＰｒｏｌ１３アミノ酸配列（１３アミノ酸欠損）
【0047】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号3)
【0048】
ＴＮＦ－α変異体ｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌＰｒｏｌ１３（１３アミノ酸欠損）核酸配列
【0049】
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg(配列番号4)
【0050】
ＴＮＦ－αｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌＰｒｏｌ１３アミノ酸配列
【0051】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQARSSSRTPSDKPAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号5)
【0052】
ＴＮＦ－αｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌＰｒｏｌ１３核酸配列
【0053】
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcaagatcatcttctcgaaccccgagtgacaagcctgcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg(配列番号6)
【0054】
ＴＮＦ－αｄｅｌＡｌａ－３からＶａｌ１３核酸配列
【0055】
TCGAGTCGAGATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGCAGGCAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCgACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTCGTCG(配列番号38)
【0056】
ＴＮＦ－αｄｅｌＡｌａ－３およびｄｅｌＶａｌ１からＶａｌ１３ アミノ酸配列（ｄｅｌ－３およびｄｅｌ１－１３（ここで、－２および－１の欠損はない））：
【0057】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLQAAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号39)
【0058】
outside-in シグナリングを阻害するCIKモチーフ変異の一例とTNFαのTNF受容体1およびTNF受容体2への結合を干渉する変異に加えてTNF-α 変異体del Ala-3からVal13核酸配列(図１０参照)
【0059】
ATGAGCACTGAAATGCATCCCGGAAGGGGGTCCTGGCACGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTTCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCCACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTTCGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCATCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCTACTTTGCCGAGTATGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTCG (配列番号40)
【0060】
配列表の配列番号４０でコードされるTNF-α変異体del Ala-3からVal13アミノ酸配列
【0061】
MSTEMHPGRGSWHEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFFLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSHQTKVNLLFAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLIAEINRPDYLYFAEYGQVYFGIIALS(配列番号41)
【0062】
特定の実施態様において、TNF-α変異体は、Ala-3からVal13の欠損を含みうるが、CIKモチーフ変異および受容体1および/またはTNF受容体2との結合を干渉する変異を含まない。
【0063】
参考のために、TNF野生型、26kD版アミノ酸配列
【0064】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号7)
【0065】
参考のために、TNF野生型17kD版アミノ酸配列
【0066】
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号8)
【0067】
細胞内TNFシグナル伝達能力又はTNF-受容体結合能力を欠くTNF-α変異体
【0068】
これらの変異体は、細胞質シグナル伝達ドメインおよび／またはＴＮＦ受容体結合領域に変異を有し、したがって、それぞれ、逆シグナル伝達能力および／またはＴＮＦ受容体に結合する能力を欠くため、生物学的活性を発揮しない。これにより、コンストラクト内のTNF-αをTNF阻害剤の標的にすることができるが、生物学的活性は発揮されない。
【0069】
本開示のいくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α変異体は、ＴＮＦ－α変異体が細胞内シグナル伝達（逆シグナル伝達）を発揮できないように、ＴＮＦ－αの細胞質内ドメインの一部または全部を欠いている。分泌不可能なＴＮＦ－α変異体は、細胞質内ドメインの一部または全部を欠くように変異している場合と変異していない場合がある。
【0070】
図９は、ＴＮＦ－αのいくつかの構造を提供する。図９に示すように、細胞質内ドメインは、ＭＳＴＥＳＭＩＲＤＶＥＬＡＥＥＡＬＰＫＫＴＧＧＰＱＧＳＲＲＣＬＦＬ（配列番号１７）を含む。カゼインキナーゼI（CKI）部位はSTES（配列番号18）である。膜貫通ドメインはFSFLIVAGATTLFCLLHFGVI（配列番号19）である。SPPL2b切断部位はSL/LIである。リンカーは、GPQREEFPRDLSLISPLAQA（配列番号20）を含む。TACEの切断部位はVRSSSRTPSDKPV（配列番号21）である。P01375は、タンパク質のUniProt番号を示す。図９の配列は、ＴＮＦタンパク質の一部のみを指す。
【0071】
それぞれ、ＣＫＩモチーフ（下線が引かれた変異配列）のＴＮＦ－α変異体の核酸およびアミノ酸の特定の例は以下の通りである：
【0072】
atgagcactgaaaTGCATCCCGGAAGGGGGTCCTGGCACgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgcg(配列番号22)
【0073】
MSTEMHPGRGSWHEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号23)
【0074】
細胞質内配列のM-71Kに変異があり、Y87Hに別の変異（変異配列に下線が引かれている）があるＴＮＦ－α変異体のそれぞれ核酸とアミノ酸の一例は次のとおりである。
【0075】
atgagcactgaaagcaAgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctccCaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg(配列番号24)
【0076】
MSTESKIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSHQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号25)
【0077】
それぞれS95FおよびC-28F（下線が引かれた変異配列）に変異を有するTNF-α変異体の核酸およびアミノ酸についての一例は、以下の通りである。
【0078】
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctTcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctTCgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg (配列番号26)
【0079】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFFLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLFAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号27)
【0080】
S133IおよびS147Y（下線が引かれた変異配列）に変異を有するTNF-α変異体の核酸およびアミノ酸についてそれぞれの一例は、以下の通りである：
【0081】
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcaTcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtAtgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg(配列番号28)
【0082】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLIAEINRPDYLDFAEYGQVYFGIIAL (配列番号29)
【0083】
Asp143Tyrに変異があり、１位にAlaが欠失しているTNF-α変異体（下線が引かれた変異配列および取り消し線で示される欠失配列）の核酸およびアミノ酸について、それぞれ、一例は次のとおりである。
【0084】
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcTactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg (配列番号30)
【0085】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLYFAESGQVYFGIIAL (配列番号31)
【0086】
欠損した配列を欠く配列番号３０および配列番号３１の版は、それぞれ以下の通りである（変異した配列にはまだ下線が引かれている）
【0087】
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctgcaggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcTactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg(配列番号32)
【0088】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLYFAESGQVYFGIIAL(配列番号33)
【0089】
CIKモチーフ変異と上記の変異の組み合わせを有するTNF-α変異体の一例は以下の通りであり、変異には下線が引かれている。
【0090】
ATGCTCGAGtcgagatgagcactgaaaTGCATCCCGGAAGGGGGTCCTGGCACgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctTcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctccCaccagaccaaggtcaacctcctctTCgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcaTcgctgagatcaatcggcccgactatctcTactttgccgagtAtgggcaggtctactttgggatcattgccctgtcg(配列番号34)
【0091】
MSTEMHPGRGSWHEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFFLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSHQTKVNLLFAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLIAEINRPDYLYFAEYGQVYFGIIAL (配列番号35)
【0092】
治療遺伝子
【0093】
場合によっては、ＴＮＦ－α変異体を発現する細胞は、１つまたは複数の治療遺伝子も発現し得る。複数の治療遺伝子が使用される場合、治療遺伝子は同じタイプの分子である場合とそうでない場合がある。例えば、ＴＮＦ－α変異体に加えて、単一の細胞はまた、改変された受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、ホーミング受容体、ケモカイン受容体、またはそれらの組み合わせを発現し得る。ここに含まれるのは、治療用遺伝子核酸；ポリペプチドを含む治療用遺伝子産物；治療遺伝子核酸を含むベクター；およびそのいずれかを収容する細胞である。
【0094】
特定の実施形態では、変異体は、治療用導入遺伝子を含む少なくとも１つの治療用遺伝子と同時発現される。治療用導入遺伝子はあらゆる種類のものであり得るが、特定の実施形態では、これは改変受容体をコードする。改変受容体の例としては、少なくともＴ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、ホーミング受容体又はそれらの組み合わせが挙げられる。何らかの改変受容体は、癌抗原（腫瘍抗原など）を含む抗原などの何らかの特定のリガンドを標的とし得る。癌抗原は、処置しようとする特定の癌に関連し、癌の特異的排除のために標的化されることが望ましいものを含む、あらゆる種類のものであり得る。
【0095】
治療用遺伝子産物が改変受容体である場合、受容体は、腫瘍抗原などの何らかの抗原を標的とし得る抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、例えばｓｃＦｖを含み得る。抗原性分子は、例えば、感染性病原体、自己（ａｕｔｏ）／自己（ｓｅｌｆ）抗原、腫瘍／癌関連抗原又は腫瘍ネオアンチゲンに由来し得る。標的とされ得る抗原の例としては、Ｂ細胞上で発現される抗原；癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、生殖細胞腫瘍及び芽細胞腫上で発現される抗原；様々な免疫細胞上で発現される抗原；並びに様々な血液疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患に関連する細胞上で発現される抗原が挙げられるが限定されない。標的とするための特異的抗原の例としては、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ９９、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、４－１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲＳ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ（ｈｕｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ 受容体 ｋｉｎａｓｅ）、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリン－α５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦ β２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン及びそれらの組み合わせが挙げられる。本開示の方法及び組成物で利用され得るあらゆる抗原受容体は、上記の抗原の何れか１つ、又は１つ以上の他のものを標的とし得、このような抗原受容体はＣＡＲ又はＴＣＲであり得る。治療用の同じ細胞は、特定の実施形態では、ＣＡＲとＴＣＲの両方を利用し得る。
【0096】
治療用遺伝子がＣＡＲをコードする場合、ＣＡＲは、例えば、第１世代、第２世代又は第３世代若しくはそれ以降の世代であり得る。ＣＡＲは、２つ以上の異なる抗原に対して二重特異性であってもよいし又はそうでなくてもよい。ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメインを含み得る。各同時刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０又はそれらの組み合わせの何れか１つ以上の同時刺激ドメインを含み得る。特定の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ３ζを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の特異的同時刺激ドメインを欠き；例えば、ＣＡＲは４－１ＢＢを欠き得る。
【0097】
特定の実施形態では、ＣＡＲは同時刺激ドメインとして少なくともＤＡＰ１２を含み、特定の態様では、ＣＡＲポリペプチドは特定のＤＡＰ１２アミノ酸配列を含むか、又は特定のＤＡＰ１２核酸配列によってコードされる。例は以下の通りである。
【0098】
ＤＡＰ１２アミノ酸配列
【0099】
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (配列番号9)
【0100】
ＤＡＰ１２核酸配列
【0101】
ATGGGGGGACTTGAACCCTGCAGCAGGCTCCTGCTCCTGCCTCTCCTGCTGGCTGTAAGTGGTCTCCGTCCTGTCCAGGCCCAGGCCCAGAGCGATTGCAGTTGCTCTACGGTGAGCCCGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCCCTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAATGA (配列番号10)
【0102】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインとして少なくともＣＤ２８を含み、特定の態様では、ＣＡＲポリペプチドは、特定のＣＤ２８アミノ酸配列を含むか、または特定のＣＤ２８コード配列によってコードされる。それらの例は次のとおりである。
【0103】
ＣＤ２８ アミノ酸配列
【0104】
KFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRG (配列番号11)
【0105】
ＣＤ２８核酸配列
【0106】
ATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCG (配列番号12)
【0107】
特定の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結する細胞外スペーサードメインを含む。細胞外スペーサードメインには、抗体のＦｃフラグメントまたはそのフラグメントまたは誘導体、抗体のヒンジ領域またはそのフラグメントまたは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。細胞外スペーサードメインの例には、ＣＤ８－αヒンジ、Ｇｌｙ３などのポリペプチドで作られた人工スペーサー、またはＩｇＧのＣＨ１、ＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４など）が含まれるが、これらに限定されない。特定の場合において、細胞外スペーサードメインは、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８-αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、または（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２、またはそれらの組み合わせを含みうる。
【0108】
特定の実施形態では、ヒンジはＩｇＧ１に由来し、特定の態様では、ＣＡＲポリペプチドは、特定のＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列を含むか、または特定のＩｇＧ１ヒンジ核酸配列によってコードされる。例は次のとおりである。
【0109】
IgG1 ヒンジアミノ酸配列
【0110】
SYVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK (配列番号13)
【0111】
IgG1 ヒンジ核酸配列
【0112】
GTACGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATC (配列番号14)
【0113】
ＩＶ. ベクター
【0114】
ＴＮＦ－α変異体は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含む任意の適切なベクターによってレシピエント細胞に送達され得る。ウイルスベクターの例には、少なくともレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。非ウイルスベクターの例には、少なくともプラスミド、トランスポゾン、脂質、ナノ粒子などが含まれる。
【0115】
細胞がＴＮＦ－α変異体をコードするベクターで形質導入され、治療遺伝子産物などの別の遺伝子の細胞への形質導入も必要とする場合、ＴＮＦ－α変異遺伝子および治療遺伝子は、同じベクターに含まれる場合と含まれない場合がある。場合によっては、ＴＮＦ－α変異遺伝子と治療遺伝子は、同じウイルスベクター分子などの同じベクター分子から発現される。このような場合、ＴＮＦ－α変異遺伝子と治療遺伝子の発現は、同じ調節要素によって調節される場合とされない場合がある。ＴＮＦ－α変異遺伝子と治療遺伝子が同じベクター上にある場合、それらは別々のポリペプチドとして発現される場合とされない場合がある。それらが別個のポリペプチドとして発現される場合、それらは、例えば、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメントによってベクター上で分離され得る。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ－α変異体および治療用遺伝子産物は、融合タンパク質として産生される。
【0116】
特定の実施形態では、ＴＮＦ－α変異遺伝子は、マルチシストロン性ベクターから発現される。マルチシストロン性ベクターは、ＴＮＦ－α変異遺伝子に加えて、少なくとも１つの治療遺伝子をコードし得る。特定の実施形態において、マルチシストロン性ベクターは、ＴＮＦ－α変異体、およびＴ細胞受容体および／またはＣＡＲなどの少なくとも１つの改変された受容体をコードする。場合によっては、マルチシストロン性ベクターは、少なくとも１つのＴＮＦ－α変異体、少なくとも１つの操作された受容体、および少なくとも１つのサイトカインをコードする。サイトカインは、ヒトまたはマウスまたは任意の種などの特定のタイプのサイトカインであり得る。特定の場合、サイトカインはインターロイキン（ＩＬ）１５、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１８、および／またはＩＬ２１である。
【0117】
ＴＮＦ－α変異体ｄｅｌＶａｌ１ｄｅｌＰｒｏ１２をコードし、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＤ２８、およびＣＤ３ｚｅｔａを備えたＣＤ１９特異的ＣＡＲを個別にコードし、ＩＬ１５を個別にコードするベクターの核酸配列の一例は次のとおりである。
【0118】
AATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAAAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTATGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGACTGATTTTATGCGCCTGCGTCGGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCGGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTCGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGTCCTAAAATCCCGATCGTTTAGGACTCTTTGGTGCACCCCCCTTAGAGGAGGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATATGGGCCCGGGCTAGCCTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTGGGGTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCCCCATATGGCCATATGAGATCTTATATGGGGCACCCCCGCCCCTTGTAAACTTCCCTGACCCTGACATGACAAGAGTTACTAACAGCCCCTCTCTCCAAGCTCACTTACAGGCTCTCTACTTAGTCCAGCACGAAGTCTGGAGACCTCTGGCGGCAGCCTACCAAGAACAACTGGACCGACCGGTGGTACCTCACCCTTACCGAGTCGGCGACACAGTGTGGGTCCGCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTCGCTGGAAAGGACCTTACACAGTCCTGCTGACCACCCCCACCGCCCTCAAAGTAGACGGCATCGCAGCTTGGATACACGCCGCCCACGTGAAGGCTGCCGACCCCGGGGGTGGACCATCCTCTAGACTGCCATGCTCGAGATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACTGTCTCCTCGTACGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCA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(配列番号15)
【0119】
ＴＮＦ－α変異体ｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌ Ｐｒｏ１２をコードし、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＤ２８、およびＣＤ３ｚｅｔａを備えたＣＤ１９特異的ＣＡＲを個別にコードし、ＩＬ１５を個別にコードするベクターのアミノ酸配列の一例は次のとおりである。
【0120】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQARSSSRTPSDKVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIALSRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVSSYVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (配列番号36)
【0121】
ＴＮＦ－α変異体ｄｅｌＶａｌ１ ｄｅｌ Ｐｒｏ１２をコードし、ＩｇＧ１ヒンジ、ＤＡＰ１２、およびＣＤ３ｚｅｔａを備えたＣＤ１９特異的ＣＡＲを個別にコードし、ＩＬ１５を個別にコードするベクターの核酸配列の一例は次のとおりである。
【0122】
AATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAAAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTATGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGACTGATTTTATGCGCCTGCGTCGGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCGGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTCGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGTCCTAAAATCCCGATCGTTTAGGACTCTTTGGTGCACCCCCCTTAGAGGAGGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATATGGGCCCGGGCTAGCCTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTGGGGTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCCCCATATGGCCATATGAGATCTTATATGGGGCACCCCCGCCCCTTGTAAACTTCCCTGACCCTGACATGACAAGAGTTACTAACAGCCCCTCTCTCCAAGCTCACTTACAGGCTCTCTACTTAGTCCAGCACGAAGTCTGGAGACCTCTGGCGGCAGCCTACCAAGAACAACTGGACCGACCGGTGGTACCTCACCCTTACCGAGTCGGCGACACAGTGTGGGTCCGCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTCGCTGGAAAGGACCTTACACAGTCCTGCTGACCACCCCCACCGCCCTCAAAGTAGACGGCATCGCAGCTTGGATACACGCCGCCCACGTGAAGGCTGCCGACCCCGGGGGTGGACCATCCTCTAGACTGCCATGCTCGAGATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACTGTCTCCTCGTACGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGGCGTGCTGGCCGGAATCGTGATGGGCGACCTGGTGCTGACAGTGCTGATCGCCCTGGCTGTGTACTTCCTGGGCAGACTGGTGCCCAGAGGAAGAGGCGCTGCCGAAGCCGCCACCCGGAAGCAGAGAATCACCGAGACAGAGAGCCCCTATCAGGAACTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAATACCCAGCGGCCCTACTACAAACGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGACAATTGCGCGTCATCATCGATCCGGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCACACATGCAGCATGTATCAAAATTAATTTGGTTTTTTTTCTTAAGTATTTACATTAAATGGCCATAGTACTTAAAGTTACATTGGCTTCCTTGAAATAAACATGGAGTATTCAGAATGTGTCATAAATATTTCTAATTTTAAGATAGTATCTCCATTGGCTTTCTACTTTTTCTTTTATTTTTTTTTGTCCTCTGTCTTCCATTTGTTGTTGTTGTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTGGTTGGTTGGTTAATTTTTTTTTAAAGATCCTACACTATAGTTCAAGCTAGACTATTAGCTACTCTGTAACCCAGGGTGACCTTGAAGTCATGGGTAGCCTGCTGTTTTAGCCTTCCCACATCTAAGATTACAGGTATGAGCTATCATTTTTGGTATATTGATTGATTGATTGATTGATGTGTGTGTGTGTGATTGTGTTTGTGTGTGTGACTGTGAAAATGTGTGTATGGGTGTGTGTGAATGTGTGTATGTATGTGTGTGTGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGTGTGTGTGTGTGACTGTGTCTATGTGTATGACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTGAAAAAATATTCTATGGTAGTGAGAGCCAACGCTCCGGCTCAGGTGTCAGGTTGGTTTTTGAGACAGAGTCTTTCACTTAGCTTGGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTGCTCTTAGGAGTTTCCTAATACATCCCAAACTCAAATATATAAAGCATTTGACTTGTTCTATGCCCTAGGGGGCGGGGGGAAGCTAAGCCAGCTTTTTTTAACATTTAAAATGTTAATTCCATTTTAAATGCACAGATGTTTTTATTTCATAAGGGTTTCAATGTGCATGAATGCTGCAATATTCCTGTTACCAAAGCTAGTATAAATAAAAATAGATAAACGTGGAAATTACTTAGAGTTTCTGTCATTAACGTTTCCTTCCTCAGTTGACAACATAAATGCGCTGCTGAGCAAGCCAGTTTGCATCTGTCAGGATCAATTTCCCATTATGCCAGTCATATTAATTACTAGTCAATTAGTTGATTTTTATTTTTGACATATACATGTG (配列番号16).
【0123】
TNF-α変異体delVal1 del Pro12をコードし、IgG1ヒンジ、DAP12、およびCD3zetaを備えたCD19特異的CARを個別にコードし、IL15を個別にコードするベクターのアミノ酸配列の一例は次のとおりである。
【0124】
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQARSSSRTPSDKVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIALSRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVSSYVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (配列番号:37)
【0125】
Ｖ．細胞
【0126】
本開示の実施形態は、本明細書中に包含される１つ以上のＴＮＦ－α突然変異体を発現する細胞を包含する。細胞は、特定の実施形態では、１つ以上の改変非分泌型膜結合ＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドをコードする組み換え核酸を含む。特定の実施形態では、１つ以上のＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドを発現させることに加えて、細胞はまた、１つ以上の治療用遺伝子産物をコードする核酸も含む。核酸は、あらゆる種類のベクターであり得る。１つ以上のＴＮＦ－α突然変異ポリペプチドをコードする核酸は、１つ以上の治療用遺伝子産物をコードする同じ核酸分子であってもよいし又はそうでなくてもよい。
【0127】
本開示の細胞は、少なくともＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、ＭＳＣ又は少なくとも造血幹細胞、多能性胚性幹細胞若しくは胚性幹細胞を含むあらゆる種類の幹細胞を含む、あらゆる種類のものであり得る。
【0128】
細胞は、個体から直接得られ得るか、又は保管場所若しくは他の貯蔵施設から得られ得る。治療としての細胞は、治療として細胞が提供される個体に関して自己又は同種であり得る。
【0129】
細胞は、医学的状態のための治療を必要とする個体に由来し得、（例えば、養子細胞療法のための形質導入及び増殖のための標準的技術を使用した）ＴＮＦ－α突然変異体及び治療用遺伝子産物を発現させるためのそれらの操作の後、それらが最初に供給された個体に戻され得る。いくつかの場合では、細胞は、個体又は別の個体に後で使用するために保存される。
【0130】
１つ以上の改変受容体を有し、常在ＴＮＦ－α自殺遺伝子によって排除される必要があり得る細胞は、あらゆる種類のものであり得る。特定の実施形態では、細胞は、例えば養子細胞療法に利用されているものを含め、免疫細胞又は幹細胞である。免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞などであり得る。細胞は、細胞の集団に含まれ得、その集団は、大部分が１つ以上のＴＮＦ－α突然変異自殺遺伝子、又は１つ以上の改変受容体及び１つ以上のＴＮＦ－α突然変異自殺遺伝子の両方で形質導入されているものであり得る。細胞集団は、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の、１つ以上のＴＮＦ－α突然変異自殺遺伝子及び任意選択的に１つ以上の改変受容体により形質導入される細胞を含み得る。ＴＮＦ－α突然変異体及び改変受容体は、別個のポリペプチドである。
【0131】
細胞は、特定の目的に関してモジュール性であることを意図してＴＮＦ－α突然変異体自殺遺伝子とともに産生され得る。例えば、商業的流通用を含め、ＴＮＦ－α突然変異体を発現する（又はその後の形質導入のために突然変異体をコードする核酸とともに分配される）細胞が作製され得、使用者は、それらの意図される目的に応じて１つ以上の関心のある治療遺伝子を発現するようにそれらを修飾し得る。ほんの一例として、ＣＤ５陽性癌の処置に関心のある個体は、ＴＮＦ－α突然変異体発現細胞を得るか又は生成させ、それらがＣＤ５特異的ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現するように修飾し得る。或いは、ＣＤ５陽性癌の処置に関心のある個体は、形質導入しようとする細胞を得て、ＴＮＦ－α突然変異体をコードするベクターを得て、ＣＤ５特異的ＣＡＲもコードするようにベクターを修飾し、続いてその後、細胞の形質導入を行い得る。これらの実施形態は何れも、ＣＤ５以外の癌抗原に適用され得る。
【0132】
特定の実施形態では、ＴＮＦ－α突然変異体を発現する形質導入細胞のゲノムが修飾され得る。ゲノムは、あらゆる方式で修飾され得るが、特定の実施形態では、ゲノムは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集によって修飾される。細胞のゲノムは、自殺遺伝子としてのＴＮＦ－α突然変異体の有効性を高めるために、治療用遺伝子産物の使用の有効性を高めるために、又は別の目的のために修飾され得る。細胞において修飾され得る遺伝子の具体例としては、次のもの：ＡＤＡＭ１３／ＴＡＣＥのノックアウト、ＴＧＦ－β受容体１又は２などの腫瘍微小環境に対するＴＮＦ－α突然変異体発現細胞の耐性の上昇、ＩＤＯ、チェックポイント分子、例えばＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＫＬＲＧ１、ＴＩＭ３などが挙げられる。
【0133】
ＶＩ．自殺遺伝子としてのＴＮＦ－α突然変異体の使用
【0134】
特定の実施形態では、ＴＮＦ－α突然変異自殺遺伝子が使用される細胞は、例えばインビボで細胞に曝露された個体にとって有害である可能性を有する細胞である。細胞は、送達時又はその後に個体にとって毒性であり得、従って、細胞を排除可能であることの必要性は、細胞に対して一貫して存在し得る。例えば、インビボで個体において使用するための何らかのタイプの細胞療法は、細胞において開示されるＴＮＦ－α突然変異体を使用可能であり、必要に応じて細胞療法を終了させることが可能になる。細胞療法を受けている、及び／又は細胞療法を受けたことがある個体が、サイトカイン放出症候群、神経毒性、アナフィラキシー／アレルギー、及び／若しくはオンターゲット／オフ腫瘍毒性（例として）などの１つ以上の有害事象の１つ以上の症状を示すか、又は切迫していることを含め、１つ以上の症状を有するリスクがあると考えられる場合、細胞療法に対してＴＮＦ－α突然変異自殺遺伝子を利用し得る。自殺遺伝子としてのＴＮＦ－α突然変異体の使用は、治療のための計画されたプロトコールの一部であり得るか、又はその使用に対して認められた必要性がある場合にのみ使用され得る。いくつかの場合では、細胞療法がもはや必要とされないので、ＴＮＦ－α自殺遺伝子を標的とする薬剤の使用によって終了される。
【0135】
ＴＮＦ－α自殺遺伝子が利用される細胞は、特定の実施形態では、哺乳動物のための細胞療法用に改変された細胞であり得る。このような場合、細胞療法はあらゆる種類のものであり得、細胞はあらゆる種類のものであり得る。特定の実施形態では、細胞は、１つ以上の治療用遺伝子産物を発現するように改変された免疫細胞又は幹細胞である。特定の実施形態では、細胞は、細胞に対する１つ以上の改変受容体で形質導入される細胞である。改変受容体は、受容体に対するリガンドに結合することなどにより、標的化時に治療特性を細胞に付与し得る。特定の実施形態では、改変受容体は非天然であり、人工的に作製される。改変受容体は、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、ホーミング受容体、遺伝子編集細胞又はそれらの組み合わせを含むあらゆる種類のものであり得る。改変受容体は、一例として、少なくとも腫瘍抗原を含め、標的、特異的な抗原などに結合可能なように、改変され得る。改変受容体は、複数の抗原に対して二重特異性又は多重特異性であり得、いくつかの場合、形質導入された細胞が改変受容体を通じて複数の抗原を発現する細胞に結合することを可能にする。
【0136】
特定の実施形態では、ＴＮＦ－α突然変異体発現細胞に結合するために有効な量の１つ以上の薬剤を送達すると、ＴＮＦ－α突然変異体発現細胞の大部分が排除される。特定の実施形態では、ＴＮＦ－α突然変異体を発現する５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％超の細胞が個体において排除される。細胞を排除する必要性が認められた後、個体への薬剤の送達は、１つ以上の症状がもはや存在しなくなるまで、又は十分な数の細胞が排除されるまで継続し得る。個体における細胞数は、ＴＮＦ－α突然変異体をマーカーとして使用して監視され得る。
【0137】
本開示の方法の実施形態は、有効量の細胞療法を、それを必要とする個体に提供する第１の段階（ここで、細胞は、１つ以上の非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体を含む）；及び（何らかの機構による細胞死を通じて直接的又は間接的に）ＴＮＦ－α突然変異体を自殺遺伝子として使用して細胞を排除する第２の段階を含み得る。第２の段階は、個体に対する少なくとも１つの有害事象の発症時に引き起こされ得、その有害事象は、細胞療法の開始から継続的であってもよいし又は継続的でなくてもよい日常的監視を含む何らかの手段によって認識され得る。有害事象は、検査及び／又は試験時に検出され得る。個体がサイトカイン放出症候群（サイトカインストームとも称され得る）を有する場合、この個体は、例えば、炎症性サイトカイン増加（単に例として：インターフェロン－γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ－１０、ＩＬ－６及びＴＮＦ－α）；発熱；疲労；低血圧；低酸素、頻脈；悪心；毛細管漏出；心／腎／肝機能障害；又はそれらの組み合わせを有し得る。個体が神経毒性を有する場合、その個体は、錯乱、せん妄、形成不全及び／又は発作を有し得る。いくつかの場合では、サイトカイン放出症候群の発症及び／又は重症度に関連するマーカー、例えば、Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及び／又はフェリチンなどについて個体を試験する。
【0138】
さらなる実施形態では、サイトカイン放出症候群又は神経毒性の期間中の非分泌型ＴＮＦ－αに結合する１つ以上の薬剤の投与は、例えば、治療の毒性に寄与する高レベルの可溶性ＴＮＦ－αを中和するというさらなる利点を有する。可溶性ＴＮＦ－αは、サイトカイン放出症候群の間に高レベルで放出され、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法との毒性のメディエーターである。このような場合、本明細書中で包含されるＴＮＦ－α抗体の投与は、ＴＮＦ－α突然変異体発現細胞の二重の有益な効果、即ち選択的な欠失、並びに毒性を引き起こす可溶性ＴＮＦ－αの中和を有する。従って、本開示の実施形態は、細胞が非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体を発現する養子細胞療法を受けているか、又は受けたことがある個体において、サイトカイン放出症候群を排除又はその重症度を軽減する方法であって、非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体に結合する有効量の薬剤を提供する段階を含み、前記薬剤が、個体において、（ａ）細胞療法の細胞の少なくとも一部の排除及び（ｂ）可溶性ＴＮＦ－αのレベル低下を引き起こす方法を包含する。
【0139】
本開示の実施形態は、非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体を発現する細胞を用いた細胞療法を受けたことがあるか又は受けている個体におけるサイトカイン放出症候群の影響を軽減する方法であって、突然変異体に結合して個体において（ａ）細胞療法の細胞の少なくとも一部の排除；及び（ｂ）可溶性ＴＮＦ－αのレベル低下を引き起こす、有効量の１つ以上の薬剤を提供する段階を含む方法を含む。
【0140】
ＴＮＦ－α自殺遺伝子を利用する必要性が生じる場合、細胞の表面上のＴＮＦ－α突然変異体に直接結合することなどにより阻害可能な有効量の１つ以上の阻害剤が個体に提供される。いくつかの実施形態では、阻害剤は、個体に全身的及び／又は局所的に提供され得る。阻害剤は、ポリペプチド（抗体など）、核酸、小分子（例えばキサンチン誘導体）、ペプチド又はそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、抗体はＦＤＡ承認されている。阻害剤が抗体である場合、少なくとも一部の場合において、阻害剤はモノクローナル抗体であり得る。抗体の混合物が使用される場合、混合物中の１つ以上の抗体はモノクローナル抗体であり得る。小分子ＴＮＦ－α阻害剤の例としては、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，１１８，５００号明細書に記載されているような小分子が挙げられる。ポリペプチドＴＮＦ－α阻害剤の例としては、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，１４３，８６６号明細書に記載されているものなどのポリペプチドが挙げられる。
【0141】
特定の実施形態では、ＴＮＦ－α突然変異体を標的化して自殺遺伝子としてのその活性を引き起こすために、少なくとも１つの抗体が利用される。抗体の例としては、例えば、少なくともアダリムマブ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、セルトリズマブペゴル、エタネルセプト、エタネルセプト－ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ又はそれらの混合物が挙げられる。
【0142】
本開示の実施形態としては、細胞療法の細胞を非分泌型ＴＮＦ－α突然変異体を発現するように修飾することによって、個体に対する細胞療法の毒性リスクを低下させる方法が挙げられる。細胞療法は、特定の実施形態では、癌のためのものであり、癌抗原を含む抗原を標的とする改変受容体を含み得る。
【0143】
特定の実施形態では、本開示の本発明の細胞療法に加えて、医学的状態のためのさらなる療法が個体に提供されたことがあり得る、提供され得る、及び／又は提供され得るであろう。医学的状態が癌である場合、個体には、手術、放射線、免疫療法（本開示の細胞療法以外）、ホルモン療法、遺伝子療法、化学療法などのうち１つ以上が提供され得る。
【0144】
本開示の細胞療法で処置されている個体が癌を有する場合、あらゆる種類の癌を有し得る。個体は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳の癌、肺癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、精巣癌、骨癌、皮膚癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌、胆嚢癌などを有し得る。
【0145】
ＶＩＩ．本開示のキット
【0146】
本明細書中に記載の組成物は何れもキットに含まれ得る。非限定例では、細胞、細胞を作製するための試薬、ベクター、並びにベクター及びその構成成分を作製するための試薬がキットに含まれ得る。一定の実施形態では、α－βＴ細胞、γ－δＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞又は幹細胞がキットに含まれ得る。このようなキットは、細胞の操作のための１つ以上の試薬を有してもよいし、又は有していなくてもよい。このような試薬としては、例えば、小分子、タンパク質、核酸、抗体、緩衝液、プライマー、ヌクレオチド、塩及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。１つ以上のＴＮＦ－α突然変異体、改変受容体又はサイトカインをコードするヌクレオチドがキットに含まれ得る。モノクローナル抗体を含むサイトカイン又は抗体などのタンパク質がキット中に含まれ得る。キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体などの改変受容体の構成成分をコードするヌクレオチドは、それを作製するための試薬を含むキットに含まれ得る。
【0147】
特定の態様では、本キットは、本開示の細胞療法及びまた別の癌療法も含む。いくつかの場合では、本キットは、細胞療法の実施形態に加えて、例えば化学療法、ホルモン療法及び／又は免疫療法などの第２の癌治療も含む。本キットは、個体に対する特定の癌に合わせて調整され得、個体に対する個々の第２の癌治療を含み得る。
【0148】
本キットは、本開示の適切に分注された組成物を含み得る。本キットの構成成分は、水性媒体又は凍結乾燥形態の何れかで包装され得る。本キットの容器手段は、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を含み、その中に構成成分が入れられ得、好ましくは適切に分注され得る。本キット中に複数の構成成分がある場合、本キットはまた、一般に、さらなる構成成分が個々に入れられ得る第２、第３又は他のさらなる容器も含有し得る。しかし、構成成分の様々な組み合わせが１本のバイアルに含まれ得る。本発明のキットはまた、典型的には、市販のために組成物及び何らかの他の試薬容器を厳重に閉じ込めて含有するための手段も含む。このような容器としては、所望のバイアルが保持される射出又はブロー成形プラスチック容器が挙げられ得る。
【実施例】
【0149】
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本開示の実施において良好に機能するように発明者により発見された技術を表し、従ってその実施のための好ましい方式を構成すると考えられ得ることが当業者により理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において多くの変更をなし得、同様又は類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
【0150】
実施例１
ＴＮＦ－α自殺遺伝子
本開示は、通常１７ｋＤの構成成分にプロセシングされる２６ｋｄの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）の切断不可能な突然変異体に基づく、細胞療法のためのマーカー部分及び自殺部分を提供する。このアプローチを使用することにはいくつかの利点がある。図１は、膜切断部位を切除するためにＴＮＦ－αに対して突然変異誘発を行うための実験計画の一例を示す。Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）によって記載されるように、図１の右側パネルは、ＴＮＦ－α突然変異体を切断不可能にする３つの典型的なＴＮＦ－α突然変異体を例示する：（１）１７ｋＤのＴＮＦのアミノ酸残基１～１２の欠失；（２）１７ｋＤ ＴＮＦのアミノ酸残基１及び１２の欠失；及び（３）１７ｋＤ ＴＮＦのアミノ酸残基１及び１３の欠失。図１の左パネルは、突然変異体を生成させるための一例として部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの例を提供する。
ＴＮＦ－α自殺遺伝子
本開示は、通常１７ｋＤの構成成分にプロセシングされる２６ｋｄの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）の切断不可能な突然変異体に基づく、細胞療法のためのマーカー部分及び自殺部分を提供する。このアプローチを使用することにはいくつかの利点がある。図１は、膜切断部位を切除するためにＴＮＦ－αに対して突然変異誘発を行うための実験計画の一例を示す。Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）によって記載されるように、図１の右側パネルは、ＴＮＦ－α突然変異体を切断不可能にする３つの典型的なＴＮＦ－α突然変異体を例示する：（１）１７ｋＤのＴＮＦのアミノ酸残基１～１２の欠失；（２）１７ｋＤ ＴＮＦのアミノ酸残基１及び１２の欠失；及び（３）１７ｋＤ ＴＮＦのアミノ酸残基１及び１３の欠失。図１の左パネルは、突然変異体を生成させるための一例として部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの例を提供する。
【0151】
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ及び図２Ｅは、ＴＮＦ－α突然変異体をコードし得るベクターの例を提供する。図２Ａは、一例として、アミノ酸Ｖａｌ１及びＰｒｏ１２の欠失を有するＴＮＦ－α突然変異体のベクターマップの例を示し、この突然変異体は、全て別個のポリペプチドとして、ＣＤ１９特異的ＣＡＲと同時発現され、またＩＬ－１５とも同時発現される。図２Ｂは、一例として、バリン１３に欠失を有するＴＮＦ－α突然変異体のベクターマップの例を示し、この突然変異体はＣＤ１９特異的ＣＡＲと別個に同時発現され、ＩＬ－１５と別個に同時発現される。図２Ｃは、一例として、アミノ酸Ｖａｌ１及びＶａｌ１３の欠失を有するＴＮＦ－α突然変異体のベクターマップの例を示し、この突然変異体は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＩＬ－１５と別個に同時発現される。図２Ｄは、一例として、アミノ酸Ｖａｌ１～Ｖａｌ１３までの欠失（１３個のａａ欠失）を有するＴＮＦ－α突然変異体のベクターマップの例を示し、この突然変異体は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＩＬ－１５と別個に同時発現される。図２Ｅは、一例として、アミノ酸Ａｌａ－１～Ｖａｌ １３までの欠失（１４個のａａ欠失）を有するＴＮＦ－α突然変異体のベクターマップの例を示し、この突然変異体はＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＩＬ－１５と別個に同時発現される。
【0152】
突然変異した切断不可能なＴＮＦ－α（例として、Ｖａｌ１及びＰｒｏ１２に欠失を有するＴＮＦ－α突然変異体及びＣＤ１９特異的ＣＡＲの両方をコードするベクターで形質導入された細胞において）は、例えば、そのコード配列のウイルス形質導入又はエレクトロポレーション後に細胞表面上で安定して発現される（図３）。
【0153】
切断不可能なＴＮＦ－α突然変異体を発現する細胞は、ＦＤＡ承認のＴＮＦ－α抗体（例えば）エタネルセプト、インフリキシマブ又はアダリルマブなど、を使用して選択的欠失に対する標的とし得る。図４Ａは抗ＴＮＦ抗体の例を示す。図４Ｂは、突然変異ＴＮＦ－αを発現するＮＫ細胞の７０％超が、インフリキシマブによる処置の９０分以内に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって排除されることを明らかにする。
【0154】
図５Ａは、Ｒａｊｉ標的に応答して、ＴＮＦ－α突然変異体及びＣＤ１９特異的ＣＡＲを同時発現するベクターで形質導入されたＮＫ細胞が、抗ＣＤ１９ ＣＡＲのみを発現するＮＫ細胞と比較した場合、より多くのエフェクターサイトカインを産生し、より効率的に脱顆粒することを明らかにする。図５Ｂでは、Ｒａｊｉ標的は、ＴＮＦ－α突然変異体（一例として、Ｖａｌ１及びＰｒｏ１２の欠失）及びＣＤ１９特異的ＣＡＲを別個に同時発現するベクターで形質導入されたＮＫ細胞によって効率的に死滅させられる。１位のバリン、１２位のプロリンが欠失したＴＮＦ－α突然変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、直接的な細胞－細胞接触時に強力な抗腫瘍応答を媒介し、形質導入細胞の抗腫瘍活性にさらに寄与する。
【0155】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＴＮＦ－α突然変異体を別個に発現するベクターを有する形質導入ＮＫ細胞は、オフターゲット活性を示さない（図６）。図７は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＴＮＦ－α突然変異体を別個に発現するベクターで形質導入されたＮＫ細胞がオフターゲット活性を示さず、ＴＮＦ－αを非特異的に分泌しないことを実証する。図８は、ＴＮＦ受容体１及び２とＴＮＦ－α抗体インフリキシマブ及びアダリムマブに対して、ＴＮＦ－α受容体結合部位が異なることを示す。これにより、ＴＮＦα遺伝子における突然変異が、ＴＮＦα抗体がＴＮＦα突然変異体タンパク質を認識する能力に悪影響を及ぼさない、即ち、ＴＮＦα突然変異体が依然として自殺遺伝子として使用され得、抗体によって標的化され得ることが明らかになる。
【0156】
さらなる安全性研究を使用し得る。例えば、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ ＮＫ細胞を用いたインビボマウス毒性試験を行い得る。例えば、確立されたＲａｊｉ ＮＳＧマウスモデルにおいて、ＴＮＦ－αＷＴと、ＴＮＦ－α突然変異体を比較し得、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ ＮＫ細胞はＩＬ１５も発現する。しかし、これらの突然変異体はマウスで以前に試験され、それらの安全性が実証された（Ｋａｒｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【0157】
ＴＮＦ－α突然変異体対ＴＮＦ－α野生型対外因性ＴＮＦ－αとＴＮＦ－α受容体１（ＴＮＦ－Ｒ１）及びＴＮＦ－α受容体２（ＴＮＦ－Ｒ２）との相互作用の特徴を調べるために、シナプス及びシグナル伝達研究を使用し得る。このような研究は、Ｒａｍｏｓ細胞（ＴＮＦＲ１を発現するがＴＮＦＲ２を発現しない）におけるアポトーシス誘導及びカスパーゼ（ＴＮＦ－Ｒ１の下流）の測定を組み込み得る。さらに、又は或いは、ＴＮＦＲ２及びＴＮＦＲ１の両方を発現するＪｕｒｋａｔ細胞においてＮＦカッパＢを測定し得る。
【0158】
実施例２
ＴＮＦＡＭＵＴ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５で形質導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞とＩＣ９－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞の抗腫瘍活性の比較
図１１は、ＴＮＦ－αｍｕｔ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクト又は誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトの何れかで形質導入された臍帯血由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞の抗腫瘍活性の比較を提供する。図１１Ａでは、Ｒａｊｉ腫瘍を有するＮＳＧマウスに、ＴＮＦ－αｍｕｔ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入されたか又はｉＣ９－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入された３ｘ１０ｅ６個のＣＡＲ臍帯血ＮＫ細胞を投与した。図１１Ｂは経時的にパーセント生存を示す。ＴＮＦ－αｍｕｔ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入されたマウスは、対照マウス及びｉＣ９－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入されたマウスよりも寿命が長かった。
ＴＮＦＡＭＵＴ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５で形質導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞とＩＣ９－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞の抗腫瘍活性の比較
図１１は、ＴＮＦ－αｍｕｔ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクト又は誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトの何れかで形質導入された臍帯血由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞の抗腫瘍活性の比較を提供する。図１１Ａでは、Ｒａｊｉ腫瘍を有するＮＳＧマウスに、ＴＮＦ－αｍｕｔ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入されたか又はｉＣ９－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入された３ｘ１０ｅ６個のＣＡＲ臍帯血ＮＫ細胞を投与した。図１１Ｂは経時的にパーセント生存を示す。ＴＮＦ－αｍｕｔ－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入されたマウスは、対照マウス及びｉＣ９－ＣＡＲ１９－ＩＬ１５コンストラクトで形質導入されたマウスよりも寿命が長かった。
【0159】
参考文献
本明細書中で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示の実施形態が属する熟練者のレベルを示す。全ての特許及び刊行物は、それぞれ個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ別個に示されている場合と同程度に、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本明細書中で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示の実施形態が属する熟練者のレベルを示す。全ての特許及び刊行物は、それぞれ個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ別個に示されている場合と同程度に、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【0160】
特許文献
米国特許第５，１１８，５００号明細書
米国特許第５，１１８，５００号明細書
【0161】
米国特許第６，１４３，８６６号明細書
【0162】
刊行物
Ｋａｒｐ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｅ．，Ｈｗｕ，Ｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎ ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）Ｍｕｔａｎｔｓ：Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｂｕｔ ｎｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｂｏｕｎｄ ＴＮＦ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ Ｔｒａｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｔｕｍｏｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４９（６）：２０７６－２０８１．
Ｋａｒｐ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｅ．，Ｈｗｕ，Ｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎ ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）Ｍｕｔａｎｔｓ：Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｂｕｔ ｎｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｂｏｕｎｄ ＴＮＦ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ Ｔｒａｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｔｕｍｏｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４９（６）：２０７６－２０８１．
【0163】
Ｐｅｒｅｚ，Ｃ．，Ａｌｂｅｒｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａ Ｎｏｎｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）Ｋｉｌｌｓ ｂｙ Ｃｅｌｌ－ｔｏ－Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔａｃｔ．Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６３，２５１－２５８．
【0164】
本開示及びその長所を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本計画の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書中で様々な変更、置換及び調整がなされ得ることを理解されたい。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載の工程、機構、製造、組成物、手段、方法及び段階の特定の実施形態に限定されるものではない。当業者が本開示から容易に認識するであろうように、本明細書中に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか又は実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、又は後に開発されるはずである、工程、機構、製造、組成物、手段、方法又は段階を本開示に従い利用し得る。従って、添付の特許請求の範囲は、このような工程、機構、製造、組成物、手段、方法又は段階をそれらの範囲内で含むものとする。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A-1】
【図5A-2】
【図5A-3】
【図5A-4】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【配列表】
【国際調査報告】