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▶ フーチェン コサンテール ファーマスーティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤の結晶形
(51)【国際特許分類】
C07D 498/04 20060101AFI20220131BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20220131BHJP
A61K 31/553 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220131BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C07D498/04 116
C07D498/04 CSP
A61P31/20
A61K31/553
C12N15/09 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021529057
(86)(22)【出願日】2019-11-22
(85)【翻訳文提出日】2021-07-20
(86)【国際出願番号】 CN2019120169
(87)【国際公開番号】W WO2020103924
(87)【国際公開日】2020-05-28
(31)【優先権主張番号】201811399514.3
(32)【優先日】2018-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519157897
【氏名又は名称】フーチェン コサンテール ファーマスーティカル カンパニー リミテッド
【住所又は居所原語表記】ＢＵＩＬＤＩＮＧ １－７， ＦＵＹＵＡＮ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＺＯＮＥ， ＺＨＥＲＯＮＧ ＣＯＵＮＴＹ， ＮＩＮＧＤＥ， ＦＵＪＩＡＮ ３５５３００， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】胡 彦▲賓▼
(72)【発明者】
【氏名】▲孫▼ ▲飛▼
(72)【発明者】
【氏名】施 沈一
(72)【発明者】
【氏名】▲蘇▼ ▲艶▼▲暁▼
(72)【発明者】
【氏名】丁 照中
【テーマコード（参考）】
4B063
4C072
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA06
4B063QA13
4B063QA14
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ10
4B063QQ43
4B063QQ79
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QS10
4B063QS14
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4C072AA01
4C072AA06
4C072BB02
4C072CC01
4C072CC11
4C072EE09
4C072FF07
4C072GG09
4C072JJ10
4C072UU01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA10
4C086CB22
4C086NA01
4C086NA20
4C086ZB33
(57)【要約】
本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤の結晶形及びその製造方法を開示し、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤の製造における前記結晶形の使用をさらに含む。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
粉末Ｘ線回折パターンにおいて、８．０４°±０．２°、１６．５２°±０．２°、１９．５２°±０．２°の２θ角に特徴的な回折ピークを有する、ことを特徴とする式（Ｉ）化合物の結晶形Ａ。【化1】
【請求項2】
粉末Ｘ線回折パターンにおいて、８．０４°±０．２°、１０．４７°±０．２°、１１．９０°±０．２°、１６．５２°±０．２°、１８．０６°±０．２°、１９．５２°±０．２°、２２．０２°±０．２°、２５．２８°±０．２°の２θ角に特徴的な回折ピークを有する、ことを特徴とする請求項１に記載の結晶形Ａ。
【請求項3】
粉末Ｘ線回折パターンが図１に示された通りである、請求項２に記載の結晶形Ａ。
【請求項4】
示差走査熱量測定曲線において１３９．６４±５℃に吸熱ピークの開始点を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の結晶形Ａ。
【請求項5】
示差走査熱量測定曲線パターンが図２に示された通りである、請求項４に記載の結晶形Ａ。
【請求項6】
熱重量分析曲線において１２５．２３±３℃で減量が０．４７５７％に達する、請求項１～３のいずれか１項に記載の結晶形Ａ。
【請求項7】
熱重量分析曲線パターンが図３に示された通りである、請求項６に記載の結晶形Ａ。
【請求項8】
Ｂ型肝炎治療薬の製造における請求項１～７のいずれか１項に記載の結晶形Ａの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、出願日が２０１８年１１月２２日である中国特許出願ＣＮ２０１８１１３９９５１４３の優先権を主張している。本出願はこの中国特許出願の全文を引用する。
本出願は、出願日が２０１８年１１月２２日である中国特許出願ＣＮ２０１８１１３９９５１４３の優先権を主張している。本出願はこの中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
〔技術分野〕
本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤の結晶形及びその製造方法に関し、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤の製造における前記結晶形の使用をさらに含む。
本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤の結晶形及びその製造方法に関し、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤の製造における前記結晶形の使用をさらに含む。
【背景技術】
【0003】
Ｂ型ウイルス性肝炎は、Ｂ型肝炎と略称され、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶと略称される）が生体に感染して引き起こした疾患である。Ｂ型肝炎ウイルスはヘパドナウイルスの１つであり、主に肝細胞内に存在し、肝細胞を損害し、肝細胞の炎症、壊死、繊維化を引き起こす。Ｂ型ウイルス性肝炎は急性と慢性の２種類に分けられる。急性Ｂ型肝炎は、成人ではほとんどが自身の免疫機序を通じて自己治癒することができる。しかし、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）はすでに全世界の健康保健が直面する大きな挑戦になっており、慢性肝疾患、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）や肝癌（ＨＣＣ）の主な原因でもある。全世界では２０億人が慢性Ｂ型肝炎ウイルスに感染しており、３億５千万人を超える人口がすでにＢ型肝炎に進行し、毎年６０万人近くが慢性Ｂ型肝炎の合併症で死亡したと予測されている。中国はＢ型肝炎の高発区域であり、累積したＢ型肝炎患者が多く、危害が深刻である。資料によると、中国の現在のＢ型肝炎ウイルス感染者は約９３００万であり、その中の約２０００万の患者は慢性Ｂ型肝炎と確診され、その中で、１０％～２０％は肝硬変、１％～５％は肝臓癌に発展する可能性がある。
【0004】
Ｂ型肝炎の機能的治癒の鍵はＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）を除去し、表面抗体を発生させることである。ＨＢｓＡｇ定量化は非常に重要な生物学的指標である。慢性感染患者では、ＨＢｓＡｇの減少と血清形質転換はほとんど観察されず、これは現在の治療の最終的な目的である。
【0005】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原タンパク質はＨＢＶが肝細胞に侵入する過程において非常に重要な役割を発揮し、ＨＢＶ感染の予防・治療に重要な意義がある。表面抗原タンパク質は大（Ｌ）、中（Ｍ）及び小（Ｓ）の表面抗原タンパク質を含み、共通のＣ末端Ｓ領域を共有する。これらはオープンリーディングフレームから発現され、その異なる長さがリーディングフレームの３つのＡＵＧ開始コドンによって決定される。これら３つの表面抗原タンパク質は、フロントＳ１／フロントＳ２／Ｓ、フロントＳ２／Ｓ、及びＳドメインを含む。ＨＢＶ表面抗原タンパク質は小胞体（ＥＲ）膜に組み込まれて、Ｎ末端シグナル配列によって起動される。それらはウイルス体の基本構造を構成するだけでなく、球形と糸状の亜ウイルス粒子（ＳＶＰｓ、ＨＢｓＡｇ）を形成し、ＥＲ、宿主ＥＲ、及びプレゴルジ体に集積し、ＳＶＰは大部分のＳ表面抗原タンパク質を含む。Ｌタンパク質は、ウイルスの形態発生とヌクレオカプシドとの相互作用において重要であるが、ＳＶＰの形成には必須なものではない。これらはヌクレオカプシドを欠いているため、前記ＳＶＰｓは非感染性である。ＳＶＰｓは疾患の進行に大きく関与しており、特にＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答において、感染者の血液中のＳＶＰｓの量は少なくともウイルス数の１０,０００倍であり、免疫系をトラップし、Ｂ型肝炎ウイルスに対する人体の免疫反応を弱める。ＨＢｓＡｇはヒトの自然免疫を阻害することもでき、多糖（ＬＰＳ）やＩＬ－２により誘導されるサイトカイン産生を阻害し、樹状細胞ＤＣ機能やＥＲＫ－１／２やｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端の干渉キナーゼ－１／２に対するＬＰＳの単球での誘導活性を阻害することができる。なお、肝硬変や肝細胞癌への行進は、持続的に分泌されるＨＢｓＡｇにも大きく関与している。これらの研究結果から、ＨＢｓＡｇが慢性肝炎の発展に重要な役割を果たすことが明らかになる。
【0006】
現在市販が承認されている抗ＨＢＶ薬は主に免疫調節剤（インターフェロン－αとペグインターフェロン－α－２α）と抗ウイルス治療薬（ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、ビブジン、テノホビル、クラフィジンなど）である。その中でも、抗ウイルス治療薬はヌクレオチド類薬物に属し、その作用機序はＨＢＶ ＤＮＡの合成を阻害することであり、ＨＢｓＡｇレベルを直接低下させることはできない。延長治療と同様に、ヌクレオチド類薬物により示されるＨＢｓＡｇ除去速度が自然観察結果と類似している。
【0007】
臨床の既存の治療法はＨＢｓＡｇを低下させる治療効果が不十分であり、そのため、ＨＢｓＡｇを効果的に低下できる小分子経口阻害剤の開発は現在臨床薬品用のために急務となっている。
【0008】
ロシュ社はＢ型肝炎の治療のためにＲＧ７８３４と呼ばれる表面抗原阻害剤を開発しており、モルモット抗Ｂ型肝炎モデルにおけるこの化合物の薬効として、ＲＧ７８３４を単剤として使用した場合、２．５７ Ｌｏｇの表面抗原を低下させ、１．７ ＬｏｇのＨＢＶ－ＤＮＡを低下できることを報告している。この化合物は、活性が良いが、分子合成過程で異性体を分割する必要があり、このため、収率が低下し、コストが増加する。
【0009】
ＷＯ２０１７０１３０４６Ａ１は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防用の一連の２－オキソ－７,８－ジヒドロ－６Ｈ－ピリド［２,１,ａ］［２］ベンザゼピン－３－カルボン酸誘導体を開示している。このシリーズの縮合環化合物の最高活性の実施例３によれば、ＩＣ５０は４１９ｎＭであり、活性を大きく高める余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】国際公開公報２０１７０１３０４６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
この一連の化合物に含まれるキラル中心は、不斉合成の難易度が高い。通常、７員炭素環は水溶性が悪く、酸化・代謝しやすい。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、粉末Ｘ線回折パターンにおいて８．０４°±０．２°、１６．５２°±０．２°、１９．５２°±０．２°の２θ角に特徴的な回折ピークを有する、式（Ｉ）化合物の結晶形Ａを提供する。
【化1】
【0013】
本発明のいくつかの形態では、上記結晶形Ａの粉末Ｘ線回折パターンにおいて８．０４°±０．２°、１０．４７°±０．２°、１１．９０°±０．２°、１６．５２°±０．２°、１８．０６°±０．２°、１９．５２°±０．２°、２２．０２°±０．２°、２５．２８°±０．２°の２θ角に特徴的な回折ピークを有する。
【0014】
本発明のいくつかの形態では、上記結晶形Ａの粉末Ｘ線回折パターンが図１に示されたと通りである。
【0015】
本発明のいくつかの形態では、上記結晶形ＡのＸＲＰＤパターン分析データが表１に示された通りである。
【0016】
【表1】
【0017】
本発明のいくつかの形態では、上記結晶形Ａの示差走査熱量測定曲線において１３９．６４±５℃に吸熱ピークの開始点を有する。
【0018】
本発明のいくつかの形態では、上記結晶形Ａの示差走査熱量測定曲線パターンが図２に示された通りである。
【0019】
本発明のいくつかの形態では、上記結晶形Ａの熱重量分析曲線において１２５．２３±３℃で減量が０．４７５７％に達する。
【0020】
本発明のいくつかの形態では、上記結晶形Ａの熱重量分析曲線パターンは図３に示された通りである。
【0021】
本発明は、Ｂ型肝炎治療薬の製造における上記結晶形Ａの使用をさらに提供する。
【発明の効果】
【0022】
本発明の化合物は顕著な抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有する。本発明の化合物は適度な血漿タンパク質結合率を有し、チトクロームＰ４５０アイソザイムを阻害せず、薬物－薬物相互作用のリスクが低いことを示し、ラット、ヒト、及びマウスの３つの種属における肝ミクロソームの安定性に優れており、化合物が代謝されにくいことを示し、良好な曝露量と生物学的利用率を有し、単回投与の神経毒性研究では耐性が良好である。本発明の化合物は、合成プロセスがシンプルで経済的である。
【0023】
本発明の結晶形は、溶解性が良く、入手しやすく、物理的安定性と化学的安定性の両方に優れている。
定義及び説明
定義及び説明
【0024】
特に断らない限り、本明細書で使用されている以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図している。１つの特定の句又は用語は、特に定義しない場合、不確実又は不明瞭とみなされるべきではなく、一般的な意味で理解されるべきである。本明細書で商品名が現れる場合、それに対応する商品又はその有効成分を指すことを意図している。
【0025】
本発明の中間体化合物は、当業者に周知の複数の合成方法によって製造することができ、以下に列挙された具体的な実施形態、これらの実施形態と他の化学合成方法との組み合わせからなる実施形態、及び当業者に周知の同等の代替形態を含み、好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されるものではない。
【0026】
本発明の具体的な実施形態の化学反応は、適切な溶媒にて行われ、前記溶媒は、本発明の化学的変化並びにそれに必要な試薬及び材料に適切でなければならない。本発明の化合物を得るためには、当業者が既存の実施形態に基づいて合成ステップ又は反応手順を修正又は選択する必要がある場合がある。
【0027】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明に対するいかなる制限でもない。
【0028】
本発明に使用されるすべての溶媒は市販品であり、さらなる精製を必要とせずに使用され得る。
【0029】
化合物は手作業又はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトウェアによって命名され、市販の化合物はベンダーカタログ名を使用する。
【0030】
本発明の粉末Ｘ線回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）方法
機器モデル：丹東浩元ＤＸ－２７００ＢＨ Ｘ線回折装置
試験方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用する。
ＸＲＰＤパラメータの詳細は次のとおりである。
管球：Ｃｕ,ｋα,（λ＝１．５４１８４Å）。
管球電圧：４０ｋＶ、管球電流：３０ｍＡ
発散スリット：１ｍｍ
検出器スリット：０．３ｍｍ
散乱防止スリット：１ｍｍ
走査範囲：３～４０ｄｅｇ
ステップ径：０．０２ｄｅｇ
ステップサイズ：０．５秒
機器モデル：丹東浩元ＤＸ－２７００ＢＨ Ｘ線回折装置
試験方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用する。
ＸＲＰＤパラメータの詳細は次のとおりである。
管球：Ｃｕ,ｋα,（λ＝１．５４１８４Å）。
管球電圧：４０ｋＶ、管球電流：３０ｍＡ
発散スリット：１ｍｍ
検出器スリット：０．３ｍｍ
散乱防止スリット：１ｍｍ
走査範囲：３～４０ｄｅｇ
ステップ径：０．０２ｄｅｇ
ステップサイズ：０．５秒
【0031】
本発明の示差熱分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
機器モデル：ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ ＤＳＣ１示差走査熱量計
試験方法：サンプル（２～６ｍｇ）を３０ＵＬのＤＳＣ金メッキ高圧るつぼに入れて試験を行い、１０℃／分の昇温速度でサンプルを４０℃から３５０℃まで加熱する。
機器モデル：ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ ＤＳＣ１示差走査熱量計
試験方法：サンプル（２～６ｍｇ）を３０ＵＬのＤＳＣ金メッキ高圧るつぼに入れて試験を行い、１０℃／分の昇温速度でサンプルを４０℃から３５０℃まで加熱する。
【0032】
本発明の熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法
機器モデル：ＴＡ ＴＧＡ５５０熱重量分析計
試験方法：サンプル（２～１０ｍｇ）をアルミニウムるつぼに入れた後、白金バスケットに入れて試験を行い、窒素ガス（Ｎ２）条件下、ガス流速４０ｍＬ／分、昇温速度１０℃／分で、サンプルを４０℃から５００℃まで加熱する。
機器モデル：ＴＡ ＴＧＡ５５０熱重量分析計
試験方法：サンプル（２～１０ｍｇ）をアルミニウムるつぼに入れた後、白金バスケットに入れて試験を行い、窒素ガス（Ｎ２）条件下、ガス流速４０ｍＬ／分、昇温速度１０℃／分で、サンプルを４０℃から５００℃まで加熱する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】式（Ｉ）化合物の結晶形ＡのＣｕ－Ｋα放射のＸＲＰＤスペクトルである。
【図2】式（Ｉ）化合物の結晶形ＡのＤＳＣスペクトルである。
【図3】式（Ｉ）化合物の結晶形ＡのＴＧＡスペクトルである。
【図4】マウス投与後の異なる日付におけるＨＢｓＡｇ含有量（ＩＵ／ｍＬ）である。
【図5】マウス投与後の異なる日付における体重変化である。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明の内容をよりよく理解できるように、以下、具体的な実施例を参照しながら、さらに説明するが、具体的な実施形態は本発明の内容を制限するものではない。
【0035】
実施例１ 式（Ｉ）化合物の製造
【化2】
【0036】
ステップＡ：
化合物１（１００．００ｇ、７６２．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（４００．００ｍｌ）の溶液に、０℃を維持しながら水素化リチウムアルミニウム（８０．００ｇ、２．１１ｍｏｌ、２．７７当量）を加えた。溶液を１０℃で１０時間撹拌した。次に、撹拌しながら反応液に水８０．００ｍｌを加えて、１５％水酸化ナトリウム水溶液２４０．００ｍｌを加え、さらに水８０．００ｍｌを加えた。得た懸濁液を１０℃で２０分間撹拌し、ろ過して無色の清澄液を得た。減圧濃縮させ、化合物２を得た。
化合物１（１００．００ｇ、７６２．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（４００．００ｍｌ）の溶液に、０℃を維持しながら水素化リチウムアルミニウム（８０．００ｇ、２．１１ｍｏｌ、２．７７当量）を加えた。溶液を１０℃で１０時間撹拌した。次に、撹拌しながら反応液に水８０．００ｍｌを加えて、１５％水酸化ナトリウム水溶液２４０．００ｍｌを加え、さらに水８０．００ｍｌを加えた。得た懸濁液を１０℃で２０分間撹拌し、ろ過して無色の清澄液を得た。減圧濃縮させ、化合物２を得た。
【0037】
ステップＢ：
ジクロロメタン（５００．００ｍｌ）に化合物２（５０．００ｇ、４２６．６６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（５９．３９ｍｌ、４２６．６６ｍｍｏｌ）を溶解し、ジクロロメタン（１００．００ｍｌ）にジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（９２．１９ｇ、４２２．４０ｍｍｏｌ）を溶解し、０℃で１滴ずつ前の反応液に滴下した。次に、反応液を２５℃で１２時間撹拌した。反応液を飽和食塩水（６００．００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、有機相を減圧濃縮させ、乾固まで回転蒸発させた後、メチルーｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（５０．００／１００．００）で再結晶して、化合物３を得た。
ジクロロメタン（５００．００ｍｌ）に化合物２（５０．００ｇ、４２６．６６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（５９．３９ｍｌ、４２６．６６ｍｍｏｌ）を溶解し、ジクロロメタン（１００．００ｍｌ）にジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（９２．１９ｇ、４２２．４０ｍｍｏｌ）を溶解し、０℃で１滴ずつ前の反応液に滴下した。次に、反応液を２５℃で１２時間撹拌した。反応液を飽和食塩水（６００．００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、有機相を減圧濃縮させ、乾固まで回転蒸発させた後、メチルーｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（５０．００／１００．００）で再結晶して、化合物３を得た。
【0038】
ステップＣ：
アセトニトリル（７０７．５０ｍｌ）に塩化スルホキシド（１００．９８ｍｌ、１．３９ｍｍｏｌ）を溶解し、アセトニトリル（２８２．９０ｍｌ）に化合物３（１２１．００ｇ、５５６．８２ｍｍｏｌ）を溶解し、零下４０℃で前の反応液に滴下し、滴下終了後、ピリジン（２２４．７２ｍｌ、２．７８ｍｏｌ）を反応液に一括加えた。氷浴を除去し、反応液を５～１０℃で１時間撹拌した。溶媒を減圧下回転蒸発により除去した後、酢酸エチル（８００．００ｍｌ）を加えて、固体を析出し、ろ過して、ろ液を減圧濃縮させた。
アセトニトリル（７０７．５０ｍｌ）に塩化スルホキシド（１００．９８ｍｌ、１．３９ｍｍｏｌ）を溶解し、アセトニトリル（２８２．９０ｍｌ）に化合物３（１２１．００ｇ、５５６．８２ｍｍｏｌ）を溶解し、零下４０℃で前の反応液に滴下し、滴下終了後、ピリジン（２２４．７２ｍｌ、２．７８ｍｏｌ）を反応液に一括加えた。氷浴を除去し、反応液を５～１０℃で１時間撹拌した。溶媒を減圧下回転蒸発により除去した後、酢酸エチル（８００．００ｍｌ）を加えて、固体を析出し、ろ過して、ろ液を減圧濃縮させた。
【0039】
第２ステップ：
得た油と水と三塩化ルテニウム（１２．５５ｇ、５５．６８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５３．８０ｍｌ）に溶解し、水（１５３．８０ｍｌ）に過ヨウ素酸ナトリウム（１４２．９２ｇ、６６８．１９ｍｍｏｌ）を懸濁させ、上記反応液にゆっくり加え、最終的な反応混合液を５～１０℃で０．１５時間撹拌した。反応混合液をろ過して得られたろ液を、酢酸エチル（８００．００ｍｌ×２）で抽出し、有機相を飽和食塩水（８００．００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮し、乾固まで回転蒸発させた。カラム（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝５０／１～２０／１）に通して精製し、化合物４を得た。
得た油と水と三塩化ルテニウム（１２．５５ｇ、５５．６８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５３．８０ｍｌ）に溶解し、水（１５３．８０ｍｌ）に過ヨウ素酸ナトリウム（１４２．９２ｇ、６６８．１９ｍｍｏｌ）を懸濁させ、上記反応液にゆっくり加え、最終的な反応混合液を５～１０℃で０．１５時間撹拌した。反応混合液をろ過して得られたろ液を、酢酸エチル（８００．００ｍｌ×２）で抽出し、有機相を飽和食塩水（８００．００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮し、乾固まで回転蒸発させた。カラム（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝５０／１～２０／１）に通して精製し、化合物４を得た。
【0040】
ステップＤ：
アセトニトリル（１３００．００ｍｌ）に化合物５（１００．００ｇ、６５７．２６ｍｍｏｌ）を溶解し、炭酸カリウム（２２７．１０ｇ、１．６４ｍｏｌ）及び１－ブロモ－３－メトキシプロパン（１１０．６３ｇ、７２２．９９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を８５℃で６時間撹拌した。反応液を酢酸エチル６００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×３）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧濃縮させ、化合物６を得た。
アセトニトリル（１３００．００ｍｌ）に化合物５（１００．００ｇ、６５７．２６ｍｍｏｌ）を溶解し、炭酸カリウム（２２７．１０ｇ、１．６４ｍｏｌ）及び１－ブロモ－３－メトキシプロパン（１１０．６３ｇ、７２２．９９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を８５℃で６時間撹拌した。反応液を酢酸エチル６００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×３）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧濃縮させ、化合物６を得た。
【0041】
ステップＥ：
ジクロロメタンに化合物６（７０．００ｇ、３１２．１５ｍｍｏｌ）を溶解し、メタクロロペルオキシ安息香酸（９４．２７ｇ、４３７．０１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を５０℃で２時間撹拌した。反応液を冷却した後、ろ過し、ろ液をジクロロメタンで抽出し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液２０００．００ｍｌ（４００．００ｍｌ×５）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮させた。茶色の油状物を得て、できるだけ少量のメタノールで溶解した後、水酸化カリウム（３５０．００ｍｌ）溶液を１リットル当たり２モルでゆっくり加えた（放熱）。暗色の反応液を室温で２０分間撹拌し、３７％塩酸で反応液のｐＨを５に調整した。酢酸エチル４００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×２）で抽出し、有機相を飽和食塩水２００．００ｍｌ（１００．００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮させ、化合物７を得た。
ジクロロメタンに化合物６（７０．００ｇ、３１２．１５ｍｍｏｌ）を溶解し、メタクロロペルオキシ安息香酸（９４．２７ｇ、４３７．０１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を５０℃で２時間撹拌した。反応液を冷却した後、ろ過し、ろ液をジクロロメタンで抽出し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液２０００．００ｍｌ（４００．００ｍｌ×５）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮させた。茶色の油状物を得て、できるだけ少量のメタノールで溶解した後、水酸化カリウム（３５０．００ｍｌ）溶液を１リットル当たり２モルでゆっくり加えた（放熱）。暗色の反応液を室温で２０分間撹拌し、３７％塩酸で反応液のｐＨを５に調整した。酢酸エチル４００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×２）で抽出し、有機相を飽和食塩水２００．００ｍｌ（１００．００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮させ、化合物７を得た。
【0042】
ステップＦ：
テトラヒドロフラン（３３０．００ｍｌ）に化合物７（３３．００ｇ、１５５．４８ｍｍｏｌ）を溶解し、パラホルムアルデヒド（４２．０２ｇ、４６６．４５ｍｍｏｌ）、塩化マグネシウム（２９．６１ｇ、３１０．９７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４７．２０ｇ、４６６．４５ｍｍｏｌ、６４．９２ｍｌ）を加えた。反応液を８０℃で８時間撹拌した。反応完了後、２５℃で塩酸溶液２ｍｏｌ（２００．００ｍｌ）でクエンチングし、次に、酢酸エチル６００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×３）で抽出し、有機相を飽和食塩水４００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、残渣を得た。残渣をエタノール（３０．００ｍｌ）で洗浄し、ろ過してろ過ケーキを得た。これにより、化合物８を得た。
テトラヒドロフラン（３３０．００ｍｌ）に化合物７（３３．００ｇ、１５５．４８ｍｍｏｌ）を溶解し、パラホルムアルデヒド（４２．０２ｇ、４６６．４５ｍｍｏｌ）、塩化マグネシウム（２９．６１ｇ、３１０．９７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４７．２０ｇ、４６６．４５ｍｍｏｌ、６４．９２ｍｌ）を加えた。反応液を８０℃で８時間撹拌した。反応完了後、２５℃で塩酸溶液２ｍｏｌ（２００．００ｍｌ）でクエンチングし、次に、酢酸エチル６００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×３）で抽出し、有機相を飽和食塩水４００．００ｍｌ（２００．００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、残渣を得た。残渣をエタノール（３０．００ｍｌ）で洗浄し、ろ過してろ過ケーキを得た。これにより、化合物８を得た。
【0043】
ステップＧ：
Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド（８０．００ｍｌ）に化合物８（８．７０ｇ、３６．２１ｍｍｏｌ）を溶解し、炭酸カリウム（１０．０１ｇ、７２．４２ｍｍｏｌ）及び化合物４（１１．１３ｇ、３９．８３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を５０℃で２時間撹拌した。反応液を１．００ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（２００．００ｍｌ）でクエンチングし、酢酸エチル（１５０．００ｍｌ×２）で抽出した。有機相を合わせて水（１５０．００ｍｌ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、化合物９を得た。
Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド（８０．００ｍｌ）に化合物８（８．７０ｇ、３６．２１ｍｍｏｌ）を溶解し、炭酸カリウム（１０．０１ｇ、７２．４２ｍｍｏｌ）及び化合物４（１１．１３ｇ、３９．８３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を５０℃で２時間撹拌した。反応液を１．００ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（２００．００ｍｌ）でクエンチングし、酢酸エチル（１５０．００ｍｌ×２）で抽出した。有機相を合わせて水（１５０．００ｍｌ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、化合物９を得た。
【0044】
ステップＨ：
ジクロロメタン（１５０．００ｍｌ）に化合物９（１５．８０ｇ、３５．９５ｍｍｏｌ）を溶解し、トリフルオロ酢酸（４３．９１ｍｌ、５９３．１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を１０℃で３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮させ、乾固まで回転蒸発させ、炭酸水素ナトリウム水溶液（１００．００ｍｌ）、ジクロロメタン（１００．００ｍｌ）を加えて抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、化合物１０を得た。
ジクロロメタン（１５０．００ｍｌ）に化合物９（１５．８０ｇ、３５．９５ｍｍｏｌ）を溶解し、トリフルオロ酢酸（４３．９１ｍｌ、５９３．１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を１０℃で３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮させ、乾固まで回転蒸発させ、炭酸水素ナトリウム水溶液（１００．００ｍｌ）、ジクロロメタン（１００．００ｍｌ）を加えて抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、化合物１０を得た。
【0045】
ステップＩ：
トルエン（２０．００ｍｌ）に化合物１０（５．００ｇ、１５．５６ｍｍｏｌ）を溶解し、化合物１１（８．０４ｇ、３１．１１ｍｍｏｌ）を加え、反応液を窒素ガス保護下、１２０℃で１２時間撹拌した。反応液を水（１００．００ｍｌ）でクエンチングし、酢酸エチル（１００．００ｍｌ×２）で抽出し、有機相を合わせて水（８０．００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させた。残渣を逆相カラムに通して精製した。さらに、高速液体分取クロマトグラフィー（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０×５０ｍｍ×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；溶出勾配：３５％～７０％、２５分間）により精製し、化合物１２を得た。
トルエン（２０．００ｍｌ）に化合物１０（５．００ｇ、１５．５６ｍｍｏｌ）を溶解し、化合物１１（８．０４ｇ、３１．１１ｍｍｏｌ）を加え、反応液を窒素ガス保護下、１２０℃で１２時間撹拌した。反応液を水（１００．００ｍｌ）でクエンチングし、酢酸エチル（１００．００ｍｌ×２）で抽出し、有機相を合わせて水（８０．００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させた。残渣を逆相カラムに通して精製した。さらに、高速液体分取クロマトグラフィー（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０×５０ｍｍ×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；溶出勾配：３５％～７０％、２５分間）により精製し、化合物１２を得た。
【0046】
ステップＪ：
トルエン（２０．００ｍｌ）及びエチレングリコールジメチルエーテル（２０．００ｍｌ）に化合物１２（８７５．００ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）を溶解し、テトラクロロベンゾキノン（１．４０ｇ、５．６９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を１２０℃で１２時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、飽和炭酸ナトリウム水溶液（５０．００ｍｌ）と酢酸エチル（６０．００ｍｌ）を加えた。混合液を１０～１５℃で２０分間撹拌し、分液して有機相を得た。有機相に２．００ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（６０．００ｍｌ）を加え、１０～１５℃で２０分間撹拌して、分液して、有機相を２ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（６０．００ｍｌ×２）でさらに洗浄し、分液し、水相に２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（２００．００ｍｌ）とジクロロメタン（２００．００ｍｌ）を加えた。分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、化合物１３を得た。
トルエン（２０．００ｍｌ）及びエチレングリコールジメチルエーテル（２０．００ｍｌ）に化合物１２（８７５．００ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）を溶解し、テトラクロロベンゾキノン（１．４０ｇ、５．６９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を１２０℃で１２時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、飽和炭酸ナトリウム水溶液（５０．００ｍｌ）と酢酸エチル（６０．００ｍｌ）を加えた。混合液を１０～１５℃で２０分間撹拌し、分液して有機相を得た。有機相に２．００ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（６０．００ｍｌ）を加え、１０～１５℃で２０分間撹拌して、分液して、有機相を２ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（６０．００ｍｌ×２）でさらに洗浄し、分液し、水相に２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（２００．００ｍｌ）とジクロロメタン（２００．００ｍｌ）を加えた。分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、化合物１３を得た。
【0047】
ステップＫ：
メタノール（６．００ｍｌ）に化合物１３（６００．００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（２．００ｍｌ、６．３９当量）を４．００ｍｏｌ／Ｌ加えた。反応液を１５℃で０．２５時間撹拌した。反応液を１．００ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液でｐＨ＝３～４に調整した後、ジクロロメタン（５０．００ｍｌ×３）で抽出し、有機相を合わせた後、飽和食塩水（５０．００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、式（Ｉ）化合物を得た。ｅｅ値（エナンチオマー過剰）：１００％。
メタノール（６．００ｍｌ）に化合物１３（６００．００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（２．００ｍｌ、６．３９当量）を４．００ｍｏｌ／Ｌ加えた。反応液を１５℃で０．２５時間撹拌した。反応液を１．００ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液でｐＨ＝３～４に調整した後、ジクロロメタン（５０．００ｍｌ×３）で抽出し、有機相を合わせた後、飽和食塩水（５０．００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧濃縮させ、式（Ｉ）化合物を得た。ｅｅ値（エナンチオマー過剰）：１００％。
【0048】
ＳＦＣ（超臨界流体クロマトグラフィー）法：
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ－３ １００ｍｍ×４．６ｍｍ規格、３μｍ。
移動相：メタノール（０．０５％ジエチルアミン）二酸化炭素中、５％～４０％。
流速：３ｍｌ／分間。
波長：２２０ｎｍ。
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ－３ １００ｍｍ×４．６ｍｍ規格、３μｍ。
移動相：メタノール（０．０５％ジエチルアミン）二酸化炭素中、５％～４０％。
流速：３ｍｌ／分間。
波長：２２０ｎｍ。
【0049】
実施例２ 式（Ｉ）化合物の結晶形Ａの製造
【0050】
ステップＡ：
式（Ｉ）化合物（１．８９Ｋｇ）をエタノール（９．５Ｌ）に加え、加熱還流して溶解させた後、段階的に降温して、反応系の温度を約２５℃まで低下させると、多量の固体が析出し、次に、ろ過して、固体を得た。
式（Ｉ）化合物（１．８９Ｋｇ）をエタノール（９．５Ｌ）に加え、加熱還流して溶解させた後、段階的に降温して、反応系の温度を約２５℃まで低下させると、多量の固体が析出し、次に、ろ過して、固体を得た。
【0051】
ステップＢ：
ステップＡで得た固体を水（９．５Ｌ）に加え、室温で３～５時間撹拌した後、ろ過して固体を得た。
ステップＡで得た固体を水（９．５Ｌ）に加え、室温で３～５時間撹拌した後、ろ過して固体を得た。
【0052】
ステップＣ：
ステップＢで得た固体を４５～５０℃のオーブンで４８～７２ｈベークし、式（Ｉ）化合物の結晶形Ａを得た。質量スペクトル：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３２．２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ １５．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．３２－８．９３（ｍ，１Ｈ），６．６０－６．９３（ｍ，２Ｈ），６．５１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３８－４．６３（ｍ，２Ｈ），４．１１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝４．５２，１２．２３ Ｈｚ，３Ｈ），３．７９－３．８７（ｍ，３Ｈ），３．４６－３．５４（ｍ，２Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．２４ Ｈｚ，２Ｈ），０．７７－１．２１（ｍ，９Ｈ）。
ステップＢで得た固体を４５～５０℃のオーブンで４８～７２ｈベークし、式（Ｉ）化合物の結晶形Ａを得た。質量スペクトル：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３２．２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ １５．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．３２－８．９３（ｍ，１Ｈ），６．６０－６．９３（ｍ，２Ｈ），６．５１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３８－４．６３（ｍ，２Ｈ），４．１１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝４．５２，１２．２３ Ｈｚ，３Ｈ），３．７９－３．８７（ｍ，３Ｈ），３．４６－３．５４（ｍ，２Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．２４ Ｈｚ，２Ｈ），０．７７－１．２１（ｍ，９Ｈ）。
【0053】
実施例３ 式（Ｉ）化合物のＨＢＶインビトロ活性試験
【0054】
実験材料：
１．細胞株：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞：
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１３３００３２；１０％血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１００９９１４１；１００単位／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００１０；１％非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１１４００５０；２ｍｍ Ｌ－ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５０３００８１；３００μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１０１３１０２７）
１．細胞株：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞：
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１３３００３２；１０％血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１００９９１４１；１００単位／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００１０；１％非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１１４００５０；２ｍｍ Ｌ－ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５０３００８１；３００μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１０１３１０２７）
【0055】
２．試薬：
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５３０００６２）
ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ－２１０３１ＣＶＲ）
ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ－Ｄ２６５０－１００ＭＬ）
ハイスループットＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ,Ｑｉａｇｅｎ－５１１６２）
定量的ファストスタートユニバーサルプローブ試薬（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ,Ｒｏｃｈｅ－０４９１４０５８００１）
Ｂ型肝炎表面抗原定量測定キット（Ａｎｔｕ Ｂｉｏ,ＣＬ ０３１０）
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５３０００６２）
ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ－２１０３１ＣＶＲ）
ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ－Ｄ２６５０－１００ＭＬ）
ハイスループットＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ,Ｑｉａｇｅｎ－５１１６２）
定量的ファストスタートユニバーサルプローブ試薬（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ,Ｒｏｃｈｅ－０４９１４０５８００１）
Ｂ型肝炎表面抗原定量測定キット（Ａｎｔｕ Ｂｉｏ,ＣＬ ０３１０）
【0056】
３．消耗品及び器具：
９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－３５９９）
ＣＯ２インキュベーター（ＨＥＲＡ－ＣＥＬＬ－２４０）
光学封止フィルム（ＡＢＩ－４３１１９７１）
定量ＰＣＲ ９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－４３０６７３７）
蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－７５００ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）
９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－３５９９）
ＣＯ２インキュベーター（ＨＥＲＡ－ＣＥＬＬ－２４０）
光学封止フィルム（ＡＢＩ－４３１１９７１）
定量ＰＣＲ ９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－４３０６７３７）
蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－７５００ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）
【0057】
実験方法：
１．ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（４×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。
１．ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（４×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。
【0058】
２．翌日、化合物を計８濃度で３倍勾配希釈した。異なる濃度の化合物を培養ウェルに加え、二重ウェルを設置した。培養液中のジメチルスルホキシドの最終濃度は０．５％であった。１０μＭ ＥＴＶ（エンテカビル）を１００％阻害対照とし、０．５％のジメチルスルホキシドを０％阻害対照とした。
【0059】
３．５日目には、化合物を含有する新鮮な培養液に交換した。
【0060】
４．８日目には、培養ウェルの中の培養液を回収して、一部のサンプルを採取してＢ型肝炎ウイルスＳ抗原含有量についてＥＬＩＳＡ測定を行い、サンプルの一部を採取して、ハイスループットＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ－５１１６２）を用いてＤＮＡを抽出した。
【0061】
５．ＰＣＲ反応液の調製は表１に示された通りである。
【0062】
【表2】
【0063】
フォワードプライマー配列：ＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡ（配列番号１）
リバースプライマー：ＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴ（配列番号２）
プローブ配列：５´＋ＦＡＭ＋ＣＣＴＣＴＫＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣ（配列番号３）＋ＴＡＭＲＡ－３´
リバースプライマー：ＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴ（配列番号２）
プローブ配列：５´＋ＦＡＭ＋ＣＣＴＣＴＫＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣ（配列番号３）＋ＴＡＭＲＡ－３´
【0064】
６．９６ウェルＰＣＲプレートに１ウェル当たり１５μＬの反応混合液を加えた後、１ウェル当たり１０μＬのサンプルＤＮＡ又はＨＢＶ ＤＮＡの標準品を加えた。
【0065】
７．ＰＣＲの反応条件：９５℃で１０分間加熱し、その後９５℃で１５秒間変性し、６０℃で１分間伸長し、合計４０サイクルとした。
【0066】
８．ＥＬＩＳＡによるＢ型肝炎ウイルスＳ抗原含有量の測定
５０μＬのサンプルと標準品をそれぞれ反応プレートに加え、次に、１ウェルあたり５０μＬの酵素結合物を加え、振とうして均一に混合し、３７℃で６０分間温浴した後、洗浄液でプレートを５回洗浄し、次に１ウェルあたり５０μＬ発光基質を加えて均一に混合し、室温で遮光下１０分間反応させ、最後に、マイクロプレートリーダーを用いて化学発光強度を検出した。
５０μＬのサンプルと標準品をそれぞれ反応プレートに加え、次に、１ウェルあたり５０μＬの酵素結合物を加え、振とうして均一に混合し、３７℃で６０分間温浴した後、洗浄液でプレートを５回洗浄し、次に１ウェルあたり５０μＬ発光基質を加えて均一に混合し、室温で遮光下１０分間反応させ、最後に、マイクロプレートリーダーを用いて化学発光強度を検出した。
【0067】
９．データ分析：
阻害率の計算：
％Ｉｎｈ．＝（１－サンプル中の値／ジメチルスルホキシド対照値）×１００。
ＥＣ５０の計算：
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＨＢＶに対する化合物の５０％阻害濃度（ＥＣ５０）値を計算した。
阻害率の計算：
％Ｉｎｈ．＝（１－サンプル中の値／ジメチルスルホキシド対照値）×１００。
ＥＣ５０の計算：
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＨＢＶに対する化合物の５０％阻害濃度（ＥＣ５０）値を計算した。
【0068】
実験結果：
式（Ｉ）化合物はＨＢＶ－ＤＮＡとＨＢｓＡｇに作用するＥＣ５０がそれぞれ２．５５ｎＭと３．８８ｎＭであった。
式（Ｉ）化合物はＨＢＶ－ＤＮＡとＨＢｓＡｇに作用するＥＣ５０がそれぞれ２．５５ｎＭと３．８８ｎＭであった。
【0069】
実験結論：
本発明の式（Ｉ）化合物はＨＢＶ－ＤＮＡ及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を効果的に阻害できる。
本発明の式（Ｉ）化合物はＨＢＶ－ＤＮＡ及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を効果的に阻害できる。
【0070】
実施例４ 式（Ｉ）化合物のインビボ薬効研究
実験材料：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、溶媒として１０％ＨＰ－β－ＣＤ、参照化合物ＴＤＦ（テノホビルジソプロキシル）、式（Ｉ）化合物、組換えウイルスｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ。
本項では、主要な試薬は、ＱＩＡａｍｐ９６ ＤＮＡキットと、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原検出キットＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを含む。
機器は、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ）、組織粉砕機（ＱＩＡＧＥＮ－Ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ ＩＩ）、及び分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ－ＮＡＮＯＤＲＯＰ １０００）を含む。
実験材料：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、溶媒として１０％ＨＰ－β－ＣＤ、参照化合物ＴＤＦ（テノホビルジソプロキシル）、式（Ｉ）化合物、組換えウイルスｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ。
本項では、主要な試薬は、ＱＩＡａｍｐ９６ ＤＮＡキットと、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原検出キットＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを含む。
機器は、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ）、組織粉砕機（ＱＩＡＧＥＮ－Ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ ＩＩ）、及び分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ－ＮＡＮＯＤＲＯＰ １０００）を含む。
【0071】
実験方法：
ａ）すべてのマウスはウイルス注射後２８日目に経口投与を開始し、その日を０日目とした。投与前にすべてのマウスの顎下採血を行い、血清を収集した。１日１回、４週間連続して投与した。具体的な投与スキームを表３に示した。
ｂ）すべてのマウスは、週に２回、１回あたり約１００μＬの顎下採血を行い、血清を収集した。具体的な採血時間を表３に示した。
ｃ）２８日目にすべてのマウスを安楽死させ、心臓から採血して血清を収集した。
ｄ）すべての血清サンプルを検出に供した。
ａ）すべてのマウスはウイルス注射後２８日目に経口投与を開始し、その日を０日目とした。投与前にすべてのマウスの顎下採血を行い、血清を収集した。１日１回、４週間連続して投与した。具体的な投与スキームを表３に示した。
ｂ）すべてのマウスは、週に２回、１回あたり約１００μＬの顎下採血を行い、血清を収集した。具体的な採血時間を表３に示した。
ｃ）２８日目にすべてのマウスを安楽死させ、心臓から採血して血清を収集した。
ｄ）すべての血清サンプルを検出に供した。
【0072】
【表3】
【0073】
【0074】
【表4】
【0075】
実験結論：
本発明の化合物は、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデル実験において、ＨＢｓＡｇを著しく低下させることができ、マウスは良好な耐性を示した。
本発明の化合物は、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデル実験において、ＨＢｓＡｇを著しく低下させることができ、マウスは良好な耐性を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】