特表2022-513130 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ 株式会社小松精機工作所の特許一覧

特表2022-513130金属材料およびそれから製造された生物学的特性を有する物品

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1A
1B
2A
2B
3A
3B
4A
4B
4C
5A
5B
5C
6
7
8
9
10
11
12A
12B
12C
13

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】金属材料およびそれから製造された生物学的特性を有する物品

(51)【国際特許分類】

A61L 29/02 20060101AFI20220131BHJP

A61L 29/16 20060101ALI20220131BHJP

A61L 31/02 20060101ALI20220131BHJP

A61L 31/16 20060101ALI20220131BHJP

B21B 3/02 20060101ALI20220131BHJP

C22C 38/00 20060101ALI20220131BHJP

C22C 38/44 20060101ALN20220131BHJP

C22C 38/58 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

A61L29/02

A61L29/16

A61L31/02

A61L31/16

B21B3/02

C22C38/00 302Z

C22C38/44

C22C38/58

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021529351

(86)(22)【出願日】2020-03-20

(85)【翻訳文提出日】2021-05-24

(86)【国際出願番号】 IB2020000135

(87)【国際公開番号】W WO2020194045

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/822,134

(32)【優先日】2019-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】592189206

【氏名又は名称】株式会社小松精機工作所

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】由佐史江

(72)【発明者】

【氏名】ウェブスター、トーマス、ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】小松隆史

【テーマコード（参考）】

4C081

【Ｆターム（参考）】

4C081AC06

4C081CE01

4C081CG05

4C081DA03

(57)【要約】

【課題】本発明の態様は、抗菌性などの生物学的特性を有する金属材料および金属材料から作製された物品に関する。
【解決手段】均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．１～３μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．１～３μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料。

【請求項2】

均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～１μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料。

【請求項3】

均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料。

【請求項4】

前記金属材料が３０４型ステンレス鋼金属であり、前記材料が磁化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のステンレス鋼金属材料。

【請求項5】

前記金属材料が３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料が磁化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のステンレス鋼金属材料。

【請求項6】

均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有する３０４型ステンレス鋼金属材料。

【請求項7】

【請求項8】

前記金属材料が、前記金属材料上の微生物の吸着または増殖を少なくとも５０％抑制する、請求項１～３または６～７のいずれかに記載の金属材料。

【請求項9】

前記金属材料が磁化されている、請求項１～３または６～７のいずれかに記載の金属材料。

【請求項10】

前記金属材料が、炎症性細胞の吸着または増殖を減少させ、細菌の吸着または増殖を減少させ、骨芽細胞の吸着または増殖を増加させ、内皮細胞の吸着または増殖を増加させ、またはそれらの組み合わせを増加させる、請求項１～３または６～７のいずれか１項に記載の金属材料。

【請求項11】

前記金属材料が、炎症性細胞の吸着または増殖を減少させ、細菌の吸着または増殖を減少させ、骨芽細胞の吸着または増殖を増加させ、内皮細胞の吸着または増殖を増加させ、またはそれらの組み合わせを増加させる、請求項９に記載の金属材料。

【請求項12】

前記微生物がグラム陽性菌である請求項１～３または６～７のいずれかに記載の金属材料。

【請求項13】

前記微生物がグラム陰性菌である請求項１～３または６～７のいずれかに記載の金属材料。

【請求項14】

前記微生物が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、大腸菌（E. coli）、多剤耐性大腸菌（Multi-drug resistant E. coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のうちの１つである請求項１～３または６～７に記載の金属材料。

【請求項15】

請求項１～３または６～７のいずれかに記載のステンレス鋼金属材料から作製されたワイヤまたはロッド。

【請求項16】

請求項１～３または６～７のいずれか１項に記載のステンレス鋼金属材料から作製された医療デバイス。

【請求項17】

請求項１～３または６～７のいずれかに記載のステンレス鋼金属材料から作製された箔。

【請求項18】

請求項１～３または６～７のいずれか１項に記載のステンレス鋼金属材料から作製された器具。

【請求項19】

請求項１～３または６～７のいずれかに記載のステンレス鋼金属材料から作製された台所用品。

【請求項20】

【請求項21】

前記金属材料が３０４型ステンレス鋼金属であり、前記材料が磁化されている、請求項２０に記載のワイヤまたはロッド。

【請求項22】

前記金属材料が３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料が磁化されている、請求項２０に記載のワイヤまたはロッド。

【請求項23】

【請求項24】

前記金属材料が３０４型ステンレス鋼金属であり、前記材料が磁化されている、請求項２３に記載の医療デバイス。

【請求項25】

前記金属材料が３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料が磁化されている、請求項２３に記載の医療デバイス。

【請求項26】

均質な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料から作製された箔。

【請求項27】

前記金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項２６に記載の箔。

【請求項28】

前記金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項２６に記載の箔。

【請求項29】

【請求項30】

前記金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項２９に記載の器具。

【請求項31】

前記金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項２９に記載の器具。

【請求項32】

均質な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属ワイヤであって、前記金属ワイヤが抗菌性を有するステンレス鋼金属ワイヤ。

【請求項33】

前記金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項３２に記載の金属ワイヤ。

【請求項34】

前記金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項３２に記載の金属ワイヤ。

【請求項35】

均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼医療デバイスであって、前記医療デバイスが抗菌性を有する、ステンレス鋼医療デバイス。

【請求項36】

前記金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項３５に記載の金属デバイス。

【請求項37】

前記金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料は磁化されている、請求項３５に記載の金属デバイス。

【請求項38】

前記医療デバイスが、前記医療デバイス上の微生物の吸着または増殖を少なくとも５０％阻害する、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の医療デバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は平成３１年３月２２日に出願された米国仮出願第６２／８２２，１３４号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示の態様は、均一な平均結晶粒径ナノ構造および生物学的特性を有する金属材料および金属デバイスに関する。

【背景技術】

【0003】

米国では、年間約４００，０００件の血管カテーテル関連菌血症および真菌血症が発生していることが報告により示されている。このような感染症は命にかかわることがあり、一般に治療が困難である。コロニー形成を減少または予防するための殺菌作用は、典型的にはデバイスを抗生物質でコーティングすることによる。

【0004】

あるいは、移植可能なデバイスが真核細胞の接着および／または増殖を増加または減少させることが望ましい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本開示の態様は、抗菌作用を促進する表面エネルギー、真核細胞の増殖の改善、またはそれらの組み合わせを提供する粒径を有する金属材料およびそれから作製される物品に関する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の態様は、均質な結晶粒を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、１００ｎｍ～３μｍ、より具体的には２００ｎｍ～１μｍ、より具体的には２００ｎｍ～５００ｎｍの平均結晶粒径を有する金属材料に関する。

【0007】

いくつかの実施形態では、金属材料は金属材料上の微生物の吸着または増殖を少なくとも５０％阻害する。いくつかの実施形態では、微生物はグラム陽性菌である。いくつかの実施形態では、微生物はグラム陰性菌である。いくつかの実施形態において、微生物は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）(MRSA)、大腸菌（E. coli）、多剤耐性大腸菌（multidrug-resistant E. coli）(MDR)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の１つである。

【0008】

いくつかの実施形態では、金属材料は炎症性細胞の吸着または増殖を減少させ、細菌の吸着または増殖を減少させ、骨芽細胞の吸着または増殖を増加させ、内皮細胞の吸着または増殖を増加させ、またはそれらの組み合わせを増加させる。

【0009】

いくつかの実施形態では金属材料は微生物の吸着または増殖を実質的に阻害するための平均結晶粒径を有し、これは異なる平均結晶粒径を有する結晶粒を有する金属材料上で微生物を培養し、平均結晶粒径に対して培養後の微生物の数をプロットして得られた応答プロファイルから決定される。

【0010】

いくつかの実施態様において、結晶粒は、０．１μｍ以上３μｍ以下の平均結晶粒径を有する。いくつかの実施態様において、結晶粒は、０．２μｍ以上１μｍ以下の平均結晶粒径を有する。いくつかの実施態様において、結晶粒は、０．２μｍ以上０．５μｍ以下の平均結晶粒径を有する。いくつかの実施態様において、結晶粒は、０．１μｍ以上１μｍ以下の平均結晶粒径を有する。いくつかの実施態様において、結晶粒は、０．２μｍ以上０．５μｍ以下の平均結晶粒径を有する。

【0011】

いくつかの実施態様において、金属材料は、ステンレス鋼であり得る。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、３１６型ステンレス鋼は、３１６Ｌステンレス鋼である。

【0012】

いくつかの実施形態では、金属材料はワイヤまたはロッドである。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．１μｍ以上３μｍ以下である。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍ以上１μｍ以下である。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍ～０．５μｍである。

【0013】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される金属材料から作製される医療デバイスに関する。

【0014】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される金属材料から作製される箔に関する。

【0015】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される材料金属材料から作製される器具に関する。

【0016】

本開示のいくつかの態様は、０．２μｍ～１μｍの平均結晶粒径を有する結晶粒を含む金属ワイヤに関し、金属ワイヤは抗菌性を有する。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍ～０．５μｍである。

【0017】

本開示のいくつかの態様は１００ｎｍ～３μｍの平均結晶粒径を有する結晶粒を含む金属医療デバイスを含むことに関し、医療デバイスは、抗菌性を有する。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍ～１μｍである。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍ～０．５μｍである。

【0018】

【0019】

いくつかの実施形態では、金属医療デバイスが金属医療デバイス上の微生物の吸着または増殖を少なくとも５０％阻害する。

【0020】

本開示の態様は、ステンレス鋼金属材料およびそれから作製される物品に関する。本開示の態様は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．１～３μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料に関する。いくつかの実施形態では、ステンレス鋼金属材料は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～１μｍの平均結晶粒径を有する。いくつかの実施形態では、ステンレス鋼金属材料は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、金属材料は磁化されている。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、金属材料は磁化されている。

【0021】

【0022】

【0023】

いくつかの実施形態では、金属材料が金属材料上の微生物の吸着または増殖を少なくとも５０％抑制する。

【0024】

いくつかの実施形態では、金属材料は磁化されている。

【0025】

いくつかの実施形態では、金属材料が炎症性細胞の吸着または増殖を減少させ、細菌の吸着または増殖を減少させ、骨芽細胞の吸着または増殖を増加させ、内皮細胞の吸着または増殖を増加させ、またはそれらの組み合わせを増加させる。

【0026】

【0027】

いくつかの実施形態では、微生物はグラム陽性菌である。いくつかの実施形態では、微生物はグラム陰性菌である。いくつかの実施形態において、微生物は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）(MRSA)、大腸菌（E. coli）、多剤耐性大腸菌（multidrug-resistant E. coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の１つである。

【0028】

いくつかの実施形態では、物品はワイヤまたはロッドである。いくつかの実施形態では、物品は医療デバイスである。いくつかの実施態様において、物品は、ステンレス鋼金属材料である。いくつかの実施形態では、物品は器具である。いくつかの実施形態では、物品は台所用品である。

【0029】

本開示のいくつかの態様は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料から作製されたワイヤまたはロッドに関する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、３１６型ステンレス鋼は、３１６Ｌステンレス鋼である。いくつかの実施形態では、金属材料は３０４ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。いくつかの実施態様において、金属材料が３１６型ステンレス鋼金属であり、前記材料が磁化されている。

【0030】

本開示のいくつかの態様は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料から作製された医療デバイスに関する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、３１６型ステンレス鋼は、３１６Ｌステンレス鋼である。いくつかの実施形態では、金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。

【0031】

本開示のいくつかの態様は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料から作製された箔に関する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、３１６型ステンレス鋼は、３１６Ｌステンレス鋼である。いくつかの実施形態では、金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。

【0032】

本開示のいくつかの態様は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料から作製された器具に関する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、３１６型ステンレス鋼は、３１６Ｌステンレス鋼である。いくつかの実施形態では、金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。

【0033】

本開示のいくつかの態様は、均質な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有し、金属ワイヤは抗菌性を有するステンレス鋼金属ワイヤに関する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、３１６型ステンレス鋼は、３１６Ｌステンレス鋼である。いくつかの実施形態では、金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。

【0034】

本開示のいくつかの態様は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼医療デバイスに関し、医療デバイスは、抗菌性を有する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼とすることができる。いくつかの実施態様において、３１６型ステンレス鋼は、３１６Ｌステンレス鋼である。いくつかの実施形態では、金属材料は３０４型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、金属材料は３１６型ステンレス鋼金属であり、材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、医療デバイスが医療デバイス上の微生物の吸着または増殖を少なくとも５０％阻害する。

【図面の簡単な説明】

【0035】

図１Ａは、いくつかの実施形態による、グラム陽性菌（黄色ブドウ球菌（S. aureus）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis））の応答量（ＣＦＵ／ｍｌ）を、平均結晶粒径に対してプロットすることによって得られた応答プロファイルの例である。

【0036】

図１Ｂは、いくつかの実施形態による、グラム陰性菌（大腸菌（E. coli）、緑膿菌（P. aeruginosa））の応答量（ＣＦＵ／ｍｌ）を、平均結晶粒径に対してプロットして得られた応答プロファイルの例である。

【0037】

図２Ａは、いくつかの実施形態による、グラム陽性菌であるＭＲＳＡの応答量（ＣＦＵ／ｍｌ）を、研磨試料または非研磨試料のそれぞれの平均結晶粒径ごとにプロットして得られた応答プロファイルの例である。

【0038】

図２Ｂは、いくつかの実施形態による、グラム陰性菌である緑膿菌（P. aeruginosa）の応答量（ＣＦＵ／ｍｌ）を、研磨試料または未研磨試料のそれぞれの平均結晶粒径ごとにプロットして得られた応答プロファイルの例である。

【0039】

図３Ａは、いくつかの実施形態による、未研磨試料の平均結晶粒径に対して骨芽細胞の生存率をプロットして得られた応答プロファイルの例である。

【0040】

図３Ｂは、いくつかの実施形態による、研磨試料の平均結晶粒径に対して骨芽細胞の生存率をプロットして得られた応答プロファイルの例である。

【0041】

図４Ａ～４Ｃは、いくつかの実施形態による、異なる粒径を有する３０４型ステンレス鋼金属サンプル上で増殖させた場合のヒト皮膚線維芽細胞の生存率パーセントを示す。

【0042】

図５Ａ～５Ｃは、いくつかの実施形態による、異なる粒径を有する３１６型ステンレス鋼金属サンプル上で増殖させた場合のヒト皮膚線維芽細胞の生存率パーセントを示す。

【0043】

図６は、いくつかの実施形態による研磨方法の概略図である。

【0044】

図７は、いくつかの実施形態による、チタン合金上での細胞増殖アッセイにおけるヒト胎児骨芽細胞の生存率を示すグラフである。

【0045】

図８は、いくつかの実施形態に従って使用される振動試料型磁力計の概略図である。

【0046】

図９は、いくつかの実施形態による、３０４型ステンレス鋼の平均結晶粒径に関して、４つの細菌株、大腸菌（E. coli）、多剤耐性大腸菌（MDR E. coli）、ＭＲＳＡおよび表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）の表面積に対して正規化された応答量（ＣＦＵ／ｃｍ²）をプロットすることによって得られた応答プロファイルの例である。

【0047】

図１０は、いくつかの実施形態による、３０４型ステンレス鋼サンプルの平均結晶粒径および磁気特性に関して、３つの細菌株、多剤耐性大腸菌（MDR E. coli）、ＭＲＳＡおよび黄色ブドウ球菌（S. aureus）の表面積に対して正規化された応答量（ＣＦＵ／ｃｍ²）をプロットすることによって得られた応答プロファイルの例である。

【0048】

図１１は、いくつかの実施形態による、３０４型ステンレス鋼サンプルの平均結晶粒径および磁気特性に関して、ヒト胎児骨芽細胞の表面積に対して正規化された応答量（細胞数）をプロットすることによって得られた応答プロファイルの例である。

【0049】

図１２Ａ～１２Ｃは、いくつかの実施形態による、３０４型ステンレス鋼サンプルの平均結晶粒径および磁気特性に関して、ヒト胎児骨芽細胞の表面積に対して正規化された応答量（細胞数）をプロットすることによって得られた応答プロファイルの例である。図１２Ａは、いくつかの実施形態による、異なる磁化（ＵＴ：未処理；ＤＭ：消磁；０．１Ｔ、０．５Ｔ、および１．１Ｔ）を有する３０４型ステンレス鋼サンプルの０．５μｍの平均結晶粒径に対して、ヒト胎児骨芽細胞の表面積に対して正規化された応答量（細胞数）をプロットすることによって得られた応答プロファイルである。図１２Ｂは、いくつかの実施形態による、異なる磁化（ＵＴ：未処理；ＤＭ：消磁；０．１Ｔ、０．５Ｔ、および１．１Ｔ）を有する３０４型ステンレス鋼サンプルの５μｍの平均結晶粒径に対して、ヒト胎児骨芽細胞の表面積に対して正規化された応答量（細胞数）をプロットすることによって得られた応答プロファイルである。図１２Ｃは、いくつかの実施形態による、異なる磁化（ＵＴ：未処理；ＤＭ：消磁；０．１Ｔ、０．５Ｔ、および１．１Ｔ）を有する３０４型ステンレス鋼サンプルの９μｍの平均結晶粒径に対して、ヒト胎児骨芽細胞の表面積に対して正規化された応答量（細胞数）をプロットすることによって得られた応答プロファイルである。

【0050】

図１３は、いくつかの実施形態による、３０４型ステンレス鋼の平均結晶粒径に対して５７０ｎｍでの吸光度をプロットすることによる、サフラニンを使用するバイオフィルム形成の応答プロファイルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0051】

結晶粒を微細化した金属材料は、粗大結晶粒を有する金属材料に比べて強度、靭性、耐食性などの特性に優れている。そのため、金属材料は、鋼板や医療機器等の様々な産業用途に広く用いられている。

【0052】

本開示のいくつかの態様は、０．０１～３μｍ、０．０２～３μｍ、０．０５～３μｍ、０．１～３μｍ、０．２～３μｍ、０．５～３μｍ、１～３μｍ、２～３μｍ、０．０１～２μｍ、０．０２～２μｍ、０．０５～２μｍ、０．１～２μｍ、０．２～２μｍ、０．５～２μｍ、１～２μｍ、０．０１～１μｍ、０．０２～１μｍ、０．０５～１μｍ、０．１～１μｍ、０．２～１μｍ、０．５～１μｍ、０．０１～０．６μｍ、０．０２～０．６μｍ、０．０５～０．６μｍ、０．１～０．６μｍ、０．２～０．６μｍ、０．５～０．６μｍ、０．０１～０．５μｍ、０．０２～０．５μｍ、０．０５～０．５μｍ、０．１～０．５μｍ、０．２～０．５μｍ、約０．０１μｍ、約０．０２μｍ、約０．０３μｍ、約０．０４μｍ、約０．０５μｍ、約０．０６μｍ、約０．０７μｍ、約０．０８μｍ、約０．０９μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ以上、またはそれらの間の任意の範囲の平均結晶粒径を有する再結晶金属材料を形成するように加工される金属に関する。いくつかの実施形態では、金属が０．２μｍ～０．５μｍの範囲の平均結晶粒径を有する再結晶金属材料を形成するように加工される。

【0053】

金属材料は、均一な平均結晶粒径を有することができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、金属は、約０．１μｍ±２０％、約０．２μｍ±２０％、約０．３μｍ±２０％、約０．４μｍ±２０％、約０．５μｍ±２０％、約０．６μｍ±２０％、約０．７μｍ±２０％、約０．８μｍ±２０％、約０．９μｍ±２０％、約１μｍ±２０％、約２μｍ±２０％、約３μｍ±２０％、またはそれらの間の任意の範囲の平均粒径を含む。いくつかの実施形態では、金属は、約０．１μｍ±４０％、約０．２μｍ±４０％、約０．３μｍ±４０％、約０．４μｍ±４０％、約０．５μｍ±４０％、約０．６μｍ±４０％、約０．７μｍ±４０％、約０．８μｍ±４０％、約０．９μｍ±４０％、約１μｍ±４０％、約２μｍ±４０％、約３μｍ±４０％、またはそれらの間の任意の範囲の平均粒径を含む。

【0054】

いくつかの態様では、金属は、約０．１０μｍ～約３μｍの範囲の平均結晶粒径、例えば０．２～０．５μｍを有する３０４型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、３０４型ステンレス鋼金属が表４に記載される組成を有する。

【0055】

いくつかの態様では、金属は、約０．１μｍ～約３μｍの範囲の平均結晶粒径、例えば０．２μｍ～０．５μｍを有する３１６型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、３１６型ステンレス鋼金属が表５に記載される組成を有する。

【0056】

いくつかの態様において、金属は、約０．８μｍ～約９μｍの範囲の結晶粒径、例えば０．８～８．８０μｍを有するチタン又はチタン合金である。いくつかの実施態様において、チタン合金は、βチタン（Ｔｉ－１５Ｖ－３Ｃｒ－３Ｓｎ－３Ａｌ）、Ｔｉ－６Ａｌ－４Ｖ又はこれらの組合せである。

【0057】

いくつかの実施形態では、金属材料は細胞接着、細胞増殖、またはそれらの組み合わせを制御するような結晶粒径を調整するように処理することができる。いくつかの実施形態では、金属材料またはデバイスが細菌の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するために、平均粒径を有することができる。いくつかの実施形態では、金属材料またはデバイスが所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを増加させるための平均粒径を有することができる。いくつかの実施形態では、金属材料またはデバイスが所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害する平均粒径を有することができる。いくつかの実施形態では、金属材料またはデバイスが（ｉ）細菌の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するための平均粒径、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するための平均粒径、および（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するための平均粒径を有することができる。

【0058】

（抗菌性を有する金属材料）
本明細書で使用される「抗菌性」という用語は微生物（例えば、細菌および真菌生物）の増殖または再生または接着を予防または減少させる、または微生物を殺す特性を指す。

【0059】

本発明における「細菌および真菌生物」とは、全ての球形、棒状およびらせん状の細菌を含むが、これらに限定されない、細菌および真菌の全ての属および種を意味する。細菌の非限定的な例としては、ブドウ球菌（例えば、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）)、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterrococcus faecalis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸菌（Escherichia coli）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）などのグラム陽性菌およびグラム陰性桿菌が挙げられる。真菌生物の非限定的な例は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ属（Candida spp）、カンジダ・プソイドトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ルシタニエ（Candida lusitaniae）、およびカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）を含む。

【0060】

いくつかの実施形態において、細菌は限定されるわけではないが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）(MRSA)などを含むグラム陽性菌である。いくつかの実施形態では、細菌が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸菌（E. Coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、サルモネラ・エンテリチディス（Salmonella enteritidis）、およびサルモネラ・チフス（Salmonella typhi）を含むがこれらに限定されないグラム陰性菌である。

【0061】

本発明の態様は耐性ブドウ球菌、ＭＤＲグラム陰性菌(MDR緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）など）に対する防御を含むがこれらに限定されない、金属材料に対する有効な広域スペクトル抗感染防御を提供するための金属材料および方法を提供する。

【0062】

本発明の態様は、改善された抗菌性を有する金属材料を提供する。いくつかの実施形態において、金属材料は、例えば、インプラント（限定されないが、整形外科インプラント）などの医療デバイスにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、金属材料は外科用器具、血管ステント、内視鏡器具、カテーテル部品、ガイドワイヤ、キルシュナーワイヤ（Ｋワイヤ）、プレート、ピン、ねじ、針、ペースメーカリード、歯科用装具など、または埋め込み型医療デバイスにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、金属材料は外科用器具に使用することができる。いくつかの実施形態では、金属材料はバイオセンサに使用することができる。いくつかの実施形態では、金属材料は台所用品に使用することができる。いくつかの実施形態では、金属材料は実験ツールで使用することができる。いくつかの実施形態では、金属材料はキルシュナーワイヤに使用することができる。

【0063】

医療デバイスの非限定的な例には、末梢に挿入可能な中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期トンネル中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、単一管腔および複数管腔の短期中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、肺動脈スワンガンツカテーテルなどの血管カテーテル、尿カテーテル、他の長期尿デバイス、組織結合尿デバイス、腎ステント、陰茎プロテーゼ、血管グラフト、血管アクセスポート、創傷ドレーンチューブ、水頭シャント、心室ドレナージカテーテル、神経カテーテルおよび硬膜外カテーテル、神経刺激装置、腹膜透析カテーテル、ペースメーカーカプセル、人工尿細管、小型または一時的な関節置換、拡張器、心臓弁、整形外科用補綴物、脊椎ハードウェア、手術部位修復メッシュ（例、ヘルニアメッシュ）、気管内チューブ、胆管ステント、胃腸管、結腸直腸管インプラント、男性および女性の生殖インプラント、美容用または再建用インプラント、整形外科用ドラム、整形外科用インプラント（例、関節（膝、腰、肘、肩、足首）、プロテーゼ、外部固定ピン、髄内ロッドおよび釘、脊椎インプラント）、心臓ペースメーカー、除細動器、電子機器リード、アダプター、リードエクステンション、埋め込み型注入デバイス、埋め込み型パルスジェネレーター、埋め込み型生理学的モニタリングデバイス、埋め込み型パルスジェネレーターまたは埋め込み型注入デバイスを皮下に配置するためのデバイス、および移植可能な注入装置または微生物の侵入を受ける可能性のある他の医療および留置装置を補充するためのデバイス（例：補充針およびポートアクセスカニューレ）が含まれる。

【0064】

いくつかの実施形態ではデバイスがステンレス鋼デバイスであり、高速外科用ドリル、椎体形成術および脊椎形成術デバイス、最小侵襲性外科用器具および内視鏡デバイス、整形外科用インプラント、ならびに外科用器具のために使用され得るが、これらに限定されない。

【0065】

いくつかの実施形態ではデバイスはチタンデバイスであり、整形外科用インプラント、歯科用インプラント、脊椎インプラント、最小侵襲性外科用器具および内視鏡デバイス、ならびに外科用器具に使用することができるが、これらに限定されない。

【0066】

いくつかの実施形態では、金属材料の抗菌性が金属材料中または金属材料上に抗生物質を添加することなく達成される。

【0067】

いくつかの実施形態では、金属材料は細菌細胞の接着を、１００％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または少なくとも５％、またはそれらの間の任意の値もしくは範囲だけ阻害する。

【0068】

（細胞接着を促進する、または細胞接着を阻害する金属材料）
いくつかの実施形態では、金属インプラントなどの金属材料上への細胞の接着を増加させることが望ましい。他の実施形態では、金属インプラントなどの金属材料上への細胞の接着を減少または阻害することが望ましい。例えば、整形外科用インプラントの表面上の骨芽細胞の接着を増大させることが望ましい場合がある。他の例では、血管ステントまたはインプラントの表面上の内皮細胞の接着を増加させ、血管ステントまたはインプラント上への線維芽細胞の接着を阻害することが望ましい場合がある。

【0069】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の金属材料は、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、平滑筋細胞、尿路上皮細胞、破骨細胞、骨細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、ニューロン、星状細胞、シュワン細胞、髄膜細胞、上皮細胞などの真核細胞の接着および／または増殖を改善することができる。

【0070】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の金属材料はいくつかの真核細胞の細胞接着および／または増殖を促進する表面エネルギーを有する。いくつかの実施形態では、金属材料は細胞接着および／または増殖を、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれらの間の任意の値もしくは範囲だけ増加させる。

【0071】

さらにいくつかの実施形態では、本明細書に記載の金属材料は細胞接着および／または他の真核細胞の増殖を阻害する表面エネルギーを有する。いくつかの実施形態では、金属材料は細胞接着および／または増殖を、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれらの間の任意の値または範囲で減少させる。

【0072】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される金属材料は抗菌性を有し、骨芽細胞、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、平滑筋細胞、尿路上皮細胞、破骨細胞、骨細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、ニューロン、星状細胞、シュワン細胞、髄膜細胞、上皮細胞などの真核細胞の接着および／または増殖を改善する。

【0073】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される金属材料は抗菌性を有し、免疫細胞などの真核細胞の接着および／または増殖を阻害する。

【0074】

金属材料及び金属材料の使用により、（ｉ）細菌の接着及び／又は増殖を減少又は阻害し、（ｉｉ）骨芽細胞、線維芽細胞等の真核細胞の接着及び／又は増殖を改善し、（ｉｉｉ）免疫細胞の接着及び／又は増殖を減少又は阻害し、又は（ｉｖ）細菌の接着及び／又は増殖を阻害し、（ｉｉ）骨芽細胞、線維芽細胞等の真核細胞の接着及び／又は増殖を改善し、（ｉｉｉ）免疫細胞の接着及び／又は増殖を減少又は阻害し、又は（ｉｉ）（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを本明細書に以下に記載する。

【0075】

（金属材料の用途）
いくつかの実施形態において、金属材料は、医療デバイスにおいて使用され得る。例えば、金属材料は、血管ステント、内視鏡器具、外科器具、カテーテル部品、ガイドワイヤ、キルシュナーワイヤ、ピン、プレート、ねじなど、または埋め込み可能な医療デバイスに使用することができる。

【0076】

いくつかの実施形態では、金属材料はバイオセンサに使用することができる。いくつかの実施形態では、金属材料は台所用品に使用することができる。いくつかの実施形態では、金属材料は実験ツールで使用することができる。

【0077】

医療デバイスの非限定的な例には、末梢に挿入可能な中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期トンネル中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、単一管腔および複数管腔の短期中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、肺動脈スワンガンツカテーテルなどの血管カテーテル、尿カテーテル、他の長期尿デバイス、組織結合尿デバイス、腎ステント、陰茎プロテーゼ、血管移植片、血管アクセスポート、創傷ドレーンチューブ、水頭シャント、心室ドレナージカテーテル、神経カテーテルおよび硬膜外カテーテル、神経刺激装置、腹膜透析カテーテル、ペースメーカーカプセル、人工尿細管、小型または一時的な関節置換、拡張器、心臓弁、整形外科用補綴物、脊椎ハードウェア、手術部位修復メッシュ（例、ヘルニアメッシュ）、気管内チューブ、胆管ステント、胃腸管、結腸直腸管インプラント、男性および女性の生殖インプラント、美容用または再建用インプラント、整形外科用ドラム、整形外科用インプラント（例、関節（膝、腰、肘、肩、足首）、プロテーゼ、外部固定ピン、髄内ロッドおよび釘、脊椎インプラント）、心臓ペースメーカー、除細動器、電子機器リード、アダプター、リードエクステンション、埋め込み型注入デバイス、埋め込み型パルスジェネレーター、埋め込み型生理学的モニタリングデバイス、埋め込み型パルスジェネレーターまたは埋め込み型注入デバイスを皮下に配置するためのデバイス、および移植可能な注入装置または微生物の侵入を受ける可能性のある他の医療および留置装置を補充するためのデバイス（例：補充針およびポートアクセスカニューレ）が含まれる。

【0078】

いくつかの実施形態は、外科用器具に関する。

【0079】

一部の実施形態では、デバイスはＫワイヤである。

【0080】

いくつかの実施形態では、デバイスは埋め込み可能な整形外科用インプラントである。

【0081】

いくつかの実施形態では、デバイスは血管ステントである。

【0082】

（構成）
医療デバイス用途のための公知の金属材料を使用することができ、金属材料の例としては、鉄、ステンレス鋼、アルミニウム、銀、銅、チタン、錫、ニッケル、亜鉛、クロム、およびこれらの金属材料の合金が挙げられる。中でも、ステンレス鋼は、結晶粒の結晶粒径の制御が容易であること、汎用性があること、入手が容易であること、加工性があること、毒性が低いことなどの観点から好ましい。ステンレス鋼は特に限定されず、マルテンサイト系ステンレス鋼、フェライト系ステンレス鋼、オーステナイト系ステンレス鋼、オーステナイト／フェライト系ステンレス鋼、析出硬化系ステンレス鋼のいずれであってもよい。

【0083】

いくつかの実施態様において、金属材料は、ステンレス鋼又はステンレス鋼合金である。例えば、金属材料は、３０４型ステンレス鋼又は３１６型ステンレス鋼とすることができる。３１６型ステンレス鋼はモリブデンの存在により３０４型と異なる。いくつかの実施例では、ステンレス鋼材料は６から２２％のニッケルを含むことができる。いくつかの実施例では、ステンレス鋼材料はまた、耐食性のためにクロム（１６から２６％）のような他の合金元素を含むことができる。いくつかの実施形態では、ステンレス鋼がマンガンおよびモリブデンを含むことができる。いくつかの実施形態では、３１６型ステンレス鋼を医療デバイスに使用することができる。

【0084】

いくつかの実施態様において、金属材料は、チタン又はチタン合金である。いくつかの実施形態では、金属材料はコバルトクロムである。幾つかの実施形態において、金属材料は、コバルト・クロム・モリブデンである。いくつかの実施形態では、金属材料はニチノールである。

【0085】

（ナノ構造）
本発明の態様によれば、本明細書で提供される金属材料は、表面に限定されないナノ構造を有する。例えば、金属材料はその加工の間、そのナノ構造を維持することができ、その結果、均一なナノ構造を有する金属材料が得られる。

【0086】

いくつかの実施形態による金属材料は微細な結晶粒から作製され、これは広範囲のデバイスへの適用を可能にする。金属材料は、均一なナノ構造を有する。所定の平均結晶粒径ナノ構造（例えば、０．２μｍ～０．５μｍ）は材料全体、すなわち、表面および材料内部で一貫している。

【0087】

いくつかの実施形態による金属材料を構成する結晶粒は、金属材料の生物学的特性を制御するための平均結晶粒径を有する。

【0088】

本発明の態様は、金属材料の生物学的特性が金属材料の平均結晶粒径に依存するという現象に基づく。

【0089】

本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載の金属材料は、（ｉ）細菌の接着および／または増殖を低減または阻害する、（ｉｉ）骨芽細胞、線維芽細胞などの真核細胞の接着および／または増殖を改善または増加する、（ｉｉｉ）免疫細胞の接着および／または増殖を低減または阻害する、（ｉｖ）細菌の接着および／または増殖を低減または阻害する、（ｉｉ）骨芽細胞、線維芽細胞などの真核細胞の接着および／または増殖を改善する、（ｉｉｉ）免疫細胞の接着および／または増殖を低減または阻害する、または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせの結晶粒径、表面自由エネルギーおよび粗さを有することができる。

【0090】

本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の金属材料は検討中の組織の真核細胞のサイズとほぼ同じ結晶粒径を有することができ、金属への細胞の接着および／または増殖を促進することができる。さらに、本明細書に記載の金属材料は、金属への細胞の接着および／または増殖を促進する表面自由エネルギーを有することができる。さらに、本明細書に記載の金属材料は、金属への細胞の接着および／または増殖を促進する粗さを有することができる。

【0091】

本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の金属材料は金属への細胞の接着および／または増殖を阻害する結晶粒径を有することができる。さらに、本明細書に記載の金属材料は、金属への細胞の接着および／または増殖を促進する表面自由エネルギーを有することができる。さらに、本明細書に記載の金属材料は、金属への細胞の接着および／または増殖を阻害する粗さを有することができる。いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞および／または真核細胞である。

【0092】

本発明のいくつかの態様は、金属材料の抗菌性が金属材料の平均結晶粒径に依存するという現象に基づく。いくつかの実施形態では、金属材料は約０．１～３μｍの範囲の所定の平均結晶粒径を有する。いくつかの実施形態では、金属材料は０．２～１μｍの範囲の所定の平均結晶粒径を有する。いくつかの実施形態では、金属材料は０．２～０．５μｍの範囲の所定の平均結晶粒径を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される金属材料は微生物の増殖および／または骨芽細胞および線維芽細胞の増殖を改善することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される金属材料は微生物の増殖、固定化または増殖、および固定化（吸着）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される金属材料は免疫細胞の増殖、固定化または増殖、および固定化（吸着）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される金属材料は所定の真核細胞の増殖、固定化または増殖、および固定化（吸着）を促進する。

【0093】

本発明の態様は、微生物の増殖、固定化または増殖および固定化を阻害するための方法に関する。

【0094】

いくつかの実施形態において、微生物の増殖および／または固定化を阻害するための平均結晶粒径は、０．０１～３μｍ、０．０２～３μｍ、０．０５～３μｍ、０．１～３μｍ、０．２～３μｍ、０．５～３μｍ、１～３μｍ、２～３μｍ、０．０１～２μｍ、０．０１～２μｍ、０．０２～２μｍ、０．０５～２μｍ、０．１～２μｍ、０．２～２μｍ、０．５～２μｍ、１～２μｍ、０．０１～１μｍ、０．０２～１μｍ、０．０５～１μｍ、０．１～１μｍ、０．２～１μｍ、０．５～１μｍ、０．０１～０．６μｍ、０．０２～０．６μｍ、０．０５～０．６μｍ、０．１～０．６μｍ、０．２～０．６μｍ、０．５～０．６μｍ、０．０１～０．５μｍ、０．０２～０．５μｍ、０．０５～０．５μｍ、０．１～０．５μｍ、０．２～０．５μｍ、約０．０１μｍ、約０．０２μｍ、約０．０３μｍ、約０．０４μｍ、約０．０５μｍ、約０．０６μｍ、約０．０７μｍ、約０．０８μｍ、約０．０９μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１μｍ、約２μｍμｍ、約３μｍ以上、またはそれらの間の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、微生物の増殖および／または固定化を阻害するための平均結晶粒径は、０．２μｍ～０．５μｍの範囲であり得る。

【0095】

いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は０．１μｍより大きいが、３μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍより大きいが１μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍより大きいが０．７μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍより大きいが０．５μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍより大きいが０．４μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍより大きいが０．３μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．３μｍより大きいが０．５μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．４μｍより大きいが０．５μｍより小さい。

【0096】

粒界は電子後方散乱回折（ＥＢＳＤ）により測定でき、低角度で異なる原子を示すことができる。角度の差は、５度より大きくてもよい。各粒は、結晶粒界線で囲まれた面積によって決定することができる。粒径が大きいとき、形状は独特でランダムな多角形である。粒子が小さくなるにつれて、形状は円に近いより小さい多角形、立方体、または長方形となる。長方形の場合は短辺、又は円の場合は直径がほぼ平均粒径である。

【0097】

いくつかの実施形態では、金属材料は約０．５μｍ（±２０％）または０．２μｍ～０．５μｍの平均粒径を有し、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の増殖を阻害する。

【0098】

結晶粒の微細化中、金属材料の化学組成は変化しない。従って、チタン、チタン系材料、ステンレス鋼、Ｃｏ－Ｃｒ合金、Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ、ニチノール、白金、パラジウム等のように、結晶または粒を有する金属材料であれば、化学組成の異なる任意の金属を用いることができる。

【0099】

いくつかの実施形態では、金属材料はその抗菌性に加えて、従来のステンレス鋼よりも改善された引張強度および硬度を有する。

【0100】

なお、結晶粒の平均結晶粒径を調整する方法としては、微細化方法を採用することができる。この方法としては、例えば、精錬前の金属原料の圧延工程、剪断工程、圧縮工程、変形工程、及びこれらの組み合わせが挙げられる。この場合、冷却、加熱を行ってもよいし、特定のガス（酸素、窒素等）の存在下または非存在下の雰囲気中で精製を行ってもよい。一般に、塑性変形に至る加熱や冷却による再結晶により微細化が進行する。以上の手順を１回または複数回繰り返すことにより、所望の平均結晶粒径を得ることができる。

【0101】

本発明の態様によれば、本明細書で提供される金属材料から形成されるデバイスは、表面に限定されないナノ構造を有する。例えば、金属材料はその処理の間、そのナノ構造を維持することができ、その結果、均一なナノ構造を有する金属材料は得られる。

【0102】

いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される金属材料の磁場は、表面電荷ならびに初期のタンパク質吸着事象を変化させて、細菌の接着およびコロニー形成および／または真核細胞の増殖を変化させることができる。

【0103】

（研磨／非研磨の金属材料）
いくつかの実施形態では、金属材料を研磨して表面粗さを変化させることができる。いくつかの実施形態では、金属材料を研磨する方法はラッピングフィルムを使用する粗研磨を含む（実施例４参照）。

【0104】

表面粗さは原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で計算でき、金属材料について三つの異なるパラメータ－二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）、算術粗さ（Ｒａ）および最大高さ（Ｒｚ）－を得ることができる。

【表1】

【表2】

【0105】

いくつかの実施形態では、材料は研磨されており、約０．１ｎｍ～１００μｍのナノスケールの表面粗さを有する。

【0106】

以前の研究は細菌増殖を阻害するための表面エネルギーの最適値が約４２ｍＮ／ｍであることを示した（Liuら, “Understanding the Role of Polymer Surface Nanoscale Topography on Inhibiting Bacteria Adhesion and Growth” Biomaterials Science and Engineering, 2016, 2 (1), pp 122-130.)。

【0107】

いくつかの実施形態では、金属材料の表面エネルギーの値は４０～４５ｍＮ／ｍ、４０～４７ｍＮ／ｍ、４０～５０ｍＮ／ｍ、４０～５５ｍＮ／ｍ、４０～６０ｍＮ／ｍ、３５～４５ｍＮ／ｍ、３５～５０ｍＮ／ｍ、３５～５５ｍＮ／ｍ、３５～６０ｍＮ／ｍ、３０～４５ｍＮ／ｍ、３０～５０ｍＮ／ｍ、３０～５５ｍＮ／ｍ、３０～６０ｍＮ／ｍである。

【0108】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の金属材料はいくつかの真核細胞の増殖を促進する表面エネルギーを有する。さらにいくつかの実施形態では、本明細書に記載の金属材料は他の真核細胞の増殖を阻害する表面エネルギーを有する。例えば、表面エネルギーは、内皮細胞の接着および増殖を促進し得、また線維芽細胞の接着および／または増殖を阻害し得る。

【0109】

いくつかの実施形態では、真核細胞の増殖を促進するための金属材料の表面エネルギーの値は４０～４５ｍＮ／ｍ、４０～４７ｍＮ／ｍ、４０～５０ｍＮ／ｍ、４０～５５ｍＮ／ｍ、４０～６０ｍＮ／ｍ、３５～４５ｍＮ／ｍ、３５～５０ｍＮ／ｍ、３５～５５ｍＮ／ｍ、３５～６０ｍＮ／ｍ、３０～４５ｍＮ／ｍ、３０～５０ｍＮ／ｍ、３０～５５ｍＮ／ｍ、３０～６０ｍＮ／ｍである。

【0110】

最適なＲａ、Ｒｑ、Ｒｚは理想的な表面エネルギーとして４５ｍＮ／ｍを用いてＫｈａｎｇの式で計算できる。
Ｅ_Ｓ＝Ｅ０，＋ρ×ｒｅｆｆ
ＥＳ＝表面エネルギー
Ｅ_０，Ｓ＝基底表面エネルギー
ｒｅｆｆ＝粗さ
ρ＝カップリング定数

【0111】

いくつかの実施形態では、金属材料は炎症性細胞機能を減少させる、細菌機能を減少させる、骨細胞機能を増加させる、内皮細胞機能を増加させる、または前述のものの任意の組み合わせによるタンパク質の吸着に合わせた表面エネルギーを有することができる。

【0112】

いくつかの実施形態では、金属材料は炎症性細胞機能を減少させる、細菌機能を減少させる、骨細胞機能を増加させる、内皮細胞機能を増加させる、または前述のものの任意の組合せによるタンパク質の吸着に合わせた平均粒径を有することができる。

【0113】

理論に束縛されるものではないが、表面エネルギーの変化は次いで、例えば、細菌の付着およびコロニー形成を阻害するために、初期のタンパク質吸着を変化させ得る。

【0114】

いくつかの実施形態では、金属材料は研磨されていても研磨されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、研磨および／または非研磨の金属材料はグラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方の接着または増殖を減少させるために、約１００ｎｍ～１０μｍ、例えば５００ｎｍ未満、例えば約１００ｎｍの平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、研磨されたおよび／または研磨されていない金属材料は好ましくは約１～３μｍの平均粒径を有する。

【0115】

（形状／デバイス）
いくつかの実施形態では、金属材料の形状は、特に限定されるものではなく、板状、線状、棒状（ｒｏｄ）、球状、円筒状等の任意の形状を採用することができる。いくつかの実施形態では、金属材料はワイヤまたは線の形状である。

【0116】

いくつかの実施形態では、金属材料は約０．１ｍｍ～１ｍｍの範囲の厚さ、例えば０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、または１ｍｍを有するプレートまたは箔の形態である。

【0117】

いくつかの実施形態では、金属材料は０．０２ｍｍ～６ｍｍの直径を有する棒（ｂａｒ）またはワイヤの形態である。

【0118】

（微生物の増殖を阻害する方法）
いくつかの実施形態では、微生物の増殖阻害方法は、所定の平均結晶粒を含む金属材料を用いる方法である。

【0119】

いくつかの実施態様において、結晶粒の各平均結晶粒径が、０．０１～３μｍ、０．０２～３μｍ、０．０５～３μｍ、０．１～３μｍ、０．２～３μｍ、０．５～３μｍ、１～３μｍ、２～３μｍ、０．０１～２μｍ、０．０２～２μｍ、０．０５～２μｍ、０．１～２μｍ、０．２～２μｍ、０．５～２μｍ、１～２μｍ、０．０１～１μｍ、０．０２～１μｍ、０．０５～１μｍ、０．１～１μｍ、０．２～１μｍ、０．５～１μｍ、０．０１～０．６μｍ、０．０２～０．６μｍ、０．０５～０．６μｍ、０．１～０．６μｍ、０．２～０．６μｍ、０．５～０．６μｍ、０．０１～０．５μｍ、０．０２～０．５μｍ、０．０５～０．５μｍ、０．１～０．５μｍ、０．２～０．５μｍ、約０．０１μｍ、約０．０２μｍ、約０．０３μｍ、約０．０４μｍ、約０．０５μｍ、約０．０６μｍ、約０．０７μｍ、約０．０８μｍ、約０．０９μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ以上またはそれらの間の任意の範囲である金属材料、例えばステンレス鋼材料が提供される。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍから０．５μｍの範囲であり得る。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍより大きいが１μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は０．１μｍより大きいが、３μｍより小さい。いくつかの実施態様において、平均結晶粒径は、０．２μｍより大きいが０．５μｍより小さい。

【0120】

いくつかの実施形態では、微生物の増殖を最適に阻害するための結晶粒の平均結晶粒径は上記手順で得られた応答プロファイルに基づいて決定される。

【0121】

図１Ａは、グラム陽性菌に対する金属材料の抗菌性を示す。例えば、図１Ａは、０．５μｍ、１μｍ、１．５μｍ、３μｍ、および９μｍの粒径を有する金属材料はグラム陽性菌の増殖／接着を阻害することを示す。図１Ｂは、グラム陰性菌に対する金属材料の抗菌性を示す。例えば、図１Ｂは、０．５μｍ、３μｍおよび９μｍの粒径を有する金属材料はグラム陽性菌の増殖／接着を阻害することを示す。

【0122】

（細胞接着および／または増殖を促進または阻害するための使用方法）
いくつかの実施形態において、デバイスは、以下の解剖学的位置：皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、眼内、脳内または他の適切な部位に移植され得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、金属材料のナノ構造はナノメートルスケールのタンパク質およびマイクロメートルスケールの細胞に適合するように調整することができる。いくつかの実施形態では、結晶粒径が内皮細胞または骨芽細胞の接着を促進することができる。

【0124】

いくつかの実施形態では、２つ以上の表面を有する移植可能な金属デバイスが提供される。いくつかの実施形態では、デバイスは第１の細胞型の接着および／または増殖を促進する表面エネルギーを有するように構成された第１の金属表面と、第２の異なる細胞型の接着および／または増殖を阻害する表面エネルギーを有するように構成された第２の表面とを含むことができる。いくつかの実施形態では、デバイスは第１の細胞型の接着および／または増殖を促進する平均粒径を有するように構成された第１の金属表面と、第２の異なる細胞型の接着および／または増殖を阻害するように平均粒径を有するように構成された第２の表面とを含むことができる。例えば、移植可能なデバイスは、内皮細胞の接着および／または増殖を促進するように構成された第１の表面と、線維芽細胞の接着および／または増殖を阻害するように構成された第２の表面とを有する血管ステントであり得る。

【0125】

いくつかの実施形態では、金属材料は細胞の接着、細胞の増殖、またはそれらの組み合わせを阻害する平均粒径および／または表面エネルギーを有することができる。例えば、金属材料は、免疫細胞などの炎症の原因となる細胞の接着および／または増殖を阻害することができる。

【0126】

本開示の態様は０．２～０．５μｍの範囲の均一平均結晶粒径ナノ構造を有する金属材料、金属デバイスまたは器具に関し、金属材料、金属デバイスまたは器具は、細菌増殖およびバイオフィルム形成を阻害／減少させる。いくつかの実施形態では、金属材料、金属デバイスまたは器具は抗菌活性を必要とする用途に使用することができる。いくつかの実施形態では、用途が外科用器具、内視鏡装置（例えば、椎体形成針）を含む。いくつかの実施態様において、金属は、３０４型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施態様において、金属は、３１６型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施態様において、金属は、３０４型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、金属は磁化されている。

【0127】

本開示の態様は０．２～０．５μｍの範囲の均一平均結晶粒径ナノ構造を有する磁化された金属材料、金属デバイスまたは機器に関し、金属材料、金属デバイスまたは機器は、細菌増殖およびバイオフィルム形成を阻害／減少させ、真核細胞接着を促進／増加させる。いくつかの実施形態では金属材料、金属デバイスまたは器具は抗菌作用および骨結合を必要とする用途に使用することができる。いくつかの実施形態では、用途は、埋め込み型デバイスおよび整形外科用インプラントを含む。いくつかの実施態様において、金属は、３０４型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施態様において、金属は、３１６型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、金属材料は２．３×１０^７ｅｍｕ／ｍ^３よりも高い磁気モーメントを有する。

【0128】

本開示の態様は、均一な結晶粒ナノ構造を含み、（ｉ）微生物の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように、（ｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを促進するように、または（ｉｉｉ）所定の真核細胞の接着、増殖、またはそれらの組み合わせを阻害するように構成された、０．１～３μｍの平均結晶粒径を有するステンレス鋼金属材料またはステンレス鋼金属材料から作製された物品に関する。いくつかの実施形態では、ステンレス鋼金属材料が均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～１μｍの平均結晶粒径を有する。いくつかの実施形態では、ステンレス鋼金属材料が均一な結晶粒ナノ構造を含み、０．２～０．５μｍの平均結晶粒径を有する。いくつかの実施態様において、金属材料は、３０４型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、金属材料は磁化されている。いくつかの実施態様において、金属材料は、３１６型ステンレス鋼金属である。いくつかの実施形態では、金属材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、金属材料は磁化されている。いくつかの実施形態では、金属材料が２．３×１０^７ｅｍｕ／ｍ^３よりも高い磁気モーメントを有する。

【実施例】

【0129】

以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、本発明の要旨を超えない限り、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0130】

実施例１－金属材料の製造）
金属材料を提供するために、ステンレス鋼（ＳＵＳ３０４）に圧延処理および加熱による再結晶を施し、結晶粒の平均結晶粒径をそれぞれ０．５μｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍおよび９μｍに調整した。金属材料は、長さ１０ｍｍ、幅１０ｍｍ、厚さ０．１ｍｍの板状であった。圧延処理及び加熱による再結晶は、以下の手順で行った。具体的には、ステンレス鋼（ＳＵＳ３０４）を回転ミルに数回通過させ、約４０～６５％（１回当たり約３～１５％の圧縮比）まで冷間圧延した。次いで、得られたステンレス鋼を６００～８５０℃で１０～１００秒（加熱速度：２００℃／ｓｅｃ）の焼鈍を行い、ステンレス鋼を再結晶させた。相変態の状態に応じて、再結晶ステンレス鋼を冷却してオーステナイト系ステンレス鋼（冷却速度：２００～４００℃／ｓｅｃ．）を得た。

【0131】

３１６型ステンレス鋼および他の金属は、平均結晶粒径を制御するために同じプロセスに供することができることが理解されるべきである。

【0132】

本明細書に記載される圧延処理および加熱による再結晶を用いて得られる金属材料は、表面に限らずナノ構造（例えば平均結晶粒径）を有する。例えば、金属材料はその加工の間、そのナノ構造を維持することができ、その結果、均一なナノ構造を有する金属材料が得られる。

【0133】

実施例２－平均結晶粒径の測定
上記で得た金属材料の試験サンプルを、イオンポリッシャー（「ＩＭ４０００」、日立ハイテクノロジーズ社製）を用いてアルゴンイオンで研磨した。その後、結晶方位解析機能を有する電子顕微鏡（「ＳＵ－７０」、日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて、室温の真空環境下（１×１０^－３Ｐａ）で金属材料の平均結晶粒径を測定した。各結晶粒の大きさは、結晶粒の形状を結晶粒の面積と同じ面積を持つ円と仮定し、任意の測定範囲（すなわち、観察画像；倍率：１０００倍）で各結晶粒の面積を求め、円の直径を算出して求めた。結晶粒の面積および結晶粒の面積と同じ面積を有する円の直径を、画像処理装置（ＴＳＬＯＭＩＡｎａｌｙｓｉｓ７、ＴＳＬＳｏｌｕｔｉｏｎｓ製）を用いて算出した。そして、任意の測定範囲における全ての結晶粒径の和を結晶粒の数で除し、得られた値を平均結晶粒径（ｎｍ）と定義した。

【0134】

実施例３－非研磨金属材料の抗菌性

【0135】

方法：
細菌を最初に一晩培養した。濃度が１０^５に達した後、最近を金属材料サンプル（３０４型ステンレス鋼サンプル）と混合し、２４時間培養した。次いで、３０４型ステンレス鋼サンプルを蒸留水で洗浄し、１０分間超音波処理した。サンプルをさらに１０秒間ボルテックスにかけた後、各サンプルのいくつかの希釈物を寒天プレート上に置いた。寒天プレートを１２時間培養した。

【0136】

結果：

【0137】

図１Ａ、１Ｂは、それぞれ培養後のグラム陽性菌またはグラム陰性菌のコロニー形成単位を、結晶粒の平均結晶粒径に対してプロットして得られた応答プロファイルの一例を示す。

【0138】

図１Ａに示すように、金属材料に吸着されたグラム陽性菌の数は、平均粒径が０．５μｍ、１μｍ、１．５μｍ、３μｍおよび９μｍである場合に比較的減少し、試験した金属材料がグラム陽性菌の増殖／接着を阻害することを示した。特に、図１Ａは、０．５μｍの平均結晶粒径を有する金属材料上のグラム陽性菌の数の一般的な減少を示す。図１Ｂに示すように、平均結晶粒径が０．５μｍ、３μｍ、および９μｍである場合、金属材料上に吸着された細菌の数は相対的に減少し、試験した金属材料がグラム陰性菌の増殖／接着を阻害することを示した。図１Ａは、０．５μｍの平均結晶粒径を有する金属材料上のグラム陰性菌、特に大腸菌の数の一般的な減少を示す。

【0139】

実施例４－非研磨金属材料対研磨材料の抗菌性

【0140】

非研磨金属材料対研磨材料の抗菌性を測定した。

【0141】

方法：
試料：表３に示す３０４型ステンレス鋼：径（φ）１１ｍｍ、厚さ０．１ｍｍ。

【表3】

【0142】

第１のステップでは、３Ｍラッピングフィルム砥石アルミナを使用してサンプルを粗研磨した。

【0143】

試料を、最初に、５枚の３ＭラッピングフィルムメッシュＮｏ．４０００（３μｍ）を用いて、手で約４０秒間研磨した。次に、試験片を３ＭラッピングフィルムメッシュＮｏ．８０００（１μｍ）により約４０秒間手で研磨した。次に、試料を３ＭラッピングフィルムメッシュＮｏ．１５０００（０．３μｍ）により約４０秒間手で研磨した。

【0144】

第２のステップでは、アルミナ溶液を用いてサンプルをアルミナ研磨し、テーブル上の研削機を用いてバフ研磨した。使用したアルミナ溶液は、φ１μｍアルミナとφ０．０５μｍアルミナ（φ１μｍアルミナ：Buehler Micro Polish II Alumina １，０μｍ；φ０．０５μｍアルミナ：BuehlerMasterPrep Polishing Suspension ０．０５μｍ）の混合液である。

【0145】

図６に示すように、サンプルを第１の方向Ａを維持しながら５分間、第２の方向Ｂを維持しながら５分間、方向Ａを維持しながら５分間、方向Ｂを維持しながら５分間、合計２０分間研磨した。

【0146】

第３のステップでは、サンプルを次のように洗浄した：（１）まず水により洗浄した：最初にサンプルを希釈した中性洗浄剤中及び水道水中にて手で柔らかく洗浄し、次に蛇口からの流水で洗浄し、次にサンプルを柔らかく拭いてサンプルを乾燥させた；（２）次にサンプルをエタノール中に置き、サンプルを取り出し、サンプルを柔らかく拭いて静置することでサンプルを乾燥させた。

【0147】

図２Ａ、２Ｂは、平均粒径が０．５、１、１．５の金属材料に吸着した細菌数を示す。２μｍ、３μｍおよび９μｍは、金属材料は研磨されたときに相対的に減少した。

【0148】

実施例５－細胞毒性ＭＴＳアッセイ
方法：

【0149】

ヒト胎児骨芽細胞（ＨＦＯｂ）を、金属材料サンプルを含む１２ウェルプレートに播種した。細胞培地を２日毎に交換した。細胞増殖アッセイのために、ＭＴＳ試薬を３、５、および７日後に添加して、生きている細胞の数を決定した。

【0150】

結果：

【0151】

図３Ａおよび図３Ｂは、金属材料は細胞毒性を有しないことを示す。ほとんどのサンプルについて、生存率は、３つの読み取り値（３、５、および７日）すべてについて８０％以上であった。７日目には、全ての読み取り値は１００％以上の生存率を示した。より高い生存率は、金属材料サンプルが細胞増殖を促進したことを示した。

【0152】

研磨サンプルについては、全ての読み取り値が９０％～１２０％の間の細胞生存率を示した。５日目について、全てのサンプルは１００％より高い細胞生存率を示し、金属材料サンプルが細胞増殖を促進したことを示した。非研磨サンプルは、研磨サンプルよりも高い細胞生存率を示した。９μｍの平均粒径を有する金属材料は、非研磨サンプルで最大の生存率を示した。

【0153】

実施例６－平均粒径との関係で表面積に対して正規化した大腸菌、多剤耐性大腸菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌のコロニー形成単位に対する３０４型ステンレス鋼の抗菌性

【0154】

方法
この実施例では平均結晶粒径が０．５、１．５、２、３および９μｍの３０４型ステンレス鋼材料を用いた。

【0155】

汚染がないことを確実にするために、サンプルを、アセトン、続いて７０％エタノール、およびＤＩ水で３回、１０分間超音波処理することによって洗浄した。

【0156】

次いで、サンプルを２４ウェルプレートのウェルに個別に入れ、ＵＶ光下で一晩滅菌した。細胞播種の前に、サンプルをＰＢＳで２回リンスして、あらゆる可能なデブリを除去した。次に、調製した細菌懸濁液０．５ｍＬ（１０^６細胞／ｍＬ）をそれぞれのサンプルに添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２に維持した固定インキュベーターに入れた。２４時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出した。各ウェルからの接種物を吸引し、１ｍｌのＰＢＳで置き換えた。滅菌２４ウェルプレートのウェルを１ｍｌのＰＢＳで満たし、サンプルをプレートに移した。サンプルをＰＢＳでさらに３回洗浄した（合計４回のＰＢＳリンス）。最終ＰＢＳ洗浄液は吸引しなかった。プレートを冷却水浴中で１５分間超音波処理した。

【0157】

プレートを短時間ボルテックスにかけ、１０μｌの溶液をピペットにより３連で寒天プレート上に移した。次いで、このストック（０希釈）を、ＰＢＳ中で１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００、および１：１０００００に希釈し、そして各希釈物を寒天プレート上にピペットで移した。次いで、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、インキュベーションの約１２～１４時間後に手動で計数した。

【0158】

この実施例で使用した方法では、サンプルを４回洗浄して（１＋３回）、プランクトン細胞を除去したが、これらの細胞はサンプルに接着せず、自由に浮遊している。サンプルを注意深く洗浄して、固着細菌を破壊しないようにする。１５分間の超音波処理は、表面からの細菌の分離を可能にした。固着細菌を計数することにより、バイオフィルム形成細菌の評価およびサンプル表面上のバイオフィルム防止が可能になった。細菌がサンプル表面に付着し、感染を引き起こすことがあり、バイオフィルム形成がその感染の特徴であることを理解されたい。

【0159】

結果

【0160】

図９は、平均結晶粒径を０．５μｍに減少させると、試験した全ての菌株について、金属材料の表面への細菌接着が減少することを示す。試験した菌はグラム陰性菌、グラム陽性菌、薬剤耐性菌、薬剤感受性菌などである。この減少は多剤耐性大腸菌（MDR E. coli）細菌の場合により顕著であった。多剤耐性大腸菌の増殖は、他の粒径と比較して、平均粒径が０．５μｍでは４～４９倍の大きさで阻害された。

【0161】

実施例７－サフラニンを用いたバイオフィルム形成試験
方法

【0162】

汚染がないことを確実にするために、サンプルを、アセトン、続いて７０％エタノール、およびＤＩ水で３回、１０分間超音波処理することによって洗浄した。次いで、サンプルを２４ウェルプレートのウェルに個別に入れ、ＵＶ光下で一晩滅菌した。細胞播種の前に、サンプルをＰＢＳで２回リンスして、あらゆる可能な破片を除去した。次に、調製したバクテリア懸濁液０．５ｍＬ（１０^６細胞／ｍＬ）をそれぞれの試料に添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２に維持した固定インキュベーターに入れた。２４時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出した。接種物を各ウェルから吸引し、１ｍｌのＰＢＳで置き換えた。滅菌２４ウェルプレートのウェルを１ｍｌのＰＢＳで満たし、サンプルをプレートに移した。ウェルをＰＢＳでさらに３回洗浄した（合計４回のＰＢＳリンス）。

【0163】

サンプルをサフラニン（０．１％ｗ／ｖ）で５分間染色した。サフラニンは異なる組織および細胞を識別および同定するために、組織学および細胞学において使用されるカチオン性色素である。サフラニンを使用して、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を染色する。

【0164】

サンプルを１ｍｌのＰＢＳを用いて３～４回洗浄した（ＰＢＳの色がなくなるまで）。

【0165】

サフラニンを９５％エタノールを用いて再溶解した。それぞれのウェルからの再溶解されたサフラニンの吸光度を、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、５７０ｎｍに設定された吸光度の波長λ_ａｂで測定した

【0166】

結果

【0167】

図１３は、平均結晶粒径を０．５μｍに減少させると、試験した全ての菌株についてサンプルの表面上のバイオフィルム形成が減少することを示す。試験した菌はグラム陰性菌、グラム陽性菌、薬剤耐性菌、薬剤感受性菌などである。

【0168】

バイオフィルム形成プロセスは、３つのステップを含むことを理解されたい：
１－吸着、すなわちコレクター表面（すなわち基質またはサンプル）上への生物の蓄積。
２－付着、すなわち生物とコレクターとの間の界面の統合（しばしば、生物とコレクターとの間のポリマー架橋の形成を含む）。
３－コロニー形成、すなわちコレクター表面上での生物の増殖と分裂。（Garrett, T.R., Bhakoo, M. and Zhang, Z., 2008. Bacterial adhesion and biofilms on surfaces. Progress in Natural Science, 18(9), pp.1049-1056参照)

【0169】

０．５μｍサンプルのバイオフィルム防止率を、他の粒径（すなわち、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ）と比較して計算した：

【0170】

大腸菌の場合、１．５、２、３μｍの平均結晶粒径サンプルと比較して、２１～３４％のバイオフィルム防止が観察された。

【0171】

多剤耐性大腸菌の場合、１．５μｍ、２μｍ、３μｍの平均結晶粒径サンプルと比較して、１０～２８％のバイオフィルム防止が観察された。

【0172】

ＭＲＳＡの場合、１．５μｍ、２μｍ、３μｍの平均結晶粒径サンプルと比較して、２９～４４％のバイオフィルム防止が観察された。

【0173】

表皮ブドウ球菌の場合、１．５μｍ、２μｍ、３μｍの平均結晶粒径サンプルと比較して、３０～４１％のバイオフィルム防止が観察された。

【0174】

実施例８－粒径の効果線維芽細胞増殖
ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１１０（商標））に対する金属材料の細胞毒性を調べた。

【0175】

方法

【0176】

最初に、ヒト皮膚線維芽細胞を、完全培地（１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリンストレプトマイシンを含むイーグル最小必須（ＥＭＥＭ）培地）中で、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃のフラスコ中で別々に培養した。

【0177】

次いで、細胞を４８ウェルプレートに金属ワイヤサンプルとともに５，０００細胞／ウェルで１０００μＬの細胞培地中に播種し、５％ＣＯ２加湿雰囲気中、３７℃で３、５、および７日間培養した。

【0178】

培養期間の後、培養培地を除去し、新鮮な培地（２００μＬ＋１０００μＬのＥＭＥＭ）中で１：５希釈した１０００μＬのＭＴＳ溶液で置き換えた。このとき、ウェルプレートをちょうど３時間培養し、変色させた。吸光度プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）にて４９０ｎｍで吸光度を測定した。データは、細胞生存率のパーセンテージとして表した。

【0179】

試験した金属サンプルは以下に示すように、異なる直径および異なる平均粒径を有する３１６型ステンレス鋼ワイヤおよび３０４型ステンレス鋼ワイヤであった：

【0180】

３０４型ステンレス鋼サンプル：試験した金属サンプルは、異なる直径（φｍｍ）および異なる平均粒径（μｍ）を有する３０４型ステンレス鋼ワイヤであった。
ＣＧ３０４ φ０．８粒径２１．５μｍ
ＣＧ３０４ φ０．４粒径１２．０μｍ
ＣＧ３０４ φ０．２粒径１５．０μｍ
ＵＦＧＳＳ３０４ φ０．８粒径０．２７μｍ
ＵＦＧＳＳ３０４ φ０．４粒径０．２２μｍ
ＵＦＧＳＳ３０４ φ０．２粒径０．２３μｍ

【0181】

使用した３０４型ステンレス鋼金属サンプルの化学組成を以下の表に示す：

【表4】

【0182】

３１６型ステンレス鋼サンプル：試験した金属サンプルは、異なる直径（φｍｍ）および異なる平均粒径（μｍ）を有する３１６型ステンレス鋼ワイヤであった。
ＣＧ３１６ φ０．８粒径１６．５μｍ
ＣＧ３１６ φ０．４粒径１０．７μｍ
ＣＧ３１６ φ０．２粒径７．１μｍ
ＵＦＧＳＳ３１６ φ０．８粒径０．２５μｍ
ＵＦＧＳＳ３１６ φ０．４粒径０．２２μｍ
ＵＦＧＳＳ３１６ φ０．２粒径０．１８μｍ

【0183】

使用した３１６型ステンレス鋼金属サンプルの化学組成を以下の表に示す：

【表5】

【0184】

試験したサンプルの直径サンプルおよび面積サンプルを以下の表に示す：

【表6】

【0185】

図４Ａ～４Ｃは、３０４型ステンレス鋼金属サンプル上で増殖させた場合のヒト皮膚線維芽細胞の生存率パーセントを示す。図４Ｃは、超微細３０４型ステンレス鋼金属サンプルについて０．２２μｍおよび０．２７μｍの平均結晶粒径がヒト皮膚線維芽細胞を促進することを示した。

【0186】

図５Ａ～５Ｃは、３１６型ステンレス鋼金属サンプル上で増殖させた場合のヒト皮膚線維芽細胞の生存率パーセントを示す。図５Ｃは、従来の金属サンプルについて、１６．５μｍの平均粒径がヒト皮膚線維芽細胞を促進することを示した。

【0187】

実施例９：３０４型ステンレス鋼の磁気分極と粒径がコロニーを形成する細菌に及ぼす影響
方法

【0188】

振動試料型磁力計（VSM, The LakeShore 7407 VSM）を用いて、サンプルの磁化率を調べた（図８）。使用したサンプル容積は６．２ｍｍ^３と等しく、試験したすべての粒径を通して同じであった。

【0189】

種々の平均結晶粒径（０．５μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、９μｍ、１０μｍ）の３０４型及び３１６型ステンレス鋼の磁化率を測定するために振動試料型磁力計を室温で用いた。試料をサンプルホルダーおよび－１０００～＋１０００エルステッド（Ｏｅ）の範囲の磁場に固定して、それらの磁化率を測定した。（ｎ≧２）．

【0190】

この実施例では、異なる平均結晶粒径（０．５μｍ、１μｍ、および９μｍ）を有する３０４型ステンレス鋼を使用した。

【0191】

サンプルは０．１テスラ磁石（０．１Ｔ），０．５テスラ磁石（０．５Ｔ）及び１．１テスラ磁石（１．１Ｔ）で磁化した。

【0192】

結果

【0193】

図１０は、３０４型ステンレス鋼サンプル（０．１Ｔ、０．８Ｔ、１．１Ｔ）の磁気モーメントを制御することが、未処理（ＵＴ）または消磁（ＤＭ）３０４型ステンレス鋼サンプルと比較して、サンプルへの細菌接着を減少させたことを示す。磁化サンプルは、細菌接着のより有意な減少を示した。統計分析は、未処理サンプル（ＵＴ）との差を表す。

【0194】

０．５μｍおよび１μｍの平均結晶粒径を有する３０４型ステンレス鋼サンプルは、９μｍ粒サンプルと比較して、それらの最大の磁化率のために、細菌接着／バイオフィルム形成をより減少させることを実証した。

【0195】

表７に０．１Ｔにおける磁気モーメントを示す。

【表7】

【0196】

表７は平均結晶粒径を減少させると、３０４型ステンレス鋼サンプルの磁化率が増加し、０．５μｍの平均結晶粒径を有する３０４型ステンレス鋼サンプルは、１４４．９８±８．９０ｍｅｍｕを超える最大の磁化率を実証したことを示す。

【0197】

例１０骨増殖
方法

【0198】

２６０００個のヒト胎児骨芽細胞（≒２×１０^４細胞ｃｍ^－２）を、組織培養処理した２４ウェルプレート内に、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含む５００μＬの適切な培養培地とともに、標本当たり播種した。このプレートを、３７℃の静止条件下で、５％ＣＯ_２に富んだ環境下で、３、２４、および７２時間インキュベートした。インキュベーション期間後、各標本の表面に接着した細胞の代謝活性を定量した。簡単に述べると、上にある培地を注意深く吸引し、２０％ＭＴＳ試薬を含有する適切な培地と交換した。細胞を暗所で３７℃、５％ＣＯ_２で３時間、ＭＴＳ混合物とともにインキュベートした。培養後、それぞれのウェルの吸光度を、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４９０ｎｍに設定した吸光度の波長λ_ａｂで測定した。入手したＯＤデータを、図表を用いて統計的に分析した。異なる平均結晶粒径（０．５、１、９μｍ）の３０４型ステンレス鋼を本試験で用いた。

【0199】

結果

【0200】

図１１はインキュベーション後３時間後に、より多くの数の骨芽細胞が、磁化された３０４ステンレスサンプルに接着したことを示す。加えて、図１１は１．１Ｔ磁石を用いた平均結晶粒径０．５および１μｍを有する３０４型ステンレスサンプルの磁化は細胞接着性を増加させるが、平均結晶粒径９μｍを有する３０４型ステンレスサンプルの磁化は細胞接着性に影響を及ぼさないことを示す。

【0201】

図１２Ａ～Ｃは、試験した０．５μｍ（図１２Ａ）、１μｍ（図１２Ｂ）または９μｍ（図１２Ｃ）の平均結晶粒径を有する全ての磁化された３０４型ステンレスサンプルが、インキュベーション後７２時間まで細胞接着および増殖を支持することを示す。さらに、図１２Ａ～Ｃは、インキュベーション後７２時間での消磁（ＤＭ）サンプル上での最低の増殖を実証した。

【0202】

実施例１１：平均粒径、磁気特性、および表面エネルギーの関係において、細菌コロニー形成単位上の３１６型ステンレス鋼の抗菌性。
方法

【0203】

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を最初に一夜インキュベートした。１０⁵の濃度に達した後、細菌を金属材料サンプルと混合し、２４時間インキュベートした。次いで、サンプルを蒸留水で洗浄し、１０分間超音波処理した。サンプルをさらに１０秒間ボルテックスにかけた後、各サンプルのいくつかの希釈物を寒天プレート上に置いた。寒天プレートを１２時間インキュベートした。

【0204】

材料

【0205】

使用した３１６型ステンレス鋼金属サンプルの化学組成を以下に示す。

【表8】

【0206】

試験した金属サンプルは直径φ０．４ｍｍを有し、異なる粒径を有する３１６型ステンレス鋼ワイヤであった：平均粒径０．２２μｍの超微細材料および平均粒径１０．７μｍの従来材料。

【0207】

サンプルを振動試料型磁力計（7400-S Series VSN, Lake Shore）サンプルホルダー上に置いた。読み取り値は、５０００Ｏｅ～－５０００Ｏｅの磁場範囲で設定した。

【0208】

結果

【0209】

以下に、結晶粒の平均結晶粒径、磁気特性および表面エネルギーに対する応答量（ＣＦＵ／ｃｍ^２）の結果を示す。

【表9】

【0210】

平均結晶粒径が１０．７μｍ（５２０ＣＦＵ／ｃｍ^２）の場合と比較して、平均結晶粒径が０．２２μｍ（６ＣＦＵ／ｃｍ^２）の場合、３１６型ステンレス鋼金属材料ワイヤ上のＭＲＳＡのＣＦＵ／ｃｍ^２は減少した。平均結晶粒径が１０．７μｍ（３３２．１４ｍＮ／ｍ）の場合と比較して、平均結晶粒径が０．２２μｍ（３７．３９ｍＮ／ｍ）の場合、サンプルの表面エネルギーは減少した。理論に束縛されるものではないが、金属サンプルの表面エネルギーが４２ｍＮ／ｍに近い場合、３１６Ｌ型ステンレス鋼金属材料へのＭＲＳＡの接着は減少する。平均結晶粒径が１０．７μｍの従来の３１６型ステンレス鋼ワイヤと比較して、平均結晶粒径が０．２２μｍの３１６型ステンレス鋼ワイヤでは加工硬化による磁気モーメントの増加が観察される。

【0211】

実施例１２－平均粒径、磁気特性、表面エネルギーの関係での細菌コロニー形成単位に対する３１６型ステンレス鋼の抗菌性
方法

【0212】

緑膿菌を最初に一晩インキュベートした。１０^５の濃度に達した後、細菌を金属材料サンプルと混合し、２４時間インキュベートした。次いで、サンプルを蒸留水で洗浄し、１０分間超音波処理した。サンプルをさらに１０秒間ボルテックスにかけた後、各サンプルのいくつかの希釈物を寒天プレート上に置いた。寒天プレートを１２時間インキュベートした。

【0213】

材料

【0214】

使用した３１６型ステンレス鋼金属サンプルの化学組成を以下の表に示す。

【表10】

【0215】

試験した金属サンプルは直径φ０．８ｍｍの３１６型ステンレス鋼ワイヤであり、異なる粒径を有していた：平均粒径０．２５μｍの超微細材料サンプルおよび平均粒径１６．５μｍの従来の材料サンプル。サンプルを振動試料型磁力計（7400-S Series VSN, Lake Shore）サンプルホルダー上に置いた。読み取り値は、５０００Ｏｅ～－５０００Ｏｅの磁場範囲で設定した。

【0216】

結果

【0217】

以下に、結晶粒の平均結晶粒径、磁気特性および表面エネルギーに対する応答量（ＣＦＵ／ｃｍ^２）の結果を示す。

【表11】

【0218】

平均粒径が１６．５μｍ（７３ＣＦＵ／ｃｍ^２）の場合と比較して、平均粒径が０．２５μｍ（２４ＣＦＵ／ｃｍ^２）の場合、３１６型ステンレス鋼金属材料ワイヤ上の緑膿菌のＣＦＵ／ｃｍ^２は減少した。３１６型ステンレス鋼金属材料ワイヤの表面エネルギーは、平均結晶粒径が１６．５μｍ（９７１ｍＮ／ｍ）である場合と比較して、平均結晶粒径が０．２５μｍ（１．８７ｍＮ／ｍ）である場合に減少した。理論に束縛されるものではないが、金属サンプルの表面エネルギーが約４２ｍＮ／ｍに近い場合、緑膿菌の３１６Ｌ型ステンレス鋼金属材料への接着は減少する。加工硬化による磁気モーメントの増加は、１６．５μｍ平均粒径を有する従来の３１６型ステンレス鋼ワイヤと比較して、０．２５μｍ平均粒径を有する３１６型ステンレス鋼ワイヤで観察される。

【0219】

実施例１３－平均粒径、磁気特性、表面エネルギーの関係での細菌コロニー形成単位に対する３０４型ステンレス鋼の抗菌性
方法

【0220】

ＭＲＳＡを最初に一晩インキュベートした。１０^５の濃度達した後、細菌を金属材料サンプルと混合し、２４時間インキュベートした。次いで、サンプルを蒸留水で洗浄し、１０分間超音波処理した。サンプルをさらに１０秒間ボルテックスにかけた後、各サンプルのいくつかの希釈物を寒天プレート上に置いた。寒天プレートを１２時間インキュベートした。

【0221】

材料

【0222】

使用した３０４型ステンレス鋼金属サンプルの化学組成を以下の表に示す。

【0223】

【表12】

【0224】

試験した金属サンプルは直径φ０．８ｍｍの３０４型ステンレス鋼ワイヤであり、異なる粒径を有していた：平均粒径０．２７μｍの超微細材料サンプルおよび平均粒径２１．５μｍの従来の材料サンプル。

【0225】

【0226】

結果

【0227】

結晶粒の平均結晶粒径、磁気特性、表面エネルギ－に対する対応量（ＣＦＵ／ｃｍ^２）の結果を下表に示す。

【表13】

【0228】

平均粒径が２１．５μｍ（８２ＣＦＵ／ｃｍ^２）の場合と比較して、平均粒径が０．２７μｍ（２３ＣＦＵ／ｃｍ^２）の場合に、３０４型ステンレス鋼金属材料ワイヤ上のＭＲＳＡのＣＦＵ／ｃｍ^２は減少した。３０４型ステンレス鋼金属材料ワイヤの表面エネルギーは、平均結晶粒サイズが２１．５μｍの場合の１５．０８ｍＮ／ｍと比較して、平均結晶粒サイズが０．２７μｍの時、３２４．２７ｍＮ／ｍであった。加工硬化による磁気モーメントの増大はまた、平均粒径２１．５μｍの従来の３０４型ステンレス鋼ワイヤと比較して、平均粒径０．２７μｍの３０４型ステンレス鋼金属材料ワイヤで観察される。理論に束縛されることなく、３０４型ステンレス鋼金属については、磁気モーメントが増加すると、表面エネルギー効果が弱くなる。

【0229】

（実施例１４）：チタン合金を用いた骨芽細胞増殖データ
ヒト胎児骨芽細胞（ｈＦＯＢ）（ＣＲＬ－１１３７２，ＡＴＣＣ）細胞毒性試験

【0230】

ヒト胎児骨芽細胞を、完全培地（１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリンストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２））中で、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃のフラスコ中で別々に培養した。次いで、細胞を４８ウェルプレートにワイヤサンプルとともに５，０００細胞／ウェルで１０００μＬの細胞培地中に播種し、５％ＣＯ２加湿雰囲気中、３７℃で３、５、および７日間培養した。培養期間の後、培養培地を除去し、新鮮な培地（１００μＬ＋９００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で１：１０希釈した１０００μＬのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ溶液で置き換えた。このとき、ウェルプレートを４５分間培養し、変色させた。蛍光を、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）下で、５６０ｎｍ励起波長および５９０ｎｍ発光波長で測定した。データは、細胞生存率のパーセンテージとして表した。

【0231】

使用したチタン合金サンプルを表１２に示す。

【表14】

【0232】

表１３は、チタン合金対照サンプルの組成を示す

【表15】

【0233】

ヒト胎児骨芽細胞（ｈＦＯＢ）細胞を用いる細胞増殖アッセイ。

【0234】

試験した全てのサンプルについて、生存率のパーセンテージは、７日間の培養の間、８０％より高く、ｈＦＯＢ細胞に対して比較的低い細胞毒性を示した（図７を参照のこと）。

【0235】

さらに、生存価のパーセンテージはほとんどの場合１００％より高く、これは新鮮な培地のみと接触して増殖した細胞の数と比較して、サンプルの存在下で増殖した細胞の数がより多いことを示す。理論に束縛されるものではないが、細胞はチタンサンプルの上部で増殖し、チタンサンプルはそれらの増殖を促進した。

【0236】

細胞生存率のパーセンテージは、５日後に３．１μｍ、２μｍ、および０．８μｍの粒径を有するサンプルについてわずかに減少した。

【0237】

本明細書の開示は特定の実施形態を参照して説明されてきたが、これらの実施形態は本開示の原理および用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示的な実施形態に対して多数の変更を行うことができ、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲から逸脱することなく、他の構成を考案することができることを理解されたい。

【図1A】