特表 2022-513152 腫瘍療法の診断マーカー及び治療標的としてのＭｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】腫瘍療法の診断マーカー及び治療標的としてのＭｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6851 20180101AFI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20220131BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20220131BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20220131BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20220131BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6851 Z

A61K48/00 ZNA

A61P35/00

A61P35/02

A61K31/7088

A61K38/16

C12Q1/686 Z

C12Q1/06

G01N33/574 A

C12N15/12

C07K14/47

C12N15/13

C12N15/113 Z

C12N5/10

C07K16/18

C12N5/09

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021530284

(86)(22)【出願日】2019-11-28

(85)【翻訳文提出日】2021-07-20

(86)【国際出願番号】 EP2019082845

(87)【国際公開番号】W WO2020109439

(87)【国際公開日】2020-06-04

(31)【優先権主張番号】16/206,526

(32)【優先日】2018-11-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520363878

【氏名又は名称】ユニバーシタッツメディズィン デア ヨハネス グーテンベルク－ユニバーシタット マインツ

(71)【出願人】

【識別番号】521228293

【氏名又は名称】ソラックスクリニク－ハイデルベルク ゲーゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】フローリン，ルイーズ

(72)【発明者】

【氏名】ヴステンハーゲン，エレナ

(72)【発明者】

【氏名】シュナイダー，マーク

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QQ79

4B063QQ96

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR48

4B063QR58

4B063QR62

4B063QS10

4B063QS14

4B063QS25

4B063QS33

4B063QS39

4B063QX02

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BB34

4B065BB40

4B065BD39

4B065CA44

4B065CA60

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA21

4C084CA27

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA51

4H045FA74

4H045HA05

4H045HA06

(57)【要約】

本発明は、（ｉ）患者サンプルにおけるＭｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）またはその一部の発現レベルを決定することと；（ｉｉ）患者サンプルのＭＹＰＯＰの発現レベルを正常サンプルのレベルと比較することと；（ｉｉｉ）正常サンプルのレベルと比較した患者サンプルのＭＹＰＯＰ発現のレベルを、癌の陽性または陰性の診断または予後と相関させることと、を含む、癌の診断または予後のための方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌の診断または予後のための方法であって、
（ｉ）患者サンプルにおけるＭｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）またはその一部の発現レベルを決定することと；
（ｉｉ）前記患者サンプルのＭＹＰＯＰの発現の前記レベルを正常サンプルのレベルと比較することと；
（ｉｉｉ）前記正常サンプルの前記レベルと比較した前記患者サンプルのＭＹＰＯＰ発現の前記レベルを、癌の陽性または陰性の診断または予後と相関させることと、を含む、方法。

【請求項2】

前記患者サンプル中のＭＹＰＯＰタンパク質の減少または欠如が、癌の陽性診断を示す、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＭＹＰＯＰのタンパク質発現の前記レベルを比較することが、約６０ｋＤａの分子量を有するＭＹＰＯＰの大きい形態（ＭＹＰＯＰ Ｌ形態）を同定することを含み、前記患者サンプルにおける前記ＭＹＰＯＰ Ｌ形態の欠如が、癌の陽性診断を示す、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ＭＹＰＯＰの発現の前記レベルを決定することが、前記患者サンプル中のＭＹＰＯＰ、ＭＹＰＯＰの断片、またはＭＹＰＯＰの短縮型もしくは伸長型のｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現の分析を伴う、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ＭＹＰＯＰタンパク質の前記発現レベルを決定することが、ＭＹＰＯＰに特異的な抗体を用いて実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ＭＹＰＯＰタンパク質を測定することが、ＭＹＰＯＰのＮ末端に特異的な抗体を用いて実施される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記患者サンプルにおいて決定されるＭＹＰＯＰが、ＭＹＰＯＰのアミノ酸配列をコードする配列番号１の核酸配列、または１つ以上の縮重核酸によって置換され、その結果、ＭＹＰＯＰの同じアミノ酸配列をもたらすそのバリアントを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記患者サンプルにおいて決定されるＭＹＰＯＰが、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の核酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を共有し、その一方で、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの生物学的活性を保持するその相同体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記患者サンプルにおいて決定されるＭＹＰＯＰが、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列、または１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって欠失され、付加され、または置換され、その一方で、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの前記生物学的活性を保持している、それらのバリアントを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記患者サンプルにおいて決定されるＭＹＰＯＰが、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性を共有する他の種に見られ、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの前記生物学的活性を保持しているＭＹＰＯＰの相同体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

ＭＹＰＯＰの発現の前記レベルを決定することが、配列番号１～５に記載の前記配列またはその一部のいずれか１つを使用して、ＭＹＰＯＰの前記ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを定量的または定性的に分析することによって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

有効量のＭｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）を患者の腫瘍細胞に投与するかまたは導入することにより、腫瘍疾患を治療するかまたは予防する方法。

【請求項13】

前記投与することが、前記腫瘍細胞においてＭＹＰＯＰタンパク質またはその一部（Ｎ末端）を発現することによって行われる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記腫瘍疾患が、発癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘発性癌または前癌段階であるか、または潜伏感染を治癒させるための、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記腫瘍疾患が、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、頸癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、白血病、腎癌、膀胱癌、または子宮内膜癌からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

Ｍｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項17】

ＭＹＰＯＰが、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の核酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を共有し、その一方で、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの生物学的活性を保持するその相同体を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

ＭＹＰＯＰが、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列、または１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって欠失され、付加され、または置換され、その一方で、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの生物学的活性を保持している、それらのバリアントを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記ＭＹＰＯＰが、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性を共有する他の種に見られ、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの前記生物学的活性を保持しているＭＹＰＯＰの相同体を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項20】

腫瘍疾患の治療または予防に使用するための、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記腫瘍疾患が、発癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘発性癌もしくは前癌段階または潜伏性ウイルス感染である、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記腫瘍疾患が、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、頸癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、白血病、腎癌、膀胱癌、または子宮内膜癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項23】

Ｍｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）の阻害剤を含む培地での細胞のインキュベーションを含む、細胞培養における細胞増殖を増強する方法。

【請求項24】

前記阻害剤が抗体である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記阻害剤がプロフィリン、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡである、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記ＭＹＰＯＰ遺伝子が、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳ９技術によって導入されるＭＹＰＯＰ遺伝子ノックアウトによって突然変異されるかまたは除去される、請求項２３に記載の方法。

【請求項27】

ＭＹＰＯＰの前記発現レベルが、ＭＹＰＯＰのタンパク質合成を阻害することによって、または細胞内ＭＹＰＯＰタンパク質を分解することによって低下する、請求項２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｍｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）の発現または生物学的活性を標的とすることによって癌を検出し、阻害するための組成物及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｍｙｂ関連転写因子（ＭＹＰＯＰ）は、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物において相同体が同定されている新規タンパク質である。ＭＹＰＯＰのオーソロガスマウスタンパク質ｐ４２^ＰＯＰは、最小ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターに導入されたときに、コンセンサスＭｙｂ認識エレメント（ＭＲＥ）を抑制できることが示された（Ｌｅｄｅｒｅｒ Ｍ．Ｊｏｃｋｕｓｃｈ ＢＭ，Ｒｏｔｈｋｅｇｅｌ Ｍ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐ４２^ＰＯＰ，ａ ｎｏｖｅｌ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００５；１１８：３３１－４１）。ＭＹＰＯＰは、両方のウイルスの長い制御領域（ＬＣＲ）活性を抑制するため、発癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型及び１８型の制限因子として作用することが発明者によって以前に発見された（Ｗｕｓｔｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＹＰＯＰ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｈｏｓｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７ Ｊｕｌｙ ２０１８）。ＭＹＰＯＰが転写後レベルでＨＰＶ形質転換された腫瘍細胞内で排除されることが本発明者らによってさらに発見された。このように、ＭＹＰＯＰの総量は、子宮頸癌のウイルスＨＰＶ形質転換細胞株内で大幅に減少することが見出された。

【0003】

現在、本発明者らは、ＭＹＰＯＰが、黒色腫、乳癌、肝細胞癌、及び肺癌のような他のすべての試験された腫瘍細胞においても大幅に下方制御されていることを発見した。これは、肺癌患者の腫瘍サンプルで確認された。これらの原発性肺腫瘍細胞及び他の腫瘍細胞株では、ＭＹＰＯＰの回復により細胞増殖が阻止された。したがって、ＭＹＰＯＰはすべての腫瘍細胞内に存在しない一般的な腫瘍抑制因子であり、ＭＹＰＯＰの回復により癌が治癒される。さらに、本発明者らは、ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡレベルの増加、おそらくＭＹＰＯＰタンパク質喪失後の癌細胞の代償機構が、予後不良及び生存率の低下と相関することを見出した。

【0004】

ＭＹＰＯＰのマウス型であるｐ４２^ＰＯＰは、核内のプロフィリンと相互作用する（Ｌｅｄｅｒｅｒ Ｍ．Ｊｏｃｋｕｓｃｈ ＢＭ，Ｒｏｔｈｋｅｇｅｌ Ｍ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐ４２^ＰＯＰ，ａ ｎｏｖｅｌ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００５；１１８：３３１－４１）。ｐ４２^ＰＯＰは、単一のＭｙｂ様ドメイン、酸性ドメイン、核外輸送シグナル、ロイシンジッパー、及びプロフィリンを媒介するプロリンクラスターの独自の組み合わせを含む。データベースでのアミノ酸配列の比較により、ｐ４２^ＰＯＰは新規のこれまでに同定されていなかったタンパク質であることが明らかになった。ｐ４２^ＰＯＰのＮ末端には、Ｍｙｂ関連転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に似たトリプトファンクラスターモチーフと、それに続くいくつかのＭｙｂタンパク質に存在する転写活性化ドメインを連想させる酸性領域が含まれている。さらに、ｐ４２^ＰＯＰはＭｙｂ ＤＮＡコンセンサス配列に結合し、Ｍｙｂ ＤＮＡコンセンサス配列には、Ｍｙｂ関連ＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端領域が関与している（Ｌｅｄｅｒｅｒ Ｍ．Ｊｏｃｋｕｓｃｈ ＢＭ，Ｒｏｔｈｋｅｇｅｌ Ｍ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐ４２^ＰＯＰ，ａ ｎｏｖｅｌ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００５；１１８：３３１－４１）。

【0005】

これまで、ＭＹＰＯＰ／ｐ４２^ＰＯＰの診断及び医薬特性は調査していないため、依然として不明であった。

【0006】

癌の信頼できる診断及び予後のための新規マーカーを同定し、腫瘍疾患を治療するために、腫瘍細胞を特異的に標的とするが、正常で健康な細胞は標的としない活性剤を所有することは、依然として現代の癌療法の主要な課題である。

【0007】

この背景に対して、本発明の目的は、ヒトまたは動物の患者における腫瘍疾患の診断、予後及び治療のための新規方法及び組成物を提供することである。

【0008】

この目的は、本発明によって提示される方法及び組成物によって解決される。好ましい実施形態は、本発明の特定の態様に関するものであり、従属請求項に記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｌｅｄｅｒｅｒ Ｍ．Ｊｏｃｋｕｓｃｈ ＢＭ，Ｒｏｔｈｋｅｇｅｌ Ｍ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐ４２ＰＯＰ，ａ ｎｏｖｅｌ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００５；１１８：３３１－４１

【非特許文献2】Ｗｕｓｔｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＹＰＯＰ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｈｏｓｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７ Ｊｕｌｙ ２０１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の発明者らは、ＭＹＰＯＰ発現（マウスに見られるｐ４２^ＰＯＰとのヒト等価物／相同体）が入ってくるウイルスを感知し、ウイルス遺伝子の転写を抑制することを示した（Ｗｕｓｔｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＹＰＯＰ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｈｏｓｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７Ｊｕｌｙ２０１８）。

【0011】

これにより、ＭＹＰＯＰは、制限因子として作用し、発癌性ＨＰＶウイルスの感染に対する細胞の許容度を制限する。これにより、ＨＰＶの早期の発癌性発現が抑制され、その後、癌が抑制される。

【0012】

本発明者らは、驚くべきことに、黒色腫、乳癌、肝細胞癌、及び肺癌のような他のすべての試験された腫瘍細胞においても、ＭＹＰＯＰが大幅に下方制御されていることを発見した。一例として、これは肺癌患者の腫瘍サンプルで確認された。これらの原発性肺腫瘍細胞及び他の腫瘍細胞株では、ＭＹＰＯＰの回復により細胞増殖が阻止された。したがって、ＭＹＰＯＰは、すべての腫瘍細胞内に存在しない一般的な腫瘍抑制因子として同定され、ＭＹＰＯＰの回復により癌が治癒されることは明らかである。さらに、本発明者らは、ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡレベルの増加、おそらくＭＹＰＯＰタンパク質喪失後の癌細胞の代償機構が、癌疾患に罹患している患者の予後不良及び生存率の低下と相関することを見出した。

【0013】

本発明において、本発明者らは、ＭＹＰＯＰが、それぞれ約６０ｋＤａ及び４２ｋＤａの分子量を有する２つのアイソフォームまたは２つの異なる修飾形態で存在するものとして同定した。本明細書に示すとおり、ＭＹＰＯＰのより大きい（Ｌ）形態は、腫瘍細胞において有意に減少するか、または存在しない。本発明で同定されるとおり、ｍＲＮＡレベルは、腫瘍の進行と負に相関しており、これは、おそらく、ＭＹＰＯＰタンパク質の喪失を補償するものである。これにより、ＭＹＰＯＰは、ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質レベルで分析したときの癌の診断または予後の好適なマーカーになる。

【0014】

癌疾患を診断するかまたはモニターするための本発明の方法では、影響を受けた組織の細胞内におけるＭＹＰＯＰの発現レベルを分析する。この方法は、ヒトまたは動物の患者から単離された腫瘍組織などの生物学的サンプル中のＭＹＰＯＰタンパク質またはＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡを検出すること及び／または定量することを伴う。この方法は、（ｉ）生物学的サンプルを、検出可能な物質で直接的または間接的に標識されたＭＹＰＯＰに特異的な抗体と接触／反応させるステップと、（ｉｉ）検出可能な物質を検出するステップと、を含む。ＭＹＰＯＰタンパク質の発現レベルの低下、または生物学的サンプル中でのＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡの発現レベルの上昇は、対象における腫瘍の存在または進行を示している。

【0015】

本明細書に示すとおり、ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡレベルの上昇は、影響を受けた腫瘍患者の生存に負に相関しており、これにより、ＭＹＰＯＰは、腫瘍の進行を評価するための好適な予後マーカーとなる。ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡの決定または分析は、例えば、ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを使用し、その後定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用することによって実施できる。

【課題を解決するための手段】

【0016】

癌の診断または予後のための方法は、（ｉ）ヒトまたは動物のサンプルであり得る患者サンプルにおけるＭＹＰＯＰまたはその一部の発現レベルを決定することと、（ｉｉ）決定されたＭＹＰＯＰまたはその一部の発現レベルを正常サンプルで観察された発現レベルと比較することと、（ｉｉｉ）正常サンプルの発現レベルに対する患者サンプルでのＭＹＰＯＰ発現のレベルを、癌の陽性または陰性の診断または予後と相関させることと、を含む。

【0017】

患者サンプル中のＭＹＰＯＰタンパク質の発現レベルが低下している場合、またはＭＹＰＯＰのｍＲＮＡが正常な非腫瘍細胞と比較して過剰発現している場合には、癌の陽性診断である可能性が高い。ＭＹＰＯＰタンパク質の継続的な減少または患者サンプル中のＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡレベルの上昇を使用して、腫瘍の進行を定量的に分析し、癌のさらなる発症、したがって生存の定性的な予後を患者に示すことができる。ＭＹＰＯＰの発現レベルが、正常組織内で見られるＭＹＰＯＰの発現レベルに対応している場合には、癌の陰性診断となる。

【0018】

本発明の好ましい実施形態では、約６０ｋＤａのより大きい（Ｌ）形態のＭＹＰＯＰタンパク質が、患者サンプルが癌の陽性または陰性の診断を有するかを決定するための生物学的指標として使用される。ＭＹＰＯＰの６０ｋＤａ Ｌ形態の減少または欠如は、癌の陽性診断を示す。生物学的サンプル中のＭＹＰＯＰのＬ形態の量の定量分析では、腫瘍のさらなる進行の予測が可能になり、したがって、患者における癌のさらなる進行の予後となる。腫瘍細胞におけるＭＹＰＯＰタンパク質レベルまたはＭＹＰＯＰタンパク質発現の回復（例えば、遺伝子療法による）は、細胞分裂の減少及びその後の細胞死をもたらす。このように、ＭＹＰＯＰは、癌の治療及び／または予防のための好適な治療標的である。

【0019】

別の態様では、本発明はまた、ＭＹＰＯＰ、ＭＹＰＯＰ安定化物質またはＭＹＰＯＰ発現促進物質を活性剤として含む医薬組成物に関する。本明細書に示すとおり、ＭＹＰＯＰは、細胞増殖を減少させ、細胞死を誘導する。そのため、ＭＹＰＯＰは、特に抗ウイルス及び／または癌療法に使用できる。これは、ＭＹＰＯＰを患者に投与するか、影響を受けた腫瘍細胞内でＭＹＰＯＰのタンパク質発現を再確立することによって行うことができる。

【0020】

本発明の医薬組成物は、ＭＹＰＯＰ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて影響を受けた腫瘍細胞におけるＭＹＰＯＰ発現を増強する１つ以上の物質のいずれかを含む。本発明の組成物は、子宮頸癌（ＨＰＶ誘発性）などのウイルス誘発性癌、非ＨＰＶ癌、例えば、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、白血病、腎癌、膀胱癌、または子宮内膜癌などの腫瘍疾患の治療または予防に好適である。

【0021】

本発明は、ＭＹＰＯＰ発現の阻害剤を含む培地中での細胞のインキュベーションを含む、細胞培養における細胞増殖を増強する方法にさらに関する。これにより、ＭＹＰＯＰは、細胞量及び結果を増加させるために細胞培養の成長を促進するための好適な標的となる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＭＹＰＯＰがＨＰＶ形質転換癌細胞株において減少することを示す図である。

【図2】ＭＹＰＯＰのＬ形態が、試験したすべての腫瘍細胞株（１：初代細胞、２－４：腫瘍細胞株）中で大幅に減少していることを示す図である。

【図3】ＭＹＰＯＰ Ｌ形態は、扁平上皮癌（Ａ）または腺癌（Ｂ）の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者で大幅に減少していることを示す図である。Ｔ＝腫瘍、Ｎ＝正常組織

【図4】ＭＹＰＯＰの２つの異なるアイソフォーム（Ｌ形態及びＳ形態）が２つの異なる抗体によって示差的に検出できることを示す図である。

【図5】ＭＹＰＯＰのｍＲＮＡレベルが、正常な肺と比較してＮＳＣＬＣ腫瘍組織で２倍増加していることを示す図である。

【図6】腫瘍中及び正常組織中におけるＭＹＰＯＰのｍＲＮＡレベルが、癌ＮＳＣＬＣ患者の全生存率と負に相関していることを示す図である。

【図7】ＭＹＰＯＰが、ＨＰＶ形質転換細胞及び非ウイルス形質転換細胞のコロニー形成を阻害することを示す図である。

【図8】ＭＹＰＯＰの再発現により細胞増殖を減少させ、乳癌細胞での細胞死を誘導することを示す図である。

【図9】ＭＹＰＯＰの再発現が、細胞増殖を減少させ、ＮＳＣＬＣ細胞内で細胞死を誘導することを示す図である。

【図10】ＭＹＰＯＰ－ＦｌａｇまたはＭＹＰＯＰ－Ｎ（ＤＮＡ結合ドメイン）が、プロモーター活性を調節することを示す図である。

【図11】ＭＹＰＯＰ－ＦｌａｇまたはＭＹＰＯＰ－Ｎ（ＤＮＡ結合ドメイン）の両方が、癌細胞の細胞増殖を阻止する際に活性があることを示す図である。

【図12】ＭＹＰＯＰＬ形態が、ＳＵＭＯ－１修飾ＭＹＰＯＰタンパク質であることを示す図である。

【図13】ＭＹＰＯＰタンパク質レベルが、細胞増殖と負に相関していることを示す図である。

【図14】ＭＹＰＯＰの下方制御が、タンパク質発現を増強することを示す図である。

【図15】ＭＹＰＯＰの再発現が、細胞増殖を減少させ、肝臓、肺扁平上皮及び腺癌細胞株内で細胞死を誘導することを示す図である。

【図16】ＭＹＰＯＰ発現レベルによるＭＹＰＯＰ及びＭＹＰＯＰ－Ｃシュードウイルス（ＰｓＶ）のＨＰＶ１６ＰｓＶの形質導入効率の試験を示す図である。

【図17】ＭＹＰＯＰ－ベクター（遺伝子療法）が、ケラチノサイト癌細胞株（治療標的）の細胞増殖を減少させるのにどのように機能するかを示す図である。

【図18】ＭＹＰＯＰ－ベクター（遺伝子療法）が、肺癌細胞株（治療標的）の細胞増殖を減少させるのに機能的であることを示す図である。

【図19】ＭＹＰＯＰ－ベクターが、正常なヒト上皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）に影響を有さないか、または軽度の影響のみ有することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

技術が本明細書に記載されているとおり、使用されるセクションの見出しは組織的な目的のためのみであり、いかなる方法でも主題を制限するものとして解釈されるべきではない。

【0024】

様々な実施形態の詳細な説明では、説明の目的で、開示された実施形態を完全に理解するために、多数の特定の詳細が示されている。しかし、当業者は、これらの様々な実施形態が、これらの特定の詳細の有無にかかわらず実施され得ることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、方法が提示され、実行される特定のステップは、例示的であり、これらのステップは、変更することができ、それでも本明細書に開示される様々な実施形態の趣旨及び範囲内にあることは容易に理解できる。

【0025】

これらに限定されないが、特許、特許出願、記事、本、論文、及びインターネットＷｅｂページなど、本出願で引用されたすべての文献及び同様の資料は、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載の様々な実施形態が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。組み込まれた参考文献の用語の定義が本明細書の教示において提供されている定義と異なると考えられる場合、本明細書の教示において提供されている定義が優先するものとする。

【0026】

定義
本技術の理解を容易にするために、いくつかの用語及び句を以下に定義する。追加の定義は、詳細な説明全体に記載されている。

【0027】

明細書及び特許請求の範囲を通じて、以下の用語は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、本明細書に明示的に関連付けられた意味をとる。

【0028】

「ＭＹＰＯＰ」という用語は、マウス（Ｌｅｄｅｒｅｒ Ｍ．Ｊｏｃｋｕｓｃｈ ＢＭ，Ｒｏｔｈｋｅｇｅｌ Ｍ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐ４２^ＰＯＰ，ａ ｎｏｖｅｌ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００５；１１８：３３１－４１）及びヒト（Ｗｕｓｔｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｙｂ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＹＰＯＰ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｈｏｓｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７ Ｊｕｌｙ ２０１８）においてｐ４２^ＰＯＰとして同定された新規のＭｙｂ関連転写因子を指す。診断または予後については、一部または断片のみを分析に使用するのみで十分である。したがって、「ＭＹＰＯＰ」という用語は、ＭＹＰＯＰの短縮形態または細長い形態も含むものとする。

【0029】

本明細書で使用される「Ｌ形態」という用語は、例えば、ウエスタンブロッティングまたは他の好適な方法によって同定された、６０ｋＤａのＭＹＰＯＰの形態を指す。

【0030】

本明細書で使用される「Ｓ形態」という用語は、例えば、ウエスタンブロッティングまたは他の好適な方法によって同定された、４２ｋＤａのＭＹＰＯＰの形態を指す。

【0031】

本明細書で使用される「一実施形態では」という句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、同じ実施形態を指す場合もある。さらに、本明細書で使用される「別の実施形態では」という句は、異なる実施形態を指す場合もあるが、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らない。したがって、以下に記載するとおり、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わせることができる。

【0032】

さらに、本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」という用語は、包括的「または」演算子であり、文脈が明確に別段の指示をしない限り、「及び／または」という用語と同等である。「をベースにした（ｂａｓｅｄ ｏｎ）」という用語は排他的ではなく、文脈で明確に別段の指示がない限り、記載されていない追加の因子をベースすることが可能になる。さらに、本明細書全体を通して、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数形の言及を含む。「ｉｎ」の意味には、「ｉｎ」及び「ｏｎ」が含まれる。

【0033】

「核酸」という用語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを有する分子を指し、これらは、未修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得る。正確なサイズは、多くの因子に依存し、またオリゴヌクレオチドの最終的な機能もしくは使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせなど、あらゆる方法で生成され得る。ＤＮＡの典型的なデオキシリボヌクレオチドは、チミン、アデニン、シトシン、及びグアニンである。ＲＮＡの典型的なリボヌクレオチドは、ウラシル、アデニン、シトシン、及びグアニンである。

【0034】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖に共有結合により連結したプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的なヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン及びチミジンが挙げられる。

【0035】

「ヌクレオチド」という用語は、糖部分へのエステル結合内で結合された１つ以上のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。例示的なヌクレオチドとしては、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸及び三リン酸が挙げられる。

【0036】

本明細書で使用されるとき、「ｍＲＮＡ」という用語は、一般に、リボヌクレオチドの一本鎖ポリマーを指す。「ＲＮＡ」はまた、主に（すなわち、８０％を超える、または好ましくは９０％を超える）リボヌクレオチドを含むが、任意により少なくとも１つの非リボヌクレオチド分子、例えば、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド及び／または少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含むポリマーを指すことができる。

【0037】

「ＤＮＡ」という用語は、一般に、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子は、自然に合成され得る（例えば、それぞれＤＮＡ複製またはＤＮＡの転写によって）。ＲＮＡ分子は、転写後修飾され得る。ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も、化学的に合成できる。ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子は、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡ及びｓｓＤＮＡ）または多本鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡ及びｄｓＤＮＡ）であり得る。

【0038】

「修飾ヌクレオチド」という用語は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを指す。好ましいヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学的性質を変更するが、ヌクレオチド類似体がその意図された機能を実行する能力を保持するように、任意の位置で修飾される。

【0039】

「変性」という用語は、異なるコドンが１つのアミノ酸をコードできる遺伝暗号を指す（例えば、ＧＵＵ、ＧＵＡ、ＧＵＧ、すべてバリンをコードする）。

【0040】

本明細書で使用される場合、核酸配列に関する「バリアント」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが別の、通常は関連するヌクレオチド酸配列とは異なる核酸配列を指す。アミノ酸配列に関して使用される場合の「バリアント」という用語は、１つ以上のアミノ酸が別の、通常は関連するアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を指す。

【0041】

「相同体」は、他の生物または種に見られるＭＹＰＯＰに関連している。

【0042】

「診断」という用語は、一般に、疾患または障害に対する対象の感受性の決定、対象が現在疾患または障害によって影響を受けているかに関する決定、疾患または障害によって影響を受けている対象の予後（例えば、転移前もしくは転移性の癌性状態、癌の病期、または療法に対する癌の応答性の同定）、及びセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療の効果または有効性に関する情報を提供するために対象の状態をモニターすること）を含む。診断は、好ましくは、対象の病状または状態の検出または同定、対象が所与の疾患または状態を発症する可能性の決定、疾患または状態を有する対象の療法に応答する可能性の決定、疾患または状態を有する対象の予後（またはその可能性のある進行もしくは退行）の決定、ならびに疾患または状態を有する対象に対する治療の効果の決定を含む。例えば、診断は、子宮頸癌または乳癌に罹患している対象の存在もしくは可能性、またはそのような対象が化合物（例えば、医薬品、例えば、薬物）もしくは他の治療に好意的に応答する可能性を検出するために使用できる。

【0043】

本明細書で使用される「マーカー」という用語は、障害関連細胞を正常細胞から区別することによって、障害（例えば、癌性障害）を診断または予知することができる物質（例えば、核酸または核酸の領域）を指す。

【0044】

本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、本発明によって提供される様々な試験または治療法の対象となる生物を指す。「対象」という用語は、動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を含む。

【0045】

本明細書で使用される場合、「癌」、「腫瘍」、及び「癌腫」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、比較的自律的な成長を呈する細胞を指し、その結果、それらは、細胞増殖の制御の有意な喪失を特徴とする異常な成長表現型を示す。

【0046】

一般に、本出願における検出または治療のための目的の細胞としては、前癌性（例えば、良性）、悪性、転移性、及び非転移性の細胞が挙げられる。癌細胞の検出は特に興味深い。

【0047】

「サンプル」または「生物学的サンプル」または「患者サンプル」は、任意の物理的状態（例えば、固体、液体、半固体、蒸気）及び任意の複雑体の、ヒトまたは非ヒト対象からの目的の物質の任意の組成物であり得る。好ましいサンプルは、ヒトまたは動物の対象から得られた動物細胞または組織を含む。好ましくは、サンプルは生体液である。サンプルは、例えば、細胞培養物またはヒト組織であり得る。細胞組織の体液ホモジネートは、開示された方法による検出のためにＭＹＰＯＰを含み得る生体液である。他のものは、血液または尿などの体液組織である。サンプルは、担体、試験管、培養容器、マルチウェルプレート、または他の任意の容器内に含まれ得る。

【0048】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分（断片）、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子を指す。この用語には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び断片、ならびに一本鎖組換え抗体が含まれる。

【0049】

本明細書で使用される場合、「投与する」、「導入する」、「適用する」、「治療する」、「送達する」という用語及びそれらの文法的変形は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで細胞を標的にするためにＭＹＰＯＰを提供するか、または対象にＭＹＰＯＰを含む遺伝子修飾（操作）細胞を提供するために同義的に使用される。

【0050】

「同時投与」という用語及びその変形は、２つ以上の剤を同時に（１つ以上の調製物中で）、または連続して投与することを指す。例えば、１つ以上の型の遺伝子修飾細胞を他の剤と同時投与することができる。

【0051】

「ベクター」という用語は、コード情報（例えば、ＭＹＰＯＰ発現分子）を宿主細胞に伝達するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指すために使用される。「発現ベクター」及び「転写ベクター」という用語は、宿主細胞（例えば、対象の細胞）での使用に好適であり、外因性核酸配列の発現を指示するかつ／または制御する核酸配列を含むベクターを指すために同義的に使用される。イントロンが存在する場合、発現としては、これらに限定されないが、転写、翻訳、及びＲＮＡスプライシングなどのプロセスが挙げられる。

【0052】

本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）という用語は、ＲＮＡの選択的な細胞内分解を指す。ＲＮＡｉは、細胞内で自然に発生し、外来ＲＮＡ（ウイルスＲＮＡなど）を除去する。天然のＲＮＡｉは、分解機構を他の類似のＲＮＡ配列に向ける遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行する。あるいは、ＲＮＡｉは、例えば、ＭＹＰＯＰなどの内因性標的遺伝子の発現を抑制するために、ヒトの手によって開始させ得る。

【0053】

本明細書で使用される場合、「低分子干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）（当技術分野では「短鎖干渉ＲＮＡ」とも呼ばれる）という用語は、ＲＮＡ干渉を指示するかまたは媒介することができる約１０～５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）を指す。

【0054】

本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば、細胞抽出物を含む、その当技術分野で認識されている意味を有する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語はまた、例えば、生物中の生細胞、例えば、生物中の不死化細胞、一次細胞、及び／または細胞株を含む、その当技術分野で認識されている意味を有する。

【0055】

「検出」という用語及びその変形は、標的ＭＹＰＯＰ（ＭＹＰＯＰをコードする核酸配列またはＭＹＰＯＰ遺伝子産物（ポリペプチド））、そのアイソフォーム（例えば、ＭＹＰＯＰのＬ形態）、または剤結合標的の組み合わせなどのその存在または非存在をアッセイもしくは他の方法で決定すること、または肝癌、転移、病期、もしくは同様の状態の１つ以上の事実上の特徴を分析、調査、確認、確立、もしくは他の方法で決定することを含む。この用語は、ＭＹＰＯＰ及び任意により他の癌バイオマーカーの診断、予後、及びモニター用途を含む。（ＭＹＰＯＰタンパク質をコードする核酸分子とは対照的に）ＭＹＰＯＰタンパク質の検出を含む実施形態では、検出方法は、好ましくは、ＥＬＩＳＡベースの方法である。好ましくは、検出方法は、対象からのサンプル中のＭＹＰＯＰの存在、不在、または量に関する情報を出力（すなわち、読み出しまたは信号）に提供する。例えば、出力は、定性的（例えば、「正」または「負」）、または定量的（例えば、ミリリットルあたりのナノグラムなどの濃度）であり得る。

【0056】

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、ＭＹＰＯＰ単独、または研究者、獣医、医師もしくは他の臨床医によって求められている細胞（例えば、組織（複数可））において生物学的または医学的応答を誘発する別の剤との組み合わせの量を意味する。これには、治療されている疾患または障害の症状の緩和及び／または予防が含まれる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与と互換性のある、任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図している。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当技術分野において周知である。

【0057】

診断及び予後マーカーとしてのＭＹＰＯＰ
本発明者らは、ＭＹＰＯＰが上皮で高発現し、子宮頸癌及び他の腫瘍の主要な原因物質であるマイナーキャプシドタンパク質Ｌ２及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡに結合することを以前に発見した。発癌性ＨＰＶ１６型及び１８型の初期プロモーター活性及び初期遺伝子発現は、ＭＹＰＯＰによって強力に抑制される。細胞のＭＹＰＯＰ枯渇により、ＨＰＶ１６感染の制限が緩和され、ＭＹＰＯＰが制限因子として作用することを示している。ＭＹＰＯＰタンパク質レベルは、多様なＨＰＶ形質転換細胞株及びＨＰＶ誘発子宮頸癌内で有意に減少する。さらに、Ｅ７がＭＹＰＯＰの分解を刺激すると考えられる。ＭＹＰＯＰの過剰発現により、ＨＰＶ及び非ウイルス性形質転換ケラチノサイトのコロニー形成が阻止されることも見出され、それにより、ＭＹＰＯＰが腫瘍抑制特性を呈することが示唆された。

【0058】

本発明者らは、ここでは、ＭＹＰＯＰがまた、黒色腫、乳癌、肝細胞癌、及び肺癌のようなすべての試験された腫瘍細胞において大幅に下方制御されていることを発見している。これは、肺癌患者の腫瘍サンプル内でさらに検証された。これらの原発性肺腫瘍細胞及び他の腫瘍細胞株では、ＭＹＰＯＰの回復により細胞増殖が阻止された。したがって、ＭＹＰＯＰはすべての腫瘍細胞内に存在しない一般的な腫瘍抑制因子であり、ＭＹＰＯＰの回復により癌が治癒される。さらに、本発明者らは、ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡレベルの上昇、おそらくＭＹＰＯＰタンパク質喪失後の癌細胞の代償機構が、患者の予後不良及び生存率の低下と相関することを見出した。

【0059】

本発明者らはまた、ＭＹＰＯＰが、例えば、ヒトのケラチノサイトまたは肺組織のサンプルを使用するウエスタンブロット分析によって決定されるように、それぞれ約６０ｋＤａ及び４２ｋＤａの分子量で出現する２つのアイソフォームで存在することを見出した。腫瘍細胞内では、ＭＹＰＯＰの大きい（Ｌ）形態が有意に減少されるかまたは排除される。これにより、ＭＹＰＯＰ Ｌ形態は、癌検出の診断マーカーとして好適である。

【0060】

癌の診断または予後のための本発明の方法は、（ｉ）生物学的サンプル中のＭＹＰＯＰの発現レベルを決定すること、（ｉｉ）上記発現レベルを正常サンプルと比較すること、（ｉｉｉ）正常なサンプルに対する患者サンプルでのＭＹＰＯＰ発現のレベルを、癌の陽性もしくは陰性の診断または予後と相関させることを含む一連のステップを特徴とする。「正常サンプル」は、同じ組織または他の組織の非腫瘍細胞、すなわち健康なドナー細胞に由来するサンプルである。

【0061】

本発明者らは、ＨＰＶ感染及び非ウイルス形質転換癌細胞の両方において、腫瘍発生におけるＭＹＰＯＰ、好ましくはＭＹＰＯＰ Ｌ形態の役割を初めて同定した。ヒトまたは動物の患者の腫瘍組織から単離された生物学的サンプルにおけるＭＹＰＯＰタンパク質の発現レベルの低下が腫瘍疾患の存在を示すことは驚くべき発見であった。本明細書に示されるように、ＭＹＰＯＰは、これらに限定されないが、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、頸部癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、白血病、腎癌、膀胱癌、または子宮内膜癌など、任意の癌種の検出のための普遍的なマーカーとして使用できる。

【0062】

また、本発明者らは、ＭＹＰＯＰ、好ましくはＭＹＰＯＰ Ｌ形態が細胞増殖と負に相関し、細胞死を誘導することを発見した。ｍＲＮＡレベルは、癌患者の生存と負に相関するため、ＭＹＰＯＰのｍＲＮＡレベルを使用してさらなる腫瘍発生の予後を予測することができる。これにより、腫瘍のさらなる進行を評価し、患者にさらなる生存の予後を示すことができる。一方でｍＲＮＡレベルの上昇と他方でＭＹＴＯＰのタンパク質レベルの減少が腫瘍細胞に特異的である根本的な機構は、完全には理解されていないが、ＭＹＰＯＰタンパク質の合成または翻訳に作用するフィードバック機構が関与している可能性がある。

【0063】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、ヒトまたは動物の患者の生物学的サンプル中のＭＹＰＯＰのタンパク質レベルを決定する。好ましい態様では、６０ｋＤａの分子量を有するＭＹＰＯＰのＬ形態が決定され、そのＬ形態の減少または不在は、サンプル中に腫瘍細胞が存在することを示す。生物学的サンプル中のＭＹＰＯＰのタンパク質発現レベルが、同じかまたは異なる対象の正常組織サンプル内に見られるタンパク質発現レベルと相関している場合、これは癌の陰性診断を示す。ＭＹＰＯＰのタンパク質発現レベルが正常細胞のタンパク質発現レベルよりも低い場合、これは癌の陽性診断の兆候となる。

【0064】

本発明のさらなる態様では、ｍＲＮＡ発現レベルは、癌の診断または予後のための指標として使用できる。ＭＹＰＯＰのｍＲＮＡレベルの上昇は、癌の陽性診断及び患者の生存の可能性の低下を示す。正常組織サンプル内に見られる正常レベルと比較してｍＲＮＡ発現量を定量的に決定することにより、腫瘍の進行を評価し、患者の生存を予測することができる。腫瘍組織内で見られるｍＲＮＡ発現レベルが高いほど、患者の生存機会は低くなる。

【0065】

本発明の好ましい実施形態では、ＭＹＰＯＰのタンパク質発現のレベルの比較は、約６０ｋＤａの分子量を有するＭＹＰＯＰの大きい形態（ＭＹＰＯＰ Ｌ形態）を同定することを含む。患者サンプル中にＭＹＰＯＰ Ｌ形態がないことは、癌の陽性診断を示している。分子量が４２ｋＤａである小さい形態のＭＹＰＯＰ（ＭＹＰＯＰ Ｓ形態）の発現は、正常細胞と比較して腫瘍細胞内では影響を受けない。

【0066】

ＭＹＰＯＰの発現レベルの決定は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで実行できる。好ましい実施形態では、ＭＹＰＯＰタンパク質の発現レベルの決定は、ＭＹＰＯＰに特異的な抗体を用いて実施される。ＭＹＰＯＰに特異的である任意のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用できる。さらにより好ましい実施形態では、ＭＹＰＯＰタンパク質の発現レベルの決定は、ＭＹＰＯＰのＮ末端に特異的である抗体を用いて実施される。好ましくは、抗体は、検出可能なシグナルを付与するタグまたはラベルで標識されている。そのようなラベルとしては、これらに限定されないが、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ、リボザイム、プロモーター、染料、蛍光、例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン化合物、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、及びフルオレスカミン、イソルミノールなどの化学発光体、増感剤、補酵素、酵素基質、放射性標識、ラテックスまたはカーボン粒子などの粒子、リポソーム、細胞、などが挙げられ、これはさらに染料、触媒または他の検出可能な群で標識することができる。

【0067】

これらに限定されないが、血液または尿などの固体組織または流体など、任意の生物学的サンプルを本発明の方法で使用することができる。ＭＹＰＯＰの生物学的活性またはタンパク質は、癌細胞内で大幅に減少するかまたは排除されるため、癌細胞は、原発性黒色腫細胞、頸部癌細胞、黒色腫細胞、乳癌細胞、または肺癌細胞など、あらゆる腫瘍組織または体液内で同定され得る。

【0068】

好ましいＭＹＰＯＰ生成物は、配列番号１～配列番号４の配列を含む、本明細書に提示される配列表によって特徴付けられる。

【0069】

好ましい実施形態では、本発明のＭＹＰＯＰタンパク質は、配列番号１のｍＲＮＡ配列を含む核酸配列によってコードされる。本発明はまた、対応する未改変または未修飾のｍＲＮＡと比較して、少なくとも１つの改変されたかまたは修飾されたヌクレオチドを有するバリアントまたはＲＮＡ類似体を含む。

【0070】

配列番号２のアミノ酸配列は、ＭＹＰＯＰのＮ末端に関連し、ＤＮＡ結合ドメイン及び単一の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む最初の１２６のアミノ酸を含む。配列番号３のアミノ酸配列は、ヒトにおけるＭＹＰＯＰの完全長アミノ酸配列に関連し、配列番号４のアミノ酸配列は、マウスにおけるＭＹＰＯＰの完全長アミノ酸配列に関連し、配列番号５のアミノ酸配列は、ラットにおけるＭＹＰＯＰの完全長アミノ酸配列に関する。しかし、本発明は、他の生物に見られるＭＹＰＯＰに対してある程度の相同性を呈する他のタンパク質または核酸も網羅する。好ましくは、そのような相同体は、配列番号２に記載のＭＹＰＯＰアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。したがって、配列番号１による核酸配列または配列番号２～４のアミノ酸配列は、コードされたＭＹＰＯＰ遺伝子産物の生物学的挙動及び／または活性を有意に変化させることなく、変異（置換、付加、欠失）を含み得る。

【0071】

本発明のＭＹＰＯＰは、好ましくは、ＭＹＰＯＰのアミノ酸配列をコードする核酸配列、または１つ以上の核酸が縮重核酸によって置換され、その結果、ＭＹＰＯＰの同じアミノ酸配列をもたらすそのバリアントを含む。好ましい実施形態では、本発明はまた、腫瘍細胞においてＭＹＰＯＰを形質転換させ、発現させるためのＭＹＰＯＰの遺伝子を含むベクターまたはプラスミドを網羅する。さらにより好ましい実施形態では、本発明はまた、完全長のＭＹＰＯＰと比較したときに、完全な腫瘍抑制機能を示す、腫瘍細胞においてＭＹＰＯＰを形質転換させ、発現させるためのＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ＭＹＰＯＰのＮ末端）をコードするＭＹＰＯＰの遺伝子を含むベクターまたはプラスミドを網羅する。コードするＤＮＡ配列は、配列番号２のアミノ酸配列から構成される。本発明はまた、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに関連するＭＹＰＯＰのヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含む。

【0072】

好ましい実施形態では、患者サンプル（例えば、生物学的組織サンプル）において決定されるＭＹＰＯＰは、配列番号１の核酸配列または配列番号１の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性を共有するその相同体またはバリアントを含み、その間相同体またはバリアントは、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの生物学的活性を保持している。

【0073】

好ましい実施形態では、患者サンプル（例えば、生体組織サンプル）内で決定されるＭＹＰＯＰは、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性を共有するその相同体またはバリアントを含み、その間、相同体またはバリアントは、Ｍｙｂ関連転写因子として、ＭＹＰＯＰの生物学的活性を保持している。

【0074】

好ましくは、ＭＹＰＯＰの発現レベルの決定は、配列番号１～５による配列のいずれか１つまたはその断片を使用して、ＭＹＰＯＰのｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを定量的または定性的に分析することによって実施される。

【0075】

この文脈における相同体は、他の種に見られるＭＹＰＯＰのタンパク質または核酸を指し、バリアントは、ＭＹＰＯＰの生物学的性質を変えることなく１つ以上の核酸またはアミノ酸交換を含み得る。

【0076】

ＭＹＰＯＰがＭｙｂ関連転写因子として作用するかの決定は、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合アッセイ、プロモーターアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、またはＥＬＩＳＡアッセイなど、当技術分野において公知である任意の好適なアッセイによって分析することができる。

【0077】

腫瘍療法で使用するためのＭＹＰＯＰ
（遺伝子療法または化学療法のいずれかによる）ＭＹＰＯＰ発現の回復が腫瘍細胞の成長の低下をもたらすという本発明者の発見により、ＭＹＰＯＰは腫瘍細胞内おけるＭＹＰＯＰ活性を回復する治療剤の好適な標的となる。

【0078】

したがって、本発明のさらなる態様は、腫瘍疾患を治療するかまたは予防する方法における好適な標的としてのＭＹＰＯＰの使用に関する。本明細書に示すとおり、腫瘍の進行は、影響を受けた腫瘍細胞におけるＭＹＰＯＰの発現の再回復によって減少させるかまたは完全に停止させることができる。ＭＹＰＯＰの発現は、ＭＹＰＯＰを発現するウイルスまたは非ウイルスのビヒクル、プラミドまたはベクターを腫瘍細胞に送達することによって達成できる。あるいは、ＭＹＰＯＰは、経口投与、静脈内投与、または影響を受けた腫瘍組織への注射など、患者に好適な方法で投与できる。ＭＹＰＯＰの発現は、腫瘍細胞内でＭＹＰＯＰの発現を回復させる好適な物質を投与することによっても回復させ得る。さらに、発現ベクターまたは転写ベクターは、影響を受けた腫瘍細胞内でＭＹＰＯＰを発現させるために使用することができる。

【0079】

治療方法は、障害のリスクがある（またはその影響を受けやすい）、またはＭＹＰＯＰ活性の低下に関連する障害を有する対象を治療する予防的及び治療的方法をさらに含む。あるいは、標的遺伝子の発現または活性は正常（異常ではない）であり得るが、それにもかかわらず、ＭＹＰＯＰ遺伝子の発現または活性の増加は、対象に有益な効果を有するであろう。

【0080】

本発明の別の実施形態では、対象は、ＭＹＰＯＰ発現を調節するか、または影響を受けた腫瘍細胞におけるＭＹＰＯＰタンパク質合成を加速する剤を投与される。乳癌、肺癌、肝癌など、異常なＭＹＰＯＰ遺伝子発現またはＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡの過剰発現によって引き起こされるか、またはその原因となる状態のリスクがある対象は、当技術分野において公知であり、かつ本明細書に記載されている例えば、診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたはそれらの組み合わせによって同定できる。

【0081】

好ましい実施形態では、治療剤は、酵素を不活性化するかまたは分解するＭＹＰＯＰの生物学的活性のうちの１つ以上を阻害するか、または腫瘍細胞におけるＭＹＰＯＰタンパク質の合成を回復させる。そのような治療剤の例としては、ブロッキングペプチド、低分子阻害剤、及び抗標的抗体が挙げられる。これらの調節方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、細胞を剤と共に培養することによって）、あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、剤を対象に投与することによって）実施することができる。このように、標的遺伝子タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患している個体を治療する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、標的遺伝子の発現または活性を調節する（例えば、上方制御または下方制御する）剤または剤の組み合わせを投与することを含む。別の実施形態では、この方法は、標的遺伝子の発現または活性の低下または異常を補償するための治療として、標的遺伝子タンパク質または核酸分子を投与することを伴う。そのような調節方法または剤は、影響を受けた腫瘍細胞におけるＭＹＰＯＰの生物学的活性または安定性の増加をもたらすことが提供される。

【0082】

治療方法には、腫瘍の進行を低減するかまたは予防するためのＭＹＰＯＰまたはその相同体を投与することまたは同時投与することも含まれる。例えば、一実施形態では、この方法は、低ＭＹＰＯＰタンパク質レベルを発現する細胞集団を有する個体に所望の薬物を投与すること、及び腫瘍細胞内におけるｍＲＮＡ過剰発現を調節するために標的遺伝子合成の阻害剤を同時投与することを伴う。投与ステップ及び同時投与のステップは、同時にまたは任意の順序で実行することができ、また細胞によるいずれかの化合物の取り込みを根絶させるのに十分な時間間隔によって分離することができる。例えば、ＭＹＰＯＰ合成を回復するペプチドまたは低分子を含む医薬組成物は、ＭＹＰＯＰ遺伝子の発現及び／またはタンパク質の産生を調節するために、薬物投与の十分前に個体に投与できる。癌細胞内などでＭＹＰＯＰ遺伝子産物が異常に下方制御されている状況では、ＭＹＰＯＰ活性の回復が望ましい。

【0083】

好ましい実施形態では、ＭＹＰＯＰタンパク質の一部は、好ましくはＭＹＰＯＰのＤＮＡ結合ドメインを含み、好ましくはＭＹＰＯＰのＮ末端を含むポリペプチド、タンパク質またはペプチドとして投与される。好ましい実施形態では、Ｎ末端を含むＭＹＰＯＰの一部は、配列番号２で定義されるアミノ酸配列を含む。

【0084】

本明細書に開示される治療剤を投与するための投薬量範囲は、ＭＹＰＯＰの症状が治療される所望の効果を生み出すのに十分な大きさのものである。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど多くあってはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、及び症状の程度によって異なり、当技術分野によって決定され得る。投薬量は、何らかの反対兆候（ｃｏｕｎｔｅｒ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の事象の場合、個々の医師によって調整され得る。投薬量は、治療される特定の障害及び患者に依存する可能性があり、これらの障害の治療に通常のスキルを有する医師による既知の投薬量調整技術を使用して容易に決定することができる。投薬量は、一般に、さらなる罹患率及び死亡率を最小限に抑えながら治療効果をもたらすであろう治療化合物の確立された治療枠内にある。

【0085】

治療方法の一実施形態では、投薬量は、活性ドメインを含むＭＹＰＯＰのＮ末端を発現して、癌の進行を阻害し、腫瘍細胞を治療薬物または遺伝子療法に感作させ、したがってこれらの治療の有効性を改善することに十分である。

【0086】

好ましい実施形態では、ＭＹＰＯＰ分子は、分子療法の標的として使用される。このために、ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡアンタゴニストとしての低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の適用など、いくつかのアプローチを使用して、腫瘍細胞におけるＭＹＰＯＰの発現を上方制御することができる。さらに、ＭＹＰＯＰの過剰発現は、腫瘍細胞を現在の治療薬物または遺伝子療法に対して感度を高くすることができ、これにより治療の有効性が改善される。

【0087】

ＭＹＰＯＰタンパク質は、保護効果を有し、腫瘍細胞内でのみ減少し、正常細胞では減少しないと考えられる。ＭＹＰＯＰのタンパク質レベルが回復することにより、細胞死または腫瘍細胞分裂の阻止がもたらされる。したがって、腫瘍疾患を治療するかまたは予防する好ましい方法は、リスクのある対象にＭＹＰＯＰタンパク質を投与することによるものである。さらに好ましい実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＹＰＯＰのタンパク質合成が維持されるかまたは増加されるように形質転換される。

【0088】

治療すべき好ましい癌の１つは、発癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘発性癌または前癌段階である腫瘍疾患または潜伏性ウイルス感染である。

【0089】

あるいは、ＭＹＰＯＰタンパク質発現の追加または回復によって治療できる他のすべての腫瘍疾患（他の病原体誘発腫瘍及び／または非ウイルス誘発腫瘍など）は、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、白血病、腎癌、膀胱癌、または子宮内膜癌からなる群から選択される。しかし、本発明はこれらの特定の癌に限定されないが、他の腫瘍疾患に有益であり得る。

【0090】

本発明はまた、治療有効量のＭＹＰＯＰ発現分子またはタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。従来のいずれの媒体または剤も活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物内でのそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物もまた、本組成物に組み込むことができる。

【0091】

医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液としては、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；及び張性を調整するための剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを挙げることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基により調整できる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数回投与バイアルに入れることができる。

【0092】

一実施形態では、ＭＹＰＯＰまたはＭＹＰＯＰ発現を媒介する剤は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムなどの制御放出製剤など、身体からの急速な排除または身体内での分解から保護するであろう担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製され得る。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体で抗原提示細胞を標的とするリポソームなど）も、薬学的に許容される担体として使用できる。

【0093】

別の実施形態では、ＭＹＰＯＰ遺伝子は、例えば、当技術分野で公知である方法を使用して、遺伝子コンストラクト、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクターに挿入できる。遺伝的コンストラクトは、例えば、吸入、経口、静脈内注射、局所投与、または定位注射によって対象に送達することができる。送達ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中にベクターを含むことができるか、または送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な送達ベクターが組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから無傷で産生され得る場合、医薬調製物は、ポリヌクレオチド送達システムを産生する１つ以上の細胞を含み得る。

【0094】

（ｉ）注射可能組成物
注射可能な使用に好適である医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌である必要があり、容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定している必要があり、また、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されている必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合に必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物には、等張剤、例えば、糖のほか、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの多価アルコールを含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。

【0095】

滅菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量の活性化合物を組み込み、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、有効成分の粉末に加えて、以前に滅菌濾過されたその溶液から任意の追加の所望の成分が得られる。

【0096】

（ｉｉ）経口組成物
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的で、ＭＹＰＯＰ化合物は、賦形剤と一緒に組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体担体を使用して調製することができ、流体担体中の化合物は、経口により適用され、吐き出されるかまたは飲み込まれる。医薬的に適合性のある結合剤、及び／またはアジュバント材料を本組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含むことができる：微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロイドなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；または、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバーなどのフレーバー剤。これらは典型的には、ポリヌクレオチドまたは抗体の投与には使用されない。

【0097】

（ｉｉｉ）肺投与のための組成物
吸入による投与の場合、化合物は、好適なプロペラント、例えば二酸化炭素などのガス、またはネブライザーを含む加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。

【0098】

（ｉｖ）局所投与用の組成物
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤としては、当技術分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与用、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤を使用して行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野において一般に知られているように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに配合される。

【0099】

（ｖ）非経口投与
非経口投与用の調製物としては、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、及び乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または生理食塩水及び緩衝培地などの懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体及び栄養素補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースをベースにしたものなど）などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。

【0100】

化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを用いて）または直腸送達のための保持浣腸の形態で調製することができる。

【0101】

投与の容易性及び投薬量の均一性のために、投与単位形態で組成物を配合することは特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される対象の単一投薬量として適した物理的に個別の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。投与単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特性及び達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって指示され、これらに直接依存する。

【0102】

医薬組成物は、投与説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
細胞培養におけるプロモーターとしてのＭＹＰＯＰ

【0103】

本発明は、細胞培養における細胞増殖を増強する方法にさらに関する。これにより、ＭＹＰＯＰは、細胞の成長、特に産生細胞、好ましくは産生細胞株の産生細胞の成長を増強するための好適な標的となる。例えば、これは、細胞の発現速度及び／または増殖速度を増加させるために、ＭＹＰＯＰ活性の阻害剤を使用することによって達成することができる。これにより、ＭＹＰＯＰは産業用途、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母、または他の細胞などの生産細胞株用に好適となる。ＭＹＰＯＰ活性の好ましい阻害剤は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかの抗体である。あるいは、プロフィリンを使用してＭＹＰＯＰ活性を阻害することができる。ＭＹＰＯＰを阻害することにより、細胞培養の成長が促進され、細胞量及び結果が増加する。

【0104】

阻害剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＭＹＰＯＰの発現またはＭＹＰＯＰの生物学的活性を阻害する任意のものであり得る。好ましい実施形態では、ＭＹＰＯＰの阻害剤は、形質転換細胞に導入されたノックダウンまたはノックアウトＭＹＰＯＰ遺伝子である。ＭＹＰＯＰの発現レベルは、ＭＹＰＯＰのタンパク質合成を阻害するか、またはＭＹＰＯＰタンパク質を分解することによって（例えば、プロテアーゼによる）低下させることができる。あるいは、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡアプローチは、ＭＹＰＯＰ ＲＮＡの細胞内分解を選択すること、またはＲＮＡ干渉を仲介するために使用され得る。さらに、例えばＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳ９技術によるＭＹＰＯＰノックアウトは、ＭＹＰＯＰの発現を阻害するために使用できる。

【0105】

さらに、ＭＹＰＯＰの発現は、産生細胞株を、少なくともＣＡＳ９などの遺伝子編集ヌクレアーゼ及びＭＹＰＯＰに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などのガイド核酸と接触させることによって阻害することができる。
実施例

【0106】

本発明は、以下の実施例でさらに説明される。しかし、本発明は、いかなる形態によってもこれらの例に限定されるものではない。

【0107】

（ｉ）実施例１：診断及び予後マーカーとしてのＭＹＰＯＰ
実験は、ＭＹＰＯＰがすべての試験された腫瘍細胞株及び患者において大幅に減少することを示すために実施した。特に、本発明者らは、ＭＹＰＯＰ Ｌ形態（約６０ｋＤａ）が腫瘍細胞株において減少することを見出した。

【0108】

図１は、ＨＰＶ形質転換細胞株及び癌組織におけるＭＹＰＯＰの減少を示している。

【0109】

初代ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）及びＨＰＶ形質転換細胞株ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８）、ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉ（両方ともＨＰＶ１６）におけるＭＹＰＯＰタンパク質及びｍＲＮＡの定量化。全細胞ｍＲＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって分析した。ＮＨＥＫを１００％に設定し、データ（ｎ＝６）を両側の対応のないｔ検定を使用して分析した：ｐ＝０．０００９４４、ｔ＝－４．６２４５、ｄＦ＝１０（ＨｅＬａ）またはウェルチの両側ｔ検定ｐ＝０．０１８３９、ｔ＝－３．３２３６、ｄＦ＝５．４４９５（ＳｉＨａ）または両側の対応のないｔ検定ｐ＝６．６５３ｘ１０－５、ｔ＝６．５２８４、ｄＦ＝１０（ＣａＳｋｉ）。ウエスタンブロットのデンシトメトリーによる定量化（代表的なウエスタンブロットは上部パネルに示す）は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実行し、相対的ＭＹＰＯＰバンド強度は、β－アクチンに対して正規化した。ＮＨＥＫ細胞を１００％に設定し、データ（ｎ＝５）をウェルチ両側ｔ検定を用いて分析した。ｐ＝９．８１ｘ１０－７、ｔ＝－１９．９６８、ｄＦ＝６．０２５５（ＨｅＬａ）、ｐ＝９．７１ｘ１０－７、ｔ＝１９．９４９、ｄＦ＝６．０３５（ＳｉＨａ）、ｐ＝９２．１１ｘ１０－７、ｔ＝－１７．６４７、ｄＦ＝７．５３４６（ＣａＳｋｉ）。

【0110】

図２は、ＭＹＰＯＰ Ｌ形態が、試験を行ったすべての腫瘍細胞株（子宮頸癌、黒色腫、乳癌細胞株）において大幅に減少していることを示している。ウエスタンブロットは、ＭＹＰＯＰが約６０ｋＤａ（大きい形態、Ｌ形態）及び４２ｋＤａ（小さい形態、Ｓ形態）の２つの形態で存在することを示している。ＭＹＰＯＰ Ｌ形態は、癌細胞株内で大幅に減少する。１：正常なヒト上皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）、２：子宮頸癌細胞（ＳｉＨａ）、３：黒色腫細胞（ＷＭ２６６．４）、４：乳癌細胞（ＭＣＦ－７）。正常なケラチノサイト（ＮＨＥＫ）は、対照として機能し、ＭＹＰＯＰの高発現レベルを示す。

【0111】

図３は、ＭＹＰＯＰ Ｌ形態が、扁平上皮癌（Ａ）または腺癌（Ｂ）を有するすべての試験された非小細胞肺癌患者において大幅に減少していることを示している。示されているのは、それぞれ４名の患者のウエスタンブロット分析におけるＭＹＰＯＰである。

【0112】

図４は、ＭＹＰＯＰ Ｌ形態及びＳ形態が、２つの異なる抗体によって異なって検出できることを示している。示されているのは、ポリクローナルウサギＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ抗体（左）またはポリクローナルウサギＡｂｃａｍ抗体（右）を使用したＨｅＬａ（１）、ＨａＣａＴ（２）、及びＮＨＥＫ（３）細胞溶解物のウエスタンブロット分析におけるＭＹＰＯＰである。ＭＹＰＯＰ抗体及びイムノブロットにおけるそれらの反応性の両方の比較を行った。ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ、及び初代ケラチノサイト細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロットでプロセシングを行い、免疫検出により分析した。ＭＹＰＯＰの検出は、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘまたはＡｂｃａｍ抗体のいずれかを使用して実行した。矢印は、Ｌ形態及びＳ形態を示している。明解かつ簡潔にするために、ウエスタンブロット画像は、トリミングしている。

【0113】

（ｉｉ）実施例２：ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡは肺癌細胞内で増強され（診断マーカー）、発現は生存率と負に相関する（予後マーカー）。
ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡは、肺癌細胞内で増強され、生存率と相関する。本発明者らは、ＭＹＰＯＰ ＲＮＡの発現レベルが癌細胞において増加し、それにより、ＭＹＰＯＰ ＲＮＡが診断マーカーとして好適になることを見出した。さらに、タンパク質レベルでは、ＭＹＰＯＰタンパク質の発現が癌細胞内では減少することを見出した。さらに、ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡの発現は、生存率と負に相関し、それにより、ＭＹＰＯＰが予後マーカーとして好適になることを見出した。

【0114】

図５では、ＭＹＰＯＰのｍＲＮＡレベルが正常な肺組織と比較して、腫瘍組織（腺癌（ｎ＝５５）及び扁平上皮癌（ｎ＝４３）において有意に高いことが示されている（ＭＹＰＯＰのΔＣ－値が低いほど発現が高いことを示す）。対応のある分析は、肺癌患者（腫瘍対正常組織）において、２倍増加したｍＲＮＡの発現を示している（ＡＤＣ＝腺癌；ＳＱＣＣ＝扁平上皮癌）。

【0115】

図６：ＭＹＰＯＰ ｍＲＮＡレベルは、癌患者の生存に関する予後マーカーである。カプランマイヤー分析は、ｍＲＮＡレベルがＮＳＣＬＣ患者の全生存率と負に相関していることを示している。

【0116】

２つの群は、すべての患者の倍率変化の中央値（腫瘍対正常組織）（２つの群の限界としての中央値）を使用して分離させた。
０＝低発現
１＝高発現
Ｐ＝０，０１８＝有意な影響

【0117】

正常組織と比較して腫瘍内での強い過剰発現により、患者の全生存率が低下する。
（ｉｉｉ）実施例３：治療標的としてのＭＹＰＯＰ。ＭＹＰＯＰは、細胞増殖を低減させ、細胞死を誘導する。

【0118】

図７は、ＭＹＰＯＰがＨＰＶ形質転換細胞及び非ウイルス形質転換細胞のコロニー形成を阻害することを示している。ａ～ｃの細胞にＭＹＰＯＰ発現プラスミドまたは対照プラスミドのいずれかをトランスフェクトし、Ｇ４１８で６～１２日間選択した。対照またはＭＹＰＯＰトランスフェクト細胞のコロニーをメタノールで固定し、クリスタルバイオレットを使用して染色した（上部パネルａ～ｃ）。プレートは、ＩｍａｇｅＪプラグイン「ＣｏｌｏｎｙＡｒｅａ」（下部パネルａ～ｃ）を使用して定量化し、値は箱ひげ図として示す。Ａ：ＳｉＨａ細胞の代表的な画像及び５つの独立した実験から得られた値を示す。対照トランスフェクト細胞は１００％に設定した。データ（ｎ＝２０）は、ウィルコクソン順位和検定を使用して分析した。ｐ＝１．４５１ｘ１０－１１、Ｗ＝４００。Ｂ：ＨｅＬａ細胞の代表的な画像及び９つの独立した実験から得られた値を示す。対照トランスフェクト細胞は１００％に設定した。データ（ｎ＝３０）は、ウィルコクソン順位和検定を使用して分析した。ｐ＝２．２ｘ１０－１６、Ｗ＝８９９。Ｃ：ＨａＣａＴ細胞の代表的な画像及び６つの独立した実験から得られた値を示す。対照トランスフェクト細胞は１００％に設定した。データ（ｎ＝２２）は、ウェルチの両側ｔ検定を使用して分析した。ｐ＝０．００１０５、ｔ＝３．５３６１、ｄＦ＝３９．７１；＊＊、ｐ≦０．０１、＊＊＊、ｐ≦０．００１。

【0119】

図８は、ＭＹＰＯＰの再発現（Ｌ形態の回復）により細胞増殖が減少し、乳癌細胞（ＭＣＦ－７）内で細胞死を誘導することを示している。Ａ：ＭＣＦ－７細胞にＭＹＰＯＰ－ＧＦＰ発現プラスミドまたは対照ＧＦＰプラスミドをトランスフェクトし、Ｇ４１８で１０日間選択した。ＧＦＰまたはＭＹＰＯＰ－ＧＦＰ発現細胞の形成されたコロニーが示されている（左）。対照またはＭＹＰＯＰトランスフェクト細胞のコロニーをメタノールで固定し、クリスタルバイオレットを使用して染色した（Ａ、右）。Ｂ：ウエスタンブロットは、ＭＹＰＯＰ－ＧＦＰの２４時間後または細胞の対照トランスフェクション後のＬ形態の再保存を示している（上部パネル）。形成されたコロニーは、ＩｍａｇｅＪプラグイン「ＣｏｌｏｎｙＡｒｅａ」（下部パネル）を使用して定量化した。これらの値は、２つの独立した実験から得られた。対照トランスフェクト細胞は１００％に設定した。（ｎ＝５）

【0120】

図９は、ＭＹＰＯＰの再発現により、肺癌患者から単離された肺癌細胞株の細胞増殖が減少し、かつ細胞死を誘導することを示している。細胞にＭＹＰＯＰ－Ｆｌａｇ発現プラスミドまたは対照Ｆｌａｇプラスミドをトランスフェクトし、Ｇ４１８で７日間選択した。Ｆｌａｇ（対照）またはＭＹＰＯＰ－Ｆｌａｇ発現細胞（左）の形成されたコロニーを示している。対照またはＭＹＰＯＰトランスフェクト細胞のコロニーをメタノールで固定し、クリスタルバイオレットを使用して染色した（左）。ウエスタンブロットは、ＭＹＰＯＰ－Ｆｌａｇまたは細胞の対照トランスフェクションの２４時間後にＭＹＰＯＰが再保存されていることを示している（右）。

【0121】

（ｉｖ）実施例４：
ＭＹＰＯＰを標的とした癌療法は、ＭＹＰＯＰの活性の回復をベースとしている。特に、ＭＹＰＯＰメインバンド（Ｌ形態）の活性を回復することがＭＹＰＯＰベースの癌療法の目的である。

【0122】

図７～９及び図１１で実施された実験では、ＭＹＰＯＰ、ＭＹＰＯＰ－ＧＦＰ、ＭＹＰＯＰ－ＧＳＴ、ＭＹＰＯＰ－Ｈｉｓ（図示せず）、ＭＹＰＯＰ－Ｆｌａｇ及びＭＹＰＯＰ－Ｎ－Ｆｌａｇを癌患者の遺伝子療法に使用できる。

【0123】

図１０は、ＭＹＰＯＰ－ＦｌａｇまたはＭＹＰＯＰ－Ｎ（ＤＮＡ結合ドメインを含む）がプロモーター活性を調節することを示している。（Ａ）ＨａＣａＴ細胞は、示されているように、２４時間、対照ＦＬＡＧベクターまたはＭＹＰＯＰ－ｗｔ、－Ｎまたは－Ｃと共にｐＧＬ４．２０ ＨＰＶ１６ＬＣＲルシフェラーゼレポータープラスミドで一時的に同時トランスフェクトさせた。次に、細胞を溶解して、モノクローナルマウスＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体を使用した免疫検出によるＭＹＰＯＰ発現をモニターした。下部パネルは、ローディング対照として不特定のバンドを示している。（Ｂ）実験は、（Ａ）に記載のとおり行ったが、細胞を溶解し、プロモーター活性の尺度としてのルシフェラーゼ活性をＬＤＨ測定によって評価し、正規化した。４つの独立した実験から得られた値は箱ひげ図として示され、空のＦＬＡＧベクターを使用したｐＧＬ４．２０ １６ＬＣＲは１００％に設定した。データ（ｎ＝１５）は、両側の対応のないｔ検定を使用して分析した。

【0124】

図１１は、ＭＹＰＯＰ及びＭＹＰＯＰ－Ｎの発現により、癌細胞内において細胞増殖が減少することを示している。ＨｅＬａ細胞は、示されているとおりＦＬＡＧベクターまたはＭＹＰＯＰ－ｗｔ、－Ｃまたは－Ｎのいずれかでトランスフェクトさせ、Ｇ４１８で１０日間選択された。Ｆｌａｇ（対照）またはＭＹＰＯＰ－ｗｔ、－Ｃまたは－ＮＦｌａｇ発現細胞の形成されたコロニーが示されている。対照またはＭＹＰＯＰトランスフェクト細胞のコロニーをメタノールで固定し、クリスタルバイオレットを使用して染色した。

【0125】

ＭＹＰＯＰ Ｌ形態を安定化させることができる剤は、癌療法にとって有用な剤であることがさらに期待されていた。Ｌ形態とＳ形態の差を分析するために、ＭＹＰＯＰの推定ＳＵＭＯ化の試験を行った。実際に、ＭＹＰＯＰはＳＵＭＯ－１によって修飾された。ＳＵＭＯ抗体は、精製されたＭＹＰＯＰ－Ｍｙｃ－ｈｉｓ６サンプル中でＭＹＰＯＰ Ｌ形態を検出する。したがって、脱ＳＵＭＯ化機構の阻止またはＳＵＭＯ修飾ＭＹＰＯＰの分解の阻害は、ＭＹＰＯＰのＬ形態の喪失を阻害し、発癌を防ぐことが期待されている。

【0126】

図１２では、ＭＹＰＯ Ｌ形態は、ＳＵＭＯ－１修飾ＭＹＰＯＰタンパク質である。ＭＹＰＯＰの不安定化は、脱ＳＵＭＯ化によって媒介される可能性がある。（Ａ）ＦＬＡＧ－ＭＹＰＯＰまたは０－ＦＬＡＧは、ＨａＣａＴ細胞内でＳＵＭＯ１－ＧＦＰ、ＳＵＭＯ２－ＧＦＰ、または０－ＧＦＰと２４時間共発現した。細胞を溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びモノクローナルマウスＦＬＡＧ抗体を使用したウエスタンブロットによってプロセシングした。（Ｂ）ＭＹＰＯＰ－Ｍｙｃ－ｈｉｓ６は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現され、そのｈｉｓ６タグを介して精製され、ＳＤＳサンプルバッファーで溶解した。１つのサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに２回ロードし、分離してウエスタンブロットによってプロセシングを行った。メンブレンを切断し、各部分をポリクローナルウサギＳＵＭＯ抗体またはモノクローナルマウスＭｙｃ抗体のいずれかと同時にインキュベートした。

【0127】

（ｖ）実施例５：生産性を高めるためのＭＹＰＯＰ
ＭＹＰＯＰの品質は、産生細胞株の生産性を高めるために使用できる。ＭＹＰＯＰタンパク質の減少により、細胞の増殖及び発現が増強され、それによって、生産細胞株の細胞分裂及び細胞増殖を加速させるために使用することができる。

【0128】

図１３は、ＭＹＰＯＰタンパク質レベルが細胞増殖と負に相関していることを示している。これは、診断用途または治療用途のみでなく、細胞株の生産性を高めるための産業用途にも有用である。ＨａＣａＴ細胞は、ＭＹＰＯＰ特異的ｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスにより形質導入された。ノックダウン効率（Ａ、上部パネル）、アクチンレベル（Ａ、下部パネル）、及び相対的ＬＤＨレベルが示されている。対照ｓｈＲＮＡ処理細胞は、１００％に設定した。アクチンレベル及びＬＤＨレベルは、細胞の量の尺度として機能する。

【0129】

図１４は、ＭＹＰＯＰの下方制御によりタンパク質発現が増強することを示している。ＨａＣａＴ細胞にＭＹＰＯＰ特異的ｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスを形質導入して、ＭＹＰＯＰタンパク質レベルを低下させた。７日後、細胞にルシフェラーゼベクターを形質導入した。遺伝子発現の尺度としての相対的なルシフェラーゼ活性は、２４時間後に評価した。対照ｓｉＲＮＡ処理細胞を１００％に設定し、ウィルコクソン順位和検定を使用してデータ（ｎ＝１６）を分析した：ｐ＝０．０００４６６６、Ｗ＝３９（＃９）。

【0130】

図１５は、ＭＹＰＯＰの再発現により、ａ）ヒト肝癌細胞株、ｂ）肺扁平上皮癌細胞株、及びｃ）肺腺癌細胞株の細胞増殖が減少することを示している。コロニー形成アッセイは、図７～９に記載のとおり実施した。データは、細胞死が肝癌細胞、肺癌細胞、及び腺癌癌細胞内で誘導されるという証拠を提供する。

【0131】

図１６は、ＭＹＰＯＰ及びＭＹＰＯＰ－Ｃ ＰｓＶのＨＰＶ１６シュードウイルス（ＰｓＶ）形質導入効率をＭＹＰＯＰ発現レベルによって試験を行った結果をまとめたものである。ＭＹＰＯＰ－ＷＴまたはＭＹＰＯＰ－ＡＤＰｓＶは、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ－グラジエント分画によって精製し、収集した。ウエスタンブロットアッセイは、ＭＹＰＯＰまたはＭＹＰＯＰ－Ｃの発現を示している。

【0132】

分画１０及び１１は、２つのグラジエントのピーク分画であり、その後の実験に使用された。

【0133】

さらなる実験のために、ＰｓＶをＭＹＰＯＰ発現プラスミドのウイルスベクターとして利用した。ＨＰＶ１６のキャプシドをＭＹＰＯＰ－発現プラスミドの送達用ベクターとして使用して、ＭＹＰＯＰ（野生型）及びＭＹＰＯＰ－Ｃ（ＤＮＡ結合ドメインのないＭＹＰＯＰのより短いバージョン）の発現プラスミドを含むシュードウイルスを調製した。このコンストラクトは、プロモーターベースのアッセイでは不活性であり、対照として機能する。これにより、ＭＹＰＯＰ発現プラスミドのトランスファーベクターが作成された。ＨＰＶ１６シュードウイルス（ＰｓＶ）は、以前に記載しているとおりに生成した（Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ここでは、ＭＹＰＯＰ－Ｆｌａｇ発現プラスミドまたは不活性な欠失コンストラクトＭＹＰＯＰ－Ｃ－Ｆｌａｇをシュードゲノム（パッケージ化されたＤＮＡ）として使用した。

【0134】

図１７は、ＭＹＰＯＰベクター遺伝子両方がケラチノサイト癌細胞株の細胞増殖を減少させるのに機能的であり、したがってＭＹＰＯＰが有益な治療標的として使用できることを示していることを例示している。ＨＰＶ１８形質転換Ｈｅｌａ細胞を用いたコロニー形成アッセイを実施して、抗癌遺伝子療法におけるＭＹＰＯＰ ＰｓＶの試験を行った。細胞を播種し、２日または３日の定期的な間隔で、ＭＹＰＯＰ ＰｓＶ対対照、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（対照）及びＭＹＰＯＰ－Ｃにより処理した（図１７Ａ）。殺傷効率（図１７Ｂ）は、メタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、ＩｍａｇｅＪ及びプラグインの「コロニー領域」により被覆面積及び強度を測定することによって決定した。ＭＹＰＯＰ－ベクターによる細胞処理後、細胞増殖の有意な減少を測定した。このデータは、ＭＹＰＯＰ－ベクターが、腫瘍細胞の細胞増殖を減少させ、それにより、ＭＹＰＯＰを腫瘍療法の好適な治療標的にすることができることを示している。

【0135】

図１８は、ＭＹＰＯＰ－ベクター遺伝子療法が腫瘍細胞の細胞増殖の減少に機能しているという追加の例を示す。ここでは、肺癌細胞株がＭＹＰＯＰベクターにより処理されている。肺癌細胞株を用いたコロニー形成アッセイを実施し、図１７Ａのように細胞を播種して処理した。

【0136】

図１９は、正常な非腫瘍細胞に対してＭＹＰＯＰベクターの有意な細胞毒性効果がないことを示している。正常ヒト上皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）を用いたコロニー形成アッセイは、正常細胞に対する推定細胞毒性副作用の試験を行うために実施した（図１９Ａ）。細胞を播種し、２日または３日の定期的な間隔で、ＭＹＰＯＰ ＰｓＶ対対照、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（対照）及びＭＹＰＯＰ－Ｃで処理した。殺傷効率（図１９Ｂ）は、メタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、ＩｍａｇｅＪ及びプラグインの「コロニー領域」により被覆面積及び強度を測定することによって決定した。ＭＹＰＯＰ－ベクターによる細胞処理後、細胞増殖の有意な減少はいずれも測定されなかった。

【0137】

要約すると、腫瘍細胞の細胞増殖の有意な減少は、ＭＹＰＯＰ発現ウイルスベクターにより癌細胞を感染させることによって観察できるが、正常で健康な非腫瘍細胞ではいかなる効果も観察できなかった。このデータは、本発明がヒトのみでなく他の哺乳動物でも機能すること、及び軽微な副作用のみが予想されるかまたはいかなる重篤な副作用も予想されないことを示唆している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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【国際調査報告】