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特表2022-513227炎症性疾患のナノ粒子ベース療法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】炎症性疾患のナノ粒子ベース療法

(51)【国際特許分類】

A61K 47/69 20170101AFI20220131BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20220131BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20220131BHJP

A61P 17/00 20060101ALI20220131BHJP

A61P 17/06 20060101ALI20220131BHJP

A61P 17/04 20060101ALI20220131BHJP

A61P 21/00 20060101ALI20220131BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20220131BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20220131BHJP

A61P 1/04 20060101ALI20220131BHJP

A61P 9/14 20060101ALI20220131BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20220131BHJP

A61K 38/17 20060101ALI20220131BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP

A61K 38/13 20060101ALI20220131BHJP

A61K 31/175 20060101ALI20220131BHJP

A61K 31/225 20060101ALI20220131BHJP

A61K 31/519 20060101ALI20220131BHJP

A61K 47/54 20170101ALI20220131BHJP

A61K 47/52 20170101ALI20220131BHJP

A61K 47/64 20170101ALI20220131BHJP

A61K 47/60 20170101ALI20220131BHJP

A61K 9/06 20060101ALI20220131BHJP

A61K 47/32 20060101ALI20220131BHJP

A61K 9/14 20060101ALI20220131BHJP

【ＦＩ】

A61K47/69

A61P37/02

A61P29/00

A61P17/00

A61P17/06

A61P17/04

A61P21/00

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P13/12

A61P1/04

A61P9/14

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K38/17

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 U

A61K38/13

A61K31/175

A61K31/225

A61K31/519

A61K47/54

A61K47/52

A61K47/64

A61K47/60

A61K9/06

A61K47/32

A61K9/14

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021534232

(86)(22)【出願日】2019-12-13

(85)【翻訳文提出日】2021-08-11

(86)【国際出願番号】 EP2019085206

(87)【国際公開番号】W WO2020120787

(87)【国際公開日】2020-06-18

(31)【優先権主張番号】1820471.9

(32)【優先日】2018-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521257857

【氏名又は名称】ミダテクリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋香元

(72)【発明者】

【氏名】マカティア，マルティーナ

(72)【発明者】

【氏名】コールター，トム

(72)【発明者】

【氏名】ディン，ヤオ

(72)【発明者】

【氏名】ポーター，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ボイマン，オヌル

(72)【発明者】

【氏名】コリオス，アントニオスジー．エー．

(72)【発明者】

【氏名】オズカン，アラズ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076AA30

4C076AA95

4C076CC05

4C076CC07

4C076CC41

4C076DD21

4C076DD50

4C076DD50Z

4C076EE09

4C076EE09A

4C076EE09P

4C076EE10

4C076EE10A

4C076EE10P

4C076EE23

4C076EE41

4C076EE45

4C076EE45A

4C076EE45P

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

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4C206ZA44

4C206ZA68

4C206ZA81

4C206ZA89

4C206ZA94

4C206ZB07

4C206ZB11

4C206ZB15

4C206ZC75

(57)【要約】

本発明は、金属および／または半導体を含むコア、およびコアに共有結合した複数のリガンドを含むナノ粒子を提供し、前記リガンドは、（ｉ）炭水化物、グルタチオンまたはポリエチレングリコール部分を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および（ｉｉ）式ＭＴＸ－Ｌ－のリガンドであって、ＭＴＸ－Ｌ－が、リンカーＬを介して前記コアに結合されるメトトレキサートである、リガンド、を含む。ゲル製剤を含むナノ粒子の医薬組成物、および乾癬などの、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療を含む、ナノ粒子および医薬組成物の医用使用も提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

金属および／または半導体を含むコア、および
コアに共有結合した複数のリガンド、
を含むナノ粒子であって、
前記リガンドは、
（ｉ）炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール部分を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および
（ｉｉ）式ＭＴＸ－Ｌ－のリガンドであって、ＭＴＸ－Ｌ－は、リンカーＬを介して前記コアに結合されたメトトレキサートである、リガンド
を含む、ナノ粒子。

【請求項2】

Ｌが、前記メトトレキサートと前記コアとの間に２～１００原子長の直鎖を含む、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項3】

Ｌが、基－（ＣＨ_２）_ｎ－および／または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ－を含み、式中、ｎおよびｍは、独立に１以上である、請求項１または請求項２に記載のナノ粒子。

【請求項4】

Ｌが、式：Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２
であり、
式中、Ｌ_１は、Ｃ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２アルキル鎖を含む第１のリンカー部分を含み、Ｌ_２は、Ｃ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２アルキル鎖を含む第２のリンカー部分を含み、Ｌ_１およびＬ_２は、同じであるまたは異なってよく、かつＺは、Ｌ_１およびＬ_２を連結する最大１０個の原子の二価のリンカー基でありかつＺは、少なくとも２個のヘテロ原子を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項5】

Ｚが、３～１０員炭素芳香環、３～１０員炭素環、３～１０員複素環、３～１０員ヘテロ芳香環、イミド、アミジン、グアニジン、１，２，３－トリアゾール、スルホキシド、スルホン、チオエステル、チオアミド、チオウレア、アミド、エステル、カルバメート、カーボネートエステルまたはウレアを含む、請求項４に記載のナノ粒子。

【請求項6】

Ｌ_１が、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ－を含みかつＬ_２が、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ－を含みかつｐおよびｑのそれぞれが、２～１０の範囲の数であり、かつｐおよびｑが、同じであるまたは異なってよい、請求項４または請求項５に記載のナノ粒子。

【請求項7】

ＭＴＸ－Ｌ－が、式：

【化1】

である、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項8】

ＭＴＸ－Ｌ－が、式：

【化2】

である、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項9】

ＭＴＸ－Ｌ－が、式：

【化3】

である、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項10】

ＭＴＸ－Ｌ－が、式：

【化4】

である、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項11】

ＭＴＸ－Ｌ－が、式：

【化5】

である、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項12】

Ｌが、末端硫黄原子を介して前記コアに結合される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項13】

前記希釈リガンドが、単糖または二糖である炭水化物を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項14】

前記希釈リガンドが、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、マルトース、ラクトース、ガラクトサミンおよび／またはＮ－アセチルグルコサミンを含む、請求項１３に記載のナノ粒子。

【請求項15】

前記希釈リガンドが、２’－チオエチル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドまたは２’－チオエチル－β－Ｄ－グルコピラノシド含む、請求項１３または請求項１４に記載のナノ粒子。

【請求項16】

前記コアが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｚｎまたはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される金属を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項17】

前記コアが、金を含む、請求項１６に記載のナノ粒子。

【請求項18】

前記コアの直径が、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、請求項１～１７のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項19】

そのリガンドを含む前記ナノ粒子の直径が、３ｎｍ～５０ｎｍの範囲である、請求項１～１８のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項20】

コア当りのリガンドの総数が、２０～２００個の範囲である、請求項１～１９のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項21】

コア当りの前記式ＭＴＸ－Ｌ－のリガンドの数が、コア当たり３～１００個の範囲でなどの、少なくとも３個である、請求項１～２０のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項22】

コア当りの前記式ＭＴＸ－Ｌ－のリガンドの数が、コア当たり５～１０、１０～１５または１５～２０個の範囲でなどの、少なくとも３個である、請求項２１のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項23】

次の構造：

【化6】

を有し、
コア当りのリガンドの総数が、少なくとも５個であり、かつコア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数が、少なくとも３個である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項24】

次の構造：

【化7】

を有し、式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、コア当りのリガンドの総数が、少なくとも５個であり、かつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数が、少なくとも３個である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項25】

次の構造：

【化8】

を有し、式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数が、少なくとも５個であり、かつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数が、少なくとも３個である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項26】

次の構造：

【化9】

【請求項27】

請求項１～２６のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子および少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項28】

前記医薬組成物が、ゲル、任意選択でヒドロゲルの形態である、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記ゲルが、カーボポール（登録商標）９８０、カーボポール（登録商標）９７４およびカーボポール（登録商標）ＥＴＤ２０２０からなる群より選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記ゲル中でナノ粒子に結合した形態であるメトトレキサートの濃度が、０．５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約２ｍｇ／ｍＬである、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記ナノ粒子コアが、金でありかつ前記ゲル中の金の濃度が、１ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約４ｍｇ／ｍＬである、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記組成物が、局所投与用である、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記組成物が、全身投与用である、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項34】

医薬での使用のための請求項１～２６のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項２７～３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項35】

哺乳動物対象における炎症性疾患または自己免疫疾患の治療での使用のための請求項１～２６のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項２７～３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項36】

前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、乾癬、乾癬性関節炎、強皮症、関節リウマチ、若年性皮膚筋炎、ループス、サルコイドーシス、クローン病、湿疹および血管炎からなる群から選択される、請求項３５に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。

【請求項37】

前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、皮膚障害である、請求項３５に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。

【請求項38】

前記障害が、乾癬である、請求項３７に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。

【請求項39】

前記ナノ粒子または前記組成物が、第２の抗炎症剤と同時に、順次にまたは別々に投与される、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。

【請求項40】

前記第２の抗炎症剤が、シクロスポリン、ヒドロキシカルバミド、ジメチルフマレート、レチノイドまたは生物学的抗炎症剤を含む、請求項３９に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。

【請求項41】

前記生物学的抗炎症剤が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦαデコイ受容体、抗ＩＬ－１７抗体または抗ＩＬ－２３抗体を含む、請求項４０に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。

【請求項42】

治療を必要とする対象に請求項１～２６のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項２７～３３のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を治療する方法。

【請求項43】

前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、乾癬、乾癬性関節炎、強皮症、関節リウマチ、若年性皮膚筋炎、ループス、サルコイドーシス、クローン病、湿疹および血管炎からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、皮膚障害である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記障害が、乾癬である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ナノ粒子または前記組成物が、第２の抗炎症剤と同時に、順次にまたは別々に投与される、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記第２の抗炎症剤が、シクロスポリン、ヒドロキシカルバミド、ジメチルフマレート、レチノイドまたは生物学的抗炎症剤を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記生物学的抗炎症剤が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦαデコイ受容体、抗ＩＬ－１７抗体または抗ＩＬ－２３抗体を含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

請求項３６～４２のいずれか１項に記載の方法での使用のための薬物の調製における請求項１～２６のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項２７～３３のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項50】

請求項１～２６のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項２７～３３のいずれか１項に記載の医薬組成物、
ナノ粒子または医薬組成物を入れるための容器、および
添付文書または標識、
を含む製品。

【請求項51】

前記添付文書および／または標識が、哺乳動物対象における炎症性疾患または自己免疫疾患の治療での前記ナノ粒子または医薬組成物の使用に関連する説明書、投与量および／または投与情報を提供する、請求項５０に記載の製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１８年１２月１４日出願のＧＢ１８２０４７１．９からの優先権を主張する。この出願の内容および要素は、本出願において参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、特に医薬としての使用のための、特定の組織型または部位への活性薬剤の送達のための担体としてのナノ粒子に関し、かつ癌を含む、炎症性、および／または自己免疫性疾患、特に乾癬などの皮膚障害の治療方法を含む。局所ゲル製剤を含む、医薬組成物、およびそれらの使用方法も開示される。

【背景技術】

【0003】

本発明は、組成物および製剤、ならびに哺乳動物および特にヒトの治療のためを含む、このような組成物および製剤の製造方法ならびに投与方法に関する。

【0004】

乾癬は、世界中で１億人を越える人々（母数の約２％）に影響する慢性多因子性炎症性皮膚疾患である。疾患の正確な病因は未知であるが、それは通常、免疫系の刺激が表皮ケラチノサイトおよび皮膚性炎症の過剰増殖をもたらす、自己免疫疾患と考えられている。

【0005】

いくつかの形態の中で、尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓｖｕｌｇａｒｉｓ）または局面型乾癬（ｐｌａｑｕｅｐｓｏｒｉａｓｉｓ）は、最もよくある乾癬で、８０％の個体を冒し、赤色の盛り上がった皮膚（プラーク）および皮膚上の銀白色の鱗屑を特徴とする。疾患の重症度は、乾癬に冒された全身のパーセントに依存して、軽度（身体の３％未満）から、中等度（身体の３～１０％）～重度（身体の１０％を越える）で様々である。大多数（７５～８０％）の患者は、軽度～中程度の乾癬に罹患する。

【0006】

局所治療は通常、過剰細胞増殖を遅らせるまたは正常化する、炎症を減らすための乾癬に対する第１選択の治療である。ビタミンＤ類似体、副腎皮質ステロイド、レチノイド、またはＵＶ光線療法を含む局所薬剤が、軽度乾癬に対して使用され、一方、中等度～重度乾癬の患者は、メトトレキサート、シクロスポリン、ヒドロキシカルバミド、ジメチルフマレートなどのフマレート、およびレチノイド、または生物学的製剤（例えば、抗ＴＮＦ抗体（例えば、インフリキシマブ）、抗ＩＬ－１７抗体（例えば、イキセキズマブ）、または抗ＩＬ－２３抗体（例えば、グセルクマブ））を含む全身性薬剤で治療される。しかし、これらの治療選択は、多くの点で準最適である。全身性薬剤は、毒性などの重度副作用に関連付けられる場合があり、一方、長期ＵＶ光線療法は、発癌性に関連付けられる場合がある。大部分の患者、特に軽度～中等度の乾癬の患者にとって、局所療法は、好ましい最適治療である。しかし、現在の局所薬剤は、それらの使用に関連付けられる不十分な皮膚浸透および副作用（例えば、皮膚の菲薄化および皮膚刺激）のため準最適である。これらの課題を考慮すると、皮膚での高い薬物濃度を達成し、既存の治療薬選択に関連付けられる副作用を減らすまたは取り除く、乾癬のための、安全で効果的な局所療法の開発に関して、未充足の強い臨床的ニーズが存在する。

【0007】

葉酸類似体である、メトトレキサート（ＭＴＸ）は、抗増殖剤および抗炎症剤である。これは、ジヒドロ葉酸還元酵素の作用を非可逆的に遮断することにより、ＤＮＡ合成を阻害する。これは現在、経口経路または注射により乾癬用に投与される。しかし、医師によるその全身性使用は、骨髄毒性、白血球および血小板数の低減、肝損傷、下痢、胃刺激、および潰瘍性口内炎を含む重度副作用のため制限されている。ＭＴＸが表皮有糸分裂に対し抑制効果を有することを考えれば、局所投与は、乾癬に対する魅力的な治療選択であろう。しかし、乾癬用の局所ＭＴＸ製剤を開発する試みは、適切な期間の間に皮膚中で充分に高い薬物濃度に到達できないことが主な理由で、それほど臨床的に成功していない。ＭＴＸの皮膚浸透は、極めて限定されている。ＭＴＸの皮膚浸透を改善するために、化学的促進剤；イオン導入法および脂質担体などの物理的方法を含む種々の手法が研究されてきた。しかし、これらの手法は、皮膚刺激問題、低薬物負荷、および限られた皮膚浸透のため、得られた成功は、限定されたものであった。

【0008】

国際公開第２０１４／０２８６０８号は、ナノスケールの送達装置および経皮浸透促進組成物を用いて皮膚障害を治療する方法について記載している。特に、ＭＴＸ封入ゼイン殻－コアナノ粒子は、ＭＴＸ溶液より高い皮膚浸透を示すと見出された。

【0009】

癌治療およびイメージングの分野では、ＭＴＸ担持金ナノ粒子が報告されている。例えば、米国出願公開第２０１５／０２３１０７７号は、ＭＴＸを含むアミン含有分子で不動態化された金ナノ粒子について記載している。Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００７，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐｐ．７１３－７２２は、ＭＴＸの１３ｎｍのコロイド状金ナノ粒子への吸着（スキーム１参照）およびその後のＭＴＸ－ＡｕＮＰの種々の癌細胞に対する細胞傷害性効果の評価について記載している。Ｔｒａｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪｏｕｒｎａｌ，２０１３，Ｖｏｌ．７８，ｐｐ．１７５－１８０は、ワンポット合成によるメトトレキサート複合化金ナノ粒子の製造、およびその後の癌細胞に対するＭＴＸ－ＡｕＮＰのインビトロ試験について記載している。

【0010】

Ｂｅｓｓａｒｅｔａｌ．，ＣｏｌｌｏｉｄｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅｓＢ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１６，Ｖｏｌ．１４１，ｐｐ．１４１－１４７は、ナトリウム３－メルカプト－１－プロパンスルホネートで官能化された水溶性金ナノ粒子（Ａｕ－３ＭＰＳ）上へのＭＴＸの非共有結合担持について記載しており、Ａｕ－３ＭＰＳ＠ＭＴＸが乾癬患者の局所療法として好適である可能性があることを提案している。Ａｕ－３ＭＰＳに対するＭＴＸの担持効率は、７０～８０％の範囲であると評価され、急速に放出される（１時間以内に８０％）。Ａｕ－３ＭＰＳ＠ＭＴＸは、吸収挙動を追跡するためにＣ５７ＢＬ／６マウスの正常皮膚で局所的に使用された。Ａｕ－３ＭＰＳ＠ＭＴＸの皮膚浸透は、ＭＴＸ単独と比較した場合より大きいことが明らかになった。乾癬皮膚の浸透は調査されず、乾癬治療薬としてのＡｕ－３ＭＰＳ＠ＭＴＸの効力も評価されなかった。Ｆｒａｔｏｄｄｉｅｔａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１９，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．２７６－２８６は、皮膚炎症マウスモデルにおける局所Ａｕ－３ＭＰＳ＠ＭＴＸの効果について記載している。

【0011】

さらなるナノ粒子送達系のための、および乾癬の治療の方法のための未充足のニーズが残されている。特に、乾癬のモデルで有効性を示す、改善されたＭＴＸ担持を示すナノ粒子およびその医薬組成物は、未充足のニーズとして残されている。本発明はこれらのニーズに対する解決策を提供し、関連する追加の利点を提供しようとするものである。

【発明の概要】

【0012】

概して、本発明は、乾癬などの炎症疾患または自己免疫疾患で使用される、局所投与用のゲルベース医薬組成物を含む、ナノ粒子およびその組成物に関する。本発明者らは驚くべきことに、メトトレキサート担持ナノ粒子が、本明細書でさらに記述されるように、乾癬モデルに対しインビボで有効性を示し、皮膚肥厚および炎症を低減し、さらには乾癬の発症を抑制することを見出した。重要なことに、本明細書で記載の実施例は、金ナノ粒子とメトトレキサートの間の相乗作用を示す。ＧＮＰ単独で処方された（すなわち、ＭＴＸ不含の）ゲルは、耳介厚の、中程度であるが有意な低減をもたらした（図４ｃ）。本明細書で定義される本発明のＭＴＸ－ＧＮＰは、皮膚炎症モデルで加算的有効性を越える有効性を示すことが見出された。

【0013】

第１の態様では、本発明はナノ粒子を提供し、ナノ粒子は、
金属および／または半導体を含むコア、および
コアに共有結合した複数のリガンド、
を含み、上記リガンドは、
（ｉ）炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分（オリゴエチレングリコールまたは（ポリ）エチレングリコール）を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および
（ｉｉ）式ＭＴＸ－Ｌ－のリガンドであって、ＭＴＸ－Ｌ－は、リンカーＬを介して上記コアに結合されるメトトレキサートである、リガンド
を含む。

【0014】

リンカーＬは、コアに共有結合される、チオール基などの、末端基を含む。あるいは、リンカーＬは、スペーサーを介して間接的にコアに結合され、それは、次に、コアに共有結合される。

【0015】

いくつかの実施形態では、リンカーＬは、メトトレキサートとコアとの間に、２～２００（例えば、２～１００、または５～５０）原子長の直鎖を含む。直鎖は任意に、置換されてよく、側鎖を含む、および／または分岐してよい。直鎖の長さは、メトトレキサート結合部位とコアの間の最大の長さにおける原子の数である。

【0016】

いくつかの実施形態では、Ｌは、基－（ＣＨ_２）_ｎ－および／または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ－を含み、式中、ｎおよびｍは独立に、１以上である。例えば、Ｌは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ－であり得、ｍは、５～２０の範囲の数である。

【0017】

いくつかの実施形態では、Ｌは式：Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２
であり、Ｌ_１は、Ｃ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２またはＣ２－Ｃ１２アルキル鎖を含む第１のリンカー部分を含み、Ｌ_２は、Ｃ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２またはＣ２－Ｃ１２アルキル鎖を含む第２のリンカー部分を含み、Ｌ_１およびＬ_２は、同じであるまたは異なってよく、Ｚは、Ｌ_１およびＬ_２を連結する最大１０個の原子の二価のリンカー基であり、Ｚは、少なくとも２個のヘテロ原子を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは、３～１０員炭素芳香環、３～１０員炭素環、３～１０員複素環、３～１０員ヘテロ芳香環、イミド、アミジン、グアニジン、１，２，３－トリアゾール、スルホキシド、スルホン、チオエステル、チオアミド、チオウレア、アミド、エステル、カルバメート、カーボネートエステルまたはウレアを含む。いくつかの実施形態では、Ｚは、カルボニル含有基である。いくつかの実施形態では、Ｚは、アミドまたはエステルを含む。好ましくは、Ｚは、アミドである。いくつかの実施形態では、Ｌ_１は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ－を含み、ｐは、１～１０の範囲、例えば、２、３、４、または５の数である。いくつかの実施形態では、Ｌ_２は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ－を含み、ｑは、１～１０の範囲、例えば、５、６、７、８、９または１０の数である。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＭＴＸ－Ｌ－は、式：

【化1】

であり、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＭＴＸ－Ｌ－は、式：

【化2】

である。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＭＴＸ－Ｌ－は式：

【化3】

である。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＭＴＸ－Ｌ－は、式：

【化4】

である。

【0022】

いくつかの実施形態では、ＭＴＸ－Ｌ－は、式：

【化5】

である。

【0023】

特定の実施形態では、ＭＴＸ－Ｌは、末端チオール基を含み、

【化6】

この末端基は、例えば、下に示すように、上記コアの表面に存在する金原子に結合される：

【化7】

【0024】

ＭＴＸ－Ｌ－の他のこのような実施形態としては、

【化8】

（式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）；

【化9】

（式中、ｎは、１～１５の整数である）；および

【化10】

（式中、ｎは、１～１５の整数である）が挙げられる。

【0025】

特定の実施形態では、ＭＴＸ－Ｌ－は式：

【化11】

である。

【0026】

特定の実施形態では、ＭＴＸ－Ｌは、末端チオール基を含み、

【化12】

この末端基は、例えば、下に示すように、上記コアの表面に存在する金原子に結合される：

【化13】

【0027】

本発明のいずれかの態様によるいくつかの実施形態では、Ｌは、末端硫黄原子を介してコアに結合され得る。

【0028】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［希釈リガンド］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ－Ｓ］_ｔ＠Ａｕであり得、ｓおよびｔは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは２０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。本明細書で使用される場合、一般的構造の式［リガンド１］_ｕ［リガンド２］_ｃ＠Ａｕは、その表面に結合されるｕの数のリガンド１部分およびｃの数のリガンド２部分を有する金ナノ粒子を定義する。
通常、ナノ粒子は、それらに結合されるメトトレキサート分子を有しない未反応リンカーリガンドを有する。従って、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［希釈リガンド］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ－Ｓ］_ｔ［ＣＯＯＨ－Ｌ－Ｓ］_ｕ＠Ａｕまたは［希釈リガンド］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ－Ｓ］_ｔ［ＮＨ_２－Ｌ－Ｓ］_ｕ＠Ａｕであり得、ｓ、ｔおよびｕは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは、２０超、例えば、３０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。いくつかの事例では、ｕは、１０超、例えば、２０超であり得る。

【0029】

本発明のいずれかの態様によるいくつかの実施形態では、上記希釈リガンドは、単糖または二糖である炭水化物を含み得る。特に、希釈リガンドは、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、マルトース、ラクトース、ガラクトサミンおよび／またはＮ－アセチルグルコサミンを含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、炭水化物含有希釈リガンドは、末端チオール基を有するＣ２－Ｃ１５（例えば、Ｃ２－Ｃ５）アルキル鎖を介してコアに共有結合され得る。特定の実施形態では、希釈リガンドは、２’－チオエチル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドまたは２’－チオエチル－β－Ｄ－グルコピラノシドを含み得る。

【0031】

いくつかの実施形態では、コアは、次記からなる群より選択される金属を含む：Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｚｎまたはこれらの任意の組み合わせ。特に、コアは、金を含み得る。

【0032】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［α－ガラクトース－Ｃ２－Ｓ］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ－Ｓ］_ｔ＠Ａｕであり得、ｓおよびｔは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは、２０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。

【0033】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［α－ガラクトース－Ｃ２－Ｓ］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ－Ｓ］_ｔ［ＣＯＯＨ－Ｌ－Ｓ］_ｕ＠Ａｕまたは［α－ガラクトース－Ｃ２－Ｓ］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ－Ｓ］_ｔ［ＮＨ_２－Ｌ－Ｓ］_ｕ＠Ａｕであり得、ｓ、ｔおよびｕは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは、２０超、例えば、３０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。いくつかの事例では、ｕは、１０超、例えば、２０超であり得る。

【0034】

いくつかの実施形態では、コアの直径は、１ｎｍ～５ｎｍ、例えば、２～４ｎｍの範囲である。コアの直径は、例えば、電子顕微鏡または動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて測定し得る。
いくつかの実施形態では、リガンドを含むナノ粒子の直径は、３ｎｍ～５０ｎｍ、例えば、５～２０ｎｍの範囲である。
いくつかの実施形態では、コア当りのリガンド総数は、２０～２００個の範囲である。

【0035】

いくつかの実施形態では、コア当りの上記式ＭＴＸ－Ｌ－のリガンドの数は、少なくとも３個、例えば、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、または少なくとも１５個である。リガンドの数は、コア当り、５～１０、１０～１５または１５～２０個の範囲であってよい。

【0036】

いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、次の構造で示すようなＭＴＸ－Ｌおよび希釈リガンドを有する：

【化14】

【0037】

ナノ粒子サイズ、リガンドサイズ、リガンドの比率の数は、一定の縮尺で図示されていない。示されていない他のリガンドも存在し得る。いくつかの事例では、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５個である。好ましくは、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも１０、１５、または２０個である。好ましくは、コア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５、１０または１５個である。

【0038】

いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、次の構造で示すようなＭＴＸ－Ｌおよび希釈リガンドを有し：

【化15】

式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である。好ましくは、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも１０、１５、または２０個である。好ましくは、コア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５、１０または１５個である。

【0039】

いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、次の構造で示すようなＭＴＸ－Ｌおよび希釈リガンドを有し：

【化16】

式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である。好ましくは、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも１０、１５、または２０個である。好ましくは、コア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５、１０または１５個である。

【0040】

いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、次の構造で示すようなＭＴＸ－Ｌおよび希釈リガンドを有し：

【化17】

【0041】

本明細書で提示される方法に加えて、２０１９年１２月１３日出願の同時係属出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０８５２０３号は、それにより請求されたナノ粒子およびそれらの中間体が合成され得る、さらなる方法を提供する。この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0042】

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の複数のナノ粒子および少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

【0043】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ゲルの形態である。ゲルは、ヒドロゲルであり得る。局所投与（例えば、皮膚送達）に好適なヒドロゲルは、例えば、ＬｉａｎｄＭｏｏｎｅｙ，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭａｔｅｒｉａｌｓ，２０１６，Ｖｏｌ．１，Ａｒｔｉｃｌｅｎｕｍｂｅｒ：１６０７１およびＲｅｈｍａｎａｎｄＺｕｌｆａｋａｒ，ＤｒｕｇＤｅｖＩｎｄＰｈａｒｍ．，２０１４，Ｖｏｌ．４０（４），ｐｐ．４３３－４４０で考察されている。これら両方の文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0044】

いくつかの実施形態では、ゲルは、カーボポール（登録商標）９８０、カーボポール（登録商標）９７４およびカーボポール（登録商標）ＥＴＤ２０２０からなる群より選択される。

【0045】

いくつかの実施形態では、上記ゲル中のメトトレキサートの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約２ｍｇ／ｍＬである。メトトレキサートの濃度は、例えば、本明細書の実施例２で記載のように、ＨＰＬＣにより測定され得る。本明細書で使用される場合、メトトレキサートの濃度は、ナノ粒子に共有結合したメトトレキサートまたはこれらの誘導体（例えば、ＭＴＸ－（ＥＧ）_ｎ－ＮＨ_２）の濃度であり得る。上で言及した濃度の範囲は、ゲル中の遊離メトトレキサートを除外することが特に意図される。

【0046】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、金であり、上記ゲル中の金の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約４ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、組成物は、局所（例えば、皮膚）投与用である。
いくつかの実施形態では、組成物は、全身投与用（例えば、皮下注射用）である。

【0047】

第３の態様では、本発明は、医薬での使用のための、本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物を提供する。

【0048】

第４の態様では、本発明は、哺乳動物対象における炎症性疾患または自己免疫疾患の治療での使用のための、本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物を提供する。

【0049】

いくつかの実施形態では、炎症性疾患または自己免疫疾患は、乾癬、乾癬性関節炎、強皮症、関節リウマチ、若年性皮膚筋炎、ループス、サルコイドーシス、クローン病、湿疹および血管炎からなる群から選択され得る。

【0050】

いくつかの実施形態では、炎症性疾患または自己免疫疾患は、皮膚障害である。特に、障害は、乾癬（例えば、尋常性乾癬または膿疱性乾癬、逆乾癬、おむつ部乾癬、爪乾癬、滴状乾癬、口腔乾癬、もしくは脂漏性湿疹様乾癬）であり得る。いくつかの実施形態では、障害は、毛孔性紅色粃糠疹、皮膚苔癬、酒さ、円形脱毛症、皮膚リンパ腫、湿疹性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、皮膚薬物反応、結節性痒疹、または皮膚肥満細胞症）、自己免疫性水疱性皮膚障害（例えば、天疱瘡／類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、表皮水疱症）、皮膚ループス、皮膚血管炎、ベーチェット病、強皮症様皮膚疾患、好中球媒介皮膚疾患（例えば、壊疽性膿皮症、スイート症候群、化膿性汗腺炎、ＳＡＰＨＯ症候群）、肉芽腫性皮膚疾患（例えば、環状肉芽腫、環状紅斑、結節性紅斑、サルコイドーシスまたはリポイド類壊死症から選択され得る。

【0051】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子または組成物は、第２の抗炎症剤と同時に、順次にまたは別々に投与され得る。特に、第２の抗炎症剤は、シクロスポリン、ヒドロキシカルバミド、ジメチルフマレート、レチノイドまたは生物学的抗炎症剤（例えば、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦαデコイ受容体、抗ＩＬ－１７抗体または抗ＩＬ－２３抗体）を含み得る。

【0052】

第５の態様では、本発明は、それを必要としている対象に本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。

【0053】

【0054】

【0055】

第６の態様では、本発明は、本発明の第５の態様の方法での使用のための薬物の調製における、本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物の使用を提供する。

【0056】

第７の態様では、本発明は、次記を含む製品を提供する：
本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物、
ナノ粒子または医薬組成物を入れるための容器、および
添付文書または標識。

【0057】

いくつかの実施形態では、添付文書および／または標識は、本発明の第５の態様の治療方法におけるナノ粒子または医薬組成物の使用に関連する説明書、投与量および／または投与情報を提供する。

【0058】

本発明のいずれかの態様では、対象は、ヒト、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたは非ヒト霊長類）、飼育動物または家畜（例えば、ブタ、雌ウシ、ウマまたはヒツジ）であり得る。好ましくは、対象は、乾癬（例えば、尋常性乾癬または膿疱性乾癬、逆乾癬、おむつ部乾癬、滴状乾癬、口腔乾癬、もしくは脂漏性湿疹様乾癬）であると診断されているヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、乾癬であるまたは以前に乾癬であった可能性があるが、現在は、寛解状態にあり、本発明の使用するためのナノ粒子もしくは組成物または本発明の方法もしくは使用は、乾癬の予防的処置のため、または乾癬の再発を遅延させるまたは防止するためであり得る。

【0059】

本発明のナノ粒子または組成物は、患部への直接適用（例えば、乾癬病変への局所投与）のための、および／またはこれまで罹患していない部位または寛解状態にある部位（例えば、非炎症皮膚）への適用のためのものであり得る。

【0060】

本発明の実施形態は、以降で、限定するものではなく、一例として、添付の図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。しかし、本開示を考慮すれば、本発明の種々のさらなる態様および実施形態が当業者には自明であろう。

【0061】

記述された態様および好ましい特徴の組み合わせは、このような組み合わせが明確に許容されないまたは明示的になされるべきでないことが述べられる場合を除き、本発明は、これらの組み合わせを包含する。本発明のこれらおよびさらなる態様および実施形態は、以下で、および添付の実施例および図に関連してさらに詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】本明細書ではＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰとしても記載される、アルファガラクトースＣ２－ＳＨリガンドおよびＭＴＸ－ＰＥＧ_３ＮＨＣ（Ｏ）ＰＥＧ_８－ＳＨリガンドを含むコロナを有する金コアナノ粒子の一般的な化学構造を示す。

【図2】ＩＭＱ誘導マウスモデルにおける全身性ＭＴＸ。（ａ）３日間のＩＭＱ処理と７日間の全身療法の実験スキーム。（ｂ）（上段パネル）対照（ＰＢＳ；＋）、ＩＭＱ処理（■）、および全身性ＭＴＸ療法（１ｍｇ／ｋｇ（▲）、２ｍｇ／ｋｇ（▼）、５ｍｇ／ｋｇ（ひしがた））を受けた動物間の耳介厚の変化。（下段パネル）４～７日目の群間の耳介厚の差異の統計分析。（ｃ）マウスの体重変化を、治療前体重からの体重の変化％として計算し、毎日記録し（上段パネル）、７日目のプロットを行った（下段パネル）。ｎｓ＝有意差なし。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図3】ＩＭＱ誘導マウスモデルにおける全身性ＭＴＸ対ＭＴＸ－ＧＮＰ。（ａ）（上段パネル）対照（ＰＢＳ；＋）、ＩＭＱ処理（■）、ならびにＩＭＱに加えて、２ｍｇ／ｋｇＭＴＸ（▲）、５．５ｍｇ／ｋｇＡｕ含有ＧＮＰ（▼）および２ｍｇ／ｋｇＭＴＸおよび５．５ｍｇ／ｋｇＡｕ含有ＭＴＸ－ＧＮＰ（ひしがた）を受けた全身療法の間の耳介厚の変化。（下段パネル）４～７日目の群間の耳介厚差異の統計分析。（ｂ）マウスの体重変化を、治療前体重からの体重の変化％として計算し、毎日記録し（上段パネル；対象（ＰＢＳ、＋）、ＩＭＱ処理（■）、ならびにＩＭＱに加えて、２ｍｇ／ｋｇＭＴＸ（▲）、５．５ｍｇ／ｋｇＡｕ含有ＧＮＰ（▼）および２ｍｇ／ｋｇＭＴＸおよび５．５ｍｇ／ｋｇＡｕ含有ＭＴＸ－ＧＮＰ（ひしがた）を受けた全身療法）、７日目のプロットを行った（下段パネル；バー、左から右へ：未処理、ＩＭＱ、ＭＴＸ全身、ＧＮＰ全身、ＭＴＸ－ＧＮＰ全身）。データを、条件毎に２～５匹のマウス、２～３の独立の実験からプールし、平均±標準偏差として表す。（ｃ）（左から右へ）：未処理、ＩＭＱ、ＭＴＸ全身、ＧＮＰ全身およびＭＴＸ－ＧＮＰ全身治療マウス耳介中のＣＤ４５^＋細胞の細胞数をプロットし、統計的比較を示す。ｎｓ＝有意差なし、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図4】ＩＭＱ誘導マウスモデルにおける局所ＭＴＸ対ＭＴＸ－ＧＮＰ。（ａ）３日間のＩＭＱ処理と７日間の局所療法の実験スキーム。（ｂ）（左から右へ）未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋ＭＴＸ、ＩＭＱ＋ＧＮＰおよびＩＭＱ＋ＭＴＸ－ＧＮＰについての８日目のマウス耳介皮膚の代表的ヘマトキシリンエオシン染色。スケールバー＝２００μｍ。（ｃ）（上段パネル）対照（ＰＢＳ；＋）、ＩＭＱ処理（■）と、カーボポール９８０ゲル担体（●）、１２．５ｍｇ／ｋｇＭＴＸ含有カーボポール９８０ゲル（▲）、ＧＮＰ３７．５ｍｇ／ｋｇＡｕ含有カーボポール９８０ゲル（▼）およびＭＴＸ－ＧＮＰ１２．５ｍｇ／ｋｇＭＴＸおよび３７．５ｍｇ／ｋｇＡｕ含有カーボポール９８０（ひしがた）を受ける局所療法動物の間の耳介厚の変化。（下段パネル）４～７日目の群間の耳介厚差異の統計分析。（ｄ）マウスの体重変化を、治療前体重からの体重の変化％として計算し、毎日記録し（上段パネル；略号は（ｃ）と同様）、７日目のプロットを行った（下段パネル；左から右へ：未処理、ＩＭＱ、担体、局所ＭＴＸ１２．５ｍｇ／ｋｇＭＴＸ、局所ＧＮＰ３７．５ｍｇ／ｋｇＧＮＰおよび局所ＭＴＸ－ＧＮＰ１２．５ｍｇ／ｋｇＭＴＸ）。データを、条件毎に２～５匹のマウス、３つの独立の実験からプールし、平均±標準偏差として表す。（ｅ）種々の局所療法についての耳介皮膚中の免疫浸潤のフローサイトメトリー分析。種々の局所療法（左から右へ：未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋局所ＭＴＸ１２．５ｍｇ／ｋｇＭＴＸ、ＩＭＱ＋局所ＧＮＰ３７．５ｍｇ／ｋｇＧＮＰおよびＩＭＱ＋局所ＭＴＸ－ＧＮＰ１２．５ｍｇ／ｋｇＭＴＸ）での耳介中へのＣＤ４５＋細胞集団の代表的ＦＡＣＳプロット。（ｆ）（左から右へ）：未処理、ＩＭＱ、ＭＴＸ局所、ＧＮＰ局所およびＭＴＸ－ＧＮＰ局所治療マウスの耳介中のＣＤ４５^＋細胞数を、プロットし、統計的比較を示す。ｎｓ＝有意差なし、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図5】種々の局所療法における耳介皮膚中の免疫浸潤のフローサイトメトリー分析。（ａ）種々の局所療法（左から右へ：未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋ＭＴＸ局所、ＩＭＱ＋ＧＮＰ局所およびＩＭＱ＋ＭＴＸ－ＧＮＰ局所）での耳介中へのＣＤ３＋ＣＤ１１ｂ＋細胞集団の代表的ＦＡＣＳプロット。（ｂ）耳介中のＣＤ３^＋細胞の定量化。（左から右へ）：未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋ＭＴＸ局所、ＩＭＱ＋ＧＮＰ局所およびＩＭＱ＋ＭＴＸ－ＧＮＰ局所についての細胞数プロット。統計的比較を示す。（ｃ）（左パネル）耳介中のＣＤ１１ｂ^＋細胞の定量化。（左から右へ）：未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋ＭＴＸ局所、ＩＭＱ＋ＧＮＰ局所およびＩＭＱ＋ＭＴＸ－ＧＮＰ局所についての細胞数プロット。統計的比較を示す。（右パネル）（左から右へ）：未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋ＭＴＸ局所、ＩＭＱ＋ＧＮＰ局所およびＩＭＱ＋ＭＴＸ－ＧＮＰ局所についてプロットしたＣＤ３^＋：ＣＤ１１ｂ^＋細胞の比率。統計的比較を示す。（ｄ）耳介中のＣＤ３^＋細胞のαβおよびγδＴ細胞組成物の細胞数の比較。（ｅ）耳介中のαβＣＤ３^＋細胞のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞数の比較。（ｆ）（上段パネル）異なる局所療法（左から右へ：未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋ＭＴＸ局所、ＩＭＱ＋ＧＮＰ局所およびＩＭＱ＋ＭＴＸ－ＧＮＰ局所）についての耳介中へのＬｙ６Ｇ^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞集団の代表的ＦＡＣＳプロット。（下段パネル）示した治療についてのＬｙ６Ｇ^＋対Ｌｙ６Ｇ^－細胞の比較。ｎｓ＝有意差なし、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図6】種々の全身および局所療法における脾臓中の免疫細胞のフローサイトメトリー分析。（ａ）示した治療法による全身（左）および局所（右）治療についての脾臓中の治療ＣＤ４５^＋細胞の細胞数。（ｂ）示した局所治療後の脾臓中のＣＤ３^＋細胞の細胞数。（ｃ）示した局所治療の脾臓中のＣＤ１１ｂ^＋細胞の細胞数。（ｄ）示した局所治療後の脾臓中のＣＤ３^＋細胞のαβおよびγδＴ細胞組成物の細胞数の比較。（ｅ）示した局所治療後の脾臓中のαβＣＤ３^＋細胞のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞組成物の細胞数の比較。（ｆ）示した治療後の脾臓中のＬｙ６Ｇ^＋対Ｌｙ６Ｇ^－細胞の比較。ｎｓ＝有意差なし、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図7】（左から右へ）未処理、ＩＭＱ、ＩＭＱ＋局所ＭＴＸゲル、ＩＭＱ＋局所ＧＮＰゲルおよびＩＭＱ＋ＭＴＸ－ＧＮＰゲル、の耳介についてμｍ単位でプロットしたアカントーシス（皮膚肥厚）。統計的比較を示す。ｎｓ＝有意差なし、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図8】ＡＧＲ１２９異種移植ヒト皮膚マウスモデルの耳介についてμｍ単位でプロットしたアカントーシス（皮膚肥厚）：（左から右へ）ワセリン、ドボベット、およびＭＴＸ－ＧＮＰゲル。統計的比較を示す。ｎｓ＝有意差なし、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本発明の態様および実施形態は、以降で、添付の図面に関連して考察される。さらなる態様および実施形態は、当業者には明白である。本明細書で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0064】

本発明の記述において、次の用語が用いられ、以下に示されるように定義されることが意図される。

【0065】

前述の記述により、または次の特許請求の範囲で、または添付図面において開示され、開示された機能を実施するための特定の形態でまたは手段の観点から表現された、または開示の結果を得るための方法または工程の特徴は、別々に、またはこのような特徴の組み合わせで、本発明をその多様な形態で実現するために使用され得る。

【0066】

本発明は、上記の例示的実施形態と共に記載されてきたが、多くの等価な修正および変形物は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。したがって、本発明の上述の例示的実施形態は、例示であり、限定するものではないと見なされる。記載された実施形態に対する種々の変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。

【0067】

疑義を生じないために、読者の理解の改善を目的として、本明細書で提供される何らかの理論的説明が提供される。本願発明者らは、これらの理論的説明のいずれかに束縛されることを望むものではない。

【0068】

本明細書で使用されるセクション見出しはいずれも、単に構成上の目的のためであり、記載主題を限定するものと解釈されるべきではない。

【0069】

後に続く特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、示した整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群の包含を意味し、任意の他の整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群の除外を意味しないと理解される。

【0070】

明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含することに留意されなければならない。範囲は、「約（ａｂｏｕｔ）」１つの特定の値から、および／または「約（ａｂｏｕｔ）」別の特定の値までとして本明細書で表され得る。このような範囲が表記される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」を用いて近似値として表記される場合、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されよう。数値に関する用語の「約（ａｂｏｕｔ）」は、任意であり、例えば、±１０％を意味する。

【0071】

ナノ粒子
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、ナノメートルスケールを有する粒子を指し、何ら特定の形状の制限を意味することを意図しない。特に、「ナノ粒子」は、ナノスフェア、ナノチューブ、ナノボックス、ナノクラスター、ナノロッド、などを包含する。特定の実施形態では、本明細書で意図されるナノ粒子および／またはナノ粒子コアは通常、多面体または球状形状を有する。ナノ粒子またはナノ粒子コアの「直径」への言及は通常、ナノ粒子またはナノ粒子コアそれぞれの最長寸法を意味すると解釈される。実質的に多面体形状または球状形状を有するナノ粒子では、粒子を横切る最短寸法は通常、粒子を横切る最長寸法の５０％以内であり、例えば、２５％または１０％以内であり得る。

【0072】

複数の炭水化物含有リガンドを含むナノ粒子は、例えば、国際公開第２００２／０３２４０４号、同第２００４／１０８１６５号、同第２００５／１１６２２６号、同第２００６／０３７９７９号、同第２００７／０１５１０５号、同第２００７／１２２３８８号、同第２００５／０９１７０４号（これらそれぞれの全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されており、このようなナノ粒子は、本発明により使用され得る。

【0073】

本明細書で使用される場合、「コロナ」は、層またはコーティングを指し、それはナノ粒子コアの露出表面を部分的にまたは完全に被覆し得る。コロナは、ナノ粒子のコアに共有結合した複数のリガンドを含む。したがって、コロナは、金属コアを取り囲むまたは部分的に取り囲む有機層であると見なされ得る。特定の実施形態では、コロナは、ナノ粒子のコアの不動態化を提供および／またはそれに関与する。したがって、特定の事例では、コロナは、実質的にコアを安定化するために充分に完全なコーティング層を含み得る。特定の事例では、コロナは、本発明のナノ粒子の溶解性、例えば、水溶解性を促進する。

【0074】

ナノ粒子は小さい粒子、例えば、金属または半導体原子のクラスターであり、不動化リガンドのための基材として使用され得る。

【0075】

好ましくは、ナノ粒子は、０．５～５０ｎｍ、より好ましくは０．５～１０ｎｍ、より好ましくは０．５～５ｎｍ、より好ましくは０．５～３ｎｍ、さらにより好ましくは０．５～２．５ｎｍの平均直径のコアを有する。リガンドがコアに付加されると見なされる場合、好ましくは、粒子の全体平均直径は、２．０～５０ｎｍ、より好ましくは３～１０ｎｍおよび最も好ましくは４～５ｎｍである。平均直径は、当該技術分野において周知の透過型電子顕微鏡などの技術を用いて測定できる。

【0076】

コア材料は、金属または半導体であり得、２種以上の原子から形成され得る。好ましくは、コア材料は、Ａｕ、ＦｅまたはＣｕから選択される金属である。ナノ粒子コアは、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／ＧｄおよびＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄを含む合金からも形成され得、かつ本発明で使用され得る。好ましいコア材料は、ＡｕおよびＦｅであり、最も好ましい材料は、Ａｕである。ナノ粒子のコアは、ナノメートル範囲のコア直径を得るために、好ましくは、約１００～５００個の原子、または１００～２，０００個の原子（例えば、金原子）を含む。他の特に有用なコア材料は、ＮＭＲ活性である１種または複数の原子でドープされた、インビトロおよびインビボの両方でＮＭＲを用いるナノ粒子の検出を可能にする。ＮＭＲ活性原子の例は、Ｍｎ^＋２、Ｇｄ^＋３、Ｅｕ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｖ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｎｉ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｆｅ^＋３およびランタニド^＋３、または量子ドットを含む。

【0077】

半導体化合物を含むナノ粒子コアは、ナノメートルスケールの半導体結晶として検出でき、かつ量子ドットとして機能でき、すなわち、それらは、光を吸収し、それにより材料中の電子をより高いエネルギー準位に励起し、その後、その材料に特徴的な周波数で光のフォトンを放出できる。半導体コア材料の例は、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウムである。硫化亜鉛などの亜鉛化合物も含まれる。

【0078】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子またはそのリガンドは、検出可能な標識を含む。標識は、ナノ粒子またはリガンドのコアの要素であり得る。標識は、ナノ粒子のその要素の固有の特性のために、または検出可能なさらなる部分と連結される、複合化されるまたは結合されることにより、検出され得る。

【0079】

メトトレキサート
以前はアメトプテリンとして知られていた、メトトレキサート（ＭＴＸ）は、化学療法剤および免疫系抑制剤である。これは、種々の癌、自己免疫疾患、子宮外妊娠の治療で、および薬剤誘発性人工流産のために使用された。
ＭＴＸは、ＣＡＳ番号５９－０５－２であり、下に示す構造を有する：

【化18】

【0080】

本明細書で使用される場合、「メトトレキサート」または「ＭＴＸ」は、上記の化学式の化合物を指すのみでなく、１個または複数の官能基がリンカーＬを介したナノ粒子への結合のために修飾されているＭＴＸの誘導体も指す。特に、ＭＴＸは、例えば、上記構造中のカルボン酸基で形成されたアミドを介してリンカーＬに結合され得る。

【0081】

エチレングリコール
本明細書で使用される場合、エチレングリコール含有リンカーまたは鎖は、１個または複数のエチレングリコールサブユニットが存在することを意味する。これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ－または（ＥＧ）_ｍまたは（ＰＥＧ）_ｍまたはＰＥＧ_ｍまたはＰＥＧｍなどの様々な方法で示され、または表され得、式中、ｍは、数である。文脈が別義を指示しない限り、これらの用語は、本明細書では同じ意味で用いられる。したがって、用語の「ＰＥＧ」は、より短い、例えば、ＰＥＧ３またはＰＥＧ８などのオリゴマー長さの鎖のエチレングリコール単位を意味し、これらは、それぞれ、（ＥＧ）_３および（ＥＧ）_８と同じ意味を有する。

【0082】

ゲル
ゲルは、その体積全体にわたり流体により広げられた非流体コロイド状ネットワークまたはポリマーネットワークである。本発明の場合では、ゲルは、薬学的に許容可能なゲル、例えば、ヒドロゲルであり得る。特に好適な種類のヒドロゲルは、ＬｕｂｒｉｚｏｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手でき、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｕｂｒｉｚｏｌ．ｃｏｍ／Ｌｉｆｅ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｃａｒｂｏｐｏｌ－Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓに記載される、架橋ポリアクリル酸ポリマーのカーボポール（登録商標）ファミリーから形成されるヒドロゲルである。

【0083】

投与および治療
本発明のナノ粒子および組成物は、腸内または非経口の経路を含むいくつかの異なる経路により患者に投与され得る。非経口的投与としては、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、眼内、経上皮、腹腔内および局所（皮膚、経眼、直腸、経鼻、吸入およびエアロゾルを含む）、ならびに直腸全身性経路が挙げられる。好ましい投与経路は、皮膚への局所投与による皮膚投与である。

【0084】

本発明のナノ粒子は、固体または液体組成物の形態であり得る医薬組成物として処方し得る。このような組成物は通常、何らかの担体、例えば、水、石油、動物または植物油、鉱物油または合成油などの固体担体または液体担体を含む。生理食塩水、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。このような組成物および製剤は通常、少なくとも０．１重量％の化合物を含む。

【0085】

静脈内、皮膚または皮下注射、または痛み部位の注射の場合、有効成分は、非経口的に許容可能な水溶液または液体の形態であり、それは発熱性物質非含有であり、かつ好適なｐＨ、張性および安定性を有する。当該技術分野において関連する技能を有する人は、例えば、生理食塩水、グリセロール、液体ポリエチレングリコールまたは油を用いて調製された分散液中の、化合物またはそれらの誘導体の溶液などを用いて、好適な溶液をうまく調製できるであろう。

【0086】

１種または複数の化合物に加えて、任意選択で別の有効成分と組み合わせて、組成物は、１個または複数の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤、等張化剤、保存剤または酸化防止剤または当業者に周知の他の物質を含んでよい。このような物質は、非毒性である必要があり、また、有効成分の効力を妨害してはならない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば、局所投与または静脈内注射に依存し得る。

【0087】

好ましくは、医薬組成物は、予防的有効量または治療的有効量で（場合によっては、予防は治療と見なされることもある）個体に投与され、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。通常、これは、個体に利益をもたらす治療的に有用な作用を与える。投与される化合物の実際の量、ならびに投与の速度および投与の時間的経過は、治療される状態の性質および重症度に依存する。治療薬の処方、例えば、投与量などの決定は、一般医および他の医師の管理下にあり、通常は、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に既知の他の因子を考慮に入れる。前述の技術およびプロトコルの例は、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｄｄｉｔｉｖｅｓ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ．Ｍ．ＡｓｈａｎｄＩ．Ａｓｈ），２００１（ＳｙｎａｐｓｅＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡ）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４で見つけることができる。一例として、組成物は、好ましくは、１ｋｇの体重当たり、約０．０１～１００ｍｇの活性化合物の投与量で、より好ましくは約０．５～１０ｍｇ／（ｋｇの体重）の活性化合物の投与量で患者に投与される。皮膚障害の治療の場合、本発明の組成物の局所投与の１つの利点は、得られるメトトレキサートの全身濃度が、メトトレキサートが全身投与された場合よりも顕著に低いことであろう。これは、メトトレキサートの毒性および他の望ましくない副作用が最小化され、または実質的に回避でき、一方でそれにもかかわらず、対象の皮膚患部で臨床的に有益なメトトレキサート濃度を達成できることを意味する。
以下は、一例として提示され、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0088】

実施例
実施例１－メトトレキサート結合金ナノ粒子（ＭＴＸ－ＧＮＰ）の合成
リガンドの調製および［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠ＡｕＧＮＰの合成
アルファガラクトース－Ｃ２（α－Ｇａｌ）および１－アミノ－６－メルカプトヘキサエチレングリコール（「アミノリンカー」または「ＡＬ」としても知られるＳＨ－ＣＨ_２－（ＥＧ）_６－ＮＨ_２）リガンドのコロナを有する金ナノ粒子を以前に記載のように合成した（国際公開第２０１１／１５４７１１号、実施例１および２、および国際公開第２０１６／１０２６１３号、実施例１を参照されたい、これら公開特許の両方は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0089】

２－チオエチル－α－Ｄ－ガラクトシド（α－ガラクトース－Ｃ２ＳＨ「α－Ｇａｌ」）の調製

【化19】

２－ブロモエタノール（３０ｍｌ）中のガラクトース（３ｇ、１６．６５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、酸樹脂アンバーライト１２０－ＨをｐＨ２に達するまで加える。反応物を、５０～６０℃で１６時間撹拌する。反応混合物を、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄する。トリエチルアミンを、ｐＨ８に達するまで加える。反応の粗製物を、濃縮し、トルエンと共に３回共沸蒸留する。反応混合物を、ピリジン（７５ｍＬ）およびＡｃ２Ｏ（３５ｍＬ）に溶解し、触媒量のＤＭＡＰを、０℃で加え、室温で３時間撹拌した。混合物を、ＡｃＯＥｔで希釈し、１．Ｈ_２Ｏ；２．ＨＣｌ（１０％）３．ＮａＨＣＯ_３ｄｉｓ４．Ｈ_２Ｏで洗浄する。有機層を集め、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させる。ＴＬＣ（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ３：１、２回溶出）は、主要生成物（目的のもの）およびより低いＲｆの小量生成物を示す。生成物を、ヘキサン：酢酸エチル６：１の混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、２－ブロモエチル－アルファガラクトシド（２）を得る。

【0090】

前の反応の生成物、２を、２７ｍｌの２－ブタノンに溶解する。この溶液に、触媒量のテトラブチルアンモニウムヨージドおよび４当量のカリウムチオアセテートを加える。得られた懸濁液を室温で２時間攪拌する。この期間中、反応物を、出発材料の消滅についてＴＬＣ（ヘキサン－ＡｃＯＥｔ２：１、２回溶出）により検査する。混合物を、２０ｍｌのＡｃＯＥｔで希釈し、ＮａＣｌの飽和溶液で洗浄する。有機相を、乾燥し、濾過し、減圧下で留去する。生成物を、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ２：１→１：１で精製して、アセチルチオ－アルファガラクトシド３を得る。

【0091】

反応の新規生成物、３を、ジクロロメタン：メタノール２：１の混合物に溶解する。この混合物に、１Ｎのナトリウムメトキシドの溶液（１当量）を加え、室温で１時間撹拌する。アンバーライトＩＲ－１２０Ｈ樹脂を、ｐＨ５～６に達するまで加える。得られた混合物を次に、濾過し、濃縮乾固して、最終生成物（α－ガラクトースＣ２ＳＨ）を得る。

【0092】

アミノチオールリンカー（ＡＬ）の調製

【化20】

２０ｍｌの無水ＴＨＦ中のＰＰｈ_３（３ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＡＣ（２．３ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、白色生成物が出現するまで０℃で１５分間撹拌する。この混合物に、乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のヘキサエチレングリコール（１．４５ｍｌ、５．７ｍｍｏｌ）およびＨＳＡｃ（６１０μｌ、８．５５ｍｍｏｌ）の溶液を滴加する（滴加漏斗）。１５分後、生成物が、ＴＬＣ上にＲｆ０．２で出現し始める。溶液を、蒸発装置中で濃縮する。反応粗製物を、５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、Ｋ_２ＣＯ_３の１０％溶液で洗浄する。有機相を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮する。溶出液としてＡｃＯＥｔ：ヘキサン１：１、ＡｃＯＥｔ、および最終的にＤＣＭ：ＭｅＯＨ４：１を用いる粗製生物のフラッシュクロマトグラフィーは、アセチルチオ－ヘキサエチレングリコール誘導体を与えた。

【0093】

反応生成物を、５ｍｌのＤＭＦに溶解し、ＰＰｈ_３（２．２５ｇ、８．５５ｍｍｏｌ）、ＮａＮ_３（０．７４１ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）およびＢｒＣｌ_３Ｃ（０．８４５ｍｌ、８．５５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を続いて、室温で４０分間撹拌する。得られた生成物は、ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ２５：１）を実施すると、出発生成物より高いＲｆを有する。反応混合物を、１００ｍｌのジエチルエーテルで希釈し、Ｈ_２Ｏで３回洗浄する。有機相を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で留去する。生成物を、溶出液の混合物、ＤＭＣ／ＭｅＯＨ２００：１およびＤＣＭ／ＭｅＯＨ４０：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、アジド－アセチルチオ－ヘキサエチレングリコール誘導体を得る。

【0094】

トリフェニルホスフィンオキシドを除去するために、反応生成物を、１０ｍｌのＴＨＦに溶解し、０．５ｇのＭｇＣｌ_２を、この溶液に加える。反応物を、白色沈殿物が出現するまで８０℃で２時間撹拌し、その後、セライトを通して濾過する。

【0095】

生成物を、エタノール：Ｈ_２Ｏ３：１の混合物に溶解し、Ｚｎダスト（０．４５ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）およびＮＨ_４Ｃｌ（０．６ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を加える。反応物を、ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ２５：１）により出発材料の存在が検出されなくなるまで、１時間、還流下攪拌した。反応物を、セライトを通して濾過し、溶媒を、留去する。粗製反応生成物を、ＡｃＯＥｔで希釈し、５ｍｌのＨ_２Ｏで抽出する。水相を、蒸発乾固させて、アミノチオール－ヘキサエチレングリコール生成物を得る。

【0096】

［α－Ｇａｌ］２２［ＡＬ］２２＠ＡｕＧＮＰの合成
アルファガラクトースＣ２誘導体３およびヘキサエチレングリコールアミンリンカー６を、ＭｉｄａｔｅｃｈＢｉｏｇｕｎｅストックから採取した。Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ＨＡｕＣｌ_４、ＮａＢＨ_４を、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙから購入した。イミダゾール－４－酢酸・一塩酸塩を、ＡｌｆａＡｅｓａｒから購入した。カンパニーハイクオリティＭｅＯＨおよびナノピュア水（１８．１ｍΩ）を、全実験および溶液に使用した。

【化21】

ＭｅＯＨ（４９ｍＬ）中の１：１の比（０．５８ｍｍｏｌ、３当量）でのアミンメルカプトヘキサエチレングリコールリンカー６およびアルファガラクトースリガンド３の混合物に、金塩（７．８６ｍＬ、０．１９ｍｍｏｌ、０．０２５Ｍ）の水溶液を加えた。反応物を、３０秒間攪拌した後、ＮａＢＨ_４の水溶液（１Ｎ）を、数回に分けて添加した（４．３２ｍＬ、４．３２ｍｍｏｌ）。反応物を、９００ｒｐｍで１００分間震盪した。この時間の後で、懸濁液を、１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清を、除去し、沈殿物を、２ｍＬの水に溶解した。次に、２ｍＬの懸濁液を、２つのフィルター（Ａｍｉｃｏｎ、１０ＫＤａ、４ｍＬ）に導入し、４５００ｇで５分間遠心分離した。フィルター中の残留物を、水でさらに２回洗浄した。最終残留物を、８０ｍＬの水に溶解した。

【0097】

メトトレキサートによる［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠ＡｕＧＮＰの官能化
上述のように調製した［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠Ａｕナノ粒子のメトトレキサートによる官能化を、下記のスキームに従い室温でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて実施した：

【化22】

【0098】

【表1】

【0099】

手順
ナノ粒子を、遠心分離により濃縮し、ＤＭＳＯ（３．６２ｍＬ）で集めて約８０００ｐｐｍの金濃度を得た。

【0100】

薬物活性化
ＤＭＳＯ中のＭＴＸ（０．１Ｍ）の溶液に、ＥＤＣ（３８．４μＬ；０．５Ｍ）を加え、混合物を約５分間撹拌した。その後、ＮＨＳ（１９．２μＬ；１．０Ｍ）を加え、混合物を、室温で３０分間活性化した。

【0101】

薬物官能化
［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠ＡｕＧＮＰ（７５０μＬ）を、前に活性化した溶液に加え、カップリング系を、暗所で室温にて一晩インキュベートした。

【0102】

精製
ナノ粒子を、ＮａＯＨ０．１Ｍを溶出液として用いて遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分）により精製した。含有物を、５００μＬのＨ_２Ｏ（１２．００μｇ／μＬ）中に集め、さらなる分析のために貯蔵した。

【0103】

分析
金含量を、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）により、サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）により、静電荷を、ゼータ電位により、および構造を、^１ＨＮＭＲにより評価した。
ＤＬＳサイズは、５．１５ｎｍに主ピークを示した。しかし、１．６１ｎｍの副次的ピークも同様に観察され、ナノ粒子の２つの集団を示した。微分型遠心沈降（ＤＣＳ）分析は、３．０ｎｍおよび８．０ｎｍのサイズを有する２つのナノ粒子集団の存在を確証した。
ゼータ電位は、－５１．１ｍＶ（すなわち、負に帯電）であることが明らかになった。
上記手順を、異なる当量のＭＴＸを用いて反復した。それぞれの場合で、ナノ粒子当りのＭＴＸの最終担持を、^１ＨＮＭＲ分析により決定した。２当量／ＧＮＰ～最大で約５当量／ＧＮＰのＭＴＸ担持を得た。

【0104】

結論
上記結果は、１０ｎｍ未満のサイズと最大５当量のＧＮＰ当りのＭＴＸを有する［α－Ｇａｌ］－［ＭＴＸ－ＡＬ］＠ＡｕＧＮＰの合成の成功を実証した。しかし、ばらつきが、ＧＮＰサイズとゼータ電位のバッチ間で観察された。メトトレキサートは、正に帯電したＧＮＰ上のアミン基への結合能力の変動に繋がり得る、２つの潜在的カルボキシレート結合部位を有する（すなわち、生じ得るＭＴＸの二重ＥＤＣ活性化が、不均一な生成物を説明し得る）。

【0105】

実施例２－修飾メトトレキサート結合金ナノ粒子（ＭＴＸ－ＧＮＰ）の合成
本発明者らは、ＧＮＰ当りのＭＴＸ担持を増大させること、および実施例１で観察されたＭＴＸ上のカルボキシル基に起因する変動を低減することを目標とした。
この目的のために、２０１８年１２月１８日出願の同時係属出願ＧＢ１８２０４７０．１に記載のように（この出願の実施例２を参照、この出願は参照により本明細書に明示的に組み込まれる）、（ＥＧ）_３ＮＨ_２リンカーを有する修飾メトトレキサートを、合成した。

【化23】

【0106】

リンカーを有するメトトレキサート誘導体の化学名は、４－［（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタン酸である。メトトレキサート誘導体を、次の反応スキームに従い調製した：

【化24】

この実験の目的は、ＧＮＰ当り１２当量超のＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２（ＭＴＸ－（ＥＧ）_３－ＮＨ_２としても知られる）担持を有する５０ｍｇのＧＮＰを合成することであった。

【0107】

ベースのＧＮＰ粒子は、（［α－ＧａｌＣ２］_５２％［ＨＳＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］_４８％＠Ａｕ）であり、カップリングを、ＥＤＣ／ＮＨＳ法を用いて実施した。実施例１の正に帯電したＡＬとは対照的に、この実施例では、ベースＧＮＰは、α－Ｇａｌ－Ｃ２リガンドに加えて、カルボン酸末端官能基（負に帯電）を有するＰＥＧ_８（すなわち、（ＥＧ）_８含有）リガンドを有する。ベースＧＮＰ［α－ＧａｌＣ２］_５２％［ＨＳＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］_４８％＠Ａｕを、基本的に国際公開第２０１７／０１７０６３号（この公開特許の実施例５を参照）に記載のように合成した。この公開特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0108】

試薬

【表2】

【0109】

反応スキーム

【化25】

溶媒：１）ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化用の９０％ＤＭＳＯ；
２）ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２カップリング用のＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．８３）

【0110】

ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化
３８．１２ｍｇのＥＤＣを、最初に３．３１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、その後、この６０ｍＭのＥＤＣＤＭＳＯストックの３．１６ｍＬを、４３．６７ｍｇのＮＨＳと混合して、ＥＤＣ（６０ｍＭ）／ＮＨＳ（１２０ｍＭ）の最終ＤＭＳＯストックを得た。
１１ｍＬの９０％ＤＭＳＯＧＮＰ溶液（６０ｍｇＡｕ）を、５００ｒｐｍで撹拌し続けた後、２．７９ｍＬのＥＤＣ／ＮＨＳＤＭＳＯストックを、滴加した。反応混合物を、２時間室温にて５００ｒｐｍで撹拌し続けた（［Ａｕ］≒４．３５ｍｇ／ｍＬ）。

【0111】

２時間の活性化後に、ＧＮＰ－ＮＨＳＤＭＳＯ溶液を、遠心分離（４３００ｒｐｍ、８分）により８ｘ１５ｍＬのＡｍｉｃｏｎチューブ（１０Ｋ）中で濃縮した。ＧＮＰ最終濃度は、約１２ｍＬであった。

【0112】

ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２カップリング：
ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２（ＮＰ当り６０当量）：（６０ｍｇＡｕ／１９６．９７）÷１００ｘ６０ｘ６５６．７５＝１２０ｍｇ
１２０ｍｇのＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２を最初に、２０ｍＬのヘペス緩衝液（ｐＨ＝７．８３）に溶解し、次にこれを、２５０ｍＬの丸底フラスコに移した。室温（約２２℃）にて６００ｒｐｍで撹拌しながら、１２ｍＬの濃縮ＧＮＰ－ＮＨＳ溶液を、滴加した。その後、２０ｍＬのヘペス緩衝液を、この混合物に加えた。反応混合物を、室温（約２２℃）にて６００ｒｐｍで一晩撹拌した（［Ａｕ］＝１．１５ｇ／Ｌ）。

【0113】

翌朝、反応溶液混合物を、１５ｍＬのＡｍｉｃｏｎチューブ（１０Ｋ）中で濃縮し、ミリＱ水で洗浄することにより精製した（ｘ８、４３００ｒｐｍ、８分／洗浄）。濃縮溶液を次に、１３．３Ｇで５分間（ｘ２）遠心分離して、全ての大きなサイズの粒子を溶液から除去した。最終濃縮ＧＮＰ溶液を、ミリＱ水で希釈して、１１ｍＬの最終体積を得た。

【0114】

【表3】

ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２含量を、下記の試料調製を行いＡｇｉｌｅｎｔＨＰＬＣにより評価した：８μｇのＡｕを、０．２ＭのＴＣＥＰで希釈して、４０μＬの最終体積を得た（［Ａｕ］＝０．２ｇ／Ｌ）後、３７℃でインキュベートし、６００ｒｐｍで１時間撹拌した。インキュベーション後に、４０μＬのミリＱ水を加えて、８０μＬの最終総体積（［Ａｕ］＝０．１ｇ／Ｌ）を得た。この溶液を、ＨＰＬＣにより分析した（２０μＬ注入→２μｇＡｕ）。ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２の標準のために：４μＬの２ｇ／ＬＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２ストック水溶液および３６μＬの０．２ＭＴＣＥＰを、３７℃でインキュベートし、６００ｒｐｍで１時間撹拌した。これに、１６０μＬのミリＱ水を加えた（総体積＝２００μＬ［ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２］＝０．０４ｇ／Ｌ）。この溶液を、ＨＰＬＣにより分析した（１０μＬ注入→０．４μｇ、２０μＬ→０．８μｇおよび３０μＬ→１．２μｇ）。

【0115】

検量線を、生成した（比色分析による金の定量化時に黄色ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２化合物の効果を考慮し、それにより金濃度を修正する）。ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２担持は、ＧＮＰ当り１６．７当量であると決定され、９７．４％の組み込みであった。

【0116】

まとめると、このＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２粒子のバッチは、次の特性を有した：小サイズの単一サイズ集団（５．６７８ｎｍ）、負のゼータ電位（－２２．８ｍＶ）、５２０ｎｍにプラズモンバンドなし、ＧＮＰ上のＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２組み込みは９７．４％であり、および最終粒子の担持はＧＮＰ当り１６．７当量であった。一致した結果が、異なる反応器サイズ（５０ｍおよび１００ｍｇＡｕ）のバッチ間でも認められた。これらの結果は、実施例１で得られた結果と比べて遜色がない。特に、修飾ＭＴＸ（ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２）は、顕著に高い担持（１６．７当量対約５当量のＭＴＸ）、高添加量効率（９７．４％）および単一サイズ集団を促進した。特定の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＧＮＰのＰＥＧ_８ＣＯＯＨリガンドへのＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２のカップリングは、実施例１で記載のＭＴＸ上の複数のカルボキシル部位の問題を回避し、およびこれは、単一粒度分布／集団（実施例２）と２つのサイズ分布／集団（実施例１）の間の観察された差異を説明し得ると考えている。さらに、ここで測定された９７．４％の担持効率は、Ｂｅｓｓａｒｅｔａｌ．，２０１６で報告された一番高い担持効率の８３±２％よりもさらに顕著に高い。Ｂｅｓｓａｒｅｔａｌ．，２０１６の担持は、ＧＮＰ当りのＭＴＸ当量の観点から報告されていない。しかし、Ｂｅｓｓａｒｅｔａｌ．，２０１６の合成で使用されたＭＴＸ薬物に対するＡｕ－３ＭＰＳの重量比は、５：１（すなわち、ＧＮＰの過剰）であった。結論として、［α－ＧａｌＣ２］［ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ－ＣＯ－ＰＥＧ_８］＠ＡｕＧＮＰは、高いＭＴＸ担持および皮膚浸透のための好適な物理学的性質を示す。

【0117】

実施例３－［α－ＧａｌＣ２］［ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ－ＣＯ－ＰＥＧ_８］＠ＡｕＧＮＰのヒドロゲルへの製剤化。
現在利用可能なメトトレキサートの市販の局所製剤は、生理学的ｐＨ（ｐＨ６）で解離型である、薬物の水溶性に主に起因して、角質層を介する浸透が不十分である。炭水化物リガンドを含むコロナを有する本明細書で開示のＧＮＰの超小寸法（＜５ｎｍ）は、好適な正味表面電荷を可能にし、無処理の皮膚を横切るメトトレキサートの浸透能力を高める可能性を提供し得る。

【0118】

最近、局所金ナノ粒子クリーム製剤が、メトトレキサート複合化ＧＮＰの予備試験で不十分な経皮吸着を示すと、Ｂｅｓｓａｒｅｔａｌ．２０１６により報告された。ヒドロゲルはまた、それらが製剤からの薬物送達のより大きな柔軟性および制御を可能にし得る単一相担体を提供するので、局所ナノ粒子製剤の開発にも適用されてきた。加えて、ヒドロゲルは、薬物と製剤基剤の間の高親和性が効率的な皮膚内への薬物移行を損なう市販の軟膏に比べて、皮膚上に残留製剤を残さない急速蒸発の利点を提供する。従って、カーボポールヒドロゲルを、ＧＮＰベース局所製剤の開発のために選択した。

【0119】

次のポリマー（ＬｕｂｒｉｚｏｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、評価した：カーボポール（登録商標）ＥＴＤ２０２０（Ｃ１０－３０アルキルアクリレート架橋ポリマー）、カーボポール（登録商標）９８０ＮＦポリマーおよびカーボポール（登録商標）９７４ＰＮＦポリマー。ゲルを、１～３％ｗ／ｖのカーボポールポリマー（ｗ／ｖ）を一定混合により精製水中に分散させ、５時間にわたり水和させることにより調製した。ゲルの調製中にロッカー上で溶液をゆっくり撹拌することにより、空気の閉じ込めを回避するように注意した。５時間後に、ゲルのｐＨを、ｐＨを中和するためにトリエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ロット＃ＳＴＢＦ６１６Ｖ）を用いてｐＨをｐＨ７．４に調節し、溶液をゲルに変化させた（トリエタノールアミンは、本明細書ではトリエチルアミンに対する好適な代替物と考えられる）。２％のカーボポール（登録商標）９８０ゲルは、透明で均質なゲルを生成することがわかったが、ＥＴＤ２０２０ゲルは、均一にするのがより困難であった。従って、金グリコナノ粒子のヒドロゲルへの製剤化を、カーボポール（登録商標）９８０ＮＦポリマーにより進めた。

【0120】

ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２担持ＧＮＰを、基本的に実施例２に記載のように調製した。メトトレキサート－ＧＮＰヒドロゲルの製造のために、２％ｗ／ｖカーボポール（登録商標）９８０を最初に、一定混合しながら５時間分散させた。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりＡｍｉｃｏｎ遠心濾過チューブ（１０Ｋ分画分子量膜）を用いて濃縮した。２％カーボポール（登録商標）９８０溶液への添加の前に、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを、ｐＨ２．６に調節した。酸性ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを次に、２％カーボポール（登録商標）９８０溶液に添加した。しかし、ナノ粒子は、カーボポール（登録商標）９８０溶液中で急速に沈殿することが観察された。プレーンメトトレキサート薬物ゲルを、水中にＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２を水中に溶解すること、およびｐＨをｐＨ４．５に調節することにより調製した。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２溶液を、以前に作製した２％カーボポール（登録商標）９８０溶液に加えた。しかし、小量の黄色沈殿も観察された。

【0121】

金ナノ粒子をカーボポール（登録商標）９８０ゲル中に製剤化する方法を、対照［α－Ｇａｌ］［ＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］＠ＡｕＧＮＰを用いて、ｐＨの影響およびナノ粒子の添加速度を試験することにより最適化した。沈殿物のない均質のナノ粒子ゲルが、［α－Ｇａｌ］［ＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］＠ＡｕＧＮＰを一定混合しながら滴加する前に、カーボポール（登録商標）９８０溶液のｐＨをｐＨ７．４に調節した場合に得られた。同様に、メトトレキサートゲル（ナノ粒子のない）についても、沈殿物のない均質の黄色ゲルが、修飾メトトレキサートの滴加の前にカーボポール（登録商標）９８０溶液のｐＨをｐＨ７．４に調節した場合に得られた。ゲルを全て、４℃で貯蔵した。

【0122】

メトトレキサート－ＧＮＰヒドロゲルの製造のために、２％ｗ／ｖカーボポール（登録商標）９８０を、一定混合しながら５時間分散させた。カーボポール（登録商標）９８０溶液のｐＨを、７．４に調節して明確なゲルを生成した。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを、Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過チューブを用いて濃縮した後、２％カーボポール（登録商標）９８０ゲルに添加した。得られたＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲルは、均質褐色ゲルであり、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰの沈殿はゲル中で観察されなかった。［α－Ｇａｌ－Ｃ２］［ＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］＠ＡｕＧＮＰを用いて、対照ＧＮＰ（薬物なし）ゲルも同様に調製し、褐色の均質ゲルを生成することが分かった。プレーンメトトレキサート薬物ゲルを、ｐＨ７．４に調節したカーボポール（登録商標）９８０ゲル（２％）に、水中に溶解したＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２を添加することにより調製した。メトトレキサートは、容易に取り込まれ、黄色で均質のヒドロゲルを生成し、メトトレキサート誘導体の沈殿が観察されないことが明らかになった。

【0123】

ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲル中のＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２の濃度は、０．１８～０．２％（ｗ／ｗ）の範囲であった。
以前に報告された局所製剤中のＭＴＸ濃度は通常、０．２５％～０．５％の範囲である（例えば、Ｌａｋｓｈｍｉｅｔａｌ．，ＩｎｄｉａｎＪＤｅｒｍａｔｏｌＶｅｎｅｒｅｏｌＬｅｐｒｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．７３，ｐｐ．１５７－１６１ａｎｄＪａｂｕｒｅｔａｌ．，ＪＦａｃＭｅｄＢａｇｈｄａｄ，２０１０，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．１，ｐｐ．３２－３６を参照のこと）。

【0124】

ＧＮＰ（＋／－ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２）ヒドロゲル製剤ならびにＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２ヒドロゲル（すなわち、ＧＮＰなし）およびカーボポール（登録商標）９８０ヒドロゲル製剤を、インビボ試験に使用して、イミキモド誘導乾癬様炎症マウスモデルでのメトトレキサートの炎症性皮膚中への送達の促進における局所適用ＧＮＰ（＋／－ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２）ヒドロゲル製剤の有効性を決定した（下記実施例４参照）。

【0125】

実施例４－イミキモド（ＩＭＱ）誘導乾癬マウスモデルでのＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰの試験
この試験の目的は、イミキモド（ＩＭＱ）誘導乾癬マウスモデル（ＩＭＱが３連続日にわたりマウスの耳介に適用される（図２（ａ）））を用いて、高められた皮膚浸透性を有するＭＴＸ－ＧＮＰゲル製剤（実施例２および３に記載のようにヒドロゲルとして処方されたＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰ）の治療効力を評価することであった。臨床的有効性およびインビボ耐容性を、全身投与（皮下注射）および局所投与の両方の場合について、関連対照に対し評価した。

【0126】

最初に、我々は、用量漸増設定を用いて、ＭＴＸに対するマウスの耐性を評価した（図２ｂ）。ＭＴＸ（５ｍｇ／ｋｇを毎日）による臨床的に効果的な治療は、動物の構成を損ない、療法中を通して制御不能な連続的減量をもたらすことがわかった（図２ｃ）。他方で、耐容量の薬物（２ｍｇ／ｋｇを毎日）は、有意な炎症制御を示さず、ＩＭＱ単独の対照群と同等の耳介厚測定値をもたらす（図２ｂ）。これらの結果は、乾癬の療法としての遊離ＭＴＸの全身投与の欠点を明確にする。

【0127】

遊離薬物として投与された場合効果的でなかったが耐容可能であった、同じ２ｍｇ／ｋｇ投与量のＭＴＸを含むＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰの皮下全身投与は、ＩＭＱ誘導炎症を有意に回復し、ＧＮＰの加算的抗炎症薬作用を示した（図３ｃ参照）。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰによる治療レジメンは、肝臓酵素測定（データは示さず）および毎日の体重監視により評価して、顕著な全身毒性をもたらさなかった（図３ｂ）。これらの結果は意外にも、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰは、全身投与された場合でも、ＭＴＸ単独に比べて改善された有効性および耐容性を示すことを示す。

【0128】

局所ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを、ＩＭＱモデルにおけるＭＴＸの全身投与に対する臨床的有効性および最適耐性の事前評価に基づいて、ヒドロゲルとして製剤化した（実施例３）。局所実験のスキームを、図４ａに示す。ゲルベースＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２ＧＮＰの毎日の局所投与は、ＩＭＱ誘導耳介炎症を劇的に低減した（図４ｂ）。３日間のＩＭＱ処理は、激しい耳介の肥厚化をもたらし、これは、局所ゲルベースＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰ療法により有意に防止された（図４ｃ）。

ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲルと同じ合成条件下で調製された、ゲルベースＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２製剤は、ＩＭＱ誘導耳介厚に影響を与えなかった（図４ｃ）。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２ゲル製剤の効果の相対的欠如はおそらく、以前に記載されたＭＴＸの親水性および不十分な皮膚浸透に起因するものであろう。興味深いことに、ＧＮＰ単独で処方されたゲル（すなわち、ＭＴＸ不含のゲル）もまた、耳介厚の中程度であるが有意な低減をもたらし（図４ｃ）、これは、おそらく、ＧＮＰの報告された抗炎症薬効果によるものであろう（Ｓｈｕｋｌａ，Ｒ．ｅｔａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ２１，１０６４４－１０６５４，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｌａ０５１３７１２（２００５），Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｙ．ｅｔａｌ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８８，６８－７６，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１１００３４４（２０１２）およびＭｏｙａｎｏ，Ｄ．Ｆ．ｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ１，３２０－３２７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｐｒ．２０１６．０７．００７（２０１６））。

【0129】

明確な組織学的差異が、局所ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲル療法対ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２ゲルまたはＧＮＰゲル療法単独を受けたＩＭＱ処理耳介および対照で観察された（図４ｂ）。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲルの局所投与は、肝臓酵素測定（データは示さず）および毎日の体重監視により評価して、動物で耐容性良好であり、かつ顕著な全身毒性は、観察されなかった（図４ｄ）。
従って、これらの結果は、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲルによる限局性局所療法は、最小限度から動物の健康との干渉がない程度まで、ＩＭＱ誘導炎症の影響を弱めることができることを示す。

【0130】

さらなる分析を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を用いて上述の療法を受けるマウスのＩＭＱ処理耳介中の炎症性環境で行った。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲルによる局所療法を受けるマウスは、ＩＭＱ単独群と比較して、少ない数のＣＤ４５^＋細胞により示される、耳介中への浸潤性免疫細胞数の有意な低減を示した。全ての他の試験した局所療法（ＩＭＱ＋ＭＴＸ、ＩＭＱ＋ＧＮＰ）は、ＩＭＱ単独群と同等の免疫浸潤を有した（図４および５）。特に、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲル治療群は、ＣＤ１１ｂ^＋とＣＤ３^＋Ｔ細胞の間のバランスの回復を示した（図５ｃ）。より詳細なＦＡＣＳ分析を実施して、獲得免疫および自然免疫のキープレーヤーに対するＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲルによる局所療法の乾癬炎症の影響を特定した。我々は、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰゲルによる限局性局所治療は、皮膚のγδＴ細胞およびＬｙ６Ｇ^＋好中球を実質的に除去でき、ＣＤ４^＋αβＴ細胞を著しく制限し、一方でＣＤ８^＋Ｔ細胞は、影響を受けないで残されることを示した（図５ｄおよびｅ）。脾臓中の免疫集団に対する明らかな全身的な作用は、観察されなかった（図６）。

【0131】

結論
この結果は、本発明のＭＴＸ担持ＧＮＰ製剤は、局所投与の場合、皮膚浸透性であり、皮膚炎症を軽減することを示す。局所ＭＴＸ－ＧＮＰゲル製剤は、イミキモド誘導炎症を克服でき、その炎症をベースライン近くに低減し、好中球をベースライン相当に減らす。さらに、限局性ＭＴＸ－ＧＮＰ適用は、動物で耐容性良好であり、高投与量で動物の健康を不可逆的に損なう全身性ＭＴＸ投与とは異なる。γδＴ細胞、好中球およびＣＤ４^＋αβＴ細胞を含む乾癬のキープレーヤーは、ＭＴＸ－ＧＮＰ治療群中の未処理対照に比べて、顕著に増殖しない。その強力な抗炎症能力および耐容性を考慮すると、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを含む、ゲルベースＭＴＸ－ＧＮＰは、乾癬およびさらにはより広範な炎症性の皮膚疾患に対する、非ステロイド性局所治療薬の代替薬としての魅力的な選択肢を提供する可能性がある。実際に、発明者らは、次の皮膚障害を、本発明のナノ粒子製剤による治療から恩恵を受けることが期待される傷害と考えている：乾癬（例えば、尋常性乾癬または膿疱性乾癬、逆乾癬、おむつ部乾癬、爪乾癬、滴状乾癬、口腔乾癬、もしくは脂漏性湿疹様乾癬）。いくつかの実施形態では、障害は、毛孔性紅色粃糠疹、皮膚苔癬、酒さ、円形脱毛症、皮膚リンパ腫、湿疹性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、皮膚薬物反応、結節性痒疹、または皮膚肥満細胞症）、自己免疫性水疱性皮膚障害（例えば、天疱瘡／類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、表皮水疱症）、皮膚ループス、皮膚血管炎、ベーチェット病、強皮症様皮膚疾患、好中球媒介皮膚疾患（例えば、壊疽性膿皮症、スイート症候群、化膿性汗腺炎、ＳＡＰＨＯ症候群）、肉芽腫性皮膚疾患（例えば、環状肉芽腫、環状紅斑、結節性紅斑、サルコイドーシスまたはリポイド類壊死症）から選択され得る。

【0132】

実施例５－異種移植ヒト皮膚ＡＧＲ１２９マウスモデルでのＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰカーボポールヒドロゲルとドボベットゲル（乾癬局所標準治療）の比較。
Ｂｏｙｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００４，Ｖｏｌ．１９９，Ｎｏ．５，ｐｐ．７３１－７３６は、無症状の乾癬前ヒト皮膚がＡＧＲ１２９マウスに移植された場合に皮膚病変が自然発症的に発症した、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン受容体を欠き、かつ組替え活性化遺伝子２のための、動物モデルについて記載している。生着時に、乾癬前皮膚中の常在性ヒトＴ細胞は、局所増殖を受ける。Ｔ細胞増殖は、Ｔ細胞の遮断が乾癬発生の抑制に繋がるため、乾癬表現型の発生にとって重要であった。腫瘍壊死因子αは、局所Ｔ細胞増殖およびそれに続く疾患発症の重要な制御因子であった。Ｂｏｙｍａｎｅｔａｌ．，２００４のＡＧＲ１２９マウスモデルは、潜在的乾癬療法の研究のために、極めて適切な系である。特に、このモデルは、試験化合物の乾癬の発症を抑制する能力を含む、ヒト皮膚に対する効果を試験するための手段を提供し、従って、実施例４で記載されるイミキモド処理マウスモデルに対する追加の関連する特徴を提供する。

【0133】

方法
非症候性皮膚のケラトーム生検材料を、ヒト乾癬患者から得た。皮膚試料（１ｃｍ^２）を次に、ＡＧＲ１２９マウスの剪毛した背中に移植した。ＡＧＲ１２９マウスは、Ｉ型（Ａ）および２型（Ｇ）インターフェロン受容体を欠いており、それらはまた、ＲＡＧ－２^ＫＯ（Ｒ）でもある。したがって、それらは、ＴおよびＢ細胞を欠き、ＮＫ細胞は非機能性である。この特殊な背景は、移植片の受け入れを保証する。

【0134】

移植された非病変皮膚を、４～６週以内に乾癬表現型に進行させた。本発明の試験の１つの目的は、この発症を阻止するＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲル局所製剤の乾癬表現型の能力を調査すること、ならびにβ－メタゾンおよびカルシポトリオールを含む標準局所治療薬ドボベットゲルと比較して、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲルがどのように機能するかを知ることであった。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲル治療群に加えて、ワセリンおよびドボベットゲル対照群を、含めた。

【0135】

毎日の局所治療を、移植を移植の２１日後に開始し、２週間にわたり実施した。１０～１２匹のマウスに、実験当たり移植した。動物を、３５日目に屠殺した。移植片の免疫組成を、組織学およびＦＡＣＳにより測定した。

【0136】

結果
最大表皮厚さ（アカントーシス）を、角質層と生存可能表皮（顆粒層または有棘層）の移行部から、乳頭間隆起の最深部まで測定した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒａｋｉｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１９８３，Ｖｏｌ．８０，Ｎｏ．６，Ｓｕｐｐｌ．１，ｐｐ．３１ｓ－３５ｓの図１に示されるように）。測定を、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅプログラムを使用して行った。１０個の網状組織を測定し、平均値を、表皮厚さとしてマイクロメートル単位で表した（図８）。

【0137】

図８に示すように、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲルについての結果は、極めて再現性が良く、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲルが、ワセリン対照（Ｐ＜０．０００１）およびドボベット（Ｐ＜０．０５）の両方に比べて乾癬の発症を抑制したことを示したことが明らかになった。これらの結果は、従って、ヒト乾癬前皮膚を用いた高性能インビボモデルにおける乾癬の発症または進展を有意に抑制する、本発明のＭＴＸ担持ナノ粒子の能力の証拠を示す。