特表 2022-513312 表面修飾細胞外小胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】表面修飾細胞外小胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/88 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20220131BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 17/02 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/88 Z

C12N15/09 100

C12N15/113 Z

A61K35/12

A61K31/7088

A61K48/00

A61K38/02

A61K31/713

A61K31/7105

A61K47/64

A61P35/00

A61P35/02

A61P29/00

A61P37/02

A61P9/00

A61P1/00

C07K17/02

C07K16/00

C12N5/078

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2021541013

(86)(22)【出願日】2019-09-20

(85)【翻訳文提出日】2021-05-19

(86)【国際出願番号】 SG2019050481

(87)【国際公開番号】W WO2020060496

(87)【国際公開日】2020-03-26

(31)【優先権主張番号】62/734,303

(32)【優先日】2018-09-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/776,009

(32)【優先日】2018-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521116532

【氏名又は名称】シティー・ユニバーシティー・オブ・ホンコン

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】シー，ジアハイ

(72)【発明者】

【氏名】ル，ティ・グエット・ミン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ，リクン

(72)【発明者】

【氏名】ファム，チャン・ティン

(72)【発明者】

【氏名】ウスマン，ワカス・ムハンマド

(72)【発明者】

【氏名】ジャヤジングヘ，ミグラ・カヴィシュカ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BD39

4B065CA23

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC16

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZA36

4C084ZA66

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB26

4C084ZB27

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086ZA36

4C086ZA66

4C086ZB07

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZB27

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB62

4C087CA10

4C087NA13

4C087ZA36

4C087ZA66

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA50

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045FA80

(57)【要約】

本発明は、細胞外小胞の膜タンパク質に共有結合されている外因性ポリペプチドタグを含む、表面修飾細胞外小胞に関する。特定の実施形態では、タグは、ソルターゼ媒介ライゲーションによってマイクロベシクルの膜タンパク質に共有結合されている。前記細胞外小胞を調製する方法及び疾患を処置するために治療分子を積載した前記細胞外小胞を使用する方法も本明細書に開示する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

外因性ポリペプチドタグを含む細胞外小胞であって、タグが細胞外小胞の膜タンパク質に共有結合されている、細胞外小胞。

【請求項2】

タグが１つ又は複数の機能性ドメインを含み、機能性ドメインが標的部分に結合することができ、検出されることができ、及び／又は治療効果を誘導することができる、請求項１に記載の細胞外小胞。

【請求項3】

機能性ドメインが、抗体又は抗原結合断片、好ましくはｓｄＡｂを含む、請求項２に記載の細胞外小胞。

【請求項4】

マイクロベシクル又はエキソソーム、好ましくはマイクロベシクルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞外小胞。

【請求項5】

赤血球に由来するマイクロベシクルである、請求項４に記載の細胞外小胞。

【請求項6】

カーゴを積載される、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞外小胞。

【請求項7】

カーゴが、核酸、ペプチド、タンパク質又は小分子である、請求項６に記載の細胞外小胞。

【請求項8】

カーゴが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、長鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はプラスミドからなる群から選択される核酸である、請求項７に記載の細胞外小胞。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載の１つ又は複数の細胞外小胞を含む組成物。

【請求項10】

処置の方法での使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞外小胞又は組成物。

【請求項11】

請求項１に記載の細胞外小胞を、処置を必要とする患者に投与することを含む、処置の方法。

【請求項12】

疾患又は障害の処置のための医薬の製造における、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞外小胞又は組成物の使用。

【請求項13】

処置の方法が、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞外小胞又は組成物の、遺伝的障害、炎症性疾患、がん、自己免疫障害、心血管疾患又は胃腸疾患を有する対象への投与を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の使用のための細胞外小胞又は組成物、処置の方法又は使用。

【請求項14】

対象ががんを有し、がんが任意選択で白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、肺がん、肝臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、腎臓がん又は神経膠腫から選択される、請求項１３に記載の使用のための細胞外小胞又は組成物、処置の方法又は使用。

【請求項15】

タグと細胞外小胞の表面タンパク質の間の共有結合を可能にする条件下で、細胞外小胞をタグ及びタンパク質リガーゼと接触させ、それによりタグ付き細胞外小胞を生成することを含む方法。

【請求項16】

（ａ）ペプチドと細胞外小胞の表面タンパク質の間の共有結合を可能にする条件下で、細胞外小胞をペプチド及び第１のタンパク質リガーゼと接触させ、それによりペプチドタグ付き細胞外小胞を生成すること；並びに
（ｂ）細胞外小胞に共有結合したペプチドと機能性ドメインペプチドの間の共有結合を可能にする条件下で、ペプチドタグ付き細胞外小胞を機能性ドメインペプチド及び第２のタンパク質リガーゼと接触させること
を含む、方法。

【請求項17】

第１及び第２のペプチドリガーゼが同じである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

第１及び第２のペプチドリガーゼが異なる、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

細胞外小胞をカーゴと接触させること、及び電気穿孔して細胞外小胞でカーゴを封入することをさらに含む、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

タンパク質リガーゼが、ソルターゼ又はＡＥＰ１、好ましくはソルターゼＡからなる群から選択される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法によって得られた細胞外小胞。

【請求項22】

結合分子及びタンパク質リガーゼ認識部位を含むタグであって、スペーサーをさらに含んでもよく、スペーサーは結合分子及びタンパク質リガーゼ認識部位の間に配置される、タグ。

【請求項23】

請求項２２に記載のタグをコードする核酸。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞外小胞、特に、排他的ではないが、表面修飾細胞外小胞に関する。

【背景技術】

【0002】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＲＮＡ治療は、高い特異性及び柔軟性で病的なヒトゲノムを標的とするプログラム可能な治療のための新興の治療法である。ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス）、脂質トランスフェクション試薬、及び脂質ナノ粒子を含む、ＲＮＡ薬送達のための一般的な媒体は、通常、免疫原性及び／又は細胞傷害性である。したがって、白血病細胞及び固形腫瘍細胞を含む、ほとんどの一次組織及びがん細胞にＲＮＡ薬を送達するための安全で有効な戦略は、依然として捉えにくい。

【0003】

細胞外小胞（ＥＶ）は、患者にＲＮＡを送達するために適用されてきた。ＥＶは、細胞間コミュニケーションのために体内の全ての型の細胞によって分泌される。ＥＶは、多胞体に由来する小胞（１０～１００ｎｍ）であるエキソソーム、生細胞の細胞膜に由来するマイクロベシクル（１００～１０００ｎｍ）、及びアポトーシス細胞の細胞膜に由来するアポトーシス小体（５００～５０００ｎｍ）からなる。ＥＶベースの薬物送達方法が望まれるが、ＥＶ産生には限界がある。高純度及び均質なＥＶを産生するため、厳密な精製方法、例えば、スクロース密度勾配超遠心分離又はサイズ排除クロマトグラフィーが必要であるが、それらは時間がかかり、スケーラブルではない。さらに、収率が非常に低いため、十分なＥＶを得るために１０億個の細胞が必要であり、そのような数の初代細胞は通常入手できない。初代細胞の不死化は、ＲＮＡ薬と一緒に発癌性ＤＮＡ及びレトロトランスポゾンエレメントを移行させるリスクがある。実際、全ての有核細胞は、ある程度の遺伝子水平伝播のリスクを示し、それは、どの細胞がすでに危険なＤＮＡを持ち、どれが持たないかを先験的に予測できないためである。したがって、有害事象を減らして患者へ核酸物質を送達するための有効な手法の必要性が残っている。

【0004】

さらに、ＥＶベースの治療をより特異的にするため、レトロウイルス又はレンチウイルスを使用してトランスフェクト又は形質導入されるプラスミドからドナー細胞においてペプチド又は抗体を発現させ、続いて抗生物質ベース又は蛍光ベースの選択により、ＥＶを操作し、特定の標的細胞に特異的に結合するペプチド又は抗体を持たせることができる。これらの方法は、高発現されたプラスミドがＥＶに組み込まれ、最終的に標的細胞へと移行されやすいため、遺伝子水平伝播の高いリスクを提起する。プラスミドの遺伝子エレメントは、発癌をもたらし得る。安定な細胞株にＥＶを産生させる場合、変異ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を含む豊富な発癌性因子がＥＶに詰め込まれ、腫瘍発生のリスクを標的細胞に送達する。一方、リボソームの欠如により、赤血球ではプラスミドが転写できないため、遺伝子操作方法は赤血球に適用できない。それは、トランスフェクト又は形質導入が難しい幹細胞及び初代細胞にも適用できない。

【0005】

近年、ＥＶの表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するラクトアドへリンのＣ１Ｃ２ドメインに融合した抗体によってＥＶをコーティングする新しい方法がある。この方法は、いかなる遺伝的改変もなく、抗体とのＥＶのコンジュゲーションを可能にする。しかしながら、Ｃ１Ｃ２は、疎水性タンパク質であり、したがって、哺乳動物細胞では面倒な精製方法及びウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中での保存を必要とする。さらに、Ｃ１Ｃ２融合抗体とのＥＶのコンジュゲーションは、一時的なＣ１Ｃ２とＰＳの間の親和性結合に基づく。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、治療又は診断目的のための安定なＥＶの強い必要性が残っている。本発明は、上記の検討に照らしてなされた。
Ｍ１３バクテリオファージキャプシドタンパク質のソルターゼ媒介機能付与の方法が、以前に提示された（米国特許出願公開第２０１４／００３０６９７ Ａ１号）。この機能付与は、ウイルスの表面で様々な構造を可能にし、表面相互作用の創出のために活用され得る新しいウイルス表面修飾を創出するために有用である。

【0007】

赤血球の表面修飾のためのソルタグ付けの方法が、遺伝子操作された細胞の使用により以前に開発された（国際公開第２０１４／１８３０７１ Ａ２号）。この方法では、ヒトＣＤ３４＋前駆細胞を遺伝子操作し、赤血球膜タンパク質と目的のペプチドを含む融合タンパク質を発現させる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、表面修飾のため、ソルターゼによって認識される配列を含むペプチドに融合したＩＩ型赤血球膜貫通タンパク質を含む。

【0008】

哺乳動物細胞への薬剤のコンジュゲーションが、以前に示されている（国際公開第２０１４／１８３０６６ Ａ２号）。この文献は、ソルターゼの存在下で、生細胞をソルターゼ並びにソルターゼ認識モチーフ及び薬剤を含むソルターゼ基質と接触させることによる、哺乳動物細胞へと薬剤をコンジュゲートする方法を提示する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、細胞外小胞の表面の酵素修飾のための方法を発明した。したがって、この開示は、その表面にタグを含む修飾細胞外小胞、並びにそのような修飾細胞外小胞を作製及び使用する方法に関する。

【0010】

細胞外小胞（ＥＶ）は、それらの天然の生物的適合性、高い送達効率、低い毒性、及び低い免疫原性特性により、新興の薬物送達媒体である。ＥＶは、通常、それらのドナー細胞の遺伝的改変によって操作されるが、遺伝子操作方法は初代細胞では非効率的であり、最終的に臨床適用に安全ではない遺伝子水平伝播のリスクを示す。ここで、本発明者らは、ペプチド、小分子、タンパク質及び抗体を含む分子の共有結合性コンジュゲーションのためのタンパク質リガーゼ酵素を使用する、ＥＶの表面を修飾する方法を記載する。この方法は、ＥＶ操作が簡単、安全及び効率的である。それは、初代細胞由来のものを含む多くの型のＥＶに適用することができる。細胞外小胞は、膜由来小胞であり、したがって、膜、通常脂質二重層を含む。

【0011】

小分子、タンパク質及び核酸を含む薬物のＥＶ媒介送達は、ほとんどのｉｎ ｖｉｖｏでの送達のハードルを克服するＥＶの天然の生物的適合性のため、魅力的なプラットフォームである。ＥＶは、通常、非毒性であり、非免疫原性である。それらは多くの細胞型によって容易に取り込まれるが、それらが細網内皮系のマクロファージ及び単球による食作用を避けるのに役立つＣＤ４７などのいくつかの抗食作用マーカーを持ち得る。さらに、ＥＶは、内皮結合を通って、及び血液脳関門を横切ってさえも血管外遊出することができ、したがって、それらは非常に多才な薬物担体である。３ 臨床的価値のうち、ＥＶによる送達は、腫瘍細胞が多くの化学化合物を除外するために使用することが多いＰ－糖タンパク質の過剰発現によって生じる多剤耐性メカニズムによって妨害されない。

【0012】

最も一般的には、この開示は、その表面にタグを有する細胞外小胞を提供する。タグは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であり得る。タグは、好ましくは外因性であり、通常は細胞外小胞の表面に見出されないことを意味する。タグは、細胞外小胞に共有結合され得る。例えば、タグは、細胞外小胞の膜に共有結合され得る。それは、細胞外小胞の膜内のタンパク質、例えばＮ末端グリシンを有する又は側鎖アミノ基、例えばアスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン及びヒスチジンを有する残基を有するタンパク質に結合され得る。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、小分子、例えばビオチン、ＦＬＡＧエピトープ（ＦＬＡＧタグ）、ＨＡタグ、又はポリヒスチジン（例えば、６×Ｈｉｓタグ）とコンジュゲートされ得る。いくつかの場合では、タグは、１つ又は複数のビオチン、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、又はポリヒスチジンを含み得る。これらは、タグの検出、単離又は精製を促進し得る。ペプチド又は小分子は、任意選択で、標的細胞の表面の受容体によって結合されるリガンドである。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、標的化部分又は結合部分であり得る。いくつかの場合では、標的部分又は結合部分は、抗体又は抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は単鎖抗体（ｓｃＡｂ）である。ｓｄＡｂ／ｓｃＡｂは、標的細胞への結合親和性を有し得る。タグは、治療分子又は実体を含み得る。タグは、標識分子又は実体を含み得る。

【0013】

細胞外小胞は、マイクロベシクル又はエキソソームであり得る。細胞外小胞は、任意の好適な細胞に由来し得るが、赤血球（ＲＢＣ）に由来する細胞外小胞が特に本明細書で企図される。

【0014】

特定の態様では、本明細書に記載の細胞外小胞は、カーゴ又は複数のカーゴ分子を積載される。言い換えると、細胞外小胞は、カーゴ、例えばタンパク質、ペプチド、小分子又は核酸を封入する。カーゴは内因性又は外因性に積載され得る。カーゴは治療用であり得る。カーゴは、パクリタキセルであり得る。カーゴは、標識分子又は実体、例えば検出可能な小分子であり得る。いくつかの場合では、カーゴは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はプラスミドからなる群から選択される核酸である。カーゴは、外因性であってよく、細胞外小胞が由来する細胞内では通常見出されないことを意味する。

【0015】

本明細書では、本明細書に開示する１つ又は複数の細胞外小胞を含む組成物も開示する。好ましくは、組成物中の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は実質的に全ての細胞外小胞がタグに結合される。いくつかの場合では、組成物中の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は実質的に全ての細胞外小胞が、カーゴ又は複数のカーゴ分子を封入する。

【0016】

本明細書では、医薬に使用される細胞外小胞及び細胞外小胞を含有する組成物も開示する。そのような組成物及び細胞外小胞は、処置を必要とする対象に有効量で投与され得る。対象は、遺伝的障害、炎症性疾患、がん、自己免疫障害、心血管疾患又は胃腸疾患の処置を必要とし得る又はこれらの疾患を有し得る。がんは、任意選択で、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、肺がん、肝臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、腎臓がん又は神経膠腫から選択される。

【0017】

本明細書に開示する特定の態様では、細胞外小胞を得ること及び細胞外小胞をタグに結合することを含む方法によって得られたタグ付き細胞外小胞を提供する。タグは、好ましくは共有結合によって結合される。それは、細胞外小胞の膜の分子、例えば膜の表面の分子に結合され得る。細胞外小胞は、タンパク質リガーゼを使用してタグに結合され得る。

【0018】

さらなる態様では、がん細胞を本発明による細胞外小胞又は組成物と接触させることを含む、がん細胞の成長又は増殖を阻害する方法を提供する。本明細書では、細胞を細胞外小胞と接触させることを含むｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法も開示する。

【0019】

本明細書では、修飾細胞外小胞を産生する方法、並びにそのような方法によって得られた細胞外小胞も開示する。最も一般的には、そのような方法は、タグと細胞外小胞の表面タンパク質の間の共有結合を可能にする条件下で、細胞外小胞をタグ及びタンパク質リガーゼと接触させることを含む。そのような方法は、細胞外小胞をカーゴと接触させるステップ、及び電気穿孔して細胞外小胞でカーゴを封入するステップも含み得る。細胞外小胞は、タグとの接触の前又は後にカーゴと接触され得る。好ましくは、細胞外小胞はタグとの接触の前にカーゴと接触される。その場合では、タグ及びタンパク質リガーゼと接触される細胞外小胞は、カーゴ分子を封入する細胞外小胞、又は「積載細胞外小胞」である。修飾細胞外小胞を産生する方法は、細胞外小胞を精製、単離又は洗浄するステップをさらに含み得る。そのようなステップは、細胞外小胞がタグによってタグ付けされた後に生じるであろう。細胞外小胞を精製すること、単離すること又は洗浄することは、細胞外小胞の分画遠心法を含み得る。分画遠心法は、スクロース勾配、又は凍結スクロースクッションでの遠心分離を含み得る。好ましい態様では、タグを細胞外小胞に共有結合させるために使用されるタンパク質リガーゼは、ソルターゼ又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）及びそれらの誘導体である。好ましくは、リガーゼはソルターゼＡ又はその誘導体である。リガーゼは、アスパラギニルエンドペプチダーゼ１又はその誘導体であり得る。リガーゼは、タグが細胞外小胞に結合した後、好ましくは細胞外小胞から洗浄され、又はその他の形で除去される。

【0020】

本明細書に記載の方法は、タグを利用する。タグは、タンパク質リガーゼ認識配列を含むであろう。タンパク質リガーゼ認識配列は、細胞外小胞をタグ付けするために使用されるリガーゼに対応するように選択されるであろう。例えば、リガーゼがソルターゼである場合、タグはソルターゼ認識配列を含むであろう。タグは、任意選択でスペーサー又はリンカーを含み得る。スペーサー又はリンカーは、好ましくはタグの結合分子とペプチド認識部位の間に配置される。スペーサーは、可動性リンカー、例えばおよそ１０以上のアミノ酸を含むペプチドリンカーであり得る。

【0021】

リンカーペプチドは、ペプチドリガーゼを使用してＥＶにコンジュゲートされることを可能にするＣ末端のリガーゼ結合部位及びｓｄＡｂへのコンジュゲーションのためにペプチドリガーゼと反応することを可能にするＮ末端の反応性アミノ酸残基（例えばＧＬ）を有し得る。

【0022】

本発明は、そのような組合せがはっきりと容認できない又は明確に避けられる以外では記載される態様と好ましい特徴の組合せを含む。
本発明の原理を例示する実施形態及び実験は、ここで、以下の添付の図面を参照して議論する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1-1】ソルターゼ酵素を使用する、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とのＥＶのコンジュゲーション。Ａ．ソルターゼＡ、ｓｄＡｂ及びＥＶのコンジュゲーションの精製の実験ワークフロー。Ｂ．Ｈｉｓタグ付きソルターゼＡ（１８ｋＤａ）のＦＰＬＣ精製前（注入）及び後（溶出液）のタンパク質のＧｅｌ電気泳動解析。Ｃ．Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ及びソルターゼ結合部位ＬＰＥＴＧ（全部で２０ｋＤａ）を有する抗ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣ）ｓｄＡｂ可変重鎖（ＶＨＨ）のＦＰＬＣ精製前（注入）及び後（溶出液）のタンパク質のゲル電気泳動解析。Ｄ．ＳＥＭをグレーで示した、３人のドナーからのＲＢＣＥＶの平均濃度及びサイズ分布（１００，０００×希釈）。Ｅ．８６０００×（右）倍率での、ＲＢＣＥＶの代表的な透過型電子顕微鏡画像。スケールバー、２００ｎｍ。Ｆ．ソルタグ付け反応前後のソルターゼＡ、ｓｄＡｂ及びＲＢＣＥＶのＨｉｓタグのウェスタンブロット（ＷＢ）解析。

【図1-2】ソルターゼ酵素を使用する、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とのＥＶのコンジュゲーション。Ａ．ソルターゼＡ、ｓｄＡｂ及びＥＶのコンジュゲーションの精製の実験ワークフロー。Ｂ．Ｈｉｓタグ付きソルターゼＡ（１８ｋＤａ）のＦＰＬＣ精製前（注入）及び後（溶出液）のタンパク質のＧｅｌ電気泳動解析。Ｃ．Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ及びソルターゼ結合部位ＬＰＥＴＧ（全部で２０ｋＤａ）を有する抗ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣ）ｓｄＡｂ可変重鎖（ＶＨＨ）のＦＰＬＣ精製前（注入）及び後（溶出液）のタンパク質のゲル電気泳動解析。Ｄ．ＳＥＭをグレーで示した、３人のドナーからのＲＢＣＥＶの平均濃度及びサイズ分布（１００，０００×希釈）。Ｅ．８６０００×（右）倍率での、ＲＢＣＥＶの代表的な透過型電子顕微鏡画像。スケールバー、２００ｎｍ。Ｆ．ソルタグ付け反応前後のソルターゼＡ、ｓｄＡｂ及びＲＢＣＥＶのＨｉｓタグのウェスタンブロット（ＷＢ）解析。

【図2-1】ソルターゼ酵素を使用する、ペプチドとのＥＶのコンジュゲーション。Ａ。自己認識又は「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルのためのＣＤ４７の一部、ソルターゼ結合配列、及びビオチンタグを含有するペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット（ＷＢ）解析。Ｂ．別々に精製され、ソルターゼＡ反応を使用して、ＥＧＦＲ結合配列、ソルターゼ結合配列及びビオチンタグ（ｂｉ－ＹＧ２０）を含有するＹＧ２０ペプチドとコンジュゲートした、３人の異なるドナーからのＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。ビオチンは、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用して検出した。Ｃ．非コートＲＢＣＥＶ又はソルターゼＡ反応を使用してｂｉ－ＹＧ２０でコートしたＲＢＣＥＶに結合するＡＦ６４７コンジュゲートストレプトアビジンビーズ（Ｓｔｒｅｐ－ＡＦ６４７）のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＡＦ６４７、ＡＰＣチャネル）対前方散乱（ＦＳＣ－Ａ）のＦＡＣＳ解析。Ｄ．質量分析を使用して同定したＲＢＣＥＶの最も豊富なタンパク質（スコア＞１，０００）。タンパク質相互作用はＲＢＣで公知の相互作用に基づいて予測された。Ｅ．ビオチン－ストレプトアビジンプルダウン及び質量分析を使用して同定したビオチン化ペプチドにソルタグ付けされた膜タンパク質。質量分析（ＭＳ）スコアは、存在量及び検出の信頼度に基づき算出された。

【図2-2】ソルターゼ酵素を使用する、ペプチドとのＥＶのコンジュゲーション。Ａ。自己認識又は「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルのためのＣＤ４７の一部、ソルターゼ結合配列、及びビオチンタグを含有するペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット（ＷＢ）解析。Ｂ．別々に精製され、ソルターゼＡ反応を使用して、ＥＧＦＲ結合配列、ソルターゼ結合配列及びビオチンタグ（ｂｉ－ＹＧ２０）を含有するＹＧ２０ペプチドとコンジュゲートした、３人の異なるドナーからのＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。ビオチンは、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用して検出した。Ｃ．非コートＲＢＣＥＶ又はソルターゼＡ反応を使用してｂｉ－ＹＧ２０でコートしたＲＢＣＥＶに結合するＡＦ６４７コンジュゲートストレプトアビジンビーズ（Ｓｔｒｅｐ－ＡＦ６４７）のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＡＦ６４７、ＡＰＣチャネル）対前方散乱（ＦＳＣ－Ａ）のＦＡＣＳ解析。Ｄ．質量分析を使用して同定したＲＢＣＥＶの最も豊富なタンパク質（スコア＞１，０００）。タンパク質相互作用はＲＢＣで公知の相互作用に基づいて予測された。Ｅ．ビオチン－ストレプトアビジンプルダウン及び質量分析を使用して同定したビオチン化ペプチドにソルタグ付けされた膜タンパク質。質量分析（ＭＳ）スコアは、存在量及び検出の信頼度に基づき算出された。

【図3-1】ＥＧＦＲ陽性ＳＫＢＲ３乳がん細胞によるＹＧ２０－ペプチドコートＥＶの取り込み。Ａ．Ｂのようにゲートをかけた、非コートＲＢＣ－ＥＶ又はＹＧ２０ペプチドコートＲＢＣＥＶで処置した低又は高ＥＧＦＲ発現のＳＫＢＲ３細胞のＰＫＨ２６（ＰＥチャネル）対ＦＳＣ－ＡのＦＡＣＳ解析。全てのＲＢＣＥＶは、ＰＫＨ２６で標識した。ＲＢＣＥＶ標識実験の最後の洗浄からの上清を陰性コントロールとして使用した。Ｂ．ＥＧＦＲ低及びＥＧＦＲ高ＳＫＢＲ３集団のゲーティング。ＥＧＦＲ発現は、ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ抗体を使用して検出した。Ｃ．図３Ａで決定したＰＫＨ２６陽性細胞の平均パーセンテージ、±ＳＥＭ（ｎ＝３回反復）。スチューデントのｔ検定の結果は、^＊＊Ｐ＜０．０１として示した。

【図3-2】ＥＧＦＲ陽性ＳＫＢＲ３乳がん細胞によるＹＧ２０－ペプチドコートＥＶの取り込み。Ａ．Ｂのようにゲートをかけた、非コートＲＢＣ－ＥＶ又はＹＧ２０ペプチドコートＲＢＣＥＶで処置した低又は高ＥＧＦＲ発現のＳＫＢＲ３細胞のＰＫＨ２６（ＰＥチャネル）対ＦＳＣ－ＡのＦＡＣＳ解析。全てのＲＢＣＥＶは、ＰＫＨ２６で標識した。ＲＢＣＥＶ標識実験の最後の洗浄からの上清を陰性コントロールとして使用した。Ｂ．ＥＧＦＲ低及びＥＧＦＲ高ＳＫＢＲ３集団のゲーティング。ＥＧＦＲ発現は、ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ抗体を使用して検出した。Ｃ．図３Ａで決定したＰＫＨ２６陽性細胞の平均パーセンテージ、±ＳＥＭ（ｎ＝３回反復）。スチューデントのｔ検定の結果は、^＊＊Ｐ＜０．０１として示した。

【図4-1】ソルターゼ酵素を使用するペプチドとのＥＶのコンジュゲーション。Ａ．ＯａＡＥＰ１発現ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの親和性精製及びＳＥＣ精製後のＯａＡＰＥ１（４９．７ｋＤａ）及びＨｉｓ－Ｕｂ－ＯａＡＰＥ１リガーゼ（Ｈｉｓ－Ｕｂタグを有する５９．５ｋＤａ）のゲル電気泳動。Ｂ．ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンによって検出した、ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してビオチン化ＴＲＮＧＬペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。Ｃ．非コートＲＢＣＥＶ又はＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してｂｉ－ＴＲＮＧＬでコートしたＲＢＣＥＶに結合するＡＦ６４７コンジュゲートストレプトアビジンビーズ（Ｓｔｒｅｐ－ＡＦ６４７）のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＡＦ６４７、ＡＰＣチャネル）対前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）のＦＡＣＳ解析。Ｄ．リガーゼを使用してビオチン化ＥＧＦＲ標的化（ＥＴ）ペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。Ｅ．ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の段階希釈による３人の異なるドナー（Ｄ１～Ｄ３）からのｂｉ－ＴＲ－ペプチドライゲートＲＢＣＥＶにおけるビオチン検出の比較。ＥＶ当たりのペプチドの数は、段階希釈のビオチン化ＨＲＰのコピー数と比較したウェスタンブロットのバンドの強度に基づいて算出した。

【図4-2】ソルターゼ酵素を使用するペプチドとのＥＶのコンジュゲーション。Ａ．ＯａＡＥＰ１発現ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの親和性精製及びＳＥＣ精製後のＯａＡＰＥ１（４９．７ｋＤａ）及びＨｉｓ－Ｕｂ－ＯａＡＰＥ１リガーゼ（Ｈｉｓ－Ｕｂタグを有する５９．５ｋＤａ）のゲル電気泳動。Ｂ．ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンによって検出した、ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してビオチン化ＴＲＮＧＬペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。Ｃ．非コートＲＢＣＥＶ又はＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してｂｉ－ＴＲＮＧＬでコートしたＲＢＣＥＶに結合するＡＦ６４７コンジュゲートストレプトアビジンビーズ（Ｓｔｒｅｐ－ＡＦ６４７）のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＡＦ６４７、ＡＰＣチャネル）対前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）のＦＡＣＳ解析。Ｄ．リガーゼを使用してビオチン化ＥＧＦＲ標的化（ＥＴ）ペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。Ｅ．ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の段階希釈による３人の異なるドナー（Ｄ１～Ｄ３）からのｂｉ－ＴＲ－ペプチドライゲートＲＢＣＥＶにおけるビオチン検出の比較。ＥＶ当たりのペプチドの数は、段階希釈のビオチン化ＨＲＰのコピー数と比較したウェスタンブロットのバンドの強度に基づいて算出した。

【図4-3】ソルターゼ酵素を使用するペプチドとのＥＶのコンジュゲーション。Ａ．ＯａＡＥＰ１発現ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの親和性精製及びＳＥＣ精製後のＯａＡＰＥ１（４９．７ｋＤａ）及びＨｉｓ－Ｕｂ－ＯａＡＰＥ１リガーゼ（Ｈｉｓ－Ｕｂタグを有する５９．５ｋＤａ）のゲル電気泳動。Ｂ．ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンによって検出した、ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してビオチン化ＴＲＮＧＬペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。Ｃ．非コートＲＢＣＥＶ又はＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してｂｉ－ＴＲＮＧＬでコートしたＲＢＣＥＶに結合するＡＦ６４７コンジュゲートストレプトアビジンビーズ（Ｓｔｒｅｐ－ＡＦ６４７）のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＡＦ６４７、ＡＰＣチャネル）対前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）のＦＡＣＳ解析。Ｄ．リガーゼを使用してビオチン化ＥＧＦＲ標的化（ＥＴ）ペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。Ｅ．ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の段階希釈による３人の異なるドナー（Ｄ１～Ｄ３）からのｂｉ－ＴＲ－ペプチドライゲートＲＢＣＥＶにおけるビオチン検出の比較。ＥＶ当たりのペプチドの数は、段階希釈のビオチン化ＨＲＰのコピー数と比較したウェスタンブロットのバンドの強度に基づいて算出した。

【図5】特異的送達の手法。ＲＢＣＥＶを、タンパク質リガーゼ、例えばソルターゼＡ又はＯａＡＥＰ１を使用して、ｓｄＡｂ又はペプチドとコンジュゲートし、次いで治療薬、例えば細胞傷害性小分子、ＲＮＡ、遺伝子治療のためのＤＮＡ、治療又は診断のためのタンパク質を積載した。ペプチド及びｓｄＡｂは、標的細胞の表面の特異的受容体に結合し、ＲＢＣＥＶによる薬物の送達、続いて標的細胞における治療効果をもたらす。

【図6】細胞外小胞へのタグの付加。この概略図は、タンパク質リガーゼ認識配列（この代表的な例ではＬＰＥＴＧ）を有するタグを、タンパク質リガーゼ（この代表的な例ではソルターゼＡ）の作用を通して細胞外小胞に付加することができる方法の代表的な例を示す。

【図7】ペプチドとの白血病ＥＶのライゲーション。Ａ．３０画分に溶出した、ＴＨＰ１細胞からのＥＶのサイズ排除クロマトグラフィー精製。ＥＶはＮａｎｏｓｉｇｈｔ粒子アナライザーを使用して検出し、タンパク質濃度はＢＣＡアッセイを使用して測定した。Ｂ．ＯａＡＥＰリガーゼを使用してビオチン化ＴＲＮＧＬペプチドとコンジュゲートしたＴＨＰ１ ＥＶのビオチンのウェスタンブロット解析。

【図8】ＥＧＦＲ標的化ペプチドの特異的結合は、ＥＧＦＲ陽性細胞によるソルタグ付きＲＢＣＥＶの取り込みを促進する。（Ａ）ＦＩＴＣ抗ＥＧＦＲ抗体によるＦＡＣＳを使用して解析した、ヒト白血病（ＭＯＬＭ１３）、乳がん（ＳＫＢＲ３及びＣＡ１ａ）及び肺がん（Ｈ３５８及びＨＣＣ８２７）細胞におけるＥＧＦＲの発現。（Ｂ）ビオチン結合ＡＦ６４７ストレプトアビジンのＦＡＣＳ解析によって示す、３つの示した細胞株へのビオチン化コントロール（Ｃｏｎｔ）又はＥＧＦＲ標的化（ＥＴ）ペプチドの結合。（Ｃ）カルセインＡＭで標識した及びソルターゼＡを使用してＣｏｎｔ又はＥＴペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶで処置したＨ３５８細胞のカルセインＡＭ蛍光のＦＡＣＳ解析。ヒストグラム内の色は、グラフのように同じパターンで表される。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図9】ＥＧＦＲ標的化ペプチドとのＲＢＣＥＶのリガーゼ媒介コンジュゲーションはＲＢＣＥＶの特異的な取り込みも増強する。（Ａ）ＯａＥＡＰ１リガーゼを使用してＣｏｎｔ又はＥＴペプチドとコンジュゲートしたカルセイン－ＡＭ標識ＲＢＣＥＶで処置したＨ３５８細胞のカルセインＡＭ蛍光のＦＡＣＳ解析。（Ｂ）ＥＧＦＲへの結合と競合する、ライゲートしたＲＢＣＥＶの取り込みへの、ブロッキングペプチドの効果。（Ｃ）カルセイン－ＡＭ標識で標識し、ＥＴペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶの取り込みへの化学阻害剤、ＥＩＰＡ（マクロピノサイトーシスのブロッキング）、フィリピン（クラスリン媒介エンドサイトーシスのブロッキング）、ワートマニン（マンノース受容体媒介エンドサイトーシスのブロッキング）の効果。スチューデントのｔ検定^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図10-1】ＥＧＦＲ標的化ＲＢＣＥＶは、ＥＧＦＲ陽性肺がんを担持するマウスの肺に濃縮される。（Ａ）ＲＢＣのゴースト膜又は無傷のＲＢＣによるマウスの条件付けを、尾静脈へのＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶの注射の１時間前にゴースト又はＲＢＣの後眼窩注射によって実施した。２４時間後、蛍光を臓器において観察した。（Ｂ）ＮＳＧマウスの尾静脈に１００万個のＨ３５８ルシフェラーゼ細胞を注射した。３週間後、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化システム（ＩＶＩＳ）を使用して肺における生物発光を検出した。肺がんを有するマウスを、後眼窩注射によってＲＢＣで前処置した。１時間後、マウスに０．１ｍｇのＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶを注射した。８時間後、ＩＶＩＳを使用して臓器におけるＤｉＲ蛍光を観察した。Ｈ３５８ルシフェラーゼ細胞のｉ．ｖ．注射後３週間の肺における生物発光シグナルによって示された肺がんを有するマウスの代表的な画像。非コートＲＢＣＥＶ、コントロール／ＥＴペプチド－ライゲートＲＢＣＥＶ又はＲＢＣＥＶ洗浄のフロースルーを注射したマウスからの臓器の代表的なＤｉＲ蛍光画像。フロースルーコントロールで検出されたシグナルをひいた、平均強度と比較した各臓器の平均ＤｉＲ蛍光強度。スチューデントのｔ検定^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００１。

【図10-2】ＥＧＦＲ標的化ＲＢＣＥＶは、ＥＧＦＲ陽性肺がんを担持するマウスの肺に濃縮される。（Ａ）ＲＢＣのゴースト膜又は無傷のＲＢＣによるマウスの条件付けを、尾静脈へのＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶの注射の１時間前にゴースト又はＲＢＣの後眼窩注射によって実施した。２４時間後、蛍光を臓器において観察した。（Ｂ）ＮＳＧマウスの尾静脈に１００万個のＨ３５８ルシフェラーゼ細胞を注射した。３週間後、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化システム（ＩＶＩＳ）を使用して肺における生物発光を検出した。肺がんを有するマウスを、後眼窩注射によってＲＢＣで前処置した。１時間後、マウスに０．１ｍｇのＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶを注射した。８時間後、ＩＶＩＳを使用して臓器におけるＤｉＲ蛍光を観察した。Ｈ３５８ルシフェラーゼ細胞のｉ．ｖ．注射後３週間の肺における生物発光シグナルによって示された肺がんを有するマウスの代表的な画像。非コートＲＢＣＥＶ、コントロール／ＥＴペプチド－ライゲートＲＢＣＥＶ又はＲＢＣＥＶ洗浄のフロースルーを注射したマウスからの臓器の代表的なＤｉＲ蛍光画像。フロースルーコントロールで検出されたシグナルをひいた、平均強度と比較した各臓器の平均ＤｉＲ蛍光強度。スチューデントのｔ検定^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００１。

【図11-1】自己ペプチドとのコンジュゲーションは、ＲＢＣＥＶの食作用を防ぎ、循環におけるＲＢＣＥＶの能力を増強する。（Ａ）コントロール又は自己ペプチド（ＳＰ）ライゲートＲＢＣＥＶで処置したＭＯＬＭ１３及びＴＨＰ１単球のカルセインＡＭのＦＡＣＳ解析。ヒストグラムの色は、グラフと同じように表す。（Ｂ）尾静脈への０．２ｍｇのＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶの注射の５分後に、ＮＳＧマウスの血漿においてＲＢＣＥＶを捕捉したビオチン化抗ＧＰＡ抗体によって結合されたストレプトアビジンビーズのＦＡＣＳ解析。（Ｃ）ソルターゼＡを使用してコントロールペプチド又はＳＰとコンジュゲートしたＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶの体内分布。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図11-2】自己ペプチドとのコンジュゲーションは、ＲＢＣＥＶの食作用を防ぎ、循環におけるＲＢＣＥＶの能力を増強する。（Ａ）コントロール又は自己ペプチド（ＳＰ）ライゲートＲＢＣＥＶで処置したＭＯＬＭ１３及びＴＨＰ１単球のカルセインＡＭのＦＡＣＳ解析。ヒストグラムの色は、グラフと同じように表す。（Ｂ）尾静脈への０．２ｍｇのＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶの注射の５分後に、ＮＳＧマウスの血漿においてＲＢＣＥＶを捕捉したビオチン化抗ＧＰＡ抗体によって結合されたストレプトアビジンビーズのＦＡＣＳ解析。（Ｃ）ソルターゼＡを使用してコントロールペプチド又はＳＰとコンジュゲートしたＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶの体内分布。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図12-1】ｓｄＡｂとのＲＢＣＥＶのコンジュゲーションは、リンカーペプチドによって増強される。（Ａ）Ｈｉｓタグ親和性精製の前（注入）及び後（溶出液）のＥＧＦＲ ＶＨＨ ｓｄＡｂのゲル電気泳動解析。（Ｂ）２ステップライゲーション反応のスキーム。第１のステップでは、リガーゼ結合部位を有するリンカーペプチドを、ＲＢＣＥＶのＧＬを有するタンパク質にコンジュゲートする。第２のステップでは、リンカーペプチドを、ＮＧＬを有するＶＨＨにライゲートする。（Ｃ）ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用して、ＥＧＦＲ標的化ＶＨＨとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのＶＨＨ（抗ＶＨＨ抗体を使用する）のウェスタンブロット解析。ライゲートしたＲＢＣＥＶはＳＥＣで洗浄した。（Ｄ）４℃で１時間のインキュベーション後にＨＣＣ８２７細胞に結合した、非コートＲＢＣＥＶ又はＥＴ－ＶＨＨライゲートＲＢＣＥＶのＧＰＡ（ＲＢＣＥＶマーカー）のＦＡＣＳ解析。

【図12-2】ｓｄＡｂとのＲＢＣＥＶのコンジュゲーションは、リンカーペプチドによって増強される。（Ａ）Ｈｉｓタグ親和性精製の前（注入）及び後（溶出液）のＥＧＦＲ ＶＨＨ ｓｄＡｂのゲル電気泳動解析。（Ｂ）２ステップライゲーション反応のスキーム。第１のステップでは、リガーゼ結合部位を有するリンカーペプチドを、ＲＢＣＥＶのＧＬを有するタンパク質にコンジュゲートする。第２のステップでは、リンカーペプチドを、ＮＧＬを有するＶＨＨにライゲートする。（Ｃ）ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用して、ＥＧＦＲ標的化ＶＨＨとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶのＶＨＨ（抗ＶＨＨ抗体を使用する）のウェスタンブロット解析。ライゲートしたＲＢＣＥＶはＳＥＣで洗浄した。（Ｄ）４℃で１時間のインキュベーション後にＨＣＣ８２７細胞に結合した、非コートＲＢＣＥＶ又はＥＴ－ＶＨＨライゲートＲＢＣＥＶのＧＰＡ（ＲＢＣＥＶマーカー）のＦＡＣＳ解析。

【図13】単一ドメイン抗体は、標的細胞によるＲＢＣＥＶの特異的取り込みを促進する。（Ａ）カルセインＡＭで標識した、及びＯａＡＥＰ１リガーゼを使用して、リンカーペプチドあり又はなしで、ＥＧＦＲ標的化ＶＨＨ ｓｄＡｂとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶで処置したＥＧＦＲ陽性Ｈ３５８細胞のカルセインＡＭのＦＡＣＳ解析。（Ｂ）カルセインＡＭで標識した、及びＯａＡＥＰ１リガーゼを使用して、リンカーペプチドあり又はなしで、ｍＣｈｅｒｒｙ標的化ＶＨＨ ｓｄＡｂとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶで処置した、表面ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＣＡ１ａ細胞のカルセインＡＭのＦＡＣＳ解析。色は、ヒストグラムと棒グラフで同じく表される。スチューデントのｔ検定^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図14-1】ＥＧＦＲ標的化ＲＢＣＥＶを使用するＲＮＡ及び薬物の送達。（Ａ）ＥＴ－ＶＨＨライゲートＲＢＣＥＶを使用するＨ３５８細胞へのルシフェラーゼｍＲＮＡの送達。ルシフェラーゼ活性は、処置の２４時間後に、Ｈ３５８細胞の溶解物で測定した。非コート及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＶＨＨ－ライゲートＲＢＣＥＶは陰性コントロールとして含んだ。（Ｂ）ＲＢＣＥＶを使用するＨ３５８腫瘍へのパクリタキセル（ＰＴＸ）の送達スキーム。ＰＴＸは、超音波処理を使用してＲＢＣＥＶへと積載された。積載ＲＢＣＥＶを洗浄し、ＥＴペプチドとライゲートした。ＮＳＧマウスは、尾静脈にＨ３５８細胞を注射した。３週間後、腫瘍が肺で検出された場合、マウスは、３日毎に５回、ＲＢＣＥＶ又はＰＴＸのみで処置した。生物発光も３日毎に測定した。（Ｃ）ＨＰＬＣを使用して決定した、ＲＢＣＥＶへのＰＴＸの積載効率。（Ｄ）２０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸのみ、又はＥＧＲＦ標的化ペプチドあり又はなしで当用量のＰＴＸを積載したＲＢＣＥＶで３日毎に処置したマウスの上体の生物発光シグナル。生物発光は、ＩＶＩＳを使用する処置の１日目から３日毎に肺領域で測定した。各条件のマウスの代表的な画像を示す。

【図14-2】ＥＧＦＲ標的化ＲＢＣＥＶを使用するＲＮＡ及び薬物の送達。（Ａ）ＥＴ－ＶＨＨライゲートＲＢＣＥＶを使用するＨ３５８細胞へのルシフェラーゼｍＲＮＡの送達。ルシフェラーゼ活性は、処置の２４時間後に、Ｈ３５８細胞の溶解物で測定した。非コート及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＶＨＨ－ライゲートＲＢＣＥＶは陰性コントロールとして含んだ。（Ｂ）ＲＢＣＥＶを使用するＨ３５８腫瘍へのパクリタキセル（ＰＴＸ）の送達スキーム。ＰＴＸは、超音波処理を使用してＲＢＣＥＶへと積載された。積載ＲＢＣＥＶを洗浄し、ＥＴペプチドとライゲートした。ＮＳＧマウスは、尾静脈にＨ３５８細胞を注射した。３週間後、腫瘍が肺で検出された場合、マウスは、３日毎に５回、ＲＢＣＥＶ又はＰＴＸのみで処置した。生物発光も３日毎に測定した。（Ｃ）ＨＰＬＣを使用して決定した、ＲＢＣＥＶへのＰＴＸの積載効率。（Ｄ）２０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸのみ、又はＥＧＲＦ標的化ペプチドあり又はなしで当用量のＰＴＸを積載したＲＢＣＥＶで３日毎に処置したマウスの上体の生物発光シグナル。生物発光は、ＩＶＩＳを使用する処置の１日目から３日毎に肺領域で測定した。各条件のマウスの代表的な画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明の態様及び実施形態を、ここで添付の図面を参照して議論する。さらなる態様及び実施形態が、当業者には明らかであろう。この本文中で述べた全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0025】

本明細書では、酵素、例えばタンパク質又はタンパク質リガーゼ又はバリアントの存在下でタグを有する細胞外小胞の表面を修飾する方法を記載する。タグは、細胞外小胞が、標的特異的送達のために標的細胞に結合することを可能にする結合分子であり得る。

【0026】

細胞外小胞
用語「細胞外小胞」は、本明細書で使用する場合、細胞から細胞外環境へと放出された小さい粒子様構造を指す。

【0027】

細胞外小胞（ＥＶ）は、直径が５０ｎｍと１０００ｎｍの間の細胞膜又はエンドソーム膜の実質的に球状の断片である。細胞外小胞は、病理学条件と生理学条件の両方の元で様々な細胞型から放出される。細胞外小胞は膜を有する。膜は、二重層膜であり得る（すなわち、脂質二重層）。膜は、細胞膜から生じ得る。したがって、細胞外小胞の膜は、それが由来する細胞と類似の組成を有し得る。本明細書に開示するいくつかの態様では、細胞外小胞は実質的に透明である。

【0028】

用語、細胞外小胞は、エキソソーム、マイクロベシクル、膜微小粒子、エクトソーム、水泡及びアポトーシス小体を包含する。細胞外小胞は、外への出芽及び分裂によって産生され得る。この産生は、天然のプロセス又は化学的に誘導若しくは増強されたプロセスであり得る。本明細書に開示するいくつかの態様では、細胞外小胞は、化学誘導によって産生されたマイクロベシクルである。

【0029】

細胞外小胞は、それらのサイズ及び形成の起源に基づいて、エキソソーム、マイクロベシクル又はアポトーシス体として分類され得る。マイクロベシクルは、本明細書に開示する本発明による細胞外小胞の特に好ましいクラスである。好ましくは、本発明の細胞外小胞は、細胞膜から放出され、エンドソーム系から生じない。

【0030】

本明細書に開示する細胞外小胞は、様々な細胞、例えば赤血球、白血球、がん細胞、幹細胞、樹状細胞、マクロファージ等に由来し得る。好ましい例では、細胞外小胞は赤血球由来であるが、いずれの供給源からの、例えば白血病細胞及び細胞株からの細胞外小胞も使用され得る。

【0031】

マイクロベシクル又は微小粒子は、細胞膜の直接外への出芽及び分裂によって生じる。マイクロベシクルは、典型的には、エキソソームより大きく、１００～５００ｎｍの範囲の直径を有する。いくつかの場合では、マイクロベシクルの組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、又は１００～３００ｎｍ、又は１０１～３００ｎｍの範囲の直径を有するマイクロベシクルを含む。好ましくは、直径は、１００～３００ｎｍである。例えば組成物、医薬組成物、薬品又は製剤中に存在するマイクロベシクルの集団は、異なる範囲の直径のマイクロベシクルを含み、マイクロベシクル試料内のマイクロベシクルの平均直径は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、又は１００～３００ｎｍ、又は１０１～３００ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、平均直径は１００～３００ｎｍの間である。

【0032】

エキソソームの直径は、およそ３０～およそ１００ｎｍの範囲である。いくつかの場合では、エキソソームの組成物は、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、又は３０～１００ｎｍの範囲の直径を有するエキソソームを含む。好ましくは、直径は３０～１００ｎｍである。例えば、組成物、医薬組成物、薬品又は製剤で提示されるエキソソームの集団は、異なる範囲の直径のエキソソームを含み、試料内のエキソソームの平均直径は、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、又は３０～１００ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、平均直径は３０～１００ｎｍの間である。

【0033】

エキソソームは、リンパ球、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マスト細胞、神経、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、及び腸上皮細胞を含む、様々な培養細胞で観察される。エキソソームは、多胞体（mutivesicular）という、細胞質の大きな嚢内に位置する、エンドソームのネットワークから生じる。これらの嚢は、細胞外環境へと放出される前に、細胞膜へと融合する。

【0034】

アポトーシス体又は小疱は、最大の細胞外小胞であり、１～５μｍの範囲である。有核細胞は、核クロマチンの濃縮に始まり、膜小疱形成及び最終的なアポトーシス体を含むＥＶの放出のいくつかの段階を通してアポトーシスを受ける。

【0035】

好ましくは、細胞外小胞は、ヒト細胞、又はヒト起源の細胞に由来する。本発明の細胞外小胞は、小胞誘導剤と接触した細胞から誘導され得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）、又はフォルボール－１２－ミリスチン酸－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。

【0036】

赤血球細胞外小胞（ＲＢＣ－ＥＶ）
本明細書に開示する特定の態様では、細胞外小胞は赤血球に由来する。赤血球は、多くの理由によりＥＶの良い供給源である。赤血球は無核であるため、ＲＢＣ－ＥＶは、他の供給源からのＥＶよりも少ない核酸を含有する。ＲＢＣ－ＥＶは、内因性ＤＮＡを含有しない。ＲＢＣ－ＥＶは、ｍｉＲＮＡ又は他のＲＮＡを含有し得る。ＲＢＣ－ＥＶは、発癌性物質、例えば発癌性ＤＮＡ又はＤＮＡ変異を含まない。

【0037】

ＲＢＣ－ＥＶは、ヘモグロビン及び／又はストマチン及び／又はフロチリン－２を含み得る。それらの色は、赤であり得る。典型的には、ＲＢＣ－ＥＶは、透過型電子顕微鏡下でドーム状（凹んだ）表面、又は「カップ形」を示す。ＲＢＣ－ＥＶは、細胞表面ＣＤ２３５ａを持つことによって特徴付けられ得る。本発明によるＲＢＣ－ＥＶは、直径約１００～約３００ｎｍであり得る。いくつかの場合では、ＲＢＣ－ＥＶの組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、又は１００～３００ｎｍ、又は１０１～３００ｎｍの範囲の直径を有するＲＢＣ－ＥＶを含む。好ましくは、直径は、１００～３００ｎｍである。ＲＢＣ－ＥＶの集団は、異なる範囲の直径を有するＲＢＣ－ＥＶを含み、ＲＢＣ－ＥＶ試料内のＲＢＣ－ＥＶの平均直径は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、又は１００～３００ｎｍ、又は１０１～３００ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、平均直径は１００～３００ｎｍの間である。

【0038】

好ましくは、ＲＢＣ－ＥＶは、ヒト又は動物血液試料又は初代細胞に由来する赤血球又は固定化赤血球株に由来する。血液細胞は、処置される患者にマッチさせた型であってよく、したがって血液細胞は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、Ｏ型、又はＯｈ型血液であり得る。好ましくは、血液はＯ型である。血液は、Ｒｈ陽性又はＲｈ陰性であり得る。いくつかの場合では、血液はＯ型及び／又はＲｈ陰性、例えばＯ－型である。血液は、疾患又は障害がない、例えばＨＩＶ、鎌状赤血球貧血、マラリアがないことが確認され得る。しかしながら、任意の血液型が使用され得る。いくつかの場合では、ＲＢＣ－ＥＶは自己及び処置される患者から得られた血液試料に由来する。いくつかの場合では、ＲＢＣ－ＥＶは同種であり、処置される患者から得られた血液試料に由来しない。

【0039】

ＲＢＣ－ＥＶは、赤血球の試料から単離され得る。赤血球からＥＶを得るためのプロトコールは当技術分野、例えば、Ｄａｎｅｓｈら、（２０１４年）Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ｊａｎ ３０；１２３（５）：６８７～６９６頁で公知である。ＥＶを得るために有用な方法は、赤血球を含む試料を提供する又は得るステップ、赤血球を誘導して細胞外小胞を産生するステップ、及び細胞外小胞を単離するステップを含み得る。試料は、全血液試料であり得る。好ましくは、赤血球以外の細胞は試料から除去され、試料の細胞成分は赤血球である。

【0040】

試料の赤血球は、濃縮され、又は全血液試料の他の成分、例えば白血球から分けられ得る。赤血球は、遠心分離によって濃縮され得る。試料は、白血球除去にかけられ得る。
赤血球を含む試料は、実質的に赤血球のみを含み得る。細胞外小胞は、赤血球を小胞誘導剤と接触させることによって赤血球から誘導され得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）、又はフォルボール－１２－ミリスチン酸－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。

【0041】

ＲＢＣ－ＥＶは、遠心分離（超遠心分離あり又はなし）、沈殿、濾過プロセス、例えばタンジェント流濾過、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって単離され得る。この方法で、ＲＢＣ－ＥＶは、ＲＢＣ及び混合物の他の成分から分離され得る。

【0042】

細胞外小胞は：赤血球の試料を得ること；赤血球を小胞誘導剤と接触させること；及び誘導された細胞外小胞を単離することを含む方法によって赤血球から得ることができる。
赤血球は、低速遠心分離により、及び白血球除去フィルターを使用して、白血球及び血漿を含有する全血液試料から分離され得る。いくつかの場合では、赤血球試料は、他の細胞型、例えば白血球を含有しない。言い換えると、赤血球試料は、実質的に赤血球からなる。赤血球は、小胞誘導剤と接触させる前に、緩衝液、例えばＰＢＳで希釈され得る。小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）又はフォルボール－１２－ミリスチン酸－１３－アセテート（ＰＭＡ）であり得る。小胞誘導剤は、約１０ｎＭのカルシウムイオノフォアであり得る。赤血球は、終夜、又は少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、又は１２時間以上、小胞誘導剤と接触させ得る。混合物は、低速遠心分離にかけ、ＲＢＣ、細胞残渣、又は他の非ＲＢＣ－ＥＶ物を除去することができ、及び／又は上清を約０．４５μｍシリンジフィルターに通す。ＲＢＣ－ＥＶは、超遠心分離、例えばおよそ１００，０００×ｇの遠心分離によって濃縮され得る。ＲＢＣ－ＥＶは、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、又は少なくとも１時間、超遠心分離によって濃縮され得る。濃縮されたＲＢＣ－ＥＶは、冷ＰＢＳに懸濁され得る。それらは、６０％スクロースクッションに重層され得る。スクロースクッションは、凍結した６０％スクロースを含み得る。スクロースクッションに重層したＲＢＣ－ＥＶは、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間以上、１００，０００×ｇで超遠心分離にかけられ得る。好ましくは、スクロースクッションに重層したＲＢＣ－ＥＶは、約１６時間、１００，０００×ｇで超遠心分離にかけられ得る。次いで、スクロースクッション上の赤い層が回収され、それによりＲＢＣ－ＥＶが得られる。得られたＲＢＣ－ＥＶは、洗浄、タグ付け、及び場合により積載等の、さらなるプロセシングに供され得る。

【0043】

タグ
本発明による細胞外小胞は、それらの表面に、タグを有する。タグは、好ましくは、タンパク質又はペプチド配列である。タグは、ペプチド又はタンパク質であり得る。それは、修飾ペプチド又はタンパク質、例えば、グリコシル化又はビオチン化タンパク質若しくはペプチドであり得る。タグは、細胞外小胞に共有結合され、例えば細胞外小胞の膜タンパク質に共有結合され得る。タグは、細胞外小胞が形成された後、細胞外小胞に付加され得る。タグは、タンパク質リガーゼ認識配列である、又はタンパク質リガーゼ認識配列由来である配列を含む又はからなる配列によって細胞外小胞に結合され得る。例えば、タグは、タンパク質リガーゼ認識配列と１００％配列同一性、又はタンパク質リガーゼ認識配列と約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％若しくは約４０％配列同一性を含む配列によって細胞外小胞に結合され得る。アミノ酸配列はＬＰＸＴを含み得る。

【0044】

タグは、小胞の細胞外表面に提示され、したがって、細胞外環境に暴露される。本発明者らは、細胞外小胞の表面修飾がマクロファージによる細胞外小胞の取り込みを低下させ、循環における細胞外小胞の利用可能性を改善し、並びに非内因性物質又はカーゴの標的細胞への特異的送達を増強することを見出した。

【0045】

タグは、外因性分子であり得る。言い換えると、タグは、天然の小胞の外側表面に提示されない分子である。いくつかの場合では、タグは、そこから細胞外小胞が由来する細胞又は赤血球に存在しない外因性分子である。

【0046】

タグは、細胞外小胞の循環における安定性、取り込み効率及び利用可能性を増加させ得る。そのようなタグは、すでにいくらかの固有の治療特性を有する細胞外小胞、例えばそれぞれ心筋再生又はワクチン接種のための間葉系幹細胞又は樹状細胞からの細胞外小胞の効果を増強し得る。

【0047】

いくつかの場合では、タグは、体内の循環及び臓器において細胞外小胞及びカーゴを含有する細胞外小胞を提示するように作用する。ペプチド及びタンパク質は、治療分子として作用し、例えば標的細胞機能をブロッキング／活性化する、又はワクチン接種のための抗原を提示することができる。それらは、バイオマーカー検出、例えば毒性の診断のためのプローブとしても作用し得る。

【0048】

タグは、好ましくは、機能性ドメイン及びタンパク質リガーゼ認識配列を含有する。機能性ドメインは、標的部分に結合することができ、検出されることができ、又は治療効果を誘導することができることがある。機能性ドメインは、標的分子に結合することができることがある。そのような機能性ドメインを含むタグは、本明細書では、結合分子と呼ばれ得る。結合分子は、標的分子と特異的に相互作用することができるものである。結合部分を含む細胞外小胞は、標的分子を有する細胞にカーゴ又は治療剤を送達するために特に有用であり得る。好適な結合分子は、抗体及び抗原結合断片（抗体断片としても公知なことがある）、リガンド分子及び受容体分子を含む。結合分子は目的の標的に結合する。標的は、目的の細胞、例えばがん細胞と関連する、例えば細胞の表面に発現される分子であり得る。リガンドは、標的細胞の生体分子、例えば受容体分子と複合体を形成し得る。

【0049】

好適な結合分子は、抗体及び抗原結合断片を含む。断片、例えば、Ｆａｂ及びＦａｂ_２断片は、遺伝子操作された抗体及び抗体断片として使用され得る。抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインは、抗原認識に関与し、事実、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識される。さらなる確証は、げっ歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。げっ歯類起源の可変ドメインは、ヒト起源の定常ドメインに融合させることができ、生じる抗体はげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ８１、６８５１～６８５５頁）。本明細書に開示する細胞外小胞に有用な抗体又は抗原結合断片は、標的分子を認識及び／又は結合する。標的分子は、がん細胞の表面に存在するタンパク質であり得る。

【0050】

抗原特異性が、可変ドメインによって与えられ、定常ドメインとは無関係であることは、全て１つ又は複数の可変ドメインを含有する抗体断片の細菌発現を含む実験から公知である。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１頁）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８頁）；Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌパートナードメインが可動性オリゴペプチドによって結合される単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３頁；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８５、５８７９頁）及び単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４頁）を含む。それらの特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に含まれる技術の一般的な説明は、Ｗｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２９３～２９９頁に見出される。本明細書で有用な抗体及び断片は、ヒト又はヒト化、マウス、ラクダ、キメラ、又は任意の他の好適な起源由来であり得る。

【0051】

「ＳｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬパートナードメインが例えば直接、ペプチドによって又は可動性オリゴペプチドによって共有結合されている分子を意味する。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｓｄＡｂ抗体断片は全て、大腸菌で発現され、大腸菌から分泌され、したがって、大量の前記断片の容易な産生を可能にし得る。

【0052】

抗体全体、及びＦ（ａｂ’）_２断片は「二価」である。「二価」によって、本発明者らは、前記抗体及びＦ（ａｂ’）_２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びＳｄＡｂ断片は、１つの抗原結合部位のみを有する、一価である。一価の抗体断片は、それらのサイズが小さいため、タグとして特に有用である。

【0053】

本明細書での使用のための好ましい結合分子は、ｓｄＡｂである。「ｓｄＡｂ」により、本発明者らは、１つ、２つ又はそれ以上の単一の単量体可変抗体ドメインからなる単一ドメイン抗体を意味する。ｓｄＡｂ分子は、ｄＡｂと呼ばれることもある。

【0054】

いくつかの場合では、結合分子は単鎖抗体、又はｓｃＡｂである。ｓｃＡｂは、共有結合したＶＨ及びＶＬパートナードメイン（例えば、直接、ペプチドにより、又は可動性オリゴペプチドにより）及び任意選択で軽鎖定常ドメインからなる。

【0055】

他の好適な結合分子は、標的分子に親和性を有するリガンド及び受容体を含む。タグは、細胞表面受容体のリガンド、例えばＥＧＦＲ結合ペプチドであり得る。例としては、ストレプトアビジン及びビオチン、アビジン及びビオチン、又は他の受容体のリガンド、例えばフィブロネクチン及びインテグリンが挙げられる。

【0056】

小サイズのビオチンは、結合分子の生物活性にわずかにしかから全く作用しない。ビオチン及びストレプトアビジンのように、ビオチン及びアビジン、並びにフィブロネクチン及びインテグリンは高親和性及び特異性でそれらの対を結合し、それらは結合分子として非常に有用である。アビジン－ビオチン複合体は、公知のタンパク質とリガンドの間の最も強い非共有結合性相互作用（Ｋｄ＝１０～１５Ｍ）である。結合形成は速く、いったん形成されると、極端なｐＨ、温度、有機溶媒及び他の変性剤によって影響されない。ビオチンのストレプトアビジンへの結合も強く、速く形成され、バイオテクノロジー適用に有用である。

【0057】

機能性ドメインは治療剤を含み得る又はからなり得る。治療剤は、酵素であり得る。それは、アポトーシス誘導剤又は阻害剤であり得る。
機能性ドメインは、抗原、抗体認識配列又はＴ細胞認識配列を含み得る。タグは、１つ又は複数の抗原性ペプチドに由来する１つ又は複数の短鎖ペプチドを含み得る。ペプチドは、抗原性ペプチドの断片であり得る。好適な抗原性ペプチドは当業者に公知である。

【0058】

機能性ドメインは、検出可能部分を含み得る又はからなり得る。検出可能部分は、蛍光標識、比色標識、フォトクロミック化合物、磁気粒子又は他の化学標識を含む。検出可能部分は、ビオチン又はＨｉｓタグであり得る。

【0059】

タグは、スペーサー又はリンカー部分を含み得る。スペーサー又はリンカーは、タグとタンパク質リガーゼ認識配列の間に配置され得る。スペーサー又はリンカーは、タグのＮ又はＣ末端に結合され得る。好ましくは、スペーサー又はリンカーは、タグの機能、例えばタグによる標的結合活性を干渉又は妨害しないように配置される。スペーサー又はリンカーは、好ましくはペプチド配列である。特定の態様では、スペーサー又はリンカーは、一連の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸又は少なくとも１５個のアミノ酸である。好ましくは、スペーサー又はリンカーは可動性である。スペーサーは、複数のグリシン及び／又はセリンアミノ酸を含み得る。

【0060】

スペーサー及びリンカー配列は当業者に公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３年）６５（１０）：１３５７～１３６９頁に記載される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は可動性リンカー配列であり得る。可動性リンカー配列は、リンカー配列によって結合されるアミノ酸配列の相対的運動を可能にする。可動性リンカーは、当業者に公知であり、いくつかはＣｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３年）６５（１０）：１３５７～１３６９頁で同定される。可動性リンカー配列は、高比率のグリシン及び／又はセリン残基を含むことが多い。

【0061】

いくつかの実施形態では、スペーサー又はリンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基及び／又は少なくとも１つのセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、グリシン及びセリン残基からなる。いくつかの実施形態では、スペーサー又はリンカー配列は１～２、１～３、１～４、１～５又は１～１０個のアミノ酸の長さを有する。

【0062】

本発明者らは、スペーサー又はリンカーの包括が、細胞外小胞とタグ部分の間のタンパク質リガーゼ反応の効率を改善し得ることを観察した。用語「タグ」は、本明細書で使用する場合、タグ、スペーサー、及びタンパク質リガーゼ認識配列を含むペプチドを包含し得る。

【0063】

好適なタンパク質リガーゼ認識配列は、当技術分野で公知である。タンパク質リガーゼ認識配列は、細胞外小胞をタグ付けする方法で使用されるタンパク質リガーゼによって認識される。例えば、本方法で使用されるタンパク質リガーゼがソルターゼである場合、次いでタンパク質リガーゼ認識配列はソルターゼ結合部位である。これらの場合では、配列はＬＰＸＴＧ（ここでＸは、任意の天然に生じるアミノ酸である）、好ましくはＬＰＥＴＧであり得る。あるいは、酵素がＡＥＰ１である場合、タンパク質リガーゼ認識配列はＮＧＬであり得る。タンパク質リガーゼ結合部位は、ペプチド又はタンパク質のＣ末端に配列され得る。

【0064】

タグは、１つ又は複数のさらなる配列をさらに含み、タグ自体の産生中、タグ付け方法中、又は続く精製のための、タグの精製又はプロセシングを助け得る。当技術分野で公知の任意の好適な配列が使用され得る。例えば、配列は、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（例えばポリＨｉｓタグ、又は６×Ｈｉｓタグ）であり得る。

【0065】

本明細書では、細胞外小胞のタグ付けに好適なタグを産生する方法を提供する。方法は、ペプチドを操作するステップを含み得る。方法は、ペプチドを化学合成するステップを含み得る。方法は、核酸配列を操作してタグを発現するステップを含み得る。例えば、方法は、タグをコードする核酸構築物を調製するステップを含み得る。核酸構築物は、タグ及び１つ又は複数のスペーサー配列、タンパク質リガーゼ認識配列、１つ又は複数のさらなる配列を含むポリペプチドをコードし得る。例えば、核酸構築物は、タグ、スペーサー及びタンパク質リガーゼ配列を含む又はからなるポリペプチドをコードし得る。

【0066】

本明細書で開示するようにタグをコードする核酸も提供される。核酸は、ベクター内に含まれ得る。ベクターは、タグ、スペーサー及びタンパク質リガーゼ認識配列をコードする核酸を含み得る。ベクターは、大腸菌発現ベクターであり得る。

【0067】

タグ付け方法
本明細書では、細胞外小胞をタグ付けする方法を提供する。方法は、タグを細胞外小胞の表面に結合させることを含む。方法は、例えば共有結合により、タグを細胞外小胞に結合させることを含み得る。方法は、タグを細胞外小胞の膜に結合させることを含み得る。好ましくは、本明細書に開示するタグ付け方法は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合することが公知のラクトアドへリンのＣ１Ｃ２ドメインを含まない。好ましくは、タグは、小胞が由来する細胞に付加されるよりも、小胞が形成された後に細胞外小胞に付加され、その形成の間に小胞に含まれる。方法は、タンパク質リガーゼ又はそのバリアントによって細胞外小胞とタグを接触させるステップ、及びタグと細胞外小胞の表面タンパク質の間の共有結合を可能にする条件下で混合物をインキュベートするステップを含み得る。条件は、切断及びタグの細胞外小胞の表面への接合を可能にする。使用される条件は使用されるリガーゼによる。

【0068】

本明細書に開示するいくつかの方法では、細胞外小胞は、単一ステップのプロセスでタグをタグ付けされる。言い換えると、タグが調製され、細胞外小胞にライゲートされる。
他の方法では、細胞外小胞は、複数ステップのプロセスでタグをタグ付けされる。そのような方法では、細胞外小胞はまずペプチドにライゲートしてペプチドタグ細胞外小胞を生成し、次いでペプチドタグ細胞外小胞が、機能性ドメイン、例えば結合部分又は標的化部分にライゲートされる。いくつかの方法では、細胞外小胞は、機能性ドメインとのライゲーションの前に、１つ又は複数のペプチドにタグ付けされる。方法は、ペプチドと細胞外小胞の表面タンパク質の間の共有結合を可能にする条件下で、細胞外小胞をペプチド及び第１のタンパク質リガーゼと接触させ、それによりペプチドタグ付き細胞外小胞を生成することを含み得る。方法は、次いで、細胞外小胞に共有結合したペプチドと機能性ドメインペプチドの間の共有結合を可能にする条件下で、ペプチドタグ付き細胞外小胞を機能性ドメインペプチド及び第２のタンパク質リガーゼと接触させることを含み得る。

【0069】

これらの場合では、ペプチドは、ペプチドのいずれかの末端にリガーゼ結合部位を含み得る。リガーゼ結合部位は、リガーゼ認識部位及びリガーゼ受容部位を含み得る。ペプチドは、一方の末端にリガーゼ認識部位を、もう一方の末端にリガーゼ受容部位を含み得る。あるいは、リガーゼ結合部位は両方ともリガーゼ認識部位を含み得る。リガーゼ認識部位は、リガーゼによって認識される特定の部位であり得る。リガーゼは、リガーゼ認識部位の１つ又は複数のアミノ酸残基とリガーゼ受容部位の間の結合の形成を触媒し得る。例えば、リガーゼ認識部位はＮＧＬを含んでよく、リガーゼ受容部位はＧＬを含んでよい。

【0070】

リガーゼ結合部位は、同じ又は異なるリガーゼに相当し得る。例えば、リガーゼ結合部位は両方ともソルターゼ結合部位であってよく、又は両方ともＡＥＰ１結合部位であってよい。あるいは、リガーゼ結合部位は、異なるリガーゼ、例えばソルターゼ結合部位及びＡＥＰ１結合部位に相当し得る。第１のタンパク質リガーゼは、第２のタンパク質リガーゼと同じリガーゼであってよく、又は第１及び第２のタンパク質リガーゼは異なってよい。いくつかの場合では、第１及び第２のタンパク質リガーゼはソルターゼである。いくつかの場合では、第１及び第２のタンパク質リガーゼは両方ともソルターゼＡである。

【0071】

機能性ドメインペプチドは、１つ又は複数の機能性ドメイン及びリガーゼ結合部位を含み得る。リガーゼ結合部位は、リガーゼ認識部位又はリガーゼ受容部位を含み得る。好ましくは、リガーゼ結合部位はリガーゼ認識部位を含む。リガーゼ結合部位は、ペプチドのリガーゼ結合部位に相当し、それによりリガーゼはペプチドのリガーゼ結合部位と機能性ドメインペプチドのリガーゼ結合部位の間の結合を触媒し得る。

【0072】

ペプチド及び機能性ドメインペプチドは、もう１つの機能性分子配列、例えばビオチン、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ又は他の配列を含み得る。そのような方法は、連続して付加した異なる成分、例えばリンカー、１つ又は複数の機能性ドメイン、例えば検出可能タグ、結合部分又は標的化部分により、細胞外小胞にタグを構築することを含み得る。

【0073】

いくつかの場合では、方法は、各成分を別々に調製することを含む。方法は、細胞外小胞、タグ、リンカー、ペプチド及び／又はリガーゼを調製又は提供することを含み得る。方法は、タグ、細胞外小胞及びリガーゼから選択される１、２又は３個の成分を組み合わせて混合物を形成することを含み得る。混合物は、さらなる薬剤、例えば緩衝液を含有し得る。混合物は、任意の順序で成分を組み合わせることによって調製され得る。例えば、３個の成分が実質的に同時に組み合わされてよく、又は第３の薬剤の添加の前に、２つの成分の混合物が調製及び一時保存されてよい。

【0074】

混合物は、約０℃～約３０℃、約４℃～約２５℃、約４℃又は約２５℃で、少なくとも１５分間、３０分間、１時間、又は２時間、又は３時間インキュベートされ得る。好ましくは、混合物は優しく攪拌される。この方法で、タンパク質リガーゼは、結合分子と細胞外小胞の表面タンパク質の間に共有結合を形成することによって細胞外小胞の表面に結合分子を接着させる。

【0075】

好ましくは、混合物のｐＨは酸性である。ｐＨは、８．０又はそれ以下であり得る。ｐＨは、８、７、６、５、４、３、２又は１より低くてよい。
方法は、混合物から修飾細胞外小胞を単離するステップを含み得る。単離は、超遠心分離、又はサイズ排除クロマトグラフィー若しくは濾過を含み得る。分画遠心分離は、生じた混合物を凍結スクロースクッションに添加すること及び遠心分離を実施することを含み得る。用語「スクロースクッション」は、遠心分離中にそれ自体で確立するスクロース勾配を指す。スクロース勾配は、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％又は約６０％、好ましくは約６０％スクロースの溶液を使用することによって調製され得る。

【0076】

いくつかの場合では、タグ付き細胞外小胞は、タグにより、例えば親和性クロマトグラフィーにより単離され得る。単離は、タグペプチド、例えばＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ又は他の配列の１つ又は複数の機能性ドメインを利用し得る。

【0077】

遠心分離後、精製した修飾細胞外小胞を回収し、任意選択で緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。次いで、遠心分離を実行して、精製した修飾細胞外小胞を回収する。方法は、１回以上の洗浄ステップを含み得る。好ましくは、方法は、２又は３回の洗浄ステップを含む。

【0078】

細胞外小胞は、積載されてもよく、積載されなくてもよい。言い換えると、細胞外小胞は、カーゴを封入し得る、又は外因性物質を含まなくてよい。いくつかの場合では、タグの結合後、細胞外小胞はカーゴを積載される。好ましくは、カーゴはタグの結合後に積載される。言い換えると、タグ付き細胞外小胞が調製される。次いで、カーゴはタグ付き細胞外小胞に積載される。

【0079】

好ましい方法は、細胞外小胞をタグと接触させることを含む。方法は、細胞外小胞及びタグをタンパク質リガーゼとさらに接触させることを含み得る。細胞外小胞及びタグは、タグの細胞外小胞への結合を誘導するために好適な条件下で接触させることができる。例えば、タグ及び小胞は、緩衝液、例えばタンパク質リガーゼ緩衝液中で接触させることができる。小胞及びタグは、タグ付けが起こるのに十分な時間接触させることができる。

【0080】

方法は、タグ付き細胞外小胞を洗浄してリガーゼを除去するステップを含み得る。
本明細書では、それらの表面にタグを有する細胞外小胞も開示し、前記細胞外小胞は本明細書に開示する方法によって得られる。この方法でタグ付けされた細胞外小胞は、タグ付き細胞から得られた細胞外小胞とは異なり、したがって最初からタグ付けされる。例えば、細胞外小胞とタグの間の結合は、組成上異なり得る。

【0081】

一実施形態では、方法は、タグを細胞外小胞の表面に結合させる。方法は、タグを細胞外小胞の膜に結合させ得る。一実施形態では、方法は、タグを細胞外小胞の表面に共有結合によって結合させる。別の実施形態では、方法は、タグを細胞外小胞の膜に共有結合によって結合させる。さらなる実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、細胞外小胞を、スペーサー又はリンカーを含有するタグに結合させる。さらなる実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、細胞外小胞を、検出されることができるか又は治療効果を誘導することができる機能性分子を含有するタグに結合させる。

【0082】

一実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、酸性条件下で実施される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、細胞外小胞及びタグをタンパク質リガーゼと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、細胞外小胞及びタグをソルターゼ酵素と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、細胞外小胞及びタグをソルターゼＡと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、非積載細胞外小胞にタグをつける。いくつかの実施形態では、細胞外小胞をタグ付けする方法は、積載細胞外小胞にタグをつける。

【0083】

本明細書に開示する特定の方法は、医薬製品のようにタグ付き細胞外小胞を製剤化するステップを含む。これは、１つ又は複数の医薬賦形剤又は担体、例えば緩衝液又は保存剤の添加を含み得る。いくつかの場合では、方法は、凍結すること、凍結乾燥すること、又はその他の形で細胞外小胞若しくは細胞外小胞を含む組成物を保存することを含み得る。

【0084】

タグの調製
本明細書に開示する方法は、タグを調製することを含み得る。タグは、組換えタンパク質であり得る。タグの調製は、分子生物学技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載のものを含んでよく、又はその他の形で当技術分野で公知であり得る。タグはより早く調製され、保存され得る。例えば、凍結、冷蔵、凍結乾燥又はその他の形で早く調製される。

【0085】

タグは、ＥＶへの結合を可能にする結合部位を含有しなければならない。したがって、タグは、使用されるタンパク質リガーゼの型によって調製又は合成され、すなわちタンパク質リガーゼの相当する結合部位を含み、認識する。例えば、使用するタンパク質リガーゼがソルターゼ又はその誘導体である場合、結合分子はソルターゼ結合部位を持ち；又はタンパク質リガーゼが、ＯａＡＥＰ１のようにＡＥＰである場合、結合分子はＯａＡＥＰ１結合部位を持つ。特に、ソルターゼＡ認識配列は、ＬＰＸＴＧ（ここでＸは、任意の天然に生じるアミノ酸である）、好ましくはＬＰＥＴＧであり得る。ソルターゼＢ認識配列は、ＮＸＺＴＮ（ここでＸは、任意の天然に生じるアミノ酸である）又はＮＰ（Ｑ／Ｋ）（Ｔ／Ｓ）（Ｎ／Ｇ／Ｓ）（Ｄ／Ａ）であってよく、ソルターゼＣ酵素は様々な局在化シグナル及びアミノ基を認識するそれらの能力のユニークな相違を実証する。

【0086】

タグは操作され、スペーサー又はリンカーを含み得る。スペーサー又はリンカーは、タグの結合分子とペプチド認識部位の間に配置され得る。スペーサーは、可動性リンカー、例えばおよそ１０又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドリンカーであり得る。

【0087】

リンカーペプチドは、ペプチドリガーゼを使用してそれをＥＶにコンジュゲートさせる一端のリガーゼ結合部位（例えば、ＮＧＬ）及びｓｄＡｂへのコンジュゲーションのためにそれをペプチドリガーゼに反応させる他の端の反応性アミノ酸残基（例えば、ＧＬ）を有する独立したペプチドであり得る。このリンカーペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸であるはずである。それは、検出目的のためのＭｙｃタグ、Ｈｉｓタグ又はＨＡタグも含有し得る。それは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有し、食作用を防ぎ得る。

【0088】

オリゴマー化を避けるため、２つのリンカーペプチドが１つの代わりに使用され得る。１つのリンカーペプチドは、そのＥＶへのライゲーションを可能にするＣ末端のＮＧＬ及びＮ末端でジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基をコンジュゲートしたシステインを有する。別のリンカーは、ＮＧＬによるｓｄＡｂへのそのライゲーションを可能にするＮ末端のＧＬ及びアジド基（Ｎ３）を有するＣ末端のＬｙｓを有する。２つのペプチドがＲＢＣＥＶ及びｓｄＡｂに別々にライゲートされた後、それらは、ＤＢＣＯとアジド基の間のクリックケミストリー反応を使用して結合され得る。

【0089】

タグは、任意選択で、検出されることができるか又は治療効果を誘導することができる機能性分子も含み得る。機能性分子は、標的分子に結合することができることがある。結合のための機能性分子を含む細胞外小胞は、カーゴ又は治療剤を、標的分子を有する細胞に送達するために特に有用であり得る。好適な機能性結合分子は、抗体及び抗原結合断片（抗体断片として公知の場合もある）、リガンド分子及び受容体分子を含む。結合分子は、目的の標的に結合するであろう。標的は、目的の細胞、例えばがん細胞と関連する、例えば表面に発現される分子であり得る。

【0090】

機能性ドメインは、治療剤を含み得る又はからなり得る。治療剤は、小分子、酵素又はアポトーシス誘導剤又は阻害剤であり得る。
機能性ドメインは、抗原、抗体認識配列又はＴ細胞認識配列を含み得る。タグは、１つ又は複数の抗原性ペプチドに由来する１つ又は複数の短鎖ペプチドを含み得る。ペプチドは、抗原性ペプチドの断片であり得る。好適な抗原性ペプチドは当業者に公知である。

【0091】

機能性ドメインは、検出可能部分を含み得る又はからなり得る。検出可能部分は、蛍光標識、比色標識、フォトクロミック化合物、磁気粒子又は他の化学標識を含む。検出可能部分は、ビオチン又はＨｉｓタグであり得る。

【0092】

タグの調製は、タグをコードする核酸を操作することを含み得る。核酸は、機能性ドメイン及びタンパク質リガーゼ認識配列をコードする配列を含み得る。核酸は、スペーサー又はリンカーをコードする核酸も含み得る。スペーサー又はリンカーをコードする核酸は、機能性ドメインとタンパク質リガーゼ認識配列の間に配置され得る。

【0093】

タグをコードする核酸を含むベクターも提供する。ベクターは、細胞、例えば大腸菌の培養中にタグを発現するための発現ベクターであり得る。
タンパク質発現
細胞において、ペプチド又はポリペプチド、例えば本発明によるタグ又はカーゴ分子を産生するために好適な分子生物学技術は当技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載される。

【0094】

ペプチドは、ヌクレオチド配列から発現され得る。ヌクレオチド配列は、細胞に存在するベクター内に含有され得る、又は細胞のゲノムに組み込まれ得る。
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、外来遺伝物質を細胞へと移行させる媒体として使用されるオリゴヌクレオチド分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。ベクターは、細胞における外来遺伝物質の発現のための発現ベクターであり得る。そのようなベクターは、発現される遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含み得る。ベクターは、終結コドン及び発現エンハンサーも含み得る。本技術分野で公知の任意の好適なベクター、プロモーター、エンハンサー、及び終結コドンは、本発明によるベクターから植物アスパラギン酸プロテアーゼを発現させるために使用され得る。好適なベクターは、プラスミド、バイナリーベクター、ウイルスベクター及び人工染色体（例えば酵母人工染色体）を含む。

【0095】

この明細書では、用語「作動可能に連結した」は、選択されたヌクレオチド配列と制御ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）が共有結合され、このような方法で制御配列の影響又は調節下でヌクレオチド配列の発現を起こす（それにより発現カセットを形成する）ような状況を含み得る。したがって、制御配列は、制御配列がヌクレオチド配列の転写に作用することができる場合、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結される。適当な場合、生じる転写物は、次いで所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得る。

【0096】

ポリペプチドの発現に好適な任意の細胞は、本発明に従ってペプチドを産生するために使用され得る。細胞は、原核生物又は真核生物であり得る。好ましくは、細胞は、真核生物細胞、例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞である。いくつかの場合では、細胞は、いくつかの原核生物細胞が真核生物と同じ翻訳後修飾が可能ではないため、原核生物細胞ではない。さらに、非常に高い発現レベルが真核生物において可能であり、タンパク質は、アポトーシスタグを使用して真核生物から容易に精製され得る。特定のプラスミドも利用され、タンパク質の培地への分泌を増強する。

【0097】

目的のペプチド、例えばタグを産生する方法は、ペプチドを発現するように修飾された真核細胞の培養又は発酵を含み得る。培養又は発酵は、栄養、空気／酸素及び／又は成長因子を適切に供給したバイオリアクター内で実施され得る。分泌されたタンパク質は、細胞から培養培地／発酵ブロスを分け、タンパク質成分を抽出し、個々のタンパク質を分離して分泌されたアスパラギン酸プロテアーゼを単離することによって回収され得る。培養、発酵及び分離技術は、当業者に周知である。

【0098】

バイオリアクターは、細胞が培養され得る１つ又は複数のベッセルを含む。バイオリアクター内での培養は、リアクターへの反応物質の連続フロー、及びリアクターからの培養細胞の連続フローによって連続的に起こり得る。あるいは、培養はバッチで起こり得る。バイオリアクターは、最適な条件が培養される細胞に提供されるように、周辺条件、例えばｐＨ、酸素、ベッセルへの又はベッセルからの流速、及びベッセル内での攪拌をモニター及び調節する。

【0099】

目的のペプチドを発現する細胞の培養後、ペプチドは好ましくは単離される。当技術分野で公知の細胞培養からのタンパク質を分離するための任意の好適な方法が使用され得る。培養から目的のタンパク質を単離するため、まず、目的のタンパク質を含有する培地から培養細胞を分離する必要があり得る。目的のタンパク質が細胞から分泌される場合、遠心分離により分泌されたタンパク質を含有する培養培地から細胞が分離され得る。目的のタンパク質を細胞内、例えば細胞の液胞内で回収する場合、遠心分離の前に、例えば超音波処置、急速凍結融解又は浸透圧溶解を使用して細胞を破壊する必要がある。遠心分離は、培養細胞、又は培養細胞の細胞残渣、並びに培養培地及び目的のタンパク質を含有する上清を含有するペレットを産生する。

【0100】

次いで、他のタンパク質及び非タンパク質成分を含有し得る上清又は培養培地から目的のタンパク質を単離することが望ましい。上清又は培養培地からタンパク質成分を分離する共通の手法は、沈殿による。異なる溶解性のタンパク質は、異なる濃度の沈殿剤、例えば硫酸アンモニウムで沈殿される。例えば、低濃度の沈殿剤では、水溶性タンパク質が抽出される。したがって、異なる漸増濃度の沈殿剤を添加することにより、異なる溶解性のタンパク質が区別され得る。続いて透析が使用され、分離されたタンパク質から硫酸アンモニウムが除去され得る。

【0101】

異なるタンパク質を区別する他の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー及びサイズクロマトグラフィーが、当技術分野で公知である。これらは、沈殿の代替として使用することができ、又は沈殿に続いて実施することができる。

【0102】

本明細書に開示する方法で有用なペプチド及びタンパク質は、精製され得る、又は精製ステップにかけられ得る。本明細書に開示する方法は、タンパク質又はペプチドを精製する１つ又は複数のステップを含み得る。例えば、タンパク質又はペプチドは、親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得る。

【0103】

目的のタンパク質が培養から単離されると、タンパク質を濃縮する必要があり得る。目的のタンパク質を濃縮する多くの方法、例えば限外濾過又は凍結乾燥が当技術分野で公知である。

【0104】

タンパク質リガーゼ
本明細書に開示するタグ付け方法は、細胞外小胞をタグに結合させるタンパク質リガーゼの使用を含み得る。タンパク質リガーゼは、トランスペプチダーゼであり得る。用語、タンパク質リガーゼ及びペプチドリガーゼは、本明細書で交換可能に使用される。本明細書に開示する方法での使用に好適なタンパク質リガーゼは、低コストで細菌、例えば大腸菌において高純度のラージスケールで産生され得る。リガーゼ媒介反応は、予測できる速度及び標的で再生できる。リガーゼは、細胞外小胞の物質的な特性を変更せず、リガーゼは洗浄によって容易に除去され得る。

【0105】

好適なタンパク質リガーゼは、細胞外小胞の表面のタグの取り込みを促進する。言い換えると、タグはリガーゼの基質として作用する。
本明細書に開示する方法で使用されるタンパク質リガーゼは、化学結合、好ましくは共有結合を形成することによって、タンパク質への基質の接合を促進することができる任意の酵素であり得る。特に、タンパク質リガーゼは、細胞外小胞の又は細胞外小胞の表面の分子へのタグの接合を促進することができる。タンパク質リガーゼの任意のバリアント、例えば、限定はされないが、アイソザイム及び異系酵素も本発明に含まれる。タンパク質のライゲート効果に影響せずにタンパク質リガーゼの構造に修飾を有するバリアントも含まれる。

【0106】

いくつかの態様では、細胞外小胞にタグを共有結合させるために使用されるタンパク質リガーゼはソルターゼ、ビオチンタンパク質リガーゼ（ＢＰＬ）、ユビキチンリガーゼ、又はアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）及びそれらの誘導体、例えばＡＥＰキメラタンパク質、ＡＥＰ断片又はＡＥＰ変異体である。好ましくは、リガーゼは、ソルターゼＡ又はその誘導体、例えばソルターゼＡキメラタンパク質、ソルターゼＡ断片又はソルターゼＡ変異体である。リガーゼは、アスパラギニルエンドペプチダーゼ１又はその誘導体、例えばアスパラギニルエンドペプチダーゼ１キメラタンパク質、アスパラギニルエンドペプチダーゼ１断片又はアスパラギニルエンドペプチダーゼ１変異体であり得る。リガーゼは、タグが細胞外小胞に結合された後、好ましくは細胞外小胞から洗浄され、又はその他の形で除去される。

【0107】

いくつかの場合では、トランスペプチダーゼはソルターゼである。ソルターゼは、カルボキシル末端局在化シグナルを認識及び切断することによって表面タンパク質を修飾する原核生物に由来する酵素である。ソルターゼは多くのペプチドを結合することができ、全てはソルターゼ認識配列によってそれらのＣ末端に伸長され、ＲＢＣ表面のＮ末端グリシン残基を有するタンパク質を修飾しない。

【0108】

いくつかの場合では、リガーゼはソルターゼＡ、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡ（ＮＣＢＩ登録番号：ＢＢＡ２５０６２．１ ＧＩ：１２３６５８８７４８）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ソルターゼＡ（ＮＣＢＩ登録番号：ＣＴＮ１３０８０．１ ＧＩ：９０６７６６２９３）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡ（ＮＣＢＩ登録番号：ＫＳＺ４７９８９．１ ＧＩ：９６１３７２９１０）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ソルターゼＡ（ＮＣＢＩ登録番号：ＯＺＮ２１１７９．１ ＧＩ：１２３４７８２２４６）である。あるいは、リガーゼは、公知のソルターゼＡ配列と１００％配列同一性、又は公知のソルターゼＡ配列と約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％若しくは約４０％配列同一性を有する酵素であり得る。さらに、タンパク質リガーゼは、ソルターゼＡと同じ酵素機能を有する酵素であり得る。

【0109】

いくつかの場合では、リガーゼは、ソルターゼＢ、例えば、黄色ブドウ球菌ソルターゼＢ（ＮＣＢＩ登録番号：ＫＰＥ２４４６６．１ ＧＩ：９２９３４３２５９）、リステリア菌ソルターゼＢ（ＮＣＢＩ登録番号：ＫＳＺ４７１０９．１ ＧＩ：９６１３７２０２６）、肺炎球菌ソルターゼＢ（ＮＣＢＩ登録番号：ＥＪＨ１４９４０．１ ＧＩ：３９５９０４０１８）、クロストリディオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ソルターゼＢ（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＫＰ４３６７９．１ ＧＩ：８７３３２１４１５）である。あるいは、リガーゼは、公知のソルターゼＢ配列と１００％配列同一性、又は公知のソルターゼＢ配列と約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％若しくは約４０％配列同一性を有する酵素であり得る。Ａ配列。さらに、タンパク質リガーゼは、ソルターゼＢと同じ酵素機能を有する酵素であり得る。

【0110】

いくつかの場合では、リガーゼは、ソルターゼＣ、例えば、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ソルターゼＣ（ＮＣＢＩ登録番号：ＫＷＷ６４４２７．１ ＧＩ：９８４８２３８６１）、肺炎球菌ソルターゼＣ（ＮＣＢＩ登録番号：ＥＩＡ０７０４１．１ ＧＩ：３７９６４２５０９）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ソルターゼＣ（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＪＧ９６５６０．１ ＧＩ：７５３３６３６３６）、リステリア菌ソルターゼＢ（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ＿０７５４９１５２４．１ ＧＩ：１１２９５４０６８９）である。あるいは、リガーゼは、公知のソルターゼＣ配列と１００％配列同一性、又は公知のソルターゼＣ配列と約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％若しくは約４０％配列同一性を有する酵素であり得る。Ａ配列。さらに、タンパク質リガーゼは、ソルターゼＣと同じ酵素機能を有する酵素であり得る。

【0111】

酵素がソルターゼである場合、細胞外小胞をタグ付けする方法は、ソルタグ付け法である。ソルターゼＡ認識配列は、ＬＰＸＴＧ（ここでＸは、任意の天然に生じるアミノ酸である）、好ましくはＬＰＥＴＧであり得る。ソルターゼＢ認識配列は、ＮＸＺＴＮ（ここでＸは、任意の天然に生じるアミノ酸である）、又はＮＰ（Ｑ／Ｋ）（Ｔ／Ｓ）（Ｎ／Ｇ／Ｓ）（Ｄ／Ａ）であり得る。ソルターゼＣ酵素は、様々な局在化シグナル及びアミノ基を認識するそれらの能力のユニークな相違を実証する。

【0112】

いくつかの場合では、タンパク質リガーゼは、ＡＥＰ１（アスパラギニルエンドペプチダーゼ１）である。それは、オルデンランディア・アフィニス（Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）ＯａＡＥＰ１（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＬＧ３６１０５．１ ＧＩ：９３１２５５８０８）であり得る。それは、ＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７ Ａｌａペプチダーゼ、又はそのバリアントであり得る。それは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）アスパラギニルエンドペプチダーゼ（例えば、ＮＣＢＩ登録番号：Ｑ３９１１９．２ ＧＩ：１４８８７７２６０）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）アスパラギニルエンドペプチダーゼ（例えば、ＮＣＢＩ登録番号：ＢＡＣ４１３８７．１ ＧＩ：２６００６０２２）、チヨウマメ（Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ）アスパラギニルエンドペプチダーゼ（例えばＮＣＢＩ登録番号：ＡＬＬ５５６５３．１ ＧＩ：９４４２０４３９５）でもあり得る。あるいは、リガーゼは、公知のアスパラギニルエンドペプチダーゼ配列と１００％配列同一性、又は公知のアスパラギニルエンドペプチダーゼ配列と約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％若しくは約４０％配列同一性を有する酵素であり得る。Ａ配列。さらに、タンパク質リガーゼは、アスパラギニルエンドペプチダーゼと同じ酵素機能を有する酵素であり得る。

【0113】

酵素がアスパラギニルエンドペプチダーゼである場合、タンパク質リガーゼ認識配列はＮＧＬであり得る。
いくつかの場合では、タンパク質リガーゼはブテラーゼである。それは、チョウマメブテラーゼ１（例えばＮＣＢＩ登録番号：６ＤＨＩ＿Ａ ＧＩ：１４７４８８９６９３）であり得る。あるいは、リガーゼは、チョウマメブテラーゼ２であり得る。

【0114】

本明細書に開示する方法で有用なタンパク質リガーゼは、市販に入手することができる、又は大腸菌若しくは他の細菌若しくは酵母細胞培養で生成することができる。
カーゴ
本明細書に開示する細胞外小胞は、カーゴを積載され得る、又はカーゴを含有し得る。カーゴは、積み荷（ｌｏａｄ）とも呼ばれ、核酸、ペプチド、タンパク質、小分子、糖又は脂質であり得る。カーゴは、天然には生じない又は合成の分子であり得る。カーゴは、治療分子、例えば治療オリゴヌクレオチド、ペプチド、小分子、糖又は脂質であり得る。いくつかの場合では、カーゴは治療分子、例えば検出可能部分又は可視化剤でない。カーゴは、その標的細胞に送達された後に標的細胞において治療効果を発揮し得る。例えば、カーゴは、標的細胞で発現される核酸であり得る。それは、特定の遺伝子又は目的のタンパク質の発現を阻害又は増強するために作用し得る。例えば、タンパク質又は核酸を使用して、遺伝子サイレンシング又は修飾のために標的遺伝子を編集することができる。

【0115】

好ましくは、カーゴは外因性分子であり、「非内因性物質」と呼ばれることもある。言い換えると、カーゴは、細胞外小胞、又はそれが由来する細胞で天然には生じない分子である。そのようなカーゴは、好ましくは、細胞によって積載又は産生されるのではなく、小胞が形成された後に細胞外小胞へと積載され、それによりそれは細胞外小胞内にも含有される。

【0116】

いくつかの場合では、カーゴは核酸であり得る。カーゴは、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。カーゴは、ＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、治療用ＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、化学合成又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって産生される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、又は長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であり得る。いくつかの場合では、カーゴは、例えば内因性核酸配列、例えば転写因子、ｍｉＲＮＡ又は他の内因性ｍＲＮＡに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0117】

カーゴは、目的の分子をコードし得る。例えば、カーゴは、Ｃａｓ９又は別のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡであり得る。
細胞では、アンチセンス核酸は相当するｍＲＮＡにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞が二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないため、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を干渉する。遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳を阻害するアンチセンス法の使用は、当技術分野で周知である（例えば、Ｍａｒｃｕｓ－Ｓａｋｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８年，１７２：２８９を参照）。さらに、ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子が使用され得る。アンチセンス核酸は一本鎖又は二本鎖核酸であり得る。アンチセンス核酸の非限定的な例は、ｓｉＲＮＡ（それらの誘導体又は前駆体、例えばヌクレオチド類似体を含む）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓａＲＮＡ（小型活性化ＲＮＡ）及び小型核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）又は特定のそれらの誘導体又は前駆体を含む。アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を刺激し得る。

【0118】

したがって、アンチセンス核酸カーゴは、標的遺伝子の転写を干渉し、標的ｍＲＮＡの翻訳を干渉し、及び／又は標的ｍＲＮＡの分解を促進し得る。いくつかの場合では、アンチセンス核酸は標的遺伝子の発現の減少を誘導することができる。

【0119】

本明細書で提供する「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「小型ＲＮＡ」、又は「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、その二本鎖ＲＮＡは、遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞で発現される場合、遺伝子又は標的遺伝子の発現を低減又は阻害する能力を有する。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成する核酸の相補性部分は、典型的には実質的又は完全な同一性を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉは、標的遺伝子と実質的又は完全な同一性を有する核酸であり、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。実施形態では、ｓｉＲＮＡは、相補的な細胞のｍＲＮＡと干渉し、それにより相補的なｍＲＮＡの発現を干渉することによって遺伝子発現を阻害する。典型的には、核酸は、少なくとも約１５～５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補性配列は１５～５０ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５～５０塩基対長である）。いくつかの実施形態では、長さは２０～３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０～２５又は約２４～２９ヌクレオチド長、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。

【0120】

ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎａら、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１７年；１３（２）：４８～５７頁に記載される。アンチセンス核酸分子は、標的核酸配列に相補的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は部分的二本鎖ＲＮＡ、例えばＦＨＲ－４を含有し得る。二本鎖ＲＮＡ分子は、分子内の第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の間の相補性対合によって形成される。ＲＮＡ配列（すなわち、一部）の長さは、通常３０ヌクレオチド長より短い（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０又はそれより少ないヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列の長さは１８～２４ヌクレオチド長である。いくつかのｓｉＲＮＡ分子では、ＲＮＡ分子の相補性の第１及び第２の部分は、ヘアピン構造の「ステム」を形成する。２つの部分は連結配列によって結合され、ヘアピン構造の「ループ」を形成し得る。連結配列は、長さが様々であってよく、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３ヌクレオチド長であり得る。好適な連結配列は、当技術分野で公知である。

【0121】

本発明の方法での使用のための好適なｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野で公知のスキームによって設計することができ、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年 ４１１：４９４～８頁；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４年 ３１６（４）：１０５０～８頁；及びＲｅｙｎｏｌｄｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００４年、２２（３）：３２６～３０頁を参照されたい。ｓｉＲＮＡ分子を作製する詳細は、いくつかの供給業者、例えばＡｍｂｉｏｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅのウェブサイトで見出すことができる。任意の可能なｓｉＲＮＡ候補の配列は、一般に、ＢＬＡＳＴアライメントプログラムを使用して、他の核酸配列又は核酸配列の多型への任意の可能なマッチを調べることができる（国立医学図書館のインターネットウェブサイトを参照）。典型的には、多くのｓｉＲＮＡが生成及びスクリーニングされ、有効な薬物候補が得られ、米国特許第７，０７８，１９６号を参照されたい。ｓｉＲＮＡは、ベクターから発現され、及び／又は化学的若しくは合成的に産生され得る。合成ＲＮＡｉは、市販の供給源、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ）から得ることができる。ＲＮＡｉベクターは、市販の供給源、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからも得ることができる。

【0122】

核酸分子は、ｍｉＲＮＡであり得る。用語「ｍｉＲＮＡ」は、その明白な通常の意味に従って使用され、転写後に遺伝子発現を制御することができる小さい非コードＲＮＡ分子を指す。一実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子と実質的又は完全な同一性を有する核酸である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは相補的な細胞のｍＲＮＡと干渉し、それにより相補的なｍＲＮＡの発現を干渉することによって遺伝子発現を阻害する。典型的には、ｍｉＲＮＡは、少なくとも約１５～５０ヌクレオチド長である（例えば、ｍｉＲＮＡの各相補性配列は１５～５０ヌクレオチド長であり、ｍｉＲＮＡは約１５～５０塩基対長である）。いくつかの場合では、核酸は合成又は組換え体である。

【0123】

本明細書に開示する核酸は、１つ又は複数の修飾、又は天然には生じないエレメント若しくは核酸を含み得る。好ましい態様では、核酸は、２’－Ｏ－メチル類似体を含む。いくつかの場合では、核酸は、３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結又は他のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの場合では、核酸は、ＡＲＣＡキャップを含む。他の化学修飾核酸又はヌクレオチド、例えば、２’位の糖修飾、２’－Ｏ－メチル化、２’－フルオロ修飾、２’ＮＨ_２修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４－チオウリジンの置換、５－ブロモの置換、又は５－ヨード－ウラシル、骨格修飾、メチル化、異常な塩基対の組合せ、例えばイソシチジン及びイソグアニジン等を使用することができる。修飾は、３’及び５’修飾、例えばキャッピングも含み得る。例えば、核酸は、ＰＥＧ化され得る。

【0124】

本発明の方法で有用な核酸は、発癌性ｍｉＲＮＡ（ｏｎｃｏｍｉＲとしても公知）又は転写因子を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｇＲＮＡを含む。カーゴは、リボザイム又はアプタマーであり得る。いくつかの場合では、核酸はプラスミドである。

【0125】

核酸分子は、アプタマーであり得る。本明細書で使用する場合、用語「アプタマー」は、タンパク質、ペプチド、及び小分子に（例えば、高い親和性及び特異性で）結合する、オリゴヌクレオチド（例えば、短鎖オリゴヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）を指す。典型的には、アプタマーは、相補性塩基対を形成するそれらの傾向により、二次又は三次構造を規定し、したがって、多様で複雑な分子構造へと折りたたむことができることが多い。三次元構造は、アプタマー結合親和性及び特異性に必須であり、特異的な三次元の相互作用はアプタマー－標的複合体の形成を駆動する。アプタマーは、指数関数的な濃縮（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ、Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ、Ｎａｔｕｒｅ １９９０年、３４６＊：８１８～８２２頁；Ｔｕｅｒｋ Ｃ，Ｇｏｌｄ Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０年、２４９：５０５～５１０頁に記載のＳＥＬＥＸ）によるリガンドの全身進化のプロセスにより、又はＳＯＭＡｍｅｒ（ｓｌｏｗ ｏｆｆ－ｒａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｐｔａｍｅｒｓ）（Ｇｏｌｄ Ｌら（２０１０年）Ａｐｔａｍｅｒ－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（１２）：ｅ１５００４）の開発により、無作為配列の非常に大きなライブラリーからｉｎ ｖｉｔｒｏで選択され得る。

【0126】

本明細書に記載の特定の態様では、カーゴは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡに相補性であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列と配列が相補性である少なくとも一部を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列に結合し、それにより阻害し得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列の翻訳プロセスを阻害し得る。ｍｉＲＮＡは、がんと関連するｍｉＲＮＡ（Ｏｎｃｏｍｉｒ）であり得る。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２５ｂであり得る。ＡＳＯは、配列５’－ＵＣＡＣＡＡＧＵＵＡＧＧＧＵＣＵＣＡＧＧＧＡ－３’を含み得る、又はからなり得る。

【0127】

いくつかの態様では、カーゴは、遺伝子編集システムの１つ又は複数の成分である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システム。例えば、カーゴは、特定の標的配列を認識する核酸を含み得る。カーゴは、ｇＲＮＡであり得る。そのようなｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集において有用であり得る。カーゴは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ又はＣａｓ９をコードするプラスミドであり得る。他の遺伝子編集分子は、カーゴ、例えばｚｉｎｃフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写活性化因子用エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）として使用され得る。カーゴは、標的細胞において特定の核酸配列を標的化するように操作された配列を含み得る。遺伝子編集分子は、特異的にｍｉＲＮＡを標的化し得る。例えば、遺伝子編集分子は、ｍｉＲ－１２５ｂを標的化するｇＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、配列５’－ＣＣＵＣＡＣＡＡＧＵＵＡＧＧＧＵＣＵＣＡ－３’を含み得る、又はからなり得る。

【0128】

いくつかの実施形態では、方法は、部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を使用する標的遺伝子編集を用いる。ＳＳＮを使用する遺伝子編集は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｉｄ ａｎｄ Ｍａｈｆｏｕｚ，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６年１０月；４８（１０）：ｅ２６５に概説される。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を創出することができる酵素は、操作され、目的の標的核酸配列にＤＳＢを導入することができる。ＤＳＢは、しばしばヌクレオチドの挿入又は欠失によって切断の２つの末端が再結合される、誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され得る。あるいは、ＤＳＢは、切断部位に相同な末端を有するＤＮＡ鋳型がＤＳＢの部位に供給及び導入される、高度相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復され得る。

【0129】

操作され、標的核酸配列特異的ＤＳＢを生成することができるＳＳＮは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びクラスター化規則的間隔回文反復配列／ＣＲＩＳＰＲ関連９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムを含む。

【0130】

ＺＦＮシステムは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵｍｏｖら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２０１０年）１１（９）：６３６～４６頁に概説される。ＺＦＮは、プログラム化可能なＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメイン）を含む。ＤＮＡ結合ドメインは、標的核酸配列に結合することができるＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒアレイをスクリーニングすることによって同定され得る。

【0131】

ＴＡＬＥＮシステムは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｈｆｏｕｚら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．（２０１４年）１２（８）：１００６～１４頁に概説される。ＴＡＬＥＮは、プログラム化可能なＤＮＡ結合ＴＡＬＥドメイン及びＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメイン）を含む。ＴＡＬＥは、反復可変二残基（ＲＶＤ）である各反復の１２位及び１３位における２つの残基以外は同一である、３３～３９アミノ酸の反復からなる反復ドメインを含む。各ＲＶＤは、以下の関係に従って標的ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドへの反復の結合を決定する：「ＨＤ」はＣに結合し、「ＮＩ」はＡに結合し、「ＮＧ」はＴに結合し、「ＮＮ」又は「ＮＫ」はＧに結合する（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９年）３２６（５９５９）：１５０１頁）。

【0132】

ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化規則的間隔短鎖回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）の略語である。用語は、これらの配列の起源及び機能が分かっていない場合、及びそれらが原核生物起源であると考えられる場合、まず使用される。ＣＲＩＳＰＲは、回文配列リピート（ヌクレオチドの配列が両方向で同じである）において短い反復の塩基配列を含有するＤＮＡのセグメントである。各反復は、ウイルス又はプラスミドからの外来ＤＮＡの事前の挿入からのスペーサーＤＮＡの短いセグメントが続く。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子の小さいクラスターは、ＣＲＩＳＰＲ配列の隣に位置する。スペーサー配列を持つＲＮＡは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質が外来病原性ＤＮＡを認識及び切断するのを助ける。他のＲＮＡガイドＣａｓタンパク質は外来ＲＮＡを切断する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの簡単なバージョン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、改変されゲノムを編集する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び全身ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に送達することにより、細胞のゲノムは所望の位置で切断され、既存の遺伝子の除去及び／又は新しい遺伝子の追加を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは２つのクラスに分けられる。クラス１システムは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用し、外来核酸を分解する。クラス２システムは、同じ目的のために単一の大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス１は、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型に分けられる；クラス２は、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型に分けられる。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する。

【0133】

いくつかの態様では、ＥＶは、ＣＲＩＳＰＲ関連カーゴを積載される。言い換えると、ＥＶは、遺伝子編集、例えば治療遺伝子編集を含む方法で有用である。いくつかの場合では、ＥＶはｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子編集に有用である。

【0134】

カーゴはガイドＲＮＡであり得る。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ｃｒＲＮＡは、活性型複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡに結合する領域と一緒に宿主ＤＮＡの正確な部分に位置するガイドＲＮＡを含有する。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡに結合し、活性型複合体を形成する。ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を結合させ、それにより活性型複合体をコードする。ｇＲＮＡは、複数のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、目的の配列又は遺伝子に結合するように設計され得る。ｇＲＮＡは、切断のための遺伝子を標的化し得る。任意選択で、ＤＮＡ修復鋳型の任意選択の部分が含まれる。修復鋳型は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同修復（ＨＤＲ）のいずれかで利用され得る。

【0135】

カーゴは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼは、その活性化形態がＤＮＡを修飾することができるタンパク質である。ヌクレアーゼバリアントは、一本鎖ニック、二本鎖切断、ＤＮＡ結合又は他の異なる機能が可能である。ヌクレアーゼは、ＤＮＡ部位を認識し、部位特異的ＤＮＡ編集を可能にする。

【0136】

ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼは、プラスミドにコードされ得る。言い換えると、ＥＶカーゴは、ｇＲＮＡとヌクレアーゼの両方をコードするプラスミドを含み得る。いくつかの場合では、ＥＶはｇＲＮＡを含有し、別のＥＶはヌクレアーゼを含有又はコードする。いくつかの場合では、ＥＶは、ｇＲＮＡをコードするプラスミド、及びヌクレアーゼをコードするプラスミドを含有する。したがって、いくつかの態様では、組成物はＥＶを含んで提供され、ＥＶの部分はＣａｓ９などのヌクレアーゼを含み又はコードし、ＥＶの部分はｇＲＮＡを含む又はコードする。いくつかの場合では、ｇＲＮＡを含む又はコードするＥＶを含有する組成物及びヌクレアーゼをコードする又は含有するＥＶを含有する組成物は、同時投与される。いくつかの場合では、組成物はＥＶを含み、ＥＶはｇＲＮＡとヌクレアーゼの両方をコードするオリゴヌクレオチドを含有する。

【0137】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び関連システム、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ２及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ３は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｄｅら、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（２０１７年）８（３）：２６５～２７３頁に概説される。これらのシステムは、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１等）及び一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子を含む。ｓｇＲＮＡは操作され、目的の核酸配列にエンドヌクレアーゼ活性を標的化することができる。

【0138】

いくつかの場合では、核酸は、１つ又は複数の脱分化因子、例えば、「Ｙａｍａｎａｋａ因子」、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＭｙｃをコードする１つ又は複数の核酸をコード又は標的化する。

【0139】

いくつかの場合では、カーゴはペプチド又はタンパク質である。それは組換えペプチド又はタンパク質であり得る。好適なペプチド又はタンパク質は、酵素、例えば遺伝子編集酵素、例えばＣａｓ９、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮを含む。

【0140】

好適な小分子は、細胞傷害性試薬及びキナーゼ阻害剤を含む。小分子は、蛍光プローブ及び／又は金属を含み得る。例えば、カーゴは、超常磁性粒子、例えば酸化鉄粒子を含み得る。カーゴは、超小型超常磁性酸化鉄粒子、例えば酸化鉄ナノ粒子であり得る。

【0141】

いくつかの場合では、カーゴは検出可能部分、例えば蛍光デキストランである。カーゴは、放射活性に標識され得る。
カーゴは、電気穿孔によって細胞外小胞に積載され得る。電気穿孔、又は電気透過（electropermeabilization）は、細胞膜の透過性を増加させるために電界が細胞に適用される微生物学技術であり、化学物質、薬物、又はＤＮＡを細胞に導入することを可能にする。言い換えると、細胞外小胞は、電気穿孔によりカーゴの封入を誘導又は強制され得る。したがって、本明細書に開示する方法は、カーゴ分子の存在下で細胞外小胞を電気穿孔するステップ、又は細胞外小胞とカーゴ分子の混合物を電気穿孔するステップを含み得る。

【0142】

本明細書に開示する他の方法では、カーゴは、超音波処理、超音波、リポフェクション、又は低張性透析によって細胞外小胞へと積載される。
カーゴは、細胞外小胞がタグ付けされる前又は後に、細胞外小胞に積載され得る。

【0143】

組成物
本明細書では細胞外小胞を含む組成物を開示する。
組成物は、ｍｌあたり１０^６～１０^１４個の間の粒子を含み得る。組成物は、ｍｌあたり少なくとも１０^５個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^６個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^７個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^８個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^９個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^１０個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^１１個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^１２個の粒子、ｍｌあたり少なくとも１０^１３個の粒子又はｍｌあたり少なくとも１０^１４個の粒子を含み得る。

【0144】

組成物は、実質的に相同な大きさを有する細胞外小胞を含み得る。例えば、細胞外小胞は、１００～５００ｎｍの範囲の直径を有し得る。いくつかの場合では、マイクロベシクルの組成物は、５０～１０００ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、又は１００～３００ｎｍ、又は１０１～３００ｎｍの範囲の直径を有するマイクロベシクルを含む。好ましくは、直径は、１００～３００ｎｍである。いくつかの組成物では、マイクロベシクルの平均直径は、１００～３００ｎｍ、好ましくは１５０～２５０ｎｍ、好ましくは約２００ｎｍである。

【0145】

タグは組成物の実質的に全ての細胞外小胞に結合されることが望ましいが、本明細書に開示する組成物は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％の細胞外小胞がタグを含む、細胞外小胞を含み得る。好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％の細胞外小胞がタグを含む。いくつかの場合では、組成物内の異なる細胞外小胞は、異なるタグを含む。いくつかの場合では、細胞外小胞は同じ、又は実質的に同じタグを含む。

【0146】

いくつかの組成物では、タグを含むことに加えて、細胞外小胞がカーゴを含有する。そのような組成物中でカーゴは、組成物中の実質的に全ての細胞外小胞へと封入されることが望ましいが、本明細書に開示する組成物は、細胞外小胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％がカーゴを含有する、細胞外小胞を含み得る。好ましくは、細胞外小胞の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％がカーゴを含有する。いくつかの場合では、組成物中の異なる細胞外小胞は異なるカーゴを含有する。いくつかの場合では、細胞外小胞は、同じ、又は実質的に同じカーゴ分子を含有する。

【0147】

組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、１つ又は複数の細胞外小胞、及び任意選択により薬学的に許容される担体を含み得る。医薬組成物は、投与の特定の経路による投与のために製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮内、皮下、鼻腔内又は他の投与経路のために製剤化され得る。

【0148】

組成物は緩衝溶液を含み得る。組成物は、保存化合物を含み得る。組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。
処置の方法及び細胞外小胞の使用
本明細書に開示する細胞外小胞は、処置の方法に有用である。特に、方法は、標的遺伝子と関連する障害を患う対象を処置するために有用であり、方法は、有効量の修飾した細胞外小胞を前記対象に投与するステップを含み、修飾した細胞外小胞はその表面に結合する分子を含み、標的細胞において標的遺伝子と相互作用するための非内因性物質を封入する。非内因性物質は、前記処置のための核酸であり得る。

【0149】

本明細書に開示する細胞外小胞は、遺伝的障害、炎症性疾患、がん、自己免疫障害、心血管疾患又は胃腸疾患の処置のために特に有用である。いくつかの場合では、障害は、サラセミア、鎌状赤血球貧血、又は遺伝的代謝障害から選択される遺伝的障害である。いくつかの場合では、細胞外小胞は、肝臓、骨髄、肺、脾臓、脳、膵臓、胃又は腸の障害の処置に有用である。

【0150】

特定の態様では、細胞外小胞は、がんの処置に有用である。本明細書に開示する細胞外小胞は、がん細胞の成長又は増殖を阻害するために有用であり得る。がんは、液体又は血液のがん、例えば白血病、リンパ腫又は骨髄腫であり得る。他の場合では、がんは、固形がん、例えば乳がん、肺がん、肝臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、腎臓がん又は神経膠腫であり得る。いくつかの場合では、がんは、肝臓、骨髄、肺、脾臓、脳、膵臓、胃又は腸に局在する。

【0151】

障害に応じて標的細胞が処置される。例えば、標的細胞は、乳がん細胞、結腸直腸がん細胞、肺がん細胞、腎臓がん細胞等であり得る。カーゴは、標的遺伝子の発現を阻害又は増強する、又は特定の遺伝子をサイレンスにする遺伝子編集を実施するための核酸であり得る。

【0152】

本明細書に記載の細胞外小胞及び組成物は、限定はされないが、全身、腫瘍内、腹腔内、非経口、静脈内、動脈内、皮内、皮下、筋肉内、経口及び鼻腔内を含む、多くの経路によって投与、又は投与のために製剤化され得る。好ましくは、細胞外小胞は、腫瘍内、腹腔内又は静脈内から選択される経路によって投与される。医薬及び組成物は、液体又は固体形態で製剤化され得る。液体製剤は、ヒト又は動物の体の選択された領域への注射による投与のために製剤化され得る。

【0153】

細胞外小胞は、処置される細胞又は組織の表面の分子に結合するタグを含み得る。タグは、処置される細胞又は組織に特異的に結合し得る。細胞外小胞は、治療用カーゴを含み得る。治療カーゴは、標的細胞において標的遺伝子と相互作用するための非内因性物質であり得る。

【0154】

投与は、好ましくは、「治療有効量」であり、これは個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、並びに投与の速さ及び時間経過は、処置される疾患の性質及び重症度による。処置の処方、例えば投与量等の決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法及び医師には公知の他の因子を考慮する。上述の技術及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０００年、ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに見出される。

【0155】

細胞外小胞は、単独で、又は処置される状態に応じて同時若しくは順に他の処置と組み合わせて投与され得る。
本明細書に記載のようにカーゴを積載された細胞外小胞は、カーゴを標的細胞に送達するために使用され得る。いくつかの場合では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法である。特に好ましいｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法では、カーゴは標識する分子又はプラスミドである。

【0156】

処置される対象は、任意の動物又はヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であり得るが、より好ましくはヒトである。対象は男性又は女性であり得る。対象は患者であり得る。治療使用は、ヒト又は動物（家畜への使用）であり得る。

【0157】

キット
本明細書では、細胞外小胞を含む、又は細胞外小胞のタグ付けでの使用のためのキットも開示する。キットは、１つ又は複数の細胞外小胞、タグ又はタグをコードする核酸、例えば細胞培養においてタグを発現する発現ベクター、カーゴ又は細胞外小胞の封入のための非内因性分子、タンパク質リガーゼ及び任意選択でタンパク質リガーゼ緩衝液から選択される１つ又は複数の成分を含み得る。

【0158】

それらの特異的形態又は開示した機能を実施する手段、又は開示した結果を得るための方法若しくはプロセスの面から表された、前述の説明、又は以下の特許請求の範囲、又は添付の図面に開示した特徴は、必要に応じて、別々に又はそのような特徴の任意の組合せで、それらの多様な形態で本発明を実現するために利用され得る。

【0159】

本発明は上記の例示的な実施形態と併せて記載されるが、この開示を与えられた場合、多くの同等の改変及びバリエーションが当業者には明らかであろう。したがって、上に記載した本発明の例示的な実施形態は、例であり、限定ではないと考えられる。記載した実施形態への様々な変更が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく実施され得る。

【0160】

いずれの疑念も避けるため、本明細書に提供する任意の理論的な説明が読み手の理解を改善する目的のために提供される。本発明者らは、これらのいずれの理論的な説明に縛られることを望まない。

【0161】

本明細書で使用するいずれの節の見出しも、構成目的のためだけであり、記載される主題を制限すると解釈されない。
特許請求の範囲を含む、この明細書を通して、他に文脈を必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、並びにバリエーション、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、言及した整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群の包括を伴うが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の除外ではないと理解されるであろう。

【0162】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈がはっきりと他に示さない限り、複数の参照を含むことに注意しなければならない。範囲は、「約」１つの特定の値から及び／又は「約」別の特定の値までとして本明細書で表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行する「約」の使用により、値がおよそとして表される場合、特定の値は別の実施形態を形成すると理解されるであろう。用語「約」は、数値に関して、任意選択であり、例えば＋／－１０％を意味する。

【実施例】

【0163】

実施例１
治療的送達のため、多くの研究グループががん細胞株及び幹細胞からＥＶを産生することを試みたが、ラージスケールの細胞培養により非常にコストがかかる。さらに、がん及び幹細胞からのＥＶは、がんの成長を促進する発癌性タンパク質又は成長因子を含有し得る。血漿及び血液細胞からのＥＶは、がん治療により安全である。本発明者らは、近年、赤血球（ＲＢＣ）からのＥＶのラージスケール精製及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）を含むがんに対する遺伝子治療のためのこれらのＥＶへのＲＮＡの取り込みのための強固な方法を開発した。本発明者らは、ＲＢＣＥＶがＡＭＬとＴＮＢＣ細胞の両方によって非常によく取り込まれ、市販のトランスフェクション試薬よりも低い毒性で、良いトランスフェクション効率を与えることを示した。本発明者らは、発癌性ｍｉＲ－１２５ｂを阻害し、ＡＭＬ及びＴＮＢＣの進行を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＲＢＣＥＶが送達する、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＢＣＥＶの取り込みも観察した。ＲＢＣＥＶは、白血病細胞におけるゲノム編集のためのＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを送達するためにも使用される。このプラットフォームは、がんに対する遺伝子治療に非常に有望である。

【0164】

ＥＶベースの治療をより特異的にするため、ＥＶは、特定の標的細胞に特異的に結合するペプチド又は抗体を持つように操作されることが多い。^５通常、これらのペプチド又は抗体は、レトロウイルス又はレンチウイルスを使用してトランスフェクト又は形質導入後、抗生物質ベース又は蛍光ベースで選択されるプラスミドからドナー細胞において発現される。^３これらの方法は、高発現されたプラスミドがＥＶに組み込まれ、最終的に標的細胞へと移行されやすいため、遺伝子水平伝播の高いリスクを提起する。プラスミドの遺伝子エレメントは、発癌をもたらし得る。安定な細胞株にＥＶを産生させる場合、変異ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を含む豊富な発癌性因子がＥＶに詰め込まれ、腫瘍発生のリスクを標的細胞に送達する。一方、リボソームの欠如により、ＲＢＣではプラスミドが転写できないため、遺伝子操作方法はＲＢＣに適用できない。それは、トランスフェクト又は形質導入が難しい幹細胞及び初代細胞にも適用できない。

【0165】

近年、ＥＶの表面のフォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するラクトアドへリンのＣ１Ｃ２ドメインに融合した抗体でＥＶをコーティングするための新しい方法がある。^６この方法は、いかなる遺伝的改変もなく、抗体とのＥＶのコンジュゲーションを可能にする。^６しかしながら、Ｃ１Ｃ２は疎水性タンパク質であり、哺乳動物細胞における面倒な精製方法及びウシ血清アルブミン含有緩衝液中での保存を必要とする。さらに、Ｃ１Ｃ２融合抗体とのＥＶのコンジュゲーションは、一時的なＣ１Ｃ２とＰＳの間の親和性結合に基づく。標的化又は治療タンパク質とのＥＶの安定及び永続的なコンジュゲーションを得るため、本発明者らは、化学又は酵素反応を使用して共有結合を生成するコンジュゲーション方法を必要とする。

【0166】

本発明者らは、先に、トランスペプチダーゼソルターゼを使用して、ペプチド及びヒト、ラクダ又は軟骨魚類に由来する単一免疫グロブリンドメインを有するタンパク質である単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を、ＲＢＣ表面タンパク質のソルターゼ認識モチーフを操作したＲＢＣの表面に共有結合させた。^７より最近の研究では、ソルターゼは多くのペプチドを結合することができ、全てはソルターゼ認識配列によってそれらのＣ末端に伸長され、ＲＢＣ表面のＮ末端グリシン残基を有するタンパク質を修飾しないことを明らかにした。^８したがって、ソルターゼは、細胞表面のＮ末端グリシンを有する天然のタンパク質を、Ｃ末端ソルターゼタグを持つタンパク質又はペプチドと共有結合によりライゲートすることができる。^８本発明者らは、ＲＢＣＥＶの表面のＮ末端グリシン及び／又は側鎖アミノ基を有する天然のタンパク質が、ソルターゼの基質として作用し得ると仮定した。したがって、本発明者らはソルターゼ及び同様のタンパク質リガーゼ酵素を使用して、ＲＢＣＥＶをペプチド、小分子、タンパク質及びｓｄＡｂでコートすることができる。

【0167】

ここで、本発明者らは、ソルターゼＡを使用するＥＶ表面の酵素修飾の方法を記載する。ソルターゼ結合部位を含有する小分子（例えば、ビオチン）及びｓｄＡｂとコンジュゲートしたペプチドは、安定な共有結合によってＥＶ表面のタンパク質に結合される。これは、治療目的のため、特定の細胞型へのＥＶの標的化送達を可能にする。

【0168】

結果
ソルターゼＡを使用するｓｄＡｂとのＥＶのコンジュゲーション
本発明者らは、各成分の精製、ソルタグ付け反応及びＥＶのソルタグ付きタンパク質の検出を含む、ペプチド及びｓｄＡｂとのＥＶのコンジュゲーションの簡単なワークフローを開発した（図１Ａ）。ソルターゼＡは、大腸菌においてＨｉｓタグと共に発現させ、約１００％の純度で１Ｌの細菌培養から約２７ｍｇのタンパク質に親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した（図１Ｂ）。同様に、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣ－ｓｄＡｂ）に特異的なｓｄＡｂは、大腸菌においてＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ及びｓｏｒｔａｓｅ結合部位（ＬＰＥＴＧ）と共に発現させ、１Ｌの培養から８ｍｇの純粋なタンパク質の収率で、ソルターゼＡと同じプロトコールを使用して精製した。１５個又はそれ以上のアミノ酸をＶＨＨとソルターゼ結合部位の間に挿入し、ソルターゼへのソルターゼ結合部位の到達可能性及び可動性を増加した。ｓｄＡｂは、精製後、明確な２０ｋＤａの単一バンドとして現れた（図１Ｃ）。

【0169】

ＲＢＣＥＶは、カルシウムイオノフォアを使用するＥＶ放出の刺激、細胞及び残渣を除去する分画遠心分離、並びに１回のスクロースクッションを含む３回の超遠心分離を含む、本発明者らが確立したプロトコールに従って精製した。^４Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ解析は、複数のドナーから精製したＲＢＣＥＶが、１００～３００ｎｍの範囲の直径で非常に一貫していることを実証した（図１Ｄ）。ＥＶは、透過型電子顕微鏡下では、典型的なカップ形であり、タンパク質凝集のない、明確な二重層膜小胞として現れた（図１Ｅ）。

【0170】

ウェスタンブロット解析のために抗Ｈｉｓタグ抗体（ＶＨＨにも結合する）を使用して、本発明者らは、ソルターゼＡ及びｍＣ－ｓｄＡｂをそれぞれ１８ｋＤａ及び２０ｋＤａのバンドとして見出した（図１Ｆ）。驚くべきことに、ソルターゼＡ及びｍＣ－ｓｄＡｂとのＲＢＣＥＶのインキュベート後、本発明者らは、ソルターゼＡのみ又はｍＣ－ｓｄＡｂのみとのＲＢＣＥＶのインキュベーション後にはなかった約４０ｋＤａ及び７０ｋＤａのさらなるバンドを観察した。ソルタグ付け反応後に現れた新しいバンドは、ソルターゼＡによるｍＣ－ｓｄＡｂとＲＢＣＥＶのタンパク質の会合を示す。この会合は、変性条件下で安定であり、ｍＣ－ｓｄＡｂがＲＢＣＥＶのタンパク質にソルタグ付け反応によって生成された共有結合によって結合することを示している。

【0171】

ソルターゼＡを使用するペプチドとのＥＶのコンジュゲーション
本発明者らは、ＲＢＣＥＶがペプチドによってソルタグ付けされ得るかどうかさらに試験した。本発明者らは、マクロファージによる食作用を避ける「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルであるＣＤ４７由来であるため、「自己ペプチド」として公知のペプチドのＣ末端にソルターゼＡ結合部位を付加した。^１０このペプチドは、Ｎ末端にビオチンタグも有する。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用するウェスタンブロット解析では、本発明者らは、そのペプチドが単独で積載された場合にはそのサイズの小ささ（２．４ｋＤａ）により検出できなかったが、ＲＢＣＥＶをペプチド及びソルターゼＡとインキュベートした場合、ソルターゼプラスペプチドのサイズに相当する約２０ｋＤａの太いバンドを観察し、これはソルタグ付け反応の中間産物であるはずである（図２Ａ）。さらに、本発明者らは、ペプチド及びソルターゼＡとインキュベートしたＲＢＣＥＶでは２５ｋＤａ～７５ｋＤａの範囲の複数のバンドを観察した（図２Ａ）。これらのバンドは、ビオチン化ペプチドでソルタグ付けされたＲＢＣＥＶの表面のタンパク質であるはずである。同様に、本発明者らは、多くの型の固形がんで高発現される表面タンパク質である上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）へのその結合が周知である別のペプチドにソルターゼ結合部位を付加した。^１１ビオチンタグも、化学合成によってペプチドのＮ末端に付加した（以降、ｂｉ－ＹＧ２０ペプチドと呼ぶ）。本発明者らは、３人のドナーから独立して精製したＲＢＣＥＶの３つの異なるバッチにＹＧ２０ペプチドをソルタグ付けし、第３の試料の１つの追加のバンド以外、３つの試料においてソルタグ付きタンパク質の同様のバンドを見出した。この観察は、一貫してソルターゼＡと反応するＮ末端のグリシン残基を含有する全てのドナーからの表面ＲＢＣＥＶのいくつかの豊富なタンパク質を示した。

【0172】

ソルタグ付けの効率を評価するため、本発明者らは、ｂｉ－ＹＧ２０コートＥＶをラテックスビーズとインキュベートし、ビーズをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）コンジュゲートストレプトアビジンで染色した。ＦＡＣＳ解析は、９６％のビーズがＡＦ６４７陽性であることを実証し、ほとんどのＥＶがビオチン化ペプチドをうまくコンジュゲートされたことを示している（図２Ｃ）。

【0173】

質量分析を使用して、本発明者らは、ＲＢＣＥＶで非常に豊富であり、ＲＢＣにおけるそれらの発現も公知の１２個の膜タンパク質を含む、ほぼ２０個のタンパク質を同定した（図２Ｄ）。ソルターゼＡと反応する膜タンパク質を同定するため、本発明者らはストレプトアビジンビーズを使用して、ビオチン化ペプチドとコンジュゲートしたＲＢＣＥＶ膜溶解物中のタンパク質をプルダウンした。本発明者らは、ビオチン－ストレプトアビジン複合体に濃縮された、ＳＴＯＭ、ＧＬＵＴ１及びＭＰＰ１を含む３個のタンパク質を同定した（図２Ｅ）。これらのタンパク質は、ウェスタンブロットを使用して観察されたいくつかのタンパク質と同様の分子量（３１．９、５４．４及び５２．５ｋＤａ）を有し、それらはＲＢＣＥＶで検出された豊富なタンパク質であり、したがってそれらはソルターゼＡと反応するタンパク質である可能性が高い。

【0174】

ＥＧＦＲ結合ペプチドによるＥＶのソルタグ付けはＥＧＦＲ陽性乳がん細胞によるＥＶの取り込みを促進する
乳がん細胞によるＥＶの取り込みを試験するため、本発明者らはＲＢＣＥＶを蛍光膜色素であるＰＫＨ２６で標識し、上記のようにｂｉ－ＹＧ２０ペプチドで標識したＲＢＣＥＶをソルタグ付けした。標識及びソルタグ付きＲＢＣＥＶを、１回のスクロースクッションを含む２回の超遠心分離によって広範に洗浄した。本発明者らは、ＳＫＢＲ３細胞を最適以下の用量の標識ＲＢＣＥＶ（９９％の取り込みを示したＭＯＬＭ１３細胞で使用した半分）とインキュベートし^４、インキュベーションの２４時間後の細胞においてＰＨＫ２６蛍光を解析した（図３Ａ）。蛍光バックグラウンドは、標識ＲＢＣＥＶの最後の洗浄の上清に基づいて決定した。ＥＧＦＲの発現が取り込みに重要であるかどうか試験するため、本発明者らは、細胞をＦＩＴＣとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ抗体でも染色し、ＳＫＢＲ３細胞の２つの集団：ＥＧＦＲ発現の低いもの及びＥＧＦＲ発現の高いものにゲートをかけた（図３Ｂ）。結果として、ＰＫＨ２６陽性細胞のパーセンテージは、ＥＧＦＲ^低集団とＥＧＦＲ^高集団の両方において、非コートのＲＢＣＥＶによる処置と比較して、ｂｉ－ＹＧ２０コートＲＢＣＥＶで処置したＳＫＢＲ３細胞で著しく高かった（図３Ａ、３Ｃ）。ＥＧＦＲのより高い発現も、ｂｉ－ＹＧ２０コートＲＢＣＥＶの取り込みに著しい差をもたらした（図３Ａ、３Ｃ）。したがって、ＹＧ２０ペプチドとのＲＢＣＥＶのコンジュゲーションは、ＥＧＦＲ陽性乳がん細胞によるＥＶの特異的な取り込みを促進した。

【0175】

ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用するペプチドとのＲＢＣＥＶのコンジュゲーション
本発明者らは、ＴＲＮＧＬ配列を担持するペプチドとＲＢＣＥＶのコンジュゲーションのためのタンパク質リガーゼであるＯａＡＥＰ１をさらに試験した。ここで、本発明者らは、速い触媒動態を示す、Ｃｙｓ２４７Ａｌａ改変を有するＯａＡＥＰ１のバリアントを使用した。^１２本発明者らは、親和性クロマトグラフィー及びＳＥＣを使用してＯａＡＥＰ１を精製し、Ｈｉｓ－Ｕｂタグあり及びなしの純粋な酵素を得た（図４Ａ）。酵素をＲＢＣＥＶ及び／又はＯａＡＥＰ１結合配列「ＮＧＬ」を含有するペプチドとインキュベートした。ペプチドとのＲＢＣＥＶの反応は、ライゲートしたＲＢＣＥＶを３回の広範な洗浄にかけた後でさえも、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンで検出される、３５ｋＤａから約５５ｋＤａ～２００ｋＤａの範囲の複数のタンパク質のバンドをもたらした（図４Ｂ）。これらのバンドは、おそらくＯａＡＥＰ１リガーゼがＣ末端にグリシンとロイシン（ＧＬ）の両方を有するタンパク質のみに作用するため、ソルタグ付け反応から現れるバンドとは異なる。ＦＡＣＳ解析を使用して、本発明者らは、ＲＢＣＥＶコンジュゲーションの効率が、ｂｉ－ＴＲＮＧＬペプチドとのライゲーション反応後にビオチンを有すると考えられるＲＢＣＥＶのパーセンテージとして９９．３％であることを見出した（図４Ｃ）。本発明者らは、リガーゼ結合部位（ＮＧＬ）を含有するビオチン化ＥＧＦＲ標的化ペプチドとのＲＢＣＥＶのライゲーションをさらに試験した。本発明者らのウェスタンブロット解析は、ライゲーション及び３回の洗浄後、３０～４５ｋＤａの突出したバンドを明らかにした（図４Ｄ）。

【0176】

ＲＢＣＥＶにライゲートしたペプチドの数を定量するため、本発明者らは、段階希釈のビオチン化ＨＲＰとライゲートしたＲＢＣＥＶタンパク質からのビオチンシグナルの強度を比較した。この比較は、３人の異なる血液ドナーからのＲＢＣＥＶの平均として、各ＲＢＣＥＶにライゲートした約３８０コピーのＴＲペプチドがあることを示した（図４Ｅ）。

【0177】

これらのデータは、標的細胞型、例えばがん処置のための腫瘍細胞によるＥＶの特異的な取り込みを媒介するタグとして、ｓｄＡｂ及びペプチドとのＥＶのコンジュゲーションのための新しいアプローチを実証した。このアプローチは、副反応を減らして、治療分子、例えば遺伝子治療のためのＲＮＡ及びＤＮＡ、酵素置換療法又はワクチン接種のためのタンパク質、がん処置のための細胞傷害性小分子等の特異的送達を促進し得る（図５～６）。さらに、ＥＶの表面にコートしたペプチド及び抗体は、診断及び治療に直接適用することもできる。

【0178】

ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用するペプチドとの白血病ＥＶのライゲーション
他の型のＥＶを修飾するＯａＡＥＰ１リガーゼの適用を検証するため、本発明者らは、白血病ＴＨＰ１細胞からＥＶを単離した。ＴＨＰ１細胞は、１０％ＥＶフリーのＦＢＳを含有する培地で培養し、終夜カルシウムイオノフォアで処置し、培養上清を増加した速度で複数回遠心分離して細胞及び残渣を除去した。ＴＨＰ１ ＥＶは、スクロースクッションによる超遠心分離を使用して単離し、次いでさらに血清タンパク質の完全除去のためにＳＥＣカラムに通した（図７Ａ）。ＲＢＣＥＶに最適化した同じライゲーションプロトコールを使用して、本発明者らはＴＨＰ１ ＥＶをビオチン化ＴＲＮＧＬペプチドにライゲートし、２５～７５ｋＤａの複数のライゲートしたタンパク質のバンドを生じた（図７Ｂ）。このパターンは、ＴＨＰ１ ＥＶがそれらの膜にＮ末端ＧＬを有する異なるタンパク質を提示し得るため、ＲＢＣＥＶのライゲートしたタンパク質のバンドとは異なる。

【0179】

ＥＧＦＲ結合ペプチドによるＥＶのソルタグ付けは、ＥＧＦＲ陽性肺がん細胞によるＥＶの取り込みを促進する
本発明者らは、５個の異なるヒト細胞株におけるＥＧＦＲの発現をさらに調べ、ＥＧＦＲがＭＯＬＭ１３で陰性であり、乳がんＳＫＢＲ３及びＣＡ１ａ細胞、肺がんＨ３５８及びＨＣＣ８２７細胞を含む固形がん細胞で豊富であることを見出した（図８Ａ）。ビオチン－ストレプトアビジンのＦＡＣＳ解析を使用して、本発明者らは、ストレプトアビジンのみのコントロールと比較して、ビオチン化ＥＧＦＲ標的化ペプチドは肺がんＨ３５８及びＨＣＣ８２７細胞の表面に結合するが、ＭＯＬＭ１３細胞には結合しないことを見出した（図８Ｂ）。スクランブル化配列を有するビオチン化コントロールペプチドは、いずれの試験細胞株にも結合しなかった。

【0180】

細胞によるＲＢＣＥＶの取り込みを試験するため、本発明者らは、蛍光色素であるカルセインＡＭでＲＢＣＥＶを標識し、上記のようにビオチン化ＥＧＦＲ標的化ペプチドで標識ＲＢＣＥＶをソルタグ付けした。標識及びソルタグ付けしたＲＢＣＥＶを、ＳＥＣ及び２回の遠心分離によって広範に洗浄した。本発明者らはＨ３５８細胞を最適以下の用量の標識ＲＢＣＥＶとインキュベートし、インキュベーションの２時間後に細胞のカルセインＡＭ蛍光を解析した（図８Ｃ）。蛍光バックグラウンドは、標識ＲＢＣＥＶの最後の洗浄の上清（フロースルー）に基づいて決定した。結果として、カルセインＡＭ陽性細胞のパーセンテージは、コントロールペプチドコートＲＢＣＥＶによる処置と比較して、ＥＧＦＲ標的化ペプチドコートＲＢＣＥＶで処置したＨ３５８細胞で著しく高かった（図８Ｃ）。したがって、ＥＧＦＲ標的化ペプチドとのＲＢＣＥＶのコンジュゲーションは、ＥＧＦＲ陽性肺がん細胞によるＥＶの特異的取り込みを促進した。

【0181】

ＥＧＦＲ標的化ペプチドとのＲＢＣＥＶのリガーゼ媒介コンジュゲーションは、クラスリン媒介エンドサイトーシスによるＲＢＣＥＶの特異的取り込みを増強する
本発明者らは、ソルターゼＡの代わりにＯａＥＡＰ１リガーゼを使用して上記の実験を繰り返した。予測されたように、Ｈ３５８細胞によるＲＢＣＥＶの取り込みは、コントロールペプチドと比較して、ＥＧＦＲ標的化ペプチドのライゲーションにより著しく増加した（図９Ａ）。取り込みの特異性を調べるため、本発明者らは、高濃度の遊離ＥＧＦＲ標的化ペプチドを、ＥＧＦＲ標的化ペプチドライゲートＲＢＣＥＶとのＨ３５８細胞のインキュベーションに添加した。遊離ペプチドは、ＥＧＦＲへの結合を競合するため、ＲＢＣＥＶのライゲートＥＧＦＲ標的化ペプチドの効果をブロックし（図９Ｂ）、ＥＧＦＲ標的化ペプチドライゲートＲＢＣＥＶの増加はＥＧＦＲ結合を必要とすることを示す。

【0182】

ＲＢＣＥＶ取り込みの経路を同定するため、本発明者らは、３つの異なるエンドサイトーシス阻害剤を、ＥＧＦＲ標的化ペプチドライゲートＲＢＣＥＶとのＨ３５８細胞のインキュベーションに添加した。結果として、クラスリン媒介エンドサイトーシスをブロックするフィリピンのみが、ＥＴライゲートＲＢＣＥＶの取り込みを低下させることができた（図９Ｃ）。したがって、ＥＧＦＲ標的化ペプチドライゲートＲＢＣＥＶの取り込みは、クラスリン媒介エンドサイトーシスによって媒介された。

【0183】

ＥＧＦＲ標的化ペプチドとのＲＢＣＥＶのコンジュゲーションは、ＥＧＦＲ陽性肺腫瘍におけるＲＢＣＥＶの濃縮をもたらす
ＲＢＣＥＶは通常、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞による取り込みにより肝臓に蓄積するため、本発明者らは、ＲＢＣＥＶの注射の前にヒトＲＢＣ又はＲＢＣゴースト（ＲＢＣの膜）の投与によりマウスを前処置することによってＲＢＣＥＶの急速なクリアランスを防ぐことを考えた（図１０Ａ）。本発明者らは、肝臓におけるＲＢＣＥＶの取り込みの低減、並びに肺及び脾臓におけるＲＢＣＥＶの取り込みの増加が、ＲＢＣはＲＢＣゴーストよりも優れていることを観察した。肺がんのｉｎ ｖｉｖｏモデルを生成するため、本発明者らは、ルシフェラーゼ標識Ｈ３５８細胞をＮＳＧマウスの尾静脈に注射した（図１０Ｂ）。３週間後、腫瘍細胞が肺で検出されると、本発明者らは、マウスをＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶで処置し、蛍光画像化を使用してＥＶの体内分布を観察した。腫瘍細胞の生物発光は、Ｈ３５８ルシフェラーゼ細胞の注射の３週間後にＮＳＧマウスの肺で一貫して検出されたが、時折尾静脈注射からの残存細胞による尾を除いて他の臓器でシグナルは検出されなかった。ＲＢＣＥＶを、コントロールペプチド又はＥＧＦＲ標的化ペプチドとコンジュゲートし、次いでＤｉＲ蛍光色素で標識し、ＳＥＣ及び遠心分離を使用して広範に洗浄した。非コート又はコートＲＢＣＥＶは、ヘモグロビンアッセイを使用して定量し、前処置したマウスの尾静脈に均等に注射した。ＥＶ洗浄のフロースルーを使用して蛍光バックグラウンドを決定した。ＲＢＣＥＶ注射の８時間後、本発明者らは、脾臓、肝臓、肺及び骨への非コートＲＢＣＥＶの分布を観察した（図１０Ｂ）。ペプチドコートＲＢＣＥＶは同じ臓器での取り込みを示した。しかしながら、ＥＧＦＲ標的化ペプチドライゲートＲＢＣＥＶの蓄積は、コントロールライゲートＲＢＣＥＶと比較して、肺で著しく増加し、肝臓で減少した（図１０Ｂ）。これらのデータは、ＥＧＦＲ標的化ペプチドが、ＥＧＦＲを発現する肺腫瘍へとＲＢＣＥＶを駆動したことを示す。

【0184】

自己ペプチドとのコンジュゲーションは、ＲＢＣＥＶの食作用を防ぎ、循環におけるＲＢＣＥＶの利用可能性を増強する
図２Ａと同様に、本発明者らは、ＲＢＣＥＶを自己ペプチドとコンジュゲートしたが、ソルターゼＡの代わりにＯａＡＥＰ１リガーゼを使用した。興味深いことに、自己ペプチドとのライゲーションは、単球ＭＯＬＭ１３及びＴＨＰ１細胞によるＲＢＣＥＶの取り込みを著しく低下させた（図１１Ａ～Ｂ）。

【0185】

本発明者らは、自己ペプチドコートＲＢＣＥＶをＣＦＳＥでさらに標識し、それらをＮＳＧマウスの尾静脈に注射した。５分後、本発明者らは、抗ＧＰＡ抗体でコートした磁気ビーズを使用して血液からＲＢＣＥＶを捕捉した（図８Ｂ）。ＧＰＡがヒトＲＢＣＥＶのマーカーであるが、マウスＲＢＣＥＶのマーカーではないため、本発明者らは、注射したヒトＲＢＣＥＶを精製し、マウスＥＶからそれらを分離することを考えた。ＲＢＣＥＶは、磁気ビーズからのＣＦＳＥ蛍光シグナルのＦＡＣＳ解析に基づいて定量した。解析は、注射したマウスの循環において、自己ペプチドライゲートＲＢＣＥＶがコントロールペプチドライゲートＲＢＣＥＶよりもずっと豊富であることを明らかにした（図８Ｂ）。さらに、本発明者らは、ＤｉＲ標識自己ペプチドライゲートＲＢＣＥＶも尾静脈に注射し、肝臓、脾臓、肺、骨及び腎臓を含む複数の臓器でのＲＢＣＥＶの体内分布の増強を観察した（図８Ｃ）。これらのデータは、自己ペプチドとのコンジュゲーションを、ＲＢＣＥＶの循環及び体内分布を増加させるために使用することができることを示す。

【0186】

生体栄養性の単一ドメイン抗体とのＲＢＣＥＶのコンジュゲーションはリンカーペプチドを必要とする
本発明者らは、ｓｄＡｂは特異性が高く、それらが１つのポリペプチドのみを有するために修飾が容易であることが公知であるため、ＲＢＣＥＶの標的化送達をガイドするｓｄＡｂを使用することを考えた。図１に示したｍＣｈｅｒｒｙ ｓｄＡｂに加えて、本発明者らは、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ及びリガーゼ結合部位を有する、ＥＧＦＲに特異的な別のラクダ類のｓｄＡｂ（ＶＨＨとも呼ばれる）を産生した（図１２Ａ）。精製したＥＧＦＲ ＶＨＨは、およそ３７ｋＤａであった。これは生体栄養性の抗体であり、典型的なｓｄＡｂよりも大きい。それは、ＥＧＦＲの２つの高親和性結合部位を有する。

【0187】

ＥＧＦＲ ＶＨＨをＲＢＣＥＶに直接ライゲート試みの複数回の失敗の後（おそらく、ＶＨＨのサイズが大きいことによる）、本発明者らは、リンカーペプチドを設計し、ＶＨＨとＲＢＣＥＶの間に架橋を作製した（図１２Ｂ）。このリンカーペプチドは、中央のＭｙｃタグ、Ｎ末端の「ＧＬ」及びＣ末端の「ＮＧＬ」から構成される。「ＮＧＬ」配列は、ＲＢＣＥＶへのペプチドのライゲーションを促進する。「ＧＬ」配列は、続いて、「ＮＧＬ」によるＶＨＨへのリンカーペプチドのライゲーションを可能にする。本発明者らは、複数のコントロールとのライゲーション反応を実施した。抗ＶＨＨウェスタンブロッティングを使用して、本発明者らは、３７ｋＤａのバンドとして遊離ＶＨＨを観察した（図１２Ｃ）。ＶＨＨへのＯａＡＥＰ１リガーゼの添加は、２つの追加のバンドをもたらし、おそらくＶＨＨの起こり得る切断及びオリゴマー化による。ＲＢＣＥＶを、リンカーペプチドの付加あり又はなしでＶＨＨにライゲートし、ＳＥＣ及び４回の遠心分離を使用して広範に洗浄した。リンカーペプチドを含むＲＢＣＥＶへの２ステップＶＨＨライゲーションにおいて、４５ｋＤａと６０ｋＤａの間のいくつかのタンパク質のバンドが抗ＶＨＨ抗体によって検出された（図１２Ｃ）。これらのバンドは、リガーゼのみとのＶＨＨのインキュベーションによって現れるものとは異なった。リンカーペプチドなしで、ＲＢＣＥＶとのＶＨＨのライゲーションではバンドは観察されなかった。データは、ＲＢＣＥＶへのＥＧＦＲ ＶＨＨのライゲーションがリンカーペプチドの付加を必要とすることを示す。

【0188】

ＥＧＦＲ ＶＨＨコンジュゲーションの結果として、本発明者らは、細胞の表面のＧＰＡのＦＡＣＳ解析に基づき、非コートＲＢＣＥＶと比較して、ＥＧＦＲ陽性ＨＣＣ８２７細胞へのＲＢＣＥＶの結合の増加を観察した（図１２Ｄ）。

【0189】

単一ドメイン抗体とのＲＢＣＥＶのコンジュゲーションは、標的細胞によるＲＢＣＥＶの特異的取り込みを促進する
ＲＢＣＥＶの取り込みへのＶＨＨコンジュゲーションの効果を試験するため、本発明者らはカルセインＡＭでＶＨＨコートＲＢＣＥＶを標識し、ＳＥＣを使用してそれらを洗浄した。カルセインＡＭのＦＡＣＳ解析は、Ｈ３５８細胞によるＲＢＣＥＶの取り込みが、ＲＢＣＥＶがリンカーペプチド及びＥＧＦＲ標的化ＶＨＨと２ステップでライゲートされた場合にのみ増加したことを示した（図１３Ａ）。同様に、本発明者らは、ＲＢＣＥＶへのｍＣｈｅｒｒｙ標的化ＶＨＨのライゲーション及びｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の表面発現を有するＣＡ１ａ細胞によるそれらの取り込みを試験した。ＣＡ１ａ－ＳｍＣｈｅｒｒｙ細胞によるＲＢＣＥＶの取り込みは、リンカーペプチド及びｍＣｈｅｒｒｙ ＶＨＨにライゲートしたＲＢＣＥＶでのみ増加した（図１０Ｂ）。ＶＨＨライゲーションにおけるリンカーペプチドの欠如は、いずれの取り込みの増強ももたらさなかった。したがって、リンカーペプチドは、ＲＢＣＥＶへのＶＨＨライゲーションに必要である。

【0190】

ｓｄＡｂライゲートＲＢＣＥＶを使用するＲＮＡ及び薬物の送達
本発明者らは、以前に、ＲＢＣＥＶがＡＳＯ、ｇＲＮＡ又はｍＲＮＡをがん細胞に送達するために使用され得ることを示した。ここで、本発明者らは、ライゲーション反応とＲＮＡ積載実験を組み合わせた。本発明者らは、ＲＢＣＥＶがまずコンジュゲートされ、遠心分離を使用して２回洗浄され、続いてＥＶトランスフェクション試薬、例えばＥｘｏＦｅｃｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＲＮＡを積載される必要があることを見出した。したがって、本発明者らはＥＧＦＲ ＶＨＨ又はｍＣｈｅｒｒｙ ＶＨＨをＲＢＣＥＶにライゲートし、それらにルシフェラーゼｍＲＮＡを積載した（図１４Ａ）。ＥＧＦＲを発現するがｍＣｈｅｒｒｙは発現しないＨ３５８細胞をこれらのＲＢＣＥＶによって処置し、２４時間後にルシフェラーゼ活性を比較した。全てのＲＢＣＥＶ処置細胞が未処置コントロールよりも高いルシフェラーゼシグナルを示したが、非コートＲＢＣＥＶ又はｍＣｈｅｒｒｙ ＶＨＨとライゲートしたＲＢＣＥＶによる処置の後よりも、ＥＧＦＲ ＶＨＨとライゲートしたＲＢＣＥＶは、Ｈ３５８細胞において２倍高いルシフェラーゼ活性をもたらした（図１４Ａ）。したがって、ＲＢＣＥＶは、ＥＧＦＲ ＶＨＨとのそれらのコンジュゲーション時に増加した効率でルシフェラーゼｍＲＮＡをＨ３５８細胞に送達できた。

【0191】

本発明者らは、肺がん処置のために一般に使用される化学療法剤であるパクリタキセル（ＰＴＸ）を、超音波処理を使用してＲＢＣＥＶへと積載するプロトコールも最適化した（図１４Ｂ）。薬物積載ＲＢＣＥＶを徹底的に洗浄し、上記のようにＥＧＦＲ標的化ペプチドとライゲートした。修飾ＲＢＣＥＶを、Ｈ３５８肺がんを担持するＮＳＧマウスに３日毎に、コントロールとして使用したＰＴＸのみと同じ用量で注射した。ＰＴＸの濃度は、ＨＰＬＣを使用して決定した。平均約６％のＰＴＸをＲＢＣＥＶに積載し、未結合のＰＴＸを洗い流した（図１４Ｃ）。腫瘍の生物発光画像は、ＥＧＦＲ標的化ＲＢＣＥＶが、ＰＴＸのみ又は非コートＰＴＸ積載ＲＢＣＥＶと比較して、腫瘍抑制へのＰＴＸの効果を増強したことを示した（図１４Ｄ）。これらのデータは、抗がん剤の標的化送達が、標的腫瘍細胞における薬物の蓄積を増加させることによって処置の有効性を増加させることができることを示す。

【0192】

実施例２：方法
ＥＶの精製
血液試料は、インフォームドコンセントを行った香港の健康なドナーから、赤十字社によって得た。ヒト血液試料による全ての実験は、香港城市大学ヒト対象倫理委員会のガイドライン及び認可に従って実施した。ＲＢＣは、遠心分離（１０００×ｇで８分間、４℃）を使用して血漿から分離し、ＰＢＳで３回洗浄し（１０００×ｇで８分間、４℃）、白血球を遠心分離又は白血球除去フィルター（Ｔｅｒｕｍｏ Ｊａｐａｎ又はＮｉｇａｌｅ、Ｃｈｉｎａ）を使用して除去した。単離したＲＢＣは、Ｎｉｇａｌｅ緩衝液（０．２ｇ／ｌのクエン酸、１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、７．９３ｇ／ｌのグルコース、０．９４ｇ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．１４ｇ／ｌのアデニン、４．９７ｇ／ｌの塩化ナトリウム、１４．５７ｇ／ｌのマンニトール）中に回収し、０．１ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウムを含有するＰＢＳで３倍希釈し、１０ｍＭのカルシウムイオノフォア（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で終夜処置した（カルシウムイオノフォアの最終濃度は１０μＭであった）。ＥＶを精製するため、ＲＢＣ及び細胞残渣は、６００×ｇで２０分間、１６００×ｇで１５分間、３２６０×ｇで１５分間、及び１０，０００×ｇで３０分間、４℃での遠心分離によって除去された。上清を０．４５μｍのシリンジフィルターに通した。ＥＶは、ＴＹ７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）を用いる、１００，０００×ｇ又は５０，０００×ｇで７０分間、４℃での超遠心分離を使用して濃縮した。ＥＶは、冷ＰＢＳに再懸濁した。標識のため、半分のＥＶを２０μＭのＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）と混合した。標識又は非標識ＥＶを、２ｍｌの凍結６０％スクロースクッション上に重層し、ＳＷ４１Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、１００，０００×ｇ又は５０，０００×ｇで１６時間、４℃でブレーキ速度を落として遠心分離した。ＥＶの赤い層（スクロース上）を回収し、ＴＹ７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、１００，０００×ｇ又は５０，０００×ｇで７０分間、４℃での超遠心分離を使用して、冷ＰＢＳで１回（非標識ＥＶ）又は２回（標識ＥＶ）洗浄した。注目すべきは、ＲＢＣＥＶの高い収率のため、１００，０００×ｇの超遠心分離を使用した。ＥＶを優しく扱おうとする場合には、５０，０００×ｇを使用した。全ての超遠心分離実験は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＸＥ－９０超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で実施した。精製したＲＢＣＥＶは、－８０℃で、４％のトレハロースを含有するＰＢＳ中に保存した。ＥＶの濃度及びサイズ分布は、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＮＳ３００システム（Ｍａｌｖｅｍ、ＵＫ）を使用して定量した。ＥＶのタンパク質含量は、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ）を使用して定量した。ＥＶの透過型電子顕微鏡解析では、ＥＶは、等量の４％パラホルムアルデヒドを添加することによって銅グリッド（２００メッシュ、ホルムバール炭素膜でコートした）に固定した。ＰＢＳによる洗浄後、４％の酢酸ウラニルをＥＶの化学染色のために添加し、Ｔｅｃｎａｉ１２ Ｂｉｏ ＴＷＩＮ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ／Ｐｈｉｌｉｐｓ、ＵＳＡ）を使用して画像を捕捉した。ＲＢＣＥＶのヘモグロビン含量は、ヘモグロビン定量キット（Ａｂｃａｍ）を使用して定量した。

【0193】

ＴＨＰ１細胞からの白血病ＥＶの精製
ＴＨＰ１細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）から得て、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｓｅｒａ、ＵＳＡ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で維持した。ＥＶフリーのＦＢＳを作製するため、ＥＶは、１１０，０００×ｇで１８時間、４℃での超遠心分離を使用してＦＢＳから除去された。ＴＨＰ１細胞は、ＥＶフリーＦＢＳ及び０．２μＭのカルシウムイオノフォアを含む上記の培地中、１０^６個の細胞／ｍｌで４８時間培養した。培養上清は、処置したＴＨＰ１細胞の５つのフラスコから回収した。細胞及び残渣は、３００×ｇで１０分間、４００×ｇで１５分間、９００×ｇで１５分間、４℃での遠心分離によって除去された。上清を０．４５μｍのフィルターにさらに通し、２ｍｌの凍結６０％スクロース上に重層し、ＳＷ３２ローターを用いる、１００，０００×ｇで９０分間、４℃での超遠心分離を使用して濃縮した。ＥＶを界面から回収し、冷ＰＢＳで１：１に希釈し、ＳＷ４１ローター中で２ｍｌの凍結６０％スクロースクッション上に重層し、１００，０００×ｇで１２時間、４℃でブレーキ速度を落として遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。ＥＶの赤い層（スクロース上）を回収し、ＴＹ７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、１００，０００×ｇで７０分間、４℃での超遠心分離を使用して、冷ＰＢＳで１回（非標識ＥＶ）又は２回（標識ＥＶ）洗浄した。５００μｌのＥＶを界面から回収し、ｑＥＶ ＳＥＣカラム（Ｉｚｏｎ）に添加した。５００μｌの溶出液を各フラクションで回収した。ＥＶ及びタンパク質の濃度は、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔアナライザー及びＢＣＡアッセイを使用して３０画分で測定した。ライゲーションのため、画分７～１１からのＥＶを組み合わせ、１００ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ－１５フィルターで、１５，０００×ｇで２０分間、遠心分離を使用して濃縮した。

【0194】

ペプチド及びｓｄＡｂ設計
ビオチン化自己ペプチド（ビオチン－ＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫ－ＧＧＧＧＳ－ＬＰＥＴＧＧＧ）、Ｂｉ－ＹＧ２０ペプチド（ビオチン－ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＬＰＥＴＧＧＧ、ソルターゼ結合部位は下線を引いた）及びビオチン－ＴＲＮＧＬ及び表１に列挙した他のペプチドは、９６／１０２ウェルの自動ペプチド合成機を使用して合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌｔｄ．、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）によって精製した。Ｃ末端にさらなるソルターゼ結合部位（ＬＰＥＴＧ）又はリガーゼ結合部位（ＮＧＬ）、ＨＡタグ及びＦＬＡＧタグを持つ抗ｍＣｈｅｒｒｙ ｓｄＡｂ（３８７ｂｐ）の可変重鎖（ＶＨＨ）配列は、Ｆｒｉｄｙら^９から得た。Ｍｙｃタグ、トロンビン切断部位及び６Ｈｉｓタグも、ＶＨＨのＮ末端に付加した。６^＊Ｈｉｓ－ＳＳＧ－トロンビン切断部位－Ｍｙｃ－ＶＨＨ－ＧＳＧ－ＨＡ－ＧＳＧ－ＬＰＥＴＧＧＧ－Ｆｌａｇの全配列（５５５ｂｐ、２０ｋＤａ、イタリック体はリンカーを示す）を合成し、ｐＥＴ３２（ａ＋）プラスミドに、Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ＩＧＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ（Ｃｈｉｎａ）によるＴ７プロモーターに続いて挿入した。生体栄養性のＥＧＦＲ－ＶＨＨ配列は、Ｒｏｏｖｅｒｓら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ、２０１１年、１２９（８）、２０１３～２０２４頁）から得て、上記のように８ Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ及びリガーゼ結合部位とこの順：８^＊Ｈｉｓ－ＧＳＧ－ＶＨＨ－ＧＳＧ－ＦＬＡＧ－ＮＧＬでｐＥＴ３２（ａ＋）プラスミドへとクローニングした。

【0195】

【表1】

【0196】

タンパク質の発現及び精製
コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌をｐＥＴ３０ｂ－７Ｍ－ＳｒｔＡプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ５１１４０）で形質転換し、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むアガープレートに撒き、ＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７Ａｌａプラスミド（Ｄｒ．Ｂｉｎ Ｗｕ、Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって提供された）又はｐＥＴ３２（ａ＋）－ＶＨＨプラスミド（特定のＶＨＨ配列でクローニング）で形質転換してアンピシリンを含むアガープレートに撒き、３７℃で終夜インキュベートした。各プレートから単一コロニーを選択し、３７℃で終夜、振盪しながらＬｙｓｏｇｅｎｙブロス（ＬＢ）中で培養した。タンパク質発現は、ＬＢ中０．５ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって、２５℃で１６時間、振盪しながら誘導した。培養を回収し、６，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離した。上清を除去し、ペレットを５０ｍＬの結合緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、５％グリセロール）中に再懸濁し、５０ｍＬの遠心チューブに移し、再び遠心分離した。

【0197】

細菌は、高圧ホモジナイザー（１０００ｐｓｉ）を使用して４～６回溶解した。細胞溶解物は、８０００ｒｐｍで６０分間、４℃にて遠心分離した。上清を回収して、０．４５μｍ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。タンパク質は、ＮＧＣ－ＱＵＥＳＴ－１０高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して精製した。簡単に言うと、試料は、結合緩衝液によって平衡化した５ｍＬ－Ｎｉ－荷電カートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）へと積載した。カラムは、３％溶出緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び５％グリセロール）で洗浄し、次いで８％～５０％の溶出緩衝液に溶出した。流速は、３ｍｌ／分で一定に保った。タンパク質がＵＶ２８０のピークとして現れると、２ｍｌの画分を回収した。タンパク質は、スウィングバケツローターで遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び４０００×ｇの遠心分離を使用して濃縮し、０．２２μｍ膜を通して濾過した。タンパク質は、低イオン強度緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）中、０．５ｍｌ／分でのＦＰＬＣシステムのＨｉＬｏａｄ１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してさらに精製した。標的タンパク質は、適切なＵＶ２８０のピークで回収し、ゲル電気泳動を使用してクマシーブルー染色により確認した。ＯａＡＥＰ１リガーゼ活性化のため、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５ｍＭ Ｔｒｉｓ １ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５ｍＭ Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩から構成される緩衝液を未成熟タンパク質に添加し、溶液のｐＨを氷酢酸で４に合わせた。タンパク質のプールを３７℃で５時間インキュベートした。このｐＨでのタンパク質の沈殿は、遠心分離による夾雑タンパク質のバルクの除去を可能にした。活性化タンパク質は、１０ｋＤａカットオフ濃縮機を使用して超遠心分離によって濃縮し、－８０℃で保存した。

【0198】

ＬＰＥＴＧ配列を担持する抗体及びペプチドによるＥＶのソルタグ付け
６００ｐｍｏｌのソルターゼＡを２．７５μｍｏｌのｓｄＡｂ又は２１μｍｏｌのペプチドと１×ソルターゼ緩衝液（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で混合し、氷上に３０分間置いた。続いて、８×１０^１１個のＥＶ（約５０μｇのＥＶタンパク質）を、総容積１２５μｌ中、４μＭのソルターゼＡ（約１０μｇ）及び２０μＭのＶＨＨ－ＬＰＥＴＧ（約５０μｇ）の最終濃度になるようにソルターゼ混合物に添加した。反応は、４℃で６０分間、回転シェイカーで優しく攪拌しながら（２０ｒｐｍ）インキュベートした。コンジュゲートしたＥＶを、２ｍｌの凍結６０％スクロースクッションに添加し、ＳＷ４１Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、１００，０００×ｇで１６時間、４℃でブレーキ速度を落として遠心分離した。ＥＶの赤い層（スクロース上）を回収し、７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、１００，０００×ｇで７０分間、４℃での超遠心分離を使用して、１６ｍｌの冷ＰＢＳで１回洗浄した。

【0199】

ＯａＡＥＰ１ Ｃｙｓ２４７Ａｌａタンパク質リガーゼを使用する、ＴＲＮＧＬ配列を担持するペプチドによるＥＶのコーティング
全ての２０μｌの反応混合物は、ＰＢＳ緩衝液中に３μｌのＲＢＣＥＶ（０．７２×１０^１１個の粒子／μｌ、ＲＢＣＥＶ中１００μｇのヘモグロビンと等価）、２．５～１０μｌの１ｍＭペプチド及び５μｌの１０μＭリガーゼを含有し、ｐＨは７～７．４（ｐＨ７．０が最適）、リガーゼ（１μＭ）及びペプチド（５０～５００μＭ）の最終濃度にした。反応は、室温で３０分間、回転シェイカーで優しく攪拌しながら（３０ｒｐｍ）インキュベートした。反応をスケールアップする場合、より長いインキュベーション時間、例えば１～２ｍｇのＲＢＣＥＶ（ヘモグロビン定量に基づく）のライゲーションに３時間が必要であった。

【0200】

蛍光色素によるコートＲＢＣＥＶの標識
ペプチド又はｓｄＡｂによってコートしたＲＢＣＥＶは、２１，０００×ｇで１５分間、４℃での遠心分離によって、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄したＲＢＣＥＶを、１０μＭのカルセインＡＭと室温で２０分間、又は２０μＭのＣＦＳＥと３７℃で１時間又は２μＭのＤｉＲと室温で１５分間インキュベートした。標識したＲＢＣＥＶは、すぐにＳＥＣカラム（Ｉｚｏｎ）に積載し、ＰＢＳで溶出した。画分７～１０（ピンク～赤色）を回収し、２１，０００×ｇで１５分間、４℃での遠心分離によって３回洗浄した。

【0201】

ＲＢＣＥＶへのＲＮＡ及び薬物の積載
ライゲートしたＲＢＣＥＶは、ＲＮＡの積載の前に、２１，０００×ｇで１５分間、４℃で、ＰＢＳで３回洗浄した。３０分間、トランスフェクション試薬を使用して、９μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を５０μｇのＲＢＣＥＶに積載した。次いで、ＥＶを２１，０００×ｇでの遠心分離によってＰＢＳで３回洗浄した。

【0202】

薬物積載のため、非コートＲＢＣＥＶを１ｍｌのＰＢＳ中２００μｇのＰＴＸと、３７℃で１５分間インキュベートした。混合物は、４℃で１２分間、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｂｉｏｇｅｎｏｄｅ）を使用して超音波処理し、次いで３７℃で１時間回復した。積載ＲＢＣＥＶは、２１，０００×ｇで１５分間、ＰＢＳで洗浄し、ヘモグロビンアッセイを使用して定量し、上記のようにペプチドでコートした。コートＲＢＣＥＶは、上記のようにＳＥＣを使用して再精製した。ＲＢＣＥＶに積載したＰＴＸを測定するため、積載ＲＢＣＥＶのアリコットを２１，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを７５℃で乾燥し、アセトニトリルに再懸濁し、２１，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清は、０．２２μｍフィルターを通し、ＨＰＬＣを使用して解析した。

【0203】

ウェスタンブロット解析
コンジュゲートしたＥＶは、プロテアーゼインヒビター（Ｂｉｏｔｏｏｌ）を補足したＲＩＰＡ緩衝液と氷上で５分間インキュベートした。３０μｇのタンパク質溶解物は、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。ＰＭ５１００ ＥｘｃｅｌＢａｎｄ（商標）３色広範囲タンパク質ラダー（ＳｍｏＢｉｏ、Ｔａｉｗａｎ）を試料の両側にロードした。膜は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中５％の脱脂乳で、室温で１時間ブロックし、一次抗体と４℃で終夜インキュベートした：マウス抗Ｈｉｓ／ＶＨＨ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、１：１０００希釈）、マウス抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ、１：５００希釈）。ブロットはＴＢＳＴで３回洗浄し、次いでＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：１００００希釈）と室温で１時間インキュベートした。ビオチン化ペプチド検出のため、ブロットはいずれの抗体ともインキュベートしなかったが、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１：４０００希釈）と直接インキュベートした。ブロットは、Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓゲルドキュメンテーションシステムを使用して画像化した。

【0204】

ペプチド又はｓｄＡｂコートＥＶによるがん細胞の処置
ヒト乳がんＳＫＢＲ３細胞、ヒト肺がんＨ３５８及びＨＣＣ８２７細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）から得た。ヒト乳がんＭＣＦ１０ＣＡ１ａ（ＣＡ１ａ）は、Ｋａｍａｎｏｓがん研究所（Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）から得た。急性骨髄性白血病ＭＯＬＭ１３及びＴＨＰ１細胞は、微生物培養細胞のＤＳＭＺコレクション（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。全ての固形がん及び白血病細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｓｅｒａ、ＵＳＡ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を含むそれぞれＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で維持した。ＥＶの取り込みを試験するため、１００，０００個のＳＫＢＲ３細胞を、６×１０^１１個のＰＫＨ２６標識非コート又はＹＧ２０コートＥＶと、２４ウェルプレートのウェル当たり５００μｌの増殖培地中で２４時間インキュベートした。より短い取り込みアッセイでは、Ｈ３５８、ＨＣＣ８２７、ＭＯＬＭ１３及びＴＨＰ１細胞を、カルセインＡＭ標識ＲＢＣＥＶと、３７℃で１～２時間インキュベートした。ＥＶ取り込みの経路を同定するため、本発明者らは、２５～１００μＭ ＥＩＰＡ、５～２０μｇ／ｍｌフィリピン、０．２５～１μＭワートマニンを添加した。ＥＶ結合アッセイでは、ＨＣＣ８２７細胞を非標識のＲＢＣＥＶと４℃で１時間インキュベートした。

【0205】

フローサイトメトリー解析
ＲＢＣＥＶ処置したＳＫＢＲ３又は他の細胞は、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞は、３μｌのＦＩＴＣコンジュゲートＥＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と氷上で１５分間、暗所でインキュベートし、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ペプチドコート効率を定量するため、１００μｇのｂｉ－ＹＧ２０コート又はｂｉ－ＴＲＮＧＬコートＲＢＣＥＶ又は非コートＲＢＣＥＶ（陰性コントロールとして）を、シェイカー上で４℃にて２．５μｇのラテックスビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と終夜インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）とコンジュゲートした１μｌのストレプトアビジンを含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、１５分間氷上でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ緩衝液中のラテックスビーズ又は細胞のフローサイトメトリーは、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して実施し、Ｆｌｏｗｊｏ Ｖ１０（Ｆｌｏｗｊｏ、ＵＳＡ）を使用して解析した。ビーズ又は細胞は、最初にＦＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ａに基づいてゲートをかけ、残渣及び死細胞（低ＦＳＣ－Ａ）を除外した。細胞は、ＦＳＣ－幅対ＦＳＣ－高さに基づいてさらにゲートをかけ、ダブレット及び凝集体を除外した。続いて、非染色／未処置の陰性コントロールでは無視できるシグナルを示す集団として、蛍光陽性ビーズ又は細胞を適切な蛍光チャネル：ＰＫＨ２６はＰＥ、ＡＦ６４７はＡＰＣでゲートにかけた。

【0206】

ｉｎ ｖｉｖｏがんモデルの生成及びＲＢＣＥＶによる処置
Ｈ３５８細胞は、レンチウイルスベクター（ｐＬＶ－Ｆｌｕｃ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｕｒｏ）で形質導入し、ピューロマイシンで選択して、安定な細胞株を作製した。１００万個のＨ３５８－ｌｕｃ細胞を、ＮＳＧマウス（６～７週齢）の尾静脈に注射した。３週間後、肺における生物発光を、Ｄ－ルシフェリンの注射後にＩＶＩＳ ＬｕｍｉｎａＩＩ（Ｐｅｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して検出した。同等の生物発光シグナルを示すマウスは、０．５～５×１０^９個のヒトＲＢＣ（ドナーからの回収後１～７日）又は同じＲＢＣ数のゴーストで、後眼窩注射を介して前処置した。

【0207】

１時間後、体内分布実験のため、コントロール又はＥＧＦＲ標的化ペプチドとライゲートした１００μｇのＤｉＲ標識ＲＢＣＥＶをマウスの尾静脈に注射した。８時間後、マウスを屠殺し、すぐに臓器でのＤｉＲ蛍光を測定した。薬物処置のため、３日毎に、ＲＢＣの前処置の１時間後、２０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル（ＰＴＸ）単独又はＥＧＦＲペプチドライゲーションあり又はなしでのＲＢＣＥＶ中の等量のＰＴＸをマウスにｉ．ｖ．注射した。同じ量の非積載ＲＢＣＥＶを陰性コントロールとして使用した。

【0208】

循環におけるＲＢＣＥＶの定量
５００μｇのＣＦＳＥ標識ペプチドライゲートＲＢＣＥＶを、ＮＳＧマウスの尾静脈に注射した。５分後、１００μｌの血液を目から回収した。血液細胞を除去し、２０μｌの血漿を５μｌのビオチン化ＧＰＡ抗体と、優しく回転しながら室温で２時間インキュベー。次いで、混合物を２０μｌのストレプトアビジンビーズと室温で１時間インキュベートした。ビーズは３回洗浄し、ＣＦＳＥの解析のため、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。

【0209】

参考文献
本発明をより完全に記載及び開示し、本発明が関係する技術を言及するため、多くの論文を上記に引用した。これらの参考文献の完全な引用は以下に示す。これらの参考文献のそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる

【0210】

【表2】

【0211】

標準的な分子生物学技術に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｅｄ． ２００１年，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【手続補正書】

【提出日】2020-05-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

外因性ポリペプチドタグを含む赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）であって、タグが細胞外小胞の天然の膜タンパク質に共有結合されている、ＲＢＣＥＶ。

【請求項2】

タグが１つ又は複数の機能性ドメインを含み、機能性ドメインが標的部分に結合することができ、検出されることができ、及び／又は治療効果を誘導することができる、請求項１に記載のＲＢＣＥＶ。

【請求項3】

機能性ドメインが、抗体又は抗原結合断片、好ましくはｓｄＡｂを含む、請求項２に記載のＲＢＣＥＶ。

【請求項4】

マイクロベシクル又はエキソソーム、好ましくはマイクロベシクルである、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＢＣＥＶ。

【請求項5】

カーゴを積載される、請求項１～４のいずれか一項に記載のＲＢＣＥＶ。

【請求項6】

カーゴが、核酸、ペプチド、タンパク質又は小分子である、請求項５に記載のＲＢＣＥＶ。

【請求項7】

カーゴが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、長鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はプラスミドからなる群から選択される核酸である、請求項６に記載のＲＢＣＥＶ。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の１つ又は複数のＲＢＣＥＶを含む組成物。

【請求項9】

処置の方法での使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載のＲＢＣＥＶ又は組成物。

【請求項10】

請求項１に記載のＲＢＣＥＶを、処置を必要とする患者に投与することを含む、処置の方法。

【請求項11】

疾患又は障害の処置のための医薬の製造における、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＲＢＣＥＶ又は組成物の使用。

【請求項12】

処置の方法が、請求項１～８のいずれか一項に記載のＲＢＣＥＶ又は組成物の、遺伝的障害、炎症性疾患、がん、自己免疫障害、心血管疾患又は胃腸疾患を有する対象への投与を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の使用のためのＲＢＣＥＶ又は組成物、処置の方法又は使用。

【請求項13】

対象ががんを有し、がんが任意選択で白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、肺がん、肝臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、腎臓がん又は神経膠腫から選択される、請求項１２に記載の使用のためのＲＢＣＥＶ又は組成物、処置の方法又は使用。

【請求項14】

タグと細胞外小胞の天然の表面タンパク質の間の共有結合を可能にする条件下で、ＲＢＣＥＶをタグ及びタンパク質リガーゼと接触させ、それによりタグ付きＲＢＣＥＶを生成することを含む方法。

【請求項15】

（ａ）ペプチドと細胞外小胞の天然の表面タンパク質の間の共有結合を可能にする条件下で、ＲＢＣＥＶをペプチド及び第１のタンパク質リガーゼと接触させ、それによりペプチドタグ付きＲＢＣＥＶを生成すること；並びに
（ｂ）ＲＢＣＥＶに共有結合したペプチドと機能性ドメインペプチドの間の共有結合を可能にする条件下で、ペプチドタグ付きＲＢＣＥＶを機能性ドメインペプチド及び第２のタンパク質リガーゼと接触させること
を含む、方法。

【請求項16】

第１及び第２のペプチドリガーゼが同じである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

第１及び第２のペプチドリガーゼが異なる、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

ＲＢＣＥＶをカーゴと接触させること、及び電気穿孔してＲＢＣＥＶでカーゴを封入することをさらに含む、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

タンパク質リガーゼが、ソルターゼ又はＡＥＰ１、好ましくはソルターゼＡからなる群から選択される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法によって得られたＲＢＣＥＶ。

【国際調査報告】