特表 2022-513318 プロピオン酸血症を処置するための遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】プロピオン酸血症を処置するための遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01

C12N15/52 Z ZNA

C12N5/10

A61K35/76

A61K48/00

A61K9/08

A61P3/00

A61P43/00 111

A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021542078

(86)(22)【出願日】2019-10-01

(85)【翻訳文提出日】2021-05-28

(86)【国際出願番号】 US2019054003

(87)【国際公開番号】W WO2020072451

(87)【国際公開日】2020-04-09

(31)【優先権主張番号】62/739,471

(32)【優先日】2018-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513252910

【氏名又は名称】ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】フラー， マシュー スコット

(72)【発明者】

【氏名】ウォズワース， サミュエル

(72)【発明者】

【氏名】クラーク， ケリー リード

(72)【発明者】

【氏名】ドーハティ， ショーン クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】クレイグ， スチュワート

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA27

4B065CA44

4C076AA11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC21

4C076CC29

4C076FF11

4C076FF68

4C084AA13

4C084MA16

4C084MA55

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZC21

4C084ZC41

4C086AA01

4C086AA02

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4C086MA55

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZC21

4C086ZC41

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA16

4C087MA55

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZC21

4C087ZC41

(57)【要約】

本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）を処置するための遺伝子治療における、アデノ随伴ウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、およびこれらの使用の方法を提供する。また、本発明の組換えアデノ随伴ウイルスおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼαサブユニット（ＰＣＣＡ）における変異またはプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼβサブユニット（ＰＣＣＢ）における変異により生じるＰＡの処置のための遺伝子治療において有用であり得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、５’から３’の順に
（ａ）５’逆位末端反復配列（５’－ＩＴＲ）の配列、
（ｂ）プロモーター配列、
（ｃ）ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列、および
（ｄ）３’逆位末端反復配列（３’－ＩＴＲ）の配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【請求項2】

前記ＡＡＶカプシドが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項3】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９由来である、請求項２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項4】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８由来である、請求項２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項5】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９バリアントカプシドである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項6】

プロモーターが、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーター、およびＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターから選択される、請求項１～５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項7】

前記プロモーターが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、配列番号３４の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、前記ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターである、請求項６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項8】

前記プロモーターが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、配列番号３６の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、前記ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターである、請求項６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項9】

前記プロモーターが、前記ＣＢＡプロモーターである、請求項６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項10】

前記５’－ＩＴＲおよび／または前記３’－ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、請求項１～９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項11】

前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列が、配列番号１５を含むか、またはこれからなる、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項12】

前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列が、非ＡＡＶ２供給源由来である、請求項１～９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項13】

前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、請求項１～７および９～１２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項14】

前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号１を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項15】

前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化コード配列である、請求項１～７および９～１２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項16】

前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号２～６から選択されるコード配列を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項17】

前記ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、請求項１～６および８～１２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項18】

前記ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号７を含む、請求項１７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項19】

前記ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化コード配列である、請求項１～６および８～１２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項20】

前記ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号８～１２から選択されるコード配列を含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項21】

前記パッケージングされたゲノムが、ヒトＰＣＣＡ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～７および９～１６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項22】

前記ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３０を含む、請求項２１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項23】

前記ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３０の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項24】

前記ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３１を含む、請求項２１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項25】

前記ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３１の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項26】

前記パッケージングされたゲノムが、ヒトＰＣＣＢ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～６、８～１２および１７～２０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項27】

前記ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３２を含む、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項28】

前記ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３２の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項29】

前記ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３３を含む、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項30】

前記ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３３の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項31】

前記パッケージングされたゲノムが、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項１～３０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項32】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列から選択される、請求項３１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項33】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、請求項３２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項34】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２２を含むか、またはこれからなる、請求項３３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項35】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２３を含むか、またはこれからなる、請求項３３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項36】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項１～７、９～１６、２１～２５ならびに３１および３２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項37】

前記ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号３５の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項38】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項１～６、８～１２、１７～２０および２６～３２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項39】

前記ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号３７の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載のｒＡＡＶ。

【請求項40】

前記パッケージングされたゲノムが、１つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含む、請求項１～３９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項41】

前記エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される、請求項４０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項42】

前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサーである、請求項４１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項43】

前記エンハンサーが、配列番号１９を含むか、またはこれからなる、請求項４２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項44】

前記エンハンサーが、前記プロモーター配列の上流に位置する、請求項４０～４３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項45】

前記パッケージングされたゲノムが、１つまたは複数のイントロン配列をさらに含む、請求項１～４４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項46】

前記イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットベータ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される、請求項４５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項47】

前記イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロンまたはｒＨＢＢイントロンである、請求項４６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項48】

前記イントロンが、配列番号２０を含むか、またはこれからなる、請求項４７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項49】

前記イントロンが、配列番号２１を含むか、またはこれからなる、請求項４７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項50】

ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’－ＩＴＲ配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’－ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【請求項51】

前記ＡＡＶカプシドが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である、請求項５０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項52】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９由来である、請求項５１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項53】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９バリアントカプシドである、請求項５０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項54】

プロモーターが、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーター、およびＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターから選択される、請求項５０から５３のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項55】

前記プロモーターが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、配列番号３４の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、前記ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターである、請求項５４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項56】

前記プロモーターが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、配列番号３６の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、前記ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターである、請求項５４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項57】

前記プロモーターが、前記ＣＢＡプロモーターである、請求項５４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項58】

前記５’－ＩＴＲおよび／または前記３’－ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、請求項５０～５７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項59】

前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列が、配列番号１５を含むか、またはこれからなる、請求項５８に記載のｒＡＡＶ。

【請求項60】

前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列が、非ＡＡＶ２供給源由来である、請求項５０～５７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項61】

前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、請求項５０～５５および５７～６０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項62】

前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号１を含む、請求項６１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項63】

前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化コード配列である、請求項５０～５５および５７～６０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項64】

前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号２～６から選択されるコード配列を含む、請求項６３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項65】

前記ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、請求項５０～５４および５６～６０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項66】

前記ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号７を含む、請求項６５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項67】

前記ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化コード配列である、請求項５０～５４および５６～６０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項68】

前記ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号８～１２から選択されるコード配列を含む、請求項６７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項69】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列から選択される、請求項５０から６８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項70】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、請求項６９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項71】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２２を含むか、またはこれからなる、請求項７０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項72】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２３を含むか、またはこれからなる、請求項７０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項73】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項５０～５５、５７～６４、および６９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項74】

前記ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号３５の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項７３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項75】

前記ポリアデニル化シグナル配列が、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項５０～５４、５６～６０、および６５～６９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項76】

前記ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号３７の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項７５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項77】

前記エンハンサーが、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびＡｐｏＥエンハンサーから選択される、請求項５０～７６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項78】

前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサーである、請求項７７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項79】

前記イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットベータ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、またはｈＦＩＸイントロンから選択される、請求項５０～７８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項80】

前記イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロンまたはｒＨＢＢイントロンである、請求項７９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項81】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｄ）と（ｅ）との間に位置するヒトＰＣＣＡ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５０～５５、５７～６４、６９～７４および７７～８０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項82】

前記ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３０を含む、請求項８１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項83】

前記ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３０の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項８１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項84】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｄ）と（ｅ）との間に位置するヒトＰＣＣＢ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５０～５４、５６～６０、６５～７２および７５～８０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項85】

前記ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３２を含む、請求項８４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項86】

前記ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３２の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項８４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項87】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｆ）と（ｇ）との間に位置するヒトＰＣＣＡ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５０～５５、５７～６４、６９～７４および７７～８３のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項88】

前記ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３１を含む、請求項８７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項89】

前記ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３１の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項８７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項90】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｆ）と（ｇ）との間に位置するヒトＰＣＣＢ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５０～５４、５６～６０、６５～７２、７５～８０および８４～８６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項91】

前記ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの完全ヌクレオチド配列が、配列番号３３を含む、請求項９０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項92】

前記ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列が、配列番号３３の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、請求項９０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項93】

前記ベクターゲノムが、ゲノムエレメント（ｅ）の上流にコンセンサスＫｏｚａｋ配列を含む、請求項５０～９２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項94】

前記コンセンサスＫｏｚａｋ配列が、配列番号２４を含む、請求項９３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項95】

ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列または配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【請求項96】

前記ＡＡＶカプシドが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である、請求項９５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項97】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９由来である、請求項９６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項98】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８由来である、請求項９６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項99】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９バリアントカプシドである、請求項９５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項100】

ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列または配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【請求項101】

ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）ＡＡＶ２ ５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の配列、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列、
（ｄ）ｒＨＢＢまたはＳＶ４０スモールＴイントロン配列、
（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列または配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、
（ｆ）ＢＧＨまたはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）ＡＡＶ２ ３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【請求項102】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記コード配列がＰＣＣＡのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｄ）と（ｅ）との間に位置するヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９５～１０１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項103】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記コード配列がＰＣＣＢのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｄ）と（ｅ）との間に位置するヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９５～１０１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項104】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記コード配列がＰＣＣＡのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｆ）と（ｇ）との間に位置するヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９５～１０２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項105】

前記パッケージングされたゲノムが、前記ベクターゲノムにおける前記コード配列がＰＣＣＢのものである場合、ベクターゲノムエレメント（ｆ）と（ｇ）との間に位置するヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９５～１０１および１０３のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項106】

前記ベクターゲノムが、ゲノムエレメント（ｅ）の上流にコンセンサスＫｏｚａｋ配列を含む、請求項９５～１０５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項107】

前記コンセンサスＫｏｚａｋ配列が、配列番号２４を含む、請求項１０６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項108】

前記請求項のいずれかに記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。

【請求項109】

治療有効量の請求項１～１０７のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項１０８に記載の組成物をヒト対象に投与するステップを含む、前記ヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法。

【請求項110】

１．前記コード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、前記プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項１～７、９～１６、２１～２５、３１～３７、４０～５５、５７～６４、６９～７４、７７～８３、８７～８９、９３～１０２、１０４ならびに１０６および１０７のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物、ならびに／または
２．前記コード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、前記プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項１～６、８～１２、１７～２０、２６～３５、３８～５４、５６～６０、６５～７２、７５～８０、８４～８６、９０～１０１、１０３および１０５～１０７のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物
をヒト対象に投与するステップを含む、前記ヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法。

【請求項111】

（１）および（２）の前記組成物が、同時、連続的、または別々に投与される、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法であって、前記コード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、前記プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項１～７、９～１６、２１～２５、３１～３７、４０～５５、５７～６４、６９～７４、７７～８３、８７～８９、９３～１０２、１０４ならびに１０６および１０７のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物を前記ヒト対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項113】

ＰＣＣＡにおける前記変異が、表１から選択される、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法であって、前記コード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、前記プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項１～６、８～１２、１７～２０、２６～３５、３８～５４、５６～６０、６５～７２、７５～８０、８４～８６、９０～１０１、１０３、および１０５～１０７のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物を前記ヒト対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項115】

ＰＣＣＢにおける前記変異が、表２から選択される、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記ｒＡＡＶまたは前記組成物が、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内に投与される、請求項１０９～１１５のいずれかに記載の方法。

【請求項117】

前記ｒＡＡＶまたは前記組成物が、静脈内に投与される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記ｒＡＡＶが、約１×１０^１１～約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、請求項１０９～１１７のいずれかに記載の方法。

【請求項119】

前記ｒＡＡＶが、約１×１０^１２～約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記ｒＡＡＶを投与するステップが、
ａ）単一用量のｒＡＡＶ、または
ｂ）複数用量のｒＡＡＶ
の投与を含む、請求項１１６～１１９のいずれかに記載の方法。

【請求項121】

核酸配列が、配列番号１の野生型コード配列と８０％未満同一である、配列番号１６のＰＣＣＡポリペプチドをコードする組換え核酸。

【請求項122】

前記核酸配列が、配列番号２～６から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１２１に記載の組換え核酸。

【請求項123】

前記核酸配列が、配列番号２～６から選択される配列を含む、請求項１２２に記載の組換え核酸。

【請求項124】

核酸配列が、配列番号７の野生型コード配列と８０％未満同一である、配列番号１７のＰＣＣＢポリペプチドをコードする組換え核酸。

【請求項125】

前記核酸配列が、配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１２４に記載の組換え核酸。

【請求項126】

前記核酸配列が、配列番号８～１２から選択される配列を含む、請求項１２５に記載の組換え核酸。

【請求項127】

配列番号２～６から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む組換え核酸。

【請求項128】

配列番号２～６から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１２７に記載の組換え核酸。

【請求項129】

配列番号２～６から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１２８に記載の組換え核酸。

【請求項130】

配列番号２～６から選択される配列を含む組換え核酸。

【請求項131】

配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む組換え核酸。

【請求項132】

配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１３１に記載の組換え核酸。

【請求項133】

配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１３２に記載の組換え核酸。

【請求項134】

配列番号８～１２から選択される配列を含む組換え核酸。

【請求項135】

前記核酸配列が、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択される１つまたは複数の終止コドンを３’末端にさらに含む、請求項１２１～１３４のいずれかに記載の組換え核酸。

【請求項136】

請求項１２１～１３５のいずれかに記載の組換え核酸を含むｒＡＡＶ。

【請求項137】

請求項１２１～１３５のいずれかに記載の組換え核酸または請求項１３６に記載のｒＡＡＶを含む宿主細胞。

【請求項138】

ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ－５細胞から選択される、請求項１３７に記載の宿主細胞。

【請求項139】

前記コード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、前記プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項１～７、９～１６、２１～２５、３１～３７、４０～５５、５７～６４、６９～７４、７７～８３、８７～８９、９３～１０２、１０４ならびに１０６および１０７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【請求項140】

前記コード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、前記プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、請求項１～６、８～１２、１７～２０、２６～３５、３８～５４、５６～６０、６５～７２、７５～８０、８４～８６、９０～１０１、１０３、および１０５～１０７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１日出願の米国特許仮出願第６２／７３９，４７１号の利益および優先権を主張し、この全開示は、あらゆる目的のために、この全体を参照により本明細書に組み込む。
配列表

【0002】

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出した配列表を含み、この全体を参照により本明細書に組み込む。２０１９年９月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＵＬＰ－００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、９８，８８９バイトのサイズである。

【0003】

本開示は一般に、プロピオン酸血症を処置するための遺伝子治療における、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、およびこれらの使用の方法に関する。

【背景技術】

【0004】

プロピオン酸血症（ＰＡ）は、プロピオン酸尿症としても知られ、奇数鎖脂肪酸およびプロピオジェニック（ｐｒｏｐｉｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸、特には、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、およびバリンの異化経路における鍵となるステップである、プロピオニルＣｏＡの（Ｄ）メチルマロニルＣｏＡへの変換に必要とされる酵素である、活性プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の欠乏により生じる先天性有機酸代謝異常である。ＰＣＣ酵素は、２つの非同一サブユニット、αおよびβからなり、これらはＰＣＣＡおよびＰＣＣＢ遺伝子によりそれぞれコードされる。プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ欠乏は、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢのいずれかにおける変異から生じ得る。ある試験では、ＰＡを有する患者３０人の変異解析を実施し、患者１５人がαサブユニット欠乏であり、患者１５人がβサブユニット欠乏であったことがわかった。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ． ８１： ３３５－３４２を参照されたい。

【0005】

ＰＡの推定発症率は、米国において１：１０５，０００～１：１３０，０００である。このまれな常染色体劣性代謝障害は、食欲不振、嘔吐、嗜眠、てんかん発作、および筋緊張の欠如を新生児初期において呈する。処置せずにおくと、二次的な高アンモニア血症、感染症、心筋症、または基底核脳卒中のため急速に死に至り得る。ＰＡは、新生児においてほぼすぐに診断することができ、疾患は、米国における新生児スクリーニングパネルに含まれる。
ＰＡは、現在、アミノ酸前駆物質の食事制限、カルニチンレベルの減少に対処するＬカルニチンの補給、および腸内細菌によるプロピオン酸産生を減少させる抗生物質の投与により処置されている。肝臓移植は、患者を標準処置により管理することができない状況下で、ＰＡの管理における役割を得つつある。しかし、食事療法、補助因子療法、および抗生物質療法の複雑な組合せを介して疾患に対処する積極的な取り組みにもかかわらず、ＰＡを有する患者の長期予後は、不良なままである。ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． １５５： ２０５－２１０を参照されたい。したがって、この疾患、すなわちＰＣＣ欠乏の根本原因に対処する治療手法の向上が、必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ． ８１： ３３５－３４２

【非特許文献2】ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． １５５： ２０５－２１０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、ＰＡを有する患者への機能性ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢ遺伝子の移行を媒介するアデノ随伴ウイルスベクターの生成を介して、この必要性に対処する。また、本発明は、ＰＡを有する患者へ機能性ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢ遺伝子を送達する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生成について記載する。

【0008】

本発明は、遺伝子治療における、組成物およびこれらの使用の方法を提供する。より詳細には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ＰＡの処置に有用な、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を本明細書において提供する。

【0009】

一態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、５’から３’の順に（ａ）５’逆位末端反復配列（５’－ＩＴＲ）の配列、（ｂ）プロモーター配列、（ｃ）ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列、および（ｄ）３’逆位末端反復配列（３’－ＩＴＲ）の配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0010】

別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）エンハンサー配列、（ｃ）プロモーター配列、（ｄ）イントロン配列、（ｅ）ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列、（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0011】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、ならびにＡＡＶ５’－ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲ配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0012】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、ならびにＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＡ５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）の切断型または完全ヌクレオチド配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、切断型または完全ヒトＰＣＣＡ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0013】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、および配列番号３０により表す完全ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲを含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、切断型ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３０の部分を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３０の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、切断型または完全ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲは、パッケージングされたベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、イントロン配列とＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列との間に位置する。

【0014】

特定の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３１により表す完全ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、切断型ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３１の部分を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３１の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、切断型または完全ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲは、パッケージングされたベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、ポリアデニル化シグナル配列と３’－ＩＴＲ配列との間に位置する。

【0015】

一実施形態では、ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列は、野生型コード配列である。代替の実施形態では、ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列は、コドン最適化コード配列である。例となる一実施形態では、ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。

【0016】

一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号１に示す野生型コード配列によりコードされる。別の実施形態では、ＰＣＣＡの天然アイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列を使用してもよく、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０５１６５－１（配列番号２５）、Ｐ０５１６５－２（配列番号２６）およびＰ０５１６５－３（配列番号２７）に示すものが挙げられる。特定の実施形態では、ＰＣＣＡは、コドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号１に示す野生型コード配列と８０％未満同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。例となる一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号２～６から選択されるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号２～６から選択される配列と少なくとも８０％同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号２～６から選択される配列と少なくとも９０％同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号２～６から選択される配列と少なくとも９５％同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。一部の実施形態では、発現したＰＣＣＡは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。

【0017】

別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、５’から３’の順に（ａ）５’－ＩＴＲの配列、（ｂ）プロモーター配列、（ｃ）ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列、および（ｄ）３’－ＩＴＲの配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0018】

別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）エンハンサー配列、（ｃ）プロモーター配列、（ｄ）イントロン配列、（ｅ）ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列、（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0019】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、ならびにＡＡＶ５’－ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲ配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0020】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、ならびにＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＢ５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）の切断型または完全ヌクレオチド配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアンの部分的もしくは完全なコード配列ト、切断型または完全ヒトＰＣＣＢ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0021】

特定の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３２により表す完全ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、切断型ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３２の部分を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３２の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、切断型または完全ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲは、パッケージングされたベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、イントロン配列とＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列との間に位置する。

【0022】

特定の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３３により表す完全ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、切断型ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３３の部分を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型ヌクレオチド配列は、配列番号３３の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、切断型または完全ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲは、パッケージングされたベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、ポリアデニル化シグナル配列と３’－ＩＴＲ配列との間に位置する。

【0023】

一実施形態では、ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、野生型コード配列である。代替の実施形態では、ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、コドン最適化コード配列である。例となる一実施形態では、ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。

【0024】

一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号７に示す野生型コード配列によりコードされる。別の実施形態では、ＰＣＣＢの天然アイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列を使用してもよく、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０５１６６－１（配列番号２８）およびＰ０５１６６－２（配列番号２９）に示すものが挙げられる。代替の実施形態では、ＰＣＣＢは、コドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号７に示す野生型コード配列と８０％未満同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。例となる一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号８～１２から選択されるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも８０％同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも９５％同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。一部の実施形態では、発現したＰＣＣＢは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。

【0025】

一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１５を含むか、またはこれからなる。他の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源由来である。

【0026】

一実施形態では、プロモーターは、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ＣＢＡ遺伝子のプロモーター、第１エクソン、および第１イントロン、ならびにウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを使用して構築されている）、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーター、およびＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターから選択される。例となる実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。一実施形態では、ＣＢＡプロモーターは、配列番号１８を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、プロモーターは、遺伝子特異的内因性プロモーターである。一部の一実施形態では、プロモーターは、天然遺伝子プロモーターエレメントを含む。例となる実施形態では、プロモーターは、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、配列番号３４の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターである。例となる実施形態では、プロモーターは、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、配列番号３６の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターである。

【0027】

一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、１つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含む。一実施形態では、エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される。例となる実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである。一実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１９を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、エンハンサーは、プロモーター配列の上流に位置する。

【0028】

一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、１つまたは複数のイントロン配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロンは、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットベータ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２イントロン、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロン（Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン）、またはｈＦＩＸイントロンから選択される。一つの例となる実施形態では、イントロンは、ＳＶ４０スモールＴイントロンである。一実施形態では、ＳＶ４０スモールＴイントロン配列は、配列番号２０を含むか、またはこれからなる。別の例となる実施形態では、イントロンは、ｒＨＢＢイントロンである。一部の実施形態では、ｒＨＢＢイントロン配列は、配列番号２１を含むか、またはこれからなる。

【0029】

一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、イントロン配列の下流に位置する。一実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号２４）である。特定の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＰＣＣＡのコード配列の上流に位置する。特定の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＰＣＣＢのコード配列の上流に位置する。

【0030】

一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列から選択される。例となる実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２２を含むか、またはこれからなる。別の例となる実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２３を含むか、またはこれからなる。別の例となる実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列を含む。一実施形態では、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３５の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む。別の例となる実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列を含む。一実施形態では、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３７の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む。

【0031】

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である。例となる一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９由来である。例となる別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８由来である。例となる別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９バリアントカプシドである。

【0032】

特定の実施形態では、本開示は、コード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内在性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、ｒＡＡＶを提供する。特定の実施形態では、本開示は、コード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、ｒＡＡＶを提供する。

【0033】

一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＡをコードする新規のコドン最適化核酸配列を提供する。一実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号１に示す野生型コード配列と８０％未満同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号２～６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１に示す野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号２～６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である、核酸配列を提供する。例となる実施形態では、本開示は、配列番号２～６から選択されるＰＣＣＡをコードする核酸配列を提供する。機能性ＰＣＣＡ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号２～６に示す核酸配列の断片をさらに提供する。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードする核酸配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。

【0034】

一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＢをコードする新規のコドン最適化核酸配列を提供する。一実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号７に示す野生型コード配列と８０％未満同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号８～１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、本開示は、配列番号７に示す野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号８～１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である、核酸配列を提供する。例となる実施形態では、本開示は、配列番号８～１２から選択されるＰＣＣＢをコードする核酸配列を提供する。機能性ＰＣＣＢ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号８～１２に示す核酸配列の断片をさらに提供する。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードする核酸配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。

【0035】

特定の実施形態では、本開示は、ＰＡの処置における遺伝子治療の薬剤として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされた本明細書に記載のベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｈｕ３７）由来である。例となる実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクター、ＡＡＶ９バリアントベクター、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクター、またはＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ベクターである。

【0036】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用なｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）エンハンサー配列、（ｃ）プロモーター配列、（ｄ）イントロン配列、（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列、（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）３’ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0037】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用なｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された分として５’から３’の順に（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）エンハンサー配列、（ｃ）プロモーター配列、（ｄ）イントロン配列、（ｅ）配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）３’ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0038】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用なｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）エンハンサー配列、（ｃ）プロモーター配列、（ｄ）イントロン配列、（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列、（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）３’ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0039】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用なｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）エンハンサー配列、（ｃ）プロモーター配列、（ｄ）イントロン配列、（ｅ）配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）３’ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0040】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用なｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に（ａ）ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列、（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列、（ｄ）ｒＨＢＢまたはＳＶ４０スモールＴイントロン配列、（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列、（ｆ）ＢＧＨまたはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）ＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0041】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用なｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に（ａ）ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列、（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列、（ｄ）ｒＨＢＢまたはＳＶ４０スモールＴイントロン配列、（ｅ）配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、（ｆ）ＢＧＨまたはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および（ｇ）ＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。

【0042】

特定の実施形態では、本開示は、（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）プロモーター配列、（ｃ）ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列、および（ｄ）３’－ＩＴＲ配列を含む、組換え核酸構築物を提供する。特定の実施形態では、本開示は、（ａ）５’－ＩＴＲ配列、（ｂ）プロモーター配列、（ｃ）ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列、および（ｄ）３’－ＩＴＲ配列を含む、組換え核酸構築物を提供する。

【0043】

一部の態様では、本開示は、ＰＡの処置のための本明細書に開示のｒＡＡＶの使用であって、このｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含む。例となる実施形態では、パッケージングされたゲノムはまた、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、プロモーターの下流にイントロン、および３’－ＩＴＲの上流にポリアデニル化配列を含む。例となる一実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ＰＣＣＡのコード配列、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号１～６から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0044】

一部の態様では、本開示は、ＰＡの処置のための本明細書に開示のｒＡＡＶの使用であって、このｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列（例えば、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーター配列）、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列、および３’－ＩＴＲを含む。例となる実施形態では、パッケージングされたゲノムはまた、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、プロモーターの下流にイントロン、および３’－ＩＴＲの上流にＰＣＣＡ遺伝子特異的ポリアデニル化配列を含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列の下流、およびＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列の上流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号１～６から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0045】

一部の態様では、本開示は、ＰＡの処置のための本明細書に開示のｒＡＡＶの使用であって、このｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に含むパッケージングされたゲノムは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含む。例となる実施形態では、パッケージングされたゲノムはまた、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、プロモーターの下流にイントロン、および３’－ＩＴＲの上流にポリアデニル化配列を含む。例となる一実施形態では、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に含むパッケージングされたゲノムは、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ＰＣＣＢのコード配列、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号７～１２から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0046】

一部の態様では、本開示は、ＰＡの処置のための本明細書に開示のｒＡＡＶの使用であって、このｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列（例えば、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーター配列）、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列、および３’－ＩＴＲを含む。例となる実施形態では、パッケージングされたゲノムはまた、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、プロモーターの下流にイントロン、および３’－ＩＴＲの上流にＰＣＣＢ遺伝子特異的ポリアデニル化配列を含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全ヌクレオチド配列の下流、およびＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列の上流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号７～１２から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0047】

本開示は、本明細書に開示のｒＡＡＶを含む医薬組成物にさらに関する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内投与用に製剤化される。例となる実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。

【0048】

さらに別の態様では、本開示は、治療有効量の本明細書に開示の少なくとも１つのｒＡＡＶをヒト対象に投与するステップを含む、ヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。

【0049】

特定の実施形態では、本開示は、（１）ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶ、ならびに（２）ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、同時に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、連続的に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、別々に投与され得る。

【0050】

特定の実施形態では、本開示は、（１）ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶ、ならびに／または（２）ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、同時に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、連続的に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、別々に投与され得る。

【0051】

特定の実施形態では、本開示は、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に、治療有効量の本明細書に開示の少なくとも１つのｒＡＡＶを投与するステップを含む、ヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、ＰＣＣＡにおける変異は、表１から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号１～６から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0052】

一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に、治療有効量の本明細書に開示の少なくとも１つのｒＡＡＶを投与するステップを含む、ヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、ＰＣＣＢにおける変異は、表２から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号７～１２から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0053】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内に投与される。例となる実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^１１～約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^１２～約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、単一用量のｒＡＡＶを投与する。他の実施形態では、複数用量のｒＡＡＶを投与する。

【0054】

一部の態様では、本明細書に開示の組換え核酸分子、ＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶを含む、宿主細胞を本明細書において提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶの増殖に適し得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ－５細胞から選択される。

【0055】

本発明のこれらおよび他の態様および特徴は、本開示の以下の節に記載する。

【0056】

本発明は、以下の図の参照により、さらに完全に理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】図１は、一実施形態による、ＰＣＣＡを含む例となるパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す例示的な図である。５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＰＣＣＡコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、および３’－ＩＴＲは、それぞれ図において１、２、３、４、５、６、７および８により表す。

【0058】

【図2】図２は、一実施形態による、ＰＣＣＢを含む例となるパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す例示的な図である。５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＰＣＣＢコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、および３’－ＩＴＲは、それぞれ図において１、２、３、４、５、６、７および８により表す。

【0059】

【図3】図３は、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）を継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）にトランスフェクションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＡ ＲＮＡ発現における倍率変化を示す棒グラフである。

【0060】

【図4A】図４Ａは、レーン１～レーン７にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、ヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列およびヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６５）、または増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）をトランスフェクトした継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）において、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0061】

【図4B】図４Ｂは、レーン１～レーン７にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質、ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、ヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列およびヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６５）をトランスフェクトした継代肝細胞株（Ｈｕｈ７）において、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0062】

【図5】図５は、全細胞溶解液（ＷＣＬ）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）をトランスフェクトするか、またはトランスフェクトしない継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）から単離した細胞内画分（細胞質画分（ｃｙｔｏ）およびミトコンドリア画分（ミトコンドリア））における、ウエスタンブロットにより検出したＰＣＣＡタンパク質発現レベルを示す画像である。１Ｘおよび２Ｘは、ロードしたミトコンドリア画分の相対容量を表す。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0063】

【図6】図６は、左から右に、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）を継代腎細胞株（ＨＥＫ２９３）に３重トランスフェクションした後のｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＡ ＡＡＶ９力価（ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬによる）の倍率変化を示す棒グラフである。それぞれを、ＡＡＶ９カプシドを発現するプラスミド（ｐＡＡＶ２／９）およびアデノウイルスヘルパー機能を供給するプラスミド（ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ）を同時トランスフェクトした細胞において発現させる。非トランスフェクト細胞を対照として使用し、「ｎｏＴＸ」として表す。

【0064】

【図7】図７は、左から右にそれぞれ、ＰＣＣＡおよびＰＣＣＢ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３６５）、ＰＣＣＡ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３４９、ＤＴＣ３４８、ＤＴＣ３４７またはＤＴＣ３４６）またはｅＧＦＰ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３４３）を含むアフィニティ精製したＡＡＶ９粒子のＤＮＡアルカリアガロースゲルの画像である。

【0065】

【図8】図８は、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）、またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３７０、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９またはＤＴＣ３７１）を継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）にトランスフェクションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＢ ＲＮＡ発現における倍率変化を示す棒グラフである。

【0066】

【図9A】図９Ａは、レーン１～レーン８にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）をトランスフェクトした継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）における、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0067】

【図9B】図９Ｂは、レーン１～レーン８にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）をトランスフェクトした継代肝細胞株（Ｈｕｈ７）における、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0068】

【図10】図１０は、全細胞溶解液（ＷＣＬ）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）をトランスフェクトするか、またはトランスフェクトしない継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）から単離した細胞内画分（細胞質画分（ｃｙｔｏ）およびミトコンドリア画分（ミトコンドリア））における、ウエスタンブロットにより検出したＰＣＣＢタンパク質発現レベルを示す画像である。１Ｘおよび２Ｘは、ロードしたミトコンドリア画分の相対容量を表す。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0069】

【図11】図１１は、左から右に、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）を継代腎細胞株（ＨＥＫ２９３）に３重トランスフェクションした後のｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＢ ＡＡＶ９力価（ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬによる）の倍率変化を示す棒グラフである。それぞれを、ＡＡＶ９カプシドを発現するプラスミド（ｐＡＡＶ２／９）およびアデノウイルスヘルパー機能を供給するプラスミド（ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ）を同時トランスフェクトした細胞において発現させる。非トランスフェクト細胞を対照として使用し、「ｎｏＴＸ」として表す。

【0070】

【図12】図１２は、左から右にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、ｅＧＦＰ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３４３）またはＰＣＣＢ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３６６、ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）を含むアフィニティ精製したＡＡＶ９粒子のＤＮＡアルカリアガロースゲルの画像である。

【0071】

【図13】図１３は、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列（ＤＴＣ３４６）またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）をコードするｒＡＡＶによる処置後の野生型ＦＶＢマウスにおけるマウス内因性ＰＣＣＡ発現に対するヒトＰＣＣＡタンパク質発現の百分率を示す棒グラフである。エラーバーは、標準偏差を表す。

【0072】

【図14】図１４は、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列（ＤＴＣ３４６）またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）をコードするｒＡＡＶによる処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）において発現したヒト野生型ＰＣＣＡタンパク質の濃度（ｎｍｏｌ／ｇタンパク質による）を示す棒グラフである。列挙する百分率の数は、野生型ＦＶＢマウスの内因性ＰＣＣＡタンパク質レベルに対する百分率として算出したヒト野生型ＰＣＣＡ発現を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。

【0073】

【図15】図１５は、１分あたりの平均カウント（ＣＰＭ）データにより測定した、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるヒトＰＣＣＡ活性の棒グラフである。エラーバーは、標準偏差を表す。列挙する百分率の数は、野生型ＦＶＢマウスにおいて観察されたものに対するＣＰＭデータを記載する。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して、＊＊は、ＰＢＳ処置群との比較によりｐ＜０．０１を表す。

【0074】

【図16-1】図１６Ａ～Ｃは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるプロピオン酸血症の既知のバイオマーカーの濃度を示す棒グラフである。図１６Ａは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるＣ３（プロピオニルカルニチン）の血漿濃度を示す棒グラフである。図１６Ｂは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるＣ３／Ｃ２（プロピオニルカルニチン／アセチルカルニチン）の血漿濃度比の棒グラフである。図１６Ｃは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡマ発現低下ウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）における２－メチルクエン酸（２ＭＣ）の血漿濃度を示す棒グラフである。Ｐｒｅは、ｒＡＡＶの注射０～１４日前を示し、２Ｗは、ｒＡＡＶ注射２週後を示し、３Ｗは、ｒＡＡＶ注射３週後を示し、４Ｗは、ｒＡＡＶ注射４週後を示し、６Ｗは、ｒＡＡＶ注射６週後を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して、＊＊は、ＰＢＳ処置群との比較によりｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、ＰＢＳ処置群との比較によりｐ＜０．００１を表す。

【図16-2】同上。

【発明を実施するための形態】

【0075】

本発明は、治療適用に使用する様々な新規の薬剤および組成物を提供する。本発明の核酸配列、ベクター、組換えウイルス、および関連する組成物は、本明細書に開示のように、ＰＡを回復、予防、または処置するために使用することができる。

【0076】

他に述べない限り、技術的用語は、通常の使用法に従って使用する。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５ （ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見出され得る。

【0077】

本開示の種々の実施形態の再考察を容易とするために、特定の用語について以下の説明を提供する。

【0078】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：小型で複製欠損の、エンベロープを有しないウイルスであり、ヒトおよび他の一部の霊長類種に感染する。ＡＡＶは、疾患を生じないとされており、誘発する免疫応答は非常に軽度である。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染させることができ、染色体外の状態で存続可能であり宿主細胞のゲノムに組み込む必要がない。このような特徴により、ＡＡＶは、遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターとなっている。現在、認識されている１２種のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～１２）が存在する。

【0079】

投与／投与する：対象に薬剤、例えば、治療薬（例えば、組換えＡＡＶ）を、任意の有効経路により提供または与えること。例となる投与経路としては、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣内、および吸入による経路が挙げられるが、これらに限定されない。

【0080】

コドン最適化：「コドン最適化」核酸は、コドンが特定の系（例えば、特定の種または種の群）における発現に最適であるように変更されている核酸配列を指す。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現のために最適化することができる。コドン最適化では、コードされたタンパク質のアミノ酸配列は変更しない。

【0081】

エンハンサー：プロモーターの活性を高めることにより転写率を上昇させる核酸配列。

【0082】

イントロン：タンパク質のコード情報を含まない遺伝子内のひと続きのＤＮＡ。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。

【0083】

逆位末端反復（ＩＴＲ）：効率的な複製に必要とされるアデノ随伴ウイルスのゲノム内の対称的な核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成のための複製起点として作用し、ＡＡＶ組込みベクターの生成に必須のｃｉｓ成分である。

【0084】

単離物：生物の細胞もしくは組織または生物それ自体における他の生物学的成分から実質的に分離または精製した「単離」生物学的成分（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）であり、この成分は、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞のように天然に存在する。「単離」された核酸分子およびタンパク質は、標準的精製方法により精製されたものを含む。また、この用語は、宿主細胞において組換え発現により調製した核酸分子およびタンパク質ならびに化学的に合成した核酸分子およびタンパク質を包含する。

【0085】

作動可能に連結：第１の核酸配列を第２の核酸配列と機能的関係において配置する場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結させる。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結させる。一般には、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、同一のリーディングフレームにおいて近接し、２つのタンパク質コード領域の連結に必要な場所に存在する。

【0086】

薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、通常のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９７５）では、１つまたは複数の治療化合物、分子または薬剤の医薬送達に適する組成物および製剤を記載している。

【0087】

一般には、担体の性質は、利用される特定の投与方法に依存する。例えば、非経口的製剤では、薬学的および生理学的に許容される液体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセリン等をビヒクルとして含む注射液を通常含む。固形組成物、例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセルの形態では、通常の非毒性固形担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与する医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含み得る。

【0088】

疾患の予防、処置または回復：疾患（例えば、ＰＡ）の「予防」は、疾患の完全な発症の阻害を指す。「処置」は、疾患または病態（例えば、ＰＡ）の兆候または症状を、発症を開始した後に回復させる治療介入を指す。「回復」は、疾患（例えば、ＰＡ）の兆候または症状の数または重症度の低下を指す。

【0089】

プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を方向づける／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは、転写開始部位の付近に必要な核酸配列を含む。多くのプロモーター配列が当業者に公知であり、人工核酸分子における種々のプロモーター配列の組合せも、やはり可能である。本明細書において使用する場合、遺伝子特異的内因性プロモーターは、目的の内因性遺伝子の発現を制御する天然プロモーターエレメントを指す。例となる実施形態では、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターは、ＰＣＣＡ遺伝子の発現を制御する。例となる別の実施形態では、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターは、ＰＣＣＢ遺伝子の発現を制御する。

【0090】

精製物：用語「精製物」は、絶対的純度を必要とせず、むしろ、相対的用語を意図する。したがって、例えば、精製ペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に付随するタンパク質および他の夾雑物から全部または部分的に単離されたものである。特定の実施形態では、用語「実質的精製物」は、細胞、細胞培養培地、または他の粗製物から単離し、分画に供して最初の調製物の種々の成分、例えば、タンパク質、細胞残屑および他の成分が除去されている、ペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物を指す。

【0091】

組換え体：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、または配列の２つの他の別々のセグメントの人工的組合せにより生成された配列を有するものである。この人工的組合せは、化学合成または核酸分子の単離したセグメントの人工的操作、例えば、遺伝子改変技術により達成することができる。

【0092】

同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない、または異なる起源の少なくとも２つの配列の人工的組合せにより生成される、配列（例えば、ゲノム配列）を含むウイルスである。また、用語「組換え体」は、天然核酸分子、タンパク質またはウイルスの部分の付加、置換、または欠失により単独で変更されている、核酸、タンパク質およびウイルスを含む。本明細書において使用する場合、「組換えＡＡＶ」は、組換え核酸分子、例えば、ＰＣＣＡをコードする組換え核酸分子および／またはＰＣＣＢをコードする組換え核酸分子がパッケージングされているＡＡＶ粒子を指す。

【0093】

配列同一性：２つもしくはそれよりも多い核酸配列、または２つもしくはそれよりも多いアミノ酸配列間の同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性に関して表す。配列同一性は、百分率同一性に関して測定することができ、百分率が高いほど、配列は同一である。配列類似性は、百分率類似性（保存的アミノ酸置換を考慮する）に関して測定することができ、百分率が高いほど、配列は類似する。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的方法を使用してアラインメントした場合、相対的に高度な配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より遠縁の種（例えば、ヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの配列）と比較して、より近縁の種（例えば、ヒトおよびマウスの配列）に由来する場合、より顕著である。

【0094】

比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４， １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ， ７３：２３７－４４， １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－３， １９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８８１－９０， １９８８；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８， １５５－６５， １９９２；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｒｉｏ． ２４：３０７－３１， １９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０では、配列アラインメント方法および相同性算出の詳細な考察を示す。

【0095】

ＮＣＢＩのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０）は、配列解析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連する使用のために、米国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）およびインターネット上を含む、いくつかの供給源から入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる。

【0096】

血清型：抗原の特性集合により識別される近縁の微生物（例えば、ウイルス）の群。

【0097】

スタッファー配列：大型の核酸分子（例えば、ベクター）に含まれるヌクレオチドの配列を指し、２つの核酸物質間（例えば、プロモーターとコード配列との間）に所望のスペースを生成するか、または核酸分子を伸長して所望の長さとするのに典型的に使用する。スタッファー配列は、タンパク質コード情報を含まず、不明／合成の起源であり、および／または大型の核酸分子内の他の核酸配列とは無関係であり得る。

【0098】

対象：生多細胞脊椎生物であり、ヒトおよび非ヒト哺乳動物含む種類。

【0099】

合成物：研究室において人工的手段により生成され、例えば、合成核酸は、研究室において化学的に合成され得る。

【0100】

非翻訳領域（ＵＴＲ）：コード領域の上流および下流にそれぞれ５’非翻訳領域（「５’ＵＴＲ」）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む典型的ｍＲＮＡ（Ｍｉｇｎｏｎｅ Ｆ． ｅｔ． ａｌ．， （２００２） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３：ＲＥＶＩＥＷＳ０００４を参照）。

【0101】

治療有効量：薬剤により処置する対象または細胞において所望の作用を達成するのに十分な特定の医薬品または治療薬（例えば、組換えＡＡＶ）の量。有効量の薬剤は、それらに限定されないが、処置する対象または細胞および治療組成物の投与方法を含む、いくつかの因子に依存する。

【0102】

ベクター：ベクターは、ベクターの複製能および／または宿主細胞に組み込む能力を妨害することなく外来核酸の挿入を可能とする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞における複製を可能とする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。また、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入した１つまたは複数の遺伝子の転写および翻訳を可能とするのに必要な制御配列を含むベクターである。本明細書における一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。

【0103】

他に説明しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。単数の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他に指示しない限り、複数の参照対象を含む。「ＡまたはＢを含む」は、ＡもしくはＢまたはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドのために示す、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびにすべての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を、本開示の実践または試験において使用することができるが、適する方法および材料は、以下に記載する。本明細書において言及するすべての公表文献、特許出願、特許、および他の参考文献は、これらの全体を参照により組み込む。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、制限することは意図しない。
ウイルスベクター：

【0104】

一部の態様では、本開示は、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。

【0105】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、切断型または完全なヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲヌクレオチド配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクターを提供する。

【0106】

一部の態様では、本開示は、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクターを提供する。

【0107】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、切断型または完全なヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲヌクレオチド配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクターを提供する。

【0108】

一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、本明細書に記載のエンハンサー、イントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、および／またはポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。一部の実施形態では、組換えベクターは、１つまたは複数のスタッファー核酸配列をさらに含み得る。一実施形態では、スタッファー核酸配列は、イントロンとＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列との間に位置する。

【0109】

本明細書に記載の種々の実施形態では、組換えウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のＡＡＶベクター（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２）ならびにヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離された１００種を超えるバリアントのいずれか１つであり得る。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２９９－３１０， ２００５およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２８５－２９７を参照されたい。任意の血清型のＡＡＶベクターを本発明において使用してもよく、ＡＡＶ血清型の選択は、遺伝子治療の標的とする細胞型（複数可）に部分的に依存する。ＰＡの処置では、肝臓は、適切な標的器官の１つである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型８（ＡＡＶ８）またはこのバリアントから選択される。例となる実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型９（ＡＡＶ９）またはこのバリアントである。

【0110】

一部の実施形態では、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がｔｒａｎｓに提供される場合、組換えＡＡＶベクターは、ベクターＤＮＡ複製起点とベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能するＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。加えて、ＩＴＲは、大型のＲｅｐタンパク質による一本鎖エンドヌクレアーゼによるニッキングの標的となり、複製中間体から個々のゲノムを分割する。

【0111】

一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来であり、配列番号１５を含むか、またはこれからなる。他の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源由来である。

【0112】

例となる一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクターであり、ベクターは、本明細書に記載のエンハンサー、プロモーター、イントロン、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢのコード配列、およびポリアデニル化シグナルを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ９ベクターは、２つのＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を、一方はエンハンサーの５’に、他方はポリアデニル化シグナルの３’にさらに含む。例となる実施形態では、ＡＡＶ９ベクターは、２つのＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を、一方はエンハンサーの５’に、他方はポリアデニル化シグナルの３’に含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、配列番号１５を含むか、またはこれからなる。例となる別の実施形態では、ＡＡＶ９ベクターは、２つのＡＡＶ９逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を、一方はエンハンサーの５’に、他方はポリアデニル化シグナルの３’に含む。
プロモーター：

【0113】

本明細書に記載の種々の態様では、導入遺伝子発現、例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの発現の駆動および制御に役立つプロモーター配列を含むパッケージングされたゲノムを含む、ウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーター、およびＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターから選択される。例となる実施形態では、プロモーター配列は、選択された５’－ＩＴＲ配列とＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列との間に位置する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサー配列の下流に位置する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、イントロン配列の上流に位置する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、選択された５’－ＩＴＲ配列とヒトＰＣＣＡまたはヒトＰＣＣＢ５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の切断型または完全なヌクレオチド配列との間に位置する。

【0114】

一部の例示的実施形態では、ＣＭＶ前初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）の下流に必要に応じて位置し得る、ユビキタスなニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）を使用する。一部の特定の実施形態では、本明細書に記載のパッケージングされたゲノムは、天然ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢプロモーターエレメントを含む。一部の例示的実施形態では、本明細書に記載のパッケージングされたゲノムは、パッケージングされたゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、配列番号３４の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のパッケージングされたゲノムは、配列番号３４の等長領域と少なくとも９５％同一である、約１５（例えば、約３０、約４５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５または約７５０）個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターを含む。一部の例示的実施形態では、本明細書に記載のパッケージングされたゲノムは、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、配列番号３４の等長領域と１００％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターを含む。

【0115】

一部の例示的実施形態では、本明細書に記載のパッケージングされたゲノムは、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、配列番号３６の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のパッケージングされたゲノムは、配列番号３６の等長領域と少なくとも９５％同一である、約１５（例えば、約３０、約４５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５または約４５０）個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターを含む。一部の例示的実施形態では、本明細書に記載のパッケージングされたゲノムは、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、配列番号３６の等長領域と１００％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターを含む。

【0116】

一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、およびＣＡＧプロモーターから選択される。例となる実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。一実施形態では、ＣＢＡプロモーターは、配列番号１８を含むか、またはこれからなる。

【0117】

プロモーターに加えて、パッケージングされたゲノムは、他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、および効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含み得る。さらに詳細に以下に記載するように、このような配列は、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、発現を増強する制御エレメント（すなわち、ＷＰＲＥ）、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびタンパク質安定性を増強する配列を含む。

【0118】

一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、イントロン配列の下流に位置する。一部の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号２４）である。当業者により理解されるように、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、コード配列のすぐ上流に典型的に位置し、この場合、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列のすぐ上流に位置する。当業者により理解されるように、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、治療ポリペプチド、例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの開始コドンに対応するＡＴＧ残基を共有すると考えられ得る。開示の単純化のために、本明細書に記載する場合、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、治療ポリペプチド、例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢと共有されない領域に対応する６ヌクレオチド配列を含む。
非翻訳領域（ＵＴＲ）：

【0119】

内因性遺伝子特異的ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳開始因子およびリボソームの細胞転写物との競合、ｍＲＮＡ崩壊または転写後遺伝子サイレンシングの最小化によるｍＲＮＡ半減期の延長、ならびに制御タンパク質または阻害ＲＮＡ二次構造との有害相互作用の回避による導入遺伝子生成の最適化において重要な役割を果たすことで知られている（Ｃｈｉｂａ， Ｙ．， ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ， Ｐ． （２００９）． Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． ５２， １１４－１２４、Ｍｏｏｒｅ， Ｍ． Ｊ．， ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， Ｎ． Ｊ． （２００９）． Ｃｅｌｌ １３６， ６８８－７００、Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｊ．， ｅｔ． ａｌ． （２０１０）． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１， １１３－１２７を参照）。タンパク質コード配列の下流に位置する３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、転写物切断、安定性およびポリアデニル化、翻訳ならびにｍＲＮＡ局在化を含む、多数の制御プロセスに関与することがわかっている。したがって、これらは、ｍＲＮＡの運命決定において重要である（Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｌ．Ｗ．， ｅｔ． ａｌ． （２０１２）． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ｎｏｖ； ６９（２１）： ３６１３－３６３４を参照）。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＰＣＣＡまたはＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列を含む、パッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＰＣＣＡまたはＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列を含む、パッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。

【0120】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、切断型または完全なヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲヌクレオチド配列、およびＡＡＶ３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、パッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。

【0121】

特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、切断型または完全なヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲヌクレオチド配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。

【0122】

特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、配列番号３０により表す完全なヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、配列番号３２により表す完全なヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲを含む。

【0123】

特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、切断型天然ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、切断型ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲは、配列番号３０の等長領域と少なくとも９５％同一である、約５０個の連続するヌクレオチド～約１４００個の連続するヌクレオチド（例えば、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１０２５、約１０５０、約１０７５、約１１００、約１１２５、約１１５０、約１１７５、約１２００、約１２２５、約１２５０、約１２７５、約１３００、約１３２５または約１３５０個）のヌクレオチド配列を含む。

【0124】

特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、切断型天然ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、切断型ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲは、配列番号３２の等長領域と少なくとも９５％同一である、約５０個の連続するヌクレオチド～約１４００個の連続するヌクレオチド（例えば、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１０２５、約１０５０、約１０７５、約１１００、約１１２５、約１１５０、約１１７５、約１２００、約１２２５、約１２５０、約１２７５、約１３００、約１３２５または約１３５０個）のヌクレオチド配列を含む。

【0125】

特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、配列番号３１により表す完全なヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、配列番号３３により表す完全なヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲを含む。

【0126】

特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、切断型天然ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、切断型ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲは、配列番号３１の等長領域と少なくとも９５％同一である、約１５（例えば、約３０、約４５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０）個の連続するヌクレオチド配列を含む。

【0127】

特定の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、切断型天然ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、切断型ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲは、配列番号３３の等長領域と少なくとも９５％同一である、約１５（例えば、約３０、約４５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０または約１５０個の連続するヌクレオチド配列を含む。
ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチド：

【0128】

本明細書に記載するように、本発明の態様では、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含む組換えベクターを提供する。さらに、ＡＡＶ５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、およびＡＡＶ３’－ＩＴＲを含む、パッケージングされたゲノムを含む組換えベクターを記載する。

【0129】

一実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、野生型コード配列である。本明細書において使用する場合、用語「野生型」は、天然に存在するバイオポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）と同一のバイオポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）を指す。

【0130】

代替の実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、コドン最適化コード配列である。一実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。

【0131】

本明細書に記載の種々の実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢのコード配列を含むパッケージングされたゲノムを含むベクターを提供する。本明細書に記載のベクターにより送達されるポリペプチドは、ヒトを含む哺乳動物の処置において使用し得る、ＰＣＣＡおよびＰＣＣＢポリペプチドを包含する。

【0132】

一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターにより発現するポリペプチドは、ＰＣＣＡ（配列番号１６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００２７３．２；７２８アミノ酸）またはこの機能性断片、機能性バリアント、もしくは機能性アイソフォームである。一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターにより発現するポリペプチドは、ＰＣＣＡであり、配列番号１６を含むか、またはこれからなる。

【0133】

一実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、配列番号１に示す野生型コード配列によりコードされる。別の実施形態では、ＰＣＣＡの天然アイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列を使用してもよく、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０５１６５－１（配列番号２５）、Ｐ０５１６５－２（配列番号２６）およびＰ０５１６５－３（配列番号２７）に示すものが挙げられる。代替の実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、コドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、配列番号１に示す野生型コード配列と８０％未満同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。例となる一部の実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、配列番号２～６から選択されるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。

【0134】

一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターにより発現するポリペプチドは、ＰＣＣＢ（配列番号１７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５２３．２；５３９アミノ酸）またはこの機能性断片、機能性バリアント、もしくは機能性アイソフォームである。一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターにより発現するポリペプチドは、ＰＣＣＢであり、配列番号１７を含むか、またはこれからなる。

【0135】

一実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、配列番号７に示す野生型コード配列によりコードされる。別の実施形態では、ＰＣＣＢの天然アイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列を使用してもよく、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０５１６６－１（配列番号２８）およびＰ０５１６６－２（配列番号２９）に示すものが挙げられる。代替の実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、コドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、配列番号７に示す野生型コード配列と８０％未満同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。例となる一部の実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、配列番号８～１２から選択されるコドン最適化コード配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。

【0136】

種々の態様では、本発明は、本明細書に記載のＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチドの断片、バリアント、アイソフォーム、または融合物を送達するのに使用し得る。

【0137】

一部の実施形態では、本発明は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００アミノ酸残基を含み、完全長ポリペプチドと関連する１つまたは複数の活性（例えば、酵素の場合は触媒活性）を保持する、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチドの断片を送達するのに使用し得る。このような断片は、当技術分野において日常的かつ周知の組換え技術により得られ得る。その上、このような断片は、当業者に公知の日常的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイにより、触媒活性について試験し得る。例えば、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）活性は、（１）１ｍＭの２メルカプトエタノールおよび０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりポリペプチドを希釈し、（２）５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭのグルタチオン、２ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭの［^１４Ｃ］炭酸水素塩（特異的活性１２．４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、３ｍＭのプロピオニルＣｏＡを含む標準的反応混合物を用いて３７℃で１５分間インキュベートし、（３）１０％のトリクロロ酢酸の追加により反応を停止させ、（４）２００×ｇで遠心分離し、（５）加熱ランプ下でアリコートを乾燥させ、（６）水に溶解させ、（７）Ａｑｕａｓｏｌ中で計数することにより定量することができ、この場合、１単位の酵素活性は、３７℃で１ｐｍｏｌの炭酸水素塩／分の固定を触媒する量の酵素として定義する。ＰＣＣ活性アッセイの説明についてＫａｌｏｕｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５（１）： ６０－６５およびＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．， １９７３ Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． ８３： ６２５－６２８を参照されたい。本発明は、上記のポリペプチド断片をコードする核酸分子をさらに含む。

【0138】

一部の実施形態では、本発明は、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチドのバリアントを送達するのに使用し得る。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、野生型治療ポリペプチド、例えば、配列番号１６の野生型ＰＣＣＡポリペプチドまたは配列番号１７の野生型ＰＣＣＢポリペプチドと少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％）同一であり得る。一部の実施形態では、バリアント治療ポリペプチドは、それぞれの野生型ポリペプチドと比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の異なる残基を有し得る。このようなバリアントは、当技術分野において日常的かつ周知の組換え技術により得られ得る。その上、このようなバリアントは、当業者に公知の日常的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイにより、触媒活性について試験し得る。プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ活性アッセイの説明について、例えば、Ｋａｌｏｕｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５（１）： ６０－６５およびＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．， １９７３ Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． ８３： ６２５－６２８を参照されたい。本発明は、上記の治療ポリペプチドバリアントをコードする核酸分子をさらに含む。
新規のコドン最適化配列：

【0139】

一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＡをコードする新規のコドン最適化核酸配列を提供する。一実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号１に示す野生型コード配列と８０％未満同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号２～６と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％）同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号２～６から選択される配列と１００％同一である。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１に示す野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号２～６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である核酸配列を提供する。例となる実施形態では、本開示は、配列番号２～６から選択される、ＰＣＣＡをコードする核酸配列を提供する。機能性ＰＣＣＡ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号２～６に示す核酸配列の断片をさらに提供する。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードする核酸配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。

【0140】

一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＢをコードする新規のコドン最適化核酸配列を提供する。一実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号７に示す野生型コード配列と８０％未満同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号８～１２と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％）同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号８～１２から選択される配列と１００％同一である。一部の実施形態では、本開示は、配列番号７に示す野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号８～１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である核酸配列を提供する。例となる実施形態では、本開示は、配列番号８～１２から選択される、ＰＣＣＢをコードする核酸配列を提供する。機能性ＰＣＣＢ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号８～１２に示す核酸配列の断片をさらに提供する。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードする核酸配列は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る。
ベクターゲノムエレメント：

【0141】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、１つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一実施形態では、エンハンサーは、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびＡｐｏＥエンハンサーから選択される。例となる実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである。一実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１９を含むか、またはこれからなる。

【0142】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、１つまたは複数のイントロン配列をさらに含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、イントロンは、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットベータ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、またはｈＦＩＸイントロンから選択される。一つの例となる実施形態では、イントロンは、ＳＶ４０スモールＴイントロンである。一実施形態では、ＳＶ４０スモールＴイントロン配列は、配列番号２０を含むか、またはこれからなる。別の例となる実施形態では、イントロンは、ｒＨＢＢイントロンである。一部の実施形態では、ｒＨＢＢイントロン配列は、配列番号２１を含むか、またはこれからなる。

【0143】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。一実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列から選択される。例となる実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２２を含むか、またはこれからなる。例となる別の実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２３を含むか、またはこれからなる。一実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である。例となる実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＡのものである場合、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である。特定の実施形態では、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３５の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３５の等長領域と少なくとも９５％同一である、約１５（例えば、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０または約１６０）個の連続するヌクレオチド配列を含む。例となる別の実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ベクターゲノムにおける部分的または完全なコード配列がＰＣＣＢのものである場合、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である。特定の実施形態では、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３７の等長領域と少なくとも９５％同一である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号３７の等長領域と少なくとも９５％同一である、約１５（例えば、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０または約１００）個の連続するヌクレオチド配列を含む。
ＡＡＶカプシド：

【0144】

別の態様では、本開示は、ＰＡの処置における遺伝子治療のための薬剤として有用なｒＡＡＶであって、ＡＡＶカプシド、およびそこにパッケージングされた本明細書に記載のベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｈｕ３７）由来である。例となる実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクター、ＡＡＶ９バリアントベクター、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクター、またはＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ベクターである。

【0145】

ＡＡＶ９カプシドは、複数のＡＡＶ９ｖｐタンパク質からなる自己集合ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ｖｐタンパク質は、配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＡＡＳ９９２６４）のｖｐ１アミノ酸配列をコードする、配列番号１３の核酸配列、またはこれと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列によりコードされる選択的スプライシンングバリアントとして典型的に発現する。このようなスプライシングバリアントは、配列番号１４の異なる長さのタンパク質を生じる。特定の実施形態では、ＡＡＶ９カプシドは、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一であるか、または配列番号１４と９９％同一であるアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。米国特許第７，９０６，１１１号および国際公開第２００５／０３３３２１号も参照されたい。本明細書において使用する場合、ＡＡＶ９バリアントは、例えば、国際公開第２０１６／０４９２３０号、米国特許第８，９２７，５１４号、米国特許出願公開第２０１５／０３４４９１１号、および米国特許第８，７３４，８０９号に記載のものを含む。

【0146】

本明細書に示すように、ＡＡＶ９配列およびタンパク質は、ｒＡＡＶの生成において有用である。しかし、他の実施形態では、別のＡＡＶカプシドが選択される。組織特異性は、カプシド型により決定される。適する標的（例えば、肝臓、筋肉、肺、またはＣＮＳ）に形質導入するＡＡＶ血清型は、ＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として選択でき、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ８が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８号、および欧州特許第１３１０５７１号を参照されたい。国際公開第２００３／０４２３９７号（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７２８２１９９号および第７７９０４４９号（ＡＡＶ８）も参照されたい。加えて、まだ発見されていないＡＡＶまたはこれに基づく組換えＡＡＶも、ＡＡＶカプシドの供給源として使用し得る。また、これらの文書は、ＡＡＶの生成のために選択され得る他のＡＡＶについても記載しており、参照により組み込まれる。一部の実施形態では、ウイルスベクターにおける使用のためのＡＡＶカプシドは、上述のＡＡＶカプシドの１つまたはこれをコードする核酸の変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換）により生成することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２つまたは３つまたは４つまたはそれよりも多い上述のＡＡＶカプシドタンパク質由来のドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ由来のＶｐ１、Ｖｐ２およびＶｐ３単量体のモザイクである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、２つ以上の上述のカプシドを含む。
組換え核酸分子を含む宿主細胞：

【0147】

一部の態様では、本明細書に開示の組換え核酸分子、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶを含む宿主細胞を本明細書において提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶの増殖に適し得る。

【0148】

広範な宿主細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞等を使用し得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生成に適切な細胞（または細胞株）、例えば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ－５細胞であり得る。

【0149】

組換え核酸分子またはベクターは、当技術分野において公知の適する任意の方法を使用して、宿主細胞培養物に送達することができる。一部の実施形態では、組換え核酸分子またはベクターをゲノムに挿入した、適する宿主細胞株を生成する。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを含む、適する宿主細胞株を生成する。ｒＡＡＶベクターの宿主細胞培養物へのトランスフェクション後、ｒＡＡＶの宿主ゲノムへの組み込みは、Ｎａｋａｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３年）３４巻、２９７～３０２頁、Ｐｈｉｌｐｏｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００２年）７６巻（１１号）：５４１１～５４２１頁およびＨｏｗｄｅｎら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８年；１０巻：４２～５０頁によって記載されるとおり、抗生物質選択、蛍光標識細胞分取、サザンブロット、ＰＣＲに基づく検出、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの種々の方法によってアッセイされうる。さらに、安定細胞株は、Ｃｌａｒｋ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、６１巻（２００２年）：Ｓ９～Ｓ１５頁およびＹｕａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１年５月；２２巻（５号）：６１３～２４頁に記載のものなどの当技術分野において周知のプロトコールに従って確立されうる。
遺伝子治療のための組換えＡＡＶ：

【0150】

ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは、小型のエンベロープを有しないウイルスであり、直鎖の一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする。ＡＡＶ ＤＮＡのセンスおよびアンチセンスの両鎖は、ＡＡＶカプシドに同頻度でパッケージングされる。

【0151】

ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＢ）に隣接する２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）により特徴づけられる。ＡＡＶ２ゲノムでは、例えば、ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドは、折り畳んで塩基対形成を最大化し、Ｔ字型ヘアピン構造を形成する回文構造である。ＩＴＲの他の２０塩基は、Ｄ配列と呼ばれ、不対形成されないままである。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に重要なｃｉｓ作用配列であり、ＩＴＲは、複製起点であって、ＤＮＡポリメラーゼによる第２鎖合成のプライマーとして作用する。この合成において形成された二本鎖ＤＮＡは、複製形態単量体と呼ばれ、第２ラウンド自己プライミング複製に使用され、複製形態二量体を形成する。このような二本鎖中間体は、鎖置換機構を介してプロセシングされ、パッケージングに使用される一本鎖ＤＮＡおよび転写に使用される二本鎖ＤＮＡが生じる。Ｒｅｐ結合エレメントおよび末端分解部位（ＴＲＳ）は、ＩＴＲ内に位置する。これらの特徴は、ＡＡＶ複製においてウイルス制御タンパク質Ｒｅｐにより使用されて、二本鎖中間体がプロセシングされる。ＡＡＶ複製におけるこれらの役割に加えて、ＩＴＲはまた、ＡＡＶゲノムのパッケージング、転写、非許容条件下での負の制御、および部位特異的組込みに必須である（Ｄａｙｓ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

【0152】

ＡＡＶの左のＯＲＦは、Ｒｅｐ遺伝子を含み、これは、４つのタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする。右のＯＲＦは、Ｃａｐ遺伝子を含み、これは、３つのウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を生成する。ＡＡＶカプシドは、正２０面体対称に配置される６０個のウイルスカプシドタンパク質を含む。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０のモル比で存在する（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

【0153】

ＡＡＶは、現在、遺伝子治療に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。ＡＡＶは、ヒトおよび他の一部の霊長類種に感染するが、疾患を生じないとされており、誘発する免疫応答は非常に軽度である。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染させることができ、染色体外の状態で存続可能であり宿主細胞のゲノムに組み込む必要がない。ＡＡＶの有利な特徴により、本開示は、本明細書に開示の組換え核酸分子および方法のためのＡＡＶの使用を企図する。

【0154】

ＡＡＶは、標的細胞に結合して侵入し、核に侵入する能力、核において長時間発現する能力、および低い毒性を含む、遺伝子治療ベクターのいくつかの望ましい特徴を有する。しかし、小型のサイズのＡＡＶゲノムでは、組込み可能な異種ＤＮＡのサイズが制限される。この問題を最小化するために、Ｒｅｐおよび組込み効率エレメント（ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターが構築されている。ＩＴＲは、パッケージングに必要とされるｃｉｓシグナルであるため、保持される（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

【0155】

遺伝子治療に適するｒＡＡＶを生成するための方法は、当技術分野において周知であり（例えば、米国特許出願第２０１２／０１００６０６号、第２０１２／０１３５５１５号、第２０１１／０２２９９７１号、および第２０１３／００７２５４８号、ならびにＧｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（４）：３２１－３２９， ２００６を参照）、本明細書に開示の組換え核酸分子および方法とともに利用することができる。

【0156】

一部の態様では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のための本明細書に開示のｒＡＡＶであって、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶの使用を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となる実施形態では、パッケージングされたゲノムはまた、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、プロモーターの下流にイントロン、および３’－ＩＴＲの上流にポリアデニル化配列を含む。したがって、例となる別の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となる別の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、ヒトＰＣＣＡ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、ヒトＰＣＣＡ３’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となるさらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ＰＣＣＡのコード配列、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となるさらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、天然ＰＣＣＡプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ＰＣＣＡ５’－ＵＴＲのヌクレオチド配列、ＰＣＣＡのコード配列、天然ＰＣＣＡポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＡ３’－ＵＴＲのヌクレオチド配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、天然ＰＣＣＡ５’－ＵＴＲ配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号１～６から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0157】

ＰＣＣＡの発現のための例となるパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す例示的な図は、図１に示し、これは、５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＰＣＣＡコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを示す。

【0158】

一部の態様では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のための本明細書に開示のｒＡＡＶであって、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶの使用を提供し、ここで、パッケージングは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となる実施形態では、パッケージングされたゲノムはまた、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、プロモーターの下流にイントロン、および３’－ＩＴＲの上流にポリアデニル化配列を含む。したがって、例となる別の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となる別の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結する成分として５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、ヒトＰＣＣＢ５’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、ヒトＰＣＣＢ３’－ＵＴＲの切断型または完全なヌクレオチド配列、および３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となるさらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ＰＣＣＢのコード配列、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。例となるさらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、天然ＰＣＣＢプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ＰＣＣＢ５’－ＵＴＲのヌクレオチド配列、ＰＣＣＢのコード配列、天然ＰＣＣＢポリアデニル化シグナル配列、ＰＣＣＢ３’－ＵＴＲのヌクレオチド配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含むパッケージングされたゲノムを含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、天然ＰＣＣＢ５’－ＵＴＲ配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号７～１２から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0159】

ＰＣＣＢの発現のための例となるパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す例示的な図は、図２に示し、これは、５’から３’の順に、５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０スモールＴイントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＰＣＣＡコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを示す。
タンパク質局在性：

【0160】

プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼは、ミトコンドリアマトリクスに局在する多量体（ｍｕｔｉｍｅｒｉｃ）タンパク質である（Ｂｒｏｗｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２６４：１２６８０－５を参照）。したがって、ＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢ遺伝子（複数可）を送達する遺伝子治療ベクターが、機能性でミトコンドリアに局在するタンパク質をコードすることが可能であることは必要不可欠である。一態様では、本明細書に開示の１つまたは複数のウイルスベクターにより、ミトコンドリアに局在するＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢタンパク質（複数可）をコードする遺伝子の発現（例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの発現）が駆動および制御される。
医薬組成物：

【0161】

本明細書に開示のｒＡＡＶを含む組成物および薬学的に許容される担体を、本開示により提供する。ｒＡＡＶの投与に適する医薬製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２１９５２８号に見出すことができる。本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、通常のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９７５）では、１つまたは複数の治療化合物、分子または薬剤の医薬送達に適する組成物および製剤について記載している。

【0162】

前述の段落において強調されるように、本開示は、一部の態様では、本発明のｒＡＡＶを含む医薬組成物に関する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内投与用に製剤化する。例となる実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化する。

【0163】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ヒト対象における注入に適する緩衝液／担体中に製剤化される。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入管に固着するのを防ぐが、ｉｎ ｖｉｖｏでのｒＡＡＶ結合活性に干渉しない成分を含むべきである。種々の適する溶液は、緩衝生理食塩水、界面活性物質、および約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムと等価なイオン強度に調整した生理学的に適合する塩または塩の混合物、あるいは等価なイオン濃度に調整した生理学的に適合する塩の１つもしくは複数を含み得る。ｐＨは、６．５～８．５または７～８．５または７．５～８の範囲であり得る。適する界面活性物質、または界面活性物質の組合せは、ポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水鎖と隣接するポリオキシプロピレン１０（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水鎖からなる非イオン性トリブロック共重合体、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸（ｃａｐｒｙｌｌｉｃ）グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールの中から選択され得る。
プロピオン酸血症を処置する方法：

【0164】

さらに別の態様では、本開示は、治療有効量の本明細書に開示する少なくとも１つのｒＡＡＶをヒト対象に投与するステップを含む、ヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。

【0165】

一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、このベクターゲノムが、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。

【0166】

別の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、このベクターゲノムが、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。

【0167】

特定の実施形態では、本開示は、（１）ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶ、ならびに（２）ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、同時に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、連続的に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、別々に投与され得る。

【0168】

特定の実施形態では、本開示は、（１）ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶ、ならびに／または（２）ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＡを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、同時に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、連続的に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、別々に投与され得る。

【0169】

特定の実施形態では、本開示は、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に、治療有効量の本明細書に開示の少なくとも１つのｒＡＡＶを投与するステップを含む、ヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＢのものではなくＰＣＣＡのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、ＰＣＣＡにおける変異は、表１から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号１～６から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0170】

一部の実施形態では、本開示は、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に、治療有効量の本明細書に開示の少なくとも１つのｒＡＡＶを投与するステップを含む、ヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシド、およびコード配列が、ＰＣＣＡのものではなくＰＣＣＢのものであり、プロモーターが、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列ではなくＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性ポリアデニル化シグナル配列である、そこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。特定の実施形態では、ＰＣＣＢにおける変異は、表２から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号７～１２から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0171】

ＰＣＣＡおよびＰＣＣＢにおけるＰＡを生じる変異を記載する総説は、Ｕｇａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． １４（４）： ２７５－２８２において提供されている。

【0172】

変異ＰＣＣＡ遺伝子により生じるＰＡでは、ＰＣＣＡ遺伝子における以下の変異および多型が同定されている。

【表1】

【0173】

変異ＰＣＣＢ遺伝子により生じるＰＡでは、ＰＣＣＢ遺伝子における以下の変異および多型が同定されている。

【表2】

【0174】

一部の実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に開示する少なくとも１つのｒＡＡＶを前記ヒト対象に投与するステップを含む、表１から選択される、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、このベクターゲノムが、ＰＣＣＡもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、表１から選択される、ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号１～６から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0175】

一部の実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に開示する少なくとも１つのｒＡＡＶを前記ヒト対象に投与するステップを含む、表２から選択される、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、このベクターゲノムが、ＰＣＣＢもしくはこのアイソフォームまたはこの機能性断片もしくは機能性バリアントの部分的もしくは完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む、表２から選択される、ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてＰＡを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号７～１２から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0176】

適する任意の方法または経路を、本明細書に開示のｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ含有組成物を投与するのに使用することができる。投与経路は、例えば、全身、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）的投与経路が挙げられる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶを含む組成物、または複数のｒＡＡＶ（例えば、ＰＣＣＡを発現する第１のｒＡＡＶおよびＰＣＣＢを発現する第２のｒＡＡＶ）を含む組成物は、静脈内に投与される。

【0177】

投与する特定の用量は、各患者について均一の用量、例えば、１患者あたりウイルス１．０×１０^１１－１．０×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）であり得る。あるいは、患者の用量は、患者のおよその体重または表面積に応じて決定することができる。適切な用量の決定における他の因子は、処置または予防する疾患または症状、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的条件を含み得る。処置に適切な用量の決定に必要とされる算出のさらなる微調整は、特に、本明細書に開示する用量情報およびアッセイを考慮して、当業者により日常的に行われる。また、用量は、使用量を決定するための公知のアッセイの使用により、適切な用量応答データと組み合わせて決定することができる。また、個々の患者の用量は、監視する疾患の進行に応じて調整することができる。

【0178】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により測定した場合、例えば、患者の体重１キログラムあたり約１．０×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、患者の体重１キログラムあたり約５×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）～約５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０^１２～約１×１０^１３ＧＣ／ｋｇの用量で投与する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^１２～１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１．１×１０^１１、約１．３×１０^１１、約１．６×１０^１１、約１．９×１０^１１、約２×１０^１１、約２．５×１０^１１、約３．０×１０^１１、約３．５×１０^１１、約４．０×１０^１１、約４．５×１０^１１、約５．０×１０^１１、約５．５×１０^１１、約６．０×１０^１１、約６．５×１０^１１、約７．０×１０^１１、約７．５×１０^１１、約８．０×１０^１１、約８．５×１０^１１、約９．０×１０^１１、約９．５×１０^１１、約１．０×１０^１２、約１．５×１０^１２、約２．０×１０^１２、約２．５×１０^１２、約３．０×１０^１２、約３．５×１０^１２、約４．０×１０^１２、約４．５×１０^１２、約５．０×１０^１２、約５．５×１０^１２、約６．０×１０^１２、約６．５×１０^１２、約７．０×１０^１２、約７．５×１０^１２、約８．０×１０^１２、約８．５×１０^１２、約９．０×１０^１２、約９．５×１０^１２、約１．０×１０^１３、約１．５×１０^１３、約２．０×１０^１３、約２．５×１０^１３、約３．０×１０^１３、約３．５×１０^１３、約４．０×１０^１３、約４．５×１０^１３、約５．０×１０^１３、約５．５×１０^１３、約６．０×１０^１３、約６．５×１０^１３、約７．０×１０^１３、約７．５×１０^１３、約８．０×１０^１３、約８．５×１０^１３、約９．０×１０^１３、約９．５×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与する。ｒＡＡＶは、所望の治療結果の必要に応じて、単一用量または複数用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはこれよりも多い用量）で投与することができる。

【0179】

用量は、週、月もしくは年に１もしくは複数回、または２～２０年毎に１回のみ与え得る。例えば、各用量は、最低で１週間隔、２週間隔、３週間隔、１カ月間隔、３カ月間隔、６カ月間隔、または１年間隔で与え得る。当業者は、体液または体組織における標的化可能な構築物または複合体の測定した滞留時間および濃度に基づいて、投与の反復速度を容易に推定することができる。

【0180】

記載全体を通じて、組成物が特定の構成成分を有している、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合、または工程および方法が特定のステップを有している、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合、追加的に、列挙された構成成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物があり、列挙された処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本発明による工程および方法があることが企図される。

【0181】

本開示において、エレメントまたは構成成分が、列挙されたエレメントまたは構成成分のリストに含まれるおよび／またはそれから選択されると述べられている場合、エレメントもしくは構成成分は、列挙されたエレメントもしくは構成成分の任意の１つでありうる、またはエレメントもしくは構成成分は、列挙されたエレメントもしくは構成成分の２つもしくはそれより多くからなる群から選択されうることは理解されるべきである。

【0182】

さらに、本明細書に記載される組成物または方法のエレメントおよび／または特性が、本明細書において明確であるかまたは暗示的であるかどうかに関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の方法において組み合わされうることは理解されるべきである。例えば、具体的な化合物に言及する場合、その化合物は、内容からそうでないと理解されない限り、本発明の組成物の種々の実施形態および／または本発明の方法において使用されうる。言い換えると、本開示内で、実施形態は、明確で簡潔な開示が記載され、描かれることを可能にする方法で記載され、描かれているが、実施形態が本教示および発明（単数または複数）から離れることなく、種々に組み合わされる、または分けられうることは意図され、理解されるであろう。例えば、本明細書に記載および描かれるすべての特性は、本明細書に記載され、描かれる本発明のすべての態様（単数または複数）に適用可能であることは理解されるであろう。

【0183】

表現「少なくとも１つの」は、内容および使用から他に理解される場合を除いて、表現の後に列挙された対象のそれぞれを個別に、および列挙された対象の２つまたはそれよりも多くの種々の組合せを含むことは理解されるべきである。３つまたはそれよりも多い列挙された対象と関連する表現「および／または」は、内容から他に理解される場合を除いて、同じ意味を有すると理解されるべきである。

【0184】

その文法的同等語を含む、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、他に具体的に述べられているまたは内容から理解されない限り、一般に制約なくかつ非限定的であるとして、例えば、追加的な列挙されていないエレメントまたはステップを排除しないとして理解されるべきである。

【0185】

用語「約（ａｂｏｕｔ）」の使用が定量的な値の前である場合、本発明は、他に具体的に述べられない限り、具体的な定量値それ自体も含む。本明細書において使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、他に示されるまたは推測されない限り、名目値からの±１０％変動を指す。

【0186】

ステップの順序またはある特定の作用を実施する順序は、本発明が作動可能なままである限り重要でないことは理解されるべきである。さらに、２つまたはそれよりも多いステップまたは作用は、同時に実施されうる。

【0187】

本明細書におけるありとあらゆる例、または例示的語の使用、例えば「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明をよりよく例示する目的のためだけであり、特許請求しない限り本発明の範囲に制限を提示しない。本明細書における語は、特許請求されていない任意のエレメントが本発明の実施に不可欠であるとことを示すとして解釈されるべきでない。

【実施例】

【0188】

ここで一般的に記載する本開示は、以下の実施例の参照により、さらに容易に理解され、これは、単に本開示の特定の態様および実施形態の例示目的のために含まれ、本開示の範囲を制限することは決して意図しない。
（実施例１）
ＰＣＣＡのＲＮＡおよびタンパク質の発現
ＲＮＡ発現

【0189】

この実施例は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより判定した場合の継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）のトランスフェクション後のＰＣＣＡのＲＮＡ発現に関する。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞に対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ＮｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＡの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し製造者の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間にＨｅｐＧ２細胞を採取して溶解した。ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し製造者の指示に従って、溶解したＨｅｐＧ２細胞から抽出した。ＲＮＡの質および量をＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ－１０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用しＯＤ２６０／２８０およびＯＤ２６０／２３０の比率で測定した。全ＲＮＡは、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し製造者の指示に従ってｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲをＰｏｗｅｒＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し製造者の指示に従ってＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。ＰＣＣＡ発現における倍率変化は、デルタ－デルタＣｔ（２^{－ΔΔＣｔ}）法により、ＲＮＡポリメラーゼＩＩポリペプチドＡ（ＰＯＬＲ２Ａ）を各試料に対する内部対照として利用して算出し、算出した倍率変化を「ｎｏＴｘ」対照に対して正規化した（Ｌｉｖａｋ ＫＪ， Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ （２００１） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－ｄｅｌｔａ ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ）） ｍｅｔｈｏｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（４）： ４０２－４０８を参照）。図３は、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）を継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）にトランスフェクションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＡ ＲＮＡ発現における倍率変化を示す棒グラフである。

【0190】

プロットしたデータは、ＤＴＣ３４６によるトランスフェクション後の完全な天然ヒトＰＣＣＡのＲＮＡ発現が、ＤＴＣ３４７およびＤＴＣ３４８によるトランスフェクション後の２つのコドン最適化ヒトＰＣＣＡバージョンの発現と同等であることを示す。ＤＴＣ３４９をトランスフェクトした細胞では、さらに高いＲＮＡ発現が実証された。
タンパク質発現

【0191】

この実施例はまた、継代肝細胞株であるＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７のトランスフェクション後のＰＣＣＡのタンパク質発現に関する。簡潔には、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７細胞株に対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ＮｏＴＸ）、ヒトＰＣＣＡの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、ヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）、ヒトＰＣＣＡの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列およびヒトＰＣＣＢの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６５）、または増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し製造者の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間に細胞を採取して、プロテアーゼインヒビタ－ミックス（Ｓｉｇｍａ）およびホスファターゼインヒビターカクテル２＋３（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６およびＰ００４４）を添加したＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＮＰ－４０）により溶解した。タンパク質を１０％のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で分解し、ＩＭＭＵＮ－ＢＬＯＴ（登録商標）フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に移した。ウエスタンブロット解析は、抗ＰＣＣＡ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）抗体を１：１０００希釈で、その後、遠赤フルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体（Ｌｉｃｏｒ ＩＲＤｙｅ二次抗体）を使用して実施した。

【0192】

図４Ａは、レーン１～レーン７にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、ヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列およびヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６５）、または増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）をトランスフェクトした継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）において、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0193】

図４Ａに示すように、「ｎｏＴＸ」対照における予想された基底レベルのＰＣＣＡタンパク質発現（レーン１）、ならびにＤＴＣ３４６（レーン２）をトランスフェクトした細胞およびＤＴＣ３４７（レーン３）またはＤＴＣ３４８（レーン４）をトランスフェクトした細胞における、「ｎｏＴＸ」対照（レーン１）と比較した場合のＰＣＣＡタンパク質の過剰発現が存在した。ＤＴＣ３４９をトランスフェクトした細胞では（レーン５）、このバージョンが大量のＲＮＡを発現することが観察されても、ＰＣＣＡタンパク質の過剰発現は実証されなかった。ＤＴＣ３４３をトランスフェクトした細胞では（レーン７）、ｅＧＦＰ発現が予想通り実証された。

【0194】

図４Ｂは、レーン１～レーン７にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質、ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、ヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列およびヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６５）をトランスフェクトした継代肝細胞株（Ｈｕｈ７）において、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0195】

図４Ｂに示すように、「ｎｏＴＸ」対照における予想された基底レベルのＰＣＣＡタンパク質発現（レーン１）、ならびにＤＴＣ３４６（レーン３）をトランスフェクトした細胞およびＤＴＣ３４７（レーン４）またはＤＴＣ３４８（レーン５）をトランスフェクトした細胞における、「ｎｏＴＸ」対照（レーン１）と比較した場合のＰＣＣＡタンパク質の過剰発現が存在した。ＤＴＣ３４９をトランスフェクトした細胞では（レーン６）、このバージョンが大量のＲＮＡを発現することが観察されても、ＰＣＣＡタンパク質の過剰発現は実証されなかった。ＤＴＣ３４３をトランスフェクトした細胞では（レーン２）、ｅＧＦＰ発現が予想通り実証された。
（実施例２）
過剰発現したヒトＰＣＣＡタンパク質はミトコンドリアに局在する

【0196】

この実施例では、継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）において過剰発現したヒトＰＣＣＡがミトコンドリアに局在することを示す。簡潔には、継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）にヒトＰＣＣＡの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞は、細胞内分画に供して、細胞質およびミトコンドリア画分を単離した。また、全細胞溶解液を処理した。タンパク質を１０％のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で分解し、ＩＭＭＵＮ－ＢＬＯＴ（登録商標）フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に移した。ウエスタンブロット解析は、抗ＰＣＣＡ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）抗体を１：１０００希釈で、その後、遠赤フルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体（Ｌｉｃｏｒ ＩＲＤｙｅ二次抗体）を使用して実施した。図５は、全細胞溶解液（ＷＣＬ）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）をトランスフェクトするか、またはトランスフェクトしない継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）から単離した細胞内画分（細胞質画分（ｃｙｔｏ）およびミトコンドリア画分（ミトコンドリア））における、ウエスタンブロットにより検出したＰＣＣＡタンパク質発現レベルを示す画像である。１Ｘおよび２Ｘは、ロードしたミトコンドリア画分の相対容量を表す。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0197】

図５に示すように、また、図４Ａ～Ｂに示す結果と一致して、ヒトＰＣＣＡの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）をトランスフェクトした細胞では、非トランスフェクト対照細胞と比較した場合（図５のレーン７対レーン８）、全細胞溶解液において、ＰＣＣＡの過剰発現が実証された。ミトコンドリアに局在することで知られるタンパク質であるミトフィリン（ｍｉｔｏｆｉｌｉｎ）のレベルを調べて、単離した細胞画分の相対純度を判定した。図５に示すように、非トランスフェクトおよびＤＴＣ３４６トランスフェクト細胞の細胞質画分では、検出可能なレベルのミトフィリンは実証されなかったが（図５のレーン１対レーン２）、ミトフィリンは、ミトコンドリア画分および全細胞溶解液において、予想通り容易に検出された（図５のレーン３～８）。過剰発現したＰＣＣＡは、ミトコンドリアに主に局在した（図５のレーン２対レーン４および６）。
（実施例３）
ＰＣＣＡ ＡＡＶ９力価収率の比較

【0198】

この実施例は、ヒトＰＣＣＡの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）からのＰＣＣＡ ＡＡＶ９力価収率の比較に関する。継代腎細胞株（ＨＥＫ２９３）にヒトＰＣＣＡの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、ヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）、または増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）を３重トランスフェクトした。それぞれを、ＡＡＶ９カプシドを発現するプラスミド（ｐＡＡＶ２／９）およびアデノウイルスヘルパー機能を供給するプラスミド（ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ）を同時トランスフェクトした細胞において発現させた。非トランスフェクト細胞を対照として使用し、図６において「ｎｏＴＸ」として表す。細胞上清を採取し、ＤＮａｓｅＩまたは等価物で処理して、カプシド形成されなかったＤＮＡを除去し、これらの築物のデザインに含まれるポリアデニル化シグナルに特異的なプライマー／プローブのセットを利用して、ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）力価の定量を容易とした。図６は、左から右に、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）を継代腎細胞株（ＨＥＫ２９３）に３重トランスフェクションした後のｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＡ ＡＡＶ９力価（ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬによる）の倍率変化を示す棒グラフである。それぞれを、ＡＡＶ９カプシドを発現するプラスミド（ｐＡＡＶ２／９）およびアデノウイルスヘルパー機能を供給するプラスミド（ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ）を同時トランスフェクトした細胞において発現させる。非トランスフェクト細胞を対照として使用し、「ｎｏＴＸ」として表す。図６は、ｑＰＣＲにより判定した場合の非トランスフェクト細胞に対するＰＣＣＡ ＡＡＶ９力価（ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍｌによる）における倍率変化を示す。図６に示すデータは、天然完全ヒトＰＣＣＡ発現構築物（ＤＴＣ３４６）とすべてのコドン最適化バージョン（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８およびＤＴＣ３４９）との間での同等のｒＡＡＶ力価を実証する。
（実施例４）
試験するＰＣＣＡ ＤＮＡの完全性

【0199】

ＨＥＫ２９３細胞における３重トランスフェクションによるＡＡＶ９ ｒＡＡＶウイルス粒子の生成後、細胞上清を採取し、ＡＡＶＸ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）または等価物とともにインキュベートした。ＡＡＶ９ ｒＡＡＶウイルス粒子を精製し、次いで、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して濃縮した。精製したウイルスをアルカリ溶解緩衝液中でインキュベートし、ＤＮＡアガロースゲルにロードして、アルカリ泳動用緩衝液の存在下で一晩、電気泳動を行った。図７は、左から右にそれぞれ、ＰＣＣＡおよびＰＣＣＢ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３６５）、ＰＣＣＡ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３４９、ＤＴＣ３４８、ＤＴＣ３４７またはＤＴＣ３４６）またはｅＧＦＰ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３４３）を含むアフィニティ精製したＡＡＶ９粒子のＤＮＡアルカリアガロースゲルの画像である。

【0200】

図７に示すように、ゲル画像は、天然およびコドン最適化ＰＣＣＡベクターカセットについて、予想したサイズの明瞭な単一のバンドを示し、ベクターゲノムの適切なパッケージングを示唆する（ＤＴＣ３４６、ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８およびＤＴＣ３４９）。ｅＧＦＰ対照（ＤＴＣ３４３）では、小型のベクターゲノムがパッケージングされるという公知の制限と一致して、２つのバンドのパッケージングが実証された。
（実施例５）
ＰＣＣＢのＲＮＡおよびタンパク質の発現
ＲＮＡ発現

【0201】

この実施例は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより判定した場合の継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）のトランスフェクション後のＰＣＣＢのＲＮＡ発現に関する。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞に対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ＮｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）、またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３７０、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９またはＤＴＣ３７１）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し製造者の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間にＨｅｐＧ２細胞を採取して溶解させた。ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し製造者の指示に従って、溶解したＨｅｐＧ２細胞から抽出した。ＲＮＡの質および量をＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ－１０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用しＯＤ２６０／２８０およびＯＤ２６０／２３０の比率で測定した。全ＲＮＡは、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し製造者の指示に従ってｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲをＰｏｗｅｒＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し製造者の指示に従ってＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。ＰＣＣＢ発現における倍率変化は、デルタ－デルタＣｔ（２^{－ΔΔＣｔ}）法により、ＲＮＡポリメラーゼＩＩポリペプチドＡ（ＰＯＬＲ２Ａ）を各試料に対する内部対照として利用して算出し、算出した倍率変化を「ｎｏＴｘ」対照に対して正規化した（Ｌｉｖａｋ ＫＪ， Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ （２００１） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－ｄｅｌｔａ ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ）） ｍｅｔｈｏｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（４）： ４０２－４０８を参照）。図８は、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）、またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３７０、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９またはＤＴＣ３７１）を継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）にトランスフェクションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＢ ＲＮＡ発現における倍率変化を示す棒グラフである。

【0202】

プロットしたデータは、ＤＴＣ３６６によるトランスフェクション後の完全なヒトＰＣＣＢの天然配列のＲＮＡ発現が、ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１によるトランスフェクション後の４つのコドン最適化ヒトＰＣＣＢバージョンの発現と同等であることを示す。ＤＴＣ３６９をトランスフェクトした細胞では、さらに低いＲＮＡ発現が実証された。
タンパク質発現

【0203】

この実施例はまた、継代肝細胞株、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７のトランスフェクション後のＰＣＣＢのタンパク質発現に関する。簡潔には、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７細胞株に対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）、またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し製造者の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間に細胞を採取して、プロテアーゼインヒビタ－ミックス（Ｓｉｇｍａ）およびホスファターゼインヒビターカクテル２＋３（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６およびＰ００４４）を添加したＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＮＰ－４０）により溶解させた。タンパク質を１０％のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で分解し、ＩＭＭＵＮ－ＢＬＯＴ（登録商標）フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に移した。ウエスタンブロット解析は、抗ＰＣＣＢ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）抗体を１：１０００希釈で、その後、遠赤フルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体（Ｌｉｃｏｒ ＩＲＤｙｅ二次抗体）を使用して実施した。

【0204】

図９Ａは、レーン１～レーン８にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）をトランスフェクトした継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）における、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0205】

図９Ａに示すように、「ｎｏＴＸ」対照における予想された基底レベルのＰＣＣＢタンパク質発現（レーン１）、ならびにＤＴＣ３６６（レーン３）をトランスフェクトした細胞およびＤＴＣ３６７（レーン４）またはＤＴＣ３７０（レーン７）をトランスフェクトした細胞における、「ｎｏＴＸ」対照（レーン１）と比較した場合のＰＣＣＢタンパク質の過剰発現が存在した。ＤＴＣ３６８（レーン５）、ＤＴＣ３６９（レーン６）またはＤＴＣ３７１（レーン８）をトランスフェクトした細胞では、ＰＣＣＢタンパク質の過剰発現は実証されなかった。ＤＴＣ３４３をトランスフェクトした細胞では（レーン２）、ｅＧＦＰ発現が予想通り実証された。

【0206】

図９Ｂは、レーン１～レーン８にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）をトランスフェクトした継代肝細胞株（Ｈｕｈ７）における、ウエスタンブロットにより検出したタンパク質発現レベルを示す画像である。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0207】

図９Ｂに示すように、「ｎｏＴＸ」対照における予想された基底レベルのＰＣＣＢタンパク質発現（レーン１）、ならびにＤＴＣ３６６（レーン３）をトランスフェクトした細胞およびＤＴＣ３６７（レーン４）またはＤＴＣ３７０（レーン７）をトランスフェクトした細胞における、「ｎｏＴＸ」対照（レーン１）と比較した場合のＰＣＣＢタンパク質の過剰発現が存在した。ＤＴＣ３６８（レーン６）、ＤＴＣ３６９（レーン５）またはＤＴＣ３７１（レーン８）をトランスフェクトした細胞では、ＰＣＣＢタンパク質の過剰発現は実証されなかった。ＤＴＣ３４３をトランスフェクトした細胞では（レーン２）、ｅＧＦＰ発現が予想通り実証された。
（実施例６）
過剰発現したヒトＰＣＣＢタンパク質はミトコンドリアに局在する

【0208】

この実施例では、継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）において過剰発現したヒトＰＣＣＢがミトコンドリアに局在することを示す。簡潔には、継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）にヒトＰＣＣＢの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞は、細胞内分画に供して、細胞質およびミトコンドリア画分を単離した。また、全細胞溶解液を処理した。タンパク質を１０％のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で分解し、ＩＭＭＵＮ－ＢＬＯＴ（登録商標）フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に移した。ウエスタンブロット解析は、抗ＰＣＣＢ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）抗体を１：１０００希釈で、その後、遠赤フルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体（Ｌｉｃｏｒ ＩＲＤｙｅ二次抗体）を使用して実施した。

【0209】

図１０は、全細胞溶解液（ＷＣＬ）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）をトランスフェクトするか、またはトランスフェクトしない継代肝細胞株（ＨｅｐＧ２）から単離した細胞内画分（細胞質画分（ｃｙｔｏ）およびミトコンドリア画分（ミトコンドリア））における、ウエスタンブロットにより検出したＰＣＣＢタンパク質発現レベルを示す画像である。１Ｘおよび２Ｘは、ロードしたミトコンドリア画分の相対容量を表す。βアクチン（「アクチン」）をローディング対照として使用した。

【0210】

図１０に示すように、また、前の結果と一致して、ヒトＰＣＣＢの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）をトランスフェクトした細胞では、非トランスフェクト対照細胞と比較した場合（レーン７対レーン８）、全細胞溶解液において、ＰＣＣＢタンパク質の過剰発現が実証された。ミトコンドリアに局在することで知られるタンパク質であるミトフィリン（ｍｉｔｏｆｉｌｉｎ）のレベルを調べて、単離した細胞画分の相対純度を判定した。図１０に示すように、非トランスフェクトおよびＤＴＣ３６６トランスフェクト細胞の細胞質画分では、検出可能なレベルのミトフィリンは実証されなかったが（レーン１対レーン２）、ミトフィリンは、ミトコンドリア画分および全細胞溶解液において、予想通り容易に検出された（レーン３～８）。過剰発現したＰＣＣＢは、ミトコンドリアに主に局在した（レーン２対レーン４および６）。
（実施例７）
ＰＣＣＢ ＡＡＶ９力価収率の比較

【0211】

この実施例は、ヒトＰＣＣＢの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）またはヒトＰＣＣＢのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）からのＰＣＣＢ ＡＡＶ９力価収率の比較に関する。継代腎細胞株（ＨＥＫ２９３）に増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全な天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０、またはＤＴＣ３７１）を３重トランスフェクトした。それぞれを、ＡＡＶ９カプシドを発現するプラスミド（ｐＡＡＶ２／９）およびアデノウイルスヘルパー機能を供給するプラスミド（ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ）を同時トランスフェクトした細胞において発現させた。非トランスフェクト細胞を対照として使用し、図１１において「ｎｏＴＸ」として表す。細胞上清を採取し、ＤＮａｓｅＩまたは等価物で処理して、カプシド形成されなかったＤＮＡを除去し、これらの構築物のデザインに含まれるポリアデニル化シグナルに特異的なプライマー／プローブのセットを利用して、ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）力価の定量を容易とした。図１１は、左から右に、増強した緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４３）、ヒトＰＣＣＢの完全天然配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６６）、またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列をコードするヌクレオチド配列を保有するｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）を継代腎細胞株（ＨＥＫ２９３）に３重トランスフェクションした後のｑＰＣＲにより判定した場合のＰＣＣＢ ＡＡＶ９力価（ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬによる）の倍率変化を示す棒グラフである。それぞれを、ＡＡＶ９カプシドを発現するプラスミド（ｐＡＡＶ２／９）およびアデノウイルスヘルパー機能を供給するプラスミド（ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ）を同時トランスフェクトした細胞において発現させる。非トランスフェクト細胞を対照として使用し、「ｎｏＴＸ」として表す。図１１は、ｑＰＣＲにより判定した場合の非トランスフェクト細胞に対するＰＣＣＢ ＡＡＶ９力価（ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬによる）における倍率変化を示す。図１１に示すデータは、天然完全ヒトＰＣＣＢ発現構築物（ＤＴＣ３６６）とすべてのコドン最適化バージョン（ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０およびＤＴＣ３７１）との間での同等のｒＡＡＶ力価を実証する。
（実施例８）
試験するＰＣＣＢ ＤＮＡの完全性

【0212】

ＨＥＫ２９３細胞における３重トランスフェクションによるＡＡＶ９ ｒＡＡＶウイルス粒子の生成後、細胞上清を採取し、ＡＡＶＸ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）または等価物とともにインキュベートした。ＡＡＶ９ ｒＡＡＶウイルス粒子を精製し、次いで、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して濃縮した。精製したウイルスをアルカリ溶解緩衝液中でインキュベートし、ＤＮＡアガロースゲルにロードして、アルカリ泳動用緩衝液の存在下で一晩、電気泳動を行った。図１２は、左から右にそれぞれ、対照プラスミド（空のベクターを有するプラスミド、ｎｏＴＸ）、ｅＧＦＰ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３４３）またはＰＣＣＢ発現組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターカセット（ＤＴＣ３６６、ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０またはＤＴＣ３７１）を含むアフィニティ精製したＡＡＶ９粒子のＤＮＡアルカリアガロースゲルの画像である。

【0213】

図１２に示すように、ゲル画像は、天然およびコドン最適化ＰＣＣＢベクターカセットについて、予想したサイズの明瞭な単一のバンドを示し、ベクターゲノムの適切なパッケージングを示唆する（ＤＴＣ３６６、ＤＴＣ３６７、ＤＴＣ３６８、ＤＴＣ３６９、ＤＴＣ３７０およびＤＴＣ３７１）。ｅＧＦＰ対照（ＤＴＣ３４３）では、小型のベクターゲノムがパッケージングされるという公知の制限と一致して、２つのバンドのパッケージングが実証された。
（実施例９）
ＰＣＣＡウイルスベクターの野生型マウスへの投与

【0214】

この実施例は、完全天然ヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４６）またはコドン最適化ヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８およびＤＴＣ３４９）を発現するｒＡＡＶによる処置後の野生型ＦＶＢマウスにおけるヒトＰＣＣＡタンパク質発現に関する。簡潔には、マウス（ｎ＝２または３）に、配列番号３８により表す完全天然ヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４６）を発現するｒＡＡＶまたはコドン最適化ヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８およびＤＴＣ３４９）を発現するｒＡＡＶを１．６６×１０^１１ウイルスゲノム（ＶＧ）または５×１０^１１ＶＧ静脈内注射した。ヒトＰＣＣＡタンパク質および内因性マウスＰＣＣＡタンパク質をＬＣ－ＭＳにより検出した。図１３は、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列（ＤＴＣ３４６）またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）をコードするｒＡＡＶによる処置後の野生型ＦＶＢマウスにおけるマウス内因性ＰＣＣＡ発現に対するヒトＰＣＣＡタンパク質発現の百分率を示す棒グラフである。エラーバーは、標準偏差を表す。図１３に表すデータは、天然ＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４６）１．６６×１０^１１ＶＧの投与により発現したヒトＰＣＣＡが、内因性マウスＰＣＣＡレベルに対して２．５％であり、天然ＰＣＣＡウイルスベクター（ＤＴＣ３４６）５×１０^１１ＶＧの投与により発現したヒトＰＣＣＡが、内因性マウスＰＣＣＡレベルに対して１１．６％であったことを示す。
（実施例１０）
ＰＣＣＡ発現低下マウスモデルにおけるヒトＰＣＣＡ活性

【0215】

この実施例は、ＰＣＣＡ発現低下マウスモデルにおけるヒトＰＣＣＡ活性の試験に関する。マウスにおけるＰＣＣＡ遺伝子の欠失は、最も重度の型のヒト疾患を模倣する。ＰＣＣＡ遺伝子を欠失させたマウスは、誕生から３６時間以内に死に、静脈内投与による全身療法の試験が困難となる（Ｇｕｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１３ Ｊｕｌ； ２１（７）： １３１６－１３２３を参照）。ＰＣＣＡ発現低下マウスでは、ＰＣＣＡノックアウトマウスの遺伝的背景に対する、病原性Ａ１３８Ｔ変異を有するヒトＰＣＣＡをコードする導入遺伝子の導入のため、ＰＣＣＡ活性が低下している。この変異ＰＣＣＡ遺伝子により、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸、グリシン、アラニン、リシン、アンモニア、および心筋症と関連するマーカーのレベルの上昇が生じ、プロピオン酸血症（ＰＡ）を有する患者におけるこれらの化合物のレベルと類似する。簡潔には、マウス（ｎ＝５）に、配列番号３８により表すヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４６）の完全天然配列をコードするｒＡＡＶを１．６６×１０^１１ウイルスゲノム（ＶＧ）または５×１０^１１ＶＧ静脈内注射した。ＰＢＳ処置マウスは、対照マウスとして使用した。
ＰＣＣＡ発現レベルおよび酵素活性アッセイ

【0216】

注射６週後に、マウス肝臓をホモジネートし、ヒト野生型ＰＣＣＡタンパク質をＬＣ－ＭＳにより測定した。図１４は、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列（ＤＴＣ３４６）またはヒトＰＣＣＡのコドン最適化配列（ＤＴＣ３４７、ＤＴＣ３４８またはＤＴＣ３４９）をコードするｒＡＡＶによる処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）において発現したヒト野生型ＰＣＣＡタンパク質の濃度（ｎｍｏｌ／ｇタンパク質による）を示す棒グラフである。列挙する百分率の数は、野生型ＦＶＢマウスの内因性ＰＣＣＡタンパク質レベルに対する百分率として算出したヒト野生型ＰＣＣＡ発現を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。列挙する百分率の数は、野生型ＦＶＢマウスの内因性ＰＣＣＡタンパク質レベルに対する百分率として算出したヒト野生型ＰＣＣＡ発現を表す。これまでの結果と一致して、コドン最適化ヒトＰＣＣＡをコードするｒＡＡＶから発現したヒトＰＣＣＡタンパク質では、完全天然ヒトＰＣＣＡをコードするｒＡＡＶから発現した天然ヒトＰＣＣＡタンパク質と比較した場合、低い発現レベルが実証された。肝臓ホモジネートのＰＣＣＡ酵素活性は、炭酸水素ナトリウム［Ｃ１４］の取込みとして、シンチレーションカウンターを使用して測定した。図１５は、１分あたりの平均カウント（ＣＰＭ）データにより測定した、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるヒトＰＣＣＡ活性の棒グラフである。エラーバーは、標準偏差を表す。列挙する百分率の数は、野生型ＦＶＢマウスにおいて観察されたものに対するＣＰＭデータを記載する。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して、＊＊は、ＰＢＳ処置群との比較によりｐ＜０．０１を表す。

【0217】

図１５に示すように、完全天然ヒトＰＣＣＡをコードするｒＡＡＶを高用量（５×１０^１１ＶＧ）で注射したマウスでは、ＰＢＳ処置マウスと比較してＰＣＣＡ活性における統計学的に有意な上昇（１１％）が実証された。
プロピオン酸血症（ＰＡ）の既知のバイオマーカーの濃度に対する天然ＰＣＣＡウイルスベクターのＰＣＣＡ発現低下マウスへの投与の作用

【0218】

また、この実施例は、ＰＡの既知のバイオマーカーの血漿濃度に対するヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４６）の完全天然配列をコードするｒＡＡＶのＰＣＣＡ発現低下マウスへの投与の作用の試験に関する。簡潔には、マウス（ｎ＝５）に、配列番号３８により表すヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４６）の完全天然配列をコードするｒＡＡＶを１．６６×１０^１１ＶＧまたは５×１０^１１ＶＧ静脈内注射した。ＰＡの既知のバイオマーカー（プロピオニルカルニチン（Ｃ３）、アセチルカルニチン（Ｃ２）および２－メチルクエン酸（２ＭＣ））の血漿濃度は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により判定した。図１６Ａ～Ｃは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置の前（Ｐｒｅ）ならびに２、３、４および６週間（それぞれ、２Ｗ、３Ｗ、４Ｗおよび６Ｗ）後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるプロピオン酸血症の既知のバイオマーカーの濃度を示す棒グラフである。エラーバーは、標準偏差を表す。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して、＊＊は、ＰＢＳ処置群との比較によりｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、ＰＢＳ処置群との比較によりｐ＜０．００１を表す。図１６Ａは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるＣ３（プロピオニルカルニチン）の血漿濃度を示す棒グラフである。図１６Ｂは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）におけるＣ３／Ｃ２（プロピオニルカルニチン／アセチルカルニチン）の血漿濃度比の棒グラフである。図１６Ｃは、ヒトＰＣＣＡの完全天然配列をコードするｒＡＡＶ（ＤＴＣ３４６）による処置後のＰＣＣＡ発現低下マウスモデル（Ａ１３８Ｔ変異体）における２－メチルクエン酸（２ＭＣ）の血漿濃度を示す棒グラフである。

【0219】

ヒトＰＣＣＡ（ＤＴＣ３４６）の完全天然配列をコードするｒＡＡＶをいずれかの用量（１．６６×１０^１１ＶＧまたは５×１０^１１ＶＧ）で処置したマウスでは、ＰＢＳ処置マウスと比較して、血漿Ｃ３、Ｃ３／Ｃ２および２－ＭＣレベルにおける統計学的に有意な低下が実証された。
付番した実施形態

【0220】

本明細書に開示する実施形態は、本開示の付番した実施形態に提供する実施形態Ｐ１～Ｐ１３６を含む。

【0221】

実施形態Ｐ１：ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、５’から３’の順に
（ａ）５’－ＩＴＲの配列、
（ｂ）プロモーター配列、
（ｃ）ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列、および
（ｄ）３’－ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0222】

実施形態Ｐ２：前記ＡＡＶカプシドが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である、実施形態Ｐ１に記載のｒＡＡＶ。

【0223】

実施形態Ｐ３：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９由来である、実施形態Ｐ２に記載のｒＡＡＶ。

【0224】

実施形態Ｐ４：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８由来である、実施形態Ｐ２に記載のｒＡＡＶ。

【0225】

実施形態Ｐ５：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９バリアントカプシドである、実施形態Ｐ１に記載のｒＡＡＶ。

【0226】

実施形態Ｐ６：プロモーターが、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、およびＣＡＧプロモーターから選択される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0227】

実施形態Ｐ７：前記プロモーターが、前記ＣＢＡプロモーターである、実施形態Ｐ６に記載のｒＡＡＶ。

【0228】

実施形態Ｐ８：前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、実施形態Ｐ１～Ｐ７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0229】

実施形態Ｐ９：前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号１を含む、実施形態Ｐ８に記載のｒＡＡＶ。

【0230】

実施形態Ｐ１０：前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化コード配列である、実施形態Ｐ１～Ｐ７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0231】

実施形態Ｐ１１：前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号２～６から選択されるコード配列を含む、実施形態Ｐ１０に記載のｒＡＡＶ。

【0232】

実施形態Ｐ１２：５’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、実施形態Ｐ１～Ｐ１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0233】

実施形態Ｐ１３：３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、実施形態Ｐ１～Ｐ１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0234】

実施形態Ｐ１４：５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、実施形態Ｐ１～Ｐ１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0235】

実施形態Ｐ１５：５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列が、配列番号１５を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ１２～Ｐ１４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0236】

実施形態Ｐ１６：５’ＩＴＲ配列および／または３’ＩＴＲ配列が、非ＡＡＶ２供給源由来である、実施形態Ｐ１～Ｐ１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0237】

実施形態Ｐ１７：パッケージングされたゲノムが、１つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0238】

実施形態Ｐ１８：エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびＡｐｏＥエンハンサーから選択される、実施形態Ｐ１７に記載のｒＡＡＶ。

【0239】

実施形態Ｐ１９：エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態Ｐ１８に記載のｒＡＡＶ。

【0240】

実施形態Ｐ２０：エンハンサーが、配列番号１９を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ１９に記載のｒＡＡＶ。

【0241】

実施形態Ｐ２１：エンハンサーが、プロモーター配列の上流に位置する、実施形態Ｐ１８～Ｐ２０に記載のｒＡＡＶ。

【0242】

実施形態Ｐ２２：パッケージングされたゲノムが、１つまたは複数のイントロン配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0243】

実施形態Ｐ２３：イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットベータ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、またはｈＦＩＸイントロンから選択される、実施形態Ｐ２２に記載のｒＡＡＶ。

【0244】

実施形態Ｐ２４：イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロンである、実施形態Ｐ２３に記載のｒＡＡＶ。

【0245】

実施形態Ｐ２５：イントロンが、配列番号２０を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ２４に記載のｒＡＡＶ。

【0246】

実施形態Ｐ２６：イントロンが、ｒＨＢＢイントロンである、実施形態Ｐ２３に記載のｒＡＡＶ。

【0247】

実施形態Ｐ２７：イントロンが、配列番号２１を含むか、これからなる、実施形態Ｐ２６に記載のｒＡＡＶ。

【0248】

実施形態Ｐ２８：前記パッケージングされたゲノムが、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0249】

実施形態Ｐ２９：前記ポリアデニル化シグナル配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、実施形態Ｐ２８に記載のｒＡＡＶ。

【0250】

実施形態Ｐ３０：前記ポリアデニル化シグナル配列が、前記ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である、実施形態Ｐ２９に記載のｒＡＡＶ。

【0251】

実施形態Ｐ３１：前記ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２２を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ３０に記載のｒＡＡＶ。

【0252】

実施形態Ｐ３２：ポリアデニル化シグナル配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、実施形態Ｐ２９に記載のｒＡＡＶ。

【0253】

実施形態Ｐ３３：ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２３を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ３２に記載のｒＡＡＶ。

【0254】

実施形態Ｐ３４：ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、５’から３’の順に
（ａ）５’－ＩＴＲの配列、
（ｂ）プロモーター配列、
（ｃ）ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列、および
（ｄ）３’－ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0255】

実施形態Ｐ３５：前記ＡＡＶカプシドが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である、実施形態Ｐ３４に記載のｒＡＡＶ。

【0256】

実施形態Ｐ３６：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９由来である、実施形態Ｐ３５に記載のｒＡＡＶ。

【0257】

実施形態Ｐ３７：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８由来である、実施形態Ｐ３５に記載のｒＡＡＶ。

【0258】

実施形態Ｐ３８：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９バリアントカプシドである、実施形態Ｐ３４に記載のｒＡＡＶ。

【0259】

実施形態Ｐ３９：プロモーターが、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、およびＣＡＧプロモーターから選択される、実施形態Ｐ３４～Ｐ３８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0260】

実施形態Ｐ４０：前記プロモーターが、前記ＣＢＡプロモーターである、実施形態Ｐ３９に記載のｒＡＡＶ。

【0261】

実施形態Ｐ４１：前記ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、実施形態Ｐ３４～Ｐ４０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0262】

実施形態Ｐ４２：前記ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号７を含む、実施形態Ｐ４１に記載のｒＡＡＶ。

【0263】

実施形態Ｐ４３：前記ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化コード配列である、実施形態Ｐ３４～Ｐ４０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0264】

実施形態Ｐ４４：前記ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号８～１２から選択されるコード配列を含む、実施形態Ｐ４３に記載のｒＡＡＶ。

【0265】

実施形態Ｐ４５：５’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、実施形態Ｐ３４～Ｐ４４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0266】

実施形態Ｐ４６：３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、実施形態Ｐ３４～Ｐ４４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0267】

実施形態Ｐ４７：５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、実施形態Ｐ３４～Ｐ４４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0268】

実施形態Ｐ４８：５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列が、配列番号１５を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ４５～Ｐ４７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0269】

実施形態Ｐ４９：５’ＩＴＲ配列および／または３’ＩＴＲ配列が、非ＡＡＶ２供給源由来である、実施形態Ｐ３４～Ｐ４４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0270】

実施形態Ｐ５０：パッケージングされたゲノムが、１つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含む、実施形態Ｐ３４～Ｐ４９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0271】

実施形態Ｐ５１：エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびＡｐｏＥエンハンサーから選択される、実施形態Ｐ５０に記載のｒＡＡＶ。

【0272】

実施形態Ｐ５２：エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態Ｐ５１に記載のｒＡＡＶ。

【0273】

実施形態Ｐ５３：エンハンサーが、配列番号１９を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ５２に記載のｒＡＡＶ。

【0274】

実施形態Ｐ５４：エンハンサーが、プロモーター配列の上流に位置する、実施形態Ｐ５１～Ｐ５３に記載のｒＡＡＶ。

【0275】

実施形態Ｐ５５：パッケージングされたゲノムが、１つまたは複数のイントロン配列をさらに含む、実施形態Ｐ３４～Ｐ５４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0276】

実施形態Ｐ５６：イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットベータ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、またはｈＦＩＸイントロンから選択される、実施形態Ｐ５５に記載のｒＡＡＶ。

【0277】

実施形態Ｐ５７：イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロンである、実施形態Ｐ５６に記載のｒＡＡＶ。

【0278】

実施形態Ｐ５８：イントロンが、配列番号２０を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ５７に記載のｒＡＡＶ。

【0279】

実施形態Ｐ５９：イントロンが、ｒＨＢＢイントロンである、実施形態Ｐ５６に記載のｒＡＡＶ。

【0280】

実施形態Ｐ６０：イントロンが、配列番号２１を含むか、これからなる、実施形態Ｐ５９に記載のｒＡＡＶ。

【0281】

実施形態Ｐ６１：前記パッケージングされたゲノムが、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、実施形態Ｐ３４～Ｐ６０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0282】

実施形態Ｐ６２：前記ポリアデニル化シグナル配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、実施形態Ｐ６１に記載のｒＡＡＶ。

【0283】

実施形態Ｐ６３：前記ポリアデニル化シグナル配列が、前記ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である、実施形態Ｐ６２に記載のｒＡＡＶ。

【0284】

実施形態Ｐ６４：前記ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２２を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ６３に記載のｒＡＡＶ。

【0285】

実施形態Ｐ６５：ポリアデニル化シグナル配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、実施形態Ｐ６２に記載のｒＡＡＶ。

【0286】

実施形態Ｐ６６：ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２３を含むか、またはこれからなる、実施形態Ｐ６５に記載のｒＡＡＶ。

【0287】

実施形態Ｐ６７：ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）部分的または完全なＰＣＣＡのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0288】

実施形態Ｐ６８：ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）部分的または完全なＰＣＣＢのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0289】

実施形態Ｐ６９：前記ＡＡＶカプシドが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である、実施形態Ｐ６７またはＰ６８に記載のｒＡＡＶ。

【0290】

実施形態Ｐ７０：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９由来である、実施形態Ｐ６９に記載のｒＡＡＶ。

【0291】

実施形態Ｐ７１：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８由来である、実施形態Ｐ６９に記載のｒＡＡＶ。

【0292】

実施形態Ｐ７２：前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９バリアントカプシドである、実施形態Ｐ６７またはＰ６８に記載のｒＡＡＶ。

【0293】

実施形態Ｐ７３：プロモーターが、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、およびＣＡＧプロモーターから選択される、実施形態Ｐ６７～Ｐ７２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0294】

実施形態Ｐ７４：前記プロモーターが、前記ＣＢＡプロモーターである、実施形態Ｐ７３に記載のｒＡＡＶ。

【0295】

実施形態Ｐ７５：前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、実施形態Ｐ６７に記載のｒＡＡＶ。

【0296】

実施形態Ｐ７６：前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号１を含む、実施形態Ｐ７５に記載のｒＡＡＶ。

【0297】

実施形態Ｐ７７：前記ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化コード配列である、実施形態Ｐ６７に記載のｒＡＡＶ。

【0298】

実施形態Ｐ７８：前記ＰＣＣＡのコード配列が、配列番号２～６から選択されるコード配列を含む、実施形態Ｐ７７に記載のｒＡＡＶ。

【0299】

実施形態Ｐ７９：ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、実施形態Ｐ６８に記載のｒＡＡＶ。

【0300】

実施形態Ｐ８０：ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号７を含む、実施形態Ｐ７９に記載のｒＡＡＶ。

【0301】

実施形態Ｐ８１：ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列が、コドン最適化配列である、実施形態Ｐ６８に記載のｒＡＡＶ。

【0302】

実施形態Ｐ８２：ＰＣＣＢのコード配列が、配列番号８～１２から選択されるコード配列を含む、実施形態Ｐ８１に記載のｒＡＡＶ。

【0303】

実施形態Ｐ８３：エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびＡｐｏＥエンハンサーから選択される、実施形態Ｐ６７またはＰ８２に記載のｒＡＡＶ。

【0304】

実施形態Ｐ８４：エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態Ｐ８３に記載のｒＡＡＶ。

【0305】

実施形態Ｐ８５：イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットベータ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、またはｈＦＩＸイントロンから選択される、実施形態Ｐ６７～Ｐ８４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0306】

実施形態Ｐ８６：イントロンが、ＳＶ４０スモールＴイントロンである、実施形態Ｐ８５に記載のｒＡＡＶ。

【0307】

実施形態Ｐ８７：イントロンが、ｒＨＢＢイントロンである、実施形態Ｐ８５に記載のｒＡＡＶ。

【0308】

実施形態Ｐ８８：前記ポリアデニル化シグナル配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、実施形態Ｐ６７～Ｐ８７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0309】

実施形態Ｐ８９：前記ポリアデニル化シグナル配列が、前記ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である、実施形態Ｐ８８に記載のｒＡＡＶ。

【0310】

実施形態Ｐ９０：ポリアデニル化シグナル配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、実施形態Ｐ８８に記載のｒＡＡＶ。

【0311】

実施形態Ｐ９１：ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0312】

実施形態Ｐ９２：ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0313】

実施形態Ｐ９３：ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９由来である、実施形態Ｐ９１またはＰ９２に記載のｒＡＡＶ。

【0314】

実施形態Ｐ９４：ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0315】

実施形態Ｐ９５：ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）エンハンサー配列、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）イントロン配列、
（ｅ）配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、
（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0316】

実施形態Ｐ９６：ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列、
（ｄ）ｒＨＢＢまたはＳＶ４０スモールＴイントロン配列、
（ｅ）配列番号１～６から選択されるＰＣＣＡのコード配列、
（ｆ）ＢＧＨまたはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0317】

実施形態Ｐ９７：ＡＡＶ９カプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結された成分として５’から３’の順に
（ａ）ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの配列、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列、
（ｄ）ｒＨＢＢまたはＳＶ４０スモールＴイントロン配列、
（ｅ）配列番号７～１２から選択されるＰＣＣＢのコード配列、
（ｆ）ＢＧＨまたはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および
（ｇ）ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの配列
を含む、ｒＡＡＶ。

【0318】

実施形態Ｐ９８：ベクターゲノムが、ベクターゲノムエレメント（ｄ）と（ｅ）との間に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列を含む、実施形態Ｐ６７～Ｐ９７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。

【0319】

実施形態Ｐ９９：コンセンサスＫｏｚａｋ配列が、配列番号２４を含む、実施形態Ｐ９８に記載のｒＡＡＶ。

【0320】

実施形態Ｐ１００：前記実施形態のいずれかに記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。

【0321】

実施形態Ｐ１０１：治療有効量の実施形態Ｐ１～Ｐ９９のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは実施形態Ｐ１００に記載の組成物をヒト対象に投与するステップを含む、ヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法。

【0322】

実施形態Ｐ１０２：
（１）実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物、および
（２）実施形態Ｐ３４～Ｐ６６のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物
をヒト対象に投与するステップを含む、ヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法。

【0323】

実施形態Ｐ１０３：（１）および（２）の組成物が、同時に投与される、実施形態Ｐ１０２に記載の方法。

【0324】

実施形態Ｐ１０４：（１）および（２）の組成物が、連続的に投与される、実施形態Ｐ１０２に記載の方法。

【0325】

実施形態Ｐ１０５：（１）および（２）の組成物が、別々に投与される、実施形態Ｐ１０２に記載の方法。

【0326】

実施形態Ｐ１０６：ＰＣＣＡにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法であって、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物をヒト対象に投与するステップを含む、方法。

【0327】

実施形態Ｐ１０７：ＰＣＣＡにおける前記変異が、表１から選択される、実施形態Ｐ１０６に記載の方法。

【0328】

実施形態Ｐ１０８：ＰＣＣＢにおける少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象においてプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法であって、実施形態Ｐ３４～Ｐ６６のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む治療有効量の組成物をヒト対象に投与するステップを含む、方法。

【0329】

実施形態Ｐ１０９：ＰＣＣＢにおける前記変異が、表２から選択される、実施形態Ｐ１０８に記載の方法。

【0330】

実施形態Ｐ１１０：前記組換えウイルス、前記ｒＡＡＶまたは前記組成物が、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内に投与される、実施形態Ｐ１０１～Ｐ１０９のいずれかに記載の方法。

【0331】

実施形態Ｐ１１１：前記ｒＡＡＶまたは前記組成物が、静脈内に投与される、実施形態Ｐ１１０に記載の方法。

【0332】

実施形態Ｐ１１２：前記ｒＡＡＶが、約１×１０^１１～約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、実施形態Ｐ１０１～Ｐ１１１のいずれかに記載の方法。

【0333】

実施形態Ｐ１１３：前記ｒＡＡＶが、約１×１０^１２～約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、実施形態Ｐ１１２に記載の方法。

【0334】

実施形態Ｐ１１４：前記ｒＡＡＶを投与するステップが、単一用量のｒＡＡＶの投与を含む、実施形態Ｐ１１０～Ｐ１１３のいずれかに記載の方法。

【0335】

実施形態Ｐ１１５：前記ｒＡＡＶを投与するステップが、複数用量のｒＡＡＶの投与を含む、実施形態Ｐ１１０～Ｐ１１３のいずれかに記載の方法。

【0336】

実施形態Ｐ１１６：核酸配列が、配列番号１の野生型コード配列と８０％未満同一である、配列番号１６のＰＣＣＡポリペプチドをコードする組換え核酸。

【0337】

実施形態Ｐ１１７：前記核酸配列が、配列番号２～６から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、実施形態Ｐ１１６に記載の組換え核酸。

【0338】

実施形態Ｐ１１８：前記核酸配列が、配列番号２～６から選択される配列を含む、実施形態Ｐ１１７に記載の組換え核酸。

【0339】

実施形態Ｐ１１９：核酸配列が、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択される１つまたは複数の終止コドンを３’末端にさらに含む、実施形態Ｐ１１６～Ｐ１１８のいずれかに記載の組換え核酸。

【0340】

実施形態Ｐ１２０：核酸配列が、配列番号７の野生型コード配列と８０％未満同一である、配列番号１７のＰＣＣＢポリペプチドをコードする組換え核酸。

【0341】

実施形態Ｐ１２１：前記核酸配列が、配列番号８～１２から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、実施形態Ｐ１２０に記載の組換え核酸。

【0342】

実施形態Ｐ１２２：前記核酸配列が、配列番号８～１２から選択される配列を含む、実施形態Ｐ１２１に記載の組換え核酸。

【0343】

実施形態Ｐ１２３：核酸配列が、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択される１つまたは複数の終止コドンを３’末端にさらに含む、実施形態Ｐ１２０～Ｐ１２２のいずれかに記載の組換え核酸。

【0344】

実施形態Ｐ１２４：配列番号２～６から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む組換え核酸。

【0345】

実施形態Ｐ１２５：配列番号２～６から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、実施形態Ｐ１２４に記載の組換え核酸。

【0346】

実施形態Ｐ１２６：配列番号２～６から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、実施形態Ｐ１２５に記載の組換え核酸。

【0347】

実施形態Ｐ１２７：配列番号２～６から選択される配列を含む組換え核酸。

【0348】

実施形態Ｐ１２８：核酸配列が、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択される１つまたは複数の終止コドンを３’末端にさらに含む、実施形態Ｐ１２４～Ｐ１２７のいずれかに記載の組換え核酸。

【0349】

実施形態Ｐ１２９：配列番号７～１２から選択される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む組換え核酸。

【0350】

実施形態Ｐ１３０：配列番号７～１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、実施形態Ｐ１２９に記載の組換え核酸。

【0351】

実施形態Ｐ１３１：配列番号２～６から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、実施形態Ｐ１３０に記載の組換え核酸。

【0352】

実施形態Ｐ１３２：配列番号７～１２から選択される配列を含む組換え核酸。

【0353】

実施形態Ｐ１３３：前記核酸配列が、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択される１つまたは複数の終止コドンを３’末端にさらに含む、実施形態Ｐ１２９～Ｐ１３２のいずれかに記載の組換え核酸。

【0354】

実施形態Ｐ１３４：実施形態Ｐ１１６～Ｐ１３３のいずれかに記載の組換え核酸を含むｒＡＡＶ。

【0355】

実施形態Ｐ１３５：実施形態Ｐ１１６～Ｐ１３３のいずれかに記載の組換え核酸または実施形態Ｐ１３４に記載のｒＡＡＶを含む宿主細胞。

【0356】

実施形態Ｐ１３６：ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ－５細胞から選択される、実施形態Ｐ１３５に記載の宿主細胞。
参照による組み込み

【0357】

本明細書において参照される特許文書および科学記事のそれぞれの開示全体は、すべての目的について参照により組み込まれる。
均等物

【0358】

本開示は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化されうる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される開示への制限よりむしろ、あらゆる点で例示的であると見なされるべきである。種々の実施形態および開示する種々の方法ステップの種々の構造エレメントは、種々の組合せおよび順列で利用してもよく、このようなすべての変形形態は、本開示の形態であるとみなされるべきである。本開示の範囲は、したがって前述の記載によってよりむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に生じるすべての変化は、それに含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【配列表】

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【国際調査報告】