ホーム > 特許ランキング > リニューロン リミテッド
特表2022-513355条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む人工多能性細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(54)【発明の名称】条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む人工多能性細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/074 20100101AFI20220131BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220131BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220131BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20220131BHJP
C12N 5/0797 20100101ALI20220131BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20220131BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20220131BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220131BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220131BHJP
C12N 5/0781 20100101ALI20220131BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20220131BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220131BHJP
A61K 35/32 20150101ALI20220131BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20220131BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C12N5/074
C12N5/10
C12N15/12
C12N15/85 Z
C12N15/867 Z
C12N15/86 Z
C12N5/0775
C12N5/0797
C12N5/0789
C12N5/077
C12N15/62 Z
C12N5/0783
C12N5/0781
C12N5/0784
A61P43/00 111
A61K35/545
A61K35/28
A61K35/30
A61K35/17 Z
A61K35/32
C07K14/47
C07K19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021545340
(86)(22)【出願日】2019-10-11
(85)【翻訳文提出日】2021-06-09
(86)【国際出願番号】 GB2019052908
(87)【国際公開番号】W WO2020074925
(87)【国際公開日】2020-04-16
(31)【優先権主張番号】1816670.2
(32)【優先日】2018-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1816934.2
(32)【優先日】2018-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521153180
【氏名又は名称】リニューロン リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ペルズ，スティーブ
(72)【発明者】
【氏名】コルテリング，ラドルフ
(72)【発明者】
【氏名】シンデン，ジョン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95Y
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087BB65
4C087MA16
4C087MA17
4C087MA23
4C087MA27
4C087MA44
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZC02
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、条件付きで不死化可能な、細胞、例えば、成体幹細胞から形成される人工多能性幹細胞に関する。特に、本発明は、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む幹細胞株から形成される人工多能性幹細胞、およびそれらの人工多能性幹細胞の後代に関する。人工多能性幹細胞、それらの多能性細胞由来の後代細胞、それらの細胞を含む組成物、それらの細胞のすべてを生成する方法、およびそれらの細胞のすべての使用も記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む、人工多能性幹細胞。
【請求項2】
条件付き不死化細胞または条件付き不死化幹細胞から得ることができるか、または得られる、多能性幹細胞。
【請求項3】
１つ以上の転写因子により条件付き不死化幹細胞をリプログラミングすることによって得ることができるか、または得られる、請求項１または請求項２に記載の多能性幹細胞。
【請求項4】
Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ融合タンパク質を含む、請求項１から３のいずれかに記載の多能性幹細胞。
【請求項5】
ｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子を含み、場合によりゲノム中に含む、請求項１から４のいずれかに記載の多能性幹細胞。
【請求項6】
条件付き不死化神経幹細胞から得ることができるか、または得られる、請求項１から５のいずれかに記載の多能性幹細胞。
【請求項7】
条件付き不死化幹細胞株から得ることができるか、または得られる、請求項１から６のいずれかに記載の多能性幹細胞。
【請求項8】
前記幹細胞株は、ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９１６０１を有するＣＴＸ０Ｅ０３またはＥＣＡＣＣ受託番号０４１１０３０１を有するＳＴＲ０Ｃ０５である、請求項７に記載の細胞。
【請求項9】
請求項１から８のいずれかに記載の多能性細胞から誘導される、細胞。
【請求項10】
前記誘導された細胞は、１つ以上の分化のマーカーを発現する幹細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項11】
前記誘導された細胞は、内胚葉、中胚葉または外胚葉系のものである、請求項９または請求項１０に記載の細胞。
【請求項12】
前記誘導された細胞は、間葉系幹細胞、神経幹細胞、もしくは造血幹細胞；
体細胞（成体）幹細胞；
多能性細胞、少能性細胞もしくは単能性細胞；
高分化細胞；
免疫細胞、場合によりＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、もしくは樹状細胞からなる一覧から選択される免疫細胞；
軟骨細胞；
脂肪細胞；または
骨細胞
である、請求項９から１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項13】
多能性幹細胞を生成する方法であって、条件付き不死化幹細胞をリプログラミングするステップを含む、方法。
【請求項14】
前記リプログラミングするステップは、前記条件付き不死化幹細胞中に、転写因子ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２のうちの１つ以上、および場合によりＲＮＡ結合性ＬＩＮ２８を導入することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記導入された転写因子は、ＯＣＴ４を含むか、もしくはそれからなり、前記導入された転写因子は、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含むか、もしくはそれらからなり、
前記導入された転写因子は、ＯＣＴ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２を含むか、もしくはそれらからなり、
前記導入された転写因子は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＭＹＣを含むか、もしくはそれらからなり、または
ＭＹＣ活性は、リプログラミングされる前記幹細胞においてｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子を活性化するために培地に４－ＯＨＴを供給することによってもたらされ、リプログラミングプロセスを促進する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記転写因子および任意のＬＩＮ２８は、前記条件付き不死化幹細胞中に、１つ以上のエピソームプラスミド、または１つ以上のウイルスベクター、場合によりレンチウイルス、レトロウイルスもしくはセンダイウイルスから選択される１つ以上のウイルスベクターを使用して、またはｍＲＮＡトランスフェクションによって導入される、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記多能性幹細胞を内胚葉、中胚葉または外胚葉系に分化させるステップをさらに含む、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
前記内胚葉、中胚葉または外胚葉系は、リプログラミングされた前記条件付き不死化幹細胞の系列とは異なる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記多能性幹細胞を、間葉系幹細胞、神経幹細胞、もしくは造血幹細胞；
体細胞（成体）幹細胞；
多能性細胞、少能性細胞もしくは単能性細胞；
高分化細胞；
免疫細胞、場合によりＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または樹状細胞からなる一覧から選択される免疫細胞；
軟骨細胞；
脂肪細胞；または
骨細胞
に分化させる、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記方法の結果もたらされる前記細胞の条件付きで不死化された表現型を再活性化するステップを含む、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項21】
リプログラミングされる前記条件付き不死化幹細胞は、請求項３から８のいずれかにおいて定義される、請求項１３から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
前記方法によって得られる前記細胞を培養するステップ；前記方法によって得られる前記細胞を継代するステップ；
前記方法によって得られる前記細胞を収集するステップもしくは回収するステップ；
前記方法によって得られる前記細胞を１つ以上の容器に包装するステップ；および／または
前記方法によって得られる前記細胞を１つ以上の賦形剤、安定剤もしくは保存料とともに製剤化するステップ
から選択される１つ以上のステップを含む、請求項１３から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
請求項１３から１６、２１または２２に記載の方法によって得られるか、または得ることができる、多能性幹細胞。
【請求項24】
請求項１７から２２のいずれかに記載の方法によって得られるか、または得ることができる、細胞。
【請求項25】
請求項１から１２、２３または２４のいずれかに記載の細胞によって産生される、微粒子。
【請求項26】
エクソソームである、請求項２５に記載の微粒子。
【請求項27】
請求項１から１２、２３または２４のいずれかに記載の細胞あるいは請求項２５または請求項２６に記載の微粒子、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項28】
疾患または障害を、処置を必要とする患者において処置する方法で使用するための、請求項２３または２４に記載の細胞、請求項２５または２６に記載の微粒子、あるいは請求項２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、条件付きで不死化可能な、細胞、例えば、成体幹細胞から形成される人工多能性幹細胞に関する。特に、本発明は、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む細胞から生成される人工多能性幹細胞、およびそれらの人工多能性幹細胞の後代に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、体に見られるあらゆる細胞タイプに分化できる特性である多能性の特性によって定義される。これらは、初期胚（胚盤胞、受精後およそ６．５日）の内部細胞塊由来の胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ならびにトランスダクションおよび特定の転写因子の外因性発現により体細胞を多能性表現型にリプログラミングすることによって生成される人工多能性細胞（ｈｉＰＳＣ）を含む。
【0003】
多能性にリプログラミングすることができるような転写因子の基本セットがＯＫＳＭ（ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ－ＭＹＣ）として知られているが、Ｏ、Ｋ、ＳもしくはＭの代わりになり得るか、またはリプログラミング、確率過程が生じる効率を調節することができる他の因子も知られている。
【0004】
一般に、低継代一次細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を形成するリプログラミングのための好ましい基材である。そのような細胞は、より高継代の細胞よりも速く分裂する傾向があるという利点を有し、非分裂細胞は、リプログラミングを受けにくい。これらはまた、正倍数体である可能性が高い。成体幹細胞（ＡＳＣ）も多能性にリプログラミングするための有望な基材をもたらし、リプログラミング因子（例えば、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４）の内因性発現、および（多／複）能性と関連するよりオープンなクロマチン構造に起因して、より少数の転写因子およびより少ないリプログラミング事象しか必要としない場合が多い。
【0005】
一次細胞よりむしろ不死の哺乳動物細胞から形成されるｉＰＳＣのいくつかの例（一般にＥＢＶ不死化血液細胞）が存在する。そのような細胞は、一般にＥＢＶまたはがん遺伝子、例えば、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原の安定なゲノムの組み込みによって不死化されるため、その臨床的有用性は不確実である。例えば、２９３ＦＴ細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を安定して発現し、リプログラミング転写因子のトランスフェクション時に表現型が変化するが、これは、真のｉＰＳＣよりもむしろ異常なコロニーを形成する。したがって、そのような不死化細胞由来のｉＰＳＣ株は、一般に、疾患モデリング、薬物の発見および発生学的研究などのインビトロ用途に限定される。
【0006】
さらに、Ｓｋｖｏｒｔｓｏｖａらによる研究（Oncotarget, 2018, Vol.9 (No.81), pp35241-35250）は、不死化マウス線維芽細胞株が多能性状態へのリプログラミングに不応性であること、および不死化と関連する異数性およびインビトロ選択がそのような不応性の原因ではなさそうであることを報告している。したがって、多能性状態へのリプログラミングに適した細胞を特定しようとする場合、重大な技術的課題があり、少なくとも一部の不死化細胞はリプログラミングに対して不応性である。
【0007】
多能性幹細胞は、安定であり、インビトロにおいて無制限に培養され得る。しかしながら、その奇形腫形成の能力などの臨床用途に対する課題および大半の分化プロトコルが所望のエンドポイントに対して１００％未満の分化をもたらすという問題がある。したがって、治療用集団において残存する多能性細胞からの奇形腫形成の本式のリスク、および望ましくない細胞タイプを患者に一緒に移植する問題が依然としてある。そのような望ましくない部分集団は、治療の効率の低下だけであっても、不明確または負の影響がある可能性もある。これは、所望の治療用細胞タイプが、慢性または急性の減少が患者における病状の原因となる高分化細胞タイプではなく、むしろ、患者の適した組織において最終細胞タイプを生じる後期組織前駆細胞／成体幹細胞集団である場合が多いという事実によって悪化する。後期前駆細胞集団は、インビトロ培養では安定でない場合が多いため、上記の純度問題に加えて、理論において多能性細胞からのその生成が事実上無制限であっても、臨床的使用に許容できるレベルの純度でのスケーラブルな生成は少なからぬ課題である。
【0008】
そのような前駆細胞集団はまた、一般に取り扱いが非常に難しい。それらの細胞が移植に先立って患者または別の人のいずれかから単離される場合（例えば、骨髄細胞）、材料の非常に制限された利用可能性、両人が同時に同じ場所での手術に応じられる要件、適した（例えば、免疫適合性の（immunocompatible））ドナーが得られること、移植される材料純度およびＱＣの欠如のすべてに関連する困難がそのような処置の一般化を制限する。理論上は、ｈｉＰＳＣなどのｈＰＳＣを分化させることによってそのような細胞集団を形成する可能性は、そのような問題を改善するであろうが、その他の課題を提示する。極めて、前駆細胞集団は、インビトロで取り扱うのが難しく、時間とともに安定でなくなる。したがって、その均一でＧＭＰに準拠したスケーラブルな生成は、ＧＭＰ（医学）品質のｉＰＳＣが利用可能であっても、一般に不可能である。大半の分化プロトコルは、１００％の効率ではないため、汚染部分集団が治療用細胞集団に存在する可能性がある。
【0009】
臨床的有用性を有する幹細胞を形成することに対するニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【0010】
本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術が、条件付き不死化細胞、特に、条件付き不死化幹細胞からｉＰＳＣを形成することによって改善され得るという驚くべき認識に基づくものである。
【0011】
本発明の第１の態様は、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む人工多能性幹細胞を提供する。制御可能な導入遺伝子は、一般に人工多能性幹細胞に由来する後代の（より分化した）細胞を条件付きで不死化することができる。こうした後代の細胞は、そうでなければ取り扱うのが難しいこともあるため、条件付き不死化導入遺伝子の存在が改善点である。
【0012】
本発明の第２の態様は、条件付き不死化細胞、一般に条件付き不死化幹細胞から得ることができるか、または得られる多能性幹細胞を提供する。
【0013】
本発明の第３の態様は、多能性幹細胞を生成する方法であって、条件付き不死化細胞、一般に条件付き不死化幹細胞をリプログラミングするステップを含む、方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞からさまざまな細胞タイプを形成する続くステップをさらに含んでもよい。
【0014】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の方法によって生成される細胞、および任意のそれらの細胞によって生成される微粒子に関する。
【0015】
本発明者らは、条件付き不死化細胞、例えば、幹細胞、例えば、ＣＴＸ０Ｅ０３またはＳＴＲ０Ｃ０５細胞株由来の細胞の多能性へのリプログラミングが、他の成体幹細胞または組織前駆細胞集団の形成を可能にすることを発見した。多能性細胞が一旦形成されると、任意の所望の系列、例えば、外胚葉、内胚葉または中胚葉系の細胞をもたらすために、従来の分化プロトコルが使用できる。特定の実施形態において、多能性細胞は、元の条件付き不死化幹細胞の系列とは異なる系列に向けられる。特定の実施形態において、人工多能性細胞は、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または造血幹細胞へ分化させることができ、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞および樹状細胞などの免疫系の細胞へのさらなる分化を含む。特定の実施形態において、人工多能性細胞は、体細胞（成体）幹細胞、多能性(multipotent)細胞、少能性(oligopotent)細胞もしくは単能性細胞、または高分化細胞に分化されてもよい。
【0016】
下記の実施例は、さまざまな条件付き不死化細胞から本発明により形成されたｉＰＳＣが多能性であり、内胚葉、中胚葉および外胚葉系になることができることを示している。実施例は、成体幹細胞（ＭＳＣ）が本発明のｉＰＳＣから形成され得ることをさらに示している。これらのＭＳＣは、多能性であること、ならびに軟骨、脂肪および骨細胞に分化できることが示されている。
【0017】
本発明の人工多能性細胞の、免疫系の機能細胞への分化も記載されている。これらの免疫細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞が挙げられる。当業者には理解されるとおり、これらの細胞は、通常、造血系を介して到達する。
【0018】
細胞、例えば、幹細胞は、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子により条件付きで不死化可能にすることができる。この導入遺伝子は、表現型にいかなる変化も与えることなく増殖および細胞分裂を促進する４－ヒドロキシタモキシフェンを細胞培養培地に添加することによって、神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３およびＳＴＲ０Ｃ０５などの幹細胞株の安定でスケーラブルな生成を可能にすることが既に示された。
【0019】
条件付き不死化幹細胞は、一般に、体細胞の幹細胞とも呼ばれる成体幹細胞である。例えば、それは、ＣＴＸ０Ｅ０３幹細胞株由来の細胞などの神経幹細胞である場合もあるであろう。ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株は、本出願人（ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によってＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫに寄託され、ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９１６０１を有する。他の実施形態において、神経幹細胞株は、「ＳＴＲ０Ｃ０５」細胞株、「ＨＰＣ０Ａ０７」細胞株（これも本出願人によってＥＣＡＣＣに寄託された）またはMiljan et al Stem Cells Dev. 2009に開示されている神経幹細胞株であってもよい。
【0020】
条件付き不死化幹細胞は、多能性にリプログラミングされる。多能性表現型を誘導することは、一般に特定のセットの多能性関連遺伝子の生成物、すなわち「リプログラミング因子」を所与の細胞タイプに導入することを伴う。リプログラミング因子の元のセット（山中因子とも呼ばれる）は、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４である。リプログラミング因子は、細胞中に、当該技術分野において周知であるとおり、一般にウイルスまたはエピソームベクターを使用して導入される。
【0021】
リプログラミング因子を細胞に導入するのに適したウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルスおよびセンダイウイルスが挙げられる。リプログラミング因子を導入するための他の技術としては、ｍＲＮＡトランスフェクションが挙げられる。
【0022】
驚くべきことに、ＣＴＸ０Ｅ０３などの特定の条件付き不死化幹細胞を多能性にリプログラミングするためにたった１つの転写因子しか必要とされないことが確認された。例えば、図２Ｂ～Ｄは、ＯＣＴ４単独でＣＴＸ０Ｅ０３の多能性を誘導することができることを示す。多能性を実現することが確認された転写因子の組み合わせとしては、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＭＹＣが挙げられる。したがって、これらの組み合わせを含むか、またはそれからなるリプログラミング因子が本発明に使用するために提供される。図２Ｃにおいて多能性を首尾よく誘導する因子の組み合わせのそれぞれが、本発明の個々の実施形態として提供される。条件付き不死化幹細胞を多能性に誘導する際に使用するためのリプログラミング因子は、例示された組み合わせを含むか、またはそれからなってもよい。
【0023】
他の不死化因子も当該技術分野において知られており、当業者には明らかであろう。因子の任意の適した組み合わせが使用されてもよく、これは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、小分子阻害剤によるリプログラミングは、当該技術分野において知られており、同時に、ＮＡＮＯＧおよびＴＥＴ１が他の適した転写因子として知られている。例として、Ｔｈｏｍｓｏｎおよび同僚は、ＯＫＳＭの代替物としてＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＬＩＮ２８を使用した。別の例において、ＴＥＴ１は、ＯＣＴ４の代わりにすることができることが示された。
【0024】
ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子の活性は、細胞のＭＹＣ活性を再現するため、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ誘導性不死化幹細胞をリプログラミングする場合、ＭＹＣがん遺伝子を発現するベクターは必須でなく、その理由は、必要とされる場合、この活性は、培地に４－ＯＨＴを供給することによってもたらされ、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ融合タンパク質を活性化することができるからである。したがって、いくつかの実施形態において、ＭＹＣ（例えば、ＭＹＣリプログラミングベクター）は、別個のリプログラミング因子として使用されない。当業者は、ＭＹＣ以外の遺伝子を使用する条件付き不死化システムが、それらをリプログラミングするために外因性ＭＹＣを必要とする場合もあることを当然認識するであろう。
【0025】
人工多能性細胞は、任意の所望の細胞タイプに分化させることができる。細胞系列または細胞タイプを判定するための技術は、当該技術分野において周知である。一般に、これらの技術は、細胞表面（および／またはＯｃｔ４などの多能性のマーカーの不在）または細胞内のいずれかの分化のマーカー、例えば、系列特異的な転写因子、細胞形態および機能の存在の判定を伴う。例えば、多能性幹細胞は、一般にカノニカル多能性転写因子ＯＣＴ４、および細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ－４が陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ－１を発現しない。
【0026】
内胚葉系のマーカーとしては、ＧＡＴＡ６、ＡＦＰまたはＨＮＦ－アルファが挙げられる。他の内胚葉マーカーとしては、クローディン－６、サイトケラチン１９、ＥＯＭＥＳ、ＳＯＸ７およびＳＯＸ１７の１つ以上を挙げることができる。
【0027】
中胚葉系のマーカーとしては、ＢＭＰ２、ブラキュリまたはＶＥＧＦが挙げられる。他の中胚葉マーカーとしては、アクチビンＡ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－３、およびＴＧＦ－ベータのうちの１つ以上を挙げることができる。
【0028】
外胚葉系のマーカーとしては、ＰＡＸ６、ネスチンまたはＴｕｂＩＩＩが挙げられる。他の外胚葉マーカーとしては、ノギン、ＰＡＸ２およびコーディンのうちの１つ以上を挙げることができる。
【0029】
さまざまな系列への分化は、例えば、図３Ｄに示される。ＣＴＸ－ｉＰＳＣおよびＳＴＲ０Ｃ－ｉＰＳＣの内胚葉、中胚葉および外胚葉系への分化は、実施例２（図７）および実施例３（図９）にも示される。実施例２は、以下のマーカーを使用する。
【0030】
【表1-1】
【0031】
多能性細胞は、任意の所望の細胞タイプに分化させることができる。これは、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または造血幹細胞を含むことがある。別の実施形態において、体細胞（成体）幹細胞は、本発明の人工多能性細胞の分化から生じる。他の実施形態において、本方法によってもたらされる細胞は、多能性細胞、少能性細胞または単能性細胞である。この実施形態の例は、前駆細胞、例えば、神経前駆細胞の生成であろう。神経前駆細胞は、PloS One (2011) vol. 6 e20692においてＮｉｓｔｏｒおよび同僚によって、場合によって神経変性疾患の処置に潜在的に有用であると記載されている。もたらされる細胞はまた、分化のための既知の技術を使用して、高分化細胞に完全に分化させることができる。この実施形態の例は、Ｃａｒｒｉおよび同僚（２０１３年）によって示されるとおり、ハンチントン病において脱落している中型有棘ニューロンへの分化およびそのニューロンのスケーラブルな生成である。Stem Cell Review and Reports, DOI 10.1007/s12015-013-9441-8を参照。特定の実施形態において、造血幹細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および／または樹状細胞に分化させることができる。したがって、Ｔ細胞は、一実施形態として提供される。ナチュラルキラー細胞は、別の実施形態として提供される。樹状細胞がさらに提供される。
【0032】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの間葉系幹細胞への分化は、実施例１および図５において示されている。この例において、ＭＳＣ表現型は、マーカーのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が存在するが、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ３４またはＣＤ４５は存在しないことによって特定される。
【0033】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣの軟骨、脂肪および骨細胞への分化は、実施例３および図１０において示されている。
【0034】
ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子に続く４－ＯＨＴの培地への添加による（必要に応じて）再活性化は、誘導される細胞集団の無限の増殖を可能にするはずである。ＣＴＸ０Ｅ０３自体と類似していることから、これは、事実上無制限の量の治療に有用な細胞集団のインビトロにおけるスケーラブルな生成を可能にすることが予想され、これは、細胞療法が存在しないか、または組織ドナーの利用可能性もしくはｈＰＳＣからの分化プロトコルの技術的な制約によって制限されるかのいずれかの、急性または慢性の細胞損失によって特徴づけられる任意の状態のための「すぐに利用できる（off-the-shelf）」療法として使用することができる。
【0035】
本発明の方法は、所望の生成物を得るために必要な場合もある処理、培養または製剤化ステップをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、本発明の方法は、典型的には方法の終わりに、以下のステップの１つ以上を含んでもよい：
本方法の結果もたらされる細胞を培養するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を継代するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を収集するステップもしくは回収するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を１つ以上の容器に包装するステップ、および／または
本方法の結果もたらされる細胞を１つ以上の賦形剤、安定剤もしくは保存料とともに製剤化するステップ。
本方法の結果もたらされる細胞を培養するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を継代するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を収集するステップもしくは回収するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を１つ以上の容器に包装するステップ、および／または
本方法の結果もたらされる細胞を１つ以上の賦形剤、安定剤もしくは保存料とともに製剤化するステップ。
【0036】
条件付き不死化幹細胞、リプログラミングの結果もたらされる多能性細胞、および多能性細胞から得ることができるさらに分化した細胞は、一般に単離または精製される。これらの細胞のいずれかによって産生される微粒子（細胞外小胞）、例えば、エクソソームも、一般に単離または精製される。
【0037】
分化後にもたらされる細胞、およびそれらによって生成される微粒子は、治療に使用することができる。治療は、一般にそれを必要とする個体の疾患または障害のものになる。患者は、一般にヒトになる。
【0038】
さらなる態様において、本発明は、条件付き不死化幹細胞；リプログラミングの結果もたらされる多能性細胞；多能性細胞から得ることができるさらに分化した細胞；またはこれらの細胞のいずれかによって生成される微粒子；および薬学的に許容される賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1-1】ＣＴＸ細胞の多能性表現型へのリプログラミングを示す図である。（Ａ）ＣＴＸリプログラミングプロセス（ＨＰＳＣ培地：Ｅ８／Ｓｔｅｍｆｌｅｘ；ｈＰＳＣ基質：ＬＮ－５２１／ビトロネクチン－ＸＦ）およびリプログラミングに使用され得るＯＫＳＭＬを発現させるエピソームプラスミド（Ｅｐｉ５キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の概略図。ＣＴＸ培養培地は、所望の場合、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子によりＭＹＣ活性を得るために、４－ＯＨＴが加えられても、または加えられなくてもよい。トランスフェクションは、リポフェクション、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションによってなど、さまざまな方法で実現されてもよい。（Ｂ）ＥＧＦＰシグナルは、トランスフェクションの２４時間後におけるトランスフェクション効率を示す。
【図1-2】（図１の続き）（Ｃ）コロニー周辺の親ＣＴＸ細胞とは非常に異なる細胞およびコロニー形態を示す、トランスフェクションの１５日後のｈＰＳＣ表現型を有するリプログラミングされたＣＴＸ細胞の日の浅いコロニーの例。（Ｄ）２１日目の終了点のｈＰＳＣ表現型の（アルカリホスファターゼ陽性、赤く染色された）コロニーを示す６ウェルプレートの例。
【図2-1】ＣＴＸ０Ｅ０３細胞がさらに少数の因子によりリプログラミング可能であることを示す図である。（Ａ）１つの因子を発現するベクター、ｐＣＥ－ＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ＳＯＸ２およびｐＣＥ－ＫＬＦ４；４－ＯＨＴ供給はｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭによりＭＹＣを模倣する。
【図2-3】（図２の続き）（Ｃ）さまざまな因子の組み合わせにより得られたコロニー数（Ｓ－Ｋ：ｐＣＥ－ＳＫ、Ｍ－Ｌ：ｐＣＥ－ＵＬ、Ｓ：ｐＣＥ－ＳＯＸ２、Ｋ：ｐＣＥ－ＫＬＦ４、Ｍ：４－ＯＨＴ→ｄ１４）。（Ｄ）組み合わせの効果を示すベン図（数：ｘ個のコロニーが得られた；ゼロ：コロニーなし）。
【図3-1】ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性表現型を示す図である。（Ａ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣの細胞およびコロニー形態、（ｉｉ、ｉｉｉ）は、ｈＰＳＣに典型的な目立つ核小体を有する小さな緊密に詰め込まれた細胞の高密度のコロニーを再現している人工多能性ＣＴＸ細胞株の２つの例であり、親ＣＴＸ細胞（ｉ）の神経細胞表現型とは著しく異なっている。（Ｂ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣ株は、酵素マーカーアルカリホスファターゼ（ピンク染色）を発現する。確立されたＣＴＸ由来ｈＩＰＳＣ株のアルカリホスファターゼ染色。ピンクの着色は、細胞が多能性マーカーＴＮＡＰに関して陽性であることを示すため、インビトロにおける酵素触媒による変色反応を実施することができる。
【図3-2】（図３の続き）（Ｃ）フローサイトメトリーは、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ株が、転写因子ＯＣＴ４、ならびに細胞表面抗原ＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ－１－６０を含む多能性関連マーカーを発現するが、初期分化マーカーＳＳＥＡ－１は発現しないことを示す。（ｉ）いくつかのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株に関する集計表、（ｉｉ）１つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株に関するデータ例：上の行、左から右に：ＳＳＥＡ－１、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ－４；下の行、左から右に：ＴＲＡ－１－６０、前方散乱対側方散乱、ＳＳＥＡ－４。
【図4】ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおいて導入遺伝子座を評価する図である。（Ａ）Ｇ４１８における親ＣＴＸ０Ｅ０３細胞（一番上、４日目、２行目、１０日目）および４日目の５つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株（３～７行目）のギムザ染色は、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ関連ＮｅｏＲ遺伝子の発現活性を示す。（Ｂ）ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子を駆動するＣＭＶ－ＩＥプロモーターのバイサルファイト変換は、その遺伝子座におけるシトシンメチル化状態を示す（白丸、非メチル化ＣｐＧ；黒円、メチル化ＣｐＧ；カンマ、不確定な読み取り）。
【図5】例示となるＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の治療用細胞集団の生成を示す図である。（Ａ）ｍＴｅＳＲ１培地のラミニン－５２１上の多能性ＣＴＸ－ｉＰＳＣ（インビトロにおいて多能性を保護するための標準的な培養条件）。（Ｂ）ＭＳＣ培地（α－ＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）において（Ａ）の細胞由来のプラスチック付着性の候補の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。（Ｃ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのフローサイトメトリーは、それらが、ＩＳＣＴ基準に従って、ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現するが、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しないことを示す（青、染色；赤、アイソタイプ対照）。
【図6】多能性へのＣＴＸの細胞リプログラミングは、遺伝子発現における劇的な全ゲノムでの変化をもたらすことを示す図であり、ここでは多能性および神経系発生において重要な役割を有する遺伝子の発現調節の例によって示される。シングルセルＲＮＡ配列（トランスクリプトーム）データを、ＣＴＸの３つのサンプル（緑）、３つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ細胞株（青）および皮質系列に沿って分化を経た同じＣＴＸ－ｉＰＳＣ株（赤）に関して示す（色調、左上パネルを参照）。後者の場合、神経外胚葉遺伝子発現の選択したセットのＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定義されるとおり、最も厳密にＣＴＸ自体を再現する時点で分化を中止させた。それぞれのパネルは、シングルセル遺伝子発現データの「ｔＳＮＥプロット」であり、「雲状のもの」のそれぞれの点は１つの細胞を示す。グレー：発現なし、オレンジ：中程度の発現；赤：高発現。プロットは、ＣＴＸにおいて不活性の多能性遺伝子：ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＵＴＦ１、ＴＥＴ１、ＤＰＰ４、ＴＤＧＦ１、ＺＳＣＡＮ１０およびＧＡＬが、リプログラミングされた細胞では活性化されたことを示す。重要なことに、これらの遺伝子のうち、ＰＯＵ５Ｆ１のみがリプログラミングの間に外因的に与えられ、リプログラミング時の内在性遺伝子の活性化を明確に確認する。反対に、ＣＴＸによって発現されるいくつかの神経系遺伝子は、多能性へのリプログラミング時、ダウンレギュレートされ（ＮＯＧＧＩＮ、ＡＤＡＭ１２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＸ６）、ＣＴＸ細胞によって強く発現される遺伝子であるＯＣＩＡＤ２も同様である。ＧＬＩ３およびＰＡＸ６などの神経外胚葉発生に重要ないくつかの遺伝子は、それらが、神経外胚葉の運命を選択するように、多能性細胞の皮質分化時にアップレギュレートされる。
【図7】ＣＴＸ－ｉＰＳＣが多能性であることのさらなる確認を示す図である。３つの一次胚細胞系列、内胚葉、中胚葉および外胚葉を特定する転写因子などのタンパク質マーカーに対する免疫染色。
【図8】別の条件付き不死化成体幹細胞タイプのリプログラミングを示す図である。この図は、別の条件付き不死化成体幹細胞（ＡＳＣ）株、胎児の線条体細胞由来のＳＴＲ０Ｃ０５の成功したリプログラミングを示す。パネル：Ａ、リプログラミング因子によるトランスフェクションの２４日後のリプログラミングされたＳＴＲ０Ｃ０５細胞のコロニー；Ｂ、いくつかの細胞が多能性マーカー、アルカリホスファターゼを発現し始めたことを示す、リプログラミングの初期のアルカリホスファターゼ（赤）染色ＳＴＲ０Ｃ０５細胞；Ｃ、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株；Ｄ、さまざまなトランスフェクション条件に供されたウェルにおいてＡＰ陽性コロニーがさまざまな頻度で出現する；陽性コロニーのないウェル１は、対照としてＧＦＰ（非リプログラミング）プラスミドでトランスフェクションされ、リプログラミングされた細胞がないが、ウェル４および６は、生存細胞がほとんどなかった；Ｅ、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株は、アルカリホスファターゼ陽性であり、Ｆ、多能性マーカーＳＳＥＡ４も陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ１は陰性である。
【図9】ＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣの多能性の確認を示す図である。内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化が、３つの一次胚細胞系列を特定するタンパク質マーカー（一般に、転写因子）の同時発現を確認する免疫染色によって示される。
【図10】ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の成体幹細胞の多能性の確認の図である。候補ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の間葉系幹細胞（ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）は、多能性である。定義されたパネルの細胞表面マーカータンパク質の発現および組織培養プラスチックへの付着に加えて（本出願の主要部分を参照）、この図は、軟骨（グリコサミノグリカンのアルシアンブルー染色によって示される）、脂肪（オイルレッドＯによる細胞内脂質滴の染色によって示される）および骨（沈着したカルシウムのアリザリンレッド染色によって示される）へ分化する能力を確認する。
【図11】条件付き不死化細胞のリプログラミングによって結果として作り出されたｉＰＳＣから分化した成体幹細胞における条件付き不死化導入遺伝子の機能を示す図である。４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の存在下または非存在下において高継代（２０継代）まで培養されたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのフローサイトメトリープロフィール。この細胞株は、ＤＮＡメチル化データが脱メチル化Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭプロモーターを有することを示し、その結果、プロモーターが活性であることを意味するものである。この細胞株は、細胞周期が４－ＯＨＴ／Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭ系により誘導されるとき、その細胞表面マーカープロフィールをよりよく維持するようである。ＣＤ９０およびＣＤ１０５発現は、より一定でより高度に発現され、陰性マーカーＣＤ１４、２０、３４および４５は、より一貫して低い。第２のパネルにおいて、４－ＯＨＴ処理細胞は、分化時に骨を形成するのにより有効であるようであり、４－ＯＨＴ／Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭにより駆動される細胞周期が、そうでなければ、細胞周期からの離脱時に生じるであろう分化および関連する能力喪失をいくぶん阻害することを示唆する。
【図12】４－ＯＨＴの非存在下または存在下において培養されたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ株の例のグラフであり、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子が活性である（４－ＯＨＴが存在する）ときに向上したより一貫した増殖挙動を長期に示す。
【図13】４－ＯＨＴの非存在下または存在下において培養されたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ株の第２の例のグラフであり、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子が活性である（４－ＯＨＴが存在する）ときに向上したより一貫した増殖挙動を長期に示す。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本発明者らは、驚くべきことに、条件付き不死化細胞が多能性幹細胞表現型にリプログラミングされ得ることを明らかにした。これは、既存の人工多能性幹細胞を超えた利点を提供する。特に、インビトロにおける不死化および長期培養にもかかわらず、驚くべきことに、神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３およびＳＴＲ０Ｃ０５が外因性転写因子によってリプログラミングされ得ることが示された。さらに、条件付きで制御される遺伝子がリプログラミング後も、以前と同様に活性化でき、発現停止できるまであることも驚きである。
【0041】
有利にも、条件付き不死化細胞のリプログラミングは、標準的な（条件付きで不死化されていない）細胞においてよりも少ないリプログラミング因子により達成できる場合が多い。特定の実施形態における成体幹細胞の使用は、同様の利点をもたらす。
【0042】
さらに、細胞の条件付き不死化の性質は、細胞および不死化システムを超えた有益な制御性を提供する。いくつかの実施形態において、これらの利点は、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭ条件付き不死化システムによってもたらされる。理論に縛られることを望まないが、多能性にリプログラミングするためのソースとしての条件付き不死化細胞の使用にって、不死化（すなわち、永続的に不死化された）細胞を使用した以前の試みを超える、確認済みの利点をもたらすと考えられる。
【0043】
実施例のＣＴＸ－ｉＰＳＣおよびＳＴＲ０Ｃ－ｉＰＳＣなどの本発明の人工多能性細胞は、非常に有用な臨床的供給源である。これらは、所望の系列に沿って分化させて、組織前駆細胞株または成体幹細胞集団などの標的集団を形成することができる。その結果、継続的な増殖を促進し、細胞周期離脱および関連するさらなる分化を防ぐための不死化剤（例えば、４－ＯＨＴ）の供給は、新しいバッチの細胞療法生成物が必要とされる都度毎に、一次材料から細胞単離を繰り返すこともなく、人工多能性幹細胞からデノボの分化プロトコルを繰り返すこともなく、以前は実現不可能だった臨床上適切な部分集団を、定型的かつスケーラブルに生成可能にするものである。これは、例えば、同種異系の細胞療法用のすぐに利用できる細胞供給源の可能性を提供する。
【0044】
同種異系のすぐに利用できる成体幹細胞療法用集団を大規模に生成するために誘導性不死化を再適用する能力が、特に有益であることが予想される。
【0045】
元の条件付き不死化細胞（例えば、ＣＴＸ０Ｅ０３）自体は適していない条件に対するすぐに利用できる処置の大規模生成のために、クローニングまたは精製ステップを使用して、より不均一またはあまり不均一でない分化培養物から所望の治療タイプの純粋な集団を形成することができ、分化プロトコルの効率が不十分な当該技術分野に見られる欠点を回避する。このことは、上記細胞自体または、ＣＴＸ細胞自体によって産生されるものに対するペイロード分子の代替レパートリーを有する、さまざまな細胞タイプによって産生される微粒子（例えば、エクソソーム）部分の両方に当てはまる。
【0046】
さらに、これらのＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の亜株は既に臨床安全性試験（clinical phase safety trial）に合格した細胞株（ＣＴＸ）から誘導されるため、新しい適応症における効力に関する臨床試験への移行が加速される可能性がある。
【0047】
特定の態様において、本発明は、それぞれ皮質組織および線条体組織由来であるＣＴＸ０Ｅ０３またはＳＴＲ０Ｃ０５神経幹細胞株、それぞれが異なるヒトドナーからの神経幹細胞株などの、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含むさまざまな神経幹細胞から形成される人工多能性幹細胞、ならびにそれらの人工多能性幹細胞の後代に関する。
【0048】
多能性の誘導およびｉＰＳ細胞
高橋および山中が、同時に４つの遺伝子を導入することによってマウス線維芽細胞から胚性幹細胞と類似の特性を有する幹細胞を形成することができることを示してから（Cell. 2006; 126: 663-676）、人工多能性細胞の形成は、当該技術分野において知られている。この原理が２００７年にヒト細胞に適用された（Takahashi et al Cell. 2007; 131: 861-872；Yu et al Science. 2007; 318: 1917-1920）。最近の概説が、Shi et al, Nature Reviews Drug Discovery volume 16, pages 115-130 (2017)によって提供される。
高橋および山中が、同時に４つの遺伝子を導入することによってマウス線維芽細胞から胚性幹細胞と類似の特性を有する幹細胞を形成することができることを示してから（Cell. 2006; 126: 663-676）、人工多能性細胞の形成は、当該技術分野において知られている。この原理が２００７年にヒト細胞に適用された（Takahashi et al Cell. 2007; 131: 861-872；Yu et al Science. 2007; 318: 1917-1920）。最近の概説が、Shi et al, Nature Reviews Drug Discovery volume 16, pages 115-130 (2017)によって提供される。
【0049】
ｉＰＳＣは、一般に、特定のセットの多能性関連遺伝子の生成物、すなわち「リプログラミング因子」を所与の細胞タイプに導入することによって誘導される。リプログラミング因子の元々のセット（山中因子とも呼ばれる）は、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４である。
【0050】
ｉＰＳ細胞の形成は、誘導に使用される転写因子に依存する。Ｏｃｔ－３／４およびＳｏｘ遺伝子ファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）の特定の生成物は、誘導プロセスに関与する非常に重要な転写制御因子として特定され、それが存在しないと誘導が不可能になる。しかしながら、Ｋｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８の特定のメンバーを含む付加的な遺伝子が誘導効率を高めることが特定された。
【0051】
「ＰＯＵ５Ｆ１」、「ＯＣＴ４」および「ＯＣＴ３／４」は、同じ転写因子に対する同義語である。これは、当該技術分野において一般的にＯＣＴ４と呼ばれる転写因子であるが、さらに最近、ＰＯＵ５Ｆ１（ＰＯＵクラス５ホメオボックス１）と改名されている。これらの名称は、当業者には明白なとおり、本明細書においては同義に使用される。
【0052】
リプログラミング因子は、細胞中に、当該技術分野において周知であるとおり、一般にウイルスまたはエピソームベクターを使用して導入される。細胞中にリプログラミング因子を導入するのに適したウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルスおよびセンダイウイルスが挙げられる。リプログラミング因子を導入するための他の技術としては、ｍＲＮＡトランスフェクションが挙げられる。
【0053】
例えば、Schlaeger et al Nat Biotechnol. 2015 Jan; 33(1): 58-63によって概説されるとおり、非組み込み型リプログラミング法が当該技術分野において知られている。センダイウイルスリプログラミングでは、リプログラミング因子のセットをコードする複製可能なＲＮＡを標的細胞に形質導入するためにセンダイウイルス粒子が一般に使用される。エピソームリプログラミングでは、長期のリプログラミング因子の発現は、一般に分裂細胞においてエピソームプラスミドＤＮＡ複製を促進するエプスタインバーウイルス由来の配列によって達成される。ｍＲＮＡリプログラミングでは、細胞は、一般にリプログラミング因子をコードするインビトロ転写ｍＲＮＡによりトランスフェクションされ、外来性の核酸による自然免疫系の活性化を制限するために化学的手段が利用される場合が多い。ｍＲＮＡの半減期は非常に短いため、ｈｉＰＳＣを誘導するためには、毎日のトランスフェクションが必要とされることが多い。
【0054】
リプログラミング因子のトランスフェクションは、当該技術分野において既知のさまざまな方法において、例えば、リポフェクション、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションによって実現されてもよい。
【0055】
下記の一実施例において、条件付きで不死のＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、「山中因子」、ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２、ならびにＬＩＮ２８をコードする標準的な非組み込み型エピソームベクターを使用して多能性にリプログラミングされた。別の実施例において、ＯＣＴ４単独でＣＴＸ０Ｅ０３の多能性を誘導することが示されている。多能性を実現することが同じく確認された転写因子の組み合わせとしては、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＭＹＣが挙げられる。
【0056】
特定の実施形態において、条件付き不死化細胞を多能性にリプログラミングするために、ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２のうちの１、２、３または４つ、ならびにＬＩＮ２８が使用される。特定の実施形態において、ＯＣＴ４ならびにＬ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２のうちの１つ以上、ならびにＬＩＮ２８が使用される。いくつかの実施形態において、これらの因子がｃＭＹＣ－ＥＲＴＡＭ条件付き不死化システムと組み合わせて使用される。
【0057】
下記の別の実施例（実施例３）において、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞は、転写因子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子を発現するリプログラミングプラスミドｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬおよびｐＣＥｍＰ５３ＤＤによりリプログラミングされた。したがって、特定の実施形態において、本発明による使用のための転写因子は、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子を含んでも、またはそれらからなってもよい。当業者には明白であろうとおり、これらの１、２、３つ以上が除去されるか、または置き換えられてもよい。特定の実施形態において、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子のうちの１、２、３、４つ以上が、条件付き不死化細胞を多能性にリプログラミングするために使用される。いくつかの実施形態において、これらの因子がｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ条件付き不死化システムと組み合わせて使用される。
【0058】
いくつかの実施形態において、ＭＹＣ活性は、リプログラミングされる幹細胞においてｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子を活性化するために培地に４－ＯＨＴを供給することによってもたらされ、リプログラミングプロセスを促進する。特定の実施形態において、したがって、個別に添加されるＭＹＣは必要ない。
【0059】
条件付き不死化細胞
本発明は、条件付き不死化細胞を採取し、それが多能性表現型を有するよう誘導する。条件付き不死化細胞は、一般に条件付き不死化幹細胞、例えば、条件付き不死化成体幹細胞である。
本発明は、条件付き不死化細胞を採取し、それが多能性表現型を有するよう誘導する。条件付き不死化細胞は、一般に条件付き不死化幹細胞、例えば、条件付き不死化成体幹細胞である。
【0060】
条件付き不死化細胞は、一般に哺乳動物のもの、より一般にヒトのものである。
【0061】
幹細胞は、当該技術分野において知られている。幹細胞は、増殖する能力、生物の寿命を超えて自己維持または再生を示す能力およびクローン的に関連する後代を形成する能力を有する細胞である。本発明によりリプログラミングされた幹細胞は、一般に多能性細胞である。本発明によりリプログラミングされる幹細胞は、一般に成体（体細胞）幹細胞である。
【0062】
本発明に使用するための幹細胞は、単離される。「単離される」という用語は、それが言及する細胞または細胞集団が天然の環境内にないことを示す。細胞または細胞集団は、周辺組織から実質的に分離されている。いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団は、サンプルが少なくとも約７５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％、およびいくつかの実施形態において、少なくとも約９５％の幹細胞を含む場合に、周辺組織から実質的に分離されている。言い換えると、サンプルは、サンプルが約２５％未満、いくつかの実施形態において、約１５％未満、およびいくつかの実施形態において、約５％未満の幹細胞以外の材料を含む場合に、周辺組織から実質的に分離されている。そのようなパーセンテージの値は、重量パーセンテージを指す。この用語は、細胞が由来し、培養物中に存在する生物から取り出された細胞を包含する。この用語はまた、細胞が由来し、その後、生物に再び挿入される生物から取り出された細胞も包含する。再び挿入された細胞を含む生物は、細胞が取り出された同じ生物であってもよく、または異なる生物であってもよい。
【0063】
幹細胞は、一般に本発明により生成される後代細胞の任意の将来的なレシピエントと同種異系である。
【0064】
本発明は、条件付き不死化幹細胞、例えば、不死化因子の発現が治療に有効な幹細胞の生成に悪影響を及ぼすことなく制御され得る幹細胞株を使用する。これは、細胞が活性化薬剤を供給されない場合に不活性である不死化因子を導入することによって実現されてもよい。そのような不死化因子は、ｃ－ｍｙｃＥＲなどの遺伝子であってもよい。ｃ－ＭｙｃＥＲ遺伝子産物は、変異エストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインと融合したｃ－Ｍｙｃバリアントを含む融合タンパク質である。ｃ－ＭｙｃＥＲのみが、合成ステロイド４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の存在下において細胞増殖を駆動する（Littlewood et al. 1995）。このアプローチは、インビトロにおける神経幹細胞の制御された増殖を可能にすると同時に、神経幹細胞株中のｃ－Ｍｙｃまたはｃ－Ｍｙｃコード遺伝子の存在に起因する、宿主細胞の増殖に対するインビボでの望ましくない影響（例えば、腫瘍形成）を回避する。
【0065】
特定の実施形態において、条件付き不死化幹細胞は、以下のものであってもよい：
間葉系幹細胞、任意に骨髄由来幹細胞、子宮内膜再生細胞、間葉系前駆細胞または多能性成体前駆細胞から選択される；
神経幹細胞；
造血幹細胞、任意にＣＤ３４＋細胞、および／または臍帯血から単離された造血幹細胞、あるいは任意にＣＤ３４＋／ＣＸＣＲ４＋細胞である；
非造血性臍帯血幹細胞（non-haematopoietic umbilical cord blood stem cell）；あるいは
脂肪組織由来の間葉系幹細胞。
間葉系幹細胞、任意に骨髄由来幹細胞、子宮内膜再生細胞、間葉系前駆細胞または多能性成体前駆細胞から選択される；
神経幹細胞；
造血幹細胞、任意にＣＤ３４＋細胞、および／または臍帯血から単離された造血幹細胞、あるいは任意にＣＤ３４＋／ＣＸＣＲ４＋細胞である；
非造血性臍帯血幹細胞（non-haematopoietic umbilical cord blood stem cell）；あるいは
脂肪組織由来の間葉系幹細胞。
【0066】
これらの実施形態のそれぞれにおいて、細胞は、一般に哺乳動物のもの、より一般にヒトのものである。
【0067】
一般に、条件付き不死化幹細胞は、神経幹細胞、例えば、ヒト神経幹細胞である。
【0068】
神経幹細胞は、発生の過程においてニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞を生じ、成体の脳において多くの神経系細胞に取って代わることができる。本発明による特定の態様に使用するための典型的な神経幹細胞は、とりわけ、神経系の表現型マーカー、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、ネスチン、ＮｅｕＮ、クラスＩＩＩ β－チューブリン、ＧＦＡＰ、ＮＦ－Ｌ、ＮＦ－Ｍ、微小管結合タンパク質（ＭＡＰ２）、Ｓ１００、ＣＮＰａｓｅ、グリピカン、（とりわけ、グリピカン４）、神経型ペントラキシンＩＩ、神経型ＰＡＳ１、神経成長関連タンパク質４３、神経突起成長伸長タンパク質（neurite outgrowth extension protein）、ビメンチン、Ｈｕ、インターネキシン、０４、ミエリン塩基性タンパク質およびプレイオトロフィンのうちの１つ以上を呈する細胞である。
【0069】
神経幹細胞は、幹細胞株、すなわち、安定して分裂する幹細胞の培養物由来であってもよい。幹細胞株は、単一の所定の供給源を使用して大量に増殖されてもよい。
【0070】
好ましい条件付き不死化神経幹細胞株としては、ＣＴＸ０Ｅ０３、ＳＴＲ０Ｃ０５およびＨＰＣ０Ａ０７神経幹細胞株が挙げられ、これらは、本特許出願の出願人、ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄによって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ０ＪＧに受託番号０４０９１６０１（ＣＴＸ０Ｅ０３）；受託番号０４１１０３０１（ＳＴＲ０Ｃ０５）；および受託番号０４０９２３０２（ＨＰＣ０Ａ０７）で寄託されている。これらの細胞の由来および起源は、欧州特許第１６４５６２６号明細書および米国特許第７４１６８８８号明細書に記載されており、ともに参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0071】
ＣＴＸ０Ｅ０３（ＥＣＡＣＣ寄託番号０４０９１６０１）
ＣＴＸ０Ｅ０３は、虚血性脳卒中および肢損傷の治療法としての臨床試験における神経幹細胞株である。これは、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭ融合タンパク質の組み込みによって制御可能に不死化され、この融合タンパク質は、ＥＲＴＡＭドメインの合成エストロゲン誘導体４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）との結合時に核に移動し、そこでＣ－ＭＹＣドメインが無限の細胞周期を促進する。Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭの発現は、細胞表現型に影響を及ぼさないようである。したがって、無制限に多くの患者が、「すぐに利用できる」同種異系療法としてＣＴＸにより処置可能である。導入遺伝子は、４－ＯＨＴの除去時および／または患者への移入時に発現停止するすることが示された。
ＣＴＸ０Ｅ０３は、虚血性脳卒中および肢損傷の治療法としての臨床試験における神経幹細胞株である。これは、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭ融合タンパク質の組み込みによって制御可能に不死化され、この融合タンパク質は、ＥＲＴＡＭドメインの合成エストロゲン誘導体４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）との結合時に核に移動し、そこでＣ－ＭＹＣドメインが無限の細胞周期を促進する。Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭの発現は、細胞表現型に影響を及ぼさないようである。したがって、無制限に多くの患者が、「すぐに利用できる」同種異系療法としてＣＴＸにより処置可能である。導入遺伝子は、４－ＯＨＴの除去時および／または患者への移入時に発現停止するすることが示された。
【0072】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞は、以下の培養条件において培養されてもよい：
・ヒト血清アルブミン ０．０３％
・トランスフェリン、ヒト ５μｇ／ｍｌ
・プトレシン二塩酸塩 １６．２μｇ／ｍｌ
・インスリンヒト組み換え型 ５μ／ｍｌ
・プロゲステロン ６０ｎｇ／ｍｌ
・Ｌ－グルタミン ２ｍＭ
・亜セレン酸ナトリウム（セレン） ４０ｎｇ／ｍｌ
加えて、細胞増殖のための塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）および４－ヒドロキシタモキシフェン（１００ｎＭ）。細胞は、４－ヒドロキシタモキシフェンの除去によって分化させることができる。一般に、細胞は、５％ ＣＯ２／３７℃または５％、４％、３％、２％もしくは１％ Ｏ２の低酸素条件下のいずれかで培養することができる。これらの細胞株は、首尾よく培養するために血清を必要としない。血清は、多くの細胞株の順調な培養に必要とされるが、多くの混入物を含む。ＣＴＸ０Ｅ０３、ＳＴＲ０Ｃ０５もしくはＨＰＣ０Ａ０７神経幹細胞株、または血清を必要としない任意の他の細胞株のさらなる利点は、血清による汚染が回避されることである。本発明の一部の実施形態において、例えば、リプログラミングのステップおよび人工多能性幹細胞の培養のステップのためにＥ８培地を使用することによって、系内に血清なしの状態を維持することができる。
・ヒト血清アルブミン ０．０３％
・トランスフェリン、ヒト ５μｇ／ｍｌ
・プトレシン二塩酸塩 １６．２μｇ／ｍｌ
・インスリンヒト組み換え型 ５μ／ｍｌ
・プロゲステロン ６０ｎｇ／ｍｌ
・Ｌ－グルタミン ２ｍＭ
・亜セレン酸ナトリウム（セレン） ４０ｎｇ／ｍｌ
加えて、細胞増殖のための塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）および４－ヒドロキシタモキシフェン（１００ｎＭ）。細胞は、４－ヒドロキシタモキシフェンの除去によって分化させることができる。一般に、細胞は、５％ ＣＯ２／３７℃または５％、４％、３％、２％もしくは１％ Ｏ２の低酸素条件下のいずれかで培養することができる。これらの細胞株は、首尾よく培養するために血清を必要としない。血清は、多くの細胞株の順調な培養に必要とされるが、多くの混入物を含む。ＣＴＸ０Ｅ０３、ＳＴＲ０Ｃ０５もしくはＨＰＣ０Ａ０７神経幹細胞株、または血清を必要としない任意の他の細胞株のさらなる利点は、血清による汚染が回避されることである。本発明の一部の実施形態において、例えば、リプログラミングのステップおよび人工多能性幹細胞の培養のステップのためにＥ８培地を使用することによって、系内に血清なしの状態を維持することができる。
【0073】
ＣＴＸ培養培地は、所望の場合、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子によりＭＹＣ活性を得るために、４－ＯＨＴが加えられても、または加えられなくてもよい。
【0074】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞は、元は１２週ヒト胎児の大脳皮質由来の多能性細胞である。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株に関する単離、製造およびプロトコルは、Ｓｉｎｄｅｎらによって詳細に記載されている（米国特許第７，４１６，８８８号明細書および欧州特許第１６４５６２６号明細書）。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、「胚性幹細胞」ではない。すなわち、それらは、胚盤胞の内部細胞塊由来の多能性細胞ではない。元の細胞の単離は、胚の破壊を招かなかった。増殖培地では、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、ネスチン陽性で、ＧＦＡＰ陽性細胞は低いパーセンテージである（すなわち、集団は、ＧＦＡＰに関して陰性である）。
【0075】
ＣＴＸ０Ｅ０３は、レトロウイルス感染によって送達されたｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子の単一コピーを含むクローン細胞株であり、４－ＯＨＴ（４－ヒドロキシタモキシフェン）によって条件付きで制御される。ｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子は、４－ＯＨＴの存在下において細胞増殖を刺激する融合タンパク質を発現するため、４－ＯＨＴの存在下で培養される場合、制御された増殖を可能にする。この細胞株は、クローン性であり、培養において急速に増え（倍加時間５０～６０時間）、正常なヒト核型（４６ＸＹ）を有する。これは、遺伝学的に安定で、大量に増殖させることができる。この細胞は、安全で、腫瘍形成性ではない。成長因子および４－ＯＨＴの非存在下では、この細胞は、増殖停止を受けて、ニューロンおよび星状細胞に分化する。虚血性損傷脳に移植されると、これらの細胞は、組織損傷の領域にのみ移動する。
【0076】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の開発は、臨床的使用のための一貫した生成物のスケールアップを可能にした。保存された材料からの細胞の生成は、商業用途用の量で細胞を形成することを可能にする（Hodges et al, 2007）。
【0077】
ＣＴＸ０Ｅ０３医薬品は、米国特許第９２６５７９５号明細書に記載され、ＰＩＳＣＥＳ ＩＩ試験に使用されたとおり、生細胞の得られたばかりのものとして（ＰＩＳＣＥＳ試験の場合と同様に）、または生細胞の凍結懸濁液として提供されてもよい。医薬品は、一般に≦３７の継代のＣＴＸ０Ｅ０３細胞を含む。
【0078】
ＣＴＸ臨床医薬品は、一般に何か月もの品質保持期間を有する、溶媒を含まない賦形剤中の「すぐに利用できる」凍結保存製品（例えば、米国特許第９２６５７９５号明細書に記載されているとおり）として製剤化される。この製剤は、一般にトロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ－、Ｈ２ＰＯ４
－、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオナート、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン－４０、アデノシンおよびグルタチオンを含む。これらの賦形剤のうちの１つ以上、例えば、２、３または４つが任意に除去されても、または置き換えられてもよい。一般に、本製剤は、両性非プロトン溶媒、特に、ＤＭＳＯを含まない。
【0079】
幹細胞製品に対する臨床発売基準は、一般に無菌性、純度（細胞数、細胞生存率）、ならびに臨床製品発売のため、または規制当局に要求される情報のために必要とされる同一性、安定性、および効力の多くの他の試験の尺度を含む。ＣＴＸ０Ｅ０３に利用される試験の概要を、下記表１に示す。
【0080】
【表1-2】
【0081】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株は、ヒトＰＢＭＣアッセイを使用して免疫原性でないことが以前に証明された。免疫原性がないことは、細胞がホスト／患者免疫系による排除を回避するのを可能にし、それによって有害な免疫および炎症応答なくその治療効果を発揮する。
【0082】
Pollock et al 2006は、脳卒中のラットモデル（ＭＣＡｏ）におけるＣＴＸ０Ｅ０３の移植が、移植後６～１２週に感覚運動機能および粗大運動の非対称性の両方において統計学的に有意な改善をもたらしたことを示している。これらのデータは、ＣＴＸ０Ｅ０３が治療用細胞株として開発するために必要な適した生物学的および製造特性を有することを示す。
【0083】
Stevanato et al 2009は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび４－ＯＨＴ除去後インビトロにおいて、およびＭＣＡｏラット脳に移植後インビボにおいての両方でｃ－ｍｙｃＥＲＴＡＭ導入遺伝子発現をダウンレギュレートしたことを確認している。インビボにおけるｃ－ｍｙｃＥＲＴＡＭ導入遺伝子のサイレンシングは、潜在的な臨床用途に対してＣＴＸ０Ｅ０３細胞のさらなる安全性の特徴をもたらす。
【0084】
Smith et al 2012は、脳卒中（一過性中大脳動脈閉塞）のラットモデルにおけるＣＴＸ０Ｅ０３の前臨床効力試験について記載している。この結果は、ＣＴＸ０Ｅ０３移植が、行動機能障害を３か月の時間枠にわたって大きく回復させ、この効果は、その移植の部位に特異的であることを示す。病変の位置が、回復における重要な要素である可能性があり、線条体に限られた脳卒中はより大きな領域の損傷と比較して良好な予後を示す。
【0085】
ＳＴＲ０Ｃ０５（ＥＣＡＣＣ寄託番号０４１１０３０１）
このｃ－ＭｙｃＥＲＴＡＭ形質導入神経幹細胞株は、１２週胎児の線条体由来であった。この株は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよび４－ヒドロキシタモキシフェンの存在下の合成無血清「ヒト培地」を使用して、ラミニンコーティング培養フラスコにおいて維持される。通常の培養において、この細胞株は、３～４日の倍加時間を有するが、短期間培養では、２０～３０時間の倍加時間が見られた。
このｃ－ＭｙｃＥＲＴＡＭ形質導入神経幹細胞株は、１２週胎児の線条体由来であった。この株は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよび４－ヒドロキシタモキシフェンの存在下の合成無血清「ヒト培地」を使用して、ラミニンコーティング培養フラスコにおいて維持される。通常の培養において、この細胞株は、３～４日の倍加時間を有するが、短期間培養では、２０～３０時間の倍加時間が見られた。
【0086】
増殖培地において、この細胞は、ネスチン陽性、β－ＩＩＩチューブリン陰性であり、ＧＦＡＰ陽性細胞は低いパーセンテージである。７日間の分化後、βＩＩＩチューブリンの低レベル発現およびＧＦＡＰの高発現を伴いネスチンがダウンレギュレートされ、これは、この細胞株の大部分が星状細胞になっていること示唆する。
【0087】
この細胞株は、遺伝学的に正常、男性ＸＹで、５０集団倍加を超えて安定なものである。
【0088】
ここに記載される株は、臨床的使用に指定された株を発展させるのに適した品質が保証された条件下で誘導された。供給源の材料として、ヒト神経幹細胞は、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンによる酵素消化によって、妊娠１２週の胎児ＧＳ００６の線条体から死後に単離された。培養において確立されると、これらの一次神経系細胞は、ｃ－ＭｙｃＥＲＴＡＭがん遺伝子によるレトロウイルストランスダクションによって形質転換され（上でＣＴＸ０Ｅ０３細胞株に関して記載されているとおり）、クローン集団細胞株および混合集団細胞株の範囲が単離された。このシリーズのすべての株は、ラミニンコーティング培養製品において、ヒト培地（ＨＭ）；ＤＭＥＭ：Ｆ１２＋以下に示される指定された補充物を使用して誘導された。
【0089】
ヒト培地（ＨＭ）
ＤＭＥＭ：Ｆ１２、以下に列挙される成分を加えた：
ヒト血清アルブミン ０．０３％。
トランスフェリン、ヒト １００μｇ／ｍｌ。
プトレシン二塩酸塩 １６．２μｇ／ｍｌ。
インスリン、ヒト組み換え型 ５μｇ／ｍｌ。
Ｌ－チロキシン（Ｔ４） ４００ｎｇ／ｍｌ。
トリヨードサイロニン（Ｔ３） ３３７ｎｇ／ｍｌ。
プロゲステロン ６０ｎｇ／ｍｌ。
Ｌ－グルタミン ２ｍＭ。
亜セレン酸ナトリウム（セレン） ４０ｎｇ／ｍｌ。
ヘパリン、ナトリウム塩 １０単位／ｍｌ。
コルチコステロン ４０ｎｇ／ｍｌ。
加えて、細胞増殖のための塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）および上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）。
ＤＭＥＭ：Ｆ１２、以下に列挙される成分を加えた：
ヒト血清アルブミン ０．０３％。
トランスフェリン、ヒト １００μｇ／ｍｌ。
プトレシン二塩酸塩 １６．２μｇ／ｍｌ。
インスリン、ヒト組み換え型 ５μｇ／ｍｌ。
Ｌ－チロキシン（Ｔ４） ４００ｎｇ／ｍｌ。
トリヨードサイロニン（Ｔ３） ３３７ｎｇ／ｍｌ。
プロゲステロン ６０ｎｇ／ｍｌ。
Ｌ－グルタミン ２ｍＭ。
亜セレン酸ナトリウム（セレン） ４０ｎｇ／ｍｌ。
ヘパリン、ナトリウム塩 １０単位／ｍｌ。
コルチコステロン ４０ｎｇ／ｍｌ。
加えて、細胞増殖のための塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）および上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）。
【0090】
ＳＴＲ０Ｃ０５増殖特性
通常の培養条件下において、細胞は、Ｔ１８０培養フラスコ中で凍結ストック、一般には２～４百万細胞から増殖させる。数回の培地変更後、コンフルエントなときに細胞を継代する。経過記録から、ＳＴＲ０Ｃ０５に関する集団倍加時間は、下記グラフに示されるとおり３～４日と推定された。この倍加時間は、対数期増殖よりもゆっくりであり、継代中の細胞喪失も含む。
通常の培養条件下において、細胞は、Ｔ１８０培養フラスコ中で凍結ストック、一般には２～４百万細胞から増殖させる。数回の培地変更後、コンフルエントなときに細胞を継代する。経過記録から、ＳＴＲ０Ｃ０５に関する集団倍加時間は、下記グラフに示されるとおり３～４日と推定された。この倍加時間は、対数期増殖よりもゆっくりであり、継代中の細胞喪失も含む。
【0091】
ＳＴＲ０Ｃ０５に関する対数期増殖のより代表的な評価として、Ｃｙｑｕａｎｔ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した細胞増殖アッセイを設定した。細胞数をＴｅｃａｎ Ｍａｇｅｌｌａｎ蛍光プレートリーダーを使用して測定する。励起４８０ｎｍ、蛍光５２０ｎｍ。
【0092】
ＳＴＲ０Ｃ０５細胞を継代し、ＨＭ＋成長因子中に再懸濁させ、ラミニンコーティング９６ウェルストリップウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播いた。１日毎を基準にプレートからストリップを取り出し（各時点につきｎ＝１６ウェル）、培地を除去し、－７０℃で細胞を凍結することによって、経時的な試験を行った。
【0093】
時間経過の終点で、凍結したすべてのストリップをプレートに一緒に戻し、Ｃｙｑｕａｎｔアッセイにより分析した。簡単に言えば、細胞を溶解バッファーに溶解させた後、Ｃｙｑｕａｎｔ試薬を添加し、暗所に５分間置いた。各ウェルの１５０ｕｌのサンプルを、その後、Ｔｅｃａｎ Ｍａｇｅｌｌａｎプレートリーダーにおける読み取りのために黒色のＯｐｔｉｌｕｘプレートに移した。数値平均化のためにＥｘｃｅｌスプレッドシートにデータをエクスポートし、解析のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにさらにエクスポートした。
【0094】
これらの結果は、細胞が７日間にわたり着実に増殖し、推定される倍加時間が２０～３０時間であったことを示した。
【0095】
ＳＴＲ０Ｃ０５表現型
神経幹細胞マーカー、ネスチンを染色するため、および分化の成熟マーカー、β－ＩＩＩチューブリン（神経細胞）およびＧＦＡＰ（星状細胞）を染色するために免疫細胞化学を使用してＳＴＲ０Ｃ０５の表現型をプロファイリングした。
神経幹細胞マーカー、ネスチンを染色するため、および分化の成熟マーカー、β－ＩＩＩチューブリン（神経細胞）およびＧＦＡＰ（星状細胞）を染色するために免疫細胞化学を使用してＳＴＲ０Ｃ０５の表現型をプロファイリングした。
【0096】
ＳＴＲ０Ｃ０５の表現型を、成長因子＋４－ＯＨＴの存在下および非存在下において判定した。細胞を、最初はＳＴＲ０Ｃ０５ワーキングストックから得た。細胞を継代し、９６ウェルプレートに播いた。
【0097】
細胞を、４％パラホルムアルデヒド中において室温で１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００／ＰＢＳで１５分間透過処理をした。非特異的結合を、その後、ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で室温において１時間ブロッキングした。細胞を、その後、ネスチン抗体（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、β－ＩＩＩチューブリン抗体（１：５００；Ｓｉｇｍａ）およびＧＦＡＰ抗体（１：５０００；ＤＡＫＯ）を用いて室温で一晩調べた。ＰＢＳで洗浄した後、それらを、その後、１％ＮＧＳ／ＰＢＳ中に溶解させたろ過済みＡｌｅｘａ Ｇｏａｔ α Ｍｏｕｓｅ ４８８（１：２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびＡｌｅｘａ Ｇｏａｔ α Ｒａｂｂｉｔ ５６８（１：２５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により室温で１時間処理した。それらを、その後、ＰＢＳで洗浄してＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）で２分間対比染色した後、蛍光顕微鏡において分析した。
【0098】
培地からの成長因子および４－ＯＨＴの除去が、細胞における形態的および表現型の変化を誘導し、これは、ネスチンのダウンレギュレーションに付随して起こる。特に、小さな割合の細胞が神経細胞マーカー、β－ＩＩＩチューブリンに関して陽性になり、樹状／軸索突起に延びる丸い細胞体を有する神経細胞の形態を獲得する。しかしながら、より主要な表現型変化は、ＧＦＡＰのアップレギュレーションであり、これは、星状細胞系列が優勢であることを示唆する。
【0099】
クローン性
ＳＴＲ０Ｃ０５に対するサザンブロット
２つの別々の実験では、他の細胞株に見られる明らかなバンドとは対照的に、プローブハイブリダイゼーションの証拠がない。
ＳＴＲ０Ｃ０５に対するサザンブロット
２つの別々の実験では、他の細胞株に見られる明らかなバンドとは対照的に、プローブハイブリダイゼーションの証拠がない。
【0100】
細胞集団
本発明は、単離された幹細胞の集団を使用し、それに関するものであり、この集団は、本質的に本発明の幹細胞のみを含み、すなわち、幹細胞集団は実質的に純粋である。多くの態様において、幹細胞集団は、全細胞集団を構成する他の細胞に対して、少なくとも約７５％、または少なくとも８０％（他の態様において、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％）の本発明の幹細胞を含む。例えば、神経幹細胞集団に関して、この用語は、全細胞集団を構成する他の細胞と比較して、少なくとも約７５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％、およびいくつかの実施形態において、少なくとも約９５％純粋な神経幹細胞が存在することを意味する。「実質的に純粋な」という用語は、したがって、約２５％未満、いくつかの実施形態において、約１５％未満、およびいくつかの実施形態において、約５％未満の神経幹細胞ではない細胞を含む本発明の幹細胞の集団を指す。
本発明は、単離された幹細胞の集団を使用し、それに関するものであり、この集団は、本質的に本発明の幹細胞のみを含み、すなわち、幹細胞集団は実質的に純粋である。多くの態様において、幹細胞集団は、全細胞集団を構成する他の細胞に対して、少なくとも約７５％、または少なくとも８０％（他の態様において、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％）の本発明の幹細胞を含む。例えば、神経幹細胞集団に関して、この用語は、全細胞集団を構成する他の細胞と比較して、少なくとも約７５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％、およびいくつかの実施形態において、少なくとも約９５％純粋な神経幹細胞が存在することを意味する。「実質的に純粋な」という用語は、したがって、約２５％未満、いくつかの実施形態において、約１５％未満、およびいくつかの実施形態において、約５％未満の神経幹細胞ではない細胞を含む本発明の幹細胞の集団を指す。
【0101】
単離された幹細胞は、特定のマーカーに関する特有の発現プロフィールによって特徴づけることができ、他の細胞タイプの幹細胞と識別される。マーカーが本明細書に記載されている場合、その有無が神経幹細胞を識別するために使用されてもよい。
【0102】
神経幹細胞集団は、いくつかの実施形態において、集団の細胞が、マーカーであるネスチン、Ｓｏｘ２、ＧＦＡＰ、βＩＩＩチューブリン、ＤＣＸ、ＧＡＬＣ、ＴＵＢＢ３、ＧＤＮＦおよびＩＤＯのうちの１、２、３、４、５つ以上、例えば、すべてを発現することを特徴としてもよい。
【0103】
一般に、神経幹細胞は、ネスチン陽性である。
【0104】
「マーカー」とは、生体分子を指し、その存在、濃度、活性、またはリン酸化状態を検出することができ、細胞の表現型を特定するために使用することができる。
【0105】
本発明の幹細胞は、一般に集団の細胞の少なくとも約７０％が検出可能なレベルのマーカーを示す場合に、マーカーをもつと見なされる。他の態様において、集団の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９７％または少なくとも約９８％またはそれ以上が検出可能なレベルのマーカーを示す。特定の態様において、集団の少なくとも約９９％または１００％が、検出可能なレベルのマーカーを示す。マーカーの定量は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の使用により、または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により検出することができる。当然のことながら、このリストは例として提供されたものに過ぎず、限定することを意図しない。一般に、本発明の神経幹細胞は、集団の細胞の少なくとも約９０％が、ＦＡＣＳによって検出される検出可能なレベルのマーカーを示す場合に、マーカーをもつと見なされる。
【0106】
「発現される」という用語は、細胞内のマーカーの存在を示すために使用される。発現されると見なされるためには、マーカーは、検出可能なレベルで存在しなければならない。「検出可能なレベル」とは、マーカーが、ｑＲＴ－ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲ、ブロッティング、マススペクトロメトリーまたはＦＡＣＳ分析などの標準的な実験手法のうちの１つを使用して検出することができることを意味する。遺伝子は、発現が３５以下のクロッシングポイント（ｃｐ）値（ｑＲＴ－ＰＣＲアレイに対する標準的なカットオフ）で合理的に検出できる場合に、本発明の細胞の集団によって発現されると見なされる。Ｃｐは、増幅曲線が検出閾値と交差する点を表し、交差閾値（crossing threshold）（ｃｔ）として報告される場合もある。
【0107】
「発現する」および「発現」という用語は、対応する意味を有する。このｃｐ値未満の発現レベルでは、マーカーは、発現されていないと見なされる。本発明の幹細胞におけるマーカーの発現レベルと、例えば、間葉系幹細胞などの別の細胞における同じマーカーの発現レベルとの間の比較は、好ましくは、同じ種から単離された２つの細胞タイプを比較することによって行われてもよい。好ましくは、この種は哺乳動物であり、より好ましくは、この種はヒトである。そのような比較は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）実験を使用して都合よく行うことができる。
【0108】
本明細書中で使用される場合、マーカーに関して使用されるとき、「著しい発現」という用語またはその同等の用語「陽性」および「＋」は、細胞集団において、細胞のうちの２０％超、好ましくは、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超またはさらにはすべての細胞が前記マーカーを発現することを意味するものと解釈される。
【0109】
本明細書中で使用される場合、マーカーに対して使用されるとき、「陰性」または「－」は、細胞集団において、細胞の２０％未満、１０％未満、好ましくは、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満が前記マーカーを発現するか、またはそのような細胞がないことを意味するものと解釈される。
【0110】
細胞表面マーカーの発現は、特定の細胞表面マーカーに対するシグナルがバックグラウンドシグナルよりも大きいかどうかを判定するために、例えば、従来法および装置（例えば、市販の抗体および当該技術分野において知られている標準的なプロトコルとともに使用されるＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬ ＦＡＣＳシステム）を使用した特定の細胞表面マーカーに対するフローサイトメトリーおよび／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって判定されてもよい。バックグラウンドシグナルは、各表面マーカーを検出するために使用される特異的抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体によって形成されるシグナル強度と定義される。陽性と見なされるマーカーに対して観察される特定のシグナルは、一般にバックグラウンドシグナル強度と比較して、２０％超、好ましくは、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、５００％超、１０００％超、５０００％超、１００００％超またはそれ以上大きい。目的とする細胞表面マーカーの発現を分析するための代替的な方法としては、目的とする細胞表面マーカーに対する抗体を使用した電子顕微鏡法による視覚的分析が挙げられる。
【0111】
幹細胞の培養および生成
幹細胞培養用の単純なバイオリアクターは、一般的に使用されるＴ－１７５フラスコ（例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）１７５ｃｍ２細胞培養フラスコ、７５０ｍｌ、組織培養処理ポリスチレン、ストレートネック、青いプラグシールスクリューキャップ、ＢＤ製品コード３５３０２８）などのシングルコンパートメントフラスコである。
幹細胞培養用の単純なバイオリアクターは、一般的に使用されるＴ－１７５フラスコ（例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）１７５ｃｍ２細胞培養フラスコ、７５０ｍｌ、組織培養処理ポリスチレン、ストレートネック、青いプラグシールスクリューキャップ、ＢＤ製品コード３５３０２８）などのシングルコンパートメントフラスコである。
【0112】
条件付き不死化幹細胞は、一般にＴ－１７５またはＴ－５００フラスコ中で培養される増殖性幹細胞から採取されてもよい。
【0113】
バイオリアクターはまた、当該技術分野において知られているとおり複数のコンパートメントを有してもよい。これらのマルチコンパートメントバイオリアクターは、一般に気体および／または培養培地を収容する１つ以上のコンパートメントから細胞を収容するコンパートメントを分離する１つ以上の膜または仕切りによって分離された少なくとも２つのコンパートメントを含む。マルチコンパートメントバイオリアクターは、当該技術分野において周知である。マルチコンパートメントバイオリアクターの例は、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣｅＬＬｉｎｅバイオリアクターであり、これは、１０ｋＤａ半透膜によって分離された培地コンパートメントおよび細胞コンパートメントを含み、この膜は、任意の阻害性廃棄物の同時除去とともに細胞コンパートメント中への栄養素の継続的な拡散を可能にする。コンパートメントの個々の疎通性は、培養を機械的に妨げることなく新しい培地を細胞に供給することを可能にする。シリコーン膜は、細胞コンパートメント底部を形成し、細胞コンパートメントに短い拡散経路を与えることによって最適な酸素供給および二酸化炭素レベルの制御をもたらす。任意のマルチコンパートメントバイオリアクターを本発明に従って使用することができる。
【0114】
「培養培地」または「培地」という用語は、当該技術分野において認識され、一般に生細胞の培養に使用される任意の物質または調製物を指す。細胞培養を言及する際に使用される「培地」という用語は、細胞周辺の環境の成分を含む。培地は、固体、液体、気体または相および材料の混合物であってもよい。培地としては、液体増殖培地ならびに細胞増殖を持続しない液体培地が挙げられる。培地としてはまた、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲンマトリックスなどのゼラチン状の培地も挙げられる。例となる気体培地としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で増殖している細胞が曝露される気相が挙げられる。「培地」という用語はまた、それが、まだ細胞と接触させられていなくても細胞培養への使用が意図される材料も指す。言い換えると、培養のために調製される栄養素が豊富な液体が培地である。同様に、水またはその他の液体と混合されたときに細胞培養に適するようになる粉末混合物が「粉末培地」と呼ばれる場合もある。「合成培地」は、化学的に定義された（通常、精製された）成分から生成される培地を指す。「合成培地」は、酵母抽出物およびビーフブロスなどの十分に特徴づけられていない生物抽出物を含まない。「富栄養培地」は、特定の種のほとんどまたはすべての生存可能な形態の増殖を助けるよう設計された培地を含む。富栄養培地は、複雑な生物抽出物を含む場合も多い。「高密度培養の増殖に適した培地」は、他の条件（温度および酸素移動速度など）がそのような増殖を可能にする場合、３以上のＯＤ６００に達する細胞培養を可能にする任意の培地である。「基礎培地」という用語は、いかなる特別な栄養補助剤も必要としない、多くのタイプの微生物の増殖を促進する培地を指す。大半の基礎培地は、一般に４つの基本的な化学物質のグループ：アミノ酸、炭水化物、無機塩、およびビタミンから構成される。基礎培地は、一般に、血清、バッファー、成長因子、脂質などの補充物が添加されるより複雑な培地の基礎としての役割を果たす。一態様において、増殖培地は、本発明の細胞の増殖および拡大を助けると同時にその自己再生能力を維持する必須の成長因子を含む複合培地であってもよい。基礎培地の例としては、イーグル基礎培地、最小必須培地、ダルベッコ改変イーグル培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１０およびＨａｍ’ｓ Ｆ－１２、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭＥＭ／Ｆ－１２、ＲＰＭＩ １６４０、およびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0115】
本発明の多能性細胞およびそれらの後代によって産生される微粒子
本発明の多能性幹細胞、およびそれらの細胞から形成される分化細胞は、微粒子を産生することになる。本発明は、一態様において、本発明の人工多能性幹細胞から、またはそれらのｉＰＳ細胞から形成される分化細胞から得ることができる微粒子を提供する。これらの微粒子は、治療に使用することができる。
本発明の多能性幹細胞、およびそれらの細胞から形成される分化細胞は、微粒子を産生することになる。本発明は、一態様において、本発明の人工多能性幹細胞から、またはそれらのｉＰＳ細胞から形成される分化細胞から得ることができる微粒子を提供する。これらの微粒子は、治療に使用することができる。
【0116】
本発明の細胞から得られる微粒子はまた、外来性カーゴのための送達ビヒクルとしても使用することができる。カーゴは、いくつかの実施形態において、外来性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、特に、ＲＮＡｉ薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ）、外来性タンパク質（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント、シグナル伝達タンパク質、またはタンパク質薬物）であってもよい。例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって、カーゴを微粒子に直接搭載できることが当該技術分野において知られている。微粒子を産生する細胞を操作することにより微粒子の内容物を変えることができることも知られている。
【0117】
微粒子の性質、内容物および特徴は、それらを産生する細胞の影響を受ける。したがって、本発明は、有利にも単一の十分に特徴づけられた出発材料（すなわち、条件付き不死化細胞）から産生される多様な範囲の微粒子を提供する。例えば、微粒子は、ｉＰＳ細胞またはその細胞由来の任意のさらに分化した細胞、例えば、内胚葉、中胚葉もしくは外胚葉系になった細胞などから、単離することができる。これは、単一の既知の開始細胞からの多くの異なる微粒子の供給を可能にする。
【0118】
「微粒子」は、細胞から放出される直径３０から１０００ｎｍの細胞外小胞である。これは、生体分子を封入する脂質二重膜によって限定される。「微粒子」という用語は、当該技術分野において知られており、膜粒子、膜小胞、微小胞、エクソソーム様小胞、エクソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソームまたはエキソベシクル（exovesicle）を含む、多くの異なる種の微粒子を包含する。さまざまな異なるタイプの微粒子は、直径、細胞内(subcellular)起源、スクロース中におけるその密度、形状、沈殿速度、脂質組成物、タンパク質マーカーおよび分泌の様式（すなわち、シグナルに従う（誘導型）か、または自然に（構成型））に基づいて識別される。一般的な微粒子およびそれらの際だった特徴の４つを下記表１に記載する。特定の実施形態において、微粒子は、エクソソームである。
【0119】
【表1-3】
【0120】
微粒子は、直接的および間接的なメカニズムによりドナー細胞とレシピエント細胞の間でビヒクルの役割を果たすことによって細胞間伝達に関与すると考えられる。直接的なメカニズムは、レシピエント細胞による微粒子およびそのドナー細胞由来の成分（タンパク質、脂質または核酸など）の取り込みを含み、その成分は、レシピエント細胞において生物学的活性を有する。間接的なメカニズムは、微小胞－レシピエント細胞表面相互作用、およびレシピエント細胞の細胞内シグナル伝達の調節をもたらすことを含む。したがって、微粒子は、レシピエント細胞による１つ以上のドナー細胞由来の特性の獲得をもたらすこともある。動物モデルにおける幹細胞療法の効力にもかかわらず、幹細胞は、ホストに生着しないようであることが確認された。したがって、幹細胞療法が有効なメカニズムは、明らかでない。理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、神経幹細胞によって分泌される微粒子がそれらの細胞の治療有用性に関与し、したがって、それら自体が治療的に有用であると考える。
【0121】
本発明の微粒子は、細胞に関して本明細書中で定義されるとおり単離される。
【0122】
本発明は、本発明の細胞によって産生される単離された幹細胞微粒子の集団を提供し、その集団は、本質的に本発明の微粒子のみを含み、すなわち、微粒子集団は、純粋である。多くの態様において、微粒子集団は、少なくとも約８０％（他の態様において、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％）の本発明の微粒子を含む。
【0123】
特定の実施形態において、微粒子は、エクソソームである。エクソソームの脂質二重膜は、一般にコレステロール、スフィンゴミエリンおよびセラミドが豊富である。エクソソームはまた、１つ以上のテトラスパニンマーカータンパク質を発現する。テトラスパニンには、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ８２およびＣＤ３７が挙げられる。ＣＤ６３は、典型的なエクソソームマーカーである。エクソソームはまた、成長因子、サイトカインおよびＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡを含む場合もある。エクソソームは、一般にマーカーＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ、ＣＤ１０９、ｔｈｙ－１およびＣＤ１３３のうちの１つ以上を発現する。Ａｌｉｘ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＷＵＭ４）、ＴＳＧ１０１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９９８１６）ならびにテトラスパニンタンパク質ＣＤ８１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ６００３３）およびＣＤ９（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２１９２６）は、特徴的なエクソソームマーカーである。
【0124】
Ａｌｉｘは、エンドソームの経路マーカーである。エクソソームは、エンドソーム由来であり、したがって、このマーカーが陽性の微粒子は、エクソソームと特徴づけられる。本発明のエクソソームは、一般にＡｌｉｘが陽性である。微小胞は、一般にＡｌｉｘが陰性である。
【0125】
いくつかの実施形態において、エクソソームなどの微粒子は、外来性カーゴを入れることができる。外来性カーゴは、タンパク質（例えば、抗体）、ペプチド、薬物、プロドラッグ、ホルモン、診断用薬剤、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ薬剤、またはＤＮＡもしくはＲＮＡベクター）、炭水化物あるいは他の目的とする分子が可能である。カーゴは、例えば、エレクトロポレーションもしくはトランスフェクションによってエクソソームに直接入れることができ、またはエクソソーム放出前に細胞がカーゴをエクソソームにカプセル化するようにエクソソームを産生する細胞を操作することによってエクソソームに入れることができる。カーゴをエクソソームなどの微粒子に入れることは、当該技術分野において知られている。
【0126】
医薬組成物
本発明の多能性幹細胞は、治療に有用な細胞を形成するために分化させられてもよく、従って、医薬組成物として製剤化することができる。本発明の多能性幹細胞、およびそれらの細胞から形成される分化細胞は、本明細書中の別の場所に記載されているとおり微粒子を産生することになり、それも治療に有用であるため、医薬組成物として製剤化することができる。
本発明の多能性幹細胞は、治療に有用な細胞を形成するために分化させられてもよく、従って、医薬組成物として製剤化することができる。本発明の多能性幹細胞、およびそれらの細胞から形成される分化細胞は、本明細書中の別の場所に記載されているとおり微粒子を産生することになり、それも治療に有用であるため、医薬組成物として製剤化することができる。
【0127】
薬学的に許容される組成物は、一般に、治療用細胞または微粒子に加えて少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクルおよび／または賦形剤を含む。適した担体の例は、乳酸リンゲル液である。そのような成分の十分な解説は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472に示されている。
【0128】
「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激症状、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは障害なく、利益／リスクの合理的な比で釣り合いのとれた、ヒトおよび動物の組織と接触させる使用に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すよう本明細書において利用される。
【0129】
本組成物は、必要に応じて、少量のｐＨ緩衝剤も含んでもよい。本組成物は、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡから商業的に入手可能なＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）などの保存培地を含んでもよい。適した医薬担体の例は、E W Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、予防または治療有効量の予防または治療用幹細胞を、好ましくは、精製された形態で、対象への投与に適した形態で提供されるように、適した量の担体とともに含むことになる。製剤は、投与様式に適合させるべきである。好適な実施形態において、医薬組成物は、無菌であり、対象、好ましくは、動物対象、より好ましくは、哺乳動物対象、および最も好ましくは、ヒト対象への投与に適した形態である。
【0130】
本発明の医薬組成物は、さまざまな形態であってもよい。これら形態としては、例えば、半固体、および液体剤形、例えば、凍結乾燥調製物、凍結調製物、液体溶液または懸濁液、注射可能および注入可能な溶液が挙げられる。医薬組成物は、注射可能であるのが好ましい。
【0131】
医薬組成物は、一般に水性形態になる。組成物は、保存料および／または酸化防止剤を含んでもよい。
【0132】
張性を制御するために、医薬組成物は、ナトリウム塩などの生理的塩を含んでもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１～２０ｍｇ／ｍｌの間で存在してもよい。存在してもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムが挙げられる。
【0133】
本組成物は、１つ以上のバッファーを含んでもよい。典型的なバッファーとしては、リン酸バッファー、トリスバッファー、ホウ酸バッファー、コハク酸バッファー、ヒスチジンバッファー、またはクエン酸バッファーが挙げられる。バッファーは、一般に５～２０ｍＭの範囲の濃度で含まれることになる。本組成物のｐＨは、一般に、５から８の間、およびより一般に６から８の間、例えば、６．５から７．５の間、または７．０から７．８の間になる。
【0134】
本組成物は、好ましくは無菌である。本組成物は、好ましくは、発熱性物質なしである。
【0135】
一般的な実施形態において、細胞または微粒子は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標））、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ－、Ｈ２Ｐ０４
－、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオナート、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン－４０、アデノシンおよびグルタチオンから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の賦形剤を含む組成物中に懸濁される。一実施形態において、本組成物は、これらの賦形剤のすべてを含む。一般に、本組成物は、両性非プロトン溶媒、例えば、ＤＭＳＯを含まないことになる。適した組成物、例えば、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍａｓｏｌ（登録商標）－ＦＲＳは、商業的に入手可能である。そのような組成物は、細胞が長期間（何時間から何日間）４℃から２５℃で保管されるのを可能にするか、または凍結温度（cryothermic temperature）、すなわち、－２０℃より低い温度で保存されるのを可能にするため、有利である。解凍後のこの組成物中の幹細胞を、その後、投与することができる。
【0136】
本発明は、理解を明確にするために詳細に記載されてきたが、一定の改変が添付の特許請求の範囲内で行われてもよい。本出願において引用されるすべての刊行物、受託番号、および特許文献は、それぞれが個別にそうであることが示されているのと同じ程度までその全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込んだものとする。２つ以上の配列が異なる時点の受託番号と関連づけられる限りにおいて、本出願の有効な出願日の時点の受託番号と関連づけられる配列が意図される。有効な出願日は、問題となっている受託番号を開示している最先の優先出願の日付である。文脈からそうでないことが明らかでない限り、本発明の任意の要素、実施形態、ステップ、特徴または態様は、任意の他のものと組み合わせて実施されてもよい。
【0137】
本発明は、以下の非限定的実施例に関してさらに記載されている。これらの実施例において、本発明者らは、最初に、条件付き不死化神経幹細胞（ＣＴＸ０Ｅ０３；本特許出願の出願人、ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄによって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０４０９１６０１で２００４年９月１６日に寄託された）が多能性にリプログラミングされ得ることを、いくつかの独立した反復実験に基づいて実証する。これらのｉＰＳＣは、その後、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に分化される。ＣＴＸ－ｉＰＳＣの遺伝子のリプログラミングおよび多能性も確認される。
【0138】
本発明者らは、その後、別の条件付き不死化成体幹細胞タイプの成功したリプログラミングを実証する。この株は、ＳＴＲ０Ｃ０５であり、胎児の線条体細胞由来である（さらに本特許出願の出願人、ＲｅＮｅｕｒｏｎ ＬｉｍｉｔｅｄによってＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０４１１０３０１で２００４年１１月３日に寄託された）。ＳＴＲ０Ｃ０５からのｉＰＳＣの形成およびそれに続くこれらＳＴＲ０Ｃ－ｉＰＳＣの内胚葉、中胚葉および外胚葉系への分化が示される。これらのデータは、本発明によって提供される利点が、本発明者らがそれを最初に証明したＣＴＸ細胞株に限定されず、任意の条件付きで不死化された成体細胞タイプに広く当てはまることを確認する。
【0139】
実施例は、その後、リプログラミングされたｉＰＳＣ由来のＭＳＣ細胞のさらなる特徴づけを提供し、これらのｉＰＳＣから誘導される成体幹細胞タイプを、そのような細胞の通常の限界を超えて増やすことができ、それによって、そのような株から多くの患者の処置を可能にするという発見をより説得力のあるものにする。これらのＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣは、軟骨（シアログリカン（sialoglycan）のアルシアンブルー染色によって示される）、脂肪（オイルレッドＯによる細胞内脂質滴の染色によって示される）および骨（沈着したカルシウムのアリザリンレッド染色によって示される）細胞に分化することが示される（図１０）。
【0140】
最後に、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ細胞のさらにいっそう詳細な特徴づけが提供される。
【実施例】
【0141】
[実施例１]
同種異系細胞療法の臨床スケール製造用の供給源としての誘導的に不死化された成体幹細胞由来のｉＰＳＣ
序論
・人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、細胞療法の供給源の材料として大きな可能性をもつ
・候補治療用集団は、一般に、高分化細胞ではなく成体幹細胞または組織前駆体（ＡＳＣ／ＴＰ）である
・ＡＳＣ／ＴＰは、培養および精製するのが難しいことが多い
・ＡＳＣ／ＴＰの条件付き不死化は、同種異系細胞療法のための細胞のスケーラブルな生成に有益であろう
・ＣＴＸは、虚血性脳卒中に対する臨床試験における神経幹細胞株である。これは、培養培地への４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の添加によって制御可能なｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子により不死化される
同種異系細胞療法の臨床スケール製造用の供給源としての誘導的に不死化された成体幹細胞由来のｉＰＳＣ
序論
・人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、細胞療法の供給源の材料として大きな可能性をもつ
・候補治療用集団は、一般に、高分化細胞ではなく成体幹細胞または組織前駆体（ＡＳＣ／ＴＰ）である
・ＡＳＣ／ＴＰは、培養および精製するのが難しいことが多い
・ＡＳＣ／ＴＰの条件付き不死化は、同種異系細胞療法のための細胞のスケーラブルな生成に有益であろう
・ＣＴＸは、虚血性脳卒中に対する臨床試験における神経幹細胞株である。これは、培養培地への４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の添加によって制御可能なｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子により不死化される
【0142】
ＣＴＸ０Ｅ０３の多能性へのリプログラミング
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を、「山中因子」（ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２、「ＯＫＳＭ」、ならびにＬＩＮ２８）をコードする標準的な非組み込み型エピソームベクターを使用して多能性にリプログラミングした（図１）。
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を、「山中因子」（ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２、「ＯＫＳＭ」、ならびにＬＩＮ２８）をコードする標準的な非組み込み型エピソームベクターを使用して多能性にリプログラミングした（図１）。
【0143】
ＣＴＸ細胞は、独立して、数回うまくリプログラミングされた。
【0144】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣに典型的な多くの特徴を共有する。リプログラミング後、細胞形態は、ＣＴＸ細胞に典型的な伸長した突起を有する神経細胞の表現型から、目立つ核小体およびヒト多能性幹細胞に典型的な「細胞群」に高密度に詰め込まれた細胞間で識別が難しい区画を有する１つの小さな丸い未分化細胞に劇的に変化する（図１Ｃ、図２）。ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、２１日目の終了点に組織非特異的なアルカリホスファターゼ酵素マーカーを発現する（図１Ｄ、図３）。
【0145】
ＣＴＸリプログラミング要件を分析するためのさまざまな転写因子の組み合わせ。
図２は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞がさらに少数の因子によりリプログラミング可能であることを示す。（Ａ）１つの因子を発現するベクター、ｐＣＥ－ＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ＳＯＸ２およびｐＣＥ－ＫＬＦ４；４－ＯＨＴ供給はｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭによりＭＹＣを模倣する。（Ｂ）挿入図：コロニーカウントのための例のＡＰ染色プレート。中心の画像：転写因子ＯＣＴ４単独によりリプログラミングされたコロニー。（Ｃ）さまざまな因子の組み合わせにより得られたコロニー数（Ｓ－Ｋ：ｐＣＥ－ＳＫ、Ｍ－Ｌ：ｐＣＥ－ＵＬ、Ｓ：ｐＣＥ－ＳＯＸ２、Ｋ：ｐＣＥ－ＫＬＦ４、Ｍ：４－ＯＨＴ→ｄ１４）。（Ｄ）組み合わせの効果を示すベン図（数：ｘ個のコロニーが得られた；ゼロ：コロニーなし）。
図２は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞がさらに少数の因子によりリプログラミング可能であることを示す。（Ａ）１つの因子を発現するベクター、ｐＣＥ－ＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ＳＯＸ２およびｐＣＥ－ＫＬＦ４；４－ＯＨＴ供給はｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭによりＭＹＣを模倣する。（Ｂ）挿入図：コロニーカウントのための例のＡＰ染色プレート。中心の画像：転写因子ＯＣＴ４単独によりリプログラミングされたコロニー。（Ｃ）さまざまな因子の組み合わせにより得られたコロニー数（Ｓ－Ｋ：ｐＣＥ－ＳＫ、Ｍ－Ｌ：ｐＣＥ－ＵＬ、Ｓ：ｐＣＥ－ＳＯＸ２、Ｋ：ｐＣＥ－ＫＬＦ４、Ｍ：４－ＯＨＴ→ｄ１４）。（Ｄ）組み合わせの効果を示すベン図（数：ｘ個のコロニーが得られた；ゼロ：コロニーなし）。
【0146】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、古典的なｈＰＳＣと多くの特徴を共有する
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性表現型を図３に示す。
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性表現型を図３に示す。
【0147】
（Ａ）ＯＫＳＭＬ転写因子セットのトランスフェクションによる多能性へのリプログラミングによってＣＴＸ細胞から誘導された２つの異なる細胞株（ｉｉ、ｉｉｉ）についてのＣＴＸ－ｉＰＳＣの細胞およびコロニー形態評価は、これらのリプログラミングされた細胞株が、ｈＰＳＣに典型的な目立つ核小体を有する小さな緊密に詰め込まれた細胞の高密度のコロニーを再現し、親ＣＴＸ細胞（ｉ）の神経細胞の表現型とは著しく異なる。
【0148】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ株は、図３Ｂに示されるとおり酵素マーカーアルカリホスファターゼ（ピンク染色）を発現する。
【0149】
ヒト多能性幹細胞に関して予想されるとおり、フローサイトメトリーにより、ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、カノニカル多能性転写因子ＯＣＴ４、ならびに細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ－４が陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ－１は発現していないことが示されている。（図３Ｃ）。
【0150】
（Ｄ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、内胚葉、中胚葉および外胚葉へのインビトロ分化時の系列特異的なマーカーのアップレギュレーションを示す（個々のＣＴＸ－ｉＰＳＣ株は色調によって示される）。
【0151】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおけるｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子の状態
ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおける導入遺伝子座の評価を図４に示す。
ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおける導入遺伝子座の評価を図４に示す。
【0152】
（Ａ）Ｇ４１８における親ＣＴＸ０Ｅ０３細胞（１行目、４日目、２行目、１０日目）および４日目の５つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株（３～７行目）のギムザ染色は、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ関連ＮｅｏＲ遺伝子の発現活性を示す。
【0153】
（Ｂ）ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ導入遺伝子を駆動するＣＭＶ－ＩＥプロモーターのバイサルファイト変換は、その遺伝子座におけるシトシンメチル化状態を示す（白丸、非メチル化ＣｐＧ；黒円、メチル化ＣｐＧ；カンマ、不確定な読み取り）。
【0154】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣからの治療用細胞集団の誘導
３つの生殖系列（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に沿った分化が達成されることをＲＴ－ｑＰＣＲを使用して示すことができる。ＣＴＸ－ｉＰＳＣの治療に適切な細胞タイプへの分化も確認できた。これは、成体幹細胞タイプ（間葉系幹細胞）に関して実証された。当業者には明白であろうとおり、他の細胞タイプも適した培養条件によって形成することができる。特に、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞および樹状細胞などの免疫系の細胞は、Themeli et al. (2013) Nature Biotechnology (31), 928-933に開示されている方法によって分化させることができる。
３つの生殖系列（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に沿った分化が達成されることをＲＴ－ｑＰＣＲを使用して示すことができる。ＣＴＸ－ｉＰＳＣの治療に適切な細胞タイプへの分化も確認できた。これは、成体幹細胞タイプ（間葉系幹細胞）に関して実証された。当業者には明白であろうとおり、他の細胞タイプも適した培養条件によって形成することができる。特に、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞および樹状細胞などの免疫系の細胞は、Themeli et al. (2013) Nature Biotechnology (31), 928-933に開示されている方法によって分化させることができる。
【0155】
図５は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の治療用細胞集団の生成を示す。（Ａ）ｍＴｅＳＲ１培地中でのラミニン－５２１についてのＣＴＸ－ｉＰＳＣ。（Ｂ）ＭＳＣ培地（α－ＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中での、（Ａ）の細胞から誘導されるプラスチック付着性の候補の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。（Ｃ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのフローサイトメトリーは、それらが、ＩＳＣＴ基準に従って、ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現するが、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しないことを示す（青、染色；赤、アイソタイプ対照）。
【0156】
結論
インビトロにおける不死化および長期培養にもかかわらず、驚くべきことに、神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３が外因性転写因子によってリプログラミングできることを示した。
インビトロにおける不死化および長期培養にもかかわらず、驚くべきことに、神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３が外因性転写因子によってリプログラミングできることを示した。
【0157】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、細胞形態、細胞表面の発現、転写因子および酵素マーカー、ならびに多能性によって定義される、低継代の一次細胞から形成される従来のｉＰＳＣと外見上、見分けがつかない。
【0158】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおけるｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ遺伝子座は、少なくとも一部の株において依然として活性のままである。
【0159】
臨床に適切な細胞タイプ（例えば、ＭＳＣ、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞）は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣから形成されてもよい。
【0160】
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣにおける４－ＯＨＴ／ｃ－ｍｙｃ－ＥＲＴＡＭ系による細胞周期の誘導は、同種異系療法用のスケーラブルな生成を可能にするであろう。
【0161】
したがって、ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、非常に有用な臨床的供給源である。これらは、所望の系列に沿って分化させて、組織前駆細胞タイプまたは成体幹細胞集団などの標的集団を形成することができ、その後、継続的な増殖を促進し、細胞周期離脱および関連するさらなる分化を防ぐための４－ＯＨＴの供給が、一次材料から細胞単離を繰り返すことなく、以前は実現不可能だった臨床に適切な部分集団の定型化したスケーラブルな生成を可能にするものである。
【0162】
ＣＴＸ自体は適していない状態に対するすぐに利用できる処置の大規模生成のために、クローニングまたは精製ステップを使用して、より不均一またはあまり不均一でない分化培養物から所望の治療タイプの純粋な集団を形成することができ、分化プロトコルの効率が不十分な当該技術分野に見られる欠点を未然に防ぐ。このことは、上記細胞自体または、ＣＴＸ細胞自体によって産生されるものに対するペイロード分子の代替レパートリーを有する、さまざまな細胞タイプによって産生されるエクソソーム部分の両方に当てはまる。
【0163】
さらに、これらのＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の亜株は既に臨床安全性試験に合格した細胞株（ＣＴＸ）から誘導されるため、新しい適応症における効力に関する臨床試験への移行が加速される可能性がある。
【0164】
[実施例２]
リプログラミングされたＣＴＸ－ｉＰＳＣの特徴づけ
重要な遺伝子の発現の、リプログラミングにより誘導された調節が示され、これは、ＣＴＸ細胞が明らかに適切にリプログラミングされたことを確認する。
リプログラミングされたＣＴＸ－ｉＰＳＣの特徴づけ
重要な遺伝子の発現の、リプログラミングにより誘導された調節が示され、これは、ＣＴＸ細胞が明らかに適切にリプログラミングされたことを確認する。
【0165】
その結果を図６に示す。各パネルは、ＣＴＸから作成されたシングルセルトランスクリプトームデータの「ｔＳＮＥ」プロットである。左上の色調は、緑の「雲状のもの」がＣＴＸであり、ＣＴＸ－ｉＰＳＣは青であり、皮質分化プロトコルに供された後、そのトランスクリプトームがＣＴＸ自体に可能な限り近づいたときに分析されたＣＴＸ－ｉＰＳＣは赤であることを示す。それぞれの雲状のものは、１つの細胞を示す点からなる。グレー：発現なし、オレンジ：中程度の発現；赤：高発現。プロットは、ＣＴＸにおいて不活性の多能性遺伝子：ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＵＴＦ１、ＴＥＴ１、ＤＰＰ４、ＴＤＧＦ１、ＺＳＣＡＮ１０およびＧＡＬが、リプログラミングされた細胞では活性化されたことを示す。重要なことに、これらの遺伝子のうち、ＰＯＵ５Ｆ１のみが、リプログラミングの間に外因的に与えられた。反対に、ＣＴＸによって発現されるいくつかの神経系遺伝子は、多能性へのリプログラミング時に、ダウンレギュレートされる（ＮＯＧＧＩＮ、ＡＤＡＭ１２、ＯＣＩＡＤ２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＸ６）。最後に、ＧＬＩ３（および大きな程度にＰＡＸ６）が、多能性細胞の皮質分化時にアップレギュレートされる。
【0166】
人工多能性幹細胞の生殖系列分化およびその染色（図７および図９）
方法
１．ＣＴＸ－ｉＰＳＣまたはＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣを、必要に応じてヒトラミニン－５２１コーティング８ウェルチャンバースライドに播いた。その後、それらを、必要に応じて、適した分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５２３０）で５～７日間処理した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドにおいて固定し、免疫染色まで４℃で保存した。
２．ウェルを、以下のとおり免疫染色した：
１． １０％ ＮＧＳ／ＰＢＳ中において室温で３０分間インキュベーションすることによって正常ヤギ血清（ＮＧＳ）でブロッキングした。
２． ウェルを、必要に応じて希釈された（下記表を参照）０．１％ ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００／ＰＢＳ）中の一次抗体：マウス抗－ｘおよびウサギ抗－ｙとともに、室温で２～４時間または４℃で一晩インキュベーションした。
３． ウェルを、ＰＢＳで１０分間、３回洗浄するか、またはＰＢＳ中４℃で一晩維持した。
４． ウェルを、ＰＢＳ中の二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－４８８（１：３００希釈）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５６８（１：２０００希釈）とともに室温で２時間インキュベーションした。
５． ウェルを、室温のＰＢＳで３回洗浄した。
６． ウェルを、ＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈されたＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で、５分間染色した。
７． ウェルを、ＰＢＳで３回、５分間洗浄した。
８． ウェルを、スライドから取り除き、２滴のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを添加し、カバーガラスを上に置いた後、蛍光顕微鏡法によって調べた。
３．利用した抗体を下記表に示す。
方法
１．ＣＴＸ－ｉＰＳＣまたはＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣを、必要に応じてヒトラミニン－５２１コーティング８ウェルチャンバースライドに播いた。その後、それらを、必要に応じて、適した分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５２３０）で５～７日間処理した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドにおいて固定し、免疫染色まで４℃で保存した。
２．ウェルを、以下のとおり免疫染色した：
１． １０％ ＮＧＳ／ＰＢＳ中において室温で３０分間インキュベーションすることによって正常ヤギ血清（ＮＧＳ）でブロッキングした。
２． ウェルを、必要に応じて希釈された（下記表を参照）０．１％ ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００／ＰＢＳ）中の一次抗体：マウス抗－ｘおよびウサギ抗－ｙとともに、室温で２～４時間または４℃で一晩インキュベーションした。
３． ウェルを、ＰＢＳで１０分間、３回洗浄するか、またはＰＢＳ中４℃で一晩維持した。
４． ウェルを、ＰＢＳ中の二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－４８８（１：３００希釈）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５６８（１：２０００希釈）とともに室温で２時間インキュベーションした。
５． ウェルを、室温のＰＢＳで３回洗浄した。
６． ウェルを、ＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈されたＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で、５分間染色した。
７． ウェルを、ＰＢＳで３回、５分間洗浄した。
８． ウェルを、スライドから取り除き、２滴のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを添加し、カバーガラスを上に置いた後、蛍光顕微鏡法によって調べた。
３．利用した抗体を下記表に示す。
【0167】
【表2】
【0168】
結果：
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性のさらなる確認は、内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化の証拠によってもたらされ、３つの一次胚葉を特定するタンパク質マーカー（一般に、転写因子）の同時発現によって示された。図７のこれらのデータは、以前に示されたＲＴ－ｑＰＣＲデータを補足するものである。
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性のさらなる確認は、内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化の証拠によってもたらされ、３つの一次胚葉を特定するタンパク質マーカー（一般に、転写因子）の同時発現によって示された。図７のこれらのデータは、以前に示されたＲＴ－ｑＰＣＲデータを補足するものである。
【0169】
[実施例３]
胎児の線条体細胞のリプログラミング
別の条件付き不死化成体幹細胞タイプも、うまくリプログラミングされた。この株は、胎児の線条体細胞由来のＳＴＲ０Ｃ０５である。
胎児の線条体細胞のリプログラミング
別の条件付き不死化成体幹細胞タイプも、うまくリプログラミングされた。この株は、胎児の線条体細胞由来のＳＴＲ０Ｃ０５である。
【0170】
方法－ＳＴＲ０Ｃ０５細胞の多能性へのリプログラミング
１．Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍによって販売されているＮｅｏｎエレクトロポレーション機器を使用して、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞に特異的なトランスフェクション条件の最適な範囲を特定した。この細胞株に適したトランスフェクション条件を特定するために、機器の製造業者によって推奨されているとおり、電圧、パルス持続時間などのさまざまなパラメーターの範囲を使用して、ＧＦＰ発現プラスミドを細胞にトランスフェクションした場合に得られた緑色の生細胞の発生頻度を評価した。
２．その後、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞を、（１）で特定した条件を使用して、Ｅｐｉ５リプログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１５９６０；転写因子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子を発現するリプログラミングプラスミド、ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬおよびｐＣＥｍＰ５３ＤＤを含む）のプラスミドでエレクトロポレーションし、ヒトラミニン－５２１上に播いた。インキュベーター内で作動するＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ自動化位相差顕微鏡により、ウェルを毎日観察した。
３．１週間後、その細胞を再播種するか、同じウェルに残し、培地をｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号８５８５０）に変えた。
４．多能性表現型コロニーが生じるまで、ウェルをモニタリングした。
５．十分大きくなったら、個々のコロニーを、ピペットの先端でｈＬｎ－５２１でもコーティングされた２４ウェルプレートのウェルに取り、凍結または分析まで増殖させた。
６．以前の研究と同様に、ともに製造業者の説明書に従って、アルカリホスファターゼ染色をＳｔｅｍｇｅｎｔアルカリホスファターゼ染色キット（カタログ番号００－００５５）で実施し、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＴＲＡ－１－６０抗体（ＢＤカタログ番号５６０３８０）を加えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｓｔｅｍｆｌｏｗ抗体キット（カタログ番号５６０４７７）を用いて、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４などの多能性幹細胞マーカーに対するフローサイトメトリーを実施した。フローサイトメトリーサンプルをＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターにおいて分析した。
１．Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍによって販売されているＮｅｏｎエレクトロポレーション機器を使用して、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞に特異的なトランスフェクション条件の最適な範囲を特定した。この細胞株に適したトランスフェクション条件を特定するために、機器の製造業者によって推奨されているとおり、電圧、パルス持続時間などのさまざまなパラメーターの範囲を使用して、ＧＦＰ発現プラスミドを細胞にトランスフェクションした場合に得られた緑色の生細胞の発生頻度を評価した。
２．その後、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞を、（１）で特定した条件を使用して、Ｅｐｉ５リプログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１５９６０；転写因子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子を発現するリプログラミングプラスミド、ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬおよびｐＣＥｍＰ５３ＤＤを含む）のプラスミドでエレクトロポレーションし、ヒトラミニン－５２１上に播いた。インキュベーター内で作動するＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ自動化位相差顕微鏡により、ウェルを毎日観察した。
３．１週間後、その細胞を再播種するか、同じウェルに残し、培地をｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号８５８５０）に変えた。
４．多能性表現型コロニーが生じるまで、ウェルをモニタリングした。
５．十分大きくなったら、個々のコロニーを、ピペットの先端でｈＬｎ－５２１でもコーティングされた２４ウェルプレートのウェルに取り、凍結または分析まで増殖させた。
６．以前の研究と同様に、ともに製造業者の説明書に従って、アルカリホスファターゼ染色をＳｔｅｍｇｅｎｔアルカリホスファターゼ染色キット（カタログ番号００－００５５）で実施し、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＴＲＡ－１－６０抗体（ＢＤカタログ番号５６０３８０）を加えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｓｔｅｍｆｌｏｗ抗体キット（カタログ番号５６０４７７）を用いて、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４などの多能性幹細胞マーカーに対するフローサイトメトリーを実施した。フローサイトメトリーサンプルをＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターにおいて分析した。
【0171】
結果
その結果を図８に示す。
パネルＡは、リプログラミング因子によるトランスフェクションの２４日後のリプログラミングされたＳＴＲ０Ｃ０５細胞のコロニーを示す。
パネルＢは、リプログラミングの初期の段階のアルカリホスファターゼ（赤）染色されたＳＴＲ０Ｃ０５細胞を示し、いくつかの細胞が多能性マーカーアルカリホスファターゼを発現することを示す。
パネルＣは、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株を示す。
パネルＤは、ＡＰ陽性コロニーがさまざまなトランスフェクション条件に供されたウェルでさまざまな頻度で出現していることを示す：コロニーのないウェル１は、対照としてＧＦＰ非リプログラミングプラスミドでトランスフェクションし、リプログラミングされた細胞がなく、ウェル４および６は、生存細胞がほとんどない。
パネルＥは、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株がアルカリホスファターゼ陽性であることを示す。
パネルＦは、その株が、多能性マーカーＳＳＥＡ４も陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ１に関しては陰性であることを示す。
その結果を図８に示す。
パネルＡは、リプログラミング因子によるトランスフェクションの２４日後のリプログラミングされたＳＴＲ０Ｃ０５細胞のコロニーを示す。
パネルＢは、リプログラミングの初期の段階のアルカリホスファターゼ（赤）染色されたＳＴＲ０Ｃ０５細胞を示し、いくつかの細胞が多能性マーカーアルカリホスファターゼを発現することを示す。
パネルＣは、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株を示す。
パネルＤは、ＡＰ陽性コロニーがさまざまなトランスフェクション条件に供されたウェルでさまざまな頻度で出現していることを示す：コロニーのないウェル１は、対照としてＧＦＰ非リプログラミングプラスミドでトランスフェクションし、リプログラミングされた細胞がなく、ウェル４および６は、生存細胞がほとんどない。
パネルＥは、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株がアルカリホスファターゼ陽性であることを示す。
パネルＦは、その株が、多能性マーカーＳＳＥＡ４も陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ１に関しては陰性であることを示す。
【0172】
ＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣの多能性も上の実施例２に記載されている生殖系列分化方法を使用して確認し、その結果を図９に示す。内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化が実証されており、ＣＴＸに関する図７のとおり、３つの一次胚葉を特定するタンパク質マーカー（一般に、転写因子）の同時発現によって示される。
【0173】
[実施例４]
リプログラミングされたｉＰＳＣ由来の成体幹細胞は多能性である
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の成体幹細胞の多能性を確認した。予め本発明者らは、候補ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ（間葉系幹細胞）に関する、適切なマーカー発現およびプラスチックに付着する能力を示すフローサイトメトリーのプロフィール例を示した。この実験は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣがいくつかの異なる細胞タイプに分化する能力を確認する。
リプログラミングされたｉＰＳＣ由来の成体幹細胞は多能性である
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の成体幹細胞の多能性を確認した。予め本発明者らは、候補ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ（間葉系幹細胞）に関する、適切なマーカー発現およびプラスチックに付着する能力を示すフローサイトメトリーのプロフィール例を示した。この実験は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣがいくつかの異なる細胞タイプに分化する能力を確認する。
【0174】
方法－多能性を確認するためのＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣの分化
１．脂肪および骨細胞形成の評価のために、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣを、６ウェル組織培養処理プレートに播き、脂肪生成および骨形成を促進する市販の培地（脂肪生成：ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４１２、骨形成：ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４６５またはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＣＣＭＮ００７およびＣＣＭ００８）を用いて最大２８日間インキュベーションした後、固定および染色を行った。軟骨形成の評価のために、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣを、１５ｍｌチューブの底にある集塊としてペレット状にし、軟骨形成培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４５５）とともに培養し、続いて標準的な方法を使用してホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋および切片作製を行った。
２．アルシアンブルー染色（軟骨形成）：スライド上の切片に蒸留水で水分を与え、３％酢酸で３分間処理した後、３％酢酸中の１％アルシアンブルー、ｐＨ２．５で３０分間染色した。そのスライドを、その後、流水中で５分間洗浄し、蒸留水中ですすぎ、５％硫酸アルミニウム溶液中の０．１％ヌクレアファストレッドで５分間対比染色した後、画像化した。
３．オイルレッドＯ染色（脂肪生成）：６ウェルプレート中の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。それらを、６０％イソプロパノール／４０％水中の０．３％オイルレッドＯで１５分間染色し、再蒸留水で洗浄した後、画像化した。
４．アリザリンレッドＳ染色（骨形成）：６ウェルプレート中の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。それらを、室温において２％アリザリンレッドＳ溶液、ｐＨ４．２で１５分間染色し、水で洗浄し、画像化した。
１．脂肪および骨細胞形成の評価のために、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣを、６ウェル組織培養処理プレートに播き、脂肪生成および骨形成を促進する市販の培地（脂肪生成：ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４１２、骨形成：ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４６５またはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＣＣＭＮ００７およびＣＣＭ００８）を用いて最大２８日間インキュベーションした後、固定および染色を行った。軟骨形成の評価のために、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣを、１５ｍｌチューブの底にある集塊としてペレット状にし、軟骨形成培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４５５）とともに培養し、続いて標準的な方法を使用してホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋および切片作製を行った。
２．アルシアンブルー染色（軟骨形成）：スライド上の切片に蒸留水で水分を与え、３％酢酸で３分間処理した後、３％酢酸中の１％アルシアンブルー、ｐＨ２．５で３０分間染色した。そのスライドを、その後、流水中で５分間洗浄し、蒸留水中ですすぎ、５％硫酸アルミニウム溶液中の０．１％ヌクレアファストレッドで５分間対比染色した後、画像化した。
３．オイルレッドＯ染色（脂肪生成）：６ウェルプレート中の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。それらを、６０％イソプロパノール／４０％水中の０．３％オイルレッドＯで１５分間染色し、再蒸留水で洗浄した後、画像化した。
４．アリザリンレッドＳ染色（骨形成）：６ウェルプレート中の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。それらを、室温において２％アリザリンレッドＳ溶液、ｐＨ４．２で１５分間染色し、水で洗浄し、画像化した。
【0175】
結果
図１０は、ｉＰＳＣ由来のＭＳＣが、軟骨（シアログリカンのアルシアンブルー染色によって示される）、脂肪（オイルレッドＯによる細胞内脂質滴の染色によって示される）および骨（沈着したカルシウムのアリザリンレッド染色によって示される）へ分化する能力を示す。
図１０は、ｉＰＳＣ由来のＭＳＣが、軟骨（シアログリカンのアルシアンブルー染色によって示される）、脂肪（オイルレッドＯによる細胞内脂質滴の染色によって示される）および骨（沈着したカルシウムのアリザリンレッド染色によって示される）へ分化する能力を示す。
【0176】
その後、４－ＯＨＴの存在下または非存在下において高継代（２０継代）まで培養したＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣに関するフローサイトメトリープロフィールを得た。その結果を図１１に示す。この試験株は、先に作成したバイサルファイトによるデータで示したように、脱メチル化されたＣ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭプロモーターを有し、その結果、プロモーターがこれらの細胞において依然として活性であることを示唆する株である。興味深いことに、この株は、４－ＯＨＴが細胞周期を誘導しているとき、そのマーカープロフィールをよりよく維持するようであり、ＣＤ９０およびＣＤ１０５発現はより一定でより高く、陰性マーカーＣＤ１４、２０、３４および４５は、より厳重に「オフ」である。（この株は、常により低いＣＤ７３発現を示す、場合によっては抗体によるアーティファクト。）第２のパネルにおいて、４－ＯＨＴ処理細胞は、分化時に骨を形成するのにより有効であるようであり、４－ＯＨＴが媒介する細胞周期の強制が、その細胞周期からの離脱および能力の喪失を改善することを示唆する。
【0177】
[実施例５]
リプログラミングされたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのさらなる特徴付け
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ株を、４－ＯＨＴの非存在下または存在下で培養した。図１２および１３の２つの異なるＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ細胞培養物を用いた実験の結果は、４－ＯＨＴ／Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭの存在および活性により向上したより、一貫した長期にわたる増殖を示す。
リプログラミングされたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのさらなる特徴付け
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ株を、４－ＯＨＴの非存在下または存在下で培養した。図１２および１３の２つの異なるＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ細胞培養物を用いた実験の結果は、４－ＯＨＴ／Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲＴＡＭの存在および活性により向上したより、一貫した長期にわたる増殖を示す。
【0178】
この実施例は、条件付きで不死化されたｉＰＳＣ－ＡＳＣが、より確実により長く増殖させることができることを示す。
【0179】
【表3】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】