特表 2022-513368 遺伝子編集に基づく癌処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】遺伝子編集に基づく癌処置

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220131BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20220131BHJP

   A61K 31/713 20060101ALN20220131BHJP

   A61K 38/46 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12M1/00 A ZNA

C12N15/55

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

A61K48/00

C12N5/09

A61K31/713

A61K38/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2021546469

(86)(22)【出願日】2019-10-18

(85)【翻訳文提出日】2021-05-28

(86)【国際出願番号】 EP2019078408

(87)【国際公開番号】W WO2020079243

(87)【国際公開日】2020-04-23

(31)【優先権主張番号】18382746.8

(32)【優先日】2018-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521158990

【氏名又は名称】フンダシオン デル セクトール プブリコ エスタタル セントロ ナシオナル デ インベスティガシオネス オンコロギカス カルロス ３ （エフ．エス．ピー． シーエヌアイオー）

【氏名又は名称原語表記】ＦＵＮＤＡＣＩＯＮ ＤＥＬ ＳＥＣＴＯＲ ＰＵＢＬＩＣＯ ＥＳＴＡＴＡＬ ＣＥＮＴＲＯ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＯＮＣＯＬＯＧＩＣＡＳ ＣＡＲＬＯＳ ＩＩＩ （Ｆ．Ｓ．Ｐ． ＣＮＩＯ）

【住所又は居所原語表記】Ｃ／ Ｍｅｌｃｈｏｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ａｌｍａｇｒｏ， ３， ２８０２９ Ｍａｄｒｉｄ， Ｓｐａｉｎ

(71)【出願人】

【識別番号】521163765

【氏名又は名称】フンダシオン インスティテュート デ インベスティガシオン コントラ ラ レウセミア ホセプ カレラス

【氏名又は名称原語表記】ＦＵＮＤＡＣＩＯＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＯ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮ ＣＯＮＴＲＡ ＬＡ ＬＥＵＣＥＭＩＡ ＪＯＳＥＰ ＣＡＲＲＥＲＡＳ

【住所又は居所原語表記】Ｃａｌｌｅ Ｍｕｎｔａｎｅｒ ３８３， ３ｒ ２， ０８０２１ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ， Ｓｐａｉｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100133503

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 一哉

(72)【発明者】

【氏名】ロドリゲス ペラレス， サンドラ

(72)【発明者】

【氏名】トレス ルイス， ラウル

(72)【発明者】

【氏名】マルティネス－ラゲ， マルタ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029BB11

4B029CC01

4B029GA03

4B029GA08

4B029GB10

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084CA18

4C084DC01

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

(57)【要約】

本発明は、癌細胞を排除する方法であって、当該細胞が、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらすゲノム再編成を含み、当該方法は、（ａ）ゲノムを少なくとも２つの部位で切断することであって、当該切断が、当該癌細胞のゲノムの欠失、逆位、フレームシフト、修復を伴わない切断および／または挿入のいずれかをもたすこと、及び又は（ｂ）当該融合遺伝子もしくは癌誘導遺伝子の発現産物を少なくとも１つの部位で切断すること、を含む方法に関する。
【選択図】図１０Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌細胞を排除する方法であって、当該細胞が、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらすゲノム再編成を含み、
ａ．前記ゲノムを少なくとも２つの部位で切断することであって、前記切断が、前記癌細胞のゲノムの欠失、逆位、フレームシフト、修復を伴わない切断および／または挿入のいずれかをもたすこと、および／または
ｂ．前記融合遺伝子もしくは癌誘導遺伝子の発現産物を少なくとも１つの部位で切断すること、を含む方法。

【請求項2】

前記癌細胞が、非癌細胞に存在しない前記再編成された遺伝子の発現をもたらす、好ましくは非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現をもたらすゲノム再編成を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ゲノムを切断することが、欠失、逆位、フレームシフト、修復を伴わない前記切断またはそれらの任意の組み合わせをもたらす、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記方法が、２つの部位で、または３つの部位で、または４つの部位でゲノムを切断することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ゲノム再編成が、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＤＮＡＪＢ１－ＰＲＫＡＣＡ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＰＡＸ３－ＦＯＸＯ１及びＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１から選択される融合遺伝子の発現をもたらし、好ましくは融合遺伝子ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１またはＢＣＲ－ＡＢＬの発現をもたらす、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記癌細胞がゲノム増幅を含み、前記方法が、少なくとも２つの部位、または少なくとも１０の部位、または少なくとも１００の部位で前記ゲノムを切断することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ゲノム増幅が染色体または染色体外である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記切断がコード領域または調節領域以外のゲノム領域にあり、好ましくは前記切断がイントロン領域にあり、より好ましくは前記切断が前記スプライス部位以外のゲノム増幅のイントロン領域にある、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ゲノム増幅が、ＭＹＣＮ、ＭＹＣ、ＦＯＸＯ１、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ２、ＣＣＮＤ１、ＭＤＭ２、ＲＡＢ２５、ＭＤＭ４、ＫＲＡＳ、ＡＵＲＫＡ、ＴＥＲＴおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの遺伝子を含み、好ましくは遺伝子ＭＹＣＮまたはＭＹＣを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記切断部位の少なくとも２つがイントロンにある、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記切断が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されるエンドヌクレアーゼによって行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記切断が、Ｃａｓタンパク質、好ましくはＣａｓ９またはＣａｓ１３、より好ましくはＣａｓ９によって行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）がゲノムの切断を標的化するために使用され、好ましくは少なくとも２つのｇＲＮＡがゲノムの切断を標的化するために使用される、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記エンドヌクレアーゼの標的が、癌細胞に存在し、非癌細胞には存在しない融合遺伝子のイントロンにあり、前記標的が患者特異的ではない、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

キットオブパーツであって、好ましくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される少なくとも２つのエンドヌクレアーゼを備え、前記エンドヌクレアーゼが少なくとも２つの部位で前記ゲノムを特異的に切断し、前記切断が、欠失、フレームシフトおよび／またはゲノムへの挿入、好ましくは欠失および／またはフレームシフトのいずれかをもたらす、キットオブパーツ。

【請求項16】

キットオブパーツであって、好ましくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されるエンドヌクレアーゼを含むキットオブパーツであって、前記エンドヌクレアーゼがコード領域または調節領域以外のゲノム領域、好ましくはゲノム増幅のイントロン領域でゲノムを特異的に切断し、より好ましくは前記切断がスプライス部位以外のイントロン領域にある、キットオブパーツ。

【請求項17】

キットオブパーツであって、
ａ．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタンパク質、より好ましくはＣａｓ９またはＣａｓ１３、最も好ましくはＣａｓ９と、
ｂ．癌誘導遺伝子の過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅をもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成における標的化ドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらす再編成のいずれかをもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成における標的化ドメインを有する少なくとも２つのｇＲＮＡと、を備える、キットオブパーツ。

【請求項18】

請求項１５～１７に記載のキットオブパーツであって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼと、
ｂ．配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号４および配列番号５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１２８もしくは配列番号１２９および配列番号１３０もしくは配列番号１３１のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３２もしくは配列番号１３３および配列番号１３４もしくは配列番号１３５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３６もしくは配列番号１３７および配列番号１３８もしくは配列番号１３９のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１４０もしくは配列番号１４１および配列番号１４２もしくは配列番号１４３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対と、を備えるキットオブパーツ。

【請求項19】

請求項１７に記載のキットオブパーツであって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼと、
ｂ．配列番号１４８もしくは配列番号１４９、またはその両方のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡと、を備える、キットオブパーツ。

【請求項20】

請求項１７に記載のキットオブパーツであって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼと、
ｂ．配列番号１５２もしくは配列番号１５３、またはその両方のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡと、を備える、キットオブパーツ。

【請求項21】

請求項１７に記載のキットオブパーツであって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ；および
ｂ．配列番号１５２、または配列番号１５４、または配列番号１５５、または配列番号１５６、または配列番号１５７、または配列番号１５８、または配列番号１５９、または配列番号１６０、または配列番号１６１、または配列番号１６２、または配列番号１６３、または配列番号１６４、または配列番号１６５を有する少なくとも１つのｇＲＮＡと、を備える、キットオブパーツ。

【請求項22】

核酸であって、
ａ ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタンパク質、より好ましくはＣａｓ９またはＣａｓ１３、さらにより好ましくはＣａｓ９；
ｂ．融合遺伝子の発現産物中に標的化ドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成における標的化ドメインを有する少なくとも一対のｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む、核酸。

【請求項23】

前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、癌細胞に存在し、非癌細胞には存在しないゲノム増幅において、好ましくは前記ゲノム増幅の遺伝子間領域またはイントロン領域において、より好ましくはスプライス部位以外の癌遺伝子のイントロン領域に標的化ドメインを有する、請求項１に記載の核酸。

【請求項24】

核酸であって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ、ならびに
ｂ．配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号４および配列番号５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１２８もしくは配列番号１２９および配列番号１３０もしくは配列番号１３１のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３２もしくは配列番号１３３および配列番号１３４もしくは配列番号１３５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３６もしくは配列番号１３７および配列番号１３８もしくは配列番号１３９のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１４０もしくは配列番号１４１および配列番号１４２もしくは配列番号１４３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対、に対するコード化配列を含む、核酸。

【請求項25】

核酸であって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ、および
ｂ．配列番号１４８もしくは配列番号１４９、またはその両方のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む、核酸。

【請求項26】

核酸であって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ、および
ｂ．配列番号１５２もしくは配列番号１５３、またはその両方のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む、核酸。

【請求項27】

核酸であって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ、および
ｂ．配列番号１５２、または配列番号１５４、または配列番号１５５、または配列番号１５６、または配列番号１５７、または配列番号１５８、または配列番号１５９、または配列番号１６０、または配列番号１６１、または配列番号１６２、または配列番号１６３、または配列番号１６４、または配列番号１６５を有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む、核酸。

【請求項28】

癌の処置のための、好ましくは線維層板型肝細胞癌、非小細胞肺癌、肺胞横紋筋肉腫、神経膠芽腫、結腸直腸癌、急性リンパ性白血病、ユーイング肉腫、膀胱癌、神経芽腫、髄芽腫、乳癌、胃癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、網膜芽細胞腫、精巣胚細胞腫瘍または副腎皮質癌の処置のための、請求項１～１５の方法、請求項１６～２１のキットオブパーツまたは請求項２２～２７の核酸の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医学の分野に属し、癌細胞が選択的に排除される遺伝子編集に基づく癌処置に関する。

【背景技術】

【0002】

特異的な再発性染色体再編成は、癌の非常に一般的で周知の特徴である。染色体異常、特に転座、欠失および逆位によって影響を受ける遺伝子は、２つのカテゴリー、すなわち新たな染色体状況の結果として強制発現を受ける癌原遺伝子、またはブレークポイントが関与する２本の染色体上の影響を受けた遺伝子のイントロン内にある融合遺伝子に分類される。後者は、染色体転座のより一般的な結果であり、２つの異なる遺伝子のコード配列の融合の結果として新たなキメラ遺伝子の作成をもたらす^１。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術の導入は、遺伝子融合の状況を劇的に変化させて、融合を同定するための根本的に新たな手段を提供した。ＮＧＳを使用して、多数（９，０００を超える）の遺伝子融合が現在同定されている^２。これまでに、３００を超える様々な遺伝子を含む３５０を超える再発性融合遺伝子が同定されている^１０。発癌性融合遺伝子の産物は多様であるが、それらは主に転写因子およびチロシンキナーゼ（ＴＫ）の２つの群に分類することができる。

【0003】

融合遺伝子は、腫瘍形成において重要な機能を有し、標的遺伝子に対して複数の効果を有することが多いため、非常に強力な癌突然変異であり、単一の「突然変異」では、それらは発現を劇的に変化させ、調節ドメインを除去し、オリゴマー化を強制し、タンパク質の細胞内位置を変化させるか、または新規結合ドメインに結合することができる。これは、いくつかの新生物が特定の融合遺伝子の存在に従って分類または管理されるという事実に臨床的に反映される^３。融合遺伝子は腫瘍特異的であり、したがって治療の重要な標的であり、レチノイン酸受容体－αのＰＭＬ－ＲＡＲα融合を有する前骨髄球性白血病はレチノイン酸で処置され^４、慢性骨髄性白血病のＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子は、イオン性標的薬グリベック（ＳＴＩ－５７１）の標的である^５。

【0004】

遺伝子融合が発癌の開始において重要で初期段階を表すという強力な証拠がある。第１に、それらは通常、特定の腫瘍表現型と密接に相関している^６～１０。第２に、処置の成功は、疾患関連キメラの減少または根絶に対応することが示されている^{１１～１４}。そして最後に、インビトロでの融合転写物のサイレンシングは、腫瘍形成能の逆転、増殖および／または分化の減少をもたらす^{１５、１６}。
腫瘍特異的治療標的としての遺伝子融合産物

【0005】

キメラＲＮＡおよびタンパク質産物は染色体再編成（転座、欠失または反転）を有する細胞でのみ生じることから、遺伝子融合は腫瘍特異的分子を産生する。これらの特有の分子は、潜在的な腫瘍特異的治療標的である。治療標的としての遺伝子融合産物の１つの重要な問題は、それらの細胞内位置である。治療分子の細胞内送達は困難であるが、それらの腫瘍特異性は、新たな標的療法を開発するための重要な動機となる因子である。ＤＮＡからｍＲＮＡおよびタンパク質への遺伝情報の流れは、治療試薬が介在し得るいくつかの点を有する。遺伝子融合を標的とするためのいくつかのアプローチが開発されており、その中には以下のものが含まれる。
１．－標的化タンパク質：小分子、イントラボディおよびアプタマー。

【0006】

２．－標的化ｍＲＮＡ：アンチセンス、リボザイムおよびＲＮＡｉ。

【0007】

３．－標的化ＤＮＡ：ゲノム編集：直接遺伝子編集を可能にする任意の所望の位置でゲノムに標的化切断を生成することができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して、ヒト癌を処置するための遺伝子型特異的アプローチを提供する融合遺伝子を作製する染色体ＤＮＡブレークポイントを標的化することができる^１７。Ｃａｓ９は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によって特定の２０ｂｐのＤＮＡ配列を標的とすることができるＤＮＡエンドヌクレアーゼである^{１８、１９}。Ｌｕｏのグループ^２０は、Ｃａｓ９ニッカーゼ媒介ゲノム編集を使用することにより、前立腺癌および肝細胞癌にそれぞれ見られる融合遺伝子ＴＭＥＭ－ＣＣＤＣ６７およびＭＡＮ２Ａ１－ＦＥＲの患者特異的染色体ブレークポイントにＨＳＶ１－ｔｋを挿入することができた。ＨＳＶ１－ｔｋの誘導後にこれらの染色体ブレークポイントを有する腫瘍をガンシクロビルで処置すると、細胞培養で細胞死がもたらされ、ヒト前立腺および肝臓癌を異種移植したマウスでは腫瘍サイズおよび死亡率が減少した。遺伝子型特異的ではあるが、この治療アプローチは、今日では低効率（０．１～１０％）に関連するノックイン戦略に依拠している。一方、このアプローチは、各特定の患者の処置のための新たな標的化ツール（ｓｇＲＮＡおよびドナーテンプレート）の設計および開発と共に、おそらくより転座に関与するイントロンの配列決定研究が必要になる、患者特異的なブレークポイント配列の以前の知識に依存する。このアプローチはまた、ＴＫランダムインテグレーションに関連する野生型細胞死事象に関連し得る。

【0008】

正常細胞に存在しない癌融合遺伝子を標的とするが、より効率的で患者特有の戦略を使用を使用しないという同じ方向で作業して、本発明者らは、融合癌遺伝子を含む大きなゲノム領域の標的化された欠失に基づいて、根本的に単純で、多用途で、非常に効率的で、臨床的に関連する遺伝子編集アプローチを開発し、それらの対応する野生型対立遺伝子のエクソン領域を変化させずに残した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチは、正常な対応物を残しつつ、再発性融合遺伝子を有する癌細胞を選択的に破壊するための効率的な（３０～８０％）ノックアウト戦略に基づく。

【0009】

国際公開第２０１６０９４８８８号明細書は、ＣＲＩＳＰＲおよびガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む組成物の使用に関し、具体的には、融合遺伝子である癌特異的標的配列のブレークポイント遺伝子座に自殺遺伝子を導入するための使用に関する。

【0010】

遺伝子増幅は、癌、特に固形腫瘍で頻繁に観察され、腫瘍の進展に寄与すると考えられている。遺伝子増幅とは、ゲノムの制限された領域のコピー数の体細胞的に獲得された増加を指す。増幅は、優勢に作用する癌遺伝子の過剰発現をもたらすゲノム機構である^３１。アンプリコンとして知られるこれらの増幅領域は、キロベース～数十メガベースに及ぶ場合があり、増幅領域に複数の発癌遺伝子ならびにパッセンジャー遺伝子を含むことができる^３２。増幅事象は、古典的には、二重微小の細胞遺伝学的特徴、自己複製染色体外要素、またはゲノム領域の複数のコピーが染色体に統合される均一に染色する領域に関連付けられている^３３。ゲノム増幅を構成するＤＮＡ配列のコピー数は様々に記載されているが、一般に、同じ染色体上の隣接する非増幅マーカーと比較して４倍または５倍を超えると見なされる。二倍体ゲノムでは、これは８コピー超に相当する。ＴＣＧＡ分析により、１４種の癌タイプにおいて統計的に増幅された４６１個の遺伝子が同定された^３４。しかしながら、癌増幅遺伝子として同定された遺伝子の一部は、アンプリコン中のパッセンジャー遺伝子であり得る。コピー数対発現分析により、７３個の潜在的なドライバー遺伝子が明らかになった^３１。増幅された癌遺伝子の機能を阻害するために、いくつかの標的療法が開発されている。これらの治療法には、ＥＧＦＲに対するゲフィチニブおよびエルロチニブを含むチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、またはモノクローナル抗体、例えば、ＥＲＢＢ２の場合はトラスツズマブ、ＥＧＦＲの場合はセツキシマブなどの分子標的療法が含まれる^３５。

【0011】

しかしながら、融合タンパク質関連癌および増幅関連癌の両方に対して、より堅固で特異的な治療法が必要とされている。普遍的であり、患者特異的ではなく、より効率的であり、癌細胞にのみ作用し、処置の副作用を最小限に抑える、癌に対する治療ツールが依然として必要とされている。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ａ．１型（ＦＬＩ１エクソン６に融合したＥＷＳＲ１エクソン７）および２型（ＦＬＩ１エクソン５に融合したＥＷＳＲ１エクソン７）ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子座の概略図。融合遺伝子を編集するために使用されるＥＷＳＲ１遺伝子のイントロン３およびＦＬＩ１遺伝子のイントロン８を標的とするｓｇＲＮＡが示される。ｂ．Ｃａｓ９編集（ｅｄｉｔｉｏｎ）によって生成された切断型ＤＮＡの概略図。ｃ．ＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１ ＷＴイントロンの標的部位に対する遺伝子編集効果。ａ．ＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１ ＷＴ遺伝子の概略図。両方の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを示す。ｄ．スプライシング機構によるインデル除去の概略図。ｐＬＶＸ－Ｕ６Ｅ３．２－Ｈ１Ｆ８．２－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰベクターの概略図。

【図2】ａ．ゲノム編集によって生成されたＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１キメラタンパク質および切断型タンパク質。ｂ ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１タンパク質（１型）のアミノ酸配列。ＥＷＳＲ１またはＦＬＩ１に対応する残基をそれぞれ黒色または灰色で示す。ｃ．編集されたＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１切断型タンパク質のアミノ酸配列。欠失された残基は、取り消し線で示され、突然変異後のリーディングフレームの変化によって生成された新たな残基は、二重下線で示されている。未成熟停止コドンはアスタリスクで示されている。

【図3】ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１ ＤＮＡの分析。ａ．ｓｇＥ３．２およびｓｇＦ８．２によって標的化されたＤＮＡ遺伝子座に隣接するオリゴを使用した編集および対照Ａ６７３ ＥＳ細胞株のゲノムＰＣＲ分析の結果を示すアガロースゲル電気泳動。３００ｂｐのＰＣＲフラグメントは、ｓｇＥＷ３．２によって標的化される遺伝子座とｓｇＦＬＩ８との間のＤＮＡフラグメントの欠失を示す。ＰＣＲ分析を、形質導入後（ｐｔ）２日目、４日目および６日目に細胞培養物からのＤＮＡを使用して行った。アルブミンをＰＣＲ反応の内部対照として使用する。ｂ．ＰＣＲバンドのサンガーシーケンシング分析。代表的な欠失配列およびクロマトグラムを示す。

【図4】ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１ ＲＮＡの分析。ａ．編集および対照Ａ６７３ ＥＳ細胞から得たＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１ ＲＴ－ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、ｐｔの２日目、４日目および６日目に細胞培養物からのＲＮＡを使用して行った。矢印は、野生型（９６１ｂｐ）および欠失（１５０ｂｐ）ＲＴ－ＰＣＲ産物のサイズを示す。ＲＴ－ＰＣＲ反応の内部対照としてＧＡＰＤＨを使用する。ｂ．Ｓａｎｇｅｒおよびクロマトグラムによって得られた代表的な欠失ｃＤＮＡ配列。

【図5】ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１タンパク質の分析。ウエスタンブロット分析によるＡ６７３ ＥＳ細胞におけるＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１タンパク質発現。ウエスタンブロット分析を、細胞培養物由来のタンパク質を使用してｐｔの３日目、６日目および１０日目に行った。ＧＡＰＤＨをアッセイの内部対照として使用する。

【図6】増殖および腫瘍形成能のインビトロアッセイ。ａ．Ａ６７３およびＲＤ－ＥＳ ＥＳおよびＵ２ＯＳ骨肉腫（ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ^－）実験細胞および対照細胞の増殖速度アッセイ曲線。ｂ．コロニー形成アッセイ。２％クリスタルバイオレット染色後のウェルの代表的な画像を、Ａ６７３、ＲＤ－ＥＳおよびＵ２ＯＳ実験細胞および対照細胞について示す。Ａ６７３、ＲＤ－ＥＳおよびＵ２ＯＳコロニー形成アッセイで形成されたコロニーの数のグラフ表示。ｐ値を表す（＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。

【図7】インビトロアッセイにおけるアポトーシス。ａ．ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーを用いてＤＮＡプロファイルを分析した。細胞アポトーシスのパーセンテージは、Ｓｕｂ－Ｇ１ピークのパーセンテージを用いて計算される。黒色のプロットはＡ６７３対照細胞を表し、灰色のプロットは実験的ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１欠失Ａ６７３細胞を表す。ｂ．カスパーゼ３免疫染色を使用して、アポトーシス細胞の数を分析した。細胞アポトーシスのパーセンテージは、分析された視野当たりのカスパーゼ３陽性細胞のパーセンテージを使用して計算される。黒色の点はＡ６７３対照細胞を表し、灰色の点は実験的ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１欠失Ａ６７３細胞を表す。

【図8】ゲノム編集特異性分析。ａ．ｓｇＥ３．２およびｓｇＦ８．２を形質導入されたＷＴヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の正常な核型を有する代表的なＧバンド化中期（ｍｅｔｈａｐｈａｓｅ）。ｂ．ＥＷＳＲ１遺伝子状態のＦＩＳＨ分析。概略図は、ＥＷＳＲ１ブレークアパート蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ ＫＢＩ－１０７５０）の構造および原理を示す。融合シグナルが別々のシグナルに分割される場合、ブレークが定義される。共局在化融合シグナルは、正常染色体（複数の場合がある）を同定する２２。対照および実験ｈＭＳＣの代表的なＦＩＳＨ画像。ｃ．ｓｇＥ３．２およびｓｇＦ８．２を形質導入されたｈＭＳＣにおいてコピー数多型（ＣＮＶ）を示さない全ゲノムを網羅する高密度アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析のプロファイルプロットの結果。

【図9】エクスビボレンチウイルスＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１遺伝子編集。ａ．レンチウイルスベクターおよびエクスビボ処置のためのアプローチを示す図である。Ａ６７３ ＥＳ細胞にｐＬＶＸ－Ｕ６Ｅ３．２－Ｈ１Ｆ８．２－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰまたは対照ベクターを形質導入し、免疫抑制マウスに移植する。次いで、異種移植マウスを観察し、測定し、細胞注入の３０日後に屠殺する。ｂ．皮下細胞注入後２８日間にわたる腫瘍成長（ｍｍ３）。プロットは中央値および範囲を示す。ｐ値を表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５）。ｃ．マウスを３０日後に屠殺し、その腫瘍を収集した。写真は、対照マウスおよび実験マウスの代表的な腫瘍を示す。Ｄ．Ａ６７３ ＥＳ実験細胞および対照細胞に対するＫｉ－６７増殖マーカーおよびカスパーゼ３アポトーシスマーカー免疫染色アッセイの代表的な画像。ｅ．実験または対照Ａ６７３細胞を注入したマウスを比較する生存曲線。

【図10】インビボアデノウイルスＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１遺伝子編集。ａ．対照Ｃａｓ９およびｓｇＥ３．２、ｓｇＦ８．２およびＣａｓ９アデノウイルスベクター、ならびにインビボ遺伝子編集アッセイに使用されるスケジュールを示す図である。Ａ６７３ ＥＳ細胞を免疫不全マウスの側腹部に注射し、規定のサイズに達したとき、アデノウイルス、対照ベクターおよびＰＢＳを異種移植腫瘍に４回（３日ごとに）注入する。次いで、異種移植マウスを観察し、測定し、細胞注入の３０日後に屠殺する。ｂ．２３日間にわたる腫瘍成長（ｍｍ３）。プロットは中央値および範囲を示す。ｐ値を表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５）。マウスを２５日後に屠殺し、その腫瘍を収集した。写真は、対照マウスおよび実験マウスの代表的な腫瘍を示す。ｃ．Ａ６７３ユーイング肉腫実験細胞および対照細胞に対するＣａｓ９免疫染色アッセイの代表的な画像。ｄ．Ａ６７３ユーイング肉腫実験細胞および対照細胞に対するＫｉ－６７増殖およびカスパーゼ３アポトーシスマーカー免疫染色アッセイの代表的な画像。ｓｇＲＮＡｓ－Ｃａｓ９実験アデノウイルスベクター、Ｃａｓ９対照アデノウイルスベクターまたはＰＢＳで処置したマウスを比較する生存曲線。

【図11】ａ．ＢＣＲ－ＡＢＬ１融合遺伝子の概略図。融合遺伝子を編集するために使用されるＢＣＲのイントロン８およびＡＢＬ１遺伝子の１つを標的とするｓｇＲＮＡが示される。ｂ．Ｃａｓ９編集（ｅｄｉｔｉｏｎ）によって生成されたＢＣＲ－ＡＢＬ１キメラおよび切断型タンパク質の概略図。ｂ．ＢＣＲ－ＡＢＬタンパク質のアミノ酸配列（ｐ２１０）。ＢＣＲまたはＡＢＬに対応する残基は、それぞれ黒色または灰色で示されている。ＡＢＬ ＤＮＡ結合ドメインには下線が引かれている。編集されたＢＣＲ－ＡＢＬ切断型タンパク質のアミノ酸配列。欠失された残基は、取り消し線で示され、突然変異後のリーディングフレームの変化によって生成された新たな残基は、斜体で示されている。未成熟停止コドンはアスタリスクで示されている。ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ＲＮＡの分析およびインビトロ生存率。ＢＣＲイントロンとＡＢＬ１イントロンの両方を標的とする４対（ＢＡ１、ＢＡ２、ＢＡ３およびＢＡ４）のｓｇＲＮＡを試験した。ｂ．実験および対照のＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞株から得られたＢＣＲ－ＡＢＬ１ ＲＴ－ＰＣＲ産物を示すアガロースゲル電気泳動。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、ヌクレオフェクション後２日目に細胞培養物からのＲＮＡを使用して行った。矢印は、野生型（１１２５ｂｐ）および欠失（４５８ｂｐ）ＲＴ－ＰＣＲ産物のサイズを示す。ＧＡＰＤＨをＲＴ－ＰＣＲ反応の内部対照として使用する。Ｓａｎｇｅｒおよびクロマトグラムによって得られた代表的な欠失ｃＤＮＡ配列を下部に示す。ｃ．コロニー形成アッセイ。Ｋ５６２実験細胞および対照細胞の２％クリスタルバイオレット染色後のウェルの代表的な画像を示す。Ｋ５６２コロニー形成アッセイで形成されたコロニーの数のグラフ表示。ｐ値を表す（＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。ｄ．インビトロアッセイにおけるアポトーシス。ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーを用いてＤＮＡプロファイルを分析した。細胞アポトーシスのパーセンテージは、Ｓｕｂ－Ｇ１ピークのパーセンテージを用いて計算される。黒色のプロットはＫ５６３対照細胞を表し、灰色のプロットは実験ＢＡ１、ＢＡ２、ＢＡ３およびＢＡ４編集Ｋ５６２細胞を表す。

【図12】インビボアデノウイルスＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子編集。ａ．皮下細胞注射および４回のインビボアデノウイルス処置（３日ごと）後の３０日間にわたる腫瘍成長（ｍｍ３）。プロットは中央値および範囲を示す。ｐ値表す（＊＊Ｐ＜０．０５）。ｂ．マウスを３０日後に屠殺し、その腫瘍を回収した。写真は、対照および実験マウスの代表的な腫瘍を示す。ｃ．ｓｇＲＮＡｓ－Ｃａｓ９実験および対照アデノウイルスベクターで処置したマウスを比較する生存曲線。

【図13】増幅された遺伝子のイントロンＣＲＩＳＰＲ媒介標的化を表す戦略であり、正常細胞および増幅を伴う細胞におけるゲノム構造を例示する。

【図14】代表的なＦＩＳＨ画像を示す図である。プローブとしてＭＹＣＮを用いた。ＳＫＮＡＳはＭＹＣＮの２つのコピーを提示する。ＩＭＲ３２はＨＳＲ増幅を示す。ＬＡＮ５は、二重微小増幅を示す。

【図15】ＭＹＣＮイントロンのＣＲＩＳＰＲ媒介性標的化はインビトロ細胞増殖を阻害する。非標的化ｓｇＲＮＡ（ｓｇＮＴ）または野生型（ＷＴ）細胞でトランスフェクトした、編集されたＩＭＲ３２、ＬＡＮ５およびＳＫＮＡＳ（ｓｇＭＹＣＮ）の増殖速度アッセイ曲線。（ｎ＝３）。編集されたおよび対照ＩＭＲ３２細胞からのＲＴ－ＰＣＲ産物。分析は、ｐｔの３日目に細胞の抽出されたＲＮＡを使用して行った。ＲＴ－ＰＣＲ反応の内部対照としてＧＡＰＤＨを用いた。

【図16】ＳＫＮＡＳ対照細胞株（ａ）、ＩＭＲ３２（ｂ）およびＬＡＮ５（Ｃ）のコロニー数の統計分析（ｎ＝３）。

【図17】Ａ．処置したＳＫＮＡＳ、ＩＭＲ３２およびＬＡＮ５細胞株（ｓｇＭＹＣＮ）または対照（ＷＴおよびｓｇＮＴ）におけるヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによるＤＮＡプロファイル分析。Ｂ．Ｇ２分析のグラフ表示。（ｎ＝３）。

【図18】抗Ｈ２ＡＸ抗体で染色されたｓｇＭＹＣＮをコードする構築物でトランスフェクトしたＳＫＮＡＳ、ＩＭＲ３２およびＬＡＮ５の代表的な免疫蛍光画像であり、ＤＮＡ損傷フォーカスを可視化する。ＤＮＡをＤＡＰＩで対比染色した。

【図19】ＭＹＣ遺伝子を標的化する２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＭＹＣ－１およびｓｇＭＹＣ－２）、非標的化ｓｇＲＮＡ（ｓｇＮＴ）または野生型（対照）細胞をトランスフェクトしたＭＤＢ－ＨＴＢ－１８５髄芽腫細胞株の増殖速度アッセイ曲線。（ｎ＝３）。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、特定の部位でゲノムを切断するエンドヌクレアーゼ（複数の場合がある）を特異的に使用して癌細胞を排除する方法を提供し、その結果、癌誘導遺伝子が選択的に排除され、それによって癌細胞が排除される。

【0014】

切断は、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらすゲノム再編成を対象とする。本発明者らは、ゲノム再編成が生じている特定の配列（ブレークポイント）に依存しないため、普遍的な（患者特異的ではない）処置を設計するための単純で直接的な方法を見出した。融合遺伝子および融合タンパク質が存在する癌の場合、本発明は、融合タンパク質の短縮または排除を可能にし、それは次に癌細胞の死をもたらす。しかしながら、より重要なことに、本発明は、ゲノムのコード領域の改変がゲノム再編成を有する細胞、すなわち癌細胞においてのみ起こるため、副作用が最小限の治療法を提供する。癌細胞が１つ以上の癌遺伝子を含む増幅領域を含む癌の場合、本発明の方法は、癌細胞ゲノムが不可逆的な方法で損傷を受け、癌細胞は細胞死を運命づけられているが、正常細胞は影響を受けないままであるため、極めて堅固である。

【0015】

したがって、第１の態様は、癌細胞を排除する方法であって、当該細胞が、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらすゲノム再編成を含み、当該方法は、（ａ）ゲノムを少なくとも２つの部位で切断することであって、当該切断が、当該癌細胞のゲノムの欠失、逆位、フレームシフト、修復を伴わない切断および／または挿入のいずれかをもたすこと、または（ｂ）当該融合遺伝子もしくは癌誘導遺伝子の発現産物を少なくとも１つの部位で切断すること、を含む方法に関する。

【0016】

本明細書で使用される場合、「切断すること」、「切断する」または「切断」という用語は、二本鎖ＤＮＡであるゲノムを指す場合、両方のＤＮＡのチェーンまたは鎖が切断されることを意味する。当該用語が二本鎖であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す場合、両方のチェーンまたは鎖が切断されることを意味する。当該用語が一本鎖であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す場合、それは１本のチェーンまたは鎖のみが切断されていることを意味する。ゲノム切断時に、二本鎖分子が切断されると、切断の結果として粘着性末端および平滑末端の両方が生成され得る。

【0017】

ゲノム再編成がゲノム増幅をもたらす癌細胞を排除するために本発明の方法が使用される場合、切断は、切断されたＤＮＡが切断部位で修復され得ないゲノム損傷をもたらす。したがって、修復を伴わない切断は、ゲノム増幅の断片化をもたらし、最終的には癌細胞の死をもたらす。

【0018】

本明細書で使用される「融合遺伝子」という用語は、遺伝子のコード化領域、ならびに調節領域およびプロモーターなどの他の非コード化配列を意味する。第１の態様の好ましい実施形態では、ゲノム再編成は、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＤＮＡＪＢ１－ＰＲＫＡＣＡ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＰＡＸ３－ＦＯＸＯ１およびＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１から選択される融合遺伝子の発現をもたらし、好ましくは融合遺伝子ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１またはＢＣＲ－ＡＢＬの発現をもたらす。好ましい実施形態では、癌細胞は、ユーイング肉腫細胞、好ましくは融合遺伝子ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１の発現をもたらすゲノム再編成を含むユーイング肉腫細胞である。好ましい実施形態では、癌細胞は骨髄性白血病細胞、好ましくは融合遺伝子ＢＣＲ－ＡＢＬの発現をもたらすゲノム再編成を含む骨髄性白血病細胞である。

【0019】

本明細書で使用される場合、「癌誘導遺伝子」という用語は、癌を引き起こす可能性がある癌遺伝子または癌原遺伝子を指す。

【0020】

好ましい実施形態では、癌誘導遺伝子の発現の誘導または過剰発現をもたらす当該ゲノム増幅または再編成は、非癌細胞には存在しない。

【0021】

好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも２つ、３つ、４つもしくは５つの部位またはさらなる切断部位で切断することを含み、例えば、遺伝子増幅の場合、切断部位は、増幅された遺伝子の反復が存在するのと同じ数の部位で生じ得る。したがって、本方法は、ゲノム再編成が癌誘導遺伝子の数百回の反復を含む場合、少なくとも２つの部位から数百の部位で切断することを含み得る。好ましい実施形態において、本方法は、同じまたは異なる切断部位を標的とする切断の連続的な反復を含む。好ましい実施形態では、本方法は、２つの部位で切断し、続いて、同じであっても異なっていてもよい２つの部位で切断することを含む。この連続的な切断のために、ネステッドｇＲＮＡが使用され得る。

【0022】

好ましい実施形態では、切断は、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼによって行われる。当該エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質またはその機能的等価物であってもよく、その標的部位はガイドＲＮＡの配列によって駆動される。また、切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのエンドヌクレアーゼによって行われてもよい。これらの場合、標的部位はヌクレアーゼに固有のものであり、したがって、ゲノムを少なくとも２つの部位で切断するためには少なくとも２つのヌクレアーゼが必要であろう。これらのアプローチはいずれも、これらのドメインのタンパク質－ＤＮＡ相互作用の原理を適用して、固有のＤＮＡ結合特異性を有する新たなタンパク質を操作することを含む。これらの方法は、多くの用途で広く成功している。

【0023】

第１の態様の方法の好ましい実施形態では、癌細胞は、非癌細胞に存在しない再編成された遺伝子の発現をもたらすゲノム再編成を含む。好ましくは、癌細胞は、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現をもたらす。

【0024】

第１の態様の方法の好ましい実施形態では、当該方法は、２つの部位、または３つの部位、または４つの部位でゲノムを切断することを含む。好ましくは、当該方法は、ゲノムを２つの部位で切断することにある。好ましくは、当該方法は、ゲノムを３つの部位で切断することにある。好ましくは、当該方法は、ゲノムを４つの部位で切断することにある。

【0025】

第１の態様の方法の好ましい実施形態では、癌細胞はゲノム増幅を含み、当該方法は、少なくとも２つの部位、または少なくとも１０の部位、または少なくとも１００の部位でゲノムを切断することを含む。別の好ましい実施形態では、ゲノム増幅は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、少なくとも８１、少なくとも８２、少なくとも８３、少なくとも８４、少なくとも８５、少なくとも８６、少なくとも８７、少なくとも８８、少なくとも８９、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、少なくとも９９、少なくとも１００のコピーの切断のため標的化される増幅されたゲノム領域を含むため、ゲノムは、標的配列のコピー数と同じ数の部位で切断される。第１の態様の方法の好ましい実施形態では、ゲノム増幅は染色体または染色体外である。

【0026】

第１の態様の方法の好ましい実施形態では、切断がコード領域または調節領域以外のゲノム領域にあり、好ましくは切断がイントロン領域にあり、より好ましくは切断がスプライス部位以外のイントロン領域にある。具体的には、ゲノム再編成がゲノム増幅をもたらす場合、切断はコード領域または調節領域外の遺伝子間領域内であり得る。

【0027】

本発明者らは、本発明の方法が、Ｇ２において細胞周期を停止させ、最終的に癌細胞の細胞死を引き起こす癌細胞におけるＤＮＡ損傷をもたらすことから、本発明の方法が、ゲノム増幅を含む癌細胞を排除するために使用される場合（正常細胞は当該増幅を含まない）に特に有利であることを見出した。この方法は、癌細胞に特異的かつ排他的に向けられ得る放射線療法と同程度に有効であり、本発明の方法はゲノム増幅を受けていない正常細胞に影響を及ぼさないため、副作用が最小限に抑えられるという非常に大きな利点がある。

【0028】

第１の態様の方法の好ましい実施形態において、ゲノム増幅は、ＭＹＣＮ、ＭＹＣ、ＦＯＸＯ１、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ２、ＣＣＮＤ１、ＭＤＭ２、ＲＡＢ２５、ＭＤＭ４、ＫＲＡＳ、ＡＵＲＫＡ、ＴＥＲＴおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの遺伝子を含み、好ましくは遺伝子ＭＹＣＮまたはＭＹＣを含む。

【0029】

第１の態様の方法の好ましい実施形態において、癌細胞は、神経芽腫細胞、好ましくは遺伝子ＭＹＣＮを含むゲノム増幅を含む神経芽腫細胞であるか、または癌細胞が髄芽腫細胞、好ましくは遺伝子ＭＹＣを含むゲノム増幅を含む髄芽腫細胞である。

【0030】

第１の態様の方法の好ましい実施形態において、ゲノムを切断することは、ゲノムの損傷、欠失、逆位、フレームシフトまたはそれらの任意の組み合わせをもたらす。

【0031】

第１の態様の方法の好ましい実施形態では、切断部位の少なくとも２つがイントロンにある。本発明の方法は、好ましくはイントロン領域における癌細胞のゲノムの切断を含む。これらの領域は、スプライシングとして知られるプロセス中に除去される。イントロンは、スプライス部位と呼ばれる保存された配列での切断によって一次転写物から除去される。これらの部位は、イントロンの５’および３’末端に見出される。最も一般的には、除去されるＲＮＡ配列は、その５’末端でジヌクレオチドＧＵで始まり、その３’末端でＡＧで終わる。これらのコンセンサス配列は、保存されたヌクレオチドの１つを変化させるとスプライシングの阻害をもたらすので、重要であることが知られている。イントロンのコンセンサス配列は（ＩＵＰＡＣ核酸表記で）、Ｇ－Ｇ－［切断］－Ｇ－Ｕ－Ｒ－Ａ－Ｇ－Ｕ（ドナー部位）．．．イントロン配列．．．Ｙ－Ｕ－Ｒ－Ａ－Ｃ（アクセプター部位の２０～５０ヌクレオチド上流の分岐配列）．．．Ｙリッチ－Ｎ－Ｃ－Ａ－Ｇ－［切断］－Ｇ（アクセプター部位）である。

【0032】

本発明者らは、癌細胞のゲノムを２つの部位で切断すると、切断された配列がそれ自体を同じ位置であるが逆向きに挿入し（逆位）、これにより、融合タンパク質が産生されない（逆位が切断型タンパク質をもたらす）か、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現が防止されるため、癌細胞の死をもたらすことが起こり得ることを観察した。

【0033】

「ゲノム再編成」という表現は、欠失、挿入またはゲノム増幅を指す。また、ゲノム再編成は、融合タンパク質の産生をもたらすものなどの染色体領域の転座であり得る。

【0034】

好ましいゲノム再編成を以下の表１に列挙する。

【0035】

【0036】

【0037】

ゲノム再編成を含むより好ましい癌は、線維層板型肝細胞癌、非小細胞肺癌、肺胞横紋筋肉腫、神経膠芽腫、結腸直腸癌、急性リンパ性白血病、ユーイング肉腫、膀胱癌、神経芽腫、髄芽腫、乳癌、胃癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、網膜芽細胞腫、精巣胚細胞腫瘍または副腎皮質癌である。

【0038】

挿入は、数ヌクレオチドから数百または数千ヌクレオチド以上までサイズが異なってもよい。当該挿入は、コード化配列または非コード化配列を含んでもよい。挿入はまた、ゲノムを少なくとも２つの部位で切断した後に挿入される自殺遺伝子を含む場合がある。挿入されたＤＮＡは、内因性または外因性のいずれかであってもよい。

【0039】

好ましい実施形態では、ゲノムが切断され、切断が挿入をもたらす場合、当該挿入は切断の修復の結果であり、外因性ＤＮＡの挿入ではない。

【0040】

好ましい実施形態において、ゲノム再編成は挿入以外である。好ましい実施形態において、ゲノム再編成は、自殺遺伝子以外の配列の挿入である。

【0041】

第１の態様の好ましい実施形態において、少なくとも２つの切断部位は、欠失後の融合遺伝子から生じる成熟ｍＲＮＡが短縮されるか、またはフレームシフトのために異なる配列を有するように選択されたイントロンにある。１つのプロモーターを別の遺伝子のコード配列に結合する転座の場合、ｓｇＲＮＡの一方はその標的ドメインをイントロンに有し、他方はプロモーター配列の前または後にあるが当該配列に影響を及ぼさずにその切断部位を有するので、このプロモーターによって制御される野生型遺伝子の発現は変化しない。

【0042】

癌細胞は、融合遺伝子をもたらすゲノム再編成と、癌誘導遺伝子、例えば癌遺伝子の発現の誘導または過剰発現をもたらすゲノム再編成の両方を含み得る。また、癌細胞は、融合遺伝子をもたらすゲノム再編成と、癌誘導遺伝子、例えば癌遺伝子の発現の誘導または過剰発現をもたらすゲノム増幅の両方を含み得る。

【0043】

融合遺伝子の場合、癌細胞のみが融合遺伝子を有し、癌誘導遺伝子の発現の誘導または過剰発現をもたらすゲノム再編成の場合、それらの細胞のみが当該ゲノム再編成を有するので、本発明の方法は、癌細胞において排他的に少なくとも２つの部位でゲノムの切断を達成する。増幅の場合、ｇＲＮＡの標的ドメイン（したがって、切断配列）は、標的ドメインが同じであるため、１つのｇＲＮＡのみが使用されるが、少なくとも２つの切断部位が存在するように繰り返される。増幅の場合の切断部位の数は反復回数に依存するが、単一のｇＲＮＡのみが必要である。したがって、この場合、少なくとも２つの部位における切断は、それらの部位が異なる標的ドメイン配列を有することを意味しない。遺伝子増幅は、染色体アームの制限された領域のコピー数の増加である。増幅されたコピー（複数の場合がある）は、親対立遺伝子と同じ染色体上に出現し得るが、他の染色体（複数の場合がある）または染色体外無動原体エレメントにも転座し得る。増幅されたＤＮＡを、染色体外物質（二重微小、ＤＭ）において、遺伝子座（均質染色領域、ＨＳＲ）においてタンデムに、またはゲノムのいくつかの領域に分布して（相互分散して）、差次的に編成することができる^３８。いくつかの癌遺伝子増幅は特定の腫瘍に関連し、通常は予後不良の指標となる^{３２、３６}。ＤＭは、多数のヒト腫瘍で観察されている染色体外ＤＮＡの小さな断片であり、ＤＭはクロマチンから構成され、細胞分裂中に細胞の核内で複製する。典型的な染色体とは異なり、それらはＤＮＡの環状断片から構成され、セントロメアまたはテロメアを含まない。増幅された癌遺伝子は、増殖および生存に関して細胞に選択的利点を与える。ＤＮＡ増幅は、通常、アンプリコンに含まれる遺伝子の発現の対応する増加をもたらす。アンプリコンは非常に大きく（一般にサイズ範囲は１００ｋｂ～数メガベースである）、いくつかの遺伝子を含むことができるが、一方の遺伝子（通常は癌遺伝子）が増幅の主な標的であり、過剰発現された場合に癌性細胞に増殖または生存の利点を提供すると考えられている^３３。ＤＭと同様に均一に染色する領域（ＨＳＲ）は、増幅されたＤＮＡセグメント（アンプリコン）のコピーを含み、セグメントに含まれる遺伝子の細胞過剰発現をもたらす。単一のＨＳＲには、通常、タンデム配列に配置された多くのアンプリコンコピーが存在する。

【0044】

遺伝子増幅とは、その転写速度の増加ではなく、同じ遺伝子のコピー数の増加を指す。これは、遺伝子の３コピー（増幅）から１０コピー（中程度に増幅）または１００コピー～１０００コピー（高度に増幅）を産生する、何度も繰り返された遺伝子重複に起因する。遺伝子増幅の例は、ゲノム内でタンデム（エンド－ツーエンド（ｅｎｄ－ｔｏ－ｅｎｄ））アレイにクラスター化されて見出されるリボソーム遺伝子およびヒストン遺伝子である。胚発生に見られるような活発に増殖または分化する組織では、同じ遺伝子の複数のコピーによってのみ提供され得る大量のリボソームＲＮＡが必要とされる。遺伝子増幅は、癌ゲノムにおいて比較的頻繁にある事象である。６４個の既知のドライバー癌遺伝子の増幅依存的過剰発現が５８７個の腫瘍において見出され（４０％）、頻繁に観察された遺伝子は、結腸直腸癌ではＭＹＣ（２５％）およびＭＥＴ（１８％）、肺扁平上皮癌ではＳＫＰ２（２１％）、肝臓癌ではＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ（１９％）およびＭＹＣＮ（１３％）、消化管間質腫瘍ではＫＩＴ（５７％）、組織全体にわたる扁平上皮癌ではＦＯＸＬ２（１２％）であった。

【0045】

第１の態様の好ましい実施形態では、切断は、国際公開第２０１６０９４８８８号明細書に開示されているもののような自殺遺伝子のような外因性遺伝子の挿入を生じない。

【0046】

本発明の別の態様は、癌細胞を排除する方法であって、当該細胞が、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現をもたらすゲノム再編成を含み、当該方法が、当該融合遺伝子の発現産物を少なくとも１つの部位で切断することを含む、方法に関する。

【0047】

融合遺伝子のｍＲＮＡの切断は癌細胞に特異的であり、ｍＲＮＡの分解をもたらし、融合タンパク質の翻訳を妨げ、ひいては癌細胞の死をもたらす。

【0048】

この態様の好ましい実施形態では、切断はエンドヌクレアーゼＣａｓ１３を使用して行われる。融合遺伝子のＲＮＡのＣａｓ１３の切断は、癌細胞を排除し、細胞内のＲＮＡの分解をもたらし、最終的にその死をもたらす。Ｃａｓ１３酵素は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ガイドＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲエフェクターである^{２１～２７}。単一のｃｒＲＮＡのガイダンスの下で、Ｃａｓ１３は、相補的配列を有する標的ＲＮＡに結合して切断することができる。この機構を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムは、哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現を効果的にノックダウンすることができ、ＲＮＡ干渉技術に匹敵する有効性および改善された特異性を有する^{２８、２９}。Ｘ．Ｚｈａｏおよび共同研究者ら^３０は、膵臓癌モデルにおける変異ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの効率的かつ特異的なノックダウンのためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムを操作できることを実証した。

【0049】

この態様の好ましい実施形態では、１種のｇＲＮＡのみが使用される。このｇＲＮＡは、融合遺伝子の発現産物中にその標的化ドメインを有する。好ましいｇＲＮＡは、融合遺伝子ＤＮＡＪＢ１－ＰＲＫＡＣＡ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＰＡＸ３－ＦＯＸＯ１およびＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１の発現産物をそれぞれ切断するのに有用な、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７および配列番号１３８の配列によってコードされるものである。

【0050】

第２の態様は、好ましくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されるエンドヌクレアーゼを備えるキットオブパーツであり、当該エンドヌクレアーゼがコード領域または調節領域以外のゲノム領域、好ましくはゲノム増幅のイントロン領域でゲノムを特異的に切断し、より好ましくは当該切断がスプライス部位以外のイントロン領域である、キットオブパーツに関する。当該キットオブパーツは、好ましくは発現ベクター中にエンドヌクレアーゼまたは当該エンドヌクレアーゼをコードする配列を含み得る。

【0051】

第３の態様は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を切断することができるエンドヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ１３もしくは当該Ｃａｓ１３に由来する別のエンドヌクレアーゼ、またはそれらの機能的等価物（または当該エンドヌクレアーゼをコードする配列）と、癌細胞に存在し、非癌細胞には存在しない融合遺伝子の発現産物中にその標的化ドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、好ましくは１つのｇＲＮＡと、を備えるキットオブパーツに関する。好ましい実施形態では、キットは、配列番号１２６のヌクレアーゼまたはその機能的等価物と、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７から選択されるｇＲＮＡとを備える。好ましい実施形態では、キットは、配列番号１２６のヌクレアーゼまたはその機能的等価物と、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７から選択されるｇＲＮＡとから本質的になる。好ましくは、配列番号１２６のヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１２７である。

【0052】

第４の態様は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を切断することができるヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ１３もしくは当該Ｃａｓ１３に由来する別のエンドヌクレアーゼ、またはその機能的等価物をコード化する核酸、および癌細胞に存在し、非癌細胞には存在しない融合遺伝子の発現産物中にその標的化ドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、好ましくは１つのｇＲＮＡをコード化する核酸に関する。好ましい実施形態では、核酸は、配列番号１２６のヌクレアーゼまたはその機能的等価物、ならびに配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７から選択されるｇＲＮＡをコード化する。

【0053】

第５の態様は、癌の処置のための、好ましくは線維層板型肝細胞癌、非小細胞肺癌、肺胞横紋筋肉腫、神経膠芽腫、結腸直腸癌、急性リンパ性白血病、ユーイング肉腫、膀胱癌、神経芽腫、髄芽腫、乳癌、胃癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、網膜芽細胞腫、精巣胚細胞腫瘍または副腎皮質癌の処置のための、前述の方法、キット、または核酸の使用に関する。

【0054】

第１の態様の方法の好ましい実施形態において、切断は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されるエンドヌクレアーゼによって行われる。好ましくは、切断は、Ｃａｓタンパク質、好ましくはＣａｓ９またはその機能的等価物によって行われる。好ましい実施形態において、エンドヌクレアーゼの標的は、癌細胞に存在し、非癌細胞には存在しない融合遺伝子のイントロンにあり、当該標的は患者特異的ではない。当該エンドヌクレアーゼの標的は、イントロンもしくはエクソン、またはプロモータならびに５’および３’末端を含む非コード配列にあり得る。好ましい実施形態では、当該エンドヌクレアーゼの標的は、コード配列または調節配列にない。好ましい実施形態では、エンドヌクレアーゼ（複数の場合がある）の標的は、プロモーター、エンハンサーまたは任意の他の調節配列を含むエクソンまたは非コード配列内にない。好ましい実施形態では、当該エンドヌクレアーゼの標的はイントロンにある。より好ましい実施形態では、標的は、スプライス部位以外のイントロン配列にある。例えば、切断のための標的は、特にゲノム増幅をもたらす再編成の場合、遺伝子間配列であり得る。

【0055】

第１の態様の方法の好ましい実施形態において、少なくとも２つのガイドＲＮＡが、ゲノムの切断を標的とするために使用される。

【0056】

本発明の第２の態様は、キットオブパーツであって、好ましくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される少なくとも２つのエンドヌクレアーゼを備え、当該エンドヌクレアーゼが少なくとも２つの部位（核エンドヌクレアーゼは１つの特異的部位で切断する）で当該ゲノムを特異的に切断し、当該切断が、欠失、フレームシフトおよび／またはゲノムへの挿入、好ましくは欠失および／またはフレームシフトのいずれかをもたらすキットオブパーツに関するものである。

【0057】

好ましい実施形態では、キットオブパーツは、好ましくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されるエンドヌクレアーゼを備え、当該エンドヌクレアーゼがゲノム増幅のイントロン領域でゲノムを特異的に切断し、好ましくは切断がスプライス部位以外のイントロン領域にある。

【0058】

好ましい実施形態では、キットオブパーツは、少なくとも２つのＺＦＮまたは少なくとも２つのＺＦＮをコードする核酸を含む。別の好ましい実施形態では、キットオブパーツは、少なくとも２つのＴＡＬＥＮまたは少なくとも２つのＴＡＬＥＮをコードする核酸を含む。別の好ましい実施形態では、キットオブパーツは、少なくとも１つのＺＦＮおよび少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、または少なくとも１つのＺＦＮおよび少なくとも１つのＴＡＬＥＮをコードする核酸を含む。

【0059】

好ましい実施形態において、キットオブパーツは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタンパク質、より好ましくはＣａｓ９またはＣａｓ１３、さらにより好ましくはＣａｓ９またはその機能的等価物と、（ｂ）ゲノムの切断を標的化するために使用される少なくとも１つのｇＲＮＡ、好ましくはゲノムの切断を標的化するために使用される少なくとも２つのｇＲＮＡと、を備える。好ましい実施形態では、キットオブパーツは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタンパク質、より好ましくはＣａｓ９もしくはＣａｓ１３またはその機能的等価物、さらにより好ましくはＣａｓ９と、（ｂ）非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成における標的化ドメインを有する少なくとも一対のｇＲＮＡと、を備える。好ましい実施形態では、キットオブパーツは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタンパク質、より好ましくはＣａｓ９もしくはＣａｓ１３またはその機能的等価物、さらにより好ましくはＣａｓ９と、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成における標的化ドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、好ましくは一対のｇＲＮＡと、を備える。本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」および「単一ガイドＲＮＡ」という用語は同じ意味で使用され、「ｇＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」と略される。

【0060】

本発明のキットオブパーツの好ましい実施形態は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼと、（ｂ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号４および配列番号５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１２８もしくは配列番号１２９および配列番号１３０もしくは配列番号１３１のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３２もしくは配列番号１３３および配列番号１３４もしくは配列番号１３５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３６もしくは配列番号１３７および配列番号１３８もしくは配列番号１３９のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１４０もしくは配列番号１４１および配列番号１４２もしくは配列番号１４３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対と、を備える。

【0061】

本発明のキットオブパーツの好ましい実施形態は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼと、（ｂ）配列番号１４８もしくは配列番号１４９、またはそれらの両方のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡと、を備える。本発明のキットオブパーツの別の好ましい実施形態は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼと、（ｂ）配列番号１４８もしくは配列番号１４９、または配列番号１５２もしくは配列番号１５３、またはそれらの組み合わせのヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡと、を備える。

【0062】

本発明の別の態様は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタンパク質、より好ましくはＣａｓ９もしくはＣａｓ１３またはそれらの機能的等価物、さらにより好ましくはＣａｓ９；および（ｂ）融合遺伝子の発現産物中に標的化ドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成における標的化ドメインを有する少なくとも一対のｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む核酸に関する。

【0063】

この態様の一実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、癌細胞に存在し、非癌細胞には存在しないゲノム増幅、好ましくはコード領域または調節領域以外のゲノム領域、より好ましくは当該ゲノム増幅のイントロン領域、より好ましくはスプライス部位以外の癌遺伝子のイントロン領域に標的化ドメインを有する。

【0064】

本発明の別の態様は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタンパク質、より好ましくはＣａｓ９もしくはＣａｓ１３またはそれらの機能的等価物、さらにより好ましくはＣａｓ９；および（ｂ）融合遺伝子の発現産物中に標的化ドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、あるいは非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成における標的化ドメインを有する少なくとも一対のｇＲＮＡ、に対するコード化配列を本質的に含む核酸に関する。当該核酸は、当業者によく知られており、標的癌細胞におけるエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、エンハンサーなどの他のエレメントを含み得る。

【0065】

本発明の特に好ましい実施形態は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、好ましくは配列番号３２のコード化配列を有するヌクレアーゼ、ならびに（ｂ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号４および配列番号５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１２８もしくは配列番号１２９および配列番号１３０もしくは配列番号１３１のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３２もしくは配列番号１３３および配列番号１３４もしくは配列番号１３５のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１３６もしくは配列番号１３７および配列番号１３８もしくは配列番号１３９のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対；または配列番号１４０もしくは配列番号１４１および配列番号１４２もしくは配列番号１４３のヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡの対、に対するコード化配列を含む核酸に関する。

【0066】

４つの好ましい癌について、好ましいｇＲＮＡ対を以下に列挙する（各疾患に対し各切断部位について２つのｇＲＮＡを提供する）：
線維層肝細胞癌。

【0067】

融合遺伝子ＤＮＡＪＢ１－ＰＲＫＡＣＡ
＞ＤＮＡＪＢ１
配列番号１２８：
位置１１２５２；鎖：１；配列：ＧＡＴＧＴＣＧＣＧＴＧＴＣＧＣＴＧＡＡＡ；ＰＡＭ：ＧＧＧ；特異性スコア：９８．２６３３２９６；効率スコア：４６．２９７４４８９４８１４９１９６
配列番号１２９：
位置１２０６８；鎖：１；配列：ＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＴＴＣＧＴ；ＰＡＭ：ＧＧＧ；特異性スコア：９５．６９５７２１７；効率スコア：５４．７８２５６０７０３９４１９３
＞ＰＲＫＡＣＡ
配列番号１３０：
位置：１９３５；鎖：１；配列：ＧＴＣＧＧＡＡＣＴＡＴＴＧＧＴＣＧＡＡＡ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：９４．８１２１９９５；効率スコア：４９．４４０６７９４２８１９７２８５
配列番号１３１：
位置：８４６；鎖：１；配列：ＣＡＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＧＡＣＣＧＣＴＧ；ＰＡＭ：ＧＧＧ；特異性スコア：９１．３５３９５７；効率スコア：６９．６５４３７４３０１８５８７５
非小細胞肺癌。融合遺伝子ＥＭＬ４－ＡＬＫ
＞ＥＭＬ４
配列番号１３２：
位置：４２２６２６４１；鎖：１；配列：ＡＣＴＴＡＴＡＡＧＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＣ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：７３．９４７２７３２；効率スコア：４１．０１０８０１９６０５５９５７
配列番号１３３：
位置：４２２６３０４０；鎖：－１；配列ＧＧＡＴＴＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＧＣＣ：；ＰＡＭ：ＴＧＧ；特異性スコア：７１．６１３３４５４；効率スコア：４２．０３４９５３０３４８６０１９
＞ＡＬＫ
配列番号１３４：
位置：６９８８８２；鎖：１；配列：ＧＴＣＣＡＣＴＡＡＡＴＧＴＧＡＣＧＣＣＣ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：９２．５５３１０６７；効率スコア：５４．８８６６０８２６６１０５８９５
配列番号１３５：
位置：６９８３７５；鎖：１；配列：ＧＡＧＧＡＣＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：７３．６８５４９２９；効率スコア：３１．５３３８６７７８４０２２４６
肺胞横紋筋肉腫。融合遺伝子ＰＡＸ３－ＦＯＸＯ１
＞ＰＡＸ３
配列番号１３６：
位置：９６６３１；鎖：１；配列：ＴＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＣＧＴＣ；ＰＡＭ：ＧＧＧ；特異性スコア：９２．４２２１５５５；効率スコア：５１．１８１１０８４５５８０４９８
配列番号１３７：
位置：９５３９６；鎖：１；配列：ＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＣＧ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：８７．０３８７３２７；効率スコア：６５．９１７６２０８５６３３９８８
＞ＦＯＸＯ１
配列番号１３８：
位置：１０８８１５；鎖：１；配列：ＣＡＡＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＡＡＣＧ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：８３．６６２１６５５；効率スコア：６２．５４１７３８０４９１９６５９６
配列番号１３９：
位置：１０８０９５；鎖：－１；配列：ＴＧＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＧＴＣＣＡ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：７６．５６７７５１７；効率スコア：６４．８１５９２７０８４９９４５４
神経膠芽腫。融合遺伝子ＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１
＞ＴＰＭ３
配列番号１４０：
位置：２３３５９；鎖：－１；配列：ＡＡＣＣＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧ；ＰＡＭ：ＡＧＧ；特異性スコア：７１．２６８９５１６；効率スコア：６２．７９２７１０６６４５０３３９６
配列番号１４１：
位置：２３６５３；鎖：１；配列：ＴＡＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧ；ＰＡＭ：ＧＧＧ；特異性スコア：６９．２１１５５３９；効率スコア：６０．９８４８０８００２８９４７３
＞ＮＴＲＫ１
配列番号１４２：
位置：１５６８７７７３２；鎖：１；配列：ＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＧＴＡ；ＰＡＭ：ＴＧＧ；特異性スコア：９０．０５３４００４；効率スコア：４７．９３００６２７３１４５８５２
配列番号１４３：
位置：１５６８７７５３６；鎖：－１；配列：ＴＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＴＡＧＡＣＣＧＡ；ＰＡＭ：ＧＧＧ；特異性スコア：８６．３５８５０８１；効率スコア：６８．２９８３９０５５５４９２７
好ましいｇＲＮＡを、少なくとも癌遺伝子を含むゲノム増幅に関連するいくつかの好ましい癌について以下に列挙する。
神経芽腫：
遺伝子ＭＹＣＮ：ｇＲＮＡ：ＣＴＧＴＣＧＴＡＧＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＣ（配列番号１４８）
遺伝子ＭＹＣＮ：ｇＲＮＡ：ＣＧＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＧ（配列番号１４９）
髄芽腫：
遺伝子ＭＹＣＮ：ｇＲＮＡ：ＣＴＧＴＣＧＴＡＧＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＣ（配列番号１４８）
遺伝子ＭＹＣＮ：ｇＲＮＡ：ＣＧＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＧ（配列番号１４９）
遺伝子ＭＹＣ：ｇＲＮＡ：ＣＡＴＣＴＣＣＧＴＡＴＴＧＡＧＴＧＣＧＡ（配列番号１５２）
遺伝子ＭＹＣ：ｇＲＮＡ：ＣＣＣＧＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣ（配列番号１５３）
横紋筋肉腫：
遺伝子ＦＯＸＯ１：ｇＲＮＡ：ＡＣＴＧＴＡＴＡＧＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＧ（配列番号１５４）
結腸癌：
遺伝子ＭＹＣ：ｇＲＮＡ：ＣＡＴＣＴＣＣＧＴＡＴＴＧＡＧＴＧＣＧＡ（配列番号１５２）
乳癌：
遺伝子ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）：ｇＲＮＡ：ＧＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＡＴＡＣ（配列番号１５５）
神経膠芽腫：
遺伝子ＥＧＦＲ：ｇＲＮＡ：ＣＡＴＧＴＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧ（配列番号１５６）
肺癌：
遺伝子ＭＥＴ：ｇＲＮＡ：ＧＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号１５７）
胃癌：
遺伝子ＦＧＦＲ２：ｇＲＮＡ：ＧＡＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＡＡＣＣＧＧＧ（配列番号１５８）
口腔扁平上皮癌：
遺伝子ＣＣＮＤ１：ｇＲＮＡ：ＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡ（配列番号１５９）
骨肉腫：
遺伝子ＭＤＭ２：ｇＲＮＡ：ＣＧＧＡＣＣＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＡＴＧ（配列番号１６０）
卵巣癌：
遺伝子ＲＡＢ２５：ｇＲＮＡ：ＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＣＡＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１６１）
網膜芽細胞腫：
遺伝子ＭＤＭ４：ｇＲＮＡ：ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＣＡＡＣＧＧＴＣＴＣＧ（配列番号１６２）
精巣生殖細胞腫瘍：
遺伝子ＫＲＡＳ：ｇＲＮＡ：ＴＡＣＴＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＧ（配列番号１６３）
膀胱癌：
遺伝子ＡＵＲＫＡ：ｇＲＮＡ：ＣＧＴＡＣＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＣＴ（配列番号１６４）
副腎皮質癌：
遺伝子ＴＥＲＴ：ｇＲＮＡ：ＧＡＣＧＣＴＴＡＴＣＴＧＡＣＴＣＧＧＣＧ（配列番号１６５）

【0068】

本発明の別の態様は、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ、および
ｂ．配列番号１４８もしくは配列番号１４９、またはその両方のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む核酸である。

【0069】

本発明の別の態様は、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ、および
ｂ．配列番号１４８もしくは配列番号１４９、または配列番号１５２もしくは配列番号１５３、またはそれらの両方のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む核酸である。

【0070】

本発明の別の態様は、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有するヌクレアーゼ、および
ｂ．配列番号１５２、または配列番号１５４、または配列番号１５５、または配列番号１５６、または配列番号１５７、または配列番号１５８、または配列番号１５９、または配列番号１６０、または配列番号１６１、または配列番号１６２、または配列番号１６３、または配列番号１６４、または配列番号１６５を有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、に対するコード化配列を含む核酸である。

【0071】

本発明の別の態様は、癌の処置のための、好ましくは線維層板型肝細胞癌、非小細胞肺癌、肺胞横紋筋肉腫、神経膠芽腫、結腸直腸癌、急性リンパ性白血病、ユーイング肉腫、膀胱癌、神経芽腫、髄芽腫、乳癌、胃癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、網膜芽細胞腫、精巣胚細胞腫瘍または副腎皮質癌の処置のための、本発明の方法のいずれか１つ、または本発明のキットオブパーツもしくは本発明の核酸のいずれか１つの使用に関する。好ましくは、非癌細胞に存在しない融合遺伝子の発現、または癌誘導遺伝子の発現もしくは過剰発現の誘導をもたらすゲノム増幅もしくは再編成のいずれかをもたらす、癌細胞に存在するゲノム再編成がある癌の処置のためのものである。より好ましくは、非癌細胞には存在しないが、癌細胞に特異的に融合遺伝子および融合タンパク質が存在する癌の処置のためのものである。さらにより好ましくは、表１に列挙される癌の処置のためのものである。好ましくは、本発明のキットオブパーツは、各特定の癌タイプにおいて有用であることが知られている特定の送達システムによって、処置を必要とする患者に送達される。送達系、例えばウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶおよび他の送達系、例えばナノ粒子およびマクロ複合体を使用することができる。本発明のキットオブパーツの投与は、患者の標的組織または癌細胞に応じて、異なる方法で行うことができる。したがって、投与は、患者の必要性に応じて、経口または非経口、皮下、筋肉内または静脈内、ならびに髄腔内、頭蓋内などであり得る。

【実施例】

【0072】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による融合遺伝子の正確な欠失。

【0073】

融合遺伝子欠失（または再編成）戦略が癌を処置するための良好な遺伝子治療アプローチであるかどうかを解明するために、本発明者らは、臨床的に関連する転写融合の２つの主要なクラスを代表する２つのよく特徴付けられた融合遺伝子である、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１ユーイング肉腫（ＥＳ）転写因子およびＢＣＲ－ＡＢＬ慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）チロシンキナーゼ融合遺伝子を試験モデルとして選択した。

【0074】

小児の骨に関与する２番目に一般的な癌であるユーイング肉腫（ＥＳ）は、ＲＮＡ結合タンパク質ＥＷＳＲ１の強力なトランス活性化ドメインをＥＴＳタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、最も一般的にはＦＬＩ１と融合する染色体転座を特徴とする。ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１は転写因子として作用し、多くの研究がＥＳ細胞のＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１発現に対する厳密な依存性を実証している。ＥＷＳＲ１エクソン７をＦＬＩ１エクソン６（いわゆる１型）またはＦＬＩ１エクソン５（いわゆる２型）に融合する２つの主要なＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１サブタイプが記載されている（図１ａ）。ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子の２つの異なるアイソフォームである１型および２型を有する２つのＥＳ細胞株（Ａ６７３およびＲＤ－ＥＳ）をモデル系として選択した。

【0075】

ＥＳおよびＣＭＬが試験モデルとして選択されているが、全体的なアプローチは、融合遺伝子の発現またはゲノム編集による除去または改変が腫瘍細胞の死を引き起こし得る染色体再編成によって生じる癌遺伝子の強制発現に依存するすべての新生物に潜在的に適用可能であることに留意することが重要である。
ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの選択

【0076】

同じＣＲＩＳＰＲツールを用いてＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１の両方のアイソフォームを選択的に標的化するために、ＥＷＳＲ１のイントロン３およびＦＬＩ１のイントロン８を標的化するｓｇＲＮＡ対を設計した（図１ａおよび表２）。標的イントロンは、第１に、融合遺伝子の重要な機能ドメインを含む大きな欠失を生成するために、第２にＦＬＩ１遺伝子の残りの３’領域のフレームシフトを誘導するために、第３にヒト患者においてブレークポイントを有する全てのホットスポットイントロンを含むように選択された。イントロン領域におけるｓｇＲＮＡの設計は、野生型（ＷＴ）遺伝子におけるオンターゲットイントロンのＮＨＥＪ修復によって生成されたインデルがｍＲＮＡにおいて除去されるので、非腫瘍細胞における野生型ＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１タンパク質の改変を保証しなかった。これは、スプライシング機構が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって生成された二本鎖ブレーク（ＤＳＢ）の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復後に野生型遺伝子のイントロンの両方のｓｇＲＮＡのオンターゲット部位に生成された任意のインデルを除去するからである（図１ｃ）。その結果、欠失は、同じ染色体中の両方のオンターゲットイントロン領域との融合遺伝子を有する細胞でのみ起こる（図１ａ）。

【0077】

表２．ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集に使用したｓｇＲＮＡ配列。ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲおよびＮＧＳ分析に使用したオリゴヌクレオチド配列。

【0078】

【0079】

標準的なｓｇＲＮＡ設計原理に従うｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／およびｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｃｒｉｓｐｒウェブツールを使用して、各イントロン領域に対して２つのｓｇＲＮＡを設計し、ゲノムの残りの部分と比較して標的に固有のＰＡＭ配列の上流にある標的化配列を確実に選択し、予測されるオフターゲット事象が可能な限り少ないものを選択した。ｓｇＲＮＡ、ｓｇＥＷＳＲ１３．２（以下、ｓｇＥ３．２（配列番号２））およびｓｇＦＬＩ１８．２（ｓｇＦ８．２（配列番号３））を、２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｕ６およびＨ１）から類似のｓｇＲＮＡ発現レベルを駆動し、２Ａ自己切断ペプチドによるＣａｓ９およびＧＦＰタンパク質の同時調節発現を駆動するｐＬＶＸ－Ｕ６Ｅ３．２－Ｈ１Ｆ８．２－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰ（以下、ｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９Ｇ）にクローニングした（図１ｄ）。それぞれＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１のイントロン３および８の切断は、２７．６７ｋｂの欠失をもたらし、ＥＷＳＲ１トランス活性化ドメインの重要な部分の除去を、ＦＬＩ１ ＤＮＡ結合ドメイン全体のフレームシフト変化と共にもたらすはずである（図１ｂおよび２）。配列番号６は、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１キメラタンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号７は、編集されたＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１切断型タンパク質のアミノ酸配列であり、両方とも図２に表されている。Ａ６７３細胞にｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９Ｇベクターを形質導入し、その後の分析のために形質導入の２日後、４日後および６日後（ｐｔ）に全ゲノムＤＮＡを単離した。２日間のｐｔ ＤＮＡディープシークエンシング分析は、ＥＷＳＲ１では６１．８のインデル頻度を示し、ＦＬＩ１オンターゲット部位では６６．２％のインデル頻度を示した（表３）。

【0080】

表３オンターゲットＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１部位のＮＧＳ分析。ａ，ｃ．ＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１遺伝子座分析の概要（ｓｇＲＮＡ配列、染色体位置、全リードおよび効率）。ｂ，ｄ．誘導されたＡ６７３編集細胞におけるＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１遺伝子座のインデル。野生型（ＷＴ）配列を各図の上部に列挙する。ｓｇＲＮＡ配列には下線が引かれており、同定された変異は太字フォントで示されている。－、欠失。

【0081】

インビトロでのＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子の標的化

【0082】

それぞれ１型または２型のＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１アイソフォームを有する２つのＥＳ細胞株、Ａ６７３およびＲＤ－ＥＳをモデル系として選択した。本発明者らは、最初に、ｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９ＧがＡ６７３にＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子欠失を生成する能力を調べた。融合遺伝子を含まない骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞株およびｓｇＲＮＡ配列を含まない空のｐＬＶ－Ｕ６＃Ｈ１＃－Ｃ９Ｇベクターをそれぞれ細胞株およびベクター対照として使用した。ｐｔの２日目、４日目および６日目に抽出されたイントロン標的部位にまたがるゲノムＤＮＡ領域のＰＣＲ分析により、特有のΔ２７．６７ｋｂ欠失産物が明らかになり、その配列をサンガー配列決定によって確認した（図３）。同様に、ｓｇＥ３．２およびｓｇＦ８．２の同時発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によって示されるように、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の確実な減少をもたらした（図４および図５）。
ＫＯ欠失ＣＲＩＳＰＲベースのアプローチでＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子を標的化すると、インビトロで癌細胞の生存、増殖および腫瘍形成能が阻害される

【0083】

ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１の標的化された欠失が癌細胞の死を誘導し得るかどうかを調べるために、インビトロで腫瘍形成能のアッセイを行った。ｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９Ｇおよび対照プラスミドを形質導入したＡ６７３、ＲＤ－ＥＳおよびＵ２ＯＳを、軟寒天アッセイで増殖速度およびコロニー形成に供した。増殖速度アッセイは、Ａ６７３およびＲＤ－ＥＳの両方におけるＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１欠失が、それらの対応する対照細胞と比較して細胞増殖を有意に抑制し、Ｕ２ＯＳ細胞に影響を及ぼさないことを実証した（図６ａ）。さらに、Ａ６７３細胞およびＲＤ－ＥＳ細胞におけるＣａｓ９およびｓｇＲＮＡの同時発現は、コロニー形成アッセイおよび軟寒天アッセイにおいてそれぞれコロニー数の６１．５％および７３．３％の有意な減少をもたらし、ＣＲＩＳＰＲを使用したＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１の欠失がＥＳ癌細胞の生存および腫瘍形成能を阻害することを示唆した。Ｕ２ＯＳ細胞におけるＣａｓ９およびｓｇＲＮＡの発現は、コロニー数を有意に変化させなかった（図６ｂ）。まとめると、本発明者らのデータは、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１欠失が腫瘍抑制活性に不十分であり、細胞増殖を阻害することを示す。特に、本発明者らは、ｐｔの３日目、６日目および８日目のＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１欠失の後に有意な細胞死の増加が続き、Ａ６７３－ｐＬＶ－Ｕ６＃Ｈ１＃－Ｃ９Ｇ対照細胞と比較して、断片化されたＤＮＡを提示する細胞の数によって測定された６日目の細胞死増加の２０％のピーク（ｓｕｂＧ１ピーク）が観察された（図７ａ）。Ｃａｓｐ３活性化分析により、これらの結果が確認された（図７ｂ）。したがって、融合遺伝子欠失は、ＥＳ癌細胞におけるアポトーシス死をもたらす。
ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子ターゲッティングは非常に特異的である

【0084】

ｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９Ｇを形質導入されたヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）において、ＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１野生型遺伝子の切断がＷＴ細胞におけるゲノム変化を誘導し得るかどうかを評価するために、核型分析およびＦＩＳＨ分析を行った。Ｇバンド化中期（ｍｅｔｈａｐｈａｓｅｓ）は、正常な核型を示し（図８ａ）、ＥＷＳＲ１ブレークアパートプローブを用いたＦＩＳＨ分析は、変化したＦＩＳＨシグナルを示さなかった（図８ｂ）。同様に、全ゲノムを網羅する高密度アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析は、コピー数多型（ＣＮＶ）を示さなかった（図８ｃ）。これらのデータは、癌ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子の治療標的化が非常に特異的であり、ＷＴ細胞を妨害しないことを示唆する。一方、オフターゲット部位で誘導された変異を同定できるかもしれないため、本発明者らは、Ａ６７３、ＲＤ－ＥＳおよびｈＭＳＣ細胞の形質導入後７日目に、標的部位（それぞれＥＷＳＲ１およびＦＬＩ１のオフターゲット部位１～９／１０）に対して最も高い相同性を有する１９のゲノム領域のアンプリコンの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を行った。全てのリードのいずれも、予測されたオフターゲット部位に突然変異を有しない（表４）。
標的化ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子欠失は、異種移植腫瘍の部分寛解を誘導する

【0085】

インビボでＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１欠失の効果を決定するために、ヌードマウスの脇腹に、対照ｐＬＶ－Ｕ６＃Ｈ１＃－Ｃ９ＧおよびｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９Ｇ形質導入Ａ６７３細胞を皮下移植した（図９ａ）。対照細胞を注入したマウスは、２８日間の分析中に腫瘍の指数関数的増殖を示した。対照的に、ｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９Ｇ細胞を注射したマウスは、Ａ６７３対照細胞によって産生されたものよりも劇的に小さい皮下腫瘍を生じた（図９ｂおよびｃ）。さらに、エクスビボＣＲＩＳＰＲ編集細胞は、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色によって示されるように、対照よりもＣＲＩＳＰＲ編集細胞において著しく減少した生存腫瘍細胞数およびより広範な壊死領域を示し、対照腫瘍と比較して、ＫＩ６７増殖マーカーの有意な６５％の減少およびカスパーゼ－３タンパク質発現の有意な２５％の増加レベルを明らかにした（図９ｄ）。重要なことに、ｐＬＶ－Ｕ６ＥＨ１Ｆ－Ｃ９Ｇ細胞を異種移植したマウスは、試験の３５日間で関連する死亡率を示さなかったが、全ての対照は２週間の細胞注入後に屠殺する必要があった（図９ｅ）。これらの結果により、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１エクスビボ融合遺伝子編集の治療有効性が確認された。

【0086】

表４．ｈＭＳＣ、Ａ６７３およびＲＤＥＳ細胞のｐｔ７日目のアンプリコンベースの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析による、オンターゲット部位との相同性が最も高い、最も可能性の高いオフターゲット部位のインデル分析。オンターゲット配列を各パネルの上部に列挙する。オンターゲット配列とのヌクレオチドの違いを太字フォントで示す。全てのリードのいずれも、予測されたオフターゲット部位に突然変異を有しない。

【0087】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子の標的化はインビボで腫瘍成長を遮断する

【0088】

ＣＲＩＳＰＲ融合遺伝子欠失がインビボで無胸腺マウスにおけるヒト癌成長を制御できるかどうかを評価するため、本発明者らはアデノウイルス送達アプローチを使用した。野生型Ａ６７３細胞を無胸腺マウスの脇腹に皮下注射した（０日目）。異種移植された腫瘍を、約１５０ｍｍ^３のサイズに達するまで２週間（１０日目）成長させた。次いで、これらの腫瘍に、２．５×１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＡｄ／ｓｇＥ３．２ｓｇＦ８．２Ｃａｓ９、Ａｄ／Ｃａｓ９またはＰＢＳを１０、１３、１６および１９日目に４回注射した（図１０ａ）。ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼのアデノウイルス送達は、有意な腫瘍成長阻害をもたらし、２９８．６６（＋９２．７７）ｍｍ^３の平均腫瘍サイズをもたらした（Ｐ＜０．０５）。ＰＢＳまたはＡｄ／Ｃａｓ９のいずれかで処置した対照群の腫瘍体積は経時的に増加し、処置終了時にそれぞれ１１４３．９８（＋３３７．５９）ｍｍ^３または１３４５．２５（＋６８５．１６）ｍｍ^３の平均サイズに達した（図１０ｂ）。そのため、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１編集実験細胞は、対照と比較して腫瘍サイズをそれぞれ８３．５％減少させた。Ｃａｓ９抗体を使用する免疫組織化学染色により、Ａｄ／ｓｇＥＷＳＲ１－ｓｇＦＬＩ１－Ｃａｓ９を注射した腫瘍におけるＣａｓ９タンパク質の発現が確認された（図１０ｃ）。融合遺伝子欠失アプローチの抗腫瘍有効性を、組織学的および免疫組織化学的分析によってさらに調査した。Ｈ＆Ｅ染色は、対照よりもＣＲＩＳＰＲ編集細胞において生存腫瘍細胞の数が著しく減少し、より広範囲の壊死領域を明らかにした。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集細胞は、対照腫瘍と比較して８０％低いレベルのＫＩ６７増殖マーカーを示した（図１０ｄ）。融合遺伝子欠失腫瘍は、対照腫瘍と比較してカスパーゼ－３タンパク質発現の約３０％の増加を示した（図１１ｄ）。重要なことに、Ａｄ／ｓｇＥ３．２ｓｇＦ８．２Ｃａｓ９で処置したマウスは、試験の８０日間で関連する死亡率を示さなかったが、対照はすべて、２週間の細胞注射後に屠殺する必要があった（図１０ｅ）。これらの結果は、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１融合遺伝子によって駆動されるインビボ腫瘍を処置するための融合遺伝子編集アプローチの治療有効性を確認した。
Ｋ５６２細胞における慢性骨髄性白血病チロシンキナーゼＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子の標的化のための戦略

【0089】

そのような遺伝子編集アプローチが融合遺伝子駆動体癌処置のための普遍的なアプローチとして使用され得るかどうかを評価するため、本発明者らは古典的なチロシンキナーゼ融合遺伝子を欠失させるための同様の戦略を再現した。本発明者らは、ＣＭＬの遺伝的異常の特徴であるｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）転座によって作製されたＢＣＲ－ＡＢＬ１を選択する。ＢＣＲ－ＡＢＬ１は構成的に活性なチロシンキナーゼを作り出し、制御されない増殖をもたらす。本発明者らは、上記と同じ方法論的アプローチに従った。簡潔には、ＢＣＲイントロン８およびＡＢＬイントロン１領域を標的とする４対のｓｇＲＮＡを設計した（図１１ａおよび表２）。ＮＨＥＪに続いて、これらはゲノムＢＣＲ－ＡＢＬ１ ＤＮＡの１３３．９ｋｂの欠失をもたらすであろう。欠失が成功すると、ＡＢＬ１ ＤＮＡ結合ドメイン全体のフレームシフト変化と共に、ＢＣＲ Ｄｂｌ相同性（ＤＨ）ドメインの大部分が除去されるであろう。４つのｓｇＲＮＡの組み合わせをクローニングして、ｐＬＶ－Ｕ６ＢＨ１Ａ－Ｃ９Ｇ（ＢＡ１、ＢＡ２、ＢＡ３およびＢＡ４）ベクターを作製した。次いで、本発明者らは、ＢＣＲ－ＡＢＬ１融合遺伝子のｐ２１０アイソフォームを有するＣＭＬ患者由来のＫ５６２細胞においてＢＣＲ－ＡＢＬ１標的化欠失を生成する効率を調べた。ＲＴ－ＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって、ヌクレオフェクションの２４時間後にＢＣＲ－ＡＢＬ ｍＲＮＡの効率的な減少が確認された（図１１ｂ）。メチルセルロース寒天上でのコロニー形成アッセイにより、ＢＣＲ－ＡＢＬ１の標的化欠失がＫ５６２細胞の増殖および死の劇的な減少を誘導することが確認された。定量的データ解析は、ＢＣＲ－ＡＢＬ１欠失がコロニー形成を約８５％まで有意に抑制したことを示した（図１１ｃ）。培養７２時間後のＫ５６２実験細胞および対照細胞におけるｓｇＲＮＡの４つの組み合わせを用いたＳｕｂＧ１分析の定量的データ解析は、対照細胞と比較して、ＢＣＲ－ＡＢＬ１欠失細胞におけるアポトーシスの有意な増加を示した（Ｐ＜０．０５）。（図１１ｄ）。

【0090】

インビボでのＢＣＲ－ＡＢＬ１欠失効果を評価するために、上記と同じ戦略的アプローチに従って、無胸腺マウスの脇腹にＫ５６２細胞を皮下注射した。３週間の成長後、腫瘍に２．５×１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＡｄ／ｓｇＢＡ１－Ｃａｓ９またはＰＢＳを１６、１９、２２および２４日目に４回注射した。標的化ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼの両方のアデノウイルス送達は、有意な腫瘍成長阻害をもたらし、１２８．７７（±６３．５３）ｍｍ^３の平均腫瘍サイズをもたらした（Ｐ＜０．０５）。ＰＢＳで処置した対照群の腫瘍体積は経時的に増加し、処理の６日後に平均サイズ１８５３．９１ｍｍ^３に達した（図１２ａおよびｂ）。重要なことに、Ａｄ／ｓｇＢＡ１Ｃａｓ９で処置したマウスは、試験の６０日間で関連する死亡率を示さなかったが、全ての対照は２週間の細胞注射後に屠殺する必要があった。
ＥＳおよびＣＭＬ癌細胞株におけるＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１およびＢＣＲ－ＡＢＬ１のｍＲＮＡ発現の確実なＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ１３媒介性ノックダウン

【0091】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムを使用してＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１およびＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの可能な限り高いサイレンシングを達成するために、Ｃａｓ１３タンパク質およびｃｒＲＮＡをレンチウイルスベクターＬＶ－Ｃａｓ１３－ｃｒＲＮＡから発現させる。一連のｃｒＲＮＡを試験して、最も効率的なものを選択する（代表例を表５に示す）。一連のｃｒＲＮＡ中のガイドフラグメントは、ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１およびＢＣＲ－ＡＢＬ１ブレークポイントを含むすべての位置をカバーする。Ｃａｓ１３－ｃｒＲＮＡレンチウイルス形質導入されたＥＳまたはＣＭＬ癌細胞のＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１またはＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ発現レベルの分析は、形質導入後に減少を示す。最も高いＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１またはＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡノックダウンを産生するｃｒＲＮＡを、その後の実験のために選択する。

【0092】

表５．ｃｒＲＮＡ
＞ｃｒＲＮＡ ＤＮＡＪＢ１－ＰＲＫＡＣＡ
配列番号１４４ ＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧ
＞ｃｒＲＮＡ ＥＭＬ４－ＡＬＫ
配列番号１４５ ＧＧＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＴＧＴＡＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＣ
＞ｃｒＲＮＡ ＰＡＸ３－ＦＯＸＯ１
配列番号１４６ ＧＧＣＡＧＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＧＴＣＡＴ
＞ｃｒＲＮＡ ＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１
配列番号１４７ ＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３によるＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１およびＢＣＲ－ＡＢＬ１ノックダウンは非常に特異的であり、ＥＳおよびＣＭＬ癌細胞の増殖を阻止する
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３媒介性のＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１およびＢＣＲ－ＡＢＬ ｍＲＮＡノックダウンの抗腫瘍効果をＥＳおよびＣＭＬ癌細胞において評価する。最初に、本発明者らは、Ｃａｓ１３およびｃｒＲＮＡのＬＶ形質導入が時間依存的にＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１およびＢＣＲ－ＡＢＬ ｍＲＮＡ発現レベルを有意に低下させることを確認する。長期および軟寒天細胞培養をｓｕｂＧ１アッセイと共に使用して、ＣＲＩＳＰＲＣａｓ１３系で処理した細胞における細胞増殖速度およびアポトーシスレベルを測定する。ＬＶ－Ｃａｓ１３－ｃｒＲＮＡベクターによる形質導入は、ＥＳおよびＣＭＬ癌細胞の増殖を有意に抑制し、アポトーシス細胞率を増加させる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムで処置した後、対照細胞の増殖またはアポトーシス速度に明らかな変化はない。

【0093】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３によるＫＲＡＳ－ｇ１２ｄノックダウンは、インビボで腫瘍成長を阻害する。

【0094】

インビボでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３系の抗腫瘍効力を調べるため、皮下ＥＳまたはＣＭＬ異種移植片を有するマウスを、アデノウイルスベクターによって送達される最適化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３系の反復腫瘍内注射で処置する。対照群と比較して、Ｃａｓ１３－ｃｒＲＮＡ処置腫瘍群は有意な体積減少を示す。ＥＷＳＲ１－ＦＬＩ１またはＢＣＲ－ＡＢＬ１ノックダウンアプローチの抗腫瘍有効性を、組織学的および免疫組織化学的分析によってさらに調査する。Ｈ＆Ｅ染色は、対照よりも処置細胞において生存腫瘍細胞の数が著しく減少し、より広範な壊死領域を明らかにする。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集細胞は、対照腫瘍と比較してより低いレベルのＫＩ６７増殖マーカーを示す。融合ｍＲＮＡノックダウン腫瘍は、対照腫瘍と比較してカスパーゼ－３タンパク質発現の増加を示す。重要なことに、Ａｄ／Ｃａｓ１３－ｃｒＲＮＡで処置したマウスは、試験中の死亡率が低い。
ゲノム増幅を含む癌細胞の排除

【0095】

増幅を標的化するための効率的なＮＨＥＪ ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集戦略が達成された。このアプローチは、増幅された遺伝子のイントロン配列を標的化して、遺伝子のコピーが増幅された領域に存在する限り、複数のＤＮＡ切断を誘導することに基づいていた。遺伝子編集に基づくアプローチは、生殖系列非増幅細胞のエクソン配列またはタンパク質発現に影響を及ぼすことなく、遺伝子増幅を有する細胞における欠失および損傷のみを誘導した（図１３）。神経芽細胞腫

【0096】

ＭＹＣＮが症例の２５％で増幅されていることが見出され、高リスク疾患および予後不良と相関する、小児の最も一般的な頭蓋外固形腫瘍である神経芽腫の細胞モデルを使用した。ＭＹＣＮ遺伝子の第１イントロンを標的とした。

【0097】

ＭＹＣＮプローブを用いたＦＩＳＨ分析を使用して増幅のタイプを決定してＭＹＣＮ増幅を検出するため、神経芽腫細胞株ＳＫＮＡＳ、ＩＭＲ３２およびＬＡＮ５を特性評価した。ＦＩＳＨ分析は、ＩＭＲ３２細胞株における相同染色領域（ＨＳＲ）ＭＹＣＮ増幅およびＬＡＮ５における二重微小ベースの増幅の存在を示したが、ＳＫＮＡＳはＭＹＣＮ増幅を全く保有せず、陰性対照として使用した（図１４）。

【0098】

インビトロアッセイを実施して、ＭＹＣＮのイントロン領域を標的とすることの機能的結果を調べた。非標的化ガイド（ｓｇＮＴ）ではなく、ＭＹＣＮを標的とするガイド（ｓｇＭＹＣＮ）での形質導入は、コロニーアッセイではＩＭＲ３２およびＬＡＮ５成長（図１５）ならびにクローン形成能（図１６）の確実な減少をもたらしたが、これらのパラメータは対照ＳＫＮＡＳ細胞では変化しなかった（非ＭＹＣＮ増幅）（図１５および図１６）。これらの観察結果と一致して、増殖表現型は、ｓｇＭＹＣＮで処置した場合、増幅細胞株の死滅（図１５）およびＭＹＣＮ ＲＮＡレベルの低下（図１５）を伴っていた。

【0099】

これらの観察結果とも一致して、ｓｇＭＹＣＮ ＩＭＲ３２およびＬＡＮ５で処置した場合、ヨウ化プロピジウム染色で測定して、細胞がＧ２細胞周期期で停止したのに対して、ＳＫＮＡＳでは正常な細胞周期進行が観察されたことが観察された（図１７）。

【0100】

免疫蛍光抗Ｈ２ＡＸは、ｓｇＭＹＣＮで処置した後、ＭＹＣＮ増幅細胞株においてＤＮＡ修復フォーカスの増加を示した（図１８）。
髄芽腫

【0101】

別のモデル、すなわち、ＭＹＣ増幅癌遺伝子が高リスク神経芽細胞腫の約５０％に存在し、高リスク疾患および予後不良と相関する、小児における最も一般的な癌性脳腫瘍である髄芽腫の細胞モデルを使用した。ＭＹＣ遺伝子のイントロン１つを、ＭＹＣが増幅された髄芽腫細胞株において欠失および損傷を生じさせ、増幅を伴わずに細胞の生殖系列を保証するために標的化した。髄芽腫細胞株ＭＤＢ－ＨＴＢ－１８５を使用した。インビトロアッセイを実施して、ＭＹＣのこのイントロン領域を標的とすることの機能的結果を調べた。

【0102】

２つの配列、すなわちｓｇＭＹＣ－１（配列番号１５２）およびｓｇＭＹＣ－２（配列番号１５３）を設計した。ｓｇＲＮＡをＬｅｎｔｉＣＲＩＰＳＲｖ２プラスミドにクローニングした。ＬＶＣａｓ９＿ＮＴではなく、ＬＶＣａｓ９＿ＭＹＣ－１およびＬＶＣａｓ９＿ＭＹＣ－２による形質導入は、確実なＭＤＢ－ＨＴＢ－１８５細胞死をもたらした（図１９）。

【0103】

癌の他の例は、当該癌において説明されるアンプリコン中に存在する癌遺伝子の非コードおよび非調節ゲノム領域に向けられたｇＲＮＡを使用してアッセイされる。ｓｇＲＮＡをＬｅｎｔｉＣＲＩＰＳＲｖ２プラスミドにクローニングし、これを対応する癌の細胞株に形質導入する。それらは以下の通りである。

ｓｇＲＮＡの設計およびレンチウイルスコンストラクトの作製

【0104】

ｓｇＲＮＡを、オンラインＢｅｎｃｈｌｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）を用いて設計した。選択されたｓｇＲＮＡは、高い特異性ランクおよび低い潜在的オフターゲット効果^３７に基づいていた。ｓｇＲＮＡをＬｅｎｔｉＣＲＩＰＳＲｖ２プラスミドにクローニングした。使用したｓｇＲＮＡの配列は、ｓｇＭＹＣＮ：ＣＧＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＧ（配列番号１４８）およびｓｇＮＴ：ＣＣＧＣＧＣＣＧＴＴＡＧＧＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号１４９）；ｓｇＭＹＣ－１：ＣＡＴＣＴＣＣＧＴＡＴＴＧＡＧＴＧＣＧＡ（配列番号１５２）、ｓｇＭＹＣ－２：ＣＣＣＧＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣ、およびｓｇＮＴ：ＣＣＧＣＧＣＣＧＴＴＡＧＧＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号１５３）に対するものである。
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析

【0105】

ＲＴ－ＰＣＲ増幅を、Ｑ５ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して行った。ＡＢＩ－Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴ検出システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）を使用して、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）を含む９６ウェルプレートでｑＲＴ－ＰＣＲを行った。発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化した。使用したプライマーは、ＲＴ－ＭＹＣＮ－ｆｗ：ＧＡＧＡＣＡＣＣＣＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣ（配列番号１５０）およびＲＴ－ＭＹＣＮ－ＲＶ：ＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣ（配列番号１５１）であった。
細胞培養

【0106】

ＩＭＲ３２、ＬＡＮ５およびＳＫＮＡＳは、Ｄｒａ Ａｆｒｉｃａ Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｍｕｒｉｌｌｏ（マドリッドのニノ・ヘスス病院）から寄贈された。ＩＭＲ３２およびＬＡＮ５細胞をＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持し、ＳＫＮＡＳを、両方とも１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍｇ／ｍｌ抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。全ての細胞を、加湿インキュベータ中、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２雰囲気で３７℃で培養した。この研究で使用した全ての細胞株は、マイコプラズマ汚染について陰性であった。

【0107】

ＭＤＢ－ＨＴＢ－１８５細胞株を、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍｇ／ｍｌ抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＡｌｐｈａ ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。細胞を、加湿インキュベータ中、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２雰囲気で３７℃で培養した。この研究で使用した全ての細胞株は、マイコプラズマ汚染について陰性であった。
イムノアッセイ

【0108】

ＤＮＡ修復フォーカスを検出するために、形質導入細胞を、ポリ－Ｌ－リジン（Ｃｕｌｔｅｋ）でコーティングしたカバーガラス上に播種した。７２時間後、細胞をｄ－ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｃｉ）中、室温（ＲＴ）で１２分間固定し、ＰＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）で透過処理し、ＰＢＳ中３％正常ヤギ血清（ＮＧＳ；シグマ）で室温で１時間ブロックした。その後、サンプルを、１％ＮＧＳを補充したＰＢＳで希釈した抗Ｈ２ＡＸ抗体（１／５００；ＳＩＧＭＡ）と４℃で一晩インキュベートし、次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５９４コンジュゲート化二次抗体（１／５００；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）とＲＴで１時間インキュベートした。最後に、サンプルをＤＡＰＩ（Ｖｅｃｏｔｏｒ Ｌａｂｓ）で対比染色し、風乾し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）に封入した。５９４ｎｍ（赤チャネル、Ｈ２ＡＸ検出）および４０５ｎｍ（青色チャネル、核ＤＡＰＩ染色）で励起した２つのレーザーを備えたＬｅｉｃａ ＤＭ５５００Ｂ顕微鏡で画像を取得した。データを、１０２４×１０２４ピクセルの解像度で連続的に収集し、Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎ ｖ７．４ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して行われたすべての実験を表す。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）

【0109】

ＭＹＣＮ増幅ＦＩＳＨプローブ（Ｖｙｓｉｓ）を使用して、ＭＹＣＮ染色体増幅を検出した。５ｍｍの組織切片をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で再水和した。組織切片を２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ、ＤＡＫＯ）で前処理し、続いてペプシン消化（ＤＡＫＯ）した。脱水後、試料をＥＷＳＲ１／ＦＬＩ１プローブの存在下、６６℃で１０分間変性させ、ハイブリダイザー機（ＤＡＫＯ）中、３７℃で一晩放置してハイブリダイゼーションさせた。次いで、スライドを６３℃で２０×ＳＳＣ－Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液で洗浄し、蛍光封入剤（ＤＡＰＩ）に封入した。ＦＩＳＨシグナルは、組織全体にわたって二重融合シグナルを有する核の数を数えることによって手動でスコア化した。ＦＩＳＨ画像を、Ｚｙｔｏｖｉｓｉｏｎ画像解析システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｌｔｄ．、英国）を実行するＰＣに接続されたＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＳｅｎＳｙｓカメラ）を使用してキャプチャした。

【0110】

文献目録：
１．Ｒａｂｂｉｔｔｓ ＴＨ．Ｎａｔｕｒｅ ３７２，１４３－１４９（１９９４）．ＤＯＩ：１０．１０３８／３７２１４３ａ０．
２．Ｍｉｔｅｌｍａｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｅｌｍａｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．ＮＣＩ［ｏｎｌｉｎｅ］（２０１７）．
３．Ｍｉｔｅｌｍａｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００７；７（４）：２３３－２４５．
４．Ｌｉｃｈｔ ＪＤ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００９；３６０（９）：９２８－９３０．
５．Ｄｒｕｋｅｒ ＢＪ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ ＪＭｅｄ ２００１；３４４（１４）：１０３１－１０３７．
６．Ｂｏｒｄｅｎ ＥＣ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９，１９４１－１９５６（２００３）．ＰＭＩＤ：１２７９６３５６
７．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３６，４９２－５０３（２００４）．ＤＯＩ：１０．１０８０／０７８５３８９０４１００１８８０８
８．Ｍｒｏｚｅｋ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１８，１１５－３６（２００４）．ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０２６８－９６０Ｘ（０３）０００４０－７
９．Ｍｉｔｅｌｍａｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎ Ｃｈｒｏｍ＆Ｃａｎｃｅｒ ４３，３５０－６６（２００５）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｇｃｃ．２０２１２
１０．Ａｎｔｏｎｅｓｃｕ ＣＲ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ４８，１３－２１（２００６）．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－２５５９．２００５．０２２８５．ｘ
１１．Ｏｅｈｌｅｒ ＶＧ＆Ｒａｄｉｃｈ ＪＰ．Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．５，４２６－４３５（２００３）．ＰＭＩＤ：１２８９５３９６
１２．Ａｖｉｇａｄ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ １００，１０５３－１０５８（２００４）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｎｃｒ．２００５９
１３．Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０５，２６４０－２６５３（２００５）．ＤＯＩ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００４－０８－３０９７
１４．Ｋｅｒｎ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．５６，２８３－３０９（２００５）．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｒｉｔｒｅｖｏｎｃ．２００４．０６．００４
１５．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｇａｒｃｉａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ １，１０９－１９（２００１）．ＰＭＩＤ：１２１８８８８４
１６．Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔ Ｐｈａｒｍｃｏｌ ２７，２７３－８１（２００６）ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１７４５－７２５４．２００６．００２８２．ｘ
１７．Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ６０，１７４－１８２（２００５）．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２３９－００４－００４６－３
１８．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）．ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９
１９．Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ３，０３４０１（２０１４）．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０３４０１
２０．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３５（６）５４３－５５０（２０１７）．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８４３
２１．Ｐ．Ｍｏｈａｎｒａｊｕ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（２０１６）ａａｄ５１４７．
２２．Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（２０１６）ａａｆ５５７３．
２３．Ｊ．Ｓ．Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６（２０１７）４３８－４４２．
２４．Ｌ．Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １７０（２０１７）７１４－７２６ ｅ７１０．
２５．Ｌ．Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（２０１７）１２１－１３４ ｅ１１２．
２６．Ａ．Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６６（２０１７）３７３－３８３ ｅ３７３．
２７．Ａ．Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３８（２０１６）２７０－２７３．
２８．Ｄ．Ｂ．Ｔ．Ｃｏｘ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８（２０１７）１０１９－１０２７．
２９．Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５５０（２０１７）２８０－２８４．
３０．Ｘ．Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３１（２０１８）１７１－１８１．
３１．Ｓａｎｔａｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ｖｏｌｕｍｅ １０，５９－６４．
３２．Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ ＤＧ（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ２２：４４７－４５５．
３３．Ｓｃｈｗａｂ Ｍ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１９９８：２０（６）：４７３－４７９．
３４．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４；９（５）：ｅ９８２９３
３５．Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ．２０１３ Ｄｅｃ；４（６）：５６７－８２．
３６．Ｍｙｌｌｙｋａｎｇａｓ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １７：４２－５５．
３７．Ｄｏｅｎｃｈ Ｎ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｆｅｂ；３４（２）：１８４－１９１．
３８．Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ ＤＧ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００３ Ａｕｇ；３４（４）：３６９－７６．Ｒｅｖｉｅｗ．

【図1A-1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【配列表】

2022513368000001.app

【国際調査報告】