特表 2022-513407 ＮＨＥＪを介したゲノム編集のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(54)【発明の名称】ＮＨＥＪを介したゲノム編集のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 9/14 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20220131BHJP

   C12N 9/22 20060101ALN20220131BHJP

   C07K 14/715 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 100Z

C12N15/10 110Z

C12N15/12 ZNA

C12N15/54

C12N15/55

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

A61K35/28

A61K35/17 Z

A61K38/46

A61K48/00

A61P37/04

A61P43/00 105

C12N9/14

C12N9/10

C12N9/22

C07K14/715

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021548554

(86)(22)【出願日】2019-10-30

(85)【翻訳文提出日】2021-06-25

(86)【国際出願番号】 US2019058917

(87)【国際公開番号】W WO2020092611

(87)【国際公開日】2020-05-07

(31)【優先権主張番号】62/752,959

(32)【優先日】2018-10-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518192998

【氏名又は名称】クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフト

【氏名又は名称原語表記】ＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ

(71)【出願人】

【識別番号】507021757

【氏名又は名称】バイエル・ヘルスケア・エルエルシー

【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100165892

【弁理士】

【氏名又は名称】坂田 啓司

(72)【発明者】

【氏名】コスト，グレゴリー ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】ウエニシ，ジーン アイ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050DD07

4B050DD11

4B050LL01

4B065AA01Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA53

4C084CA56

4C084DC22

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB051

4C084ZB091

4C084ZB211

4C084ZC541

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB02

4C087ZB05

4C087ZB09

4C087ZB21

4C087ZC54

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA51

4H045EA20

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、相同性に依存しない機序による細胞中のゲノム編集、特に相同性に依存する機序による修復に必要な機構を欠く細胞中のゲノム編集のための組成物および方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

造血幹細胞（ＨＳＣ）中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸を前記ＨＳＣに導入することであって、前記標的遺伝子座が、前記ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、
（ｂ）二本鎖ドナー核酸を前記ＨＳＣに導入することであって、前記二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序によって前記標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記ＨＳＣが、長期生着ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）またはＳＣＩＤ再増殖細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＨＳＣが、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－を特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

Ｌｉｎ^－が、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上として特徴付けられる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

Ｌｉｎ^－が、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

静止Ｔ細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸を前記静止Ｔ細胞に導入することであって、前記標的遺伝子座が、前記ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、
（ｂ）二本鎖ドナー核酸を前記静止Ｔ細胞に導入することであって、前記二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序によって前記標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む、方法。

【請求項7】

前記静止Ｔ細胞が、非活性化Ｔ細胞である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ＨＤＲ欠損細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸を前記ＨＤＲ欠損細胞に導入することであって、前記標的遺伝子座が、前記ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、
（ｂ）二本鎖ドナー核酸を前記ＨＤＲ欠損細胞に導入することであって、前記二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序によって前記標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、
（ｃ）前記標的遺伝子座への前記二本鎖ドナー核酸の組込みに十分な時間、ＨＤＲ欠損細胞を培養することと、を含み、
ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、前記二本鎖ドナー核酸の挿入効率が少なくとも約４％であるように実行される、方法。

【請求項9】

前記二本鎖ドナー核酸の前記挿入効率が、少なくとも約８％である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記二本鎖ドナー核酸が、前記外因性核酸配列の第１の末端に隣接する前記ヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記二本鎖ドナー核酸が、前記外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記二本鎖ドナー核酸が、前記細胞への導入後、前記第２および／または第３の認識配列において切断される、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

前記二本鎖ドナー核酸が、前記切断された二本鎖ドナー核酸を前記標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座における前記ヌクレアーゼの認識配列が作成されず、前記切断された二本鎖ドナー核酸を前記標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、前記修飾された標的遺伝子座における前記ヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり、前記標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸における前記ヌクレアーゼの前記認識配列の各々が、プロトスペーサー配列である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法が、前記プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを前記細胞に導入することをさらに含む、方法。

【請求項15】

前記標的遺伝子座および前記ドナー核酸における前記プロトスペーサーを標的とするスペーサーを含むｇＲＮＡを、前記細胞に導入することを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記標的遺伝子座における前記プロトスペーサーが順配向にあり、前記二本鎖ドナー核酸における前記外因性核酸が順配向にあり、前記二本鎖ドナー核酸における前記プロトスペーサーが逆配向にある、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記標的遺伝子座および前記ドナー核酸における前記プロトスペーサーが同じである、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記標的遺伝子座および前記ドナー核酸における前記プロトスペーサーのうちの少なくとも１つが、前記ｇＲＮＡスペーサーに不完全に一致する遅延作用プロトスペーサー（ＤＡＰ）である、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項19】

前記ＤＡＰが、ｉ）前記ｇＲＮＡスペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド短い長さであり、かつ／またはｉｉ）前記ｇＲＮＡスペーサーとの少なくとも約１ヌクレオチドのミスマッチを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ドナー核酸における前記プロトスペーサーが、ＤＡＰであり、前記標的遺伝子座における前記プロトスペーサーが、前記ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する、請求項１８または１９に記載の方法。

【請求項21】

前記二本鎖ドナー核酸が、前記外因性核酸配列に隣接する２つのＤＡＰを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ドナー核酸における前記プロトスペーサーが、前記ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、前記標的遺伝子座における前記プロトスペーサーが、ＤＡＰである、請求項１８または１９に記載の方法。

【請求項23】

前記ＲＧＥＮが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ＲＧＥＮおよび前記１つ以上のｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を前記細胞に導入することを含む、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＲＧＥＮをコードするｍＲＮＡを前記細胞に導入することを含む、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記二本鎖ドナー核酸が、二本鎖ウイルスゲノムである、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記二本鎖ウイルスゲノムが、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＡＡＶゲノムが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ｓｃＡＡＶゲノムが、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ドナー核酸が前記細胞に導入される前に、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸が前記細胞に導入される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸が、前記ドナー核酸が前記細胞に導入される前の１時間以内に前記細胞に導入される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸が、前記ドナー核酸が前記細胞に導入される前の５分以内に前記細胞に導入される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記細胞が、低酸素条件下で培養される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞が、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸および前記ドナー核酸を前記細胞に導入する前に、約４８時間まで培養される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞が、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸および前記ドナー核酸を前記細胞に導入する前に、約２４時間まで培養される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記細胞が、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸および前記ドナー核酸を前記細胞に導入する前に、約２時間まで培養される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記細胞が、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ）、Ｊａｇｇｅｄ－１、Ｊａｇｇｅｄ－２、またはそれらのコンジュゲートである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、またはＤＬＬ４である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、Ｆｃ－ＤＬＬ１、Ｆｃ－ＤＬＬ３、Ｆｃ－ＤＬＬ４、Ｆｃ－Ｊａｇｇｅｄ－１、またはＦｃ－Ｊａｇｇｅｄ－２である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む、編集されたＨＳＣの個体における生着のための方法であって、
（ａ）前記標的遺伝子座において挿入された前記外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣの集団を含むＨＳＣの出力された集団を生成するために、前記個体から得られたＨＳＣの入力された集団に対して、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法を実行することと、
（ｂ）編集されたＨＳＣの前記集団を前記個体に投与して、前記編集されたＨＳＣが前記個体に生着するようにすることと、を含む、方法。

【請求項42】

前記個体における編集されたＨＳＣの生着の量が、相同性に依存する機序を使用して調製された対応する編集されたＨＳＣの生着の量と同じであるか、またはそれより多い、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記個体から得られたＨＳＣの前記入力された集団が、ＬＴ－ＨＳＣおよび短期生着ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）を含むＨＳＣの混合集団を含み、生着した編集されたＨＳＣの前記集団が、編集されたＬＴ－ＨＳＣを含む、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

編集されたＨＳＣの前記集団を前記個体に投与することは、ＨＳＣの前記出力された集団を前記個体に投与することを含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

請求項１～５および１０～４０のいずれか一項に記載のＨＳＣ中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法によって調製された、操作されたＨＳＣ。

【請求項46】

請求項６～７および１０～４０のいずれか一項に記載の静止Ｔ細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法によって調製された、操作された静止Ｔ細胞。

【請求項47】

対象の疾患または状態を治療する方法であって、前記疾患または状態が、機能性タンパク質の発現の欠損を特徴とし、請求項４５または４６に記載の操作された細胞を前記対象に投与することを含み、前記外因性核酸が、前記操作された細胞中で発現され得る前記タンパク質の機能的形態をコードする、方法。

【請求項48】

前記疾患または状態が、ＳＣＩＤであり、前記外因性核酸が、リンパ系の発達またはリンパ球の増殖および／もしくは代謝に関与する前記個体において変異した遺伝子の機能的形態を含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記外因性核酸が、機能的形態のＩＬ２Ｒｇ、ＲＡＧ１、ＩＬ７Ｒ、ＡＤＡ、またはＰＮＰをコードする、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記疾患または状態が、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ～ＩＸ型、または副腎白質ジストロフィーである、請求項４７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７５２，９５９号の優先権の利益を主張し、これは、任意の図面を含め、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

配列表の組込み
添付の配列表の内容は、ここで参照により本出願に組み込まれる。０５２９８４－５２８００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前の添付の配列表テキストファイルは、２０１９年１０月２８日に作成され、２４，９３２バイトである。

【0003】

本開示は、相同性に依存しない機序による細胞におけるゲノム編集のための組成物および方法に関する。さらに、例えば様々な疾患および状態の治療のために、そのような操作された細胞を使用する方法が提供される。

【背景技術】

【0004】

重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）は、リンパ系の発達に関連する遺伝子（例えば、ＩＬ２Ｒｇ、ＲＡＧ１、およびＩＬ７Ｒ）、またはリンパ球の増殖および代謝に関連する遺伝子（例えば、ＡＤＡおよびＰＮＰ）における変異によって最も一般的に引き起こされる稀な遺伝性障害である。この疾患の表現型は、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の欠如を特徴とし、したがって、感染症と闘うことができなくなる。

【0005】

現在、ＳＣＩＤの最も一般的な治療法は、十分に近い一致を見出すことができる人のための骨髄移植である。骨髄移植を受けた患者の８０％は生存するが、生涯にわたる免疫抑制に追いやられる。γレトロウイルスを用いた遺伝子療法が試みられたが、白血病の発生率が高いため、取組みが中止された。

【0006】

ＳＣＩＤ患者の大多数は、特定の遺伝子座に変異があり、既にＳＣＩＤのスクリーニングの一部になっている。一旦同定されると、患者の骨髄から造血幹細胞（ＨＳＣ）を採取して、遺伝子置換または遺伝子修正のいずれかによって、ＳＣＩＤの原因となる変異した遺伝子（複数可）の標的ゲノム編集を行うことができる。しかしながら、ＨＳＣにおける遺伝子編集のための現在の技法では、効果的な治療効果を生み出すのに十分な期間持続する、編集されたＨＳＣを産生することができない。したがって、ＨＳＣで使用するための改良された遺伝子編集技法が必要である。

【発明の概要】

【0007】

一態様では、本明細書で提供されるのは、造血幹細胞（ＨＳＣ）中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であり、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸をＨＳＣに導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、長期生着ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）またはＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－（系統陰性）／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。

【0008】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、静止Ｔ細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であり、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を静止Ｔ細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸を静止Ｔ細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、静止Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞である。

【0009】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＨＤＲ欠損細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であり、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相動性に依存しない機序によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、（ｃ）標的遺伝子座への二本鎖ドナー核酸の組込みに十分な時間、ＨＤＲ欠損細胞を培養することと、を含み、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、二本鎖ドナー核酸の挿入効率が少なくとも約４％であるように実行される。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸の挿入効率は、少なくとも約８％である。

【0010】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、細胞への導入後、第２および／または第３の認識配列において切断される。

【0011】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0012】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列であり、この方法は、プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、標的遺伝子座およびドナー核酸におけるプロトスペーサーを標的とするスペーサーを含むｇＲＮＡを、細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座におけるプロトスペーサーは順配向にあり、二本鎖ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座およびドナー核酸におけるプロトスペーサーは同じである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座およびドナー核酸におけるプロトスペーサーのうちの少なくとも１つは、ｇＲＮＡスペーサーに不完全に一致する遅延作用プロトスペーサー（ＤＡＰ）である。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｉ）ｇＲＮＡスペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド短い長さであり、かつ／またはｉｉ）ｇＲＮＡスペーサーとの少なくとも約１ヌクレオチドのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸におけるプロトスペーサーは、ＤＡＰであり、標的遺伝子座におけるプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列に隣接する２つのＤＡＰを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸におけるプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、標的遺伝子座におけるプロトスペーサーは、ＤＡＰである。

【0013】

いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮを採用する上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮを採用する上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、この方法は、ＲＧＥＮおよび１つ以上のｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に導入することを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮを採用する上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、この方法は、ＲＧＥＮをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。

【0017】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前の１時間以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前の５分以内に細胞に導入される。

【0018】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、細胞は、低酸素条件下で培養される。

【0019】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約４８時間まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約２４時間まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約２時間まで培養される。

【0020】

いくつかの実施形態では、上記のゲノム修飾のための方法のうちのいずれかに従い、細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ）、Ｊａｇｇｅｄ－１、Ｊａｇｇｅｄ－２、またはそれらのコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、またはＤＬＬ４である。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｆｃ－ＤＬＬ１、Ｆｃ－ＤＬＬ３、Ｆｃ－ＤＬＬ４、Ｆｃ－Ｊａｇｇｅｄ－１、またはＦｃ－Ｊａｇｇｅｄ－２である。

【0021】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣの個体における生着のための方法であり、（ａ）標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣの集団を含むＨＳＣの出力された集団を生成するために個体から得られたＨＳＣの入力された集団に対して、上記の実施形態のうちのいずれかによるゲノム修飾のための方法を実行することと、（ｂ）編集されたＨＳＣが個体に生着するように（例えば、編集されたＨＳＣが、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６週間、またはそれ以上のうちのいずれかにわたって個体において持続するように）、編集されたＨＳＣの集団を個体に投与することと、を含む。いくつかの実施形態では、個体における編集されたＨＳＣの生着の量は、相同性に依存する機序を使用して調製された対応する編集されたＨＳＣの生着の量と同じか、またはそれより多い。いくつかの実施形態では、個体から得られたＨＳＣの入力された集団は、ＬＴ－ＨＳＣおよび短期生着ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）を含むＨＳＣの混合集団を含み、生着した編集されたＨＳＣの集団は、編集されたＬＴ－ＨＳＣを含む。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣの集団を個体に投与することは、ＨＳＣの出力された集団を個体に投与することを含む。

【0022】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む標的遺伝子座、（ｂ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）外因性核酸配列を含む二本鎖ドナー核酸を含む、操作されたＨＳＣであり、二本鎖ドナー核酸は、相同性に依存しない機序によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ＬＴ－ＨＳＣまたはＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。

【0023】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、上記の実施形態のうちのいずれかによる、細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法によって調製された、操作されたＨＳＣである。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を入力されたＨＳＣに導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸を入力されたＨＳＣに導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序（例えば、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ＬＴ－ＨＳＣまたはＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。

【0024】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む標的遺伝子座、（ｂ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）外因性核酸配列を含む二本鎖ドナー核酸を含む、操作された静止Ｔ細胞であり、二本鎖ドナー核酸は、相同性に依存しない機序によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態では、静止Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞である。

【0025】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、上記の実施形態のうちのいずれかによる、細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法によって調製された、操作された静止Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を入力された静止Ｔ細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸を入力された静止Ｔ細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序（例えば、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、静止Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞である。

【0026】

いくつかの実施形態では、上記の操作された細胞のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、上記の操作された細胞のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0028】

いくつかの実施形態では、上記の操作された細胞のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列であり、操作された細胞は、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの各々別個の認識配列に特異的な１つ以上のｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、標的遺伝子座およびドナー核酸におけるプロトスペーサーを標的とするスペーサーを含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座におけるプロトスペーサーは順配向にあり、二本鎖ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座およびドナー核酸におけるプロトスペーサーは同じである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座およびドナー核酸におけるプロトスペーサーのうちの少なくとも１つは、ｇＲＮＡスペーサーに不完全に一致する遅延作用プロトスペーサー（ＤＡＰ）である。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｉ）ｇＲＮＡスペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド短い長さであり、かつ／またはｉｉ）ｇＲＮＡスペーサーとの少なくとも約１ヌクレオチドのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸におけるプロトスペーサーは、ＤＡＰであり、標的遺伝子座におけるプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列に隣接する２つのＤＡＰを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸におけるプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、標的遺伝子座におけるプロトスペーサーは、ＤＡＰである。

【0029】

いくつかの実施形態では、上記のＲＧＥＮを含む操作された細胞のうちのいずれかに従い、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。

【0030】

いくつかの実施形態では、上記のＲＧＥＮを含む操作された細胞のうちのいずれかに従い、操作された細胞は、ＲＧＥＮおよび１つ以上のｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、上記のＲＧＥＮを含む操作された細胞のうちのいずれかに従い、操作された細胞は、ＲＧＥＮをコードするｍＲＮＡを含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、上記の操作された細胞のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。

【0033】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象の疾患または状態を治療する方法であって、疾患または状態が、機能性タンパク質の発現の欠損を特徴とし、上記の実施形態のうちのいずれかに従って、操作された細胞を対象に投与することを含み、外因性核酸が、操作された細胞中で発現され得るタンパク質の機能的形態をコードする、方法である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、ＳＣＩＤであり、外因性核酸は、リンパ系の発達またはリンパ球の増殖および／もしくは代謝に関与する個体において変異した遺伝子の機能的形態を含む。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、ＩＬ２Ｒｇ、ＲＡＧ１、ＩＬ７Ｒ、ＡＤＡ、またはＰＮＰの機能的形態をコードする。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型～ＩＸ型、または副腎白質ジストロフィーである。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1A】Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの存在下または非存在下、示された濃度のｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ－ｐｓＳＣＲＡＭ－ＳＡ－Ｐ２Ａ－Ｈ２Ｂｊ－Ｖｅｎｕｓ－ＢＧＨｐＡ－ｐｓＳＣＲＡＭ（０カットベクタープラスミド）またはｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ－ｐｓＡＡＶＳ１－ＳＡ－Ｐ２Ａ－Ｈ２Ｂｊ－Ｖｅｎｕｓ－ＢＧＨｐＡ－ｐｓＳＣＲＡＭ（１カットベクタープラスミド）で処理されたＫ５６２細胞におけるＧＦＰ発現によって決定される、ＮＨＥＪを介した標的組込みの１４日目（Ｄ１４）にフローサイトメトリー結果を示し、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯは、ベクタープラスミド骨格であり、ｐｓＳＣＲＡＭは、ＰＡＭを有するスクランブルプロトスペーサー配列であり、ｐｓＡＡＶＳ１は、ゲノムＤＮＡ配列と同じプロトスペーサー配列であり、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰは、ＰＡＭで切断し、ＳＡは、スプライスアクセプターであり、Ｐ２Ａは、ペプチド切断シグナル配列であり、Ｈ２Ｂｊ－Ｖｅｎｕｓは、核中のＧＦＰを安定化するヒストンＨ２Ｂに融合された修飾ＧＦＰであり、ＢＧＨｐＡは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列である。

【図1B】７日目（Ｄ７）および１４日目（Ｄ１４）における図１Ａのフローサイトメトリー研究の定量化を示す。

【図2】Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの存在下または非存在下、Ｋ５６２細胞における示された濃度での０カットベクタープラスミドまたは１カットベクタープラスミドの標的ドナー組込みのＰＣＲ分析を示す。

【図3A】ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、またはＨＤＲおよびＮＨＥＪの両方による活性化Ｔ細胞への標的組込みのフローサイトメトリーの結果を示す。

【図3B】図３Ａのフローサイトメトリー研究の定量化を示す。

【図4】それぞれＨＤＲドナー、ｓｃＡＡＶ６ ２カットＮＨＥＪドナー、または両方を送達するＡＡＶ６を利用することによって、ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、またはＨＤＲおよびＮＨＥＪの両方による標的組込みを伴う活性化Ｔ細胞のＣＤ４／ＣＤ８分布のフローサイトメトリー結果を示す。

【図5A】それぞれＨＤＲドナー、ｓｃＡＡＶ６ ２カットＮＨＥＪドナー、または両方を送達するＡＡＶ６を利用することによって、ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、またはＨＤＲおよびＮＨＥＪの両方による非活性化Ｔ細胞への標的組込みのフローサイトメトリー結果を示す。

【図5B】図５Ａのフローサイトメトリー研究の定量化を示す。

【図5C】ＮＨＥＪによる標的組込みを伴う非活性化Ｔ細胞のＣＤ４／ＣＤ８分布のフローサイトメトリー結果を示す。

【図6】プロトコル１またはプロトコル２を使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みのフローサイトメトリーの結果を示す。

【図7A】プロトコル１またはプロトコル２を使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みのフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図7B】ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを有する２人の異なるドナーからのヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みのフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図8A】プロトコル１またはプロトコル２を使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みの絶対細胞性を示す。

【図8B】ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを有する２人の異なるドナーからのヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みの絶対細胞性を示す。

【図9A】Ｄ１で編集した場合の、プロトコル１またはプロトコル２を使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、２日目（Ｄ２）、３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）、および５日目（Ｄ５）のフローサイトメトリーの結果を示す。

【図9B】Ｄ１で編集した場合の、プロトコル１またはプロトコル２を使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５でのフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図9C】Ｄ１で編集した場合の、プロトコル１またはプロトコル２を使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５での絶対細胞性を示す。

【図9D】Ｄ１で編集した場合の、プロトコル１またはプロトコル２を使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについてのＤ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５での相対細胞性を示す。

【図10A】Ｄ１でＳＦＥＭ ＩＩ培地中で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５でのフローサイトメトリー結果を示す。

【図10B】ＳＣＧＭ培地で編集した場合の、Ｄ１でのヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５でのフローサイトメトリー結果を示す。

【図11A】低酸素または正常酸素条件下、ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５でのフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図11B】低酸素または正常酸素条件下、ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５での絶対細胞性を示す。

【図11C】低酸素または正常酸素条件下、ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みのＤ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５での相対細胞性を示す。

【図11D】低酸素または正常酸素条件下、ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５でのＧＦＰ^＋およびｅＧＦＰ^－集団中のＣＤ３４^＋：ＣＤ３４^－細胞の比を示す。

【図12A】ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＤ１またはＤ２で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５でのフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図12B】ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＤ１またはＤ２で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５での絶対細胞性を示す。

【図12C】ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＤ１またはＤ２で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５での相対細胞性を示す。

【図13】ｓｃＡＡＶ６ ２カットドナーを用いてＨ１（時間１）またはＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４でのフローサイトメトリー結果の定量化および相対細胞性を示す。

【図14A】ＲＮＰ Ｌｏｎｚａ ４－ＤヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００またはＲＮＰ Ｌｏｎｚａ ４－ＤヌクレオフェクションプロトコルＣＡ－１３７を使用してＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２でのフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図14B】ＲＮＰ Ｌｏｎｚａ ４－ＤヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００またはＲＮＰ Ｌｏｎｚａ ４－ＤヌクレオフェクションプロトコルＣＡ－１３７を使用してＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２での絶対細胞性を示す。

【図14C】ＲＮＰ Ｌｏｎｚａ ４－ＤヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００またはＲＮＰ Ｌｏｎｚａ ４－ＤヌクレオフェクションプロトコルＣＡ－１３７を使用してＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２での相対細胞性を示す。

【図15】ＳｐｙＦｉ Ｃａｓ９またはＧｅｎｅＡｒｔ Ｃａｓ９を使用してＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みのフローサイトメトリー結果の定量化、絶対細胞性、および相対細胞性を示す。

【図16】少量（＋）または大量（＋＋＋）のＲＮＰと少量（＋）または大量（＋＋＋）のＡＡＶを使用してＤ１で編集した場合の、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みのフローサイトメトリー結果の定量化、絶対細胞性、および相対細胞性を示す。

【図17】Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの存在下または非存在下、ＣＤ３４^＋細胞において５０００ｖｐ／細胞でＡｄ５／３５によって送達された２カットドナーの標的ドナー組込みのＰＣＲ分析を示す。

【図18A】Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ（ＴｅｎＣ）、Ｆｃ－ＤＬＬ１（ＤＬＬ１）、またはＴｅｎａｓｃｉｎ Ｃ＋Ｆｃ－ＤＬＬ１コーティング上で、またはコーティングなしで培養されたｓｃＡＡＶ６ ０カットドナーを使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ２でのフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図18B】Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ（ＴｅｎＣ）、Ｆｃ－ＤＬＬ１（ＤＬＬ１）、またはＴｅｎａｓｃｉｎ Ｃ＋Ｆｃ－ＤＬＬ１コーティング上で、またはコーティングなしで培養されたｓｃＡＡＶ６ ０カットドナーを使用した、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みについて、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３でのＣＤ３４^＋／ＣＤ９０^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ４５ＲＡ^－細胞の絶対細胞性を示す。

【図19】ｓｃＡＡＶ６ ０カットまたはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入されたマウスの末梢血からの、０、６、９、１３、および１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞（上のパネル）およびＧＦＰ^＋細胞（下のパネル）のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図20A】ｓｃＡＡＶ６ ０カットまたはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入されたマウスの骨髄からの、１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞（上のパネル）およびＧＦＰ^＋細胞（下のパネル）のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図20B】ｓｃＡＡＶ６ ０カットまたはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ１において注入された後１６週目のマウス骨髄からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ｈＣＤ３４^＋、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量を示す。

【図21】ｓｃＡＡＶ６ ０カットまたはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１（新鮮な解凍）のＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋の、Ｄ２におけるＧＦＰ^＋／ＣＤ３４^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図22A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの８週目のｈＣＤ４５^＋細胞について、フローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図22B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＤ１における注入、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＨ２における注入後８週目におけるマウスの末梢血からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量を示す。

【図22C】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの８週目のｈＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図22D】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの８週目の総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図23A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１０週目のｈＣＤ４５^＋細胞について、フローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図23B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＤ１における注入、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＨ２における注入後１０週目におけるマウスの末梢血からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量を示す。

【図23C】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１０週目のｈＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図23D】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１０週目の総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図24A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１２週目のｈＣＤ４５^＋細胞について、フローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図24B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＤ１における注入、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＨ２における注入後１２週目におけるマウスの末梢血からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量を示す。

【図24C】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１２週目のｈＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図24D】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１２週目の総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図25A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１４週目のｈＣＤ４５^＋細胞について、フローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図25B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＤ１における注入、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＨ２における注入後１４週目におけるマウスの末梢血からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量を示す。

【図25C】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１４週目のｈＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図25D】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１４週目の総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図26A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞について、フローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図26B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＤ１における注入、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＨ２における注入後１６週目におけるマウスの末梢血からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量を示す。

【図26C】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図26D】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの１６週目の総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図27A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの骨髄からの１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞について、フローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図27B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＤ１における注入、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞のＨ２における注入後１６週目におけるマウスの骨髄からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量を示す。

【図28A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの骨髄からの１６週目のＣＤ３４^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図28B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの骨髄からの１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図28C】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの骨髄からの１６週目の総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞のフローサイトメトリー結果の定量化を示す。

【図29A】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からのｈＣＤ４５^＋血細胞の時間経過を示す。

【図29B】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からのｈＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞の時間経過を示す。

【図29C】ｉ）ｓｃＡＡＶ６ ０カットもしくはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入された、またはｉｉ）ｓｃＡＡＶ６ ２カット（新鮮な解凍）のＮＨＥＪを介した標的組込みによってＨ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＨ２において注入されたマウスの末梢血からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとして、ＧＦＰ^＋細胞の時間経過を示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

出願人は、相同性指向修復（ＨＤＲ）を十分に行わない細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のためのシステムおよび方法を発見した。特に、出願人は、長期生着造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）および静止（休止）Ｔ細胞を含む他の静止細胞における改善された編集、ならびに操作された細胞を作製し、使用する方法、およびそのような方法に有用な組成物を実証した。

【0036】

以前のデータは、ＨＤＲを受けるＨＳＣは、長期生着の可能性を失ったものであり、修正されたＨＳＣが疾患の永続的な治療的修正を不可能にすることを示した。逆に、長期生着の可能性を保持しているＨＳＣは分裂しないため、ＨＤＲを効率的に受けない。対照的に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、ＬＴ－ＨＳＣなどの静止細胞を含むすべての細胞型で作動するＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機序である。出願人は、この経路を操作して、静止ＬＴ－ＨＳＣおよび静止Ｔ細胞における導入遺伝子の標的組込みを媒介し、編集された細胞の長期生着および導入遺伝子の持続的発現を可能にすることを発見した。例えば、ヒトＣＤ３４^＋細胞は、インビボドナー切断のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９認識部位とのＮＨＥＪを介した組込みに二本鎖ドナーテンプレートを採用して、ＧＦＰ発現カセットを内因性ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座に標的組込みするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して編集された。編集された細胞を注入されたマウスでは、末梢出血からのｈＣＤ４５^＋細胞の割合としてのＧＦＰ^＋細胞の量は、注入後１６週目まで安定しており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ＬＴ－ＨＳＣを編集することができ、編集されたＬＴ－ＨＳＣが、治療用途に役立つのに十分な時間にわたって生着および持続可能であったことを実証した。このプラットフォーム技術により、異種核酸の標的遺伝子修正または挿入を、ＬＴ－ＨＳＣ中でそれらの生着の可能性を失うことなく実施することができ、これらの編集されたＨＳＣの治療用途での使用を可能にする。

【0037】

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で参照されるすべての特許、出願、公開された出願、および他の刊行物は、特に明記しない限り、それら全体が参照により明示的に組み込まれる。本明細書の用語に複数の定義がある場合、特に明記しない限り、このセクションの定義が優先する。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。

【0039】

「約」は、明細書に照らして読むと、その平易かつ通常の意味を持ち、例えば、測定可能な値を指すときに使用することができ、指定値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、およびなおもより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し得る。

【0040】

本明細書で使用される場合、「タンパク質配列」は、タンパク質の一次構造であるアミノ酸のポリペプチド配列を指す。本明細書で使用される場合、「上流」は、ポリヌクレオチド上の位置の５′位、およびポリペプチド上の位置のＮ末端に向かう位置を指す。本明細書で使用される場合、「下流」は、ヌクレオチド上の位置の３′位、およびポリペプチド上の位置のＣ末端に向かう位置を指す。したがって、「Ｎ末端」という用語は、ポリペプチド上の位置のＮ末端に向かうポリヌクレオチド上の要素または場所の位置を指す。

【0041】

「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるフラグメント、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のうちのいずれかによって生成されるフラグメントを指す。核酸分子は、天然型ヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）であるモノマー、または天然型ヌクレオチドの類似体（例えば、天然型ヌクレオチドのエナンチオマー形態）、または両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に改変を有する可能性がある。糖修飾には、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による置換が含まれるか、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的かつ電子的に類似した構造に置き換えることができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって結合することができる。ホスホジエステル結合の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート等が含まれる。「核酸分子」という用語はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含み、これはポリアミド骨格に結合した天然型または修飾型核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。

【0042】

「コーディング」または「エンコーディング」は、本明細書で使用され、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の特性を指し、定義されたアミノ酸配列などの他の高分子の合成のためのテンプレートとして役立つ。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生体系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。

【0043】

「ポリペプチドをコードする核酸配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が提供され、ここで核酸は、融合タンパク質をコードする。

【0044】

「ベクター」、「発現ベクター」、「ドナー」、または「構築物」は、細胞内で異種核酸の発現を提供するための調節エレメントを有する細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸である。ベクターには、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母、またはウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌系におけるタンパク質発現のためのものである。本明細書で使用される場合、「発現」または「タンパク質発現」という用語は、転写されたＲＮＡ分子のタンパク質分子への翻訳を指す。タンパク質の発現は、その時間的、空間的、発達的、または形態学的な性質、ならびに定量的または定性的な兆候を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質は、タンパク質がリガンドの存在下で二量体化のために位置付けられるように発現される。

【0045】

本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子、例えば、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写および／または翻訳に影響を与える能力を有するものを指す。プロモーター、リーダー、イントロン、および転写終結領域などの調節エレメントは、遺伝子調節活性を有し、生細胞における遺伝子の全体的な発現に不可欠な役割を果たすＤＮＡ分子である。したがって、植物において機能するプロモーターなどの単離された調節要素は、遺伝子工学の方法を通じて植物の表現型を修飾するのに有用である。

【0046】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、第２の分子に接合された第１の分子を指し、分子は、第１の分子が第２の分子の機能に影響を与えるように配置される。２つの分子は、単一の連続する分子の一部であり得、隣接し得る。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節する場合、プロモーターは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されている。

【0047】

「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近く、同じ鎖上、およびＤＮＡの上流（センス鎖の５′領域）に位置し得る。プロモーターは、条件付き、誘導性、または構成的プロモーターであり得る。プロモーターは、細菌、哺乳動物、または昆虫細胞のタンパク質発現に特異的であり得る。融合タンパク質をコードする核酸が提供されるいくつかの実施形態では、核酸は、プロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌、哺乳動物、または昆虫細胞のタンパク質発現に特異的である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、条件付き、誘導性、または構成的プロモーターである。

【0048】

本明細書で使用される場合、「対象」は、治療、観察、または実験の対象である動物を指す。「動物」は、魚、甲殻類、爬虫類、特に哺乳類などの冷血および温血の脊椎動物および無脊椎動物を含む。「哺乳類」は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類（サル、チンパンジー、類人猿など）、特にヒトを含む。いくつかの代替例では、対象は、ヒトである。

【0049】

ＮＨＥＪを介したゲノム編集のためのシステム
一態様では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸の標的組込みを含む操作された細胞（例えば、ＬＴ－ＨＳＣなどの操作された造血幹細胞）を生成するためのシステムであり、外因性核酸は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に挿入される。このシステムは、ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸（ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む標的遺伝子座でのゲノム編集を媒介することができる）、およびｂ）二本鎖ドナー核酸（二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される）を含む。いくつかの実施形態では、システムは、編集されるセルをさらに含む。とりわけ、エクスビボゲノム編集を採用して、機能的標的タンパク質欠損に関連する障害または健康状態を有するか、または有すると疑われる対象を治療するためのシステムも提供される。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、標的細胞における標的タンパク質の機能的欠損（例えば、標的タンパク質の発現および／または活性の欠損）に起因する疾患を有し、システムは、標的細胞またはその前駆体におけるゲノム編集を媒介することができ、疾患が治療されるように、対象におけるゲノム編集細胞またはそれらの子孫における標的タンパク質またはその機能的誘導体の十分な発現を可能にする。いくつかの実施形態では、標的細胞またはその前駆体は、エクスビボで編集され、対象に投与される。

【0050】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を含む本明細書に記載のシステムのうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの第２の認識配列は、外因性核酸配列の第１の末端に直接隣接するか、または約５塩基以上（例えば、約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００塩基、もしくはそれ以上のうちのいずれか）外因性核酸配列の最初の末端から離れている。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの第３の認識配列は、外因性核酸配列の第２の末端に直接隣接するか、または約５塩基以上（例えば、約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００塩基、もしくはそれ以上のうちのいずれか）外因性核酸配列の第２の末端から離れている。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0051】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を含む本明細書に記載のシステムのうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスＲＮＡゲノムのｄｓＤＮＡ中間体）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスゲノムは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスゲノムである。

【0052】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を含む本明細書に記載のシステムのうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、システムは、標的遺伝子座における第１の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができるｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における１つ以上の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができる。いくつかの実施形態では、システムは、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む。いくつかの実施形態では、システムは、ＲＧＥＮをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を含む本明細書に記載のシステムのうちのいずれかに従い、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列である。いくつかの実施形態では、システムは、プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーの各々は同じであり、システムは、プロトスペーサー配列を標的とする１つのｇＲＮＡを含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムは、ｉ）第１のプロトスペーサーを含む第１の核酸、およびｉｉ）スペーサーを含むｇＲＮＡを含み、第１のプロトスペーサーは、スペーサーに対する不完全な一致であり、第１のプロトスペーサーがスペーサーに一致する程度は、第１のプロトスペーサーにおける第１の核酸の修飾を可能にするのに十分である。対応するｇＲＮＡに関連するそのようなプロトスペーサーは、本明細書では「遅延作用プロトスペーサー」または「ＤＡＰ」とも称される。そのようなシステムは、ＤＡＰとスペーサーとの間の一致の程度を変えることによって、第１のプロトスペーサーにおける第１の核酸の、ＲＧＥＮを介した切断の一時的な制御を可能にする。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）だけ長さが短い。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーとの少なくとも約１（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）ヌクレオチドミスマッチを含む。例えば、ｇＲＮＡは、配列番号８のポリヌクレオチド配列からのスペーサーを含み得、第１のプロトスペーサーは、配列番号１６～２８のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列からのプロトスペーサーを含み得る。いくつかの実施形態では、システムは、第２のプロトスペーサーを含む第２の核酸をさらに含み、第２のプロトスペーサーは、スペーサーに完全に一致する。例えば、ｇＲＮＡは、配列番号８のポリヌクレオチド配列からのスペーサーを含み得、第２のプロトスペーサーは、配列番号９のポリヌクレオチド配列からのプロトスペーサーを含み得る。そのようなシステムは、単一のｇＲＮＡを使用してそれぞれのプロトスペーサーでの第１および第２の核酸の、ＲＧＥＮを介した切断の異なる時間的プロファイルを可能にし、ｇＲＮＡスペーサーに不完全に一致する第１のプロトスペーサーでの第１の核酸の切断の開始と比較して、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する第２のプロトスペーサーでの第２の核酸の切断の開始がより速い。

【0055】

標的部位の切断の一時的な制御を容易にするための、標的核酸またはドナーテンプレートなどの核酸におけるＤＡＰの存在には、いくつかの利点がある。一つには、そのような核酸にＤＡＰが存在することにより、異なる時間に投与される各遺伝子座に複数のｇＲＮＡを必要とせずに、複数の遺伝子座における標的部位の切断の一時的な制御が可能になる。これにより、ゲノム編集システムを比較的少ないスペースに被包することができ、使用するｇＲＮＡの数が少なくなるため、オフターゲット効果の可能性が低くなる。本開示の実施形態のさらなる利点は、当業者には明らかであろう。

【0056】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムのうちのいずれかに従い、システムは、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、システムは、標的遺伝子座を含む細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、相同性指向修復（ＨＤＲ）に必要な機構を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞は、長期生着造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）などの造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、静止Ｔ細胞である。

【0057】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムのうちのいずれかに従い、システムは、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、システムは、標的遺伝子座を含む細胞をさらに含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムのうちのいずれかに従い、システムは、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、システムは、標的遺伝子座を含む細胞をさらに含む。

【0059】

ＮＨＥＪを介したゲノム編集の方法
一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であり、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞におけるゲノム修飾の方法のうちのいずれかに従い、細胞は、相同性指向修復（ＨＤＲ）に必要な機構を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞は、長期生着造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）などの造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、静止Ｔ細胞である。

【0061】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を採用する本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、細胞への導入後、第２および／または第３の認識配列において切断される。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0062】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を採用する本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスＲＮＡゲノムのｄｓＤＮＡ中間体）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスゲノムは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスゲノムである。

【0063】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を採用する本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、この方法は、標的遺伝子座における第１の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができるｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における１つ以上の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。

【0064】

いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を採用する本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従い、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列である。いくつかの実施形態では、この方法は、プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーの各々は同じであり、この方法は、プロトスペーサー配列を標的とする１つのｇＲＮＡを細胞に導入することを含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸を細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｇＲＮＡスペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）だけ長さが短い。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｇＲＮＡスペーサーとの少なくとも約１（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）ヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、細胞は、相同性指向修復（ＨＤＲ）に必要な機構を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞は、ＬＴ－ＨＳＣなどのＨＳＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、静止Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。

【0066】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸を細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0067】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸を細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0068】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のゲノム修飾の方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前の１時間以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前の５分以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入することは、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0069】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のゲノム修飾の方法のうちのいずれかに従い、この方法は、ドナー核酸が細胞に導入される前に、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ドナー核酸が細胞に導入される前の１時間以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ドナー核酸が細胞に導入される前の５分以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0070】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のゲノム修飾の方法のうちのいずれかに従い、細胞は、低酸素条件下で培養される。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のゲノム修飾の方法のうちのいずれかに従い、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約４８時間まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約２４時間まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約２時間まで培養される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入することは、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0072】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のゲノム修飾の方法のうちのいずれかに従い、細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ）、Ｊａｇｇｅｄ－１、Ｊａｇｇｅｄ－２、またはそれらのコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、またはＤＬＬ４である。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｆｃ－ＤＬＬ１、Ｆｃ－ＤＬＬ３、Ｆｃ－ＤＬＬ４、Ｆｃ－Ｊａｇｇｅｄ－１、またはＦｃ－Ｊａｇｇｅｄ－２である。

【0073】

一態様では、本明細書で提供されるのは、ＨＳＣ中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であり、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸をＨＳＣに導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、長期生着ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）またはＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。

【0074】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸をＨＳＣ中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、ＨＳＣゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰをＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸をＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。

【0075】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸をＨＳＣ中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、ＨＳＣゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0076】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸をＨＳＣ中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、ＨＳＣゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0077】

一態様では、本明細書で提供されるのは、静止Ｔ細胞内の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であり、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を静止Ｔ細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸を静止Ｔ細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、静止Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞である。

【0078】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸を静止Ｔ細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、静止Ｔ細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を静止Ｔ細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを静止Ｔ細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を静止Ｔ細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。

【0079】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸を静止Ｔ細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、静止Ｔ細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を静止Ｔ細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0080】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸を静止Ｔ細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、静止Ｔ細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を静止Ｔ細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0081】

一態様では、本明細書で提供されるのは、ＨＤＲ欠損細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法であり、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、二本鎖ドナー核酸の標的遺伝子座への組み込みに十分な時間、ＨＤＲ欠損細胞を培養することをさらに含み、ステップは、二本鎖ドナー核酸の挿入効率が少なくとも約４％（例えば、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上のうちのいずれか）であるように実行される。いくつかの実施形態では、ＨＤＲ欠損細胞は、分裂しておらず、複製しておらず、したがって、ＨＤＲの機構を発現していない任意の細胞型である。

【0082】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸をＨＤＲ欠損細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、ＨＤＲ欠損細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰをＨＤＲ欠損細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。

【0083】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸をＨＤＲ欠損細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、ＨＤＲ欠損細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0084】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、外因性核酸をＨＤＲ欠損細胞中の標的遺伝子座に組み込むための方法であり、ＨＤＲ欠損細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＤＲ欠損細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0085】

操作された細胞
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、標的染色体遺伝子座において組み込まれた外因性核酸配列を含む、操作された哺乳動物細胞（例えば、ＨＳＣ、Ｔ細胞）などの操作された細胞であり、外因性核酸配列は、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に組み込まれている。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、本明細書に記載のゲノム編集の方法のうちのいずれかによって産生される。「操作された細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。変異または環境の影響のいずれかにより、特定の修飾が次の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。

【0086】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む標的遺伝子座、（ｂ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）外因性核酸配列を含む二本鎖ドナー核酸を含む操作された細胞（例えば、ＬＴ－ＨＳＣなどのＨＳＣ、もしくは静止Ｔ細胞などのＴ細胞）であって、二本鎖ドナー核酸は、相同性に依存しない機序（例えば、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される。

【0087】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかによる、細胞中の標的遺伝子座におけるゲノム修飾のための方法によって調製された、操作された細胞（例えば、ＬＴ－ＨＳＣなどのＨＳＣ、または静止Ｔ細胞などのＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を入力された細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸を入力された細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、相同性に依存しない機序（例えば、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、細胞は、相同性指向修復（ＨＤＲ）に必要な機構を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞は、長期生着造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）などの造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、静止Ｔ細胞である。

【0089】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0090】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスＲＮＡゲノムのｄｓＤＮＡ中間体）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスゲノムは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスゲノムである。

【0091】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、標的遺伝子座における第１の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができるｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における１つ以上の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＲＧＥＮをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。

【0092】

いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーの各々は同じであり、操作された細胞は、プロトスペーサー配列を標的とする１つのｇＲＮＡを含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、ｉ）第１のプロトスペーサーを含む第１の核酸、およびｉｉ）スペーサーを含むｇＲＮＡを含み、第１のプロトスペーサーは、スペーサーに不完全に一致するＤＡＰであり、第１のプロトスペーサーがスペーサーに一致する程度は、第１のプロトスペーサーにおける第１の核酸の修飾を可能にするのに十分である。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）だけ長さが短い。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーとの少なくとも約１（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）ヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、第２のプロトスペーサーを含む第２の核酸をさらに含み、第２のプロトスペーサーは、スペーサーに完全に一致する。

【0094】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、操作された細胞は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される操作された細胞中の標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、相同性指向修復（ＨＤＲ）に必要な機構を欠いている。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＬＴ－ＨＳＣなどのＨＳＣである。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、静止Ｔ細胞である。

【0095】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、操作された細胞は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される操作された細胞中の標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0096】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかに従い、操作された細胞は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される操作された細胞中の標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0097】

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＨＳＣであり、ＬＴ－ＨＳＣおよび短期生着ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）、例えばＣＤ３４^＋であるが、ＣＤ９０^＋／^－、ＣＤ３８^＋／^－、および／またはＣＤ４５ＲＡ^＋／^－ではないＨＳＣの両方を含む。

【0098】

ＨＳＣは、既知の技法に従って収集し、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択などの抗体への親和性結合などの既知の技法によって濃縮または枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、患者から得られた自己ＨＳＣである。

【0099】

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、Ｔ細胞、またはＴ細胞に分化することができる前駆体細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、および／またはＣＤ４^＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞傷害性リンパ球細胞であり、これはナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、中央記憶ＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクター記憶ＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはバルクＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み得る。

【0100】

リンパ球（Ｔリンパ球）は、既知の技法に従って収集し、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択などの抗体への親和性結合などの既知の技法によって濃縮または枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、患者から得られた自己Ｔ細胞である。

【0101】

本開示はさらに、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように操作された細胞を含む組成物を提供する。

【0102】

操作された細胞の生着方法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、個体の標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを生着させる方法であり、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかによる編集されたＨＳＣの集団を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６週間、またはそれ以上のうちのいずれかにわたって個体において持続する。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣの集団は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って調製される。いくつかの実施形態では、個体における編集されたＨＳＣの生着の量は、相同性に依存する機序を使用して調製された対応する編集されたＨＳＣの生着の量と同じか、またはそれより多い。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣの集団は、個体から得られたＨＳＣの入力された集団に由来するＨＳＣの出力された集団に含まれる。いくつかの実施形態では、個体から得られたＨＳＣの入力された集団は、ＬＴ－ＨＳＣおよびＳＴ－ＨＳＣを含むＨＳＣの混合集団を含み、生着する編集されたＨＳＣの集団は、編集されたＬＴ－ＨＳＣを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＳＣの出力された集団を個体に投与することを含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体の標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを生着させる方法のうちのいずれかに従い、編集されたＨＳＣは、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸をＨＳＣに導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む方法によって調製される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、長期生着造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。

【0104】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体の標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを生着させる方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、細胞への導入後、第２および／または第３の認識配列において切断される。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0105】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体の標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを生着させる方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスＲＮＡゲノムのｄｓＤＮＡ中間体）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスゲノムは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスゲノムである。

【0106】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体の標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを生着させる方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣを調製する方法は、標的遺伝子座における第１の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができるｇＲＮＡをＨＳＣに導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における１つ以上の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができる。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣを調製する方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）をＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣを調製する方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸をＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。

【0107】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体の標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを生着させる方法のうちのいずれかに従い、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列である。いくつかの実施形態では、編集されたＨＳＣを調製する方法は、プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡをＨＳＣに導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーの各々は同じであり、この方法は、プロトスペーサー配列を標的とする１つのｇＲＮＡを細胞に導入することを含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、ＨＳＣゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、この方法は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｇＲＮＡスペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）だけ長さが短い。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｇＲＮＡスペーサーとの少なくとも約１（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）ヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰをＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸をＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。

【0109】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、ＨＳＣゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、この方法は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0110】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、ＨＳＣゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、この方法は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸をＨＳＣに導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0111】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸がＨＳＣに導入される前にＨＳＣに導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸がＨＳＣに導入される前の１時間以内にＨＳＣに導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸がＨＳＣに導入される前の５分以内にＨＳＣに導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸をＨＳＣに導入することは、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰをＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0112】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、この方法は、ドナー核酸がＨＳＣに導入される前に、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰをＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ドナー核酸がＨＳＣに導入される前の１時間以内にＨＳＣに導入される。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ドナー核酸がＨＳＣに導入される前の５分以内にＨＳＣに導入される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0113】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、ＨＳＣは、低酸素条件下で培養される。

【0114】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、ＨＳＣは、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸をＨＳＣに導入する前に、約４８時間まで培養される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸をＨＳＣに導入する前に、約２４時間まで培養される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸をＨＳＣに導入する前に、約２時間まで培養される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸をＨＳＣに導入することは、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰをＨＳＣに導入することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0115】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個体において編集されたＨＳＣを生着させる方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集されたＨＳＣを調製する方法のうちのいずれかに従い、ＨＳＣは、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ）、Ｊａｇｇｅｄ－１、Ｊａｇｇｅｄ－２、またはそれらのコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、またはＤＬＬ４である。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｆｃ－ＤＬＬ１、Ｆｃ－ＤＬＬ３、Ｆｃ－ＤＬＬ４、Ｆｃ－Ｊａｇｇｅｄ－１、またはＦｃ－Ｊａｇｇｅｄ－２である。

【0116】

治療の方法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象における疾患または状態を治療する方法であり、疾患または状態は、対象に、タンパク質の機能的形態を発現するための本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って編集された細胞を投与することを含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、疾患は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）であり、この方法は、対象において変異したタンパク質の機能的形態を発現するように、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って編集されたＨＳＣの集団を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、リンパ系の発達に関与するタンパク質、例えば、ＩＬ２Ｒｇ、ＲＡＧ１、またはＩＬ７Ｒを発現するように編集される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、リンパ球の増殖および／または代謝に関与するタンパク質、例えば、ＡＤＡまたはＰＮＰを発現するように編集される。いくつかの実施形態では、疾患は、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型～ＩＸ型、または副腎白質ジストロフィーである。

【0118】

いくつかの実施形態では、疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法のうちのいずれかに従い、編集された細胞は、（ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入することであって、標的遺伝子座が、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む、導入することと、（ｂ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することであって、二本鎖核酸が、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される、導入することと、を含む方法によって調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、相同性指向修復（ＨＤＲ）に必要な機構を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞は、長期生着造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）などの造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、静止Ｔ細胞である。

【0119】

いくつかの実施形態では、疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、細胞への導入後、第２および／または第３の認識配列において切断される。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0120】

いくつかの実施形態では、疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスＲＮＡゲノムのｄｓＤＮＡ中間体）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスゲノムは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスゲノムである。

【0121】

いくつかの実施形態では、それを必要とする対象における疾患または状態を治療する方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、編集された細胞を調製する方法は、標的遺伝子座における第１の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができるｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における１つ以上の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができる。いくつかの実施形態では、編集された細胞を調製する方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、編集された細胞を調製する方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。

【0122】

いくつかの実施形態では、疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法のうちのいずれかに従い、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列である。いくつかの実施形態では、編集された細胞を調製する方法は、プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーの各々は同じであり、この方法は、プロトスペーサー配列を標的とする１つのｇＲＮＡを細胞に導入することを含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、細胞ゲノムは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを含み、この方法は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｇＲＮＡスペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）だけ長さが短い。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、ｇＲＮＡスペーサーとの少なくとも約１（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）ヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。

【0124】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、細胞ゲノムは、標的遺伝子座に第１のプロトスペーサーを含み、この方法は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0125】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、細胞ゲノムは、標的遺伝子座に第１のプロトスペーサーを含み、この方法は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。

【0126】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入される外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前の１時間以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー核酸が細胞に導入される前の５分以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入することは、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0127】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、この方法は、ドナー核酸が細胞に導入される前に、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ドナー核酸が細胞に導入される前の１時間以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ドナー核酸が細胞に導入される前の５分以内に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0128】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、細胞は、低酸素条件下で培養される。

【0129】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入される外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約４８時間まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約２４時間まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー核酸を細胞に導入する前に、約２時間まで培養される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入することは、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノム、例えば、ｓｃＡＡＶゲノムである。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法で採用される、標的遺伝子座において挿入された外因性核酸配列を含む編集された細胞を調製する方法のうちのいずれかに従い、細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ）、Ｊａｇｇｅｄ－１、Ｊａｇｇｅｄ－２、またはそれらのコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、Ｄｅｌｔａ様Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、またはＤＬＬ４である。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｆｃ－ＤＬＬ１、Ｆｃ－ＤＬＬ３、Ｆｃ－ＤＬＬ４、Ｆｃ－Ｊａｇｇｅｄ－１、またはＦｃ－Ｊａｇｇｅｄ－２である。

【0131】

組成物
本明細書で提供されるのは、本開示に記載されるように、操作された細胞を生成するためのシステムの１つ以上の要素を含む組成物である。

【0132】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ａ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸（ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの第１の認識配列を含む標的遺伝子座においてゲノム編集を媒介することができる）、およびｂ）二本鎖ドナー核酸（二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される）のうちの１つ以上を含む組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、編集される細胞をさらに含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を含む本明細書に記載の組成物のうちのいずれかによれば、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接するヌクレアーゼの第２の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第３の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。

【0134】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を含む本明細書に記載の組成物のうちのいずれかによれば、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスＲＮＡゲノムのｄｓＤＮＡ中間体）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスゲノムは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスゲノムである。

【0135】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を含む本明細書に記載の組成物のうちのいずれかによれば、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、組成物は、標的遺伝子座における第１の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができるｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における１つ以上の認識配列を切断するようにＲＧＥＮを誘導することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＧＥＮおよびｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＧＥＮをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはプラスミドである。

【0136】

いくつかの実施形態では、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を含む本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに従い、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるヌクレアーゼの認識配列の各々は、プロトスペーサー配列である。いくつかの実施形態では、組成物は、プロトスペーサー配列のうちの１つ以上を標的とする１つ以上のｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座および二本鎖ドナー核酸におけるプロトスペーサーの各々は同じであり、組成物は、プロトスペーサー配列を標的とする１つのｇＲＮＡを含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ｉ）第１のプロトスペーサーを含む第１の核酸、およびｉｉ）スペーサーを含むｇＲＮＡを含み、第１のプロトスペーサーは、スペーサーに不完全に一致するＤＡＰであり、第１のプロトスペーサーがスペーサーに一致する程度は、第１のプロトスペーサーにおける第１の核酸の修飾を可能にするのに十分である。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）だけ長さが短い。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーとの少なくとも約１（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）ヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第２のプロトスペーサーを含む第２の核酸をさらに含み、第２のプロトスペーサーは、スペーサーに完全に一致する。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに従い、組成物は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができる）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸のうちの１つ以上を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが片側または両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサーおよび第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、組成物は、標的遺伝子座を含む細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、相同性指向修復（ＨＤＲ）に必要な機構を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞は、長期生着造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）などの造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＣＩＤ再増殖細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、以下のマーカー：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５のうちのいずれか）を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－、ＣＤ４１ａ^－、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ２０^－、およびＣＤ５６^－のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８のうちのいずれか）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ^－は、ＣＤ２３５ａ^－／ＣＤ４１ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１９^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ２０^－／ＣＤ５６^－として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、静止Ｔ細胞である。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに従い、組成物は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致する）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸のうちの１つ以上を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰであり、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、組成物は、標的遺伝子座を含む細胞をさらに含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに従い、組成物は、ａ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、ｂ）スペーサーを含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸（ｇＲＮＡは、外因性核酸が挿入される標的遺伝子座において第１のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第１のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全には一致しないＤＡＰである）、およびｃ）二本鎖ドナー核酸のうちの１つ以上を含み、ドナー核酸は、第２のプロトスペーサーが両側に隣接する外因性核酸を含み、ｇＲＮＡは、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーを切断するようにＲＧＥＮを標的とすることができ、第２のプロトスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーに完全に一致し、ドナー核酸は、外因性核酸がＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、ｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されず、ｉｉ）切断されたドナー核酸を切断された標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによって切断され得る外因性核酸に隣接するプロトスペーサーが作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座における第１のプロトスペーサーは順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸における第２のプロトスペーサーは逆配向にある。いくつかの実施形態では、組成物は、標的遺伝子座を含む細胞をさらに含む。

【0141】

本開示に記載されるように調製された、哺乳動物細胞などの遺伝子組換え細胞を含む組成物もまた、本明細書で提供される。

【0142】

本明細書で提供および説明される操作された細胞を生成するための操作された細胞および／またはシステム要素を含むキットおよびシステムもまた、本明細書で提供される。したがって、例えば、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質配列、本明細書に記載の発現ベクター、および／または本明細書に記載の細胞のうちの１つ以上を含むキットである。

【0143】

核酸
ゲノム標的化核酸またはガイドＲＮＡ
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に向けることができるゲノム標的化核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡである。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、少なくとも目的の標的核酸配列およびＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするスペーサー配列を有する。タイプＩＩシステムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも有する。タイプＩＩガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。タイプＶガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。どちらのシステムでも、二重鎖は、ガイドＲＮＡおよび部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように部位特異的ポリペプチドに結合する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性を提供する。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を指示する。

【0144】

いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡである。二重分子ガイドＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を有する。第１の鎖は、５′から３′の方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、および最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。第２の鎖は、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ拡張配列を有する。タイプＩＩシステムの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５′から３′方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ拡張配列を有する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）を寄与する要素を有し得る。単一分子ガイドリンカーは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを有する。タイプＶシステムの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５′から３′の方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびスペーサー配列を有する。

【0145】

例示的なゲノム標的化核酸は、ＷＯ２０１８／００２７１９に記載されている。

【0146】

ドナーＤＮＡまたはドナーテンプレート
ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、二本鎖切断または一本鎖切断を核酸、例えばゲノムＤＮＡに導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性に依存する修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替の非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、切断された標的核酸を修復することができる。これにより、切断部位の標的核酸に小さな欠失または挿入（インデル）が生じることがあり、遺伝子発現の破壊または改変をもたらし得る。

【0147】

二本鎖切断が起こる細胞の核内に外因性ＤＮＡ分子が十分な濃度で供給されると、外因性ＤＮＡは、ＮＨＥＪ修復プロセス中に二本鎖切断に挿入され、したがってゲノムへの恒久的な付加となり得る。外因性ＤＮＡにヌクレアーゼ標的部位を含めると、ＮＨＥＪを介したＤＮＡ修復中に標的部位へのヌクレアーゼ標的部位の挿入が大幅に刺激される。これらの外因性ＤＮＡ分子は、いくつかの実施形態ではドナーテンプレートと称される。ドナーテンプレートが、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列、および／またはスプライスアクセプター配列（本明細書では「ドナーカセット」とも称される）などの関連する調節配列とともに、必要に応じて導入遺伝子のコード配列を含む場合、導入遺伝子は、ゲノムに組み込まれた核酸から発現され、細胞の寿命にわたって恒久的発現をもたらし得る。さらに、ドナーＤＮＡテンプレートの組み込まれた核酸は、細胞が分裂するときに娘細胞に伝達され得る。

【0148】

いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼとともに、または様々な異なる方法によって、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、またはウイルス形質導入によって独立して供給され得る。

【0149】

いくつかの実施形態では、外因性核酸配列を含む本明細書に記載のドナーテンプレートのうちのいずれかに従い、外因性核酸配列は、片側または両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している。例えば、そのようなドナーテンプレートは、外因性核酸配列の５′のｇＲＮＡ標的部位および／または外因性核酸配列の３′のｇＲＮＡ標的部位を有する外因性核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートは、外因性核酸配列の５′にｇＲＮＡ標的部位を有する外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートは、外因性核酸配列の３′にｇＲＮＡ標的部位を有する外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートは、外因性核酸配列の５′のｇＲＮＡ標的部位および外因性核酸配列の３′のｇＲＮＡ標的部位を有する外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートは、外因性核酸配列の５′のｇＲＮＡ標的部位および外因性核酸配列の３′のｇＲＮＡ標的部位を有する外因性核酸配列を含み、２つのｇＲＮＡ標的部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートは、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナーテンプレート中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナーテンプレートの外因性核酸配列が組み込まれる標的遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートは、外因性核酸配列の５′のｇＲＮＡ標的部位および外因性核酸配列の３′のｇＲＮＡ標的部位を有する外因性核酸配列を含み、ドナーテンプレート中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナーテンプレートの外因性核酸配列が組み込まれる標的遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位は順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸のｇＲＮＡ標的部位は逆配向にある。

【0150】

いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートは、二本鎖ドナー核酸である。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列を含み、ＮＨＥＪによって標的遺伝子座に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第１の末端に隣接する第１のヌクレアーゼの第１の認識配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、外因性核酸配列の第２の末端に隣接する第２のヌクレアーゼの第２の認識配列を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のヌクレアーゼは、同じヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１および第２の認識配列は、同じ認識配列である。いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸は、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に所望の配向で挿入しても、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されず、切断された二本鎖ドナー核酸を標的遺伝子座に他の配向で挿入すると、修飾された標的遺伝子座におけるヌクレアーゼの認識配列が作成されるように構成される。いくつかの実施形態では、第１および第２のヌクレアーゼは、ＲＧＥＮであり、第１および第２の認識配列は、プロトスペーサー配列である。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二本鎖ドナー核酸は、プロトスペーサーが一端または両端に隣接する外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、その５′末端にプロトスペーサーが隣接している。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、その３′末端にプロトスペーサーが隣接している。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、その５′および３′末端にプロトスペーサーが隣接している。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座におけるプロトスペーサー配列は順配向にあり、ドナー核酸における外因性核酸は順配向にあり、ドナー核酸におけるプロトスペーサーは逆配向にある。

【0152】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二本鎖ドナー核酸は、ｇＲＮＡのスペーサーに不完全に一致する遅延作用プロトスペーサー（ＤＡＰ）が一端または両端に隣接する外因性核酸配列を含み、ＤＡＰがスペーサーに一致する程度は、ｇＲＮＡによって誘導されるＲＧＥＮによるＤＡＰでのドナー核酸の修飾を可能にするのに十分である。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーよりも少なくとも約１ヌクレオチド（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）だけ長さが短い。いくつかの実施形態では、ＤＡＰは、スペーサーとの少なくとも約１（例えば、少なくとも約２、３、またはそれ以上のうちのいずれか）ヌクレオチドミスマッチを含む。例えば、ｇＲＮＡは、配列番号８のポリヌクレオチド配列からのスペーサーを含み得、ＤＡＰは、配列番号１６～２８のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列からのプロトスペーサーを含み得る。

【0153】

いくつかの実施形態では、二本鎖ドナー核酸を採用する本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従い、二本鎖ドナー核酸は、二本鎖ウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、二本鎖ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスＲＮＡゲノムのｄｓＤＮＡ中間体）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｓｃＡＡＶゲノムは、ｓｃＡＡＶ６ゲノムである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスゲノムは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスゲノムである。

【0154】

部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸
したがって、いくつかの実施形態では、ゲノム編集の方法および組成物は、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を使用することができる。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列がＲＮＡである場合、それはｇＲＮＡ配列に共有結合するか、または別個の配列として存在することができる。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼのペプチド配列が、その核酸配列の代わりに使用され得る。

【0155】

ベクトル
別の態様では、本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の実施形態を実行するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子を提供する。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）である。

【0156】

企図される発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびＲｏｕｓ肉腫ウイルス、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）、ならびに他の組換えベクターが含まれるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞について企図される他のベクターには、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞について企図される追加のベクターには、ベクターｐＣＴｘ－１、ｐＣＴｘ－２、およびｐＣＴｘ－３が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞と適合する限り、他のベクターを使用することができる。

【0157】

いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の転写および／または翻訳制御要素を有する。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的かつ誘導性のプロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、多数の適切な転写および翻訳制御要素のいずれかを発現ベクターで使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構の構成要素または他の要素のいずれかを不活化する自己不活化ベクターである。

【0158】

好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞で機能するプロモーター）の非限定的な例には、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子－１プロモーター（ＥＦ１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合させたハイブリッド構成体、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネイン－Ｉからのものが挙げられる。

【0159】

Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを発現するために、例えばＵ６およびＨ１プロモーターを含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが有利であり得る。そのようなプロモーターの使用を強化するための説明およびパラメータは、当該技術分野で知られており、追加の情報およびアプローチが定期的に説明されている。例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい。

【0160】

発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位と転写ターミネーターを含むこともできる。発現ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列を含むことができる。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合され、したがって融合タンパク質をもたらす非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。

【0161】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子がゲノムに挿入された後、ゲノムに存在する内因性プロモーターの下で発現されようとしている場合、宿主細胞において発現される少なくとも１つの遺伝子のためのプロモーターを有しない。

【0162】

部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、変異、欠失、改変、統合、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座、および／または遺伝子変異につながり得る。非天然核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の一例である。

【0163】

部位特異的ポリペプチドは、ゲノム編集でＤＮＡを切断するために使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド、またはポリペプチドをコードする１つ以上の核酸のいずれかとして細胞または患者に投与することができる。

【0164】

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの文脈では、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することができ、順にポリペプチドが向けられている標的ＤＮＡの部位を指定する。本明細書のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼである。そのようなＲＮＡ誘導型部位特異的ポリペプチドはまた、本明細書では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、またはＲＧＥＮとも称される。

【0165】

例示的な部位特異的ポリペプチドは、ＷＯ２０１８／００２７１９に記載されている。

【0166】

標的配列の選択
いくつかの実施形態では、特定の参照遺伝子座に対する５′境界および／または３′境界の位置のシフトは、本明細書でさらに説明および図示されるように、編集のために選択されたエンドヌクレアーゼ系に部分的に依存する遺伝子編集の特定の用途を促進または強化するために使用される。

【0167】

そのような標的配列選択の第１の非限定的な態様では、多くのエンドヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩまたはタイプＶエンドヌクレアーゼの場合、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの要件など、切断のための潜在的な標的部位の最初の選択を導く規則または基準を有する。

【0168】

標的配列の選択または最適化の別の非限定的な態様では、標的配列および遺伝子編集エンドヌクレアーゼの特定の組み合わせに対する「オフターゲット」活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で発生するＤＳＢの頻度）は、オンターゲット活動の頻度と比較して評価される。場合によっては、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、他の細胞と比較して選択的な利点を有し得る。選択的利点の例示的であるが非限定的な例には、複製率の向上、持続性、ある特定の条件に対する耐性、生着の成功率の向上または患者への導入後のインビボでの持続性などの属性の獲得、およびそのような細胞の数または生存率の維持または増加に関連する他の属性が含まれる。他の場合には、正しく編集された細胞を特定、分類、または他の方法で選択するために使用される１つ以上のスクリーニング方法により、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞を適切に選択することができる。選択的利点および指示された選択方法の両方が、修正に関連する表現型を利用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、意図された細胞集団を選択または精製するために使用される新しい表現型を作成する第２の修飾をもたらすために、２回以上編集され得る。そのような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーに第２のｇＲＮＡを付加することで作成され得る。場合によっては、ｃＤＮＡおよび選択可能なマーカーを含むＤＮＡ断片を使用して、所望される遺伝子座で細胞を正しく編集することができる。

【0169】

実施形態では、任意の選択的利点が適用可能であるか、または任意の有向選択が特定の場合に適用されるかどうかにかかわらず、標的配列選択はまた、適用の有効性を増強し、かつ／または所望の標的以外の部位での望ましくない改変の可能性を低減するために、オフターゲット頻度を考慮することによって導かれる。本明細書および当該技術分野でさらに説明および図示されるように、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似性および非類似性、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む多くの要因によって影響を受ける。オフターゲット活性の予測を支援する生物情報学的ツールを利用することができ、また頻繁に、そのようなツールを使用して、オフターゲット活性の最も可能性の高い部位を特定することもでき、次いで、実験設定で評価して、オンターゲット活性に対するオフターゲットの相対頻度を評価することができ、それにより高い相対オンターゲット活性を有する配列の選択を可能にする。そのような技法の例示的な例が本明細書で提供され、他のものは当該技術分野で知られている。

【0170】

標的配列の選択の別の態様は、相同的組換え事象に関する。相同領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同的組換え事象の焦点として機能し得る。そのような組換え事象は、染色体および他のＤＮＡ配列の通常の複製過程で、またＤＮＡ配列が合成されている他の時点で、例えば、通常の細胞複製サイクル中に規則的に起こるが、様々な事象の発生（ＵＶ光および他のＤＮＡ切断の誘導物質など）またはある特定の薬剤の存在（様々な化学的誘導物質など）によって強化され得る、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合に発生する。そのような誘導物質の多くは、ＤＳＢをゲノム内で無差別に発生させ、ＤＳＢは、正常細胞内で定期的に誘導および修復されている。修復中に、元の配列を完全に忠実に再構築することができるが、場合によっては、小さな挿入または欠失（「インデル」と称される）がＤＳＢ部位に導入される。

【0171】

本明細書に記載のエンドヌクレアーゼ系の場合のように、特定の位置でＤＳＢを特異的に誘導することもでき、これを使用して選択された染色体位置で有向または選好的遺伝子修飾事象を引き起こすことができる。相同配列がＤＮＡ修復（および複製）の文脈で組換えを受ける傾向は、多くの状況で利用でき、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集システムの１つのアプリケーションの基礎となり、相同性指向修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を通じて提供される目的の配列を所望の染色体位置に挿入する。

【0172】

わずか１０塩基対以下を有し得る「マイクロホモロジー」の小さな領域であり得る、特定の配列間の相同性の領域を使用して、所望の欠失をもたらすこともできる。例えば、単一のＤＳＢが、近くの配列とのマイクロホモロジーを示す部位に導入される。そのようなＤＳＢの通常の修復過程において、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび付随する細胞修復プロセスによって促進される組換えの結果としての介在配列の欠失である。

【0173】

しかしながら、状況によっては、相同領域内の標的配列を選択することによっても、遺伝子融合（欠失がコード領域にある場合）を含む、はるかに大きな欠失が生じる可能性があり、特定の状況では望ましい場合とそうでない場合がある。

【0174】

本明細書で提供される例は、本明細書に記載の１つ以上のシステム構成要素を挿入するように設計されたＤＳＢの作成のための様々な標的領域の選択、ならびにオンターゲット事象に相対的なオフターゲット事象を最小化するように設計されたそのような領域内の特定の標的配列の選択をさらに示す。

【0175】

核酸の修飾
いくつかの実施形態では、細胞に導入されたポリヌクレオチドは、例えば、本明細書でさらに説明され、当該技術分野で知られているように、活性、安定性、もしくは特異性を強化する、送達を改変する、宿主細胞中の自然免疫応答を低減するため、または他の強化のために、独立してまたは組み合わせて使用され得る１つ以上の修飾を有する。

【0176】

特定の実施形態では、修飾ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用され、その場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドもしくは二重分子ガイドのいずれか）および／または細胞に導入されたＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下に説明および図示されるように修飾され得る。そのような修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用して、いずれか１つ以上のゲノム遺伝子座を編集することができる。

【0177】

そのような用途の非限定的な説明の目的でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを使用すると、ガイドＲＮＡの修飾を使用して、単一分子ガイドまたは二重分子、およびＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る、ガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を高めることができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替として、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または動力学を強化するために使用することができ、これは、例えば、オンターゲット活性を強化するために使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替として、他の（オフターゲット）部位での効果と比較して、特異性、例えば、オンターゲット部位でのゲノム編集の相対速度を高めるために使用することもできる。

【0178】

修飾はまた、または代替として、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する抵抗性を高めることによって、ガイドＲＮＡの安定性を高め、それにより細胞内での半減期を増加させるために使用することができる。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡを使用して、ガイドＲＮＡおよびコードされたＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞中で共存する時間を増やすことができるのと同時に導入されたガイドＲＮＡの半減期を延長するため、ガイドＲＮＡ半減期を強化する修飾は、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳する必要があるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される実施形態において特に有用であり得る。

【0179】

修飾はまた、または代替として、細胞に導入されたＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性または程度を減少させるために使用することができる。下記および当該技術分野で説明するように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈で十分に特徴付けられているそのような応答は、ＲＮＡの半減期の低減および／またはサイトカインまたは免疫応答に関連する他の因子の誘発に関連する傾向がある。

【0180】

細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対して１つ以上のタイプの修飾を行うこともでき、限定されないが、ＲＮＡの安定性を高める修飾（例えば、細胞中に存在するＲＮＡｓｅによる分解を増加させることによって）、得られた産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を強化する修飾、および／または細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性または程度を低下させる修飾が挙げられる。

【0181】

前述のものおよび他のものなどの修飾の組み合わせも同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、ガイドＲＮＡ（上に例示したものを含む）に対して１つ以上のタイプの修飾を行うことができ、かつ／またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上に例示したものを含む）に対して１つ以上のタイプの修飾を行うことができる。

【0182】

例示的な修飾核酸は、ＷＯ２０１８／００２７１９に記載されている。

【0183】

送達
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用される任意の核酸分子、例えば、本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸および／または部位特異的ポリペプチドは、細胞への送達のために送達ビヒクルの中または表面上に被包される。企図される送達媒体には、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で説明されているように、様々な標的化部分を使用して、そのようなビヒクルと所望の細胞型または位置との優先的相互作用を強化することができる。

【0184】

本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって起こり得る。

【0185】

例示的な送達方法および試薬は、ＷＯ２０１８／００２７１９に記載されている。

【0186】

本開示は、特定の代替案を参照して上記に記載されている。しかしながら、上記以外の代替案も、本開示の範囲内で同様に可能である。上記のものとは異なる方法ステップが、本開示の範囲内で提供され得る。本明細書に記載されている異なる特徴およびステップは、記載されているもの以外の組み合わせで組み合わせることができる。

【0187】

本明細書における複数形および／または単数形の使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に適切であるように、複数形から単数形へ、および／または単数形から複数形へと翻訳することができる。明確にするために、様々な単数形／複数形の順列を、本明細書に明示的に記載することができる。

【0188】

一般に、本明細書で、特に添付の特許請求の範囲で使用される用語（例えば、添付の特許請求の範囲）は、一般に「オープン」な用語と解釈されるべきであることは、当業者によって理解されるであろう（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきであるなど）。

【0189】

さらに、本開示の特徴または態様が、マーカッシュ群に関して説明される場合、当業者は、それによって、本開示が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても説明されることを認識するであろう。

【0190】

第１～第１１の態様の代替案の特徴のうちのいずれも、本明細書で特定されるすべての態様および代替案に適用可能である。さらに、第１～第１１の態様の代替案の特徴のうちのいずれも、任意の方法で本明細書に記載される他の代替案と部分的または全体的に独立して組み合わせることができ、例えば、１つ、２つ、または３つ以上の代替案を、全体的または部分的に組み合わせることができる。さらに、第１～第１１の態様の代替案の特徴のいずれも、他の態様または代替案に対して任意に作製することができる。様々な例示的代替案および実装に関して上で説明したが、個々の代替案のうちの１つ以上に記載された様々な特徴、態様、および機能性は、それらが説明された特定の代替案への適用性に限定されないが、代わりに、そのような代替案が説明されているかどうか、およびそのような特徴が説明されている代替案の一部として提示されているかどうかにかかわらず、本出願の他の代替案のうちの１つ以上に、単独でまたは様々な組み合わせで適用することができる。したがって、本出願の幅および範囲は、上記の代替例のうちのいずれによっても制限されるべきではない。

【0191】

本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、そのような矛盾するいかなる資料に優先し、かつ／または上位にあることを意図している。参照により本明細書に組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、そのような矛盾するいかなる資料にも優先し、かつ／または上位にあることを意図している。

【0192】

本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載されている。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の材料および方法を、本開示の実施または試験に使用することができる。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明から明らかとなるであろう。説明において、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、単数形は複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が優先する。

【0193】

本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0194】

本明細書で提供される開示のいくつかの実施形態は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。

【実施例】

【0195】

実施例１：Ｋ５６２細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込み
この研究は、Ｋ５６２細胞において、ドナー切断の有無にかかわらず刺激されたＮＨＥＪを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。発現のために内因性ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃプロモーターに依存するＧＦＰ発現カセットを備えたプラスミドドナーベクターを、インビボドナー切断のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９認識部位の有無にかかわらずクローン化した。

【0196】

これらの実験では、３０万個のＫ５６２細胞を、１．５０、２．７５、および３．５０ｐｍｏｌの１カットプラスミドドナー（ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ－ｐｓＡＡＶＳ１－ＳＡ－Ｐ２Ａ－Ｈ２Ｂｊ－Ｖｅｎｕｓ－ＢＧＨｐＡ－ｐｓＳＣＲＡＭ）または３．５０ｐｍｏｌの０カットプラスミドドナー（ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ－ｐｓＳＣＲＡＭ－ＳＡ－Ｐ２Ａ－Ｈ２Ｂｊ－Ｖｅｎｕｓ－ＢＧＨｐＡ－ｐｓＳＣＲＡＭ）を用いて－１日目にヌクレオフェクトした。ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ：ベクタープラスミド骨格；ｐｓＳＣＲＡＭ：ＰＡＭを有するスクランブルプロトスペーサー配列；ｐｓＡＡＶＳ１：ゲノムＤＮＡ配列と同じプロトスペーサー配列、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰはＰＡＭにより切断する；ＳＡ：スプライスアクセプター；Ｐ２Ａ：ペプチド切断シグナル配列；Ｈ２Ｂｊ－Ｖｅｎｕｓ：核内でＧＦＰを安定化するヒストンＨ２Ｂに融合された修飾型ＧＦＰ；およびＢＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列。２４時間後、各条件のＫ５６２細胞を、ＲＮＰの有無にかかわらずヌクレオフェクトした。ＲＮＰは、１２ｐｍｏｌのＣａｓ９（Ｆｅｌｄａｎ）と６０ｐｍｏｌのＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（Ａｘｏｌａｂｓ）との複合体であった。Ｋ５６２細胞株用のＬｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）による標準的なヌクレオフェクションプロトコルを使用した。ヌクレオフェクション後７日目（Ｄ７）および１４日目（Ｄ１４）にフローサイトメトリーによって細胞を分析し、組込みの分子分析のためにゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＤ７で収集した。

【0197】

フローサイトメトリー結果を図１Ａおよび１Ｂに示す。ＧＦＰ^＋シグナルによって決定された編集効率は、次のとおりであった：ＮＨＥＪ ０カット３．５ｐｍｏｌ－ＲＮＰ：Ｄ７＝３．２５％、Ｄ１４＝７．９％；ＮＨＥＪ ０カット３．５ｐｍｏｌ＋ＲＮＰ：Ｄ７＝３．２８％、Ｄ１４＝６．８６％；ＮＨＥＪ １－カット１．５０ｐｍｏｌ－ＲＮＰ：Ｄ７＝２．７８％、Ｄ１４＝７．３４％；ＮＨＥＪ １－カット１．５０ｐｍｏｌ＋ＲＮＰ：Ｄ７＝１３．７％、Ｄ１４＝１５．７％；ＮＨＥＪ １－カット２．７５ｐｍｏｌ－ＲＮＰ：Ｄ７＝３．９５％、Ｄ１４＝７．２９％；ＮＨＥＪ １－カット２．７５ｐｍｏｌ＋ＲＮＰ：Ｄ７＝２０．３％、Ｄ１４＝１８．９％；ＮＨＥＪ １－カット３．５０ｐｍｏｌ－ＲＮＰ：Ｄ７＝４．４６％、Ｄ１４＝７．２５％；ＮＨＥＪ １－カット３．５０ｐｍｏｌ＋ＲＮＰ：Ｄ７＝２３．０％、Ｄ１４＝２２．２％。これらの結果は、ドナー切断による編集効率の向上を示す。

【0198】

Ｄ７で抽出されたｇＤＮＡを、組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲに使用した（図２の概略図を参照）。ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、以下のプライマーの組み合わせ：５′正配向ＡＢ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４））、３′正配向ＣＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、５′逆配向ＡＣ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、３′逆配向ＢＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ２Ｏ（合計２０μＬまで）のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅させた。図２に示されるように、すべての試料は、予想どおりｏｕｔ－ｏｕｔバンドを有していたが、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰおよびＲＮＰによって標的とされる少なくとも１つの切断部位を有するドナープラスミドの両方で処理された試料のみが、ｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲバンドによって証明されるように、導入遺伝子の組込みを示した。

【0199】

実施例２：分裂細胞と非分裂細胞におけるＮＨＥＪ－ＴＩとＨＤＲ－ＴＩのモデルとしてのＴ細胞
この研究は、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞において、分裂細胞と非分裂細胞におけるＮＨＥＪを介した標的組込みとＨＤＲを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。エクスビボ培養で精製されたＴ細胞は、自然に静止しており、成長および拡張を開始するように刺激されない限り、ＨＤＲを効率的に受けない。以下は、刺激されたＴ細胞および刺激されていないＴ細胞の両方におけるＨＤＲを介した標的組込みおよびＮＨＥＪを介した標的組込みの両方について説明する。
刺激後（分裂）Ｔ細胞の標的組込み

【表1】

【0200】

Ｐａｎ ＣＤ３^＋Ｔ細胞を、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓキット（１７９５１）を介して単離し、ＡＩＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２０５５０８３）＋５％ ＣＴＳ免疫細胞血清置換（ＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２５９６１０１）で培養し、Ｔ細胞活性化／拡張キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９３－６２７）を使用し、ＩＬ－２ １００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびＩＬ－７ １００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を用いて活性化した。

【0201】

ＶＢＬ（ＣＢＧＵ００４）からのＮＨＥＪ－ＴＩウイルス（配列番号６）は、５０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、ＶＢＬ（ＣＢＧＧＵ０１４）からのＨＤＲ－ＴＩウイルス（配列番号７）は、５０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用した。ＲＮＰには、ＧｅｎｅＡｒｔ ｖ２ Ｃａｓ９ １ｐｍｏｌ／１０，０００細胞およびＳｙｎｔｈｅｇｏ ｇＲＮＡ（配列番号８）２．５ｐｍｏｌ／１０，０００細胞が含まれていた。

【0202】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＥＯ－１１５とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0203】

細胞培養
これらの実験では、２０万個の細胞／条件（合計３２０万個の細胞）を解凍し、ＤＭＳＯを洗い流した（１ｍＬの凍結細胞を解凍し、１０ｍＬの培地で希釈した）。細胞を３５０×ｇで１０分間回転させ、上清を吸引し、管を軽くたたいて細胞を再懸濁した。活性化ビーズを含む培地を１００万細胞／ｍＬで添加し、細胞を４８時間培養した。

【0204】

ビーズの枯渇
解凍後２日目に、細胞を５０ｍＬ円錐管に収集し、激しくピペッティングして凝集細胞を解離させた。細胞を含む管を磁気スタンドに置き、１０分間インキュベートした後、上清を他の５０ｍＬ円錐管に静かにピペッティングした。細胞を含む管を再び磁気スタンドに置き、１０分間インキュベートした後、上清を他の５０ｍＬ円錐管に静かにピペッティングした。管を３５０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引除去し、細胞を１００万細胞／ｍＬで再懸濁し、ヌクレオフェクションの前に少なくとも２時間培養した。

【0205】

ＲＮＰヌクレオフェクション
細胞を５０ｍＬ円錐管に収集し、３５０×ｇで１０分間遠心分離し、その間にＲＮＰ複合体を調製した。以前に分注されたＲＮＰ複合体を解凍し、２０：５０ｐｍｏｌのＣａｓ９：ｇＲＮＡ／１０μＬヌクレオフェクション試薬で、Ｐ３ヌクレオフェクション試薬＋ＲＮＰマスターミックスを調製した。１０μＬのヌクレオフェクション試薬／ウェルを適切なウェル／条件で１６ウェルヌクレオフェクションストリップに分注した。収集した細胞を、Ｐ３ヌクレオフェクション試薬に２００，０００細胞／１０μＬ（２０，０００細胞／μＬ）で再懸濁し、１０μＬの細胞含有ヌクレオフェクション試薬を、１６ウェルヌクレオフェクションストリップの各ウェルに総量２０μＬで分配した。

【0206】

ウイルス形質導入
ヌクレオフェクションの前に、ウイルス形質導入培地を調製した。無血清培地のウイルス含有マスターミックスを以下のように調製した。ａ．５０，０００ｖｇ／細胞ウイルスを含む総量８０μＬ、ｂ．４００億（ｖｇ＋追加）を含む３２０μＬ（＋追加）。培地のみの対照も調製した。８０μＬの形質導入培地または対照を、９６ウェルプレートのウェルに分注した。

【0207】

ヌクレオフェクションに続いて、８０μＬの形質導入培地を１００μＬのピペットで吸引し、１６ウェルヌクレオフェクションストリップのウェルに穏やかに移した。１００μＬの形質導入培地／ヌクレオフェクション培地の混合物を吸引し、ピペットで９６ウェルプレートの対応するウェルに戻した。細胞（現在は、２×１０^６細胞／ｍＬで）形質導入を可能にするために２時間インキュベートし、次いで、１ｍＬの培地を有する２４ウェルプレートのウェルに移した。細胞を最大２週間培養し、２日目（Ｄ２）、４日目（Ｄ４）、７日目（Ｄ７）、および１４日目（Ｄ１４）にフローサイトメトリーによって分析した。ゲノムＤＮＡを２日目（Ｄ２）に収集して切断効率を決定し、７日目（Ｄ７）に収集してドナー組込みを決定した。
非刺激（非分裂）Ｔ細胞の標的組込み

【表2】

【0208】

Ｐａｎ ＣＤ３^＋Ｔ細胞を、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓキット（１７９５１）を介して単離し、ＡＩＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２０５５０８３）＋５％ ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２５９６１０１）中でＩＬ－２ １００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＩＬ－７ １００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＩＬ－１５ １００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、およびＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）とともに培養した。

【0209】

ＶＢＬ（ＣＢＧＵ００４）からのＮＨＥＪ－ＴＩウイルス（配列番号６）は、５０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、ＶＢＬ（ＣＢＧＧＵ０１４）からのＨＤＲ－ＴＩウイルス（配列番号７）は、５０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用した。ＲＮＰには、ＧｅｎｅＡｒｔ ｖ２ Ｃａｓ９ １ｐｍｏｌ／１０，０００細胞およびＳｙｎｔｈｅｇｏ ｇＲＮＡ（配列番号８）２．５ｐｍｏｌ／１０，０００細胞が含まれていた。

【0210】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＥＯ－１１５とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0211】

細胞培養
これらの実験では、５００万個の細胞／条件（合計１億２０００万個の細胞）を解凍し、ＤＭＳＯを洗い流した（５ｍＬの凍結細胞を解凍し、５０ｍＬの培地で希釈した）。細胞を３５０×ｇで１０分間回転させ、上清を吸引し、管を軽くたたいて細胞を再懸濁した。培地を２００～５００万個の細胞／ｍＬで添加し、細胞を２４時間培養した。

【0212】

ＲＮＰヌクレオフェクション
細胞を５０ｍＬ円錐管に収集し、３５０×ｇで１０分間遠心分離し、その間にＲＮＰ複合体を調製した。以前に分注されたＲＮＰ複合体を解凍し、２００：５００ｐｍｏｌのＣａｓ９：ｇＲＮＡ／５０μＬヌクレオフェクション試薬で、Ｐ３ヌクレオフェクション試薬＋ＲＮＰマスターミックスを調製した。適切な条件のために、５０μＬのヌクレオフェクション試薬を、１００μＬのヌクレオフェクションキュベットに分注した。収集した細胞をＰ３ヌクレオフェクション試薬に２，０００，０００細胞／５０μＬで再懸濁し、５０μＬの細胞含有ヌクレオフェクション試薬を、各ヌクレオフェクションキュベットに総量１００μＬで分配した。

【0213】

ウイルス形質導入
ヌクレオフェクションの前に、ウイルス形質導入培地を調製した。無血清培地のウイルス含有マスターミックスを以下のように調製した。ａ．５０，０００ｖｇ／細胞ウイルスを含む総量９００μＬ、ｂ．１０００億（ｖｇ＋追加）を含む４８００μＬ（＋追加）。培地のみの対照も調製した。９００μＬの形質導入培地または対照を、２４ウェルプレートのウェルに分注した。

【0214】

ヌクレオフェクションに続いて、約５００μＬの形質導入培地をトランスファーピペットで吸引し、ヌクレオフェクションキュベットに穏やかに移した。すべての形質導入培地／ヌクレオフェクション培地混合物を吸引し、ピペットで２４ウェルプレートの対応するウェルに戻した。細胞を最大２週間培養し、２日目（Ｄ２）、４日目（Ｄ４）、７日目（Ｄ７）、および１４日目（Ｄ１４）にフローサイトメトリーによって分析した。ゲノムＤＮＡを２日目（Ｄ２）に収集して切断効率を決定し、７日目（Ｄ７）に収集してドナー組込みを決定した。

【0215】

結果を図３Ａ、３Ｂ、４、５Ａ、５Ｂ、および５Ｃに示す。ＨＤＲ－ＴＩは、活性化Ｔ細胞（図３Ａおよび３Ｂ）で好まれたが、ＮＨＥＪ－ＴＩは、非活性化Ｔ細胞で好まれた（これらは検出可能なＨＤＲ－ＴＩではなかった、図５Ａおよび５Ｂ）。さらに、図５Ｃに示されるように、ＮＨＥＪ編集非活性化Ｔ細胞は、主にＣＤ４^＋であった（４．９７％ ＣＤ８^＋と比較して９１．１％ ＣＤ４^＋）。

【0216】

実施例３：ＣＤ３４細胞中のＮＨＥＪを介したＴＩを試験する。
この研究は、ヒトＣＤ３４^＋細胞において、インビボドナー切断の有無にかかわらず、刺激されたＮＨＥＪを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。この研究では、２つのプロトコルを比較して、操作の順序が標的組込みの収量および生存率／細胞性に影響を与えるかどうかを判断した。ＨＳＣは、２カットドナー（配列番号５）または０カットドナー（配列番号４）およびＲＮＰのいずれかを担持するｓｃＡＡＶ６で処理した。

【表3】

【0217】

条件ごとに２０万個のＣＤ３４^＋細胞を使用した（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＡｌｌＣｅｌｌｓ製）。ｓｃＡＡＶ６ ０カットＮＨＥＪベクター（配列番号４）または２カットＮＨＥＪベクター（配列番号５）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を２０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用した。ＲＮＰには、２４ｐｍｏｌのＣａｓ９（Ｆｅｌｄａｎ）～１２０ｐｍｏｌのＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ａｘｏｌａｂｓ）が含まれていた。

【0218】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0219】

細胞培養
分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。２００，０００細胞／条件に十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引し、細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁した。低結合Ｔ７５フラスコ（最大２００，０００細胞／ｍＬ）で総量を少なくとも２０ｍＬにし、細胞を少なくとも２４時間静置した。

【0220】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した。その後の実験のために十分なＲＮＰを解凍した。細胞を１．５、１５、または５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰまたはｍＲＮＡをヌクレオフェクションストリップの各ウェルに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大１０μＬの容量まで添加した。培養プレートを、２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬの完全培地を添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞１０μＬを各ウェルに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、８０μＬの予熱した完全培地を各ウェルに直ちに添加し、細胞を調製した培養プレートの各ウェルに細胞を穏やかにピペッティングした。

【0221】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子をＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温めた。細胞を１５ｍＬ円錐管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、その間にＡＡＶ希釈液を低結合タンパク質管内で調製した。培養プレートを、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの完全培地を添加することによって調製し、対応する量のＡＡＶ希釈液を各ウェルに添加した。上清をデカントし、細胞を完全培地の条件数の５０μＬ倍に再懸濁した。５０μＬの細胞を各ウェルに添加し、細胞を加湿した３７℃の正常酸素インキュベーターに２時間戻した。次いで、細胞を１．５ｍＬの滅菌エッペンドルフ管に収集し、９０×ｇで１０分間回転させ、その間に２４ウェルプレートの各ウェルに０．７ｍＬの完全培地を添加することによって培養プレートを調製した。上清をデカントし、細胞を３００μＬの完全培養培地に再懸濁し、調製した培養プレートに移した。

【0222】

条件固有のプロトコル
プロトコル１（Ｐ１）
プロトコル１（Ｐ１）を、最初にＡＡＶ処理、続いてＲＮＰ処理により実行した。細胞をＡＡＶで処理し、２時間後に１．５ｍＬの滅菌エッペンドルフ管に収集した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間にヌクレオフェクション試薬およびＲＮＰを調製し、ウェルあたり９００μＬの完全培地を含む２４ウェル培養プレートを調製した。細胞を２０μＬのＰ３＋／－ＲＮＰに再懸濁し、１００μＬの細胞を調製した２４ウェル培養プレートに移した。細胞を正常酸素インキュベーターで最大＋５日間培養し、２日ごとに培地を添加した。

【0223】

プロトコル２（Ｐ２）
プロトコル２（Ｐ２）を、最初にＲＮＰ処理、続いてＡＡＶ処理により実行した。細胞をＲＮＰの有無にかかわらずヌクレオフェクトし、１００μＬの細胞を調製した培養プレートに移した。細胞を１時間静置した後、ＡＡＶで２時間処理した。次いで、細胞を収集し、回転させ、新鮮な培地に再懸濁し、正常酸素インキュベーターで最大＋５日間培養し、２日ごとに培地を添加した。

【0224】

データ収集
ＴＩＤＥ分析
細胞を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に収集した。次いで、細胞をすすぎ、残りの培地を１ｍＬのＰＢＳで収集した。細胞を３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントした。総量が１．２ｍＬを超える場合は、同じ管内でステップ１～４を繰り返した。ｇＤＮＡを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（カタログ番号６９５０６）を使用して抽出した。

【0225】

ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、１μＬのプライマー１ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマー２ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）を使用し、以下のパラメータを用いてＰＣＲ増幅させた：１．変性：９５℃ ００：０１０：００、２．変性：９５℃ ００：００：１５、３．アニーリング：６０℃ ００：００：１５、４．伸長：７２℃ ００：０２：００、ステップ２～４を３５サイクル繰り返す、５．最終伸長７２℃ ００：０７：００、６．１２℃を保持する。

【0226】

次いで、精製されたＰＣＲ産物を以下のように配列決定した。ＰＣＲクリーンアップを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して実施した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定のためにＳｅｑｕｅｔｅｃｈに提出した。配列決定に使用されるネストされたプライマー：ＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｒ：ｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇ（配列番号１２）、およびＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｆ：ａａｃｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｇａａｇｔ（配列番号１３）。

【0227】

ＴＳＵＮＡＭＩ Ｂａｔｃｈ ＴＩＤＥ分析（５４．２３４．７４．３７／ｈｏｍｅ／または５４．１５８．１８９．０／ｈｏｍｅ／のウェブページ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断効率についてＩＮＤＥＬ分析を実行した。分析を開始するために必要なデータファイルをアップロードした。ＣＳＶファイルリスト－４つのカラムを含むヘッダーのない「．ｃｓｖ」ファイル（試料名のリスト－アウトプットファイルでラベル付けに使用される）；予想されるｇＲＮＡ配列－ＰＡＭ配列のすぐ上流にある予想されるｇＲＮＡ配列を表す２０ｎｔ（５′－３′）ＤＮＡ文字列（ＰＡＭは含まれない）、試験試料の名称、対照試料の名称）、配列決定ファイル（．ａｂ１または．ｓｃｆファイル）。分析のために次のパラメータを入力した。左側の境界：デフォルトは１００ｂｐである、右の境界：切断部位でのデフォルト設定－１０ｂｐ、分解ウィンドウ：分解に使用される配列セグメントを決定する（デフォルト設定は、アップロードされた配列に可能な最大のウィンドウである）、インデルサイズ範囲：モデル化されるインデルの最大サイズを設定する。デフォルト値は１０である。Ｐ値のしきい値：デフォルトはｐ＜０．００１である。次いで、結果を生成し、出力の品質測定値を評価し、必要に応じてパラメータを調整した（切断部位前の平均異常配列シグナル＜１０％（対照および試験試料の両方）、分解結果についてＲ２＞０．９）。参考文献：Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６。

【0228】

組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲ
ＴＩＤＥ分析のために抽出された同じｇＤＮＡを、組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲに使用した。ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、以下のプライマーの組み合わせ：５′正配向ＡＢ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４））、３′正配向ＣＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、５′逆配向ＡＣ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、３′逆配向ＢＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅させた。

【0229】

ＴＯＰＯ－ＴＡクローニング
ＴＯＰＯ－ＴＡクローニングを、４μＬのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲアンプリコン、１μＬの塩溶液、および１μＬのＴＯＰＯ－ＴＡベクター（ｐＣＲ（商標）２．１－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター）を使用して実行した。反応物を２５℃で１５分間インキュベートした後、氷上で冷却した。

【0230】

上位１０の化学的にコンピテントな細胞を氷上で解凍し、２μＬのＴＯＰＯ－ＴＡクローニング産物を解凍した上位１０の化学的にコンピテントな細胞に添加した。細胞懸濁液を穏やかに軽くたたくことによって混合し、氷上で５分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。次いで、細胞を氷上で５分間インキュベートし、２５０μＬのＳＯＣ培地を添加し、細胞を細菌シェーカー内で３７℃で３０分間インキュベートした。１５０μＬの細胞をＸ－ｇａｌでコーティングしたカルベニシリン寒天プレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。プラスミドの成長および配列決定のために白いコロニーを選択した。

【0231】

フローサイトメトリー
細胞を細胞培養プレートから５ｍＬのＦＡＣＳ管に収集し、最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を３５０×ｇで５分間回転させ、上清をデカントした。細胞表面抗原に対する生存率色素および／またはコンジュゲートされた抗体を添加し、細胞を室温で２０分間インキュベートした。最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を３５０×ｇで５分間回転させた。上清をデカントし、総量を２００μＬにし、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移し、Ａｔｔｕｎｅハイスループットシステムを使用して実行した。

【0232】

結果を図６、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、および８Ｂに示す。Ｐ１およびＰ２の両方について、編集効率は、０カットドナーよりも２カットドナーの方が高く、Ｐ２は、対応する条件のＰ１と比較してより優れた編集効率を示し（図６および７Ａ）、ドナー切断の利点をさらに示し、最初にＲＮＰ処理、続いてＡＡＶ処理が、より効率的な標的組込みにつながることを示唆している。

【0233】

実施例４：ＣＤ３４細胞中のＮＨＥＪを介したＴＩを試験する：ＳＣＧＭとＳＦＥＭ－ＩＩ培地、低酸素と正常酸素、Ｄ１編集とＤ２編集
この研究は、ヒトＣＤ３４^＋細胞において、インビボドナー切断の有無にかかわらず、刺激されたＮＨＥＪを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。ここで、培地またはＯ_２レベルがＮＨＥＪ－ＴＩに影響を与えたかどうかを調べた。Ｐ２およびＰ１の両方が休止し、ＨＤＲを介した標的組込みによって編集する前に４８時間ＨＳＣを予備刺激するため、１日（Ｄ１）と２日（Ｄ２）の休止期間条件も試験した。

【表4】

【表5】

【0234】

これらの実験では、２００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／条件（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。細胞を、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、ＧＭＰグレード）またはＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）または正常酸素条件（ＡＴＭ Ｏ２、５％ ＣＯ２、９０％ Ｎ２）で培養した。

【0235】

ＲＮＰには、２４ｐｍｏｌのＣａｓ９（Ｆｅｌｄａｎ）～１２０ｐｍｏｌのＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ａｘｏｌａｂｓ）が含まれていた。ｓｃＡＡＶ６ ２カットＮＨＥＪベクトル（配列番号５）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、２０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間のインキュベーションに続いて、０．９ｍＬの新鮮な培地に移した。

【0236】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0237】

細胞培養
分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＣＧＭまたはＳＦＥＭ ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。２００，０００細胞／条件に十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引した。細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁し、低結合Ｔ７５フラスコで総量を少なくとも２０ｍＬにした（最大で２００，０００細胞／ｍＬ）。

【0238】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した（後続の実験のために十分なＲＮＰを解凍した）。細胞を１．５、１５、または５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰまたはｍＲＮＡをヌクレオフェクションストリップの各ウェルに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大１０μＬの容量まで添加した。培養プレートを、２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬの完全培地を添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞１０μＬを各ウェルに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、８０μＬの予熱した完全培地を各ウェルに直ちに添加し、細胞を調製した培養プレートの各ウェルに細胞を穏やかにピペッティングした。

【0239】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＣＧＭまたはＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温め、その間に低結合タンパク質管内でＡＡＶ希釈液を調製した。９６ウェル培養プレートを調製し、８０μＬの完全培地および対応する量のＡＡＶ希釈液を各ウェルに添加した。１００μＬのヌクレオフェクトされた細胞（８０μＬのレスキュー培地を添加）を、１６ウェルストリップから調製した培養プレートに移し、細胞を加湿した３７℃の低酸素インキュベーターに２時間戻した。次いで、細胞を収集し、その間に２４ウェルプレートの各ウェルに０．７ｍＬの完全培地を添加することによって培養プレートを調製した。細胞上清をデカントし、細胞を再懸濁し、調製した２４ウェル培養プレートに移した。９６ウェル培養プレートを２００μＬの新鮮な培地で激しくピペッティングすることによって洗浄し、培地を２４ウェルプレートの対応するウェルに移した。

【0240】

次いで、細胞を４日間培養した後、細胞を収集し、１．５ｍＬ管内でペレット化した。Ｍａｃｈｅｒｙ－ＮａｇｅｌゲノムＤＮＡ抽出キットを、製造元のプロトコルに従って使用して、ｇＤＮＡを収集した。

【0241】

ＴＩＤＥ分析
細胞を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に収集した。次いで、細胞をすすぎ、残りの培地を１ｍＬのＰＢＳで収集した。細胞を３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントした。総量が１．２ｍＬを超える場合は、同じ管内でステップ１～４を繰り返した。ｇＤＮＡを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（カタログ番号６９５０６）を使用して抽出した。

【0242】

ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、１μＬのプライマー１ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマー２ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）を使用し、以下のパラメータを用いてＰＣＲ増幅させた：１．変性：９５℃ ００：０１０：００、２．変性：９５℃ ００：００：１５、３．アニーリング：６０℃ ００：００：１５、４．伸長：７２℃ ００：０２：００（ステップ２～４を３５サイクル繰り返す）、５．最終伸長７２℃ ００：０７：００、６．１２℃を保持する。

【0243】

次いで、精製されたＰＣＲ産物を以下のように配列決定した。ＰＣＲクリーンアップを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して実施した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定のためにＳｅｑｕｅｔｅｃｈに提出した。配列決定に使用されるネストされたプライマー：ＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｒ：ｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇ（配列番号１２）、およびＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｆ：ａａｃｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｇａａｇｔ（配列番号１３）。

【0244】

ＴＳＵＮＡＭＩ Ｂａｔｃｈ ＴＩＤＥ分析（５４．２３４．７４．３７／ｈｏｍｅ／または５４．１５８．１８９．０／ｈｏｍｅ／のウェブページ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断効率についてＩＮＤＥＬ分析を実行した。分析を開始するために必要なデータファイルをアップロードした。ＣＳＶファイルリスト－４つのカラムを含むヘッダーのない「．ｃｓｖ」ファイル（試料名のリスト－アウトプットファイルでラベル付けに使用される）；予想されるｇＲＮＡ配列－ＰＡＭ配列のすぐ上流にある予想されるｇＲＮＡ配列を表す２０ｎｔ（５′－３′）ＤＮＡ文字列（ＰＡＭは含まれない）、試験試料の名称、対照試料の名称）、配列決定ファイル（．ａｂ１または．ｓｃｆファイル）。分析のために次のパラメータを入力した。左側の境界：デフォルトは１００ｂｐである、右の境界：切断部位でのデフォルト設定－１０ｂｐ、分解ウィンドウ：分解に使用される配列セグメントを決定する（デフォルト設定は、アップロードされた配列に可能な最大のウィンドウである）、インデルサイズ範囲：モデル化されるインデルの最大サイズを設定する。デフォルト値は１０である。Ｐ値のしきい値：デフォルトはｐ＜０．００１である。次いで、結果を生成し、出力の品質測定値を評価し、必要に応じてパラメータを調整した（切断部位前の平均異常配列シグナル＜１０％（対照および試験試料の両方）、分解結果についてＲ２＞０．９）。参考文献：Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６。

【0245】

組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲ
ＴＩＤＥ分析のために抽出された同じｇＤＮＡを、組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲに使用した。ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、以下のプライマーの組み合わせ：５′正配向ＡＢ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４））、３′正配向ＣＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、５′逆配向ＡＣ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、３′逆配向ＢＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅させた。

【0246】

フローサイトメトリー
細胞を細胞培養プレートから５ｍＬのＦＡＣＳ管に収集し、最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を３５０×ｇで５分間回転させ、上清をデカントした。細胞表面抗原に対する生存率色素および／またはコンジュゲートされた抗体を添加し、細胞を室温で２０分間インキュベートした。最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を３５０×ｇで５分間回転させた。上清をデカントし、総量を２００μＬにし、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移し、Ａｔｔｕｎｅハイスループットシステムを使用して実行した。フローサイトメトリーＣＤ３４エクスビボパネルには、ＣＤ３４ ＢＶ５１０、ＣＤ９０ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ３８ ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ ＰＥ、およびＧｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０生存率色素が含まれていた。

【0247】

結果を、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃに示す。ＳＣＧＭ培地は、５００ｎｍ範囲のシフトを引き起こし、ｅＧＦＰおよびＣＤ３４－ＢＶ５１０チャネルの負の集団のシフトを引き起こした。これは、ｅＧＦＰ^＋細胞の明確な集団の欠如を説明し得る。酸素レベルは、編集率に大きな影響を与えなかった。しかしながら、低酸素状態は細胞成長、恐らく細胞周期を減少させ、ＨＳＣがより静止していることを示唆する。ＬＴ－ＨＳＣ集団は、正常酸素と比較して低酸素で保持された。Ｄ１編集は、Ｄ２編集よりもわずかな利点を示した。ＨＳＣが培養に費やす時間を減らすことで、生着の可能性を維持できる場合がある。長期間培養されたＨＳＣは、生着の可能性を失うことが以前に示されている。ＨＤＲを介した標的組込みには２日間の予備刺激が必要であったが、ＨＳＣは、ＮＨＥＪを介したＴＩに余分な日を必要としないようである。

【0248】

実施例５：ＣＤ３４細胞中のＮＨＥＪを介したＴＩを試験する：Ｈ１編集とＤ１編集
この研究は、ヒトＣＤ３４^＋細胞において、インビボドナー切断の有無にかかわらず、刺激されたＮＨＥＪを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。以前に、解凍後２４時間（Ｄ１）の予備刺激／レスキュー培養が、高い生存率を維持しながらＮＨＥＪを介した標的組込みに十分であると判断された。この研究では、解凍後２４時間のレスキュー培養と比較して、解凍後１時間（Ｈ１）のレスキュー培養が効率的かつ実行可能なＮＨＥＪを介したＴＩに十分であるかどうかを調査した。

【表6】

【0249】

これらの実験では、２００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／条件（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。細胞を、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）で培養した。

【0250】

ＲＮＰには、Ｃａｓ９（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２）およびＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が１０：２５ｐｍｏｌの比率で含まれていた。ｓｃＡＡＶ６ ０カットＮＨＥＪベクトル（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、２０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間のインキュベーションに続いて、０．９ｍＬの新鮮な培地に移した。

【0251】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0252】

細胞培養
Ｈ１編集条件では、解凍後１～２時間で細胞を下記のように操作した。Ｄ１編集条件では、解凍後２４時間で細胞を下記のように操作した。

【0253】

分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ－ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。２００，０００細胞／条件に十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引した。細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁し、低結合Ｔ７５フラスコで総量を少なくとも２０ｍＬにした（最大で２００，０００細胞／ｍＬ）。

【0254】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した（後続の実験のために十分なＲＮＰを解凍した）。細胞を１．５、１５、または５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰまたはｍＲＮＡをヌクレオフェクションストリップの各ウェルに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大１０μＬの容量まで添加した。培養プレートを、２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬの完全培地を添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞１０μＬを各ウェルに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、８０μＬの予熱した完全培地を各ウェルに直ちに添加し、細胞を調製した培養プレートの各ウェルに細胞を穏やかにピペッティングした。

【0255】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温め、その間に低結合タンパク質管内でＡＡＶ希釈液を調製した。９６ウェル培養プレートを調製し、８０μＬの完全培地および対応する量のＡＡＶ希釈液を各ウェルに添加した。１００μＬのヌクレオフェクト細胞（８０μＬのレスキュー培地を添加）を、１６ウェルストリップから調製した培養プレートに移し、細胞を加湿した３７℃の低酸素インキュベーターに２時間戻した。次いで、細胞を収集し、その間に２４ウェルプレートの各ウェルに０．７ｍＬの完全培地を添加することによって培養プレートを調製した。細胞上清をデカントし、細胞を再懸濁し、調製した２４ウェル培養プレートに移した。９６ウェル培養プレートを２００μＬの新鮮な培地で激しくピペッティングすることによって洗浄し、培地を２４ウェルプレートの対応するウェルに移した。

【0256】

次いで、細胞を４日間培養した後、細胞を収集し、１．５ｍＬ管内でペレット化した。Ｍａｃｈｅｒｙ－ＮａｇｅｌゲノムＤＮＡ抽出キットを、製造元のプロトコルに従って使用して、ｇＤＮＡを収集した。

【0257】

ＴＩＤＥ分析
細胞を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に収集した。次いで、細胞をすすぎ、残りの培地を１ｍＬのＰＢＳで収集した。細胞を３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントした。総量が１．２ｍＬを超える場合は、同じ管内でステップ１～４を繰り返した。ｇＤＮＡを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（カタログ番号６９５０６）を使用して抽出した。

【0258】

ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、１μＬのプライマー１ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマー２ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）を使用し、以下のパラメータを用いてＰＣＲ増幅させた：変性：９５℃ ００：０１０：００、２．変性：９５℃ ００：００：１５、３．アニーリング：６０℃ ００：００：１５、４．伸長：７２℃ ００：０２：００（ステップ２～４を３５サイクル繰り返す）、５．最終伸長７２℃ ００：０７：００、６．１２℃を保持する。

【0259】

次いで、精製されたＰＣＲ産物を以下のように配列決定した。ＰＣＲクリーンアップを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して実施した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定のためにＳｅｑｕｅｔｅｃｈに提出した。配列決定に使用されるネストされたプライマー：ＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｒ：ｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇ（配列番号１２）、およびＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｆ：ａａｃｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｇａａｇｔ（配列番号１３）。

【0260】

ＴＳＵＮＡＭＩ Ｂａｔｃｈ ＴＩＤＥ分析（５４．２３４．７４．３７／ｈｏｍｅ／または５４．１５８．１８９．０／ｈｏｍｅ／のウェブページ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断効率についてＩＮＤＥＬ分析を実行した。分析を開始するために必要なデータファイルをアップロードした。ＣＳＶファイルリスト－４つのカラムを含むヘッダーのない「．ｃｓｖ」ファイル（試料名のリスト－アウトプットファイルでラベル付けに使用される）；予想されるｇＲＮＡ配列－ＰＡＭ配列のすぐ上流にある予想されるｇＲＮＡ配列を表す２０ｎｔ（５′－３′）ＤＮＡ文字列（ＰＡＭは含まれない）、試験試料の名称、対照試料の名称）、配列決定ファイル（．ａｂ１または．ｓｃｆファイル）。分析のために次のパラメータを入力した。左側の境界：デフォルトは１００ｂｐである、右の境界：切断部位でのデフォルト設定－１０ｂｐ、分解ウィンドウ：分解に使用される配列セグメントを決定する（デフォルト設定は、アップロードされた配列に可能な最大のウィンドウである）、インデルサイズ範囲：モデル化されるインデルの最大サイズを設定する。デフォルト値は１０である。Ｐ値のしきい値：デフォルトはｐ＜０．００１である。次いで、結果を生成し、出力の品質測定値を評価し、必要に応じてパラメータを調整した（切断部位前の平均異常配列シグナル＜１０％（対照および試験試料の両方）、分解結果についてＲ２＞０．９）。参考文献：Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６。

【0261】

組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲ
ＴＩＤＥ分析のために抽出された同じｇＤＮＡを、組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲに使用した。ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、以下のプライマーの組み合わせ：５′正配向ＡＢ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４））、３′正配向ＣＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、５′逆配向ＡＣ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、３′逆配向ＢＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅させた。

【0262】

フローサイトメトリー
細胞を細胞培養プレートから５ｍＬのＦＡＣＳ管に収集し、最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を３５０×ｇで５分間回転させ、上清をデカントした。細胞表面抗原に対する生存率色素および／またはコンジュゲートされた抗体を添加し、細胞を室温で２０分間インキュベートした。最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を３５０×ｇで５分間回転させた。上清をデカントし、総量を２００μＬにし、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移し、Ａｔｔｕｎｅハイスループットシステムを使用して実行した。フローサイトメトリーＣＤ３４エクスビボパネルには、ＣＤ３４ ＢＶ５１０、ＣＤ９０ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ３８ ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ ＰＥ、およびＧｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０生存率色素が含まれていた。

【0263】

結果を図１３に示す。解凍の１時間後に編集された細胞は、わずかに低い効率ではあるが、ＮＨＥＪを介した標的組込みの成功の証拠を示した。しかしながら、細胞がＤ１と比較してＨ１で編集された場合、相対細胞性および生存率はわずかに増加した。細胞を同じ日に解凍、編集、および注入するプロトコルは、技術の臨床応用を簡素化し得る。これは、ＨＤＲを介したＴＩに必要な予備刺激ステップを必要としないため、ＮＨＥＪ－ＴＩに固有のものである。

【0264】

実施例６：ＣＤ３４細胞中のＮＨＥＪを介したＴＩを試験する：ヌクレオフェクションプロトコル（ＤＺ－１００とＣＡ－１３７）、Ｃａｓ９ソース（Ａｌｄｅｖｒｏｎ ＳｐｙＦｉ、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２）
この研究は、ヒトＣＤ３４^＋細胞において、インビボドナー切断の有無にかかわらず、刺激されたＮＨＥＪを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。ここでは、ヌクレオフェクションプロトコル、およびＣａｓ９のソースを比較した。

【表7】

【0265】

これらの実験では、２００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／条件（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。細胞を、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）で培養した。

【0266】

ＲＮＰには、２４ｐｍｏｌのＣａｓ９（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２とＡｌｄｅｖｒｏｎ ＳｐｙＦｉ）～１２０ｐｍｏｌのＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が含まれていた。ｓｃＡＡＶ６ ２カットＮＨＥＪベクトル（配列番号５）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、２０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間のインキュベーションに続いて、０．９ｍＬの新鮮な培地に移した。

【0267】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００またはＣＡ－１３７とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0268】

細胞培養
分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ－ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。２００，０００細胞／条件に十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引した。細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁し、低結合Ｔ７５フラスコで総量を少なくとも２０ｍＬにした（最大で２００，０００細胞／ｍＬ）。

【0269】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した（後続の実験のために十分なＲＮＰを解凍した）。細胞を１．５、１５、または５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰまたはｍＲＮＡをヌクレオフェクションストリップの各ウェルに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大１０μＬの容量まで添加した。培養プレートを、２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬの完全培地を添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞１０μＬを各ウェルに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、８０μＬの予熱した完全培地を各ウェルに直ちに添加し、細胞を調製した培養プレートの各ウェルに細胞を穏やかにピペッティングした。

【0270】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温め、その間に低結合タンパク質管内でＡＡＶ希釈液を調製した。９６ウェル培養プレートを調製し、８０μＬの完全培地および対応する量のＡＡＶ希釈液を各ウェルに添加した。１００μＬのヌクレオフェクトされた細胞（８０μＬのレスキュー培地を添加）を、１６ウェルストリップから調製した培養プレートに移し、細胞を加湿した３７℃の低酸素インキュベーターに２時間戻した。次いで、細胞を収集し、その間に２４ウェルプレートの各ウェルに０．７ｍＬの完全培地を添加することによって培養プレートを調製した。細胞上清をデカントし、細胞を再懸濁し、調製した２４ウェル培養プレートに移した。９６ウェル培養プレートを２００μＬの新鮮な培地で激しくピペッティングすることによって洗浄し、培地を２４ウェルプレートの対応するウェルに移した。

【0271】

次いで、細胞を４日間培養した後、細胞を収集し、１．５ｍＬ管内でペレット化した。Ｍａｃｈｅｒｙ－ＮａｇｅｌゲノムＤＮＡ抽出キットを、製造元のプロトコルに従って使用して、ｇＤＮＡを収集した。

【0272】

ＴＩＤＥ分析
細胞を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に収集した。次いで、細胞をすすぎ、残りの培地を１ｍＬのＰＢＳで収集した。細胞を３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントした。総量が１．２ｍＬを超える場合は、同じ管内でステップ１～４を繰り返した。ｇＤＮＡを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（カタログ番号６９５０６）を使用して抽出した。

【0273】

ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、１μＬのプライマー１ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマー２ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）を使用し、以下のパラメータを用いてＰＣＲ増幅させた：１．変性：９５℃ ００：０１０：００、２．変性：９５℃ ００：００：１５、３．アニーリング：６０℃ ００：００：１５、４．伸長：７２℃ ００：０２：００（ステップ２～４を３５サイクル繰り返す）、５．最終伸長７２℃ ００：０７：００、６．１２℃を保持する。

【0274】

次いで、精製されたＰＣＲ産物を以下のように配列決定した。ＰＣＲクリーンアップを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して実施した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定のためにＳｅｑｕｅｔｅｃｈに提出した。配列決定に使用されるネストされたプライマー：ＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｒ：ｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇ（配列番号１２）、およびＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｆ：ａａｃｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｇａａｇｔ（配列番号１３）。

【0275】

ＴＳＵＮＡＭＩ Ｂａｔｃｈ ＴＩＤＥ分析（５４．２３４．７４．３７／ｈｏｍｅ／または５４．１５８．１８９．０／ｈｏｍｅ／のウェブページ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断効率についてＩＮＤＥＬ分析を実行した。分析を開始するために必要なデータファイルをアップロードした。ＣＳＶファイルリスト－４つのカラムを含むヘッダーのない「．ｃｓｖ」ファイル（試料名のリスト－アウトプットファイルでラベル付けに使用される）；予想されるｇＲＮＡ配列－ＰＡＭ配列のすぐ上流にある予想されるｇＲＮＡ配列を表す２０ｎｔ（５′－３′）ＤＮＡ文字列（ＰＡＭは含まれない）、試験試料の名称、対照試料の名称）、配列決定ファイル（．ａｂ１または．ｓｃｆファイル）。分析のために次のパラメータを入力した。左側の境界：デフォルトは１００ｂｐである、右の境界：切断部位でのデフォルト設定－１０ｂｐ、分解ウィンドウ：分解に使用される配列セグメントを決定する（デフォルト設定は、アップロードされた配列に可能な最大のウィンドウである）、インデルサイズ範囲：モデル化されるインデルの最大サイズを設定する。デフォルト値は１０である。Ｐ値のしきい値：デフォルトはｐ＜０．００１である。次いで、結果を生成し、出力の品質測定値を評価し、必要に応じてパラメータを調整した（切断部位前の平均異常配列シグナル＜１０％（対照および試験試料の両方）、分解結果についてＲ２＞０．９）。参考文献：Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６。

【0276】

組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲ
ＴＩＤＥ分析のために抽出された同じｇＤＮＡを、組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲに使用した。ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、以下のプライマーの組み合わせ：５′正配向ＡＢ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４））、３′正配向ＣＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、５′逆配向ＡＣ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、３′逆配向ＢＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅させた。

【0277】

フローサイトメトリー
細胞を細胞培養プレートから５ｍＬのＦＡＣＳ管に収集し、最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を３５０×ｇで５分間回転させ、上清をデカントした。細胞表面抗原に対する生存率色素および／またはコンジュゲートされた抗体を添加し、細胞を室温で２０分間インキュベートした。最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を３５０×ｇで５分間回転させた。上清をデカントし、総量を２００μＬにし、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移し、Ａｔｔｕｎｅハイスループットシステムを使用して実行した。フローサイトメトリーＣＤ３４エクスビボパネルには、ＣＤ３４ ＢＶ５１０、ＣＤ９０ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ３８ ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ ＰＥ、およびＧｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０生存率色素が含まれていた。

【0278】

結果を図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、および１５に示す。ＤＺ－１００ヌクレオフェクションプログラムは、ＣＡ－１３７ヌクレオフェクションプログラムよりも優れたパフォーマンスを示した。細胞の絶対細胞性に著しい相違はなかったが、ＤＺ－１００を使用すると編集効率が大幅に向上した。ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２ Ｃａｓ９は、ＡｌｄｅｖｒｏｎのＳｐｙＦｉ Ｃａｓ９よりも優れた性能を発揮した。編集効率は、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２ Ｃａｓ９で著しく向上したが、ＳｐｙＦｉは生存率を改善しなかった。

【0279】

実施例７：ＣＤ３４細胞におけるＮＨＥＪを介したＴＩを試験する：ＲＮＰおよびＡＡＶ滴定
この研究は、ヒトＣＤ３４^＋細胞において、インビボドナー切断の有無にかかわらず、刺激されたＮＨＥＪを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。ＮＨＥＪを介したＴＩ効率を維持しながら生存率を高めるために、ＲＮＰレベルおよびＡＡＶレベルを滴定した。

【表8】

【0280】

これらの実験では、２００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／条件（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。細胞を、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）で培養した。

【0281】

ＲＮＰには、Ｃａｓ９（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２）：ＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が、１）Ｌｏ：１０：５０ｐｍｏｌまたは２）Ｈｉ：２０：１００ｐｍｏｌの比率で含まれていた。ｓｃＡＡＶ６ ２カットＮＨＥＪベクトル（配列番号５）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１）Ｌｏ：２０，０００ｖｇ／細胞または２）Ｈｉ：６０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間のインキュベーションに続いて、０．９ｍＬの新鮮な培地に移した。

【0282】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0283】

細胞培養
分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ－ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。２００，０００細胞／条件に十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引した。細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁し、低結合Ｔ７５フラスコで総量を少なくとも２０ｍＬにした（最大で２００，０００細胞／ｍＬ）。

【0284】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した（後続の実験のために十分なＲＮＰを解凍した）。細胞を１．５、１５、または５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰまたはｍＲＮＡをヌクレオフェクションストリップの各ウェルに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大１０μＬの容量まで添加した。培養プレートを、２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬの完全培地を添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞１０μＬを各ウェルに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、８０μＬの予熱した完全培地を各ウェルに直ちに添加し、細胞を調製した培養プレートの各ウェルに細胞を穏やかにピペッティングした。

【0285】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温め、その間に低結合タンパク質管内でＡＡＶ希釈液を調製した。９６ウェル培養プレートを調製し、８０μＬの完全培地および対応する量のＡＡＶ希釈液を各ウェルに添加した。１００μＬのヌクレオフェクトされた細胞（８０μＬのレスキュー培地を添加）を、１６ウェルストリップから調製した培養プレートに移し、細胞を加湿した３７℃の低酸素インキュベーターに２時間戻した。次いで、細胞を収集し、その間に２４ウェルプレートの各ウェルに０．７ｍＬの完全培地を添加することによって培養プレートを調製した。細胞上清をデカントし、細胞を再懸濁し、調製した２４ウェル培養プレートに移した。９６ウェル培養プレートを２００μＬの新鮮な培地で激しくピペッティングすることによって洗浄し、培地を２４ウェルプレートの対応するウェルに移した。

【0286】

次いで、細胞を４日間培養した後、細胞を収集し、１．５ｍＬ管内でペレット化した。Ｍａｃｈｅｒｙ－ＮａｇｅｌゲノムＤＮＡ抽出キットを、製造元のプロトコルに従って使用して、ｇＤＮＡを収集した。

【0287】

ＴＩＤＥ分析
細胞を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に収集した。次いで、細胞をすすぎ、残りの培地を１ｍＬのＰＢＳで収集した。細胞を３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントした。総量が１．２ｍＬを超える場合は、同じ管内でステップ１～４を繰り返した。ｇＤＮＡを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（カタログ番号６９５０６）を使用して抽出した。

【0288】

ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、１μＬのプライマー１ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマー２ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）を使用し、以下のパラメータを用いてＰＣＲ増幅させた：１．変性：９５℃ ００：０１０：００、２．変性：９５℃ ００：００：１５、３．アニーリング：６０℃ ００：００：１５、４．伸長：７２℃ ００：０２：００（ステップ２～４を３５サイクル繰り返す）、５．最終伸長７２℃ ００：０７：００、６．１２℃を保持する。

【0289】

次いで、精製されたＰＣＲ産物を以下のように配列決定した。ＰＣＲクリーンアップを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して実施した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定のためにＳｅｑｕｅｔｅｃｈに提出した。配列決定に使用されるネストされたプライマー：ＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｒ：ｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇ（配列番号１２）、およびＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｆ：ａａｃｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｇａａｇｔ（配列番号１３）。

【0290】

ＴＳＵＮＡＭＩ Ｂａｔｃｈ ＴＩＤＥ分析（５４．２３４．７４．３７／ｈｏｍｅ／または５４．１５８．１８９．０／ｈｏｍｅ／のウェブページ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断効率についてＩＮＤＥＬ分析を実行した。分析を開始するために必要なデータファイルをアップロードした。ＣＳＶファイルリスト－４つのカラムを含むヘッダーのない「．ｃｓｖ」ファイル（試料名のリスト－アウトプットファイルでラベル付けに使用される）；予想されるｇＲＮＡ配列－ＰＡＭ配列のすぐ上流にある予想されるｇＲＮＡ配列を表す２０ｎｔ（５′－３′）ＤＮＡ文字列（ＰＡＭは含まれない）、試験試料の名称、対照試料の名称）、配列決定ファイル（．ａｂ１または．ｓｃｆファイル）。分析のために次のパラメータを入力した。左側の境界：デフォルトは１００ｂｐである、右の境界：切断部位でのデフォルト設定－１０ｂｐ、分解ウィンドウ：分解に使用される配列セグメントを決定する（デフォルト設定は、アップロードされた配列に可能な最大のウィンドウである）、インデルサイズ範囲：モデル化されるインデルの最大サイズを設定する。デフォルト値は１０である。Ｐ値のしきい値：デフォルトはｐ＜０．００１である。次いで、結果を生成し、出力の品質測定値を評価し、必要に応じてパラメータを調整した（切断部位前の平均異常配列シグナル＜１０％（対照および試験試料の両方）、分解結果についてＲ２＞０．９）。参考文献：Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６。

【0291】

組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲ
ＴＩＤＥ分析のために抽出された同じｇＤＮＡを、組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲに使用した。ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、以下のプライマーの組み合わせ：５′正配向ＡＢ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４））、３′正配向ＣＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、５′逆配向ＡＣ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、３′逆配向ＢＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅させた。

【0292】

フローサイトメトリー
細胞を細胞培養プレートから５ｍＬのＦＡＣＳ管に収集し、最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を３５０×ｇで５分間回転させ、上清をデカントした。細胞表面抗原に対する生存率色素および／またはコンジュゲートされた抗体を添加し、細胞を室温で２０分間インキュベートした。最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を３５０×ｇで５分間回転させた。上清をデカントし、総量を２００μＬにし、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移し、Ａｔｔｕｎｅハイスループットシステムを使用して実行した。フローサイトメトリーＣＤ３４エクスビボパネルには、ＣＤ３４ ＢＶ５１０、ＣＤ９０ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ３８ ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ ＰＥ、およびＧｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０生存率色素が含まれていた。

【0293】

結果を図１６に示す。ＲＮＰレベルが低下すると、編集効率が低下した。ＡＡＶレベルの増加は、ＲＮＰのレベルの増加とともに使用した場合に効率を著しく増加させ、相対生存率を低下させなかった。

【0294】

実施例８：２カットドナーの標的ドナー組込みのＰＣＲ分析
この研究は、ヒトＣＤ３４^＋細胞における標的ドナー組込みを媒介する際にＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの要件を決定するために実行した。

【0295】

これらの実験では、２００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／条件を使用した。細胞を、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）で培養した。

【0296】

ＲＮＰには、Ｃａｓ９（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２）：ＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が２０：５０ｐｍｏｌの比率で含まれていた。Ａｄ５／３５ ２カットＮＨＥＪベクター（Ｗｅｌｇｅｎ Ｉｎｃ）を、５０００ｖｐ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間インキュベーションした。

【0297】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0298】

ＲＮＰヌクレオフェクションおよびウイルス感染を、以前に記載されたように実行した。組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲ分析は、ヌクレオフェクションおよびＡｄ５／３５処理の７日後に実施した。

【0299】

結果を図１７に示す。すべての試料はｏｕｔ－ｏｕｔバンドを有していたが、Ａｄ５／３５およびＲＮＰヌクレオフェクションの両方で処理された試料のみが、ｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲバンドによって証明されるように導入遺伝子の組込みを示した。

【0300】

実施例９：ＣＤ３４細胞中のＮＨＥＪを介したＴＩを試験する：培養条件－マトリックスタンパク質
前の実施例は、ＣＤ３４ ＨＳＣでのＮＨＥＪを介した標的組込みのための全体的に最適化された編集条件を示す。培養条件はＨＤＲのために最適化されており、ＨＳＣでの細胞周期が必要である。しかしながら、ＨＳＣでの細胞増殖を誘導すると、一般に分化が誘導され、ＬＴ－ＨＳＣの割合が減少する。ＮＨＥＪを介したＴＩでは、細胞が循環して成長する必要がない。ここでは、マトリックスタンパク質が、効率的な標的組込みを維持しながらＬＴ－ＨＳＣ表現型を維持するのに役立ち得るかどうかを調べた。ＮＯＴＣＨシグナル伝達の誘導のためのｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ、マトリックスタンパク質、およびＤＬＬ１－Ｆｃコーティングの使用を調べた。これらの要因は両方とも、骨髄のニッチ、ＨＳＣの発生、および維持に関連している。

【表9】

【0301】

これらの実験では、２００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／条件（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。細胞を、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）で培養した。

【0302】

培養プレート（組織培養処理した２４ウェルプレート）を、以下のように調製した。１．対照プレート（低付着プレート）。２．Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ：１μｇ／ｃｍ^２（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、３．ＤＬＬ１－Ｆｃ：１μｇ／ｃｍ^２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、４．Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ：１μｇ／ｃｍ^２（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＋ＤＬＬ１－Ｆｃ：１μｇ／ｃｍ^２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

【0303】

ＲＮＰには、Ｃａｓ９（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２）：ＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が１０：２５ｐｍｏｌの比率で含まれていた。ｓｃＡＡＶ６ ０カットＮＨＥＪベクトル（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、２０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間のインキュベーションに続いて、０．９ｍＬの新鮮な培地に移した。

【0304】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0305】

細胞培養
Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃでコーティングされた細胞培養プレートを、以下のように調製した。１００μｇの解凍したＴｅｎａｓｃｉｎ Ｃを２４ｍＬの冷ＰＢＳで希釈し、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜でのろ過によって滅菌し、０．５ｍＬ／ウェルのＰＢＳ－ＴｅｎＣ混合物を２４ウェルプレートのウェルに添加した。プレートをパラフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－ＴｅｎＣ混合物を、使用直前に吸引した。

【0306】

ＤＬＬ１－Ｆｃでコーティングされた細胞培養プレートを、以下のように調製した。ＤＬＬ１－Ｆｃを、５０μｇのＤＬＬ１－Ｆｃを１２ｍＬの冷ＰＢＳに希釈することによってＰＢＳ（製造業者のプロトコル）で再構成し、０．５ｍＬ／ウェルのＰＢＳ－ＤＬＬ１－Ｆｃ混合物を２４ウェルプレートのウェルに添加した。プレートをパラフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－ＤＬＬ１－Ｆｃ混合物を、使用直前に吸引した。

【0307】

Ｔｅｎａｓｃｉｎ ＣおよびＤＬＬ１－Ｆｃでコーティングされた細胞培養プレートを、以下のように調製した。５０μｇの解凍したＴｅｎａｓｃｉｎ Ｃを１２ｍＬの冷ＰＢＳに希釈し、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜でのろ過によって滅菌した。５０μｇの再構成されたＤＬＬ１－Ｆｃを添加し、０．５ｍＬ／ウェルのＰＢＳ－ＴｅｎＣ－ＤＬＬ１－Ｆｃ混合物を、２４ウェルプレートのウェルに添加した。プレートをパラフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－ＴｅｎＣ－ＤＬＬ１－Ｆｃを、使用直前に吸引した。

【0308】

分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ－ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。２００，０００細胞／条件に十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引した。細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁し、低結合Ｔ７５フラスコで総量を少なくとも２０ｍＬにした（最大で２００，０００細胞／ｍＬ）。

【0309】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した（後続の実験のために十分なＲＮＰを解凍した）。細胞を１．５、１５、または５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰまたはｍＲＮＡをヌクレオフェクションストリップの各ウェルに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大１０μＬの容量まで添加した。培養プレートを、２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬの完全培地を添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞１０μＬを各ウェルに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、８０μＬの予熱した完全培地を各ウェルに直ちに添加し、細胞を調製した培養プレートの各ウェルに細胞を穏やかにピペッティングした。

【0310】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温め、その間に低結合タンパク質管内でＡＡＶ希釈液を調製した。９６ウェル培養プレートを調製し、８０μＬの完全培地および対応する量のＡＡＶ希釈液を各ウェルに添加した。１００μＬのヌクレオフェクトされた細胞（８０μＬのレスキュー培地を添加）を、１６ウェルストリップから調製した培養プレートに移し、細胞を加湿した３７℃の低酸素インキュベーターに２時間戻した。次いで、細胞を収集し、その間に２４ウェルプレートの各ウェルに０．７ｍＬの完全培地を添加することによって培養プレートを調製した。細胞上清をデカントし、細胞を再懸濁し、調製した２４ウェル培養プレートに移した。９６ウェル培養プレートを２００μＬの新鮮な培地で激しくピペッティングすることによって洗浄し、培地を２４ウェルプレートの対応するウェルに移した。

【0311】

次いで、細胞を４日間培養した後、細胞を収集し、１．５ｍＬ管内でペレット化した。Ｍａｃｈｅｒｙ－ＮａｇｅｌゲノムＤＮＡ抽出キットを、製造元のプロトコルに従って使用して、ｇＤＮＡを収集した。

【0312】

ＴＩＤＥ分析
細胞を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に収集した。次いで、細胞をすすぎ、残りの培地を１ｍＬのＰＢＳで収集した。細胞を３５０×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントした。総量が１．２ｍＬを超える場合は、同じ管内でステップ１～４を繰り返した。ｇＤＮＡを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（カタログ番号６９５０６）を使用して抽出した。

【0313】

ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、１μＬのプライマー１ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマー２ ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）を使用し、以下のパラメータを用いてＰＣＲ増幅させた：１．変性：９５℃ ００：０１０：００、２．変性：９５℃ ００：００：１５、３．アニーリング：６０℃ ００：００：１５、４．伸長：７２℃ ００：０２：００（ステップ２～４を３５サイクル繰り返す）、５．最終伸長７２℃ ００：０７：００、６．１２℃を保持する。

【0314】

次いで、精製されたＰＣＲ産物を以下のように配列決定した。ＰＣＲクリーンアップを、製造元のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して実施した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定のためにＳｅｑｕｅｔｅｃｈに提出した。配列決定に使用されるネストされたプライマー：ＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｒ：ｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇ（配列番号１２）、およびＡＡＶＳ１ ＴＩＤＥ－４Ｆ：ａａｃｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｇａａｇｔ（配列番号１３）。

【0315】

ＴＳＵＮＡＭＩ Ｂａｔｃｈ ＴＩＤＥ分析（５４．２３４．７４．３７／ｈｏｍｅ／または５４．１５８．１８９．０／ｈｏｍｅ／のウェブページ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断効率についてＩＮＤＥＬ分析を実行した。分析を開始するために必要なデータファイルをアップロードした。ＣＳＶファイルリスト－４つのカラムを含むヘッダーのない「．ｃｓｖ」ファイル（試料名のリスト－アウトプットファイルでラベル付けに使用される）；予想されるｇＲＮＡ配列－ＰＡＭ配列のすぐ上流にある予想されるｇＲＮＡ配列を表す２０ｎｔ（５′－３′）ＤＮＡ文字列（ＰＡＭは含まれない）、試験試料の名称、対照試料の名称）、配列決定ファイル（．ａｂ１または．ｓｃｆファイル）。分析のために次のパラメータを入力した。左側の境界：デフォルトは１００ｂｐである、右の境界：切断部位でのデフォルト設定－１０ｂｐ、分解ウィンドウ：分解に使用される配列セグメントを決定する（デフォルト設定は、アップロードされた配列に可能な最大のウィンドウである）、インデルサイズ範囲：モデル化されるインデルの最大サイズを設定する。デフォルト値は１０である。Ｐ値のしきい値：デフォルトはｐ＜０．００１である。次いで、結果を生成し、出力の品質測定値を評価し、必要に応じてパラメータを調整した（切断部位前の平均異常配列シグナル＜１０％（対照および試験試料の両方）、分解結果についてＲ２＞０．９）。参考文献：Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６。

【0316】

組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲ
ＴＩＤＥ分析のために抽出された同じｇＤＮＡを、組込み検出のためのｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲに使用した。ｇＤＮＡ試料を、１０μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ ２×マスターミックス、以下のプライマーの組み合わせ：５′正配向ＡＢ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４））、３′正配向ＣＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、５′逆配向ＡＣ（１μＬのプライマーＡ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＦ（ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ、配列番号１０）、１μＬのプライマーＣ：ＩｎｔＡｍｐ２（ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ、配列番号１５））、３′逆配向ＢＶ（１μＬのプライマーＶ：ＡＡＶＳ１－ｏｕｔｓｉｄｅＲ（ｃｔｇｇｇａｔａｃｃｃｃｇａａｇａｇｔｇ、配列番号１１）、１μＬのプライマーＢ：ＩｎｔＡｍｐ１（ＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧ、配列番号１４）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＬのＧＣ－エンハンサー、およびＨ_２Ｏ（合計２０μＬまで）のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅させた。

【0317】

フローサイトメトリー
細胞を細胞培養プレートから５ｍＬのＦＡＣＳ管に収集し、最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を３５０×ｇで５分間回転させ、上清をデカントした。細胞表面抗原に対する生存率色素および／またはコンジュゲートされた抗体を添加し、細胞を室温で２０分間インキュベートした。最大４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を３５０×ｇで５分間回転させた。上清をデカントし、総量を２００μＬにし、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移し、Ａｔｔｕｎｅハイスループットシステムを使用して実行した。フローサイトメトリーＣＤ３４エクスビボパネルには、ＣＤ３４ ＢＶ５１０、ＣＤ９０ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ３８ ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ ＰＥ、およびＧｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０生存率色素が含まれていた。

【0318】

結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。マトリックスタンパク質上で細胞を培養しても、対照細胞と比較して、編集された細胞の生存率および絶対細胞性は増加しなかった。興味深いことに、ＤＬＬ１－Ｆｃ上で培養された細胞は、ＬＴ－ＨＳＣ表現型（ＣＤ３４^＋ＣＤ９１^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ３８^－）を有する細胞数を維持していた。Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃの効果は、ＤＬＬ１－Ｆｃの効果を打ち消した。ＤＬＬ１－ＦｃもＴｅｎａｓｃｉｎ Ｃも、ＮＨＥＪを介した標的組込み効率に影響を与えなかった。

【0319】

実施例１０：ＮＨＥＪ－ＴＩ生着研究２
この研究は、ヒトＣＤ３４^＋細胞において、インビボドナー切断の有無にかかわらず、刺激されたＮＨＥＪを介した標的組込みの実現可能性を決定するために実行した。ここでは、注射前の細胞内ドナー切断の有無にかかわらず、ＮＨＥＪ－ＴＩによって修飾されたＣＤ３４^＋ＨＳＣの生着の可能性を調べた。

【0320】

この研究では、以下の条件で合計２０匹のマウスを使用した。培養対照：３匹のマウス、ＲＮＰのみ：３匹のマウス、ｓｃＡＡＶ６ ０カットのみ：３匹のマウス、ｓｃＡＡＶ６ ２カットのみのマウス：３匹のマウス、ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ０カット：４匹のマウス、およびＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カット：４匹のマウス。

【0321】

５００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／マウス（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用し、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）で培養した。

【0322】

ＲＮＰには、Ｃａｓ９（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｖ２）：ＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が５０：２５０ｐｍｏｌの比率で含まれていた。ｓｃＡＡＶ６ ０カットＮＨＥＪベクター（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはｓｃＡＡＶ６ ２カットＮＨＥＪベクター（配列番号５）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、６０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間のインキュベーションを伴う。

【0323】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0324】

実験のタイムラインは次のとおりであった。０日目（Ｄ０）－細胞を解凍した：１，０００万個の動員されたＣＤ３４^＋ＨＳＣ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。１日目（Ｄ１）－細胞を操作した：ＲＮＰのヌクレオフェクションおよびｓｃＡＡＶ６感染。２日目（Ｄ２）－マウスに注入した：午前中に２００ｃＧｙでマウスに照射し、午後に注入した。６週目－中間採血を行う。９週目－中間採血を行う。１３週目－中間採血を行う。１６週目－エンドポイント分析。

【0325】

細胞培養
分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ－ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。５００，０００細胞／マウスに十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引した。細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁し、低結合Ｔ７５フラスコで総量を少なくとも２０ｍＬにした（最大で２００，０００細胞／ｍＬ）。

【0326】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した（後続の実験のために十分なＲＮＰを解凍した）。細胞を５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰを各ヌクレオフェクションキュベットに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大５０μＬの容量まで添加した。培養フラスコを、各条件について５ｍＬの完全培地を個々のＴ２５フラスコに添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞５０μＬを各キュベットに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、５００μＬの予熱した完全培地を各キュベットに直ちに添加し、細胞を調製した培養フラスコに穏やかにピペッティングした。

【0327】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温め、その間に低結合タンパク質管内でＡＡＶ希釈液を調製した。培養フラスコを、７５０μＬまたは１ｍＬの完全培地および対応する量のＡＡＶ希釈液をＴ７５フラスコに添加することによって調製した。６００μＬのヌクレオフェクトした細胞（５００μＬのレスキュー培地を添加）を、ヌクレオフェクションフラスコから調製したＡＡＶ感染培養フラスコに移し、細胞を、加湿した３７℃の低酸素インキュベーターに６時間戻した。次いで、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、９０×ｇで１０分間回転させ、上清を吸引し、細胞を７．５ｍＬまたは１０ｍＬに再懸濁し、Ｔ７５フラスコに移して一晩培養を続け、細胞のアリコートを保存して、編集分析のために培養を続けた。

【0328】

細胞を収集し、１５ｍＬ円錐管にペレット化し、上清を吸引し、細胞を１６５μＬまたは２２０μＬの注入緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ）に再懸濁した。１０μＬアリコートの細胞を１：１００に希釈し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌを使用してカウントした。残りの細胞を、注入時まで氷上に置いた。操作中の細胞の解凍から注入の準備までの細胞損失のレベルは予想よりも大きく、各マウスは、最大２００，０００個の細胞のみを受容した。

【0329】

細胞の編集効率は次のとおりであった。

【0330】

Ｄ２ ｅＧＦＰレベル：培養対照：０．３１％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰのみ：０．２１％ ｅＧＦＰ^＋、ｓｃＡＡＶ６ ０カットのみ：０．２８％ ｅＧＦＰ^＋、ｓｃＡＡＶ６ ２カットのみ：１．２９％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ０カット：１．１０％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カット：２．９３％ ｅＧＦＰ^＋。

【0331】

Ｄ３ ｅＧＦＰレベル：培養対照：０．０６４％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰのみ：０．１７％ ｅＧＦＰ^＋、ｓｃＡＡＶ６ ０カットのみ：０．３２％ ｅＧＦＰ^＋、ｓｃＡＡＶ６ ２カットのみ：０．７１％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ０カット：１．６４％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カット：４．１４％ ｅＧＦＰ^＋。

【0332】

Ｄ４ ｅＧＦＰレベル：培養対照：０．２４％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰのみ：０．３８％ ｅＧＦＰ^＋、ｓｃＡＡＶ６ ０カットのみ：０．３５％ ｅＧＦＰ^＋、ｓｃＡＡＶ６ ２カットのみ：０．５３％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ０カット：１．６７％ ｅＧＦＰ^＋、ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カット：４．４９％ ｅＧＦＰ^＋。

【0333】

これらのデータは、ドナー切断を採用する場合の編集効率の向上をさらに示す。

【0334】

ｓｃＡＡＶ６ ０カットまたはｓｃＡＡＶ６ ２カットのＮＨＥＪを介した標的組込みによってＤ１において編集されたヒトＣＤ３４^＋細胞をＤ２において注入されたマウスの末梢血からの０、６、９、１３、および１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞（上のパネル）およびＧＦＰ^＋細胞（下のパネル）について、結果を図１９に示し、注入後１６週目にＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カットで処理された細胞を注入されたマウスにおけるＧＦＰ^＋細胞の持続を示し、編集された細胞が長期生着ＨＳＣであったことを示唆する。図２０Ａは、マウスの骨髄から１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞（上のパネル）およびＧＦＰ^＋細胞（下のパネル）の結果を示し、この時点でＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カットで処理された細胞を注入されたマウスにおけるＧＦＰ^＋細胞の持続をさらに示す。図２０Ｂは、１６週目のマウスの骨髄からの総ＣＤ４５^＋細胞のパーセントとしてのｈＣＤ３４^＋、ｈＣＤ３^＋、ｈＣＤ３３^＋、ｈＣＤ１９^＋、および他のｈＣＤ４５^＋細胞の相対量の結果を示し、この時点でＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カットで処理された細胞を注射したマウスにおけるｈＣＤ４５^＋細胞の最大の亜集団が、ＣＤ３３^＋であったことを示す。結果は驚くべきものであり、トランスジェニック画分がしばしば急激に低下する、ＨＳＰＣでのＨＤＲを介した標的組込みで一般的に見られるものとは異なる。

【0335】

実施例１１：ＮＨＥＪ－ＴＩ生着研究３
この研究では、ＮＨＥＪを介した標的組込みプロトコルをさらに最適化した。ＮＨＥＪ－ＴＩによって修飾されたＣＤ３４^＋ＨＳＣの生着能を評価し、操作中の細胞喪失を説明した。ＤＬＬ１－Ｆｃおよび解凍－編集－注入条件で培養されたＣＤ３４^＋ＨＳＣの生着の可能性も評価した。

【0336】

この実験では、３６匹のマウスを使用した。１）ＰＢＳ対照：３匹のマウス、２）培養対照：３匹のマウス、３）ＲＮＰのみ：３匹のマウス、４）ｓｃＡＡＶ６ ０カットのみ：３匹のマウス、５）ｓｃＡＡＶ６ ２カットのみ：３匹のマウス、６）ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ０カット：４匹のマウス、７）ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カット：４匹のマウス、８）ＤＬＬ１コーティングされたプレート上のＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カット：４匹のマウス、９）新鮮な解凍：３匹のマウス、１０）ＲＮＰ＋ｓｃＡＡＶ６ ２カット（Ｄ０編集－解凍－注入）：４匹のマウス。

【0337】

１００万個のＣＤ３４^＋細胞／マウス（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）をＤ１＋１条件に使用した。細胞喪失を説明するために、１６０万個のＣＤ３４^＋細胞／マウスを解凍した。５００，０００個のＣＤ３４^＋細胞／マウスを、新鮮な解凍および培養対照条件に使用した。細胞を、ＳＣＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３Ｌ １００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬを含むＳＦＥＭ－ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９０％ Ｎ_２）で培養した。

【0338】

ＲＮＰには、Ｃａｓ９（Ｆｅｌｄａｎ）：ＡＡＶＳ１ガイドＲＮＡ（配列番号８）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が５０：２５０ｐｍｏｌの比率で含まれていた。ｓｃＡＡＶ６ ０カットＮＨＥＪベクター（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｓｃＡＡＶ６ ２カットＮＨＥＪベクター（配列番号５）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、５０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで使用し、２×１０^６細胞／ｍＬで２時間のインキュベーションを伴う。

【0339】

Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０３２）およびヌクレオフェクションプロトコルＤＺ－１００またはＣＡ－１３７とともに製造元の推奨に従って使用した。

【0340】

研究で使用された実験のタイムラインは、次のとおりであった。０日目（Ｄ０）：細胞を解凍した。Ｄ１＋１注入：４０００万個のＣＤ３４＋細胞（ＧＣＳＦ動員）。１日目（Ｄ１）：Ｄ１＋１細胞を操作した。ＲＮＰのヌクレオフェクションおよびｓｃＡＡＶ６感染。２日目（Ｄ２）：マウスに注射した。午前－２００ｃＧｙでマウスに照射した。Ｄ０解凍－編集－注入条件：細胞を操作した。午後－Ｄ１＋１条件：マウスに注入した。Ｄ０条件：マウスに注入した。８、１０、１２、および１４週目：中間採血。１６週目：エンドポイント分析。

【0341】

細胞培養
分注された培地およびサイトカインを、使用直前に解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ－ＩＩに添加して完全培地を作成し、３７℃に温めた。１，６００，０００細胞／マウスに十分なｈＣＤ３４^＋のバイアルを解凍し（細胞喪失を説明する）、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、ＣＤ３４^＋培養培地とともに、総量を最大１５ｍＬにした。細胞を９０×ｇで９分間回転させ、上清を吸引した。細胞を１ｍＬのＣＤ３４^＋培養培地に再懸濁し、低結合Ｔ７５フラスコで総量を少なくとも２０ｍＬにした（最大で２５０，０００細胞／ｍＬ）。

【0342】

ＲＮＰヌクレオフェクション
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を、各ウェルに適切なプログラムで使用した。ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３をサプリメントと事前に混合し、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰを前述のように調製し、１０μＬ／管で分注した（後続の実験のために十分なＲＮＰを解凍した）。細胞を５０ｍＬ管に収集し、１００μＬ（全体の１：１００）の細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲを使用して生存率および細胞濃度を測定するために１ｍＬ（１：１０希釈）に希釈した。細胞を９０×ｇで１０分間回転させ、その間に対応する量のＲＮＰを各ヌクレオフェクションキュベットに添加し、ヌクレオフェクション試薬を最大５０μＬの容量まで添加した。培養フラスコを、各条件について５ｍＬの完全培地を個々のＴ２５フラスコに添加することによって調製した。細胞上清を吸引またはデカントし、緩衝液Ｐ３＋サプリメントの試料あたり１／２量で細胞を再懸濁した。ヌクレオフェクション試薬中の細胞５０μＬを各キュベットに添加し、ヌクレオフェクターを製造元のプロトコルに従って実行した。ヌクレオフェクション後、５００μＬの予熱した完全培地を各キュベットに直ちに添加し、細胞を調製した培養フラスコに穏やかにピペッティングした。

【0343】

ＡＡＶ感染
ＡＡＶを氷上で解凍した。解凍したサイトカインおよび小分子を、ＳＦＥＭ ＩＩに添加して、使用直前に完全培地を作成し、３７℃に温め、その間に低結合タンパク質管内でＡＡＶ希釈液を調製した。培養フラスコを、７５０μＬまたは１ｍＬの完全培地および対応する量のＡＡＶ希釈液をＴ７５フラスコに添加することによって調製した。６００μＬのヌクレオフェクトした細胞（５００μＬのレスキュー培地を添加）を、ヌクレオフェクションフラスコから調製したＡＡＶ感染培養フラスコに移し、細胞を、加湿した３７℃の低酸素インキュベーターに６時間戻した。次いで、細胞を１５ｍＬ円錐管に移し、９０×ｇで１０分間回転させ、上清を吸引し、細胞を７．５ｍＬまたは１０ｍＬ培地に再懸濁し、Ｔ７５フラスコに移して一晩培養を続け、細胞のアリコートを保存して、編集分析のために培養を続けた。

【0344】

細胞を収集し、１５ｍＬ円錐管にペレット化し、上清を吸引し、細胞を１６５μＬまたは２２０μＬの注入緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ）に再懸濁した。１０μＬアリコートの細胞を１：１００に希釈し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌを使用してカウントした。残りの細胞を、注入時まで氷上に置いた。

【0345】

ＤＬＬ１－Ｆｃ条件固有のプロトコル：１）Ｔ７５フラスコを、実施例９で前述したようにＤＬＬ１－Ｆｃでコーティングした。２）細胞を解凍し、ＤＬＬ１－Ｆｃでコーティングされたプレート上で一晩培養した。３）操作のために細胞を剥離するために、上清を収集し、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＥＤＴＡとともに５分間２回インキュベートした。４）細胞を上記のように編集した。５）ＲＮＰヌクレオフェクション後、新しいＤＬＬ１－ＦｃでコーティングされたＴ７５フラスコでＡＡＶ感染を行った。６）細胞を一晩培養した。７）細胞を上記のように注入用に調製したが、再度、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡ中で５分間２回インキュベートした。

【0346】

解凍－編集－注入条件固有のプロトコル：１）細胞を注入日に解凍した。２）細胞を低付着Ｔ７５フラスコ内の完全培地で１時間静置した。３）細胞を上記のように操作した。４）ＡＡＶ感染の２時間後、細胞を希釈する代わりに収集し、注入用に調製した。

【0347】

各マウスは、必要な数の細胞を受容した（培養対照の場合は５００，０００細胞／マウス、他の条件の場合は１，０００，０００細胞／マウス）。結果を図２１、２２Ａ～２２Ｄ、２３Ａ～２３Ｄ、２４Ａ～２４Ｄ、２５Ａ～２５Ｄ、２６Ａ～２６Ｄ、２７Ａ、２７Ｂ、２８Ａ～２８Ｃ、および２９Ａ～２９Ｃに示す。

【0348】

細胞の初期編集効率は次のとおりであった。培養対照：０．０１％ ＧＦＰ^＋、ＲＮＰのみ：０．６２％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ０カットのみ：０．４２％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ２カットのみ：０．７３％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ０カット＋ＲＮＰ：１．５４％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ：３．０７％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ＋ＤＬＬ１－Ｆｃ：２．４９％ ＧＦＰ^＋、新鮮な解凍：０．２４％ ＧＦＰ^＋、新鮮な解凍ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ：２．５８％ ＧＦＰ^＋、ここで培養対照、ＲＮＰのみ、ＡＡＶ ０カットのみ、ＡＡＶ ２カットのみ、および新鮮な解凍条件のＧＦＰ^＋シグナルのパーセンテージは、バックグラウンドノイズである。これらのデータは、ドナー切断を採用する場合の編集効率の向上をさらに示す。

【0349】

１６週間後の骨髄生着のパーセンテージ：培養対照：３８％±２７％ ｈＣＤ４５^＋、ＲＮＰのみ：３７％±２５％ ｈＣＤ４５^＋、ＡＡＶ ０カットのみ：１９％±８．４％ ｈＣＤ４５^＋、ＡＡＶ ２カットのみ：２３％±１７％ ｈＣＤ４５^＋、ＡＡＶ ０カット＋ＲＮＰ：１８％±１１％ ｈＣＤ４５^＋、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ：１５％±６．７％ ｈＣＤ４５^＋、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ＋ＤＬＬ１－Ｆｃ：３５％±１９％ ｈＣＤ４５^＋、新鮮な解凍：３８％±６．６％ ｈＣＤ４５^＋、新鮮な解凍ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ：４７％±１２％ ｈＣＤ４５^＋。１６週目のｈＣＤ４５^＋細胞の生着の最大量は、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰを用いた新鮮な解凍条件で観察された。

【0350】

１６週間後の骨髄ＧＦＰ^＋パーセンテージ：培養対照：０．３０％±０．１９％ ＧＦＰ^＋、ＲＮＰのみ：０．７６％±０．１４％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ０カットのみ：０．６４％±０．３３％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ２カットのみ：０．７０％±０．０１３％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ０カット＋ＲＮＰ：１．３６％±０．０７７％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ：４．１％±０．９０％ ＧＦＰ^＋、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ＋ＤＬＬ１－Ｆｃ：３．６％±１．９％ ＧＦＰ^＋、新鮮な解凍：０．６６％±０．０３９％ ＧＦＰ^＋、新鮮な解凍ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ：２．４％±１．７％ ＧＦＰ^＋、ここで培養対照、ＲＮＰのみ、ＡＡＶ ０カットのみ、ＡＡＶ ２カットのみ、および新鮮な解凍条件のＧＦＰ^＋シグナルのパーセンテージは、バックグラウンドノイズである。１６週目のＧＦＰ^＋細胞の最大量は、ＡＡＶ ２カット＋ＲＮＰ条件で観察された。図２９Ｂに示されるように、末梢出血からのｈＣＤ４５＋細胞の画分としてのＧＦＰ＋細胞の量は、ＮＨＥＪを介した編集のためにＲＮＰ＋ＡＡＶで処理した細胞を注入されたマウスでは、１６週目まで安定しており、編集されたＨＳＣが長期生着ＨＳＣであったことを示す。

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【表10-4】

【表10-5】

【表10-6】

【表10-7】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A-1】

【図9A-2】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19-1】

【図19-2】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【配列表】

2022513407000001.app

【国際調査報告】