▶ ソリッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-08
(54)【発明の名称】筋ジストロフィーの治療のための併用療法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20220201BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220201BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220201BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220201BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220201BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220201BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220201BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20220201BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220201BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20220201BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20220201BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20220201BHJP
A61K 38/46 20060101ALN20220201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/09 110
A61P21/00
A61K48/00
A61P43/00 105
A61K9/08
A61K47/22
A61K47/02
A61K35/761
C12N7/01
A61K31/7088
A61K38/46
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021533367
(86)(22)【出願日】2019-12-11
(85)【翻訳文提出日】2021-08-10
(86)【国際出願番号】 US2019065718
(87)【国際公開番号】W WO2020123645
(87)【国際公開日】2020-06-18
(31)【優先権主張番号】62/778,646
(32)【優先日】2018-12-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】521254373
【氏名又は名称】ソリッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】ラム，センディル
(72)【発明者】
【氏名】シュナイダー，ジョエル
(72)【発明者】
【氏名】モーガン，キャシー・イェ
(72)【発明者】
【氏名】ツェン，ウェン・アレン
(72)【発明者】
【氏名】オズソロック，ファティ
(72)【発明者】
【氏名】ソウステック－クレーマ，メーガン
(72)【発明者】
【氏名】レイズ，エリック
(72)【発明者】
【氏名】マンダーバ，サラット
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91X
4B065AA93Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA12
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB21
4C076CC09
4C076DD23
4C076DD60
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084DC50
4C084MA05
4C084MA17
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZB211
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA94
4C086ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087MA05
4C087MA17
4C087MA55
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA94
4C087ZB21
(57)【要約】
本明細書に記載の本発明は、遺伝子治療ベクター、例えば、機能性タンパク質（微小ヒトマイクロジストロフィン遺伝子産物等）ならびにＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のガイド配列（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのｃｒＲＮＡ等）、及び／またはマイクロＲＮＡに対する１つ以上のさらなるコード配列を共発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ならびに筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ／ＢＭＤに罹患した対象を治療するための該ベクターの使用方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む組み換えウイルスベクター：ａ）目的の機能性遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、例えば、筋ジストロフィーの治療に有効なもの、ここで、前記ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲコード領域を含み、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記機能性タンパク質の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあるもの、
ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する制御要素（例えば、筋特異的制御要素）、ならびに
ｃ）前記イントロン配列または前記３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上のコード配列、
ここで、前記１つ以上のコード配列は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のガイド配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
【請求項2】
前記組み換えウイルスベクターが、組み換えＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターである、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項3】
前記１つ以上のコード配列が、前記３’－ＵＴＲコード領域に、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）の後に挿入される、請求項１または２に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項4】
前記機能性ＧＯＩの発現が、前記１つ以上のコード配列の存在下で実質的に影響を受けない（例えば、前記１つ以上のコード配列が挿入されていない以外は同一の対照構築物と比較して）、請求項１～３のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクターであって：ａ）前記ポリヌクレオチドが、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィンマイクロ遺伝子またはミニ遺伝子であり、及び／または
ｂ）前記制御要素が、前記ジストロフィンミニ遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的プロモーターである、前記組み換えウイルスベクター。
【請求項6】
前記機能性ジストロフィンタンパク質が、マイクロＤ５であり、及び／または前記筋特異的プロモーターが、ＣＫプロモーターである、請求項５に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項7】
前記１つ以上のコード配列が、欠陥ジストロフィンのエクソンのスキッピング、例えば、ジストロフィンのエクソン４５～５５のいずれか１つ、またはジストロフィンのエクソン４４、４５、５１、及び／または５３のスキッピングを誘導するエクソンスキッピングアンチセンス配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項8】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、及び／またはｍｉＲ－２０６である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項9】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－２９ｃであり、標的配列用にデザインされたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを促進する修飾隣接骨格配列を任意に有する、請求項８に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項10】
前記修飾隣接骨格配列が、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１に由来するか、またはそれに基づく、請求項９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項11】
宿主細胞での前記マイクロＲＮＡの発現が、前記宿主細胞での前記マイクロＲＮＡの内因性の発現と比較して、少なくとも約１．５～１５倍（例えば、約２～１０倍、約１．４～２．８倍、約２～５倍、約５～１０倍、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５倍）上方制御される、請求項８～１０のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項12】
前記ＲＮＡｉ配列が、サルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項13】
前記１つ以上のコード配列が、１つ以上の同一または異なるサルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項14】
前記ｓｈＲＮＡが、サルコリピンのｍＲＮＡ及び／またはサルコリピンタンパク質の発現を少なくとも約５０％減少させる、請求項１２または１３に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項15】
前記ＧＯＩが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、前記ガイド配列が、ｓｇＲＮＡ（一本鎖ガイドＲＮＡ）であるか、または、前記ＧＯＩが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａであり、前記ガイド配列が、ｃｒＲＮＡである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項16】
前記ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、前記アンチセンス配列、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡ、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのｃｒＲＮＡ及び／または前記マイクロＲＮＡが、１つ以上の標的遺伝子、例えば、炎症遺伝子、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ））、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－κＢによって誘導される下流の炎症性サイトカイン、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ２）、ＴＧＦ－β、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、コラーゲン、エラスチン、細胞外マトリックスの構成成分、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ミオスタチン、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）またはＡＣＥ、ＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１またはＦｌｔ－１）、及び造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）の機能に拮抗する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項17】
請求項１に記載の組み換えウイルスベクターであって：福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）患者において、
ａ）前記ポリヌクレオチドが、機能性フクチン（ＦＫＴＮ）タンパク質をコードし、及び／または
ｂ）前記１つ以上のコード配列が、欠陥ＦＫＴＮ遺伝子の正確なエクソン１０のスプライシングを回復するエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする、前記組み換えウイルスベクター。
【請求項18】
請求項１に記載の組み換えウイルスベクターであって：メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）患者において、
ａ）前記ポリヌクレオチドが、機能性ＬＡＭＡ２タンパク質をコードし、及び／または
ｂ）前記１つ以上のコード配列が、欠陥ＬＡＭＡ２遺伝子のＣ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特に、Ｇ４及びＧ５の発現を回復するエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする、前記組み換えウイルスベクター。
【請求項19】
請求項１に記載の組み換えウイルスベクターであって：ＤＭ１患者において、
ａ）前記ポリヌクレオチドが、機能性ＤＭＰＫタンパク質、またはＣＬＣＮ１遺伝子をコードし、及び／または
ｂ）前記ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、前記アンチセンス配列、または前記マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、欠陥ＤＭＰＫ遺伝子の変異転写産物の伸長リピートを標的とし、もしくは、ＣＬＣＮ１遺伝子のエクソン７Ａのスキッピングにつながるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする、前記組み換えウイルスベクター。
【請求項20】
請求項１に記載の組み換えウイルスベクターであって：ジスフェリン異常症（ＬＧＭＤ２ＢまたはＭＭ）患者において、
ａ）前記ポリヌクレオチドが、機能性ＤＹＳＦタンパク質をコードし、及び／または
ｂ）１つ以上のコード配列が、欠陥ＤＹＳＦ遺伝子のエクソン３２のスキッピングにつながるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする、前記組み換えウイルスベクター。
【請求項21】
請求項１に記載の組み換えウイルスベクターであって：ＬＧＭＤ２Ｃ患者において、
ａ）前記ポリヌクレオチドが、機能性ＳＧＣＧタンパク質をコードし、及び／または
ｂ）１つ以上のコード配列が、欠陥ＬＧＭＤ２Ｃ遺伝子（例えば、Δ－５２１ＴのＳＧＣＧ変異を有するもの）のエクソン４～７のスキッピングにつながるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする、前記組み換えウイルスベクター。
【請求項22】
前記異種イントロン配列が、配列番号１である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項23】
前記１つ以上のコード配列が、前記イントロン配列に挿入される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項24】
前記機能性タンパク質の発現が、前記１つ以上のコード配列の挿入による悪影響を受けない、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項25】
前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３の組み換えＡＡＶベクターである、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項26】
前記制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子素、心筋型アクチン遺伝子素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子素、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子素、遅筋トロポニンｉ遺伝子素、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性因子、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項27】
前記制御要素が、ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクターを含む組成物。
【請求項29】
医薬組成物である請求項２８に記載の組成物であって、さらに、治療上適合性のある担体、希釈剤、または賦形剤を含む、前記組成物。
【請求項30】
前記治療上許容される担体、希釈剤、または賦形剤が、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
少なくとも１．６×１０１３のベクターゲノムを有する水溶液約１０ｍＬの剤形である、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項32】
１ミリリットルあたり少なくとも２×１０１２のベクターゲノムの効力を有する、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項33】
細胞内で前記組み換えウイルスベクター（例えば、前記組み換えＡＡＶベクター）を生成し、前記細胞を溶解して前記ベクターを得ることを含む、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の組成物を生成する方法。
【請求項34】
前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３の組み換えＡＡＶベクターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
治療を必要とする対象における筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載の組み換えウイルスベクター（例えば、前記組み換えＡＡＶベクター）、または請求項２８～３２のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項36】
前記組み換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、筋肉注射、静脈内注射、非経口投与または全身投与によって投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、ジスフェリン異常症、筋緊張性ジストロフィー、及びメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、または肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤＲ５またはＬＧＭＤ２Ｃ）である、請求項３５または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／７７８，６４６号の優先権及びその出願日の利益を主張する。その全内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／７７８，６４６号の優先権及びその出願日の利益を主張する。その全内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、進行性衰弱及び筋肉量の損失を引き起こす疾患群である。筋ジストロフィーでは、異常遺伝子（突然変異遺伝子）は、健康な筋肉を形成するために必要な機能性の野生型タンパク質を産生しない。
【0003】
筋ジストロフィーは、罹患患者の生活の質を深刻に悪化させる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、新生男児の５，０００人に１人が罹患する最も深刻な筋肉疾患の１つである。これは、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の突然変異に起因する最もよく特徴付けられた筋ジストロフィーである。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋細胞膜鞘－細胞骨格連結の喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。
【0004】
具体的には、ＤＭＤはＤＭＤ遺伝子の突然変異によって引き起こされ、ＤＭＤのｍＲＮＡの減少及びジストロフィンまたは機能的ジストロフィン、すなわち、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に関連する４２７ｋＤａの筋細胞膜鞘タンパク質の欠如につながる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－９２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、筋細胞膜鞘において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び細胞骨格間に、ジストロフィン、すなわち、アクチン結合タンパク質、及びアルファ－ジストログリカン、すなわち、ラミニン結合タンパク質を介した構造的関連を形成する複数のタンパク質で構成されている。これらの構造的関連は、収縮時に筋細胞膜を安定させ、収縮による損傷を防ぐように作用する。
【0005】
ＤＭＤ遺伝子突然変異の結果としてのジストロフィンの損失により、ジストロフィン糖タンパク質複合体が破壊され、筋膜の脆弱性が増加する。筋形質へのカルシウムの流入、プロテアーゼ及び炎症性サイトカインの活性化、ならびにミトコンドリア機能不全等の一連の事象は、進行性の筋変性をもたらす。さらに、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の転位は、組織虚血、酸化ストレスの増加、及び修復の障害に寄与する。疾患の進行は、筋壊死、線維化、及び脂肪組織置換の増加、ならびにその後の筋生検で見られる線維サイズの変化の程度がより大きいことによって特徴付けられる。
【0006】
蓄積されたエビデンスは、細胞内Ｃａ２＋（Ｃａ２＋
ｉ）の異常な上昇が、ＤＭＤにおける疾患の進行を開始し、永続させる重要な早期の病原性事象であることを示唆している。筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）ポンプの正常機能は、サイトゾルからの＞７０％のＣａ２＋除去及び適切な筋収縮の主要因である。ＳＥＲＣＡ活性の低下は、それ故、ＤＭＤにおけるＣａ２＋
ｉ過負荷及び筋機能不全の主な原因と考えられている。
【0007】
現在のところ、ＤＭＤの治療法はない。標準治療としては、コルチコステロイド（プレドニゾンまたはデフラザコート等）を投与し、筋力及び機能を安定させること、独立歩行を延長させること、ならびに脊柱側彎及び心筋症を遅延させること、ビスホスフォネート、ならびにデノスマブ及び組み換え副甲状腺ホルモンが挙げられる。
【0008】
遺伝子治療の出現により、ＤＭＤ治療の研究及び臨床試験は、ジストロフィン機能を少なくとも部分的に回復させることを目的とした遺伝子置換または他の遺伝子治療に焦点を合わせている。これらには、ジストロフィン遺伝子の機能性コピー、例えば、ジストロフィンミニ遺伝子の供給、またはエクソンスキッピング及びナンセンス変異抑制による欠陥ジストロフィン遺伝子産物の修復が含まれる。
【0009】
しかしながら、ジストロフィンの突然変異によって引き起こされる影響の範囲は広いため、ジストロフィンの一次突然変異に関連する他の二次的症状を治療する必要がある。
例えば、ジストロフィンの損失は、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の損失につながり、これは次に、ｎＮＯＳによる一酸化窒素（ＮＯ）の産生、及びＨＤＡＣ２の異常なＮ－ニトロシル化につながる。かかる異常にＮ－ニトロシル化されたＨＤＡＣ２は、クロマチンから解離し、特定のマイクロＲＮＡのカスケードの阻害を解放し、これが次に、線維化及び酸化ストレスの増加等の多数の下流の事象につながる。
例えば、ジストロフィンの損失は、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の損失につながり、これは次に、ｎＮＯＳによる一酸化窒素（ＮＯ）の産生、及びＨＤＡＣ２の異常なＮ－ニトロシル化につながる。かかる異常にＮ－ニトロシル化されたＨＤＡＣ２は、クロマチンから解離し、特定のマイクロＲＮＡのカスケードの阻害を解放し、これが次に、線維化及び酸化ストレスの増加等の多数の下流の事象につながる。
【0010】
特に、線維化に関しては、ジストロフィンが損失すると、膜の脆弱性により、筋細胞膜鞘の分裂及びカルシウムの流入が生じ、カルシウム活性化プロテアーゼ及び分節状線維壊死を誘発する（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８－１７５，１９９７）。この制御不能な筋変性と筋再生のサイクルは、最終的に筋幹細胞集団を枯渇させ（Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４３（７）：１０５９－１０７１，２０１０、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７１：３７－５７，２００９）、進行性筋衰弱、筋内膜炎症、及び線維性瘢痕を引き起こす。
【0011】
ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンによる膜安定化がないため、ＤＭＤでは、制御不能な組織の傷害と修復のサイクルが現れ、最終的に結合組織の増殖を介して、失われた筋線維が線維性瘢痕組織で置き換わる。
【0012】
ＤＭＤと診断された最低年齢（例えば、４～５歳）で行われた筋生検は、顕著な結合組織の増殖を明らかにしている。筋線維症は、様々な点で有害である。それは、結合組織バリアを介した筋内膜栄養素の正常な通過を減らし、血流を減らし、筋肉から血管由来の栄養成分を奪い、機能的には、四肢拘縮による歩行の早期喪失の一因となる。時間の経過とともに、筋肉の著しい線維化による治療の課題が増加する。これは、連続した時点での結合組織の増殖を比較する筋生検で観察され得る。この過程は悪化を続け、歩行の喪失につながり、特に、車椅子に依存している患者では、加速して制御不能になる。
【0013】
従って、線維性浸潤は、ＤＭＤでは深刻であり、任意の治療の可能性を妨げる重大な障害である。この関連で、単独の遺伝子置換療法は、ＤＭＤの幼児にすでに存在する重度の線維化によって通常は妨げられる。
【0014】
線維症は、コラーゲン及びエラスチン等のＥＣＭ基質タンパク質の過剰な沈着を特徴とする。ＥＣＭタンパク質は主に、サイトカイン、例えば、ストレス及び炎症に反応して活性化した線維芽細胞によって放出されるＴＧＦから産生される。ＤＭＤの主な病理学的特徴は、筋線維の変性及び壊死であるが、病理学的帰結としての線維症は、同等の影響を与える。線維性組織の過剰産生は、筋再生を制限し、ＤＭＤ患者の進行性筋衰弱の一因となる。
【0015】
ある研究では、最初のＤＭＤ筋生検での線維化の存在が、１０年間の追跡調査での運動転帰不良と高度に相関した（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６８（７）：７６２－７６７，２００９）。これらの結果は、線維化がＤＭＤの筋機能不全の主要原因であることを示しており、線維性組織を減少させる治療法を開発する必要性を強調している。
【0016】
ｍｄｘマウスで試験されたほとんどの抗線維化治療は、ＴＧＦ経路の阻害を通じて線維化サイトカインのシグナル伝達をブロックするように作用する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡであり、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の塩基と対合することにより転写後レベルで遺伝子抑制を仲介し、翻訳を阻害するか、またはｍＲＮＡの分解を促進する。該ｍｉＲＮＡの５’末端にある７ｂｐのシード配列は、該ｍｉＲＮＡを標的とし、さらなる認識は、該標的配列の残部及びその二次構造によって提供される。ｍｉＲＮＡは筋疾患の病理において重要な役割を果たし、問題の筋ジストロフィーの型に独自に依存する発現プロファイルを示す（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。相次ぐエビデンスは、心臓、肝臓、腎臓、及び肺等の多くの臓器でｍｉＲＮＡが線維化過程に関与していることを示唆している（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡであり、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の塩基と対合することにより転写後レベルで遺伝子抑制を仲介し、翻訳を阻害するか、またはｍＲＮＡの分解を促進する。該ｍｉＲＮＡの５’末端にある７ｂｐのシード配列は、該ｍｉＲＮＡを標的とし、さらなる認識は、該標的配列の残部及びその二次構造によって提供される。ｍｉＲＮＡは筋疾患の病理において重要な役割を果たし、問題の筋ジストロフィーの型に独自に依存する発現プロファイルを示す（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。相次ぐエビデンスは、心臓、肝臓、腎臓、及び肺等の多くの臓器でｍｉＲＮＡが線維化過程に関与していることを示唆している（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。
【0017】
最近、ｍｉＲ－２９の下方制御が心筋線維化に寄与することが示された（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １２（４）：３４１－３５１，２０１０）。ｍｉＲ－２９の発現低下は、ヒトＤＭＤ患者の筋肉と遺伝的に関連していた（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。
【0018】
ｍｉＲ－２９ファミリーは、２つのバイシストロン性ｍｉＲＮＡクラスターから発現する３つのファミリーメンバーからなる。ｍｉＲ－２９ａは、ｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－１）と共発現し、ｍｉＲ－２９ｃは、ｍｉＲ－２９ｂの第２のコピー（ｍｉＲ－２９ｂ－２）と共発現する。ｍｉＲ－２９ファミリーは、保存されたシード配列を共有しており、ｍｉＲ－２９ａとｍｉＲ－２９ｂは、各々、ｍｉＲ－２９ｃと１塩基異なるのみである。さらに、ｍｄｘマウス筋へのｍｉＲ－２９プラスミド（ｍｉＲ－２９ａ及びｍｉＲ－２９ｂ－１のクラスター）のエレクトロポレーションは、ＥＣＭ成分、コラーゲン及びエラスチンの発現レベルを低下させ、処理後２５日以内で筋肉部位におけるコラーゲン沈着を大幅に減少させた（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １２（４）：３４１－３５１，２０１０）。
【0019】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂの長さであり、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。
【0020】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の機能を有する。培養細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症状及び無症候である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳類細胞に感染するため、インビボで多くの異なる組織を標的にすることが可能になる。さらに、ＡＡＶは、分裂が遅い細胞及び非分裂細胞への形質導入を引き起こし、基本的にそれらの細胞の生涯にわたって、転写活性のある核エピソーム（染色体外因子）として存続することができる。ＡＡＶのプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローン化されたＤＮＡとして感染性であり、これにより、組み換えゲノムの構築が可能になる。さらに、ＡＡＶの複製、ゲノムのカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルはＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、該ゲノムの内部約４．３ｋｂの一部またはすべて（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、外来ＤＮＡ、例えば、プロモーター、目的のＤＮＡ及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットと交換され得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、ｔｒａｎｓで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、これが非常に安定した豊富なウイルスであるということである。アデノウイルスの不活化に使用される条件（５６°～６５℃で数時間）に容易に耐えるため、ＡＡＶの低温保存はそれほど重要ではない。ＡＡＶは、凍結乾燥される場合もある。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は、重複感染に対して耐性はない。
【0021】
複数の研究により、筋肉では、長期（＞１．５年）の組み換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証された。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４：２１７－２２２（２００１）も参照のこと。さらに、筋肉は高度に血管新生されているため、組み換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載の通り、筋肉注射後の体循環において導入遺伝子産物が出現した。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正確な抗体グリコシル化、フォールディング、及び分泌に必要な細胞因子を有することを示し、筋肉は、分泌タンパク質治療の安定発現が可能であることを示している。
【0022】
ＡＡＶベクターを使用した遺伝子治療は、この部門への多大な投資を奨励しているが、商業化には重要な課題が残る。組み換えウイルスベクターの生産は複雑であると考えられており、生産のスケールアップは技術的に大きな課題であり、商業化には大きな障壁であると見なされる。
【0023】
具体的には、ＡＡＶベースのウイルスベクターについて報告されている臨床用量は、治療領域に応じて、患者あたり１０１１～１０１４のゲノム粒子（ベクターゲノム、ｖｇ）に及ぶ。従って、より広い遺伝子治療開発の観点から、現在のスケールアップアプローチは、後の相（例えば、第ＩＩ／ＩＩＩ相）の追跡を進めるために必要な投与回数を供給するには不十分であり、ひいては、遺伝子治療薬の開発を遅らせている。これは、臨床試験の大部分が非常に小規模で、患者数＜１００人（場合によっては＜１０人）で行われ、ごくわずかな量の製品を生成する接着細胞トランスフェクション過程を使用しているという事実によって裏付けられている。後の相の進展に必要なウイルスの予測量を現在の生産性（例えば、単一の１０層セルファクトリーから５×１０１１ｖｇ）と比較すると、このアプローチが、「標準」遺伝子治療の適応症はもちろん、高用量及び小患者コホートの超希少疾患であっても後の相に対する材料要件及び市場のニーズには不十分であるという現実の懸念がある。
【0024】
Ｃｌｅｍｅｎｔ及びＧｒｉｅｇｅｒが最近の総説（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６００２、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．２）で述べているように、「臨床環境でのｒＡＡＶの使用は、極めて大量の高純度ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な生産及び精製システムに対する差し迫ったニーズを強調している。典型的なＦＤＡ承認治験薬には、毒物学、安全性、用量、及び生体内分布の評価のための広範な前臨床研究が含まれており、ベクターの要件は、多くの場合、１Ｅ１５～１Ｅ１６のベクターゲノムの範囲に達する。かかる量を製造することは、技術的には実現可能であるが、現在の生産システムを用いた場合、依然として信じられないほどの努力を意味する。」
この問題は、体系的に（局所的にの対語として）送達されることが望ましいＡＡＶベクターの場合に特に緊急である。最近の論文において、Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６０３１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．３１）は、以下のように述べている。「ベクターの生産及び精製における現在の制約は、特に、全身投与が検討される場合、臨床候補ベクターの広範な実施を妨げる。…これは、しばしば高ＡＡＶ用量での全身投与に依存する全身への遺伝子導入が必要になる可能性がある場合、筋ジストロフィー等の先天性遺伝性疾患の治療に特に当てはまる。」実際、筋ジストロフィーの臨床試験におけるｒＡＡＶの以前の研究では、全身投与を支援するために必要な量を生成するための大規模な生産能力が多くの場合不足しているために、筋肉注射を介してベクターを送達している。併用療法における２つのＡＡＶベクターの体系的送達は、その併用療法に必要な高品質のＡＡＶベクターを十分な量生産するという点で、さらに大きな課題をもたらす。
この問題は、体系的に（局所的にの対語として）送達されることが望ましいＡＡＶベクターの場合に特に緊急である。最近の論文において、Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６０３１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．３１）は、以下のように述べている。「ベクターの生産及び精製における現在の制約は、特に、全身投与が検討される場合、臨床候補ベクターの広範な実施を妨げる。…これは、しばしば高ＡＡＶ用量での全身投与に依存する全身への遺伝子導入が必要になる可能性がある場合、筋ジストロフィー等の先天性遺伝性疾患の治療に特に当てはまる。」実際、筋ジストロフィーの臨床試験におけるｒＡＡＶの以前の研究では、全身投与を支援するために必要な量を生成するための大規模な生産能力が多くの場合不足しているために、筋肉注射を介してベクターを送達している。併用療法における２つのＡＡＶベクターの体系的送達は、その併用療法に必要な高品質のＡＡＶベクターを十分な量生産するという点で、さらに大きな課題をもたらす。
【0025】
従って、ＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーに罹患した患者の機能改善には、遺伝子の回復及び線維化等のいくつかの二次カスケードに関連する症状の軽減の両方が必要である。代替的にまたはさらに、筋ジストロフィーは、異なる疾患の原因となる経路を同時に標的とする治療から利益を得る可能性がある。より効果的なＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーの治療のための遺伝子回復法と組み合わせられ得るかかる二次カスケード症状（例えば、線維化）を軽減する方法が必要である。かかる併用療法は、特に、遺伝子治療ベクターの体系的送達において、両方の治療成分を標的組織に送達するのに十分な量の遺伝子治療ベクターを生産するという重要な臨床的及び商業的課題もまた克服しなければならない。
【発明の概要】
【0026】
本明細書に記載の本発明は、遺伝子治療用のウイルスベクターを提供し、該ベクターは、第１のポリペプチドまたは第１のＲＮＡ、及び第２のポリペプチドまたは第２のＲＮＡを同時にコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【0027】
例えば、該ベクターは、第１の治療用タンパク質及び第２の治療用ＲＮＡを同時にコードし得る。
しかしながら、該第１のもしくは該第２のＲＮＡのいずれか、またはその両方は、タンパク質もポリペプチドも産生しない非コードＲＮＡでもよい。かかる非コードＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡ、例えば、Ｘｉｓｔ及びＨＯＴＡＩＲ、アンチセンスＲＮＡ、またはそれらの前駆体でよく、好ましくは治療効果、例えば、がん、自閉症、アルツハイマー病、軟骨毛髪形成不全、難聴、及びプラダー・ウィリー症候群、特に、ＤＭＤ／ＢＭＤを含めた様々な型の筋ジストロフィー（ＭＤ）等の疾患と関連するものを有する。
しかしながら、該第１のもしくは該第２のＲＮＡのいずれか、またはその両方は、タンパク質もポリペプチドも産生しない非コードＲＮＡでもよい。かかる非コードＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡ、例えば、Ｘｉｓｔ及びＨＯＴＡＩＲ、アンチセンスＲＮＡ、またはそれらの前駆体でよく、好ましくは治療効果、例えば、がん、自閉症、アルツハイマー病、軟骨毛髪形成不全、難聴、及びプラダー・ウィリー症候群、特に、ＤＭＤ／ＢＭＤを含めた様々な型の筋ジストロフィー（ＭＤ）等の疾患と関連するものを有する。
【0028】
かかる非コードＲＮＡはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質の単一または複数のガイドＲＮＡ（複数可）の場合もあれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（かつてはＣｐｆ１）タンパク質のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の場合もある。
【0029】
従って、１つの態様では、本発明は、以下を含む組み換えウイルスベクターを提供する：ａ）目的の機能性遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、例えば、筋ジストロフィーの治療に有効なもの、ここで、該ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ポリヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあるもの、ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する制御要素（例えば、筋特異的制御要素）、ならびにｃ）該イントロン配列または該３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上のコード配列、ここで、該１つ以上のコード配列は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のガイド配列（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのａｃｒＲＮＡ等）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
【0030】
ある特定の実施形態では、該組み換えウイルスベクターは、組み換えＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターまたは組み換えレンチウイルスベクターである。
関連する態様では、本発明は、以下を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する：ａ）筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで、該ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ポリヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあるもの、ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的制御要素、ならびにｃ）該イントロン配列または該３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上のコード配列、ここで、該１つ以上のコード配列は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
関連する態様では、本発明は、以下を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する：ａ）筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで、該ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ポリヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあるもの、ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的制御要素、ならびにｃ）該イントロン配列または該３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上のコード配列、ここで、該１つ以上のコード配列は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
【0031】
特定の実施形態では、本明細書に記載の本発明は、以下を含むウイルスベクター、例えば、組み換えＡＡＶベクターを提供する：ａ）機能性マイクロジストロフィンタンパク質（例えば、マイクロＤ５）をコードするジストロフィンマイクロ遺伝子またはミニ遺伝子、ここで、該ジストロフィンマイクロ遺伝子またはミニ遺伝子は、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ジストロフィンマイクロ遺伝子またはミニ遺伝子の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあるもの、ｂ）該ジストロフィンマイクロ遺伝子またはミニ遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的制御要素、ならびにｃ）該イントロン配列または該３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）のコード配列（複数可）、ここで、該１つ以上のコード配列（複数可）は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
【0032】
ある特定の実施形態では、該機能性ジストロフィンタンパク質は、マイクロＤ５であり、及び／または該筋特異的制御要素／プロモーターは、ＣＫプロモーターである。
本発明は、一部は、該１つ以上のコード配列（複数可）を、ある特定の位置、例えば、異種イントロンに挿入することができると同時に、該機能性タンパク質（例えば、該ジストロフィンミニ遺伝子産物）のみまたは該１つ以上のコード配列のみを含む同様のベクター構築物と比較して発現を大幅に低下させることなく、機能性タンパク質（ジストロフィンマイクロ遺伝子またはミニ遺伝子産物等）及び１つ以上のコード配列の両方を、感染標的細胞（例えば、筋細胞）内部で発現させることができるという驚くべき発見に基づいている。
本発明は、一部は、該１つ以上のコード配列（複数可）を、ある特定の位置、例えば、異種イントロンに挿入することができると同時に、該機能性タンパク質（例えば、該ジストロフィンミニ遺伝子産物）のみまたは該１つ以上のコード配列のみを含む同様のベクター構築物と比較して発現を大幅に低下させることなく、機能性タンパク質（ジストロフィンマイクロ遺伝子またはミニ遺伝子産物等）及び１つ以上のコード配列の両方を、感染標的細胞（例えば、筋細胞）内部で発現させることができるという驚くべき発見に基づいている。
【0033】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列は、該３’－ＵＴＲコード領域に、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）の後に挿入される。
【0034】
ある特定の実施形態では、該機能性ＧＯＩの発現は、該１つ以上のコード配列の存在下で実質的に影響を受けない（例えば、該１つ以上のコード配列が挿入されていない以外は同一の対照構築物と比較して）。
【0035】
ある特定の実施形態では、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性５－スペクトリン様リピートジストロフィンタンパク質（例えば、マイクロＤ５、参照することにより本明細書に組み込まれるＵＳ１０，４７９，８２１に記載の通り）をコードするジストロフィンミニ遺伝子であり、及び／または、ｂ）該筋特異的制御要素は、ジストロフィンミニ遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動するＣＫプロモーターである。
【0036】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列は、欠陥ジストロフィンのエクソンのスキッピング、例えば、ジストロフィンのエクソン４５～５５のいずれか１つ、またはジストロフィンのエクソン４４、４５、５１、及び／または５３のスキッピングを誘導するエクソンスキッピングアンチセンス配列を含む。
【0037】
ある特定の実施形態では、該マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、及び／またはｍｉＲ－２０６である。例えば、該マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２９ｃの場合、該ｍｉＲ－２９ｃは、標的配列用にデザインされたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを促進する修飾隣接骨格配列を任意に有する。該修飾隣接骨格配列は、他のｍｉＲ配列、例えば、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１に由来する場合もそれに基づく場合もある。
【0038】
ある特定の実施形態では、宿主細胞での該マイクロＲＮＡの発現は、該宿主細胞での該マイクロＲＮＡの内因性の発現と比較して、少なくとも約１．５～１５倍（例えば、約２～１０倍、約１．４～２．８倍、約２～５倍、約５～１０倍、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５倍）上方制御される。
【0039】
ある特定の実施形態では、該ＲＮＡｉ配列は、サルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）である。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列は、１つ以上の同一または異なるサルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列は、１つ以上の同一または異なるサルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。
【0040】
ある特定の実施形態では、該ｓｈＲＮＡは、サルコリピンのｍＲＮＡ及び／またはサルコリピンタンパク質の発現を少なくとも約５０％減少させる。
ある特定の実施形態では、該ＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、該ガイド配列は、ｓｇＲＮＡであるか、または、該ＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａであり、該ガイド配列は、ｃｒＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、該ＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、該ガイド配列は、ｓｇＲＮＡであるか、または、該ＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａであり、該ガイド配列は、ｃｒＲＮＡである。
【0041】
ある特定の実施形態では、該ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、該アンチセンス配列、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡ、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのｃｒＲＮＡ及び／または該マイクロＲＮＡは、１つ以上の標的遺伝子、例えば、炎症遺伝子、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ））、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－κＢによって誘導される下流の炎症性サイトカイン、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ２）、ＴＧＦ－β、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、コラーゲン、エラスチン、細胞外マトリックスの構成成分、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ミオスタチン、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）またはＡＣＥ、ＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１またはＦｌｔ－１）、及び造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）の機能に拮抗する。
【0042】
ある特定の実施形態では、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）患者において、該ベクター、例えば、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターでは、ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性フクチン（ＦＫＴＮ）タンパク質をコードし、及び／またはｂ）該１つ以上のコード配列は、欠陥ＦＫＴＮ遺伝子の正確なエクソン１０のスプライシングを回復するエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
【0043】
ある特定の実施形態では、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）患者において、該ベクター、例えば、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターでは、ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性ＬＡＭＡ２タンパク質をコードし、及び／またはｂ）該１つ以上のコード配列は、欠陥ＬＡＭＡ２遺伝子のＣ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特に、Ｇ４及びＧ５の発現を回復するエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
【0044】
ある特定の実施形態では、ＤＭ１患者において、該ベクター、例えば、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターでは、ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性ＤＭＰＫタンパク質、またはＣＬＣＮ１遺伝子をコードし、及び／またはｂ）該ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、該アンチセンス配列、または該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、欠陥ＤＭＰＫ遺伝子の変異転写産物の伸長リピートを標的とし、もしくは、ＣＬＣＮ１遺伝子のエクソン７Ａのスキッピングにつながるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
【0045】
ある特定の実施形態では、ジスフェリン異常症（ＬＧＭＤ２ＢまたはＭＭ）患者において、該ベクター、例えば、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターでは、ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性ＤＹＳＦタンパク質をコードし、及び／またはｂ）１つ以上のコード配列は、欠陥ＤＹＳＦ遺伝子のエクソン３２のスキッピングにつながるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
【0046】
ある特定の実施形態では、ＬＧＭＤ２Ｃ患者において、該ベクター、例えば、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターでは、ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性ＳＧＣＧタンパク質をコードし、及び／またはｂ）１つ以上のコード配列は、欠陥ＬＧＭＤ２Ｃ遺伝子（例えば、Δ－５２１ＴのＳＧＣＧ変異を有するもの）のエクソン４～７のスキッピングにつながるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
【0047】
ある特定の実施形態では、該異種イントロンコード配列は、配列番号１である。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列は、該イントロン配列に挿入される。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列は、該イントロン配列に挿入される。
【0048】
ある特定の実施形態では、該機能性タンパク質の発現は、該１つ以上のコード配列の挿入による悪影響を受けない。
ある特定の実施形態では、該ベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３のものである。ある特定の実施形態では、該ベクターは、既知の血清型の派生体である。ある特定の実施形態では、該派生体は、様々な症状に対する医薬組成物または遺伝子治療に関して所望の組織特異性もしくは指向性、所望の免疫原性プロファイル（例えば、対象患者の免疫系による攻撃に影響されない）、または他の所望の特性を示し得る。
ある特定の実施形態では、該ベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３のものである。ある特定の実施形態では、該ベクターは、既知の血清型の派生体である。ある特定の実施形態では、該派生体は、様々な症状に対する医薬組成物または遺伝子治療に関して所望の組織特異性もしくは指向性、所望の免疫原性プロファイル（例えば、対象患者の免疫系による攻撃に影響されない）、または他の所望の特性を示し得る。
【0049】
ある特定の実施形態では、該筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子素、心筋型アクチン遺伝子素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子素、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子素、遅筋トロポニンｉ遺伝子素、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性因子、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である。
【0050】
ある特定の実施形態では、該筋特異的制御要素は、ＷＯ２０１７／１８１０１５（参照することにより本明細書に組み込まれる）の配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
【0051】
本発明の別の態様は、該ベクターのいずれか、例えば、本発明の組み換えウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、該組成物は、さらに治療上適合性のある担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物である。
ある特定の実施形態では、該組成物は、さらに治療上適合性のある担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物である。
【0052】
ある特定の実施形態では、該治療上許容される担体、希釈剤、または賦形剤は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液である。
【0053】
ある特定の実施形態では、該組成物は、少なくとも１．６×１０１３のベクターゲノムを有する水溶液約１０ｍＬの剤形である。
ある特定の実施形態では、該組成物は、１ミリリットルあたり少なくとも２×１０１２のベクターゲノムの効力を有する。
ある特定の実施形態では、該組成物は、１ミリリットルあたり少なくとも２×１０１２のベクターゲノムの効力を有する。
【0054】
本発明の別の態様は、細胞内で該ベクター、例えば、該組み換えＡＡＶベクターを生成し、該細胞を溶解して該ベクターを得ることを含む、本主題の組成物を生成する方法を提供する。
【0055】
ある特定の実施形態では、該ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３ベクターである。
【0056】
本発明の別の態様は、治療を必要とする対象において筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の該組み換えベクターのいずれか１つ、例えば、本発明の組み換えＡＡＶベクター、または本発明の組成物のいずれか１つを該対象に投与することを含む。
【0057】
ある特定の実施形態では、該組み換えベクター、例えば、該組み換えＡＡＶベクターまたは該組成物は、筋肉注射、静脈内注射、非経口投与または全身投与によって投与される。
【0058】
ある特定の実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである。
ある特定の実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、ジスフェリン異常症、筋緊張性ジストロフィー、及びメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、または肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤＲ５またはＬＧＭＤ２Ｃ）である。
ある特定の実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、ジスフェリン異常症、筋緊張性ジストロフィー、及びメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、または肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤＲ５またはＬＧＭＤ２Ｃ）である。
【0059】
本発明の別の態様は、対象におけるＤＭＤまたは関連（ｒｅｌａｔｅｄ）／関連（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）疾患を予防または治療するためのキットを提供し、該キットは、１つ以上のベクター、例えば、本明細書に記載の組み換えＡＡＶ、または本明細書に記載の組成物、使用説明書（書記、印刷、電子／光学記憶媒体、もしくはオンライン）、及び／または包装を含む。ある特定の実施形態では、キットは、併用療法のための既知のＭＤ（例えば、ＤＭＤ）治療薬も含む。
【0060】
実施例または特許請求の範囲にのみ記載されているものを含め、本明細書に記載の任意の１つの実施形態は、当該組み合わせが明示的に請求権を放棄させるものでない限り、または不適切でない限り、本発明の任意の１つ以上の他の実施形態と組み合わせることができることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】２つのＩＴＲ配列間に、目的の遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、以下に記載のマイクロジストロフィン、ミニジストロフィンまたはジストロフィンミニ遺伝子（例えば、以下に記載の５－スペクトリン様リピートマイクロＤ５ジストロフィンタンパク質）及び非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、ｓｈＲＮＡに対する１つ以上（すなわち、示されるように５つ）のさらなるコード配列を含む代表的な組み換えウイルス（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶ）ベクターを示す概略図を示す（正確な縮尺ではない）。該さらなるｎｃＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）コード配列は、同じでも異なっていてもよく、この図では、目的の遺伝子（ＧＯＩ）コード領域（例えば、マイクロジストロフィンコード配列）の遺伝子に対して５’の異種イントロン配列内であるように見えるが、該さらなるコード配列の位置は、そのように限定されない。すなわち、該コード配列は、該ＡＡＶベクター内の他の場所、例えば、３’－ＵＴＲ領域内に配置してもよいし、該異種イントロン及び該３’－ＵＴＲ領域の両方に配置してもよい。該ＡＡＶベクターゲノムの転写時、該ＧＯＩまたはジストロフィンミニ遺伝子（例えば、マイクロＤ５）ｍＲＮＡ及び該さらなるコード配列を融合ＲＮＡとして含む予備プロセスｍＲＮＡが産生される。さらなるプロセシング後、該ＧＯＩ、例えば、ジストロフィンミニ遺伝子ｍＲＮＡ（抗ＤＭＤ薬として）及び該さらなるコード配列、例えば、示されているｓｈＲＮＡが分離される。
【図2A】単一のさらなるマイクロＲＮＡ２９ｃコード配列が、該３’－ＵＴＲ領域に挿入される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶ）ベクターの１つの特定の実施形態を示す。転写及びさらなるプロセシングにより、マイクロジストロフィンのマイクロＤ５（「ＳＧＴ－００１」と表示）のｍＲＮＡ及び機能性ｍｉＲ２９ｃマイクロＲＮＡが創出される。この例示的な非限定的な例における、ＴＡＧ終止コドン、ＡＡＴＡＡＡポリＡシグナル配列、及びｍｉＲ－２９ｃ挿入配列（偶然ＣＡである）にはすべて下線が引かれていることに留意されたい。この図では、ｍｉＲ２９ｃコード配列は、ポリＡシグナル配列の後に挿入されるように描かれたが、同じものを他の場所、例えば、ポリＡシグナル配列の前にある成熟ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ領域に挿入することもできる。図１２も参照されたい。
【図2B】単一のさらなるサルコリピン（ＳＬＮ）ｓｈＲＮＡコード配列（ｓｈＳＬＮ）が、異種イントロンに挿入される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶ）ベクターの別の特定の実施形態を示す。転写及びさらなるプロセシングにより、マイクロジストロフィンのマイクロＤ５（ＳＧＴ－００１と表示）のｍＲＮＡ及び機能性サルコリピンｓｈＲＮＡが創出される。この場合もやはり、該ｓｈＳＬＮの挿入位置は、例示のみを目的としており、本開示に従って他の場所、例えば、３’－ＵＴＲ領域、またはポリＡシグナル配列の前もしくは後のいずれかに挿入することができる。
【図3】マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１と表示）マイクロジストロフィンのみをコードするＡＡＶベクター（左）、異種イントロンでマイクロＲＮＡ２９ｃをさらにコードするＡＡＶベクター（中央）、及び異種イントロンでサルコリピンｓｈＲＮＡをさらにコードするＡＡＶベクター（右）が感染した細胞における核のＤＡＰＩ染色、及びジストロフィンの免疫蛍光染色を示す。パーセンテージ値は、トランスフェクション効率、または正常にトランスフェクトされた細胞のパーセンテージを表す。
【図4】サルコリピン－ルシフェラーゼレポーター融合をコードするＡＡＶベクターを示す概略図である。サルコリピンに対するｓｈＲＮＡの標的位置も示されている。
【図5】マイクロＤ５とｓｈＳＬＮの両方を発現するＡＡＶベクター（「ＳＧＴ００１＋ＳＬＮ」）によって細胞をコトランスフェクトした場合、マイクロＤ５のみを発現するＡＡＶベクター（「ＳＧＴ００１」）によってコトランスフェクトされた細胞と比較して、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるサルコリピン－ルシフェラーゼ融合レポーターの発現が８６．８％減少することを示す。
【図6A】Ｃ２Ｃ１２細胞における内因性サルコリピン発現（トランスフェクションの６日後）が、マイクロＤ５及びｓｈＳＬＮをコードするＡＡＶベクターによってトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞（「ＳＧＴ００１－ｓｈＳＬＮ」と表示）において、マイクロＤ５のみをコードするＡＡＶベクターによってトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞（「ＳＧＴ－００１」と表示）と比較して、５５％減少したことを示す。
【図7】Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｓｈＳＬＮの発現（マイクロＤ５ジストロフィンとｓｈＳＬＮの両方をコードするＡＡＶベクターをトランスフェクトすることによる）が、内因性ＳＬＮの機能を低下させ、筋小胞体へのカルシウムの再取り込みが、経時的に影響を受けることを示す。対照は、マイクロＤ５ジストロフィンのみをコードしｓｈＳＬＮを含まないＡＡＶベクターによってトランスフェクトされた細胞、及び非トランスフェクト細胞を含む。Ｙ軸の相対蛍光強度は、カルシウムプローブＦｌｕｏ－８の蛍光強度の測定値に基づく。
【図8A】ＳＧＴ－００１－ｓｈＳＬＮ（マイクロＤ５ジストロフィンとｓｈＳＬＮの両方をコードするＡＡＶベクター）によってトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞におけるマイクロジストロフィンの発現が、ＳＧＴ－００１（マイクロＤ５ジストロフィンをコードするＡＡＶベクター）のみによってトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞のそれよりも、トランスフェクションの１日後（１ｄ）、すなわち、約２０％のレベルで遅れたが、該マイクロＤ５ジストロフィンミニ遺伝子の発現が、トランスフェクションの６日後（６ｄ）、すぐに追いついたことを示す（誤差の範囲内で）。
【図9】マウスＳＬＮのいくつかの例示的なｓｈＲＮＡデザインを示す。
【図10】マウス（サブジェクト）及びヒト（クエリー）のサルコリピン配列間のヌクレオチド配列比較、及びマウスまたはヒト特異的ｓｈＲＮＡの可能なｓｈＲＮＡデザイン、ならびにマウスとヒトに共通のｓｈＲＮＡを示す。
【図11】ジストロフィンミニ遺伝子（マイクロＤ５、「ＳＧＴ－００１」と表示）をコードするＡＡＶベクター内の代表的な位置が、１つ以上のコード配列、例えば、ｍｉＲ－２９ｃコード配列（示されているもの）またはＳＬＮに対するｓｈＲＮＡのコード配列の挿入点としての役割を果たすことができることを示す。具体的には、ＳＧＴ－００１ミニ遺伝子のイントロン内の複数の位置を使用することができるが、ジストロフィンミニ遺伝子の発現への悪影響の欠如により、一部の位置（Ｉｍｉｒ２等）がより好ましい場合がある。
【図12】本主題の組み換えウイルス（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶ）ベクターの１つの代表的かつ非限定的実施形態を示す概略図である（正確な縮尺ではない）。示されているこの特定の実施形態では、制御要素は、筋特異的プロモーターＣＫ８であり、ＧＯＩは、機能性ＤＭＤ遺伝子（マイクロジストロフィンまたはμＤｙｓ）の型である。ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ等のコード配列は、該ベクターの「転写産物」が示されている範囲、例えば、ＧＯＩの前のイントロン、３’－ＵＴＲ領域、またはポリＡシグナル配列の後に挿入することができる。該プロモーターによる転写の結果、最初の融合転写産物が得られる。
【図13】ヒトｉＰＳ由来心筋細胞における相対的ｍｉＲ－２９ｃ発現レベルの変化（μＤｙｓのみを発現する対照ベクターに対する比）を、ｍｉＲ－２９ｃをコードする様々な組み換えウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターに関して、該ウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」構築物）、または本開示の融合構築物の一部として（「融合」構築物）のいずれかで示す。
【図14】分化したＣ２Ｃ１２細胞またはマウス心筋細胞におけるｍｉＲ－２９ｃの相対的発現レベルを、ｍｉＲ－２９ｃをコードする様々な組み換えＡＡＶベクターに関して、該ウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」構築物）、または本開示の融合構築物の一部として（「融合」構築物）のいずれかで示す。
【図15】本開示のｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ融合構築物、及び同じｓｈＳＬＮコード配列を発現するいくつかのソロ構築物による、マウスＳＬＮタンパク質発現レベルの約５０％のノックダウン（下段）を示す。上段はローディング対照である。
【図16】分化したＣ２Ｃ１２筋管またはマウス心筋細胞におけるｓｉＳＬＮ（転写ｓｈＳＬＮ由来のプロセスｓｉＲＮＡ産物）の相対的発現レベルを、ｓｈＳＬＮをコードする様々な組み換えＡＡＶベクターに関して、該ウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」）、または本開示の融合構築物の一部として（「融合」）のいずれかで示す。
【図17】ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞における、ｓｈＳＬＮをコードするいくつかの主題の融合構築物による最大約９０％のヒトＳＬＮのｍＲＮＡのノックダウンを示す。
【図18】ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞における、いくつかのＨｕｍ－ｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ融合構築物の正規化されたμＤｙｓのｍＲＮＡレベルを示す。
【図19】変性アガロースゲルの画像であり、ｍｉＲ－２９ｃコード配列を有するソロ及び融合構築物におけるほぼ無傷のＡＡＶゲノムを示唆している。
【図20A】ＡＡＶ９ベクターで本発明のｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合構築物を用いた左腓腹筋における約１．４～２．８倍のｍｉＲ－２９ｃ発現の上方制御を示す。
【図20B】ＡＡＶ９ベクターで本発明のｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合構築物を用いた横隔膜における約１．４～２．８倍のｍｉＲ－２９ｃ発現の上方制御を示す。
【図20C】ＡＡＶ９ベクターで本発明のｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合構築物を用いた左心室における約１．４～２．８倍のｍｉＲ－２９ｃ発現の上方制御を示す。
【図21】腓腹筋において、ｍｉＲ－２９ｃ上方制御融合ＡＡＶ９ベクターによるＲＮＡ及びタンパク質レベルでのμＤｙｓ発現の低下がないことを示す。
【図22】ｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ融合構築物のμＤｙｓのみのＡＡＶ９に対するＡＡＶ９媒介性の発現を介した横隔膜、左腓腹筋（左腓腹筋）、及び心房における最大５０％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御をそれぞれ示す。最大５０％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御は、舌でも観察された（データは示さず）。
【図23】ＡＡＶ９のｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ融合構築物を介した横隔膜における同様のレベルのμＤｙｓのＲＮＡ／タンパク質発現を示す。同様の結果が舌及び心房でも得られた（データは示さず）。
【図24】ＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃソロ及びｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合構築物が血清ＣＫレベルを低下させることを示す。
【図25】ＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃソロ及びｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合構築物が血清ＴＩＭＰ１レベルを低下させることを示す。
【図26】いくつかのＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合ベクターまたはＡＡＶ９のｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ融合ベクター由来の腓腹筋におけるｍｉＲ－２９ｃまたはｓｈＳＬＮベクターのほぼ同様の生体内分布を示す。
【図27】肝臓における、ｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合及びｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ融合対μＤｙｓソロ構築物のＡＡＶ９ベクターの同様の力価を示す。
【図28】横隔膜における、本発明の融合構築物のμＤｙｓ構築物単独に対する追加的な効果を、それらが２つの線維化マーカー遺伝子に与える影響に基づいて示す。
【図30】ｍｉＲ－３０Ｅ骨格配列に基づく代表的な修飾ｍｉＲ－２９ｃ構築物の予測２Ｄ構造を示す。
【図31】ｍｉＲ－１０１骨格配列に基づく代表的な修飾ｍｉＲ－２９ｃ構築物の予測２Ｄ構造を示す。
【図32】ｍｉＲ－４５１骨格配列に基づく代表的な修飾ｍｉＲ－２９ｃ構築物の予測２Ｄ構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【0062】
線維化及び細胞内Ｃａ２＋の異常な上昇等の様々な二次カスケード症状を治療するための並行したアプローチがなければ、エクソンスキッピング、終止コドンリードスルー、または遺伝子置換療法の利点が完全に達成される可能性は低い。小分子またはタンパク質補充戦略であっても、筋線維症を含めたかかる二次カスケード事象の症状を軽減するアプローチなしでは失敗する可能性がある。例えば、ＡＡＶマイクロジストロフィンで処理された既存の線維化を有する老齢ｍｄｘマウスにおける以前の研究では、完全な機能回復を達成することができないことが示された（Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：４９２９－４９３７，２０１３）。また、ＤＭＤ心筋症の進行には心室壁の瘢痕化及び線維化が伴うことも知られている。
【0063】
本発明は、１つには、患者を治療するための遺伝子治療法に関し、これは、ジストロフィン及びその機能の欠陥を、代替の機能性ジストロフィンミニ遺伝子を提供することによって補償するだけでなく、同じ遺伝子治療ベクターにおいて１つ以上のさらなるコード配列を使用して１つ以上の二次カスケード遺伝子を直接標的とし、ひいては、１つのコンパクトなベクターにて体系的送達用の併用療法を達成する。
【0064】
実際には、本発明、特に本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ＤＭＤの治療に限定されない。本発明は、遺伝子が欠損している他の筋ジストロフィーの治療に適用可能である。例えば、本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、筋ジストロフィーを治療するための機能性タンパク質及び／または１つ以上のコード配列（非コードＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ配列、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を提供することができる。該機能性タンパク質は、筋ジストロフィーの欠陥遺伝子産物の野生型代替物を提供するか、または、非野生型であるにもかかわらず筋ジストロフィーの治療に有効な代替物（例えば、５－スペクトリン様マイクロＤ５ジストロフィンミニ遺伝子産物）を提供する。
【0065】
従って、１つの態様では、本発明は、以下を含む組み換えウイルスベクター、例えば、組み換えレンチウイルスまたはＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する：ａ）治療を必要とする患者／対象／個体における筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで、該ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ポリヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあり、ここで、該機能性タンパク質の対応する野生型は、筋ジストロフィーでは欠損しているか、または、該機能性タンパク質は、野生型ではないにもかかわらず、筋ジストロフィーの治療に有効であるもの、ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する制御要素（例えば、筋特異的制御要素）、ならびにｃ）該イントロン配列もしくは該３’－ＵＴＲコード領域または該機能性タンパク質の発現カセットの他の場所に挿入された１つ以上のコード配列、ここで、該１つ以上のコード配列は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
【0066】
関連する態様では、本明細書に記載の本発明は、酵素ベースの遺伝子編集システムの２つ以上の成分、例えば、標的ゲノム部位／標的ゲノム配列でＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を創出することができる標的配列特異的（改変）ヌクレアーゼ、及び該（野生型または所望の）標的ゲノム配列と一致するドナーまたは鋳型配列等を同時に送達する／発現させるためのウイルスベクターとしても使用することができる。かかるシステムにより、該標的細胞内で内因性相同組み換え（ＨＲ）プロセスを利用して、欠陥のある／望ましくない標的ゲノム配列を削除し、それを所望の標的ゲノム位置で野生型または他の所望の配列と置き換えることが可能になる。
【0067】
例えば、該標的配列特異的（改変）ヌクレアーゼとしては、メガヌクレアーゼ（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのもの等）及び固有の標的ゲノム配列を認識するそのバリアント、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集酵素が挙げられ得る。
【0068】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合、本主題のベクターは、ドナー配列以外の、またはドナー配列に加えて、１つ以上の標的配列（複数可）を標的とするために望ましい配列（複数可）を有する１つ以上の遺伝子編集ガイド配列（複数可）、及び該ウイルスベクターによってＧＯＩとしてコードされ得る適合性の編集酵素を同時に送達することができる。かかるウイルス送達システムを使用して、細胞、組織、または生物に生じる望ましくない配列を所望の配列で置換することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素システムの一例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（かつてはＣｐｆ１）、及び標的細胞に対して必要な１つ以上のガイド配列（例えば、Ｃａｓ９の場合は一本鎖ガイドＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａの場合はｃｒＲＮＡ）である。Ｃａｓ９には、野生型Ｃａｓ９及びその機能性バリアントが含まれる。いくつかのＣａｓ９バリアントは、マイクロジストロフィン遺伝子とほぼ同じサイズであり、本発明のウイルスベクターによってコードされる機能性ＧＯＩであり得る。Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９よりもさらに小さく、同様にＧＯＩとしてコードされ得る。ある特定の実施形態では、該ウイルス構築物によってコードされるＣａｓ遺伝子は、ＵＴＲ及び／またはイントロン要素を有する場合もあれば、有さない場合もある。
【0069】
関連する態様では、本発明は、エキソビボまたはインビボ遺伝子治療で用いる組み換えレンチウイルスベクターを提供する。エキソビボ遺伝子治療では、培養宿主細胞は、主題のウイルスベクターを使用してインビトロでトランスフェクトされ、目的の遺伝子を発現し、その後、体内に移植される。インビボ遺伝子治療は、遺伝物質を標的組織に挿入する直接的な方法であり、形質導入は患者自身の細胞内で行われる。従って、本発明のレンチウイルスベクターは、以下を含み得る：ａ）治療を必要とする患者／対象／個体における筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで、該ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ポリヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあり、ここで、該機能性タンパク質の対応する野生型は、筋ジストロフィーでは欠損しているか、または、該機能性タンパク質は、野生型ではないにもかかわらず、筋ジストロフィーの治療に有効であるもの、ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する制御要素（例えば、筋特異的制御要素）、ならびにｃ）該イントロン配列もしくは該３’－ＵＴＲコード領域または該発現カセットの他の場所に挿入された１つ以上のコード配列、ここで、該１つ以上のコード配列は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
【0070】
本明細書で使用される場合、文脈次第で、「融合」という用語は、異なる意味を有する場合があり、融合タンパク質、２つ以上のコード配列（例えば、ＧＯＩのコード配列及び該ＧＯＩの３－ＵＴＲ領域またはイントロン配列に挿入された／埋め込まれた１つ以上のＲＮＡｉ剤のコード配列等）が存在し得る融合ＲＮＡ転写産物、ならびに該ウイルスベクターが該ＧＯＩ及び該１つ以上のＲＮＡｉ剤のコード配列を含む融合構築物等を含む。
【0071】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列は、該３’－ＵＴＲコード領域に、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）の後に挿入される。
【0072】
ある特定の実施形態では、該機能性ＧＯＩの発現は、該１つ以上のコード配列の存在のために上方制御または下方制御される（例えば、該１つ以上のコード配列が挿入されていない以外は同一の対照構築物と比較して）。
【0073】
ある特定の実施形態では、該機能性ＧＯＩの発現は、該１つ以上のコード配列の存在下で実質的に影響を受けない（例えば、該１つ以上のコード配列が挿入されていない以外は同一の対照構築物と比較して）。
【0074】
本明細書で使用される、「筋ジストロフィー（ＭＤ）」は、健康な筋肉を形成するのに必要な野生型のタンパク質の産生を妨げる異常な遺伝子または遺伝子突然変異による進行性衰弱及び筋肉量の損失を特徴とする疾患群を含む。ＭＤは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、特に、特定された遺伝子突然変異を有するもの、例えば、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）及びメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）を含めた後述のもの、ジスフェリン異常症（ＬＧＭＤ２Ｂ及び三好ミオパチー）、筋緊張性ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、例えば、ＬＧＭＤ２Ｃ、ならびに顔面肩甲上腕型（ＦＳＨＤ）を含む。
【0075】
本明細書で使用される、「患者」、「対象」、及び「個体」は、同義で使用され、本主題の方法で治療される、診断される、及び／または生体試料が取得される哺乳類（例えば、ヒト）対象を含む。通常、該対象は、ＤＭＤ及び本明細書に記載の他の関連疾患、ならびにいくつかの実施形態では、ＤＭＤならびに関連する心筋症及びジストロフィー性心筋症に罹患しているか、または罹患する可能性が高い。特定の実施形態では、対象は、ヒト小児または青年（例えば、１８歳、１５歳、１２歳、１０歳、８歳、５歳、３歳、１歳、月齢６か月、月齢３か月、月齢１か月未満等）である。特定の実施形態では、該小児または青年は男子である。別の特定の実施形態では、対象は、成人（例えば、≧１８歳）、例えば、成年男子である。
【0076】
完全長ジストロフィン遺伝子は、２．６ｍｂであり、７９エクソンをコードする。１１．５－ｋｂのコード配列が、４２７－ｋＤのタンパク質になる。ジストロフィンは、Ｎ末端ドメイン、桿状ドメイン、システインリッチドメイン、及びＣ末端ドメインを含めた４つの主要なドメインに分割することができる。桿状ドメインは、さらに、２４のスペクトリン様リピート及び４つのヒンジに分割することができる。
【0077】
機能性「ジストロフィンミニ遺伝子」または「ジストロフィンマイクロ遺伝子」は、２４個未満のスペクトリン様リピート及び遺伝子治療送達ベクター（アデノウイルス及びレンチウイルス）と適合性の１つ以上のヒンジ領域を有し、ＵＳ７００１７６１、ＵＳ６８６９７７７、ＵＳ８５０１９２０、ＵＳ７８９２８２４、ＵＳ１０４７９８２１、及びＵＳ１０１６６２７２（すべて参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0078】
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、ＤＭＤまたはＢＭＤであり、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性５－スペクトリン様リピートジストロフィンタンパク質（参照することにより本明細書に組み込まれるＵＳ１０，４７９，８２１に記載のマイクロＤ５ジストロフィンタンパク質等）をコードするジストロフィンミニ遺伝子であり、及び／または、ｂ）該筋特異的制御要素は、ジストロフィンミニ遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動するＣＫプロモーターである。
【0079】
本明細書で使用される、「マイクロＤ５」、「ＳＧＴ－００１によってコードされるマイクロジストロフィンミニ遺伝子」、または略して「ＳＧＴ－００１」は、Ｎ末端からＣ末端へ、ヒト完全長ジストロフィンタンパク質のＮ末端アクチン結合ドメイン、ヒンジ領域１（Ｈ１）、スペクトリン様リピートＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４、ヒンジ領域４（Ｈ４）、及びＣ末端ジストログリカン結合ドメインを含む特定の改変５リピートマイクロジストロフィンタンパク質を指す。この５リピートマイクロジストロフィン及び関連するジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質配列は、ＵＳ１０，４７９，８２１及びＷＯ２０１６／１１５５４３（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0080】
ある特定の実施形態では、該ジストロフィンミニ遺伝子は、例えば、特定のスペクトリン様リピート、及び／またはスペクトリン様リピートの数に関してマイクロＤ５とは異なる（例えば、ヒトジストロフィンのスペクトリン様リピートを最低４、５、または６個含み、好ましくは、１、２、または３個の最Ｎ末端及び／または最Ｃ末端リピートを含む）機能性ジストロフィンタンパク質をコードする。該ヒトジストロフィンの１つ以上のスペクトリン様リピートは、ユートロフィンまたはスペクトリン由来のスペクトリン様リピートでも置換され得る。ある特定の実施形態では、該ジストロフィンミニ遺伝子は、ＡＡＶウイルスベクターの５ｋｂのパッケージング制限より小さく、好ましくは、４．９ｋｂ、４．８ｋｂ、４．６ｋｂ、４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、または４ｋｂ以下である。
【0081】
ある特定の実施形態では、該ジストロフィンミニ遺伝子は、例えば、マイクロＤ５に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性であるマイクロジストロフィンタンパク質をコードし、該タンパク質は、マイクロジストロフィン活性を保持する。
【0082】
ある特定の実施形態では、該マイクロジストロフィンは、マイクロＤマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。該ポリヌクレオチドは、任意に、哺乳類、例えば、ヒトでの発現用にコドン最適化される。
【0083】
ある特定の実施形態では、該ヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、マイクロＤ５マイクロジストロフィン、またはその相補体をコードする核酸配列にハイブリダイズし、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードする。
【0084】
「ストリンジェントな」という用語は、当技術分野でストリンジェントであると通常理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決まる。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。
【0085】
よりストリンジェントな条件（より高温度、より低イオン強度、より高ホルムアミド、または他の変性剤等）もまた使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係している場合、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）、及び６０℃（２３塩基オリゴの場合）で６×ＳＳＣ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
【0086】
非特異的及び／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的で、他の薬剤をハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液に含めてもよい。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳ０４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤を使用することもできる。これら添加剤の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更することができる。ハイブリダイゼーションの実験は、通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。これらの可変要素に対応し、異なる配列近縁性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるため、当業者によってハイブリダイゼーション条件が調整され得る。
【0087】
さらなるジストロフィンミニ遺伝子配列は、例えば、ＵＳ２０１７／０３６８１９８（参照することにより本明細書に組み込まれる）、及びＷＯ２０１７／１８１０１５（参照することにより本明細書に組み込まれる）の配列番号７に見出すことができる。
【0088】
ある特定の実施形態では、マイクロＤ５等の任意のジストロフィンミニ遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、本開示のタンパク質配列に基づく任意のものであり得る。好ましくは、該ヌクレオチド配列は、ヒトでの発現用にコドン最適化される。
【0089】
該マイクロジストロフィンタンパク質は、筋収縮時の筋膜を安定させる。例えば、マイクロジストロフィンは、筋収縮時に衝撃吸収材として機能する。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、ＤＭＤにおける二次カスケード遺伝子の１つを標的とする。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、ＤＭＤにおける二次カスケード遺伝子の１つを標的とする。
【0090】
例えば、ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９、特にｍｉＲ２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、及び／またはｍｉＲ－２０６をコードする。例えば、ｍｉＲ－２９ｃは、結合組織の３つの主要な成分（例えば、コラーゲン１、コラーゲン３及びフィブロネクチン）を直接減少させ、線維化を低減する。
【0091】
本明細書で使用される、「線維化」は、骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓等の損傷時の組織における、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または無秩序な沈着ならびに異常な修復過程を指す。沈着するＥＣＭ成分には、フィブロネクチン及びコラーゲン、例えば、コラーゲン１、コラーゲン２またはコラーゲン３が含まれる。
【0092】
本明細書で使用される、「ｍｉＲ－２９」は、ｍｉＲ－２９ａ、－２９ｂ、または－２９ｃのうちの１つを指す。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９は、ｍｉＲ－２９ｃを指す。
【0093】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、発現したｍｉＲ２９（ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ、またはｍｉＲ－２９ｃ等）は、コラーゲン及びフィブロネクチン遺伝子の３’ＵＴＲに結合し、これら標的遺伝子の発現を下方制御すると考えられる。
【0094】
別の実施形態では、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、ＲＮＡｉ配列、例えば、サルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。該１つ以上のコード配列は、同一または異なるサルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードし得る。ある特定の実施形態では、該ｓｈＲＮＡは、サルコリピンのｍＲＮＡ及び／またはサルコリピンタンパク質の発現を少なくとも約５０％減少させる。
【0095】
本明細書で使用される、「サルコリピン（ＳＬＮ）」、「サルコリピンタンパク質」、「ＳＬＮタンパク質」、「サルコリピンポリペプチド」及び「ＳＬＮポリペプチド」は、同義で使用され、ＳＬＮ遺伝子の発現産物、例えば、アミノ酸配列（ＭＧＩＮＴＲＥＬＦＬＮＦＴＩＶＬＩＴＶＩＬＭＷＬＬＶＲＳＹＧＹ）（配列番号１）、受託番号ＮＰ＿００３０５４．１を有する天然のヒトＳＬＮタンパク質を含む。該用語は、好ましくは、該ヒトＳＬＮを指す。該用語は、バリアントＳＬＮタンパク質を指すために使用される場合もあり、該バリアントは、配列番号１とは、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、または８アミノ酸異なり、任意に、該相違は、残基２～５、１０、１４、１７、２０、及び３０、好ましくは、２～５及び３０にある。該用語は、残基６～２９で配列番号１と同一であるか、または残基６～２９で最大１、２、もしくは３個の保存的置換、例えばＬ→Ｉ及び／またはＩ→Ｖによって異なるバリアントＳＬＮタンパク質を指すために使用される場合もある。任意に、該バリアントＳＬＮは、Ｇ３０Ｑ置換を有する。該バリアントは、天然のＳＬＮタンパク質の機能活性を示し、これには、ＳＬＮのリン酸化、脱リン酸化、ニトロシル化及び／またはユビキチン化、またはＳＥＲＣＡへの結合、及び／または、例えば、ＡＴＰ加水分解に由来するＣａ２＋輸送の脱共役によって、ＳＥＲＣＡによる筋小胞体へのカルシウムの取り込み速度を低下させること、または、エネルギー代謝及び体重増加の調節におけるその役割が含まれ得る。
【0096】
本明細書で使用される、「ＳＬＮ遺伝子」、「ＳＬＮポリヌクレオチド」、及び「ＳＬＮ核酸」は同義で使用され、天然のヒトＳＬＮコード核酸配列、例えば、該天然のヒトＳＬＮ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ受託：ＮＭ＿００３０６３．２）、ＳＬＮのｃＤＮＡが転写され得る配列を有する核酸、及び／または前述のものの対立遺伝子バリアント及びホモログ、例えば、本明細書に記載のバリアントＳＬＮのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む。該用語には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。
【0097】
別の実施形態では、本主題のベクターの１つ以上のさらなるコード配列は、ジストロフィン遺伝子の欠損に起因する二次カスケード事象のうちの１つに関連する任意の他の遺伝子、例えば、炎症遺伝子、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ））、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－κＢによって誘導される下流の炎症性サイトカイン、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ２）、ＴＧＦ－β、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、コラーゲン、エラスチン、細胞外マトリックスの構成成分、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ミオスタチン、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）またはＡＣＥ、ＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１またはＦｌｔ－１）、及び造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）を標的とし得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、上記標的遺伝子の機能に拮抗するＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、及び／またはマイクロＲＮＡであり得る。
【0098】
本主題の組み換えベクターのデザインは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５）のかかる二次カスケード遺伝子または経路、例えば、ＳＬＮ、マイクロＲＮＡ等を同時に標的とすることができる。
【0099】
例えば、ある特定の実施形態では、本主題のベクターのさらなるコード配列のうちの１つは、ＳＬＮの発現を下方制御し、ひいては、ＳＥＲＣＡによるカルシウムの再取り込みを増加させることによってジストロフィー筋での二次欠陥である細胞内Ｃａ２＋の異常な上昇を少なくとも部分的に軽減するようにデザインされたＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンス配列であり得る。
【0100】
ある特定の代替的な実施形態では、二次カスケード遺伝子の１つを標的とする代わりに、またはそれに加えて、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、欠陥のある内因性ジストロフィンのエクソン、例えば、ジストロフィンのエクソン４５～５５のいずれか１つ、またはジストロフィンのエクソン４４、４５、５１、及び／または５３のスキッピングを誘導し、ひいては、ジストロフィンミニ遺伝子（例えば、マイクロＤ５）の治療効果をさらに高めるエクソンスキッピングアンチセンス配列でもよい。
【0101】
本明細書で使用される、「エクソンスキッピング」または「スプライススイッチング」アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、ＲＮａｓｅ－Ｈ耐性であるアンチセンス配列の一種であり、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節し、該ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシング欠陥を修正するように作用する。アンチセンスを介したエクソンスキッピング療法では、ＡＯＮは通常、特定のスプライシングシグナルをブロックし、ある特定のエクソンの特異的スキッピングを誘導するように使用される。これが、変異転写産物のリーディングフレームの修正をもたらし、それが、内部欠損であるが部分的に機能性のタンパク質に翻訳され得る。
【0102】
特定の態様では、本発明は、ジストロフィンミニ遺伝子コード配列（マイクロＤ５／ＳＧＴ－００１等）、及びジストロフィン機能の損失に起因する二次カスケードに関与する１つ以上のさらなる標的遺伝子を標的とするための１つ以上のさらなる配列の両方をコードする組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。かかる構築物は、ジストロフィンミニ遺伝子、及び該ジストロフィンミニ遺伝子の５’の異種イントロン、及び／または該ジストロフィンミニ遺伝子の３’－ＵＴＲ領域に挿入された１つ以上のさらなるコード配列の両方を含む。
【0103】
具体的には、１つの態様では、本発明は、以下を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する：ａ）機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィンミニ遺伝子、ここで、該ジストロフィンミニ遺伝子は、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ジストロフィンミニ遺伝子の発現を高める異種イントロン配列の直ぐ３’側にあるもの、ｂ）該ジストロフィンミニ遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的制御要素、ならびにｃ）該イントロン配列または該３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）のコード配列（複数可）、ここで、該１つ以上のコード配列（複数可）は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
【0104】
例えば、該ｒＡＡＶベクターは、ｍｉＲ－２９（例えば、ｍｉＲ－２９ｃ）を発現するポリヌクレオチド配列、例えば、ｍｉＲ－２９ｃ標的ガイド鎖（ＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＡＧＡ、参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号３）、ｍｉＲ－２９ｃガイド鎖（ＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡ、参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号４）ならびに天然のｍｉＲ－３０骨格及びステムループ（ＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧ、参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号５）を含むヌクレオチド配列を含み得る。
【0105】
ｍｉＲ－３０骨格にｍｉＲ－２９ｃのｃＤＮＡを含む例示的なポリヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１７／１８１０１５（参照することにより本明細書に組み込まれる）の配列番号２及び図１に示される。
【0106】
ある特定の実施形態では、該マイクロＲＮＡ－２９コード配列は、ｍｉＲ－２９ｃをコードする。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９ｃは、標的配列用にデザインされたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを促進する修飾隣接骨格配列を任意に有する。例えば、該修飾隣接骨格配列は、ｍｉＲ－３０（ｍｉＲ－３０Ｅ）、－１０１、－１５５、または－４５１のものに由来する場合もそれに基づく場合もある。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９ｃは、標的配列用にデザインされたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを促進する修飾隣接骨格配列を任意に有する。例えば、該修飾隣接骨格配列は、ｍｉＲ－３０（ｍｉＲ－３０Ｅ）、－１０１、－１５５、または－４５１のものに由来する場合もそれに基づく場合もある。
【0107】
ある特定の実施形態では、該マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－３０ｃ、及び／またはｍｉＲ－２０６である。
ある特定の実施形態では、宿主細胞での該マイクロＲＮＡの発現は、該宿主細胞での該マイクロＲＮＡの内因性の発現と比較して、少なくとも約１．５～１５倍（例えば、約２～１０倍、約１．４～２．８倍、約２～５倍、約５～１０倍、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５倍）上方制御される。
ある特定の実施形態では、宿主細胞での該マイクロＲＮＡの発現は、該宿主細胞での該マイクロＲＮＡの内因性の発現と比較して、少なくとも約１．５～１５倍（例えば、約２～１０倍、約１．４～２．８倍、約２～５倍、約５～１０倍、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５倍）上方制御される。
【0108】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピン（ＳＬＮ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピンの機能に拮抗するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、図９及び１０に開示するもの（例えば、図９の下線付きの配列、及び図１０の強調表示された配列）が挙げられる。さらなる例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、ＷＯ２０１８／１３６８８０（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号７～１１が挙げられる。
【0109】
本発明はまた、１つには、遺伝子治療ベクター、例えば、該１つ以上のコード配列（複数可）、及び該ジストロフィンミニ遺伝子を発現するレンチウイルスまたはＡＡＶ、ならびにそれを筋肉に送達し、ジストロフィン機能を回復しつつ二次カスケード症状を軽減及び／または予防する方法に関する。
【0110】
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、既知の遺伝的欠陥、例えば、フクチン遺伝子またはＦＫＲＰ（フクチン関連タンパク質）遺伝子と関連する先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）である。従って、ある特定の実施形態では、該先天性筋ジストロフィーは、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）である。
【0111】
先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）は、出生時またはその間近に明らかになる筋ジストロフィーの一群である。ある特定の実施形態では、本発明の方法及びｒＡＡＶは、ＣＭＤ、特に、タイチン（心筋症を伴うＣＭＤ）、ＳＥＰＮ１（デスミン封入を伴うＣＭＤ、もしくは（初期の）脊髄性固縮を伴うＣＭＤ）、インテグリン－アルファ７（インテグリンアルファ７変異を伴うＣＭＤ）、インテグリン－アルファ９（関節過弛緩を伴うＣＭＤ）、プレクチン（家族性接合部型表皮水疱症を伴うＣＭＤ）、フクチン（福山型ＣＭＤもしくはＭＤＤＧＡ４）、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）（筋肥大を伴うＣＭＤもしくはＭＤＣ１Ｃ）、ＬＡＲＧＥ（ＭＤＣ１Ｄ）、ＤＯＫ７（筋無力症候群を伴うＣＭＤ）、ラミンＡ／Ｃ（脊髄性固縮及びラミンＡ／Ｃ異常を伴うＣＭＤ）、ＳＢＰ２（脊髄性固縮及びセレンタンパク質欠損を伴うＣＭＤ）、コリンキナーゼベータ（ミトコンドリアの構造的異常を伴うＣＭＤ）、ラミニンアルファ２（メロシン欠損ＣＭＤもしくはＭＤＣ１Ａ）、ＰＯＭＧｎＴ１（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ筋・眼・脳病）、ＣＯＬＧＡ１、ＣＯＬ６Ａ２、もしくはＣＯＬ６Ａ３（Ｕｌｌｒｉｃｈ ＣＭＤ）、Ｂ３ＧＮＴ１（ウォーカー・ワールブルグ症候群：ＭＤＤＧＡ型）、ＰＯＭＴ１（ウォーカー・ワールブルグ症候群：ＭＤＤＧＡ１型）、ＰＯＭＴ２（ウォーカー・ワールブルグ症候群：ＭＤＤＧＡ２型）、ＩＳＰＤ（ＭＤＤＧＡ３、ＭＤＤＧＡ４、ＭＤＤＧＢ５、ＭＤＤＧＡ６、及びＭＤＤＧＡ７）、ＧＴＤＣ２（ＭＤＤＧＡ８）、ＴＭＥＭ５（ＭＤＤＧＡ１０）、Ｂ３ＧＡＬＮＴ２（ＭＤＤＧＡ１１）、またはＳＧＫ１９６（ＭＤＤＧＡ１２）等の遺伝子に既知の遺伝的欠陥を有するＣＭＤの治療に使用することができる。
【0112】
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、治療を必要とする対象のＣＭＤを治療するため、ＣＭＤにおいて欠陥のある野生型遺伝子（上記で挙げたもの等）のいずれか、またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを含み得る。１つ以上のさらなるコード配列は、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、または変異ＣＭＤ遺伝子を排除または修飾するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または該野生型遺伝子機能の喪失によって上方制御される二次カスケード遺伝子をコードし得る。
【0113】
例えば、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）は、変異ＦＫＴＮ遺伝子が原因であり、該１つ以上のさらなるコード配列は、エクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし、正しいエクソン１０スプライシングを、該患者における欠陥のあるＦＫＴＮ遺伝子において修復する。
【0114】
別の例では、該先天性筋ジストロフィーは、６５エクソンのＬＡＭＡ２遺伝子の突然変異によって引き起こされるメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）である。
【0115】
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、機能性ＬＡＭＡ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、α－ジストログリカンとの相互作用の仲介にとって最も重要なＬＡＭＡ２のＣ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４及びＧ５の発現を回復するエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードし得る。例えば、該変異ＬＡＭＡ２遺伝子のエクソン４は、ＭＤＣ１Ａを治療するためにスキップされ得る。
【0116】
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、例えば、ＤＭ１またはＤＭ２である。
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、ＤＭ１における欠陥のある機能性筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）タンパク質、またはＤＭ２における機能性ＣＣＨＣ型ジンクフィンガー核酸結合タンパク質遺伝子（ＣＮＢＰ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＭＰＫ遺伝子またはＣＮＢＰ遺伝子の変異転写産物の伸長リピートを標的とし、ＲＮａｓｅによって分解するために使用することができるＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードし得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＭ１患者のＣＬＣＮ１遺伝子のエクソン７Ａのスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列もコードする場合がある。
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、ＤＭ１における欠陥のある機能性筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）タンパク質、またはＤＭ２における機能性ＣＣＨＣ型ジンクフィンガー核酸結合タンパク質遺伝子（ＣＮＢＰ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＭＰＫ遺伝子またはＣＮＢＰ遺伝子の変異転写産物の伸長リピートを標的とし、ＲＮａｓｅによって分解するために使用することができるＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードし得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＭ１患者のＣＬＣＮ１遺伝子のエクソン７Ａのスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列もコードする場合がある。
【0117】
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）遺伝子の突然変異によって引き起こされるジスフェリン異常症であり、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）及び三好ミオパチー（ＭＭ）を含む。
【0118】
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、ＬＧＭＤ２ＢまたはＭＭで欠陥のある機能性ＤＹＳＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ジスフェリン異常症患者で欠陥のあるＤＹＳＦ遺伝子のエクソン３２のスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする場合もある。
【0119】
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）であり、４つのサルコグリカン遺伝子、すなわち、α（ＬＧＭＤ２Ｄ）、β（ＬＧＭＤ２Ｅ）、γ（ＬＧＭＤ２Ｃ）及びδ（ＬＧＭＤ２Ｆ）遺伝子のうちのいずれか、特に、ＳＧＣＧ遺伝子によってコードされるγサルコグリカン（ＬＧＭＤ２Ｃ）の突然変異によって引き起こされる。
【0120】
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、ＬＧＭＤで欠陥のある機能性サルコグリカンタンパク質、例えば、ＬＧＭＤ２Ｃで欠陥のあるＳＧＣＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、欠陥ＬＧＭＤ２Ｃ遺伝子、例えば、Δ－５２１ＴのＳＧＣＧ変異を有するもののエクソン４～７のスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする場合もある。
【0121】
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、ＤＵＸ４遺伝子の突然変異によって引き起こされる顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
従って、該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＵＸ４または下流の標的、例えば、ＰＩＴＸ１の発現を低下させるＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする場合もある。
従って、該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＵＸ４または下流の標的、例えば、ＰＩＴＸ１の発現を低下させるＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする場合もある。
【0122】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＵＸ４の３’－ＵＴＲを標的とし、その発現を低下させるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。これは、ＤＵＸ４コード配列が、完全に該遺伝子の第１のエクソンに位置するため、及び該ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの要素を標的とするエクソンスキッピングが、許容状態のポリアデニル化を妨害するか、またはイントロン１もしくは２のスプライシングを妨害し、ひいては機能性ＤＵＸ４のｍＲＮＡを破壊することができるためである。
【0123】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、進行性の筋変性によって臨床的に特徴付けられる遺伝性の常染色体優性疾患である。これは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び筋緊張性ジストロフィーに次いで３番目に多い筋ジストロフィーである。ＦＳＨＤは、４番染色体上のマクロサテライトリピートのサブセットの病原性短縮によって遺伝的に特徴付けられ、ダブルホメオボックスプロテイン４（ＤＵＸ４）遺伝子の異常な発現をもたらす。
【0124】
ＦＳＨＤには、２つの型、すなわち、ＦＳＨＤ１及びＦＳＨＤ２がある。ＦＳＨＤ１は、全ＦＳＨＤ患者の９５％以上に発症する最も一般的な形態である。遺伝分析により、ＦＳＨＤ１は、４番染色体上のマクロサテライトＤ４Ｚ４リピート配列の遺伝的短縮に関連付けられている。一方、ＦＳＨＤ２は、正常数のＤ４Ｚ４リピートを有するが、代わりに、染色体１８ｐにＳＭＣＨＤ１遺伝子におけるヘテロ接合突然変異、クロマチン修飾因子を含む。ＦＳＨＤ１及びＦＳＨＤ２の患者は、同様の臨床像を共有する。
【0125】
現在の薬物療法は、ＦＳＨＤを治すものではないが、ＦＳＨＤ症状の管理に焦点を当てており、ミオスタチン阻害物質ラスパテルセプトや抗炎症生物製剤（ＡＴＹＲ１９４０）を含む。抗炎症生物製剤の原則は、ＦＳＨＤ患者の筋病理に一般に見られる炎症を抑制し、表現型の進行を遅らせることである。従って、本主題の１つ以上のコード配列は、ミオスタチンまたは炎症経路の遺伝子に対するＲＮＡｉ試薬またはアンチセンスＲＮＡをコードし得る。それと同時に、該ＲＮＡｉ試薬、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、もしくはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋障害性ＤＵＸ４遺伝子及びその下流のｐａｉｒｅｄ－ｌｉｋｅホメオドメイン転写因子１（ＰＩＴＸ１）等の分子の発現をノックダウンするために使用することができる。実際に、インビトロ研究では、アンチセンスオリゴをＦＳＨＤ患者の一次骨格筋細胞に投与し、かつＡＡＶベクターを使用してＤＵＸ４マウスモデルに送達されたＤＵＸ４に対するｍｉＲＮＡを使用することにより、ＤＵＸ４のｍＲＮＡ発現の抑制に成功したことが示されている。さらに、ＰＩＴＸ１発現の抑制の成功は、インビボではすでに全身的に実証されている。
【0126】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のさらなるコード配列は、同じ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス）をコードすることができ、ひいては、該さらなるコード配列のコピー数は、投与を考慮して調節または微調整され得る。
【0127】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のさらなるコード配列は、異なる配列をコードして、異なる標的を標的とする場合もあれば、同じ標的を標的とする場合もある。例えば、ある特定の実施形態では、１つのさらなるコード配列は、標的に対するアンチセンスであり、別のさらなるコード配列は、同じ標的に対するｓｈＲＮＡである。代替的に、２つのさらなるコード配列は、両方ともｓｈＲＮＡであるが、それらは、同じ標的の異なる領域を標的とする。
【0128】
ある特定の実施形態では、該機能性タンパク質、例えば、ジストロフィンミニ遺伝子産物の発現は、該１つ以上のコード配列（複数可）の挿入による悪影響を受けない。
１９９０年代初頭までに、イントロンを含まない多くの導入遺伝子は、インビトロでは組織培養細胞中で完全に発現するものの、インビボ（例えば、該導入遺伝子を有するトランスジェニックマウス）では同じ導入遺伝子の発現ができず、ある特定の異種イントロン配列を、該導入遺伝子のプロモーター及び該（イントロンを含まない）コード配列間に挿入することで、インビボでの導入遺伝子の発現が大きく向上することが分かった。
１９９０年代初頭までに、イントロンを含まない多くの導入遺伝子は、インビトロでは組織培養細胞中で完全に発現するものの、インビボ（例えば、該導入遺伝子を有するトランスジェニックマウス）では同じ導入遺伝子の発現ができず、ある特定の異種イントロン配列を、該導入遺伝子のプロモーター及び該（イントロンを含まない）コード配列間に挿入することで、インビボでの導入遺伝子の発現が大きく向上することが分かった。
【0129】
特に、Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：４７８－４８２， １９９１、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、メタロチオネインプロモーター及び成長ホルモン導入遺伝子間に挿入されたいくつかの異種イントロンが、導入遺伝子の発現を改善することを示し、導入遺伝子の発現を改善するための一般的な戦略として、ある特定の異種イントロンの付加を提供した。これらとしては、天然のｒＧＨの第１のイントロン、ラットインスリンＩＩ（ｒＩｎｓ－ＩＩ）遺伝子のイントロンＡ、ｈβＧ遺伝子のイントロンＢ、及びＳＶ４０の小ｔイントロンから選択される異種イントロンが挙げられる。
【0130】
同様の発見は、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（６）：３０７０－３０７４，１９９１、参照することにより本明細書に組み込まれる）によっても確認された。彼らは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌遺伝子に連結されたヒトヒストンＨ４プロモーターを有するトランスジェニックマウスにおいて、２３０－ｂＰの異種ハイブリッドイントロンが転写単位に存在することで、ＣＡＴ活性が大きく（該介在配列を正確に削除した類似導入遺伝子と比較して、５～３００倍）向上することを報告した。このハイブリッドイントロンは、アデノウイルスのスプライスドナー及び免疫グロブリンＧのスプライスアクセプターからなり、該動物の広範囲の組織で発現を刺激した。該ハイブリッドイントロンは、組織培養中で組織プラスミノーゲン活性化因子及び第ＶＩＩＩ因子の発現を刺激したため、Ｃｈｏｉは、このマウスで見られた向上は、ＣＡＴに特異的である可能性は低く、代わりにトランスジェニックマウスでの任意のｃＤＮＡの発現に一般に適用可能であると結論付けた。
【0131】
従って、ある特定の実施形態では、本主題のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターにおける異種イントロンは、天然のｒＧＨの第１のイントロン、ラットインスリンＩＩ（ｒＩｎｓ－ＩＩ）遺伝子のイントロンＡ、ｈβＧ遺伝子のイントロンＢ、ＳＶ４０の小ｔイントロン、及びＣｈｏｉのハイブリッドイントロンからなる群から選択される。
【0132】
ある特定の実施形態では、該異種イントロン配列は、以下の配列番号１である：
ＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ。
ＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ。
【0133】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のさらなるコード配列は、該異種イントロン配列（配列番号１）にすべて挿入されるか、または該３’－ＵＴＲ領域にすべて挿入されるか、または両方の領域に挿入される。例えば、該マイクロＲＮＡ－２９ｃコード配列は、以下の配列番号２にあるようなイントロンコード配列に挿入することができる：
ＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ。
ＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ。
【0134】
配列番号２におけるｍｉＲ－２９ｃ配列は、
ＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡ（配列番号３）である。
ＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡ（配列番号３）である。
【0135】
ある特定の実施形態では、該レンチウイルスまたはｒＡＡＶは、該ポリヌクレオチド（該ジストロフィンミニ遺伝子等）及び該さらなるコード配列（複数可）に隣接する２つのレンチウイルスまたはＡＡＶのＬＴＲ／ＩＴＲ配列をさらに含む。
【0136】
ある特定の実施形態では、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。例えば、該筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子素、心筋型アクチン遺伝子素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（切断型ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子素、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子素、遅筋トロポニンＩ遺伝子素、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性因子、またはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）であり得る。
【0137】
ある特定の実施形態では、筋特異的制御要素は、該異種イントロン配列に対して５’であり、これは、該ジストロフィンミニ遺伝子に対して５’であり、これは、翻訳終止コドン（ＴＡＧ等）、ポリＡアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ等）、及びｍＲＮＡ切断部位（ＣＡ等）を含む３’－ＵＴＲ領域を含む。
【0138】
ある特定の実施形態では、該筋特異的制御要素は、ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０：
ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０：
【0139】
【化1】
【0140】
ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１１：
【0141】
【化2】
【0142】
ある特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＭＣＫエンハンサーのヌクレオチド配列（参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０参照）及び／またはＭＣＫプロモーターの配列（参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１１参照）を含む筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。
【0143】
ある特定の実施形態では、該ｒＡＡＶは、さらに、該ジストロフィンミニ遺伝子及び該さらなるコード配列に作動可能に連結され、それらの転写を駆動することが可能なプロモーターを含む。
【0144】
例示的なプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
ある特定の実施形態では、該ｒＡＡＶは、さらに、ポリＡ配列を転写ｍＲＮＡに挿入するためのポリＡアデニル化配列を含む。
ある特定の実施形態では、該ｒＡＡＶは、さらに、ポリＡ配列を転写ｍＲＮＡに挿入するためのポリＡアデニル化配列を含む。
【0145】
ある特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３のものである。
【0146】
本発明の別の態様は、ウイルスベクター、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターの生成方法を提供し、該方法は、任意のウイルスベクター、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養すること、及び該ウイルス、例えば、ｒＡＡＶ粒子を、該トランスフェクトされた細胞の上清から回収することを含む。
【0147】
本発明の別の態様は、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明の組み換えＡＡＶベクターを含むウイルス粒子を提供する。
本発明の別の態様は、筋ジストロフィーにおいて、欠陥があるか、または該筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質（マイクロジストロフィンタンパク質等）、及び１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を生成する方法を提供し、該方法は、宿主細胞内で本発明の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該コード配列産物（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス、マイクロＲＮＡまたはその阻害物質）を共発現する主題の組み換えＡＡＶベクターで宿主細胞を感染させることを含む。
本発明の別の態様は、筋ジストロフィーにおいて、欠陥があるか、または該筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質（マイクロジストロフィンタンパク質等）、及び１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を生成する方法を提供し、該方法は、宿主細胞内で本発明の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該コード配列産物（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス、マイクロＲＮＡまたはその阻害物質）を共発現する主題の組み換えＡＡＶベクターで宿主細胞を感染させることを含む。
【0148】
本発明の別の態様は、治療を必要とする対象において筋ジストロフィー（ＤＭＤもしくはＢＭＤ等）またはジストロフィン異常症を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量のウイルスベクター、例えば、本発明の組み換えＡＡＶベクター、または本発明の組成物を該対象に投与することを含む。
【0149】
本発明は、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のＡＡＶベクターを、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤまたは任意の他のＭＤ、特に、欠陥ジストロフィン関連筋ジストロフィーと診断された患者に、好ましくは、該対象で線維化等の１つ以上の二次カスケード症状が認められる前に、または該対象の筋力が減少する前に、または該対象の筋肉量が減少する前に投与することを企図する。
【0150】
本発明はまた、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶを、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤまたは任意の他のＭＤ、特に、ジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患し、線維化等の１つ以上の二次カスケード症状をすでに発症している対象に投与し、これら対象においてさらなる疾患の進行を防止または減速することを企図する。
【0151】
本発明の別の態様は、筋ジストロフィーにおいて欠損しているか、または該筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、マイクロジストロフィンタンパク質）及び該１つ以上のさらなるコード配列を含む組み換えウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターを提供する。
【0152】
ある特定の実施形態では、本発明は、機能性マイクロジストロフィンタンパク質、例えば、マイクロＤ５をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。
【0153】
該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターは、筋特異的プロモーター、例えば、ＭＣＫプロモーター、該ジストロフィン遺伝子の発現を高めるのに有効な異種イントロン配列、該マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡアデニル化シグナル配列、これらの配列に隣接するＩＴＲ／ＬＴＲリピートを含み得る。該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターは、任意にさらに、細菌宿主での増幅のためのアンピシリン耐性及びプラスミド骨格配列またはｐＢＲ３２２複製起点を含んでもよい。
【0154】
１つの態様では、本発明の組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３である。
【0155】
本発明の方法のいずれかでは、該ｒＡＡＶベクターは、筋肉注射または静脈内注射によって投与することができる。
本発明の方法のいずれかでは、該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、全身投与される。例えば、該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入または移植によって非経口投与される。
本発明の方法のいずれかでは、該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、全身投与される。例えば、該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入または移植によって非経口投与される。
【0156】
本発明の別の態様は、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、該組成物は、さらに治療上適合性のある担体または賦形剤を含み得る医薬組成物である。
ある特定の実施形態では、該組成物は、さらに治療上適合性のある担体または賦形剤を含み得る医薬組成物である。
【0157】
別の実施形態では、本発明は、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーに罹患した対象を治療するための本主題の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現するウイルスベクターのいずれか、例えば、ｒＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。
【0158】
本発明の組成物（例えば、医薬組成物）は、筋肉注射または静脈内注射用に製剤化することができる。本発明の組成物は、全身投与用、例えば、注射、注入または移植による非経口投与用に製剤化することもできる。さらに、該組成物のいずれかは、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えばＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患した対象に投与するために製剤化される。
【0159】
さらなる実施形態では、本発明は、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患した対象を回復させるための薬剤の調製のための主題の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現する該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
【0160】
本発明は、ＤＭＤと診断された患者に対して、１つ以上の二次カスケード症状、例えば、線維化が該対象で認められる前に投与するための薬剤の調製用の該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のＡＡＶベクターの使用を企図する。
【0161】
本発明はまた、筋ジストロフィーに罹患し、線維化等の二次カスケード症状をすでに発症している対象に対して該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶを投与し、これら対象において疾患の進行を防止または減速するための薬剤の調製用の該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のＡＡＶベクターの使用を企図する。
【0162】
本発明はまた、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ／ＢＭＤの治療用の薬剤の調製のための主題の機能性タンパク質、例えば、マイクロジストロフィン、及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現するウイルスベクター、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
【0163】
本発明の使用のいずれかでは、該薬剤は、筋肉注射用に製剤化することができる。さらに、該薬剤のいずれかは、筋ジストロフィー、例えばＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患した対象に投与するために製剤化され得る。
【0164】
本発明はまた、筋ジストロフィー患者において、主題の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現する遺伝子治療ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターを提供する。
【0165】
本明細書に記載の本発明の任意の１つの実施形態は、実施例にのみまたは上記もしくは下記のセクションの１つにのみ、あるいは本発明の１つの態様に記載の実施形態を含め、本発明の任意の１つ以上のさらなる実施形態と組み合わせることができることを理解されたい。
【0166】
ＡＡＶ
本明細書で使用される、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な省略形である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染するヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。特徴付けられているＡＡＶには少なくとも１３の血清型が存在する。ＡＡＶの概説及び総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（参照することにより本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。しかしながら、様々な血清型は、遺伝子レベルでも構造的及び機能的に非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原則がさらなるＡＡＶの血清型に適用されることが十分に予想される。例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．のｐｐ．１６５－１７４、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい。例えば、すべてのＡＡＶの血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、すべてが、ＡＡＶ２で発現するような３つの関連するカプシドタンパク質を有する。近縁性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖分析、及び「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端での類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。同様の感染性パターンもまた、各血清型の複製機能が同様の調整制御下にあることを示唆する。
本明細書で使用される、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な省略形である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染するヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。特徴付けられているＡＡＶには少なくとも１３の血清型が存在する。ＡＡＶの概説及び総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（参照することにより本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。しかしながら、様々な血清型は、遺伝子レベルでも構造的及び機能的に非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原則がさらなるＡＡＶの血清型に適用されることが十分に予想される。例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．のｐｐ．１６５－１７４、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい。例えば、すべてのＡＡＶの血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、すべてが、ＡＡＶ２で発現するような３つの関連するカプシドタンパク質を有する。近縁性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖分析、及び「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端での類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。同様の感染性パターンもまた、各血清型の複製機能が同様の調整制御下にあることを示唆する。
【0167】
本明細書で使用される、「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶの末端リピート配列（ＩＴＲ）が隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコードし、発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に存在する場合、感染性ウイルス粒子に複製及びパッケージ化され得る。
【0168】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。該粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは、通常、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。従って、かかるベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含まれるため、ＡＡＶベクター粒子の生成は、ＡＡＶベクターの生成を必然的に含む。
【0169】
本発明の組み換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶのＩＴＲを含む。
ＡＡＶには複数の血清型があり、該ＡＡＶの血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４５：５５５－５６４（１９８３）に示され、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正された。ともに参照することにより本明細書に組み込まれる。他の例として、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６（参照することにより本明細書に組み込まれる）及びＡＸ７５３２４９（参照することにより本明細書に組み込まれる）にそれぞれ示され（ＡＡＶ－８に関しては米国特許第７，２８２，１９９号及び第７，７９０，４４９号も参照のこと）、ＡＡＶ－９のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８（２００４）に示され、ＡＡＶ－１０のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３（１）：６７－７６（２００６）に示され、ＡＡＶ－１１のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＶｉｒｏｌｏｇｙ ３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に示される。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、参照することにより本明細書に組み込まれるＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に記載されている。
ＡＡＶには複数の血清型があり、該ＡＡＶの血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４５：５５５－５６４（１９８３）に示され、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正された。ともに参照することにより本明細書に組み込まれる。他の例として、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６（参照することにより本明細書に組み込まれる）及びＡＸ７５３２４９（参照することにより本明細書に組み込まれる）にそれぞれ示され（ＡＡＶ－８に関しては米国特許第７，２８２，１９９号及び第７，７９０，４４９号も参照のこと）、ＡＡＶ－９のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８（２００４）に示され、ＡＡＶ－１０のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３（１）：６７－７６（２００６）に示され、ＡＡＶ－１１のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＶｉｒｏｌｏｇｙ ３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に示される。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、参照することにより本明細書に組み込まれるＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に記載されている。
【0170】
ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶのＤＮＡは、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよく、これには以下に限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、及びＡＡＶ－２ｉ８が含まれる。
【0171】
偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示されている。
他の型のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシドの突然変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で既知である。
他の型のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシドの突然変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で既知である。
【0172】
ある特定の実施形態では、骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶｒｈ．７４が使用され得る。
ある特定の実施形態では、本主題のＡＡＶベクターのＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９である。
ある特定の実施形態では、本主題のＡＡＶベクターのＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９である。
【0173】
ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用性配列は、ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と呼ばれる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。
【0174】
これら２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）の選択的スプライシングを伴って、該ｒｅｐ遺伝子由来の４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的に該ウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。
【0175】
ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、該３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。
【0176】
単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、該ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
【0177】
本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。該ＤＮＡプラスミドは、該ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるため、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅｌ欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を感染させることができる細胞に移入される。パッケージ化されるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当技術分野では標準的である。ｒＡＡＶの生成は、単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞を意味する）内に以下の成分が存在することが必要である：ｒＡＡＶゲノム、該ｒＡＡＶゲノムとは別の（すなわち、ｒＡＡＶ内ではない）ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。該ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよく、ｒＡＡＶゲノムのＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型、すなわち、以下に限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２及びＡＡＶ－１３等からのものでよい。
【0178】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子生成に必要なすべての成分を安定的に発現する細胞株を創出することである。例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が欠如したｒＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、細菌のプラスミドに、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：２０７７－２０８１，１９８２）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２３：６５－７３，１９８３）等の手順によって、または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：４６６１－４６６６，１９８４）によって導入されている。該パッケージング細胞株を次にアデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、これらの細胞が選択可能であること及びｒＡＡＶの大規模生産に適していることである。
【0179】
適切な方法の他の例では、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
【0180】
ｒＡＡＶ生成の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５３３－１５３９，１９９２、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９，１９９２）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２，１９８４、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６４６６，１９８４、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１，１９８５、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３，１９８８、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９，１９８８、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８，１９８９、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０，１９９５、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５，１９９３、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２，１９９６、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、ｒＡＡＶの生成に関連する該文書のセクションに特に重点を置いて、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
【0181】
ある特定の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６０３１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．３１、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載の方法、すなわち、高力価及び高品質のアデノ随伴９型ベクターを、ＨＳＶプラットフォームを使用して生産するための拡張性のある方法に従って生産される。これは、完全単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースの生産及び精製方法であり、１０層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫのＨＥＫ２９３生成細胞あたり１×１０１４を超えるｒＡＡＶ９ベクターゲノム、または最終的な完全に精製された生成物中、細胞あたり１×１０５を超えるベクターゲノムを生成することが可能である。これは、トランスフェクションベースの方法に比べて５～１０倍の増加を表す。さらに、この方法によって生産されたｒＡＡＶベクターは、トランスフェクションベースの生産と比較して、高い形質導入単位対ベクターゲノム比及び低い空対充実比によって示される総カプシドタンパク質量の減少によって示される感染性の増加を含め、改善された生物学的特性を示した。この方法は、大規模医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）ならびに製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）のｒＡＡＶ９ベクターの生産に容易に適用することもでき、前臨床及び臨床試験を可能にし、後の相及び商業生産に向けたプラットフォームを構築する。この研究ではＡＡＶ９が使用されたが、この方法は、他の血清型にも拡張可能である可能性が高く、前臨床研究、初期相の臨床試験、ならびに遺伝子疾患及び障害に対する遺伝子治療ベースの薬物の大規模な世界的開発の間のギャップを埋めるはずである。
【0182】
本発明は、従って、感染性ｒＡＡＶを生成するパッケージング細胞を提供する。１つの実施形態では、パッケージング細胞は、安定に形質転換されたがん細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３系統）であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥｌで形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎仔肺細胞）である。
【0183】
本発明の組み換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド形成ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態では、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＤＮＡを欠き、換言すれば、該ゲノムのＩＴＲ間に、ＡＡＶのｒｅｐのＤＮＡもｃａｐのＤＮＡも存在しない。本発明の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。
【0184】
該ｒＡＡＶは、当技術分野で標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：１０３１－１０３９，１９９９、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：４２７－４４３，２００２、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法を含む。
【0185】
さらなるコード配列
マイクロＤ５等のジストロフィンタンパク質のコード配列に加えて、本発明の組み換えベクターは、ジストロフィンの損失に関連する、またはこれに起因する二次合併症／二次カスケードの１つにおける標的遺伝子（複数可）のための１つ以上のさらなるコード配列も含む。
マイクロＤ５等のジストロフィンタンパク質のコード配列に加えて、本発明の組み換えベクターは、ジストロフィンの損失に関連する、またはこれに起因する二次合併症／二次カスケードの１つにおける標的遺伝子（複数可）のための１つ以上のさらなるコード配列も含む。
【0186】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、特定のジストロフィン遺伝子突然変異を修正することができるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
例えば、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、対象における欠損ジストロフィン遺伝子のプレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）スプライシング時に特定のエクソンのスキッピングを誘導し、リーディングフレームの回復及び内部切断型タンパク質の部分的産生をもたらし、ベッカー型筋ジストロフィーで見られるジストロフィンタンパク質の発現と類似している。
例えば、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、対象における欠損ジストロフィン遺伝子のプレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）スプライシング時に特定のエクソンのスキッピングを誘導し、リーディングフレームの回復及び内部切断型タンパク質の部分的産生をもたらし、ベッカー型筋ジストロフィーで見られるジストロフィンタンパク質の発現と類似している。
【0187】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、フレーム破壊エクソン（突然変異エクソン）及び／または隣接するエクソンをスキップまたはスプライスし、正しい転写リーディングフレームを回復し、短くなったが機能性のジストロフィンタンパク質を産生する。
【0188】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、単一のエクソンスキッピングを誘導する。ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、複数のエクソンスキッピング、例えば、エクソン４５～５５のうちの１つ以上、またはそのすべてのスキッピング（すなわち、天然のエクソン４４が直接エクソン５６に結合される）を誘導する。例えば、１１個のアンチセンス配列を一緒に使用して、エクソン４５～５５を含む１１個のエクソンすべてをスキップすることができる。１０個のＡＯＮのカクテルを、ｍｄｘ５２マウスモデル（エクソン５２を削除）に使用して、エクソン４５～５１及び５３～５５のスキップを誘導し、機能性ジストロフィンの発現を回復させた。
【0189】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ジストロフィンのｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導する。エクソン５１のスキッピングの成功で、理論的には、すべてのＤＭＤ患者の約１４％を治療することができる。
【0190】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）部位を標的とし、ひいては、エクソン５１のスキップを引き起こし、切断されたが部分的に機能性のジストロフィンタンパク質を産生する。
【0191】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、エクソン４４、４５、及び５３のうちの１つ以上のスキッピングを誘導する。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、カシメルセン（エクソン４５）、ＮＳ－０６５／ＮＣＮＰ－０１もしくはゴロジルセン（エクソン５３）、またはエテプリルセンもしくはＥｘｏｎｄｙｓ５１（エクソン５１）のものと同じ標的配列を標的とする。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、カシメルセン（エクソン４５）、ＮＳ－０６５／ＮＣＮＰ－０１もしくはゴロジルセン（エクソン５３）、またはエテプリルセンもしくはＥｘｏｎｄｙｓ５１（エクソン５１）のものと同じ標的配列を標的とする。
【0192】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）患者における突然変異ＦＣＭＤ／ＦＫＴＮ遺伝子の潜在スプライシングドナー及び／またはアクセプター部位を標的とし、正しいエクソン１０のスプライシングを回復する。
【0193】
福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）は、まれな常染色体劣性疾患であり、日本で２番目に一般的な形態の小児筋ジストロフィーである。ＦＣＭＤ（ＦＣＭＤ、ＦＫＴＮとしても知られる）の原因となる遺伝子は、推定グリコシルトランスフェラーゼであるタンパク質フクチンをコードし、ジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＡＧＣ）のメンバーであるα－ジストログリカンをグリコシル化する。ＦＣＭＤの病因は、フクチン遺伝子の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）へのＳＩＮＥ－ＶＮＴＲ－Ａｌｕ（ＳＶＡ）レトロトランスポゾンの祖先挿入により、エクソン１０の新たな潜在スプライスドナー、及び該ＳＶＡ挿入部位での新たな潜在スプライスアクセプターが活性化され、ひいては該潜在ドナー及びアクセプター部位間で異常なｍＲＮＡのスプライシングが誘導されることによって生じる。その結果、ＦＣＭＤのエクソン１０が早期切断される。ＦＣＭＤ患者の細胞及びインビボでのモデルマウスでは、該潜在スプライス調節領域を標的とする３つのビボＰＭＯのカクテルが、病原性ＳＶＡエクソントラッピングを防止し、正常なＦＫＴＮタンパク質レベル及びα－ジストログリカンのＯ－グリコシル化を回復させることが示された。
【0194】
ある特定の実施形態では、該アンチセンス配列は、３－または４－ヌクレオチドリピートの病的な伸長、例えば、ＤＭ１患者におけるＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ領域でのＣＴＣトリプレットリピート、またはＤＭ２患者におけるＣＮＢＰ遺伝子の第１のイントロン内のＣＣＴＧリピートを標的とする。
【0195】
筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）は、成年期の筋ジストロフィーの最も一般的な形態である。筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）及び筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）に分類され得るのは、常染色体優性疾患である。ＤＭ１は、筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’－ＵＴＲ領域のＣＴＣトリプレットの病的伸長によって引き起こされるが、ＤＭ２は、ＣＣＨＣ型ジンクフィンガー核酸結合タンパク質遺伝子（ＣＮＢＰ）の第１のイントロンにおけるＣＣＴＧトラクトの病的伸長によって引き起こされる。リピートが伸長した転写ＲＮＡ凝集体から生じるＲＮＡの機能獲得毒性は、異常なスプライシング（スプライセオパシー（ｓｐｌｉｃｅｏｐａｔｈｙ））につながる。有毒なＲＮＡの凝集体は、マッスルブラインドライク（Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ－ｌｉｋｅ）（ＭＢＮＬ）タンパク質及びＣＵＧ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ１）等の選択的スプライシング調節因子の機能を、前者の核内ＲＮＡ焦点内で封鎖及び枯渇させることにより、ならびに後者の発現及びリン酸化を高めることによりＤＭ１において破壊する。ＭＢＮＬ及びＣＵＧＢＰ１タンパク質の機能の変化は、標的遺伝子、すなわち、それぞれ、インスリン抵抗性、筋緊張、筋衰弱、及びジストロフィー筋過程（すべて筋緊張性ジストロフィーの典型的な症状）に関連する、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）、筋クロライドチャネル（ＣＬＣＮ１）、ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）、及びジストロフィン（ＤＭＤ）のｐｒｅ－ｍＲＮＡの異常なスプライシングにつながる。
【0196】
従って、ＤＭＰＫ遺伝子のＣＵＧリピートの伸長は、ＭＢＮＬ１タンパク質を隔離し、いくつかの下流の遺伝子で異常なスプライシングを引き起こし、それにより、ＤＭ１表現型が生じる。一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＲＮａｓｅによる分解のための変異転写産物のかかる伸長リピートを標的とし、それにより、下流の遺伝子のスプライシングを回復させることができる。２’－Ｏ－メトキシエチルギャップマーＡＯＮは、変異ＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅ Ｈによる伸長ＣＵＧの分解を標的とし、変異ｍＲＮＡ転写産物の減少及びタンパク質発現の回復をもたらすために使用されている。
【0197】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ＤＭ１患者のＣＬＣＮ１遺伝子のエクソン７Ａのスキッピングをもたらす。
ＤＭ１患者ではクロライドチャネル１（ＣＬＣＮ１）が筋緊張を引き起こすため、この遺伝子の異常なスプライシングを修正することによってもＤＭ１を治療することができる。超音波照射したバブルリポソームとともにＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）を使用してＤＭ１マウス（ＨＳＡＬＲ）の筋肉へのＰＭＯの送達を高めることで、ＣＬＣＮ１のエクソン７Ａのスキッピングがインビボで達成され、骨格筋で筋緊張及びＣｌｃｎ１タンパク質発現が改善された。
ＤＭ１患者ではクロライドチャネル１（ＣＬＣＮ１）が筋緊張を引き起こすため、この遺伝子の異常なスプライシングを修正することによってもＤＭ１を治療することができる。超音波照射したバブルリポソームとともにＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）を使用してＤＭ１マウス（ＨＳＡＬＲ）の筋肉へのＰＭＯの送達を高めることで、ＣＬＣＮ１のエクソン７Ａのスキッピングがインビボで達成され、骨格筋で筋緊張及びＣｌｃｎ１タンパク質発現が改善された。
【0198】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ＤＹＳＦ突然変異を有するジスフェリン異常症（例えば、ＬＧＭＤ２ＢまたはＭＭ）患者でのエクソンスキッピングのため、ＤＹＳＦ遺伝子のエクソン１７、３２、３５、３６、及び／または４２、好ましくは、エクソン３２及び／または３６を標的とする。
【0199】
ジスフェリン異常症は、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）遺伝子の突然変異によって引き起こされる筋ジストロフィーを包含する総称である。ジスフェリン遺伝子は、筋膜損傷の修復に必要な筋細胞膜鞘タンパク質をコードする。これは、カルシウム依存性Ｃ２脂質結合ドメイン及び不可欠な膜貫通ドメインからなる。２つの一般的なジスフェリン異常症、すなわち、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）及び三好ミオパチー（ＭＭ）があり、どちらも臨床的に異なる表現型及び常染色体劣性遺伝を有する。ＬＧＭＤ２Ｂは、近位筋衰弱を特徴とし、ＭＭは、遠位筋衰弱を特徴とする。ＬＧＭＤ２ＢとＭＭの初期臨床表現型は異なる。しかしながら、病気が進行するにつれて、両方の状態の臨床症状は重複し、より類似したものになり、患者は四肢近位及び遠位の両方で筋衰弱を経験する。ジスフェリン欠損筋線維は、膜修復に欠陥がある。
【0200】
ジスフェリン異常症は、１つには、わずか１０％の野生型レベルの発現の切断型変異ＤＹＳＦタンパク質を有する患者において観察される軽度の表現型のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたエクソンスキッピングによって治療することができる。具体的には、複合ヘテロ接合女性患者のＬＧＭＤ２Ｂの症例では、該患者は、イントロン３１に、１つのヌル対立遺伝子及びの他の対立遺伝子にＤＹＳＦ分岐点突然変異を有していた。エクソン３２の天然のインフレームスキッピングにより、野生型レベルの約１０％で発現する切断型ジスフェリンタンパク質が生じ、これは、ヌル突然変異を部分的に補完するのに十分であった。該患者は軽度の症状を示し、７０歳で歩行可能であった。近年、患者の細胞でのエクソン３２のスキッピングにより、疑似ジスフェリン発現レベルがもたらされ、これにより、低浸透圧及び筋細胞膜鞘に局在するレーザー損傷にさらされた処理細胞の膜修復がインビトロでレスキューされたことが示された。
【0201】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ＬＡＭＡ２の突然変異を有するメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）患者におけるエクソンスキッピングのため、ＬＡＭＡ２遺伝子のエクソン４を標的とする。ある特定の実施形態では、エクソンスキッピングにより、α－ジストログリカンとの相互作用の仲介にとって最も重要なＣ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４及びＧ５の発現を回復する。
【0202】
メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）は、ラミニン－α２鎖の発現を完全にまたは部分的に欠損させる６５エクソンのＬＡＭＡ２遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ラミニン－α２鎖は、ベータ１（β１）、及びガンマ１（γ１）鎖とともに、ラミニン－２１１またはメロシンとして知られるヘテロ三量体ラミニンアイソフォームの一部であり、神経筋接合部を含めた骨格筋の基底膜及びシュワン細胞（末梢神経）で特に発現される。ラミニン－α２は、ジストロフィン－ジストログリカン複合体（ＤＧＣ）と相互作用し、骨格筋及び末梢神経における細胞のシグナル伝達、接着、及び組織の完全性を仲介する。いつでも当てはまるというわけではないが、ラミニン－α２の部分的発現は、軽度のＭＤＣ１Ａを引き起こし、ラミニン－α２の完全な欠如は、重度のＭＤＣ１Ａを引き起こす。Ｃ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４及びＧ５は、α－ジストログリカンとの相互作用の仲介にとって最も重要である。Ｇ４及びＧ５を排除する突然変異は、部分切断型ラミニン－α２発現の存在下でも深刻な表現型と関連がある。
【0203】
ＰＭＯを介したエクソン４のスキッピングがオープンリーディングフレームを修正し、切断型ラミニン－α２鎖の回復及び患者の寿命のわずかな延長をもたらすという点で、エクソンスキッピングは、ＭＤＣ１Ａの治療のために探求されてきた。
【0204】
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、Δ－５２１ＴのＳＧＣＧ突然変異の肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型患者の治療のため、ＬＧＭＤ２Ｃ／ＳＧＣＧ遺伝子における最も一般的なΔ－５２１Ｔ突然変異のエクソン４～７のスキッピング、及びリーディングフレームの回復を誘導し、内部切断型ＳＧＣＧタンパク質を産生する。ある特定の実施形態では、エクソンスキッピングは、野生型ＳＧＣＧタンパク質の細胞内、膜貫通、及び最遠カルボキシ末端を保持する内部切断型ＳＧＣＧタンパク質の発現を回復する。
【0205】
ジストロフィン結合タンパク質（ＤＡＰ）は、筋細胞膜内の複合体であり、その膜貫通成分は、細胞骨格を成熟筋線維の細胞外マトリックスに連結し、筋細胞膜の完全性の維持に不可欠である。ＤＧＣ内のサルコグリカンサブ複合体は、４つの１回貫通膜貫通サブユニット：α－、β－、γ－、及びδ－サルコグリカンからなる。α～δ－サルコグリカン遺伝子、すなわち、α（ＬＧＭＤ２Ｄ）、β（ＬＧＭＤ２Ｅ）、γ（ＬＧＭＤ２Ｃ）及びδ（ＬＧＭＤ２Ｆ）は、横紋筋において主に（β）または排他的に（α、γ及びδ）発現される。該４つのサルコグリカン遺伝子のいずれかの突然変異は、おそらく該サルコグリカン複合体の不安定化により、他のサルコグリカンタンパク質の二次欠乏症を引き起こし、サルコグリカン異常症、すなわち、常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）を引き起こす可能性がある。α～δ遺伝子における疾患を引き起こす突然変異は、筋細胞膜のジストロフィン結合タンパク質（ＤＡＰ）複合体内で崩壊を引き起こす。
【0206】
ヒトでは、γサルコグリカン（ＬＧＭＤ２Ｃ）は、ＳＧＣＧ遺伝子によってコードされるタンパク質である。重症小児常染色体劣性筋ジストロフィー（ＳＣＡＲＭＤ）は、γ－サルコグリカン遺伝子で、マイクロサテライトマーカーと分離する進行性の筋消耗性疾患である。γ－サルコグリカン遺伝子の突然変異は、γ－サルコグリカン異常症が、通常の発生率よりも高い北アフリカのマグレブ諸国で最初に報告された。ＬＧＭＤ２Ｃ患者で最も一般的な突然変異の１つであるΔ－５２１Ｔは、γ－サルコグリカン遺伝子のエクソン６のヌクレオチド塩基５２１～５２５における５つのチミン鎖からのチミンの欠失である。この突然変異は、リーディングフレームをずらし、γ－サルコグリカンタンパク質の不在ならびにβ－及びδ－サルコグリカンの二次的な低下をもたらし、ひいては重度の表現型を引き起こす。該突然変異は、マグレブの集団及び他の諸国の両方で生じる。
【0207】
エクソンスキッピングは、得られる内部切断型ＳＧＣＧタンパク質が、γ－サルコグリカンを欠くショウジョウバエモデルにおいて、異種細胞発現試験において、及びトランスジェニックマウスにおいて、γ－サルコグリカンの欠損を修正するために機能的及び病理学的な利点をもたらすという点で、Δ－５２１Ｔの突然変異を有するＬＧＭＤ２Ｃの治療のために探索されてきた。ヒト筋疾患の細胞モデルも作成され、変異ヒトγ－サルコグリカンをコードするＲＮＡで複数のエクソンスキッピングが誘導され得ることが示された。
【0208】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピン（ＳＬＮ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピンの機能に拮抗するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。
【0209】
例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、図９及び１０に開示するもの（例えば、図９の下線付きの配列、及び図１０の強調表示された配列）が挙げられる。さらなる例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、ＷＯ２０１８／１３６８８０（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号７～１１が挙げられる。
【0210】
さらなるｓｈＳＬＮ配列は、以下に示すヒトＳＬＮのｍＲＮＡ配列を使用して、当技術分野で認識されている任意の方法に基づいてデザインされ得る。
【0211】
【化3】
【0212】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、１つ以上の標的遺伝子、例えば、炎症遺伝子の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。
【0213】
ＩκＢキナーゼ／核内因子－カッパＢ（ＮＦ－κＢ）のシグナル伝達は、ＤＭＤの動物モデル及び患者の両方において、免疫細胞及び再生筋線維で持続的に上昇する。さらに、ＤＭＤの筋肉では、ＴＮＦ－αならびにＩＬ－１及びＩＬ－６等のＮＦ－κＢの活性化因子が上方制御される。従って、ＮＦ－κＢのシグナル伝達カスケードの成分、例えば、ＮＦ－κＢ自体、その上流の活性化因子及び下流の炎症性サイトカインを阻害することは、欠損ジストロフィン遺伝子の置換／修復と併せて対象患者を治療するのに有益である。
【0214】
従って、ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、１つ以上の炎症遺伝子、例えば、ＮＦ－κＢ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。
【0215】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ヒストンデアセチラーゼ、例えば、ＨＤＡＣ２の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ＤＭＤでは、筋細胞膜鞘でのジストロフィンの不在により、一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）が非局在化及び下方制御され、これにより、ＨＤＡＣ２のＳ－ニトロシル化及びそのクロマチン結合が変化する。ＮＯ経路が欠損しているジストロフィン欠損ｍｄｘマウスでは、ＨＤＡＣ２の活性が特異的に増加した。対照的に、ｍｄｘ動物におけるｎＮＯＳ発現のレスキューは、ジストロフィーの表現型を改善した。さらに、デアセチラーゼ阻害物質は、ジストロフィー筋線維に強い形態機能的な効果をもたらした。実際、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質であるギビノスタットは、ＤＭＤの潜在的な疾患修飾治療として評価段階にある。データは、マウスとヒトの両ジストロフィー細胞において、ジストロフィンの不在は、ｍｉＲＮＡの特定のサブセットに結合するＨＤＡＣ２と相関し（下記参照）、ジストロフィンのレスキュー時に、ＨＤＡＣ２がこれらのプロモーターから放出されることを示している。
【0216】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＴＧＦ－β、または結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）、またはマイクロＲＮＡをコードする。筋ジストロフィーにおけるＴＧＦ－βレベルの上昇は、衛星細胞の活性化を阻害することにより線維化を刺激し、筋肉再生を損なう。ＴＧＦ－βの発現を減少させるアンギオテンシンＩＩタイプ１受容体遮断薬であるロサルタンを含め、筋ジストロフィーのマウスモデルで抗線維化剤が試験されている。ＨＴ－１００（ハロフジノン）は、筋ジストロフィーにおいてＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ３経路を介して線維化を防ぐことも示されている。一方、線維化の病因における中心的なメディエーターである結合組織増殖因子の作用を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体であるＦＧ－３０１９は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者での非盲検第２相試験で評価されている。
【0217】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１３３、及び／またはｍｉＲ－２０６をコードする。デュシェンヌ型状態の野生型状態に対する異なったＨＤＡＣ２のニトロシル化状態が、マイクロＲＮＡ遺伝子の特定のサブセットの発現を脱調節する。同定されたマイクロＲＮＡによって制御されるいくつかの回路、例えば、ｍｉＲ－１をＧ６ＰＤ酵素及び細胞のレドックス状態に結合するもの、またはｍｉＲ－２９を細胞外タンパク質及び線維化過程に結合するものは、いくつかのＤＭＤの病因を説明する。ｍｄｘで下方制御された筋特異的（ｍｙｏｍｉＲ）ｍｉＲ－１及びｍｉＲ－１３３、ならびに普遍的なｍｉＲ－２９ｃ及びｍｉＲ－３０ｃは、エクソンスキッピング処理された動物において野生型レベルまで回復した。該ｍｄｘモデルによると、エクソンスキッピングを介してジストロフィン合成が回復した場合、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、及びｍｉＲ－２０６のレベルは増加したが、ｍｉＲ－２３ａの発現は変化しなかった。
【0218】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＤＭＤまたはその関連疾患において上方制御されるマイクロＲＮＡの機能を阻害するマイクロＲＮＡ阻害物質をコードする。例えば、炎症性ｍｉＲ－２２３の発現レベルは、ｍｄｘマウスの筋肉では上方制御され、エクソンスキッピング処理マウスでは下方制御される。その減少は、エクソンスキッピングによるジストロフィンレスキューに起因して、観察された筋肉の炎症状態の改善と一致する。
【0219】
該ｍｄｘ動物は、広範な線維化変性を受け、ｍｉＲ－２９は、コラーゲン、エラスチン、及び細胞外マトリックスの構造成分等の線維化変性に関与する重要な因子のｍＲＮＡを標的とすることが示されている。ｍｄｘマウスでは、ｍｉＲ－２９の発現が不良であり、コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）及びエラスチン（ＥＬＮ）のｍＲＮＡが上方制御された。従って、ｍｉＲ－２９ｃの発現は、ＤＭＤ患者における線維化変性を、１つには、コラーゲン及びエラスチンの発現、ならびにコラーゲン及びエラスチンの発現に関連する病的な細胞外マトリックスの修飾を下方制御することを介して軽減する。
【0220】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、Ｇ６ＰＤ（グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ジストロフィー筋における１つの重要な問題は、疾患の進行に関与することが示唆されている酸化ストレスに対する感受性及び反応である。Ｇ６ＰＤは、ペントースリン酸経路の細胞質内酵素であり、ＮＡＤＰＨのレベルを維持することによって細胞に還元エネルギーを供給する。これにより、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）の比が高くなる。ＧＳＨは、細胞を酸化的障害から保護する主要な抗酸化分子である。Ｇ６ＰＤのｍＲＮＡは、ｍｄｘの筋内で脱調節されている。それは、その３’－ＵＴＲ領域に、ｍｉＲ－１ファミリーの３つの推定結合部位を含み、ｍｉＲ－１及びｍｉＲ－２０６は、Ｇ６ＰＤ発現を抑制することができる。実際、Ｇ６ＰＤとｍｉＲ－１の発現の間には逆相関があり、Ｃ２筋芽細胞のインビトロでの分化は、ｍｉＲ－１のレベルの増加が、Ｇ６ＰＤタンパク質、ｍＲＮＡレベル、及びＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の減少と相関していることを示した。ｍｉＲ－１が下方制御されているｍｄｘマウスでは、Ｇ６ＰＤはＷＴ筋より高レベルで検出されたが、ｍｉＲ－１が回復するエクソンスキッピング処理されたｍｄｘでは、Ｇ６ＰＤの量が減少した。特に、ｍｄｘマウスでは、Ｇ６ＰＤレベルの増加は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の減少を伴った。
【0221】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ミオスタチンの機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ミオスタチンは、筋肉量の負の調節因子である。内因性ミオスタチンの阻害または遮断は、ＤＭＤを含めた多くの種類の筋ジストロフィーに共通する重度の筋肉消耗を補償する。ミオスタチン遮断抗体であるＭＹＯ－０２９は、ＢＭＤ及びその他のジストロフィーを有する成人被験者を対象とした臨床試験中である。フォリスタチンならびにＰＦ－０６２５２６１６（ＮＣＴ０２３１０７６４）及びＢＭＳ－９８６０８９等のミオスタチン阻害物質を使用した他の臨床試験も実施されている。
【0222】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）もしくはＡＣＥ、またはＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１もしくはＦｌｔ－１）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ジストロフィンの損失は、神経型一酸化窒素合成酵素の転位及び筋肉由来の一酸化窒素の減少を微小血管系にもたらし、機能性筋虚血及びさらなる筋障害につながる。従って、ホスホジエステラーゼ－５もしくはＡＣＥ、またはＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１もしくはＦｌｔ－１）のいくつかの阻害物質が、筋肉への血流を増加させる戦略の一部として試験されており、ホスホジエステラーゼ－５またはＡＣＥのいずれかの医薬品阻害を含む。
【0223】
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）は、様々な炎症細胞によって産生され、造血ＰＧＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）は、ＤＭＤ患者の壊死筋で発現することが分かっている。ＨＰＧＤＳ阻害物質の投与により、ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいて、ＰＧＤ２の尿代謝産物であるテトラノル－ＰＧＤＭの尿排泄が減少し、筋壊死が抑制された。新規ＨＰＧＤＳ阻害物質であるＴＡＳ－２０５は、ＤＭＤ治療に関して臨床試験で評価されている。
【0224】
ＲＮＡｉ及びアンチセンスのデザイン
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）では、内因性の標的ｍＲＮＡに相補的であり、これに結合する低ＲＮＡ分子が創出される。かかる結合は、該標的ｍＲＮＡの分解を含めた該標的ｍＲＮＡの機能的不活化につながる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）では、内因性の標的ｍＲＮＡに相補的であり、これに結合する低ＲＮＡ分子が創出される。かかる結合は、該標的ｍＲＮＡの分解を含めた該標的ｍＲＮＡの機能的不活化につながる。
【0225】
該ＲＮＡｉ経路は、植物や動物を含めた多くの真核生物に見出され、細胞質で酵素ダイサーによって開始され、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を、約２１ヌクレオチドの低分子二本鎖断片ｓｉＲＮＡに切断する。各ｓｉＲＮＡは次に、２つの一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、すなわち、パッセンジャー鎖とガイド鎖に巻き戻される。パッセンジャー鎖は分解され、ガイド鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。最もよく研究されている結果は、転写後遺伝子サイレンシングであり、これは、ガイド鎖がｍＲＮＡ分子内の相補配列と対合し、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）による切断を誘導する場合に生じる。一部の生物では、最初はｓｉＲＮＡのモル濃度が制限されるにもかかわらず、このプロセスが全身に広がる。
【0226】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ以外に、ＲＮＡ干渉の中心となる別のタイプの低ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
マイクロＲＮＡは、特に発達段階の遺伝子発現の調節を支援する、ゲノム的にコードされた非コードＲＮＡである。成熟型ｍｉＲＮＡは、構造的にはｓｉＲＮＡと同様であるが、成熟に達する前に、最初に大幅な転写後修飾を受ける必要がある。ｍｉＲＮＡは、非常に長いＲＮＡコード遺伝子から、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物として発現され、これが次に、細胞核内で、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａ及びｄｓＲＮＡ結合タンパク質ＤＧＣＲ８からなるマイクロプロセッサ複合体によって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる７０ヌクレオチドのステムループ構造までプロセシングされる。このｐｒｅ－ｍｉＲＮＡがサイトゾルに輸送されると、そのｄｓＲＮＡ部分がダイサーによって固定及び切断され、成熟型ｍｉＲＮＡ分子が生成され、この２本の鎖が、パッセンジャー鎖とガイド鎖に分離され得る。このｍｉＲＮＡのガイド鎖は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖と同様、同じＲＩＳＣ複合体に組み込まれ得る。
マイクロＲＮＡは、特に発達段階の遺伝子発現の調節を支援する、ゲノム的にコードされた非コードＲＮＡである。成熟型ｍｉＲＮＡは、構造的にはｓｉＲＮＡと同様であるが、成熟に達する前に、最初に大幅な転写後修飾を受ける必要がある。ｍｉＲＮＡは、非常に長いＲＮＡコード遺伝子から、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物として発現され、これが次に、細胞核内で、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａ及びｄｓＲＮＡ結合タンパク質ＤＧＣＲ８からなるマイクロプロセッサ複合体によって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる７０ヌクレオチドのステムループ構造までプロセシングされる。このｐｒｅ－ｍｉＲＮＡがサイトゾルに輸送されると、そのｄｓＲＮＡ部分がダイサーによって固定及び切断され、成熟型ｍｉＲＮＡ分子が生成され、この２本の鎖が、パッセンジャー鎖とガイド鎖に分離され得る。このｍｉＲＮＡのガイド鎖は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖と同様、同じＲＩＳＣ複合体に組み込まれ得る。
【0227】
従って、２つのｄｓＲＮＡ経路、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡは、どちらも、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの成熟型機能性ガイド鎖を生成するために、骨格配列を有する前駆体分子（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）のプロセシングを必要とし、どちらの経路も最終的にはＲＩＳＣ複合体に合流する。
【0228】
ＲＩＳＣへの組み込み後、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと塩基対を形成してそれを切断し、それが翻訳鋳型として使用されることを防ぐ。しかしながら、ｓｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡを搭載するＲＩＳＣ複合体は、潜在的な相補性に関して細胞質ｍＲＮＡをスキャンする。破壊的な切断（Ａｇｏ２による）の代わりに、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ領域を標的とし、通常はそこで不完全な相補性で結合し、ひいては翻訳のためのリボソームの接近をブロックする。
【0229】
ｍｉＲＮＡ、特に動物のｍｉＲＮＡは通常、標的との塩基対合が不完全であり、同様の配列を有する多くの異なるｍＲＮＡの翻訳を阻害するという点で、ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡは異なる。対照的に、ｓｉＲＮＡは通常、完全に塩基対を形成し、単一の特定の標的でのみｍＲＮＡの切断を誘導する。
【0230】
歴史的には、ＲＮＡｉの応用には、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡが使用されてきた。ｓｉＲＮＡは通常、２０～２５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを、それらが細胞内で分解されるまで一時的に阻害する。ｓｈＲＮＡは通常、約８０塩基対の長さであり、ヘアピン構造を創出する内部ハイブリダイゼーションの領域を含む。前述のように、ｓｈＲＮＡ分子は細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを形成し、これが次に遺伝子発現をノックダウンする。ｓｈＲＮＡの１つの利点は、より長期のまたは安定した発現、ひいては標的ｍＲＮＡのより長いノックダウンのためにそれらをプラスミドベクターに組み込むこと及びゲノムＤＮＡに統合することができることである。
【0231】
ｓｈＲＮＡのデザインは市販されている。例えば、Ｃｅｌｌｅｃｔａは、ヒト全ゲノムｓｈＲＮＡライブラリまたはマウスＤＥＣＩＰＨＥＲ ｓｈＲＮＡライブラリ（約１０，０００のマウス遺伝子を標的とする）を使用して、任意の標的遺伝子（例えば、１９，２７６のタンパク質コードヒト遺伝子すべて）に対するＲＮＡｉスクリーニングサービスを提供している。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃは、ＡｍｂｉｏｎのＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ（クラシック２１量体）を提供しており、これには、製造元によれば、ｓｉＲＮＡデザイン、オフターゲット効果予測アルゴリズム、及び化学における最新の改善が組み込まれている。
【0232】
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃはまた、内因性成熟型ｍｉＲＮＡを模倣するようにデザインされた、化学修飾された低分子二本鎖ＲＮＡ分子であるＡｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ－ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体分子も提供している。かかるＰｒｅ－ｍｉＲ ｍｉＲＮＡ前駆体を使用すると、ｍｉＲＮＡ活性の上方制御によるｍｉＲＮＡの機能解析が可能になり、ｍｉＲＮＡの標的部位の同定及び検証、標的遺伝子の発現を調節するｍｉＲＮＡのスクリーニング、及び標的遺伝子（ＳＬＮ等）または細胞過程の機能に影響を与えるｍｉＲＮＡのスクリーニングに使用することができる。
【0233】
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃはさらに、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子に特異的に結合して阻害するようにデザインされた、化学修飾された一本鎖核酸であるＡｍｂｉｏｎ（登録商標）Ａｎｔｉ－ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ阻害物質を提供している。
【0234】
アンチセンス配列のデザインもまた、多くの商業的及び公的供給源、例えば、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＧｅｎＬｉｎｋから市販されている。デザイン上の考慮事項としては、オリゴ長、標的ｍＲＮＡの二次／三次構造、標的ｍＲＮＡ上のタンパク質結合部位、標的ｍＲＮＡまたはアンチセンスオリゴのいずれかにおけるＣＧモチーフの存在、アンチセンスオリゴにおける四重体の形成、及びアンチセンスの活性を向上するまたは低下させるモチーフの存在を挙げてもよい。
【0235】
エクソンスキッピングアンチセンスオリゴのデザインは、当技術分野で既知である。例えば、標的部位の選択、オリゴの長さ、オリゴの化学、及びＲＮＡ鎖に対する融解温度等の要因を考慮に入れ、効果的なエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドのデザインについて詳しく論じたＳｈｉｍｏ ｅｔ ａｌ．によるＣａｍｉｌｌａ Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ（ｅｄ．），Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６８７，ＤＯＩ １０．１００７／９７８－１－４９３９－７３７４－３＿１０，Ｃｈａｐｔｅｒ １０（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣにより発行），２０１８）を参照されたい。複数のエクソンをスキップするためのアンチセンスオリゴのカクテルの使用についても論じられている。取り扱われている特定の遺伝子及び筋ジストロフィーには、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＬＡＭＡ２（メロシン欠損型ＣＭＤ、ＤＹＳＦ（ジスフェリン異常症、ＦＫＴＮ（福山型ＣＭＤ）、ＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィー、及びＳＧＣＧ（ＬＧＭＤ２Ｃ）が含まれる。その全内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【0236】
例えば、罹患疾患遺伝子におけるタンパク質／遺伝子配列及びその突然変異は、ＮＣＢＩ及びライデン筋ジストロフィーページ（Ｌｅｉｄｅｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐａｇｅｓ）からオンラインで公開されている。効率的なエクソンスキッピングの潜在的な標的部位は、ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦのヒューマンスプライシングファインダーのウェブサイトを使用して取得することができる。標的ｍＲＮＡの二次構造は、例えば、Ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕウェブサイトのｍｆｏｄウェブサーバーを使用して評価することができる。オリゴの長さは通常８～３０量体である。オリゴのＧＣ含量の計算は、ノースウェスタン大学のサーバーにあるＯｌｉｇｏＣａｌｃのＷｅｂサイトで可能である。任意の標的外配列の検索は、ＧＧＧｅｎｏｍｅのウェブサイトを使用して行うことができる。オリゴの融解温度は、ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍのＬＮＡオリゴ予測ツールまたはＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．１ソフトウェアで推定することができる。
【0237】
ＲＮＡｉ（ｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）のガイド鎖生成の改善
ある特定の実施形態では、該コード配列は、ＲＮＡｉ試薬、例えば、ｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする。
ある特定の実施形態では、該コード配列は、ＲＮＡｉ試薬、例えば、ｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする。
【0238】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ及び／またはｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡのデザインに関して、成熟型ｍｉＲまたは成熟型ｓｉＲＮＡが生成される野生型骨格配列を修飾して、ガイド鎖生成を改善すること及びパッセンジャー鎖の生成を最小化／排除することができる。成熟型ｍｉＲ／ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの両方の鎖（切断後）は、理論上、ＲＩＳＣ複合体に組み込まれ、ＲＮＡｉのガイド鎖になり得るため、例えば、オフターゲット効果（例えば、パッセンジャー鎖がＲＩＳＣに搭載された場合の意図しない標的配列の切断に起因する）を低減または最小化するために、ＲＩＳＫ複合体において、デザインされたガイド鎖の利用を選択的に高め、大部分相補的なパッセンジャー鎖の利用を最小限に抑えることが有利である。
【0239】
この目標（リーディング鎖の生成を高め、パッセンジャー鎖の生成を最小化／排除する）を達成するために使用することができる１つのアプローチは、所望のガイド鎖を含むデザインされた成熟型ｍｉＲ／ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ配列が、ガイド鎖の生成に有利に働きかつパッセンジャー鎖の生成に不利な他のｍｉＲ配列の骨格配列の内部に埋め込まれているハイブリッド構築物を使用することによる。
【0240】
この原理は、いくつかの修飾ｍｉＲ－２９ｃ構築物及びｓｈＳＬＮ構築物のデザインに示されているが、同じ原理は、任意の他の配列を標的とする他のＲＮＡｉ試薬に容易に採用することができる。
【0241】
以下に示すすべてのデザインについて、採用するデザイン戦略としては、天然の骨格配列の２Ｄ及び３Ｄ構造を維持するために、隣接する骨格配列、ループ配列、及びパッセンジャー鎖のヌクレオチド配列の改変が挙げられる。これに関連して、ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡデザインの場合、天然の骨格配列の２Ｄ／３Ｄ構造は、主に、ステムループと隣接する骨格ポリヌクレオチド配列間の距離、中心ステムの構造、バルジの位置及び／またはサイズ、ステム内の任意の内部ループ及びミスマッチの存在及び局在等を指す。選択されたｍｉＲ－３０Ｅ、ｍｉＲ－１０１、及びｍｉＲ－４５１の骨格配列に基づくｍｉＲ－２９ｃハイブリッド構築物のある特定の例示的な２Ｄ構造マップを、以下に実例として提供する。
【0242】
Ａ．ｍｉＲ－３０骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－Ｍ３０Ｅ）
Ｆｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．５（６）：１７０４－１７１３， ２０１３、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、いわゆる「ｓｈＲＮＡｍｉｒ」、すなわち、内因性マイクロＲＮＡ文脈に埋め込まれた合成ｓｈＲＮＡの最適プロセシングに極めて必要な基本的なステムの保存要素の３’を特定することによる、実験的ｍｉＲ－３０骨格を最適化するための体系的なアプローチを記載している。得られた「ｍｉＲ－Ｅ」と呼ばれる最適化骨格は、成熟型ｓｈＲＮＡのレベル及びノックダウン効果を大きく増加させた。このアプローチは、既存のｍｉＲ及びｓｈＲＮＡ試薬をｍｉＲ－Ｅに容易に変換し、より効果的なｍｉＲ及びｓｈＲＮＡを生成することができる。
Ｆｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．５（６）：１７０４－１７１３， ２０１３、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、いわゆる「ｓｈＲＮＡｍｉｒ」、すなわち、内因性マイクロＲＮＡ文脈に埋め込まれた合成ｓｈＲＮＡの最適プロセシングに極めて必要な基本的なステムの保存要素の３’を特定することによる、実験的ｍｉＲ－３０骨格を最適化するための体系的なアプローチを記載している。得られた「ｍｉＲ－Ｅ」と呼ばれる最適化骨格は、成熟型ｓｈＲＮＡのレベル及びノックダウン効果を大きく増加させた。このアプローチは、既存のｍｉＲ及びｓｈＲＮＡ試薬をｍｉＲ－Ｅに容易に変換し、より効果的なｍｉＲ及びｓｈＲＮＡを生成することができる。
【0243】
この技術を適用して、２９ｃ－Ｍ３０Ｅハイブリッド配列が、所望の成熟型ｍｉＲ－２９ｃ配列、及びＦｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．に記載の改変／最適化ｍｉＲ－３０骨格配列に基づいて生成された。この２９ｃ－Ｍ３０Ｅ配列（その予測２Ｄ構造については図２９参照）は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：μＤｙｓ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ－ｉ２、ＥＦ１Ａ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ、Ｕ６－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ。以下の２９ｃ－Ｍ３０Ｅの５’→３’配列は、連続配列であり、該連続配列の異なるセグメントを示すために異なるラインに人為的に分離されている。
【0244】
【化4】
【0245】
具体的には、上記の連続配列において、中央のラインは、パッセンジャー鎖配列、二重下線付きループ配列、及び成熟型ｍｉＲ－２９ｃガイド配列を表す。該パッセンジャー配列及びガイド配列は、互いに逆相補的であり、スナップバックして、介在ループ配列とともにステムループ構造を形成することができることに留意されたい。しかしながら、完全な逆相補配列は必要ではないことに留意されたい。内部にバルジ等がある可能性があるため、該２本の鎖は、場合によっては必ずしも互いに１００％相補的ではない（本サブセクションの最後の配列におけるガイド鎖及びパッセンジャー鎖を参照のこと）。上のライン及び下のラインは、ガイド配列の生成を高め、パッセンジャー鎖の生成を最小化するように最適化されたＭ３０Ｅの隣接骨格配列を表す。
【0246】
同様のデザインで、ヒトＳＬＮを標的とするｓｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３０Ｅ－ｈＳＬＮ－ｃ１において同じＭ３０Ｅ骨格配列に埋め込まれている（本パラグラフの直上及び直下の配列の上行及び下行、ならびに二重下線付きのループ配列を比較されたい）。ただし、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は異なる。このいわゆるｃ１－Ｍ３０Ｅ配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ１－Ｍ３０Ｅ－ｉ２、ｃ１－Ｍ３０Ｅ－３ＵＴＲ、及びｃ１－Ｍ３０Ｅ－ｐａ。
【0247】
【化5】
【0248】
ヒトＳＬＮもまた標的とする同様にデザインされた第２のｓｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３０Ｅ－ｈＳＬＮ－ｃ２において同じＭ３０Ｅ骨格配列に埋め込まれている（本パラグラフの直上及び直下の配列の上行及び下行、ならびに二重下線付きのループ配列を比較されたい）。ただし、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は異なる。このいわゆるｃ２－Ｍ３０Ｅ配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ２－Ｍ３０Ｅ－ｉ２、ｃ２－Ｍ３０Ｅ－３ＵＴＲ、及びｃ２－Ｍ３０Ｅ－ｐａ。
【0249】
【化6】
【0250】
天然のｍｉＲ－３０骨格配列（「Ｍ３０Ｎ」）を使用した修飾ｍｉＲ－２９ｃの配列も、比較として以下に提供する。この場合のガイド鎖は、ループ配列の５’にあることに留意されたい。このＭ３０Ｎ骨格配列も同様にガイド鎖の生成を高めたが、調べた実験系のＭ３０Ｅ骨格配列よりも程度は低かった（データは示さず）。
【0251】
【化7】
【0252】
Ｂ．ｍｉＲ－１０１骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－１０１）
ｍｉＲ－１０１骨格配列を使用した異なるｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１０１、その予測２Ｄ構造については図３０参照）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と最後の２行は、ｍｉＲ－１０１骨格配列を表し、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。この２９ｃ－１０１配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２、μＤｙｓ－２９ｃ－３ＵＴＲ－１０１。
ｍｉＲ－１０１骨格配列を使用した異なるｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１０１、その予測２Ｄ構造については図３０参照）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と最後の２行は、ｍｉＲ－１０１骨格配列を表し、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。この２９ｃ－１０１配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２、μＤｙｓ－２９ｃ－３ＵＴＲ－１０１。
【0253】
【化8】
【0254】
Ｃ．ｍｉＲ－１５５骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－１５５）
ｍｉＲ－１５５骨格配列を使用した異なるｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１５５）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。この２９ｃ－１５５配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５。
ｍｉＲ－１５５骨格配列を使用した異なるｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１５５）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。この２９ｃ－１５５配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５。
【0255】
【化9】
【0256】
同様にｍｉＲ－１５５骨格配列を使用した別のｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１９ｎｔ）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列（直上の配列におけるものと同一）を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。ここでのループ配列は、上記の配列の１７ｎｔループの代わりに、１９ｎｔであることに留意されたい。この２９ｃ－１９ｎｔ配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１９ｎｔ、２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－ｐＡ、２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－３ＵＴＲ。
【0257】
【化10】
【0258】
Ｄ．ｍｉＲ－１５５骨格配列を有するハイブリッドｓｈＳＬＮ（ｓｈｍＳＬＮ－ｖ２及びｃ１／ｃ２－ｍ１５５）
ｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するマウスＳＬＮを標的とする成熟型ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＳＬＮ）である。このｓｈｍＳＬＮ－ｖ２配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ、融合－ｖ１、μＤｙｓ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１。
ｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するマウスＳＬＮを標的とする成熟型ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＳＬＮ）である。このｓｈｍＳＬＮ－ｖ２配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ、融合－ｖ１、μＤｙｓ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１。
【0259】
【化11】
【0260】
ｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するマウスＳＬＮを標的とする別の成熟型ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＳＬＮ）である。上記の類似／関連するｓｈｍＳＬＮ配列と比較して、余分なジヌクレオチド塩基対ＴＴ：ＡＡ（または厳密には、ｓｉＲＮＡの３’末端のＵＵ）の存在は、生成されたガイド鎖ｓｉＲＮＡの効力の増加と関連している。このｓｈｍＳＬＮ－ｖ２配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ－ｖ２、融合－ｖ２、μＤｙｓ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ２。
【0261】
【化12】
【0262】
別のｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するヒトＳＬＮを標的とする成熟型ｓｈＲＮＡである。このｃ１－ｍ１５５配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ１－ｍ１５５－ｐａ、ｃ１－ｍ１５５－ｉ２、ｃ１－ｍ１５５－３ＵＴＲ。
【0263】
【化13】
【0264】
別のｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、異なるガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するヒトＳＬＮを標的とする成熟型ｓｈＲＮＡである。このｃ２－ｍ１５５配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ２－ｍ１５５－ｐａ、ｃ２－ｍ１５５－ｉ２、ｃ２－ｍ１５５－３ＵＴＲ。
【0265】
【化14】
【0266】
Ｅ．ｍｉＲ－４５１骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－４５１）
ｍｉＲ－４５１骨格配列を使用したｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－４５１、その予測２Ｄ構造については図３１参照）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上２行と下２行は、ｍｉＲ－４５１の隣接骨格配列を表し、３番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。
ｍｉＲ－４５１骨格配列を使用したｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－４５１、その予測２Ｄ構造については図３１参照）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上２行と下２行は、ｍｉＲ－４５１の隣接骨格配列を表し、３番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。
【0267】
【化15】
【0268】
Ｆ．Ｕ６駆動ｍｉＲ－２９ｃ及びｓｈＳＬＮ
以下の実験のセクションでは、ｍｉＲ－２９ｃのみまたはｓｈＳＬＮのみを発現するある特定の「ソロ」ウイルスベクター構築物の使用についても説明する。かかるソロ発現カセットは、強力なＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動される。この強力なＵ６プロモーターは、隣接するヌクレオチド配列なしで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたはｓｈＳＬＮを直接生成するため、かかる配列は、修飾ｍｉＲ－２９ｃまたは修飾ｓｈＳＬＮ配列には属さない。しかしながら、比較の目的で、かかる配列も同じ命名法を使用してここに記載する。
以下の実験のセクションでは、ｍｉＲ－２９ｃのみまたはｓｈＳＬＮのみを発現するある特定の「ソロ」ウイルスベクター構築物の使用についても説明する。かかるソロ発現カセットは、強力なＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動される。この強力なＵ６プロモーターは、隣接するヌクレオチド配列なしで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたはｓｈＳＬＮを直接生成するため、かかる配列は、修飾ｍｉＲ－２９ｃまたは修飾ｓｈＳＬＮ配列には属さない。しかしながら、比較の目的で、かかる配列も同じ命名法を使用してここに記載する。
【0269】
該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｍｉＲ－２９ｃを以下に示す（Ｕ６－２９ｃ－ｖ１）。ここで、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。これは、ｐＧＦＰ－Ｕ６－ｓｈＡＡＶ－ＧＦＰベクターで「ソロ」対照ベクターを生成するために使用されている。以下の連続配列の最初の行のヌクレオチドは、Ｕ６プロモーターの転写開始部位後の最初の５ヌクレオチドであり、Ｔ６の転写終結配列は、以下の連続配列の最後の行のクローニングに使用された配列の前にある。
【0270】
【化16】
【0271】
該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｓｈＳＬＮを以下に示す（Ｕ６－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１）。ここで、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｓｈＳＬＮである。これは、実施例のＵ６－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１ベクターで使用されている。
【0272】
【化17】
【0273】
該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｓｈＳＬＮを以下に示す（Ｕ６－ｍＳＬＮ－ｖ４）。ここで、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｓｈＳＬＮである。これは、実施例のＵ６－ｍＳＬＮ－ｖ４ベクターで使用されている（図１５参照）。
【0274】
【化18】
【0275】
組成物及び医薬組成物
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び医薬的に許容される担体を含む。該組成物は、他の成分、例えば、希釈剤及びアジュバントも含んでよい。許容される担体、希釈剤及びアジュバントは、レシピエントに無害であり、好ましくは、使用される用量及び濃度で不活性であり、これらとしては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン、単糖、二糖、及び他の炭水化物、すなわち、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン等、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール、塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び医薬的に許容される担体を含む。該組成物は、他の成分、例えば、希釈剤及びアジュバントも含んでよい。許容される担体、希釈剤及びアジュバントは、レシピエントに無害であり、好ましくは、使用される用量及び濃度で不活性であり、これらとしては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン、単糖、二糖、及び他の炭水化物、すなわち、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン等、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール、塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【0276】
投薬及び投与
本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野で標準的な方法で決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３から、約１×１０１４まで、またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）に及び得る。用量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある。
本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野で標準的な方法で決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３から、約１×１０１４まで、またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）に及び得る。用量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある。
【0277】
標的細胞にインビボまたはインビトロでｒＡＡＶを形質導入する方法は、本発明によって企図される。該インビボ法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数回用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。該用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、該投与は予防的である。該用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、該投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または軽減）する用量であり、それにより、障害／疾患状態への進行が遅延または防止され、障害／疾患状態の進行が遅延または防止され、疾患の程度が弱まり、疾患の寛解（部分または完全）がもたらされ、及び／または生存期間が延長される。本発明の方法による予防または治療に対して企図される疾患の例は、ＰＭＤまたは他のミエリン産生、変性、再生、または機能の欠陥を特徴とする疾患である。
【0278】
投与に関して、有効量及び治療有効量（本明細書では用量とも呼ばれる）は、最初は、インビトロアッセイ及び／または動物モデルでの試験の結果に基づいて推定され得る。例えば、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおける用量が処方され得る。かかる情報は、目的の対象での有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【0279】
該組成物の有効用量の投与は、当技術分野で標準的な経路によるものでよく、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、経鼻、経肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むがこれらに限定されない、本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、該ＡＡＶのＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）及び血清型（複数可）は、当業者によって、治療される感染及び／または疾患状態ならびに該１つ以上のコード配列及び／またはマイクロジストロフィンを発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して選択及び／または適合され得る。
【0280】
具体的には、本明細書に記載の製剤は、限定されないが、注射、注入、灌流、吸入、洗浄、及び／または摂取によって投与され得る。投与経路としては、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、心膜内、臍内、眼内、粘膜、経口、皮下、及び／または結膜下が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0281】
本発明は、本発明の併用療法を含む本発明のｒＡＡＶ及び組成物の有効用量の局所投与または全身投与を提供する。例えば、全身投与は循環系への投与であり、全身が影響を受ける。全身投与には、経腸投与、例えば、消化管からの吸収、及び注射、注入または移植による非経口投与が含まれる。
【0282】
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、動物の標的組織、例えば、骨格筋に該ｒＡＡＶ組み換えベクターを輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与には、筋肉、血流及び／または直接肝臓への注射が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁するだけで、筋組織での発現に有用な媒体を提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体または他の成分に対する制限は知られていない（ただし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶでは普通に回避するべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが目的の特定の標的組織、例えば、筋肉を標的とするように修飾され得る。例えば、その開示が参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。
【0283】
医薬組成物は、注射製剤または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉注射及び経皮輸送の両方に対する多数の製剤が以前に開発されており、本発明の実施において使用することができる。該ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするための任意の医薬的に許容される担体とともに使用することができる。
【0284】
本明細書に開示する方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野で標準的な方法で決定され得る。
【0285】
特定の対象に投与される実際の投与量は、医師、獣医、または研究者によって、体重、状態の重症度、疾患の型、以前のまたは併用される治療的介入、該対象の特発性疾患、及び／または投与経路を含めた物理的及び生理的因子等であるが、これらに限定されないパラメータを考慮して決定される場合もある。
【0286】
投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４から、または約１×１０１５まで、またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）に及び得る。用量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある（すなわち、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ、１×１０１５ｖｇ）。用量は、体重１キログラム（ｋｇ）あたりのウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある（すなわち、それぞれ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶの力価を測定する方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１０３１－１０３９，１９９９に記載されている。
【0287】
例示的な用量は、約１×１０１０～約１×１０１５ベクターゲノム（ｖｇ）／キログラム体重に及び得る。いくつかの実施形態では、用量は、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ体重、または１×１０１５ｖｇ／ｋｇ体重を含み得る。用量は、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ／日、または１×１０１５ｖｇ／ｋｇ／日を含み得る。用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日～５ｍｇ／ｋｇ／日または０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日または０．１ｍｇ／ｋｇ／日～５μｇ／ｋｇ／日または０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１μｇ／ｋｇ／日に及び得る。他の非限定的な例では、用量は、１μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、２００μｇ／ｋｇ／日、３５０μｇ／ｋｇ／日、５００μｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日、３５０ｍｇ／ｋｇ／日、５００ｍｇ／ｋｇ／日、または１０００ｍｇ／ｋｇ／日を含み得る。治療有効量は、治療計画の過程（すなわち、数日、数週間、数ヶ月等）において、単回投与により達成される場合もあれば、複数回投与により達成される場合もある。
【0288】
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、少なくとも１．６×１０１３のベクターゲノムを有する水溶液１０ｍＬの剤形である。いくつかの実施形態では、該剤形は、１ミリリットルあたり少なくとも２×１０１２のベクターゲノムの効力を有する。いくつかの実施形態では、該剤形は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液を含む。いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む１０ｍＬの滅菌水溶液の剤形に含まれ、少なくとも１．６×１０１３のベクターゲノムを有する。
【0289】
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、１×１０１０～１×１０１５のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、１×１０１１～１×１０１４のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、１×１０１２～２×１０１３のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、または約１．６×１０１３以上のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液を含む剤形であり得る。いくつかの実施形態では、該水溶液は、約１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジンと、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液である。いくつかの実施形態では、該剤形は、１ミリリットルあたりのベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）約１×１０１１超、約１×１０１２ｖｇ／ｍＬ超、約２×１０１２ｖｇ／ｍＬ超、約３×１０１２ｖｇ／ｍＬ超、または約４×１０１２ｖｇ／ｍＬ超の効力を有する。
【0290】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＡＶベクターは、医薬組成物の一部として提供される。該医薬組成物は、例えば、少なくとも０．１％ｗ／ｖの該ＡＡＶベクターを含み得る。いくつかの他の実施形態では、該医薬組成物は、該医薬組成物の重量あたり２％～７５％の化合物、または該医薬組成物の重量あたり２５％～６０％の化合物を含み得る。
【0291】
いくつかの実施形態では、該剤形はキットに含まれる。該キットはさらに、該剤形の使用説明書を含んでもよい。
筋肉注射の目的のため、滅菌水溶液だけでなく、ゴマ油もしくは落花生油等のアジュバント溶液または水性プロピレングリコール溶液も使用することができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、該希釈液は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合した水中で調製され得る。ｒＡＡＶの分散体もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中及び油中で調製され得る。通常の保存条件及び使用条件下、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。これに関連して、使用される無菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準的な技術で容易に得られる。
筋肉注射の目的のため、滅菌水溶液だけでなく、ゴマ油もしくは落花生油等のアジュバント溶液または水性プロピレングリコール溶液も使用することができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、該希釈液は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合した水中で調製され得る。ｒＡＡＶの分散体もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中及び油中で調製され得る。通常の保存条件及び使用条件下、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。これに関連して、使用される無菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準的な技術で容易に得られる。
【0292】
いくつかの実施形態では、注射用に、製剤は水溶液として、例えば、限定されないが、ハンクス液、リンゲル液、及び／または生理食塩水を含む緩衝液として作製され得る。該溶液は、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤等の配合剤を含んでもよい。代替的に、該製剤は、凍結乾燥状態及び／または粉末形態であってもよく、使用前に適切な媒体対照（例えば、パイロジェンフリーの滅菌水）で構成される。
【0293】
本明細書に開示する任意の製剤は、有利には、研究、予防、及び／または治療処置用であるかどうかにかかわらず、投与の利益を上回る可能性のある重大な副反応、アレルギー反応、または他の有害反応を生じさせないものを含む、任意の他の医薬的に許容される担体（複数可）を含み得る。例示的な医薬的に許容される担体及び製剤は、それに関連する教示に関して、参照することにより本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に開示されている。さらに、製剤は、米国ＦＤＡのＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ及び／または他の関連する米国及び外国の規制機関によって要求される、無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たすように調製され得る。
【0294】
例示的な一般的に使用される医薬的に許容される担体は、増量剤もしくは充填剤、溶媒もしくは共溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、及びビタミンＥ）、防腐剤、等張剤、吸収遅延剤、塩、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、ゲル、結合剤、崩壊剤、及び／または滑沢剤を含み得るが、これらに限定されない。
【0295】
例示的な緩衝剤は、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルコン酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及び／またはトリメチルアミン塩を含み得るが、これらに限定されない。
【0296】
例示的な防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ－クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベン等）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び／または３－ペンタノールを含み得るが、これらに限定されない。
【0297】
例示的な等張剤は、三価以上の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及び／またはマンニトール）を含むがこれらに限定されない多価糖アルコールを含み得る。
【0298】
例示的な安定剤は、有機糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール、硫黄含有還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマー、及び／または多糖類を含み得るが、これらに限定されない。
【0299】
製剤はまた、デポー製剤でもよい。いくつかの実施形態では、かかる長時間作用型製剤は、限定されないが、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉注射によって投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー及び／または疎水性材料（例えば、許容される油中エマルションとして）もしくはイオン交換樹脂で、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化され得る。
【0300】
さらに、様々な実施形態では、該ＡＡＶベクターは、持続放出システム、例えば、該ＡＡＶベクターを含む固体ポリマーの半透性マトリックスを使用して送達され得る。様々な持続放出材料が確立されており、当業者には周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に応じて、投与後数週間から１００日以上にわたって該ベクターを放出する。
【0301】
注射用途に適した医薬担体、希釈剤または賦形剤としては、滅菌注射剤溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体及び滅菌粉末が挙げられる。すべての場合で、当該形態は、無菌でなければならず、容易にシリンジを通過する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保管条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。該担体は、溶媒の場合も分散媒の場合もあり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散体の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射剤組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【0302】
無菌注射剤溶液は、必要量のｒＡＡＶを、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散体は、滅菌された活性成分を、基本的な分散媒及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射剤溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分に加えて任意のさらなる所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【0303】
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行われる場合もある。１つの実施形態では、所望の標的筋細胞は、該対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、該対象に再導入される。代替的に、同系または異種筋細胞を使用することができ、ここでは、これらの細胞は、不適切な免疫応答を該対象内で生じない。
【0304】
対象への形質導入及び形質導入細胞の再導入に適した方法は、当技術分野で既知である。１つの実施形態では、細胞は、インビトロで、例えば、適切な培地中でｒＡＡＶを筋細胞と混合すること、及び目的のＤＮＡを有する細胞を、従来の技術、例えば、サザンブロット及び／またはＰＣＲを使用して、または選択可能なマーカーを使用してスクリーニングすることにより、形質導入することができる。形質導入細胞は、その後医薬組成物に製剤化することができ、該組成物は、様々な技術、例えば、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内注射、または、例えば、カテーテルを用いた平滑筋及び心筋への注射により、該対象に導入され得る。
【0305】
本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンの持続的な共発現をもたらす。本発明は、従って、該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンを共発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、組織（筋肉等の組織、肝臓及び脳等の器官、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）を本発明の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することが含まれる。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットを用いて行われ得る。例えば、本発明の１つの実施形態は、筋肉特異的制御要素によって指示される筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供し、該制御要素としては、限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー由来のもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６１－７６６，１９９１参照）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２，１９９１）、ヒト骨格アクチン遺伝子（Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：４０８９－４０９９，１９８７）、心筋型アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：３３９３－３３９９，１９８９）、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素に由来する制御要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘導性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６８０－５６８４，１９９１）、ステロイド誘導性因子及びグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５６０３－５６０７，１９９３参照）、ならびに他の制御要素が挙げられる。
【0306】
筋肉組織は、それが重要器官ではなく、かつ近づきやすいため、インビボでのＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのｍｉＲＮＡとマイクロジストロフィンの持続的な共発現を企図する。
【0307】
本明細書で使用される、「筋細胞」または「筋組織」は、あらゆる種類の筋肉に由来する細胞または細胞群を意味する（例えば、骨格筋及び平滑筋、例えば、消化管、膀胱、血管または心臓組織に由来するもの）。かかる筋細胞は、分化していても未分化でもよく、例えば、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞及び心筋芽細胞であり得る。
【0308】
「形質導入」という用語は、該１つ以上のさらなるコード配列及び該マイクロジストロフィンのコード領域を、インビボまたはインビトロのいずれかで、レシピエント細胞による該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンの共発現をもたらす本発明の複製欠損性のｒＡＡＶを介して、該レシピエント細胞に投与／送達することを指すために使用される。
【0309】
従って、本発明は、該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶの有効用量（または複数回用量、本質的に同時に投与されるか、または間隔を置いて投与される）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。
【0310】
ＡＡＶの生成
ＡＡＶベクターの必要な複製（ｒｅｐ）及び構造（ｃａｐ）タンパク質をコードする遺伝子は、ＡＡＶベクターから削除されており、送達されるべき配列を残りの末端リピート配列間に挿入することが可能である。従って、ＡＡＶベクターの増殖には、ヘルパーウイルスだけでなく、感染細胞に送達される必要があるｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をコードする遺伝子が必要である。代替的に、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をコードする遺伝子は、生成に使用される細胞に存在することが必要である。
ＡＡＶベクターの必要な複製（ｒｅｐ）及び構造（ｃａｐ）タンパク質をコードする遺伝子は、ＡＡＶベクターから削除されており、送達されるべき配列を残りの末端リピート配列間に挿入することが可能である。従って、ＡＡＶベクターの増殖には、ヘルパーウイルスだけでなく、感染細胞に送達される必要があるｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をコードする遺伝子が必要である。代替的に、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をコードする遺伝子は、生成に使用される細胞に存在することが必要である。
【0311】
本発明の方法に適したＡＡＶベクターは、当技術分野で認められている方法のいずれかを使用して生成することができる。最近の総説で、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ．８，ｐａｇｅｓ １６６－１８０，２０１８）は、ｒＡＡＶを生成するために最も一般的に使用される上流方法の総説を示した。該総説に記載の各方法は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【0312】
パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクション
特に、ある特定の実施形態では、該ＡＡＶベクターは、パッケージング細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを使用して生成される。これは、ヒト胚性ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドトランスフェクションを含む、最も確立されたＡＡＶの生成方法である。通常、ＨＥＫ２９３細胞は、ベクタープラスミド（目的の遺伝子、例えば、該ジストロフィンミニ遺伝子及び該１つ以上のさらなるコード配列の両方をコードする本主題のポリヌクレオチドを含む）、及び１つまたは２つのヘルパープラスミドによって、リン酸カルシウムまたはカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて同時にトランスフェクトされる。
特に、ある特定の実施形態では、該ＡＡＶベクターは、パッケージング細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを使用して生成される。これは、ヒト胚性ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドトランスフェクションを含む、最も確立されたＡＡＶの生成方法である。通常、ＨＥＫ２９３細胞は、ベクタープラスミド（目的の遺伝子、例えば、該ジストロフィンミニ遺伝子及び該１つ以上のさらなるコード配列の両方をコードする本主題のポリヌクレオチドを含む）、及び１つまたは２つのヘルパープラスミドによって、リン酸カルシウムまたはカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて同時にトランスフェクトされる。
【0313】
該ヘルパープラスミド（複数可）は、４つのＲｅｐタンパク質、ＡＡＶの３つの構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、ＡＡＰ、及びアデノウイルス補助機能Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡＲＮＡの発現を可能にする。ｒＡＡＶ複製に必要なさらなるアデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ補因子は、ＨＥＫ２９３生成細胞で発現される。Ｒｅｐ－ｃａｐ及びアデノウイルスヘルパー配列は、２つの別々のプラスミドにクローニングされるか、または１つのプラスミドに結合されるため、トランスフェクションのための３つのプラスミド系及び２つのプラスミド系の両方が可能である。３つのプラスミドのプロトコルは、ある血清型から別の血清型に容易に切り替えることができるｃａｐ遺伝子を備えた汎用性を提供する。
【0314】
該プラスミドは通常、従来の技術により、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、細菌起源の抗生物質耐性遺伝子を使用して、またはミニサークル技術によって生成される。
接着性のＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションは、ｒＡＡＶベクターの大規模製造に使用されている。最近では、ＨＥＫ２９３細胞はまた、長期にわたり経済的に実行可能な浮遊条件にも適応している。
接着性のＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションは、ｒＡＡＶベクターの大規模製造に使用されている。最近では、ＨＥＫ２９３細胞はまた、長期にわたり経済的に実行可能な浮遊条件にも適応している。
【0315】
ＨＥＫ２９３株は、無血清浮遊Ｆ１７、Ｅｘｐｉ２９３、または他の製造元の特殊培地で維持される浮遊ＨＥＫ２９３細胞を除き、通常、Ｌ－グルタミン、５％～１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで増殖させる。接着細胞の場合、動物由来成分による汚染を制限するため、ＡＡＶの生成時にＦＢＳの割合を減らすことができる。
【0316】
一般に、ｒＡＡＶベクターは、血清型に応じて、プラスミドのトランスフェクションの４８～７２時間後に細胞ペレット及び／または上清から回収される。
組み換えバキュロウイルスによる昆虫細胞の感染
バキュロウイルスＳｆ９のプラットフォームは、哺乳類細胞におけるＧＭＰ準拠の拡張可能な代替ＡＡＶ生成方法として確立されている。これは、粗製収穫物で細胞あたり最大２×１０５ベクターゲノム（ｖｇ）を生成することができる。
組み換えバキュロウイルスによる昆虫細胞の感染
バキュロウイルスＳｆ９のプラットフォームは、哺乳類細胞におけるＧＭＰ準拠の拡張可能な代替ＡＡＶ生成方法として確立されている。これは、粗製収穫物で細胞あたり最大２×１０５ベクターゲノム（ｖｇ）を生成することができる。
【0317】
現在のプロトコルは、２つの組み換えバキュロウイルス、すなわち、Ｒｅｐ７８／５２及びＣａｐの合成を可能にするバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）、及びＡＡＶのＩＴＲに隣接する目的の遺伝子を運ぶ組み換えバキュロウイルスによるＳｆ９昆虫細胞の感染を含む。いくつかの無血清培地は、浮遊でのＳｆ９細胞の増殖に適応化される。
【0318】
該デュアルバキュロウイルスＳｆ９生成システムは、これらの安全性の問題に関して他の生成プラットフォームと比べて多くの利点を有する：（１）無血清培地の使用、（２）Ｓｆ細胞株での外来ウイルス転写産物の発見にもかかわらず、昆虫に感染するウイルスのほとんどは、哺乳類細胞では能動的に複製しない、及び（３）バキュロウイルス以外に、昆虫細胞でのｒＡＡＶ生成にヘルパーウイルスは必要ない。
【0319】
ある特定の実施形態では、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質を発現する安定なＳｆ９昆虫細胞株が使用されるため、感染性ｒＡＡＶベクターを高収率で生成するためには１つのみの組み換えバキュロウイルスの感染が必要とされる。
【0320】
ｒＨＳＶベクターによる哺乳類細胞の感染
ＨＳＶは、許容細胞でのＡＡＶの複製用のヘルパーウイルスである。従って、ＨＳＶは、ヘルパーとして、及びＡＡＶゲノムの複製及び生成細胞へのパッケージングを支援する必須のＡＡＶ機能を送達するためのシャトルとしての両方の役割を果たし得る。
ＨＳＶは、許容細胞でのＡＡＶの複製用のヘルパーウイルスである。従って、ＨＳＶは、ヘルパーとして、及びＡＡＶゲノムの複製及び生成細胞へのパッケージングを支援する必須のＡＡＶ機能を送達するためのシャトルとしての両方の役割を果たし得る。
【0321】
ｒＨＳＶとの重感染に基づくＡＡＶ生成では、大量のｒＡＡＶを効率的に生成することができる。高い総収量（最大１．５×１０５ｖｇ／細胞）に加えて、該方法は、ウイルス力価の改善によって測定される明らかに品質が向上したｒＡＡＶストックを創出する点でさらに有利である。
【0322】
本方法では、細胞、通常はハムスターＢＨＫ２１細胞株またはＨＥＫ２９３及び派生体に、１つはＡＡＶのＩＴＲで囲まれた目的の遺伝子を搭載し（ｒＨＳＶ－ＡＶＶ）、２つ目は所望の血清型のＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＯＲＦを有する（ｒＨＳＶｒｅｐｃａｐ）２つのｒＨＳＶを感染させる。２～３日後、該細胞及び／または培地を回収し、ｒＡＡＶを複数の精製ステップで精製して、細胞不純物、ＨＳＶ由来の混入物、及びパッケージ化されていないＡＡＶのＤＮＡを除去する。
【0323】
従って、いくつかの実施形態では、ＨＳＶは、ＡＡＶ感染のヘルパーウイルスとしての役割を果たす。いくつかの実施形態では、ＡＡＶの増殖は、ＩＣＰ２７が欠失したＨＳＶの非複製突然変異体を使用して達成される。
【0324】
哺乳類細胞で組み換えＡＡＶウイルス粒子を生成するある特定の方法は、当技術分野で知られており、過去１０年間で改善されてきた。例えば、米国出願公開第２００７０２０２５８７号は、２つ以上の複製欠損組み換えＨＳＶベクターによる該細胞の重感染に基づく、哺乳類細胞における組み換えＡＡＶの生成について記載している。米国出願公開第２０１１０２２９９７１号及びＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（８）：８６１－８７０，２００９）は、浮遊培養に適応化させた哺乳類細胞の組み換えＨＳＶ１型の重感染を使用した、拡張可能な組み換えＡＡＶの生成方法について記載している。Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（１）：１－１４，２０１７）は、該ＨＳＶ系を用いた無血清浮遊製造プラットフォームでのＡＡＶの生成方法の改良を記載している。
【0325】
哺乳類の安定細胞株
ｒＡＡＶベクターはまた、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を安定して発現する安定した哺乳類の生成細胞を使用して、効率的かつ拡張可能に生成され得る。かかる細胞は、野生型のＡｄ５ヘルパーウイルス（これは遺伝的に安定しており、高力価で容易に生成され得る）に感染し、高レベルのｒｅｐ及びｃａｐの発現を誘導することができる。感染性ｒＡＡＶベクターは、これらのパッケージング細胞株に野生型Ａｄ５型を感染させ、プラスミドのトランスフェクションによって、または組み換えＡｄ／ＡＡＶハイブリッドウイルスによる感染後にｒＡＡＶゲノムを提供することで生成され得る。
ｒＡＡＶベクターはまた、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を安定して発現する安定した哺乳類の生成細胞を使用して、効率的かつ拡張可能に生成され得る。かかる細胞は、野生型のＡｄ５ヘルパーウイルス（これは遺伝的に安定しており、高力価で容易に生成され得る）に感染し、高レベルのｒｅｐ及びｃａｐの発現を誘導することができる。感染性ｒＡＡＶベクターは、これらのパッケージング細胞株に野生型Ａｄ５型を感染させ、プラスミドのトランスフェクションによって、または組み換えＡｄ／ＡＡＶハイブリッドウイルスによる感染後にｒＡＡＶゲノムを提供することで生成され得る。
【0326】
別の方法として、Ａｄを、ヘルパーウイルスとしてのＨＳＶ－１で置き換えることもできる。
適切な安定した哺乳類の生成細胞としては、ＨｅＬａ由来の生成細胞株、Ａ５４９細胞、またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられ得る。好ましいＨｅＬａ細胞株は、ＨｅＬａＳ３細胞、すなわち、浮遊培養に適応化させたＨｅＬａサブクローンである。
適切な安定した哺乳類の生成細胞としては、ＨｅＬａ由来の生成細胞株、Ａ５４９細胞、またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられ得る。好ましいＨｅＬａ細胞株は、ＨｅＬａＳ３細胞、すなわち、浮遊培養に適応化させたＨｅＬａサブクローンである。
【0327】
本明細書に記載の方法を使用して、動物成分を含まない培地中で、好ましくは２５０－Ｌ規模、または２，０００－Ｌの商業規模で、本主題のＡＡＶベクターを製造することができる。
【実施例】
【0328】
実施例１ Ｃ２Ｃ１２細胞でのマイクロＤ５（ＳＧＴ００１）構築物の発現検証
マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）のマイクロジストロフィン導入遺伝子が、同じＡＡＶベクターに挿入されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２９ｃコード配列等）またはｓｈＲＮＡ（ＳＬＮに対するｓｈＲＮＡ等）のさらなるコード配列がある場合またはない場合で、インビトロで発現することができることを確認するため、Ｃ２Ｃ１２細胞を、インビトロで３種のＡＡＶウイルス構築物：野生型マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）構築物をコードするもの、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）及びｍｉＲ－２９ｃの融合構築物をコードするもの、ただし、このｍｉＲ－２９ｃコード配列は、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）コード配列の５’の異種イントロン領域に挿入されたもの、ならびにマイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）及びＳＬＮに対するｓｈＲＮＡの融合構築物をコードするもの、ただし、このｓｈＲＮＡコード配列は、ＳＧＴ－００１コード配列の５’の異種イントロン領域に挿入されたものに感染させた。図３を参照されたい。
マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）のマイクロジストロフィン導入遺伝子が、同じＡＡＶベクターに挿入されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２９ｃコード配列等）またはｓｈＲＮＡ（ＳＬＮに対するｓｈＲＮＡ等）のさらなるコード配列がある場合またはない場合で、インビトロで発現することができることを確認するため、Ｃ２Ｃ１２細胞を、インビトロで３種のＡＡＶウイルス構築物：野生型マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）構築物をコードするもの、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）及びｍｉＲ－２９ｃの融合構築物をコードするもの、ただし、このｍｉＲ－２９ｃコード配列は、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）コード配列の５’の異種イントロン領域に挿入されたもの、ならびにマイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）及びＳＬＮに対するｓｈＲＮＡの融合構築物をコードするもの、ただし、このｓｈＲＮＡコード配列は、ＳＧＴ－００１コード配列の５’の異種イントロン領域に挿入されたものに感染させた。図３を参照されたい。
【0329】
マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）／ｍｉＲ－２９ｃ融合構築物は、ジストロフィンミニ遺伝子産物及びｍｉＲ－２９ｃのＲＮＡの両方をコードする最初の転写産物を生成することが予測された。マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）／ＳＬＮに対するｓｈＲＮＡ融合構築物は、ジストロフィンミニ遺伝子産物及びｓｈＲＮＡの両方をコードする最初の転写産物を生成することもまた予測された。
【0330】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、出願人はまた、融合転写産物のその後のプロセシングが、融合ｍＲＮＡの早期切断をもたらす可能性があると考えた（ポリＡテールの損失を引き起こす等）。これは、この融合構築物に感染させたＣ２Ｃ１２細胞でのマイクロジストロフィンの発現が、このさらなるコード配列を有さない野生型マイクロジストロフィン構築物に感染させたものと比較して、低下したことに寄与した可能性がある。図３を参照されたい。
【0331】
しかしながら、この実験では、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）構築物が、所望のマイクロジストロフィンタンパク質を正常に発現したこと（マイクロジストロフィン遺伝子産物に特異的な抗体を使用した免疫蛍光染色からも明らかなように）、及びこの発現が、わずかにレベルが低下／阻害／抑制されたが、ｍｉＲ－２９ｃまたはｓｈＲＮＡ融合構築物に感染させたＣ２Ｃ１２細胞で持続することを確認した。
【0332】
同様の実験を、ｍｉＲ－２９ｃコード配列が、プロモーターとマイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）コード配列間の異種イントロンの異なる位置に挿入された他の融合構築物についても行った。これらの様々な融合構築物Ｉｍｉｒ２、Ｉｍｉｒ３、Ｉｍｉｒ４、及びＩｍｉｒ５の挿入位置については、図１１を参照されたい。
【0333】
挿入されたコード配列を含む場合または含まない場合でイントロン配列をＰＣＲにより増幅した後、挿入を確認し、その増幅産物を電気泳動で分析した。例えば、８８－ｂｐのｍｉＲ－２９ｃコード配列の挿入により、ＰＣＴ増幅産物のサイズは１００ｂｐ弱増加した。
【0334】
この融合構築物をその後いくつかの実験で使用して、感染したＣ２Ｃ１２細胞におけるマイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）の発現が影響を受けるかどうかを特定した。
この特定の実験では、ｓｈＲＮＡのコード配列の存在が、トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞におけるマイクロジストロフィンの発現を、トランスフェクションの１日後に最初は妨げたことが明らかである。しかしながら、マイクロジストロフィンの発現はすぐに追いつき、トランスフェクション後６日目までに、トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞におけるマイクロジストロフィンの発現は、ＡＡＶベクターのｓｈＲＮＡに対するさらなるコード配列の有無にかかわらず、実質的に同じであった。図８Ａ～８Ｃを参照されたい。
この特定の実験では、ｓｈＲＮＡのコード配列の存在が、トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞におけるマイクロジストロフィンの発現を、トランスフェクションの１日後に最初は妨げたことが明らかである。しかしながら、マイクロジストロフィンの発現はすぐに追いつき、トランスフェクション後６日目までに、トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞におけるマイクロジストロフィンの発現は、ＡＡＶベクターのｓｈＲＮＡに対するさらなるコード配列の有無にかかわらず、実質的に同じであった。図８Ａ～８Ｃを参照されたい。
【0335】
このデータは、本主題のＡＡＶ構築物が、マイクロジストロフィン遺伝子の発現に大きな影響を与えることなく、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡに対するさらなるコード配列を包含することができることを実証する。
【0336】
実施例２ サルコリピン（ＳＬＮ）に対するｓｈＲＮＡの機能アッセイ
本実施例は、本主題のＡＡＶベクターに挿入されたＳＬＮに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）のコード配列が、ＳＬＮの発現を低下させる機能性ｓｈＲＮＡを生成することができることを実証する。
本実施例は、本主題のＡＡＶベクターに挿入されたＳＬＮに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）のコード配列が、ＳＬＮの発現を低下させる機能性ｓｈＲＮＡを生成することができることを実証する。
【0337】
図４は、ＡＡＶベクターによってコードされるサルコリピン－ルシフェラーゼ融合レポーターを示す概略図である。ルシフェラーゼ保有レポーター、及びｓｈＳＬＮを含むまたは含まないマイクロＤ５をコードするＡＡＶをＣ２Ｃ１２細胞にコトランスフェクトした後、コードされたｓｈＳＬＮがＳＬＮ－ルシフェラーゼ融合の発現を減少させる能力は、ルシフェラーゼが生成するシグナルに基づいて評価することができる。
【0338】
図５は、かかるコトランスフェクション実験の代表的な結果を示す。具体的には、１つの実験では、ＳＬＮ－ルシフェラーゼ融合レポーター構築物を、マイクロＤ５のみをコードするＡＡＶベクター（「ＳＧＴ００１」）とコトランスフェクトすることにより、強いルシフェラーゼシグナルが生じた。一方、別の実験では、ＳＬＮ－ルシフェラーゼ融合レポーター構築物を、マイクロＤ５及びｓｈＳＬＮをコードするＡＡＶベクター（「ＳＧＴ００１＋ＳＬＮ」）とコトランスフェクトすることにより、ルシフェラーゼシグナルが８６．７％減少した。これは、ｓｈＳＬＮが発現したこと、及びｓｈＳＬＮが標的遺伝子（マイクロＤ５－ルシフェラーゼ融合）の発現を減少させるのに有効であったことを示唆している。
【0339】
図６Ａは、サルコリピンの直接免疫染色に基づくｓｈＲＮＡ（ＳＬＮ）の機能試験の結果を示す。マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）ジストロフィンミニ遺伝子及びｓｈＲＮＡのコード配列（ｓｈＳＬＮ）をコードするＡＡＶ９ベクターをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞では、内因性ＳＬＮ発現は、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）ジストロフィンミニ遺伝子のみをコードする同じベクターでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞と比較して５５％減少した。図６Ｂの免疫蛍光画像を参照されたい。
【0340】
このＡＡＶベクターにおけるｓｈＲＮＡ（ＳＬＮ）コード配列の機能を、筋小胞体へのカルシウム再取り込みの測定に基づいてさらに調べた。
筋小胞体（小胞体）Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）は、筋細胞における筋小胞体の内腔に、細胞質ゾルからのＣａ２＋のＡＴＰ依存性の輸送を触媒する膜貫通タンパク質である。ＳＬＮ遺伝子によってコードされるサルコリピンは、ＡＴＰの加水分解速度に影響を与えることなく、筋小胞体におけるＣａ２＋の蓄積を減少させることによっていくつかのＳＥＲＣＡを調節する小さな膜貫通プロテオリピドである。サルコリピンの消耗により、心房のＣａ２＋過渡振幅が増加し、心房収縮力が高まる。さらに、サルコリピンヌルマウスの心房では、イソプロテレノール刺激に対する反応が鈍化しており、サルコリピンが心房におけるベータ－アドレナリン作動性反応のメディエーターであることを示している。
筋小胞体（小胞体）Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）は、筋細胞における筋小胞体の内腔に、細胞質ゾルからのＣａ２＋のＡＴＰ依存性の輸送を触媒する膜貫通タンパク質である。ＳＬＮ遺伝子によってコードされるサルコリピンは、ＡＴＰの加水分解速度に影響を与えることなく、筋小胞体におけるＣａ２＋の蓄積を減少させることによっていくつかのＳＥＲＣＡを調節する小さな膜貫通プロテオリピドである。サルコリピンの消耗により、心房のＣａ２＋過渡振幅が増加し、心房収縮力が高まる。さらに、サルコリピンヌルマウスの心房では、イソプロテレノール刺激に対する反応が鈍化しており、サルコリピンが心房におけるベータ－アドレナリン作動性反応のメディエーターであることを示している。
【0341】
従って、機能性ｓｈＲＮＡ（ＳＬＮ）は、内因性ＳＬＮの発現レベルを低下させ、ＳＥＲＣＡへのＳＬＮの結合を減らし、ひいては、筋小胞体へのカルシウムの再取り込みの障害を減らすことが期待される。表現型的には、機能性ｓｈＲＮＡ（ＳＬＮ）の発現の効果は、ＳＥＲＣＡ２ａ等のＳＥＲＣＡの過剰発現と同様であり、ラットでの過剰発現は、右心室乳頭筋の弛緩時間を短縮することが示されており、筋小胞体へのより速いカルシウムの再取り込みを示唆している。
【0342】
実際、筋小胞体へのより速いカルシウムの再取り込みが図７に示されている。これは、カルシウム結合色素Ｆｌｕｏ－８によって放出された正規化された蛍光シグナルを示している。
【0343】
Ｆｌｕｏ－８（Ａｂｃａｍ）は、細胞透過性媒体親和性の緑色蛍光カルシウム結合色素である。これは、約３９０ｎＭのＫｄで細胞内カルシウムに結合する。Ｃａ２＋の結合によりその蛍光強度が増加する。
【0344】
Ｆｌｕｏ－８シグナルのより速い減少は、非トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞、及びマイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）ジストロフィンミニ遺伝子のみをコードするＡＡＶベクターを感染させたＣ２Ｃ１２細胞と比較して、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）－ｓｈＳＬＮをコードするＡＡＶベクターを感染させたＣ２Ｃ１２細胞において細胞質カルシウムの減少がより速いことを表している。
【0345】
一方、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）ジストロフィンミニ遺伝子の発現は、細胞をＡＡＶ構築物に感染させてから数日後（例えば、６日）でも、ｓｈＳＬＮコード配列の存在またはｓｈＳＬＮ発現によって大きく影響されないが、マイクロＤ５（ＳＧＴ－００１）ジストロフィンミニ遺伝子の発現は、最初は減少した（すなわち、感染の１日後）。図８Ａ～８Ｃを参照されたい。
【0346】
【0347】
これらのデータは、マイクロジストロフィンとｓｈＳＬＮの両方を共発現する本主題のＡＡＶベクターが、同じＡＡＶベクターで両方の導入遺伝子を効率的に発現することができる一方で、ｓｈＳＬＮの発現は長期にわたりマイクロジストロフィンミニ遺伝子の発現に悪影響を与えないという見解を支持する。
【0348】
さらに、発現されたｓｈＳＬＮは、ルシフェラーゼレポーターアッセイ及び内因性ＳＬＮ発現の直接測定の両方に基づいて、機能性であると思われる。
実施例３ 融合構築物からのコード配列のインビトロ発現
本発明の融合ウイルスベクターは、目的の機能性遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）だけでなく、ある特定のＲＮＡｉ、アンチセンス、ｓｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはそれらの阻害物質の１つ以上のコード配列も発現することができる。本発明の組み換えウイルスベクターの代表的な非限定的な構成を図１２に示す。例えば、本発明の組み換えウイルスベクターは、融合ＡＡＶベクター、例えば、ある型の機能性ジストロフィン遺伝子、例えば、前述のμＤｙｓ遺伝子のいずれか１つを発現するようにデザインされたＡＡＶ９ベクターであり得る。同じ融合ベクターはまた、最初の転写産物のイントロン内、３’－ＵＴＲ内、またはポリＡシグナルの後、例えば、組み換えＡＡＶ９ベクターのポリＡシグナルの後であるが転写終結配列の前、または転写終結配列の後に、１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を発現する。
実施例３ 融合構築物からのコード配列のインビトロ発現
本発明の融合ウイルスベクターは、目的の機能性遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）だけでなく、ある特定のＲＮＡｉ、アンチセンス、ｓｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはそれらの阻害物質の１つ以上のコード配列も発現することができる。本発明の組み換えウイルスベクターの代表的な非限定的な構成を図１２に示す。例えば、本発明の組み換えウイルスベクターは、融合ＡＡＶベクター、例えば、ある型の機能性ジストロフィン遺伝子、例えば、前述のμＤｙｓ遺伝子のいずれか１つを発現するようにデザインされたＡＡＶ９ベクターであり得る。同じ融合ベクターはまた、最初の転写産物のイントロン内、３’－ＵＴＲ内、またはポリＡシグナルの後、例えば、組み換えＡＡＶ９ベクターのポリＡシグナルの後であるが転写終結配列の前、または転写終結配列の後に、１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を発現する。
【0349】
さらなるコード配列がｍｉＲ－２９ｃ等のｍｉＲＮＡをコードする場合、成熟型ｍｉＲ－２９ｃ配列の周囲の配列が他のｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１のものから得られるように、ｍｉＲ－２９ｃコード配列の骨格配列を修飾することができる。（上記参照）。天然のｍｉＲ－２９ｃの周辺配列をｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１からのもので置き換えると、ｍｉＲ－２９ｃの標的配列を標的とするようにデザインされたｍｉＲ－２９ｃの１本の鎖（すなわち、ガイド鎖）の生成を高める（すなわち、ｍｉＲ－２９ｃの標的配列を標的とするのに有用ではないその相補的パッセンジャー鎖の生成を低下させる）ことができることが分かっている。
【0350】
対照として、いくつかのいわゆるソロ発現構築物を同じベクターバックグラウンドで生成した。これらのソロ発現構築物は、μＤｙｓ遺伝子を発現しないが、代わりにＥＧＦＰまたはＧＦＰ等のレポーター遺伝子を発現し得る。
【0351】
例えば、１つのかかるソロベクターは、すべてＥＦ１Ａプロモーターから、ＥＧＦＰコード配列の上流のイントロン配列に挿入されたｍｉＲ－２９ｃコード配列を発現する可能性がある。ｍｉＲ－２９ｃコード配列の骨格配列は、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１のものによって修飾される場合もある。
【0352】
別のかかるソロベクターは、ｓｈＲＮＡ、例えば、ＳＬＮを標的とする／その発現を下方制御するｓｈＳＬＮを発現する場合もある。このｓｈＲＮＡの発現は、短いＲＮＡ転写産物の強力な転写を生成するＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩによって使用され得るＵ６プロモーターによって駆動される場合もある。このｓｈＲＮＡコード配列は、ＧＦＰのコード配列の前のＵ６転写カセットのイントロンに挿入され得る。
【0353】
いくつかのかかる代表的な融合またはソロベクターを使用して、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞をインビトロでトランスフェクトし、感染した心筋細胞におけるｍｉＲ－２９ｃの発現を測定し、その結果を図１３に示した。
【0354】
具体的には、５種のソロ構築物、５種の融合構築物、及び対照のμＤｙｓ発現構築物を、標準的な手順に従って、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞にトランスフェクトした。成熟型ｍｉＲ－２９ｃのレベルは、ＴａｑｍａｎステムループＱＰＣＲで測定した。調べた５種のソロ構築物は、Ｕ６またはＥＦ１Ａ駆動型のｍｉＲ－２９ｃ発現カセットをｍｉＲ－３０骨格でデザインしたもの（ＥＦ１Ａ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ及びＵ６－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ）ならびにｍｉＲ－１５５骨格でデザインしたもの（ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１９ｎｔ及びＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５）を含む。調べた５種の融合構築物は、ｍｉＲ－２９ｃ発現カセットを、ｍｉＲ－１０１骨格でデザインし（μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２及びμＤｙｓ－２９ｃ－３ＵＴＲ－１０１）、ｍｉＲ－３０骨格でデザインし（μＤｙｓ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ－ｉ２）、ならびにｍｉＲ－１５５骨格でデザインし（２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－３ＵＴＲ及び２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－ｐａ）、μＤｙｓ発現カセットに対してイントロン（ｉ２）、３’ＵＴＲ（３ＵＴＲ）及びｐＡ後（ｐａ）部位の位置に挿入されたものを含む。
【0355】
本発明の融合構築物は、感染させたヒトｉＰＳ由来の心筋細胞において、類似の構築物を用いたμＤｙｓのみを発現する対照（ひいては、内因性ｍｉＲ－２９ｃ発現のバックグラウンドレベルのみが存在するもの）と比較して、概してｍｉＲ－２９ｃを２～１１倍で過剰発現したことが明らかである。
【0356】
図１３のデータを生成するために使用した特定の融合構築物は、以下を含む：
２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－３ＵＴＲ：修飾ｍｉＲ２９ｃをｍｉＲ－１５５骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットの３’－ＵＴＲ領域（ポリＡアデニル化シグナル配列の前）に挿入されたもの。
２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－３ＵＴＲ：修飾ｍｉＲ２９ｃをｍｉＲ－１５５骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットの３’－ＵＴＲ領域（ポリＡアデニル化シグナル配列の前）に挿入されたもの。
【0357】
２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－ｐＡ：同じ修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１５５骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットのポリＡアデニル化シグナル配列の後に挿入されたもの。
【0358】
μＤｙｓ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ－ｉ２：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－３０Ｅ骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットのイントロン領域に挿入されたもの。
μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１０１骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットのイントロン領域に挿入されたもの。
μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１０１骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットのイントロン領域に挿入されたもの。
【0359】
μＤｙｓ－２９ｃ－３ＵＴＲ－１０１：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１０１骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットの３’－ＵＴＲ領域に挿入されたもの。
一方、ｍｉＲ－２９ｃを発現するソロ構築物は、感染させたヒトｉＰＳ由来の心筋細胞において、μＤｙｓのみを発現する同じ対照ベクターと比較して、概してｍｉＲ－２９ｃを６～７３倍で過剰発現した。
一方、ｍｉＲ－２９ｃを発現するソロ構築物は、感染させたヒトｉＰＳ由来の心筋細胞において、μＤｙｓのみを発現する同じ対照ベクターと比較して、概してｍｉＲ－２９ｃを６～７３倍で過剰発現した。
【0360】
図１３のデータを生成するために使用した特定のソロ構築物は、以下を含む：
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－３０Ｅ骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－３０Ｅ骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
【0361】
Ｕ６－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－３０Ｅ骨格に含み、Ｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動されるもの。
Ｕ６－２９ｃ－ｖ１：ｍｉＲ２９ｃコード配列がＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動されるもの。
Ｕ６－２９ｃ－ｖ１：ｍｉＲ２９ｃコード配列がＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動されるもの。
【0362】
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１９ｎｔ：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１５５骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５：別の修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１５５骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５：別の修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１５５骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
【0363】
これらの構築物からのｍｉＲ－２９ｃの（優先的な）生成を示す同様の傾向は、これらの構築物をＭｏｕｌｙのヒトの健康な初代筋芽細胞及びマウスＣ２Ｃ１２不死化筋芽細胞株を含めた他のインビトロ細胞系で評価した際にも得られた（データは示さず）。μＤｙｓ発現カセットへのｍｉＲ－２９ｃ要素の挿入は、μＤｙｓのｍＲＮＡ産生に大幅な減少をもたらさない。
【0364】
いくつかの選択された融合組み換えウイルスベクターを含むＡＡＶ９ウイルス粒子を同様に使用して、分化したＣ２Ｃ１２の筋管及び初代マウス心筋細胞に感染させ、ｍｉＲ－２９ｃの発現をこれらの細胞でも確認した。μＤｙｓのみを発現する対照に対して正規化した後の相対的ｍｉＲ－２９ｃ発現として表される結果を含む図１４を参照されたい。
【0365】
この実験では、μＤｙｓの産生は、対照群と比較して大きく影響されないと思われた。さらに、ｍｉＲ－２９ｃのパッセンジャー鎖のレベルは、レベルの増加を示さなかった。
一方、本主題の融合構築物からのｓｈＳＬＮの発現、及びかかる融合構築物に感染させたマウス細胞におけるＳＬＮの約５０％の下方制御の結果を、それぞれ図１６及び１５に示した。
一方、本主題の融合構築物からのｓｈＳＬＮの発現、及びかかる融合構築物に感染させたマウス細胞におけるＳＬＮの約５０％の下方制御の結果を、それぞれ図１６及び１５に示した。
【0366】
具体的には、μＤｙｓのみを発現する３種のソロ構築物ならびにμＤｙｓ及びｓｈＳＬＮを発現する２種の融合構築物を、ＳＬＮ－Ｍｙｃ／ＤＤＫ（Ｍｙｃ－ＤＤＫタグ付きＳＬＮ。ＤＤＫは、商標登録されたＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈのＦＬＡＧ（登録商標）タグと同じであり、Ｍｙｃ－ＤＤＫタグは、抗Ｍｙｃまたは抗ＤＤＫ抗体を用いて検出することができる）を安定に過剰発現するマウスＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトした。このマウスＣ２Ｃ１２安定細胞株は、ＳＬＮ－Ｍｙｃ／ＤＤＫをコードするベクターのレンチウイルス形質導入と、それに続く安定細胞株の選択によって生成された。融合構築物の１つ「融合－ｖ２」またはμＤｙｓ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ２は、Ｍｙｃタグ特異的抗体を介して検出されたＳＬＮタンパク質発現レベルで約５０％のノックダウンを示した。図１５を参照されたい。
【0367】
図１５で使用された様々な構築物を以下に示す。
μＤｙｓ：μＤｙｓのＧＯＩのみをコードする対照ＡＡＶ９ベクター。
ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ：マウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのみを発現するソロ構築物。このｓｈＲＮＡコード配列の転写は、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動される。
μＤｙｓ：μＤｙｓのＧＯＩのみをコードする対照ＡＡＶ９ベクター。
ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ：マウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのみを発現するソロ構築物。このｓｈＲＮＡコード配列の転写は、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動される。
【0368】
ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ（Ｖ２）：マウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのみを発現する別のソロ構築物。このｓｈＲＮＡコード配列の転写は、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動される。
【0369】
ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ（Ｖ４）：マウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのみを発現するさらに別のソロ構築物。このｓｈＲＮＡコード配列の転写は、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動される。
【0370】
融合－ｖ１：μＤｙｓのＧＯＩ及びマウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのコード配列の両方を発現する本発明の融合構築物。
融合－ｖ２：μＤｙｓのＧＯＩ及びマウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのコード配列の両方を発現する本発明の別の融合構築物。
融合－ｖ２：μＤｙｓのＧＯＩ及びマウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのコード配列の両方を発現する本発明の別の融合構築物。
【0371】
ｍＳＬＮの発現は、ある型のｍＳＬＮのｓｈＲＮＡをコードする本主題の融合構築物によるマウス細胞の感染により、約５０％減少したことが明らかである。
図１６は、分化したＣ２Ｃ１２筋管またはマウスの初代心筋細胞におけるｓｉＳＬＮ（転写ｓｈＳＬＮ由来のプロセスｓｉＲＮＡ産物）の相対的発現レベルを、ｓｈＳＬＮをコードする様々な組み換えＡＡＶ９ベクターに関して、このウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」）、または本開示の融合構築物の一部として（「融合」）のいずれかで示す。ｓｉＲＮＡ産生は、慣用ＴａｑｍａｎステムループＱＰＣＲシステムで定量化した。ソロ及び融合構築物の相対的なｓｉＳＬＮ発現レベルを、μＤｙｓ対照群のレベルに対して正規化したが、対照群ではｓｉＳＬＮ様ＲＮＡの生成がほぼないか、または非常にわずかであるため、明らかな高い発現比は参考にはならない可能性がある。それでもなお、調べた両細胞型において、ソロ構築物は、対照群と比較して、強力なＵ６ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから約１０００倍高いレベルのｓｉＳＬＮを発現したことは明らかである。一方、調べた融合構築物は、対照と比較して、１～２桁高いレベルのｓｉＳＬＮを発現した。
図１６は、分化したＣ２Ｃ１２筋管またはマウスの初代心筋細胞におけるｓｉＳＬＮ（転写ｓｈＳＬＮ由来のプロセスｓｉＲＮＡ産物）の相対的発現レベルを、ｓｈＳＬＮをコードする様々な組み換えＡＡＶ９ベクターに関して、このウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」）、または本開示の融合構築物の一部として（「融合」）のいずれかで示す。ｓｉＲＮＡ産生は、慣用ＴａｑｍａｎステムループＱＰＣＲシステムで定量化した。ソロ及び融合構築物の相対的なｓｉＳＬＮ発現レベルを、μＤｙｓ対照群のレベルに対して正規化したが、対照群ではｓｉＳＬＮ様ＲＮＡの生成がほぼないか、または非常にわずかであるため、明らかな高い発現比は参考にはならない可能性がある。それでもなお、調べた両細胞型において、ソロ構築物は、対照群と比較して、強力なＵ６ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから約１０００倍高いレベルのｓｉＳＬＮを発現したことは明らかである。一方、調べた融合構築物は、対照と比較して、１～２桁高いレベルのｓｉＳＬＮを発現した。
【0372】
ヒトＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡを発現する多数のさらなるソロ及び融合構築物も同様に、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞で調べた。これらは、ヒトＳＬＮを標的とする６種のソロ構築物及び１２種の融合構築物を含む。これらの融合構築物は、ｓｈＳＬＮ配列をｍｉＲ－２９及びｍｉＲ－１５５骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットに対してイントロン、３’－ＵＴＲ、またはｐＡ後部位に挿入された。これらの実験の結果を図１７に要約した。
【0373】
具体的には、いくつかの陰性対照（例えば、複数のμＤｙｓ及びＧＦＰプラスミド）ならびに陽性対照を図１７の実験で使用した。陰性対照は、以下を含む：μＤｙｓのみを発現する２種の構築物（μＤｙｓ１及びμＤｙｓ２）（ＳＬＮのｍＲＮＡ発現レベルに影響を与えなかった）、筋特異的プロモーターＣＫ８の下でＧＦＰを発現する構築物（ＣＫ８－ＧＦＰ）（このＧＦＰもＳＬＮのｍＲＮＡ発現に影響を与えなかった）、ならびに「シグマスクランブル」、すなわち、ｈＳＬＮを標的とするｓｈＳＬＮのスクランブル配列を発現する構築物（これは、ＳＬＮのｍＲＮＡ発現に影響を与えなかったと予想される）。陽性対照は、「シグマｓｈｒｎａ」であり、これは、約８０％のｈＳＬＮのｍＲＮＡを下方制御するｈＳＬＮ標的化ｓｈＳＬＮをコードするＳｉｇｍａ製の市販のｓｈＲＮＡプラスミドである。
【0374】
各々が、ｈＳＬＮを標的とするある型のｓｈＲＮＡを発現し、かつ各々が強力なＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターの転写制御下にある６種のソロ構築物を調べたところ、概してｈＳＬＮのｍＲＮＡ発現の約８０～９０％を下方制御することが分かった。
【0375】
６種のソロ構築物及び本発明の４種の融合構築物にわたって、最大９０％のｈＳＬＮのｍＲＮＡ発現のダウンダウン（ｄｏｗｎ－ｄｏｗｎ）も観察された。例えば、このｃ２－ｍ３０ｅ－ｉ２構築物は、μＤｙｓ及びｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡを共発現する融合構築物である。このｓｈＲＮＡは、Ｍ３０Ｅ骨格配列（上記参照）に埋め込まれ、μＤｙｓ発現カセットのイントロンに挿入される。ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞にこの構築物を感染させると、ｈＳＬＮのｍＲＮＡの最大９０％がノックダウンされた。
【0376】
これらの融合構築物は、ｈＳＬＮのｍＲＮＡ発現に大きく影響を与えたが、同じベクターでのμＤｙｓの発現には悪影響を与えるとは思われなかった。図１８に示すように、ヒトＳＬＮを標的とする６種のソロ及び１２種の融合構築物を、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞にトランスフェクトした。ほとんどの融合構築物は、対照のμＤｙｓのみの構築物とほぼ同様の（＞５０％）μＤｙｓのｍＲＮＡ発現を示した。
【0377】
選択されたソロ及び２種の融合構築物の変性アガロースゲル分析でも、これらのｍｉＲ－２９ｃ構築物のＡＡＶ９ゲノムがほとんど無傷であることが確認された。図１９を参照されたい。
【0378】
実施例４ 融合構築物からのコード配列のインビボ発現
この実験は、本主題の融合構築物を使用して、μＤｙｓと、別の経路（例えば、ＳＬＮの下方制御、及び／またはｍｉＲ－２９ｃの上方制御）に影響する１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を同時に発現することができ、相乗的な治療効果ではないにしても、ソロ以上を達成することができることを実証する。
この実験は、本主題の融合構築物を使用して、μＤｙｓと、別の経路（例えば、ＳＬＮの下方制御、及び／またはｍｉＲ－２９ｃの上方制御）に影響する１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を同時に発現することができ、相乗的な治療効果ではないにしても、ソロ以上を達成することができることを実証する。
【0379】
この一連の実験では、μＤｙｓ遺伝子をコードするＡＡＶ９、及び第２のコード配列、すなわち、ｍｉＲ－２９ｃまたはマウスＳＬＮを標的とするｓｈＳＬＮの構築物を融合する。様々な融合構築物を、用量約５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇで（１つの群、すなわち、Ｕ６－２９ｃ－ｖ１の１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇを除く）、６週齢の雄ｍｄｘマウスに尾静脈から注射した。次いで、μＤｙｓ、ｍｉＲ－２９ｃ、及びＳＬＮのｍＲＮＡの発現を、注射後２８日間にわたって観察した。詳細な実験設定を以下に要約する：
【0380】
【表1】
【0381】
ｍｉＲ－２９ｃの実験群では、調べた２種の融合構築物、すなわち、Ｍ３０Ｅ骨格に含まれ、μＤｙｓ発現カセットのイントロンに挿入されたもの、及びｍｉＲ－１０１骨格に含まれ、μＤｙｓ発現カセットの３’－ＵＴＲ領域に挿入されたものは、左腓腹筋（図２０Ａ）、横隔膜（図２０Ｂ）、及び左心室（図２０Ｃ）において、１．４～２．８倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御をもたらすことが見出された。ｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合ＡＡＶ９構築物は、５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶ９中のソロＵ６プロモーター駆動型ｍｉＲ－２９ｃ構築物は、５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量では２～１１倍の上方制御をもたらし、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量では６～１６倍をもたらした。
【0382】
一方、融合ＡＡＶ９構築物によるｍｉＲ－２９ｃの上方制御は、腓腹筋（図２１）、横隔膜（データは示さず）及び左心室（データは示さず）において、μＤｙｓ産生の減少をもたらさなかった。融合ＡＡＶ９構築物は、ＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで、対照のμＤｙｓのみのＡＡＶ９構築物のものと同様のμＤｙｓ発現を示した。ｍｉＲ－２９ｃのみを発現するソロ構築物は、μＤｙｓを産生しないため、μＤｙｓレベルの欠如を示した。
【0383】
このｓｈＳＬＮ実験群では、調べたｓｈＳＬＮ融合ＡＡＶ９構築物は、横隔膜、左腓腹筋、及び心房（図２２）、ならびに舌（データは示さず）において最大５０％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御をもたらすことが分かった。同様に、融合ＡＡＶ９構築物によるｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御は、ＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで、腓腹筋（図２３）、横隔膜（データは示さず）、及び左心室（データは示さず）において、μＤｙｓのみを発現する対照ＡＡＶ９のものと比較してμＤｙｓ産生を減少させなかった。ｓｈｍＳＬＮのみを発現するソロ構築物は、μＤｙｓを産生しなかったため、μＤｙｓレベルの欠如を示した。横隔膜の結果を示す。舌及び心房でも同様の結果となる。
【0384】
これらのデータは、本主題の融合構築物が、μＤｙｓ遺伝子及び少なくとも１つのさらなるコード配列、例えば、ｍｉＲ－２９ｃまたはＳＬＮに対するｓｈＲＮＡの両方を同時に発現することができること、ひいては、１つのコード配列、例えば、μＤｙｓのみを発現するウイルスベクターと比較して、良好な治療結果を達成することを示す。
【0385】
実施例５ 融合構築物からインビボで発現されるコード配列は生物学的に活性である
この実験は、本発明の融合構築物から発現されるコード配列が生物学的に活性であることを実証する。
この実験は、本発明の融合構築物から発現されるコード配列が生物学的に活性であることを実証する。
【0386】
ジストロフィンは、筋細胞膜に構造的安定性をもたらし、筋細胞膜鞘の透過性の増加は、筋線維からのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の放出につながる。従って、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルの上昇は、筋損傷の特徴である。ＤＭＤ患者では、ＣＫレベルは正常範囲を超えて大幅に増加する（例えば、出生以来正常レベルの１０～１００倍）。同様に、血清ＣＫレベルは、ｍｄｘマウスモデルでは、筋肉の健康状態の一般的な尺度と見なされる。
【0387】
この実験のデータは、ＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃソロ（１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの高用量で投与）及びｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合（５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与）の両構築物が、ｍｄｘマウスモデルの血清ＣＫレベルをμＤｙｓ対照と比較して同程度まで低下させたことを示すことから、ＤＭＤ患者において、ｍｉＲ－２９ｃを発現することの治療的有用性を示唆している。
【0388】
具体的には、実施例４のインビボ実験で、様々なマウス群の血清ＣＫレベルも測定した。図２４は、μＤｙｓ単独の発現が血清ＣＫレベルの有意な低下を引き起こしたことを示す。両方とも調べた融合構築物でのμＤｙｓ及びｍｉＲ－２９ｃの共発現により、血清ＣＫレベルも同様に有意に低下した。興味深いことに、ｍｉＲ－２９ｃを単独で発現させると、特に、より高ウイルス用量（のｍｉＲ－２９ｃを発現するソロ構築物）を使用した場合に、血清ＣＫレベルが有意に低下した。
【0389】
一方、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子１（ＴＩＭＰ－１）は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者の疾患の進行及び／または治療効果を観察するための血清バイオマーカーとして提示されている。これは、健康な対照と比較して、ＤＭＤ患者ではＴＩＭＰ－１の血清レベルが有意に高いからである。同様に、ＴＩＭＰ１は、ｍｄｘマウスモデルにおける筋肉の健康状態の血清マーカーでもある。
【0390】
従って、実施例４のインビボ実験で、様々なｍｄｘマウス群の血清ＴＩＭＰ１レベルも測定した。図２５の左側のパネルは、μＤｙｓ単独の発現が血清ＴＩＭＰ１レベルの有意な低下を引き起こしたことを示す。両方とも調べた融合構築物でのμＤｙｓ及びｍｉＲ－２９ｃの共発現により、血清ＴＩＭＰ１レベルも同様に有意に低下した。一方、ｍｉＲ－２９ｃを単独で発現させると、より高ウイルス用量（のｍｉＲ－２９ｃを発現するソロ構築物）を使用した場合でも、血清ＴＩＭＰ１レベルは低下しなかった。
【0391】
同様に、図２５の右側のパネルは、μＤｙｓ単独の発現が血清ＴＩＭＰ１レベルの有意な低下を引き起こしたことを示す。調べた融合構築物でのμＤｙｓ及びｍＳＬＮに対するｓｈＲＮＡの共発現により、血清ＴＩＭＰ１レベルも同様に有意に低下した。一方、ｍＳＬＮに対するｓｈＲＮＡを単独で発現させても、血清ＴＩＭＰ１レベルは低下しなかった。
【0392】
これらのデータは、本発明の融合構築物からインビボで発現されるコード配列が生物学的に活性であることを示唆する。
実施例６ 融合構築物はウイルスベクターの生体内分布を変更しない
実施例４のインビボ実験で、融合ウイルスベクターの生体内分布を、μＤｙｓのみを発現するソロウイルスベクターのものと比較した。使用されたすべてのウイルスベクターの生体内分布は、融合構築物がｍｉＲ－２９ｃを発現するかｓｈＳＬＮを発現するかにかかわらず、腓腹筋ではほぼ同じであることが見出された。図２６を参照されたい。
実施例６ 融合構築物はウイルスベクターの生体内分布を変更しない
実施例４のインビボ実験で、融合ウイルスベクターの生体内分布を、μＤｙｓのみを発現するソロウイルスベクターのものと比較した。使用されたすべてのウイルスベクターの生体内分布は、融合構築物がｍｉＲ－２９ｃを発現するかｓｈＳＬＮを発現するかにかかわらず、腓腹筋ではほぼ同じであることが見出された。図２６を参照されたい。
【0393】
腓腹筋でのウイルス力価の定量もまた、融合及び対照ＡＡＶ９で同様のウイルス力価を示した。
実施例７ 融合構築物はウイルスベクターの肝臓の生体内分布を変更しない
実施例４のインビボ実験で、融合ウイルスベクターの肝臓レベルを、μＤｙｓのみを発現するソロウイルスベクターのものと比較した。使用されたすべてのウイルスベクターのウイルス力価は、融合構築物がｍｉＲ－２９ｃを発現するかｓｈＳＬＮを発現するかにかかわらず、肝臓ではほぼ同じであることが見出された。図２７を参照されたい。
実施例７ 融合構築物はウイルスベクターの肝臓の生体内分布を変更しない
実施例４のインビボ実験で、融合ウイルスベクターの肝臓レベルを、μＤｙｓのみを発現するソロウイルスベクターのものと比較した。使用されたすべてのウイルスベクターのウイルス力価は、融合構築物がｍｉＲ－２９ｃを発現するかｓｈＳＬＮを発現するかにかかわらず、肝臓ではほぼ同じであることが見出された。図２７を参照されたい。
【0394】
実施例８ 融合構築物を使用する治療効果のμＤｙｓ単独療法と比較した向上
μＤｙｓとｍｉＲ－２９ｃの同時発現が、良好な治療効果及び／または線維化等の合併症の減少につながるかどうかを判断するため、２つの線維化マーカー遺伝子、Ｃｏｌ３ａ１及びＦｎ１の発現レベルを、実施例４の様々な融合、ソロ、または対照構築物を投与したマウスで調べた。Ｃｏｌ３Ａ１の発現及びＦＮ１の発現は、線維化活性のマーカーとして使用されている。
μＤｙｓとｍｉＲ－２９ｃの同時発現が、良好な治療効果及び／または線維化等の合併症の減少につながるかどうかを判断するため、２つの線維化マーカー遺伝子、Ｃｏｌ３ａ１及びＦｎ１の発現レベルを、実施例４の様々な融合、ソロ、または対照構築物を投与したマウスで調べた。Ｃｏｌ３Ａ１の発現及びＦＮ１の発現は、線維化活性のマーカーとして使用されている。
【0395】
ｍｉＲ－２９ｃのみを発現するソロＡＡＶ９ベクターは、５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの低用量及び１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの高用量で、Ｃｏｌ３Ａ１及びＦＮ１の発現の減少をもたらした。融合ＡＡＶ９ベクターもまた、横隔膜においてマーカー遺伝子発現の減少をもたらした。図２８を参照されたい。
【0396】
これらの結果は、横隔膜における、本発明の融合構築物のμＤｙｓ構築物単独に対する追加的な効果を、それらがこれら２つの線維化マーカー遺伝子に与える影響に基づいて示す。
【0397】
実施例９ 酵素ベースの遺伝子編集の送達：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ
本主題のウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶウイルスベクターを使用して、標的細胞での標的遺伝子の同時ノックダウンのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（または他の改変もしくは修飾Ｃａｓ酵素もしくはその相同物）を、標的細胞に、１つ以上のｓｇＲＮＡ（Ｃａｓ９用）、または１つ以上のｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ１２ａ用）とともに送達することができる。標的細胞の指向性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡをコードする配列が存在するウイルス粒子の指向性によって部分的に制御することができる。
本主題のウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶウイルスベクターを使用して、標的細胞での標的遺伝子の同時ノックダウンのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（または他の改変もしくは修飾Ｃａｓ酵素もしくはその相同物）を、標的細胞に、１つ以上のｓｇＲＮＡ（Ｃａｓ９用）、または１つ以上のｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ１２ａ用）とともに送達することができる。標的細胞の指向性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡをコードする配列が存在するウイルス粒子の指向性によって部分的に制御することができる。
【0398】
例えば、ＡＡＶを介した送達の場合、本主題のウイルスベクターにおけるＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのコード配列であり得る。Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａにそれぞれ搭載することができる１つ以上のｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２ａの発現カセットのイントロン、３’－ＵＴＲ、または他の場所から発現され得る。
【0399】
標的細胞を本主題のウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターに感染させると、Ｃａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡが標的細胞内で共発現され、遺伝子編集を媒介する。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】
【国際調査報告】