特表 2022-513480 変異型ステビオール配糖体の生合成製造

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-08

(54)【発明の名称】変異型ステビオール配糖体の生合成製造

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/56 20060101AFI20220201BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20220201BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20220201BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20220201BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20220201BHJP

   A23L 27/20 20160101ALI20220201BHJP

   A23L 2/60 20060101ALI20220201BHJP

   A23L 2/02 20060101ALI20220201BHJP

   A23F 3/16 20060101ALI20220201BHJP

   A23F 5/24 20060101ALI20220201BHJP

   A23L 2/00 20060101ALI20220201BHJP

   A23C 9/152 20060101ALI20220201BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20220201BHJP

   A23L 29/20 20160101ALI20220201BHJP

   C07H 15/256 20060101ALI20220201BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20220201BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20220201BHJP

   A61Q 11/00 20060101ALI20220201BHJP

【ＦＩ】

C12P19/56 ZNA

C12N15/52 Z

C12N15/29

C12N9/10

C12N9/00

A23L27/20 G

A23L2/60

A23L2/02 A

A23F3/16

A23F5/24

A23L2/00 T

A23L2/00 V

A23C9/152

A23L33/10

A23L29/20

C07H15/256

A61K47/36

A61K8/73

A61Q11/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021533660

(86)(22)【出願日】2019-12-12

(85)【翻訳文提出日】2021-08-02

(86)【国際出願番号】 US2019066090

(87)【国際公開番号】W WO2020123877

(87)【国際公開日】2020-06-18

(31)【優先権主張番号】62/778,422

(32)【優先日】2018-12-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516131979

【氏名又は名称】コナゲン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】マオ，グオホン

(72)【発明者】

【氏名】バッテン，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ルオ，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ユ，オリヴァー

【テーマコード（参考）】

4B001

4B018

4B027

4B041

4B047

4B050

4B064

4B117

4C057

4C076

4C083

【Ｆターム（参考）】

4B001AC43

4B001EC01

4B001EC05

4B018LB10

4B018MD42

4B018ME01

4B018ME14

4B027FB13

4B027FB24

4B027FC02

4B027FC06

4B027FK04

4B027FP85

4B027FQ19

4B041LC01

4B041LC10

4B041LD01

4B041LK09

4B047LB02

4B047LF07

4B047LF10

4B047LG06

4B047LG14

4B047LG15

4B047LG17

4B047LG18

4B047LG22

4B047LG23

4B047LG24

4B047LG25

4B047LG31

4B047LG32

4B047LG35

4B047LG56

4B047LG57

4B050CC03

4B050CC05

4B050DD13

4B050KK03

4B050KK07

4B050LL05

4B064AF12

4B064CA19

4B064CB30

4B064CC24

4B064CD09

4B064DA01

4B064DA10

4B064DA20

4B117LC03

4B117LC05

4B117LE01

4B117LG05

4B117LK04

4B117LK11

4B117LL02

4C057AA03

4C057BB04

4C057DD01

4C057JJ53

4C076BB01

4C076BB22

4C076CC40

4C076CC50

4C076DD66T

4C076FF70

4C083AD211

4C083BB55

4C083EE03

4C083FF01

(57)【要約】

本発明は、新規ステビオール配糖体、Ｒ６－１、Ｒ６－２Ａ、Ｒ６－２Ｂ、Ｒ６－４Ａ、Ｒ６－４ＢおよびＲ７－２ならびにこれらの新規ステビオール配糖体の、酵素変換を介するなどの製造に関する。これらの新規ステビオール配糖体の甘味料としての、および経口消費製品中での使用も提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂの製造方法であって、
（Ｉ）反応混合物を調製することであって、
（ｉ）レバウジオシドＤ３、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
（ＩＩ）前記反応混合物をレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
前記レバウジオシドＤ３は：

【化1】

の構造を有し、前記レバウジオシドＲ６－２Ａは：

【化2】

の構造を有し、前記レバウジオシドＲ６－２Ｂは：

【化3】

の構造を有する、方法。

【請求項2】

レバウジオシドＲ７－２の製造方法であって、
（Ｉ）反応混合物を調製することであって、
（ｉ）レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＲ６－２Ａ、およびＲ６－２Ｂのうちの１種または複数、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
（ＩＩ）前記反応混合物をレバウジオシドＲ７－２の製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
前記レバウジオシドＤ３は：

【化4】

の構造を有し、前記レバウジオシドＲ６－２Ａは：

【化5】

の構造を有し、前記レバウジオシドＲ６－２Ｂは：

【化6】

の構造を有し、前記レバウジオシドＲ７－２は：

【化7】

の構造を有する、方法。

【請求項3】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドＤ３に共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂが生成される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖Ｉに共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ａが生成される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖ＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ｂが生成される、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

２つのグルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドＤ３に共有結合され、レバウジオシドＲ７－２が生成される、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記２つのグルコースが、酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖Ｉおよびショ糖ＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ７－２が生成される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

レバウジオシドＥをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＤ３を製造することをさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

レバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－４Ｂを製造する方法であって、
（Ｉ）反応混合物を調製することであって、
（ｉ）レバウジオシドＺ１およびレバウジオシドＺ２のうちの少なくとも１種、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
（ＩＩ）前記反応混合物をレバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－４Ｂの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
前記レバウジオシドＺ１は：

【化8】

の構造を有し、前記レバウジオシドＺ２は：

【化9】

の構造を有し、前記レバウジオシドＲ６－４Ａは：

【化10】

の構造を有し、前記レバウジオシドＲ６－４Ｂは：

【化11】

の構造を有する、方法。

【請求項18】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドＺ１またはレバウジオシドＺ２に共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドＺ１のショ糖ＩＶに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドＺ２のショ糖ＩＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドＺ２に共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ｂが生成される、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドＺ２のショ糖Ｖに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ｂが生成される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

レバウジオシドＥをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＺ１またはレバウジオシドＺ２を製造することをさらに含む、請求項１７～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

レバウジオシドＲ６－１の製造方法であって、
（Ｉ）反応混合物を調製することであって、
（ｉ）レバウジオシドＤ、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
（ＩＩ）前記反応混合物をレバウジオシドＲ６－１を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、前記レバウジオシドＤは：

【化12】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－１は：

【化13】

の構造を有する、方法。

【請求項33】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドＤに共有結合され、レバウジオシドＲ６－１が生成される、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドのショ糖Ｖに共有結合され、レバウジオシドＲ６－１が生成される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

レバウジオシドＥをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＤを製造することをさらに含む、請求項３３～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

レバウジオシドＡをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＤを製造することをさらに含む、請求項３３～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記反応混合物がインビトロ条件下にある、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記反応混合物が細胞ベースの反応混合物である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記細胞が、酵母、非ステビオール配糖体生成植物、藻類、真菌類、および細菌からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

下記から選択される合成レバウジオシド：
（ｉ）構造：

【化14】

を有するレバウジオシドＲ６－２Ａ、（ｉｉ）構造：

【化15】

を有するレバウジオシドＲ６－２Ｂ、（ｉｉｉ）構造：

【化16】

を有するレバウジオシドＲ７－２、（ｉｖ）構造：

【化17】

を有するレバウジオシドＲ６－４Ａ、（ｖ）構造：

【化18】

を有するレバウジオシドＲ６－４Ｂ、（ｖｉ）構造：

【化19】

を有するレバウジオシドＲ６－１。

【請求項49】

請求項４８に記載の合成レバウジオシドを含む、組成物。

【請求項50】

甘味料として使用するための請求項４８に記載の合成レバウジオシド。

【請求項51】

飲料製品および消費製品からなる群より選択される、甘味を付与する量の、レバウジオシドＲ６－２Ａ、Ｒ６－２Ｂ、Ｒ７－２、Ｒ６－４Ａ、Ｒ６－４Ｂ、および／またはＲ６－１からなる群より選択される甘味料を含む経口消費製品。

【請求項52】

前記甘味料が唯一の甘味料である、請求項５１に記載の経口消費製品。

【請求項53】

約５ｐｐｍ～１００ｐｐｍのレバウジオシドを含む、請求項５１または請求項５２に記載の経口消費製品。

【請求項54】

前記経口消費製品は、約１％（ｗ／ｖ－％）～約４％（ｗ／ｖ－％）のスクロース溶液に同等の甘味強度を有する、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の経口消費製品。

【請求項55】

少なくとも１種の追加の甘味料をさらに含む、請求項５１～５４のいずれか１項に記載の経口消費製品。

【請求項56】

前記少なくとも１種の追加の甘味料が、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、組換え微生物の生合成由来のレバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシド、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ－アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項５５に記載の経口消費製品。

【請求項57】

炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香味料、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１種の添加物をさらに含む、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の経口消費製品。

【請求項58】

前記消費製品が、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科用衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品および卓上調味料からなる群より選択される、請求項５１～５７のいずれか１項に記載の経口消費製品。

【請求項59】

前記飲料製品が、炭酸飲料製品および非炭酸飲料製品からなる群より選択される、請求項５１～５７のいずれか１項に記載の経口消費製品。

【請求項60】

前記飲料製品が、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、フローズン飲料、レディ・トゥ・ドリンク飲料、フローズンおよびレディ・トゥ・ドリンク飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、フレーバー・ウォーター、強化水、果実ジュース、果実ジュース香味飲料、スポーツドリンク、またはエナジードリンクからなる群より選択される、請求項５９に記載の飲料製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１８年１２月１２日に出願された、「ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＶＡＲＩＡＮＴ ＳＴＥＶＩＯＬ ＧＬＹＣＯＳＩＤＥＳ」と題する米国特許仮出願第６２／７７８，４２２号に対する利益を主張する。この仮出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明の分野は、いくつかの特定のステビオール配糖体の酵素変換による製造に有用な方法および工程ならびに関連組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

ステビオール配糖体は、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の葉中で認められ、これらのいくつかは、食品、飼料および飲料での高強度で低カロリーの甘味料として広く使用されてきた。これらの天然のステビオール配糖体は、同じ基本ジテルペン構造（ステビオール骨格）を有するが、ステビオール骨格のＣ－１３位およびＣ－１９位の炭水化物残基修飾（例えば、グルコース、ラムノース、およびキシロース残基）の数および構造が異なる。興味深いことに、基本ステビオール構造のこれらのショ糖「装飾」の変化は、個別のステビオール配糖体それ自体の性質に影響を与え得る。これらの性質には、限定されないが、特に、味覚プロファイル、結晶化点、溶解度、口当たりおよび知覚甘味度を挙げることができる。既知の構造を有するステビオール配糖体には、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＮおよびレバウジオシドＯが挙げられる。商業的使用の観点では、レバウディオサイドＤおよびＭが通常、安全であると見なされており（すなわち、これらは「ＧＲＡＳ」資格を有する）、食品および飲料市場での広範囲の使用を目的として研究されている。

【0004】

乾燥重量ベースで、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、およびズルコシドＡはそれぞれ、野生型ステビアの葉で認められるステビオール配糖体の全重量の９．１、３．８、０．６、および０．３０パーセントを占めるが、Ｒｅｂ ＤおよびＲｅｂ Ｍなどの他のステビオール配糖体は、それよりも大幅に少ない量で存在する。ステビア・レバウディアナ植物からの抽出物は市販されており、このような抽出物では、ステビオシドおよびレバウジオシドＡがほとんどの場合に主要な成分であり、さらなる酵素活性のための出発物質または基質とし使用できる。比較すると、他の既知のステビオール配糖体は通常、少量または微量成分としてステビア抽出物中に存在する。例えば、典型的な市販調製物中のレバウジオシドＡの量は、総ステビオール配糖体含量の約２０％から９０％超、レバウジオシドＢの量は１～２％、レバウジオシドＣの量は約７～１５％で変動し得、およびレバウジオシドＤの量は総ステビオール配糖体の約２％であり得る。

【0005】

それぞれの異なるステビオール配糖体は、それらに関連する、異なる甘味度、「口当たり」、および特定の残味覚を有する。ショ糖（すなわち、「スクロース」）と比べて、ステビオール配糖体の甘味度は通常著しく高い。例えば、ステビオシドはスクロースよりも１００～１５０倍甘いが、多くの味覚試験で認められるように苦い残味覚を有し、一方、レバウジオシドＡおよびＥはスクロースよりも２５０～４５０倍甘く、残味覚プロファイルはステビオシドよりもはるかに良好である。しかし、これらのステビオール配糖体それ自体は、まだ顕著な残味覚を有し、食品および飲料業界において、この残味覚またはスクロースとの差異をマスクまたは除去できる用途に適している。加えて、植物由来ステビア抽出物の全体味覚プロファイルは、抽出物中の種々のステビオール配糖体の存在により影響を受け、これがさらには、基礎となる植物が経験する環境条件および使われる抽出工程により影響され得る。植物生産、気象条件および抽出条件におけるこれらの変動は、ステビア抽出物中のステビオール配糖体の一貫性のない組成をもたらし得るので、味覚プロファイルは、抽出生成物のバッチ毎に大きく異なる。このような場合、これらのバッチは、食品および飲料産業における特定の用途または配合物取って有用ではない可能性がある。またステビア抽出物の味覚プロファイルは、抽出工程後に生成物中に残存する植物由来または環境由来の汚染物質（例えば、色素、脂質、タンパク質、フェノール類および糖類など）によっても影響を受け得る。これらの汚染物質は通常、それら自体の異臭を有し、得られたステビア抽出物を消費者製品として使用するのに望ましくないものにし得る。加えて、ステビア抽出物中の量が少ないステビオールレバウジオシドの個々のまたは特定の組合せを単離するコストは、費用がかかり、リソース的に極めて高額になる場合がある。

【0006】

通常、全てのステビオール配糖体は、ステビオールの一連のグリコシル化反応によって形成され、これは通常、ウリジン５’－ジホスホグルコース（ＵＤＰ－グルコース）をショ糖部分の供与体として用いて、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素により触媒される。植物では、ＵＧＴは、グルコース残基をＵＤＰ－グルコースからステビオールへ転移させ得る非常に多様な酵素群である。これらの反応では、ステビオシドは、種々のレバウジオシド化合物の生合成における中間体であることが多い。例えば、ステビオシドのＣ－１３－Ｏ－グルコースのＣ－３’のステビオシドのグリコシル化はレバウジオシドＡを生じ、ステビオシドの１９－Ｏ－グルコース位置のＣ－２’のグリコシル化はレバウジオシドＥを生ずる。

【0007】

Ｒｅｂ Ｄ３（１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－６－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－ドグルコピラノシル）オキシ］ ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステル）は、Ｒｅｂ ＥからＥＵＧＴ１１またはＥＵＳ酵素により変換できることが以前に記載された。Ｒｅｂ Ｚ（Ｚ１およびＺ２）は、Ｒｅｂ ＥからＨＶ１酵素により変換できる。Ｒｅｂ Ｚと命名された２種の化合物の混合物は、１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－オイック酸－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシルエステル（Ｒｅｂ Ｚ１）、または１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－オイック酸－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステル（Ｒｅｂ Ｚ２）として特性が明らかにされた。

【0008】

ステビオール配糖体生合成経路は、酵素ＫＡＨの作用によるｅｎｔ－カウレン酸のステビオールへの変換を含む。ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールビオシドに対するグルコシル化活性を示して、レバウジオシドＢを形成し、ステビオシドに対してはレバウジオシドＡの生成をもたらすことが示された。加えて、ｅｎｔ－カウレン酸およびステビオールに対し、ＫＡＨ、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ７６Ｇ１の相互作用親和性が評価された。ＫＡＨのモデルは、リガンドステビオールに対し最も高い親和性を示し、次に、ステビオールモノシドおよびｅｎｔ－カウレン酸の順であった。ＵＧＴ７６Ｇ１の三次元モデルに対する結合結果は、ｅｎｔ－カウレン酸に対するその最高の結合親和性を示唆したが、これらの酵素は、ステビオール配糖体生合成経路中で複数のリガンドと相互作用する能力を有することも示唆した。

【0009】

ステビア抽出物の味覚品質を改善するための実際的な手法は、より望ましい味覚特性を有するレバウジオシド化合物の収率を高めること、およびより生産的な経路によりこれを実現することである。試験されるこれらのステビオール配糖体のうち、種々の食品および飲料での使用のためにＲｅｂ Ｍが最も望ましい味覚および特性を有すると考えられている。しかしながら、上記のように、植物には、この化合物がその葉の中に無視できるほどの少量で存在するに過ぎない。

【0010】

さらに、植物からの抽出工程は通常、ステビオール配糖体の回収のためにヘキサン、クロロホルム、およびエタノールのような溶媒を用いる固液抽出技術を使用する（Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。しかし、溶媒抽出はそれ自体がエネルギー集約的であり、毒性廃棄物処理の問題につながり、植物自体を成長させるために広大な面積を必要とし、さらなる精製／改質または生物変換を必要とする生成物をもたらす。発酵および／または酵素的生物変換技術の使用は、所望のステビオール配糖体の選択性、存在量および純度を高めることができる微生物種中でのステビオール配糖体の生産を可能にする。

【0011】

上記に加えて、消費者は、食品、飼料、香味または薬用成分の天然の生物源を良いと認め、積極的に求める一方で、原材料の供給元の選定、一貫性のある味覚プロファイル、および環境的に持続可能な製造についても関心がある。微生物発酵および製造方法は、無機合成または現在の植物抽出技術よりも自然な方式でそれを行ないながら、様々な産業および研究に有用な量のレバウジオシドを提供できる。

【0012】

したがって、ヒトおよび動物の消費をさらに可能にするために経済的で便利に実施できる新規ステビオール配糖体変異体ならびに関連製造方法の開発が必要とされている。

【発明の概要】

【0013】

本開示は、少なくとも一部は、種々のレバウジオシドからのいくつかのステビオール配糖体の特定、合成および製造に関する。いくつかの態様では、本開示は、Ｒｅｂ Ｒ７－２またはＲｅｂ Ｒ６－２の製造でのＲｅｂ Ｄ３の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、Ｒｅｂ Ｒ６－１の製造でのＲｅｂ Ｄの使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、Ｒｅｂ Ｒ６－４Ａの製造のための出発材料としてのＲｅｂ Ｚ１またはＲｅｂ Ｚ２の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、Ｒｅｂ Ｒ６－４Ｂの製造のための出発材料としてのＲｅｂ Ｚ２の使用を提供する。生成物ステビオール配糖体をＮＭＲ分析により特定し、製造後、種々の味覚試験および処理試験に供し、それらの特定の香味および性能特性を特定した。

【0014】

本開示のいくつかの態様は、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂの製造方法を提供し、該方法は、
（Ｉ）反応混合物を以下のように調整し、
（ｉ）レバウジオシドＤ３、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらに組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合されたＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、
（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
レバウジオシドＤ３は：

【化1】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－２Ａは：

【化2】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－２Ｂは：

【化3】

の構造を有する。

【0015】

本開示の他の態様は、レバウジオシドＲ７－２の製造方法を提供し、該方法は、
（Ｉ）反応混合物を以下のように調整し
（ｉ）レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＲ６－２Ａ、およびＲ６－２Ｂのうちの１種または複数、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ７－２を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、レバウジオシドＤ３は：

【化4】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－２Ａは：

【化5】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－２Ｂは：

【化6】

の構造を有し、レバウジオシドＲ７－２は：

【化7】

の構造を有する。

【0016】

いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、グルコースは、酵素によりレバウジオシドＤ３に共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂが生成される。いくつかの実施形態では、グルコースは、酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖Ｉに共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ａが生成される。いくつかの実施形態では、グルコースは、酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖ＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ｂが生成される。いくつかの実施形態では、２つグルコースが、酵素によりレバウジオシドＤ３に共有結合され、レバウジオシドＲ７－２が生成される。いくつかの実施形態では、２つのグルコースが、酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖Ｉおよびショ糖ＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ７－２が生成される。

【0018】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、方法は、レバウジオシドＥをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＤ３を製造することをさらに含む。

【0020】

さらに本明細書で提供されるのは、レバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－４Ｂを製造する方法であり、該方法は、
（Ｉ）反応混合物を以下のように調整し、
（ｉ）レバウジオシドＺ１およびレバウジオシドＺ２のうちの少なくとも１種、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－４Ｂの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
レバウジオシドＺ１は：

【化8】

の構造を有し、レバウジオシドＺ２は：

【化9】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－４Ａは：

【化10】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－４Ｂは：

【化11】

の構造を有する。

【0021】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテスクロースシンターゼからなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。

【0022】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ１またはレバウジオシドＺ２に共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ１のショ糖ＩＶに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ２のショ糖ＩＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ２に共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ｂが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ２のショ糖Ｖに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ｂが生成される。

【0023】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

【0024】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、方法は、レバウジオシドＥをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＺ１またはレバウジオシドＺ２を製造することをさらに含む。

【0025】

本開示の他の態様は、レバウジオシドＲ６－１の製造方法を提供し、該方法は、
（Ｉ）反応混合物以下のように調整し、
（ｉ）レバウジオシドＤ、
（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質、および
（ｉｉｉ）以下の群から選択される酵素
（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、
（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合されたＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、
（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ６－１を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、レバウジオシドＤは：

【化12】

の構造を有し、レバウジオシドＲ６－１は：

【化13】

の構造を有する。

【0026】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテスクロースシンターゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤに共有結合され、レバウジオシドＲ６－１が生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤのショ糖Ｖに共有結合され、レバウジオシドＲ６－１が生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

【0027】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、方法は、レバウジオシドＥをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＤを製造することをさらに含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、方法は、レバウジオシドＡをＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドＤを製造することをさらに含む。

【0028】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、反応混合物はインビトロの状態である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、反応混合物は細胞ベース反応混合物である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、細胞は、酵母、非ステビオール配糖体生成植物、藻類、真菌類、および細菌からなる群より選択される。

【0029】

本開示の別の態様は、下記から選択されるレバウジオシド（例えば、合成レバウジオシド）を提供する：
（ｉ）構造：

【化14】

を有するレバウジオシドＲ６－２Ａ、（ｉｉ）構造：

【化15】

を有するレバウジオシドＲ６－２Ｂ、（ｉｉｉ）構造：

【化16】

を有するレバウジオシドＲ７－２、（ｉｖ）構造：

【化17】

を有するレバウジオシドＲ６－４Ａ、（ｖ）構造：

【化18】

を有するレバウジオシドＲ６－４Ｂ、（ｖｉ）構造：

【化19】

を有するＲ６－１。

【0030】

本明細書で提供されるレバウジオシドのいずれか１種（例えば、合成レバウジオシド）を含む組成物も提供される。

【0031】

本明細書でさらに提供されるのは、本明細書で記載のレバウジオシドにいずれか１種（例えば、合成レバウジオシド）の甘味料としての使用である。

【0032】

本開示の他の態様は、甘味を付与する量の、レバウジオシドＲ６－２Ａ、Ｒ６－２Ｂ、Ｒ７－２、Ｒ６－４Ａ、Ｒ６－４Ｂ、および／またはＲ６－１からなる群より選択されるものなどの本明細書で提供される甘味料のいずれか１種を含む経口消費製品を提供し、例えば、経口消費製品は、飲料製品および消費製品からなる群より選択される。

【0033】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、甘味付与剤は甘味料のみである。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、経口消費製品は、約５ｐｐｍ～１００ｐｐｍのレバウジオシドを含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、経口消費製品は、約１％（ｗ／ｖ－％）～約４％（ｗ／ｖ－％）のスクロース溶液に同等の甘味強度を有する。

【0034】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、経口消費製品は少なくとも１種の追加の甘味料をさらに含む。
本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、少なくとも１種の追加の甘味料は、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、組換え微生物の生合成由来のレバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシド、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ－アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびこれらの組合せからなる群より選択される。

【0035】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、経口消費製品は、炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香味料、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加 水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものなどの少なくとも１種の添加物をさらに含む。

【0036】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、消費製品は、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科用衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品および卓上調味料からなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、飲料製品は、炭酸飲料製品および非炭酸飲料製品からなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、飲料製品は、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、フローズン飲料、レディ・トゥ・ドリンク飲料、フローズンおよびレディ・トゥ・ドリンク飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、フレーバー・ウォーター、強化水、果実ジュース、果実ジュース香味飲料、スポーツドリンク、またはエナジードリンクからなる群より選択される。

【0037】

本明細書で提供されるいずれか１種のレバウジオシドまたは組成物は、鎮痛剤、害虫忌避剤、食品または健康補助食品に使用できる。いずれか１種のこのような組成物も本明細書で提供される。本明細書で提供されるいずれか１種の組成物は、エアロゾル、液体、ゲルまたは顆粒形態で使用できる。

【0038】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物では、細胞系は、細菌、酵母、およびこれらの組合せ、または選択された遺伝子による遺伝子形質転換、およびその後の、所望のステビオール配糖体の生合成製造を可能にし得る任意の細胞系からなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物では、細胞系は大腸菌などの微生物系である。

【0039】

一態様では、本明細書で提供されるいずれか１つの方法により製造されるレバウジオシドまたはその組成物が提供される。

【0040】

本開示は種々の修正および代替形態を許容できるが、その特定の実施形態が例として図面により示され、また、本明細書で詳細に記載されるであろう。しかしながら、本明細書で提示される図面および発明を実施するための形態は、本開示を開示される特定の実施形態に限定することが意図されておらず、むしろ逆に、本発明が、特許請求の範囲により定められる本開示の趣旨および範囲内に包含される全ての修正物、等価物、および代替物を網羅できることは理解されるべきである。

【0041】

本発明の他の特徴および利点は、添付図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な記載において明らかになるであろう。

【0042】

添付図は一定の縮尺で描くことが意図されていない。図中では、種々の図で示されているそれぞれの同一のまたはほぼ同一の要素は、類似の数字で表される。分かりやすくするために、各図で全ての要素を標識することはしていない。図面は次の通りである。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】Ｒ６－１、Ｒ７－２、Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂの生合成経路。

【図2】Ｒ６－２およびＲ７－２の生合成経路。

【図3】Ｒｅｂ Ｄ３からＲ６－２およびＲ７－２を製造するためのＵＧＴ７６Ｇ１触媒反応。パネルＡは、レバウジオシドＤ３（「Ｄ３」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。パネルＢ～Ｄは、２時間（パネルＢ）、４時間（パネルＣ）および１９時間（パネルＤ）でＵＧＴ７６Ｇ１により酵素的に製造されたＲ６－２およびＲ７－２を示す。

【図4】製造されたＲ６－２化合物のＬＣ ＭＳ分析。

【図5】製造されたＲ７－２化合物のＬＣ ＭＳ分析。

【図6】Ｒ７－２の構造。

【図7A】Ｒ６－２Ａ（図７Ａ）の構造。

【図7B】Ｒ６－２Ｂ（図７Ｂ）の構造。

【図8】Ｒ７－２の重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣの相関。

【図9】Ｒ６－１化合物の生合成経路。

【図10】Ｒｅｂ ＤからＲ６－１を製造するためのＨＶ１触媒反応。パネルＡは、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ Ｄ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。パネルＢおよびＣは、６時間（パネルＢ）および２４時間（パネルＣ）でＨＶ１により触媒的に製造されたＲ６－１を示す。

【図11】製造されたＲ６－１化合物のＬＣ ＭＳ分析。

【図12】Ｒ６－１の構造。

【図13】Ｒ６－１の重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣ相関。

【図14】Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂ化合物の生合成経路。

【図15】Ｒｅｂ ＺからＲ６－４を製造するためのＨＶ１触媒反応。パネルＡは、レバウジオシドＺ（「Ｚ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。Ｒ６－４は、３時間（パネルＢ）および２４時間（パネルＣ）でＨＶ１により酵素的に製造された。

【図16】製造されたＲ６－４化合物のＬＣ ＭＳ分析。

【図17】Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂの構造。

【0044】

定義
特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書で記載のものと類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい材料および方法が以下に記載される。

【0045】

「相補的」という用語は、当業者により理解されるその通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本技術は、添付の配列表に報告されている完全な配列に相補的である単離核酸フラグメント、ならびにそれらの実質的に類似の核酸配列も含む。

【0046】

「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、当業者により理解されるそれぞれの通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖形態のいずれかのこれらのポリマーを指すために使用される。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然のヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に指示がない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたまたは縮重変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明確に示された配列を暗黙に包含する。

【0047】

「単離」という用語は、当業者より理解されるその通常および慣例の意味に従って使用され、単離核酸または単離ポリペプチドとの関連で使用される場合、限定されないが、人の手によりその天然環境から離れて存在し、従って天然の産物ではない核酸またはポリペプチドを指すために使用される。単離された核酸またはポリペプチドは精製形態で存在することもでき、あるいは、例えば遺伝子導入宿主細胞内などの非天然環境において存在することができる。

【0048】

「インキュベートする（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）」および「インキュベーション」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上の化学的または生物学的物質（例えば、 化合物および酵素など）を混合し、これらを、ステビオール配糖体組成物を生じさせるのに好ましい条件下で相互作用させる工程を意味する。

【0049】

「縮重変異体」という用語は、１個または複数の縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１個または複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を作成することにより達成できる。核酸配列およびその縮重変異体の全ては、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現するであろう。

【0050】

「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、当業者により理解されるそれぞれの通常および慣例の意味に従って使用され、３つの用語は同義に使用されることもあり、限定されないが、そのサイズまたは機能に関係なく、アミノ酸、またはアミノ酸類似体のポリマーを指すために使用される。「タンパク質」は比較的大きいポリペプチドに関して使用されることが多く、「ペプチド」は小さいポリペプチドに関して使用されることが多いが、当該技術分野でのこれらの用語の使用は重複しており、変動する。「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、他に断らない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、ポリヌクレオチド産物を指す場合に、本明細書では同義に使用される。したがって、例示的なポリペプチドは、ポリヌクレオチド産物、天然に存在するタンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび他の等価物、変異体、ならびに上記のものの類似体を含む。

【0051】

「ポリペプチドフラグメント」および「フラグメント」という用語は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、当業者によるその通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、参照ポリペプチド自体と比べてアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列は通常参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一であるポリペプチドを指すために使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいは両方で起こり得る。

【0052】

ポリペプチドまたはタンパク質の「機能性フラグメント」という用語は、全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部分であり、完全長ポリペプチドまたはタンパク質と実質的に同じ生物活性を有するか、あるいは実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）ペプチドフラグメントを指す。

【0053】

同義に使用される「変異体ポリペプチド」、「改変アミノ酸配列」、または「改変ポリペプチド」という用語は、同義的に使用され、１個または複数のアミノ酸により、例えば、１個または複数のアミノ酸置換、欠失、および／または付加により参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。一態様では、変異体は、参照ポリペプチドの能力の一部または全てを保持する「機能的変異体」である。

【0054】

「機能的変異体」という用語はさらに、保存的に置換された変異体を含む。「保存的に置換された変異体」という用語は、１個または複数の保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドとは異なり、参照ペプチドの活性のいくらかまたは全てを保持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例には、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１個の非極性（疎水性）残基による別の残基の置換、アルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、トレオニンとセリンの間などの１個の荷電または極性（親水性）残基による別の残基の置換、リシン、またはアルギニンまたはヒスチジンなどの１個の塩基性残基による別の残基の置換、および／またはアスパラギン酸またはグルタミン酸またはグルタミン酸などの１個の酸性残基による別の残基の置換、またはフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンなどの１個の芳香族残基による別の残基の置換が挙げられる。このような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量または等電点に対してほとんどまたは全く影響を与えないことが予測される。「保存的に置換された変異体」という語句は、化学的に誘導された残基によって残基が置換されたペプチドも含むが、ただし、得られるペプチドが本明細書に記載される参照ペプチドの活性の一部または全てを保持することを条件とする。

【0055】

本技術のポリペプチドに関連する「変異体」という用語は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらに１００％同一であるアミノ酸配列を有する、機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。

【0056】

「相同」という用語は、その文法的形態およびスペリングバリエーションの全てにおいて、「共通の進化的起源」を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の関係を指し、スーパーファミリーからのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、異なる種からの相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質とが含まれる（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬ ５０：６６７，１９８７）。このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、同一性パーセントの観点からか、または保存的位置における特定のアミノ酸もしくはモチーフの存在の観点からかにかかわらず、その配列類似性に反映されるような配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらに１００％同一であるアミノ酸配列を有し得る。

【0057】

本技術の変異ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列の整列後、および最大パーセント配列同一性を得るために必要に応じてギャップ導入後に、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。

【0058】

パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための整列化は、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野における技能の範囲内の種々の方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大整列化を達成するためのいずれかのアルゴリズムを含む整列化を測定するための適切なパラメーターを決定できる。例えば、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２を用いて決定し得る。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．からダウンロードし得る。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２は、いくつかのサーチパラメーターを使用し、これらのサーチパラメーターの全ては、例えば、アンマスク（ｕｎｍａｓｋ）＝可、鎖＝全て、予想出現数（ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ）＝１０、最小低複雑度長（ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｅｎｇｔｈ）＝１５／５、マルチパスｅ値（ｍｕｌｔｉ－ｐａｓｓ ｅ－ｖａｌｕｅ）＝０．０１、マルチパス定数（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ－ｐａｓｓ）＝２５、最終ギャップアライメントのドロップオフ＝２５、およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含めてデフォルト値に設定される。アミノ酸配列比較のためにＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２が使用される状況においては、与えられたアミノ酸配列Ｂに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいはこれは、与えられたアミノ酸配列Ｂに対して一定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む与えられたアミノ酸配列Ａと表し得る）は以下のとおりに計算される：１００ｘ比率Ｘ／Ｙ（ここで、Ｘは、配列アライメントプログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２により、そのプログラムのＡとＢとのアライメントにおいて同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならないことが理解されよう。

【0059】

この意味において、アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は当技術分野においてよく知られている。一般に、「類似性」は適切な部位における２個以上のポリペプチド間のアミノ酸の厳密な比較を意味し、アミノ酸は同一である、あるいは類似の化学的および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する。したがって、いわゆる「パーセント類似性」は、比較されるポリペプチド配列の間で決定され得る。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術も当技術分野でよく知られており、その遺伝子のｍＲＮＡ（通常はｃＤＮＡ中間体を経由する）のヌクレオチド配列を決定し、それにコードされるアミノ酸配列を決定し、これを第２のアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性」は、２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、ヌクレオチドとヌクレオチドのまたはアミノ酸とアミノ酸の厳密な対応を意味する。２種以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較可能であり、２種以上のアミノ酸配列の場合も同様である。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）で利用可能なプログラム、例えばＧＡＰプログラムは、それぞれ、２種のポリヌクレオチドの間の同一性ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方を計算し得る。配列間の同一性または類似性を計算するための他のプログラムは当業者に既知である。

【0060】

基準位置に「対応」するアミノ酸位置は、アミノ酸配列を整列させることにより特定された、参照配列と整列する位置である。このような整列は、手動により、またはよく知られた配列アライメントプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｂｌａｓｔ ２などを使用して実施できる。

【0061】

特に指示がない限り、２種のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のパーセント同一性は、それらの２種の配列のうちの短いほうの全長にわたる同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを意味する。

【0062】

「コード配列」は、当業者により理解されるその通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために使用される。

【0063】

「適切な制御配列」は、当業者より理解されるその通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、コード配列の上流側（５’非コード配列）、その中、または下流側（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指すために使用される。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含み得る。

【0064】

「プロモーター」は、当業者により理解されるその通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すために使用される。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、あるいは天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、あるいはさらに、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターは、異なる細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは当業者により理解されよう。ほとんどの時点でほとんどの細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には定義されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得ることも、さらに認識されよう。

【0065】

「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一の核酸フラグメントにおける核酸配列の関連性を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる場合に、コード配列と作動可能に連結されている（すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向に制御配列と動作可能に連結され得る。

【0066】

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者により理解されるその通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、本技術の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指すために使用される。「過剰発現」は、正常または非形質転換生物における産生レベルを超える、遺伝子導入または組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。

【0067】

「形質転換」は、当業者により理解されるその通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、ポリヌクレオチドの標的細胞内への導入を指すために使用される。導入ポリヌクレオチドは標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡ内に取り込まれ、遺伝学的に安定した遺伝をもたらすこともでき、あるいは宿主染色体と関係なく複製することもできる。形質転換核酸フラグメントを含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。

【0068】

「形質転換」、「遺伝子導入」、および「組換え」という用語は、本明細書において宿主細胞と関連して使用される場合、当業者により理解されるそれらの通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、異種核酸分子が導入されている宿主生物の細胞、例えば植物または微生物細胞を指すために使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノム内に安定して組み込むことができ、あるいは核酸分子は染色体外分子として存在することもできる。このような染色体外分子は自己複製できる。形質転換細胞、組織、または対象は、形質転換工程の最終産物だけでなく、その遺伝子導入子孫も包含することが理解される。

【0069】

「組換え」、「異種」、および「外因性」という用語は、本明細書においてポリヌクレオチドと関連して使用される場合、当業者により理解されるそれらの通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、特定の宿主細胞に対して外来性である起源に由来するか、あるいは同じ起源に由来する場合はその元の形態から改変されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すために使用される。したがって、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、部位特異的変異誘発または他の組換え技術の使用により改変されている遺伝子を含む。この用語は、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数コピーも含む。したがって、この用語は、細胞に対して外来性または異種であるか、あるいは細胞に対して相同であるが、その要素が通常見出されない宿主細胞内の位置または形態にあるＤＮＡセグメントを指す。

【0070】

同様に、「組換え」、「異種」および「外因性」という用語は、本明細書においてポリペプチドまたはアミノ酸配列と関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来性である起源に由来するか、あるいは同じ起源に由来する場合はその元の形態から改変されたポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントは宿主細胞中で発現され、組換えポリペプチドを産生することができる。

【0071】

「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、当業者により理解されるそれらの通常および慣例の意味に従って使用され、限定されないが、細胞の中央代謝の一部ではなく、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を保有することが多い染色体外要素を指すために使用される。このような要素は、任意の起源に由来する自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、いくつかのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができる特有の構成に連結または組換えられている。「形質転換カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて、外来性宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。

【0072】

本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（以降、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ａｎｄ ｂｙ Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；ａｎｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７に記載されている（これらそれぞれの全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0073】

本明細書で使用される場合、「合成による（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）」または「有機的に合成された（ｏｒｇａｎｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）」または「化学的に合成された（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）」または「有機的合成の（ｏｒｇａｎｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ）」または「化学的合成の（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ）」または「有機合成（ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」または「化学合成（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」は、一連の化学反応により化合物を調製することを指すために使用され、これは、例えば、天然源から化合物を抽出することを含まない。

【0074】

本明細書で使用される場合、「経口消費製品」という用語は、口内に取り込まれ、その後、口内から排出される物質、および飲まれ、食され、飲み込まれ、あるいは消化される物質、また、通常の許容可能な範囲の濃度で使用される場合にヒトまたは動物にとって安全である物質を含む、ヒトまたは動物の口腔と接触する任意の飲料、食品、健康補助食品、栄養補助食品、医薬組成物、歯科用衛生組成物および化粧品を意味する。

【0075】

本明細書で使用される場合、「食品」という用語は、果実、野菜、ジュース；ハム、ベーコンおよびソーセージなどの肉製品；卵製品、果実濃縮物；ジャム、ゼリー、砂糖漬け、などのゼラチンおよびゼラチン様製品；アイスクリーム、サワークリーム、ヨーグルト、およびシャーベットなどの乳製品；アイシング；糖蜜を含むシロップ；トウモロコシ、小麦、ライ麦、大豆、オート麦、米および大麦製品、穀物製品、堅果の仁およびナット製品、ケーキ、クッキー；キャンディ、ガム、果実フレーバドロップ、などの砂糖菓子；チョコレート、チューインガム、ミント、クリーム、アイシング、アイスクリーム、パイおよびパンを指す。また、「食品」は、ハーブ、スパイスおよび調味料などの香辛料；グルタミン酸モノナトリウムなどの香味増強剤も指す。「食品」は、例えば、調製されたパッケージ化製品、例えば、ダイエット用甘味料、液体甘味料、卓上調味料、水で再構成時に非炭酸飲料を与える粒状香味ミックス、インスタントプディングミックス、インスタントコーヒーおよびティー、コーヒー用クリームの代用品、麦芽乳ミックス、ペットフード、家畜飼料、タバコ、およびベーキング用途の材料、例えば、パン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、ドーナツなどの調製のための粉末ベーキングミックスを含むことをさらに意味する。「食品」は、スクロースをほとんどまたは全く含有しないダイエットおよび低カロリー食品および飲料も意味する。

【0076】

本明細書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、空間中での原子の配向のみが異なる個別の分子の全ての異性体のための一般的用語である。「立体異性体」は、相互に鏡像（ジアステレオマー）ではない２個以上のキラル中心を備えた化合物の鏡像異性体および異性体を含む。

【0077】

本明細書で使用される場合、「甘味強度」という用語は、個体、例えば、ヒトにより観察または経験される甘味感覚の相対的強度、または食味検査員により、例えば、ブリックス計で検出される甘味の度合いまたは量を意味する。

【0078】

本明細書で使用される場合、「甘味度の強化」という用語は、本開示のレバウジオシドを含まない対応する経口消費製品に比べて、本開示の飲料製品または消費製品の１種または複数の甘味特性の感覚認知を、それらの食感または品質を変えることなく、増大する、強化する、増強する、目立たせる、拡大する、および／または強力にする意味でのレバウジオシドの効果を意味する。

【0079】

本明細書で使用される場合、「異味」という用語は、本開示の飲料製品または消費製品で、特徴的に、または通常認められない味覚の量または程度を意味する。例えば、異味は、甘味付与消費製品の消費者にとって望ましくない味覚、例えば、苦味、甘草様味覚、金属味、有害な味覚、渋味、遅延甘味度発生、長引く甘味残味覚、などである。

【0080】

本明細書で使用される場合、「ｗ／ｖ－％」という用語は、ショ糖などの化合物を含む本開示の液体経口消費製品の１００ｍｌ毎のこのような化合物の重量（ｇ）を意味する。本明細書で使用される場合、「ｗ／ｗ－％」という用語は、ショ糖などの化合物を含む本開示の経口消費製品１グラム当りのこのような化合物の重量（ｇ）を意味する。

【0081】

本明細書で使用される場合、「ｐｐｍ」という用語は、重量による百万分率、例えば、レバウジオシドなどの化合物を含む本開示の経口消費製品１ｋｇ当りの本開示のこのような化合物の重量（ｍｇ）（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）またはレバウジオシド化合物を含む本開示の経口消費製品１リットル当りの本開示のこのような化合物の重量（ｍｇ）（すなわち、ｍｇ／Ｌ）；または体積により、例えば、本開示のレバウジオシドを含む本開示の経口消費製品１リットル当りの本開示のこのような化合物の体積（ｍｌ）（すなわち、ｍｌ／Ｌ）を意味する。

【0082】

ステビオール配糖体は南米の植物ステビア・レバウディアナ（キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ））の葉の甘味の原因となる化合物の種類であり、食品、飼料および飲料における甘味料として、単独で、相互に組み合わせて、または他の甘味料および味覚調節剤と組み合わせて使用できる。

【0083】

細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これには、細菌、酵母、植物細胞および動物細胞が含まれる。これには、原核細胞および真核細胞の両方が含まれる。またこれには、リボソームなどの細胞成分に基づいたタンパク質のインビトロ発現も含まれる。

【0084】

細胞系の増殖。増殖には、細胞の増殖および分裂を可能にし得る適切な培地を提供することが含まれる。また、細胞または細胞成分が組換えタンパク質を翻訳および作製できるように資源を提供することも含まれる。

【0085】

タンパク質発現。タンパク質の産生は遺伝子発現後に起こり得る。これは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。ｍＲＮＡは次にポリペプチド鎖に翻訳され、これは、最終的にタンパク質に折り畳まれる。ＤＮＡは、核酸を意図的に細胞内に導入する工程である遺伝子導入を介して細胞内に存在する。この用語は、真核細胞における非ウィルス法に使用されることが多い。また、これは、他の方法および細胞型を指してもよいが、他の用語が好ましい：「形質転換」は、細菌、植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウィルスＤＮＡ導入を記述するために使用されることが多い。動物細胞では、形質転換はこれらの細胞における癌性状態への進行（発癌）を指すためにも使用されるので、遺伝子導入が好ましい用語である。形質導入は、ウィルス媒介のＤＮＡ導入を記述するために使用されることが多い。形質転換、形質導入、およびウィルス感染は、本出願の遺伝子導入の定義に含まれる。

【0086】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ、ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の参照物を含む。

【0087】

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」などの用語が説明または特許請求の範囲において使用される限りにおいて、このような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が特許請求の範囲において移行語として使用される場合に解釈されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語と同様に包括的であることが意図される。

【0088】

「例示的」という用語は、本明細書において、「実施例、例、または例証としての役割を果たすこと」を意味するために使用される。「例示的」であると本明細書に記載される任意の実施形態は、必ずしも、他の実施形態よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。

【発明を実施するための形態】

【0089】

本発明は、少なくとも一部は、新規ステビオール配糖体、Ｒ７－２、Ｒ６－２Ａ、Ｒ６－２Ｂ、Ｒ６－１、Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂならびにこれらの新規ステビオール配糖体の、酵素変換を介するなどの製造方法に関する。化学構造は、ＬＣ ＭＳおよびＮＭＲ分析により確認できる。Ｒ６－１、Ｒ６－２Ａ、Ｒ６－６２Ｂ、Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂは、６個のグルコシル基を含み、Ｒ７－２は、７個のグルコシル基を含む。

【0090】

前駆物質の合成
既に述べたように、ステビオール配糖体は、南米の植物ステビア・レバウディアナ（キク科）の葉、および植物ゴショイチゴ（Ｒｕｂｕｓ ｃｈｉｎｇｉｉ）（バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ））における甘味の原因となる化合物である。これらの化合物はグリコシル化ジテルペンである。特に、これらの分子は、そのヒドロキシル水素原子がグルコース分子で置換されてエステルが形成され、ヒドロキシル水素がグルコースおよびラムノースの組合せで置換されてアセタールが形成されたステビオール分子と見なすことができる。

【0091】

本発明における目的の化合物を製造する１つの方法は、化学的に誘導される、あるいは細菌および／または酵母などの操作された微生物における生合成によって産生されるなどによるステビオール、ステビオシド、Ｒｅｂ Ｅ、Ｒｅｂ Ｄまたはルブソシドなどの一般的または安価な前駆体を使用し、既知のまたは安価な方法などにより、Ｒｅｂ Ｄ３およびＺなどの目的のステビオール配糖体を合成することである。

【0092】

本開示の態様は、ステビオールを産生できる微生物系において酵素を組換えで発現させることを含む方法に関する。一般に、このような酵素は、コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＰＳ）、カウレンシンターゼ（ＫＳ）およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素を含み得る。好ましくは、いくつかの実施形態では、これは、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路またはメバロン酸経路（ＭＶＡ）などの内因性イソプレノイド合成経路を発現する微生物株において生じる。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、細胞は、大腸菌などの細菌細胞、またはサッカロミセス細胞、ピキア細胞、またはヤロウィア細胞などの酵母細胞である。
本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、細胞は藻類細胞または植物細胞である。

【0093】

その後、発酵培養物から前駆体が回収され、化学合成で使用され得る。通常、これは、細胞培養物由来のステビオール（カウレンでもあり得るが）、またはステビオール配糖体である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ステビオール、カウレンおよび／またはステビオール配糖体は気相から回収されるが、他の実施形態では、細胞培養物に有機層またはポリマー樹脂が添加され、カウレン、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体が、有機層またはポリマー樹脂から回収される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦまたはズルコシドＡから選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、産生されたテルペノイドは、ステビオビオシドまたはステビオシドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素ステップ、例えば、１つまたは複数のグリコシル化ステップがエクスビボで実施されることも理解されたい。

【0094】

本明細書に記載されるように、本明細書に記載される方法で使用される酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ活性を有し、天然に存在しないか、あるいは通常天然源に存在量が少ないステビオール配糖体、例えば、それぞれ、レバウジオシドＲ６－１、Ｒ２－２Ａ、Ｒ６－２Ｂ、Ｒ６－４Ａ、Ｒ６－４ＢおよびＲ７－２を調製するための生合成方法を開発するのに有用である。

【0095】

基質は、１種または複数のＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼにより触媒される反応でステビオール配糖体化合物に変換されることが可能な任意の天然または合成化合物であり得る。例えば、基質は、天然ステビア抽出物、ステビオール、ステビオール－１３－Ｏ－グルコシド、ステビオール－１９－Ｏ－グルコシド、２－ビオシド、ルブソシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２またはレバウジオシドＥであり得る。基質は、純粋な化合物または異なる化合物の混合物であり得る。

【0096】

また本明細書に記載されるのは、本明細書で記載の酵素（例えば、ＵＤＰトランスフェラーゼ）を、１種または複数の酵素（例えば、スクロースシンターゼ）と組み合わせて、ステビオール配糖体化合物の生合成全体の効率を改善するか、または結果を改良するように機能し得るカップリング反応系である。例えば、追加の酵素は、グリコシル化反応で産生されるＵＤＰを変換してＵＤＰ－グルコースに戻す（例えば、グルコース残基の供与体としてスクロースを使用して）ことにより、グリコシル化反応に必要なＵＤＰ－グルコースを再生することが可能であり、これにより、グリコシル化反応の効率が改善される。

【0097】

スクロースシンターゼは、ＵＤＰグルコースとＤ－フルクトースとの間の化学反応を触媒して、ＵＤＰおよびスクロースを産生する。スクロースシンターゼは、グリコシルトランスフェラーゼである。この酵素クラスの系統名は、ＵＤＰグルコース：Ｄ－フルクトース ２－α－Ｄ－グルコシルトランスフェラーゼである。一般的に使用される他の名称には、ＵＤＰグルコース－フルクトースグルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンテターゼ、スクロース－ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ、スクロース－ウリジン二リン酸グルコシルトランスフェラーゼ、およびウリジンジホスホグルコース－フルクトースグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物に対するスクロースシンターゼの添加は、「ＵＧＴ－ＳＵＳカップリング系」をもたらす。ＵＧＴ－ＳＵＳカップリング系では、ＵＤＰグルコースは、ＵＤＰおよびスクロースから再生でき、これは、反応混合物への余分のＵＤＰグルコースの添加および反応混合物中のＵＤＰの使用を省くことを可能にする。

【0098】

本明細書に記載される方法で使用するための好適なスクロースシンターゼには、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテスクロースシンターゼが挙げられる。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。

【0099】

適切なＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼには、ステビオール配糖体化合物の生合成において、１種または複数の反応を触媒できるとして当該技術分野において既知の任意のＵＧＴ、例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＨＶ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、またはこれらの機能的相同体が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法のいずれか１つで使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１である。いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法のいずれか１つで使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１－スクロースシンターゼ融合酵素である。いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法のいずれか１つで使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＨＶ１ ＵＴＧである。いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法のいずれか１つで使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＨＶ１ ＵＧＴ－スクロースシンターゼ融合酵素である。

【0100】

本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｌ，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７により記載されている（これらのそれぞれの全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0101】

特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい材料および方法は本明細書で記載される。

【0102】

本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮してより詳細に理解されるであろう。これらの実施例は本技術の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として示されることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は本技術の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適合させるために本技術の種々の変更および修正を行なうことができる。

【0103】

グリコシル化は、植物の天然産物の生物活性および貯蔵を制御する広範な反応であると考えられることが多い。小分子のグリコシル化は、今まで研究されてきたほとんどの植物種において、トランスフェラーゼのスーパーファミリーにより触媒される。これらのグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は６０を超えるファミリーに分類されている。これらのうち、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）およびＵＤＰラムノシルトランスフェラーゼとしても知られているファミリー１ ＧＴ酵素は、糖部分を特定の受容体分子へ転移させる。これらは、ステビオール配糖体中にこのような糖部分を転移させて、種々のレバウジオシドの形成を支援する分子である。これらの酵素のそれぞれは、その独自の活性プロファイルと、その活性化糖部分を転移させる好ましい構造位置とを有する。

【0104】

合成レバウジオシドＲ６－２ＡおよびＲ６－２Ｂおよび製造方法
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドＲ６－２Ａ（Ｒｅｂ Ｒ６－２Ａ）」と名付けられた甘味料（例えば、ノンカロリーおよび／または合成の甘味料）を提供する。レバウジオシドＲ６－２ＡはＣ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３の分子式を有し、構造：

【化20】

を有する。

【0105】

本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドＲ６－２Ｂ（Ｒｅｂ Ｒ６－２Ｂ）」と名付けられた甘味料（例えば、ノンカロリーおよび／または合成の甘味料）を提供する。レバウジオシドＲ６－２ＢはＣ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３の分子式を有し、構造：

【化21】

を有する。

【0106】

本開示のいくつかの態様は、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－２Ｂの製造方法を提供する。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－２Ｂは、レバウジオシドＤ３から製造される。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、（Ｉ）次のように反応化合物を調製し、（ｉ）レバウジオシドＤ３；（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質；および（ｉｉｉ）（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）；（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ；および（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素；を含む反応混合物を調製すること；および（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂを製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含む。

【0107】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤ３に共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖Ｉに共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ａが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖ＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ｂが生成される。図２は、レバウジオシドＤ３、Ｒ６－２Ａ、およびＲ６－２Ｂ中のショ糖のナンバリングを示す。

【0108】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３からレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－２Ｂを製造するための酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴはウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１またはその機能性変異体）である。ＵＧＴ７６Ｇ１は、１，３－１３－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。ＵＧＴ７６Ｇ１は、１，３－１９－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有することも示された。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0109】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３からレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－２Ｂを製造するための酵素は、反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）およびスクロースシンターゼを含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴは、本明細書に記載のＵＧＴ７６Ｇ１および変異体であり、スクロースシンターゼは、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテスクロースシンターゼからなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。いくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。いくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0110】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３からレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－２Ｂを製造するための酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を含む。融合酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼの活性を有する。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素中のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書に記載のＵＧＴ７６Ｇ１および変異体のいずれか１種であり、スクロースシンターゼドメインは、本明細書に記載のスクロースシンターゼ（例えば、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３、ビグナ・ラディアテスクロースシンターゼ）および変異体のいずれか１種である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0111】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはレバウジオシドＲ６－２Ｂを製造する方法のいずれか１つは、レバウジオシドＤ３を製造するステップをさらに含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３は、レバウジオシドＥを、ＵＤＰ－グリコトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより製造できる。本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤ３を製造するために使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１である。レバウジオシドＥからレバウジオシドＤ３を製造する方法は、米国特許第９，７６５，１０４号に記載されており、この方法は、参照により本明細書に組み込まれる。レバウジオシドＤ３は、構造：

【化22】

を有する。

【0112】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂを製造する方法のいずれか１つは、生成されたレバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂを単離することをさらに含む。

【0113】

合成レバウジオシドＲ７－２および製造方法
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドＲ７－２（Ｒｅｂ Ｒ７－２）」と名付けられた甘味料（例えば、ノンカロリーおよび／または合成の甘味料）を提供する。
Ｒｅｂ Ｒ７－２化合物は、Ｃ－１３ヒドロキシルに結合した４個のグルコシル部分を有し、そのうちの３個は２，３－分岐グルコトリオシル置換基としてエーテルの形で結合し、別の２，３－分岐グルコトリオシル部分はＣ－１９にエステルとして結合する、ステビオール配糖体である。

【0114】

レバウジオシドＲ７－２はＣ_６２Ｈ_１００Ｏ_３８の分子式を有し、構造：

【化23】

を有する。

【0115】

本開示のいくつかの態様は、レバウジオシドＲ７－２の製造方法を提供する。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＲ７－２は、レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＲ６－２Ａ、およびレバウジオシドＲ６－２Ｂのうちの１種または複数から製造される。レバウジオシドＲ７－２を製造するための反応混合物は、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂを製造するための反応混合物と同じであり得る。グルコースは、酵素によりレバウジオシドＤ３に共有結合され、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂが生成される。酵素は、レバウジオシドＲ６－２Ａおよび／またはＲ６－２Ｂに第２のグルコースをさらに共有結合させて、レバウジオシドＲ７－２を得る。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤ３のショ糖Ｉおよびショ糖ＩＩのそれぞれに共有結合され、レバウジオシドＲ７－２が生成される。図２は、レバウジオシドＤ３およびレバウジオシドＲ７－２中のショ糖のナンバリングを示す。

【0116】

提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、方法は、（Ｉ）次の反応化合物を調製し、（ｉ）レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＲ６－２Ａ、およびレバウジオシドＲ６－２Ｂのうちの１種または複数；（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質；および（ｉｉｉ）次の群から選択される酵素：（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）；（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ；および（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素からなる群より選択される酵素；を含む反応混合物を調製すること；および（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ７－２を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含む。

【0117】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３からレバウジオシドＲ７－２を製造するための酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴはウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１またはその機能性変異体）である。ＵＧＴ７６Ｇ１は、１，３－１３－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。ＵＧＴ７６Ｇ１は、１，３－１９－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有することも示された。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0118】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３からレバウジオシドＲ７－２を製造するための酵素は、反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）およびスクロースシンターゼを含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴは、本明細書に記載のＵＧＴ７６Ｇ１および変異体であり、スクロースシンターゼは、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテスクロースシンターゼからなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0119】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３からレバウジオシドＲ７－２を製造するための酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を含む。融合酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼの活性を有する。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素中のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書に記載のＵＧＴ７６Ｇ１および変異体のいずれか１種であり、スクロースシンターゼドメインは、本明細書に記載のスクロースシンターゼ（例えば、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３、ビグナ・ラディアテスクロースシンターゼ）および変異体のいずれか１種である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号５のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0120】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ７－２を製造する方法は、レバウジオシドＤ３を製造するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、レバウジオシドＤ３は、レバウジオシドＥを、ＵＤＰ－グリコトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより製造できる。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤ３を製造するために使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１である。レバウジオシドＥからレバウジオシドＤ３を製造する方法は、米国特許第９，７６５，１０４号に記載されており、この方法は、参照により本明細書に組み込まれる。レバウジオシドＤ３は、構造：

【化24】

を有する。

【0121】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ７－２を製造する方法のいずれか１つは、生成されたレバウジオシドＲ７－２を単離することをさらに含む。

【0122】

合成レバウジオシドＲ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂならびに製造方法
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドＲ６－４Ａ（Ｒｅｂ Ｒ６－４Ａ）」と名付けられた甘味料（例えば、ノンカロリーおよび／または合成の甘味料）を提供する。レバウジオシドＲ６－４ＡはＣ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３の分子式を有し、構造：

【化25】

を有する。

【0123】

本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドＲ６－４Ｂ（Ｒｅｂ Ｒ６－４Ｂ）」と名付けられた甘味料（例えば、ノンカロリーおよび／または合成の甘味料）を提供する。レバウジオシドＲ６－４ＢはＣ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３の分子式を有し、構造：

【化26】

を有する。

【0124】

本開示のいくつかの態様は、レバウジオシドＲ６－４Ａの製造方法を提供する。
提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＲ６－４Ａは、レバウジオシドＺ１またはレバウジオシドＺ２から製造される。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、（Ｉ）次のように反応混合物を調製し、（ｉ）レバウジオシドＺ１またはレバウジオシドＺ２；（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質；および（ｉｉｉ）次の群から選択される酵素、（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）；（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ；および（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素からなる群より選択される酵素；を含む反応混合物を調製すること；および（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ６－４Ａを製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含む。

【0125】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ１またはレバウジオシドＺ２に共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ１のショ糖ＩＶに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ２のショ糖ＩＩＩに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ａが生成される。図１４は、レバウジオシドＺ１、Ｚ２およびＲ６－４Ａ中のショ糖のナンバリングを示す。

【0126】

本開示のいくつかの態様は、レバウジオシドＲ６－４Ｂの製造方法を提供する。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＲ６－４Ｂは、レバウジオシドＺ２から製造される。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、（Ｉ）（ｉ）レバウジオシドＺ２；（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質；および（ｉｉｉ）（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）；（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ；および（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素からなる群より選択される酵素；を含む反応混合物を調製すること；および（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ６－４Ｂを製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含む。

【0127】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ２に共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ｂが生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＺ２のショ糖Ｖに共有結合され、レバウジオシドＲ６－４Ｂが生成される。図１４は、レバウジオシドＺ２およびＲ６－４Ｂ中のショ糖のナンバリングを示す。

【0128】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＺ１またはＺ２からレバウジオシドＲ６－４ＡまたはＲ６－４Ｂを製造するための酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴはＨＶ１グリコシルトランスフェラーゼである。ＨＶ１は、１，２－１９－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。ＨＶ１ ＵＧＴは、１，２－１９－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有することも示された。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0129】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＺ１またはＺ２からレバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはＲ６－４Ｂを製造するための酵素は、反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）およびスクロースシンターゼを含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴは、本明細書に記載のＨＶ１ ＵＧＴおよび変異体であり、スクロースシンターゼは、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテスクロースシンターゼからなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。いくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0130】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＺ１またはＺ２からレバウジオシドＲ６－４ＡまたはＲ６－４Ｂを製造するための酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を含む。融合酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼの活性を有する。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素中のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書に記載のＨＶ１ ＵＧＴおよび変異体のいずれか１種であり、スクロースシンターゼドメインは、本明細書に記載のスクロースシンターゼ（例えば、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３、ビグナ・ラディアテスクロースシンターゼ）および変異体のいずれか１種である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0131】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはＲ６－４Ｂを製造する方法のいずれか１つは、レバウジオシドＺ１および／またはＺ２を製造するステップをさらに含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＺ１および／またはＺ２は、レバウジオシドＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより製造できる。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＥからレバウジオシドＺ１および／またはＺ２を製造するために使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１である。レバウジオシドＥからレバウジオシドＤ３を製造する方法は、米国特許第１０，０８１，８２６号に記載されており、この方法は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0132】

レバウジオシドＺ１は、構造：

【化27】

を有する。

【0133】

レバウジオシドＺ２は、構造：

【化28】

を有する。

【0134】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはＲ６－４Ｂを製造する方法のいずれか１つは、生成されたレバウジオシドＲ６－４Ａおよび／またはＲ６－４Ｂを単離することをさらに含む。

【0135】

合成レバウジオシドＲ６－１および製造方法
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドＲ６－１（Ｒｅｂ Ｒ６－１）」と名付けられた甘味料（例えば、ノンカロリーおよび／または合成の甘味料）を提供する。レバウジオシドＲ６－１はＣ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３の分子式を有し、構造：

【化29】

を有する。

【0136】

本開示のいくつかの態様は、レバウジオシドＲ６－１の製造方法を提供する。本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＲ６－１は、レバウジオシドＤから製造される。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、（Ｉ）（ｉ）レバウジオシドＤ；（ｉｉ）スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の基質；および（ｉｉｉ）（ａ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）；（ｂ）反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ；および（ｃ）スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素からなる群より選択される酵素；を含む反応混合物を調製すること；および（ＩＩ）反応混合物をレバウジオシドＲ６－１を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含む。

【0137】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤに共有結合され、レバウジオシドＲ６－１が生成される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、グルコースが、酵素によりレバウジオシドＤのショ糖Ｖに共有結合され、レバウジオシドＲ６－１が生成される。図９は、レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＲ６－１中のショ糖のナンバリングを示す。

【0138】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤからレバウジオシドＲ６－１を製造するための酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴはＨＶ１グリコシルトランスフェラーゼである。ＨＶ１は、１，２－１９－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。ＨＶ１ ＵＧＴは、１，２－１９－Ｏ－グルコースグリコシル化活性を有することも示された。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＶ１ ＵＧＴは、配列番号３のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0139】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤからレバウジオシドＲ６－１を製造するための酵素は、反応混合物に別々に添加されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）およびスクロースシンターゼを含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、ＵＧＴは、本明細書に記載のＨＶ１ ＵＧＴおよび変異体であり、スクロースシンターゼは、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテスクロースシンターゼからなる群より選択される。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインは、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩである。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、シロイヌナズナスクロースシンターゼＩは、配列番号９のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0140】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤからレバウジオシドＲ６－１を製造するための酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を含む。融合酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼの活性を有する。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素中のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書に記載のＨＶ１ ＵＧＴおよび変異体のいずれか１種であり、スクロースシンターゼドメインは、本明細書に記載のスクロースシンターゼ（例えば、アラビドプシススクロースシンターゼＩ、アラビドプシススクロースシンターゼ３、ビグナ・ラディアテスクロースシンターゼ）および変異体のいずれか１種である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、融合酵素は、配列番号７のアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる。

【0141】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ６－１を製造する方法のいずれか１つは、レバウジオシドＤを製造するステップをさらに含む。本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤは、レバウジオシドＡを、ＵＤＰ－グリコトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより製造できる。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造するために使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１である。レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法は、米国特許出願公開第２０１８００３７６００号に記載されており、この方法は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0142】

本明細書で提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＤは、レバウジオシドＥを、ＵＤＰ－グリコトランスフェラーゼおよびスクロース、ＵＤＰ、ＵＤＰ－グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより製造できる。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤを製造するために使用されるＵＤＰグリコトランスフェラーゼは、ＨＶ１ ＵＧＴまたはＵＧＴ７６Ｇ１である。レバウジオシドＥからレバウジオシドＤを製造する方法は、米国特許第１０，２５３，３４４号に記載されており、この方法は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0143】

レバウジオシドＤは、構造：

【化30】

を有する。

【0144】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレバウジオシドＲ６－１を製造する方法のいずれか１つは、生成されたレバウジオシドＲ６－１を単離することをさらに含む。

【0145】

反応混合物、核酸および細胞系
提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、反応混合物はインビトロの状態であり、すなわち、本明細書で記載の方法はインビトロで実施される。インビトロ反応の場合、単離酵素（例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、および／またはＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素）は、インビトロで反応混合物に添加できる。

【0146】

提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、反応混合物は細胞ベースの反応混合物であり、すなわち、反応は細胞中で行われる。細胞ベース反応の場合、酵素（例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、および／またはＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素）は宿主細胞中で発現される。

【0147】

提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、酵素（例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、および／またはＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素）はそれぞれ、それらをコードするヌクレオチド配列から発現される。したがって、本明細書で記載のいずれか１種の酵素をコードする核酸が提供される。本開示は、配列番号２、４、６、８、および１０のずれか１つに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号２に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列、および配列番号１０に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号４に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列、および配列番号１０に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0148】

提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母、非ステビオール配糖体生成植物、藻類、真菌類、および細菌からなる群より選択される。

【0149】

提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルツロボトリス属（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ）、ブレビバクテリア属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からなる群より選択される。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）である。提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、出芽酵母細胞）である。

【0150】

提供されるいずれか１つの方法のいくつかの実施形態では、大豆、菜種、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、オート麦、サトウモロコシ、米、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ、サトウダイコン、サトウキビ、ビーンズ、エンドウマメ、ライ麦、亜麻、堅木、軟木、樹木、飼料草、シロイヌナズナ、稲（イネ）、オオムギ、スイッチグラス（パニクム・ウィルガツム）、ブラキポジウム属種、アブラナ属種、およびクランベ・アビシニカからなる群より選択される植物から単離された細胞である。

【0151】

原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて細菌宿主細胞中で実施される。
融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、通常、次の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の溶解度を増大させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとしての役割を果たすことにより組換えタンパク質の精製を支援助すること。多くの場合、融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質を融合部分から分離可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質切断部位が導入される。このようなベクターは本開示の範囲内に含まれる。

【0152】

ある実施形態では、発現ベクターは、細菌細胞中での組換えポリペプチドの発現のための遺伝要素を含む。細菌細胞中での転写および翻訳のための要素は、プロモーター、タンパク質複合体のコード領域、および転写ターミネーターを含むことができる。

【0153】

当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学的技術を理解しているであろう。本技術の発現ベクターへの取込みのために使用されるポリヌクレオチドは、上記のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの定型的な技術により作製できる。

【0154】

相補的な付着末端を介してＤＮＡをベクターに操作可能なように連結するためにいくつかの分子生物学的技術が開発され得る。一実施形態では、ベクターＤＮＡに挿入すべき核酸分子に相補的ホモポリマー領域（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ ｔｒａｃｔ）が付加され得る。ベクターおよび核酸分子は次に、相補的ホモポリマーテイル間の水素結合により連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成される。

【0155】

代替的実施形態では、提供される１つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーを使用して、本技術のポリヌクレオチドが発現ベクターに操作可能なように連結される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ消化により生成される。ある実施形態では、核酸分子は、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（突出３’－一本鎖末端をその３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性により除去し、陥凹３’末端をその重合活性により穴埋めする酵素）によって処理され、それにより平滑末端ＤＮＡセグメントが生成される。平滑末端セグメントは次に、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒できる酵素の存在下で、多量のモル過剰のリンカー分子と共にインキュベートされる。したがって、反応の生成物は、高分子リンカー配列をその末端に有するポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは次に適切な制限酵素により切断され、ポリヌクレオチドの末端に適合する末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結される。

【0156】

あるいは、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）部位を有するベクターを使用できる。次に、制限消化または連結を行うことなく、必要とされるＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドがＬＩＣベクターにクローニングされ得る（Ａｓｌａｎｉｄｉｓ ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ，ＮＵＣＬ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８ ６０６９－７４，（１９９０），Ｈａｕｎ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，５１５－１８（１９９２）（参照により本明細書と一致する範囲で本明細書に組み込まれる））。

【0157】

ある実施形態では、選択されたプラスミド内への挿入のために、目的のポリヌクレオチドを単離および／または改変するためには、ＰＣＲの使用が好適する。配列のＰＣＲ調製で使用するのに適切なプライマーは、必要とされる核酸分子のコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまたはＬＩＣ部位を付加し、所望の読み枠内にコード領域を配置するように設計できる。

【0158】

ある実施形態において、本技術の発現ベクター内への取込みのためのポリヌクレオチドは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲの使用により調製される。コード領域は増幅され、プライマー自体は増幅配列産物内に取り込まれる。ある実施形態では、増幅プライマーは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有し、これは、増幅配列産物が適切なベクター内にクローニングされることを可能にする。

【0159】

発現ベクターは、従来の形質転換または遺伝子導入技術により植物または微生物宿主細胞内に導入され得る。本技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は当該技術分野において既知の方法によって達成され、通常、ベクターおよび細胞のタイプの両方に依存する。適切な技術には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介遺伝子導入、リポフェクション、ケモポレーション（ｃｈｅｍｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはエレクトロポレーションが含まれる。

【0160】

うまく形質転換された細胞、すなわち発現ベクターを含有する細胞は、当該技術分野においてよく知られた技術により特定され得る。例えば、本技術の発現ベクターがトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載されるポリペプチドを生成させることができる。当該技術分野においてよく知られた技術により、発現ベクターＤＮＡの存在について細胞を検査することができる。

【0161】

宿主細胞は、既に記載された発現ベクターの単一コピー、あるいは発現ベクターの複数コピーを含有することができる。

【0162】

いくつかの実施形態では、形質転換細胞は動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、または酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、キャノーラ植物細胞、ナタネ植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、綿植物細胞、トウモロコシ植物細胞、ピーナッツ植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群より選択される植物細胞である

【0163】

微生物宿主細胞発現系、および外来性タンパク質の高レベルの発現を指示する制御配列を含有する発現ベクターは、当業者によく知られている。これらはいずれも、微生物宿主細胞における本技術の組換えポリペプチドの発現のためのベクターを構築するために使用され得る。これらのベクターは次に、本技術の組換えポリペプチドの高レベルの発現を可能にするために、形質転換により適切な微生物に導入され得る。

【0164】

適切な微生物宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは当該技術分野においてよく知られている。通常、ベクターまたはカセットは、関連のポリヌクレオチドの転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、ならびに自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を含有するポリヌクレオチドの５’の領域と、転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’の領域とを含む。いくつかの実施形態では、両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同の遺伝子に由来するのが好ましいが、このような制御領域は、宿主として選択された特定の種に特有の遺伝子に由来する必要はないと理解されるべきである。

【0165】

所望の微生物宿主細胞中で組換えポリペプチドの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を機能させることができるプロモーターは実質的にいずれも本技術に適しており、ＣＹＣＩ、ＨＩＳ３、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ、ＡＤＨＩ、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）；ＡＯＸＩ（ピキア属における発現に有用）；ならびにｌａｃ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌における発現に有用）が含まれるが、これらに限定されない。

【0166】

また終結制御領域は微生物宿主に特有の種々の遺伝子に由来してもよい。終結部位は、任意選択で、本明細書に記載される微生物宿主のために含まれ得る。

【0167】

植物細胞では、本技術の発現ベクターは、所望の発生段階の所望の組織での本技術の組換えポリペプチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されたコード領域を含み得る。便宜上、発現されるポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在すべきである。発現ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を促進するために１種または複数のイントロンも含み得る。

【0168】

植物宿主細胞の場合、本技術のベクター配列において、コード領域の発現を誘導することができる任意のプロモーターおよび任意のターミネーターの任意の組合せが使用され得る。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの好適例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが含まれる。使用可能な効率的な植物プロモーターの１つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。本技術の発現ベクターと機能的に連結しているこのようなプロモーターは、ベクターの発現を促進できなければならない。本技術において使用され得る高レベル植物プロモーターには、例えば、ダイズ由来のリブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Ｂｅｒｒｙ－Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＡＰＰ．ＧＥＮ．，１：４８３ ４９８（１９８２）、その全体が、本明細書と一致する範囲で本明細書中に組み込まれる）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが含まれる。これらの２つのプロモーターは植物細胞において光誘導性であることが知られている（例えば、ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＬＡＮＴＳ，ＡＮ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＰＥＲＳＰＥＣＴＩＶＥ，Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．（１９８３），ｐａｇｅｓ ２９－３８；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８：１３９９（１９８３）、およびＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．，２：２８５（１９８３）を参照されたい。これらはそれぞれ、参照によって本明細書と一致する範囲で本明細書中に組み込まれる）。

【0169】

経口消費製品
本明細書記載いずれか１つの方法を用いて製造したレバウジオシド（例えば、レバウジオシドＲ６－１、Ｒ６－２Ａ、Ｒ６－２Ｂ、Ｒ６－４Ａ、Ｒ６－４Ｂ、およびＲ７－２）を甘味料として使用できる。本開示の他の態様は、甘味を付与する量の、レバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、および／またはＲ７－２を有する、例えば、飲料製品および消費製品からなる群より選択される経口消費製品を提供する。

【0170】

経口消費製品のいずれか１種は、約１％（ｗ／ｖ－％）～約４％（ｗ／ｖ－％）のスクロース溶液に同等の甘味強度を有し得る。

【0171】

経口消費製品のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－１を含み得る。経口消費製品のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－２Ａを含み得る。経口消費製品のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－２Ｂを含み得る。経口消費製品のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－４Ａを含み得る。経口消費製品のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－４Ｂを含み得る。経口消費製品のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ７－２を含み得る。

【0172】

レバウジオシドＲ６－１は、経口消費製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＲ６－２Ａは、経口消費製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＲ６－２Ｂは、経口消費製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＲ６－４Ａは、経口消費製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＲ６－４Ｂは、経口消費製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＲ７－２は、経口消費製品中の唯一の甘味料とすることができる。

【0173】

消費製品のいずれか１種は、少なくとも１種の追加の甘味料を含むこともできる。少なくとも１種の追加の甘味料は、例えば、天然の高甘味度甘味料であり得る。追加の甘味料は、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２、レバウジオシドＤ３、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシド、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ－アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびこれらの組合せから選択できる。

【0174】

経口消費製品のいずれか１種は、少なくとも１種の添加物を含むこともできる。添加物は、例えば、炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香味料、香味成分、渋味化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびこれらの組み合わせであり得る。

【0175】

いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－１を含む飲料製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－２Ａを含む飲料製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－２Ｂを含む飲料製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－４Ａを含む飲料製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－４Ｂを含む飲料製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ７－２を含む飲料製品を提供する。

【0176】

飲料製品のいずれか１種は、例えば、炭酸飲料製品または非炭酸飲料製品であり得る。飲料製品のいずれか１種はまた、例えば、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、フローズン飲料、レディ・トゥ・ドリンク飲料、フローズンおよびレディ・トゥ・ドリンク飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、香味・ウォーター、強化水、果実ジュース、果実ジュース風味ドリンク、スポーツドリンク、またはエナジードリンクであり得る。

【0177】

いくつかの実施形態では、本開示の飲料製品のいずれか１種は、例えば、酸味料、果実ジュースおよび／または野菜ジュース、パルプなど、香味料、着色料、保存剤、ビタミン、ミネラル、電解質、エリスリトール、タガトース、グリセリン、および二酸化炭素などの１種または複数の飲料成分を含むことができる。このような飲料製品は、飲料濃縮物または炭酸ガスで飽和されたレディ・トゥ・ドリンク飲料などの任意の適切な形態で提供され得る。

【0178】

特定の実施形態では、本開示の飲料製品のいずれか１種は、多数の異なる特定の配合または構成のいずれかを有することができる。本開示の飲料製品の配合物は、製品の意図される市場区分、その所望の栄養特性、香味プロファイルなどの因子に応じてある程度変動し得る。例えば、特定の実施形態では、一般に、さらなる成分を特定の飲料製品の配合物に添加することは１つの選択肢であり得る。例えば、追加の（すなわち、より多くのおよび／または他の）甘味料を添加することができ、香味料、電解質、ビタミン、果実ジュースまたは他の果実製品、味物質、マスキング剤など、香味増強剤、および／または炭酸飽和は、通常、味覚、口あたり、栄養特性などを変えるために任意のこのような配合物に追加され得る。いくつかの実施形態では、飲料製品のいずれか１種は、水、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－１、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料であり得る。いくつかの実施形態では、飲料製品のいずれか１種は、水、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－２Ａ、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料であり得る。いくつかの実施形態では、飲料製品のいずれか１種は、水、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－２Ｂ、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料であり得る。いくつかの実施形態では、飲料製品のいずれか１種は、水、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－４Ａ、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料であり得る。いくつかの実施形態では、飲料製品のいずれか１種は、水、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－４Ｂ、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料であり得る。いくつかの実施形態では、飲料製品のいずれか１種は、水、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ７－２、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料であり得る。

【0179】

例示的な香味料は、例えば、コーラ香味料、シトラス香味料、およびスパイス香味料であり得る。いくつかの実施形態では、二酸化炭素の形態での炭酸化が起泡のために行われる。他の実施形態では、他の成分、製造技術、所望の貯蔵寿命などに応じて保存剤を添加できる。特定の実施形態では、カフェインを添加できる。いくつかの実施形態では、飲料製品は、炭酸水、甘味料、コーラ・ナッツ抽出物および／または他の香味料、カラメル着色料、１種または複数の酸、および任意選択で、他の成分を特徴として含有する、コーラ風味の炭酸飲料であり得る。

【0180】

飲料製品中に存在する好適な量のレバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、例えば、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍであり得る。いくつかの実施形態では、低濃度のレバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、例えば、約１００ｐｐｍ未満であり、１０，０００ｐｐｍ～３０，０００ｐｐｍの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味度を有する。最終濃度は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約９５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約９０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約８５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約８０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約７５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約７０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約６５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約６０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約４５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約４０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約３５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約３０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約２５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約２０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約１５ｐｐｍ、または約５ｐｐｍ～約１０ｐｐｍの範囲である。あるいは、レバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約３５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約４０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約４５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約６０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約６５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約７０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約７５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約８５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約９０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、または約９５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍの範囲の最終濃度で本開示の飲料製品中に存在し得る。

【0181】

いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－１を含む消費製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－２Ａを含む消費製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－２Ｂを含む消費製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－４Ａを含む消費製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ６－４Ｂを含む消費製品を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、甘味付与量のレバウジオシドＲ７－２を含む消費製品を提供する。消費製品は、例えば、飲料製品、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科用衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品および卓上調味料であり得る。

【0182】

本明細書で使用される場合、「健康補助食品」は、食事を補充し、食事において欠けているかまたは十分な量で消費されない可能性のある栄養素、例えば、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、アミノ酸などを提供することを目的とした化合物を指す。当該技術分野において知られている任意の適切な健康補助食品が使用され得る。適切な健康補助食品の例は、例えば、栄養素、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、ハーブ、生薬、アミノ酸、および代謝産物であり得る。

【0183】

本明細書で使用される場合、「栄養補助食品」は、疾患または障害（例えば、疲労、不眠症、老化作用、記憶喪失、気分障害、心血管疾患および高レベルの血中コレステロール、糖尿病、骨粗鬆症、炎症、自己免疫障害など）の予防および／または治療を含む、薬用または健康上の利益を提供し得る任意の食品または食品の一部を含む化合物を指す。当該技術分野において既知の任意の適切な栄養補助食品が使用され得る。いくつかの実施形態では、栄養補助食品は、食品および飲料のサプリメントとして、ならびにカプセルもしくは錠剤などの固体製剤、または溶液もしくは懸濁液などの液体製剤であり得る、経腸または非経口適用のための医薬製剤として使用できる。

【0184】

いくつかの実施形態では、健康補助食品および栄養補助食品はさらに、保護親水コロイド（例えば、ガム、タンパク質、加工デンプン）、結合剤、皮膜形成剤、カプセル化剤／材料、壁／殻材料、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動化剤、矯味剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、酸化防止剤および抗菌剤を含むことができる。

【0185】

本明細書で使用される場合、「ゲル」は、粒子のネットワークが液体媒体全体に広がったコロイド系を指す。ゲルは主に液体から構成され、従って液体と同様の密度を示すが、ゲルは、液体媒体に広がる粒子のネットワークのために、固体の構造コヒーレンスを有する。この理由から、ゲルは一般に、固体のゼリー様材料のように見える。ゲルは、いくつかの用途で使用できる。例えば、ゲルは、食品、塗料、および接着剤に使用できる。食べることができるゲルは、「食用ゲル組成物」と呼ばれる。食用ゲル組成物は、通常、軽食として、デザートとして、主食の一部として、または主食と共に食される。適切な食用ゲル組成物の例は、例えば、ゲルデザート、プディング、ジャム、ゼリー、ペースト、トライフル、アスピック、マシュマロ、グミキャンディなどであり得る。いくつかの実施形態では、食用ゲルミックスは一般に粉末または顆粒状の固体であり、これに流体が添加されて、食用ゲル組成物が形成され得る。適切な流体の例は、例えば、水、乳製品流体、乳製品類似流体、ジュース、アルコール、アルコール飲料、およびこれらの組み合わせであり得る。適切な乳製品流体の例は、例えば、乳、発酵乳、クリーム、流体乳清、およびこれらの混合物であり得る。適切な乳製品類似流体の例は、例えば、豆乳および乳成分不含コーヒー用クリーム代用品であり得る。

【0186】

本明細書で使用される場合、「ゲル化成分」という用語は、液体媒体内にコロイド系を形成することができる任意の材料を指す。適切なゲル化成分の例は、例えば、ゼラチン、アルギン酸塩、カラギーナン、ガム、ペクチン、コンニャク、寒天、食品酸、レンネット、デンプン、デンプン誘導体、およびこれらの組み合わせであり得る。食用ゲルミックスまたは食用ゲル組成物で使用されるゲル化成分の量は、例えば、使用される特定のゲル化成分、使用される特定の流体基剤、およびゲルの所望の特性などのいくつかの因子に応じてかなり変動し得ることが当業者によく知られている。

【0187】

本開示のゲルミックスおよびゲル組成物は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、本開示の食用ゲルミックスおよび食用ゲル組成物は、ゲル化剤に加えて他の成分を用いて調製することができる。他の適切な成分の例は、例えば、食品酸、食品酸の塩、緩衝系、増量剤、捕捉剤、架橋剤、１種または複数の香味料、１種または複数の着色料、およびこれらの組み合わせであり得る。

【0188】

本明細書で提供されるレバウジオシドのいずれか１種を含む医薬組成物も提供される。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－１、および１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－２Ａ、および１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－２Ｂ、および１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－４Ａ、および１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－４Ｂ、および１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ７－２、および１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、生物学的効果を発揮する１種または複数の活性薬剤を含有する医薬品を処方するために使用できる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物のいずれか１種は、生物学的効果を発揮する１種または複数の活性薬剤を含有できる。適切な活性薬剤は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）。このような組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡに記載されるように、当該技術分野においてよく知られている手順に従って調製できる。

【0189】

レバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、当該技術分野で既知の任意の好適な歯科用および経口衛生組成物と共に使用できる。適切な歯科および口腔衛生組成物の例は、例えば、練り歯磨き、歯の光沢剤、デンタルフロス、うがい薬、口内洗浄剤、歯磨剤、マウススプレー、マウスリフレッシャー、プラークリンス、歯科用鎮痛剤などであり得る。本明細書で提供されるレバウジオシドのいずれか１種を含む歯科用および経口衛生組成物も提供される。

【0190】

本明細書で提供される消費製品中などの組成物のいずれか１種中に存在するレバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２の好適な量は、例えば、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍであり得る。いずれか１種の組成物のいくつかの実施形態では、低濃度のレバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、例えば、約１００ｐｐｍ未満であり、１０，０００ｐｐｍ～３０，０００ｐｐｍの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味度を有する。最終濃度は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約９５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約９０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約８５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約８０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約７５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約７０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約６５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約６０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約４５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約４０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約３５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約３０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約２５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約２０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約１５ｐｐｍ、または約５ｐｐｍ～約１０ｐｐｍの範囲であり得る。あるいは、レバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約３５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約４０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約４５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約６０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約６５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約７０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約７５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約８５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約９０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、または約９５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍの範囲の最終濃度で本開示のいずれか１種の消費製品中などの提供される組成物のいずれか１種中に存在し得る。

【0191】

特定の実施形態では、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのレバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２が食品組成物中に存在する。このような組成物も提供される。本明細書で使用される場合、「食品組成物」は、栄養価を有し、ヒトおよび動物による消費を目的とすることができるが、そうでなくてもよい、任意の固体または液体の摂取可能な材料を指す。

【0192】

適切な食品組成物の例は、例えば、菓子組成物、例えば、キャンディ、ミント、果実フレーバドロップ、ココア製品、チョコレートなど；香辛料、例えば、ケチャップ、マスタード、マヨネーズなど；チューインガム；シリアル組成物；焼き物、例えば、パン、ケーキ、パイ、クッキーなど；乳製品、例えば、乳、チーズ、クリーム、アイスクリーム、サワークリーム、ヨーグルト、シャーベットなど；卓上甘味料組成物；スープ；シチュー；インスタント食品；食肉、例えば、ハム、ベーコン、ソーセージ、ジャーキーなど；ゼラチンおよびゼラチン様製品、例えば、ジャム、ゼリー、砂糖漬けなど；果実；野菜；卵製品；アイシング；糖蜜を含むシロップ；軽食；ナッツミートおよびナッツ製品；ならびに動物飼料であり得る。

【0193】

また食品組成物は、ハーブ、スパイスおよび調味料、天然および合成香味料、ならびに香味増強剤、例えば、グルタミン酸モノナトリウムでもあり得る。いくつかの実施形態では、食品組成物のいずれか１種は、例えば、調製されたパッケージ化製品、例えば、ダイエット用甘味料、液体甘味料、粒状香味ミックス、ペットフード、家畜飼料、タバコ、およびベーキング用途の材料、例えば、パン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、ドーナツなどの調製のための粉末ベーキングミックスであり得る。他の実施形態では、食品組成物にいずれか１種は、スクロースをほとんどまたは全く含有しないダイエットおよび低カロリー食品および飲料であり得る。

【0194】

前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせることができるまたはできない特定の実施形態では、レバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、唯一の甘味料であり、製品は、約１％～約４％（ｗ／ｖ－％）のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせることができるまたはできない特定の実施形態では、消費製品および飲料製品はさらに追加の甘味料を含むことができ、製品は、約１％～約１０％（ｗ／ｖ－％）のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせることができるまたはできない特定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は高甘味度甘味料である。前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせることができるまたはできない特定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は天然の高甘味度甘味料であり得る。前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせることができるまたはできない特定の実施形態では、追加の甘味料は、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＤ３、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＶ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシドモグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ－アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびこれらの組合せから選択される１種または複数の甘味料を含む。前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせることができるまたはできない特定の実施形態では、消費製品および飲料製品はさらに、炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、着香剤、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびこれらの組合せから選択される１種または複数の添加剤を含むことができる。 前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせることができるまたはできない特定の実施形態では、レバウジオシドＲ６－１、レバウジオシドＲ６－２Ａ、レバウジオシドＲ６－２Ｂ、レバウジオシドＲ６－４Ａ、レバウジオシドＲ６－４Ｂ、またはレバウジオシドＲ７－２は、それが製品中に添加される前で、約５０重量％～約１００重量％の純度を有する。

【0195】

実施例
実施例１：酵素生物変換による新規ステビオール配糖体Ｒ６－２およびＲ７－２の製造
本発明では、全ての候補ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）遺伝子の完全長ＤＮＡフラグメントを商業的に合成した。ほとんど全てのｃＤＮＡのコドンを大腸菌にとって好ましいものに変更した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）。合成したＤＮＡを、細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅ Ｎ－Ｈｉｓ ＳＵＭＯ Ｋａｎベクターに挿入した（Ｌｕｃｉｇｅｎ）。

【0196】

各発現構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、続いてこれを、０．８～１．０のＯＤ６００に到達するまで、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地中３７℃で増殖させた。１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現を誘導し、培養物を１６℃で２２時間、さらに増殖させた。遠心分離（３，０００ｘｇ；１０分；４℃）により細胞を回収した。細胞ペレットを採集し、直ちに使用するか、あるいは－８０℃で貯蔵した。

【0197】

典型的な例では、細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５μｇ／ｍｌのリゾチーム、５μｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、および０．４％のトリトンＸ－１００）中に再懸濁した。４℃での超音波処理により細胞を破壊し、遠心分離（１８，０００ｘｇ；３０分）により細胞片を清澄化した。上清を平衡化（平衡化緩衝液：５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール）Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティカラムにロードした。タンパク質試料をロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して、非結合混入タンパク質を除去した。Ｈｉｓタグ化ＵＧＴ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する平衡化緩衝液により溶出した。

【0198】

レバウジオシドＤ３（Ｒｅｂ Ｄ３）を基質として使用して、精製された候補ＵＧＴ組換え型ポリペプチドのグリコシル化活性をアッセイした。通常、組換えポリペプチド（１０～５０μｇ）は２００μＬのインビトロ反応系で試験された。反応系は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌのＲｅｂ Ｄ３基質、および１ｍＭのＵＤＰ－グルコースまたはＵＤＰおよび／またはスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）および２５０ｍＭのスクロースを含有した。反応を３０～３７℃で実施し、種々の時点で２００μＬの１－ブタノールの添加により５０ｕｌの反応を終結させた。試料を２００μＬの１－ブタノールで３回抽出した。プールした画分を乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために１００μＬの８０％のメタノール中に溶解した。

【0199】

その後、ＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を含むＤｉｏｎｅｘ ＵＰＬＣ ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００システム（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて実施した。プールした試料中のステビオール配糖体のキャラクタリゼーションのためにガードカラムを有するＳｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用した。ＨＰＬＣ分析における定組成溶離のために水中アセトニトリルを使用した。ＨＰＬＣ分析で使用した検出波長は２１０ｎｍであった。

【0200】

活性スクリーニング後に、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１）は、Ｒ６－２およびＲ７－２ステビオール配糖体を生成する強力な活性を有することが明らかになった（図２）。

【0201】

図３に示すように、ＵＧＴ７６Ｇ１は、Ｒｅｂ Ｄ３をＲ６－２に変換でき、生成されたＲ６－２は、連続的にＲ７－２に変換できる。Ｒ６－２およびＲ７－２は、初期反応時間に生成された（２時間、図３、パネルＢ）。生成されたＲ６－２は、さらに後の時点でＲ７－２に変換できる（４時間、図３、パネルＣ）。最終的に、全てのＲｅｂ Ｄ３および生成されたＲ６－２は、Ｒ７－２化合物に完全に変換できる（１９時間、図３、パネルＤ）。

【0202】

実施例２：ＬＣ－ＭＳ分析によるＲ６－２およびＲ７－２生成の特定
生成された化合物を確認するために、生成した化合物を標準と比較するＬＣ－ＭＳ分析により解析し、それらの同一性を確認した。

【0203】

上記酵素生物変換由来の同じ試料をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラムを用いてＬＣ－ＭＳにより分析した。移動相Ａは、水中０．１％ギ酸、および移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ギ酸とした。流速は、０．６ｍｌ／分であった。試料の質量分析をＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、最適化された方法を用いて正イオンモードで実施した。

【0204】

化合物Ｒ６－２の分子式は、ｍ／ｚ １２９１．５４０１に［Ｍ＋Ｈ］^＋に対応する付加イオンを示すそのポジティブ高解像度（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３と推定された（図４）。Ｒ６－２の予測構造を図２に示す。

【0205】

化合物Ｒ７－２の分子式は、ｍ／ｚ １４５３．５９２１に［Ｍ＋Ｈ］^＋に対応する付加イオンを示すそのポジティブ高解像度（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ_６２Ｈ_１００Ｏ_３８と推定された（図５）。Ｒ７－２の予測構造を図２、６および７に示す。

【0206】

実施例３：Ｒ７－２の構造はＮＭＲにより分析された：
生成されたＲ７－２化合物を上述の半分取クロマトグラフィーにより精製した。

【0207】

ＨＲＭＳデータを、解像度を３０ｋに設定したＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲＭＳ測定器を用いて生成した。正イオンエレクトロスプレーモードで、ｍ／ｚ １５０～１５００のデータをスキャンした。ニードル電圧を４ｋＶに設定し、その他のソース条件は、シースガス＝２５、補助ガス＝０、スイープガス＝５（全てのガス流は任意単位）、キャピラリー電圧＝３０Ｖ、キャピラリー温度＝３００℃、チューブレンズ電圧＝７５であった。試料をピリジンで希釈し、５０マイクロリットルを注入した。

【0208】

ＮＭＲスペクトルは、標準パルスシーケンスを用いてＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＤＲＸ ５００ＭＨｚまたはＶａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ６００ＭＨｚ測定器により取得した。１Ｄ（^１Ｈおよび^１３Ｃ）および２Ｄ（ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＲＯＥＳＹ、およびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルをＣ_５Ｄ_５Ｎ中で実施した。

【0209】

化合物Ｒ７－２の分子式は、ｍ／ｚ １４７０．６２２２に［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋に対応する、およびｍ／ｚ １４７５．５７７４に［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対応する付加イオンを示すそのポジティブ高解像度（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ_６２Ｈ_１００Ｏ_３８と推定され、この組成は、^１３Ｃ ＮＭＲ、およびＨＳＱＣスペクトルデータにより裏付けられた。Ｒ７－２の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルでは、δ１．３３および１．３９に２つのｓｐ^３メチル一重線；環外二重結合のδ５．００および５．７４に一重線としての２つのオレフィンプロトン；δ０．７５－２．７４の間に、ステビア属から以前に単離されたｅｎｔ－カウレンジテルペノイドに特徴的な９つのｓｐ^３メチレンおよび２つのｓｐ^３メチンのプロトンの存在が示された。Ｒ７－２の酵素加水分解は、ＮＭＲスペクトルデータに基づいて、ステビオールと同一であることが明らかになった化合物を与えた（Ｏｈｔａｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９２）。Ｒ７－２の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルはまた、δ４．９９、５．０５、５．３５、５．３８、５．４３、５．８２、および６．４０で共鳴するアノマープロトンの存在も示し、その分子構造中に存在する７つの糖単位を示唆した。５％Ｈ_２ＳＯ_４によるＲ７－２の酸加水分解は、ＴＬＣによる標準試料との直接比較により特定されたＤ－グルコースを与え、その分子構造中に６個のグルコピラノシル部分の存在を示唆した（Ｂｅｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３；およびＨｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらに、Ｄ－グルコースの配置が、Ｌ－システインメチルエステルおよびＯ－トリルイソチオシアネートを用いて、その対応するチオカルバモイル－チアゾリジンカルボキシレート誘導体を調製することにより、およびその保持時間を標準ショ糖と文献に記載のように比較して、特定された（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。Ｒ７－２のＮＭＲスペクトルデータからの結果に基づいて、その構造中に、ステビオール部分に結合した７つのＤ－グルコシル単位が存在すると結論付けた。Ｒ７－２中のステビオールの基本骨格は、ＴＯＣＳＹ（Ｈ－１／Ｈ－２；Ｈ－２／Ｈ－３；Ｈ－５／Ｈ－６；Ｈ－６／Ｈ－７；Ｈ－９／Ｈ－１１；Ｈ－１１／Ｈ－１２）とＨＭＢＣ（Ｈ－１／Ｃ－２、Ｃ－１０；Ｈ－３／Ｃ－１、Ｃ－２、Ｃ－４、Ｃ－５、Ｃ－１８、Ｃ－１９；Ｈ－５／Ｃ－４、Ｃ－６、Ｃ－７、Ｃ－９、Ｃ－１０、Ｃ－１８、Ｃ－１９、Ｃ－２０；Ｈ－９／Ｃ－８、Ｃ－１０、Ｃ－１１、Ｃ－１２、Ｃ－１４、Ｃ－１５；Ｈ－１４／Ｃ－８、Ｃ－９、Ｃ－１３、Ｃ－１５、Ｃ－１６およびＨ－１７／Ｃ－１３、Ｃ－１５、Ｃ－１６）との相関により裏付けられた。

【0210】

Ｒ７－２中の全てのプロトンおよび炭素の^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ値は、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ相関に基づいて帰属され、表１に示される。

【0211】

Ｒ７－２の^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのレバウジオシドＤ３（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．２０１７）との厳密な比較は、この化合物が、Ｃ－１３ヒドロキシルに結合した４個のグルコシル部分を有し、そのうちの３個は２，３－分岐グルコトリオシル置換基としてエーテルの形で結合し、別の２，３－分岐グルコトリオシル部分はＣ－１９にエステルとして結合する、ステビオール配糖体でもあることを示唆した。Ｒ７－２の分子構造中で６個のグルコシル単位から成る上記データは、Ｃ－１３位置の２，３－分岐グルコトリオシル置換基上の追加のグルコシル部分の特定を残している。図８に示す重要なＴＯＣＳＹとＨＭＢＣとの相関に基づいて、７番目のグルコシル部分の配置を、レバウジオシドＤ３におけるような、ショ糖ＩＩのＣ－６位置に帰属させた。

【0212】

グルコシル部分の全ての７個のアノマープロトンに対して観察されたδ４．９９（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、５．０５（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、５．３５（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、５．３８（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、５．４３（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、５．８２（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、および６．４０（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）の大きな結合定数は、ステビオール配糖体に対し報告されたそれらのβ配向を示唆した。

【0213】

ＮＭＲおよびＨＲ質量スペクトルデータならびに加水分解試験に基づいて、レバウジオシドＤ３の酵素変換により生成されたＲ７－２の構造は、１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－６－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステルと推定された。

【0214】

Ｒ７－２（５００μｇ）を、ｐＨを４．５に維持することにより、５．０ｍｌの０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液中に溶解し、アスペルギルス・ニガー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来の１００ｕＬの粗製ペクチナーゼを加えた。混合物を５０℃で９６時間撹拌し、反応中に沈殿した生成物を濾過した後、固化させた。得られた生成物は、それらの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータによる比較によりステビオールとして特定された。

【0215】

Ｒ７－２（１ｍｇ）をＭｅＯＨ（８ｍｌ）に溶解し、５％のＨ_２ＳＯ_４（２５ｍＬ）を加えた。混合物を１６時間環流し、室温まで冷却した後、飽和炭酸ナトリウムで中和した。水相を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、２ｘ２５ｍｌ）で抽出し、水層を濃縮し、ＴＬＣ系：ＥｔＯＡｃ／ｎ－ブタノール／水（２：７：１）およびＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／水（１０：６：１）（Ｂｅｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を用いて標準ショ糖と比較し、Ｒ７－２中のショ糖をＤ－グルコースとして特定した。

【0216】

Ｒ７－２（１ｍｇ）を０．５ＭのＨＣｌ（１．５ｍＬ）で１．５時間加水分解した。冷却後、混合物をアンバーライトＩＲＡ４００カラムを通過させた後、溶出液を凍結乾燥した。残留物をピリジン（０．７５ｍＬ）に溶解し、Ｌ－システインメチルエステル塩酸塩（７．５ｍｇ）と共に６０℃で１．５時間加熱した後、Ｏ－トリルイソチオシアネート（３０ｕＬ）を混合物に加え、６０℃で追加の１．５時間加熱した。移動相：２５％アセトニトリル－水中０．２％ＴＦＡ、１ｍＬ／分の流量、２５０ｎｍでのＵＶ検出を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａカラム［Ｃ１８、１５０ｘ４．６ｍｍ（５ｕ）］により反応混合物のＨＰＬＣ分析を実施した。ショ糖をＤ－グルコース（ｔＲ、１２．７２）として特定した［標準試料、Ｄ－グルコース（ｔＲ、１２．６４）およびＬ－グルコース（ｔＲ、１１．４８分）］（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0217】

Ｒ７－２と命名された化合物をレバウジオシドＤ３の酵素生物変換により得た。Ｒ７－２の構造解明、および完全ＮＭＲスペクトル帰属（^１Ｈおよび^１３Ｃ）を、広範囲にわたる１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲならびに高解像度質量スペクトルデータおよび加水分解試験に基づいて実施し、これにより、構造が１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－６－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステルであるとして示唆された（図６）。

【0218】

実施例５：酵素生物変換による新規ステビオール配糖体Ｒ６－１の製造
全ての候補ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）遺伝子の完全長ＤＮＡフラグメントを商業的に合成した。ほとんど全てのｃＤＮＡのコドンを大腸菌にとって好ましいものに変更した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）。合成したＤＮＡを、細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅ Ｎ－Ｈｉｓ ＳＵＭＯ Ｋａｎベクターに挿入した（Ｌｕｃｉｇｅｎ）。

【0219】

各発現構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、続いてこれを、０．８～１．０のＯＤ６００に到達するまで、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地中３７℃で増殖させた。１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現を誘導し、培養物を１６℃で２２時間、さらに増殖させた。遠心分離（３，０００ｘｇ；１０分；４℃）により細胞を回収した。細胞ペレットを採集し、直ちに使用するか、あるいは－８０℃で貯蔵した。

【0220】

典型的な例では、細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５μｇ／ｍｌのリゾチーム、５μｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、および０．４％のトリトンＸ－１００）中に再懸濁した。４℃での超音波処理により細胞を破壊し、遠心分離（１８，０００ｘｇ；３０分）により細胞片を清澄化した。上清を平衡化（平衡化緩衝液：５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール）Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティカラムにロードした。タンパク質試料をロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して、非結合混入タンパク質を除去した。Ｈｉｓタグ化ＵＧＴ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する平衡化緩衝液により溶出した。

【0221】

レバウジオシドＤ（Ｒｅｂ Ｄ）を基質として用いて、精製された候補ＵＧＴ組換え型ポリペプチドのグリコシル化活性をアッセイした。通常、組換えポリペプチド（５０～１００μｇ）は２００μｌのインビトロ反応系で試験された。反応系は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍｇ／ｍｌのＲｅｂ Ｄ基質、および１ｍＭのＵＤＰ－グルコースまたはＵＤＰおよび／またはスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）および２５０ｍＭのスクロースを含有した。反応を３０～３７℃で実施し、種々の時点で２００μＬの１－ブタノールの添加により５０ｕｌの反応を終結させた。試料を２００μＬの１－ブタノールで３回抽出した。プールした画分を乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために１００μＬの８０％のメタノール中に溶解した。

【0222】

その後、ＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を含むＤｉｏｎｅｘ ＵＰＬＣ ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００システム（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて実施した。プールした試料中のステビオール配糖体のキャラクタリゼーションのためにガードカラムを有するＳｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用した。移動相Ａは水、および移動相Ｂはアセトニトリルである。ＨＰＬＣ分析で使用した検出波長は２１０ｎｍであった。

【0223】

活性スクリーニング後に、ＨＶ１（配列番号３）は、Ｒ６－１ステビオール配糖体を生成する強力な活性を有することが明らかになった（図９）。図１０に示されるように、ＨＶ１は、Ｒｅｂ ＤをＲ６－１に変換できる．より長い反応時間後（２４時間、図１０、パネルＣ）には、より多くのＲ６－１を製造できる。

【0224】

実施例６：ＬＣ－ＭＳ分析によるＲ６－１生成の特定
生成された化合物を確認するために、生成した化合物を標準と比較するＬＣ－ＭＳ分析により解析し、それらの同一性を確認した。

【0225】

上記酵素生物変換由来の同じ試料をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラムを用いてＬＣ－ＭＳにより分析した。移動相Ａは、水中０．１％ギ酸、および移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ギ酸とした。流速は、０．６ｍｌ／分であった。試料の質量分析をＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、最適化された方法を用いて正イオンモードで実施した。

【0226】

化合物Ｒ６－１の分子式は、ｍ／ｚ １２９１．５４３０に［Ｍ＋Ｈ］^＋およびｍ／ｚ １３１３．５２４５に［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対応する付加イオンを示すそのポジティブ高解像度（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３と推定された（図１１）。Ｒ６－１の予測構造を図９および図１２に示す。

【0227】

実施例７：Ｒ６－１の構造はＮＭＲにより分析された：
生成されたＲ６－１化合物を上述の半分取クロマトグラフィーにより精製した。
高解像度質量スペクトルデータを、解像度を３０ｋに設定したＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲＭＳ測定器を用いて生成した。正イオンエレクトロスプレーモードで、ｍ／ｚ １５０～１５００のデータをスキャンした。ニードル電圧を４ｋＶに設定し、その他のソース条件は、シースガス＝２５、補助ガス＝０、スイープガス＝５（全てのガス流は任意単位）、キャピラリー電圧＝３０Ｖ、キャピラリー温度＝３００℃、チューブレンズ電圧＝７５であった。試料をピリジンで希釈し、５０マイクロリットルを注入した。

【0228】

ＮＭＲスペクトルは、標準パルスシーケンスを用いてＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＤＲＸ ５００ＭＨｚまたはＶａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ６００ＭＨｚ測定器により取得した。１Ｄ（^１Ｈおよび^１３Ｃ）および２Ｄ（ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＲＯＥＳＹ、およびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルをＣ_５Ｄ_５Ｎ中で実施した。

【0229】

化合物Ｒ６－１の分子式は、ｍ／ｚ １３０８．５６９３および１３１３．５２３６に［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋および［Ｍ＋Ｎａ］^＋イオンにそれぞれ対応する付加イオンを示すそのポジティブ高解像度（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３と推定され、この組成は、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータにより裏付けられた。Ｒ６－１の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルでは、δ１．１２および１．４８に２つのｓｐ^３メチル一重線；環外二重結合のδ５．０１および５．６４に一重線としての２つのオレフィンプロトン；δ０．７４－２．８７の間に、ステビア属から以前に単離されたｅｎｔ－カウレンジテルペノイドに特徴的な９つのｓｐ^３メチレンおよび２つのｓｐ^３メチンのプロトンの存在が示された。ｅｎｔ－カウレンジテルペノイドの基本骨格は、ＴＯＣＳＹ（Ｈ－１／Ｈ－２；Ｈ－２／Ｈ－３；Ｈ－５／Ｈ－６；Ｈ－６／Ｈ－７；Ｈ－９／Ｈ－１１；Ｈ－１１／Ｈ－１２）とＨＭＢＣ（Ｈ－１／Ｃ－２、Ｃ－１０；Ｈ－３／Ｃ－１、Ｃ－２、Ｃ－４、Ｃ－５、Ｃ－１８、Ｃ－１９；Ｈ－５／Ｃ－４、Ｃ－６、Ｃ－７、Ｃ－９、Ｃ－１０、Ｃ－１８、Ｃ－１９、Ｃ－２０；Ｈ－９／Ｃ－８、Ｃ－１０、Ｃ－１１、Ｃ－１２、Ｃ－１４、Ｃ－１５；Ｈ－１４／Ｃ－８、Ｃ－９、Ｃ－１３、Ｃ－１５、Ｃ－１６およびＨ－１７／Ｃ－１３、Ｃ－１５、Ｃ－１６）との相関により裏付けられた。

【0230】

５％Ｈ_２ＳＯ_４によるＲ６－１の酸加水分解は、ＴＬＣによる標準試料との直接比較により特定されたＤ－グルコースを与え、その分子構造中に６個のグルコピラノシル部分の存在を示唆した（Ｂｅｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３；およびＨｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。Ｒ６－１の酵素加水分解は、ＮＭＲスペクトルデータに基づいて、ステビオールと同一であることが分かった化合物をもたらした（Ｏｈｔａｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９２）。Ｄ－グルコースの配置が、Ｌ－システインメチルエステルおよびＯ－トリルイソチオシアネートを用いて、その対応するチオカルバモイル－チアゾリジンカルボキシレート誘導体を調製することにより、およびその保持時間を標準ショ糖と文献に記載のように比較して、特定された（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。Ｒ６－１の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータに基づいて、その構造中に６個のグルコシル単位が存在すると結論付けられ、この構造は、その分子構造中の６個の糖単位を示唆する、δ５．０４、５．０５、５．２４、５．３７、５．５７、および６．３６で共鳴するアノマープロトンの存在を示したＲ６－１の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより裏付けられた。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのレバウジオシドＤとの厳密な比較は、化合物Ｒ６－１が、２，３－分岐グルコトリオシル置換基としてＣ－１３ヒドロキシルにエーテルとして結合した３個のグルコース残基、およびＣ－１９にエステルとして２置換グルコビオシル部分を有し、追加のグルコシル部分の帰属の割付けを残している、ステビオール配糖体でもあることを示唆した。図１３に示す重要なＴＯＣＳＹとＨＭＢＣとの相関は、ショ糖ＶのＣ－２位置での６番目のグルコシル部分の配置を示唆した。

【0231】

グルコース部分の６個のアノマープロトンに対して観察されたδ５．０４（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、５．０５（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、５．２４（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、５．３７（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、５．５７（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）および６．３６（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）の大きな結合定数は、ステビオール配糖体に対し報告されたそれらのβ配向を示唆した。

【0232】

Ｒ６－１中の全てのプロトンおよび炭素の^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ値は、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ相関に基づいて帰属され、表２に示される。

【0233】

ＮＭＲおよびＨＲ質量スペクトルデータならびに加水分解試験の結果に基づいて、レバウジオシドＤの酵素変換により生成されたＲ６－１の構造は、１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－［（２－Ｏ－｛２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル｝－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステルと推定された（図１２）。

【0234】

Ｒ６－１（２５０μｇ）を、ｐＨを４．５に維持することにより、２．５ｍｌの０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液中に溶解し、アスペルギルス・ニガー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来の５０μＬの粗製ペクチナーゼを加えた。混合物を５０℃で４８時間撹拌し、反応中に沈殿した生成物を濾過した後、結晶化させた。得られた生成物は、それらの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータによる比較によりステビオールとして特定された（Ｏｈｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。

【0235】

Ｒ６－１（５００μｇ）をＭｅＯＨ（３ｍｌ）に溶解し、５％のＨ_２ＳＯ_４（１０ｍＬ）を加えた。混合物を１６時間環流し、室温まで冷却した後、飽和炭酸ナトリウムで中和した。水相を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、２ｘ１５ｍｌ）で抽出し、水層を濃縮し、ＴＬＣ系：ＥｔＯＡｃ／ｎ－ブタノール／水（２：７：１）およびＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／水（１０：６：１）（Ｂｅｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を用いて標準ショ糖と比較し、Ｒ６－１中のショ糖をＤ－グルコースとして特定した。

【0236】

Ｒ６－１（５００μｇ）を０．５ＭのＨＣｌ（０．５ｍＬ）で１．５時間加水分解した。冷却後、混合物をアンバーライトＩＲＡ４００カラムを通過させた後、溶出液を凍結乾燥した。残留物をピリジン（０．２５ｍＬ）に溶解し、Ｌ－システインメチルエステル塩酸塩（２．５ｍｇ）と共に６０℃で１．５時間加熱した後、Ｏ－トリルイソチオシアネート（１２．５ｕＬ）を混合物に加え、６０℃で追加の１．５時間加熱した。移動相：２５％アセトニトリル－水中０．２％ＴＦＡ、１ｍＬ／分の流量、２５０ｎｍでのＵＶ検出を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａカラム［Ｃ１８、１５０ｘ４．６ｍｍ（５ｕ）］により反応混合物のＨＰＬＣ分析を実施した。ショ糖をＤ－グルコース（ｔＲ、１２．６４）として特定した［標準試料、Ｄ－グルコース（ｔＲ、１２．５４）およびＬ－グルコース（ｔＲ、１１．４２分）］（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0237】

Ｒ６－１の完全な^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル帰属を、広範囲にわたる１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲならびに高解像度質量スペクトルデータおよび加水分解に基づいて実施し、これにより、構造が１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－［（２－Ｏ－｛２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル］－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステルであるとして示唆された（図１２）。

【0238】

実施例８：酵素生物変換によるステビオール配糖体レバウジオシドＲ６－４ＡおよびレバウジオシドＲ６－４Ｂの製造
全ての候補ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）遺伝子の完全長ＤＮＡフラグメントを商業的に合成した。ほとんど全てのｃＤＮＡのコドンを大腸菌にとって好ましいものに変更した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）。合成したＤＮＡを、細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅ Ｎ－Ｈｉｓ ＳＵＭＯ Ｋａｎベクターに挿入した（Ｌｕｃｉｇｅｎ）。

【0239】

各発現構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、続いてこれを、０．８～１．０のＯＤ_６００に到達するまで、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地中３７℃で増殖させた。１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現を誘導し、培養物を１６℃で２２時間、さらに増殖させた。遠心分離（３，０００ｘｇ；１０分；４℃）により細胞を回収した。細胞ペレットを採集し、直ちに使用するか、あるいは－８０℃で貯蔵した。

【0240】

典型的な例では、細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５μｇ／ｍｌのリゾチーム、５μｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、および０．４％のトリトンＸ－１００）中に再懸濁した。４℃での超音波処理により細胞を破壊し、遠心分離（１８，０００ｘｇ；３０分）により細胞片を清澄化した。上清を平衡化（平衡化緩衝液：５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール）Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティカラムにロードした。タンパク質試料をロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して、非結合混入タンパク質を除去した。Ｈｉｓタグ化ＵＧＴ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する平衡化緩衝液により溶出した。

【0241】

レバウジオシドＺ（Ｒｅｂ Ｚ１およびＲｅｂ Ｚ２の混合物）を基質として使用して、精製された候補ＵＧＴ組換え型ポリペプチドのグリコシル化活性をアッセイした。通常、組換えポリペプチド（１０～５０μｇ）は２００μＬのインビトロ反応系で試験された。反応系は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌのＲｅｂ Ｚ基質、および１ｍＭのＵＤＰ－グルコースまたはＵＤＰおよび／またはスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）および２５０ｍＭのスクロースを含有した。反応を３０～３７℃で実施し、種々の時点で２００μＬの１－ブタノールの添加により５０ｕｌの反応を終結させた。試料を２００μＬの１－ブタノールで３回抽出した。プールした画分を乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために１００μＬの８０％のメタノール中に溶解した。

【0242】

その後、ＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を含むＤｉｏｎｅｘ ＵＰＬＣ ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００システム（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて実施した。プールした試料中のステビオール配糖体のキャラクタリゼーションのためにガードカラムを有するＳｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用した。ＨＰＬＣ分析における移動相溶液としてアセトニトリルおよび水を使用した。ＨＰＬＣ分析で使用した検出波長は２１０ｎｍであった。

【0243】

活性スクリーニング後に、ＨＶ１（配列番号３）は、Ｒ６－４ステビオール配糖体を生成する強力な活性を有することが明らかになった（図１４）。図１５に示されるように、ＨＶ１は、Ｒｅｂ ＺをＲ６－４に変換できる．より後の反応時間後には、より多くのＲ６－４を製造できる（図１５、パネルＣ）。

【0244】

実施例９：ＬＣ－ＭＳ分析によるＲ６－４生成の特定
生成された化合物を確認するために、生成した化合物を標準と比較するＬＣ－ＭＳ分析により解析し、それらの同一性を確認した。

【0245】

上記酵素生物変換由来の同じ試料をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラムを用いてＬＣ－ＭＳにより分析した。移動相Ａは、水中０．１％ギ酸、および移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ギ酸とした。流速は、０．６ｍｌ／分であった。試料の質量分析をＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、最適化された方法を用いて正イオンモードで実施した。

【0246】

化合物Ｒ６－４の分子式は、ｍ／ｚ １３１３．５２４２に［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対応する付加イオンを示すそのポジティブ高解像度（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３と推定された（図１６）。Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂの予測構造を図１４および１７に示す。

【0247】

実施例１０：Ｒ６－４の構造はＮＭＲにより分析された：
生成されたＲ６－４化合物を上述の半分取クロマトグラフィーにより精製した。
ＨＲＭＳデータを、解像度を３０ｋに設定したＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲＭＳ測定器を用いて生成した。正イオンエレクトロスプレーモードで、ｍ／ｚ １５０～１５００のデータをスキャンした。ニードル電圧を４ｋＶに設定し、その他のソース条件は、シースガス＝２５、補助ガス＝０、スイープガス＝５（全てのガス流は任意単位）、キャピラリー電圧＝３０Ｖ、キャピラリー温度＝３００℃、チューブレンズ電圧＝７５であった。試料をピリジンで希釈し、５０マイクロリットルを注入した。

【0248】

ＮＭＲスペクトルは、標準パルスシーケンスを用いてＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＤＲＸ ５００ＭＨｚまたはＶａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ６００ＭＨｚ測定器により取得した。１Ｄ（^１Ｈおよび^１３Ｃ）および２Ｄ（ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＲＯＥＳＹ、およびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルをＣ_５Ｄ_５Ｎ中で実施した。

【0249】

化合物Ｒ６－４化合物の分子式は、ｍ／ｚ １３０８．５６９２および１３１３．５２３７に［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋および［Ｍ＋Ｎａ］^＋イオンにそれぞれ対応する付加イオンを示すそのポジティブ高解像度（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ_５６Ｈ_９０Ｏ_３３と推定され、この組成は、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータにより裏付けられた。Ｒ６－４のＮＭＲスペクトルデータおよびＨＰＬＣは、この化合物が、２種の主要化合物Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂの約７０：３０の比率の混合物であることを示し、そのため、Ｒ６－４の^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータは、その分子構造中に存在する大部分のプロトンおよび炭素に対し、２つのピークを示した。Ｒ６－４の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルでは、２つのｓｐ^３メチル一重線；環外二重結合の一重線としての２つのオレフィンプロトン；ステビア属から以前に単離されたｅｎｔ－カウレンジテルペノイドに特徴的な９つのｓｐ^３メチレンおよび２つのｓｐ^３メチンのプロトンの存在が示された。Ｒ６－４の酵素加水分解は、ＮＭＲスペクトルデータに基づいて、ステビオールと同一であることが分かった化合物が得られた（Ｏｈｔａｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９２）。 ５％Ｈ_２ＳＯ_４によるＲ６－４の酸加水分解は、ＴＬＣによる標準試料との直接比較により特定されたＤ－グルコースを与え、その分子構造中に６個のグルコピラノシル部分の存在を示唆した（Ｂｅｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３；およびＨｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。Ｄ－グルコースの配置が、Ｌ－システインメチルエステルおよびＯ－トリルイソチオシアネートを用いて、その対応するチオカルバモイル－チアゾリジンカルボキシレート誘導体を調製することにより、およびその保持時間を標準ショ糖と文献に記載のように比較して、特定された（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＮＭＲスペクトルデータおよび加水分解試験に基づいて、Ｒ６－４の分子構造中に６個のグルコシル単位が存在すると結論付けられ、この構造は、その分子構造中のδ５．０３－６．４４間で共鳴する６個のアノマープロトンを示した^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより裏付けられた。さらに、グルコシル部分の６個全てのアノマープロトンに対して観察された大きな結合定数は、ステビオール配糖体に対し報告されたそれらのβ配向を示唆した。

【0250】

Ｒ６－４ＡおよびＲ６－４Ｂの全てのプロトンおよび炭素の^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ値は、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣおよびＲＯＥＳＹ相関に基づいて帰属され、表３に示される。

【0251】

^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのレバウジオシドＺ（Ｒｅｂ Ｚ１およびＲｅｂ Ｚ２の混合物）との、ならびに重要なＴＯＣＳＹ、ＲＯＥＳＹおよびＨＭＢＣ相関からの厳密な比較は、Ｒ６－４化合物が、２種のステビオール配糖体の混合物であり、その主要な化合物は、エーテルとしてＣ－１３ヒドロキシルに結合した３個のグリコシル単位およびＲ６－４Ａで示されるようなＣ－１９にエステルとして別の３個のグリコシル単位を有し、一方、より少ない方の化合物は、Ｃ－１３ヒドロキシルにエーテルとして結合した２個のグリコシル単位およびＲ６－４Ｂに示されるＣ－１９にエステルとして４個のグリコシル単位を有することを示唆した。

【0252】

ＮＭＲおよびＨＲ質量スペクトルデータならびに加水分解試験の結果に基づいて、レバウジオシドＺの酵素変換により生成されたＲ６－４の構造は、１３－［（２－Ｏ－｛２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル｝－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－［（２－Ｏ－｛２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル｝－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステル（Ｒ６－４Ａ）または１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ－カウラ－１６－エン－１９－酸－［（２－Ｏ－［（２－Ｏ－｛２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル｝－β－Ｄ－グルコピラノシル）－β－Ｄ－グルコピラノシル）エステル（Ｒ６－４Ｂ）と推定された（図１７）。

【0253】

Ｒ６－４化合物（１ｍｇ）を、ｐＨを４．５に維持することにより、１０ｍｌの０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液中に溶解し、アスペルギルス・ニガー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来の２５０ｕＬの粗製ペクチナーゼを加えた。混合物を５０℃で４８時間撹拌し、反応中に沈殿した生成物を濾過した後、固化させた。得られた生成物は、それらの１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータおよび同時ＴＬＣによる比較によりステビオールとして特定された（Ｏｈｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。

【0254】

Ｒ６－４化合物（５００μｇ）をＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、５％のＨ_２ＳＯ_４（１５ｍＬ）を加えた。混合物を２４時間環流し、室温まで冷却した後、飽和炭酸ナトリウムで中和した。水相を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、２ｘ２５ｍｌ）で抽出し、水層を濃縮し、ＴＬＣ系：ＥｔＯＡｃ／ｎ－ブタノール／水（２：７：１）およびＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／水（１０：６：１）（Ｂｅｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を用いて標準ショ糖と比較し、Ｒ６－４中のショ糖をＤ－グルコースとして特定した。

【0255】

Ｒ６－４化合物（１ｍｇ）を０．５ＭのＨＣｌ（２ｍＬ）で１．５時間加水分解した。冷却後、混合物をアンバーライトＩＲＡ４００カラムに通過させた後、溶出液を凍結乾燥した。残留物をピリジン（０．７５ｍＬ）に溶解し、Ｌ－システインメチルエステル塩酸塩（５ｍｇ）と共に６０℃で１．５時間加熱した後、Ｏ－トリルイソチオシアネート（３０μＬ）を混合物に加え、６０℃で追加の１．５時間加熱した。移動相：２５％アセトニトリル－水中０．２％ＴＦＡ、１ｍＬ／分の流量、２５０ｎｍでのＵＶ検出を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａカラム［Ｃ１８、１５０ｘ４．６ｍｍ（５ｕ）］により反応混合物のＨＰＬＣ分析を実施した。ショ糖をＤ－グルコース（ｔＲ、１２．３８）として特定した［標準試料、Ｄ－グルコース（ｔＲ、１２．４４）およびＬ－グルコース（ｔＲ、１１．３０分）］（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0256】

配列：
ＵＧＴ７６Ｇ１：アミノ酸配列（配列番号１）
ＭＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＬＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬ

ＵＧＴ７６Ｇ１：ＤＮＡ配列（配列番号２）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＴＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＡＧＡＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＡＴＣＣＧＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＴＡＧＣＡＡＡＣＧＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＡＧＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＣＧＴＡＴＣＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＴＡＣＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＡＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＧＴＣＧＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＡＣＴＧＡＴＧＣＧＣＴＴＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＧＣＡＧＡＣＴＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＣＣＧＣＡＡＴＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＣＧＣＧＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＡＧＣＧＣＴＴＡＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＣＧＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＡＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＴＣＴＴＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＴＡＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＴＣＧＴＣＡＧＴＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＧＧＧＡＴＴＣＧＴＴＡＡＧＧＧＣＴＣＧＡＣＧＴＧＧＧＴＣＧＡＧＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＴＣＧＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＧＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＧＣＴＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＴＧＧＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＴＡＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＡＣＧＴＣＡＧＡＡＣＧＣＴＣＧＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＣＣＣＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＡＡＧＣＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＡＡ

ＨＶ１ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ：アミノ酸配列（配列番号３）
ＭＤＧＮＳＳＳＳＰＬＨＶＶＩＣＰＷＬＡＬＧＨＬＬＰＣＬＤＩＡＥＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＡＲＬＰＰＬＲＰＡＶＡＰＬＶＤＦＶＡＬＰＬＰＨＶＤＧＬＰＥＧＡＥＳＴＮＤＶＰＹＤＫＦＥＬＨＲＫＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＲＡＡＣＡＥＧＡＧＳＲＰＤＷＬＩＶＤＴＦＨＨＷＡＡＡＡＡＶＥＮＫＶＰＣＶＭＬＬＬＧＡＡＴＶＩＡＧＦＡＲＧＶＳＥＨＡＡＡＡＶＧＫＥＲＰＡＡＥＡＰＳＦＥＴＥＲＲＫＬＭＴＴＱＮＡＳＧＭＴＶＡＥＲＹＦＬＴＬＭＲＳＤＬＶＡＩＲＳＣＡＥＷＥＰＥＳＶＡＡＬＴＴＬＡＧＫＰＶＶＰＬＧＬＬＰＰＳＰＥＧＧＲＧＶＳＫＥＤＡＡＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＲＡＥＱＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＳＧＡＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＤＡＰＤＡＡＶＬＰＰＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＬＶＶＴＧＷＶＰＱＩＧＶＬＡＨＧＡＶＡＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＬＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＳＳＤＱＧＰＮＡＲＬＭＥＧＲＫＶＧＭＱＶＰＲＤＥＳＤＧＳＦＲＲＥＤＶＡＡＴＶＲＡＶＡＶＥＥＤＧＲＲＶＦＴＡＮＡＫＫＭＱＥＩＶＡＤＧＡＣＨＥＲＣＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＡ

ＨＶ１ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ：ＤＮＡ配列（配列番号４）
ＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＣＣＧＣＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣＧＴＣＧＣＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＴＧＴＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＧＴＡＴＧＡＣＡＡＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＧＴＡＡＧＧＣＧＴＴＣＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＧＣＣＣＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＡＧＣＧＡＡＣＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＡＡＡＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＧＣＴＣＴＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＣＧＴＧＧＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＴＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧＣＡＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＡＣＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＣＣＧＡＴＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣＧＣＡＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡＣＧＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＧＴＣＡＴＣＣＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＡＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＴＡＡＡＧＴＣＧＧＴＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＧＣＣＡＣＧＡＡＣＧＴＴＧＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＴＡＡ

ＵＧＴ７６Ｇ１－スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）融合酵素：アミノ酸配列（配列番号５）
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ＵＧＴ７６Ｇ１－スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）融合酵素：ＤＮＡ配列（配列番号６）
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ＨＶ１－ＳＵＳ融合酵素：アミノ酸配列（配列番号７）
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ＨＶ１－ＳＵＳ融合酵素：ＤＮＡ配列（配列番号８）ＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＣＣＧＣＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣＧＴＣＧＣＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＴＧＴＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＧＴＡＴＧＡＣＡＡＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＧＴＡＡＧＧＣＧＴＴＣＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＧＣＣＣＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＡＧＣＧＡＡＣＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＡＡＡＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＧＣＴＣＴＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＣＧＴＧＧＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＴＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧＣＡＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＡＣＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＣＣＧＡＴＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣＧＣＡＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡＣＧＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＧＴＣＡＴＣＣＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＡＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＴＡＡＡＧＴＣＧＧＴＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＧＣＣＡＣＧＡＡＣＧＴＴＧＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＧＣＧＣＧＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＧＡＡＣＧＡＡＡＣＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＡＧＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＣＴＴＡＣＧＡＧＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＴＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＴＡＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＣＧＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＣＧＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣＣＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＴＴＴＡＴＣＧＧＣＴＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＡＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＣＴＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＡＡＧＴＣＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＴＴＧＡＧＡＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＴＡＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＡＧＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＧＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＣＣＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＴＴＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＴＡＴＣＧＡＧＴＴＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＡＴＧＴＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＴＧＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＧＧＣＴＴＧＡＴＣＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＴＣＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＴＧＧＴＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＧＣＴＡＡＣＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＧＧＴＣＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＴＧＣＡＣＧＧＴＡＡＡＴＣＧＧＧＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＣＡＣＴＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＴＣＧＡＡＣＣＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＴＧＡＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＣＴＡＴＧＣＡＴＴＧＡＡＧＴＡＴＣＧＣＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡ

シロイヌナズナスクロースシンターゼＩ：アミノ酸配列（配列番号９）
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シロイヌナズナスクロースシンターゼＩ：ＤＮＡ配列（配列番号１０）
ＡＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＣＣＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＣＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＣＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＴＡＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＴＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＧＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＴＡＴＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＡＣＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＣＡＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＡＣＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＡＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＧＴＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＧＣＧＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＣＣＧＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣＧＣＧＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＴＧＣＧＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＴＧＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＡＴＴＧＣＡＣＡＣＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＣＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＣＡＴＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴＴＣＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧＴＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＧＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＧＴＣＧＣＣＴＧＡＣＧＡＡＡＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＧＣＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＣＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＴＧＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＣＣＧＴＡＴＣＡＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＧＡＡＧＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＴＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＣＧＴＣＴＡＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＣＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＧＣＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＴＡＡ

【表1】

^ａ帰属は、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＲＯＥＳＹおよびＨＭＢＣ相関に基づいてなされた；^ｂ化学シフト値はδ（ｐｐｍ）；^ｃ結合定数はＨｚ単位。

【表2】

^ａ帰属は、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＲＯＥＳＹおよびＨＭＢＣ相関に基づいてなされた；^ｂ化学シフト値はδ（ｐｐｍ）；^ｃ結合定数はＨｚ単位。

【表3】

^ａ帰属は、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＲＯＥＳＹおよびＨＭＢＣ相関に基づいてなされた；^ｂ化学シフト値はδ（ｐｐｍ）；^ｃ結合定数はＨｚ単位。

【0257】

産業上の利用可能性／技術分野の記述
本開示は、食品、飼料、飲料、および薬理学的な産業における適用性を有する。本開示は、一般に、酵素および／または改変された微生物株による特定のステビオール配糖体の生合成製造法および食品および飲料のための甘味料ならびに関連組成物としてのそれらの利用可能性に関する。

【0258】

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【0259】

本明細書、例えば、背景技術、発明の概要、発明を実施するための形態、実施例、および／または参考文献セクションで言及された、全ての刊行物、特許、特許出願、広報、およびデータベース項目（例えば、配列データベース項目）は、あたかも、各個別の刊行物、特許、特許出願、特許出願広報、およびデータベース項目が具体的に、個別に参照により本明細書に組み込まれるように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、本明細書のいずれかの定義を含めた本出願が優先する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【手続補正書】

【提出日】2021-08-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022513480000001.app

【国際調査報告】