特表 2022-513548 ミクロバクテリウム・パラオキシダンス、その広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤の調製方法、及び応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(54)【発明の名称】ミクロバクテリウム・パラオキシダンス、その広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤の調製方法、及び応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220202BHJP

   C05G 3/00 20200101ALI20220202BHJP

   C12N 9/00 20060101ALN20220202BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

C12N1/20 D

C12N1/20 F

C05G3/00 Z

C12N9/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021501333

(86)(22)【出願日】2019-07-02

(85)【翻訳文提出日】2021-01-08

(86)【国際出願番号】 CN2019094295

(87)【国際公開番号】W WO2020011052

(87)【国際公開日】2020-01-16

(31)【優先権主張番号】201810747535.3

(32)【優先日】2018-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521014711

【氏名又は名称】山東省科学院生態研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】季 蕾

(72)【発明者】

【氏名】張 強

(72)【発明者】

【氏名】傅 暁文

(72)【発明者】

【氏名】王 加寧

(72)【発明者】

【氏名】陳 貫虹

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4H061

【Ｆターム（参考）】

4B050DD02

4B050EE10

4B050LL05

4B065AA32X

4B065AC14

4B065CA27

4B065CA54

4H061AA01

4H061EE66

4H061FF02

4H061GG48

4H061JJ03

(57)【要約】

ミクロバクテリウム・パラオキシダンス、その広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤の調製方法、及び応用に関する。ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２は、２０１８年０６月０１日に、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに預けられ、菌種の受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５８３６である。ミクロバクテリウム・パラオキシダンスＥＣＯ－２株をビフェニルである単一基質で誘導培養して得た細胞内複合酵素が、好気性条件で、ＰＣＢ２８、ＰＣＢ１０１及び／又はＰＣＢ１１４などの低塩素化・過塩素化ＰＣＢｓを分解することができ、酵素製剤は、分解スペクトルが広く、単一誘導培養では単一の成分しか分解できないという従来の公知のものと明らかに異なり、応用の将来性が期待できる。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２０１８年０６月０１日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所）に預けられた菌種（受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５８３６）である
ことを特徴とするミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２。

【請求項2】

請求項１に記載のミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２の培養方法であって、
ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２株を固体活性化培地に画線し、活性化培養して、活性化済み株を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた活性化済み株を液体培地に接種し、振とう培養して、種液を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた種液を、２％～１０％の体積パーセントで拡大培地に移し替え、拡大培養して、菌液を得るステップ（３）とを含む
ことを特徴とする培養方法。

【請求項3】

前記ステップ（１）において、固体活性化培地はＬＢ固体培地であり、組成は、
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天２０ｇであり、水で１Ｌに定容し、自然な状態でのｐＨであり、
好ましくは、前記ステップ（１）において、活性化条件は、２８～３７℃で、１～２日間倒置培養することである
請求項２に記載の培養方法。

【請求項4】

前記ステップ（２）における液体培地とステップ（３）における拡大培地はいずれもＬＢ液体培地であり、組成は、
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇであり、水で１Ｌに定容し、自然な状態でのｐＨであり、
好ましくは、前記ステップ（２）における振とう培養条件は、２８～３７℃で、回転速度１００～２００回転／分の条件で、１～２日間振とう培養することである
請求項２に記載の培養方法。

【請求項5】

前記ステップ（３）における拡大培養条件は、２８～３７℃で、溶存酸素２０～７０％の条件で、１～２日間拡大培養することである
請求項２に記載の培養方法。

【請求項6】

請求項１に記載のミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２の応用であって、
ポリ塩化ビフェニル汚染土壌を修復する酵素製剤の調製における応用である
ことを特徴とする応用。

【請求項7】

ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２の菌液を、１～１０％の体積パーセントで、濃度０．３～０．８ｇ／Ｌのビフェニルを含む無機塩培地である無機塩誘導培地に接種し、温度２８～３７℃、回転速度１００～２００回転／分の条件で、３～５日間誘導培養して、誘導済みミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２菌液を得るステップ（ｉ）と、
ステップ（ｉ）で得られた誘導済みミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２菌液を固液分離し、菌体をリン酸緩衝液に懸濁し、細胞破砕を行い、さらに４～２５℃の条件で固液分離し、上澄み液を採取して、酵素製剤を得るステップ（ｉｉ）とを含む
請求項６に記載の応用。

【請求項8】

前記ステップ（ｉ）において、１リットルあたりの無機塩培地の組成は、
リン酸二水素カリウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、塩化ナトリウム０．２ｇ、硫酸アンモニウム１．０ｇ、ペプトン２．０ｇで、ｐＨ７．０であり、
好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）において、固液分離は３０００～１００００回転／分の条件で２～１０分間遠心分離することであり、
好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）において、細胞破砕は高圧ホモジナイズ細胞破砕法を採用することであり、
好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）において、リン酸緩衝液はｐＨ５．０～８．０のリン酸緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液の使用量は５～５０倍容量である
請求項７に記載の応用。

【請求項9】

請求項８で得られた酵素製剤の応用であって、
ポリ塩化ビフェニル汚染土壌の修復における応答である
ことを特徴とする応用。

【請求項10】

前記ポリ塩化ビフェニルは、２，４，４’－トリクロロビフェニル、２，２’，４，５，５’－ペンタクロロビフェニル及び／又は２，３，４，４’，５－ペンタクロロビフェニルである
請求項９に記載の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミクロバクテリウム・パラオキシダンス、その広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤の調製方法、及び応用に関し、微生物の技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

持続性有機汚染物質であるポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）は、高毒性、生物蓄積性及び長距離移動性を有し、半減期が長く、土壌、水生生態系や飲用水源をひどく汚染し、奇形や癌の原因となる。ＰＣＢｓ汚染に引き起こされた台湾油症事件や日本カネミ油症事件はいずれも深刻な生命と財産の損失をもたらした。ＰＣＢｓは熱的・化学的安定性、難燃性、絶縁性及び耐酸化性のため、化学工業、電力、電子及び機械の産業に広く応用されており、現在、中国のＰＣＢｓ及びその汚染物質の現存量は多く、電子廃棄物や工業用地移転により大量のＰＣＢｓ汚染用地が生じている。２０１５年、環境保護部は国家環境保護基準（ＨＪ７４３－２０１５）『土壌及び堆積物中のポリ塩化ビフェニル測定用のガスクロマトグラフィー－質量分析法』を発表し、土壌及び堆積物中のＰＣＢｓの測定方法を規範化した。ＰＣＢｓ汚染を適時かつ効果的に処置し、環境を保護し、人体の健康を保障することはすでに急務となっている。ＰＣＢｓ異性体は多様性を有し、コプレーナ構造のＰＣＢｓはダイオキシンと類似した毒性を有し、指標となるＰＣＢｓは国連ＧＥＭＳ／ＦＯＯＤにＰＣＢｓ汚染状況をモニタリングするための指標として規定されているモノマーであり、環境中の主なＰＣＢｓ汚染物質であるトリクロロビフェニルＰＣＢ２８、ペンタクロロビフェニルＰＣＢ１０１はいずれもその代表的な化合物である。

【0003】

ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）は熱的・化学的安定性、難燃性、絶縁性及び耐酸化性を持っているので、化学工業、電力、電子及び機械の産業に広く応用されており、用途は主に絶縁油、難燃剤、熱伝導剤、作動油、可塑剤、鉄道用変圧器、鉱山用設備、電磁設備、カーボンレス炭化紙、顔料、ワックス添加剤、除塵剤、殺虫剤添加剤、潤滑剤、切削油、シーリング剤、閉塞剤を含む。中国では、ポリ塩化ビフェニルの長年にわたる累積生産量は１万トン近くであり、８０年代の初めに中国国内は基本的にその生産を停止したが、一部の先進国からＰＣＢｓを含む電力コンデンサ、電力変圧器を輸入し、また９０年代後に国外は主に電子廃棄物を通じて中国にポリ塩化ビフェニルを輸入したため、現在、中国のＰＣＢｓ及びその汚染物の現存量は依然として非常に多く、工業用地移転のため大量のＰＣＢｓ汚染用地が存在している。ＰＣＢｓは廃棄物の排出、貯油タンクの漏れ、揮発や乾式、湿式沈降などの原因で土壌や水環境に侵入し、土壌、水生生態系や飲用水源に深刻な汚染をもたらし、また、ＰＣＢｓに対する管理が不十分で、処置や保管が不適切であると相まって、ＰＣＢｓの二次汚染及び持続性汚染の問題はかなり深刻である。

【0004】

特許文献１；中国特許１０７２８７１３４Ａ（出願番号２０１７１０５０８６５２．Ｘ）には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＥＣＯ－１株が開示されており、２０１７年３月３１日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに預けられ、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１３９６０である。本発明は、ＰＯＰｓ汚染土壌からシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＥＣＯ－１株を初めて単離し、この株を用いて、ポリ塩化ビフェニル、アトラジンを効率よく分解することができる二機能性酵素製剤を初めて製造し、この酵素製剤は、特に好気性条件では分解しにくい高塩素化ポリ塩化ビフェニルに対して分解活性が顕著であり、従来知られているシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）やその酵素製剤とは全く機能が異なり、大量生産への応用が期待される。

【0005】

しかし、上記株は、処理速度及び処理できるポリ塩化ビフェニルの種類に関しては、まだ実際の処理のニーズを満たすことができず、好気性条件でＰＣＢｓ複合汚染に対する迅速な修復は、現在の研究の焦点となっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】中国特許１０７２８７１３４Ａ（出願番号２０１７１０５０８６５２．Ｘ）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来技術の欠陥に対して、ミクロバクテリウム・パラオキシダンス、その広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤の調製方法、及び応用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の技術案は以下のとおりである。

【0009】

２０１８年０６月０１日に、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所）に預けられ、菌種の受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５８３６であるミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２。

【0010】

この株の純培養されたモノクローナルの形態としては、図１に示すように、コロニーは黄色であり、且つエッジや表面が滑らかであり、円形をしている。

【0011】

上記株の培養方法は、
ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２株を固体活性化培地に画線し、活性化培養して、活性化済み株を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた活性化済み株を液体培地に接種し、振とう培養して、種液を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた種液を、２％～１０％の体積パーセントで拡大培地に移し替え、拡大培養して、菌液を得るステップ（３）とを含む。

【0012】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（１）において、固体活性化培地はＬＢ固体培地であり、組成は、
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天２０ｇであり、水で１Ｌに定容し、自然な状態でのｐＨである。

【0013】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（１）において、活性化条件は、２８～３７℃で、１～２日間倒置培養することである。

【0014】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（２）における液体培地とステップ（３）における拡大培地はいずれもＬＢ液体培地であり、組成は、
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇであり、水で１Ｌに定容し、自然な状態でのｐＨである。

【0015】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（２）における振とう培養条件は、２８～３７℃で、回転速度１００～２００回転／分の条件で、１～２日間振とう培養することである。

【0016】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（３）における拡大培養条件は、２８～３７℃で、溶存酸素２０～７０％の条件で、１～２日間拡大培養することである。

【0017】

ポリ塩化ビフェニル汚染土壌を修復する酵素製剤の調製における、上記ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２の応用。

【0018】

上記応用は、
ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２の菌液を、１～１０％の体積パーセントで、濃度０．３～０．８ｇ／Ｌのビフェニルを含む無機塩培地である無機塩誘導培地に接種し、温度２８～３７℃、回転速度１００～２００回転／分の条件で、３～５日間誘導培養して、誘導済みミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２菌液を得るステップ（ｉ）と、
ステップ（ｉ）で得られた誘導済みミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２菌液を固液分離し、菌体をリン酸緩衝液に懸濁し、細胞破砕を行い、さらに４～２５℃の条件で固液分離し、上澄み液を採取して、酵素製剤を得るステップ（ｉｉ）とを含む。

【0019】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（ｉ）において、１リットルあたりの無機塩培地の組成は、
リン酸二水素カリウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、塩化ナトリウム０．２ｇ、硫酸アンモニウム１．０ｇ、ペプトン２．０ｇで、ｐＨ７．０である。

【0020】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）において、固液分離は３０００～１００００回転／分の条件で２～１０分間遠心分離することである。

【0021】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）において、細胞破砕は高圧ホモジナイズ細胞破砕法を採用することである。

【0022】

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）において、リン酸緩衝液はｐＨ５．０～８．０のリン酸緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液の使用量は５～５０倍容量である。

【0023】

ポリ塩化ビフェニル汚染土壌の修復における、上記酵素製剤の応用。

【0024】

本発明によれば、好ましくは、前記ポリ塩化ビフェニルは、２，４，４’－トリクロロビフェニル（ＰＣＢ２８）、２，２’，４，５，５’－ペンタクロロビフェニル（ＰＣＢ１０１）及び／又は２，３，４，４’，５－ペンタクロロビフェニル（ＰＣＢ１１４）である。

【発明の効果】

【0025】

１、本発明では、ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２株が初めて開示されており、ビフェニルである単一基質で誘導培養して得た細胞内複合酵素は、好気性条件で、ＰＣＢ２８、ＰＣＢ１０１及び／又はＰＣＢ１１４などの低塩素化・過塩素化ＰＣＢｓを分解することができ、酵素製剤は、分解スペクトルが広く、単一誘導培養では単一の成分しか分解できないという従来の公知のものと明らかに異なり、物理的・化学的処理方法に比べて、環境により優しく、そして大規模で取り扱うのが便利であり、微生物方法に比べて、分解速度が高く、修復周期を短縮させ、分解効率を高め、応用の将来性が期待できる。
２、ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２を用いて調製した広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤は、コプレーナ構造のＰＣＢ１１４、及び環境汚染指標であるトリクロロビフェニルＰＣＢ２８、ペンタクロロビフェニルＰＣＢ１０１のいずれに対しても分解活性が高く、ペンタクロロビフェニルＰＣＢ１０１に対する分解率が１００％に達し、適用範囲が広く、しかも、調製時に毒性のより高い過塩素化ＰＣＢｓを誘導のために用いる必要がなく、このため、調製プロセスがシンプルであり、大量生産への応用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２株の純培養されたモノクローナル形態の写真

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、実施例にて本発明の技術案をさらに説明するが、本発明の特許範囲はそれに制限されない。

【0028】

生物の由来
ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２は、２０１８年０６月０１日に、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所）に預けられ、菌種の受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５８３６である。

【0029】

培地
ＬＢ固体培地では、１リットルあたりの組成は以下のとおりである。
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天２０ｇ、水で１Ｌに定容、自然な状態でのｐＨ
ＬＢ液体培地では、１リットルあたりの組成は以下のとおりである。
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、水で１Ｌに定容、自然な状態でのｐＨ
無機塩培地では、１リットルあたりの組成は以下のとおりである。
リン酸二水素カリウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、塩化ナトリウム０．２ｇ、硫酸アンモニウム１．０ｇ、ペプトン２．０ｇ、水で１Ｌに定容、ｐＨ７．０。

【0030】

実施例１
ＰＯＰｓ汚染土壤浸出液を準備し、それぞれ濃度１０^－１、１０^－２、１０^－３、１０^－４、１０^－５という５つの濃度勾配に希釈した。希釈した菌懸濁液をビフェニル含有固体培地に塗布し、３０℃で１～３日間培養した。成長速度が高く、典型的な形態を持っている細菌コロニーを選択して、３回の平板画線により分離精製した后、単一コロニーを無機塩液体培地に取り、３０℃、１５０回転／分で３日間培養し、培養物１．５ｍＬにグリセリン０．５ｍＬを加えて均一に混合した後、－８０℃の冷蔵庫で長期的に保管した。

【0031】

菌懸濁液が塗布される固体培地はＬＢ固体培地であり、組成は以下のとおりである。
ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天２０ｇ、水で１Ｌに定容、自然な状態でのｐＨ。

【0032】

単一コロニーを培養するための無機塩液体培地の組成は以下のとおりである。
リン酸二水素カリウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、塩化ナトリウム０．２ｇ、硫酸アンモニウム１．０ｇ、ペプトン２．０ｇ、水で１Ｌに定容、ｐＨ７．０。

【0033】

上記で得られた株を、それぞれ濃度２５ｍｇ／Ｌのポリ塩化ビフェニルＰＣＢ２８（２，４，４’－トリクロロビフェニル）、ＰＣＢ１０１（２，２’，４，５，５’－ペンタクロロビフェニル）、ＰＣＢ１１４（２，３，４，４’，５－ペンタクロロビフェニル）を含有する無機塩液体培地に接種し、１５０回転／分、３０℃で７２ｈ培養し、菌液の濁りの状況を観察し、菌懸濁液について６００ｎｍでの吸光値を検出した。上記指標に基づいて酵素産生株を選択した。吸光値が最高の株をＬＢ固体培地に取って培養し、ＥＣＯ－２として保存した。

【0034】

モノクローナルを青島▲チン▼科梓熙生物技術有限公司に送ってシーケンシングを行い、検出したところ、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列が１３５７ｂｐ含有され、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すとおりであり、菌種を同定したところ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓであり、ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２と命名し、２０１８年０６月０１日に、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所）に預け、菌種の受託号をＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５８３６とした。

【0035】

菌種の同定は以下のとおりである。
サンプル：細菌の菌液
細菌ゲノムのＤＮＡ抽出キット：天根生化科技（北京）有限公司、ＤＰ３０２
ＴＡＥ緩衝液（５０×、１Ｌ）：Ｔｒｉｓ ２４２ｇ、氷酢酸５７．１ｍｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ ３７．２ｇ、１Ｌまで水添加
アガロース：ＢＩＯＷＥＴ、ＡＧＡＲＯＳＥ Ｇ－１０
２×Ｐｆｕ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、Ｄ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、核酸染料、ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ等：天根生化科技（北京）有限公司
ＤＮＡ精製回収キット：天根生化科技（北京）有限公司、ＤＰ２１４
遠心チューブ、ピペットチップなどの消耗品：米国Ｇｅｎｅ Ｅｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ＧＥＢ）

【0036】

プライマー：青島▲チン▼科梓熙生物技術有限公司により合成。合成取扱書に従ってｄｄＨ_２Ｏを加えて、１０μＭ溶液とした。
１、ＤＰ３０２キットに従ってゲノムＤＮＡ抽出を行った。
２、ＰＣＲ増幅

【0037】

【表1】

【0038】

【表2】

【0039】

２．３ ＰＣＲサイクルのパラメータ
予備変性：９４℃、３ｍｉｎ、変性９４℃、３０ｓ、アニーリング５５、３０ｓ、伸長、７２℃、１．５ｍｉｎ（合計３５サイクル）、伸長７２℃、１０ｍｉｎ；４℃で保存。

【0040】

３、アガロースゲル電気泳動検出
１．０％のアガロースゲルを調製し、電気泳動には電圧を１８Ｖ／ｃｍ、電気泳動時間を２０ｍｉｎとした。

【0041】

４、精製回収
一般的なアガロースゲルＤＮＡ回収キットを用いて、目標断片に対してアガロースゲルを回収し、青島▲チン▼科梓熙生物技術有限公司にて回収産物をシーケンシングした。

【0042】

【表3】

【0043】

実施例２
実施例１の前記ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２を用いて、広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル分解酵素製剤を調製する方法のステップは以下のとおりである。
（１）ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２をＬＢ固体培地に画線し、３５℃で倒置活性化培養を２日間行い、活性化済み株を得た。
（２）ステップ（１）で得られた活性化済み株をＬＢ液体培地に接種し、３５℃、回転速度２００回転／分の条件で、２日間振とう培養し、種液を得た。
（３）ステップ（２）で得られた種液を、１０％の体積パーセントでビフェニル０．５ｇ／Ｌを含有する無機塩培地に移し替え、３５℃、溶存酸素７０％の条件で、２日間拡大培養して、菌液を得た。
（４）ステップ（３）で得られた菌液を、３０００回転／分の条件で、１０分間遠心分離して、菌体を収集し、３０倍容積のｐＨ７．０のリン酸緩衝液に懸濁し、高圧ホモジナイズ細胞破砕を行った後、４℃、３０００回転／分の条件で、２分間遠心分離して、上澄み液を収集し、広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル分解酵素製剤を得た。

【0044】

比較例１
遺伝的関係が最も類似したミクロバクテリウム・パラオキシダンスＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＭＡ２５を用いて、実施例２の方法により酵素製剤を調製し、ステップ（３）の無機塩培地で培養したところ、菌液の濁りが認められておらず、また、菌懸濁液について６００ｎｍでの吸光値を検出したところ、ＯＤ_{６００ｎｍ}の値がゼロであり、このことから、ステップ（３）の無機塩培地ではミクロバクテリウム・パラオキシダンスＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＭＡ２５が生存できないことが明らかになった。

【0045】

比較例２
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＥＣＯ－１株を用いて、実施例２の方法により酵素製剤を調製した。ステップ（３）の無機塩培地で培養したところ、菌液の濁りが認められ、また、菌懸濁液について６００ｎｍでの吸光値を検出したところ、ＯＤ_{６００ｎｍ}の値が１．０５であり、このことから、ステップ（３）の無機塩培地ではシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＥＣＯ－１が生存できることが明らかになった。

【0046】

実験例
濃度２５ｍｇ／ＬのペンタクロロビフェニルＰＣＢ１１４、ＰＣＢ１０１、トリクロロビフェニルＰＣＢ２８のそれぞれを、広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤及びＰＢＳ緩衝液と１：５：１９（体積比）の割合で混合した後、３０℃、ｐＨ７．０でそれぞれ１０ｈ、１３ｈ、１０ｈ反応させ、ｎ－ヘキサン１０ｍＬを加えて３回抽出し、抽出液について、ＧＣ－ＭＳ法により上記ポリ塩化ビフェニルの分解率を検出した。
検出した結果、実施例２で得られた広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル分解酵素製剤は、好気性条件で、トリクロロビフェニルＰＣＢ２８に対する分解率が１０ｈ内で９０％に達し、ダイオキシン様ペンタクロロビフェニルＰＣＢ１１４に対する分解率が１０ｈ内で５７．１％に達し、指標となるペンタクロロビフェニルＰＣＢ１０１に対する分解率が１３ｈ内で１００％に達した。

【0047】

比較例２では、ダイオキシン様ペンタクロロビフェニルＰＣＢ１１４だけに対して、分解率が１０ｈ内で６０．３％に達し、他のものに対しては、分解率がゼロであった。

【0048】

以上のデータから分かるように、本発明の前記ミクロバクテリウム・パラオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｏｘｙｄａｎｓ）ＥＣＯ－２は、単一基質で誘導すると、ＰＣＢ１１４、ＰＣＢ１０１、ＰＣＢ２８に対する広域スペクトルのポリ塩化ビフェニル酵素製剤を産生することができ、単一基質で誘導すると単一分解しかできない従来の公知の酵素製剤に比べて、高い応用価値があった。

【図1】

【配列表】

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【国際調査報告】