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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(54)【発明の名称】サイトカインを分泌するように改変されたＰＤＣ株
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220202BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20220202BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220202BHJP
C12N 5/0784 20100101ALN20220202BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20220202BHJP
C07K 14/52 20060101ALN20220202BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20220202BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20220202BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61K39/00 Z
A61P35/02
C12N5/0784 ZNA
C12P21/02 C
C07K14/52
C07K14/705
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021523162
(86)(22)【出願日】2019-10-23
(85)【翻訳文提出日】2021-06-14
(86)【国際出願番号】 EP2019078845
(87)【国際公開番号】W WO2020083974
(87)【国際公開日】2020-04-30
(31)【優先権主張番号】1859773
(32)【優先日】2018-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521173085
【氏名又は名称】ペデセ リヌ ファルマ
【氏名又は名称原語表記】ＰＤＣ ＬＩＮＥ ＰＨＡＲＭＡ
(71)【出願人】
【識別番号】512217400
【氏名又は名称】エタブリスマン フランセ デュ サン
(74)【代理人】
【識別番号】100094640
【弁理士】
【氏名又は名称】紺野 昭男
(74)【代理人】
【識別番号】100103447
【弁理士】
【氏名又は名称】井波 実
(74)【代理人】
【識別番号】100111730
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 武泰
(74)【代理人】
【識別番号】100180873
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 慶政
(72)【発明者】
【氏名】ハナニ、デリル
(72)【発明者】
【氏名】プリュマ、ジョエル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG02
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA45
4C085AA03
4C085BB01
4C085CC03
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA04
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、サイトカインを分泌するように遺伝子改変されたＰＤＣ（形質細胞様樹状細胞）株、および免疫療法において抗原特異的細胞の増殖を増加させるためのその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン１５（ＩＬ１５）およびインターロイキン２（ＩＬ２）から選択されるサイトカインを発現するように遺伝子改変されてなるＰＤＣ株。
【請求項2】
初期ＰＤＣ株が、白血病性形質細胞様樹状細胞から得られることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子改変株。
【請求項3】
前記改変が、ウイルス粒子を用いて行われることを特徴する、請求項１または２のいずれか一項に記載の遺伝子改変株。
【請求項4】
前記サイトカインが単独で発現されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変株。
【請求項5】
１つ以上の抗原で負荷されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変株。
【請求項6】
１つ以上の抗原を発現するようにさらに遺伝子改変されてなることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変株。
【請求項7】
前記抗原がペプチド抗原であることを特徴とする、請求項５または６のいずれか一項に記載の遺伝子改変株。
【請求項8】
放射線照射されてなるものであることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変株。
【請求項9】
抗原特異的細胞のインビトロ増幅のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変株の使用。
【請求項10】
治療における使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変株。
【請求項11】
一方に請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＰＤＣ株、および他方に抗原特異的細胞を含む、組み合わせ物またはキット。
【請求項12】
免疫療法による疾患の治療における併用のための、請求項１１に記載の組み合わせ物。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＰＤＣ株、およびその投与のための適切なビヒクルを含む、ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サイトカインを分泌するように遺伝子改変された形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）株、および免疫療法において抗原特異的細胞の増殖を増加させるためのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
抗原特異的細胞の産生を促進させることを試みる免疫療法アプローチは公知である。ドナー単核細胞（ＭＮＣ）、特に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抗原特異的細胞傷害性細胞を誘導するために形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）株（「ＰＤＣ＊株」と呼ぶ）を使用するアプローチは、本発明者らによって開発されている（ＷＯ２００９／１３８４８９）。このアプローチは、放射線照射および抗原負荷された「ＰＤＣ＊株」の存在下でＭＮＣを培養することからなり、単核細胞は、「ＰＤＣ＊株」と少なくとも１つのＨＬＡ分子を共有する（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）。
【0003】
本出願人によって実施された研究は、この治療アプローチの魅力、およびメラノーマまたは肺がんなどのがんの免疫療法治療におけるその注目に値する可能性を示した（Ａｓｐｏｒｄら，２０１２年、未公表データ）。
【0004】
抗原特異的細胞の増殖を誘導する能力は、これらの新たな治療アプローチの実行における決定因子である。特に、ＷＯ２００９／１３８４８９の出願から、サイトカインの存在がこの増殖のために必要であることが公知である。開示された実験プロトコールは、第１週目に、サイトカインなしで行われる放射線照射および抗原負荷されたＰＤＣ＊株とＭＮＣとの共培養、次いで、第２週目に、放射線照射された抗原負荷されたＰＤＣ＊株およびＩＬ－２による新たな刺激で構成される。
【0005】
さまざまな免疫応答の発達メカニズムにおけるサイトカインの重要性は、特にＩＬ－２およびＩＬ１５について、当業者に周知である（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ ２００６年）。ＩＬ－２は、活性化されたＴ細胞によって主に産生されるが、ＩＬ－１５およびその関連する受容体ＩＬ－１５Ｒａ（Ｄｕｂｏｉｓ，２００２年）は、単球または骨髄樹状細胞（ＭＤＣ）によって産生される（Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋら，２０１１年）。抗腫瘍応答の誘導において（ＮＫ、抗体または抗原特異的Ｔ）、細胞機能を増強する目的のために、ＩＬ１５を産生するインビトロで発生したＭＤＣを一過的または持続的に改変することが記載されている（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈら，２０１５年、Ｓｔｅｅｌら（２０１０年）またはＺｈａｎｇら（２０１４年））。
【0006】
ＭＤＣおよびＰＤＣ両方が抗原提示細胞であるとしても、病原体または抗原の起源、および一般に、多くの特徴：とりわけ、起源、組織局在性、トール様受容体発現、サイトカイン産生によって分化させられる環境状況に依存して、異なる種類の免疫応答を誘導することができる２つの異なる細胞型が存在する。ＩＬ１５を発現するように改変されたＭＤＣに関するこれらの論文は、ＰＤＣを使用する可能性について言及しておらず、あるいはＩＬ１５またはさらにＩＬ２によるＰＤＣに対する少なくとも同等の効果について考慮すらしていない。
【0007】
ＷＯ２００９／１３８４８９に記載の従来の活性化および増殖方法は、特に高レベルの増殖を既に達成しているが（Ａｓｐｏｒｄら，２０１０年）、抗原特異的細胞の増殖のレベルでこの新たな治療アプローチを改善することは依然として有利である。
【発明の概要】
【0008】
したがって、本発明は、インターロイキン１５（ＩＬ１５）およびインターロイキン２（ＩＬ２）から選択されるサイトカインを発現するように遺伝子改変された新たなＰＤＣ株に関する。
【0009】
特に、本発明による遺伝子改変ＰＤＣ細胞は、ペプチド形態の１つ以上の抗原で負荷される。
【0010】
本発明は、抗原特異的細胞、具体的には、単核細胞（ＭＮＣ）、より具体的には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を増幅するための新たな遺伝子改変ＰＤＣ株の使用にも関する。
【0011】
本発明は、特に、免疫療法による疾患の治療における併用のための、一方に本発明による遺伝子改変ＰＤＣ株、および他方に単核細胞（ＭＮＣ）を含む、組み合わせ物またはキットにも関する。
【0012】
本発明は、本発明による遺伝子改変ＰＤＣ株、およびその投与のための適切なビヒクルを含む、ワクチン組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図2】図２は、ＩＬ２またはＩＬ１５レトロウイルス上清で形質導入されたＰＤＣ＊株によるＩＬ２またはＩＬ１５の発現を表す。各サイトカインは、メッセンジャーＲＮＡのレベル（Ａ、Ｇ６ＰＤＨに対して正規化）、または形質導入された細胞の上清中（Ｂ、ｐｇ／ｍｌ）で検出される。
【発明を実施するための形態】
【0014】
したがって、本発明は、ＩＬ１５およびＩＬ２から選択されるサイトカインを発現するように遺伝子改変された新規ＰＤＣ株に関する。
【0015】
遺伝子改変するためにおいて有用なＰＤＣ株は、初期ＰＤＣ株とも呼ばれ、当業者に周知であり、特にＥＰ１５７２９８９およびＷＯ２００９／１３８４８９に記載されている。特に、これらはＰＤＣ白血病細胞から得られる細胞である。特に、ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、７５０１５ パリ）に寄託番号２９３８および３１１０で寄託されるＧＥＮ２．２およびＧＥＮ３株、ならびにＰＤＣ白血病細胞に由来するすべての株が挙げられる。
【0016】
「ＰＤＣ白血病細胞に由来する株」は、免疫不全マウスへのＰＤＣ白血病細胞の注射後の腫瘍小結節に由来する株を意味し、これらの小結節は、引き裂かれて、前記株の成長を促進する合成培地中で培養される細胞懸濁液が得られる。
【0017】
「ＩＬ１５およびＩＬ２から選択されるサイトカインの発現」は、本発明によれば、遺伝子改変株によるサイトカインの分泌を意味する。
【0018】
サイトカインの配列は、当業者に周知である。特に、ＩＬ２について、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ６０５６８で特定されるタンパク質配列およびＥｎｓｅｍｂｌエントリーＥＮＳＧ０００００１０９４７１で特定されるコード配列、またＩＬ－１５について、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ４０９３３で特定されるタンパク質配列およびＥｎｓｅｍｂｌエントリーＥＮＳＧ０００００１６４１３６で特定されるコード配列が挙げられる。上記の配列と同じ活性を有するこれらのサイトカインの改変体または断片も本発明の一部である。好ましくは、サイトカインは、上記で特定されたヒトサイトカインである。
【0019】
「遺伝子改変ＰＤＣ株」は、本発明によれば、株のゲノムへの遺伝子の組み込みを可能にするウイルス粒子で形質導入された任意の株を意味し、このウイルスは、アデノウイルス、レンチウイルスまたはレトロウイルスであってよい。好ましくは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）型のレトロウイルスが使用される。これらのレトロウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔカプセル化株によって産生され、自然に、またはトランスフェクション後にレトロウイルスのｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ配列を発現する。
【0020】
当業者にとって、目的遺伝子についてのコード配列、および調節要素、特に、遺伝子改変哺乳動物細胞においてサイトカインの発現を可能にするために使用される配列を含むウイルス粒子を調製するための方法は公知であろう。特に、４０７０Ａ、ＭＫ－Ｇ、ＨＡ、ＬＣＭＶ、ＲＤ１１４、ＨＩＶ、ＶＳＶ、ＭＬＶ、ＧＡＬＶ、ＢＡＥＶなどの細胞へのウイルスの侵入を可能にするウイルスエンベロープ配列、長い末端反復（ＬＴＲ）配列、改変または改変されていないＰＧＫ、ＥＦ－１、ＣＭＶ、ＳＦＦＶ、ＲＳＶもしくはＳＶ４０などの目的遺伝子の転写の開始を可能にするプロモーター配列、ｃＰＰＴなどの形質導入効率を増強する配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ １９８８年）またはＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌ ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９９１年）などの翻訳を容易にするまたは開始する配列、ＷＰＲＥ配列（Ｄｏｎｅｌｌｏら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９８年）などのタンパク質発現を促進する配列が挙げられる。好ましくは、ＬＴＲ、ＩＲＥＳ、ＫｏｚａｋおよびＷＰＲＥ配列が使用される。
【0021】
ＰＤＣ細胞をウイルス粒子で形質導入し、ＩＬ１５およびＩＬ２から選択されるサイトカインを発現するように遺伝子改変された新規ＰＤＣ株を得るための方法も当業者に公知である。特に、ポリブレンまたはＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）などのポリカチオン剤、またはウイルスおよび目的細胞間の接触を促進する薬剤、例えばフィブロネクチン断片（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）の使用が挙げられる。好ましくは、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを使用する方法が使用される。
【0022】
好ましくは、サイトカインは単独で発現される。ある特定の場合において、特に、ＩＬ１５について、ＰＤＣ株は、サイトカイン受容体、特にＩＬ１５Ｒａ受容体も発現する。ＩＬ１５Ｒａ受容体、特にそのタンパク質配列は、当業者に周知である。
【0023】
本発明による改変されたＰＣＤ株が前記受容体を発現しない場合において、ＰＤＣ株はまた、本分野の通常の方法により、前記受容体を発現するように改変されてもよい。
【0024】
本発明による改変ＰＣＤは、抗原特異的細胞、具体的には単核細胞（ＭＮＣ）、より具体的には末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増幅のために特に有用である。
【0025】
これらは直接使用することができるが、本発明による改変ＰＤＣ細胞は、好ましくは、抗原、特にペプチド抗原と併せられる。
【0026】
本発明の文脈において、「抗原」という用語は、免疫系の細胞によって認識され、細胞媒介性免疫反応を引き起こすことができる、分子または分子の部分と定義される。本発明において抗原は、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質、リン酸化タンパク質などの、天然または改変された、腫瘍または微生物（特に、細菌またはウイルス）の抗原であり得る。
【0027】
当業者は、治療される疾患にしたがって、改変ＰＤＣ株に関連する抗原を選択するであろう。
【0028】
本発明の好ましい実施形態において、抗原は、腫瘍またはウイルス起源の抗原性タンパク質から得られ得るペプチドである。これらのペプチドは、当業者に周知であり、特に、多数の特許出願または特許、特に、ＥＰ１４８５７１９、ＥＰ２１１３２５３、ＵＳ７，０８７，７１２、ＵＳ７，５２８，２２４、ＷＯ９４／０２０１２７、ＷＯ９５／０２５５３、ＷＯ９８／２２５８９、ＷＯ２０００／００３６９３、ＷＯ２０００／０２０４４５、ＷＯ２０００／０５２１６３、ＷＯ２０００／０７８８０６、ＷＯ２００４／０６７０２３、ＷＯ２００７／０３６６３８、ＷＯ２００７／０３９１９２、ＷＯ２００８／０４５２８６、ＷＯ２０１１／０１２７２０、ＷＯ２０１５／０９６５５７２およびＷＯ２０１６／１７９５７３に記載されている。
【0029】
使用され得る多くの腫瘍抗原は、オンラインで利用可能なデータベース、例えば、アドレスｈｔｔｐ：／／ｃｖｃ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔａｄｂ／もしくはｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｃｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔｓ／ｕ／１／ｄ／１ＢＦｎ５＿ｍｕ７ｏｇＵｈ３５ＮｓＬＵｏｚｊ９ＥＢ２ｒｂＬｔｊ７ＸｊＭｙｔ７ＢｏＹＮｘｇ／ｐｕｂｈｔｍｌ？ｗｉｄｇｅｔ＝ｔｒｕｅ＆ｈｅａｄｅｒｓ＝ｆａｌｓｅ＃ｇｉｄ＝１６０９２１０７１２などに、またはＤｊｕｒｅｉｎｏｖｉｃら（ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１６年；１（１０）：ｅ８６８３７）などの刊行物にも記載されている。
【0030】
同様に、使用され得る多くのウイルス抗原は、オンラインで利用可能なデータベース、例えば、アドレスｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／またはｈｔｔｐ：／／ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ａｎｔｉｇｅｎｄｂ／などにも記載されている。
【0031】
本発明の特定の実施形態によれば、腫瘍抗原から得られ得るペプチドは、抗原ＣＥＡ、ＮＹ－ＢＲ１、Ｈｅｒ－２／Ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＲＡＧＥ－１、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、Ｍｕｌｔｉ－ＭＡＧＥ、ＭＵＣ－１、ｐ５３、ｈＴＥＲＴ、サバイビン、ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＧＰ１００、チロシナーゼ、ＣＡＭＥＬまたはＮＹ－ＥＳＯ１の配列に含まれるペプチドから、改変または未改変を問わず、また単独または組み合わせで、選択することができる。同様に、変異したタンパク質、または核酸配列の新しいリーディングフレームによって発生したメッセンジャーＲＮＡの転写から生じるタンパク質（ネオ抗原）の中から選択される任意の抗原であってよい。
【0032】
本発明の別の実施形態によれば、ウイルス抗原から得られ得るペプチドは、抗原ＨＩＶウイルスのｅｎｖ、ｎｅｆ、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｇａｇもしくはｐｏｌ、ＨＢＶウイルスのＨＢｃもしくはＨＢｓ、ＨＣＶウイルスのｃｏｒｅ、ＮＳ３もしくはＮＳ５、インフルエンザウイルスのＦｌｕ Ｍ１、ＣＭＶウイルスのＣＭＶｐｐ６５、ＥＢＶウイルスのＢＭＬＦ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ－２もしくはＥＢＮＡ－３ａ、ＢＫＶウイルスのＬＴＡもしくはＶＯＰ１、Ｈａｔａｎウイルスの核タンパク質、デングウイルスのＮＳ３、ＨＰＶウイルスのＥ６およびＥ７、西ナイルウイルスのプロテインＥ、ＮＳ３もしくはＢＳ４ｂの配列に含まれるペプチドから、改変または未改変を問わず、また単独または組み合わせで、選択することができる。
【0033】
好ましくは、Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１０、Ｍｕｌｔｉ－ＭＡＧＥ、ＣＴＡＧ２、ＣＴＡＧ１、サバイビン、Ｈｅｒ－２／Ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴおよびＭＵＣ１が挙げられる。
【0034】
本発明の第１の好ましい実施形態によれば、遺伝子改変ＰＤＣ細胞は、１つ以上の抗原で負荷される。これらは、パルスするとも言われ、すなわち、１つ以上の抗原とともにインキュベートされる。
【0035】
本発明は、したがって、上記に定義される遺伝子改変ＰＤＣ株に、例では、上記に列挙された抗原の１つで負荷された遺伝子改変ＰＤＣ株に関する。
【0036】
本発明の別の実施形態によれば、細胞はまた、前記抗原を発現するように遺伝子改変される。遺伝子改変ツールは、サイトカインを発現するようにＰＤＣ細胞を改変するために使用されるものと同じである。抗原の場合において、当業者は、遺伝要素が、エピトープに形質転換され、ＨＬＡ分子によって、インビトロまたはインビボで提示されるように、抗原が細胞レベルで発現することを可能にする遺伝要素も選択する。このような要素は、当業者にも周知である（Ｈｕ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ２０１１年）。
【0037】
治療的使用のために、上記および下記に定義される本発明による遺伝子改変ＰＤＣ株は、放射線照射された株である。
【0038】
本発明による形質転換ＰＣＤ株の成長および増殖の能力を阻害するための放射線照射方法および条件は、当業者に周知であり、特に、ＷＯ２００９／１３８４８９に記載されている。
【0039】
本発明は、抗原特異的細胞、具体的には単核細胞（ＭＮＣ）、より具体的には末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を増幅するための新規遺伝子改変ＰＤＣ株の使用にも関する。
【0040】
本発明は、治療における使用のための、特に、免疫療法による疾患の治療のための、新規遺伝子改変ＰＤＣ株にも関する。
【0041】
本発明は、特に、免疫療法による疾患の治療における併用のための、一方に本発明による遺伝子改変ＰＤＣ株、および他方に単核細胞（ＭＮＣ）を含む、組み合わせ物またはキットにも関する。
【0042】
治療される疾患は、本発明による株に関連する抗原、例えば、がんの治療のために使用される腫瘍抗原およびウイルス感染症の治療のためのウイルス抗原に本質的に依存する。
【0043】
本発明は、本発明による遺伝子改変ＰＤＣ株、およびその投与のための適切なビヒクルを含む、ワクチン組成物にも関する。
【0044】
本発明は、がんおよび／または感染性疾患を予防および／または治療するための方法であって、本発明による放射線照射およびパルスされた遺伝子改変ＰＤＣ株が、治療を必要とする患者に注射され、前記患者の抗原特異的細胞およびＰＤＣが、少なくとも１つの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）アレルを共有することを特徴とする、方法にも関する。
【0045】
本発明は、がんおよび／または感染性疾患を予防および／または治療するための方法であって、本発明によるＰＤＣ株を少なくとも１つの抗原とともにインキュベートすることによって得られる特異的エフェクターが、治療を必要とする患者に注射され、次いで、パルスされ、場合により放射線照射されたＰＤＣを、前記患者の抗原特異的細胞と接触させ、培養し、ＰＤＣおよび抗原特異的細胞が、少なくとも１つの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）アレルを共有することを特徴とする方法にも関する。
【0046】
「特異的エフェクター」は、本発明によれば、特異的抗原、またはこの抗原に由来する産物を認識することができる免疫細胞、具体的には細胞傷害性エフェクター、より具体的には使用される抗原に特異的なＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞を意味する。
【0047】
これらの方法は、特に、ＷＯ２００９／１３８４８９に記載されている。
【実施例】
【0048】
実施例１：ＩＬ－２またはＩＬ１５を発現するように遺伝子改変されたＰＤＣ＊株の発生
ＩＬ２（配列番号１）およびＩＬ１５（配列番号２）をコードする目的遺伝子配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｆｒ／ｆｒ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｇｅｎｅ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅａｒｔ－ｇｅｎｅ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｈｔｍｌ）によって合成し、プラスミド中に導入して、ＤＨ５アルファ細菌（ＮＥＢ）の形質転換後にプラスミドの増幅を可能にした。その後、目的配列（ＩＬ２またはＩＬ１５）をギブソン・アッセンブリー技術（ＮＥＢ）を使用して、Ｓａｌ－ＩおよびＭｕｌ－Ｉ制限部位の間のプラスミドＳＦＧΔＣＤ３４（Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ，Ｂｌｏｏｄ ２００７，寛大にもＭ．Ｐｕｌｅ博士によって提供された）にサブクローニングした。ＳＦＧΔＣＤ３４プラスミド（細胞質内ドメインなし）中のトランケートされたＣＤ３４配列の存在は、目的遺伝子を発現する細胞の選択を可能にする。その後、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ＶＷＲ）の存在下で、ＳＦＧΔＣＤ３４－ＩＬ２またはＳＦＧΔＣＤ３４－ＩＬ１５プラスミドならびにＭｏＭＬＶ ｇａｇ－ｐｏｌ ｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ）およびＲＤ１１４ ｅｎｖ発現プラスミド（Ｍ．Ｐｕｌｅ博士およびＭ．Ｃｏｌｌｉｎｓ博士によって寛大にも提供された（Ｃｏｓｓｅｔ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５年））を用いたＨＥＫ－２９３Ｔ株の三重トランスフェクションによってレトロウイルス懸濁液を得た。
ＩＬ２（配列番号１）およびＩＬ１５（配列番号２）をコードする目的遺伝子配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｆｒ／ｆｒ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｇｅｎｅ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅａｒｔ－ｇｅｎｅ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｈｔｍｌ）によって合成し、プラスミド中に導入して、ＤＨ５アルファ細菌（ＮＥＢ）の形質転換後にプラスミドの増幅を可能にした。その後、目的配列（ＩＬ２またはＩＬ１５）をギブソン・アッセンブリー技術（ＮＥＢ）を使用して、Ｓａｌ－ＩおよびＭｕｌ－Ｉ制限部位の間のプラスミドＳＦＧΔＣＤ３４（Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ，Ｂｌｏｏｄ ２００７，寛大にもＭ．Ｐｕｌｅ博士によって提供された）にサブクローニングした。ＳＦＧΔＣＤ３４プラスミド（細胞質内ドメインなし）中のトランケートされたＣＤ３４配列の存在は、目的遺伝子を発現する細胞の選択を可能にする。その後、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ＶＷＲ）の存在下で、ＳＦＧΔＣＤ３４－ＩＬ２またはＳＦＧΔＣＤ３４－ＩＬ１５プラスミドならびにＭｏＭＬＶ ｇａｇ－ｐｏｌ ｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ）およびＲＤ１１４ ｅｎｖ発現プラスミド（Ｍ．Ｐｕｌｅ博士およびＭ．Ｃｏｌｌｉｎｓ博士によって寛大にも提供された（Ｃｏｓｓｅｔ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５年））を用いたＨＥＫ－２９３Ｔ株の三重トランスフェクションによってレトロウイルス懸濁液を得た。
【0049】
その後、ＰＤＣ株の細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）の存在下で、ＩＬ２またはＩＬ１５に対応するレトロウイルス上清で形質導入し、形質導入効率を反映するＣＤ２４発現を測定した。この株は、ＧＥＮ２．２およびＧＥＮ３株が由来する患者であるＰＤＣ白血病（Ｃｈａｐｅｒｏｔ，Ｂｌｏｏｄ ２００１年）を有する患者の細胞に由来した。
【0050】
図１に示されるように、９０％を超えるＰＤＣ＊株が形質導入された。
【0051】
このＣＤ３４の発現は、ＩＬ２またはＩＬ１５遺伝子の発現と相関する。実際に、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ法、Ｒｏｃｈｅ）は、Ｇ６ＰＤＨ遺伝子と比較して、ＩＬ２またはＩＬ１５について、それぞれ２０または３０より多くの因子によって、高い相対発現を示す（図２Ａ）。また、ＣＢＡ（ＢＤ）またはＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）法を使用して、両方のサイトカインが、対応する遺伝子改変株の上清中に、ＩＬ２およびＩＬ１５について、それぞれ、２００００ｐｇ／ｍｌおよび２５００ｐｇ／ｍｌの濃度で、可溶な形態で産生されることが確認される（図２Ｂ）。
【0052】
実施例２：ＭＮＣと腫瘍ペプチドで負荷された形質導入株との共培養後のＣＤ８＋リンパ球の増殖
次いで、改変株の能力を、ＨＬＡ－Ａ２＋健康ドナー単核細胞（ＭＮＣ）との共培養を使用して、評価した。簡潔には、遺伝子改変ＰＤＣ株および未改変ＰＤＣ株からの細胞を、Ｍｅｌａｎ－Ａ２６Ｌ－３５ペプチドで負荷し、放射線照射し、次いで、２４ウェルプレート中で、１４日間、ＭＮＣとともに培養した。異なる量のＰＤＣ株細胞を、ウェルあたり２００万個のＭＮＣ（１０／１または２０／１）に添加した。７日目に、細胞を、可溶性ＩＬ－２の存在下、Ｍｅｌａｎ－Ａ負荷ＰＤＣ株で再刺激した。１４日目に、抗Ｍｅｌａｎ－Ａ ＣＤ８＋リンパ球の増殖を、蛍光色素標識Ｍｅｌａｎ－Ａ／Ａ２デキストラマー（多量体）ならびに抗ＣＤ３およびＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、測定した。
次いで、改変株の能力を、ＨＬＡ－Ａ２＋健康ドナー単核細胞（ＭＮＣ）との共培養を使用して、評価した。簡潔には、遺伝子改変ＰＤＣ株および未改変ＰＤＣ株からの細胞を、Ｍｅｌａｎ－Ａ２６Ｌ－３５ペプチドで負荷し、放射線照射し、次いで、２４ウェルプレート中で、１４日間、ＭＮＣとともに培養した。異なる量のＰＤＣ株細胞を、ウェルあたり２００万個のＭＮＣ（１０／１または２０／１）に添加した。７日目に、細胞を、可溶性ＩＬ－２の存在下、Ｍｅｌａｎ－Ａ負荷ＰＤＣ株で再刺激した。１４日目に、抗Ｍｅｌａｎ－Ａ ＣＤ８＋リンパ球の増殖を、蛍光色素標識Ｍｅｌａｎ－Ａ／Ａ２デキストラマー（多量体）ならびに抗ＣＤ３およびＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、測定した。
【0053】
図３に表される結果は、ＰＤＣ株によるＩＬ２またはＩＬ１５の発現が、未改変株よりも強い増殖を可能にすることを示す。この増加は、平均して３．７以上の係数である。
【0054】
実施例３：ＩＬ２またはＩＬ１５によって改変されたＰＤＣ株または改変されていないＰＤＣ株により発生するエフェクターの機能性：細胞質内ＩＦＮγ発現
ＩＬ－２またはＩＬ１５によって形質導入されたまたは形質導入されていないＭｅｌａｎ－Ａ負荷ＰＤＣ株の存在下での共培養の１４日後に増幅されたＴ細胞を、Ｍｅｌａｎ－Ａ／Ａ２デキストラマー（多量体）で負荷し、脱顆粒阻害剤であるＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の存在下で、Ｍｅｌａｎ－Ａ負荷Ｔ２標的株で４時間再刺激した。次いで、細胞を、抗ＩＦＮγ抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ならびに抗ＣＤ３およびＣＤ８抗体で標識した。図４Ａは、得られた表現型が多量体標識細胞によるＩＦＮγ陽性細胞の情報を表すことを表す。図４Ｂは、Ｍｅｌａｎ－Ａ特異的細胞（多量体＋）のみが、Ｔ２／Ｍｅｌａｎ－Ａ系統で再刺激された場合に、ＩＦＮγを産生することを示す。結果は、ＩＬ２またはＩＬ１５を発現するように改変されたＰＤＣ株の存在下で増幅されたＭｅｌａｎ－Ａ特異的リンパ球が、未改変株で増幅されたＭｅｌａｎ－Ａ特異的リンパ球よりも、１．８～２．１倍よりも高いＩＦＮγを分泌することを示す。
ＩＬ－２またはＩＬ１５によって形質導入されたまたは形質導入されていないＭｅｌａｎ－Ａ負荷ＰＤＣ株の存在下での共培養の１４日後に増幅されたＴ細胞を、Ｍｅｌａｎ－Ａ／Ａ２デキストラマー（多量体）で負荷し、脱顆粒阻害剤であるＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の存在下で、Ｍｅｌａｎ－Ａ負荷Ｔ２標的株で４時間再刺激した。次いで、細胞を、抗ＩＦＮγ抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ならびに抗ＣＤ３およびＣＤ８抗体で標識した。図４Ａは、得られた表現型が多量体標識細胞によるＩＦＮγ陽性細胞の情報を表すことを表す。図４Ｂは、Ｍｅｌａｎ－Ａ特異的細胞（多量体＋）のみが、Ｔ２／Ｍｅｌａｎ－Ａ系統で再刺激された場合に、ＩＦＮγを産生することを示す。結果は、ＩＬ２またはＩＬ１５を発現するように改変されたＰＤＣ株の存在下で増幅されたＭｅｌａｎ－Ａ特異的リンパ球が、未改変株で増幅されたＭｅｌａｎ－Ａ特異的リンパ球よりも、１．８～２．１倍よりも高いＩＦＮγを分泌することを示す。
【0055】
参照文献
Aspord C, et al., Novel cancer vaccine strategy based on HLA-A*0201 matched allogeneic plasmacytoid dendritic cells. PLoS One. 2010 May 4;5(5):e10458
Aspord et al., HLA-A(*)0201(+) plasmacytoid dendritic cells provide a cell-based immunotherapy for melanoma patients. J Invest Dermatol. 2012 Oct;132(10):2395-406
Djureinovic et al., Profiling cancer testis antigens in non–small-cell lung cancer, JCI Insight. 2016;1(10):e86837
Dubois et al., IL-15R Recycles and Presents IL-15 In trans to Neighboring Cells, Immunity, Vol. 17, 537–547, November, 2002,
Dubsky et al., IL-15-induced human DC efficiently prime melanoma- specific naive CD8+ T cells to differentiate into CTL, Eur. J. Immunol. 2007. 37: 1678–1690
Jakobisiak et al., Interleukin 15 as a promising candidate for tumor immunotherapy, Cytokine & Growth Factor Reviews 22 (2011) 99–108
Steel et al., Interleukin-15 and Its Receptor Augment Dendritic Cell Vaccination against the neu Oncogene through the Induction of Antibodies Partially Independent of CD4 Help, Cancer Res; 70(3) February 1, 2010, 1072-1081
Vand den Bergh et al., Transpresentation of interleukin‐15 by IL‐15/IL‐15Rα mRNA‐ engineered human dendritic cells boosts antitumoral natural killer cell activity, Oncotarget, 2015, Vol. 6, No. 42, 44123-44133
Zhang et al., Dendritic cell-derived interleukin-15 is crucial for therapeutic cancer vaccine potency, OncoImmunology 3:10, e959321; November 1, 2014
EP 1 485 719, EP 2 113 253, US 7 087 712, US 7 528 224, WO 94/020127, WO 95/02553, WO 98/22589, WO 2000/003693, WO 2000/020445, WO 2000/052163, WO 2000/078806, WO 2004/067023, WO 2007/036638, WO 2007/039192, WO 2008/045286, WO 2009/13848, WO 2011/012720, WO 2015/0965572 and WO 2016/179573
http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/
https://docs.google.com/spreadsheets/u/1/d/1BFn5_mu7ogUh35NsLUozj9EB2rbLtj7XjMyt7BoYNxg/pubhtml?widget=true&headers=false#gid=1609210712
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】