特表 2022-513587 造血幹細胞移植後の回復を実施および促進するための改善

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(54)【発明の名称】造血幹細胞移植後の回復を実施および促進するための改善

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0789 20100101AFI20220202BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220202BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220202BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220202BHJP

   A61K 31/565 20060101ALI20220202BHJP

   C07J 1/00 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220202BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0789 ZNA

A61P35/02

A61P7/00

A61P7/06

A61P43/00 105

A61K35/28

A61K35/15 Z

A61K31/565

C07J1/00 CSP

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021523992

(86)(22)【出願日】2019-10-31

(85)【翻訳文提出日】2021-06-23

(86)【国際出願番号】 EP2019079945

(87)【国際公開番号】W WO2020089446

(87)【国際公開日】2020-05-07

(31)【優先権主張番号】18382779.9

(32)【優先日】2018-10-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521186546

【氏名又は名称】セントロ デ インヴェスティガティオネス エネルヘティカス メディオアンビエンタレス イ テクロノヒカス オーアー エメぺー （シエマット）

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＯ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＥＮＥＲＧＥＴＩＣＡＳ， ＭＥＤＩＯＡＭＢＩＥＮＴＡＬＥＳ Ｙ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＣＡＳ Ｏ．Ａ．， Ｍ．Ｐ． （ＣＩＥＭＡＴ）

(71)【出願人】

【識別番号】516124487

【氏名又は名称】コンソルシオ セントロ デ インベスティガシオン バイオメディカ エン レッド エム．ピー．

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＯＲＣＩＯ ＣＥＮＴＲＯ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡ ＥＮ ＲＥＤ， Ｍ．Ｐ．

(71)【出願人】

【識別番号】516355014

【氏名又は名称】フンダシオン、インスティトゥト、デ、インベスティガシオン、サニタリア、フンダシオン、イメネス、ディアス

【氏名又は名称原語表記】ＦＵＮＤＡＣＩＯＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＯ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮ ＳＡＮＩＴＡＲＩＡ ＦＵＮＤＡＣＩＯＮ ＪＩＭＥＮＥＺ ＤＩＡＺ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100173473

【弁理士】

【氏名又は名称】高井良 克己

(72)【発明者】

【氏名】オスカー キンタナ ブスタマンテ

(72)【発明者】

【氏名】ホセ カルロス セゴヴィア サンス

(72)【発明者】

【氏名】ホアン ア ブエレン ロンセロ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C086

4C087

4C091

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AC20

4B065BB06

4B065CA44

4B065CA46

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086DA09

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA51

4C086ZA55

4C086ZB21

4C086ZB27

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB44

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZA55

4C087ZB21

4C087ZB27

4C091AA01

4C091BB03

4C091BB04

4C091BB07

4C091CC01

4C091DD01

4C091EE04

4C091FF01

4C091GG01

4C091HH01

4C091JJ01

4C091KK01

4C091LL04

4C091LL09

4C091MM03

4C091NN12

4C091PA02

4C091PA09

4C091QQ01

(57)【要約】

本発明は、移植を受けた対象へのエストロゲンの投与に基づく造血幹細胞移植の後の造血再構成および回復を増強する方法を提供し、なぜなら、エストロゲンが、レシピエント中で、移植されたドナー細胞に由来する造血細胞のパーセンテージの増加を誘導したからである。また、エストロゲンは、造血幹細胞コンパートメントにおけるドナーの寄与を増加させる。培養物へのエストロゲンの添加に基づいて、培養物中の造血前駆細胞または幹細胞の数を増加させるための方法も提供される。得られた造血前駆細胞または幹細胞も移植することができるので、その方法は、移植のためのドナー細胞の利用可能性を増大させる。したがって、本発明は、患者における造血幹細胞移植を改善する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）または造血前駆細胞移植の後の造血再構成を増強することに使用するためのエストロゲンであって、エストロゲンは、移植の対象レシピエントに投与することに使用するためものであり、かつ、エストロゲンは、エステトロールである、エストロゲン。

【請求項2】

エストロゲンが、全身投与される、請求項１に記載の使用のためのエストロゲン。

【請求項3】

エストロゲンが、造血幹細胞または前駆幹細胞の移植後に投与される、請求項１に記載の使用のためのエストロゲン。

【請求項4】

培養物中の造血前駆細胞および／または造血幹細胞の数を増加させるための方法であって、該方法は、造血前駆細胞および／または造血幹細胞と共に細胞培養物にエストロゲンを添加するステップ、エストロゲンの存在下で細胞を培養するステップ、および任意で、造血前駆細胞および／または造血幹細胞を収集するステップを含み、細胞培養物に添加されるエストロゲンは、エステトロールである、方法。

【請求項5】

細胞が、骨髄－間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）のニッチの存在下で培養される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

細胞が、エストロゲンの存在下で少なくとも１週間培養される、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または対象への移植に使用するための造血前駆細胞および／または造血幹細胞を含む組成物であって、細胞（単数形）または細胞（複数形）は、エステトロールであるエストロゲンの存在下で培養されてきている、造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または組成物。

【請求項8】

請求項７に記載の使用のための造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団であって、造血前駆細胞または造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団は、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法を適用することによって得られた、造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団。

【請求項9】

請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン、または請求項７または８に記載の使用のための造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団であって、移植された前駆細胞および／または造血幹細胞が、対象に対して自己由来または同種異系である、エストロゲン、または造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団。

【請求項10】

請求項１～３または９のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン、または請求項７または８または９に記載の使用のための造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団であって、対象が、ヒトである、エストロゲン、または造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団。

【請求項11】

請求項１～３または９～１０のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン、または請求項７または８または９～１０に記載の使用のための造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団であって、対象が、固形腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、化学療法および／または放射線療法による骨髄切除または骨髄抑制後にＨＳＣ移植を必要とする任意の血液疾患、貧血、原発性または後天性免疫不全、同種造血前駆細胞移植によって治癒し得る遺伝性遺伝性疾患、遺伝的に修正された造血幹細胞の移植によって治癒し得る遺伝性遺伝性疾患：の群から選択される疾患に罹患しているか、または罹患してきている、エストロゲン、または造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団。

【請求項12】

請求項１～３または９～１０のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン、または請求項７または８に記載の使用のための造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団であって、対象が、骨髄または幹細胞移植のための候補者であるか、または切除する化学療法または放射線療法の後に骨髄を受けていた対象である、エストロゲン、または造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団。

【請求項13】

請求項１～３または９～１２のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン、または請求項４～６または１２のいずれか一項に記載の方法、または請求項７または８または９～１２のいずれか一項に記載の使用のための造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞の集団であって、移植されたまたは移植される造血前駆細胞または造血幹細胞が、末梢血、臍帯血、骨髄、羊水、胎盤索または任意のその他の造血細胞源から得られる、エストロゲン、または方法、または造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または造血前駆細胞の集団。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（発明の分野）
本発明は、造血幹細胞移植後の造血回復を増強するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、エストロゲンによる造血幹細胞活性を増強するための方法に言及する。

【背景技術】

【0002】

（発明の背景）
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、成体哺乳動物の骨髄に存在するまれな細胞集団であり、いくつかまたは単一の血液系統に次第に制限されるようになる前駆細胞の階層の上に位置する。ＨＳＣは、自己複製（追加のＨＳＣの生成）およびすべての血球系統への多能性分化が可能である（Ｏｒｋｉｎ ＆ Ｚｏｎ， ２００８）。ＨＳＣは、すべての血球の生涯にわたる生産を維持する上で非常に重要である。ＨＳＣは、静止、自己複製、分化の間の微妙なバランスを通じて恒常性を維持するように高度に制御される。ＨＳＣは滅多に分裂しないが、骨髄損傷に応答して自己再生するように活性化され、恒常性を再確立する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。

【0003】

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、現在最も使用されている細胞治療法である。 ＨＳＣＴは、白血病、まれな血球疾患、再生不良性貧血等の生命を脅かすいくつかの状態に推奨される治療法であり、骨髄切除化学療法または照射療法後に造血系を回復させるために推奨される。これまでに世界中で１００万を超えるＨＳＣＴが実施される。ＨＳＣは血球の生涯にわたる生産の責を担う。自己複製および多能性等のＨＳＣの特別な特性により、ＨＳＣＴの成功が保証される。とりわけ、ＨＳＣＴの主なボトルネックは、ＨＳＣドナー不足、およびドナーＨＳＣの数を減らすことによるＨＳＣＴ不履行である。これらの問題を解決するために、種々のＨＳＣ源（骨髄、臍帯血、動員末梢血、羊水、胎盤索）の使用、胚性細胞からの移植可能なＨＳＣの生成、ｅｘ ｖｉｖｏでのＨＳＣの拡大等、種々のアプローチが取り上げられている。また、限られた数のＨＳＣの生着を最大化することがどのように広く研究されてきたか；アクセサリー細胞または定義されたモジュレーター分子のいずれかである異なるＨＳＣＴモジュレーターをアッセイして、減少した数のドナーＨＳＣの造血再構成を増強する。

【0004】

「エストロゲン」という用語は、コレステロールに由来する女性ホルモンのグループに適用され、そのグループは、いくつかの化合物：エストロン（Ｅ１）、１７β－エストラジオール（Ｅ２、通常はβ－エストラジオールまたは単にエストラジオールと略される）、エストリオール（Ｅ３）を、およびさらには妊娠中に生成され、胎児の肝臓からのみ発現されるエストロゲン（Ｅ４：１５α－ヒドロキシエストリオールとしても知られる）でさえも含む（Ｈｏｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．， ２００８によるレビュー、要約は以下で入手可能：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｂｓ／ｐｉｉ／Ｓ０９６００７６００８０００７９４）。エストロゲンは、主要な女性ホルモンであり、生殖器系の成長、分化、機能を含む多くの細胞プロセスの制御を担う。エストロゲンは、ゲノム（核によって開始されるステロイドシグナル伝達）および非ゲノム（膜によって開始されるステロイドシグナル伝達）シグナル伝達経路を介して作用する。また、ゲノムおよび非ゲノムシグナル伝達の両方は、エストロゲンとエストロゲン受容体α（ＥＳＲα）またはＥＳＲβのいずれかとの相互作用から開始することができる。その結果、細胞プロセスのエストロゲン調節は異なるメカニズムに従うことができ、おそらく異なる応答を得ることができる。

【0005】

最近、１β－エストラジオール（Ｅ２）とエステトロール（Ｅ４）の両方のシグナル伝達は、主にＥＳＲαとの相互作用によって起こることが報告されるが、エストラジオールの調節は非ゲノムシグナル伝達とは無関係である（Ａｂｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。より具体的には、Ａｂｏｔ ｅｔ ａｌ．， （Ａｂｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）によれば、エステトロールは、特にエステトロールがＥＳＲαによって媒介される細胞応答を誘発することができないため、β－エストラジオールのそれとは異なるＥＳＲαの調節の特定のプロファイルを示す膜に作用するが、エストロゲンの核活動に関連していると思われるエストロゲンに共通する他の反応を引き起こすことができる。さらに、エステトロールは、エストラジオール依存性乳腺増殖に拮抗する弱いエストロゲンとして作用する可能性があり（Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）、これはその臨床使用の重要な考慮事項である。さらに、Ｅ４は他のエストロゲンとは異なるＥＳＲβと比較してＥＳＲαに対して高い親和性を有する。そして、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅ４半減期は他のエストロゲンよりもかなり長く、エストロゲンとしての効力が明らかに低いことを補う。Ｅ４の別の特徴は、Ｅ４血清レベルが生物活性を代表し、ＳＨＢＧレベルとは無関係である最も知られているエストロゲンとは対照的に、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）によって結合されない。最後に、Ｅ４のもう１つの重要な利点は、ミクロソーム肝酵素の調節と、他の薬物との相互作用に対するその相対的な非感受性にあまり依存していない（Ｃｏｅｌｉｎｇｈ Ｂｅｎｎｉｎｋ， Ｈｏｌｉｎｋａ， ＆ Ｄｉｃｚｆａｌｕｓｙ， ２００８）。

【0006】

最近の証拠は、エストロゲンが造血幹細胞の増殖と系統決定の調節に関与していることを示す（Ｈｅｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。しかしながら、ＨＳＣの自己複製と多能性の調節におけるエストロゲンの役割を明確に定義する必要がある。ＨＳＣに対するエストロゲンの効果については、ほとんど、時には矛盾する研究がある。これらの研究は、主にβ－エストラジオールを使用して実施されるが、他のエストロゲンにも適用できる可能性があることは一般に認められている。造血前駆細胞または造血細胞のいずれかを含む研究は、エストロゲンを用いて実施された。したがって、一般に、エストロゲン治療は、マウスの血管内膜ＨＳＣの数を特異的に増加させることができるが、骨内膜ＨＳＣの数を増加させることができないことがわかっていると考えられます。しかし、エストロゲンはＨＳＣの長期的な再増殖能力を制限していました（Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ。、２０１２）。具体的には、Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．は、エストラジオールがマウスの皮下または腹腔内に投与されるアッセイを開示している。引用された記事に記載されている発見の中で、エストラジオールは骨髄の骨内膜コンパートメントではなく血管の前駆細胞（ＨＳＣ）数を増加させると言うことができる。これは、ＥＲαノックアウトマウス中の骨量の増加がない場合にも発生する効果である。これは、骨に対するエストラジオールの影響とは無関係に、エストラジオールＩによって誘発されるＨＳＣ数の増加を示す。また、ＨＳＣ数の増加（致死的に照射されたマウスを再構成できる造血前駆細胞の増加）は、細胞周期エントリーの強化によって増加するため、エストラジオール処理動物からの異なる希釈のＢＭ細胞を移植したマウスは４日後に良好な再構成を示したと説明されるコントロールで治療されたＢＭを投与されたマウスよりも数ヶ月であるが、エストラジオール治療はまた、連続移植後の長期的な再構成の可能性の低下につながります。さらに、Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．はまた、エストラジオール治療は、骨髄の血管ニッチにおける造血幹細胞の保持を強化するとも記載する。

【0007】

さらに、エストロゲンは、ＨＳＣおよび多能性前駆細胞（ＭＰＰ）の細胞周期を促進し、女性の赤血球分化を増加させることが示される。雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒｇ_ｃ－ｎｕｌｌ （ＮＳＧ）マウスは、単一のヒトＨＳＣの生着と検出において、雄のマウスよりもはるかに優れていることが報告される（Ｎｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。同じ記事では、女性のＮＳＧ受信者が人間のＨＳＣの自己更新を支持しているように見えることもコメントされる。Ｎｏｔｔａらは、得られた結果を説明する２つの理由を示唆する。雌のＮＳＧマウスは雄よりも免疫不全であり得るか、ステロイドホルモン等の性関連因子が、状況を明確に議論することなく、ヒトのＨＳＣを正または負に調節できるということである。正または負の制御が発生し得る。彼らの結果は、Ｎｏｔｔａおよびその同僚が、ヒトＨＳＣアッセイを必要とする実験の将来の設計において、性別の注意深いモニタリングを推奨することにつながる。

【0008】

エストロゲンで観察された女性のＨＳＣの細胞周期促進と赤血球分化の増加は、エストロゲン受容体α（ＥＳＲα）によって媒介されると言われ、妊娠中に検出できるＨＳＣへの影響である（Ｎａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。対照的に、タモキシフェン（その活性代謝物である４－ヒドロキシタモキシフェンはエストロゲン受容体拮抗薬として作用する）は、ＭＰＰと短期ＨＳＣの数を減少させるが、長期ＨＳＣの増殖を活性化する（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。エストロゲン受容体αの遺伝子（ＥＲ^－／－： ＥＲαノックアウト、ＥＲ^＋／＋：野生型、および放射線キメラ：ＥＲα陽性）に関する発現能力の種々の組合せによる雄の動物モデル（マウス）に対するエストラジオールの影響に関する研究または非造血性または造血性要素のいずれか、あるいはその両方で陰性）も報告される（Ｔｈｕｒｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。骨髄キメラは、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．１）および１２９／ＳＶ ｘ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｌｙ５．２） ＥＲ^＋／＋またはＥＲ^－／－マウスに照射し、照射したマウスにＬｙ５．１、Ｌｙ５．２ ＥＲ^＋／＋またはＬｙ５．２ ＥＲ^－／－マウスの骨髄細胞を投与することによって得られました、即ち、投与された骨髄細胞もマウス細胞であった。ＥＲ^－／－：ＥＲ^＋／＋：またはＥＲαキメラマウスは、免疫系に影響を与えるために最小用量でエストラジオールの単回皮下注射を受け、その注射は骨髄細胞の投与の４週間後にキメラマウスに投与された。エストラジオール投与の１０日後に効果を調べた。少なくともＥＲ^＋エレメントを有するすべての動物において、エストラジオール投与後に総骨髄細胞の減少が観察されたが、ＥＲ^－／－およびＥＲに対して完全に陰性のキメラ動物、すなわちＥＲ^－／－動物およびキメラのエストラジオール治療造血区画と非造血区画の両方の動物ＥＲ^－／－は、骨髄細胞数の有意な減少をもたらさなかった。骨髄細胞の減少は、以前に報告されたマウス投与エストロゲンの骨芽細胞活性をアップレギュレートし、その後骨密度を増加させる能力と関連し得たことが示唆される。

【0009】

さらに、エストロゲンは、作用する骨形成とそれらの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を介して間接的にＨＳＣを調節することができる。しかしながら、このホルモンファミリーによって媒介される調節はより間接的であり得る。エストロゲン（β－エストラジオール）治療は、ＭＳＣの骨形成分化とこれらのＭＳＣからのＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ６分泌を活性化することが報告されており、これらはすべて、ニッチを調節することによってＨＳＣの数を改善する（Ｑｉｕ＿Ｚｈａｏ）。しかしながら、前述のように、ＭＳＣを介して造血前駆細胞を調節するこのエストロゲンの作用については議論の余地がある（Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。

【0010】

また、臍帯血に存在する造血前駆細胞の頻度は、エストリオール等の種々のホルモンや成長因子のレベルと関連する（Ｓａｖａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。

【0011】

欧州特許出願ＥＰ－２０４９１２９－Ａ１は、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３等の骨髄性サイトカインまたはカテコラミン受容体の発現ベクターとともに提示されるため、ＨＳＣ移植を改善できる薬剤としてエストロゲンに言及する。それ自体、カテコラミン受容体の発現をアップレギュレートすることができる薬剤の例として、カテコラミン神経伝達物質が、移植療法において重要である造血前駆細胞の増殖および遊走を直接調節するという事実との関連を確立している。しかしながら、そのような効果が特にエストラジオールまたは他のエストロゲンに対して期待されるかどうかは議論されておらず、エストロゲンが実際にそのような効果を持っていることを証明するアッセイは示されていない。

【0012】

ＵＳ２０１８／１６３１７７Ａ１として公開された米国特許出願は、基本培地、サイトカイン、臍帯間葉系幹細胞馴化培地（またはＭＳＣフィーダー細胞）および補足を含む造血幹細胞（ＨＳＣ）増殖のための無血清培養培地を記載する。補足成分には、ビタミンＣ、ビタミンＥ、およびエストラジオール（Ｅ２）が含み得る。細胞（臍帯血由来）は１２日間培養される。アッセイ（ＵＳ２０１８／１６３１７７の図６を参照）は、エストラジオール（Ｅ２）、ビタミンＣ、およびビタミンＥの添加により、ＣＤ３４＋細胞（造血前駆細胞に関連するマーカー）およびコロニー形成単位の拡大が増加することを示す。

【0013】

これらの証拠にもかかわらず、造血前駆細胞の調節における種々のエストロゲンの完全な役割とその根底にあるメカニズムは不明である。したがって、ＨＳＣ制御におけるエストロゲンの役割に関する包括的な研究は、これらのホルモンの臨床的可能性を開発できるようにするために不可欠である。そして、特に、ＨＳＣに対する各エストロゲン（特にβ－エストラジオールとエステトロール）の活性に関する知識、および制御におけるＨＳＣ数を増やすためにそれらを使用する可能性、および／または造血再構成を改善するためのそれらの適用性に関する知識造血細胞移植の対象となっているのは、その目的のための臨床使用が提供できるかどうかを確認し、それを行うための適切な条件を知るために、特に特定の好みがあり得る場合等に、特定の細胞系統を生成する能力を強化するため、増やす必要がある。したがって、造血回復を促進するためにエストロゲンを使用できるかどうか、その目的に使用できるエストロゲン、およびその使用条件を明確にする必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、前記課題に対する解決を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0015】

（発明の概要）
本発明は、エストロゲン、特にエステトロールでの治療による造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）からの回復の増強に関する。

【0016】

第１の局面において、本発明は、対象における造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）または造血前駆細胞移植後の造血再構成を増強するために使用するためのエストロゲンに関する。移植（すなわち、移植された細胞のレシピエント）、およびエストロゲンがエステトロールである場合、エストロゲンは、好ましくは全身投与される。また好ましくは、エストロゲン（エストロゲン）は、対象が造血幹細胞または前駆幹細胞の移植を受けた後に対象に投与される。

【0017】

第２の態様では、本発明は、培養物中の造血前駆細胞および／または造血幹細胞の数を増加させるための方法であって、該方法は、造血前駆細胞および／または造血幹細胞と共に細胞培養物にエストロゲンを添加するステップ、エストロゲンの存在下で細胞を培養するステップ、および任意で、造血前駆細胞および／または造血幹細胞を収集するステップを含み、細胞培養物に添加されるエストロゲンは、エステトロールである、方法に関する。細胞は、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）のニッチの存在下で培養することが好ましい。例えば、１週間の間培養することができる。

【0018】

第３の態様では、本発明は、造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または対象への移植に使用するための造血前駆細胞および／または造血幹細胞を含む組成物であって、細胞（単数形）または細胞（複数形）は、エステトロールであるエストロゲンの存在下で培養されてきている、造血前駆細胞もしくは造血幹細胞または組成物に関する。造血前駆細胞または造血幹細胞または造血前駆細胞および／または造血幹細胞の集団は、本発明の第２の態様の方法である上記の方法を適用することによって得ることができる。

【0019】

本発明のいずれの態様についても、エストロゲンは、エステトロールである。

【0020】

また、本発明の任意の態様について、レシピエント対象、すなわち、移植を受けた、または受けることを意図されている対象は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、異種移植マウスにおけるエストロゲン効果をテストするためのプロトコルの図を示す。

【図2】図２は、エストロゲン治療によるヒト造血再構成の増強に関する。それは、造血前駆細胞をビヒクル（対照）またはβ－エストラジオール（Ｅ２、２μｇ／日）またはエステトロール（Ｅ４、２μｇ／日）で移植した後４日間治療した免疫不全雄ＮＳＧマウスにおける移植３か月後のヒト生着のＦＡＣＳ分析を表す。。両方の処理は、対照と比較して統計的に有意な差をもたらした（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ＜０．０５、３つの独立した実験でグループあたり９～１３匹のマウス）。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、ヒト造血生着における多系統再構成を描写する。図４Ａは、ＦＡＣＳによって分析されたヒト細胞における、ＣＤ３３を発現するヒト造血細胞である骨髄細胞のパーセンテージを示す。図３Ｂは、ＦＡＣＳによって分析されたヒト生着におけるＢ細胞（ＣＤ１９^＋細胞）のパーセンテージを示す。治療なしでは有意差は生じない（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ値は有意でない（ｎ．ｓ．、２つの独立した実験でグループあたり５～９匹のマウス）。

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、ＮＳＧマウスのヒト造血生着におけるヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）コンパートメントに関する。図４Ａおよび図４Ｂ。移植後３か月のヒト生着における、ヒト造血前駆細胞（ｈＣＤ３４^＋）およびヒトＨＳＣ（ｈＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－）をそれぞれ示す。Ｅ４処理は、コントロールおよびＥ２処理グループと比較して統計的に有意な差をもたらした（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ＜０．０５、３つの独立した実験でグループあたり９～１３匹のマウス）。

【図5】図５は、エストロゲン治療がヒトＨＳＣの長期的な自己複製能力を低下させないことを示す。ヒトＣＤ４５^＋細胞は、移植後３月のセルソーティングにより、初代異種移植マウスから回収された。ソートされたヒトＣＤ４５^＋細胞を二次雌ＮＳＧに移植した。ヒトの生着は、移植の３か月後にＦＡＣＳによって分析された。データは、対照群のヒト生着に対して正規化された。治療は有意差をもたらさない（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ＝０．１１８３、２つの独立した実験でグループあたり４匹のマウス）。

【図6】図６は、エストロゲン治療により、５ｘ１０^３ ＣＢ－ＣＤ３４＋を移植し、３日後にビヒクルＥ２またはＥ４で治療した男性免疫不全ＮＳＧのヒト生着が増加することを示す。図６Ａは、Ｅ４投与によって上昇したヒト生着のレベルを示す。図６Ｂは、骨髄に０．１％以下のヒト造血細胞を有する非生着動物が考慮される。マウスの約４分の１は、０．１％を超えるヒトの生着があった。しかしながら、Ｅ２またはＥ４処理のいずれかにより、生着したマウスの割合が動物の７０％に増加する。（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ＝０．１１５０、グループあたり７～１０匹のマウス）。

【図7】図７は、女性レシピエントにおける少数のＣＢ－ＣＤ３４^＋のヒト生着がエストロゲンによって増強されたことを示す。ヒト造血生着の改善に対するＥ２およびＥ４の有益な効果が男性受容体に限定されるかどうかを知るために、致死量以下で照射された女性ＮＳＧに、限られた数のヒト造血前駆細胞（５ｘ１０^３ ＣＢ－ＣＤ３４＋）を移植し、３日後にビヒクルＥ２またはＥ４で治療した。図７Ａは、４か月後のヒト造血再構成を示す。興味深いことに、雌の動物におけるヒトの生着は、おそらく雌の動物における内因性エストロゲンの存在のために、同じ減少した数の造血前駆細胞を移植された雄のレシピエントよりも高かった。しかし、この内因性エストロゲンの存在にもかかわらず、女性レシピエントにおけるヒトの生着は、Ｅ２後、さらに重要なことにＥ４治療後に増加した。図７Ｂは、原始造血前駆細胞の存在が、エストロゲンで処置された雌マウスにおいてより高かったことに関連しており、このことは、再構成の質を示した。（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ＜０．０５、グループあたり４匹のマウス）。

【図8】図８は、長期培養開始細胞（ＬＴＣ－ＩＣ）アッセイを示す。ＬＴＣ－ＩＣは、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）とヒト前駆細胞（ＣＢ－ＣＤ３４＋）の共培養を通じて確立され、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト骨髄モデル等のヒトの状況におけるエストロゲンのプラスの効果を研究する。ＬＴＣ－ＩＣは、ビヒクルまたは１００μＭのＥ２またはＥ４で１週間処理された。図８Ａは、造血細胞の数がＥ２によって減少し、Ｅ４によってわずかに減少したことを示す。図８Ｂ。原始造血前駆細胞の割合は、主にＥ２であるエストロゲン治療後に高かったことを示す。図８Ｃは、原始造血前駆細胞の総数はＥ２治療によって変化しなかったが、Ｅ４治療後にはほぼ２倍になったと関係する。図８Ｄは、１週間の共培養後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）分析を示す。造血前駆細胞の含有量を評価するために、細胞を特定の造血サイトカインを含むメチルセルロース培地にプレーティングした。１４日後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントした。データは対照群に対して正規化された。両方の処理は、コントロールと比較して統計的に有意な差をもたらした（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ＜０．０５、グループあたり６回の反復）。

【図9】図９は、ヒト造血前駆細胞におけるＥ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４の異なる濃度の影響を示す。ヒト造血前駆細胞は、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、および異なる濃度のＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４（１０ｎＭから５００μＭ）を添加したフェノールレッドフリー培地で培養した。図９Ａは、４日間の培養後の造血細胞数の倍数増加を表す。図９Ｂは、ＦＡＣＳによって分析された細胞数とこの集団の頻度から推定された、培養物中に存在する原始造血前駆細胞（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－）の総数を示す。図９Ｃは、前述のように計算された、培養物中に存在するＨＳＣ（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－）の総数を示す。灰色の破線は対照群の値を示し、赤い破線は０日目の初期値を示す（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｐ＜０．０５、４つの独立した実験からのデータ）。

【図10】図１０は、造血前駆細胞の異なるサブセットにおけるＥＳＲαおよびＥＳＲβの発現を示す。造血前駆細胞の異なる亜集団を、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０およびＣＤ４５ＲＡの発現に従って分類した。ＨＳＣ（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^＋／ＣＤ４５ＲＡ^－）、ＭＬＰ（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ９０^－／ＣＤ４５ＲＡ^＋）およびその他の造血前駆細胞（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ４５ＲＡ^－）からのｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡに逆転写した。次に、ｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化される。図１０Ａは、異なる造血亜集団および乳癌細胞株におけるＥＳＲα、ＥＳＲβおよびＨＰＲＴ１転写物の存在を示す。図１０Ｂは、ＥＳＲαの相対的発現をＨＰＲＴ１に関連する。図１０Ｃは、ＨＰＲＴ１に対するＥＳＲβの相対的発現を示す。

【図11】図１１は、造血ニッチの調節におけるエストロゲンの影響を示す。図１１は、５ｘ１０４ ｈＣＢ－ＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧ雄マウスのＢＭにおける非造血集団（ｈＣＤ４５－ｈＣＤ２３５ａ－ｍＣＤ４５．１－ｍＴｅｒ１１９－）内のマウスＭＳＣ（ｍＣＤ１４０ａ＋）およびマウス血管内皮細胞（ｍＣＤ１４４＋）のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットを示す。

【図12】図１２は、エストロゲンによる造血ニッチの調節を示す。図１２Ａは、移植の４か月後に分析された５ｘ１０^４ ｈＣＢ－ＣＤ３４＋細胞を移植された雄マウスのＢＭにおけるマウスＭＳＣ７１０（ｍＣＤ１４０ａ＋またはＰｄｇｆｒａ＋）の相対的な割合を示す。図１２Ｂは、移植の４ヶ月後に分析された５ｘ１０^４ ｈＣＢ－ＣＤ３４＋細胞で移植された雄マウスのＢＭにおける相対的なマウス血管内皮細胞（ｍＣＤ１４４＋またはＶＥ－カドヘリン＋）を指す。図１２Ｃは、ＥＳＲ１（上部パネル）、ＥＳＲ２（中央パネル）、およびＨＰＲＴ１（下部パネル）のＲＴ－ＰＣＲ分析のＰＣＲ産物を示す代表的なアガロースゲルを示す。図１２Ｄは、抗ＥＳＲ１（緑、左パネル）、抗ＥＳＲ２（緑、中央パネル）、または二次抗体（緑、右パネル）およびＤＡＰＩ（青）で染色されたヒトＢＭ－ＭＳＣの代表的な免疫蛍光画像を示す。データは、四分位範囲を表すドットと箱ひげ図で表される（ｐ７５、上端；ｐ２５、下端；ｐ５０、正中線；ｐ９５、ボックスの上の線；ｐ５、ボックスの下の線）。有意性は、Ｍａｎｎ-Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によって分析され、＊＊Ｐ＜０．０１で表された。

【発明を実施するための形態】

【0022】

（詳細な説明）
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。

【0023】

本発明は、本出願に開示された発見に基づいており、エストロゲン、特に１７β－エストラジオール（または単にエストラジオール）および１５α－ヒドロキシエストリオール（エステトロールとしても知られる）が造血幹細胞の数を増加させることができることが分かる。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の対象レシピエントである、またはそうすることを意図している（または必要としているため）個人に投与した場合の前駆細胞（ＣＤ３４^＋）および／または造血幹細胞（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^＋）移植後の回復とプロセスの効率を促進し、ＣＤ３４^＋細胞が存在するｉｎ ｖｉｔｒｏ骨髄様培養に添加すると、移植に使用する前にドナーから造血幹細胞または前駆幹細胞を利用できるようになり、なぜなら、以前にエストロゲンで処理されたそのような細胞、特にエステトロールで処理された細胞は、移植にも効果的に使用できるためである。

【0024】

したがって、本発明は、ＨＳＣＴ後の造血再構成を増強する方法を提供すると言うことができ、これは主に、本出願で開示された、低用量のエストロゲン、特にエステトロールが造血生着を増強して増加を引き起こすことができるという発見に基づく。ＨＳＣＴ後の造血再構成において、ＨＳＣＴを受けた、または受ける予定の被験者にエストロゲンを投与する場合だけでなく、ドナー細胞（ＣＤ３４^＋細胞）を培養している細胞培養にエストロゲンを投与する場合も同様である。そしてそれは３つの可能な態様を有する：

【0025】

対象における造血幹細胞移植の前後の造血再構成の増強に使用するために特にエステトロールであるエストロゲン（より直接的には、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の造血再構成を増強する方法としても考慮できる側面 すでに細胞移植を受けた、または言及された細胞のレシピエントとなる対象、移植された造血幹細胞（ＨＳＣ）からの造血寄与を高めるために有効量のエストロゲン、特にエステトロールを対象に投与することを含む方法。対象または個体は、ＨＳＣＴを受けた、またはＨＳＣＴを必要としているためにＨＳＣＴを受ける予定の任意の哺乳動物であり得、特に本出願のアッセイが以下で実施されることを考慮に入れると、好ましくはヒトであり、ヒト細胞はヒトへの適用性をサポートする。対象は、固形腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、または化学療法および／または放射線療法による骨髄切除または骨髄抑制後にＨＳＣ移植を必要とする血液疾患に罹患し得るかまたは罹患していたかもしれない。ＨＳＣＴは、対象に対して自家または同種異系であり得る。対象は、貧血（鎌状細胞貧血、サラセミア、ピルビン酸キナーゼ欠損症、ファンコニ貧血または他の再生不良性貧血）、原発性または後天性免疫不全症、同種造血前駆細胞移植によって治癒することができる遺伝性遺伝病、遺伝的に修正された造血前駆細胞の移植、または造血前駆細胞の移植から利益を得る可能性のある他の疾患によって治癒する。ＨＳＣ集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、羊水、胎盤索、またはその他の造血前駆細胞源から得てもよい。ＨＳＣは、最先端の手順を使用して遺伝子組み換えすることができる。特に本発明のこの態様は、エストロゲンがＨＳＣＴ後の造血再構成の増加を引き起こすという発見に基づいている。エストロゲン（特にエストロゲン）の投与は、好ましくは全身経路で行われ（皮下経路などの他の経路も適格であるが）、骨髄抑制剤によるＨＳＣ損傷を回避するために、被験者の骨髄抑制治療後に行われ、なぜなら、これらの細胞がこれらの骨髄破壊治療に対してより敏感である場合、エストロゲンはＨＳＣの自己複製を誘発するからである。

【0026】

培養物中の造血前駆細胞および／または造血幹細胞の数を増加させるための方法であって、該方法は、細胞培養物にエストロゲン（特にエストロゲン）を添加するステップ、エストロゲンの存在下で細胞を培養するステップを含む。一定期間の曝露後（例えば、実施例４のように１週間）、細胞が収集される。好ましくは、細胞培養は、骨髄の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）のニッチの存在下で実行される。例５の結果はまた、各エストロゲンが、前駆細胞の異なるサブセットの割合の増加に有利に働くようであり、このことは、特定の疾患に関連するいくつかの特定の治療用途に有用であり得る。一方で、本出願に開示されるアッセイによれば、前記細胞の培養物中の造血前駆細胞および／または造血幹細胞の数を増加させるためのエストロゲン、特にエステトロールの使用は、可能であるだけではなく、移植用のドナー細胞の数を増やすだけでなく、ＨＳＣＴに必要な造血幹細胞の割合を減らすこともできる。その結果、対象から採取されたＨＳＣの有効性が改善される可能性があるため、対象または別の対象への移植に利用可能なＨＳＣの数も最大化することができる。前の態様と同様に、ＨＳＣ集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、羊水、胎盤索、または他の造血前駆細胞の供給源から得ることができる。ＨＳＣは、最先端の手順を使用して遺伝子組み換えすることができる。

【0027】

骨髄切除または骨髄抑制（通常は化学療法および／または放射線療法による）を受けた対象への移植に使用するために、以前にエストロゲンで処理された造血幹細胞または造血前駆細胞、即ち、移植のための本発明の第２の態様として上記の方法によって得られた細胞の使用。対象は、化学療法および／または放射線療法による骨髄切除または骨髄抑制の後にコメントされているように、固形腫瘍またはＨＳＣ移植を必要とする血液疾患に罹患し得るかまたは罹患していたかもしれない。本発明の第１の態様と同様に、ＨＳＣＴは、対象に対して自家または同種異系であり得る。ＨＳＣ集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、羊水、胎盤索、またはその他の造血前駆細胞源から得てもよい。ＨＳＣは、最先端の手順を使用して遺伝子組み換えすることができる。

【0028】

本明細書で使用される場合、「エストロゲン」という用語は、インビトロアッセイでエストロゲン受容体を活性化することができる任意の物質を含み、天然エストロゲン物質の誘導体も含む。適用はそれらで実行された、用語は特にβ－エストラジオールとエストロゲンを指する。以下に説明する理由により、エステトロールは、本発明の目的および実施形態のために選択されたエストロゲンである。

【0029】

本発明およびその異なる態様は、以下に示す実施例の結果に基づく。

【0030】

第一に、エストロゲンがＨＳＣＴを調節することが示され（例１）、エストロゲンが移植されたＨＳＣまたはレシピエントの骨髄のいずれかで役割を果たしていることを示唆している。

【0031】

例２に示されるように、低用量のエストロゲン治療、主にエステトロールは、造血生着を促進し、生着された造血幹細胞区画を増強し、これにより、ＨＳＣＴの成功を確実にする。エステトロールは、エストラジオールよりも造血前駆細胞および造血幹細胞の割合に高い値をもたらすことに注意する必要がある。本発明者らは、エステトロール用量を減らした短期治療を使用したことにも言及する価値がある。

【0032】

その後、エストロゲンが雄および雌の両方のレシピエントにプラスの効果をもたらすかどうかを判断するために、雌の動物に制限された細胞用量を移植し、エストロゲンで治療した。雌の免疫不全マウスにおける限られた数のヒトＨＳＣからの生着もまた、エストロゲン、特にエステトロールによって増強された（実施例３）。この結果は、エストロゲン治療が雌および雄の被験者のＨＳＣＴに有益な効果をもたらし得ることを示す。エストロゲンが胎児のエストロゲンであることを考えると、Ｎｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．の教示を考慮した後、得られた結果は期待されていなかった。「発明の背景」のセクションで説明されており、性差だけでは説明し得ない。

【0033】

さらに、実施例４に示されるように、ヒトＨＳＣは、ヒト骨髄様環境において正に調節され、このことは、患者におけるエストロゲンの有効性を強く示唆する。そして、以前のアッセイと同様に、エステトロールで得られた結果は、エストラジオールで得られた結果よりも高かった。

【0034】

さらに、エステトロールは、インビボでの造血前駆細胞に対して他の天然エストロゲンよりも毒性が低く、β－エストラジオールに応答したＥＲαの非ゲノムシグナル伝達と部分的に拮抗することが観察される（例５）。後者は以前の報告のデータと一致する（Ａｂｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。したがって、エステトロールによるＨＳＣ活性の調節は、造血前駆細胞におけるエストロゲンの一般的な効果とは異なる可能性があり、造血回復を促進するために使用することができる。

【0035】

エステトロールがＨＳＣＴ後にヒトＨＳＣに作用することが判明したのはこれが初めてである。以前にコメントしたように、雌マウスはエストロゲンシグナル伝達によってＨＳＣの自己複製を増加させることが報告されていたが（Ｎａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、一方、エストラジオールによる長期治療はＨＳＣを一時的に増加させるようでしたが、ＨＳＣの長期再増殖活性（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は減少した（Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。エストラジオールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで間葉系幹細胞に作用することによりＨＳＣの増殖を誘導するが（Ｑｉｕ， Ｊｉｎ， Ｓｈａｏ， ＆ Ｚｈａｏ， ２０１４）、逆に、エストロゲンシグナル伝達は造血前駆細胞に負の役割を果たし、ＨＳＣ機能を損なうことが示される（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。本出願に示された結果とは反対に、以前のデータのいくつかは、エストロゲン作用がＨＳＣＴに有害であり得たことを示しているように思われた。さらに、そのような結果はβ－エストラジオールで得られたものであり、本出願に示された結果によれば、ＨＳＣＴを増強するためにより効果的であると思われるエストロゲンのような他のエストロゲンが持つ可能性のある作用を実際に示すものではなかった。

【0036】

エストロゲンの負の効果（Ｑｕ， １９８３） （Ｄｉｅｔｅｒ， Ｆｒｅｎｃｈ， Ｂｏｏｒｍａｎ， ＆ Ｌｕｓｔｅｒ， １９８７） （Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｐｅｒｒｙ， Ｓａｍｕｅｌｓ， Ｂｉｒｄ， ＆ Ｔｏｂｉａｓ， ２０００； Ｓｈｅｖｄｅ ＆ Ｐｉｋｅ， １９９６； Ｓｏｎｔａｓ， Ｄｏｋｕｚｅｙｌｕ， Ｔｕｒｎａ， ＆ Ｅｋｉｃｉ， ２００９）とＨＳＣ活性を高めるためのそれらの有益な適用（Ｈａｙａｍａ， Ｎａｗａ， Ｅｚａｋｉ， ＆ Ｋｏｔａｎｉ， １９８３； Ｎａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）との間の不一致は、使用されるエストロゲン治療時間と用量だけでなく、ＨＳＣでエストロゲンとそれらによって引き起こされる分子経路の違いにも起因し得る。

【0037】

エステトロールで得られた結果は、特に驚くべきものと見なすことができる。その作用機序は他のエストロゲン、特にβ－エストラジオールの作用機序とは異なることが報告されているため、エステトロールの発現は胎児肝臓からのみ発生し、エストロゲンはこれまで造血前駆細胞または造血前駆細胞のいずれかを含む研究で使用されていなかった。造血細胞では、エストロゲンがＨＳＣ、特にＨＳＣＴ後、または造血に及ぼす影響は予測できなかった。さらに、エステトロールは伝統的にβ－エストラジオールまたは他のエストロゲンよりも弱いエストロゲンと考えられていた。驚くべきことに、以下の例のアッセイは、造血前駆細胞に対するエステトロールの効果がエストラジオールの効果よりも明らかに強いことを示す。低用量のヒト臍帯血ＣＤ３４^＋細胞を移植した照射マウス（雄および雌の両方）を用いたアッセイでのヒト造血再構成の割合が高く、エストロゲンが投与されるヒト骨髄様培養物のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでのヒト前駆細胞の増加率が高い追加された（例４を参照）。さらに、例５に示すように、エストロゲンは他のエストロゲンとは異なるメカニズムで作用するため（Ａｂｏｔ ｅｔ ａｌ。、２０１４； Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ。、２０１５）、ヒト造血前駆細胞の毒性が低下する。エストロゲンの臨床使用は、それを本発明の目的に特に適したものにする。

【0038】

エステトロールは、β－エストラジオールよりも親和性が低く、ＥＲβよりもわずかに優先してＥＲに結合することが記載される。しかしながら、エステトロールとのＥＲα複合体は、β－エストラジオールとの複合体として重要なコアクチベーターＳＲＣ３に結合することができた。また、エストラジオールはパルミトイル－オレオイル－ホスファチジルコリンリポソームへのβ－エストラジオールと同様の溶解性を示したが、二重層内のエストラジオール分布（脂質－水界面のフェノールと疎水性コア内のフェノール）は主に脂質－水中間相に向けられていた。β－エストラジオールは、二重層の２つの配向の間で平衡状態で配向した。エステトロールのこれらの異なる化学的特性は、その特別な生物学的特性を促進する。

【0039】

本発明の方法は、以下の利点を提供する：ａ）造血生着が失敗するリスクが高いと考えられる患者を移植することができる。ｂ）ＨＳＣの適切な収穫を得るために必要なアフェレーシスサイクルの減少。ｃ）特定の数のＨＳＣの生着を可能にするＨＳＣＴコンディショニングレジメンの用量の減少。ｄ）全体として、造血移植の失敗の減少。本発明のために選択されたエストロゲン、エステトロールまたはその誘導体のいずれかは、ＨＳＣＴ（すなわち、エストロゲン用量を減少させた短期間の治療）の後に低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ／日で４日間）で投与される。例えば、Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．およびＴｈｕｒｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．よって記載されたアッセイ）。血液の回復は、血球数と免疫表現型の分析によって評価される。

【0040】

さらに、エストロゲン、特にエステトロールの投与が造血再構成を拡大し、移植においてさらに少量の造血幹細胞で十分であり得ることは注目に値する。その結果、例えば、臍帯血幹細胞移植は、子供だけでなく大人にも適用され得る。さらに、エストロゲンの投与は、雌の動物の造血再構成を促進し得る。したがって、本発明は女性対象に適用することができる。

【0041】

次に、いくつかの実施形態を、以下の非限定的な例によって詳細に説明する。

【実施例】

【0042】

（略語）
以下の例では、次の略語の意味は次のとおりである。定義されていない略語は、一般的に受け入れられている意味を持っています。
Ｇｙ ＝ グレイ
ＮＳＧ ＝ ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス
ＬＴＣ－ＩＣ ＝ 長期培養開始細胞
α－ＭＥＭ ＝ アルファ改変イーグル培地
ＦＢＳ ＝ ウシ胎児血清
ＨＳ ＝ ウマ血清
ＰＳ ＝ ペニシリン／ストレプトマイシン
ｈＥＰＯ ＝ ヒト組換えエリスロポエチン
ｈＳＣＦ ＝ ヒト組換え幹細胞因子
ｈＦＬＴ３Ｌ ＝ ヒトＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド

【0043】

（例１．造血幹細胞移植後の造血再構成の増加）
雄の免疫不全ＮＳＧマウスに２．２Ｇｙを照射し、２４時間後に５ｘ１０^４のヒト臍帯血ＣＤ３４^＋細胞を移植した。７２時間後、移植された動物は２μｇのエストロゲンまたはビヒクル（オリーブオイル）のいずれかで４日間毎日処理された。 ３～４か月後、動物を犠牲にし、ヒトの造血生着をＦＡＣＳで分析した。ヒト造血集団は、ｈＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が陽性で、マウスＣＤ４５．１－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が陰性の細胞として同定された。

【0044】

エストロゲンまたはビヒクルで処理した動物を比較した。結果を表１に示す：

【0045】

【表1】

【0046】

また、これらの動物のヒトの多系統再構成を分析した。結果を表２に示す：

【0047】

【表2】

【0048】

したがって、エストロゲンで処理されたマウスは、対照動物よりも約８０％多いヒト造血生着を有していた。さらに、造血系統のいずれにも違いはなかった。全体として、エストロゲンがヒトの造血再構成にプラスの効果をもたらすことを示す。

【0049】

（例２．エストロゲンはヒト造血生着において造血幹細胞コンパートメントを上昇させる）
ＨＳＣＴにおけるエストロゲンの効果をさらに調べるために、造血前駆細胞（ｈＣＤ３４＋）および造血幹細胞（ｈＣＤ３４＋／ｈＣＤ３８－）を、例１に記載の処理済みＮＳＧのヒト集団内のＦＡＣＳによって分析した。結果を表３に示す。

【0050】

【表3】

【0051】

さらに、ＨＳＣＴでの長期的な影響を研究するために、ヒトＣＤ４５＋細胞を選別し、二次照射された雌のＮＳＧマウスに移植した。二次移植の３か月後、エストロゲン処理した一次マウスの細胞を移植したすべての動物で、ヒトの造血生着が検出された。

【0052】

したがって、エストロゲン治療は、ヒト造血前駆細胞の７０％の増加と、ヒトＨＳＣの倍増をもたらした。さらに重要なことに、治療は長期的な人間の再構成に影響を与えなかった。

【0053】

（実施例３．雄動物における限られたＣＤ３４^＋細胞用量の移植に由来するエストロゲン産生ヒト造血生着）
エストロゲンが少数の造血前駆細胞の造血再構成を改善できるかどうかを判断するために、男性のＮＳＧに低用量のヒト臍帯血ＣＤ３４＋（５ｘ１０３ ｈＣＤ３４＋）を照射して移植した。例１に記載されるように、ヒト生着を分析した。低ヒト前駆細胞用量の生着を増強するためのエストロゲンの効果を表４に示す：

【0054】

【表4】

【0055】

エストロゲン、主にＥ４は、骨髄に０．１％以下のヒト造血細胞を有する非生着動物を考慮した場合、限られたＨＰＣ用量でＨＳＣＴの成功を支持した。以前に示したように、マウスの約４分の１が０．１％を超えるヒトの生着を持っていました。ただし、Ｅ２またはＥ４処理のいずれかは、移植されたマウスの割合をほぼ３倍にした。

【0056】

エストロゲンが女性レシピエントの造血再構成を改善できるかどうかを評価するために、女性ＮＳＧに低線量のヒト臍帯血ＣＤ３４^＋（５ｘ１０^３ ｈＣＤ３４^＋）を照射して移植した。例１に記載されるようにヒト生着を分析した。興味深いことに、雌動物におけるヒト生着は、おそらく雌動物における内因性エストロゲンの存在のために、同じ減少した数の造血前駆細胞を移植された雄レシピエントよりも高かった。しかし、この内因性エストロゲンの存在にもかかわらず、女性レシピエントにおけるヒトの生着は、Ｅ２後、さらに重要なことにＥ４治療後に増加した。

【0057】

【表5】

【0058】

さらに、原始造血前駆細胞の存在は、エストロゲンで治療された雌マウスでより高く、これは再構成の質を示した。

【0059】

【表6】

【0060】

データは、エストロゲンが限られた数のｈＣＤ３４^＋のレシピエントにおける生着も改善することができることを示す。

【0061】

（例４．エストロゲンはｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト骨髄様培養においてヒト前駆細胞を増加させる）
ヒトＨＳＣＴにおけるエストロゲンの有益な効果をさらに調査するために、ＬＴＣ－ＩＣ培養等のヒト骨髄様培養が確立された。１ｘ１０^５のヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）をｐ６ウェルに播種し、翌日３０Ｇｙを照射した。翌日、５ｘ１０^４ ｈＣＤ３４^＋がＬＴＣ－ＩＣ培地〔：フェノールレッド非含有７５％α－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１２．５％Ｈｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＨＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、β－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５％ＰＳおよび１ｘ１０^－６Ｍヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）〕中のｈＭＳＣに添加された。エタノールに溶解した１００μＭのエストロゲンを共培養に１週間加えた後、細胞を収集し、特定の造血サイトカイン（Ｈ４５３５、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラス８ Ｕ／ｍｌ ｈＥＰＯを含む半固形培地サプリメントでヒト造血前駆細胞の量を評価した。１４日後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を評価し、対照に対して正規化した：

【0062】

【表7】

【0063】

したがって、エストロゲン治療は、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト骨髄様培養におけるヒト造血前駆細胞の頻度を９８％にまで改善した。

【0064】

（例５．エステトロールはｉｎ ｖｉｔｒｏで造血細胞に対して他の天然エストロゲンよりもさらに低い毒性を示した）
造血前駆細胞に対する天然エストロゲン（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４）の毒性を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施した。５ｘ１０^４ ｈＣＤ３４^＋をフェノールレッド非含有培地Ｘ－Ｖｉｖｏ ２０（Ｌｏｎｚａ）中で、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、０．５％ＰＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の存在下で、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、またはＥ４（１０ｎＭから５００μＭ）の異なる濃度で培養した。異なる造血サブセット（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－、ＨＳＣ［ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ４５ＲＡ^－／ＣＤ９０^＋］、多能性前駆細胞［ＭＰＰ，ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ４５ＲＡ^－／ＣＤ９０^－］、多能性リンパ球前駆細胞［ＭＬＰ，ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ４５ＲＡ^＋］を培養０日目および４日後に評価した。

【0065】

Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、Ｅ４よりもすべての造血前駆細胞亜集団に対して毒性が高かった。対照的に、高濃度のＥ４は、すべての造血前駆細胞サブセット、主に最も原始的なもの（ＨＳＣ）に対してより許容されるようであった。Ｅ４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血前駆細胞に対する他の天然エストロゲンよりも低毒性である。

【0066】

【表8】

【0067】

（例６．エストロゲン受容体は造血前駆細胞で種々のレベルで発現する）
造血前駆細胞の種々のエストロゲンによって引き起こされる根本的なメカニズムを理解するために、造血前駆細胞コンパートメント中のＥＳＲα（ＥＳＲ１）およびＥＳＲβ（ＥＳＲ２）のｍＲＮＡ発現レベル。ＨＳＣ（ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ４５ＲＡ^－／ＣＤ９０^＋）、多能性リンパ球前駆細胞［ＭＬＰ，ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－／ＣＤ４５ＲＡ^＋］および残りの造血前駆細胞（ＣＤ３４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－）をソートした；ｍＲＮＡをＴｒｙｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって精製した。ｍＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってｃＤＮＡにレトロ転写し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。両方のエストロゲン受容体のｍＲＮＡ発現レベルをＨＰＲＴ１発現と比較し、すべての値をＰｆａｆｆｌの方法に従ってＨＳＣサブ集団のＥＳＲで正規化した。分析に使用した特定のプライマーは：ＥＳＲ１フォワード（ＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧ：配列番号１）およびＥＳＲ１リバース（ＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＴＡＣＴＣＡ：配列番号２）；ＥＳＲ２フォワード（ＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴ：配列番号３）およびＥＳＲ２リバース（ＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧ：配列番号４）；ＨＰＲＴ１フォワード（ＡＴＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧ：配列番号５）およびＨＰＲＴ１リバース（（ＴＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＣＣＣＴＣＡ：配列番号６）
であった。

【0068】

両方のＥＳＲの差次的発現を異なる造血前駆細胞サブセット間で同定した。ＥＳＲαは、ＨＳＣよりもＭＬＰで最大４倍発現した。驚いたことに、ＨＳＣでのＥＳＲβの発現は他の前駆細胞の２倍であった。これらの違いは、造血前駆細胞におけるエストロゲンの異なる効果を説明し得た。

【0069】

（例７．ミューズ造血ニッチ内のＭＳＣに対するＥ４（エステトロール）の影響）
ヒト造血生着の促進に対するエストロゲンのプラスの影響についてさらに洞察を提供するため、我々は、移植してＥ２（エストラジオール）またはＥ４（エステトロール）で治療してから４か月後のマウスＢＭニッチの間葉系および血管内皮コンパートメントを試験した。マウスＭＳＣ（ｍＣＤ１４０ａ＋、Ｐｄｇｆｒａ＋とも呼ばれる）および血管内皮細胞（ｍＣＤ１４４＋、ＶＥ－カドヘリン＋とも呼ばれる）の割合を非造血コンパートメントで分析した（図１１）。驚くべきことに、ｍＣＤ１４４＋細胞ではなく、ｍＣＤ１４０ａ＋細胞の数が、ビヒクルで処理した動物と比較して、Ｅ４で処理したマウスで増加した（図１２Ａ、１２Ｂ）。

【0070】

次に、ヒト間葉系間質細胞がこれらのエストロゲンと相互作用するかどうかを評価した。したがって、ＥＳＲ１およびＥＳＲ２の発現を、ＲＴ－ＰＣＲ（図１２Ｃ）および免疫蛍光（図１２Ｄ）によってヒトＢＭ－ＭＳＣコンパートメントでも分析した。そのために、細胞をレトロネクチン処理チャンバーで１日培養した。次に、それらを４％ＰＦＡで１０分間固定し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／１０％ＦＢＳ／０．３Ｍグリシン／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１時間ブロッキングおよび透過処理した。最後に、細胞をウサギ抗ＥＳＲ１（Ａｂｃａｍ）または抗ＥＳＲ２（Ａｂｃａｍ）とマウス抗ｈＣＤ３４－ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ）のいずれかで染色し、次に洗浄して二次抗Ｒａｂｂｉｔ－Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｒｏｃｈｅ）で対比染色して、細胞核を可視化した。すべての画像は１４６ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２ ｉｍａｇｉｎｇ（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡で視覚化した

【0071】

両方のエストロゲン受容体がヒトＢＭ－ＭＳＣに存在し、エストロゲンの存在がこれらの間質細胞の挙動に影響を及ぼし、生物学および／またはヒトＨＳＰＣの生着に間接的に影響を与え得たことを示す。

【0072】

全体として、エストロゲン、そしてより重要なことにエストロゲンは、免疫不全マウスへのヒト前駆細胞の造血生着を増強し、支持する。

【0073】

参考文献

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【配列表】

2022513587000001.app

【国際調査報告】