特表 2022-513642 バイオテクノロジー的に重要な細菌、クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＣａｓ９タンパク質に基づく、ＤＮＡカット手段

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(54)【発明の名称】バイオテクノロジー的に重要な細菌、クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＣａｓ９タンパク質に基づく、ＤＮＡカット手段

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220202BHJP

   C12N 9/22 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20220202BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N9/22 ZNA

C12N15/31

C12N15/55

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021529802

(86)(22)【出願日】2019-11-26

(85)【翻訳文提出日】2021-07-26

(86)【国際出願番号】 RU2019050229

(87)【国際公開番号】W WO2020111983

(87)【国際公開日】2020-06-04

(31)【優先権主張番号】2018141524

(32)【優先日】2018-11-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516261966

【氏名又は名称】ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド”

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】セベリノフ，コンスタンチン・ビクトロビッチ

(72)【発明者】

【氏名】シュマコフ，セルゲイ・アナトーレビッチ

(72)【発明者】

【氏名】アルタモノーバ，ダリア・ニコラエフナ

(72)【発明者】

【氏名】ゴリャニン，イグナティ・イゴーレビッチ

(72)【発明者】

【氏名】ムシャローバ，オルガ・セルゲーフナ

(72)【発明者】

【氏名】ピスクノーバ，イウリーア・バレレフナ

(72)【発明者】

【氏名】フェドロバ，イアナ・ビタレフナ

(72)【発明者】

【氏名】ジュブコ，タティアナ・イゴレフナ

(72)【発明者】

【氏名】ホドルコフスキー，ミクハイル・アレクセービッチ

(72)【発明者】

【氏名】ポベガロフ，ゲオルギー・エフゲネビッチ

(72)【発明者】

【氏名】アルセニエフ，アナトリー・ニコラエビッチ

(72)【発明者】

【氏名】セルコワ，ポリーナ・アナトレフナ

(72)【発明者】

【氏名】バシレバ，アレクサンドラ・アンドレエフナ

(72)【発明者】

【氏名】アルタモノーバ，タチアナ・オレゴフナ

(72)【発明者】

【氏名】アブラモバ，マリーナ・ビクトロフナ

【テーマコード（参考）】

4B050

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050LL01

4B050LL10

(57)【要約】

本発明は、細菌クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の新規細菌ヌクレアーゼ、ならびにＤＮＡ分子において厳密に特異的な二本鎖切断を形成するためのその使用を記載する。このヌクレアーゼは独自の特性を有し、そして単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列中の厳密に定義された部位に、修飾を導入するためのツールとして使用可能である。したがって、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の多用途性が増加し、これにより、より多数の特定の部位およびより広い温度範囲で、ゲノムまたはプラスミドＤＮＡをカットするため、多様な生物由来のＣａｓ９ヌクレアーゼの使用が可能になるであろう。さらに、バイオテクノロジー的に重要な細菌クロストリジウム・セルロリティクムのゲノムのより容易な編集を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’の直前に位置する、前記ＤＮＡ分子中の二本鎖切断を形成するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含む、タンパク質の使用。

【請求項2】

３７℃～６５℃の温度で、ＤＮＡ分子中に二本鎖切断が形成されることで特徴づけられる、請求項１記載のタンパク質の使用。

【請求項3】

タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のタンパク質の使用。

【請求項4】

配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’に直接隣接する、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列中に二本鎖切断を生成するための方法であって、当該生物の少なくとも１つの細胞内に、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、並びにｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’にすぐ隣接する生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、そして二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、を導入する工程を含む、
ここで、前記タンパク質と前記ガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＧＮＡ－３’の相互作用が、配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’に直接隣接するゲノムＤＮＡ配列中の二本鎖切断の形成を生じる
前記方法。

【請求項5】

ガイドＲＮＡと同時に、外因性ＤＮＡ配列の導入をさらに含む、請求項４記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関し、特に、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の新規細菌ヌクレアーゼを開示する。本発明を、多様な生物におけるＤＮＡの厳密に特異的な修飾のためのツールとして用いてもよい。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡ配列の修飾は、今日のバイオテクノロジー分野における時事問題の１つである。真核および原核生物のゲノムの編集および修飾、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの操作は、ＤＮＡ配列内への二本鎖切断のターゲティングされた導入を必要とする。この問題を解決するため、現在、以下の技術：ジンクフィンガー型のドメインを含有する人工的ヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、および細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が用いられる。最初の２つの技術は、特定のＤＮＡ配列の認識のため、ヌクレアーゼアミノ酸配列を最適化する労力を要する。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合は、ＤＮＡターゲットを認識する構造はタンパク質ではなく、小分子ガイドＲＮＡである。特定のＤＮＡターゲットのカットには、ヌクレアーゼまたはその遺伝子を新規に合成する必要はなく、ターゲット配列に相補的なガイドＲＮＡを用いることによって行われる。このため、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、多様なＤＮＡ配列をカットするための好適でそして効率的な手段となっている。該技術は、異なる配列のガイドＲＮＡを用いて、いくつかの領域でＤＮＡを同時にカットすることを可能にする。こうしたアプローチはまた、真核生物において、いくつかの遺伝子を同時に修飾するためにも用いられる。

【0003】

その性質により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ウイルス遺伝物質内に非常に特異的に切断を導入することが可能な、原核生物免疫系である（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００５． Ｖｏｌ． ６０． Ｉｓｓｕｅ ２． ｐｐ．１７４－１８２）。略語ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、「クラスター化され、規則的に間隔を空けられた、短いパリンドローム反復およびＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ）」を表す（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。すべてのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲカセットおよび多様なＣａｓタンパク質をコードする遺伝子からなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。ＣＲＩＳＰＲカセットは、各々、ユニークなヌクレオチド配列を有するスペーサー、および反復パリンドロームリピートからなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。ＣＲＩＳＰＲカセットの転写、その後のそのプロセシングの結果、ガイドｃｒＲＮＡが形成され、該ガイドｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質とともに、エフェクター複合体を形成する（Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ． Ｊ． Ｊ．ら Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８． Ｖｏｌ． ３２１． Ｉｓｓｕｅ ５８９１． ｐｐ．９６０－９６４）。ｃｒＲＮＡおよびプロトスペーサーと呼ばれるターゲットＤＮＡ部位の間の相補的対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡターゲットを認識し、そしてその中に、非常に特異的に切断を導入する。

【0004】

単一エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、系に含まれるＣａｓタンパク質に応じて、６つの異なるタイプ（Ｉ～ＶＩ型）にグループ分けされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、単純な組成および活性機構が特徴であり、すなわちその機能には、１つのＣａｓ９タンパク質および以下のような２つの小分子ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるエフェクター複合体の形成しか必要としない。トレーサーＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲリピートから生じるｃｒＲＮＡ領域と相補的に対形成して、ガイドＲＮＡがＣａｓエフェクターに結合するために必要な二次構造を形成する。Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ターゲットＤＮＡの相補鎖内に切断を導入する２つのヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を持ち、したがって、二本鎖ＤＮＡ切断を形成する、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼである（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ／／Ｎａｔｕｒｅ． ２０１１． Ｖｏｌ． ４７１． Ｉｓｓｕｅ ７３４０． ｐ．６０２）。

【0005】

これまでに、ＤＮＡ内に二本鎖切断をターゲティングし、そして特異的に導入することが可能な、いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼが知られる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の使用を制限する主な特性の１つは、ＤＮＡターゲットの３’端に隣接し、そしてその存在が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるＤＮＡの正確な認識のために必要である、ＰＡＭ配列である。多様なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は異なるＰＡＭ配列を有し、このため、任意のＤＮＡ領域でのヌクレアーゼの使用の潜在的可能性が制限される。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび生物ゲノムの両方で、任意のＤＮＡ領域を修飾することを可能にするには、新規の多様なＰＡＭ配列を持つＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の使用が必要である。真核ゲノムの修飾はまた、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＡＡＶ仲介性送達を提供するため、小さいサイズのヌクレアーゼの使用も必要とする。

【0006】

ＤＮＡをカットし、そしてゲノムＤＮＡ配列を修飾するための多くの技術が知られるが、多様な生物において、そしてＤＮＡ配列の厳密に特定の部位で、ＤＮＡを修飾するための新規の有効な手段に関する必要性がなおある。本発明は、この問題を解決するために必要ないくつかの特性を提供する。

【0007】

本発明の基礎は、細菌クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）で発見されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系である。嫌気性細菌クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃ．セルロリティクム）は、商業的なセルラーゼを添加せずにリグノセルロースを加水分解して、最終産物として、ラクテート、アセテートおよびエタノールを形成することが可能である（Ｄｅｓｖａｕｘ Ｍ． Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ： ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． ２００５ Ｓｅｐ；２９（４）：７４１－６４）。これらの微生物のこうした能力により、これらは生物燃料産生者の有望な候補となっている。バイオテクノロジー的産生におけるＣ．セルロリティクムなどの産生細菌の使用は、原材料プロセシングサイクルをより効率的にし、効率を増加させ、そして最終的に生物圏のすべての構成要素に対する負荷を減少させるのを補助するであろう。遺伝子操作法は、微生物代謝パラメータを有意に改善し、そしてラクテートおよびアセテートよりもより多くのブタノールの産生を支持するように、バランスを傾けることも可能である。例えば、乳酸およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の二重突然変異体は、ラクテート形成の非存在およびブタノール収率の増加を示した（Ｌｉ Ｙら， Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ ｌａｃｔａｔｅ ａｎｄ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｙｉｅｌｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ． ２０１２ Ｊａｎ ４；５（１）：２）。これまでに、アセテート産生を減少させうる、ホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼ遺伝子に突然変異を持つＣ．セルロリティクム株を産生するための有効な方法を開発することは不可能であった。本発明を用いて、クロストリジウム・セルロリティクムならびに他の生物のゲノムを修飾してもよい。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００５． Ｖｏｌ． ６０． Ｉｓｓｕｅ ２． ｐｐ．１７４－１８２

【非特許文献2】Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５

【非特許文献3】Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ． Ｊ． Ｊ．ら Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８． Ｖｏｌ． ３２１． Ｉｓｓｕｅ ５８９１． ｐｐ．９６０－９６４

【非特許文献4】Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ／／Ｎａｔｕｒｅ． ２０１１． Ｖｏｌ． ４７１． Ｉｓｓｕｅ ７３４０． ｐ．６０２

【非特許文献5】Ｄｅｓｖａｕｘ Ｍ． Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ： ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． ２００５ Ｓｅｐ；２９（４）：７４１－６４

【非特許文献6】Ｌｉ Ｙら， Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ ｌａｃｔａｔｅ ａｎｄ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｙｉｅｌｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ． ２０１２ Ｊａｎ ４；５（１）：２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いて、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾するための新規手段を提供することである。現在の系は、修飾しようとするＤＮＡ領域の３’端に存在しなければならない、特定のＰＡＭ配列のため、使用に制限がある。他のＰＡＭ配列を持つ新規Ｃａｓ９酵素の検索は、多様な生物のＤＮＡ分子における望ましい厳密な特定の部位に、二本鎖切断を形成するための利用可能な手段の範囲を拡張するであろう。

【課題を解決するための手段】

【0010】

この問題を解決するため、著者らは、上記のおよび他の生物の両方のゲノム内に、定向性修飾を導入するために使用可能な、Ｃ．セルロリティクムに関して以前予期されていたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＣｃＣａｓ９を特徴づけた。本発明を特徴づける本質的な特徴は、以下の通りである：（ａ）他の既知のＰＡＭ配列とは異なる、小分子２文字ＰＡＭ配列；（ｂ）１０３０アミノ酸残基（ａ．ａ．ｒ．）であり、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の既知のＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）のものよりも２３ａ．ａ．ｒ．小さい、特徴的なＣｃＣａｓ９タンパク質の小さいサイズ；（ｃ）多様な温度を有する生物中で使用可能となるであろう、３７℃～６５℃の温度で活性であり、４５℃で最適である、ＣｃＣａｓ９ヌクレアーゼの広い作動温度範囲。

【0011】

前記問題は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして配列番号１と非保存性アミノ酸残基においてのみ異なるアミノ酸配列を含む、タンパク質を用いて、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’の直前に位置する、前記ＤＮＡ分子中の二本鎖切断を形成することによって、解決される。Ｎは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を指すよう意図される。本発明のいくつかの態様において、この使用は、３７℃～６５℃の温度で、ＤＮＡ分子中に二本鎖切断が形成されることで特徴づけられる。本発明の好ましい態様において、この使用は、３７℃～５５℃の温度で、ＤＮＡ分子中に二本鎖切断が形成されることで特徴づけられる。

【0012】

前記問題は、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾するための方法であって、当該生物の少なくとも１つの細胞内に、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸のいずれか、並びにｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’にすぐ隣接する生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、そして二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のいずれかであって、前記タンパク質と該ガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’との相互作用が、配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’にすぐ隣接するゲノムＤＮＡ配列中の二本鎖切断の形成を生じる、前記ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のいずれかを導入する工程を含む、前記方法を用いることによって、さらに解決される。

【0013】

ターゲットＤＮＡ領域およびＣｃＣａｓ９タンパク質と複合体を形成可能であるｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の混合物を、ガイドＲＮＡとして用いてもよい。本発明の好ましい態様において、ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡに基づいて構築されたハイブリッドＲＮＡをガイドＲＮＡとして用いてもよい。ハイブリッドガイドＲＮＡを構築するための方法は、当業者に公知である（Ｈｓｕ ＰＤら， ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８２７－３２）。

【0014】

本発明を、ターゲットＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏカットのため、そしていくつかの生物のゲノムを修飾するため、の双方に用いてもよい。直接方式で、すなわち対応する部位でゲノムをカットすることによって、ならびに相同修復を通じて、外因性ＤＮＡ配列を挿入することによって、ゲノムを修飾してもよい。

【0015】

投与に用いる以外の生物ゲノム由来の二本鎖または一本鎖ＤＮＡの任意の領域（またはそれら自体の中のこうした領域の組成物、および他のＤＮＡ断片を含むもの）を外因性ＤＮＡ配列として用いてもよく、ここで前記領域（または領域の組成物）は、ＣｃＣａｓ９ヌクレアーゼによって誘導されて、ターゲットＤＮＡ中の二本鎖切断の部位内に組み込まれるよう意図される。本発明のいくつかの態様において、ＣｃＣａｓ９タンパク質の導入のために用いられるが、突然変異（ヌクレオチド置換）によって、ならびに１つまたはそれより多いヌクレオチドの挿入または欠失によって、さらに修飾されている、生物ゲノム由来の二本鎖ＤＮＡ領域を、外因性ＤＮＡ配列として用いてもよい。

【0016】

本発明の技術的結果は、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の多用途性を増加させて、より多数の特定の部位およびより広い温度範囲で、ゲノムまたはプラスミドＤＮＡをカットするためのＣａｓ９ヌクレアーゼの使用を可能にすることである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】クロストリジウム・セルロリティクムにおけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のスキーム。

【図2】ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によるＰＡＭの決定。配列ＮＮＮＮＧＮＡに制限された、ＤＮＡをカットするための系の発展。

【図3】個々のＰＡＭ位の有意性のチェック。

【図4】多様なＤＮＡターゲットをカットする際のタンパク質活性のチェック。

【図5】ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子のＤＮＡ断片のｉｎ ｖｉｔｒｏカット反応。

【図6】ＣｃＣａｓ９活性の温度範囲の研究。

【図7】ガイドＲＮＡおよびターゲットＤＮＡ領域の間の相互作用のスキーム。

【図8】生物、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＣｊＣａｓ９）、およびＣｃＣａｓ９由来のＣａｓ９タンパク質の配列の整列。配列の非保存性領域を下線で示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明の説明で用いた際、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「他のものの中でも、含む」を意味するよう解釈すべきである。前記用語は、「のみからなる」と解釈されるとは意図されない。別に定義しない限り、本出願中の技術的および科学的用語は、科学的および技術的文献中に一般的に認められる典型的な意味を有する。

【0019】

本明細書において、用語「２つの配列の相同性パーセント」は、用語「２つの配列の同一性パーセント」と同等である。配列同一性は、参照配列に基づいて決定される。配列分析のためのアルゴリズムが当該技術分野に知られ、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ｐｐ．４０３－１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴがある。本発明の目的のため、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の間の同一性および類似性のレベルを決定するため、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較を用いてもよく、これは、標準パラメータを伴い、ギャップ化整列を用いて、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって提供されるＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によって実行される。２つの配列の同一性パーセントは、整列による２つの配列の最適比較のために挿入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、これらの２つの配列中の同一アミノ酸位の数によって決定される。同一性パーセントは、配列整列を考慮に入れ、所定の位で同一であるアミノ酸の数を、位の総数で割り、そして１００を乗じたものに等しい。

【0020】

用語「特異的にハイブリダイズする」は、２つの一本鎖核酸分子または十分に相補的な配列の間の会合を指し、これは、当該技術分野において典型的に用いられるあらかじめ決定した条件下でのこうしたハイブリダイゼーションを可能にする。

【0021】

句「ヌクレオチドＰＡＭ配列の直前に位置する二本鎖切断」は、ターゲットＤＮＡ配列中の二本鎖切断が、ヌクレオチドＰＡＭ配列の０～２５ヌクレオチド前の距離で作製されることを意味する。

【0022】

特定のアミノ酸配列を含むタンパク質は、前記アミノ酸配列、および前記アミノ酸配列にペプチド結合によって連結されるありうる他の配列で構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質を指すよう意図される。他の配列の例は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または前記アミノ酸配列の機能性増加を提供する他の配列であってもよい。

【0023】

ガイドＲＮＡと同時に導入される外因性ＤＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの特異性によって決定される切断の部位での二本鎖ターゲットＤＮＡの特異的修飾のために特に調製されるＤＮＡ配列を指すよう意図される。こうした修飾は、例えば、ターゲットＤＮＡ中の切断部位での特定のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。外因性ＤＮＡは、異なる生物由来のＤＮＡ領域またはターゲットＤＮＡのものと同じ生物由来のＤＮＡ領域のいずれであってもよい。

【0024】

細胞内に導入されるタンパク質およびＲＮＡの有効量は、前記細胞内に導入された際、機能的複合体、すなわちターゲットＤＮＡに特異的に結合し、そして該ＤＮＡ中で、ガイドＲＮＡおよびＤＮＡ上のＰＡＭ配列によって決定される部位で二本鎖切断を生じるであろう複合体を形成可能であるような、タンパク質およびＲＮＡの量を指すよう意図される。このプロセスの効率は、当業者に知られる慣用的技術を用いて、前記細胞から単離されたターゲットＤＮＡを分析することによって評価されうる。

【0025】

多様な技術によって、タンパク質およびＲＮＡを細胞に送達してもよい。例えば、タンパク質を、このタンパク質の遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドとして、細胞質においてこのタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡとして、またはこのタンパク質およびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体として、送達してもよい。当業者に知られる多様な技術によって、送達を行ってもよい。

【0026】

系の構成要素をコードする核酸を、以下のように：当業者に知られる方法による細胞のトランスフェクションまたは形質転換によって、組換えウイルスの使用によって、細胞に対する操作、例えばＤＮＡマイクロインジェクション等によって、直接または間接的に細胞内に導入してもよい。

【0027】

ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡおよび外因性ＤＮＡ（必要な場合）からなるリボ核酸複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）を、複合体を細胞内にトランスフェクションすることによって、または複合体を細胞内に機械的に導入することによって、例えばマイクロインジェクションによって、送達してもよい。

【0028】

細胞内に導入しようとするタンパク質をコードする核酸分子は、染色体内に組み込まれてもよいし、または染色体外で複製されるＤＮＡであってもよい。いくつかの態様において、細胞内に導入されたＤＮＡでのタンパク質遺伝子の有効な発現を確実にするために、多様な生物ゲノムのコード領域において、同義のコドンの出現頻度は不均等であるため、発現のためコドンを最適化するように、細胞タイプにしたがって、前記ＤＮＡの配列を修飾することが必要である。コドン最適化は、動物、植物、真菌、または微生物細胞において、発現を増加させるために必要である。

【0029】

配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である配列を有するタンパク質が、真核細胞において機能するには、このタンパク質が、最終的にこの細胞の核中に行きつくことが必要である。したがって、本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして１つまたはそれより多い核局在化シグナルの付加によって一端または両端でさらに修飾されている配列を有するタンパク質を用いて、ターゲットＤＮＡ中に二本鎖切断を形成する。例えば、ＳＶ４０ウイルス由来の核局在化シグナルを用いてもよい。核への効率的な送達を提供するため、例えば、Ｓｈｅｎ Ｂら ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｙ；２３（５）：７２０－３に記載される、スペーサー配列によって、主要タンパク質配列から核局在化シグナルを分離してもよい。さらに、他の態様において、異なる核局在化シグナル、または前記タンパク質を細胞核内に送達するための代替法を用いてもよい。

【0030】

本発明は、厳密に特定される位で、ＤＮＡ分子内に二本鎖切断を導入するための、以前特徴づけられたＣａｓ９タンパク質に相同であるクロストリジウム・セルロリティクム（Ｃ．セルロリティクム）生物由来のタンパク質の使用を含む。

【0031】

代謝操作において、Ｃ．セルロリティクムゲノムの編集は、効率的な編集ツールがないため、困難なタスクである。ターゲティング化ゲノム編集のための方法、例えばリコンビアニリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ＩＩ群イントロンレトロ転位、およびアレル交換は、いくつかの重大な制限を有する。例えば、組換え依存性アレル交換の方法は、かなり時間を消費し、そして低い効率を有する（Ｈｅａｐ Ｊ． Ｔ．ら Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｃｏｕｎｔｅｒ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ／／Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１２． Ｖｏｌ． ４０． Ｉｓｓｕｅ ８． ｐｐ．ｅ５９－ｅ５９）。長いＤＮＡ断片の挿入、例えば代謝経路トランスファーは、組換え部位および／またはリコンビナーゼの存在を必要とする、現在のゲノム編集ツールでは困難である（Ｅｓｖｅｌｔ Ｋ． Ｍ．， Ｗａｎｇ Ｈ． Ｈ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１３． Ｖｏｌ． ９． Ｉｓｓｕｅ １． ｐ．６４１）。ゲノム操作を成功させ、そしてあらかじめ決定した特性を持つ突然変異体を産生するには、単純で効率的な方法が必要である。

【0032】

ゲノムにターゲティング化修飾を導入するためのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの使用は、いくつかの利点を有する。第一に、系の活性の特異性は、ｃｒＲＮＡ配列によって決定され、これは、すべてのターゲット遺伝子座に対して１つのタイプのヌクレアーゼを使用することを可能にする。第二に、該技術は、異なる遺伝子ターゲットに相補的ないくつかのガイドＲＮＡを、細胞内に同時に送達することを可能にし、それによって、いくつかの遺伝子を同時に修飾することを可能にする。

【0033】

さらに、細菌Ｃ．セルロリティクム由来の天然ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の使用は、この生物のゲノムを編集するための系を、より容易でそして効率的なものにし、これは、この方法が外来性の遺伝子の細胞内への導入、その維持および発現を必要としないためである。その代わり、細菌内に、ターゲット遺伝子に対して向けられるガイドＲＮＡを導入するための方法を開発することが可能であり、これによって、宿主細胞内ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、バイオテクノロジー的に重要な細菌の対応するＤＮＡターゲットを認識し、そしてその中に二本鎖切断を導入することが可能であろう。

【0034】

Ｃ．セルロリティクムＨ１０由来のＣａｓ９タンパク質の生化学的特徴づけのため、主な系の構成要素（ＣｃＣａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２タンパク質遺伝子、ならびにＣＲＩＳＰＲカセットおよびガイドＲＮＡ）をコードするＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、単一コピー細菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４内にクローニングした。Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（トレーサーＲＮＡ）二重鎖からなるエフェクター・リボ核酸複合体は、ｃｒＲＮＡスペーサー－プロトスペーサー相補性に加えて、ＤＮＡの認識およびそれに続く加水分解のため、ＤＮＡターゲット上に、ＰＡＭ（プロトスペーサー調節モチーフ）の存在を必要とする（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ／／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００９． Ｖｏｌ． １５５． Ｉｓｓｕｅ ３． ｐｐ．７３３－７４０）。ＰＡＭは、オフターゲット鎖上のプロトスペーサーの３’端に隣接するかまたは数ヌクレオチド離れて、ＩＩ型系中に位置する、数ヌクレオチドの厳密に定義された配列である。ＰＡＭが存在しない場合、二本鎖切断の形成を伴うＤＮＡ結合の加水分解は起こらない。ターゲット上のＰＡＭ配列の存在の必要性は、認識特異性を増加させるが、同時に、切断を導入するためのターゲットＤＮＡ領域の選択に制約を課す。

【0035】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のガイドＲＮＡの配列を決定するため、生成されたｐＡＣＹＣ１８４＿ＣｃＣａｓ９構築物を所持する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファ細菌のＲＮＡ配列決定を行った。配列決定は、系のＣＲＩＳＰＲカセットが活発に転写され、トレーサーＲＮＡも同様であることを示した（図１）。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の分析によって、これらが、おそらくＣｃＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される二次構造を形成可能であると考えることを可能にした。

【0036】

さらに、著者らは、細菌ＰＡＭスクリーニングを用いて、ＣｃＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定した。ＣｃＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定するため、ｐＡＣＹＣ１８４＿ＣｃＣａｓ９プラスミドを所持する大腸菌ＤＨ５アルファ細胞を、５’または３’端にランダム７文字配列が隣接する、ＣｃＣａｓ９系のＣＲＩＳＰＲカセットのスペーサー配列５’－ＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＣＡＡＧＣＧＡＴＧＡＴＡＴＧＡＡＴＧＣ－３’を含有するプラスミドライブラリーによって形質転換した。ＣｃＣａｓ９系のＰＡＭ配列に対応する配列を所持するプラスミドを、機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の作用の下で分解に供する一方、残りのライブラリープラスミドを細胞内に有効に形質転換して、これらを抗生物質アンピシリンに耐性にした。形質転換し、そして抗生物質を含有するプレート上で細胞をインキュベーションした後、コロニーを寒天表面から洗い流し、そしてＱｉａｇｅｎプラスミド精製Ｍｉｄｉキットを用いて、そこからＤＮＡを抽出した。プラスミドの単離プールから、ＰＣＲによって、ランダム化ＰＡＭ配列を含有する領域を増幅し、そして次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上でハイスループット配列決定に供した。ｐＡＣＹＣ１８４＿ＣｃＣａｓ９を所持する細胞への、または空ベクターｐａｃｙｃ１８４を所持する対照細胞への、ライブラリー中に含まれるユニークなＰＡＭを含むプラスミドの形質転換効率を比較することによって、生じた読み取りを分析した。バイオインフォマティクス法を用いて、結果を分析した。その結果、ＣｃＣａｓ９系のＰＡＭを同定することが可能であり、これは２文字配列ＮＮＮＮＧＮＡ（図２）である。

【0037】

次に、カット反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで再現することによって、ＰＡＭ配列をさらに決定した。ＣｃＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定するため、二本鎖ＰＡＭライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏカットを用いた。この目的に向けて、以下のようなＣｃＣａｓ９エフェクター複合体の構成要素：ガイドＲＮＡおよび組換え型のヌクレアーゼをすべて得る必要があった。ＲＮＡ配列決定によるガイドＲＮＡ配列の決定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を合成することを可能にした。ＮＥＢ ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キットを用いて、合成を行った。二本鎖ＤＮＡライブラリーは、ランダム化７ヌクレオチド（５’ＮＮＮＮＮＮＮ３’）が３’端に隣接しているプロトスペーサー配列を含む、３７４ｂｐ断片であった：

【0038】

【化1】

【0039】

このターゲットをカットするため、以下の配列のガイドＲＮＡを用いた：

【0040】

【化2】

【0041】

太字は、プロトスペーサー（ターゲットＤＮＡ配列）に相補的なｃｒＲＮＡ配列を示す。
組換えＣｃＣａｓ９タンパク質を得るため、その遺伝子をプラスミドｐＥＴ２１ａ内にクローニングした。生じたプラスミドＣｃＣａｓ９＿ｐＥＴ２１ａによって、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ細胞を形質転換した。プラスミドを所持する細胞をＯＤ＿６００＝０．６の光学密度まで増殖させ、次いで、１ｍＭ濃度までＩＰＴＧを添加することによって、ＣｃＣａｓ９遺伝子の発現を誘導した。細胞を２５℃で４時間インキュベーションした後、溶解した。組換えタンパク質を以下のように：アフィニティクロマトグラフィ（ＮｉＮＴＡ）により、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上のタンパク質サイズ排除により、２段階で精製した。Ａｍｉｃｏｎ ３０ｋＤａフィルターを用いて、生じたタンパク質を濃縮した。その後、マイナス８０℃でタンパク質を凍結し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に用いた。

【0042】

直鎖ＰＡＭライブラリーをカットするｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を、以下の条件で行った：
１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液
４００ｎＭ ＣｃＣａｓ９
１００ｎＭ ＤＮＡライブラリー
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
総反応体積は２０μｌであった。

【0043】

クロストリジウム・セルロリティクムＨ１０は、堆肥の山でよく見られ、そして４５℃の最適分裂温度を有し、そしてしたがって、この温度での反応を３０分間で行った。
カットの結果、ライブラリー断片の部分は、約５０塩基対（ｂｐ）および３２４ｂｐの長さを有する２つの部分に分割された。対照試料として、Ｃａｓエフェクター複合体の本質的な構成要素であるｃｒＲＮＡが添加されていない反応を用いた。

【0044】

反応産物を１．５％アガロースゲル上に適用し、そして電気泳動に供した。長さ３７４ｂｐのアンカットＤＮＡ断片をゲルから抽出し、そしてＮＥＢ ＮｅｘｔＵｌｔｒａ ＩＩキットを用いたハイスループット配列決定のために調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で試料を配列決定し、そして次いで、バイオインフォマティクス法を用いて配列を分析し、ここで、対照試料と比較して、ＰＡＭ（ＮＮＮＮＮＮＮ）の個々の位のヌクレオチドの提示の相違を決定した（図３）。

【0045】

その結果、著者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって、ＣｃＣａｓ９のＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＮＡを決定することが可能であり、これは細菌を用いた実験で得られた結果を完全に反復した。

【0046】

次に、ＰＡＭ配列の個々の位の有意性をチェックした。この目的に向けて、ＰＡＭ配列ＧＡＧＡＧＴＡに隣接するＤＮＡターゲット５’－ｇｔｇｃｔｃａａｔｇａａａｇｇａｇａｔａ－３’を含むＤＮＡ断片をカットする際の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を行った：

【0047】

【化3】

【0048】

以下の条件下で反応を行った：
１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液
４００ｎＭ ＣｃＣａｓ９
２０ｎＭ ＤＮＡ
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
インキュベーション時間は３０分間であり、反応温度は４５℃であった。実験結果は、ＣｃＣａｓ９のＰＡＭ配列をＮＮＮＮＧＮＡ－３’と確認した。最も保存されたアミノ酸は、５位のＧであった（図４を参照されたい）。

【実施例】

【0049】

方法の以下の例示的態様は、本発明の特性を開示する目的のために提供され、そしていかなる意味でも本発明の範囲を制限するとは見なされないものとする。
実施例１． 多様なＤＮＡターゲットのカットにおけるＣｃＣａｓ９タンパク質の活性の試験。

【0050】

ＮＮＮＮＧＮＡ３’配列が隣接している多様なＤＮＡ配列を認識するＣｃＣａｓ９の能力をチェックするため、ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子配列由来のＤＮＡターゲット（以下の表１を参照されたい）のｉｎ ｖｉｔｒｏカットに関する実験を行った。

【0051】

表１． ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子から単離されたＤＮＡターゲット

【0052】

【表1】

【0053】

上述の実験のものと類似の条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡカット反応を行った。ＤＮＡターゲットとして、約５００ｂｐのサイズを持つヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子断片を用いた：

【0054】

【化4】

【0055】

実験結果は、ガイドＲＮＡを含む複合体中のＣｃＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＮＡを含む多様なＤＮＡターゲットを認識可能であることを示す（図５）。いくつかのターゲットの場合、ＣｃＣａｓ９は、ＰＡＭ配列の７位での置換を許容する。

【0056】

実施例２． ＣｃＣａｓ９活性の温度範囲。
ＣｃＣａｓ９タンパク質の温度範囲を決定するため、異なる温度条件下で、ＤＮＡターゲットのｉｎ ｖｉｔｒｏカットに対する実験を行った。

【0057】

この目的に向けて、ＰＡＭ配列ＧＡＧＡＧＴＡが隣接するターゲットＤＮＡを、異なる温度で、対応するガイドＲＮＡを含むＣｃＣａｓ９エフェクター複合体によるカットに供した（図６）。

【0058】

ＣｃＣａｓ９タンパク質は、活性の広い温度範囲を有することが見出された。最大ヌクレアーゼ活性は４５℃の温度で達成される一方、タンパク質は、３７℃～５５℃の範囲で十分に活性である。したがって、ガイドＲＮＡを含む複合体中のＣｃＣａｓ９は、３７℃～５５℃の温度範囲を持つ、配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’に制限されるＤＮＡ分子中のカット（二本鎖切断の形成）のための新規ツールである。ガイドＲＮＡを一緒に形成するｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とターゲットＤＮＡの複合体のスキームを図７に示す。

【0059】

実施例３．
クロストリジウム属に属する近縁生物由来のＣａｓ９タンパク質。これまでに、クロストリジウム属では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は１つしか見出されておらず、これはクロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系である（Ｍａｉｋｏｖａ Ａら， Ｎｅｗ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ ３１；９：１７４０）。

【0060】

細菌クロストリジウム・ペルフリンゲンス由来のＣａｓ９タンパク質は、ＣｃＣａｓ９タンパク質と３６％同一である（ＢＬＡＳＴｐソフトウェア、デフォルトパラメータを用いて、同一性の度合いを計算した）。匹敵するサイズの、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９タンパク質は、ＣｃＣａｓ９に２８％同一である（ＢＬＡＳＴｐ、デフォルトパラメータ）。

【0061】

したがって、ＣｃＣａｓ９タンパク質は、関連生物で見出されたものを含めて、これまでに研究されている他のＣａｓ９タンパク質由来のアミノ酸配列において、有意に異なる。

【0062】

遺伝子操作の当業者は、本出願者らによって得られ、そして特徴づけられているＣｃＣａｓ９タンパク質配列変異体を、タンパク質自体の機能を変化させずに修飾しうる（例えば機能活性に直接影響を及ぼさないアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８９）， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１５．３－１５．１０８））ことを認識するであろう。特に、当業者は、タンパク質機能性に関与する（タンパク質機能または構造を決定する）残基に影響を及ぼすことなく、非保存性アミノ酸残基を修飾しうることを認識するであろう。こうした修飾の例には、相同のものでの非保存性アミノ酸残基の置換が含まれる。非保存性アミノ酸残基を含有する領域のいくつかを図８に示す。本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を使用して、ＤＮＡ分子において、前記ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’の直前に位置する二本鎖切断を形成することが可能である。対応する核酸分子を突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ仲介性突然変異誘発）することによって、相同タンパク質を得て、その後、本明細書に記載する機能分析にしたがって、その機能の保持に関して、コードされる修飾Ｃａｓ９タンパク質を試験してもよい。

【0063】

実施例４． 本発明記載のＣｃＣａｓ９系を、ガイドＲＮＡと組み合わせて用いて、真核生物を含む多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾してもよい。この生物の細胞内に（すべての細胞内にまたは一部の細胞内に）、ガイドＲＮＡを含む複合体中のＣｃＣａｓ９系を導入するため、当業者に知られる多様なアプローチを適用してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を生物の細胞に送達するための方法は、情報源中（Ｌｉｕ Ｃら， Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１７ Ｎｏｖ ２８；２６６：１７－２６； Ｌｉｎｏ ＣＡら， Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２０１８ Ｎｏｖ；２５（１）：１２３４－１２５７）に、そしてこれらの情報源内にさらに開示される情報源中に開示されている。

【0064】

真核細胞におけるＣｃＣａｓ９ヌクレアーゼの有効な発現のため、当業者に知られる方法（例えば、ＩＤＴコドン最適化ツール）によって、ＣｃＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列に関してコドンを最適化することが望ましいであろう。

【0065】

真核細胞におけるＣｃＣａｓ９ヌクレアーゼの有効な活性のため、真核細胞の核内にタンパク質を移入することが必要である。これは、Ｓｈｅｎ Ｂら ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｙ；２３（５）：７２０－３に記載されるスペーサー配列を通じて、またはスペーサー配列を含まずに、ＣｃＣａｓ９配列に連結された、ＳＶ４０ Ｔ抗原（Ｌａｎｆｏｒｄら， Ｃｅｌｌ， １９８６， ４６：５７５－５８２）由来の核局在化シグナルを用いることによって行われてもよい。したがって、真核細胞の核内に輸送されるべきヌクレアーゼの完全アミノ酸配列は、以下の配列であろう：ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ－ＣｃＣａｓ９－ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（以後、ＣｃＣａｓ９ ＮＬＳと称される）。上記アミノ酸配列を含むタンパク質を、少なくとも２つのアプローチを用いて送達してもよい。

【0066】

遺伝子送達は、プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の制御下でＣｃＣａｓ９ ＮＬＳ遺伝子を、そしてＵ６プロモーターの制御下でガイドＲＮＡをコードする配列を所持するプラスミドを生成することによって達成される。ＤＮＡターゲットとして、５’－ＮＮＮＮＧＮＡ－３’が隣接するＤＮＡ配列を用い、これは例えばヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子のものである：

【0067】

【化5】

【0068】

したがって、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、以下のようになる：

【0069】

【化6】

【0070】

太字は、Ｕ６プロモーター配列を示し、この後に、ターゲットＤＮＡ認識に必要な配列が続き、一方、ダイレクトリピート配列は、大文字で強調される。
トレーサーＲＮＡ発現カセットは、以下のようになる：

【0071】

【化7】

【0072】

太字は、Ｕ６プロモーター配列を示し、この後に、トレーサーＲＮＡをコードする配列が続く。
プラスミドＤＮＡを精製し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションする。細胞を７２時間インキュベーションし、その後、ゲノムＤＮＡ精製カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、そこからゲノムＤＮＡを抽出する。定向性二本鎖切断、その後、その修復によりターゲット部位で行われたＤＮＡ中の挿入／欠失の数を決定するため、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定することによって、ターゲットＤＮＡ部位を分析する。

【0073】

例えば、上述のｇｒｉｎ２ｂ遺伝子部位に関して、切断導入の推定部位に隣接するプライマーを用いて、ターゲット断片の増幅を行う：

【0074】

【化8】

【0075】

増幅後、ハイスループット配列決定のためのＩｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）試薬試料調製プロトコルに関してＵｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリープレップキットにしたがって、試料を調製する。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上、３００サイクル、直接読み取りで、配列決定を行う。バイオインフォマティクス法によって、配列決定結果を分析する。ターゲットＤＮＡ配列中のいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失を、カット検出と見なす。

【0076】

ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）中、ガイドＲＮＡと組換えＣｃＣａｓ９ ＮＬＳをインキュベーションすることによって、リボ核酸複合体としての送達を行う。サイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）を伴うアフィニティクロマトグラフィ（ＮｉＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）によって、組換えタンパク質を精製することによって、細菌産生細胞から組換えタンパク質を産生する。

【0077】

タンパク質を、１：２：２（ＣｃＣａｓ９ ＮＬＳ：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）の比でＲＮＡと混合し、該混合物を室温で１０分間インキュベーションし、そして次いで細胞内にトランスフェクションする。

【0078】

次に、そこから抽出したＤＮＡを、ターゲットＤＮＡ部位での挿入／欠失に関して分析する（上述の通り）。
本発明で特徴づけられる細菌クロストリジウム・セルロリティクム由来のＣｃＣａｓ９ヌクレアーゼは、以前特徴づけられたＣａｓ９タンパク質に比較して、いくつかの利点を有する。

【0079】

ＣｃＣａｓ９は、系が機能するために必要な他の既知のＣａｓヌクレアーゼとは異なり、短い２文字ＰＡＭを有する。著者らによれば、プロトスペーサーから４ヌクレオチド離れて位置する短いＰＡＭ ＧＮＡが、ＣｃＣａｓ９には十分である。さらに、＋５位のＧが非常に重要である一方、＋７位はそれより重要ではなく、そして＋７位のＡまたはＴの存在下だけでなく、Ｃの存在下でも、効率はわずかに低いが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解が検出された。

【0080】

ＤＮＡ内に二本鎖切断を導入可能である、これまでに知られているＣａｓヌクレアーゼの大部分は、複雑な多文字ＰＡＭ配列を有し、カットに適切な配列の選択が制限される。小分子ＰＡＭを認識する、研究したＣａｓヌクレアーゼの中で、ＣｃＣａｓ９のみが、ＧＮＡヌクレオチドに制限された配列を認識可能である。

【0081】

ＣｃＣａｓ９の第二の利点は、タンパク質サイズが小さい（１０３０ａ．ａ．ｒ．、これはＳａＣａｓ９のものに比較して、２３ａ．ａ．ｒ．少ない）ことである。今日まで、ＣｃＣａｓ９は、２文字ＰＡＭ配列を有する、研究される唯一の低分子量タンパク質である。

【0082】

ＣｃＣａｓ９系の第三の利点は、活性の広い温度範囲である：該ヌクレアーゼは３７℃～６５℃の温度で活性であり、４５℃が最適である。
本発明は、開示する態様に言及して記載されてきているが、当業者は、詳細に記載される特定の態様が、本発明を例示する目的のために提供されており、そしていかなる意味でも本発明の範囲を限定するとは見なされないことを認識するであろう。本発明の精神から逸脱することなく、多様な修飾を行ってもよいことが理解されるであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】