特表 2022-513652 機能および抑制性環境に対する抵抗性を増強するための免疫細胞のマルチプレックスゲノム編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(54)【発明の名称】機能および抑制性環境に対する抵抗性を増強するための免疫細胞のマルチプレックスゲノム編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220202BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220202BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220202BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220202BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20220202BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20220202BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20220202BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20220202BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N5/10

C12N5/0783

C12N15/63 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

A61P37/02

A61P31/00

A61P35/00

A61P37/06

A61P29/00

A61K35/17 Z

A61K45/00

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/55

C12N15/31

C12N5/0781

C12N5/0789

C07K14/725

C07K19/00

C12N5/0775

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021530101

(86)(22)【出願日】2019-11-27

(85)【翻訳文提出日】2021-07-26

(86)【国際出願番号】 US2019063641

(87)【国際公開番号】W WO2020113029

(87)【国際公開日】2020-06-04

(31)【優先権主張番号】62/772,406

(32)【優先日】2018-11-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500039463

【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム

【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ，ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ

【住所又は居所原語表記】２１０ Ｗｅｓｔ ７ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ ７８７０１ Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】バサール、ラフェット

(72)【発明者】

【氏名】シュポール、エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】レズヴァニ、ケイティ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA92X

4B065AA92Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

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4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB11

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4C087ZC75

4H045AA10

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4H045AA30

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4H045BA41

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4H045DA50

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】操作された免疫細胞を特に含む癌免疫療法に関する組成物および方法を提供する。
【解決手段】複数の遺伝子が破壊されている免疫細胞を作製するための方法が本明細書中に提供される。免疫細胞の遺伝子の遺伝子座にキメラ抗原レセプターを挿入するための方法がさらに提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫細胞の少なくとも２つの遺伝子を破壊するためのインビトロ方法であって、前記少なくとも２つの遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７からなる群より選択される、方法。

【請求項2】

破壊が、各遺伝子に対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記免疫細胞に導入することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記少なくとも２つの遺伝子が、（ａ）ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨ、（ｂ）ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｃ）ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｄ）ＴＩＧＩＴおよびＦＯＸＯ１、（ｅ）ＴＩＧＩＴおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｆ）ＣＤ９６およびＦＯＸＯ１、（ｇ）ＣＤ９６およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｈ）ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｉ）ＣＤ９６およびＴＩＧＩＴ、（ｊ）ＣＩＳＨおよびＴＩＧＩＴ、（ｋ）ＴＩＭ３およびＣＩＳＨ、（ｌ）ＴＩＭ３およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｍ）ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｎ）ＴＩＭ３およびＴＩＧＩＴ、（ｏ）ＳＩＧＬＥＣ７およびＣＩＳＨ、（ｐ）ＳＩＧＬＥＣ７およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｑ）ＣＤ４７およびＣＩＳＨ、（ｒ）ＣＤ４７およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｓ）ＳＩＲＰＡおよびＣＩＳＨ、（ｔ）ＳＩＲＰＡおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｕ）ＣＤ４７およびＴＩＧＩＴ、（ｖ）ＣＤ４７およびＳＩＲＰＡ、（ｗ）Ａ２ＡＲおよびＣＩＳＨ、（ｘ）Ａ２ＡＲおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｙ）ＡＤＡＭ１７およびＣＩＳＨ、（ｚ）ＴＧＦＢＲＩＩおよびＡＤＡＭ１７、（ａ１）Ａ２ＡＲおよびＴＩＧＩＴ、（ｂ１）ＳＨＰ１およびＣＩＳＨ、（ｃ１）ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｄ１）ＳＨＰ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｅ１）ＳＨＰ１およびＴＩＧＩＴ、ならびに（ｆ１）ＳＨＰ１およびＴＩＭ３からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

少なくとも３つの遺伝子が、破壊される、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記少なくとも３つの遺伝子が、（１）ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（２）ＴＩＧＩＴ、ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（３）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＤ９６およびＴＩＧＩＴ、（４）ＴＧＦＢＲ２、ＣＩＳＨおよびＴＩＧＩＴ、（５）ＴＩＭ３、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（６）ＣＤ９６、ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（７）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＩＭ３およびＴＩＧＩＴ、（８）ＳＩＧＬＥＣ７、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（９）ＣＤ４７、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１０）ＳＩＲＰＡ、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１１）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＤ４７およびＴＩＧＩＴ、（１２）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＤ４７およびＳＩＲＰＡ、（１３）Ａ２ＡＲ、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１４）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＩＳＨおよびＡＤＡＭ１７、（１５）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＩＭ３およびＴＩＧＩＴ、（１６）ＴＧＦＢＲＩＩ、Ａ２ＡＲおよびＴＩＧＩＴ、（１７）ＳＨＰ１、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１８）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＩＳＨおよびＳＨＰ１、（１９）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＳＨＰ１およびＴＩＧＩＴ、ならびに（２０）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＳＨＰ１およびＴＩＭ３からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを導入する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを導入する工程が、前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記免疫細胞に導入する工程を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

３つ、４つ、５つまたは６つの遺伝子が、破壊される、請求項１～９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記遺伝子が、（ａ）～（ｊ１）のサブグループのうちの２つを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記遺伝子が、（ａ）～（ｊ１）のうちの１つのサブグループおよび１～２３のうちの１つのサブグループを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記遺伝子が、１～２３のサブグループのうちの２つを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記破壊が、同時である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞または幹細胞である、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記免疫細胞が、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するように操作されている、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記免疫細胞が、ＣＡＲを発現するように操作されている、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記免疫細胞が、ＴＣＲを発現するように操作されている、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

前記免疫細胞が、ＣＡＲおよびＴＣＲを発現するように操作されている、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

前記免疫細胞が、ウイルス特異的である、請求項１５に記載の方法。

【請求項21】

前記Ｔ細胞が、ウイルス特異的Ｔ細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項22】

前記Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｂ細胞が、制御性Ｂ細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項24】

前記幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞またはそれらの混合物である、請求項１５に記載の方法。

【請求項26】

前記免疫細胞が、末梢血、臍帯血、骨髄またはそれらの混合物から単離される、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

前記免疫細胞が、臍帯血から単離される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記臍帯血が、２単位以上の個々の臍帯血単位からプールされている、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

導入が、トランスフェクトまたは形質導入を含む、請求項２～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項30】

導入が、エレクトロポレーションを含む、請求項２～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

エレクトロポレーションが、２回以上行われる、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

２回のエレクトロポレーションが行われる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

第１の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、第１のエレクトロポレーションにおいて導入され、第２の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、２回目のエレクトロポレーションにおいて導入される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記第１の群および／または第２の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、１つ、２つ、３つまたは４つのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

２つのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、第１のエレクトロポレーションにおいて導入され、２つのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、２回目のエレクトロポレーションにおいて導入される、請求項３２に記載の方法。

【請求項36】

前記方法が、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨを破壊する工程を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記方法が、ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２およびＡＤＯＲＡ２を破壊する工程を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記方法が、ＮＫＧ２Ａ、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨを破壊する工程を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記方法が、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＩＳＨおよびＡＤＯＲＡ２を破壊する工程を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記方法が、ＡＤＡＭ１７、ＴＧＦβＲ２ ＮＫＧ２ＡおよびＳＨＰ１を破壊する工程を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記破壊によって、前記免疫細胞の抗腫瘍細胞傷害性の増強、インビボ増殖、インビボ持続性および／または機能の改善がもたらされる、請求項１～４０のいずれかに記載の方法。

【請求項42】

前記免疫細胞が、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１０７および／またはＴＮＦαの分泌を増加させている、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記免疫細胞が、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢの産生を増加させている、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

ＣＡＲまたはＴＣＲを前記免疫細胞に導入する工程をさらに含む、請求項１～４３のいずれかに記載の方法。

【請求項45】

導入が、前記ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸を前記免疫細胞に導入する工程を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記核酸が、発現ベクター内に存在する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記発現ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記レトロウイルスベクターが、アデノウイルス関連ベクターである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記アデノウイルス関連ベクターが、ＡＡＶ６である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ベクターが、阻害性遺伝子配列をさらに含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項51】

前記阻害性遺伝子配列が、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ベクターが、前記阻害性遺伝子に対するガイドＲＮＡをさらに含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項53】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子に対する相同性アームに隣接している、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記ＣＡＲ配列を含む前記ベクターを導入することにより、前記免疫細胞の前記阻害性遺伝子の遺伝子座に前記ＣＡＲが挿入される、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子のエキソンに挿入される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子の内在性プロモーターの支配下にある、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記ベクターの導入が、前記阻害性遺伝子の発現をさらに妨害する、請求項５４に記載の方法。

【請求項58】

免疫細胞の少なくとも２つの遺伝子の発現が妨害された免疫細胞であって、前記少なくとも２つの遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７からなる群より選択される、免疫細胞。

【請求項59】

前記細胞が、請求項１～５７のいずれか１項に従って作製される、請求項５８に記載の細胞。

【請求項60】

３つ、４つ、５つまたは６つの遺伝子が破壊されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項61】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞または幹細胞である、請求項５８に記載の細胞。

【請求項62】

前記免疫細胞が、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するように操作されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項63】

前記免疫細胞が、ＣＡＲを発現するように操作されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項64】

前記免疫細胞が、ＴＣＲを発現するように操作されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項65】

前記免疫細胞が、ＣＡＲおよびＴＣＲを発現するように操作されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項66】

前記免疫細胞が、ウイルス特異的である、請求項５８に記載の細胞。

【請求項67】

前記Ｔ細胞が、ウイルス特異的Ｔ細胞である、請求項６１に記載の細胞。

【請求項68】

前記Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞である、請求項６１に記載の細胞。

【請求項69】

前記Ｂ細胞が、制御性Ｂ細胞である、請求項６１に記載の細胞。

【請求項70】

前記幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項６１に記載の細胞。

【請求項71】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞である、請求項６１に記載の細胞。

【請求項72】

前記免疫細胞が、末梢血、臍帯血、骨髄またはそれらの混合物から単離される、請求項５８に記載の細胞。

【請求項73】

前記免疫細胞が、臍帯血から単離される、請求項５８に記載の細胞。

【請求項74】

前記臍帯血が、２単位以上の個々の臍帯血単位からプールされている、請求項７３に記載の細胞。

【請求項75】

前記免疫細胞のＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨが破壊されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項76】

前記免疫細胞のＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２およびＡＤＯＲＡ２が破壊されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項77】

前記免疫細胞のＮＫＧ２Ａ、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨが破壊されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項78】

前記免疫細胞のＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＩＳＨおよびＡＤＯＲＡ２が破壊されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項79】

前記免疫細胞のＡＤＡＭ１７、ＴＧＦβＲ２ ＮＫＧ２ＡおよびＳＨＰ１が破壊されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項80】

前記免疫細胞が、抗腫瘍細胞傷害性の増強、インビボ増殖、インビボ持続性および／または機能の改善を有する、請求項５８に記載の細胞。

【請求項81】

前記免疫細胞のＩＦＮ－γ、ＣＤ１０７および／またはＴＮＦαの分泌を増加させている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項82】

前記免疫細胞が、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢの産生を増加させている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項83】

前記細胞が、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するように操作されている、請求項５８に記載の細胞。

【請求項84】

前記ＣＡＲが、前記細胞の内在性の阻害性遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項８３に記載の細胞。

【請求項85】

前記阻害性遺伝子の遺伝子座が、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７からなる群より選択される、請求項８４に記載の細胞。

【請求項86】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子の内在性プロモーターの支配下にある、請求項８４に記載の細胞。

【請求項87】

前記ＣＡＲが、ＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集によって、前記阻害性遺伝子の遺伝子座に挿入された、請求項８４に記載の細胞。

【請求項88】

前記ＣＡＲが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖからなる群より選択される抗原結合ドメインを含む、請求項８３～８７のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項89】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ５、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒアルファ、カッパー鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ－１、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＬＬ－１、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡおよびＣＤ９９からなる群より選択される１つ以上の腫瘍関連抗原を標的化する、請求項８３～８８のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項90】

前記ＣＡＲが、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１２、ＣＤ７０およびＣＤ４０からなる群より選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む、請求項８３～９０のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項91】

前記細胞が、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびそれらの組み合わせからなる群より選択される異種サイトカインを発現するように操作されている、請求項５８～９０のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項92】

前記細胞が、自殺遺伝子をさらに含む、請求項８３に記載の細胞。

【請求項93】

前記自殺遺伝子が、膜結合型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ変異遺伝子である、請求項９２に記載の細胞。

【請求項94】

ＣＡＲ、阻害性遺伝子配列およびｇＲＮＡをコードする発現ベクター。

【請求項95】

前記阻害性遺伝子配列が、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７からなる群より選択される阻害性遺伝子に由来する、請求項９４に記載のベクター。

【請求項96】

前記ｇＲＮＡが、前記阻害性遺伝子に特異的である、請求項９４に記載のベクター。

【請求項97】

前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項９４に記載のベクター。

【請求項98】

前記レトロウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項９４に記載のベクター。

【請求項99】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子に対する相同性アームに隣接している、請求項９４に記載のベクター。

【請求項100】

請求項９４～９９のいずれかに記載のベクターを発現するように操作された、宿主細胞。

【請求項101】

前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または幹細胞である、請求項１００に記載の細胞。

【請求項102】

前記細胞が、請求項５８～８３のいずれか１項に記載の細胞である、請求項１００に記載の細胞。

【請求項103】

請求項５８～９３のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団を含む、薬学的組成物。

【請求項104】

免疫関連障害、感染症または癌を処置するための、請求項５８～９３のいずれか１項に記載の細胞の集団を含む組成物。

【請求項105】

被験体の疾患または障害を処置する方法であって、有効量の請求項５８～９３のいずれか１項に記載の免疫細胞を前記被験体に投与する工程を含む、方法。

【請求項106】

前記疾患または障害が、感染症、癌または免疫関連障害である、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記免疫関連障害が、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または炎症状態である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記免疫関連障害が、炎症状態であり、前記免疫細胞が、糖質コルチコイドレセプターの発現を本質的に有しない、請求項１０６に記載の方法。

【請求項109】

前記免疫細胞が、前記被験体に対して自己である、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項110】

前記免疫細胞が、前記被験体に対して同種異系である、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記免疫関連障害が、癌である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項112】

前記癌が、固形癌または血液悪性腫瘍である、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

少なくとも第２の治療薬を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１０５～１１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項114】

前記少なくとも第２の治療薬が、化学療法、免疫療法、手術、放射線療法または生物療法を含む、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記免疫細胞および／または前記少なくとも第２の治療薬が、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって、投与される、請求項１１３または１１４に記載の方法。

【請求項116】

ＣＡＲを発現するように免疫細胞を操作するための方法であって、前記方法は、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを使用して、前記ＣＡＲを前記免疫細胞の阻害性遺伝子の遺伝子座に挿入する工程を含む、方法。

【請求項117】

前記ＣＡＲが、発現ベクターによってコードされる、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記発現ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記レトロウイルスベクターが、アデノウイルス関連ベクターである、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記アデノウイルス関連ベクターが、ＡＡＶ６である、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記ベクターが、阻害性遺伝子配列をさらに含む、請求項１１７に記載の方法。

【請求項122】

前記阻害性遺伝子配列が、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７からなる群より選択される阻害性遺伝子に由来する、請求項１２１に記載の方法。

【請求項123】

前記ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、前記阻害性遺伝子に対するものである、請求項１１６～１２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項124】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子に対する相同性アームに隣接している、請求項１１６～１２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項125】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子のエキソンに挿入される、請求項１１６～１２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項126】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子の内在性プロモーターの支配下にある、請求項１１６～１２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項127】

前記ＣＡＲが、前記阻害性遺伝子の発現を妨害する、請求項１１６～１２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項128】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ５、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒアルファ、カッパー鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ－１、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＬＬ－１、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡおよびＣＤ９９からなる群より選択される１つ以上の腫瘍関連抗原を標的化する、請求項１１６～１２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項129】

前記ＣＡＲが、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１２、ＣＤ７０、ＣＤ４０およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む、請求項１１６～１２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項130】

前記細胞が、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの異種サイトカインを発現するように操作される、請求項１１６～１２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項131】

前記細胞が、自殺遺伝子をさらに含む、請求項１１６～１３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項132】

前記自殺遺伝子が、膜結合型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ変異遺伝子である、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記免疫細胞の阻害性遺伝子に挿入されたＣＡＲを有する免疫細胞。

【請求項134】

前記細胞が、請求項１１６～１３２のいずれか１項に記載の方法によって作製される、請求項１３３に記載の免疫細胞。

【請求項135】

請求項１３３または１３４に記載の免疫細胞の集団を含む、組成物。

【請求項136】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１３５に記載の組成物。

【請求項137】

免疫関連障害、感染症または癌を処置するための、請求項１３３～１３６のいずれか１項に記載の細胞の集団を含む、組成物。

【請求項138】

被験体の疾患または障害を処置する方法であって、有効量の請求項５８～９３、１００または１３３～１３４のいずれか１項に記載の細胞を前記被験体に投与する工程を含む、方法。

【請求項139】

前記疾患または障害が、感染症、癌または免疫関連障害である、請求項１３８に記載の方法。

【請求項140】

前記免疫関連障害が、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または炎症状態である、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

前記免疫関連障害が、炎症状態であり、前記免疫細胞が、糖質コルチコイドレセプターの発現の本質的に有しない、請求項１３９に記載の方法。

【請求項142】

前記細胞が、前記被験体に対して自己である、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項143】

前記細胞が、同種異系である、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項144】

前記免疫関連障害が、癌である、請求項１３８に記載の方法。

【請求項145】

前記癌が、固形癌または血液悪性腫瘍である、請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

少なくとも第２の治療薬を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１３８～１４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項147】

前記少なくとも第２の治療薬が、化学療法、免疫療法、手術、放射線療法または生物療法を含む、請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

前記免疫細胞および／または前記少なくとも第２の治療薬が、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって、投与される、請求項１４６または１４７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年１１月２８日出願の米国仮特許出願第６２／７７２，４０６号に対する優先権を主張する。この仮出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。

【0002】

本開示は、概して、免疫学、細胞生物学、分子生物学および医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫細胞のマルチプレックス編集およびその使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

細胞免疫療法は、癌を処置できる大きな可能性を秘めている。しかしながら、ほとんどの免疫療法のアプローチが、単独で適用されたとき、悪性腫瘍、特に固形腫瘍の大部分に対する価値は限定的である。この成功が限定的である理由としては、腫瘍細胞の表面上での腫瘍抗原の発現が低く、免疫系による腫瘍細胞の検出が低下していること、免疫細胞の不活性化を誘導する阻害性レセプター（例えば、ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴまたはＣＩＳＨ）に対するリガンドが発現していること；および免疫応答を抑制し、腫瘍細胞の増殖および生存を促進する物質（例えば、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦβ）およびアデノシン）を放出する細胞（例えば、制御性Ｔ細胞または骨髄系由来サプレッサー細胞）が微小環境において誘導されることが挙げられる。このように、細胞免疫療法の方法の改善に対するニーズが未だ対処されていない。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、操作された免疫細胞を特に含む癌免疫療法に関する組成物および方法を提供する。具体的な実施形態は、１つ、２つまたはそれ以上の遺伝子の発現を欠くようにまたはその発現を低下させるように人間の手によって改変されたある特定の免疫細胞に関し、具体的な場合において、そのような改変を有する細胞は、抗原レセプターのような非天然のタンパク質を含む１つ以上の異種タンパク質も発現する。非天然の免疫細胞を作製する方法も含まれる。ある特定の場合において、異種抗原レセプターの導入は、発現が低減または排除される遺伝子のゲノム遺伝子座において行われる。

【0005】

１つの実施形態において、本開示は、免疫細胞の少なくとも２つの遺伝子を破壊するためのインビトロ方法を提供し、その少なくとも２つの遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の態様において、３つ、４つ、５つもしくは６つまたはそれ以上の遺伝子が破壊される。具体的な態様において、２つ以上の遺伝子の破壊は、同じ方法工程における破壊など、同時である。その方法は、各遺伝子に対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を免疫細胞に導入する工程を含み得る。

【0006】

上記方法は、例えば以下のような特定の遺伝子の組み合わせ：（ａ）ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨ、（ｂ）ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｃ）ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｄ）ＴＩＧＩＴおよびＦＯＸＯ１、（ｅ）ＴＩＧＩＴおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｆ）ＣＤ９６およびＦＯＸＯ１、（ｇ）ＣＤ９６およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｈ）ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｉ）ＣＤ９６およびＴＩＧＩＴ、（ｊ）ＣＩＳＨおよびＴＩＧＩＴ、（ｋ）ＴＩＭ３およびＣＩＳＨ、（ｌ）ＴＩＭ３およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｍ）ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｎ）ＴＩＭ３およびＴＩＧＩＴ、（ｏ）ＳＩＧＬＥＣ７およびＣＩＳＨ、（ｐ）ＳＩＧＬＥＣ７およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｑ）ＣＤ４７およびＣＩＳＨ、（ｒ）ＣＤ４７およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｓ）ＳＩＲＰＡおよびＣＩＳＨ、（ｔ）ＳＩＲＰＡおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｕ）ＣＤ４７およびＴＩＧＩＴ、（ｖ）ＣＤ４７およびＳＩＲＰＡ、（ｗ）Ａ２ＡＲおよびＣＩＳＨ、（ｘ）Ａ２ＡＲおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｙ）ＡＤＡＭ１７およびＣＩＳＨ、（ｚ）ＴＧＦＢＲＩＩおよびＡＤＡＭ１７、（ａ）Ａ２ＡＲおよびＴＩＧＩＴ、（ｂ）ＳＨＰ１およびＣＩＳＨ、（ｃ）ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｄ）ＳＨＰ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（ｅ）ＳＨＰ１およびＴＩＧＩＴ、または（ｆ）ＳＨＰ１およびＴＩＭ３のノックダウンを含み得る。上記方法は、（１）ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（２）ＴＩＧＩＴ、ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（３）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＤ９６およびＴＩＧＩＴ、（４）ＴＧＦＢＲ２、ＣＩＳＨおよびＴＩＧＩＴ、（５）ＴＩＭ３、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（６）ＣＤ９６、ＦＯＸＯ１およびＴＧＦＢＲＩＩ、（７）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＩＭ３およびＴＩＧＩＴ、（８）ＳＩＧＬＥＣ７、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（９）ＣＤ４７、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１０）ＳＩＲＰＡ、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１１）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＤ４７およびＴＩＧＩＴ、（１２）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＤ４７およびＳＩＲＰＡ、（１３）Ａ２ＡＲ、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１４）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＩＳＨおよびＡＤＡＭ１７、（１５）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＩＭ３およびＴＩＧＩＴ、（１６）ＴＧＦＢＲＩＩ、Ａ２ＡＲおよびＴＩＧＩＴ、（１７）ＳＨＰ１、ＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲＩＩ、（１８）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＣＩＳＨおよびＳＨＰ１、（１９）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＳＨＰ１およびＴＩＧＩＴ、または（２０）ＴＧＦＢＲＩＩ、ＳＨＰ１およびＴＩＭ３のノックダウンを含み得る。任意の上記サブグループを、上に開示されたような第２のサブグループと組み合わせてもよい。例えば、サブグループａ～ｊ１のいずれか１つが、他のサブグループａ～ｊ１のうちのいずれか１つ以上と組み合わされ得るか、サブグループａ～ｊ１のいずれか１つ以上が、他のサブグループ１～２３のいずれか１つ以上と組み合わされ得るか、またはサブグループ１～２３のいずれか１つ以上が、他のサブグループ１～２３のいずれか１つ以上と組み合わされ得る。

【0007】

いくつかの態様において、上記方法は、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを上記細胞に導入する工程をさらに含む。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの導入は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を上記免疫細胞に導入することを含み得る。

【0008】

ある特定の態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫＴ細胞または幹細胞である。代替の場合において、免疫細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞ではないなど、Ｔ細胞ではない。いくつかの態様において、免疫細胞は、１つ以上のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および／または１つ以上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するように操作されている。免疫細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞など、ウイルス特異的であり得る。Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞であり得る。Ｂ細胞は、制御性Ｂ細胞であり得る。いくつかの態様において、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。特定の態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞である。免疫細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄またはそれらの混合物から単離され得る。いくつかの態様において、臍帯血は、２単位以上の個々の臍帯血単位からプールされている。

【0009】

いくつかの態様において、導入工程は、トランスフェクトまたは形質導入を含む。例えば、導入は、２回以上行われ得るエレクトロポレーション、例えば、２回または３回のエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様において、第１の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、第１のエレクトロポレーションにおいて導入され、第２の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、２回目のエレクトロポレーションにおいて導入される。具体的な場合において、第１の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡは、第２の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡと異なる。特定の態様において、第１の群および／または第２の群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡは、１つ、２つ、３つまたは４つ以上のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを含む。いくつかの態様において、２つのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、第１のエレクトロポレーションにおいて導入され、異なる２つのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、２回目のエレクトロポレーションにおいて導入される。具体的な実施形態では、ある群のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが、ある群のｇＲＮＡを含み、そのうちの少なくとも２つは、異なる遺伝子を標的化し、特定の実施形態では、その群のｇＲＮＡはそれぞれ、異なる遺伝子を標的化する。

【0010】

特定の態様において、上記方法は、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨ；ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２およびＡＤＯＲＡ２；ＮＫＧ２Ａ、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨ；ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＩＳＨおよびＡＤＯＲＡ２；またはＡＤＡＭ１７、ＴＧＦβＲ２、ＮＫＧ２ＡおよびＳＨＰ１を破壊する工程を含む。

【0011】

いくつかの態様では、破壊によって、免疫細胞の抗腫瘍細胞傷害性の増強、インビボ増殖、インビボ持続性および／または機能の改善がもたらされる。特定の態様において、その免疫細胞は、改変が無い場合と比べて、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１０７および／またはＴＮＦαの分泌を増加させている。いくつかの態様において、その免疫細胞は、改変が無い場合と比べて、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢの産生を増加させている。

【0012】

追加の態様において、上記方法は、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを免疫細胞に導入する工程（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲをコードする核酸を免疫細胞に導入する工程）をさらに含む。いくつかの態様において、その核酸は、レトロウイルスベクターなどの発現ベクター内に存在する。ある特定の態様において、そのベクターは、ＡＡＶ６などのアデノウイルス関連ベクターである。いくつかの態様において、そのベクターは、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される阻害性遺伝子配列などの阻害性遺伝子配列をさらに含む。特定の態様において、そのベクターは、阻害性遺伝子に対するガイドＲＮＡをさらに含む。ＣＡＲは、阻害性遺伝子に対する相同性アームに隣接していることがある。いくつかの態様において、ＣＡＲ配列を含むベクターを導入することにより、免疫細胞の阻害性遺伝子の遺伝子座（例えば、阻害性遺伝子のエキソン）にＣＡＲが挿入され、そのＣＡＲは、阻害性遺伝子の内在性プロモーターの支配下になる。特定の態様において、ベクターの導入は、阻害性遺伝子の発現をさらに妨害する。

【0013】

別の実施形態では、免疫細胞の少なくとも２つの遺伝子の発現が妨害された免疫細胞（例えば、開示される実施形態の免疫細胞）が提供され、その免疫細胞は、各遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記免疫細胞に導入することを含む工程によって少なくとも作製され、少なくとも２つの遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様において、３つ、４つ、５つもしくは６つまたはそれ以上の遺伝子が、破壊される。

【0014】

ある特定の態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または幹細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するように操作されている。免疫細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞など、ウイルス特異的であり得る。Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞であり得る。Ｂ細胞は、制御性Ｂ細胞であり得る。いくつかの態様において、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。特定の態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞である。免疫細胞は、末梢血、臍帯血または骨髄から単離され得る。いくつかの態様において、臍帯血は、２単位以上の個々の臍帯血単位からプールされている。

【0015】

特定の態様において、上記方法は、特定の遺伝子群（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨ；ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２およびＡＤＯＲＡ２；ＮＫＧ２Ａ、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨ；ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＩＳＨおよびＡＤＯＲＡ２；またはＡＤＡＭ１７、ＴＧＦβＲ２ ＮＫＧ２ＡおよびＳＨＰ１）を破壊する工程を含む。

【0016】

いくつかの態様では、破壊によって、免疫細胞の抗腫瘍細胞傷害性の増強、インビボ増殖、インビボ持続性および／または機能の改善がもたらされる。特定の態様において、その免疫細胞は、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１０７および／またはＴＮＦαの分泌を増加させている。いくつかの態様において、その免疫細胞は、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢの産生を増加させている。

【0017】

いくつかの態様において、上記細胞は、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するように操作されている。ＣＡＲは、例えば、その細胞の内在性の阻害性遺伝子の遺伝子座に挿入され得、阻害性遺伝子の遺伝子座は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様において、ＣＡＲは、阻害性遺伝子の内在性プロモーターの支配下にある。ある特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集によって、阻害性遺伝子の遺伝子座に挿入される。

【0018】

いくつかの態様において、ＣＡＲは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖからなる群より選択される抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ５、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒアルファ、カッパー鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ－１、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＬＬ－１、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ９９およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の腫瘍関連抗原を標的化する。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１２、ＣＤ７０、ＣＤ４０およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、免疫細胞は、１つ以上の異種サイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１の１つ以上）を含む。ある特定の態様において、ＣＡＲは、膜結合型非分泌性ＴＮＦ－アルファ変異体または誘導性カスパーゼ９などの自殺遺伝子をさらに含む。

【0019】

少なくとも１つのＣＡＲおよび／またはＴＣＲ、少なくとも１つの阻害性遺伝子配列ならびに少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする発現ベクターがさらに本明細書中に提供される。いくつかの態様において、その阻害性遺伝子配列は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７からなる群より選択される阻害性遺伝子由来である。特定の態様において、ｇＲＮＡは、阻害性遺伝子に特異的である。いくつかの態様において、ベクターは、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである。ＣＡＲは、阻害性遺伝子に対する相同性アームに隣接していることがある。上記実施形態のベクターを発現するように操作された宿主細胞（例えば、実施形態の細胞）も本明細書中に提供される。態様において、その細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または幹細胞である。

【0020】

開示される実施形態の免疫細胞の集団を含む薬学的組成物も本明細書中に提供される。別の実施形態は、免疫関連障害、感染症および／または癌を処置するための、開示される実施形態の細胞の集団を含む組成物を提供する。

【0021】

さらなる実施形態では、被験体の疾患または障害を処置する方法が提供され、その方法は、有効量の開示される実施形態の免疫細胞をその被験体に投与する工程を含む。いくつかの態様において、その疾患または障害は、感染症、癌（例えば、固形癌または血液悪性腫瘍）または免疫関連障害である。免疫関連障害は、例えば、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または炎症状態であり得る。いくつかの態様において、免疫関連障害は、炎症状態であり、免疫細胞は、糖質コルチコイドレセプターの発現を本質的に有しない。ある特定の態様において、免疫細胞は、レシピエント個体に対して自己または同種異系である。

【0022】

追加の態様において、上記方法は、免疫細胞を投与される個体に少なくとも第２の治療薬を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、その少なくとも第２の治療薬には、化学療法、免疫療法、手術、放射線療法、ホルモン療法または生物療法が含まれる。ある特定の態様において、免疫細胞および／または少なくとも第２の治療薬は、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって、投与される。

【0023】

別の実施形態は、ＣＡＲを発現するように免疫細胞を操作するための方法を提供し、その方法は、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを使用して、そのＣＡＲをその免疫細胞の阻害性遺伝子の遺伝子座に挿入する工程を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、発現ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ウイルスベクターなど）によってコードされる。ある特定の態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６などのアデノウイルス関連ベクターである。

【0024】

いくつかの態様において、上記ベクターは、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される阻害性遺伝子配列などの阻害性遺伝子配列をさらに含む。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡは、阻害性遺伝子に対するものである。ある特定の態様において、ＣＡＲは、阻害性遺伝子に対する相同性アームに隣接している。特定の態様において、ＣＡＲは、阻害性遺伝子の任意の部分（例えば、阻害性遺伝子のエキソン）において、その阻害性遺伝子の遺伝子座に挿入される。ＣＡＲは、阻害性遺伝子の内在性プロモーターの支配下であり得る。具体的な態様において、ＣＡＲは、阻害性遺伝子の発現を妨害する。

【0025】

いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ５、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒアルファ、カッパー鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ－１、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＬＬ－１、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ９９およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の腫瘍関連抗原を標的化する。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１２、ＣＤ７０およびＣＤ４０からなる群より選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードするベクターは、サイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１またはそれらの組み合わせ）もコードする。代替の場合において、そのサイトカインは、ＣＡＲをコードするベクターとは別個のベクター上に存在する。ある特定の態様において、ＣＡＲをコードする発現構築物は、自殺遺伝子（例えば、誘導性カスパーゼ９または膜結合型非分泌性ＴＮＦ－アルファ変異体）をさらに含む。

【0026】

本方法によって作製される免疫細胞などの免疫細胞の阻害性遺伝子に少なくとも１つのＣＡＲが挿入されている免疫細胞が、さらに本明細書中に提供される。本開示の実施形態の免疫細胞の集団（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、幹細胞の集団、それらの混合物などの集団）を含む組成物も本明細書中に提供される。

【0027】

別の実施形態は、上記実施形態の細胞の集団を含む組成物を提供し、ある特定の実施形態において、その集団は、任意の種類の病状の処置のために（少なくとも、免疫関連障害、感染症および／または癌の処置などのために）利用される。

【0028】

さらなる実施形態は、被験体の疾患または障害を処置する方法を提供し、その方法は、有効量の上記実施形態の免疫細胞をその被験体に投与する工程を含む。いくつかの態様において、その疾患または障害は、感染症；癌（例えば、固形癌または血液悪性腫瘍）；および／または免疫関連障害である。免疫関連障害は、いくつかの場合において、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶および／または炎症状態であり得る。いくつかの態様において、免疫関連障害は、炎症状態であり、免疫細胞は、糖質コルチコイドレセプターの発現を本質的に有しない。ある特定の態様において、免疫細胞は、レシピエント個体に対して自己または同種異系である。

【0029】

追加の態様において、上記方法は、少なくとも第２の治療薬を個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、その少なくとも第２の治療薬には、化学療法、免疫療法、手術、放射線療法、ホルモン療法または生物療法が含まれる。ある特定の態様において、免疫細胞および／または少なくとも第２の治療薬は、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって、投与される。免疫細胞および少なくとも第２の治療薬は、同時に投与されてもよいし、異なる時点において投与されてもよく、それらは、異なる時点において投与されるとき、または同時であるが同じ製剤としてではなく投与されるとき、同じ経路によって投与されてもよいし、そうでなくてもよい。

【0030】

本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本開示の趣旨および範囲内での様々な変更および改変が明らかになるので、その詳細な説明および具体例は、本開示の特定の実施形態を示すが、単に例証として与えられることを理解するべきである。

【0031】

以下の図面は、本明細書の一部を成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含められる。本発明は、本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１つ以上を参照することによって、より理解される可能性がある。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＮＫ細胞において複数の遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦＢＲ２およびＣＩＳＨ）の効率的な破壊を媒介する。この遺伝子セットでは、１回目のエレクトロポレーションにおいてＮＫＧ２ＡおよびＣＤ４７をノックアウトし、２回目のエレクトロポレーションにおいてＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲ２を標的化した。両方の回のエレクトロポレーションについて、ＰＣＲおよびフローサイトメトリーを使用してノックアウト効率を検証することに成功した。フローパネル内の赤色（右側のピーク）および青色（左側のピーク）のヒストグラムは、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ ＫＯの前および後のタンパク質の発現を表している。

【0033】

【図2】別の遺伝子セット（ＴＩＧＩＴ（Ｔ）、ＣＤ９６（Ｃ）、ＣＩＳＨ（ＣＨ）、アデノシン（Ａ））を用いた、ＮＫ細胞におけるマルチプレックス遺伝子編集の検証。この遺伝子セットでは、１回目のエレクトロポレーションにおいてＴＩＧＩＴおよびＣＤ９６をノックアウトし、２回目のエレクトロポレーションにおいてＣＩＳＨおよびアデノシンを標的化した。両方の回のエレクトロポレーションについて、ＰＣＲおよびフローサイトメトリーを使用してノックアウト効率を検証することに成功した。フローパネル内の赤色（右側のピーク）および青色（左側のピーク）のヒストグラムは、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ ＫＯの前および後のタンパク質の発現を表している。

【0034】

【図3】ＮＫ細胞において複数の遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦＢＲ２およびＣＩＳＨ）を破壊することにより、標的腫瘍細胞に対する機能が高まる。標的細胞株による刺激後に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦαおよびＣＤ１０７の分泌が増大した。ブレフェルジンＡの存在下において標的細胞株で５時間、共刺激された様々なＮＫ細胞（編集済み 対 Ｃａｓ９のみ）を用いて、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦαおよびＣＤ１０７産生のフローサイトメトリー解析を行った。

【0035】

【図4A】ＮＫ細胞において複数の遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦＢＲ２およびＣＩＳＨ）を破壊することにより、抗腫瘍細胞傷害性が高まる。遺伝子編集されたＮＫ細胞の細胞傷害活性 対 Ｃａｓ９のみのＮＫ細胞の細胞傷害活性を、Ｋ５６２に対する^５１Ｃｒ放出アッセイによって測定した。

【図4B】ＮＫ細胞において複数の遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦＢＲ２およびＣＩＳＨ）を破壊することにより、抗腫瘍細胞傷害性が高まる。組換えＴＧＦ－Ｂ処置（５０ｎｇ／ｍｌ）の３０分後に、ｐＳＭＡＤ活性をフローサイトメトリーによって測定した。外来性ＴＧＦ－βを添加しても、ＫＯ ＣＡＲ－ＮＫ細胞においてｐＳＭＡＤの活性化は誘導されなかった。

【0036】

【図5】ＣｙＴＯＦ解析によって示されるように、ＮＫ細胞は、サイトカインの刺激を受けるかまたは標的を認識すると、ＣＤ１６およびＣＤ６２Ｌの発現を失う。

【0037】

【図6】ＮＫ細胞においてＡＤＡＭ１７をノックアウトすると、ＣＤ１６およびＣＤ６２Ｌのシェディングが阻止される。

【0038】

【図7】ＮＫ細胞においてＡＤＡＭ１７をノックアウトすると、Ｋ５６２標的に対するＡＤＣＣおよび細胞傷害性が改善される。

【0039】

【図8】７２時間後のＮＫ細胞におけるＳＨＰ１ノックアウト効率のＦＡＣＳベースのスクリーニング。

【0040】

【図9】ＮＫ細胞においてＳＨＰ１を破壊すると、抗腫瘍効果が高まる。ＮＫ細胞をＫ５６２細胞またはＲａｊｉ細胞と１：１の比で４時間共培養した。インキュベーションの後、それらの細胞をアネキシンＶで染色し、生細胞および死細胞を解析した。Ｋ５６２細胞は、ＮＫ細胞の殺滅に対して感受性であり、Ｒａｊｉ細胞は、ＮＫ細胞の殺滅に対して抵抗性である。

【0041】

【図10A】ＮＫ細胞においてＳＨＰ１を破壊すると、抗腫瘍効果が高まる。ＮＫ細胞をＫ５６２細胞またはＲａｊｉ細胞と２：１の比で５時間共培養した。

【図10B】ＮＫ細胞においてＳＨＰ１を破壊すると、抗腫瘍効果が高まる。様々なエフェクター：標的比での溶解パーセント、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＣＤ１０７ａのパーセンテージ、ならびに生細胞または死細胞のパーセンテージを示している。

【0042】

【図11】ＮＫ－ＣＡＲ細胞においてＳＨＰ１を破壊すると、アポトーシスアッセイによって評価される抗腫瘍効果が高まる。

【0043】

【図12A】７日目のＦＡＣＳベースのＮＫＧ２Ａノックアウト効率。

【図12B】拡大されたＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａを破壊すると、抗腫瘍効果が高まる。

【図12C】ＮＫ－ＣＡＲ細胞においてＮＫＧ２Ａを破壊すると、Ｒａｊｉ標的に対する抗腫瘍効果が高まる。

【0044】

【図13】別の遺伝子セット、つまり、ＴＩＧＩＴ（Ｔ）、ＣＤ９６（Ｃ）、ＣＩＳＨ（ＣＨ）およびアデノシン（ＡＤＯＲＡ２Ａ）（Ａ）を用いて、アプローチを検証した。この遺伝子セットの場合、１回目のエレクトロポレーションの間にＴＩＧＩＴおよびＣＤ９６を１セットのＮＫ細胞においてノックアウトした。ＴＩＧＩＴおよびＣＤ９６ ＫＯ細胞における２回目のノックアウトでは、ＣＩＳＨおよびアデノシン（ＡＤＯＲＡ２Ａ）を標的化した。両方の回のエレクトロポレーションについて、ＰＣＲおよびフローサイトメトリーを使用してノックアウト効率を検証することに成功した。フローパネル内の赤色（右側のピーク）および青色（左側のピーク）のヒストグラムは、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ ＫＯの前および後のタンパク質の発現を表している。

【0045】

【図14】ＮＫ細胞において複数の遺伝子を破壊すると、抗腫瘍効果が高まる。これを評価するために、複数の遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦＢＲＩＩおよびアデノシン（ＡＤＯＲＡ２Ａ））のノックアウト細胞およびｃａｓ９だけをエレクトロポレーションした細胞を、コントロールとして、Ｋ５６２（ＮＫ感受性）細胞およびＲａｊｉ（ＮＫ抵抗性）細胞とともに、５時間使用した。ＮＫ細胞の機能をフローサイトメトリー測定によって評価したところ、標的細胞株による刺激を受けたとき、ＫＯ細胞ではＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＣＤ１０７ａの増加が観察された。

【0046】

【図15】ＮＫ細胞において複数の遺伝子を破壊すると、抗腫瘍効果が高まる。これを評価するために、複数の遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦＢＲＩＩ）のノックアウト細胞およびｃａｓ９だけをエレクトロポレーションした細胞を、コントロールとして使用した。ＮＫＧ２Ａの発現をフローサイトメトリーによって確認した。外来性ＴＧＦ－βを添加しても、ＫＯ ＣＡＲ－ＮＫ細胞においてｐＳＭＡＤの活性化は誘導されなかった。

【0047】

【図16】ＮＫ－ＣＡＲ細胞において複数の遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＴＧＦβＲ２およびＣＩＳＨ）を破壊すると、抗腫瘍効果が高まる。

【0048】

【図17】ＴＧＦβＲ２のＫＯは、ＴＧＦβの抑制作用からＮＫ－ＣＡＲ細胞を守る。

【0049】

【図18】マルチプレックス遺伝子編集は、種々のＮＫ－ＣＡＲ構築物で、種々の標的に対して再現性がある。

【0050】

【図19】複数の阻害性遺伝子のマルチプレックス遺伝子編集は、ＮＫの構造を維持し、ＴＦＧβによって誘導される疲弊からＮＫ細胞を守る。

【発明を実施するための形態】

【0051】

ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いて、ヒト免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞またはＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞）において２つ以上の遺伝子（例えば、遺伝子（例えば、アデノシン２ａレセプター、ＴＧＦβＲ２、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴおよび／またはＣＩＳＨをはじめとした表１に列挙される遺伝子））を同時にノックダウン（またはノックアウト）する新規アプローチを提供する。それらの免疫細胞は、末梢血または臍帯血またはそれらの組み合わせに由来し得る。

【0052】

本研究は、これらのタンパク質の低発現が、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の機能の改善、インビボにおける増殖および持続性ならびに細胞傷害性と相関することを実証した。このストラテジーはまた、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびｉＮＫＴ細胞を、ＴＧＦβおよびアデノシンによって主に駆動される免疫抑制性の腫瘍微小環境から守る。したがって、本方法を用いることにより、様々な養子細胞療法用の生成物（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞（例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞）、Ｂ細胞（例えば、制御性Ｂ細胞）、ＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにＴＣＲによって操作されたＴおよびＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＮＫＴ細胞）の有効性を改善することができる。その養子細胞療法用の生成物は、例えば癌（例えば、血液悪性腫瘍または固形悪性腫瘍）から感染症および免疫障害にまで及ぶ様々な疾患を処置するために使用され得る。

【0053】

特定の実施形態において、上記免疫細胞は、少なくとも１つのＣＡＲを発現する。ＣＡＲ技術は、過去数年間でいくつもの進歩が見られた。実際に、ＣＡＲ－ＣＤ１９が、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫を有する患者において目覚ましい臨床結果を示し、昨年、２つのＣＡＲ Ｔ製品がＦＤＡに承認された。ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞が、過去数年間で先頭に立ったが、たくさんの前臨床研究、ならびに本出願人らが主導する第Ｉ／ＩＩ相ＣＡＲ ＮＫ試験も、癌に対してＣＡＲ－ＮＫ細胞の有効性を示した。ＣＡＲ技術が前進しているにもかかわらず、未だにＣＡＲは、大部分がウイルスベクターを用いてＴ細胞またはＮＫ細胞に形質導入されており、ウイルスベクターは、ランダムにしか細胞のＤＮＡにインテグレートせず、クローン増殖、癌化、導入遺伝子の発現の変化または転写のサイレンシングをもたらす恐れがある。したがって、特定のＤＮＡ遺伝子座へのＣＡＲの挿入を標的化する方法を見つけることが有益であろう。

【0054】

したがって、１つの実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、特定の遺伝子の遺伝子座（例えば、阻害性遺伝子またはチェックポイントタンパク質の遺伝子座）にＣＡＲを挿入するための方法を提供する。遺伝子の遺伝子座におけるＣＡＲの挿入は、所望であれば必要に応じてそのＣＡＲをその遺伝子のプロモーターの支配下に置きつつ、同時に遺伝子の発現を妨害するためにも使用することができる。具体的には、本方法は、ＡＡＶ６ベクターおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、阻害性遺伝子（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＳＨＰ１またはＴＧＦβＲ２を含むがこれらに限定されない表１に列挙される遺伝子など）の遺伝子座におけるＣＡＲの挿入を導き得る。阻害性遺伝子の遺伝子座におけるＣＡＲの挿入により、ＣＡＲの発現がチェックポイントのプロモーターの制御下になって、腫瘍微小環境においてアップレギュレートされることも可能にしつつ、チェックポイント分子（例えば）の阻害効果を妨害することができる。これは、固形腫瘍にＣＡＲ治療を適用する場合に有用であり、ここで、チェックポイント分子のアップレギュレーションは、ＣＡＲ治療の成功に悪影響を及ぼし得る。したがって、高い安全性プロファイルを有し得るＣＡＲ挿入方法を用いて養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ、ＮＫＴまたはｉＮＫＴ細胞）を作製するためのさらなる方法が提供される。
Ｉ．定義

【0055】

本明細書中で使用されるとき、特定の構成要素に関する「本質的に含まない」は、その特定の構成要素が、意図的に組成物に製剤化されていないことおよび／または夾雑物としてでさえもしくは微量でさえ存在しないことを意味するために本明細書中で使用される。ゆえに、ある組成物の任意の意図されない混入に起因する、その特定の構成要素の総量は、０．０５％未満、好ましくは、０．０１％未満である。標準的な分析方法ではその特定の構成要素の量を検出できない組成物が最も好ましい。

【0056】

本明細書中で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。請求項で使用されるとき、語「ａ」または「ａｎ」は、語「～を含む」とともに使用されるとき、１つまたは１つより多いことを意味し得る。本明細書中で使用されるとき、「別の」は、少なくとも第２のものまたはそれ以上のものを意味し得る。なおもさらには、用語「～を有する」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドの用語であることを承知している。具体的な実施形態において、本開示の態様は、例えば、本開示の１つ以上の配列「から本質的になり」得るか、またはそれら「からなり」得る。本発明のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上のエレメント、方法工程および／または方法からなり得るか、またはそれらから本質的になり得る。本明細書中に記載される任意の方法または組成物は、本明細書中に記載される他の任意の方法または組成物に対して実行され得ることが企図される。本願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されると意図されていない。本明細書中で使用されるとき、用語「または」および「および／または」は、複数の構成要素を組み合わせてまたは互いから排除して記載するために使用される。例えば、「ｘ、ｙおよび／またはｚ」とは、「ｘ」のみ、「ｙ」のみ、「ｚ」のみ、「ｘ、ｙおよびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」または「ｘまたはｙまたはｚ」のことを指し得る。ｘ、ｙまたはｚが、ある実施形態から明確に排除され得ることが明確に企図される。

【0057】

請求項での用語「または」の使用は、選択肢だけを指すと明示的に示されない限り、またはそれらの選択肢が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢だけおよび「および／または」を指すという定義を支持する。本明細書中で使用されるとき、「別の」は、少なくとも第２のものまたはそれ以上のものを意味し得る。用語「約」、「実質的に」および「およそ」は、一般に、述べられている値プラスまたはマイナス５％を意味する。

【0058】

本明細書全体にわたる「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」または「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含められることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所における前述の句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造または特性が、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。

【0059】

「免疫障害」、「免疫関連障害」または「免疫媒介性障害」とは、免疫応答が、その疾患の発症または進行において重要な役割を果たす障害のことを指す。免疫媒介性障害としては、自己免疫障害、同種移植片拒絶、移植片対宿主病ならびに炎症状態およびアレルギー状態が挙げられる。

【0060】

「免疫応答」は、刺激に対する、Ｂ細胞またはＴ細胞または自然免疫細胞などの免疫系細胞の応答である。１つの実施形態において、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。

【0061】

本明細書中で使用される用語「阻害性遺伝子」とは、その遺伝子産物が、１つ以上のタイプの免疫細胞の活性、増殖および／または持続性にとって直接または間接的に有害である遺伝子のことを指す。

【0062】

「自己免疫疾患」とは、免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を起こし、その結果、組織が傷害される疾患のことを指す。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、または共生生物（例えば、通常、粘膜表面にコロニー形成する微生物（共生生物として知られる））に由来し得る。

【0063】

本明細書中で使用される用語「操作された」とは、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクターなどをはじめとした、人間の手によって作製された実体のことを指す。少なくともいくつかの場合において、操作された実体は、合成物であり、天然に存在しないエレメントまたは本開示において使用されるように構成されたエレメントを含む。

【0064】

疾患または状態を「処置する」またはそれらの処置とは、その疾患の徴候または症状を軽減する目的で、１つ以上の薬物を患者に投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。処置の望ましい効果としては、疾患の進行速度の低下、疾患状態の回復または緩和、および予後の緩解または改善が挙げられる。軽減は、現れる疾患または状態の徴候または症状が現れる前ならびに現れた後において生じ得る。したがって、「処置する」または「処置」は、疾患または望ましくない状態を「予防する」またはそれらの「予防」を含み得る。さらに、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、詳細には、患者に対して周辺効果しか及ぼさないプロトコルを含む。

【0065】

本願全体にわたって使用される用語「治療効果」または「治療的に有効な」とは、この状態の医学的処置に関して被験体の福祉を増進または向上させる何らかのことを指す。これには、ある疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の処置は、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の成長速度の低下、または転移の予防を含み得る。癌の処置とは、癌を有する被験体の生存時間の延長のことも指し得る。

【0066】

「被験体」および「患者」とは、ヒトまたは非ヒト、例えば、霊長類、哺乳動物および脊椎動物のことを指す。特定の実施形態において、被験体は、ヒトである。

【0067】

本明細書中で使用されるとき、「哺乳動物」は、本発明の方法にとって適切な被験体である。哺乳動物は、ヒトを含む、高等脊椎動物の哺乳綱の任意のメンバーであり得、生児出生、体毛、および子を養うための乳を分泌する女性（雌）の乳腺を特徴とし得る。さらに、哺乳動物は、気候条件の変動にもかかわらず体温を一定に維持する能力を特徴とする。哺乳動物の例は、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびチンパンジーである。哺乳動物は、「患者」または「被験体」または「個体」と称されることがある。

【0068】

句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」とは、ヒトなどの動物に適宜投与されたとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。抗体またはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らせば当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓが要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の規格を満たすべきであることが理解される。

【0069】

本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、当業者に公知であるように、任意のおよびすべての水性溶媒（例えば、水、アルコール溶液／水溶液、食塩水、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、流動性および栄養補給剤、そのような同様の材料ならびにそれらの組み合わせを含む。薬学的組成物中の様々な構成要素のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。

【0070】

本明細書中で使用されるとき、遺伝子の「破壊」とは、破壊が無い場合の遺伝子産物の発現レベルと比べて、ある細胞における対象遺伝子によってコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現が無くなることまたは低下することを指す。例示的な遺伝子産物としては、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡおよびタンパク質産物が挙げられる。破壊は、いくつかの場合では、一過性または可逆的であり、他の場合では、永続的である。切断型または非機能性の産物が生成され得るという事実があるにもかかわらず、破壊は、いくつかの場合において、機能的なまたは完全長のタンパク質またはｍＲＮＡの破壊である。本明細書中のいくつかの実施形態において、遺伝子の活性または機能は、発現とは全く異なって妨害される。遺伝子破壊は、一般に、人工的な方法、すなわち、化合物、分子、複合体もしくは組成物の添加もしくは導入、および／または当該遺伝子の核酸もしくは当該遺伝子に関連する核酸の、ＤＮＡレベルなどでの破壊によって誘導される。遺伝子破壊のための例示的な方法としては、遺伝子のサイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、および／または遺伝子編集などの遺伝子破壊の手法が挙げられる。例としては、一般に発現の一過性の低下をもたらすアンチセンス技術（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはリボザイム）、ならびに例えば切断および／または相同組換えの誘導によって、標的化された遺伝子の不活性化または破壊をもたらす遺伝子編集の手法が挙げられる。例としては、挿入、変異および欠失が挙げられる。破壊は、通常、遺伝子によってコードされる正常な産物または「野生型」産物の発現を阻止し、かつ／またはその発現を完全に無くす。そのような遺伝子破壊の例示は、遺伝子または遺伝子の一部の挿入、フレームシフト変異およびミスセンス変異、欠失、ノックインならびにノックアウト（遺伝子全体の欠失を含む）である。そのような破壊は、コード領域、例えば、１つ以上のエキソンにおいて生じ得るため、停止コドンの挿入などによって完全長の産物、機能的な産物または任意の産物を生成することができなくなる。そのような破壊は、遺伝子の転写を防ぐように、プロモーターもしくはエンハンサーまたは転写の活性化に影響する他の領域における破壊によっても生じ得る。遺伝子破壊には、相同組換えによる標的化された遺伝子不活性化を含む遺伝子ターゲティングが含まれる。
ＩＩ．マルチプレックス遺伝子編集

【0071】

ある特定の実施形態において、本開示は、任意のタイプの免疫細胞のマルチプレックス遺伝子編集に関する。ＣＲＩＳＰＲは、免疫細胞において２つ以上の遺伝子（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の遺伝子）の発現を妨害するために使用することができる一例である。それらの遺伝子は、表１に列挙される遺伝子、例えば、ＮＫ細胞レセプターＡ（ＮＫＧ２Ａ）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ－７、ＣＤ３２８）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチンファミリーメンバー３（ＴＩＭ３、ＣＤ３６６、ＨＡＶＣＲ２）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ、ＣＩＳ－１、ＳＯＣＳ）、フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）、トランスフォーミング成長因子ベータレセプター２（ＴＧＦβＲ２）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ＣＤ９６、アデノシンレセプター２Ａ（ＡＤＯＲＡ２）、核レセプターサブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤＬ－１）、プログラム細胞死１リガンド２（ＰＤＬ－２）、ＣＤ４７、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ）、ＳＨ２ドメイン含有イノシトール５－ホスファターゼ１（ＳＨＩＰ１）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７（ＡＤＡＭ１７）、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）、ＣＤ２５、ＣＤ４０、インターロイキン２１レセプター（ＩＬ２１Ｒ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、インターロイキン２１レセプター（ＩＬ１０Ｒ）、ＣＤ５、ＣＤ７から選択され得るか、または他の阻害性遺伝子も存在し得る。遺伝子編集によって、複数の遺伝子の発現を同時に妨害することが可能になる。

【0072】

いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、その遺伝子において破壊をもたらすこと（例えば、ノックアウト、挿入、ミスセンス変異またはフレームシフト変異、例えば、両アレルフレームシフト変異、遺伝子の全部または一部の欠失、例えば、１つ以上のエキソンもしくはゆえに一部分の欠失、および／またはノックイン）によって行われる。例えば、破壊は、遺伝子またはその一部分の配列に標的化されるように特異的にデザインされた、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼ、ならびにＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡガイドヌクレアーゼをはじめとした、配列特異的ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼによってもたらされ得る。

【0073】

いくつかの実施形態において、破壊は、一過性または可逆的であり、その遺伝子の発現は、後になって回復する。他の実施形態において、破壊は、可逆的または一過性でなく、例えば、永続的である。

【0074】

いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、その遺伝子における、通常は標的化様式での、１つ以上の二本鎖切断および／または１つ以上の一本鎖切断の誘導によって行われる。いくつかの実施形態において、二本鎖または一本鎖の切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、その切断は、遺伝子のコード領域、例えば、エキソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、その誘導は、コード領域、例えば、第１のエキソン、第２のエキソンまたはそれ以降のエキソンのＮ末端部分の近くにおいて生じる。

【0075】

上記免疫細胞には、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素、またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡが導入され得る。いくつかの態様において、その細胞には、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のガイドＲＮＡが同時に導入される。例えば、その細胞には、第１のエレクトロポレーションの間に１つ、２つまたは３つのガイドＲＮＡが導入され得、次いで、第２のエレクトロポレーションなどの間に１つ、２つまたは３つのさらなるガイドＲＮＡがさらに導入され得る。

【0076】

いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、アンチセンス法（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）および／またはリボザイム）を用いて達成され、それらを用いることにより、遺伝子の発現が選択的に抑制または阻止される。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列およびそのヌクレオチド配列と相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ分子を使用するＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、または種々の領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、ポリシストロニック構築物に含められる。

【0077】

いくつかの実施形態において、破壊は、遺伝子に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする、ＤＮＡ標的化分子（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸）またはそれを含む複合体、化合物もしくは組成物を用いて達成される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）のＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）のＤＮＡ結合ドメインもしくはＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）のＤＮＡ結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを含む。ジンクフィンガー、ＴＡＬＥおよびＣＲＩＳＰＲシステムの結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の変更）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。デザインに対する合理的基準としては、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥのデザインおよび結合データの情報を保存しているデータベースにおける情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムが挙げられる。

【0078】

ＣＲＩＳＰＲ媒介性の破壊の場合、ガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼは、細胞または細胞内コンパートメントの内側への送達を可能にする当該分野で公知の任意の手段によって免疫細胞に導入され得、使用され得る作用物質／化学物質および／または分子（タンパク質および核酸）としては、非限定的な例として、リポソーム送達手段、高分子キャリア、化学的キャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、エマルジョン、天然のエンドサイトーシスまたは貪食経路、ならびにエレクトロポレーションなどの物理的な方法が挙げられる。具体的な態様では、エレクトロポレーションを用いて、ガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入する。

【0079】

例示的な１つの具体的な方法では、複数の遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトのための方法は、臍帯血または末梢血からの、ＮＫ細胞などの免疫細胞の単離を含み得る。ＮＫ細胞を単離し、照射済みのフィーダー細胞と、一例として１：２の比などで培養プレート上に播種し得る。次いで、それらの細胞に、２００ＩＵ／ｍＬの濃度などのＩＬ－２の存在下において、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をエレクトロポレーションし得る。培地は、一例として、１日おきに交換し得る。１～３日後に、ＮＫ細胞を単離してフィーダー細胞を除去し、次いで、そのＮＫ細胞にＣＡＲ構築物を形質導入し得る。次いで、そのＮＫ細胞を、さらなる遺伝子に対する第２のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ノックアウトに供し得る。エレクトロポレーションの後、ＮＫ細胞をフィーダー細胞とともに、例えば５～９日間、播種し得る。

【0080】

【表1】

【0081】

【表2】

【0082】

いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、２つ以上の遺伝子の発現が変更されるように改変される。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の変更は、その遺伝子において破壊をもたらすこと（例えば、ノックアウト、挿入、ミスセンス変異またはフレームシフト変異、例えば、両アレルフレームシフト変異、その遺伝子の全部または一部の欠失、例えば、１つ以上のエキソンもしくはゆえに一部分の欠失、および／またはノックイン）によって行われる。具体的な実施形態において、遺伝子発現の変更は、遺伝子またはその一部分の配列に標的化されるように特異的にデザインされたＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡガイドヌクレアーゼをはじめとした、配列特異的ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼによってもたらされ得る。

【0083】

いくつかの実施形態において、遺伝子の発現、活性および／または機能の変更は、その遺伝子を破壊することによって行われる。いくつかの態様において、遺伝子は、その発現が、遺伝子改変が無い場合の発現または改変をもたらす構成要素の導入が無い場合の発現と比べて、少なくとも１０、２０、３０もしくは４０％または約１０、２０、３０もしくは４０％低下するように、通常、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％または約５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％低下するように、改変される。

【0084】

いくつかの実施形態において、変更は、一過性または可逆的であり、所望であれば、遺伝子の発現は、後になって回復する。他の実施形態において、変更は、可逆的または一過性でなく、例えば、永続的である。

【0085】

いくつかの実施形態において、遺伝子の変更は、その遺伝子における、通常は標的化様式での、１つ以上の二本鎖切断および／または１つ以上の一本鎖切断の誘導によって行われる。いくつかの実施形態において、二本鎖または一本鎖の切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、その切断は、遺伝子のコード領域、例えば、エキソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、その誘導は、コード領域、例えば、第１のエキソン、第２のエキソンまたはそれ以降のエキソンのＮ末端部分の近くにおいて生じる。

【0086】

いくつかの態様において、二本鎖または一本鎖の切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）などによる細胞の修復プロセスを介した修復を受ける。いくつかの態様において、この修復プロセスは、エラーが発生しやすく、遺伝子の完全なノックアウトをもたらし得る遺伝子の破壊、例えば、フレームシフト変異、例えば、両アレルのフレームシフト変異をもたらす。例えば、いくつかの態様において、破壊は、欠失、変異および／または挿入を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、破壊によって、停止コドンが早期に存在するようになる。いくつかの態様において、挿入、欠失、転座、フレームシフト変異および／または中途での停止コドンが存在することにより、遺伝子の発現、活性および／または機能が妨害される。

【0087】

いくつかの実施形態において、上記変更は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変更など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて行われる。例えば、上記変更は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ会合（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行われ得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ会合（「Ｃａｓ」）遺伝子（Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含む）、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直列反復配列」、およびｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされた部分的な直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物の発現に関与するかまたはその活性を指示する転写物および他のエレメントのことを総称する。

【0088】

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、およびヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。

【0089】

いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと既定のｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物を含む）が、細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端における標的部位が、相補的な塩基対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的部位、例えば、遺伝子に標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、通常、ＮＧＧまたはＮＡＧ）のすぐ５’の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１または１０ヌクレオチドを改変することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。通常、「標的配列」とは、一般に、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされる配列のことを指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ない。

【0090】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）に続いて、本明細書中で論じられるような破壊または変更を誘導し得る。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが、標的部位において一本鎖にニックを入れるために使用される。例えば特異性を改善するために、対のニッカーゼを使用することができ、そのニッカーゼの各々は、配列を標的化する異なるｇＲＮＡの対によって導かれ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入される。他の実施形態では、遺伝子発現に影響するように、触媒的に不活性なＣａｓ９が、転写抑制因子または転写活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。

【0091】

標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞のオルガネラ内など、細胞の核または細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的化される遺伝子座への組換えのために使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。いくつかの態様では、外来性の鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称されることがある。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。

【0092】

通常、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化するガイド配列を含む）の形成によって、標的配列においてまたは標的配列の近くで（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対以内またはそれ以上以内において）一方または両方の鎖の切断が生じる。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部もしくは一部分（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６７ヌクレオチド、約８５ヌクレオチドもしくはそれ以上または約２０ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約３２ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約４８ヌクレオチド超、約５４ヌクレオチド超、約６３ヌクレオチド超、約６７ヌクレオチド超、約８５ヌクレオチド超もしくはそれ以上）を含み得るかまたはそれからなり得るｔｒａｃｒ配列も、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部分へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部分に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加する、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性（例えば、最適にアラインメントされたとき、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性）を有する。

【0093】

ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現によって、１つ以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が指示されるように、そのＣＲＩＳＰＲシステムのそれらのエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターが細胞に導入され得る。また、構成要素がタンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列がそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上が、単一ベクターにおいて組み合わされ得、ここで、１つ以上のさらなるベクターが、第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供する。そのベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に配置される。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、単一の発現構築物が、細胞内の異なる複数の対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために使用され得る。

【0094】

ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は、公知であり；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として見られ得る。

【0095】

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のもの）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置（例えば、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内）において、一方または両方の鎖の切断を指示し得る。ベクターは、対応する野生型酵素に対して変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし得、その変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼ由来のＣａｓ９をニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、ＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的化する２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせは、両方の鎖にニックを入れることができ、ＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導するために使用される。

【0096】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に向けてコドンが最適化される。真核細胞は、特定の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物）の細胞またはそれらの生物に由来する細胞であり得る。一般に、コドンの最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、天然の配列の少なくとも１つのコドンをその宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞において発現が高まるように核酸配列を改変するプロセスのことを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間でのコドン使用頻度の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、その翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において優勢に選択されるｔＲＮＡは、通常、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンを反映する。したがって、コドンの最適化に基づいて、遺伝子を所与の生物における最適な遺伝子発現に適応させることができる。

【0097】

一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズする標的ポリヌクレオチド配列であって標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示する標的ポリヌクレオチド配列に対して十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上であるか、またはそれらを超える。

【0098】

最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得、そのアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。

【0099】

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および必要に応じて、任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写阻止活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するかまたは他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得、それらのタンパク質としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書中に援用されるＵＳ２０１１００５９５０２に記載されている。
ＩＩＩ．阻害性遺伝子の遺伝子座におけるＣＡＲおよび／またはＴＣＲの挿入

【0100】

いくつかの実施形態において、本開示は、免疫細胞の特定の遺伝子の遺伝子座におけるＣＡＲおよび／またはＴＣＲの挿入に関する。ＣＡＲおよび／またはＴＣＲは、阻害性遺伝子の遺伝子座（例えば、ＮＫＧ２Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、アデノシンレセプター２Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ｐＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子）に挿入され得る。

【0101】

本明細書中に開示される方法のいずれかにおける１つ以上のＣＡＲおよび／またはＴＣＲの挿入は、部位特異的であり得る。例えば、１つ以上のＣＡＲおよび／またはＴＣＲは、プロモーターに隣接して、またはプロモーターの近くに、挿入され得る。別の例では、１つ以上の導入遺伝子が、遺伝子（例えば、阻害性遺伝子）のエキソンに隣接して、遺伝子のエキソンの近くに、または遺伝子のエキソン内に、挿入され得る。そのような挿入は、遺伝子の発現を妨害しながら、同時にＣＡＲおよび／またはＴＣＲをノックインするために使用され得る。別の例では、１つ以上のＣＡＲおよび／またはＴＣＲが、遺伝子のイントロンに隣接して、遺伝子のイントロンの近くに、または遺伝子のイントロン内に、挿入され得る。ＣＡＲおよび／またはＴＣＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスベクターによって導入され得、標的化されたゲノム位置にインテグレートされ得る。いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターを使用して、ある特定の位置への導入遺伝子の挿入を指示することができる。例えば、いくつかの場合において、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲが、ｒＡＡＶまたはＡＡＶベクターによって、ＮＫＧ２Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、アデノシンレセプター２Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ｐＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５またはＣＤ７遺伝子の少なくとも一部分にインテグレートされ得る。

【0102】

細胞の標的化される遺伝子座の改変は、細胞にＤＮＡを導入することによって行うことができ、ここで、そのＤＮＡは、標的遺伝子座に対して相同性を有する。ＤＮＡは、マーカー遺伝子を含むことができ、それにより、インテグレートされた構築物を含む細胞の選択が可能になる。標的ベクター内の相補ＤＮＡは、標的遺伝子座において染色体ＤＮＡと組み換わり得る。マーカー遺伝子は、相補ＤＮＡ配列、３’組換えアームおよび５’組換えアームに隣接し得る。細胞内の複数の遺伝子座が標的化され得る。例えば、複数のゲノム改変が一工程で行われるように、１つ以上の標的遺伝子座に特異的な組換えアームを有する導入遺伝子が同時に導入され得る。相同性アームは、約０．２ｋｂ～約５ｋｂ長（例えば、約０．２ｋｂ、０．４ｋｂ ０．６ｋｂ、０．８ｋｂ、１．０ｋｂ、１．２ｋｂ、１．４ｋｂ、１．６ｋｂ、１．８ｋｂ、２．０ｋｂ、２．２ｋｂ、２．４ｋｂ、２．６ｋｂ、２．８ｋｂ、３．０ｋｂ、３．２ｋｂ、３．４ｋｂ、３．６ｋｂ、３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、４．２ｋｂ、４．４ｋｂ、４．６ｋｂ、４．８ｋｂから約５．０ｋｂ長など）であり得る。

【0103】

１つの方法において、ガイドＲＮＡは、阻害性遺伝子の遺伝子座の領域（例えば、その遺伝子のプロモーター、エキソンまたはイントロンに隣接した領域）を標的化するようにデザインされ得る。ガイドＲＮＡは、阻害性遺伝子のエキソン（例えば、第１、第２または第３のエキソン）の５’末端を標的化し得る。ガイドＲＮＡは、ＡＡＶベクター修復マトリックスに含められ得る。ＡＡＶベクターは、Ｐ２Ａペプチドなどの自己切断２Ａペプチドに続いてＣＡＲｃＤＮＡをコードし得る。ＣＡＲカセットおよびガイドＲＮＡ配列は、阻害性遺伝子に対する相同性アームに隣接していることがある。次いで、免疫細胞に、ＡＡＶベクターおよびＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）が導入（例えば、エレクトロポレーション）され得る。
ＩＶ．免疫細胞

【0104】

本開示のある特定の実施形態は、複数の遺伝子のノックアウトを有するようにおよび／または阻害性遺伝子の遺伝子座にＣＡＲのノックインを有するように操作された免疫細胞に関する。それらの免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳＣ）細胞）であり得る。それらの免疫細胞は、ウイルス特異的であり得、ＣＡＲを発現し得、かつ／またはＴＣＲを発現し得る。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球および／または好塩基球である。免疫細胞を作製および操作する方法、ならびに養子細胞療法のためにそれらの細胞を使用および投与する方法も本明細書中に提供され、その場合、それらの細胞は、自己または同種異系であり得る。したがって、それらの免疫細胞は、癌細胞を標的化するためなどの免疫療法として使用され得る。

【0105】

上記免疫細胞は、被験体、特にヒト被験体から単離され得る。それらの免疫細胞は、目的の被験体（例えば、特定の疾患もしくは状態を有すると疑われる被験体、特定の疾患もしくは状態の素因を有すると疑われる被験体、または特定の疾患もしくは状態に対する治療を受けている被験体）から得ることができる。免疫細胞は、それらが被験体内に存在する任意の位置から回収することができ、それらの位置としては、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節および骨髄が挙げられるが、これらに限定されない。単離された免疫細胞は、直接使用され得るか、または凍結などによって、ある時間にわたって保存され得る。

【0106】

上記免疫細胞は、それらが存在する任意の組織から濃縮／精製されてもよく、それらの組織としては、血液（血液バンクまたは臍帯血バンクによって回収された血液を含む）、脾臓、骨髄、外科手技中に除去および／または露出された組織、ならびに生検手技を介して得られた組織が挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞が濃縮、単離および／または精製される組織／器官は、生存している被験体と生存していない被験体の両方から単離され得る。ここで、生存していない被験体は、臓器ドナーである。特定の実施形態において、免疫細胞は、末梢血もしくは臍帯血またはそれらの混合物などの血液から単離される。いくつかの態様において、臍帯血から単離された免疫細胞は、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の抑制によって測定されるような、高い免疫調節能を有する。具体的な態様において、免疫細胞は、高い免疫調節能を求めて、プールされた血液、特に、プールされた臍帯血から単離される。プールされた血液は、２つ以上の起源（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の起源（例えば、ドナー被験体））からの血液であり得る。

【0107】

免疫細胞の集団は、治療を必要とする被験体または低い免疫細胞活性に関連する疾患に罹患している被験体から得ることができる。したがって、それらの細胞は、治療を必要とする被験体にとって自己であり得る。あるいは、免疫細胞の集団は、ドナー、好ましくは、組織適合性がマッチしたドナーから得ることができる。その免疫細胞集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、脾臓、または免疫細胞が被験体もしくはドナーに存在する他の任意の器官／組織から収集され得る。それらの免疫細胞は、被験体および／またはドナーのプール、例えば、プールされた臍帯血から単離され得る。

【0108】

免疫細胞集団が、被験体とは異なるドナーから得られるとき、そのドナーは、好ましくは同種異系であるが、但し、得られる細胞は、それらの細胞が被験体に導入可能であるという点で、被験体と適合している。同種異系ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合していてもよいし、そうでなくてもよい。
Ａ．Ｔ細胞

【0109】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。機能的な抗腫瘍エフェクター細胞の誘導、活性化および拡大のためのいくつかの基本的なアプローチが、過去２０年で報告されてきた。これらとしては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの自己細胞；自己ＤＣ、リンパ球、人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）、またはＴ細胞リガンドおよび活性化抗体でコーティングされたビーズ、または標的細胞膜の捕捉によって単離された細胞を用いてエキソビボで活性化されたＴ細胞；抗宿主腫瘍Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を天然に発現している同種異系細胞；および「Ｔ－ボディ」として知られる抗体様腫瘍認識能を示す腫瘍反応性ＴＣＲ分子またはキメラＴＣＲ分子を発現するように遺伝的に再プログラムされたまたは「再指示された」非腫瘍特異的な自己細胞または同種異系細胞が挙げられる。これらのアプローチは、本明細書中に記載される方法において使用され得る、Ｔ細胞を調製および免疫化するための数多くのプロトコルの元となった。

【0110】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ液、臍帯またはリンパ系器官に由来する。いくつかの態様において、それらの細胞は、ヒト細胞である。それらの細胞は、通常、初代細胞であり、例えば、被験体から直接単離された細胞、および／または被験体から単離され、凍結された細胞である。いくつかの実施形態において、それらの細胞には、Ｔ細胞または他の細胞型の１つ以上のサブセット（例えば、Ｔ細胞集団全体、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、およびそれらの部分集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、拡大、再循環、局在化および／または残存能、抗原特異性、抗原レセプターのタイプ、特定の器官もしくはコンパートメントに存在すること、マーカーもしくはサイトカイン分泌のプロファイル、および／または分化の程度によって定義される部分集団）が含まれる。処置される被験体に関して、細胞は、同種異系細胞および／または自己細胞であり得る。いくつかの態様において、既存技術などの場合、細胞は、多能性および／または複能性である（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞）。いくつかの実施形態において、上記方法は、被験体から細胞を単離する工程、それらを本明細書中に記載されるように調製、処理、培養および／または操作する工程、ならびに凍結保存の前または後にそれらを同じ患者に再導入する工程を含む。

【0111】

Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞）のサブタイプおよび部分集団に含まれるのは、ナイーブＴ（Ｔ_Ｎ）細胞、エフェクターＴ細胞（Ｔ_ＥＦＦ）、メモリーＴ細胞およびそのサブタイプ（例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣ_Ｍ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣ_Ｍ）、エフェクターメモリーＴ（Ｔ_ＥＭ）または最終分化型エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、内在性および獲得型（ａｄａｐｔｉｖｅ）の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞）、アルファ／ベータＴ細胞およびデルタ／ガンマＴ細胞である。

【0112】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞集団の１つ以上は、表面マーカーなどの特異的マーカーが陽性であるかまたは特異的マーカーが陰性である細胞が濃縮されているか、または枯渇している。いくつかの場合において、そのようなマーカーは、ある特定のＴ細胞集団（例えば、非メモリー細胞）上に存在しないかまたは比較的低レベルでしか発現されないが、ある特定の他のＴ細胞集団（例えば、メモリー細胞）上には存在するかまたは比較的高レベルで発現されるマーカーである。

【0113】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、非Ｔ細胞（例えば、Ｂ細胞、単球または他の白血球）上に発現されているマーカー（例えば、ＣＤ１４）のネガティブ選択によってＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋選択工程を用いることにより、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞が分離される。そのようなＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋集団は、１つ以上のナイーブ、メモリーおよび／またはエフェクターＴ細胞の部分集団上に発現されているまたは比較的高い程度に発現されているマーカーのポジティブまたはネガティブ選択によって、さらに部分集団にソーティングされ得る。

【0114】

いくつかの実施形態において、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、それぞれの部分集団に関連する表面抗原に基づくポジティブ選択またはネガティブ選択などによって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリーおよび／またはセントラルメモリー幹細胞がさらに濃縮されるかまたは枯渇される。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ（Ｔ_ＣＭ）細胞の濃縮は、投与後の長期生存率、拡大および／または生着を改善するなどの有効性を高めるために行われ、これは、いくつかの態様において、そのような部分集団において特に頑健である。

【0115】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞である。この方法では、腫瘍サンプルを患者から入手し、単一細胞の懸濁液を得る。その単一細胞の懸濁液は、任意の好適な様式で、例えば、機械的に（例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ^ＴＭＤｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．を用いて腫瘍を脱凝集させて）または酵素的に（例えば、コラゲナーゼまたはＤＮａｓｅ）得ることができる。腫瘍の酵素消化物の単一細胞の懸濁液を、インターロイキン－２（ＩＬ－２）中で培養する。

【0116】

培養されたＴ細胞は、プールされ、急速に拡大され得る。約１０～約１４日間にわたる急速な拡大によって、抗原特異的Ｔ細胞の数が少なくとも約５０倍（例えば、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００倍またはそれ以上）増加する。より好ましくは、約１０～約１４日間にわたる急速な拡大によって、少なくとも約２００倍（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００またはそれ以上）増加する。

【0117】

当該分野で公知であるようないくつかの方法のうちのいずれかによって、拡大が達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、フィーダーリンパ球と、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）のいずれか（ＩＬ－２が好ましい）との存在下において非特異的Ｔ細胞レセプター刺激を用いて容易に拡大され得る。その非特異的Ｔ細胞レセプター刺激は、およそ３０ｎｇ／ｍｌの、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ（登録商標），Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．から入手可能）を含み得る。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞成長因子（例えば、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２またはＩＬ－１５（ＩＬ－２が好ましい））の存在下において１つ以上の癌抗原（エピトープなどのその抗原性部分、または細胞を含む）で末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をインビトロにおいて刺激することによって容易に拡大され得、その癌抗原は、必要に応じてベクターから発現され得、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチドである。そのインビトロで誘導されたＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２を発現している抗原提示細胞に対してパルスされた同じ癌抗原による再刺激によって急速に拡大される。あるいは、それらのＴ細胞は、例えば、照射された自己リンパ球または照射されたＨＬＡ－Ａ２^＋同種異系リンパ球およびＩＬ－２で再刺激され得る。

【0118】

上記自己Ｔ細胞は、それらの自己Ｔ細胞の増殖および活性化を促進するＴ細胞成長因子を発現するように改変され得る。好適なＴ細胞成長因子としては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２が挙げられる。好適な改変方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照のこと。特定の態様において、改変された自己Ｔ細胞は、Ｔ細胞成長因子を高レベルで発現する。Ｔ細胞成長因子コード配列（例えば、ＩＬ－１２のコード配列）は、Ｔ細胞成長因子コード配列への作動可能な連結が高レベル発現を促進するプロモーターと同様に、当該分野において容易に入手可能である。
Ｂ．ＮＫ細胞

【0119】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は、種々の腫瘍細胞、ウイルスに感染した細胞、ならびに骨髄および胸腺における一部の正常細胞に対して自発的な細胞傷害性を有するリンパ球の部分集団である。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化し、成熟する。ＮＫ細胞は、ヒトにおいては、ＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ８などの特定の表面マーカーによって検出され得る。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原レセプター、汎ＴマーカーＣＤ３、または表面免疫グロブリンＢ細胞レセプターを発現しない。

【0120】

ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、当該分野で周知の方法によってヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、未刺激の白血球搬出法生成物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄または臍帯血から得られる。特に、臍帯血が、ＮＫ細胞を得るために使用される。ある特定の態様において、ＮＫ細胞は、以前に報告された、ＮＫ細胞をエキソビボで拡大する方法（Ｓｐａｎｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）によって単離され、拡大される。この方法では、ＣＢ単核細胞をフィコール密度勾配遠心分離によって単離し、ＩＬ－２および人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とともにバイオリアクター内で培養する。７日後に、細胞培養物から、ＣＤ３を発現する任意の細胞を枯渇させ、さらに７日間、再培養する。再度、細胞のＣＤ３枯渇を行い、ＣＤ５６^＋／ＣＤ３^－細胞またはＮＫ細胞のパーセンテージを測定するために特徴付ける。他の方法では、臍帯血を使用し、ＣＤ３４^＋細胞の単離、ならびにＳＣＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２を含む培地中で培養することによるＣＤ５６^＋／ＣＤ３^－細胞への分化によって、ＮＫ細胞を得る。

【0121】

具体的な実施形態において、ＮＫ細胞は、調製中のある時点において拡大される。具体的な場合において、ＮＫ細胞の拡大は、臍帯血由来の単核細胞（ＭＮＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＩＬ－２の存在下において刺激すること；およびそれらの細胞をＡＰＣで再刺激して、拡大されたＮＫ細胞を生成することを含み、少なくともいくつかの場合において、この方法は、バイオリアクター内で行われる。刺激工程は、ＭＮＣをＮＫ細胞に向かわせることができる。再刺激工程は、ＩＬ－２の存在を含んでもよいし、含まなくてもよい。特定の態様において、その方法は、刺激工程中に任意の培地構成要素の除去または添加を含まない。特定の態様において、その方法は、ある特定の時間枠内（例えば、１５日未満、例えば、１４日）で行われる。

【0122】

ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、拡大するためのエキソビボでの方法によって拡大され、その方法は、（ａ）臍帯血から単核細胞（ＭＮＣ）の出発集団を得る工程；（ｂ）そのＭＮＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＩＬ－２の存在下において刺激する工程；および（ｃ）その細胞をＡＰＣで再刺激して、拡大されたＮＫ細胞を生成する工程を含み、その方法は、バイオリアクター内で行われ、優良製造規範（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）に準拠している。工程（ｂ）の刺激によって、ＭＮＣをＮＫ細胞に向かわせることができる。工程（ｃ）は、ＩＬ－２の存在を含んでもよいし、含まなくてもよい。特定の態様において、その方法は、工程（ｂ）の間に任意の培地構成要素の除去または添加を含まない。特定の態様において、その方法は、１５日未満（例えば、１４日）で行われる。

【0123】

いくつかの態様において、上記方法は、例えばＣＤ３などの１つ以上の特定のマーカーが陽性の細胞を枯渇させる工程をさらに含む。ある特定の態様において、枯渇工程は、工程（ｂ）と工程（ｃ）の間に行われる。いくつかの態様において、それらの細胞は、ＣＤ３枯渇のためにバイオリアクターから取り出され、工程（ｃ）のためのバイオリアクターに入れられる。

【0124】

ある特定の態様において、臍帯血からＭＮＣの出発集団を得る工程は、デキストラン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＤＮＡｓｅおよび／または塩化マグネシウムの存在下において臍帯血を解凍する工程を含む。特定の態様において、臍帯血からＭＮＣの出発集団を得る工程は、デキストランおよび／またはＤＮａｓｅの存在下において臍帯血を解凍する工程を含む。具体的な態様において、臍帯血は、５～２０％（例えば、１０％）のデキストランの存在下において洗浄される。ある特定の態様において、臍帯血は、１００～３００ｍＭの濃度、特に２００ｍＭなどの塩化マグネシウムの存在下において懸濁される。いくつかの態様において、得る工程は、フィコール密度勾配遠心分離を行って単核細胞（ＭＮＣ）を得る工程を含む。

【0125】

ある特定の態様において、バイオリアクターは、気体透過性のバイオリアクターである。特定の態様において、気体透過性のバイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ１００ＭまたはＧ－Ｒｅｘ１００である。いくつかの態様において、工程（ｂ）の刺激は、３～５Ｌの培地（例えば、３、３．５、４、４．５または５Ｌ）において行われる。

【0126】

いくつかの態様において、ＡＰＣは、ガンマ線を照射される。ある特定の態様において、ＡＰＣは、膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように操作される。特定の態様において、ＡＰＣは、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２を発現するように操作される。いくつかの態様において、ＭＮＣとＡＰＣとは、１：２の比で培養される。いくつかの態様において、ＩＬ－２は、５０～２００ＩＵ／ｍＬの濃度（例えば、１００ＩＵ／ｍＬ）で存在する。特定の態様において、ＩＬ－２は、２～３日ごとに補充される。

【0127】

特定の態様において、工程（ｂ）は、６～８日間（例えば、７日間）行われる。いくつかの態様において、工程（ｃ）は、６～８日間（例えば、７日間）行われる。いくつかの態様において、工程（ｃ）は、細胞の分割を含まない。特定の態様において、上記細胞には、工程（ｃ）の間にＩＬ－２が２回供給され、具体的な場合では、工程（ｃ）の間に他の培地構成要素が添加されないか、または除去されない。

【0128】

いくつかの態様において、上記方法は、３つ、４つ、５つまたは６つのバイオリアクターの使用を含む。特定の態様において、上記方法は、１０個未満のバイオリアクターの使用を含む。

【0129】

具体的な態様において、ＮＫ細胞は、少なくとも５００倍、８００倍、１０００倍、１２００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍または５０００倍拡大される。特定の態様において、バイオリアクター内でＮＫ細胞を培養することにより、静置液体培養と比べて１０００倍超のＮＫ細胞が生成される。

【0130】

ある特定の態様において、上記方法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の適合を含まない。いくつかの態様において、ＮＫ細胞の出発集団は、ハプロタイプ一致ドナーから得られない。

【0131】

いくつかの態様において、上記の拡大されたＮＫ細胞は、末梢血から拡大されたＮＫ細胞と比べて高い抗腫瘍活性を有する。ある特定の態様において、上記の拡大されたＮＫ細胞は、末梢血から拡大されたＮＫ細胞と比べて、１つ以上の細胞周期遺伝子、１つ以上の細胞分裂遺伝子および／または１つ以上のＤＮＡ複製遺伝子を高発現している。いくつかの態様において、上記の拡大されたＮＫ細胞は、末梢血から拡大されたＮＫ細胞と比べて、より高い増殖能を有する。いくつかの態様において、上記の拡大されたＮＫ細胞は、疲弊を示さない。ある特定の態様において、疲弊は、パーフォリン、グランザイム、ＣＤ５７、ＫＬＲＧ１および／またはＰＤ１の発現を測定することによって検出される。いくつかの態様において、上記の拡大されたＮＫ細胞は、パーフォリンおよび／またはグランザイムを高発現している。ある特定の態様において、上記の拡大されたＮＫ細胞は、ＣＤ５７、ＫＬＲＧ１および／またはＰＤ１を低発現しているか、または発現していない。

【0132】

いくつかの態様において、拡大されたＮＫ細胞は、臨床的に妥当な用量を含む。ある特定の態様において、臍帯血は、凍結臍帯血である。特定の態様において、凍結臍帯血は、１つ以上の感染症（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、ＨＩＶ、ヒトＴリンパ向性ウイルス、梅毒、ジカウイルスなど）について試験済みである。いくつかの態様において、臍帯血は、３、４、５、６、７または８単位の個々の臍帯血単位などからプールされた臍帯血である。

【0133】

いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、例えばレシピエント自体に対して、自己のＮＫ細胞ではない。ある特定の態様において、ＮＫ細胞は、例えばレシピエント自体に対して、同種異系のＮＫ細胞ではない。

【0134】

いくつかの態様において、ＡＰＣは、ユニバーサル抗原提示細胞（ｕＡＰＣ）である。ある特定の態様において、ｕＡＰＣは、（１）ＣＤ４８および／またはＣＳ１（ＣＤ３１９）、（２）膜結合型インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）、ならびに（３）４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するように操作される。いくつかの態様において、ｕＡＰＣは、ＣＤ４８を発現する。ある特定の態様において、ｕＡＰＣは、ＣＳ１を発現する。特定の態様において、ｕＡＰＣは、ＣＤ４８およびＣＳ１を発現する。いくつかの態様において、ｕＡＰＣは、内在性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩおよび／またはＣＤ１ｄ分子の発現を本質的に有しない。ある特定の態様において、ｕＡＰＣは、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）および／またはＬＦＡ－３（ＣＤ５８）を発現する。特定の態様において、ｕＡＰＣはさらに、Ｋ５６２細胞などの白血病細胞由来のａＡＰＣと定義される。
Ｃ．幹細胞

【0135】

いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、人工多能性幹細胞（ＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）などの幹細胞であり得る。

【0136】

本明細書中で使用される多能性幹細胞は、通常、ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと省略される、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり得る。生殖細胞を除く任意の細胞をｉＰＳＣの出発点として使用することができる。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉系細胞、肝臓細胞または胃細胞であり得る。細胞分化の程度または細胞が回収される動物の年齢に制限はない。未分化な前駆細胞（体性幹細胞を含む）および最終分化した成熟細胞でさえも、本明細書中に開示される方法において体細胞の起源として使用することができる。

【0137】

体細胞は、当業者に公知の方法を用いて初期化されて、ｉＰＳ細胞を生成し得る。一般に、体細胞から多能性幹細胞を生成するために、核の初期化因子が使用される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つまたは少なくとも４つが使用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４が使用されるか、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が使用される。

【0138】

ｉＰＳＣは、いったん誘導されると、多能性を維持するのに十分な培地中で培養することができる。ある特定の実施形態では、不確定条件が使用され得る。例えば、多能性細胞は、その幹細胞を未分化な状態で維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞上で、または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養され得る。いくつかの実施形態において、その細胞は、細胞分裂を終結させるために照射または抗生物質で処置されたマウス胎仔線維芽細胞をフィーダー細胞として共存させて培養される。あるいは、多能性細胞は、ＴＥＳＲ^ＴＭ培地またはＥ８^ＴＭ／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地などのフィーダー非依存性の明確な培養系を用いて、本質的に未分化な状態で培養および維持され得る。
Ｖ．遺伝的に操作された抗原レセプター

【0139】

本開示の免疫細胞は、抗原レセプター（例えば、操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、キメラサイトカインレセプター、ケモカインレセプター、それらの組み合わせなど）を発現するように遺伝的に操作され得る。例えば、免疫細胞は、癌抗原に対する抗原特異性を有するＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するように改変される。複数のＣＡＲおよび／またはＴＣＲ（例えば、種々の抗原に対するもの）が、免疫細胞に加えられ得る。いくつかの態様において、免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲを用いた阻害性遺伝子の遺伝子座におけるＣＡＲまたはＴＣＲのノックインによって、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作される。

【0140】

好適な改変方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，前出を参照のこと。例えば、上記細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９に記載されている形質導入法を用いて、癌抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように形質導入され得る。

【0141】

レトロウイルスによって形質導入されたＴＣＲ鎖と内在性のＴＣＲ鎖との対形成によって引き起こされる自己反応性に関する長期的な問題を克服する選択肢として、完全長ＴＣＲαおよびβ（またはγおよびδ）鎖をコードするＲＮＡのエレクトロポレーションを使用することができる。そのような代替の対形成が、一過性のトランスフェクションストラテジーにおいて起きたとしても、導入されたＴＣＲαおよびβ鎖は、一過性に発現されるだけなので、生成される可能性がある自己反応性Ｔ細胞は、しばらくするとこの自己反応性を失う。導入されたＴＣＲαおよびβ鎖の発現が減少すると、正常な自己のＴ細胞だけが残る。これは、完全長ＴＣＲ鎖が、安定したレトロウイルス形質導入によって導入されたときは当てはまらず、導入されたＴＣＲ鎖は失われることはなく、患者に絶えず自己反応性が存在するようになる。

【0142】

いくつかの実施形態において、上記細胞は、１つ以上の抗原レセプターをコードする、遺伝子操作を介して導入された１つ以上の核酸、およびそのような核酸の遺伝的に操作された産物を含む。いくつかの実施形態において、それらの核酸は、異種であり、すなわち、正常には、細胞または細胞から得られるサンプルに存在しない（例えば、別の生物または細胞から得られ、それは、例えば、操作されている細胞および／またはそのような細胞が由来する生物において通常見られない）。いくつかの実施形態において、それらの核酸は、自然界に見られない核酸（例えばキメラ）など、天然に存在しない。

【0143】

いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外の抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態において、その抗原は、細胞表面上に発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、ＴＣＲと同様に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の状況において細胞表面上で認識される、プロセシングを受けたペプチド抗原（例えば、細胞内タンパク質のペプチド抗原）である。

【0144】

ＣＡＲおよび組換えＴＣＲをはじめとした例示的な抗原レセプター、ならびにそれらのレセプターを操作するための方法およびそれらのレセプターを細胞に導入するための方法としては、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３１９６０、ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３７、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号および同第８，４７９，１１８号、ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、および／またはＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２によって記載されたものが挙げられる。いくつかの態様において、遺伝的に操作された抗原レセプターには、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されているようなＣＡＲ、および国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８Ａｌに記載されているものが含まれる。
Ａ．キメラ抗原レセプター

【0145】

いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ａ）１つ以上の細胞内のシグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）抗原結合領域を含む細胞外のドメインを含む。

【0146】

いくつかの実施形態において、操作された抗原レセプターには、活性化型または刺激型のＣＡＲ、共刺激型のＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照のこと）および／または阻害型のＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照のこと）をはじめとしたＣＡＲが含まれる。それらのＣＡＲは、一般に、１つ以上の細胞内のシグナル伝達構成要素に、いくつかの態様ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して連結された、細胞外の抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、通常、天然の抗原レセプターを介するシグナル、共刺激レセプターとともにそのようなレセプターを介するシグナル、および／または共刺激レセプターのみを介するシグナルを模倣するかまたはまねる。

【0147】

本開示のある特定の実施形態は、細胞内のシグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外のドメインを含む、抗原特異的ＣＡＲポリペプチド（免疫原性を低減するためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む）をコードする核酸を含む核酸の使用に関する。ある特定の実施形態において、そのＣＡＲは、１つ以上の抗原の間で共有される空間を含むエピトープを認識し得る。ある特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはそれらの抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態において、その特異性は、レセプターに結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。

【0148】

ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を増強するために使用されるヒト遺伝子であり得ると企図される。具体的な実施形態において、本発明は、ＣＡＲの完全長ｃＤＮＡまたはコード領域を含む。その抗原結合領域またはドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖のフラグメント（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第７，１０９，３０４号に記載されているもの）を含み得る。そのフラグメントは、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態において、そのフラグメントは、ヒト細胞における発現のためにヒトのコドン使用頻度に最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。

【0149】

配置は、多量体であり得る（例えば、ダイアボディまたは多量体）。その多量体は、軽鎖および重鎖の可変部分がダイアボディに交差対形成することによって形成される可能性が最も高い。その構築物のヒンジ部分には、完全欠失から、１つ目のシステインが維持されること、セリン置換ではなくプロリン置換であること、１つ目のシステインまで切断されることにまで及ぶ複数の選択肢があり得る。Ｆｃ部分を欠失させることができる。安定したかつ／または二量体化する任意のタンパク質が、この目的にかない得る。Ｆｃドメインのうちの１つだけ、例えば、ヒト免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを使用することができる。二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを使用することもできる。ＣＤ８アルファの部分を使用することもできる。

【0150】

いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの、他の共刺激レセプターをコードする配列を含む。他の共刺激レセプターとしては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζによって惹起される１次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激レセプターによって提供されるさらなるシグナルが、ＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、インビボでの持続性および養子免疫療法の治療の成功の改善を助け得る。

【0151】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、養子療法によって標的化される特定の細胞型において発現される抗原などの特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば、癌マーカーおよび／または減衰応答を誘導することを目的とした抗原（例えば、正常細胞型上または非罹患細胞型上に発現される抗原）に対する特異性を有するように構築される。したがって、上記ＣＡＲは通常、その細胞外の部分に、１つ以上の抗原結合分子（例えば、１つ以上の抗原結合フラグメント、抗原結合ドメインもしくは抗原結合部分）または１つ以上の抗体可変ドメイン、および／または抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、抗体分子の抗原結合部分（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む。

【0152】

キメラ抗原レセプターのある特定の実施形態において、そのレセプターの抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称され得る）は、腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、デクチン－１などのパターン認識レセプターによって認識される糖鎖抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上に発現される限り、任意の種類であってよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓなどが挙げられる。ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原の量が少ないとき、持続性を改善するためにサイトカインと同時発現され得る。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１またはそれらの組み合わせなどの１つ以上のサイトカインと同時発現され得る。

【0153】

キメラレセプターをコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ起源、ｃＤＮＡ起源から得ることができるか、または合成することができるか（例えば、ＰＣＲを介して）、またはそれらの組み合わせであり得る。イントロンはｍＲＮＡを安定化すると見出されているので、ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化するために内在性または外来性の非コード領域を使用することもさらに有益であり得る。

【0154】

上記キメラ構築物は、裸のＤＮＡとしてまたは好適なベクターに入った状態で免疫細胞に導入され得ることが企図される。裸のＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによって細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡとは、一般に、発現にとって適切な向きでプラスミド発現ベクターに含められたキメラレセプターをコードするＤＮＡのことを指す。

【0155】

あるいは、キメラ構築物を免疫細胞に導入するために、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を用いることができる。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、免疫細胞において非複製性のベクターである。ウイルスに基づくベクターが多数知られており（例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクター）、細胞内に維持されるそのウイルスのコピー数は、その細胞の生存能を維持するほど十分低い。

【0156】

いくつかの態様において、抗原に特異的に結合する構成要素または抗原特異的認識構成要素は、１つ以上の膜貫通ドメインおよび細胞内のシグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態において、そのＣＡＲにおけるドメインの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、その膜貫通ドメインは、レセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるためにそのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように、選択されるかまたはアミノ酸置換によって改変される。

【0157】

膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、天然起源または合成起源に由来する。起源が天然である場合、そのドメインは、いくつかの態様において、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞レセプターのアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ分子に由来する（すなわち、それらの分子の膜貫通領域を少なくとも含む）膜貫通領域を含む。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、合成の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、合成の膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成の膜貫通ドメインの各末端に見られることがある。

【0158】

ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞などの免疫細胞を遺伝的に改変するための本明細書中に開示されるプラットフォーム技術としては、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３－ζまたは他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）長さが不定の細胞外ドメインであって抗原認識ドメインを細胞表面に接続する細胞外ドメインを有するＣＡＲ、およびいくつかの場合では、（ｉｖ）ＣＡＲ^＋免疫細胞を頑強かつ数値的に拡大することができる、Ｋ５６２に由来する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）が挙げられる。
Ｂ．Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）

【0159】

いくつかの実施形態において、遺伝的に操作された抗原レセプターには、組換えＴＣＲ、および／または天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲが含まれる。「Ｔ細胞レセプター」または「ＴＣＲ」とは、可変ａ鎖および可変β鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）または可変γ鎖および可変δ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られる）を含む分子であって、ＭＨＣレセプターに結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子のことを指す。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αβ型である。

【0160】

通常、αβ型およびγδ型として存在するＴＣＲは、一般に構造が似ているが、それらを発現しているＴ細胞は、解剖学的位置または機能が異なり得る。ＴＣＲは、細胞表面上にまたは可溶型として見られ得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見られ、通常、その表面上で、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または短い細胞質テイルも含み得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ，１９９７を参照のこと）。例えば、いくつかの態様において、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質テイルを有し得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関わるＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合される。別段述べられない限り、用語「ＴＣＲ」は、その機能的ＴＣＲフラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語は、αβ型またはγδ型のＴＣＲをはじめとしたインタクトなまたは完全長のＴＣＲも包含する。

【0161】

したがって、本明細書中の目的では、ＴＣＲへの言及には、任意のＴＣＲまたは機能的フラグメント（例えば、ＭＨＣ分子において結合した特異的な抗原ペプチド、すなわち、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分）が含まれる。交換可能に使用され得る、ＴＣＲの「抗原結合部分」または抗原結合フラグメントとは、ＴＣＲの構造ドメインの一部分しか含まないが、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子のことを指す。いくつかの場合において、抗原結合部分は、特異的なＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン（例えば、ＴＣＲの可変ａ鎖および可変β鎖）を含み、例えば一般に、各鎖が３つの相補性決定領域を含む。

【0162】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは、会合してループ、または免疫グロブリンに類似の相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成し、それにより、抗原認識がもたらされ、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性が決定され、ペプチド特異性が決定される。通常、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられる（例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１は、抗原ペプチドのＮ末端部と相互作用するとも示されているのに対して、ベータ鎖のＣＤＲ１は、そのペプチドのＣ末端部と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含み得る。

【0163】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外の部分（例えば、ａ鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメインである、Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、Ｖ_ａまたはＶｐ；通常、ＫａｂａｔナンバリングであるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５^ｔｈ ｅｄ．に基づくアミノ酸１～１１６）、および細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメインまたはＣ_ａ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２９５）を含み得る。例えば、いくつかの場合、それらの２本の鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外の部分は、２つの膜近位定常ドメイン、およびＣＤＲを含む２つの膜遠位可変ドメインを含む。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列を含み、それにより、それらの２本の鎖の間に連結が形成される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲが、定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含むように、そのＴＣＲは、α鎖およびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してもよい。

【0164】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、正に帯電している。いくつかの場合において、ＴＣＲ鎖は、細胞質テイルを含む。いくつかの場合において、その構造のおかげで、ＴＣＲはＣＤ３のような他の分子と会合することができる。例えば、膜貫通領域とともに定常ドメインを含むＴＣＲは、そのタンパク質を細胞膜に固定し得、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。

【0165】

一般に、ＣＤ３は、哺乳動物においては３つの異なる鎖（γ、δおよびε）およびζ鎖を有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびホモ二量体のＣＤ３ζ鎖を含み得る。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これは、これらの鎖が、正に帯電したＴ細胞レセプター鎖と会合できるようにする特性である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の各細胞内テイルは、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られる保存された単一のモチーフを含むのに対して、各ＣＤ３ζ鎖は、３つ含む。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関わる。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから細胞へのシグナルの伝播において役割を果たす。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと一体となって、Ｔ細胞レセプター複合体として知られる複合体を形成する。

【0166】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、２本の鎖αおよびβ（または必要に応じてγおよびδ）のヘテロ二量体であり得るか、または一本鎖ＴＣＲ構築物であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ジスルフィド結合などによって連結された２本の別個の鎖（α鎖とβ鎖またはγ鎖とδ鎖）を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、標的抗原（例えば、癌抗原）に対するＴＣＲが特定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸は、公的に入手可能なＴＣＲ ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などによって、種々の起源から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、生物学的起源、例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な起源から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、インビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態において、高親和性Ｔ細胞クローンが、患者から単離され得、ＴＣＲが単離され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系またはＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて産生されたクローンである。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイを用いて、標的抗原に対するＴＣＲが単離される（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＬｉ，２００５を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識によって合成的に作製され得る。
Ｃ．抗原提示細胞

【0167】

マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のＭＨＣ分子の発現によって識別される。ＡＰＣは、抗原を内部移行し、その抗原の一部をＭＨＣ分子とともにその細胞膜の外膜上に再発現する。ＭＨＣは、複数の遺伝子座を含む大きな遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣと称されるＭＨＣ膜分子の主要な２クラスをコードする。Ｔヘルパーリンパ球は、一般に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子と会合した抗原を認識する。ＭＨＣは、ヒトではＨＬＡ複合体と称され、マウスではＨ－２複合体と称される。

【0168】

いくつかの場合において、上記実施形態の治療的組成物および細胞療法用の生成物を調製する際には、ａＡＰＣが有用である。抗原提示システムの調製および使用に関する一般的ガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号および同第６，７９０，６６２号；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号および同第２００９／０００４１４２号；ならびに国際公開番号ＷＯ２００７／１０３００９を参照のこと。

【0169】

ａＡＰＣシステムは、少なくとも１つの外来性の補助分子を含み得る。任意の好適な数および組み合わせの補助分子が使用され得る。補助分子は、共刺激分子および接着分子などの補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ８６、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、４１ＢＢリガンドおよびＩＬ－２１が挙げられる。接着分子としては、例えば細胞間の接触または細胞とマトリックスとの接触を促進する、セレクチンなどの糖結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの１回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質が挙げられ得る。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ－３、およびＩＣＡＭ－１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子および接着分子をはじめとした例示的な補助分子の選択、クローニング、調製および発現に有用な手法、方法および試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号に例証されている。
Ｄ．抗原

【0170】

遺伝的に操作された抗原レセプターによって標的化される抗原には、養子細胞療法を介して標的化される疾患、状態または細胞型の状況において発現される抗原が含まれる。それらの疾患および状態には、血液癌、免疫系の癌（例えば、リンパ腫、白血病および／またはミエローマ、例えば、Ｂ、Ｔおよび骨髄性白血病、リンパ腫ならびに多発性骨髄腫）をはじめとした癌および腫瘍を含む、増殖性、腫瘍性および悪性の疾患および障害が含まれる。いくつかの実施形態において、抗原は、正常細胞もしくは正常組織または非標的化細胞もしくは非標的化組織と比べて、その疾患または状態の細胞上、例えば、腫瘍細胞上または病原性細胞上に、選択的に発現されるかまたは過剰発現される。他の実施形態において、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ／または操作された細胞上に発現される。

【0171】

任意の好適な抗原が、本方法において標的化され得る。その抗原は、ある特定の癌細胞に関連することもあるが、いくつかの場合では、非癌性細胞と関連しないこともある。例示的な抗原としては、感染性物質、自己（ａｕｔｏ）抗原／自己（ｓｅｌｆ）抗原、腫瘍関連抗原／癌関連抗原、および腫瘍新抗原に由来する抗原性分子（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、それらの抗原には、ＮＹ－ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｕｃ－１、Ｈｅｒ２、ＣＡ－１２５、ＷＴ－１、Ｍａｇｅ－Ａ３、Ｍａｇｅ－Ａ４、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４およびＣＥＡが含まれる。特定の態様において、２つ以上の抗原レセプターに対する抗原としては、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＷＴ１、ＣＤ１２３、ＮＹ－ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＣＡ－１２５、ＷＴ１、Ｍａｇｅ－Ａ３、Ｍａｇｅ－Ａ４、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４および／またはＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗原に対する配列は、当該分野で公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおける以下のものである：ＣＤ１９（アクセッション番号ＮＧ＿００７２７５．１）、ＥＢＮＡ（アクセッション番号ＮＧ＿００２３９２．２）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、ＣＤ１２３（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＮＹ－ＥＳＯ（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（アクセッション番号ＮＧ＿００７７２６．３）、ＭＵＣ１（アクセッション番号ＮＧ＿０２９３８３．１）、ＨＥＲ２（アクセッション番号ＮＧ＿００７５０３．１）、ＣＡ－１２５（アクセッション番号ＮＧ＿０５５２５７．１）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、Ｍａｇｅ－Ａ３（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４４．１）、Ｍａｇｅ－Ａ４（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４５．１）、Ｍａｇｅ－Ａ１０（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４（アクセッション番号ＮＣ＿０００００３．１２）、および／またはＣＥＡ（アクセッション番号ＮＣ＿００００１９．１０）。

【0172】

腫瘍関連抗原は、例として、前立腺癌、乳癌、直腸結腸癌、肺癌、膵臓癌、腎癌、中皮腫、卵巣癌、肝臓癌、脳癌、骨癌、胃癌、脾臓癌、精巣癌、子宮頸癌、肛門癌、胆嚢癌、甲状腺癌または黒色腫に由来し得る。例示的な腫瘍関連抗原または腫瘍細胞由来抗原としては、ＭＡＧＥ１、３およびＭＡＧＥ４（または他のＭＡＧＥ抗原、例えば、国際特許公開番号ＷＯ９９／４０１８８に開示されているもの）；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ ＥＳＯ１としても知られる）；ＳＡＧＥ；およびＨＡＧＥまたはＧＡＧＥが挙げられる。腫瘍抗原のこれらの非限定的な例は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌などの広範囲の腫瘍タイプにおいて発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照のこと。前立腺癌の腫瘍関連抗原としては、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、ＮＫＸ３．１および前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）が挙げられる。

【0173】

他の腫瘍関連抗原としては、Ｐｌｕ－１、ＨＡＳＨ－１、ＨａｓＨ－２、ＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｉｎが挙げられる。さらに、腫瘍抗原は、多くの癌の処置において有用な自己ペプチドホルモン、例えば、完全長の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、短い１０アミノ酸長のペプチドであり得る。

【0174】

腫瘍抗原には、ＨＥＲ－２／ｎｅｕの発現などの腫瘍関連抗原の発現を特徴とする癌に由来する腫瘍抗原が含まれる。目的の腫瘍関連抗原には、系列特異的腫瘍抗原、例えば、メラノサイト－黒色腫系列抗原ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ－７、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質が含まれる。例証的な腫瘍関連抗原としては、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ－Ｍｙｃ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、Ａ－Ｒａｆ、Ｂ－ＲａｆおよびＣ－Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＲＴ－１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ－６、－１０、ＧＡＧＥ－１、－２、－８、ＧＡＧＥ－３、－４、－５、－６、－７Ｂ、ＮＡ８８－Ａ、ＭＡＲＴ－１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＡＲＴ－４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫレセプター、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、－カテニン／ｍ、カスパーゼ－８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ－４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、７０７－ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ－ａｂｌ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、レセプターチロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）（特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子レセプター（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃファミリー、ｓｙｋ－ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、シグナル伝達性転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳおよびＳＴＡＴＥ、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ－１およびＨＩＦ－２）、核因子－カッパーＢ（ＮＦ－Ｂ）、Ｎｏｔｃｈレセプター（例えば、Ｎｏｔｃｈ１～４）、ｃ－Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）およびそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ－３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌－５Ｔ４、ＳＭ２２－アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点（ｓａｒｃｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）、ＥｐｈＡ２、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲンレセプター、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１ならびにイディオタイプのうちのいずれか１つ以上に由来するかまたはいずれか１つ以上を含む腫瘍抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

【0175】

抗原は、腫瘍細胞において変異した遺伝子由来の、または正常細胞と比べて腫瘍細胞において異なるレベルで転写される遺伝子由来の、エピトープ領域またはエピトープペプチド（例えば、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再配列、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型または野生型ｐ５３、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１、およびＮ－アセチルグルコサミン転移酵素－Ｖなどの異常に発現されるイントロン配列）；ミエローマおよびＢ細胞リンパ腫においてユニークなイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再配列；オンコウイルスのプロセスに由来するエピトープ領域またはエピトープペプチドを含む腫瘍抗原（例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７）；エプスタイン・バーウイルスタンパク質ＬＭＰ２；腫瘍選択的に発現する変異していない腫瘍胎児性タンパク質（例えば、癌胎児抗原およびアルファ－フェトプロテイン）を含み得る。

【0176】

他の実施形態において、抗原は、病原性微生物または日和見病原性微生物（本明細書中で感染症微生物とも呼ばれる）（例えば、ウイルス、真菌、寄生生物および細菌）から得られるかまたはそれらに由来する。ある特定の実施形態において、そのような微生物に由来する抗原には、完全長タンパク質が含まれる。

【0177】

本明細書中に記載される方法において使用が企図される抗原を有する例証的な病原性生物としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルス）、アデノウイルス、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む連鎖球菌属の種が挙げられる。当業者が理解するように、本明細書中に記載されるような抗原として使用するためのこれらおよび他の病原性微生物に由来するタンパク質、ならびにそれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、刊行物ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて特定され得る。

【0178】

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原には、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のうちのいずれかが含まれる。

【0179】

単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）に由来する抗原としては、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。後期群の遺伝子は、ビリオン粒子を形成するタンパク質を主にコードする。そのようなタンパク質としては、ウイルスキャプシドを形成する（ＵＬ）の５つのタンパク質：ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８ならびに主要キャプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５およびＵＬ２７（これらの各々が、本明細書中に記載されるような抗原として使用され得る）が挙げられる。本明細書中で抗原としての使用が企図される他の例証的なＨＳＶタンパク質としては、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質が挙げられる。ＨＳＶゲノムは、少なくとも７４個の遺伝子を含み、その各々が、抗原として使用され得る可能性があるタンパク質をコードする。

【0180】

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原としては、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の前初期および初期に発現されるウイルス抗原、糖タンパク質ＩおよびＩＩＩ、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、低分子マトリックスタンパク質（ｌｏｗｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１および１Ｅ２（ＵＬ１２３およびＵＬ１２２）、ＵＬ１２８～ＵＬ１５０の遺伝子クラスターのタンパク質産物（Ｒｙｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００６）、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ、ならびにｐｐ１５０が挙げられる。当業者が理解するように、本明細書中に記載される抗原として使用するためのＣＭＶタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて特定され得る（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍａｒｓｃｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照のこと）。

【0181】

ある特定の実施形態において使用が企図されるエプスタイン・バンウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原としては、ＥＢＶ溶解性タンパク質ｇｐ３５０およびｇｐ１１０、エプスタイン・バン核抗原（ＥＢＮＡ）－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３Ａ、ＥＢＮＡ－３Ｂ、ＥＢＮＡ－３Ｃ、ＥＢＮＡ－リーダータンパク質（ＥＢＮＡ－ＬＰ）、ならびに潜伏感染膜タンパク質（ＬＭＰ）－１、ＬＭＰ－２ＡおよびＬＭＰ－２Ｂを含む、潜伏感染サイクル中に生成されるＥＢＶタンパク質が挙げられる（例えば、Ｌｏｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照のこと）。

【0182】

本明細書中で使用が企図される呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する抗原には、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１個のタンパク質またはそれらの抗原性フラグメント：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオキャプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）ＳＨ、ＧおよびＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリックスタンパク質）、Ｍ２－１（伸長因子）、Ｍ２－２（転写制御）、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにリンタンパク質Ｐのうちのいずれかが含まれる。

【0183】

使用が企図される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する抗原には、ＶＳＶゲノムによってコードされる主要な５つのタンパク質およびそれらの抗原性フラグメント：巨大タンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ）のうちのいずれか１つが含まれる（例えば、Ｒｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照のこと）。

【0184】

ある特定の実施形態において使用が企図されるインフルエンザウイルスに由来する抗原としては、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質Ｍ１およびＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、ならびにＰＢ２が挙げられる。

【0185】

例示的なウイルス抗原としては、アデノウイルスのポリペプチド、アルファウイルスのポリペプチド、カリシウイルスのポリペプチド（例えば、カリシウイルスのキャプシド抗原）、コロナウイルスのポリペプチド、ジステンパーウイルスのポリペプチド、エボラウイルスのポリペプチド、エンテロウイルスのポリペプチド、フラビウイルスのポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）のポリペプチド（Ｂ型肝炎コアまたは表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、コアまたは非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスのポリペプチド（単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスのポリペプチド、白血病ウイルスのポリペプチド、マールブルグウイルスのポリペプチド、オルトミクソウイルスのポリペプチド、パピローマウイルスのポリペプチド、パラインフルエンザウイルスのポリペプチド（例えば、赤血球凝集素ポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスのポリペプチド、パルボウイルスのポリペプチド、ペスチウイルスのポリペプチド、ピコルナウイルスのポリペプチド（例えば、ポリオウイルスのキャプシドポリペプチド）、ポックスウイルスのポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスのポリペプチド）、狂犬病ウイルスのポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルスの糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスのポリペプチド、レトロウイルスのポリペプチド、およびロタウイルスのポリペプチドも挙げられるが、これらに限定されない。

【0186】

ある特定の実施形態において、抗原は、細菌抗原であり得る。ある特定の実施形態において、目的の細菌抗原は、分泌型ポリペプチドであり得る。他のある特定の実施形態において、細菌抗原には、細菌の細胞外面上に露出したポリペプチドの一部分を有する抗原が含まれる。

【0187】

使用が企図される、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種に由来する抗原としては、ビルレンス制御因子、例えば、Ａｇｒシステム、ＳａｒおよびＳａｅ、Ａｒｌシステム、Ｓａｒホモログ（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺおよびＴｃａＲ）、ＳｒｒシステムならびにＴＲＡＰが挙げられる。抗原として役立ち得る他のブドウ球菌属のタンパク質としては、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡおよびＣｆｖＢが挙げられる（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８ Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄ．Ｊｏｄｉ Ｌｉｎｄｓａｙを参照のこと）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの２種（Ｎ３１５およびＭｕ５０）のゲノムが、配列決定済みであり、例えば、ＰＡＴＲＩＣ（ＰＡＴＲＩＣ：Ｔｈｅ ＶＢＩ ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）において公的に入手可能である。当業者が理解するように、抗原として使用するためのブドウ球菌属のタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（登録商標）およびＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的データベースにおいても特定され得る。

【0188】

本明細書中に記載されるある特定の実施形態において使用が企図されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原としては、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔおよびピリンタンパク質（ＲｒｇＡ；ＲｒｇＢ；ＲｒｇＣ）が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原性タンパク質も、当該分野で公知であり、いくつかの実施形態において抗原として使用され得る（例えば、Ｚｙｓｋ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照のこと）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの毒性株の全ゲノム配列は、配列決定済みであり、当業者が理解するように、本明細書中で使用するためのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的データベースにおいても特定され得る。本開示に係る抗原として特に興味深いタンパク質としては、肺炎球菌の表面に露出すると予測される病原性因子およびタンパク質が挙げられる（例えば、Ｆｒｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０を参照のこと）。

【0189】

抗原として使用され得る細菌抗原の例としては、アクチノマイセス属のポリペプチド、バチルス属のポリペプチド、バクテロイデス属のポリペプチド、ボルデテラ属のポリペプチド、バルトネラ属のポリペプチド、ボレリア属のポリペプチド（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＯｓｐＡ）、ブルセラ属のポリペプチド、カンピロバクター属のポリペプチド、キャプノサイトファーガ属のポリペプチド、クラミジア属のポリペプチド、コリネバクテリウム属のポリペプチド、コクシエラ属のポリペプチド、デルマトフィルス属のポリペプチド、エンテロコッカス属のポリペプチド、エーリキア属のポリペプチド、エシェリキア属のポリペプチド、フランシセラ属のポリペプチド、フソバクテリウム属のポリペプチド、ヘモバルトネラ属のポリペプチド、ヘモフィルス属のポリペプチド（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型外膜タンパク質）、ヘリコバクター属のポリペプチド、クレブシエラ属のポリペプチド、Ｌ型細菌のポリペプチド、レプトスピラ属のポリペプチド、リステリア属のポリペプチド、マイコバクテリウム属のポリペプチド、マイコプラズマ属のポリペプチド、ナイセリア属のポリペプチド、ネオリケッチア属のポリペプチド、ノカルジア属のポリペプチド、パスツレラ属のポリペプチド、ペプトコッカス属のポリペプチド、ペプトストレプトコッカス属のポリペプチド、肺炎球菌のポリペプチド（すなわち、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのポリペプチド）（本明細書中の説明を参照のこと）、プロテウス属のポリペプチド、シュードモナス属のポリペプチド、リケッチア属のポリペプチド、ロシャリメア属のポリペプチド、サルモネラ属のポリペプチド、シゲラ属のポリペプチド、ブドウ球菌属のポリペプチド、Ａ群連鎖球菌のポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＭタンパク質）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のポリペプチド、トレポネーマ属のポリペプチド、およびエルシニア属のポリペプチド（例えば、Ｙ ｐｅｓｔｉｓのＦ１およびＶ抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0190】

真菌抗原の例としては、アブシディア属のポリペプチド、アクレモニウム属のポリペプチド、アルテルナリア属のポリペプチド、アスペルギルス属のポリペプチド、バシジオボラス属のポリペプチド、ビポラーリス属のポリペプチド、ブラストミセス属のポリペプチド、カンジダ属のポリペプチド、コクシジオイデス属のポリペプチド、コニディオボラス属のポリペプチド、クリプトコッカス属のポリペプチド、カーバラリア属のポリペプチド、エピデルモフィトン属のポリペプチド、エクソフィアラ属のポリペプチド、ゲオトリクム属のポリペプチド、ヒストプラズマ属のポリペプチド、マヅレラ属のポリペプチド、マラセチア属のポリペプチド、ミクロスポルム属のポリペプチド、モニリエラ属のポリペプチド、モルチエレラ属のポリペプチド、ケカビ属のポリペプチド、ペシロマイセス属のポリペプチド、ペニシリウム属のポリペプチド、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）のポリペプチド、フィアロフォラ属のポリペプチド、プロトテカ属のポリペプチド、シュードアレシェリア属のポリペプチド、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）のポリペプチド、フィチウム属のポリペプチド、リノスポリジウム属のポリペプチド、クモノスカビ属のポリペプチド、スコレコバシジウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）のポリペプチド、スポロトリクス属のポリペプチド、ステンフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）のポリペプチド、白癬菌属のポリペプチド、トリコスポロン属のポリペプチドおよびキシロヒファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0191】

原生動物の寄生生物抗原の例としては、バベシア属のポリペプチド、バランチジウム属のポリペプチド、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）のポリペプチド、クリプトスポリジウム属のポリペプチド、エイメリア属のポリペプチド、エンセファリトゾーン属のポリペプチド、エントアメーバ属のポリペプチド、ジアルジア属のポリペプチド、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）のポリペプチド、ヘパトゾーン属のポリペプチド、イソスポラ属のポリペプチド、リーシュマニア属のポリペプチド、微胞子虫門のポリペプチド、ネオスポラ属のポリペプチド、ノゼマ属のポリペプチド、ペンタトリコモナス属のポリペプチド、プラスモディウム属のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。蠕虫寄生生物抗原の例としては、アカントケイロネマ属のポリペプチド、アエルロストロンギルウス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）のポリペプチド、鉤虫属のポリペプチド、住血線虫属のポリペプチド、回虫属のポリペプチド、ブルギア属のポリペプチド、ブノストムム属のポリペプチド、キャピラリア属のポリペプチド、カベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）のポリペプチド、クーペリア属のポリペプチド、クレノソマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）のポリペプチド、ディクチオカウルス属のポリペプチド、ジオクトフィーメ属のポリペプチド、ディペタロネマ属のポリペプチド、裂頭条虫属のポリペプチド、ジプリジウム属のポリペプチド、イヌ糸状虫属のポリペプチド、ドラクンクルス属のポリペプチド、エンテロビウス属のポリペプチド、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）のポリペプチド、ヘモンクス属のポリペプチド、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）のポリペプチド、ロア糸状虫属（Ｌｏａ）のポリペプチド、マンソネラ属のポリペプチド、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）のポリペプチド、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）のポリペプチド、アメリカ鉤虫属のポリペプチド、ネマトジルス属のポリペプチド、腸結節虫属のポリペプチド、オンコセルカ属のポリペプチド、オピストルキス属のポリペプチド、オステルタギア属のポリペプチド、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）のポリペプチド、肺吸虫属のポリペプチド、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）のポリペプチド、フィサロプテラ属のポリペプチド、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）のポリペプチド、セタリア属のポリペプチド、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）のポリペプチド スピロメトラ属のポリペプチド、ステファノフィラリア属のポリペプチド、ストロンギロイデス属のポリペプチド、ストロンギルス属のポリペプチド、テラジア属のポリペプチド、トキサスカリス属のポリペプチド、トキソカラ属のポリペプチド、旋毛虫属のポリペプチド、毛様線虫属のポリペプチド、鞭虫属のポリペプチド、ウンシナリア属のポリペプチドおよびウケレリア属のポリペプチド（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲ポリペプチド（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原（ｌｉｖｅｒ ｓｔａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ ｃ末端）、ならびに搬出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ－１）、ニューモシスチス属のポリペプチド、サルコシスティス属のポリペプチド、住血吸虫属のポリペプチド、タイレリア属のポリペプチド、トキソプラズマ属のポリペプチド、ならびにトリパノソーマ属のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0192】

外寄生生物抗原の例としては、ノミ；カタダニおよびヒメダニを含むマダニ；ハエ、例えば、小虫、蚊、スナバエ、ブユ、ウマバエ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ幼虫症の原因となるハエおよび刺して血を吸う小さな羽虫（ｂｉｔｉｎｇ ｇｎａｔｓ）；アリ；クモ、シラミ；ダニ；ならびに半翅類の昆虫、例えば、トコジラミおよびサシガメのポリペプチド（抗原ならびにアレルゲンを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｅ．自殺遺伝子

【0193】

いくつかの場合において、本開示の任意の細胞が、異種サイトカイン、操作されたレセプターなど以外の１つ以上の作用物質を産生するように改変される。具体的な実施形態において、ＮＫ細胞などの細胞は、１つ以上の自殺遺伝子を有するように操作され、本明細書中で使用される用語「自殺遺伝子」は、プロドラッグが投与された際に、遺伝子産物が、宿主細胞を殺滅する化合物に変化する遺伝子と定義される。いくつかの場合において、ＮＫ細胞療法は、ＮＫ細胞療法を受けている個体および／またはＮＫ細胞療法を受けた個体が、１つ以上の有害事象の１つ以上の症状（例えば、サイトカイン放出症候群、神経毒性、アナフィラキシー／アレルギーおよび／またはオンターゲット／オフ腫瘍毒性（例として））を示したとき、または１つ以上の症状を有するリスクがあると考えられるとき（切迫した場合を含む）、任意の種類の１つ以上の自殺遺伝子の利用の対象となり得る。自殺遺伝子の使用は、治療のために計画されたプロトコルの一部であり得るか、またはそれを使用する必要性が認められたときにだけ使用され得る。いくつかの場合において、細胞療法は、もはや必要なくなったという理由で、自殺遺伝子またはその遺伝子産物を標的化する作用物質を使用することによって終結される。

【0194】

自殺遺伝子の例としては、操作された非分泌性（膜結合型を含む）の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ変異ポリペプチド（その全体が参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ／ＵＳ１９／６２００９を参照のこと）が挙げられ、それらのポリペプチドは、ＴＮＦ－アルファ変異体に結合する抗体の送達によって標的化され得る。使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）と、ガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼとシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼと５－フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）とＡＺＴ；およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシドである。プロドラッグである６－メチルプリンデオキシリボシドを毒性のプリンである６－メチルプリンに変換するいわゆる自殺遺伝子であるＥ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオシドホスホリラーゼが使用され得る。他の自殺遺伝子としては、ＣＤ２０、ＣＤ５２、誘導性カスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロ還元酵素（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン－α，γ－リアーゼ（ＭＥＴ）およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が例として挙げられる。
Ｆ．送達方法

【0195】

当業者であれば、本開示の抗原レセプターを発現させるために標準的な組換え手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６（両方が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）によってベクターを構築する能力を十分に備えているだろう。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来するもの）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来するもの）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能型、複製欠損型およびガットレス型（ｇｕｔｌｅｓｓ ｆｏｒｍｓ）を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、マラバウイルス（ｍａｒａｂａ ｖｉｒｕｓ）ベクターおよびＢ群アデノウイルスｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖベクターが挙げられるがこれらに限定されない。

【0196】

具体的な実施形態において、ベクターは、ＰＣＴ／ＵＳ１９／６２０１４（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されているようなマルチシストロニックベクターである。そのような場合、単一のベクターが、ＣＡＲまたはＴＣＲ（その発現構築物は、ＣＡＲまたはＴＣＲの部分の相互交換を可能にするためにモジュール形式で構成され得る）、自殺遺伝子および１つ以上のサイトカインをコードし得る。
ａ．ウイルスベクター

【0197】

抗原レセプターをコードするウイルスベクターが、本開示のある特定の態様において提供され得る。組換えウイルスベクターを作製する際、必須ではない遺伝子は、通常、異種（または非天然）タンパク質の遺伝子またはコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して、核酸および場合によってはタンパク質を細胞に導入する一種の発現構築物である。ある特定のウイルスが細胞に感染する能力またはレセプター媒介性のエンドサイトーシスを介して細胞に侵入する能力、および宿主細胞のゲノムにインテグレートし、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力によって、それらのウイルスが、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移行させるための魅力的な候補になった。本発明のある特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を下記に記載する。

【0198】

レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子も含む。レンチウイルスベクターは、当該分野で周知である（例えば、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照のこと）。

【0199】

組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボとエキソビボの両方において遺伝子導入および核酸配列発現のために使用され得る。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルス（ここで、好適な宿主細胞が、パッケージング機能を有する２つ以上のベクター、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔでトランスフェクトされる）は、参照により本明細書中に援用される米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
ｂ．調節エレメント

【0200】

本開示において有用なベクターに含められる発現カセットは、特に、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を（５’から３’の方向で）含む。タンパク質をコードする遺伝子の転写を真核細胞において制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝的エレメントから構成される。細胞機構は、各エレメントによって運ばれる調節情報を集め、統合することができ、それにより、異なる遺伝子が、多くの場合は複雑なパターンである異なるパターンの転写制御を展開することが可能になる。本開示の状況において使用されるプロモーターとしては、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーターが挙げられる。
（ｉ）プロモーター／エンハンサー

【0201】

本明細書中に提供される発現構築物は、抗原レセプターの発現を駆動するプロモーターを含む。プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位の位置を特定するように機能する配列を含む。これの最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、一部のプロモーターでは、ＴＡＴＡボックスを欠き、開始部位自体と重なっている不連続なエレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を制御する。通常、これらは、開始部位の３０１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むと示されている。コード配列をプロモーター「の支配下に」するためには、転写読み枠の転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’）に置く。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるＲＮＡの発現を促進する。

【0202】

プロモーターエレメント間の間隔は、変更がきくことが多く、エレメントが、反転されるかまたは互いに対して移動された場合でも、プロモーターの機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めるまで最大５０ｂｐ広げられ得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協同的にまたは独自に機能して転写を活性化し得るとみられる。プロモーターは、核酸配列の転写性の活性化に関わるシス作用性制御配列のことを指す「エンハンサー」と併せて使用されてもよいし、使用されなくてもよい。

【0203】

プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られることがあるような、ある核酸配列と天然に会合したプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、「内在性」プロモーターと呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、ある核酸配列の下流または上流に位置する、その配列と天然に会合したエンハンサーであり得る。あるいは、ある核酸配列とその天然の環境では天然には会合していないプロモーターのことを指す、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの支配下にコード核酸セグメントを置くことによって、一定の利点が得られる。また、組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーは、その天然の環境では核酸配列と天然には会合していないエンハンサーのことを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに他の任意のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在」しない、すなわち、種々の転写制御領域の種々のエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含む、プロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡの構築において最もよく使用されるプロモーターとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ－）プロモーターシステムが挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、組換えクローニング、および／またはＰＣＲ^ＴＭをはじめとした核酸増幅技術を用いて、ある配列が、本明細書中に開示される組成物に関連して作製され得る。さらに、核以外のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）内での配列の転写および／または発現を指示する調節配列も同様に使用できることが企図される。

【0204】

当然、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要になる。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のために、プロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせを使用することを承知している（例えば、参照により本明細書中に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および／または導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示する、適切な条件下において有用なプロモーター（例えば、組換えタンパク質および／または組換えペプチドの大規模生成において有益なプロモーター）であり得る。そのプロモーターは、異種であっても、内在性であってもよい。

【0205】

さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／のワールドワイドウェブを介したＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢに従って）も、発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用が、別の実行可能な実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたはさらなる遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質での転写を支持し得る。

【0206】

プロモーターの非限定的な例としては、初期ウイルスプロモーターまたは後期ウイルスプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター）；真核細胞プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；および連鎖状応答エレメントプロモーター（例えば、サイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）およびミニマルＴＡＴＡボックス近傍の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ））が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）に記載されているヒト成長ホルモンミニマルプロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ４５００７）を使用することも可能である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ、デクチン－１、デクチン－２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ ＭＬＰ、ベータ－アクチン、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、しかしながら、治療用の遺伝子の発現を駆動するために有用な他の任意のプロモーターも本開示の実施に適用できる。

【0207】

ある特定の態様において、本開示の方法は、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増加させる核酸配列であって、シスで、かつその向きを問わず、比較的長い距離（標的プロモーターから最大数キロベース離れた距離）にわたって作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかしながら、エンハンサーは、所与のプロモーターに対して近位でも機能し得るので、エンハンサーの機能は必ずしもそのような長い距離に限定されない。
（ｉｉ）開始シグナルおよび連結発現

【0208】

コード配列の効率的な翻訳のために、本開示に提供される発現構築物において、特異的な開始シグナルも使用され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。外来性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供される必要がある場合がある。当業者であれば、これを判断することおよび必要なシグナルを提供することが容易にできるだろう。インサート全体の翻訳を確保するためには、開始コドンが、所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことは周知である。その外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものまたは合成のものであり得る。適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって、発現効率が高められ得る。

【0209】

ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子のメッセージ、すなわちポリシストロニックなメッセージを生成するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部の部位において翻訳を開始することができる。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント、ならびに哺乳動物のメッセージ由来のＩＲＥＳが、報告されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結できる。各々がＩＲＥＳによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、ポリシストロニックなメッセージを生成できる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームが、効率的な翻訳のためにリボソームに接近できるようになる。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現して、単一のメッセージを転写することもできる。

【0210】

さらに、本開示に提供される構築物内の遺伝子の連結発現または同時発現をもたらすために、ある特定の２Ａ配列エレメントが使用され得る。例えば、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成することによって遺伝子を同時発現するために、切断配列が使用され得る。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）である。
（ｉｉｉ）複製開始点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、そのベクターは、１つ以上の複製開始部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）、例えば、複製が開始される特異的な核酸配列である、上に記載されたようなＥＢＶのｏｒｉＰまたはプログラミングにおける機能が似ているかもしくは高められた遺伝的に操作されたｏｒｉＰに対応する核酸配列を含み得る。あるいは、上に記載されたような染色体外で複製する他のウイルスの複製起点、または自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
ｃ．選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカー

【0211】

いくつかの実施形態において、本開示の構築物を含む細胞は、マーカーを発現ベクターに含めることによって、インビトロまたはインビボにおいて特定され得る。そのようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞を容易に特定できるようにする特定可能な変化を細胞にもたらす。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、そのマーカーが存在することによってその選択が可能になるマーカーであり、ネガティブ選択マーカーは、その存在が選択を妨げるマーカーである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。

【0212】

通常、薬物選択マーカーを含めることにより、形質転換体のクローニングおよび特定が助けられ、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対して耐性にする遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色解析を基礎とする、ＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーをはじめとした他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの、ネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素が利用され得る。当業者であれば、免疫学的マーカーをおそらくはＦＡＣＳ解析と併せて使用する方法も承知しているだろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、重要ではないと考えられている。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
ｄ．他の核酸送達方法

【0213】

抗原レセプターをコードする核酸のウイルス送達に加えて、以下の方法が、所与の宿主細胞への組換え遺伝子送達のさらなる方法であるので、本開示において考慮される。

【0214】

本開示の免疫細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の導入は、本明細書中に記載されるようにまたは当業者に公知であるように、細胞を形質転換するための核酸送達に適した任意の方法を使用し得る。そのような方法としては、ＤＮＡの直接送達（例えば、エキソビボトランスフェクション、注射（マイクロインジェクションを含む））；エレクトロポレーション；リン酸カルシウム沈殿；ＤＥＡＥ－デキストランに続くポリエチレングリコールの使用；直接的な音波負荷；リポソーム媒介性のトランスフェクションおよびレセプター媒介性のトランスフェクション；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；炭化ケイ素繊維を伴った撹拌；アグロバクテリウム媒介性の形質転換；乾燥／阻害媒介性のＤＮＡ取り込み、およびそのような方法の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの手法などの手法の適用により、オルガネラ、細胞、組織または生物が安定にまたは一過性に形質転換され得る。
ＶＩ．処置方法

【0215】

本開示の実施形態は、癌、任意の種類の感染症および任意の免疫障害について個体を処置する方法を含む。その個体は、最初の処置として、または別の処置の後にもしくは別の処置の最中に、本開示の処置方法を使用し得る。免疫療法の方法は、癌のタイプまたはステージに基づいて、癌を有する個体のニーズに合わせることができ、少なくともいくつかの場合では、免疫療法は、処置の期間中にその個体に対して改変され得る。

【0216】

具体的な場合において、処置方法は、以下のとおりである：１）任意のタイプの血液悪性腫瘍を有する癌患者を処置するために、ＴまたはＮＫ細胞（エキソビボで拡大されたＴもしくはＮＫ細胞、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを発現するＴもしくはＮＫ細胞）を用いる養子細胞療法、（２）任意のタイプの固形癌を有する癌患者を処置するために、ＴまたはＮＫ細胞（エキソビボで拡大されたＴもしくはＮＫ細胞、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを発現するＴもしくはＮＫ細胞）を用いる養子細胞療法、（３）免疫障害を有する患者を処置するために、Ｔｒｅｇおよび制御性Ｂ細胞を用いる養子細胞療法（エキソビボ拡大された、またはＣＡＲまたはＴＣＲを発現する）、（４）感染症を有する患者を処置するために、ＴまたはＮＫ細胞（エキソビボで拡大されたＴもしくはＮＫ細胞、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを発現するＴもしくはＮＫ細胞）を用いる養子細胞療法。本開示は、ヒトＮＫ細胞における複数の遺伝子をノックダウン／ノックアウトすることが、細胞の機能の改善および腫瘍微小環境に対する抵抗性に寄与することを初めて示した。具体的な実施形態において、これには、患者自身の免疫細胞または養子移入された免疫細胞の機能を高める新規の免疫療法アプローチを用いた患者のケアに対して直接の意味がある。実施形態は、免疫療法に向けて高度に機能的なＴ、ＮＫおよびＢ細胞（エキソビボで拡大され、かつＣＡＲまたはＴＣＲが操作された細胞）を作製する新規アプローチを提供する。これらには、癌（血液腫瘍と固形腫瘍の両方）（ＮＫ細胞およびＴ細胞、また、ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＡＲ ＮＫ細胞）、自己免疫障害および同種免疫障害（Ｂ細胞、制御性Ｂ細胞および制御性Ｔ細胞）の標的化、および感染症の処置（病原体特異的Ｔ細胞）が含まれる。

【0217】

いくつかの実施形態において、本開示は、有効量の本開示の免疫細胞を投与する工程を含む、免疫療法のための方法を提供する。１つの実施形態において、免疫応答を誘発する免疫ＮＫ細胞集団の移入によって、内科疾患または内科障害が処置される。本開示のある特定の実施形態において、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって、癌または感染症が処置される。個体の癌を処置するためまたは癌の進行を遅延させるための方法が本明細書中に提供され、その方法は、有効量の抗原特異的細胞療法を個体に投与する工程を含む。本方法は、免疫障害、固形癌、血液癌およびウイルス感染症の処置に適用され得る。

【0218】

本処置方法が有用な腫瘍には、任意の悪性細胞タイプ、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍に見られる細胞タイプが含まれる。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群より選択される器官の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、ミエローマなどが挙げられる。本明細書中に提供される方法を用いて処置され得る癌のさらなる例としては、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌および消化管間質癌を含む）、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々なタイプの頭頸部癌、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0219】

癌は、具体的には以下の組織タイプの癌であり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌・胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ内腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状・濾胞腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子黒色腫；末端黒子型黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑内悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；グリオーマ、悪性；上衣腫；アストロサイトーマ；原形質性アストロサイトーマ；細線維性アストロサイトーマ；星芽腫；膠芽腫；乏突起膠腫；希突起芽腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非切れ込み型細胞ＮＨＬ；巨大病変（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病。

【0220】

特定の実施形態は、白血病の処置方法に関する。白血病は、血液または骨髄の癌であり、血液細胞、通常は白血球細胞（白血球）の異常な増殖（分裂増殖による生成）を特徴とする。白血病は、血液腫瘍と呼ばれる広範な疾患群の一部である。白血病は、多種多様な疾患を網羅する広義語である。白血病は、急性および慢性の形態に臨床的におよび病理学的に分けられる。

【0221】

本開示のある特定の実施形態において、免疫細胞は、それを必要とする個体（例えば、癌または感染症を有する個体）に送達される。次いで、それらの細胞は、その個体の免疫系を増強して、それぞれの癌細胞または病原性細胞を攻撃する。いくつかの場合では、その個体に免疫細胞が１回以上提供される。個体に免疫細胞が２回以上提供される場合、投与間の時間は、その個体において伝播するのに十分な時間であるべきであり、具体的な実施形態では、投与間の時間は、ｌ、２、３、４、５、６、７日間またはそれ以上である。

【0222】

本開示のある特定の実施形態は、免疫媒介性障害を処置または予防するための方法を提供する。１つの実施形態において、被験体は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および自己免疫性睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック多発性皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐａｔｅ－ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化群、巣状糸球体硬化症または膜性腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎または疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書中に開示される方法を用いて処置され得る自己免疫疾患のいくつかの例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。被験体は、喘息などのアレルギー性障害も有し得る。

【0223】

さらに別の実施形態では、被験体は、移植される器官または幹細胞のレシピエントであり、拒絶反応を予防および／または処置するために免疫細胞が使用される。特定の実施形態において、被験体は、移植片対宿主病を有するか、または移植片対宿主病を発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーからの幹細胞を使用するまたは含む任意の移植に関して起こり得る合併症である。ＧＶＨＤには、急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後の最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、手および足における赤みがかった発疹が挙げられ、それは、剥皮または皮膚の水疱形成を伴って広がることがあり、より重篤になることがある。急性ＧＶＨＤは、胃および腸にも影響することがあり、その場合、筋痙攣、悪心および下痢が認められる。皮膚および目の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響していることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいて等級付けされる：ステージ／グレード１が軽度であり；ステージ／グレード４が重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植の３ヶ月後またはそれ以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、さらに、慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液腺、口の唾液腺ならびに胃壁および腸を滑らかにする腺にも影響し得る。本明細書中に開示される任意の免疫細胞集団を使用することができる。移植される器官の例としては、臓器移植片、例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺および／または心臓、あるいは細胞移植片、例えば、小島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄または造血性幹細胞もしくは他の幹細胞が挙げられる。移植片は、複合性の移植片、例えば、顔面の組織であり得る。免疫細胞は、移植の前、移植と同時、または移植の後に、投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、移植の前に、例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週間前、少なくとも２週間前、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前または少なくとも１ヶ月前に投与される。１つの非限定的な具体例では、治療有効量の免疫細胞の投与は、移植の３～５日前に行われる。

【0224】

いくつかの実施形態において、被験体には、免疫細胞療法の前に骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法が施され得る。その骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、任意の好適な経路によって投与され得る任意の好適なそのような治療であり得る。その骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、特に、癌が転移性であり得る黒色腫である場合、例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与を含み得る。シクロホスファミドおよびフルダラビンの例示的な投与経路は、静脈内である。同様に、任意の好適な用量のシクロホスファミドおよびフルダラビンが投与され得る。特定の態様では、およそ６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが２日間投与され、その後、およそ２５ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンが５日間投与される。

【0225】

ある特定の実施形態では、免疫細胞の増殖および活性化を促進する成長因子が、免疫細胞と同時にまたは免疫細胞に続いて被験体に投与される。免疫細胞成長因子は、免疫細胞の増殖および活性化を促進する任意の好適な成長因子であり得る。好適な免疫細胞成長因子の例としては、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１が挙げられ、これらは、単独でまたは様々な組み合わせで（例えば、ＩＬ－２とＩＬ－７、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－１２とＩＬ－７、ＩＬ－１２とＩＬ－１５またはＩＬ－１２とＩＬ２）使用され得る。

【0226】

治療有効量の免疫細胞が、非経口投与をはじめとしたいくつかの経路、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内もしくは関節内の注射または注入によって投与され得る。

【0227】

養子細胞療法において使用するための免疫細胞の治療有効量は、処置される被験体において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するために必要な免疫細胞の量、または自己免疫疾患もしくは同種免疫疾患を後退させるために必要な免疫細胞の量、または自己免疫疾患によって引き起こされる症状、例えば、疼痛および炎症を和らげることができる量であり得る。これは、炎症に伴う症状、例えば、疼痛、浮腫および体温上昇を和らげるために必要な量であり得る。これは、移植された器官の拒絶反応を減少させるまたは予防するために必要な量でもあり得る。

【0228】

上記免疫細胞集団は、疾患状態を回復させるために、上記疾患と一致した処置レジメンで、例えば、１日から数日間にわたって１回または数回で、投与され得るか、または疾患の進行を阻害するためおよび疾患の再発を予防するために、長期間にわたる定期的な投与で投与され得る。製剤において用いられる正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度にも依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。免疫細胞の治療有効量は、処置される被験体、苦痛の重症度およびタイプならびに投与様式に依存する。いくつかの実施形態において、ヒト被験体の処置において使用され得る用量は、少なくとも３．８×１０^４、少なくとも３．８×１０^５、少なくとも３．８×１０^６、少なくとも３．８×１０^７、少なくとも３．８×１０^８、少なくとも３．８×１０^９または少なくとも３．８×１０^１０免疫細胞／ｍ^２で変動する。ある特定の実施形態において、ヒト被験体の処置において使用される用量は、約３．８×１０^９～約３．８×１０^１０免疫細胞／ｍ^２で変動する。さらなる実施形態において、免疫細胞の治療有効量は、約５×１０^６細胞／ｋｇ体重～約７．５×１０^８細胞／ｋｇ体重、例えば、約２×１０^７細胞～約５×１０^８細胞／ｋｇ体重または約５×１０^７細胞～約２×１０^８細胞／ｋｇ体重で変動し得る。免疫細胞の正確な量は、被験体の年齢、体重、性別および生理学的状態に基づいて当業者によってすぐに決定される。有効量は、インビトロモデルまたは動物モデルの試験系から導かれた用量反応曲線から外挿され得る。

【0229】

上記免疫細胞は、免疫媒介性障害を処置するための１つ以上の他の治療薬と併用して投与され得る。併用療法としては、１つ以上の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリンまたは糖質コルチコイド、例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、糖質コルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）または非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェンまたはナプロキセンナトリウム））、サイトカイン（例えば、インターロイキン－１０またはトランスフォーミング成長因子－ベータ）、ホルモン（例えば、エストロゲン）またはワクチンが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、抗体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧまたはＢ細胞を認識する抗体）；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；照射；またはケモカイン、インターロイキンもしくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、抗ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含むがこれらに限定されない免疫抑制剤または免疫寛容誘発剤が投与され得る。そのようなさらなる医薬品は、所望の効果に応じて免疫細胞の投与前、投与中または投与後に投与され得る。上記細胞および作用物質のこの投与は、同じ経路または異なる経路による投与、および同じ部位または異なる部位における投与であり得る。
Ａ．薬学的組成物

【0230】

免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞）および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物および製剤も本明細書中に提供される。

【0231】

本明細書中に記載されるような薬学的組成物および製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分（例えば、抗体またはポリペプチド）を１つ以上の自由選択の薬学的に許容され得るキャリア（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で調製され得る。薬学的に許容され得るキャリアは、一般に、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって無毒性であり、それらのキャリアとしては、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な本明細書中の薬学的に許容され得るキャリアとしては、間質薬物分散剤、例えば、中性で活性な可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと併用される。
Ｂ．併用療法

【0232】

ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療と併用される免疫細胞集団を含む。そのさらなる治療は、放射線療法、手術（例えば、ランペクトミーおよび乳房切除術）、化学療法、遺伝子治療、ＤＮＡ治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、免疫療法、骨髄移植、ナノ治療、モノクローナル抗体治療または前述の組み合わせであり得る。そのさらなる治療は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。

【0233】

いくつかの実施形態において、さらなる治療は、小分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生率および／または重症度を下げることを目的とする作用物質、例えば、抗悪心剤など）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、手術である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法と手術の併用である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的化する治療、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤および／または化学予防剤である。さらなる治療は、当該分野で公知の化学療法剤の１つ以上であり得る。

【0234】

免疫細胞療法は、免疫チェックポイント療法などのさらなる癌治療の前、最中、後または様々な組み合わせで投与され得る。それらの投与は、同時から数分、数日、数週間までの範囲の間隔で行われ得る。免疫細胞療法がさらなる治療薬とは別に患者に提供される実施形態では、それら２つの化合物が、なおも患者に対して有益な併用効果を発揮できるように、各送達時点の間にかなりの期間が経過しないことを保証するのが一般的である。そのような場合、抗体療法と抗癌療法とが、互いの約１２～２４または７２時間以内に、より詳細には、互いの約６～１２時間以内に患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況において、それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過した場合、処置期間をかなり延長することが望ましいことがある。

【0235】

様々な組み合わせが使用され得る。下記の例の場合、免疫細胞療法が、「Ａ」であり、抗癌療法が、「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ

【0236】

本実施形態の任意の化合物または治療の患者への投与は、それらの作用物質に毒性がある場合はそれを考慮して、そのような化合物を投与するための一般的なプロトコルに従う。ゆえに、いくつかの実施形態では、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングする工程が存在する。
１．化学療法

【0237】

多種多様の化学療法剤が、本実施形態に従って使用され得る。用語「化学療法」とは、薬物を使用して癌を処置することを指す。「化学療法剤」は、癌の処置において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内でのそれらの活性様式によって、例えば、それらが細胞周期に影響するか否かおよびどのステージにおいて細胞周期に影響するかによって、分類される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、または核酸合成に影響することによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。

【0238】

化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）およびウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマｌＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１））；ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ジネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質であるエンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモミシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラルニシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；抗代謝産物（例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリンおよびトリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）およびチオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン）；抗副腎（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、ミトタンおよびトリロスタン）；葉酸補給剤（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ））；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチノイン酸）；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
２．放射線療法

【0239】

ＤＮＡ損傷を引き起こす、広く使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位体の定方向送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、陽子ビーム照射およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対して広範囲のダメージをもたらす可能性が最も高い。Ｘ線の線量の範囲は、長期間（３～４週間）にわたる５０～２００レントゲンという１日線量から、２０００～６０００レントゲンという単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量の範囲は、大きく異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依存する。
３．免疫療法

【0240】

当業者は、さらなる免疫療法が上記実施形態の方法と併用してまたは併せて使用され得ることを理解する。癌の処置の状況において、免疫治療薬は、通常、癌細胞を標的化し、破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子を使用することに頼る。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体であり得る。その抗体は、単独で治療のエフェクターとして機能し得るか、または他の細胞をリクルートして、実際に細胞殺滅に影響し得る。その抗体はまた、薬物またはトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、標的化剤として役立ち得る。あるいは、そのエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。

【0241】

抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）は、殺細胞薬に共有結合的に連結されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含み、併用療法において使用され得る。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を非常に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせることから、豊富なレベルの抗原を有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装した」ＭＡｂをもたらす。また、薬物の標的化送達は、正常組織への曝露を最小限に抑えることから、毒性の低減および治療指数の改善をもたらす。例示的なＡＤＣ薬物としては、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）およびＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）が挙げられる。

【0242】

免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化の影響を受けやすい何らかのマーカー、すなわち、他の大部分の細胞上に存在しない何らかのマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが、本実施形態の状況において標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニンレセプター、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗癌効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８などのケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドなどの成長因子をはじめとした免疫刺激分子も存在する。

【0243】

免疫療法の例としては、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦならびにＴＮＦ；遺伝子治療、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２およびｐ５３；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５が挙げられる。１つ以上の抗癌療法が、本明細書中に記載される抗体療法とともに使用され得ることが企図される。

【0244】

いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を強めるかまたはシグナルを弱めるかのいずれかである。免疫チェックポイントの遮断によって標的化され得る阻害性免疫チェックポイントとしては、アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびにＴ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸および／またはＣＴＬＡ－４を標的化する。

【0245】

免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え型のリガンドまたはレセプターなどの薬物であり得るか、または特に、ヒト抗体などの抗体である。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの公知の阻害剤が、使用され得、特に、キメラ化型、ヒト化型またはヒト型の抗体が使用され得る。当業者が承知しているように、代替のおよび／または等価な名称が、本開示において述べられるある特定の抗体に対して使用され得る。そのような代替のおよび／または等価な名称は、本開示の文脈において相互交換可能である。例えば、ランブロリズマブが、代替のおよび等価な名称であるＭＫ－３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることは公知である。

【0246】

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１がそのリガンド結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。

【0247】

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびＣＴ－０１１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外の部分またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られるニボルマブは、使用され得る抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ－９００４７５としても知られるペンブロリズマブは、例示的な抗ＰＤ－１抗体である。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても知られるＣＴ－０１１も、抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られるＡＭＰ－２２４は、ＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性レセプターである。

【0248】

本明細書中に提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見られ、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合したとき「切」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現される免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８に似ており、両分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達するのに対して、ＣＤ２８は、刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞にも見られ、それらの細胞の機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞レセプターおよびＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化により、Ｂ７分子に対する阻害性レセプターであるＣＴＬＡ－４が高発現される。

【0249】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、それらの抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。

【0250】

本方法における使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれ由来のＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン）は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。あるいは、当該分野で認められている抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られる）またはその抗原結合フラグメントおよびバリアントである。他の実施形態において、その抗体は、イピリムマブの重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＶＲおよび軽鎖ＶＲを含む。したがって、１つの実施形態において、その抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態において、その抗体は、ＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープへの結合について競合し、かつ／またはＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、その抗体は、上述の抗体に対して少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性）を有する。
４．手術

【0251】

癌を有する人のおよそ６０％が、予防的手術、診断的手術または進行度診断手術、根治的手術および緩和手術をはじめとした何らかのタイプの手術を受ける。根治的手術には、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、切除および／または破壊する摘出術が含まれ、他の治療（例えば、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法）と併せて使用され得る。腫瘍摘出術とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。手術による処置には、腫瘍摘出術に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。

【0252】

癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全部を切除する際、身体に空洞が形成され得る。処置は、さらなる抗癌療法によるその領域の灌流、直接注射または局所適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週間ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月ごとに、反復され得る。これらの処置は、様々な投与量の処置でもあり得る。
５．他の作用物質

【0253】

処置の治療効果を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質が使用され得ることが企図される。これらのさらなる作用物質としては、細胞表面レセプターおよびギャップ結合のアップレギュレーションに影響する作用物質、細胞分裂抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感度を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が挙げられる。ギャップ結合数を増加させることによる細胞間のシグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を高め得る。他の実施形態では、処置の抗過剰増殖の有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて細胞分裂抑制剤または分化剤が使用され得る。本実施形態の有効性を改善するために、細胞接着の阻害剤が企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を高める他の作用物質（例えば、抗体ｃ２２５）が、処置の有効性を改善するために本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用され得ることがさらに企図される。
ＶＩＩ．製品またはキット

【0254】

免疫細胞を含む製品またはキットも本明細書中に提供される。その製品またはキットは、個体の癌を処置するためもしくは癌の進行を遅延させるためにまたは癌を有する個体の免疫機能を高めるために免疫細胞を使用するための指示を含む添付文書をさらに含み得る。本明細書中に記載される抗原特異的免疫細胞のいずれかが、その製品またはキットに含められ得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが挙げられる。その容器は、ガラス、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニルまたはポリオレフィン）または金属合金（例えば、ステンレス鋼またはハステロイ）などの種々の材料から形成され得る。いくつかの実施形態において、その容器は、製剤およびラベルを保持し、そのラベルは、容器に付着しているかまたは関連付けられており、その容器には、使用法が示されている場合がある。その製品またはキットは、商業的な観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含むことがあり、それらの材料としては、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用するための指示を含む添付文書が挙げられる。いくつかの実施形態において、その製品は、１つ以上の別の作用物質（例えば、化学療法剤および抗悪性腫瘍剤）をさらに含む。その１つ以上の作用物質に適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが挙げられる。

【実施例】

【0255】

ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本発明の実施において十分に機能すると本発明者が発見した手法であり、ゆえにその実施に対する好ましい形式であると考えることができることが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、それらの変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、なおも同様または類似の結果をもたらすと認識するはずである。
実施例１－マルチプレックス遺伝子編集

【0256】

Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの免疫細胞において複数の遺伝子の発現を同時に妨害することの有効性を試験するために、いくつかの研究を行って、ＣＲＩＳＰＲを用いて異なる遺伝子の組み合わせの破壊を試験した。第１の研究では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦＢＲ２およびＣＩＳＨの発現を妨害した。この遺伝子セットでは、ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ４７を１回目のエレクトロポレーションにおいてノックアウトし、２回目のエレクトロポレーションにおいてＣＩＳＨおよびＴＧＦＢＲ２を標的化した。両方の回のエレクトロポレーションに対してＰＣＲおよびフローサイトメトリーを用いたノックアウト効率の検証が成功した（図１）。

【0257】

ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＩＳＨ、アデノシン（図２）、ならびにＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦＢＲ２およびＣＩＳＨ（図３）を含むさらなる遺伝子セットにおいて、複数の遺伝子を破壊する方法を検証した。複数の遺伝子を破壊することにより、標的腫瘍細胞に対する機能が高まることが見出された。ブレフェルジンＡの存在下において５時間、標的細胞株で共刺激された様々なＮＫ細胞（編集済み 対 Ｃａｓ９のみ）を用いて、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦαおよびＣＤ１０７の産生のフローサイトメトリー解析を行った。標的細胞株による刺激の後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦαおよびＣＤ１０７の分泌が増大した（図３）。

【0258】

この機能の増強を、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＴＧＦＢＲ２およびＣＩＳＨの破壊によって確かめた。そのＮＫ細胞は、^５１Ｃｒ放出アッセイによって測定したとき、Ｋ５６２細胞に対して抗腫瘍細胞傷害性の増大を示した（図４Ａ）。さらに、組換えＴＧＦ－Ｂのよる処置（５０ｎｇ／ｍｌ）の３０分後に、ｐＳＭＡＤ活性をフローサイトメトリーによって測定した（図４Ｂ）。ＮＫ細胞は、サイトカインで刺激されるかまたは標的を認識すると、ＣＤ１６およびＣＤ６２Ｌの発現を失うこと（図５）、およびＮＫ細胞においてＡＤＡＭ１７をノックアウトすると、ＣＤ１６およびＣＤ６２Ｌのシェディングが阻止され（図６）、Ｋ５６２標的に対するＡＤＣＣおよび細胞傷害性が改善されること（図７）も観察された。

【0259】

さらなる研究は、ＮＫ細胞においてＳＨＰ１を破壊すると、抗腫瘍効果が高まることを示した（図９および１０）。ＮＫ細胞を、Ｋ５６２／Ｒａｊｉ細胞と１：１の比で４時間共培養した。インキュベーションの後、それらの細胞をアネキシンＶで染色し、生細胞および死細胞を解析した。Ｋ５６２細胞は、ＮＫ細胞の殺滅に対して感受性であり、Ｒａｊｉ細胞は、ＮＫ細胞の殺滅に対して抵抗性である。さらに、ＮＫ－ＣＡＲ細胞においてＮＫＧ２Ａを破壊すると、Ｒａｊｉ標的に対する抗腫瘍効果が高まった（図１２）。

【0260】

本アプローチを、さらなる遺伝子セット、つまり、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＩＳＨおよびアデノシン、ならびにＮＫＧ２Ａ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦＢＲＩＩおよびアデノシンを用いてさらに検証した。ＮＫ細胞の機能をフローサイトメトリー測定によって評価したところ、標的細胞株で刺激すると、それらの細胞においてＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＣＤ１０７ａの増加が観察された（図１３～１４）。

【0261】

したがって、本方法は、免疫細胞において複数の遺伝子の発現を同時に妨害して、その免疫細胞の機能を高めるために用いることができる。
実施例２－方法

【0262】

ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９のプレ複合体化およびエレクトロポレーション：近接領域にまたがる１つまたは２つのｓｇＲＮＡを各遺伝子に対してデザインし、使用した。１ｕｇのｃａｓ９（ＰＮＡ Ｂｉｏ）および５００ｎｇのｓｇＲＮＡ（全ｓｇＲＮＡの合計）の反応物を各遺伝子に対して作製し、氷上で２０分間インキュベートした。２０分後、２５０，０００個のＮＫ細胞を、Ｔ－緩衝液^＊（Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに添付されているもの、ＲＮＰ複合体および細胞を含む総体積は１４ｕｌであるべきである）に再懸濁し、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて１０ｕｌのエレクトロポレーションチップでエレクトロポレーションした。ＮＫ細胞に対するエレクトロポレーション条件は、１６００Ｖ、１０ｍｓおよび３パルス^＊である。次いで、それらの細胞を、ＡＰＣ（１ＮＫ：２ＡＰＣ）、ＳＣＧＭ培地（優先的には抗生物質不含）、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を含む培養プレートに加え、３７℃恒温器において回復させた。

【0263】

ｃｒＲＮＡのプレ複合体化およびエレクトロポレーション：ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖をピペットおよび遠心機を用いて混合した。その混合物をサーモサイクラーにおいて９５℃で５分間インキュベートし、次いで、卓上で室温に冷却した。

【0264】

【表3】

【0265】

【表4】

【0266】

【表5】

【0267】

ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を、ピペットを用いてＣａｓ９ヌクレアーゼミックスと合わせ、室温で１５分間インキュベートした。次いで、その混合物をｃｒＲＮＡと合わせた。

【0268】

【表6】

【0269】

まず、ＡＰＣ（１ＮＫ：２ＡＰＣ）、ＳＣＧＭ培地（好ましくは抗生物質不含）および２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む培養プレートを調製することによって、エレクトロポレーションを行った。１ウェルあたり２５０，０００個の細胞の調製物を、使用の直前に、７．５ｕｌのＴ緩衝液に再懸濁した。エレクトロポレーション条件は、１６００Ｖ、１０ｍｓおよび３パルス^＊であった。次いで、それらの細胞を培養プレートに加え、３７℃恒温器において回復させた。

【0270】

ＮＫ細胞の拡大：ＭｉｌｔｅｎｙｉのＮＫ細胞単離キット（１３０－０９２－６５７）を用いて臍帯血または末梢血からＮＫ細胞を単離する。ＮＫ細胞をフィーダー細胞と１：２の比（１ＮＫ細胞２フィーダー細胞）でＩＬ２（２００ＩＵ／ｍｌ）の存在下においてＳＣＧＭ培地に入れる。培地を１日おきにＩＬ２とともに交換する。４日目に、ＮＫ細胞単離キットを用いてＮＫ細胞を再度選択して、フィーダー細胞を除去するか、またはすべてのフィーダー細胞が死ぬまで７日目まで待つ。キメラ抗原レセプターを形質導入するか、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に対するエレクトロポレーションを行う。

【0271】

本明細書中に開示および特許請求される方法のすべてが、本開示に鑑みて、過度の実験を行うことなく実施および実行され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の点から説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された方法および方法の工程または工程の順序に変更が適用されてもよいことが当業者には明らかだろう。より詳細には、同じまたは類似の結果が達成される限り、化学的かつ生理的に関係するある特定の作用物質を本明細書中に記載される作用物質の代わりに用いてもよいことが明らかだろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変のすべてが、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10A-1】

【図10A-2】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B-1】

【図12B-2】

【図12C-1】

【図12C-2】

【図12C-3】

【図12C-4】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図19-1】

【図19-2】

【配列表】

2022513652000001.app

【国際調査報告】