2022-513722 窒素固定微生物製品のための改善された安定性を有するポリマー組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(54)【発明の名称】窒素固定微生物製品のための改善された安定性を有するポリマー組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220202BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220202BHJP

   A01G 7/00 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220202BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20220202BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20220202BHJP

   C12P 19/04 20060101ALN20220202BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

C12N1/21 ZNA

A01G7/00 605Z

C12N15/31

C12N15/113 Z

C12N15/52 Z

C12N15/53

C12N15/55

C12P19/04 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021531992

(86)(22)【出願日】2019-12-05

(85)【翻訳文提出日】2021-08-03

(86)【国際出願番号】 US2019064782

(87)【国際公開番号】W WO2020118111

(87)【国際公開日】2020-06-11

(31)【優先権主張番号】62/776,782

(32)【優先日】2018-12-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518011220

【氏名又は名称】ピボット バイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】レザエイ， ファルザネ

(72)【発明者】

【氏名】キッビー， ジョン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AF11

4B064CA02

4B064DA11

4B065AA01X

4B065AA29X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC15

4B065BA02

4B065BC41

4B065CA47

4B065CA48

4B065CA49

(57)【要約】

本開示は、微生物への外因性ポリマーの組み込みを提供し、これは、該外因性ポリマーが欠如した微生物の保存寿命と比較して、所望の微生物（例えば、細菌）の保存寿命を延長するように増加した安定性及び生存率を与えるものである。微生物には、トランスジェニック微生物、非トランスジェニック微生物、及びリモデリングされた非属間微生物が含まれる。教示される微生物製品の利用により、微生物組成物の典型的な保存寿命の顕著な増大が可能となろう。本明細書に記載の外因性ポリマーを含む微生物は、他の農業上有益な組成物と組み合わせることが可能である。さらに、本開示は、前述の組成物への外来微生物バイオフィルムの添加を可能にする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物組成物であって、
ａ．１つまたは複数の単離された細菌と、
ｂ．１つまたは複数のポリマーを含むポリマー組成物と、を含み、
前記１つまたは複数のポリマーが、前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性である、前記微生物組成物。

【請求項2】

ｃ．前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性の１つまたは複数のバイオフィルムをさらに含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項3】

前記１つまたは複数のバイオフィルムが、以下の属、すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから選択される属内の種を含む、請求項２に記載の微生物組成物。

【請求項4】

前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む、請求項２に記載の微生物組成物。

【請求項5】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属の微生物を含む、請求項２に記載の微生物組成物。

【請求項6】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａであり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む、請求項２に記載の微生物組成物。

【請求項7】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む、請求項２に記載の微生物組成物。

【請求項8】

前記１つまたは複数のバイオフィルムが、２つの異なるバイオフィルム産生微生物によって産生される２つのバイオフィルムを含む、請求項２に記載の微生物組成物。

【請求項9】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、以下の属、すなわち、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項10】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ菌種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｒａｌｅ、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項11】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項12】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａである、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項13】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項14】

前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギネート、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項15】

前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項16】

前記１つまたは複数のポリマーが、電界紡糸ポリマーである、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項17】

前記１つまたは複数のポリマーが、コポリマーを含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項18】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素を固定することができる、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項19】

前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項20】

前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、少なくとも３０日間保管された場合に、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項21】

前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、液体培養中で保管された場合に増加を示す、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項22】

前記組成物が固体である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項23】

前記組成物が液体である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項24】

前記組成物が半固体である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項25】

前記微生物組成物が、植物種子または他の植物繁殖材料上に存在する種子コーティングである、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項26】

前記微生物組成物が、トウモロコシ種子上に存在する殺虫剤、除草剤、殺真菌剤、または殺線虫剤を有する、前記種子上に存在する種子コーティングである、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項27】

前記微生物組成物が、畦間製剤中にある、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項28】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項29】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、野生型細菌である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項30】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、トランスジェニック細菌である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項31】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、リモデリングされた非属間細菌である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項32】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、表１から選択されるリモデリングされた非属間細菌、またはその子孫もしくは派生物である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項33】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、空中窒素を固定することができる、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項34】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができるリモデリングされた非属間細菌である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項35】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、リモデリングされた非属間細菌である、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項36】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入制御配列を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項37】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項38】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される成員に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項39】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの増加した発現もしくは活性；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの減少した発現もしくは活性；ＧｌｎＥの減少したアデニリル除去活性；またはＧｌｎＤの減少したウリジリル除去活性のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項40】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項41】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項42】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項43】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子；ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子；及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項44】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、及びアデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項45】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子、及びａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項46】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、エキソポリサッカライド産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、及びグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項47】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項48】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、及びそれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項49】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項50】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む、請求項１に記載の微生物組成物。

【請求項51】

細菌組成物の生存率を増加させるための方法であって、前記方法が、
ａ．１つまたは複数の単離された細菌と、
ｂ．１つまたは複数のポリマーを含むポリマー組成物と、を組み合わせることを含み、
前記１つまたは複数のポリマーが、前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性であり、前記生存率の増加が、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比べてのものである、前記方法。

【請求項52】

ａ）及びｂ）と、
ｃ．前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性の１つまたは複数のバイオフィルムを組み合わせることをさらに含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記１つまたは複数のバイオフィルムが、以下の属、すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから選択される属内の種を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属由来の微生物を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項56】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａであり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項57】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項58】

前記１つまたは複数のバイオフィルムが、２つの異なるバイオフィルム産生微生物によって産生される２つのバイオフィルムを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項59】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、以下の属、すなわち、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項60】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ菌種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｒａｌｅ、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項61】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来である、請求項５１に記載の方法。

【請求項62】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａである、請求項５１に記載の方法。

【請求項63】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株である、請求項５１に記載の方法。

【請求項64】

前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギネート、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項65】

前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）である、請求項５１に記載の方法。

【請求項66】

前記１つまたは複数のポリマーが、電界紡糸ポリマーである、請求項５１に記載の方法。

【請求項67】

前記１つまたは複数のポリマーが、コポリマーを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項68】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素を固定することができる、請求項５１に記載の方法。

【請求項69】

前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、請求項５１に記載の方法。

【請求項70】

前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、少なくとも３０日間保管された場合に、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、請求項５１に記載の方法。

【請求項71】

前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、液体培養中で保管された場合に増加を示す、請求項５１に記載の方法。

【請求項72】

前記組成物が固体である、請求項５１に記載の方法。

【請求項73】

前記組成物が液体である、請求項５１に記載の方法。

【請求項74】

前記組成物が半固体である、請求項５１に記載の方法。

【請求項75】

前記微生物組成物が、植物種子または他の植物繁殖材料上に存在する種子コーティングである、請求項５１に記載の方法。

【請求項76】

前記微生物組成物が、トウモロコシ種子上に存在する殺虫剤、除草剤、殺真菌剤、または殺線虫剤を有する、前記種子上に存在する種子コーティングである、請求項５１に記載の方法。

【請求項77】

前記微生物組成物が、畦間製剤中にある、請求項５１に記載の方法。

【請求項78】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、請求項５１に記載の方法。

【請求項79】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、野生型細菌である、請求項５１に記載の方法。

【請求項80】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、トランスジェニック細菌である、請求項５１に記載の方法。

【請求項81】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、リモデリングされた非属間細菌である、請求項５１に記載の方法。

【請求項82】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、表１から選択されるリモデリングされた非属間細菌、またはその子孫もしくは派生物である、請求項５１に記載の方法。

【請求項83】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、空中窒素を固定することができる、請求項５１に記載の方法。

【請求項84】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができるリモデリングされた非属間細菌である、請求項５１に記載の方法。

【請求項85】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、リモデリングされた非属間細菌である、請求項５１に記載の方法。

【請求項86】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入制御配列を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項87】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項88】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される成員に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項89】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの増加した発現もしくは活性；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの減少した発現もしくは活性；ＧｌｎＥの減少したアデニリル除去活性；またはＧｌｎＤの減少したウリジリル除去活性のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項90】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項91】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項92】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項93】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子；ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子；及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項94】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、及びアデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項95】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子、及びａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項96】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、エキソポリサッカライド産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、及びグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項97】

前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項98】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、及びそれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項99】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項100】

前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む、請求項５１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１２月７日に出願された米国仮出願第６２／７７６，７８２号に対する優先権の利益を主張するものであり、この仮出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0002】

配列表に関する記述
本明細書と共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される：配列表のコンピューター可読形式のコピー（ファイル名：ＰＩＶＯ＿００９＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日：２０１９年１１月３０日、ファイルサイズ約６３２キロバイト）。

【背景技術】

【0003】

国連食糧農業機関は、２０５０年までに、増大し続ける人口のニーズを満たすために食料総生産量が７０％増加しなければならないと予測している。この難問は、淡水資源の減少、耕地に対する競合の増加、エネルギー価格の上昇、投入コストの増加、及び作物が、より乾燥した高温かつより極端な全地球的気候の圧力に適応する必要がある可能性が高いことを含めた、多数の要因によってさらに難しいものになっている。

【0004】

現行の農業慣行は、この増大し続ける食料生産の需要を満たしながらも、同時に農業集中の増加からもたらされる環境影響との均衡を保つための十分な装備がない。

【0005】

世界的な食料需要を満たすために必要とされる主要な農業投入物のうちの１つは、窒素肥料である。しかしながら、窒素肥料を生産するために利用される現行の工業規格は、ハーバーボッシュ法と呼ばれる人工窒素固定法であり、これは、高温高圧下で金属触媒を使用して水素（Ｈ_２）との反応によって空中窒素（Ｎ_２）をアンモニア（ＮＨ_３）に変換するものである。このプロセスは、資源集約的であり、環境に有害である。

【0006】

合成ハーバーボッシュ法とは対照的に、ある特定の生物系は、空中窒素を固定するように進化してきた。これらの系は、Ｎ_２とＨ_２との間の反応を触媒し、窒素固定をもたらす、ニトロゲナーゼと呼ばれる酵素を利用する。例えば、根粒菌は、マメ科植物の根粒内で定着した後に窒素を固定するジアゾ栄養細菌である。窒素固定研究の重要な目標は、この表現型を非マメ科植物、特にコムギ、イネ、及びトウモロコシ等の重要な農学的な草本に拡張することである。しかしながら、根粒菌とマメ科植物との間の窒素固定共生関係の発達の理解において顕著な進歩が遂げられたにもかかわらず、その知識を使用して、非マメ科作物において窒素固定瘤を誘発させる目処は依然として立っていない。

【0007】

結果として、大多数の現代的な条播作物農業は、資源集約的で環境的に有害なハーバーボッシュ法を介して生産される窒素肥料を利用する。例えば、ＵＳＤＡは、米国における平均的なトウモロコシ農業従事者が典型的に、１エーカー当たり１３０～２００ｌｂの窒素（１４６～２２４ｋｇ／ｈａ）を施用すると述べている。この窒素は、資源集約的な合成プロセスで生産されるだけでなく、圃場の土壌を横断し／それに衝撃を与え、石油を燃焼し、何時間もの人間の労働を必要とする重機械によって施用される。

【0008】

さらに、工業的ハーバーボッシュ法によって生産される窒素肥料は、標的作物によって十分に利用されない。雨、流出、熱、揮発、及び土壌マイクロバイオームが、施用された化学肥料を劣化させる。これは、無駄金に等しいだけでなく、収穫高の代わりに汚染の増加も上乗せする。このために、国際連合は、８０％近い肥料が、作物がそれを利用することができる前に失われると算出している。結果として、現代的な農業用肥料の生産及び送達は、環境に有害なだけでなく、極めて非効率的でもある。

【0009】

空中窒素を固定することができる改善された微生物が望ましいが、微生物を保存するかまたは微生物の自然な安定性を延長する方法はさらに望ましい。

【0010】

世界の増大し続ける食料供給のニーズを満たしながらも、同時に資源利用との均衡を保ち、環境システムへの影響を最小化するために、窒素固定及び植物への窒素送達に向けたより良好な手法が緊急に必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本開示は、窒素固定微生物を保存することができる組成物、及び該組成物を作出する方法を提供する。本明細書で教示される微生物組成物は、安定である。つまり、該組成物中の微生物の生存率は、改善されている。

【0012】

故に、複数の実施形態では、微生物組成物であって、１つまたは複数の単離された細菌と、１つまたは複数のポリマーを含むポリマー組成物とを含み、該１つまたは複数のポリマーが、１つまたは複数の単離された細菌に外因性である、該微生物組成物が教示される。微生物組成物は、１つまたは複数の単離された細菌に外因性の１つまたは複数のバイオフィルムをさらに含み得る。複数の実施形態では、１つまたは複数のバイオフィルムは、以下の属、すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから選択される属内の種を含む。複数の実施形態では、１つまたは複数のバイオフィルムは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来であり、１つまたは複数のバイオフィルムは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属の微生物を含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａであり、１つまたは複数のバイオフィルムは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株であり、１つまたは複数のバイオフィルムは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを含む。複数の実施形態では、１つまたは複数のバイオフィルムは、２つの異なるバイオフィルム産生微生物によって産生される２つのバイオフィルムを含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、以下の属、すなわち、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びそれらの組み合わせから選択される。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ菌種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｒａｌｅ、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、及びそれらの組み合わせから選択される。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来である。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａである。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株である。

【0013】

複数の実施形態では、１つまたは複数のポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギネート、及びそれらの組み合わせから選択される。複数の実施形態では、１つまたは複数のポリマーは、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）である。複数の実施形態では、１つまたは複数のポリマーは、電界紡糸ポリマーである。複数の実施形態では、１つまたは複数のポリマーは、コポリマーを含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌は、窒素を固定することができる。

【0014】

複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌の生存率は、１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌の生存率は、少なくとも３０日間保管された場合に、１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す。複数の実施形態では、１つまたは複数の単離された細菌の生存率は、液体培養中で保管された場合に増加を示す。複数の態様では、「安定性」という用語が使用され、これは本開示の文脈において、組成物中に見出される微生物の「生存率」にしばしば関連する。

【0015】

複数の態様では、組成物は、固体、液体、または半固体である。複数の態様では、組成物は、植物種子または他の植物繁殖材料上に存在する種子コーティングである。複数の態様では、組成物は、トウモロコシ種子上に存在する殺虫剤、除草剤、殺真菌剤、または殺線虫剤を有する、該種子上に存在する種子コーティングである。複数の態様では、組成物は、畦間製剤中にある。

【0016】

複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性である。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、野生型細菌である。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、トランスジェニック細菌である。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、リモデリングされた非属間細菌である。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、表１から選択されるリモデリングされた非属間細菌、またはその子孫もしくは派生物である。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、空中窒素を固定することができる。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができるリモデリングされた非属間細菌である。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、リモデリングされた非属間細菌である。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入制御配列を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される成員に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの増加した発現もしくは活性；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの減少した発現もしくは活性；ＧｌｎＥの減少したアデニリル除去活性；またはＧｌｎＤの減少したウリジリル除去活性のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の該ｎｉｆＬ遺伝子を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の該ａｍｔＢ遺伝子を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の該ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子；ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の該ａｍｔＢ遺伝子；及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の該ｎｉｆＬ遺伝子、及びアデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の該ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子、及びａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の該ａｍｔＢ遺伝子を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、エキソポリサッカライド産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、及びグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌の各々は、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、及びそれらの組み合わせから選択される細菌を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む。複数の態様では、１つまたは複数の単離された細菌は、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む。

【0017】

一部の態様では、本開示の組成物は、組成物の要素が、組成物のそれぞれ個々の構成成分単独で見られるであろう相加的生存率よりも高い微生物の生存率につながるという点で、相乗的である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】複数の実施形態に従った、誘導型微生物リモデリング（ｇｕｉｄｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）プロセスの概要を図示する。

【図1B】図１Ａに示されるようなマイクロバイオーム組成の測定の拡大図を図示する。

【図1C】教示される誘導型微生物リモデリング（ＧＭＲ）プラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題を含む「慣習的なバイオプロスペクティング」手法を図示する。

【図1D】教示される誘導型微生物リモデリング（ＧＭＲ）プラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題を含む「バイオプロスペクティングに向けた圃場第一の手法（ｆｉｅｌｄ－ｆｉｒｓｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）」システムを図示する。

【図1E】植物によって窒素が最も必要とされる、トウモロコシ成長周期における時間枠を図示する。

【図1F】リモデリングされた微生物のための圃場開発プロセスの概要を図示する。

【図1G】誘導型微生物リモデリングプラットフォーム実施形態の概要を図示する。

【図1H】計算誘導型（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ－ｇｕｉｄｅｄ）微生物リモデリングプラットフォームの概要を図示する。

【図1I】誘導型微生物リモデリングプラットフォームの態様におけるモデリングと組み合わされた圃場データの使用を図示する。

【図1J】本開示のリモデリングされた微生物が持つことのできる５つの特性を図示する。

【図1K】微生物ＰＢＣ６．１のためのリモデリング手法の概略図を図示する。

【図1L】リモデリングされた微生物における内因性窒素調節から切り離されたｎｉｆＡ発現を図示する。

【図1M】リモデリングされた微生物による固定窒素の改善された同化及び排泄を図示する。

【図1N】リモデリングされた微生物に起因するトウモロコシ収量の改善を図示する。

【図1O】施肥不足の圃場、過剰施肥された圃場、及び環境的に有害な窒素流出をもたらす、現行の窒素送達システムの非効率性を例示する。

【図2A】２５℃で１週間保管した後の１３７－１０３６製剤の安定性を図示する。

【図2B】３７℃で１週間保管した後の１３７－１０３６製剤の安定性を図示する。

【図3A】２５℃で２週間保管した後の１３７－１０３６製剤の安定性を図示する。

【図3B】３７℃で２週間保管した後の１３７－１０３６製剤の安定性を図示する。

【図4A】２５℃で１週間保管した後の１３７－１０３４製剤の安定性を図示する。

【図4B】３７℃で１週間保管した後の１３７－１０３４製剤の安定性を図示する。

【図5A】２５℃で２週間保管した後の１３７－１０３４製剤の安定性を図示する。

【図5B】３７℃で２週間保管した後の１３７－１０３４製剤の安定性を図示する。

【図6A】３０日間、３７℃の保管でのバイオフィルム及びＰＶＰ－ＶＡを含む１３７－１０３６製剤の安定性を図示する。生存率低下の比較は、任意の所与のバイオフィルム濃度で、５％ＰＶＰ－ＶＡの添加が缶中の生存率低下を改善した（より低い対数損失）ことを実証する。

【図6B】３０日間、２５℃の保管でのバイオフィルム及びＰＶＰ－ＶＡを含む１３７－１０３６製剤の安定性を図示する。生存率低下の比較は、２０％及び５％バイオフィルムで、５％ＰＶＰ－ＶＡの添加が缶中の生存率低下を改善した（より低い対数損失）ことを実証する。１０％バイオフィルムは確定的でなかった。

【図6C】３０日間、３７℃の保管でのバイオフィルム及びＰＶＰ－ＶＡを含む１３７－１０３４製剤の安定性を図示する。生存率低下の比較は、任意の所与のバイオフィルム濃度で、５％ＰＶＰ－ＶＡの添加が缶中の生存率低下を改善した（より低い対数損失）ことを実証する。２５Ｃでは有益性は何ら検出されなかった。

【図7A】異なる商用トウモロコシ生殖質にわたってばらついた安定性応答を実証した、４℃でのＰＶＰ－ＶＡ製剤安定性研究の結果を図示する。例示されるように、一部のトウモロコシ種子は、７週間にわたって目標ＣＦＵ／種子を維持したが、一方で他のトウモロコシ種子は、生存率がより迅速に低下した。生存率低下は、ＰＶＰ－ＶＡを含まない製剤においてより高く、ＰＶＰ－ＶＡの影響は、種子のタイプに依存していた。

【図7B】異なる商用トウモロコシ生殖質にわたってばらついた安定性応答を実証した、１０℃でのＰＶＰ－ＶＡ製剤安定性研究の結果を図示する。例示されるように、異なる雑種種子は、ＰＶＰ－ＶＡに対して異なる安定性応答を示した。ＰＶＰ－ＶＡは、全ての種子に対して好影響を有したが、種子安定性に対するＰＶＰ－ＶＡの影響は、微生物に対してより悪影響を有する種子においてより明白であった。Ｃｈａｎｎｅｌ種子＞Ｈｅｉｎｅ種子＞Ｇｏｌｄｅｎ Ｈａｒｖｅｓｔ種子

【図7C】商用トウモロコシ生殖質、またはＰＶＰ－ＶＡ処理を問わず、全ての細胞で生存率が１週間以内に失われることを実証した、２５℃でのＰＶＰ－ＶＡ製剤安定性研究の結果を図示する。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本開示の種々の実施形態が本明細書に示され、説明されているが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは、当業者には明白であろう。本開示から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置換が当業者に想到され得る。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する種々の代替例が用いられてもよいことを理解されたい。

【0020】

肥料利用の増加は、それと共に環境上の懸念をもたらし、また、多くの経済的苦境にある地球上の地域では可能でない可能性が高い。さらに、微生物分野の多くの工業関係者が、属間微生物を作出することに注力している。しかしながら、属間性であると特性評価／分類される操作された微生物には、厳しい規制負担が課せられている。これらの属間微生物は、広範囲の採用及び実装を困難にする大きな規制負担に直面するだけでなく、社会的認識による相当の詮索にも直面する。

【0021】

現在のところ、非属間性であり、かつ非マメ科作物において窒素固定を増加させることが可能である操作された微生物は市場に存在しない。そのような微生物のこの不足は、真に環境に優しく、より持続可能な２１世紀の農業システムを迎え入れるのを助ける上で欠けている要素である。

【0022】

本開示は、前述の問題を解決し、作物において窒素を容易に固定するように操作された非属間微生物を提供する。これらの微生物は、属間微生物としては特性評価／分類されず、故に、属間微生物の厳格な規制負担に直面することがない。さらに、教示される非属間微生物は、２１世紀の農業従事者が、かつてなく増加している量の外因性窒素肥料の利用により依存しなくなるよう助ける役目を果たすであろう。

【0023】

定義
本開示を説明する文脈における（とりわけ添付の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書で別途指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別途注記のない限り、範囲を限定しない用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別途指示されない限り、その範囲内に該当する各々別個の値を個々に指す簡略表記法としての役目を果たすことが意図されるにすぎず、各々別個の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細書に援用される。例えば、１０～１５の範囲が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で別途指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる例、または例示的な文言（例えば、「等」）の使用は、本開示をよりよく明らかにすることが意図されるにすぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に制限を課すものではない。本明細書のいかなる文言も、任意の特許請求されていない要素が本開示の実施に必須であることを示すものと解釈されるべきではない。

【0024】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有してもよく、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合によって、重合後にさらに修飾されてもよい。

【0025】

「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック型塩基対形成、フーグスティーン型結合によって、または塩基相補性に従った任意の他の配列特異的様態で生じてもよい。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの酵素的切断等のより大規模なプロセスにおけるステップを構成し得る。第１の配列に相補的な第２の配列は、第１の配列の「相補配列」と称される。ポリヌクレオチドに適用されるような「ハイブリダイズ可能」という用語は、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応においてヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する能力を指す。

【0026】

本明細書で使用されるとき、「バイオフィルム」または「成熟バイオフィルム」とは、結び付いた及び／または蓄積した及び／または集合した微生物細胞、それらの産物（例えば、エキソポリマー物質）ならびに生体表面または不活性表面に接着性の無機粒子を指す。

【0027】

本明細書で使用されるとき、「ポリマー」または「ポリマー物質」とは、重合／共重合によって形成され、反復する構造単位を含む化合物または化合物の混合物を指す。「ポリマー」という用語は、同じモノマーの反復単位を含むポリマー、及び２つ以上の異なるタイプのモノマーの反復単位を含むポリマー（コポリマー）を包含することが理解される。

【0028】

本明細書で使用されるとき、「溶媒を実質的に含まない」ポリマーは、約１，０００百万分率未満の溶媒を含有する。

【0029】

本明細書で使用されるとき、「対数損失」とは、対数｛最初のＣＦＵ／ｍｌ｝－対数｛保管後のＣＦＵ／ｍｌ｝である。

【0030】

「相補性」とは、核酸が、慣習的なワトソン・クリック型または他の非従来型のいずれかによって別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、ある核酸分子における、第２の核酸配列と水素結合を形成し得る（例えば、ワトソン・クリック型塩基対形成）残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、ある核酸配列の全ての連続した残基が、第２の核酸配列における同数の連続した残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。相補性パーセントを評価する目的等での配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、任意選択でデフォルト設定を用いた、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにて入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、任意選択でデフォルト設定を用いた、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにて入手可能なＢＬＡＳＴアライメントツールを参照されたい）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、任意選択でデフォルト設定を用いた、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにて入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを参照されたい）を含むがこれらに限定されない、任意の好適なアライメントアルゴリズムによって測定されてもよい。最適なアライメントは、デフォルトパラメータを含む、選定されたアルゴリズムの任意の好適なパラメータを使用して評価されてもよい。

【0031】

一般に、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が、標的配列と優勢的にハイブリダイズし、かつ非標的配列には実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に、配列依存性であり、いくつかの要因に応じて様々である。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙに詳述される。

【0032】

本明細書で使用されるとき、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／または転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡからもたらされる場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。

【0033】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分との結合により修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤまたはＬの両光学異性体を含む天然及び／または非天然もしくは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む。

【0034】

本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、「およそ」という用語と同義的に使用される。例示説明として、量に関する「約」という用語の使用は、例証される値のわずかに外側にある、例えば、プラスまたはマイナス０．１％～１０％である値を示す。

【0035】

「生物学的に純粋な培養物」または「実質的に純粋な培養物」という用語は、培養物の複製を妨げたり、または通常の細菌学的技法によって検出されたりするほど十分な量で他の細菌種を含有しない、本明細書に記載の細菌種の培養物を指す。

【0036】

「植物生産性」とは一般に、植物を成長させる根拠となる植物の成長または発達の任意の側面を指す。穀物または野菜等の食用作物の場合、「植物生産性」とは、特定の作物から収穫される穀物または果実の収量を指すことができる。本明細書で使用されるとき、改善された植物生産性とは、種々の目的で収穫される穀物、果実、花、または他の植物部位の収量の改善、茎、葉、及び根を含めた植物部位の成長の改善、植物成長の促進、葉における高葉緑素含量の維持、果実または種子数の増加、果実または種子の単位重量の増加、低減された窒素肥料使用量に起因するＮＯ_２排出量の低減、ならびに植物の成長及び発達の類似の改善を広く指す。

【0037】

食用作物中及びその周囲の微生物は、それらの作物の形質に影響を及ぼし得る。微生物によって影響を受け得る植物形質には、収量（例えば、穀物生産、バイオマス生成、果実発達、花の束）、栄養素（例えば、窒素、リン、カリウム、鉄、微量栄養素獲得）、非生物ストレス管理（例えば、干ばつ耐性、耐塩性、耐熱性）、及び生物ストレス管理（例えば、有害生物、雑草、昆虫、真菌、及び細菌）が含まれる。作物形質を改変するための戦略には、主要な代謝物濃度を増加させること、主要な代謝物に及ぼす微生物の影響の経時的動力学を変化させること、微生物による代謝物産生／分解を新たな環境要因に関連付けること、負の代謝物を低減すること、及び代謝物または基盤となるタンパク質の均衡を改善することが含まれる。

【0038】

本明細書で使用されるとき、「制御配列」とは、オペレーター、プロモーター、サイレンサー、またはターミネーターを指す。

【0039】

本明細書で使用されるとき、「植物内で（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）」とは、使用例の文脈に応じて、植物中にある、植物上にある、または植物に密接に結び付いていることを指し得る（例えば、内部寄生性、着生性、または根圏性の結び付き）。植物は、植物部位、組織、葉、根、根毛、根茎、茎、種子、胚珠、花粉、花、果実等を含んでもよい。

【0040】

一部の実施形態では、本開示の遺伝子の天然または内因性制御配列が、１つまたは複数の属内制御配列と置換される。

【0041】

本明細書で使用されるとき、「導入される」とは、現代的なバイオテクノロジー手段によるもので、天然に存在する導入ではない導入を指す。

【0042】

一部の実施形態では、本開示の細菌は、それらが天然に存在する細菌ではないように修飾されている。

【0043】

一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の新鮮または乾燥重量１グラム当たり、少なくとも１０^３ｃｆｕ、１０^４ｃｆｕ、１０^５ｃｆｕ、１０^６ｃｆｕ、１０^７ｃｆｕ、１０^８ｃｆｕ、１０^９ｃｆｕ、１０^１０ｃｆｕ、１０^１１ｃｆｕ、または１０^１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の新鮮または乾燥重量１グラム当たり、少なくとも約１０^３ｃｆｕ、約１０^４ｃｆｕ、約１０^５ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕ、約１０^７ｃｆｕ、約１０^８ｃｆｕ、約１０^９ｃｆｕ、約１０^１０ｃｆｕ、約１０^１１ｃｆｕ、または約１０^１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の新鮮または乾燥重量１グラム当たり、少なくとも１０^３～１０^９、１０^３～１０^７、１０^３～１０^５、１０^５～１０^９、１０^５～１０^７、１０^６～１０^１０、１０^６～１０^７ｃｆｕの量で植物中に存在する。

【0044】

本開示の肥料及び外因性窒素は、以下の窒素含有分子、すなわち、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア、グルタミン等を含んでもよい。本開示の窒素源には、無水アンモニア、硫酸アンモニア、尿素、リン酸二アンモニウム、尿素ホルム、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、窒素溶液、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等が含まれてもよい。

【0045】

本明細書で使用されるとき、「外因性窒素」とは、アンモニア、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、尿酸、アンモニウム酸等を含む、非窒素制限条件下で存在する土壌、圃場、または増殖培地において容易に利用可能な非空中窒素を指す。

【0046】

本明細書で使用されるとき、「非窒素制限条件」とは、Ｋａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６２（４）：１４９９－１５０９）（参照により本明細書に援用される）によって開示されるような、約４ｍＭ超の窒素の濃度で土壌、圃場、培地において利用可能な非空中窒素を指す。

【0047】

本明細書で使用されるとき、「属間微小生物」とは、異なる分類学的属の生物から元々単離された遺伝物質の計画的な組み合わせによって形成される微生物である。「属間突然変異体」は、「属間微小生物」と互換的に使用され得る。例示的な「属間微小生物」には、レシピエント微生物とは異なる属の微小生物において最初に同定された、可動遺伝要素を含有する微小生物が含まれる。さらなる説明は、とりわけ、連邦規則集第４０巻第７２５．３条において見出すことができる。

【0048】

複数の態様では、本明細書で教示される微生物は、「非属間性」であり、これは、微生物が属間性でないことを意味する。

【0049】

本明細書で使用されるとき、「属内微小生物」とは、同じ分類学的属の生物から元々単離された遺伝物質の計画的な組み合わせによって形成される微小生物である。「属内突然変異体」は、「属内微小生物」と互換的に使用され得る。

【0050】

本明細書で使用されるとき、「導入遺伝物質」とは、レシピエントのゲノムに追加され、その構成成分として留まる遺伝物質を意味する。

【0051】

本明細書で使用されるとき、非属間微生物の文脈において、「リモデリングされた」という用語は、「操作された」という用語と同義的に使用される。結果として、「リモデリングされた非属間微小生物」は、「操作された非属間微小生物」と同義を有し、互換的に利用されよう。さらに、本開示は、「操作された菌株」または「操作された派生物」または「操作された非属間微生物」に言及する場合があり、これらの用語は、「リモデリングされた菌株」または「リモデリングされた派生物」または「リモデリングされた非属間微生物」と同義的に使用される。

【0052】

一部の実施形態では、窒素固定及び同化遺伝子調節ネットワークは、ポリヌクレオチドコード遺伝子ならびに微生物の窒素固定及び／または同化を指示する、調整する、及び／または調節する非コード配列を含み、また、ｎｉｆクラスター（例えば、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＣ、……ｎｉｆＺ）のポリヌクレオチド配列、窒素調節タンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチド、窒素調節タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎクラスター（例えば、ｇｌｎＡ及びｇｌｎＤ）、ｄｒａＴ、及びアンモニアトランスポーター／透過酵素のポリヌクレオチド配列を含み得る。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、及びＮｉｆＶを含んでもよい。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、及びＮｉｆＶのサブセットを含んでもよい。

【0053】

一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量に基づき、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の窒素を含む。

【0054】

一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量に基づき、少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の窒素を含む。

【0055】

一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量に基づき、約５％～５０％、約５％～７５％、約１０％～５０％、約１０％～７５％、約１５％～５０％、約１５％～７５％、約２０％～５０％、約２０％～７５％、約２５％～５０％、約２５％～７５％、約３０％～５０％、約３０％～７５％、約３５％～５０％、約３５％～７５％、約４０％～５０％、約４０％～７５％、約４５％～５０％、約４５％～７５％、または約５０％～７５％の窒素を含む。

【0056】

一部の実施形態では、植物における窒素固定の増加及び／または１％以上の窒素の産生は、本開示の細菌に曝露されたことのない対照植物と比べて測定される。細菌における全ての増加または減少は、対照細菌と比べて測定される。植物における全ての増加または減少は、対照植物と比べて測定される。

【0057】

本明細書で使用されるとき、「構成的プロモーター」とは、ほとんどの条件下で及び／またはほとんどの発生段階中に活性であるプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクターにおいて構成的プロモーターを使用することには、トランスジェニック細胞または生物を選択するために使用されるタンパク質の高レベルの産生；簡便な検出及び定量を可能にする、レポータータンパク質または採点可能マーカーの高レベルの発現；転写調節系の一部である転写因子の高レベルの産生；生物において普遍的活性を必要とする化合物の産生；ならびに全ての発生段階中に必要とされる化合物の産生等のいくつかの利点がある。非限定的で例示的な構成的プロモーターには、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、オパイン（ｏｐｉｎｅ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター等が含まれる。

【0058】

本明細書で使用されるとき、「非構成的プロモーター」とは、ある特定のタイプの細胞におけるある特定の条件下で及び／またはある特定の発生段階中に活性であるプロモーターである。例えば、組織特異的、組織優先的、細胞タイプ特異的、細胞タイプ優先的、誘導性プロモーター、及び発生制御下にあるプロモーターは、非構成的プロモーターである。発生制御下にあるプロモーターの例としては、ある特定の組織において転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。

【0059】

本明細書で使用されるとき、「誘導性」または「抑制性」プロモーターは、化学または環境要因の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気性条件、ある特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件等が挙げられる。

【0060】

本明細書で使用されるとき、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、いくつかの遺伝子調節レベルの相互作用の結果である。したがって、当該技術分野において、特定の組織における導入遺伝子の効率的で確実な発現を達成するために、同種または近縁種由来のプロモーターを使用することが好ましいことがある。これは、特定の組織から単離された組織特異的プロモーターが大量に、科学文献及び特許文献の両方に見出されることの主な理由のうちの１つである。

【0061】

本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって調節されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現を調節することが可能である（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。別の例では、本開示の相補的ＲＮＡ領域は、直接もしくは間接的のいずれかで、標的ｍＲＮＡに対して５’側、もしくは標的ｍＲＮＡに対して３’側、もしくは標的ｍＲＮＡ内で作動可能に連結され得るか、または第１の相補的領域が標的ｍＲＮＡに対して５’側であり、その相補配列が３’側である。

【0062】

複数の態様では、「植物に複数の非属間細菌を施用すること」は、植物の生活環の任意の段階で植物（種子、根、茎、組織等といった植物部位を含む）を該細菌に接触させる（すなわち、曝露する）任意の手段を含む。結果として、「植物に複数の非属間細菌を施用すること」は、植物（種子、根、茎、組織等といった植物部位を含む）を該細菌に曝露する以下の手段、すなわち、植物に噴霧すること、植物に滴下すること、種子コーティングとして施用すること、その後種子を植栽される圃場に施用すること、種子をすでに植栽されられた圃場に施用すること、成植物を有する圃場に施用すること等、のうちのいずれかを含む。

【0063】

本明細書で使用されるとき、「ＭＲＴＮ」とは、対窒素最大収益（ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｔｕｒｎ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）の頭字語であり、実施例において実験的処理として利用される。ＭＲＴＮは、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって開発され、情報は、／／ｃｎｒｃ．ａｇｒｏｎ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／にて見出すことができる。ＭＲＴＮは、窒素施用に対する経済的純収益が最大化される窒素量である。ＭＲＴＮを算出するための手法は、個々の州においてトウモロコシ窒素量ガイドラインを開発するための地域別手法である。窒素量試験データは、ダイズの後のトウモロコシ植栽及びトウモロコシの後のトウモロコシ植栽に関して十分な数の研究試験が入手可能であったイリノイ州、アイオワ州、ミシガン州、ミネソタ州、オハイオ州、及びウィスコンシン州に対して評価された。試験は、噴出施肥、側方施肥、または植栽前／側方分割施肥（ｓｐｌｉｔ ｐｒｅｐｌａｎｔ／ｓｉｄｅ ｄｒｅｓｓ）で施用した窒素で実施され、敷地は、ウィスコンシン州の潅漑砂地で適応とされた場合を除いて潅漑されなかった。ＭＲＴＮは、トウモロコシ生産に必要とされる提案される窒素量を決定するための方法に明らかな差異があること、窒素量ガイドラインに関する誤解、及び施用量に関する懸念に起因して、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって開発された。ＭＲＴＮの算出により、実施者は、以下のことを決定することができる：（１）窒素施用の経済的純収益が最大化される窒素量、（２）窒素の最終増分が、追加の窒素の費用を賄うのに十分に大きな収量増加を生み出すポイントである、経済的に最適な窒素量、（３）窒素施用に起因するトウモロコシ穀物価値の増加、及びより多くの窒素を施用してもトウモロコシ収量が増加しない収量である最大収量。故に、ＭＲＴＮ算出は、異なる地域でのトウモロコシ作物を最大化しつつ、窒素施用からの金融上の利得を最大化する手段を実施者に提供する。

【0064】

ｍｍｏｌという用語は、ミリモルの略語であり、本明細書でｍｏｌと略されるモルの１０００分の１（１０^－３）である。

【0065】

本明細書で使用されるとき、「微小生物」または「微生物」という用語は、広義に解釈されるべきである。互換的に使用されるこれらの用語は、２つの原核生物ドメインである細菌及び古細菌を含むが、これらに限定されない。この用語はまた、真核生物真菌及び原生生物も包含し得る。

【0066】

「微生物コンソーシア」または「微生物コンソーシアム」という用語は、個々の微生物種または種の菌株の微生物群落のサブセットを指し、共通の機能を実施すると説明することができるか、または目的の表現型形質等の認識可能なパラメータに関与する、もしくはそれにつながる、もしくはそれと相関すると説明することができる。

【0067】

「微生物群落」という用語は、２つ以上の種または菌株を含む微生物の群を意味する。微生物コンソーシアとは異なり、微生物群落は、共通の機能を実施している必要はないか、または目的の表現型形質等の認識可能なパラメータに関与する、もしくはそれにつながる、もしくはそれと相関する必要はない。

【0068】

本明細書で使用されるとき、「単離する」、「単離された」、「単離された微生物」、及び類似の用語は、１つまたは複数の微小生物が、特定の環境（例えば、土壌、水、植物組織等）で結び付いている材料のうちの少なくとも１つから分離されたことを意味することが意図される。故に、「単離された微生物」は、その天然に存在する環境に存在せず、むしろ、本明細書に記載の種々の技法により、微生物がその自然設定から取り出されており、天然に存在しない状態の存在に置かれているものである。故に、単離された菌株または単離された微生物は、例えば、生物学的に純粋な培養物または胞子（または他の形態の菌株）として存在していてもよい。複数の態様では、単離された微生物は、農業的に許容される担体であり得る、許容される担体に結び付いていてもよい。

【0069】

本開示のある特定の態様では、単離された微生物は、「単離された生物学的に純粋な培養物」として存在する。当業者であれば、特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物は、該培養物が他の生存生物を実質的に含まず、問題としている個々の微生物のみを含有することを表すことを理解しよう。培養物は、様々な濃度の該微生物を含有することができる。本開示では、単離された生物学的に純粋な微生物が、多くの場合、「純度がより低い材料または不純な材料とは必然的に異なる」ことに留意する。例えば、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍに関して、４２７ Ｆ．２ｄ １３９４、（ＣＣＰＡ１９７０）（精製プロスタグランジンに関する考察）を参照されたく、また、Ｂｅｒｇｙに関して、５９６ Ｆ．２ｄ ９５２（ＣＣＰＡ１９７９）（精製微生物に関する考察）を参照されたく、また、Ｐａｒｋｅ－Ｄａｖｉｓ＆Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ＆Ｃｏ．，１８９ Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（精製アドレナリンに関するＬｅａｒｎｅｄ Ｈａｎｄの考察）、一部認容され、一部破棄されている、１９６ Ｆ．４９６（２ｄ Ｃｉｒ．１９１２）を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。さらに、一部の態様では、本開示は、単離された生物学的に純粋な微生物培養物内に見出されなければならない濃度または純度制限に関するある特定の定量的尺度を提供する。これらの純度値の存在は、ある特定の実施形態では、天然の状態で存在する微生物から本開示の微生物を区別するさらなる属性である。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，２５３ Ｆ．２ｄ １５６（４ｔｈ Ｃｉｒ．１９５８）（微生物により産生されるビタミンＢ１２の純度制限に関する考察）を参照されたい。

【0070】

本明細書で使用されるとき、「個々の単離株」は、１つまたは複数の他の微小生物から分離された後の、微小生物の優勢的な単一の属、種、または菌株を含む組成物または培養物を意味すると解釈されるべきである。

【0071】

本開示の微生物は、胞子及び／または栄養細胞を含んでもよい。一部の実施形態では、本開示の微生物は、生存能力があるが培養不能な（ＶＢＮＣ）状態の微生物を含む。本明細書で使用されるとき、「胞子（単数）」または「胞子（複数）」とは、生存及び散布に適した、細菌及び真菌によってもたらされる構造を指す。胞子は一般に、休眠構造として特性評価される。しかしながら、胞子は、発芽プロセスにより分化することが可能である。発芽は、胞子が、代謝活性、成長、及び生殖が可能な栄養細胞へと分化することである。単一の胞子の発芽は、単一の真菌または細菌栄養細胞をもたらす。真菌胞子は、無性生殖の単位であり、一部の場合では、真菌の生活環に必要な構造である。細菌胞子は、通常は栄養細胞の生存または成長の助けとならない場合がある条件を生き抜くための構造である。

【0072】

本明細書で使用されるとき、「微生物組成物」とは、１つまたは複数の本開示の微生物を含む組成物を指す。一部の実施形態では、微生物組成物は、植物（種々の植物部位を含む）及び／または農業圃場に適用される。

【0073】

本明細書で使用されるとき、「担体」、「許容される担体」、または「農業的に許容される担体」は、微生物と共に適用することができ、微生物に有害な影響を及ぼさない希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。

【0074】

窒素固定の調節
一部の場合では、窒素固定経路は、遺伝子操作及び最適化のための標的として作用し得る。本明細書に記載の方法による調節のための標的となり得る１つの形質は、窒素固定である。窒素肥料は、農場における最も大きな運営上の出費であり、トウモロコシ及びコムギのような条播作物の収量を向上させる最大の駆動因子である。本明細書では、非マメ科作物において再生可能な形態の窒素を送達することができる微生物製品が記載される。一部の内部寄生菌は、純粋培養中で窒素固定に必要な遺伝的特質を有するが、根本的な技術的課題は、穀類（ｃｅｒｅａｌ）及びイネ科草本の野生型内部寄生菌が、施肥された圃場では窒素固定を中止することである。化学肥料の施用及び圃場土壌中の残留窒素レベルは、微生物に対して、窒素固定の生化学経路を停止するようシグナルを送る。

【0075】

肥料の存在下で窒素を固定してトウモロコシへと移行させることが可能な微生物の開発のためには、窒素固定調節ネットワークの構成成分の転写レベル及び翻訳後レベルを変更することが有益であり得る。そのため、本明細書では、調節ネットワークを的確に進化させ、新規の表現型を誘発させるための宿主微生物進化（ＨｏＭＥ）技術が記載される。また、本明細書では、トウモロコシから単離された窒素固定内部寄生菌の固有の独自ライブラリーが、窒素ストレス及び窒素過剰のような異なる環境条件下での微生物及び宿主植物の相互作用を取り巻く広範なオーミクスデータと対にして記載される。一部の実施形態では、この技術により、内部寄生菌の遺伝子調節ネットワークを的確に進化させて、圃場に肥料が存在する場合であっても活発に窒素を固定する微生物を生産することが可能になる。また、本明細書では、トウモロコシ根組織でコロニー形成し、施肥されている植物のために窒素を産生する微生物に進化させる技術的可能性の評価、ならびに微生物を現代的な窒素管理戦略に統合する実現可能性を決定するための、標準的製剤化慣例及び多様な土壌との内部寄生菌の適合性の評価も記載される。

【0076】

窒素元素（Ｎ）を化学合成に利用するために、生命体は、窒素固定として知られるプロセスにおいて大気中で利用可能な窒素ガス（Ｎ_２）を水素と化合させる。生物学的窒素固定はエネルギー集約的性質を持つため、ジアゾトロフ（大気窒素ガスを固定する細菌及び古細菌）は、環境中の酸素及び利用可能な窒素に応答してｎｉｆ遺伝子クラスターを精巧かつ緻密に調節するように進化してきた。Ｎｉｆ遺伝子は、窒素固定に関与する酵素（ニトロゲナーゼ複合体等）及び窒素固定を調節するタンパク質をコードする。Ｓｈａｍｓｅｌｄｉｎ（２０１３．Ｇｌｏｂａｌ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８（４）：８４－９４）には、ｎｉｆ遺伝子及びそれらの産物の詳細な説明が開示されており、これは参照により本明細書に援用される。本明細書では、改善された形質を有する植物を生産するための方法であって、第１の植物から細菌を単離することと、単離された細菌の遺伝子に遺伝的変異を導入して窒素固定を増加させることと、第２の植物を変種細菌に曝露することと、第１の植物と比べて改善された形質を有する第２の植物から細菌を単離することと、第２の植物から単離された細菌を用いてこれらのステップを繰り返すことと、を含む、該方法が記載される。

【0077】

プロテオバクテリアでは、ｎｉｆクラスターの正の転写調節因子である、σ_５４依存性エンハンサー結合タンパク質ＮｉｆＡが、窒素固定の調節に中心的な役目を果たす。活性ＮｉｆＡの細胞内レベルは、ｎｉｆＬＡオペロンの転写、及びＮｉｆＬとのタンパク質間相互作用によるＮｉｆＡ活性の阻害という２つの主要な因子によって制御される。これらプロセスは両方とも、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、細胞内グルタミンレベルに応答性である。このカスケードは、ＧｌｎＤによって媒介され、ＧｌｎＤは、グルタミンを直接感知し、結合したグルタミンの不在または存在にそれぞれ応答して、２つのＰＩＩ調節タンパク質ＧｌｎＢ及びＧｌｎＫのウリジリル化または脱ウリジリル化を触媒する。窒素過剰条件下では、未修飾ＧｌｎＢが、ｎｉｆＬＡプロモーターの非活性化シグナルを送る。しかしながら、窒素制限条件下では、ＧｌｎＢは翻訳後修飾を受け、それによりその活性が阻害され、ｎｉｆＬＡオペロンの転写につながる。このように、ｎｉｆＬＡ転写は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、環境中の窒素に応答して緻密に制御される。ＮｉｆＡの翻訳後レベルの調節では、ＧｌｎＫは、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルに依存する様態（ｍａｔｔｅｒ）でＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害する。

【0078】

ＮｉｆＡは、ｎｉｆＬＡオペロンから転写され、そのプロモーターは、別のσ_５４依存性調節因子であるリン酸化ＮｔｒＣによって活性化される。ＮｔｒＣのリン酸化状態は、ヒスチジンキナーゼＮｔｒＢによって媒介され、ＮｔｒＢは、脱ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用するが、ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用しない。窒素過剰条件下では、グルタミンの高い細胞内レベルが、ＧｌｎＢの脱ウリジリル化につながり、次いで、脱ウリジリル化されたＧｌｎＢは、ＮｔｒＢと相互作用して、そのリン酸化活性を不活化すると共に、そのホスファターゼ活性を活性化させて、ＮｔｒＣの脱リン酸化及びｎｉｆＬＡプロモーターの不活化がもたらされる。しかしながら、窒素制限条件下では、低レベルの細胞内グルタミンが、ＧｌｎＢのウリジリル化をもたらし、それによりＮｔｒＢとのその相互作用が阻害され、ＮｔｒＣのリン酸化及びｎｉｆＬＡオペロンの転写を可能にする。このように、ｎｉｆＬＡ発現は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、環境中の窒素に応答して緻密に制御される。ｎｉｆＡ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、及びｇｌｎＢは全て、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。また、これらのプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答性であり得る。

【0079】

また、ＮｉｆＡの活性は、最も典型的にはＮｉｆＡ活性のＮｉｆＬ媒介性阻害により、環境中の窒素に応答して翻訳後に調節される。一般に、ＮｉｆＬとＮｉｆＡとの相互作用は、ＧｌｎＫを介したＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードによって影響を受けるが、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの間の相互作用の性質は、ジアゾトロフ間で顕著に異なる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、両形態のＧｌｎＫが、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害し、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの間の相互作用は、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルによって決定される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、アンモニウムトランスポーターＡｍｔＢと相互作用し、これは、ＡｍｔＢによるアンモニウム取り込みを阻止すると共に、ＧｌｎＫを膜に隔離し、ＮｉｆＬによるＮｉｆＡの阻害を可能にする役目を果たす。一方、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉでは、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用及びＮｉｆＡ阻害には、脱ウリジリル化ＧｌｎＫとの相互作用が必要とされるが、ＧｌｎＫのウリジリル化は、ＮｉｆＬとの相互作用を阻害する。ｎｉｆＬ遺伝子が欠如したジアゾトロフでは、ＮｉｆＡ活性は、窒素過剰条件下では、ＧｌｎＫ及びＧｌｎＢの両方の脱ウリジリル化形態との相互作用によって直接阻害されるという証拠が存在する。一部の細菌では、Ｎｉｆクラスターが、ｇｌｎＲによって調節される場合があり、さらに一部の場合では、これは、負の調節を含む場合がある。その機序を問わず、ほとんどの既知のジアゾトロフでは、ＮｉｆＡの翻訳後阻害は、ｎｉｆクラスターの重要な調節因子である。加えて、ｎｉｆＬ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＫ、及びｇｌｎＲは、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。

【0080】

ｎｉｆ遺伝子クラスターの転写の調節に加えて、多くのジアゾトロフは、ニトロゲナーゼ遮断として知られる、ニトロゲナーゼ酵素自体の直接的翻訳後修飾及び阻害の機序を進化させている。これは、窒素過剰条件下でのＦｅタンパク質（ＮｉｆＨ）のＡＤＰリボシル化によって媒介され、それにより、ＭｏＦｅタンパク質複合体（ＮｉｆＤＫ）とのその相互作用が妨害され、ニトロゲナーゼ活性が消失する。ＤｒａＴは、Ｆｅタンパク質のＡＤＰリボシル化及びニトロゲナーゼの遮断を触媒する一方で、ＤｒａＧは、ＡＤＰリボースの除去及びニトロゲナーゼの再活性化を触媒する。ｎｉｆＬＡ転写及びＮｉｆＡ阻害の場合と同様に、ニトロゲナーゼ遮断もまた、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して調節される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＢは、ＤｒａＴと相互作用してそれを活性化する一方で、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、ＤｒａＧ及びＡｍｔＢの両方と相互作用して複合体を形成し、ＤｒａＧを膜に隔離する。窒素制限条件下では、ＧｌｎＢ及びＧｌｎＫのウリジリル化形態は、それぞれＤｒａＴ及びＤｒａＧと相互作用せず、ＤｒａＴの不活化及びＤｒａＧのＦｅタンパク質への拡散につながり、そこでＡＤＰリボースが除去され、ニトロゲナーゼが活性化される。本明細書に記載の方法はまた、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、及びｄｒａＴ遺伝子に遺伝的変異を導入することも企図する。

【0081】

一部の内部寄生菌は、インビトロで窒素を固定する能力を有するが、多くの場合、この遺伝的特質は、圃場では高レベルの外因性化学肥料によってサイレンシングされる。圃場に基づく窒素固定を容易にするために、外因性窒素の感知をニトロゲナーゼ酵素の発現から切り離すことができる。さらに、経時的なニトロゲナーゼ活性の積分を改善することは、作物が利用するための窒素の産生を増大させる役目を果たす。本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝的変異のための具体的な標的には、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、及びｎｉｆＱからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子が含まれる。

【0082】

本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝的変異のための追加の標的は、ＮｉｆＡタンパク質である。ＮｉｆＡタンパク質は、典型的には、窒素固定遺伝子の発現の活性化因子である。ＮｉｆＡの産生を（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）増加させることにより、天然アンモニア感知経路が迂回される。加えて、ＮｉｆＡの既知の阻害剤であるＮｉｆＬタンパク質の産生を低減することは、遊離活性ＮｉｆＡレベルの増加にもつながる。加えて、ｎｉｆＡＬオペロンの転写レベルを（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）増加させることは、全体的により高いレベルのＮｉｆＡタンパク質にもつながる。ｎｉｆＡＬ発現レベルの上昇は、プロモーター自体を改変することによって、またはＮｔｒＢ（元々は高窒素条件中にｎｉｆＡＬオペロンの遮断をもたらすことになるｎｔｒＢ及びｎｔｒＣシグナル伝達カスケードの一部）の発現を低減させることによって達成される。これらの方法または本明細書に記載の任意の他の方法によって達成される高レベルのＮｉｆＡは、内部寄生菌の窒素固定活性を増加させる。

【0083】

本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝的変異のための別の標的は、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ ＰＩＩシグナル伝達カスケードである。細胞内グルタミンレベルは、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ ＰＩＩシグナル伝達カスケードにより感知される。ＧｌｎＤのウリジリル除去活性を消失させるＧｌｎＤの活性部位突然変異は、窒素感知カスケードを妨害する。加えて、ＧｌｎＢ濃度の低減は、グルタミン感知カスケードを短絡させる。これらの突然異により、細胞を「騙して」窒素制限状態であると認識させ、それにより窒素固定レベル活性を増加させる。また、これらのプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答性であり得る。

【0084】

ａｍｔＢタンパク質もまた、本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝的変異のための標的である。環境からのアンモニア取り込みは、ａｍｔＢタンパク質の発現レベルを減少させることによって低減され得る。細胞内アンモニアが存在しないと、内部寄生菌は、アンモニアのレベルが高いことを感知することができず、窒素固定遺伝子の下方制御が防止される。細胞内区画への侵入を果たしたアンモニアはいずれもグルタミンに変換される。細胞内グルタミンレベルは、窒素感知の主要な通貨である。細胞内グルタミンレベルを減少させることにより、細胞が、環境中のアンモニウムレベルが高いことを感知することが防止される。この効果は、グルタミンをグルタミン酸に変換する酵素であるグルタミナーゼの発現レベルを増加させることによって達成され得る。加えて、細胞内グルタミンは、グルタミン合成酵素（アンモニアをグルタミンに変換する酵素）を減少させることによっても低減され得る。ジアゾトロフでは、固定アンモニアは、細胞プロセスに使用するためにグルタミン及びグルタミン酸へと迅速に同化される。アンモニア同化の妨害は、固定窒素をそらして、アンモニアとして細胞から搬出されることを可能にし得る。固定アンモニアは、主として、ｇｌｎＡによりコードされるグルタミン合成酵素（ＧＳ）によってグルタミンへと、その後はグルタミンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＧＡＴ）によってグルタミンへと同化される。一部の例では、ｇｌｎＳが、グルタミン合成酵素をコードする。ＧＳは、ＧＳアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｎＥ）、すなわち、それぞれアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン及びアデニリル除去（ＡＲ）ドメインの活性によりＧＳのアデニリル化及び脱アデニリル化の両方を触媒する、ｇｌｎＥによりコードされる二機能性酵素によって、翻訳後に調節される。窒素制限条件下では、ｇｌｎＡが発現され、ＧｌｎＥのＡＲドメインは、ＧＳを脱アデニリル化して、その活性化を可能にする。窒素過剰条件下では、ｇｌｎＡ発現は遮断され、ＧｌｎＥのＡＴドメインは、グルタミンによってアロステリック的に活性化され、ＧＳのアデニリル化及び不活化が引き起こされる。

【0085】

さらに、ｄｒａＴ遺伝子もまた、本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝的変異のための標的であってもよい。細胞によって窒素固定酵素が産生されると、ニトロゲナーゼ遮断が、細胞が高窒素条件で固定活性を下方制御する別のレベルを表す。この遮断は、ＤｒａＴの発現レベルを減少させることによって除去することが可能である。

【0086】

新たな微生物表現型を付与するための方法は、転写レベル、翻訳レベル、及び翻訳後レベルで実施することができる。転写レベルでは、プロモーターでの変更（プロモーターの全てまたは一部分の欠失を含む、転写因子に対するシグマ因子親和性または結合部位の変更等）または転写ターミネーター及びアテニュエータを変更することが含まれる。翻訳レベルでは、リボソーム結合部位での変更、及びｍＲＮＡ分解シグナルを変更することが含まれる。翻訳後レベルでは、酵素の活性部位を突然変異させること、及びタンパク質間相互作用を変更することが含まれる。これらの変更は、数多くの方式で達成することができる。発現レベルの低減（または完全な消失）は、天然リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはプロモーターを、強度／効率がより低い別のものと交換することによって達成することができる。ＡＴＧ開始部位を、ＧＴＧ、ＴＴＧ、またはＣＴＧ開始コドンと交換することができ、それにより、コード領域の翻訳活性の低減がもたらされる。発現の完全な消失は、遺伝子のコード領域をノックアウト（欠失）することによって行うことができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をフレームシフトすると、ＯＲＦに未成熟終止コドンがもたらされ、それによって非機能性の短縮産物が作出されることになる可能性がある。インフレーム終止コドンの挿入も同様に、非機能性の短縮産物を作出することになる。Ｎ末端またはＣ末端に分解タグの付加を行って、特定の遺伝子の有効濃度を低減させることもできる。

【0087】

逆に、より強力なプロモーターを使用することによって、本明細書に記載の遺伝子の発現レベルを達成することができる。高窒素レベル条件（または任意の他の条件）中の高いプロモーター活性を確実にするために、高窒素レベル条件における全ゲノムの転写プロファイルを取得し、そのデータセットから所望の転写レベルを有する活性プロモーターを選定して、弱いプロモーターを置換することが可能である。より良好な翻訳開始効率のために、弱い開始コドンをＡＴＧ開始コドンと交換することができる。弱いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を、より高い翻訳開始効率を有する異なるＲＢＳと交換することもできる。加えて、部位特異的突然変異誘発を実施して、酵素の活性を改変することもできる。

【0088】

植物において生じる窒素固定のレベルを増加させることにより、作物生産に必要とされる化学肥料の量の低減につながると共に、温室効果ガス排出（例えば、亜酸化窒素）を削減することができる。

【0089】

コロニー形成ポテンシャルの調節
一部の実施形態では、コロニー形成に関与する経路及び遺伝子が、遺伝子操作及び最適化のための標的として作用し得る。

【0090】

一部の場合では、エキソポリサッカライドが、植物での細菌コロニー形成に関与し得る。一部の場合では、植物コロニー形成微生物は、バイオフィルムを産生し得る。一部の場合では、植物コロニー形成微生物は、植物への接着または植物免疫応答の回避を補助し得る分子を分泌する。一部の場合では、植物コロニー形成微生物は、微生物に対する植物応答を改変するシグナル伝達分子を排泄し得る。一部の場合では、植物コロニー形成微生物は、局所微小環境を改変する分子を分泌し得る。一部の場合では、植物コロニー形成微生物は、該微生物が近接する植物に適合するように遺伝子の発現を改変し得る。一部の場合では、植物コロニー形成微生物は、局所環境において植物の存在を検出し得、応答して遺伝子の発現を変化させ得る。

【0091】

一部の実施形態では、コロニー形成を改善するために、エキソポリサッカライド産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、及びグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子が、遺伝子操作及び最適化のための標的となり得る。

【0092】

一部の実施形態では、エキソポリサッカライドの産生に関与する酵素または経路が、コロニー形成を改善するように遺伝子組換えされ得る。コロニー形成を改善するための標的となり得る、エキソポリサッカライド産生酵素をコードする例示的な遺伝子には、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、及びｙｊｂＥが含まれるが、これらに限定されない。

【0093】

一部の実施形態では、線維状ヘマグルチニンの産生に関与する酵素または経路が、コロニー形成を改善するように遺伝子組換えされ得る。例えば、線維状ヘマグルチニンをコードするｆｈａＢ遺伝子が、コロニー形成を改善するための標的となり得る。

【0094】

一部の実施形態では、エンドポリガラクツロナーゼの産生に関与する酵素または経路が、コロニー形成を改善するように遺伝子組換えされ得る。例えば、エンドポリガラクツロナーゼ前駆体をコードするｐｅｈＡ遺伝子が、コロニー形成を改善するための標的となり得る。

【0095】

一部の実施形態では、トレハロースの産生に関与する酵素または経路が、コロニー形成を改善するように遺伝子組換えされ得る。コロニー形成を改善するための標的となり得る、トレハロース産生酵素をコードする例示的な遺伝子には、ｏｔｓＢ及びｔｒｅＺが含まれるが、これらに限定されない。

【0096】

一部の実施形態では、グルタミンの変換に関与する酵素または経路が、コロニー形成を改善するように遺伝子組換えされ得る。例えば、ｇｌｓＡ２遺伝子は、グルタミンをアンモニウム及びグルタミン酸に変換するグルタミナーゼをコードする。ｇｌｓＡ２の上方制御は、細胞のグルタミン酸プールを増加させることによって適合性を改善し、それによって細胞に利用可能なＮを増加させる。したがって、一部の実施形態では、ｇｌｓＡ２遺伝子が、コロニー形成を改善するための標的となり得る。

【0097】

一部の実施形態では、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコロニー形成遺伝子が、コロニー形成を改善するように遺伝子組換えされ得る。

【0098】

コロニー形成ポテンシャルを改善するための標的となり得るコロニー形成遺伝子については、ＰＣＴ公報ＷＯ／２０１９／０３２９２６にも記載され、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0099】

細菌集団の生成
細菌の単離
本明細書に開示される方法及び組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することによって得ることができる。微生物は、種子を粉砕して微生物を単離することによって得ることができる。微生物は、種子を多様な土壌試料に植栽し、組織から微生物を回収することによって得ることができる。加えて、微生物は、植物に外因性微生物を接種し、どの微生物が植物組織に出現するかを決定することによって得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、または塊茎が挙げられ得る。

【0100】

微生物を得るための方法は、細菌を土壌から単離することによるものであってもよい。細菌は、種々の土壌タイプから収集されてもよい。一部の例では、土壌は、高肥沃度または低肥沃度、水分のレベル、鉱物のレベル、及び種々の作付け慣習等の特色により特性評価され得る。例えば、土壌は、異なる作物が連続した植栽季節で同じ土壌に植栽される輪作に関与する場合がある。同じ土壌での異なる作物の順次栽培は、ある特定の鉱物の不均衡な枯渇を防止し得る。細菌は、選択された土壌で成長している植物から単離することができる。実生植物は、２～６週間の栽培で収穫することができる。例えば、少なくとも４００個の単離株を、１ラウンドの収穫で収集することができる。土壌及び植物のタイプは、植物表現型、ならびにある特定の表現型の下流濃縮を可能にする条件を明らかにする。

【0101】

微生物を植物組織から単離して、微生物の形質を評価することができる。組織試料を処理するためのパラメータを変化させて、根圏細菌、着生菌、または内部寄生菌等の、異なるタイプの付随性微生物を単離してもよい。分離株を無窒素培地で培養して、窒素固定を実施する細菌について濃縮することができる。代替として、世界の菌株バンクから微生物を得ることができる。

【0102】

植物内分析を実施して、微生物の形質を評価する。一部の実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡのハイスループット処理によるスクリーニングのために、植物組織を処理することができる。加えて、非侵襲性測定を使用して、コロニー形成等の植物特性を評価することができる。野生微生物の測定は、植物ごとに得ることができる。また、野生微生物の測定は、圃場でミディアムスループット（ｍｅｄｉｕｍ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）法を使用して得ることもできる。測定は、経時的に順次に行うことができる。Ｓｅｔａｒｉａを含むがこれに限定されないモデル植物系を使用することができる。

【0103】

植物系中の微生物は、植物系での微生物の転写プロファイリングを介してスクリーニングすることができる。転写プロファイリングによるスクリーニングの例は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法、転写物検出用の分子バーコード法、次世代配列決定法、及び蛍光マーカーでの微生物のタグ付け法を使用することである。マイクロバイオーム、非生物要因、土壌条件、酸素、水分、温度、接種材料条件、及び根局在化を含むがこれらに限定されない影響要因を測定して、温室におけるコロニー形成を評価することができる。窒素固定は、細菌中で、本明細書に記載されるようなＩＲＭＳまたはＮａｎｏＳＩＭＳを用いて１５Ｎ気体／肥料（希釈）を測定することによって評価することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、高分解能二次イオン質量分析法である。ＮａｎｏＳＩＭＳ技法は、生物学的試料に由来する化学活性を調査するための方式である。微小生物の代謝を駆動する酸化反応を還元する触媒作用を、細胞レベル、細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）レベル、分子レベル、及び元素レベルで調査することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、０．１μｍ超の高空間分解能を提供することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、^１３Ｃ、^１５Ｎ、及び^１８Ｏ等の同位体トレーサーの使用を検出することができる。したがって、ＮａｎｏＳＩＭＳは、細胞における化学的活性窒素に対して使用することができる。

【0104】

植物分析には、自動化温室を使用することができる。微生物曝露に応答した植物測定基準には、バイオマス、葉緑体分析、ＣＣＤカメラ、容積トモグラフィー測定が含まれるが、これらに限定されない。

【0105】

微生物集団を濃縮するための１つの方式は、遺伝子型によるものである。例えば、標的化プライマーまたは特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである。ジアゾトロフは窒素固定のプロセス中にｎｉｆＨ遺伝子を発現するため、ｎｉｆＨ遺伝子に対して設計されたプライマーを使用して、ジアゾトロフを特定することができる。また、微生物集団は、単一細胞培養非依存的手法及び走化性誘導単離手法を介して濃縮することもできる。代替として、微生物の標的化単離は、微生物を選択培地上で培養することによって実施することができる。微生物集団を所望の形質について濃縮するための計画的な手法は、バイオインフォマティクスデータによって誘導され得、これは本明細書に記載される。

【0106】

バイオインフォマティクスを使用した窒素固定能を有する微生物の濃縮
バイオインフォマティクスツールを使用して、植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を特定及び単離することができる。これらは、窒素固定を実施する能力に基づいて選択される。高い窒素固定能を有する微生物は、植物の有利な形質を促進することができる。ＰＧＰＲを特定するためのバイオインフォマティクス分析モードには、ゲノミクス、メタゲノミクス、標的化単離、遺伝子配列決定、トランスクリプトーム配列決定、及びモデリングが含まれるが、これらに限定されない。

【0107】

ゲノミクス分析を使用して、ＰＧＰＲを特定し、本明細書に記載されるような次世代配列決定法、及び微生物バージョン管理法（ｍｉｃｒｏｂｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）により突然変異の存在を確認することができる。

【0108】

メタゲノミクスを使用して、コロニー形成の予測アルゴリズムを使用してＰＧＰＲを特定及び単離することができる。また、メタデータを使用して、環境試料及び温室試料中の操作された菌株の存在を特定することもできる。

【0109】

トランスクリプトーム配列決定を使用して、ＰＧＰＲ表現型につながる遺伝子型を予測することができる。加えて、トランスクリプトームデータを使用して、遺伝子発現を改変するためのプロモーターを特定する。全ゲノム配列（ＷＧＳ）と併せてトランスクリプトームデータを分析して、代謝及び遺伝子調節ネットワークのモデルを生成することができる。

【0110】

微生物の順化
自然界から単離された微生物は、微生物が遺伝学的に追跡可能及び特定可能な形態に変換される順化プロセスを経ることができる。微生物を順化させる１つの方式は、抗生物質耐性を微生物に導入操作することである。抗生物質耐性を導入操作するプロセスは、野生型微生物菌株の抗生物質感受性を決定することによって開始し得る。細菌が抗生物質に感受性である場合、その抗生物質は、抗生物質耐性導入操作の良好な候補であり得る。その後、リコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）法を使用して、抗生物質耐性遺伝子または対抗選択可能自殺ベクターを微生物のゲノムに組み込むことができる。対抗選択可能自殺ベクターは、目的の遺伝子の欠失、選択可能マーカー、及び対抗選択可能マーカーｓａｃＢからなり得る。対抗選択を使用して、天然微生物ＤＮＡ配列を抗生物質耐性遺伝子と交換することができる。ミディアムスループット法を使用して、複数の微生物を同時に評価して、並行順化を可能にすることができる。代替の順化方法は、ホーミングヌクレアーゼを使用して、自殺ベクター配列のループアウトまたは介在ベクター配列獲得を防止することを含む。

【0111】

ＤＮＡベクターは、エレクトロポレーション及び化学的形質転換を含めたいくつかの方法を介して細菌に導入することができる。ベクターの標準的ライブラリーを形質転換に使用することができる。遺伝子編集法の一例は、Ｃａｓ９試験により微生物におけるＣａｓ９の活性を確実にした後でのＣＲＩＳＰＲである。

【0112】

微生物の非トランスジェニック操作
有利な形質を有する微生物集団は、定向進化を介して得ることができる。定向進化は、自然淘汰プロセスを模倣して、タンパク質または核酸をユーザ定義目標に向かって進化させる手法である。定向進化の一例は、ランダム突然変異を微生物集団に導入した場合、最も有利な形質を有する微生物を選択し、選択した微生物の増殖を継続させることである。成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）の最も有利な形質は、窒素固定であり得る。定向進化法は、各反復後の選択プロセスに基づき、反復性及び適応性であってもよい。

【0113】

高い窒素固定能を有する植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を生成することができる。ＰＧＰＲの進化は、遺伝的変異の導入を介して実施することができる。遺伝的変異は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、飽和突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的突然変異誘発、及びそれらの組み合わせを介して導入することができる。これらの手法により、ランダム突然変異を微生物集団に導入することができる。例えば、突然変異体は、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発を介して合成ＤＮＡまたはＲＮＡを使用して生成することができる。突然変異体は、プラスミドに含まれるツール（これは後で除去される（ｃｕｒｅｄ））を使用して生成することができる。目的の遺伝子は、改善されたＰＧＰＲ特性、穀類での改善されたコロニー形成、増加した酸素感受性、増加した窒素固定、及び増加したアンモニア排泄を含むがこれらに限定されない、改善された形質を有する他の種に由来するライブラリーを使用して特定することができる。これらのライブラリーに基づき、ＧｅｎｅｉｏｕｓまたはＰｌａｔｙｐｕｓ設計ソフトウェア等のソフトウェアを使用して、属内遺伝子を設計することができる。突然変異は、機械学習の支援により設計することができる。突然変異は、代謝モデルの支援により設計することができる。ａ ｌａ Ｐｌａｔｙｐｕｓを使用して突然変異の自動設計を行うことができ、Ｃａｓ指向性突然変異誘発のためのＲＮＡが誘導されることになる。

【0114】

属内遺伝子を、宿主微生物に移入することができる。加えて、レポーター系も微生物に移入することができる。レポーター系は、プロモーターの特性を決定し、形質転換成功を決定し、突然変異体をスクリーニングし、負のスクリーニングツールとして作用する。

【0115】

突然変異を担持する微生物は、連続継代を介して培養することができる。微生物コロニーは、微生物の単一の変種を含有する。微生物コロニーは、自動コロニーピッカー及び液体ハンドラーの支援によりスクリーニングされる。遺伝子重複及び増加したコピー数を有する突然変異体は、所望の形質のより高い遺伝子型を発現する。

【0116】

窒素固定に基づく植物成長促進性微生物の選択
微生物コロニーを、種々のアッセイを使用してスクリーニングして、窒素固定を評価することができる。窒素固定を測定するための１つの方式は、窒素排泄を測定する単一の発酵アッセイを介するものである。代替方法は、経時的なインライン試料採取によるアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）である。ＡＲＡは、マイクロチューブアレイのハイスループットプレートにおいて実施することができる。ＡＲＡは、生植物及び生植物組織で実施することができる。ＡＲＡアッセイでは、培地処方及び培地酸素濃度を変化させることができる。微生物変種をスクリーニングする別の方法は、バイオセンサーの使用によるものである。ＮａｎｏＳＩＭＳ及びラマン顕微分光法の使用は、微生物の活性を調査するために使用することができる。また、一部の場合では、バイオリアクタ中での発酵法を使用して細菌を培養及び増殖させることもできる。バイオリアクタは、細菌増殖の頑強性を改善する共に、酸素への細菌の感受性を減少させるように設計されている。ミディアム～ハイＴＰプレートに基づくマイクロ発酵槽を使用して、酸素感受性、栄養必要性、窒素固定、及び窒素排泄を評価する。また、細菌を、競合性のまたは有益な微生物と共培養して、隠れた経路を解明することもできる。フローサイトメトリーを使用して、化学的、比色定量的、または蛍光性の指示薬を使用して高レベルの窒素を産生する細菌に関してスクリーニングすることができる。細菌は、窒素源の存在下または不在下で培養されてもよい。例えば、細菌は、グルタミン、アンモニア、尿素、または硝酸塩と共に培養されてもよい。

【0117】

誘導型微生物リモデリング－概要
誘導型微生物リモデリングは、作物マイクロバイオーム内での種の役割を系統的に特定及び改善する方法である。一部の態様では、群分け／カテゴリー化の特定の方法論に従って、この方法は、１）植物－微生物間相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連付けられる調節ネットワークを予測することによって候補種を選択すること、２）微生物のゲノム内での調節ネットワーク及び遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的かつ予測可能に改善すること、ならびに３）所望の作物表現型をもたらす新たな微生物遺伝子型をスクリーニング及び選択すること、の３つのステップを含む。

【0118】

菌株の改善を系統的に評価するために、微生物群落のコロニー形成動力学を主要な種による遺伝子活性に結び付けるモデルを作出する。このモデルを使用して、非属間遺伝子リモデリング（すなわち、非トランスジェニック様式で微生物の遺伝的構造を操作する）のための遺伝子標的を予測する。このプロセスの実施形態の図形表現については、図１を参照されたい。

【0119】

図１に例示されるように、作物マイクロバイオームの合理的改善を使用して、土壌の生物多様性を増加させ、キーストーン種の影響を調整し、及び／または重要な代謝経路のタイミング及び発現を改変してもよい。

【0120】

この目的で、発明者らは、作物マイクロバイオーム内での菌株の役割を特定及び改善するためのプラットフォームを開発した。一部の態様では、発明者らは、このプロセスを微生物育種（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）と呼んでいる。

【0121】

前述の「誘導型微生物リモデリング」プロセスは、実施例、例えば、「誘導型微生物リモデリング－農業用の微生物種の合理的改善に向けたプラットフォーム」と題される実施例１でさらに詳述される。

【0122】

連続継代
植物形質（例えば、窒素固定）を改善する細菌の生産は、連続継代により達成することができる。この細菌の生産は、１つまたは複数の植物に１つまたは複数の改善された形質を付与することが可能な細菌及び／または組成物を特定することに加えて、微生物叢によって影響を受ける特定の改善された形質を有する植物を選択することによって行うことができる。植物形質を改善する細菌を生産する１つの方法は、（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離するステップ、（ｂ）細菌のうちの１つまたは複数に遺伝的変異を導入して、１つまたは複数の変種細菌を生産するステップ、（ｃ）複数の植物を変種細菌に曝露するステップ、（ｄ）複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離するステップであって、細菌が単離される植物が、複数の植物中の他の植物と比べて改善された形質を有する、該ステップ、及び（ｅ）改善された形質を有する植物から単離された細菌（ステップ（ｄ））を用いて、ステップ（ｂ）～（ｄ）を繰り返すステップを含む。ステップ（ｂ）～（ｄ）は、植物の改善された形質が所望のレベルに達するまで、何回でも（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、またはそれよりも多く）繰り返すことができる。さらに、複数の植物は、１０～２０個の植物、または２０個以上、５０個以上、１００個以上、３００個以上、５００個以上、または１０００個以上の植物等の、２個を超える植物であり得る。

【0123】

改善された形質を有する植物を得ることに加えて、１つまたは複数の遺伝子（例えば、窒素固定を調節する遺伝子）に導入された１つまたは複数の遺伝的変異を含む細菌を含む細菌集団が得られる。上述のステップを繰り返すことによって、目的の植物形質と相関する集団の最も適切な成員を含む細菌の集団を得ることができる。遺伝子分析及び／または表現型分析等によって、この集団における細菌を特定して、それらの有益な特性を決定することができる。ステップ（ａ）において、単離された細菌の遺伝子分析を行ってもよい。表現型及び／または遺伝子型の情報は、植物起源の化学成分のハイスループットスクリーニング、遺伝物質のハイスループット配列決定を含む配列決定技法、ディファレンシャルディスプレイ技法（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ及びＤＤ－ＰＣＲを含む）、核酸マイクロアレイ技法、ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）、及びｑＲＴ－ＰＣＲ（定量的リアルタイムＰＣＲ）を含む技法を使用して得てもよい。獲得した情報を使用して、系統発生分析、またはｒＲＮＡオペロンもしくは他の分類学的に参考になる遺伝子座の構成成分をコードする核酸のマイクロアレイに基づくスクリーニング等、存在する細菌の同一性及び活性に関する群落プロファイリング情報を得ることができる。分類学的に参考になる遺伝子座の例としては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘｌ遺伝子、ｎｉｆＤ遺伝子が挙げられる。集団に存在する分類群を決定するための分類学的プロファイリングの例となるプロセスは、ＵＳ２０１４０１５５２８３に記載される。細菌の特定は、窒素固定経路に関連する遺伝子等の、１つもしくは複数の遺伝子または１つもしくは複数のシグナル伝達経路の活性を特性評価することを含んでもよい。また、異なる細菌種間の相乗的な相互作用（２つの成分が、それらを組み合わせることにより、相加的な量を超えて所望の効果が増加すること）が、細菌集団に存在している場合もある。

【0124】

遺伝的変異－ゲノム改変の位置及び供給源
遺伝的変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、及びｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子であってもよい。遺伝的変異は、グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼａＤＰ－Ｄ－リボシルトランスフェラーゼからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異であってもよい。遺伝的変異は、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの増加した発現もしくは活性；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの減少した発現もしくは活性；ＧｌｎＥの減少したアデニリル除去活性；またはＧｌｎＤの減少したウリジリル除去活性のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい。遺伝的変異の導入は、１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００ヌクレオチド、またはそれよりも多くのヌクレオチド等の、標的部位での１つまたは複数のヌクレオチドの挿入及び／または欠失を含んでもよい。本明細書に開示される方法の１つまたは複数の細菌に導入された遺伝的変異は、ノックアウト突然変異（例えば、プロモーターの欠失、未成熟終止コドンをもたらす挿入または欠失、全遺伝子の欠失）であってもよいし、またはそれは、タンパク質ドメインの活性の排除もしくは消失（例えば、活性部位に影響を及ぼす点突然変異、またはタンパク質産物の関連性のある部分をコードする遺伝子の一部分の欠失）であってもよいし、またはそれは、標的遺伝子の調節配列を改変もしくは消失させてもよい。また、異種調節配列、及び遺伝的変異が導入されている細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列を含む、１つまたは複数の調節配列が挿入されてもよい。その上、調節配列は、細菌培養物中のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択されてもよい。遺伝的変異は、標的部位に特異的に導入される既定の遺伝的変異であってもよい。遺伝的変異は、標的部位内のランダム突然変異であってもよい。遺伝的変異は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。一部の場合では、形質改善を評価するために細菌を植物に曝露する前に、複数の異なる遺伝的変異（例えば、２、３、４、５、１０個、またはそれよりも多く）が、単離された細菌のうちの１つまたは複数に導入される。複数の遺伝的変異は、上記のタイプのうちのいずれか、同じタイプまたは異なるタイプ、及び任意の組み合わせであることができる。一部の場合では、複数の遺伝的変異が細菌に蓄積されて、進行的に改善された形質が関連する植物に付与されるように、第１の単離ステップ後に第１の遺伝的変異を導入し、第２の単離ステップ後に第２の遺伝的変異を導入する等、複数の異なる遺伝的変異が連続的に導入される。

【0125】

遺伝的変異－ゲノム改変を導入する方法
一般に、「遺伝的変異」という用語は、参照ゲノムもしくはその一部分または参照遺伝子もしくはその一部分等の参照ポリヌクレオチドと比べた、ポリヌクレオチド配列に導入される任意の変更を指す。遺伝的変異は、「突然変異」と称される場合があり、遺伝的変異を含む配列または生物は、「遺伝的変種」または「突然変異体」と称される場合がある。遺伝的変異は、遺伝子発現、代謝、及び細胞シグナル伝達を含めた何らかの生物活性の増加または減少等の、任意の数の効果を有し得る。遺伝的変異は、標的部位に特異的に導入されることも、またはランダムに導入されることもできる。遺伝的変異を導入するための様々な分子ツール及び方法が利用可能である。例えば、遺伝的変異は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、飽和突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発、相同組換え、リコンビニアリング、ラムダレッド（ｌａｍｂｄａ ｒｅｄ）媒介組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的突然変異誘発、及びそれらの組み合わせを介して導入することができる。遺伝的変異を導入するための化学的方法には、ＤＮＡを、化学的突然変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ－ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロ－Ｎ’－ニトロソグアニジン、４－ニトロキノリンＮ－オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ－１７０、ホルムアルデヒド、塩酸プロカルバジン、エチレンオキシド、ジメチルニトロソアミン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）等に曝露することが含まれる。放射線突然変異誘導因子には、紫外線、γ線、Ｘ線、及び高速中性子衝撃が含まれる。また、例えば、トリメチルソラレンを紫外光と共に使用して、核酸に遺伝的変異を導入することができる。可動ＤＮＡ要素、例えば転位因子のランダムな挿入または標的挿入は、遺伝的変異を生成するための別の好適な方法である。遺伝的変異は、例えば、エラープローンＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、無細胞インビトロ系での増幅中に核酸に導入することができる。遺伝的変異は、ＤＮＡシャフリング技法（例えば、エクソンシャフリング、ドメイン交換等）を使用して、インビトロで核酸に導入することができる。また、遺伝的変異は、細胞におけるＤＮＡ修復酵素の欠損の結果として核酸に導入され得、例えば、突然変異ＤＮＡ修復酵素をコードする突然変異遺伝子が細胞に存在すると、その細胞のゲノムには、高頻度の突然変異（すなわち、約１個の突然変異／１００遺伝子～１個の突然変異／１０，０００遺伝子）が生成されることが予想される。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例としては、Ｍｕｔ Ｈ、Ｍｕｔ Ｓ、Ｍｕｔ Ｌ、及びＭｕｔ Ｕ、ならびに他の種におけるそれらのホモログ（例えば、ＭＳＨ１６、ＰＭＳ１２、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、及びＥＲＣＣ－１等）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝的変異を導入するための種々の方法の例となる説明は、例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ５：１－７、Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ２（３）：２１０－２１７、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１、及び米国特許第６，０３３，８６１号及び同第６，７７３，９００号に提供される。

【0126】

微生物に導入される遺伝的変異は、トランスジェニック、シスジェニック、ゲノム内、属内、属間、合成、進化、再構成、またはＳＮＰとして分類され得る。

【0127】

遺伝的変異を、微生物内の多数の代謝経路に導入して、上述の形質の改善を誘発してもよい。代表的な経路には、硫黄取り込み経路、グリコーゲン生合成、グルタミン調節経路、モリブデン取り込み経路、窒素固定経路、アンモニア同化、アンモニア排泄または分泌、窒素取り込み、グルタミン生合成、アナモックス（ａｎｎａｍｏｘ）、リン酸塩可溶化、有機酸輸送、有機酸産生、凝集素産生、活性酸素ラジカルスカベンジング遺伝子、インドール酢酸生合成、トレハロース生合成、植物細胞壁分解酵素または経路、根付着遺伝子、菌体外多糖分泌、グルタミン酸合成酵素経路、鉄取り込み経路、シデロフォア経路、キチナーゼ経路、ＡＣＣデアミナーゼ、グルタチオン生合成、亜リン酸シグナル伝達（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）遺伝子、クオラムクエンチング経路、チトクロム経路、ヘモグロビン経路、細菌ヘモグロビン様経路、低分子ＲＮＡ ｒｓｍＺ、リゾビトキシン（ｒｈｉｚｏｂｉｔｏｘｉｎｅ）生合成、ｌａｐＡ接着タンパク質、ＡＨＬクオラムセンシング経路、フェナジン生合成、環状リポペプチド生合成、及び抗生物質産生が含まれる。

【0128】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ））／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を使用して、所望の突然変異を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して、侵入核酸のサイレンシングを誘導することによって、ウイルス及びプラスミドに対する適応免疫を細菌及び古細菌に提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価体及び／もしくは変種、すなわちＣａｓ９様タンパク質）は、このタンパク質と、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）と呼ばれる２つの天然に存在するＲＮＡ分子または合成ＲＮＡ分子との会合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然で含有する。一部の場合では、これら２つの分子は、共有結合で連結されて、単一分子（単鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。故に、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ構成及び単一分子ガイドＲＮＡ構成の両方を包含する）と会合し、それによりＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質が活性化され、このタンパク質が標的核酸配列に指向される。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質がその天然の酵素機能を保持する場合、それは標的ＤＮＡを切断して、二本鎖切断が作出されることになり、それによりゲノム改変（すなわち、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換等）をもたらすことができ、それによって遺伝子発現が改変される。Ｃａｓ９の一部の変種（そのような変種は、Ｃａｓ９様という用語により包含される）は、減少したＤＮＡ切断活性を有するように改変されている（一部の場合では、それらは標的ＤＮＡの両鎖ではなく一本鎖を切断し、他の場合には、それらは著しく還元されて、ＤＮＡ切断活性を示さない）。遺伝的変異を導入するためのＣＲＩＳＰＲ系のさらなる例示的な説明は、例えば、ＵＳ８７９５９６５に見出すことができる。

【0129】

サイクリック増幅技法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発では、変異原性プライマーを使用して、所望の突然変異を導入する。ＰＣＲは、変性、アニーリング、及び伸長のサイクルによって実施される。ＰＣＲによる増幅後、突然変異ＤＮＡの選択及び親プラスミドＤＮＡの除去は、１）ＰＣＲ中にｄＣＴＰをヒドロキシメチル化ｄＣＴＰと置換し、続いて制限酵素で消化して、非ヒドロキシメチル化親ＤＮＡのみを除去する、２）抗生物質耐性遺伝子及び研究対象遺伝子を両方とも同時に突然変異誘発させて、プラスミドを異なる抗生物質耐性に変化させ、新たな抗生物質耐性により、その後の所望の突然変異の選択を容易にする、３）所望の突然変異を導入した後、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限酵素Ｄｐｎｌによって親メチル化鋳型ＤＮＡを消化し、それによって突然変異誘発された非メチル化鎖を回収する、または４）突然変異ＰＣＲ産物を、追加のライゲーション反応で環状化して、突然変異ＤＮＡの形質転換効率を増加させることによって、達成することができる。例示的な方法のさらなる説明は、例えば、ＵＳ７１３２２６５、ＵＳ６７１３２８５、ＵＳ６６７３６１０、ＵＳ６３９１５４８、ＵＳ５７８９１６６、ＵＳ５７８０２７０、ＵＳ５３５４６７０、ＵＳ５０７１７４３、及びＵＳ２０１００２６７１４７に見出すことができる。

【0130】

部位指向性突然変異誘発とも呼ばれるオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発では、典型的には、合成ＤＮＡプライマーが利用される。この合成プライマーは、所望の突然変異を含有し、それが目的の遺伝子におけるＤＮＡとハイブリダイズすることができるように、突然変異部位付近が鋳型ＤＮＡと相補的である。突然変異は、単一塩基の変更（点突然変異）、複数塩基の変更、欠失、もしくは挿入、またはこれらの組み合わせであってもよい。次いで、ＤＮＡポリメラーゼを使用して一本鎖プライマーを伸長させ、それにより遺伝子の残りがコピーされる。このようにしてコピーされた遺伝子は、突然変異部位を含有し、次いでこれをベクターとしての宿主細胞に導入し、クローニングしてもよい。最後に、突然変異体をＤＮＡ配列決定によって選択して、それらが所望の突然変異を含有することを確認することができる。

【0131】

遺伝的変異は、エラープローンＰＣＲを使用して導入され得る。この技法では、目的の遺伝子は、配列複製の忠実度が不全である条件下でＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅される。その結果、増幅産物は、少なくとも１つのエラーを配列に含有する。遺伝子を増幅し、得られた反応の産物（複数可）が、鋳型分子と比較したときに１つまたは複数の改変を配列に含有する場合、得られた産物は、鋳型と比較して突然変異誘発されている。ランダム突然変異を導入する別の手段は、細胞を、ニトロソグアニジンまたはメタンスルホン酸エチル等の化学的突然変異原に曝露することであり（Ｎｅｓｔｍａｎｎ，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ １９７５ Ｊｕｎｅ；２８（３）：３２３－３０）、次いで、その遺伝子を含有するベクターが宿主から単離される。

【0132】

飽和突然変異誘発は、別の形態のランダム突然変異誘発であり、特定部位にまたは遺伝子の狭い領域に、全てのまたはほぼ全ての考えられる突然変異を生成しようするものである。一般的な意味では、飽和突然変異誘発は、突然変異誘発させようとする規定のポリヌクレオチド配列（突然変異誘発させようとする配列の長さは、例えば１５～１００，０００塩基である）に変異原性カセットの完全なセット（各カセットの長さは、例えば１～５００塩基である）を突然変異誘発させることで構成されている。したがって、突然変異の群（例えば、１～１００個の範囲の突然変異）が、突然変異誘発させようとする各カセットに導入される。１つのカセットに導入される突然変異の群分けは、飽和突然変異誘発の１ラウンドを施している間に第２のカセットに導入される突然変異の第２の群分けと異なることも、または同じであることもできる。そのような群分けは、欠失、付加、特定のコドンの群分け、及び特定のヌクレオチドカセットの群分けにより例示される。

【0133】

ＤＮＡシャフリングとも呼ばれる断片シャフリング突然変異誘発は、有益な突然変異を迅速に伝播する方式である。シャフリングプロセスの一例では、ＤＮＡｓｅを使用して、１セットの親遺伝子を、例えば、長さが約５０～１００ｂｐの小片に断片化する。これに続いて、プライマーを用いないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が行われ、十分な重複相同配列を有するＤＮＡ断片が互いにアニーリングすることになり、次いでこれがＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。ＤＮＡ分子の一部が親遺伝子のサイズに達した後も、このＰＣＲ伸長を数ラウンド継続させる。次いで、これらの遺伝子を、今度は鎖の末端に相補的になるように設計されたプライマーを添加して、別のＰＣＲで増幅することができる。プライマーは、クローニングベクターへのライゲーションに必要とされる制限酵素認識部位の配列等の追加の配列が、それらの５’末端に付加されてもよい。シャフリング技法のさらなる例は、ＵＳ２００５０２６６５４１に提供される。

【0134】

相同組換え突然変異誘発は、外因性ＤＮＡ断片と標的ポリヌクレオチド配列との間の組換えを伴う。二本鎖切断が生じた後、切断の５’末端付近のＤＮＡの区画は、切除と呼ばれるプロセスで切り離される。その後のストランド侵入ステップでは、切断されたＤＮＡ分子のオーバーハングを持つ３’末端が、次いで、切断されていない類似のまたは同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。この方法を使用して、遺伝子を欠失させ、エクソンを除去し、遺伝子を付加し、点突然変異を導入することができる。相同組換え突然変異誘発は、恒久的であることも、または暫定的であることもできる。典型的には、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別のベクターの構成成分であってもよいし、別個のベクターに含有されていてもよいし、または別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。一部の実施形態では、組換え鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼによって切れ目を入れられるまたは切断される標的配列内または標的配列付近等で、相同組換えの鋳型としての役目を果たすように設計されている。鋳型ポリヌクレオチドの長さは、約１０ヌクレオチド以上、約１５ヌクレオチド以上、約２０ヌクレオチド以上、約２５ヌクレオチド以上、約５０ヌクレオチド以上、約７５ヌクレオチド以上、約１００ヌクレオチド以上、約１５０ヌクレオチド以上、約２００ヌクレオチド以上、約５００ヌクレオチド以上、約１０００ヌクレオチドヌクレオチド以上、またはそれよりも多くのヌクレオチド等の、任意の好適な長さであってもよい。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部分に相補的である。最適にアランメントされたとき、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つまたは複数のヌクレオチドと重複する可能性がある（例えば、約１ヌクレオチド以上、約５ヌクレオチド以上、約１０ヌクレオチド以上、約１５ヌクレオチド以上、約２０ヌクレオチド以上、約２５ヌクレオチド以上、約３０ヌクレオチド以上、約３５ヌクレオチド以上、約４０ヌクレオチド以上、約４５ヌクレオチド以上、約５０ヌクレオチド以上、約６０ヌクレオチド以上、約７０ヌクレオチド以上、約８０ヌクレオチド以上、約９０ヌクレオチド以上、約１００ヌクレオチド以上、またはそれよりも多くのヌクレオチド）。一部の実施形態では、鋳型配列及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアランメントされるとき、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から、約１ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約５０００ヌクレオチド、約１００００ヌクレオチド、またはそれよりも多くのヌクレオチド以内にある。相同組換え法に有用な部位指向性ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、及びメガヌクレアーゼが挙げられる。そのようなヌクレアーゼの使用のさらなる説明については、例えば、ＵＳ８７９５９６５及びＵＳ２０１４０３０１９９０を参照されたい。

【0135】

化学的突然変異原または放射線を含む、主として点突然変異、ならびに短い欠失、挿入、転換、及び／または転移を作出する突然変異原を使用して、遺伝的変異を作出してもよい。突然変異原には、メタンスルホン酸エチル、メタンスルホン酸メチル、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、トリエチルメラミン、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２－アミノプリン、７，１２ジメチル－ベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン等）、２－メトキシ－６－クロロ－９［３－（エチル－２－クロロ－エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、及びホルムアルデヒドが含まれるが、これらに限定されない。

【0136】

遺伝的変異の導入は、処置される細菌集団中の一部の細菌が所望の突然変異を担持する一方で、他の細菌はそれを担持しないような、不完全なプロセスであってもよい。一部の場合では、所望の遺伝的変異を担持する細菌が濃縮されるように、選択圧を加えることが望ましい。慣習的には、成功裏の遺伝的変異の選択には、抗生物質耐性遺伝子を挿入する場合、または非致死性化合物を致死性代謝物へと変換することが可能な代謝活性を消失させる場合等、遺伝的変異によって付与されたまたは消失された何らかの機能性について選択することまたはそれらを除くように選択することを伴っていた。また、所望の遺伝的変異の導入のみが必要とされる（例えば、選択可能マーカーを同時に必要とすることなく）ように、ポリヌクレオチド配列自体に基づく選択圧を加えることも可能である。この場合、選択圧は、遺伝的変異を導入することが求められている参照配列に対して選択が効果的に向けられるように、標的部位に導入される遺伝的変異が欠如したゲノムを切断することを含み得る。典型的には、切断は、標的部位の１００ヌクレオチド以内で生じる（例えば、標的部位での切断または標的部位内での切断を含めて、標的部位から７５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、またはそれよりも少ないヌクレオチド以内）。切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼによって指向されてもよい。そのようなプロセスは、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、標的部位での相同組換えを強化するためのプロセスに類似する。結果として、所望の遺伝的変異が欠如した細菌は、修復されずに細胞死に至る切断を受ける可能性がより高い。次いで、選択を生き抜いた細菌を単離し、植物に曝露して、改善された形質の付与を評価するために使用することができる。

【0137】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼとして使用して、切断を標的部位に指向してもよい。突然変異微生物の選択の改善は、Ｃａｓ９を使用して非突然変異細胞を死滅させることによって得ることができる。次いで、植物に突然変異微生物を接種して共生を再確認し、進化圧を作出して、効率的な共生生物を選択する。次いで、微生物を植物組織から再単離することができる。非変種を除く選択に用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系は、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、遺伝的変異の導入に関して上述したものと同様の要素を用いることができる。故に、標的部位に指向された切断は、影響を受けた細胞の死を強化する。

【0138】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、及びメガヌクレアーゼ等の、標的部位での切断を特異的に誘導するための他の選択肢が利用可能である。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、固有の標的配列を切断することが可能になる。細胞内に導入される場合、ＺＦＮを使用して、二本鎖切断を誘導することによって細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集することができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、事実上任意の所望のＤＮＡ配列に結合するよう迅速に操作することができ、細胞内に導入される場合、ＴＡＬＥＮを使用して、二本鎖切断を誘導することによって細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集することができる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、大型認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを使用して、高度に標的化された方式で配列を置換、排除、または修飾することができる。タンパク質工学によりそれらの認識配列を修飾することによって、標的配列を変更することができる。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、または動物に関わらず、あらゆるゲノムタイプの修飾に使用することができ、一般的に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号１）、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓｔボックスファミリー、及びＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、及びＩ－ＴｅｖＩＩＩが含まれる。

【0139】

遺伝的変異－特定方法
本開示の微生物は、該微生物に導入された１つまたは複数の遺伝子組換えまたは改変によって特定され得る。該遺伝子組換えまたは改変を特定することができる１つの方法は、遺伝子組換えまたは改変を特定するのに十分な微生物のゲノム配列の一部分を含有する配列番号を参照することを介するものである。

【0140】

さらに、遺伝子組換えまたは改変がそれらのゲノムに導入されていない微生物（例えば、野生型、ＷＴ）の場合、本開示では、１６Ｓ核酸配列を利用して、該微生物を特定することができる。１６Ｓ核酸配列は、「分子マーカー」または「遺伝子マーカー」の一例であり、これは核酸配列の特性の差異を可視化するための方法に使用される指標を指す。他のそのような指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入突然変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特性化増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、もしくはアイソザイムマーカー、または具体的な遺伝子及び染色体位置を規定する本明細書に記載のマーカーの組み合わせである。マーカーにはさらに、１６Ｓまたは１８Ｓ ｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び互いに対して比較したときに関係性または区別の解明にとりわけ有用であることが判明している小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子と大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子との間に見出される配列である、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列が含まれる。さらに、本開示は、目的の遺伝子（例えば、ｎｉｆＨ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、ｇｌｎＥ、ａｍｔＢ等）に見出される固有配列を利用して、本明細書に開示される微生物を特定する。

【0141】

主要ｒＲＮＡサブユニット１６Ｓの一次構造は、異なる速度で進化し、ドメイン等の非常に古代の系統、及び属等のより現代的な系統の両方の解像度を有効にする、保存された領域、可変領域、及び超可変領域の特定の組み合わせを含む。１６Ｓサブユニットの二次構造は、残基の約６７％の塩基対合をもたらすおよそ５０個のヘリックスを含む。これらの高度に保存された二次構造特徴は、機能的に非常に重要であり、複数配列アラインメント及び系統学的分析における位置的相同性を確保するために使用することができる。これまで数十年間にわたって、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、最も多く配列決定された分類学的マーカーになっており、細菌及び古細菌の現行の系統的分類の基盤である（Ｙａｒｚａ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．１２：６３５－４５）。

【0142】

故に、ある特定の態様では、本開示は、表２３、２４、２５、及び２６におけるいずれかの配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する配列を提供する。

【0143】

故に、ある特定の態様では、本開示は、配列番号６２～３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する配列を含む微生物を提供する。これらの配列及びそれらの関連する説明は、表２５及び２６に見出すことができる。

【0144】

一部の態様では、本開示は、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７～２８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する１６Ｓ核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列及びそれらの関連する説明は、表２６に見出すことができる。

【0145】

一部の態様では、本開示は、配列番号８６～９５、９７～１１０、１１２～１２０、１２５～１３５、１３７～１４８、１５０～１５６、１５８～１６６、１６８～１７６、２６３～２６８、２７０～２７４、２７５、２７６、２８４～２９５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列及びそれらの関連する説明は、表２６に見出すことができる。

【0146】

一部の態様では、本開示は、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列及びそれらの関連する説明は、表２６に見出すことができる。

【0147】

一部の態様では、本開示は、配列番号３０４～４２４と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物、またはプライマー、またはプローブ、または非天然ジャンクション配列を提供する。これらの配列は、表２７に記載される。

【0148】

一部の態様では、本開示は、配列番号３７２～４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する非天然ジャンクション配列を含む微生物を提供する。これらの配列は、表２７に記載される。

【0149】

一部の態様では、本開示は、配列番号７７、７８、８１、８２、または８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列及びそれらの関連する説明は、表２５に見出すことができる。

【0150】

遺伝的変異－検出方法：プライマー、プローブ、及びアッセイ
本開示は、本明細書で教示される微生物の検出に有用なプライマー、プローブ、及びアッセイを教示する。一部の態様では、本開示は、ＷＴ親菌株を検出するための方法を提供する。他の態様では、本開示は、ＷＴ菌株に由来する操作された非属間微生物を検出するための方法を提供する。複数の態様では、本開示は、微生物において非属間遺伝子改変を特定するための方法を提供する。

【0151】

複数の態様では、本開示のゲノム操作法は、誘導された非属間微生物中の非天然ヌクレオチド「ジャンクション」配列の作出につながる。これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションは、本明細書で教示される微生物における特定の遺伝子改変の存在を示す一種の診断手段として使用することができる。

【0152】

本技法は、固有に設計されたプライマー及びプローブを含む特化した定量的ＰＣＲ法の利用を介して、これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを検出することができる。一部の態様では、本開示のプローブは、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合する。一部の態様では、慣習的なＰＣＲが利用される。他の態様では、リアルタイムＰＣＲが利用される。一部の態様では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が利用される。

【0153】

故に、本開示は、（１）任意の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素、及び（２）プローブがその相補的配列とハイブリダイズした後でのみ検出が可能になる蛍光レポーターで標識されているオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブという、リアルタイムでＰＣＲ産物を検出するための２つの一般的な方法の利用を網羅することができる。一部の態様では、天然に存在しないヌクレオチドジャンクションのみが、教示されるプライマーを介して増幅されることになり、結果的に、非特異的色素、または特異的ハイブリダイゼーションプローブの利用のいずれかを介して検出することができる。他の態様では、本開示のプライマーは、プライマーがジャンクション配列のそれぞれの側に隣接するように選定され、それにより、増幅反応が生じる場合、該ジャンクション配列が存在することになる。

【0154】

本開示の態様は、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列分子それ自体に加えて、穏やかなハイブリダイゼーション条件からストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、該天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能な他のヌクレオチド分子を伴う。一部の態様では、穏やかなハイブリダイゼーション条件からストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、該天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能なヌクレオチド分子は、「ヌクレオチドプローブ」と称される。

【0155】

複数の態様では、ゲノムＤＮＡを試料から抽出し、これを使用して、ｑＰＣＲを使用することによって本開示の微生物の存在を定量することができる。ｑＰＣＲ反応に利用されるプライマーは、野生型ゲノムの固有領域または操作された非属間突然変異体菌株の固有領域を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ（／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／）によって設計されたプライマーであり得る。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ １１７６２１００）キットを使用し、順方向及び逆方向増幅プライマーのみを使用して実施することができる。代替として、Ｋａｐａ Ｐｒｏｂｅ Ｆｏｒｃｅ ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ＫＫ４３０１）を、増幅プライマー、ならびに５’末端のＦＡＭ色素標識、内部のＺＥＮクエンチャー、ならびに３’末端の副溝結合剤及び蛍光クエンチャーを含むＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用することができる。

【0156】

ある特定のプライマー、プローブ、及び非天然ジャンクション配列が、表２７に列挙される。ｑＰＣＲ反応効率は、標的ゲノムに由来する既知量のｇＤＮＡから生成される標準曲線を使用して測定することができる。データは、組織重量及び抽出容量を使用して、生重量１ｇ当たりのゲノムコピー数に正規化することができる。

【0157】

定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、１つまたは複数の核酸配列の増幅をリアルタイムで定量する方法である。ＰＣＲアッセイのリアルタイム定量は、増幅している目的の核酸及び校正標準としての役目を果たし得る適切な対照核酸配列を比較することによって、ＰＣＲ増幅ステップによって生成されている核酸の量の決定を可能にする。

【0158】

ＴａｑＭａｎプローブは、標的核酸配列を定量するために特異性を増加させることを必要とするｑＰＣＲアッセイで利用されることが多い。ＴａｑＭａｎプローブは、フルオロフォアがプローブの５’末端に付着され、クエンチャーが３’末端に付着されたオリゴヌクレオチドプローブを含む。ＴａｑＭａｎプローブが、プローブの５’末端及び３’末端が互いに緊密に接触した状態でそのまま留まる場合、クエンチャーは、フルオロフォアからの蛍光シグナル伝達を阻止する。ＴａｑＭａｎプローブは、特異的なプライマーセットによって増幅される核酸領域内にアニーリングするように設計されている。Ｔａｑポリメラーゼが、プライマーを伸長し、新生鎖を合成するときに、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にアニーリングしたプローブが分解される。このプローブ分解によりフルオロフォアが放出されるため、クエンチャーへの緊密な近接が断たれ、フルオロフォアの蛍光が可能になる。ｑＰＣＲアッセイで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォア及び反応中に存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。

【0159】

ｑＰＣＲのこの特徴は、実施者が、慣習的なＰＣＲアッセイの増幅産物の観察に一般に必要とされる労働集約的なゲル電気泳動調製の増幅後ステップを排除することを可能にする。従来のＰＣＲを上回るｑＰＣＲの有益性は大きく、これには、速度の増加、使いやすさ、再現性、及び定量能力が含まれる。

【0160】

形質の改善
本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または改善するために用いられてもよい。導入または改善され得る形質の例としては、根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収量、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、及びプロテオーム発現が挙げられる。植物丈、全体的バイオマス、根及び／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数もしくは質量、植物穀物もしくは果実の収量、葉の葉緑素含量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組み合わせを含めた、望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された参照農業植物（例えば、改善された形質を有しない植物）の成長速度と比較することができる。

【0161】

導入または改善される好ましい形質は、本明細書に記載されるような窒素固定である。一部の場合では、本明細書に記載の方法から生じる植物は、同じ土壌条件下で栽培された参照農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。追加の例では、本明細書に記載の方法から生じる植物は、類似の土壌条件下で栽培された参照農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。

【0162】

改善されることになる形質は、１つまたは複数の生物ストレス因子または非生物ストレス因子を適用することを含む条件下で評価されてもよい。ストレス因子の例としては、非生物ストレス（熱ストレス、塩ストレス、干ばつストレス、寒冷ストレス、及び低栄養ストレス等）及び生物ストレス（線虫ストレス、昆虫草食ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス、及びウイルス病原体ストレス等）が挙げられる。

【0163】

本開示の方法及び組成物によって改善された形質は、以前は窒素固定が可能ではなかった植物における窒素固定を含めた、窒素固定であってもよい。一部の場合では、本明細書に記載の方法により単離された細菌は、植物の窒素の１％以上（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれよりも多く）を産生し、これは、任意の遺伝的変異を導入する前の第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれよりも多く）の窒素固定能の増加に相当し得る。一部の場合では、細菌は、植物の窒素の５％以上を産生する。所望のレベルの窒素固定は、遺伝的変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、及び改善された形質を有する植物から細菌を単離するステップを、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で達成されてもよい。一部の場合では、強化されたレベルの窒素固定は、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源を補充した肥料の存在下で達成される。窒素固定の程度を評価するための方法は既知であり、それらの例が本明細書に記載される。

【0164】

微生物育種は、作物マイクロバイオーム内の種の役割を系統的に特定及び改善するための方法である。この方法は、１）植物－微生物間相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連付けられる調節ネットワークを予測することによって候補種を選択すること、２）調節ネットワーク及び遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的かつ予測可能に改善すること、ならびに３）所望の作物表現型をもたらす新たな微生物遺伝子型をスクリーニング及び選択すること、の３つのステップを含む。菌株の改善を系統的に評価するために、微生物群落のコロニー形成動力学を主要な種による遺伝子活性に結び付けるモデルを作出する。このモデルを使用して、育種のための遺伝子標的を予測し、農学的に関連性のあるマイクロバイオームコード形質の改善の選択頻度を改善する。

【0165】

農業的に関連性のある圃場背景で送達された窒素の測定
圃場では、送達された窒素の量は、コロニー形成に活性を乗じた関数によって決定することができる。

【数1】

【0166】

上記の数式は、（１）植物組織１単位当たりの平均コロニー形成、及び（２）固定窒素の量または各微生物細胞によって排泄されたアンモニアの量のいずれかとしての活性を必要とする。１エーカー当たりの窒素のポンドに変換するために、トウモロコシ成長生理学、例えば植物のサイズ及び関連する根系を、成熟期全体にわたって経時的に追跡する。

【0167】

１エーカー－季節当たりの作物に送達された窒素のポンドは、以下の数式によって算出することができる。

【数2】

【0168】

植物組織（ｔ）は、栽培時間（ｔ）にわたるトウモロコシ植物組織の生重量である。合理的に算出を行うための値は、Ｒｏｏｔｓ，Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｕｐｔａｋｅ（Ｍｅｎｇｅｌ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ Ｐｕｂ．＃ ＡＧＲＹ－９５－０８（Ｒｅｖ．Ｍａｙ－９５．ｐ．１－８．）と題される刊行物に詳述される。

【0169】

コロニー形成（ｔ）は、成長季節中の任意の特定の時間ｔにおける、植物組織の生重量１グラム当たりの植物組織内に見出される目的の微生物の量である。単一時点のみが利用可能である場合、その単一時点が、季節全体のピークコロニー形成速度として正規化され、残りの時点のコロニー形成速度は、それに応じて調整される。

【0170】

活性（ｔ）は、成長季節中の任意の特定の時間ｔにおいて、Ｎが、目的の微生物によって１単位時間当たりに固定される速度である。本明細書に開示される実施形態では、この活性速度は、５ｍＭグルタミン存在下のＡＲＡ培地でのインビトロアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）、または５ｍＭアンモニウムイオンの存在下のＡＲＡ培地でのアンモニウム排泄アッセイによって近似される。

【0171】

次いで、上記の関数を数値積分することによって窒素送達量を算出する。上述の変数の値が、設定された時点で個別に測定される場合、それらの時点間の値は、線形補間を実施することによって近似される。

【0172】

窒素固定
本明細書では、植物における窒素固定を増加させる方法であって、植物を、窒素固定を調節する１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝的変異を含む細菌に曝露することを含み、細菌が、植物における窒素の１％以上（例えば、２％、５％、１０％、またはそれよりも多く）を産生し、この産生が、細菌の不在下での植物と比較して、少なくとも２倍の窒素固定能に相当し得る、該方法が記載される。細菌は、グルタミン、尿素、硝酸塩、またはアンモニアを補充した肥料の存在下で窒素を産生し得る。遺伝的変異は、上記で提供した例を任意の数及び任意の組み合わせで含む、本明細書に記載の任意の遺伝的変異であり得る。遺伝的変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、及びｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子に導入されてもよい。遺伝的変異は、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの増加した発現もしくは活性；ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢの減少した発現もしくは活性；ＧｌｎＥの減少したアデニリル除去活性；またはＧｌｎＤの減少したウリジリル除去活性のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい。本明細書に開示される方法の１つまたは複数の細菌に導入された遺伝的変異は、ノックアウト突然変異であってもよいし、またはそれは、標的遺伝子の調節配列を消失させてもよいし、またはそれは、異種調節配列の挿入、例えば、同じ細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列の挿入を含んでもよい。調節配列は、細菌培養物中のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選定され得る。遺伝的変異は、化学的突然変異誘発によってもたらされてもよい。ステップ（ｃ）で栽培された植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露してもよい。

【0173】

本明細書に記載の植物に生じる窒素固定の量は、いくつかの方法で、例えば、アセチレン還元（ＡＲ）アッセイによって測定されてもよい。アセチレン還元アッセイは、インビトロまたはインビボで実施することができる。特定の細菌が植物に固定窒素を提供している証拠としては、１）接種すると、総計植物Ｎが顕著に増加し、好ましくはそれに伴って植物におけるＮ濃度が増加すること、２）接種すると、窒素欠乏症状がＮ制限条件下で緩和されること（これには乾燥物質の増加が含まれるべきである）、３）Ｎ_２固定が、^１５Ｎ手法（これは同位体希釈実験、^１５Ｎ_２還元アッセイ、または^１５Ｎ天然存在量アッセイであり得る）の使用により確認されること、４）固定Ｎが、植物タンパク質または代謝物に組み込まれること、及び５）これら効果の全てが、未接種の植物または接種菌株の突然変異体を接種した植物で見られるものではないこと、が挙げられ得る。

【0174】

野生型の窒素固定調節カスケードは、入力Ｏ_２及びＮＨ_４ ^＋がＮＯＲゲートを通過し、その出力が、ＡＴＰに加えてＡＮＤゲートに入力されるデジタル論理回路として表すことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、微生物が施肥圃場であっても窒素を産生することができるように、この回路に対するＮＨ_４ ^＋の影響を調節カスケードの複数地点で妨害する。しかしながら、本明細書に開示される方法はまた、この回路に対するＡＴＰもしくはＯ_２の影響を変化させること、または回路を細胞における他の調節カスケードと置換すること、または窒素固定以外の遺伝子回路を変化させることも想定する。異種調節系の制御下で機能性産物を生成するように遺伝子クラスターを再操作することができる。遺伝子クラスターのコード配列の外部及び内部の天然調節要素を排除し、それらを代替の調節系と置換することによって、複雑な遺伝子オペロン及び他の遺伝子クラスターの機能性産物を制御することができ、及び／または天然遺伝子が由来していた種以外の異なる種の細胞を含めた異種細胞に移動させることができる。ひとたび再操作されると、合成遺伝子クラスターは、遺伝子回路または他の誘導可能な調節系によって制御され、それによって産物の発現を所望通りに制御することができる。発現カセットを、ロジックゲート、パルス発生器、発振器、スイッチ、またはメモリデバイスとして作用するように設計することができる。制御性発現カセットは、発現カセットが、酸素、温度、接触、浸透圧ストレス、膜ストレス、または酸化還元センサ等の環境センサとして機能するように、プロモーターに連結されてもよい。

【0175】

例として、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＴ、及びｎｉｆＸ遺伝子をｎｉｆ遺伝子クラスターから排除することができる。各アミノ酸配列をコードするＤＮＡをコドンランダム化することによって、合成遺伝子を設計することができる。コドン使用頻度を天然遺伝子のコドン使用頻度からできるだけ逸脱するよう指定しながら、コドン選択を実施する。提案された配列を、制限酵素認識部位、トランスポゾン認識部位、反復配列、シグマ５４及びシグマ７０プロモーター、潜在性リボソーム結合部位、ならびにｒｈｏ非依存性ターミネーター等の、一切の望まれない特徴について走査する。合成リボソーム結合部位を、遺伝子の開始コドンを取り囲む１５０ｂｐ（－６０～＋９０）が蛍光遺伝子に融合されている蛍光レポータープラスミドを構築すること等によって、各々対応する天然リボソーム結合部位の強度と一致するように選定する。このキメラをＰｔａｃプロモーターの制御下で発現させ、フローサイトメトリーを介して蛍光を測定することができる。合成リボソーム結合部位を生成するために、合成発現カセットの１５０ｂｐ（－６０～＋９０）を使用するレポータープラスミドのライブラリーを生成する。手短に述べると、合成発現カセットは、ランダムＤＮＡスペーサー、ＲＢＳライブラリーをコードする縮重配列、及び各合成遺伝子のコード配列からなり得る。複数のクローンをスクリーニングして、天然リボソーム結合部位に最も良好に一致した合成リボソーム結合部位を特定する。このようにして天然オペロンと同じ遺伝子からなる合成オペロンを構築し、機能的な相補性について試験する。合成オペロンのさらなる例示的な説明は、ＵＳ２０１４０３２９３２６に提供される。

【0176】

細菌種
本明細書に開示される方法及び組成物に有用な微生物は、任意の供給源から得てもよい。一部の場合では、微生物は、細菌、古細菌、原生動物、または真菌であってもよい。本開示の微生物は、窒素固定微生物、例えば、窒素固定細菌、窒素固定古細菌、窒素固定真菌、窒素固定酵母、または窒素固定原生動物であってもよい。本明細書に開示される方法及び組成物に有用な微生物は、胞子形成微生物、例えば、胞子形成細菌であってもよい。一部の場合では、本明細書に開示される方法及び組成物に有用な細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。一部の場合では、細菌は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門の内生胞子形成細菌であってもよい。一部の場合では、細菌は、ジアゾトロフであってもよい。一部の場合では、細菌は、ジアゾトロフでない場合がある。

【0177】

本開示の方法及び組成物は、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ等の古細菌と共に使用されてもよい。

【0178】

一部の場合では、有用であり得る細菌には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｉｚａｗａｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｂｏｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｉｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓとしても知られる）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（同義語：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｄｏｒｈｙｔｈｍｏｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｄｕｓａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｄｏｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｕｒｓｔａｋｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｃｏｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓとしても知られる）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｒｏｃｃａｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｍａｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｇｒｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｎｉｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ（以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ（以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｕｓｇａｅ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ（以前はＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ（以前はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａとして知られていた）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｒｏｒａｄｉｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒａｓｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓａｒａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ ＡＱ７１９（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ－２１６６３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌種ＡＱ１７５（ＡＴＣＣ受託番号５５６０８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌種ＡＱ１７７（ＡＴＣＣ受託番号５５６０９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌種ＡＱ１７８（ＡＴＣＣ受託番号５３５２２）、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌種菌株ＮＲＲＬ受託番号Ｂ－３０１４５が含まれるが、これらに限定されない。一部の場合では細菌は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂｃｔｅｒ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉであり得る。

【0179】

一部の場合では、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの種、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍであり得る。

【0180】

一部の場合では、本開示の方法及び組成物と共に使用される細菌は、シアノバクテリアであってもよい。シアノバクテリア属の例としては、Ａｎａｂａｅｎａ（例えば、Ａｎａｇａｅｎａ菌種ＰＣＣ７１２０）、Ｎｏｓｔｏｃ（例えば、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ菌種ＰＣＣ６８０３）が挙げられる。

【0181】

一部の場合では、本開示の方法及び組成物と共に使用される細菌は、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ門、例えば、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍに属していてもよい。

【0182】

一部の場合では、本開示の方法及び組成物と共に使用される微生物は、既知のＮｉｆＨ遺伝子と相同性である遺伝子を含んでもよい。既知のＮｉｆＨ遺伝子の配列は、例えば、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（：／／ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）、またはＢｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（：／／ｗｗｗ．ｃｓｓ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｂｕｃｋｌｅｙ／ｎｉｆｈ．ｈｔｍ、及びＧａｂｙ，Ｊｏｈｎ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ．“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．”Ｄａｔａｂａｓｅ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１）に見出すことができる。一部の場合では、本開示の方法及び組成物と共に使用される微生物は、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。一部の場合では、本開示の方法及び組成物と共に使用される微生物は、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（Ｇａｂｙ，Ｊｏｈｎ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ．“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．”Ｄａｔａｂａｓｅ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。

【0183】

本明細書に開示される方法及び組成物に有用な微生物は、天然植物の表面もしくは組織から微生物を抽出することによって；種子を粉砕して微生物を単離することによって；多様な土壌試料に種子を植栽し、組織から微生物を回収することによって；または植物に外因性微生物を接種し、どの微生物が植物組織に出現するか決定することによって、得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、塊茎、根、及び根茎が挙げられる。一部の場合では、細菌は、種子から単離される。試料を処理するためのパラメータを変化させて、根圏菌、着生菌、または内部寄生菌等の、異なるタイプの付随性微生物を単離してもよい。また、細菌は、第１の植物から最初に単離する代わりに、環境菌株コレクション等のレポジトリを供給源としてもよい。微生物は、単離された微生物のゲノムを配列決定することにより；植物内群落の組成物をプロファイリングすることにより；群落もしくは単離された微生物のトランスクリプトーム機能性を特性評価することにより；または選択培地もしくは表現型培地（例えば、窒素固定またはリン酸可溶化表現型）を使用して微生物の特徴をスクリーニングすることにより、遺伝子型及び表現型を決定することができる。選択された候補菌株または集団は、配列データ；表現型データ；植物データ（例えば、ゲノム、表現型、及び／または収量データ）；土壌データ（例えば、ｐＨ、Ｎ／Ｐ／Ｋ含量、及び／またはバルク土壌生物群落）；またはこれらの任意の組み合わせにより得ることができる。

【0184】

本明細書に記載の細菌及び細菌を生産するための方法は、有害な植物防御反応を誘導することなく葉表面、根表面、もしくは内部植物組織で効率的に自己増殖することが可能な細菌、または植物防御応答に耐性である細菌に施用されてもよい。本明細書に記載の細菌は、窒素が添加されていない培地で植物組織抽出物または葉表面洗浄液を培養することによって単離されてもよい。しかしながら、細菌は、培養可能でない場合があり、すなわち、培養可能であることが知られていないか、または当該技術分野で既知の標準的方法を使用しては培養が困難である場合がある。本明細書に記載の細菌は、内部寄生菌、または着生菌、または植物根圏に生息する細菌（根圏細菌）であってもよい。遺伝的変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、及び改善された形質を有する植物から細菌を単離するステップを、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で得られる細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性であってもよい。内部寄生菌は、病害症状を引き起こすことなく、または共生構造の形成を誘発することなく、植物の内部に侵入する生物であり、植物成長を強化し、植物の栄養を改善する（例えば、窒素固定により）ことができるため農耕学的な関心対象となっている。細菌は、種子伝染性内部寄生菌であり得る。種子伝染性内部寄生菌には、成熟し乾燥した無損傷の（例えば、ひび割れ、目に見える真菌性感染、または早期発芽がない）種子に見出される種子伝染性細菌性内部寄生菌等の、イネ科草本または植物の種子に結び付いているまたはそれに由来する細菌が含まれる。また、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、種子の表面に結び付いているまたはそれに由来する場合があり、代替として、またはそれに加えて、それは（例えば、表面滅菌種子の）内部種子区画に結び付いているまたはそれに由来する場合がある。一部の場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、植物組織内で、例えば種子の内部で複製することが可能である。また、一部の場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、乾燥化しても生存することができる。

【0185】

本開示の方法により単離される、または本開示の方法もしくは組成物において使用される細菌は、複数の異なる細菌分類群を組み合わせで含むことができる。例として、細菌には、プロテオバクテリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びＨａｌｏｍｏｎａｓ等）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、及びＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ等）、及びアクチノバクテリア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ等）が含まれてもよい。本開示の方法及び組成物で使用される細菌は、２つ以上の種の窒素固定細菌コンソーシアを含んでもよい。一部の場合では、細菌コンソーシアの１つまたは複数の細菌種は、窒素を固定することが可能であってもよい。一部の場合では、細菌コンソーシアの１つまたは複数の種は、窒素を固定する他の細菌の能力を促進または強化してもよい。窒素を固定する細菌及び窒素を固定する他の細菌の能力を強化する細菌は、同じであっても、または異なってもよい。一部の例では、細菌株は、異なる細菌株と組み合わせたときに、またはある特定の細菌コンソーシアにおいて、窒素を固定することができる場合があるが、単一培養では窒素を固定することができない場合がある。窒素固定細菌コンソーシアに見出され得る細菌属の例としては、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、及びＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0186】

本明細書に開示される方法によって生産することができる細菌には、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ菌種、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌種、及びＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌種が含まれる。一部の場合では、細菌は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉからなる群から選択され得る。一部の場合では、細菌は、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒまたはＲａｈｎｅｌｌａ属のものであり得る。一部の場合では、細菌は、ＦｒａｎｋｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のものであり得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｉｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが挙げられるが、これらに限定されない。一部の場合では、細菌は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属のもの、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ亜種、Ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ亜種、Ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｏｒｉａｅ、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａであり得る。

【0187】

一部の例では、本開示の方法により単離された細菌は、以下の分類群、すなわち、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｚ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｆｉｐｉａ、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｔｏｐｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ、Ｂｏｓｅａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｈａｌｏｒｅｄｉｖｉｖｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒａｌｉｏｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｄｅｓｅｍｚｉａ、Ｄｅｖｏｓｉａ、Ｄｏｋｄｏｎｅｌｌａ、Ｄｙｅｌｌａ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ／Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｌｉｍｏｎａｓ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ、Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｆｎｉａ、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｈａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｌｅｎｔｚｅａ、Ｌｕｔｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ、Ｍａｓｓｉｌｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｇａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｃｅａｎｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、Ｏｋｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ、Ｏｒｙｚｉｈｕｍｕｓ、Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｅｏａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｅｒｌｕｃｉｄｉｂａｃａ、Ｐｌａｎｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｈｉｎｅｌｌａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、２５ Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ、Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ、Ｔａｔｕｍｅｌｌａ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎａｓ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、ＷＰＳ－２ ｇｅｎｅｒａ ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎｅｌｌａのうちの１つまたは複数の成員であり得る。

【0188】

一部の場合では、以下の属、すなわち、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、及びＲａｈｎｅｌｌａのうちの少なくとも１つから選択される細菌種が利用される。一部の場合では、以下の属、すなわち、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、及びＲａｈｎｅｌｌａに由来する細菌種の組み合わせが利用される。一部の場合では、利用される種は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、及びＲａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓのうちの１つまたは複数であり得る。

【0189】

一部の場合では、グラム陽性微生物は、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＸ、ｈｅｓＡ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＩ１、及びｎｉｆＩ２を含む、モリブデン－鉄ニトロゲナーゼ系を有してもよい。一部の場合では、グラム陽性微生物は、ｖｎｆＤＧ、ｖｎｆＫ、ｖｎｆＥ、ｖｎｆＮ、ｖｕｐＣ、ｖｕｐＢ、ｖｕｐＡ、ｖｎｆＶ、ｖｎｆＲ１、ｖｎｆＨ、ｖｎｆＲ２、ｖｎｆＡ（転写調節因子）を含む、バナジウムニトロゲナーゼ系を有してもよい。一部の場合では、グラム陽性微生物は、ａｎｆＫ、ａｎｆＧ、ａｎｆＤ、ａｎｆＨ、ａｎｆＡ（転写調節因子）を含む、鉄のみのニトロゲナーゼ系を有してもよい。一部の場合ではグラム陽性微生物は、ｇｌｎＢ及びｇｌｎＫ（窒素シグナル伝達タンパク質）を含むニトロゲナーゼ系を有してもよい。グラム陽性微生物の窒素代謝に関与する酵素の一部の例としては、ｇｌｎＡ（グルタミン合成酵素）、ｇｄｈ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、ｂｄｈ（３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ）、グルタミナーゼ、ｇｌｔＡＢ／ｇｌｔＢ／ｇｌｔＳ（グルタミン酸合成酵素）、ａｓｎＡ／ａｓｎＢ（アスパラギン酸－アンモニアリガーゼ／アスパラギン合成酵素）、及びａｎｓＡ／ａｎｓＺ（アスパラギナーゼ）が挙げられる。グラム陽性微生物の窒素輸送に関与するタンパク質の一部の例としては、ａｍｔＢ（アンモニウムトランスポーター）、ｇｌｎＫ（アンモニウム輸送の調節因子）、ｇｌｎＰＨＱ／ｇｌｎＱＨＭＰ（ＡＴＰ依存性グルタミン／グルタミン酸トランスポーター）、ｇｌｎＴ／ａｌｓＴ／ｙｒｂＤ／ｙｆｌＡ（グルタミン様プロトン共輸送トランスポーター）、及びｇｌｔＰ／ｇｌｔＴ／ｙｈｃｌ／ｎｑｔ（グルタミン酸様プロトン共輸送トランスポーター）が挙げられる。

【0190】

特に関心対象となり得るグラム陽性微生物の例としては、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｉｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｆｒａｎｋｉａ菌種、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｈｅｌｉｏｐｈｉｌｕｍ菌種、Ｈｅｌｉｏｒｅｓｔｉｓ菌種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ菌種、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ菌種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｉｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｓｐｏｒａ菌種、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ菌種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌種、及びＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種が挙げられる。

【0191】

グラム陽性微生物において行われ得る遺伝子改変の一部の例としては、ｇｌｎＲを欠失させて、環境中の窒素の存在下でのＢＮＦの負の調節を除去すること、ｎｉｆクラスターのすぐ上流に異なるプロモーターを挿入して、環境中の窒素に応答したＧｌｎＲによる調節を除去すること、ｇｌｎＡを突然変異させて、ＧＳ－ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化の速度を低減すること、ａｍｔＢを欠失させて、培地からのアンモニウムの取り込みを低減すること、ｇｌｎＡを突然変異させ、それによりそれを構成的にフィードバック阻害（ＦＢＩ－ＧＳ）状態にして、ＧＳ－ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化を低減することが挙げられる。

【0192】

一部の場合では、ｇｌｎＲは、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種におけるＮ代謝及び固定の主要な調節因子である。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＲを産生するための遺伝子を含有しない場合がある。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＥまたはｇｌｎＤを産生するための遺伝子を含有しない場合がある。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含有し得る。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ菌種ＷＬＹ７は、ｇｌｎＢの遺伝子、または古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに見出されるそのホモログであるｎｉｆＩ１及びｎｉｆＩ２を含有しない。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、様々であってもよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｉｘａ Ｅ６８１は、ｇｌｎＫ及びｇｄｈを欠如し、いくつかの窒素化合物トランスポーターを有するが、ａｍｔＢのみが、ＧｌｎＲによって制御されるようである。別の例では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ菌種ＪＤＲ２は、ｇｌｎＫ、ｇｄｈ、及びほとんどの他の中心的な窒素代謝遺伝子を有し、はるかにより少ない窒素化合物トランスポーターを有するが、ＧｌｎＲによって制御されるｇｌｎＰＨＱを有する。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ ＳＢＲ５は、標準ｇｌｎＲＡオペロン、ｆｄｘ遺伝子、主要ｎｉｆオペロン、二次ｎｉｆオペロン、及びａｎｆオペロン（鉄のみのニトロゲナーゼをコードする）を含有する。推定上のｇｌｎＲ／ｔｎｒＡ部位が、これらのオペロンの各々の上流に見出された。ＧｌｎＲは、ａｎｆオペロンを除き、上記のオペロンの全てを調節し得る。ＧｌｎＲは、二量体として、これらの調節配列の各々に結合し得る。

【0193】

Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ Ｎ固定菌株は、最小限のｎｉｆ遺伝子クラスターのみを含有する亜群Ｉ、ならびに最小限のクラスターに加えて、ｎｉｆＸとｈｅｓＡとの間にある特性評価されていない遺伝子、及び多くの場合、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＨＤＫ、ｎｉｆＢＥＮ等のｎｉｆ遺伝子の一部が重複している他のクラスター、またはバナジウムニトロゲナーゼ（ｖｎｆ）もしくは鉄のみの（ｉｒｏｎ－ｏｎｌｙ）ニトロゲナーゼ（ａｎｆ）遺伝子をコードするクラスターを含有する亜群ＩＩの２つの亜群に分類され得る。

【0194】

一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含有しない場合がある。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ－７０プロモーターから転写される９つの遺伝子を有する最小限のｎｉｆクラスターを含有し得る。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｆクラスターは、窒素または酸素によって負に調節されてもよい。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ－５４を産生するための遺伝子を含有しない場合がある。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ菌種ＷＬＹ７８は、シグマ－５４の遺伝子を含有しない。一部の場合では、ｎｉｆクラスターは、ｇｌｎＲ、及び／またはＴｎｒＡによって調節されてもよい。一部の場合では、ｎｉｆクラスターの活性が、ｇｌｎＲ、及び／またはＴｎｒＡの活性を改変することによって改変され得る。

【0195】

Ｂａｃｉｌｌｉでは、グルタミン合成酵素（ＧＳ）は、高濃度の細胞内グルタミンによってフィードバック阻害され、確認のシフト（ｓｈｉｆｔ ｉｎ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を引き起こす（ＦＢＩ－ＧＳと称される）。Ｎｉｆクラスターは、いくつかのＢａｃｉｌｌｉ種では、調節因子ＧｌｎＲ及びＴｎｒＡに対して別々の結合部位を含有する。ＧｌｎＲは、過剰な細胞内グルタミン及びＡＭＰの存在下で結合し、遺伝子発現を抑制する。ＧｌｎＲの役割は、高窒素利用可能条件下で、グルタミン及びアンモニウムの流入及び細胞内産生を防止することであり得る。ＴｎｒＡは、限定的な細胞内グルタミンの存在下及び／またはＦＢＩ－ＧＳの存在下で結合し得、及び／または遺伝子発現を活性化（または抑制）し得る。一部の場合では、Ｂａｃｉｌｌｉ ｎｉｆクラスターの活性は、ＧｌｎＲの活性を改変することによって改変され得る。

【0196】

フィードバック阻害されたグルタミン合成酵素（ＦＢＩ－ＧＳ）は、ＧｌｎＲに結合し、認識配列に対するＧｌｎＲの結合を安定化し得る。いくつかの細菌種は、ｎｉｆクラスターの上流にＧｌｎＲ／ＴｎｒＡ結合部位を有する。ＦＢＩ－ＧＳ及びＧｌｎＲの結合を改変することにより、ｎｉｆ経路の活性が改変され得る。

【0197】

微生物の供給源
細菌（または本開示による任意の微生物）は、その土壌、植物、真菌、動物（無脊椎動物を含む）、ならびに湖及び川の堆積物、水、及び生物相を含む他の生物相を含めた、任意の一般的陸生環境；海洋環境、その生物相及び堆積物（例えば、海水、海泥、海洋植物、海洋無脊椎動物（例えば、海綿動物）、海洋脊椎動物（例えば、魚類））；陸生及び海洋性地圏（表土及び岩石、例えば、粉砕された地中岩石、砂、及び粘土）；氷雪圏及びその融雪氷水；大気（例えば、濾過空気粉塵、雲、及び雨滴）；都市環境、工業環境、及び他の人為的環境（例えば、コンクリート、道路側溝、屋根表面、及び道路表面に蓄積された有機物及び鉱物質）から得られてもよい。

【0198】

細菌（または本開示による任意の微生物）が得られる植物は、１つまたは複数の望ましい形質を有する植物、例えば、特定の環境でまたはある特定の目的の条件下で自然に成長する植物であってもよい。例として、ある特定の植物は、砂質土壌及び高塩分の砂地で、もしくは極端な温度下で、もしくは水がほとんどなくとも自然に成長する場合があり、またはそれは、環境に存在するある特定の有害生物もしくは病害に耐性であり得、商品作物がそのような条件下で成長することが望ましい場合があり、例えば、そのような条件が特定の地理的位置において利用可能な唯一の条件である場合は特に、望ましい場合がある。さらなる例として、細菌は、そのような環境で栽培された商品作物から、またはより具体的には、任意の特定の環境で栽培された作物の中でも目的の形質を最も良好に示す個々の作物植物、例えば、塩分制限土壌で栽培された作物の中でも最も迅速に成長する植物、または深刻な虫害もしくは病害流行に曝露された作物のうち最も被害が少なかった植物、または繊維含量及び油分含量等を含めた、ある特定の代謝物及び他の化合物の所望の量を有する植物、または望ましい色、味、もしくは匂いを示す植物から収集されてもよい。細菌は、先に言及したような環境の真菌及び他の動物相及び植物相、土壌、水、堆積物、ならびに他の要素を含む、目的の環境に生じる目的の植物または任意の材料から収集されてもよい。

【0199】

細菌（または本開示による任意の微生物）は、植物組織から単離されてもよい。この単離は、例えば、根、茎及び葉、ならびに植物生殖組織を含む、植物の任意の適切な組織から行われ得る。例として、植物から単離するための従来の方法は、典型的には、目的の植物材料（例えば、根または茎長、葉）を滅菌切除し、適切な溶液（例えば、２％次亜塩素酸ナトリウム）で表面を滅菌し、その後、植物材料を微生物増殖用の栄養培地に配置することを含む。代替として、表面を滅菌した植物材料を滅菌液（通常は水）中で粉砕し、粉砕した植物材料の小片を含む懸濁液を、選択的である場合もそうでない場合もある（例えば、リンの供給源としてフィチン酸のみを含有する）好適な固体寒天培地（単数または複数）の表面に播種することができる。この手法は、単離されたコロニーを形成し、個々に摘取して栄養培地のプレートから分離することができ、さらに周知の方法によって単一種に精製することができる細菌にとりわけ有用である。代替として、植物根または葉試料を表面滅菌せず、穏やかな洗浄のみを行うことにより、表面に生息する着生微生物を単離プロセスに含めてもよいし、または植物の根、茎、もしくは葉の小片を寒天培地の表面に押しつけてから離し、次いで上記のように個々のコロニーを単離することによって、着生微生物を別個に単離することができる。この手法は、例えば、細菌にとりわけ有用である。代替として、根に付着している少量の土を洗い流さずに、故に植物根圏でコロニー形成する微生物を含めて、根を処理してもよい。そうでなければ、根に接着している土を取り出し、希釈し、好適な選択的及び非選択的培地の寒天上に播種して、根圏細菌の個々のコロニーを単離することができる。

【0200】

特許手続きのための微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約（ＢＵＤＡＰＥＳＴ ＴＲＥＡＴＹ ＯＮ ＴＨＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ ＯＦ ＴＨＥ ＤＥＰＯＳＩＴ ＯＦ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＵＲＰＯＳＥ ＯＦ ＰＡＴＥＮＴ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ）
本開示の微生物寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条項に基づいてなされた。

【0201】

出願人は、米国特許規則第１．８０８条（ａ）（２）に準じて、「寄託された物質の公的な入手可能性に対して寄託者により課された全ての制限は、特許付与時に変更不能に取り除かれることになる」ことを申し立てる。この陳述は、この項の段落（ｂ）（すなわち、米国特許規則第１．８０８条（ｂ））に従うものとする。

【0202】

Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉは、現在はＫｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉとして再分類されており、この生物の名称は、本稿全体にわたって互換的に使用される場合がある。

【0203】

本開示の多くの微生物は、２つの野生型菌株に由来する。菌株ＣＩ００６は、以前はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（前述のＫｏｓａｋｏｎｉａへの再分類を参照されたい）に分類されていた細菌種である。菌株ＣＩ０１９は、Ｒａｈｎｅｌｌａ属に分類されている細菌種である。ＣＩ００６ Ｋｏｓａｋｏｎｉａ野生型（ＷＴ）及びＣＩ０１９ Ｒａｈｎｅｌｌａ ＷＴの寄託情報は、下記の表１に見出される。

【0204】

本出願に記載される一部の微小生物は、２０１７年１月６日または２０１７年８月１１日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託された。前述のように、寄託は全て、特許手続きのための微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項に基づいてなされた。前述のブダペスト条約寄託に関する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ受託番号及び寄託日は、表１に提供される。

【0205】

Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ（ＷＴ）、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ（ＷＴ）、及び変種／リモデリングされたＫｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１月６日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託表示番号第２０１７０１００１号、第２０１７０１００３号、及び第２０１７０１００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。

【0206】

変種／リモデリングされたＫｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託表示番号第２０１７０８００４号、第２０１７０８００３号、及び第２０１７０８００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。

【0207】

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ（ＷＴ）の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、ＮＣＭＡ特許寄託表示番号第２０１７０８００１号が割り当てられた。変種／リモデリングされた２つのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１２月２０日に、６０ Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託表示番号第２０１７１２００１号及び第２０１７１２００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。

【表1】

【0208】

単離された生物学的に純粋な微小生物
本開示は、ある特定の実施形態では、とりわけ農業に用途を有する、単離された生物学的に純粋な微小生物を提供する。開示される微小生物は、単離された生物学的に純粋な状態で利用することができると同時に、組成物に製剤化することができる（例示的な組成物の説明については、下記の節を参照されたい）。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微小生物の少なくとも２つの成員を含む微生物組成物、ならびに該微生物組成物を利用する方法を提供する。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微生物の利用を介して植物中の窒素固定を調節する方法を提供する。

【0209】

一部の態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表１からのものである。他の態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表１の微小生物に由来する。例えば、表１からの微小生物の菌株、子孫、突然変異体、または派生物が、本明細書に提供される。本開示では、表１に列挙される微生物のあらゆる考えられる組み合わせが企図され、該組み合わせが微生物コンソーシアを形成することがある。表１からの微生物は、個々にまたは任意の組み合わせのいずれかで、本開示で言及される任意の植物、活性分子（合成、有機等）、アジュバント、担体、補助剤、または生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と組み合わせることができる。

【0210】

一部の態様では、本開示は、表２～８に群分けされる種を含む微生物組成物を提供する。一部の態様では、種々の微生物種を含むこれらの組成物は、微生物コンソーシアまたはコンソーシアムと呼ばれる。

【0211】

表２～８に関して、Ａ～Ｉの文字は、下記のように定義される、本開示の微小生物の非限定的な選択を表す。

【0212】

Ａ＝表１で特定される受託番号２０１７０１００１を有する微生物。

【0213】

Ｂ＝表１で特定される受託番号２０１７０１００３を有する微生物。

【0214】

Ｃ＝表１で特定される受託番号２０１７０１００２を有する微生物。

【0215】

Ｄ＝表１で特定される受託番号２０１７０８００４を有する微生物。

【0216】

Ｅ＝表１で特定される受託番号２０１７０８００３を有する微生物。

【0217】

Ｆ＝表１で特定される受託番号２０１７０８００２を有する微生物。

【0218】

Ｇ＝表１で特定される受託番号２０１７０８００１を有する微生物。

【0219】

Ｈ＝表１で特定される受託番号２０１７１２００１を有する微生物。

【0220】

Ｉ＝表１で特定される受託番号２０１７１２００２を有する微生物。

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【0221】

一部の実施形態では、微生物組成物は、表２～８からの任意の成員から選択されてもよい。

【0222】

一部の実施形態では、本開示の任意の微生物は、アンモニウムを構成的または非構成的に排泄するように修飾または最適化されてもよい。一部の実施形態では、本開示の任意の微生物の修飾は、トランスジェニック修飾である。一部の実施形態では、微生物は、すでにトランスジェニック生物であり、菌株は、それらがトランスジェニック要素をもはや含有しないように修飾される。一部の実施形態では、本開示の任意の微生物の修飾は、非トランスジェニック修飾である。一部の実施形態では、任意の２つ以上のＰＧＰＲが、微生物コンソーシア中で組み合わされる。一部の実施形態では、本開示の任意の２つ以上の微生物、またはそれに由来するものが、微生物コンソーシア中で組み合わされる。一部の実施形態では、微生物コンソーシアは、本開示の任意の１つもしくは複数の植物及び／または周囲の土壌もしくは増殖培地に施用される。一部の実施形態では、任意のＰＧＰＲは、本開示の植物のうちの任意の１つもしくは複数及び／または周囲の土壌もしくは増殖培地に施用される。

【0223】

一部の実施形態では、本開示の微生物は、植物でコロニー形成する能力を強化または増加させるように修飾または最適化される。一部の実施形態では、植物でコロニー形成する能力の強化または増加は、根の表面でコロニー形成する能力の強化または増加である。

【0224】

農業組成物
本明細書に記載の方法により生産される及び／または本明細書に記載されるような特性を有する細菌または細菌集団を含む組成物は、液体、泡沫、または乾燥製品の形態であり得る。また、本明細書に記載の方法により生産される及び／または本明細書に記載されるような特性を有する細菌または細菌集団を含む組成物を使用して、植物形質を改善してもよい。一部の例では、細菌集団を含む組成物は、乾燥粉末、粉末及び水のスラリー、または流動性種子処理剤の形態であってもよい。細菌集団を含む組成物は、種子の表面にコーティングされてもよく、液体形態であってもよい。

【0225】

組成物は、連続撹拌槽反応器、回分反応器等のバイオリアクタ中で、及び農場で製造することができる。一部の例では、組成物は、ジャグ等の容器中でまたはミニバルクで保管することができる。一部の例では、組成物は、ボトル、ジャー、アンプル、パッケージ、入れ物、袋、箱、ビン、封筒、紙箱、容器、サイロ、発送容器、トラック荷台、及び／またはケースからなる群から選択される物体内で保管されてもよい。

【0226】

また、組成物を使用して、植物形質を改善してもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物が、種子にコーティングされてもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物が、実生にコーティングされてもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物が、種子の表面にコーティングされてもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物が、種子の表面の上の層としてコーティングされてもよい。一部の例では、種子にコーティングされる組成物は、液体形態、乾燥製品形態、泡沫形態、粉末及び水のスラリー形態、または流動性種子処理剤であってもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物を種子及び／または実生に、噴霧、浸漬、コーティング、封入、及び／または散布することによって、１つまたは複数の組成物を種子及び／または実生に施用してもよい。一部の例では、複数の細菌または細菌集団が、植物の種子及び／または実生にコーティングされ得る。一部の例では、細菌の組み合わせのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種よりも多くの細菌は、以下の属、すなわち、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓのうちの１つから選択され得る。

【0227】

一部の例では、内部寄生菌の組み合わせのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種よりも多くの細菌及び細菌集団は、以下の科、すなわち、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、及びＰｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。

【0228】

一部の例では、内部寄生菌の組み合わせのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種よりも多くの細菌及び細菌集団は、以下の科、すなわち、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。

【0229】

組成物の例としては、商業的に重要な農業作物、例えば、モロコシ、キャノーラ、トマト、イチゴ、オオムギ、イネ、メイズ、及びコムギのための種子コーティングが挙げられ得る。組成物の例としてはまた、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、及び脂肪種子のための種子コーティングを挙げることもできる。本明細書に提供されるような種子は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機、または従来のものであってもよい。一部の例では、組成物は、植物の気中部分に噴霧されてもよいし、または、植物種子が植栽される畦間に挿入すること、土壌に散水すること、もしくは根を組成物の懸濁液に浸漬することによって根に施用されてもよい。一部の例では、組成物は、細胞生存率／安定性、ならびに宿主植物での人為的接種及びコロニー形成の能力を維持する好適な様態で脱水されてもよい。細菌種は、１０^８～１０^１０ＣＦＵ／ｍｌの濃度で組成物中に存在してもよい。一部の例では、組成物は、モリブデンイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらイオンの組み合わせ等の微量金属イオンを補充されてもよい。本明細書に記載されるような組成物の例におけるイオン濃度は、約０．１ｍＭ～約５０ｍＭであってもよい。また、組成物の一部の例は、ベータ－グルカン、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、細菌性細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）、糖、畜乳、または他の好適な担体等の担体と共に製剤化されてもよい。一部の例では、泥炭もしくは植栽用材料を担体として使用することができ、または組成物がバイオポリマーに捕捉されているバイオポリマーを担体として使用することができる。本明細書に記載の細菌集団を含む組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含量の維持、果実数または種子数の増加、及び果実単位重量または種子単位重量の増加等、植物形質を改善することができる。

【0230】

本明細書に記載の細菌集団を含む組成物は、種子の表面にコーティングされてもよい。したがって、本明細書に記載の１つまたは複数の細菌でコーティングされた種子を含む組成物もまた企図される。種子コーティング剤は、細菌集団を、多孔性の化学的に不活性な顆粒状担体と混合することによって形成することができる。代替として、組成物は、種子が植栽される畝間に直接挿入されてもよいし、または植物葉に噴霧されてもよいし、または根を組成物の懸濁液に浸漬することによって施用されてもよい。有効量の組成物を使用して、植物の根に隣接する土壌下領域に生存可能な細菌増殖を定着させてもよいし、または植物の葉に生存可能な細菌増殖を定着させてもよい。一般に、有効量は、改善された形質（例えば、所望のレベルの窒素固定）を有する植物をもたらすのに十分な量である。

【0231】

本明細書に記載の細菌組成物は、農業的に許容される担体を使用して製剤化することができる。これらの実施形態に有用な製剤は、粘着付与剤、微生物安定剤、殺真菌剤、抗細菌剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、抗錯体剤（ａｎｔｉ－ｃｏｍｐｌｅｘ ａｇｅｎｔ）、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、肥料、殺鼠剤、乾燥剤、殺菌剤、栄養素、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成員を含んでもよい。一部の例では、組成物は、常温保存可能であってもよい。例えば、本明細書に記載の組成物のうちのいずれも、農業的に許容される担体（例えば、天然に存在しない肥料等の肥料、天然に存在しない接着剤等の接着剤、及び天然に存在しない農薬等の農薬のうちの１つまたは複数）を含むことができる。天然に存在しない接着剤は、例えば、ポリマー、コポリマー、または合成ろうであり得る。例えば、本明細書に記載のコーティングされた種子、実生、または植物のうちのいずれも、種子コーティングにそのような農業的に許容される担体を含有することができる。本明細書に記載の組成物または方法のうちのいずれにおいても、農業的に許容される担体は、天然に存在しない化合物（例えば、天然に存在しない肥料、ポリマー、コポリマー、もしくは合成ろう等の天然に存在しない接着剤、または天然に存在しない農薬）であり得るか、またはそれを含み得る。農業的に許容される担体の非限定的な例は、下記に記載される。農業的に許容される担体の追加の例は、当該技術分野で既知である。

【0232】

一部の場合では、細菌は、農業的に許容される担体と混合される。担体は、固体担体または液体担体であり得、ミクロスフェア、粉末、エマルション等を含めた種々の形態であり得る。担体は、増加した安定性、湿潤性、または分散性等の様々な特性を付与するいくつかの担体のうちのいずれか１つまたは複数であってもよい。非イオン性もしくはイオン性界面活性剤であってもよく、またはそれらの組み合わせであり得る、天然または合成界面活性剤等の湿潤剤が、組成物中に含まれ得る。また、油中水型エマルションを使用して、単離された細菌を含む組成物を製剤化することができる（例えば、米国特許第７，４８５，４５１号を参照されたい）。調製され得る好適な製剤には、水和性粉末、顆粒、ゲル、寒天片またはペレット、増粘剤等、マイクロカプセル化粒子等、流動性水溶液、水性懸濁液、油中水型エマルション等の液体等が含まれ得る。製剤は、穀物もしくはマメ科植物製品、例えば、地上穀物もしくは豆、穀物もしくは豆に由来するブロスまたは粉末、デンプン、糖、または油を含んでもよい。

【0233】

一部の実施形態では、農業担体は、土壌または植物増殖培地であってもよい。使用され得る他の農業担体には、水、肥料、植物系の油、保湿剤、またはそれらの組み合わせが含まれる。代替として、農業担体は、顆粒、ペレット、または懸濁液を含めた、ケイソウ土、ローム、シリカ、アルギネート、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種嚢、他の植物及び動物製品、または組み合わせ等の固体であってもよい。限定されないが、ローム、砂、または粘土等の中のペスタ（ｐｅｓｔａ）（粉類及びカオリン粘土）、寒天または粉類に基づくペレット等の、前述の成分のうちのいずれかの混合物もまた、担体として企図される。製剤は、オオムギ、イネ、または種子等の他の生物学的材料、植物部位、サトウキビバガス、穀物処理に由来する殻または柄、建築現場廃物に由来する地上植物材料または木材、紙、繊維、または木材の再利用に由来するおがくずまたは繊維片等の、細菌の食料源を含んでもよい。

【0234】

例えば、肥料を使用して、成長促進の一助とするか、または種子、実生、もしくは植物に栄養素を供給してもよい。肥料の非限定的な例としては、窒素、亜リン酸、カリウム、カルシウム、硫黄、マグネシウム、ホウ素、塩化物、マンガン、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、及びセレン（またはそれらの塩）が挙げられる。肥料の追加の例としては、１つまたは複数のアミノ酸、塩、炭水化物、ビタミン、グルコース、ＮａＣｌ、酵母抽出物、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、グリセロール、バリン、Ｌ－ロイシン、乳酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸水素カリウム、キシロース、リキソース、及びレシチンが挙げられる。一実施形態では、製剤は、他の活性薬剤を物質（例えば、種子の表面）に結合させる一助とするために、粘着付与剤または接着性剤（接着剤と呼ばれる）を含むことができる。そのような薬剤は、他の化合物（例えば、生物製剤ではない防除剤）を含有し得る担体を細菌と組み合わせて、コーティング組成物を産出するために有用である。そのような組成物は、植物または種子の周囲にコーティングを作出して、微生物及び他の薬剤と植物または植物部位との間の接触を維持する一助となる。一実施形態では、接着剤は、アルギネート、ゴム、デンプン、レシチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、アルカリホルモノネチネート、ヘスペリチン、ポリ酢酸ビニル、ケファリン、アラビアゴム、キサンタンガム、鉱油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビノ－ガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランガム、ポリスチレン、ポリビニル、カルボキシメチルセルロース、ガッチゴム、及びポリオキシエチレン－ポリオキシブチレンブロックコポリマーからなる群から選択される。

【0235】

一部の実施形態では、接着剤は、例えば、カルナウバろう、みつろう、中国ろう、セラックろう、鯨ろう、カンデリラろう、キャスターろう、オーリクリーろう、及び米ぬかろう等のろう、多糖（例えば、デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギネート、及びキトサン）、脂肪、油、タンパク質（例えば、ゼラチン及びゼイン）、アラビアガム、ならびにシェラックであり得る。接着剤は、天然に存在しない化合物、例えば、ポリマー、コポリマー、及びろうであり得る。例えば、接着剤として使用され得るポリマーの非限定的な例としては、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（例えば、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アシルアミドポリマー及びコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレンが挙げられる。

【0236】

一部の例では、付着剤、抗真菌剤、成長調節剤、及び農薬（例えば、殺虫剤）のうちの１つまたは複数は、（例えば、任意の組み合わせでの）天然に存在しない化合物である。農業的に許容される担体の追加の例としては、分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルＰＶＰＩＶＡ Ｓ－６３０）、界面活性剤、結合剤、及び充填剤が挙げられる。

【0237】

製剤はまた、界面活性剤も含有し得る。界面活性剤の非限定的な例としては、Ｐｒｅｆｅｒ２８（Ｃｅｎｅｘ）、Ｓｕｒｆ－Ｎ（ＵＳ）、Ｉｎｈａｎｃｅ（Ｂｒａｎｄｔ）、Ｐ－２８（Ｗｉｌｆａｒｍ）、及びＰａｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ）等の窒素界面活性剤配合物が挙げられる。エステル化種子油としては、Ｓｕｎ－Ｉｔ ＩＩ（ＡｍＣｙ）、ＭＳＯ（ＵＡＰ）、Ｓｃｏｉｌ（Ａｇｓｃｏ）、Ｈａｓｔｅｎ（Ｗｉｌｆａｒｍ）、及びＭｅｓ－１００（Ｄｒｅｘｅｌ）が挙げられる。有機シリコーン界面活性剤としては、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ７７（ＵＡＰ）、Ｓｉｌｉｋｉｎ（Ｔｅｒｒａ）、Ｄｙｎｅ－Ａｍｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｋｉｎｅｔｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｓｙｌｇａｒｄ３０９（Ｗｉｌｂｕｒ－Ｅｌｌｉｓ）、及びＣｅｎｔｕｒｙ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）が挙げられる。一実施形態では、界面活性剤は、０．０１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。別の実施形態では、界面活性剤は、０．１％（ｖ／ｖ）～１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。

【0238】

ある特定の場合では、製剤は、微生物安定剤を含む。そのような薬剤には、乾燥剤として分類することができる任意の化合物または化合物の混合物を含み得る乾燥剤が含まれ得、化合物（単数または複数）が、液体接種剤に対して実際に乾燥効果を有するような濃度で使用されるか否かを問わない。そのような乾燥剤は、理想的には、使用される細菌集団と適合性であり、微生物集団が種子に施用されても生存し、乾燥化しても生存する能力を促進するべきである。好適な乾燥剤の例としては、トレハロース、スクロース、グリセロール、及びメチレングリコールのうちの１つまたは複数が挙げられる。他の好適な乾燥剤には、非還元糖及び糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）が含まれるが、これらに限定されない。製剤に導入される乾燥剤の量は、重量／容量に基づき約５％～約５０％、例えば、約１０％～約４０％、約１５％～約３５％、または約２０％～約３０％の範囲であり得る。一部の場合では、製剤は、殺真菌剤、抗細菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、殺鼠剤、殺菌剤、または栄養素等の薬剤を含有することが有利である。一部の例では、薬剤は、種子表面伝染性病原体からの保護を提供する保護剤を含んでもよい。一部の例では、保護剤は、いくらかのレベルの土壌伝染性病原体の防除を提供してもよい。一部の例では、保護剤は、主として種子表面上で有効であり得る。

【0239】

一部の例では、殺真菌剤は、化学的かまたは生物学的かに関わらず、真菌の増殖を阻害するかまたは真菌を死滅させることができる化合物または薬剤を含んでもよい。一部の例では、殺真菌剤は、静真菌性または殺真菌性であり得る化合物を含んでもよい。一部の例では、殺真菌剤は、保護剤であり得るか、または主として種子表面上で有効であり、種子表面伝染性病原体に対する保護を提供し、いくらかのレベルの土壌伝染性病原体の防除を提供する薬剤であり得る。保護剤殺真菌剤の非限定的な例としては、カプタン、マネブ、チラム、またはフルジオキソニルが挙げられる。

【0240】

一部の例では、殺真菌剤は、出芽中の実生に吸収され、宿主植物組織の内部の真菌を阻害するかまたは死滅させることができる浸透移行性殺真菌剤であり得る。種子処理に使用される浸透移行性殺真菌剤には、アゾキシストロビン、カルボキシン、メフェノキサム、メタラキシル、チアベンダゾール、トリフロキシストロビン、ならびにジフェノコナゾール、イプコナゾール、テブコナゾール、及びトリチコナゾールを含めた種々のトリアゾール殺真菌剤が含まれるが、これらに限定されない。メフェノキサム及びメタラキシルは、主として、水生カビ真菌Ｐｙｔｈｉｕｍ及びＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａを標的とするために使用される。病原性真菌種の感受性に微妙な差異があること、または植物の殺真菌剤分布もしくは感受性に差異があることのいずれかのため、植物種に応じて、一部の殺真菌剤が、他の殺真菌剤よりも好ましい。一部の例では、殺真菌剤は、細菌または真菌等の生物学的防除剤であり得る。そのような生物は、病原性真菌に寄生性であってもよいし、または真菌を死滅させるかもしくはそうでなければ真菌の増殖を防止することができる毒素もしくは他の物質を分泌してもよい。任意のタイプの殺真菌剤、特に植物に対して一般的に使用されるものが、種子組成物中の防除剤として使用され得る。

【0241】

一部の例では、種子コーティング組成物は、抗細菌特性を有する防除剤を含む。一実施形態では、抗細菌特性を有する防除剤は、本明細書の他の箇所に記載される化合物から選択される。別の実施形態では、この化合物は、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、オキソリン酸、またはゲンタマイシンである。種子コーティング組成物の一部として使用され得る抗細菌化合物の他の例としては、ジクロロフェン及びベンジルアルコールヘミホルマールに基づくもの（ＩＣＩからのＰｒｏｘｅｌ（登録商標）またはＴｈｏｒ ＣｈｅｍｉｅからのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＲＳ、及びＲｏｈｍ＆ＨａａｓからのＫａｔｈｏｎ（登録商標）ＭＫ２５）、ならびにアルキルイソチアゾリノン及びベンゾイソチアゾリノン等のイソチアゾリノン誘導体に基づくもの（Ｔｈｏｒ ＣｈｅｍｉｅからのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＭＢＳ）が挙げられる。

【0242】

一部の例では、成長調節剤は、アブシジン酸、アミドクロル、アンシミドール、６－ベンジルアミノプリン、ブラシノリド、ブトラリン、クロルメコート（塩化クロルメコート）、塩化コリン、シクラニリド、ダミノジット、ジケグラック、ジメチピン、２，６－ジメチルプリジン、エテホン、フルメトラリン、フルルプリミドール、フルチアセト、ホルクロルフェヌロン、ジベレリン酸、イナベンフィド、インドール－３－酢酸、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メピクアト（塩化メピクアト）、ナフタレン酢酸、Ｎ－６－ベンジルアデニン、パクロブトラゾール、プロヘキサジオンホスホロトリチオエート、２，３，５－トリ－ヨード安息香酸、トリネキサパックエチル（ｔｒｉｎｅｘａｐａｃ－ｅｔｈｙｌ）、及びウニコナゾールからなる群から選択される。成長調節剤の追加の非限定的な例としては、ブラシノステロイド、サイトカイニン（例えば、キネチン及びゼアチン）、オーキシン（例えば、インドリル酢酸及びアスパラギン酸インドリルアセチル）、フラボノイド及びイソフラボノイド（ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｉｄ）（例えば、ホルモノネチン及びジオスメチン）、フィトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｉｘｉｎ）（例えば、グリセオリン）、及びフィトアレキシン誘導性オリゴ糖（例えば、ペクチン、キチン、キトサン、ポリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、及びオリゴガラクツロン酸）、ならびにジベレリン（ｇｉｂｅｌｌｅｒｉｎ）が挙げられる。そのような薬剤は、理想的には、製剤が施用される農業種子または実生と適合性である（例えば、それは植物の成長または健康に有害であるべきではない）。さらに、薬剤は、理想的には、ヒト、動物、または工業使用に関して安全性の懸念を引き起こさないものである（例えば、安全性の問題がないか、または化合物は、植物に由来する商品植物製品が含有する化合物の量がごくわずかであるように十分に不安定である）。

【0243】

線虫アンタゴニスト生物防除剤の一部の例としては、ＡＲＦ１８、３０ Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ菌種、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ菌種、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ菌種、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ菌種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ菌種、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ菌種、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ菌種、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ菌種、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ菌種、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ菌種、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ菌種、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ菌種、Ｐｏｃｈｏｎｉａ菌種、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ菌種、ＶＡ菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ菌種、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ菌種、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌種、及び根圏細菌が挙げられる。特に好ましい線虫アンタゴニスト生物防除剤としては、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ ｈｅｔｅｒｏｎｅｍａ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｖｉｘｅｎｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔｅｎｓｉｓ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｅｃａｎｉｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｇｅｐｈｙｒｏｐａｇｕｍ、Ｍｙｒｏｔｅｈｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ、Ｐｏｃｈｏｎｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｅ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｈａｓｅｏｌｉ、ＶＡ菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｔｈｏｒｎｅｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｎｉｓｈｉｚａｗａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｒａｍｏｓａ、Ｐａｓｔｒｕｅｉａ ｕｓａｇｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ菌株Ｇ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、及び根圏細菌が挙げられる。

【0244】

栄養素の一部の例は、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、無加圧窒素溶液、アンモニア水、無水アンモニア、チオ硫酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、尿素－ホルムアルデヒド、ＩＢＤＵ、ポリマー被覆尿素、硝酸カルシウム、尿素ホルム、及びメチレン尿素を含むがこれらに限定されない窒素肥料、リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、ポリリン酸アンモニウム、濃縮過リン酸石灰、及び重過リン酸石灰等の亜リン酸肥料、ならびに塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硝酸カリウム等のカリウム肥料からなる群から選択され得る。そのような組成物は、種子コーティング組成物内の遊離塩またはイオンとして存在することができる。代替として、栄養素／肥料は、経時的な持続放出を提供するように錯化またはキレート化され得る。

【0245】

殺鼠剤の一部の例としては、２－イソバレリルインダン－１，３－ジオン、４－（キノキサリン－２－イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド、アルファ－クロロヒドリン、リン化アルミニウム、アンツー（ａｎｔｕ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｏｕｓ ｏｘｉｄｅ）、炭酸バリウム、ビスチオセミ、ブロディファコウム、ブロマジオロン、ブロメタリン、シアン化カルシウム、クロラロース、クロロファシノン、コレカルシフェロール、クマクロル、クマフリル、クマテトラリル、クリミジン、ジフェナコウム、ジフェチアロン、ジファシノン、エルゴカルシフェロール、フロクマフェン、フルオロアセトアミド、フルプロパジン、フルプロパジン塩酸塩、シアン化水素、ヨードメタン、リンデン、リン化マグネシウム、臭化メチル、ノルボルミド、ホサセチン、ホスフィン、リン、ピンドン、亜ヒ酸カリウム、ピリヌロン、シリロシド、亜ヒ酸ナトリウム、シアン化ナトリウム、フルオロ酢酸ナトリウム、ストリキニーネ、硫酸タリウム、ワルファリン、及びリン化亜鉛からなる物質の群から選択されるものが挙げられ得る。

【0246】

液体形態、例えば、溶液または懸濁液では、細菌集団は、水中または水溶液中に混合または懸濁され得る。好適な液体希釈剤または担体には、水、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体が含まれる。

【0247】

固体組成物は、泥炭、コムギ、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、ケイソウ土、フラー土、及び低温滅菌土等の適切に分割された固体担体内または固体担体上に細菌集団を分散させることによって調製することができる。そのような製剤が水和性粉末として使用される場合、非イオン性、陰イオン性、両性、または陽イオン性の分散剤及び乳化剤等の、生物学的に適合性の分散剤を使用することができる。

【0248】

製剤時に使用される固体担体には、例えば、カオリン粘土、パイロフィライト、ベントナイト、モンモリロナイト、ケイソウ土、酸性白土、バーミキュライト、及びパーライト等の鉱物担体、ならびに硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム、及び炭酸カルシウム等の無機塩が含まれる。また、小麦粉、小麦ふすま、及び米ぬか等の有機微粉末を使用してもよい。液体担体には、ダイズ油及び綿実油等の植物油、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール等が含まれる。

【0249】

有害生物
本明細書で教示される任意の微生物を含み得る、本開示の農業組成物は、１つまたは複数の農薬と組み合わされることがある。

【0250】

本開示の微生物と組み合わされる農薬は、下記で言及される有害生物のうちのいずれか標的とし得る。

【0251】

「有害生物」には、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニ等が含まれるが、これらに限定されない。昆虫有害生物には、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、ハジラミ目、同翅目、半翅目 直翅目、総翅目、革翅目、等翅目、シラミ目、ノミ目、トビケラ目等、特に鱗翅目及び鞘翅目から選択される昆虫が含まれる。

【0252】

当業者であれば、全ての化合物が全ての有害生物に対して等しく有効であるとは限らないことを認識しよう。本開示の微生物と組み合わされ得る化合物は、昆虫有害生物に対して活性を示してもよく、これには、経済的に重要な農学的観賞植物、森林観賞植物、温室観賞植物、ナーセリー観賞植物、食料及び繊維、公衆衛生及び動物衛生、家庭用構造物及び商用構造物、家庭内有害生物及び保管製品の有害生物が含まれ得る。

【0253】

前述のように、本開示の農業組成物（本明細書で教示される任意の微生物を含み得る）は、複数の実施形態では、１つまたは複数の農薬と組み合わされる。これらの農薬は、以下の有害生物のいずれかに対して活性であり得る。

【0254】

鱗翅目の幼虫には、ヤガ科Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ）（ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ））；Ｓ．ｅｘｉｇｕａ Ｈｕｂｎｅｒ（ビートアワヨトウ（ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ））；Ｓ．ｌｉｔｕｒａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ハスモンヨトウ（ｔｏｂａｃｃｏ ｃｕｔｗｏｒｍ）、ハスモンヨトウ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ（Ｗａｌｋｅｒ）（バーサアワヨトウ（ｂｅｒｔｈａ ａｒｍｙｗｏｒｍ））；Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コナガ（ｃａｂｂａｇｅ ｍｏｔｈ））；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ（Ｈｕｆｎａｇｅｌ）（タマナヤガ（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ａ．ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（セイヨウネキリムシ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ａ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（グラニュレートネキリムシ（ｇｒａｎｕｌａｔｅ ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ（Ｈｕｂｎｅｒ）（コットンリーフワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｗｏｒｍ））；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｕｂｎｅｒ）（キャベツシャクトリムシ（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ））；Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ Ｗａｌｋｅｒ（ダイズシャクトリムシ（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ））；Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（Ｈｕｂｎｅｒ）（ベルベットビーンキャタピラー（ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（グリーンクローバーワーム（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒ ｗｏｒｍ））；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（オオタバコガ（ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ））；Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ（アワヨトウ（ａｒｍｙｗｏｒｍ））；Ａｔｈｅｔｉｓ ｍｉｎｄａｒａ（Ｂａｒｎｅｓ及びＭｃｄｕｎｎｏｕｇｈ）（ラフスキンドネキリムシ（ｒｏｕｇｈ ｓｋｉｎｎｅｄ ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ｅｕｘｏａ ｍｅｓｓｏｒｉａ（Ｈａｒｒｉｓ）（ダークサイデッドネキリムシ（ｄａｒｋｓｉｄｅｄ ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（スパイニーボールワーム（ｓｐｉｎｙ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；Ｅ．ｖｉｔｔｅｌｌａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（スポッテドボールワーム（ｓｐｏｔｔｅｄ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｕｂｎｅｒ）（アメリカボールワーム（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；Ｈ．ｚｅａ（Ｂｏｄｄｉｅ）（アメリカタバコガ（ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ）またはオオタバコガ（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；Ｍｅｌａｎｃｈｒａ ｐｉｃｔａ（Ｈａｒｒｉｓ）（ゼブラキャタピラ（ｚｅｂｒａ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｅｇｉｒａ（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ）ｃｕｒｉａｌｉｓ（Ｇｒｏｔｅ）（シトラスネキリムシ（ｃｉｔｒｕｓ ｃｕｔｗｏｒｍ））のアワヨトウ（ａｒｍｙｗｏｒｍ）、ネキリムシ（ｃｕｔｗｏｒｍ）、シャクトリムシ（ｌｏｏｐｅｒ）、及びタバコガ（ｈｅｌｉｏｔｈｉｎｅｓ）；メイガ科Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（Ｈｕｂｎｅｒ）（ヨーロッパマツマダラメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））；Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ（Ｗａｌｋｅｒ）（ネーブルオレンジワーム（ｎａｖａｌ ｏｒａｎｇｅｗｏｒｍ））；Ａｎａｇａｓｔａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ（Ｚｅｌｌｅｒ）（スジコナマダラメイガ（Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｆｌｏｕｒ ｍｏｔｈ））；Ｃａｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ（Ｗａｌｋｅｒ）（コナマダラメイガ（ａｌｍｏｎｄ ｍｏｔｈ））；Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（Ｗａｌｋｅｒ）（ニカメイガ（ｒｉｃｅ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ））；Ｃ．ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、（モロコシボーラー（ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｏｒｅｒ））；Ｃｏｒｃｙｒａ ｃｅｐｈａｌｏｎｉｃａ（Ｓｔａｉｎｔｏｎ）（ガイマイツヅリガ（ｒｉｃｅ ｍｏｔｈ））；Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ（Ｃｌｅｍｅｎｓ）（コーンルートワーム（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ｗｅｂｗｏｒｍ））；Ｃ．ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ（Ｚｉｎｃｋｅｎ）（シバツトガ（ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｗｅｂｗｏｒｍ））；Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ（Ｇｕｅｎｅｅ）（イネハマキムシ（ｒｉｃｅ ｌｅａｆ ｒｏｌｌｅｒ））；Ｄｅｓｍｉａ ｆｕｎｅｒａｌｉｓ Ｈｕｂｎｅｒ（グレープリーフフォルダ（ｇｒａｐｅ ｌｅａｆｆｏｌｄｅｒ））；Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ（メロンワーム（ｍｅｌｏｎ ｗｏｒｍ））；Ｄ．ｎｉｔｉｄａｌｉｓ（Ｓｔｏｌｌ）（ピックルワーム（ｐｉｃｋｌｅｗｏｒｍ））；Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（Ｄｙａｒ）（サウスウェスタンマツマダラメイガ（ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））、Ｄ．ｗｅｂｗｏｒｍｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（サトウキビボーラー（ｓｕｒｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ））；Ｅｏｒｅｕｍａ ｌｏｆｔｉｎｉ（Ｄｙａｒ）（メキシコニカメイガ（Ｍｅｘｉｃａｎ ｒｉｃｅ ｂｏｒｅｒ））；Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ（Ｈｕｂｎｅｒ）（タバコ（カカオ）ガ（ｔｏｂａｃｃｏ（ｃａｃａｏ）ｍｏｔｈ））；Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（オオハチミツガ（ｇｒｅａｔｅｒ ｗａｘ ｍｏｔｈ））；Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ（Ｗａｌｋｅｒ）（ソッドウェブワーム（ｓｏｄ ｗｅｂｗｏｒｍ））；Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ（Ｈｕｌｓｔ）（ヒマワリガ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ））；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ（Ｚｅｌｌｅｒ）（レッサーコーンストークボーラー（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ））；Ａｃｈｒｏｉａ ｇｒｉｓｅｌｌａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（コハチノスツヅリガ（ｌｅｓｓｅｒ ｗａｘ ｍｏｔｈ））；Ｌｏｘｏｓｔｅｇｅ ｓｔｉｃｔｉｃａｌｉｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ビートウェブワーム（ｂｅｅｔ ｗｅｂｗｏｒｍ））；Ｏｒｔｈａｇａ ｔｈｙｒｉｓａｌｉｓ（Ｗａｌｋｅｒ）（ティーツリーウェブモス（ｔｅａ ｔｒｅｅ ｗｅｂ ｍｏｔｈ））；Ｍａｒｕｃａ ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ Ｇｅｙｅｒ（マメノメイガ（ｂｅａｎ ｐｏｄ ｂｏｒｅｒ））；Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ（Ｈｕｂｎｅｒ）（ノシメマダラメイガ（Ｉｎｄｉａｎ ｍｅａｌ ｍｏｔｈ））；Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ（Ｗａｌｋｅｒ）（イエローステムボーラー（ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ））；Ｕｄｅａ ｒｕｂｉｇａｌｉｓ（Ｇｕｅｎｅｅ）（セロリリーフタイヤー（ｃｅｌｅｒｙ ｌｅａｆｔｉｅｒ））のボーラー（ｂｏｒｅｒ）、ツツミノガ（ｃａｓｅ ｂｅａｒｅｒ）、ウェブワーム（ｗｅｂｗｏｒｍ）、マツマダラメイガ（ｃｏｎｅｗｏｒｍ）、及びスケリトナイザ（ｓｋｅｌｅｔｏｎｉｚｅｒ）；ならびにハマキガ科Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ（Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（ウェスタンブラックヘッデッドバッドワーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌａｃｋｈｅａｄｅｄ ｂｕｄｗｏｒｍ））；Ａ．ｖａｒｉａｎａ（Ｆｅｒｎａｌｄ）（イースタンブラックヘデッドバッドワーム（Ｅａｓｔｅｒｎ ｂｌａｃｋｈｅａｄｅｄ ｂｕｄｗｏｒｍ））；Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ（Ｗａｌｋｅｒ）（果樹ハマキムシ（ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅ ｌｅａｆ ｒｏｌｌｅｒ）；Ａ．ｒｏｓａｎａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ヨーロッパハマキムシ）；ならびに他のＡｒｃｈｉｐｓ種、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｖｏｎ Ｒｏｓｓｌｅｒｓｔａｍｍ）（サマーフルーツトートリックスモス（ｓｕｍｍｅｒ ｆｒｕｉｔ ｔｏｒｔｒｉｘ ｍｏｔｈ））；Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ（Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（バンデッドサンフラワーモス（ｂａｎｄｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ））；Ｃｙｄｉａ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎａ（Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（フィルバートワーム（ｆｉｌｂｅｒｔｗｏｒｍ））；Ｃ．ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（シンクイガ（ｃｏｌｄｉｎｇ ｍｏｔｈ））；Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ（Ｃｌｅｍｅｎｓ）（バリアゲイテッドリーフローラー）；Ｐ．ｓｔｕｌｔａｎａ（Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（雑食性ハマキムシ（ｏｍｎｉｖｏｒｏｕｓ ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ））；Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ（Ｄｅｎｉｓ及びＳｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ）（ヨーロピアングレープバインモス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｇｒａｐｅ ｖｉｎｅ ｍｏｔｈ））；Ｓｐｉｌｏｎｏｔａ ｏｃｅｌｌａｎａ（Ｄｅｎｉｓ及びＳｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ）（アイスポテッドバッドモス（ｅｙｅｓｐｏｔｔｅｄ ｂｕｄ ｍｏｔｈ））；Ｅｎｄｏｐｉｚａ ｖｉｔｅａｎａ Ｃｌｅｍｅｎｓ（グレープベリーモス（ｇｒａｐｅ ｂｅｒｒｙ ｍｏｔｈ））；Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ（Ｈｕｂｎｅｒ）（バインモス）；Ｂｏｎａｇｏｔａ ｓａｌｕｂｒｉｃｏｌａ Ｍｅｙｒｉｃｋ（ブラジリアンアップルリーフローラー（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ａｐｐｌｅ ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ）；Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ Ｂｕｓｃｋ（ナシヒメシンクイ（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｆｒｕｉｔ ｍｏｔｈ））；Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ（Ｒｉｌｅｙ）（サンフラワーバッドモス（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ ｍｏｔｈ））；Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ種；Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ種のハマキムシ、バッドワーム（ｂｕｄｗｏｒｍ）、シードワーム（ｓｅｅｄ ｗｏｒｍ）、及びフルーツワーム（ｆｒｕｉｔ ｗｏｒｍ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0255】

鱗翅目の選択される他の農学的有害生物には、Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ（Ｈａｒｒｉｓ）（フォールカンカーワーム（ｆａｌｌ ｃａｎｋｅｒｗｏｒｍ））；Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ（Ｚｅｌｌｅｒ）（ピーチトゥイグボーラー（ｐｅａｃｈ ｔｗｉｇ ｂｏｒｅｒ））；Ａｎｉｓｏｔａ ｓｅｎａｔｏｒｉａ（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ）（オレンジストライプドオークワーム（ｏｒａｎｇｅ ｓｔｒｉｐｅｄ ｏａｋｗｏｒｍ））；Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ Ｇｕｅｒｉｎ－Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（チャイニーズオークタッサーモス（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｏａｋ Ｔｕｓｓａｈ Ｍｏｔｈ））；Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（カイコ）；Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ Ｂｕｓｃｋ（コットンリーフパーホレータ（ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｐｅｒｆｏｒａｔｏｒ））；Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（アルファルファキャタピラー（ａｌｆａｌｆａ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ Ｇｒｏｔｅ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ウォールナッツキャタピラー（ｗａｌｎｕｔ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ Ｔｓｃｈｅｔｗｅｒｉｋｏｖ（シベリアンシルクモス（Ｓｉｂｅｒｉａｎ ｓｉｌｋ ｍｏｔｈ））、Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ（Ｈｕｂｎｅｒ）（エルムスパンワーム（ｅｌｍ ｓｐａｎｗｏｒｍ））；Ｅｒａｎｎｉｓ ｔｉｌｉａｒｉａ（Ｈａｒｒｉｓ）（リンデンルーパー（ｌｉｎｄｅｎ ｌｏｏｐｅｒ））；Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ブラウンテールモス（ｂｒｏｗｎｔａｉｌ ｍｏｔｈ））；Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｇｕｅｒｉｎ－Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（グレープリーフスケルトナイザ（ｇｒａｐｅｌｅａｆ ｓｋｅｌｅｔｏｎｉｚｅｒ））；Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ ｏｌｉｖｉａｅ Ｃｏｃｋｒｅｌｌ（レンジキャタピラー（ｒａｎｇｅ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ Ｄｒｕｒｙ（アメリカシロヒトリ（ｆａｌｌ ｗｅｂ－ｗｏｒｍ））；Ｋｅｉｆｅｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ（Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（トマトピンワーム（ｔｏｍａｔｏ ｐｉｎｗｏｒｍ））；Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ（Ｈｕｌｓｔ）（イースタンヘムロックルーパー（Ｅａｓｔｅｒｎ ｈｅｍｌｏｃｋ ｌｏｏｐｅｒ））；Ｌ．ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ ｌｕｇｕｂｒｏｓａ（Ｈｕｌｓｔ）（ウェスタンヘムロックルーパー（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｈｅｍｌｏｃｋ ｌｏｏｐｅｒ））；Ｌｅｕｃｏｍａ ｓａｌｉｃｉｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（サテンモス（ｓａｔｉｎ ｍｏｔｈ））；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（マイマイガ（ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ））；Ｍａｎｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ（ファイブスポテッドホークモス（ｆｉｖｅ ｓｐｏｔｔｅｄ ｈａｗｋ ｍｏｔｈ）、トマトスズメガ（ｔｏｍａｔｏ ｈｏｒｎｗｏｒｍ））；Ｍ．ｓｅｘｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ（トマトスズメガ（ｔｏｍａｔｏ ｈｏｍｗｏｒｍ）、タバコスズメガ（ｔｏｂａｃｃｏ ｈｏｒｎｗｏｒｍ））；Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ウィンターモス（ｗｉｎｔｅｒ ｍｏｔｈ））；Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｖｅｒｎａｔａ Ｐｅｃｋ（スプリングカンカーワーム（ｓｐｒｉｎｇ ｃａｎｋｅｒｗｏｒｍ））；Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ Ｃｒａｍｅｒ（クレスフォンテスタスキアゲハオレンジドッグ（ｇｉａｎｔ ｓｗａｌｌｏｗｔａｉｌ ｏｒａｎｇｅ ｄｏｇ））；Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｐａｃｋａｒｄ（カリフォルニアオークワーム（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｏａｋｗｏｒｍ））；Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ Ｓｔａｉｎｔｏｎ（ミカンハモグリガ（ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（スポッテッドテンチフォームリーフマイナー（ｓｐｏｔｔｅｄ ｔｅｎｔｉｆｏｒｍ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（オオモンシロチョウ）；Ｐ．ｒａｐａｅ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（モンシロチョウ）；Ｐ．ｎａｐｉ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（エゾスジグロシロチョウ）；Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ（Ｒｉｌｅｙ）（アーティチョークプルームモス（ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｐｌｕｍｅ ｍｏｔｈ））；Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コナガ）；Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）（ワタアカミムシガ）；Ｐｏｎｔｉａ ｐｒｏｔｏｄｉｃｅ（Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ及びＬｅｃｏｎｔｅ）（サザンキャベッジワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃａｂｂａｇｅ－ｗｏｒｍ））；Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ（Ｇｕｅｎｅｅ）（雑食性シャクトリムシ（ｏｎｍｉｖｏｒｏｕｓ ｌｏｏｐｅｒ））；Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ）（レッドハンプドキャタピラー（ｒｅｄ ｈｕｍｐｅｄ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ ｃｅｒｅａｌｅｌｌａ（Ｏｌｉｖｉｅｒ）（バクガ）；Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ（Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ）（マツノギョウレツケムシ）；Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（Ｈｕｍｍｅｌ）（ウェビングクロウズモス（ｗｅｂｂｉｎｇ ｃｌｏｔｈｅｓ ｍｏｔｈ））；Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ（Ｍｅｙｒｉｃｋ）（トマトリーフマイナー（ｔｏｍａｔｏ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（エルミンモス（ｅｒｍｉｎｅ ｍｏｔｈ））；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ（Ｇｕｅｎｅｅ）；Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ種ならびにＯｒｇｙｉａ種；Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（ヨーロッパマツマダラメイガ）；タネバエ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ（タマナヤガ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0256】

ヒゲナガゾウムシ、マメゾウムシ、及びゾウムシ科のゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ（Ｂｏｈｅｍａｎ）（ワタミハナゾウムシ）；Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ（Ｋｕｓｃｈｅｌ）（イネミズゾウムシ）；Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（グラナリアコクゾウムシ）；Ｓ．ｏｒｙｚａｅ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コクゾウムシ）；Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ツメクサタコゾウムシ（ｃｌｏｖｅｒ ｌｅａｆ ｗｅｅｖｉｌ））；Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ（ＬｅＣｏｎｔｅ）（サンフラワーステムウィービル（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｔｅｍ ｗｅｅｖｉｌ））；Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ（ＬｅＣｏｎｔｅ）（レッドサンフラワーシードウィービル（ｒｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｗｅｅｖｉｌ））；Ｓ．ｓｏｒｄｉｄｕｓ（ＬｅＣｏｎｔｅ）（グレーサンフラワーシードウィービル（ｇｒａｙ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｗｅｅｖｉｌ））；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ（メイズビルバグ（ｍａｉｚｅ ｂｉｌｌｂｕｇ））を含むがこれらに限定されない）；ハムシ科のノミトビヨロイムシ、ウリハムシ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）、ネクイムシ（ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、ハムシ（ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ）、イモハムシ（ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）、及び潜葉性昆虫（ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（Ｓａｙ）（コロラドハムシ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ））；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ＬｅＣｏｎｔｅ）（ウェスタンコーンルートワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ））；Ｄ．ｂａｒｂｅｒｉ（Ｓｍｉｔｈ及びＬａｗｒｅｎｃｅ）（ノーザンコーンルートワーム（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ））；Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ（Ｂａｒｂｅｒ）（サザンコーンルートワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ））；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ（Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ）（トウモロコシノミトビヨロイムシ（ｃｏｒｎ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ（Ｇｏｅｚｅ）（アブラナ科植物ノミトビヨロイムシ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ（キスジノミトビヨロイムシ（ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））；Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（グレープコラスピス（ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ））；Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（シリアルリーフビートル（ｃｅｒｅａｌ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ））；Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（サンフラワービートル（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ））を含むがこれらに限定されない）；テントウムシ科の甲虫（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ（Ｍｕｌｓａｎｔ）（インゲンテントウ（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ））を含むがこれらに限定されない）；コガネムシ科のコガネムシ及び他の甲虫（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｎｅｗｍａｎ）（マメコガネ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ））；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ（Ａｒｒｏｗ）（ノーザンマスクドチェーファー（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）、ホワイトグラブ（ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ））；Ｃ．ｉｍｍａｃｕｌａｔａ（Ｏｌｉｖｉｅｒ）（サザンマスクドチェーファー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）、ホワイトグラブ）；Ｒｈｉｚｏｔｒｏｇｕｓ ｍａｊａｌｉｓ（Ｒａｚｏｕｍｏｗｓｋｙ）（ヨーロピアンチェーファー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｈａｆｅｒ））；Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ）（ホワイトグラブ）；Ｌｉｇｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ（Ｄｅ Ｇｅｅｒ）（キャロットビートル（ｃａｒｒｏｔ ｂｅｅｔｌｅ））を含むがこれらに限定されない）；カツオブシムシ科のカツオブシムシ；コメツキムシ科、Ｅｌｅｏｄｅｓ種、Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ種のハリガネムシ；Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ種；Ｌｉｍｏｎｉｕｓ種；Ａｇｒｉｏｔｅｓ種；Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ種；Ａｅｏｌｕｓ種；キクイムシ科のキクイムシ及びゴミムシダマシ科の甲虫；Ｃｅｒｏｔｏｍａ ｔｒｉｆｕｒｃａｔｅ（ビーンリーフビートル（ｂｅａｎ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ））；ならびにハリガネムシを含む、鞘翅目の幼虫及び成体。

【0257】

潜葉性昆虫Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ（Ｌｏｅｗ）（コーンブロッチリーフマイナー（ｃｏｒｎ ｂｌｏｔｃｈ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；小虫（ｍｉｄｇｅ）（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ（Ｃｏｑｕｉｌｌｅｔｔ）（ソルガムミッジ（ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｉｄｇｅ））；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ（Ｓａｙ）（コムギタマバエ（Ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ））；Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ（Ｇｅｈｉｎ）（ウィートミッジ（ｗｈｅａｔ ｍｉｄｇｅ））；Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ Ｆｅｌｔ、（サンフラワーシードミッジ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｉｄｇｅ））を含むがこれらに限定されない）；ショウジョウバエ（ミバエ科）、Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ショウジョウバエ）；ウジ（Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ（Ｍｅｉｇｅｎ）（シードコーンマゴット（ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ））；Ｄ．ｃｏａｒｃｔａｔａ Ｆａｌｌｅｎ（ウィートバルブフライ（ｗｈｅａｔ ｂｕｌｂ ｆｌｙ）及び他のＤｅｌｉａ種、Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（Ｆｉｔｃｈ）（ムギキモグリバエ（ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｍａｇｇｏｔ））；Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（イエバエ）；Ｆａｎｎｉａ ｃａｎｉｃｕｌａｒｉｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）、Ｆ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ Ｓｔｅｉｎ（ヒメイエバエ）；Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（サシバエ）を含むがこれらに限定されない）；フェイスフライ（ｆａｃｅ ｆｌｉｅｓ）、ノサシバエ、クロバエ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ種；Ｐｈｏｒｍｉａ種、及び他のキンバエ有害生物、アブ（ｈｏｒｓｅ ｆｌｉｅｓ）Ｔａｂａｎｕｓ種；ウマバエ（ｂｏｔ ｆｌｉｅｓ）Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ種；Ｏｅｓｔｒｕｓ種；ウシバエ（ｃａｔｔｌｅ ｇｒｕｂｓ）Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ種；メクラアブ（ｄｅｅｒ ｆｌｉｅｓ）Ｃｈｒｙｓｏｐｓ種；Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ ｏｖｉｎｕｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ヒツジシラミバエ（ｋｅｄｓ））及び他のハエ亜目、蚊Ａｅｄｅｓ種；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ種；Ｃｕｌｅｘ種；ブユＰｒｏｓｉｍｕｌｉｕｍ種；Ｓｉｍｕｌｉｕｍ種；ヌカカ、スナバエ、サイアリッド（ｓｃｉａｒｉｄ）、及び他のカ亜目を含む、双翅目の成体及び幼体。

【0258】

限定されないが、カサアブラムシ科のカサアブラムシ、メクラカメムシ科のカスミカメムシ、セミ科のセミ、ヒメヨコバイ科のヨコバイ、Ｅｍｐｏａｓｃａ種、ヒシウンカ科、アオバハゴロモ科、ビワハゴロモ上科、マルウンカ科、及びウンカ科のウンカ、ツノゼミ科のツノゼミ、キジラミ科のキジラミ、コナジラミ科のコナジラミ、アブラムシ科のアブラムシ、ネアブラムシ科のネアブラムシ、コナカイガラムシ科のコナカイガラムシ、フサカイガラムシ科（Ａｓｔｅｒｏｌｅｃａｎｉｄａｅ）、カタカイガラムシ科、コチニールカイガラムシ科、マルカイガラムシ科、フクロカイガラムシ科、ハカマカイガラムシ科、ホエニココシダエ（Ｐｈｏｅｎｉｃｏｃｏｃｃｉｄａｅ）科、及びワタフキカイガラムシ科のカイガラムシ、グンバイムシ科のグンバイムシ、カメムシ科のカメムシ、ヒメコガネナガカメムシ、Ｂｌｉｓｓｕｓ種；ならびに、ナガカメムシ科の他のナガカメムシ、アワフキムシ科のアワフキムシ、ヘリカメムシ科のヘリカメムシ、ならびにホシカメムシ科のツツガムシ及びコットンステイナー（ｃｏｔｔｏｎ ｓｔａｉｎｅｒ）等の半翅目及び同翅亜目の成体及び若虫。

【0259】

同翅亜目の農学的に重要な成員には、Ａｃｙｒｔｈｉｓｉｐｈｏｎ ｐｉｓｕｍ（Ｈａｒｒｉｓ）（エンドウヒゲナガアブラムシ）；Ａｐｈｉｓ ｃｒａｃｃｉｖｏｒａ（Ｋｏｃｈ）（ササゲアブラムシ（ｃｏｗｐｅａ ａｐｈｉｄ））；Ａ．ｆａｂａｅ（Ｓｃｏｐｏｌｉ）（マメクロアブラムシ（ｂｌａｃｋ ｂｅａｎ ａｐｈｉｄ））；Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ（Ｇｌｏｖｅｒ）（ワタアブラムシ、メロンアブラムシ（ｍｅｌｏｎ ａｐｈｉｄ））；Ａ．ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ（Ｆｏｒｂｅｓ）（コーンルートアフィド（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ））；Ａ．ｐｏｍｉ（Ｄｅ Ｇｅｅｒ）（リンゴアブラムシ（ａｐｐｌｅ ａｐｈｉｄ））；Ａ．ｓｐｉｒａｅｃｏｌａ（Ｐａｔｃｈ）（スピレアアフィド（ｓｐｉｒｅａ ａｐｈｉｄ））；Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ ｓｏｌａｎｉ（Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ）（ジャガイモヒゲナガアブラムシ（ｆｏｘｇｌｏｖｅ ａｐｈｉｄ））；Ｃｈａｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｆｒａｇａｅｆｏｌｉｉ（Ｃｏｃｋｅｒｅｌｌ）（イチゴアブラムシ）；Ｄｉｕｒａｐｈｉｓ ｎｏｘｉａ（Ｋｕｒｄｊｕｍｏｖ／Ｍｏｒｄｖｉｌｋｏ）（ロシアコムギアブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ））；Ｄｙｓａｐｈｉｓ ｐｌａｎｔａｇｉｎｅａ（Ｐａａｓｅｒｉｎｉ）（バラリンゴアブラムシ（ｒｏｓｙ ａｐｐｌｅ ａｐｈｉｄ））；Ｅｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ（Ｈａｕｓｍａｎｎ）（リンゴワタムシ）；Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（キャベツアブラムシ）；Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ｐｒｕｎｉ（Ｇｅｏｆｆｒｏｙ）（モモコフキアブラムシ（ｍｅａｌｙ ｐｌｕｍ ａｐｈｉｄ））；Ｌｉｐａｐｈｉｓ ｅｒｙｓｉｍｉ（Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ）（ニセダイコンアブラムシ）；Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ ｄｉｒｒｈｏｄｕｍ（Ｗａｌｋｅｒ）（穀物アブラムシ（ｃｅｒｅａｌ ａｐｈｉｄ））；Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ（Ｔｈｏｍａｓ）（ジャガイモヒゲナガアブラムシ（ｐｏｔａｔｏ ａｐｈｉｄ））；Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ（Ｓｕｌｚｅｒ）（モモアカアブラムシ（ｐｅａｃｈ ｐｏｔａｔｏ ａｐｈｉｄ）、モモアカアブラムシ（ｇｒｅｅｎ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ））；Ｎａｓｏｎｏｖｉａ ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ（Ｍｏｓｌｅｙ）（レタスアブラムシ）；Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ種（ルートアフィド（ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ）及びガルアフィド（ｇａｌｌ ａｐｈｉｄ））；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ（Ｆｉｔｃｈ）（トウモロコシアブラムシ（ｃｏｒｎ ｌｅａｆ ａｐｈｉｄ））；Ｒ．ｐａｄｉ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ムギクビレアブラムシ（ｂｉｒｄ ｃｈｅｒｒｙ－ｏａｔ ａｐｈｉｄ））；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ（Ｒｏｎｄａｎｉ）（ムギミドリアブラムシ）；Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ（Ｆｏｒｂｅｓ）（イエローシュガーケーンアフィド（ｙｅｌｌｏｗ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ））；Ｓｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ムギヒゲナガアブラムシ（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ））；Ｔｈｅｒｉｏａｐｈｉｓ ｍａｃｕｌａｔａ（Ｂｕｃｋｔｏｎ）（マダラアルファルファアブラムシ（ｓｐｏｔｔｅｄ ａｌｆａｌｆａ ａｐｈｉｄ））；Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ ａｕｒａｎｔｉｉ（Ｂｏｙｅｒ ｄｅ Ｆｏｎｓｃｏｌｏｍｂｅ）（コミカンアブラムシ（ｂｌａｃｋ ｃｉｔｒｕｓ ａｐｈｉｄ）及びＴ．ｃｉｔｒｉｃｉｄａ（Ｋｉｒｋａｌｄｙ）（ミカンクロアブラムシ（ｂｒｏｗｎ ｃｉｔｒｕｓ ａｐｈｉｄ））；Ｍｅｌａｎａｐｈｉｓ ｓａｃｃｈａｒｉ（サトウキビアブラムシ（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ））；Ａｄｅｌｇｅｓ種（カサアブラムシ）；Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ ｄｅｖａｓｔａｔｒｉｘ（Ｐｅｒｇａｎｄｅ）（ペカンネアブラムシ（ｐｅｃａｎ ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ））；Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ（Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ）（タバココナジラミ（ｔｏｂａｃｃｏ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）、ワタコナジラミ（ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｗｈｉｔｅｆｌｙ））；Ｂ．ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉｉ（Ｂｅｌｌｏｗｓ及びＰｅｒｒｉｎｇ）（シルバーリーフコナジラミ（ｓｉｌｖｅｒｌｅａｆ ｗｈｉｔｅｆｌｙ））；Ｄｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｃｉｔｒｉ（Ａｓｈｍｅａｄ）（ミカンコナジラミ）；Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅｕｓ（バンデッドウィングドホワイトフライ（ｂａｎｄｅｄｗｉｎｇｅｄ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）及びＴ．ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ（Ｗｅｓｔｗｏｏｄ）（オンシツコナジラミ）；Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ（Ｈａｒｒｉｓ）（ジャガイモヒゲヨコバイ（ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ））；Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ（Ｆａｌｌｅｎ）（ヒメトビウンカ）；Ｍａｃｒｏｌｅｓｔｅｓ ｑｕａｄｒｉｌｉｎｅａｔｕｓ（Ｆｏｒｂｅｓ）（フタテンヨコバイ（ａｓｔｅｒ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ））；Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ Ｕｈｌｅｒ（ツマグロヨコバイ（ｇｒｅｅｎ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ））；Ｎ．ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ Ｓｔａｌ（クロスジツマグロヨコバイ（ｒｉｃｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ））；Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ Ｓｔａｌ（トビイロウンカ）；Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ Ａｓｈｍｅａｄ（トウモロコシウンカ（ｃｏｒｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ））；Ｓｏｇａｔｅｌｌａ ｆｕｒｃｉｆｅｒａ（Ｈｏｒｖａｔｈ）（セジロウンカ）；Ｓｏｇａｔｏｄｅｓ ｏｒｉｚｉｃｏｌａ（Ｍｕｉｒ）（イネウンカ（ｒｉｃｅ ｄｅｌｐｈａｃｉｄ））；Ｔｙｐｈｌｏｃｙｂａ ｐｏｍａｒｉａ（ＭｃＡｔｅｅ）（シロリンゴヨコバイ）；Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｏｕｒａ種（グレープヨコバイ（ｇｒａｐｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒｓ））；Ｍａｇｉｃｉｃａｄａ ｓｅｐｔｅｎｄｅｃｉｍ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（周期ゼミ）；Ｉｃｅｒｙａ ｐｕｒｃｈａｓｉ（Ｍａｓｋｅｌｌ）（ワタフキカイガラムシ）；Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓｕｓ（Ｃｏｍｓｔｏｃｋ）（サンホセカイガラムシ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ｓｃａｌｅ））；Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｉｔｒｉ（Ｒｉｓｓｏ）（ミカンコナカイガラムシ（ｃｉｔｒｕｓ ｍｅａｌｙｂｕｇ））；Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ種（他のコナカイガラムシ複合体））；Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ ｐｙｒｉｃｏｌａ（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）（フタホシナシキジラミ）；Ｔｒｉｏｚａ ｄｉｏｓｐｙｒｉ（Ａｓｈｍｅａｄ）（カキキジラミ（ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｐｓｙｌｌａ）がさらに含まれるが、これらに限定されない。

【0260】

半翅目の種には、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ（Ｓａｙ）（アオクサカメムシ（ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ））；Ａｎａｓａ ｔｒｉｓｔｉｓ（Ｄｅ Ｇｅｅｒ）（ヘリカメムシ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ（Ｓａｙ）（ヒメコガネナガカメムシ）；Ｃｏｒｙｔｈｕｃａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（コットンレースバグ（ｃｏｔｔｏｎ ｌａｃｅ ｂｕｇ））；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ ｍｏｄｅｓｔａ（Ｄｉｓｔａｎｔ）（トマトバグ（ｔｏｍａｔｏ ｂｕｇ））；Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ ｓｕｔｕｒｅｌｌｕｓ（Ｈｅｒｒｉｃｈ－Ｓｃｈａｆｆｅｒ）（コットンステイナー（ｃｏｔｔｏｎ ｓｔａｉｎｅｒ））；Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ（Ｓａｙ）（茶色カメムシ（ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ））；Ｅ．ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ（Ｐａｌｉｓｏｔ ｄｅ Ｂｅａｕｖａｉｓ）（イッテンカメムシ（ｏｎｅ ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ））；Ｇｒａｐｔｏｓｔｅｔｈｕｓ種（ナガカメムシの複合体）；Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ ｃｏｒｃｕｌｕｓ（Ｓａｙ）（リーフフッテッドパインシードバグ（ｌｅａｆ ｆｏｏｔｅｄ ｐｉｎｅ ｓｅｅｄ ｂｕｇ））；Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ（Ｐａｌｉｓｏｔ ｄｅ Ｂｅａｕｖａｉｓ）（サビイロメクラガメ）；Ｌ．Ｈｅｓｐｅｒｕｓ（Ｋｎｉｇｈｔ）（ウェスタンサビイロメクラガメ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ））；Ｌ．ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コモンメドウバグ（ｃｏｍｍｏｎ ｍｅａｄｏｗ ｂｕｇ））；Ｌ．ｒｕｇｕｌｉｐｅｎｎｉｓ（Ｐｏｐｐｉｕｓ）（ヨーロッパサビイロメクラガメ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ））；Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ ｐａｂｕｌｉｎｕｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コモングリーンカプシド（ｃｏｍｍｏｎ ｇｒｅｅｎ ｃａｐｓｉｄ））；Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（サザンアオクサカメムシ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ））；Ｏｅｂａｌｕｓ ｐｕｇｎａｘ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（イネカメムシ）；Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ ｆａｓｃｉａｔｕｓ Ｄａｌｌａｓ（ラージミルクウィードバグ（ｌａｒｇｅ ｍｉｌｋ－ｗｅｅｄ ｂｕｇ））；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ（Ｒｅｕｔｅｒ）（ワタノミハムシ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0261】

Ｃａｌｏｃｏｒｉｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｇｍｅｌｉｎ）（ストロベリーバグ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｂｕｇ））；Ｏｒｔｈｏｐｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）；Ｐｌｅｓｉｏｃｏｒｉｓ ｒｕｇｉｃｏｌｌｉｓ（Ｆａｌｌｅｎ）（アップルカプシド（ａｐｐｌｅ ｃａｐｓｉｄ））；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ ｍｏｄｅｓｔｕｓ（Ｄｉｓｔａｎｔ）（トマトバグ（ｔｏｍａｔｏ ｂｕｇ））；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ ｎｏｔａｔｕｓ（Ｄｉｓｔａｎｔ）（サックフライ（ｓｕｃｋｆｌｙ））；Ｓｐａｎａｇｏｎｉｃｕｓ ａｌｂｏｆａｓｃｉａｔｕｓ（Ｒｅｕｔｅｒ）（ホワイトマークトフリーホッパー（ｗｈｉｔｅｍａｒｋｅｄ ｆｌｅａｈｏｐｐｅｒ））；Ｄｉａｐｈｎｏｃｏｒｉｓ ｃｈｌｏｒｉｏｎｉｓ（Ｓａｙ）（ハニーロクストプラントバグ（ｈｏｎｅｙｌｏｃｕｓｔ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ））；Ｌａｂｏｐｉｄｉｃｏｌａ ａｌｌｉｉ（Ｋｎｉｇｈｔ）（オニオンプラントバグ（ｏｎｉｏｎ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ））；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ（Ｒｅｕｔｅｒ）（ワタノミハムシ）；Ａｄｅｌｐｈｏｃｏｒｉｓ ｒａｐｉｄｕｓ（Ｓａｙ）（ラピッドプラントバグ（ｒａｐｉｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ））；Ｐｏｅｃｉｌｏｃａｐｓｕｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（フォーラインドプラントバグ（ｆｏｕｒ ｌｉｎｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ））；Ｎｙｓｉｕｓ ｅｒｉｃａｅ（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ）（偽ヒメコガネナガカメムシ）；Ｎｙｓｉｕｓ ｒａｐｈａｎｕｓ（Ｈｏｗａｒｄ）（偽ヒメコガネナガカメムシ）；Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（サザンアオクサカメムシ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ））；Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ種；Ｃｏｒｅｉｄａｅ種；Ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｄａｅ種；Ｔｉｎｉｄａｅ種；Ｂｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ種；Ｒｅｄｕｖｉｉｄａｅ種及びＣｉｍｉｃｉｄａｅ種等の半翅目。

【0262】

Ａｃｅｒｉａ ｔｏｓｉｃｈｅｌｌａ（Ｋｅｉｆｅｒ）（フシダニ（ｗｈｅａｔ ｃｕｒｌ ｍｉｔｅ））；Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ（Ｍｕｌｌｅｒ）（ホモノハダニ）；ハダニ科のハダニ及びミカンハダニ（ｒｅｄ ｍｉｔｅ）、Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｕｌｍｉ（Ｋｏｃｈ）（リンゴハダニ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｄ ｍｉｔｅ））；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ（Ｋｏｃｈ）（ナミハダニ）；（Ｔ．ｍｃｄａｎｉｅｌｉ（ＭｃＧｒｅｇｏｒ）（マクダニエルダニ（ＭｃＤａｎｉｅｌ ｍｉｔｅ））；Ｔ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ（Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ）（ニセナミハダニ（ｃａｒｍｉｎｅ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ））；Ｔ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ（Ｕｇａｒｏｖ及びＮｉｋｏｌｓｋｉ）（ストロベリースパイダーマイト（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ））；ヒメハダニ科のフラットマイト（ｆｌａｔ ｍｉｔｅ）、Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ ｌｅｗｉｓｉ（ＭｃＧｒｅｇｏｒ）（シトラスフラットマイト（ｃｉｔｒｕｓ ｆｌａｔ ｍｉｔｅ））；フシダニ科のサビダニ及びフシダニ、ならびに、他の食葉性ダニならびにヒト及び動物の健康に重要なダニ、すなわち、ヒョウヒダニ科のチリダニ、ニキビダニ科のニキビダニ、ニクダニ科の穀物ダニ、マダニ目Ｉｘｏｄｅｓ ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ（Ｓａｙ）（シカダニ）；Ｉ．ｈｏｌｏｃｙｃｌｕｓ Ｎｅｕｍａｎｎ（オーストラリアの麻痺ダニ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｔｉｃｋ））；Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（Ｓａｙ）（アメリカイヌダニ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｏｇ ｔｉｃｋ））；Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ローンスターチック（ｌｏｎｅ ｓｔａｒ ｔｉｃｋ））、ならびにキュウセンダニ科、シラミダニ類、及びヒゼンダニ科のキュウセンダニ及びヒゼンダニ等のダニ目（ダニ）の成体及び幼虫。

【0263】

Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（セイヨウシミ）；Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（Ｐａｃｋａｒｄ）（マダラシミ）等のシミ目の昆虫有害生物。

【0264】

追加の節足動物有害生物には、Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｒｅｃｌｕｓａ（Ｇｅｒｔｓｃｈ及びＭｕｌａｉｋ）（ドクイトグモ）及びＬａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（クロゴケグモ）等のクモ目のクモ、ならびにＳｃｕｔｉｇｅｒａ ｃｏｌｅｏｐｔｒａｔａ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ゲジ）等のゲジ目のムカデが含まれる。

【0265】

カメムシ科（Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ、Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ ｈａｌｙｓ、Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ ｇｕｉｌｄｉｎｉ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｔｒｉｓｔｉｇｍｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｍｅｌａｃａｎｔｈｕｓ、及びＢａｇｒａｄａ ｈｉｌａｒｉｓ（Ｂａｇｒａｄａ Ｂｕｇ））、マルカメムシ科（Ｍｅｇａｃｏｐｔａ ｃｒｉｂｒａｒｉａ、すなわち、タイワンマルカメムシ）及びツチカメムシ科（Ｓｃａｐｔｏｃｏｒｉｓ ｃａｓｔａｎｅａ、すなわち、ルートスティンクバグ（Ｒｏｏｔ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ））に属する種を含むがこれらに限定されない、カメムシ及び他の関連する昆虫の上科、ならびに、コナガ、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（Ｂｏｄｄｉｅ）；ソイビーンルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ）、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（Ｗａｌｋｅｒ）、及びベルベットビーンキャタピラー（ｖｅｌｖｅｔ ｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、例えば、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（Ｈｕｂｎｅｒ）を含むがこれらに限定されない鱗翅目の種。

【0266】

線虫には、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ種、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種、及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ種を含む、ネコブセンチュウ、シストセンチュウ、及びネグサレセンチュウ（ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ）；特に、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズシストセンチュウ（ｓｏｙｂｅａｎ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（テンサイシストセンチュウ）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ（ムギシストセンチュウ）、及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ（ジャガイモシロシストセンチュウ）を含むがこれらに限定されない、シストセンチュウの成員等の寄生線虫が含まれる。ネグサレセンチュウ（ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ）には、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ種が含まれる。

【0267】

本開示の農薬及び微生物を含む農薬組成物
前述のように、本明細書で教示される任意の微生物を含み得る、本開示の農業組成物は、１つまたは複数の農薬と組み合わされることがある。農薬には、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤等が含まれ得る。

【0268】

一部の実施形態では、農薬／微生物の組み合わせは、組成物の形態で施用され得、他の化合物と同時にまたは連続して、処理されるべき作付面積または植物に施用され得る。これらの化合物は、肥料、除草剤、凍結保護物質、界面活性剤、洗剤、殺有害生物性石鹸、休眠油、ポリマー、及び／または、製剤の単回施用後に標的面積の長期の投薬を可能にする徐放性もしくは生分解性担体製剤であり得る。それらはまた、所望であれば、さらなる農業的に許容される担体、界面活性剤、または製剤化技術分野で慣習的に用いられる施用促進アジュバント（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔ）と一緒にした、選択的除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺微生物剤、抗アメーバ薬、農薬、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤、またはこれらの調製物のうちのいくつかの混合物であることができる。好適な担体（すなわち、農業的に許容される担体）及びアジュバントは、固体または液体であり得、製剤化技術で通常に用いられる物質、例えば、天然または再生鉱物物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、固着剤、粘着付与剤、結合剤、または肥料に対応し得る。同様に、製剤は、食用餌へと調製されてもよいし、または標的有害生物による農薬製剤の摂食もしくは摂取を可能にする有害生物トラップへと形作られてもよい。

【0269】

本開示の微生物と組み合わされ得る例示的な化学組成物には、以下が含まれる。

【0270】

以下の果実／野菜用除草剤、すなわち、アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リニュロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロスルフロン（Ｈａｌｏ ｓｕｌｆｕｒｏｎ）（Ｇｏｗａｎ）、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル（Ｂｕｔａｆｅｎａｃｉｌ）、ハロスルフロン（Ｈａｌｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、インダジフラム；以下の果実／野菜用殺虫剤、すなわち、アルジカルブ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、ダイアジノン、マラチオン、アベルメクチン、シフルトリン／ベータシフルトリン、エスフェンバレレート（Ｅｓｆｅｎｖａｌｅｒａｔｅ）、ラムダ－シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド（Ｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎｏｚｉｄｅ）、ノバルロン、クロマフェノジド（Ｃｈｒｏｍａｆｅｎｏｚｉｄｅ）、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム（ＦｌｕａＣｒｙｐｙｒｉｍ）、トルフェンピラド、クロチアニジン、スピロジクロフェン、ガンマ－シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、サイアジピル（Ｃｙａｚｙｐｙｒ）、スピネトラム、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロル、シフルメトフェン、シアノピラフェン（Ｃｙａｎｏｐｙｒａｆｅｎ）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、スピネトラム（Ｓｐｉｎｏｔｏｒａｍ）、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、ホルチアザート（Ｆｏｒｔｈｉａｚａｔｅ）、フェナミホス、カズサホス（Ｃａｄｕｓａｐｈｏｓ）、ピリプロキシフェン（Ｐｙｒｉｐｒｏｘｉｆｅｎ）、酸化フェンブタスズ、ヘキシチアゾクス（Ｈｅｘｔｈｉａｚｏｘ）、メソミル、４－［［（６－クロロピリジン（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｄｉｎ）－３－イル）メチル］（２，２－ジフルオロエチル（ｄｉｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ））アミノ］フラン－２（５Ｈ）－オン；以下の果実野菜用殺真菌剤、すなわち、カルベンダジム、クロロタロニル、ＥＢＤＣ、イオウ、チオファナートメチル、アゾキシストロビン、シモキサニル、フルアジナム、ホセチル、イプロジオン、クレソキシムメチル、メタラキシル／メフェノキサム、トリフロキシストロビン、エタボキサム、イプロバリカルブ（Ｉｐｒｏｖａｌｉｃａｒｂ）、トリフロキシストロビン、フェンヘキサミド、オキスポコナゾールフマル酸塩、シアゾファミド、フェンアミドン、ゾキサミド、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、シフルフェンアミド（Ｃｙｆｌｕｆｅｎａｍｉｄ）、ボスカリド。

【0271】

以下の穀類用除草剤、すなわち、イソプロチュロン（Ｉｓｏｐｒｏｔｕｒｏｎ）、ブロモキシニル、アイオキシニル、フェノキシ（Ｐｈｅｎｏｘｉｅｓ）、クロルスルフロン（Ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、クロジナホップ、ジクロホップ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルロキシピル（Ｆｌｕｏｒｏｘｙｐｙｒ）、メトスルフロン、トリアスルフロン（Ｔｒｉａｓｕｌｆｕｒｏｎ）、フルカルバゾン（Ｆｌｕｃａｒｂａｚｏｎｅ）、インドスルフロン（ｌｏｄｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、プロポキシカルバゾン、ピコリナフェン、メソスルフロン、ベフルブタミド（Ｂｅｆｌｕｂｕｔａｍｉｄ）、ピノキサデン、アミドスルフロン（Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロン、フルピルスルフロン（Ｆｌｕｐｙｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、スルホスルフロン、ピラスルホトール、ピロキシスラム、フルフェナセット、トラルコキシジム（Ｔｒａｌｋｏｘｙｄｉｍ）、ピロキサスルホン；以下の穀類用殺真菌剤、すなわち、カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、シプロジニル、フェンプロピモルフ、エポキシコナゾール、クレソキシム－メチル、キノキシフェン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、シメコナゾール、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストロビン、プロチオコナゾール、フルオキサストロビン（Ｆｌｕｏｘａｓｔｒｏｂｉｎ）；以下の穀類用殺虫剤、すなわち、ジメトエート、ラムダ－シハロトリン、デルタメトリン、アルファ－シペルメトリン、β－シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン（Ｄｉｎｅｔｏｆｕｒａｎ）、クロルピリホス（Ｃｌｏｒｐｈｙｒｉｐｈｏｓ）、メタミドホス（Ｍｅｔａｍｉｄｏｐｈｏｓ）、オキシデメトン（Ｏｘｉｄｅｍｅｔｈｏｎ）メチル、ピリミカルブ、メチオカルブ。

【0272】

以下のトウモロコシ用除草剤、すなわち、アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロール、ジカンバ、クロピラリド、Ｓ－ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、Ｓ－メトラクロール、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン（Ｓｕｌｃｏｔｒｉｏｎｅ）、ホラムスルフロン（Ｆｏｒａｍｓｕｌｆｕｒｏｎ）、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン；以下のトウモロコシ用殺虫剤、すなわち、カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ラムダ－シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、デルタメトリン、チオジカルブ、β－シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、トリフルモロン（Ｔｒｉｆｌｕｍｏｒｏｎ）、テフルトリン、テブピリムホス（Ｔｅｂｕｐｉｒｉｍ－ｐｈｏｓ）、エチプロール（Ｅｔｈｉｐｒｏｌｅ）、サイアジピル（Ｃｙａｚｙｐｙｒ）、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン（Ｄｉｎｅｔｏｆｕｒａｎ）、アベルメクチン、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト；以下のトウモロコシ用殺真菌剤、すなわち、フェニトロパン（Ｆｅｎｉｔｒｏｐａｎ）、チラム、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン。

【0273】

以下のイネ用除草剤、すなわち、ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ（Ｃｙｈａｌｏ－ｆｏｐ）、ダイムロン、フェントラザミド（Ｆｅｎｔｒａｚａｍｉｄｅ）、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメホン（Ｏｘａｚｉｃｌｏｍｅｆｏｎｅ）、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド（Ｆｅｎｔｒａｚａｍｉｄｅ）、ハロスルフロン（Ｈａｌｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、オキサジクロメホン（Ｏｘａｚｉｃｌｏｍｅｆｏｎｅ）、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；以下のイネ用殺虫剤、すなわち、ダイアジノン、フェニトロチオン、フェノブカルブ、モノクロトホス、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド（Ｃｈｒｏｍａｆｅｎｏｚｉｄｅ）、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロール（Ｅｔｈｉｐｒｏｌｅ）、フルベンジアミド、リナキシピル（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、サイアジピル（Ｃｙａｚｙｐｙｒ）、スピノサド、スピネトラム（Ｓｐｉｎｏｔｏｒａｍ）、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｐｈｏｓ）、カルタップ、メタミドホス、エトフェンプロックス、トリアゾホス、４－［［（６－クロロピリジン（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｄｉｎ）－３－イル）メチル］（２，２－ジフルオロエチル（ｄｉｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ））アミノ］フラン－２（５Ｈ）－オン、カルボフラン、ベンフラカルブ；以下のイネ用殺真菌剤、すなわち、チオファナートメチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド、エディフェンホス、フェリムゾン、イプロベンホス、イソプロチオラン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、ジクロシメット、フェノキサニル、シメコナゾール、チアジニル。

【0274】

以下の綿用除草剤、すなわち、ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ－ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンディメタリン、ピリチオバックナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；以下の綿用殺虫剤、すなわち、アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アベルメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ－シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ－シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、ベータ－シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジノテフラン（Ｄｉｎｅｔｏｆｕｒａｎ）、フルベンジアミド、サイアジピル（Ｃｙａｚｙｐｙｒ）、スピノサド、スピネトラム（Ｓｐｉｎｏｔｏｒａｍ）、ガンマシハロトリン、４－［［（６－クロロピリジン（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｄｉｎ）－３－イル）メチル］（２，２－ジフルオロエチル（ｄｉｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ））アミノ］フラン－２（５Ｈ）－オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロル、プロフェノホス、トリアゾホス（Ｔｈｒｉａｚｏｐｈｏｓ）、エンドスルファン；以下の綿用殺真菌剤、すなわち、エトリジアゾール、メタラキシル、キントゼン。

【0275】

以下のダイズ用除草剤、すなわち、アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル（Ｃｈｌｏｒｉｍｕｒｏｎ－Ｅｔｈｙｌ）、クロランスラムメチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン（Ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス（Ｉｍａｚａｍｏｘ）、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ－）メトラクロール、メトリブジン、ペンディメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；以下のダイズ用殺虫剤、すなわち、ラムダ－シハロトリン、メソミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン（Ｄｉｎｅｔｏｆｕｒａｎ）、フルベンジアミド、リナキシピル（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、サイアジピル（Ｃｙａｚｙｐｙｒ）、スピノサド、スピネトラム（Ｓｐｉｎｏｔｏｒａｍ）、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール（Ｅｔｈｉｐｒｏｌｅ）、デルタメトリン、β－シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、４－［［（６－クロロピリジン（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｄｉｎ）－３－イル）メチル］（２，２－ジフルオロエチル（ｄｉｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ））アミノ］フラン－２（５Ｈ）－オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン（Ｓｐｉｎｏｄｉｃｌｏｆｅｎ）、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ－シフルトリン；以下のダイズ用殺真菌剤、すなわち、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール。

【0276】

以下のサトウダイコン用除草剤、すなわち、クロリダゾン、デスメディファム、エトフメサート、フェンメディファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック（Ｑｕｉｎｍｅｒａｃ）、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；以下のサトウダイコン用殺虫剤、すなわち、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン（Ｄｉｎｅｔｏｆｕｒａｎ）、デルタメトリン、β－シフルトリン、ガンマ／ラムダシハロトリン、４－［［（６－クロロピリジン（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｄｉｎ）－３－イル）メチル］（２，２－ジフルオロ（ｄｉｆｌｕｏｒ）－エチル）アミノ］フラン－２（５Ｈ）－オン、テフルトリン、リナキシピル（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、シアキシピル（Ｃｙａｘｙｐｙｒ）、フィプロニル、カルボフラン。

【0277】

以下のキャノーラ用除草剤、すなわち、クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロール、トリフルラリンエタメツルフロン、キンメラック（Ｑｕｉｎｍｅｒａｃ）、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；キャノーラ殺真菌剤、すなわち、アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル、イプロジオン、プロクロラズ、ビンクロゾリン；以下のキャノーラ用殺虫剤、すなわち、カルボフラン有機リン酸エステル（Ｃａｒｂｏｆｕｒａｎ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓ－ｐｈａｔｅｓ）、ピレスロイド、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン（Ｄｉｎｅｔｏ－ｆｕｒａｎ）、β－シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、タウ－フルバレリエート（ｔａｕ－Ｆｌｕｖａｌｅｒｉａｔｅ）、エチプロール（Ｅｔｈｉｐｒｏｌｅ）、スピノサド、スピネトラム（Ｓｐｉｎｏｔｏｒａｍ）、フルベンジアミド、リナキシピル（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、サイアジピル（Ｃｙａｚｙｐｙｒ）、４－［［（６－クロロピリジン（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｄｉｎ）－３－イル）メチル］（２，２－ジフルオロエチル（ｄｉｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ））アミノ］フラン－２（５Ｈ）－オン。

【0278】

本開示の殺虫剤及び微生物を含む殺虫性組成物
前述のように、本明細書で教示される任意の微生物を含み得る、本開示の農業組成物は、１つまたは複数の殺虫剤と組み合わされることがある。

【0279】

一部の実施形態では、殺虫性組成物が、本明細書に述べられる組成物に含まれてもよく、他の化合物と同時にまたは連続して、植物（複数可）またはその部位（複数可）に施用され得る。殺虫剤には、炭酸アンモニウム、水性ケイ酸カリウム、ホウ酸、硫酸銅、元素硫黄、石灰硫黄、スクロースオクタノエートエステル、４－［［（６－クロロピリジン（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｄｉｎ）－３－イル）メチル］（２，２－ジフルオロエチル（ｄｉｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ））アミノ］フラン－２（５Ｈ）－オン、アベルメクチン、ノテノン（ｎｏｔｅｎｏｎｅ）、フェナザキン、フェンピロキシメート、ピリダベン、ピリメジフェン（ｐｙｒｉｍｅｄｉｆｅｎ）、テブフェンピラド、トルフェンピラド、アセフェート、エマメクチン安息香酸塩、レピメクチン、ミルベメクチン、ヒドロプレン（ｈｄｒｏｐｒｅｎｅ）、キノプレン、メトプレン、フェノキシカルブ、ピリプロキシフェン、臭化メチル及び他のハロゲン化アルキル、フッ化フルフリル（ｆｕｌｆｕｒｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、クロルピクリン、ホウ砂、八ホウ酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、メタホウ酸ナトリウム、吐酒石、ダゾメット、メタム（ｍｅｔａｍ）、ピメトロジン、ピリフルキナゾン、フロフェンテジン（ｆｌｏｆｅｎｔｅｚｉｎｅ）、ジフロビダジン（ｄｉｆｌｏｖｉｄａｚｉｎ）、ヘキシチアゾクス、ビフェナゼート、チアメトキサム、イミダクロプリド、フェンピロキシメート、アザジラクチン、ペルメトリン、エスフェンバレレート（Ｅｓｆｅｎｖａｌｅｒａｔｅ）、アセタミプリド、ビフェントリン、インドキサカルブ、アザジラクチン、ピレトリン、イミダクロプリド、ベータ－シフルトリン、スルホテップ、テブピリンホス、テメホス、テルブホス、テトラクロルビンホス、チオメトン、トリアゾホス、アラニカルブ（ａｌａｎｙｃａｒｂ）、アルジカルブ、ベンジオカルブ、ベンフルラカルブ（ｂｅｎｆｌｕｒａｃａｒｂ）、ブトカルボキシム、ブトキシカルボキシム、カルバリル、カルボフラン、カルボスルファン、エチオフェンカルブ、フェノブカルブ、ホルメタネート、フラチオカルブ、イソプロカルブ、メチオカルブ、メチミル（ｍｅｔｈｙｍｙｌ）、メトルカルブ、オキサミル、ピリミカルブ（ｐｒｉｍｉｃａｒｂ）、プロポクスル、チオジカルブ、チオファノックス、トリアザメート、トリメタカルブ、ＸＭＣ、キシリルカルブ（ｘｙｌｙｌｃａｒｂ）、アセフェート、アザメチホス、アジンホスエチル、アジンホスメチル、カズサホス、クロルエトキシフォックス（ｃｈｌｏｒｅｔｈｏｘｙｆｏｘ）、トリクロルホン、バミドチオン、クロルデン、エンドスルファン、エチプロール（Ｅｔｈｉｐｒｏｌｅ）、フィプロニル、アクリナトリン、アレトリン、ビフェントリン、ビオアレトリン、ビオアレトリンＸ－シクロペンテニル、ビオレズメトリン、シクロロスリン（ｃｙｃｌｏｒｏｔｈｒｉｎ）、シフルトリン、シハロトリン、シペルメトリン、シフェノトリン［（１Ｒ）－トランス異性体］、デルタメトリン、エムペントリン［（ＥＺ）－（１Ｒ）－異性体］、エスフェンバレレート（Ｅｓｆｅｎｖａｌｅｒａｔｅ）、エトフェンプロックス、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フルシトリネート、フルメトリン、ハルフェンプロックス（ｈａｌｆｅｎｐｒｏｘ）、カダトリン（ｋａｄａｔｈｒｉｎ）、フェノトリン［（１Ｒ）－トランス異性体］プラレトリン、ピレトリン（除虫菊（ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ））、レスメトリン、シラフルオフェン、テフルトリン、テトラメトリン、テトラメトリン［（１Ｒ）－異性体］、トラロメトリン、トランスフルトリン、アルファ－シペルメトリン、ベータ－シフルトリン、ベータ－シペルメトリン、ｄ－シス－トランスアレトリン、ｄ－トランスアレトリン、ガンマ－シハロトリン、ラムダ－シハロトリン、タウ－フルバリネート、シータ－シペルメトリン、ゼータ－シペルメトリン、メトキシクロル、ニコチン、スルホキサフロル、アセタミプリド、クロチアニジン、ジノテフラン、イミダクロプリド、ニテンピラム、チアクロプリド、チアメトキサン（ｔｈｉａｍｅｔｈｏｘａｎ）、テブプリムホス（ｔｅｂｕｐｒｉｍｐｈｏｓ）、ベータ－シフルトリン、クロチアニジン、フロニカミド、ヒドラメチルノン、アミトラズ、フルベンジアミド、ブロラントラニリプロール（ｂｌｏｒａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅ）、ラムダシハロトリン、スピノサド、ガンマシハロトリン、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ、トウガラシオレオレジン抽出物、ニンニク油、カルバリル、クロルピリホス、スルホキサフロル、ラムダシハロトリン、クロルフェンビンホス、クロルメホス（Ｃｈｌｏｒｍｅｐｈｏｓ）、クロルピリホス、クロルピリホスメチル、クマホス、シアノホス、デメトン－Ｓ－メチル、ダイアジノン、ジクロルボス／ＤＤＶＰ、ジクロトホス、ジメトエート、ジメチルビンホス、ジスルホトン、ＥＰＮ、エチオン、エトプロホス、ファムフール（Ｆａｍｐｈｕｒ）、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、ホスチアゼート、ヘプテノホス、イミシアホス、イソフェンホス、イソプロピルＯ－（メトキシアミノチオ－ホスホリル）サリチレート、イソキサチオン、マラチオン、メカルバム、メタミドホス、メチダチオン、メビンホス、モノクロトホス、ナレド、オメトエート、オキシデメトンメチル、パラチオン、パラチオンメチル、フェントエート、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ホキシム、ピリミホスメチル、プロフェノホス、プロペタンホス、プロチオホス、ピラクロホス、ピリダフェンチオン、キナルホスフルアクリピリム（Ｑｕｉｎａｌｐｈｏｓｆｌｕａｃｒｙｐｙｒｉｍ）、テブフェノジド、クロラントラニリプロール、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種Ｋｕｒｓｔａｋｉ、テルブホス、鉱油、フェンプロパトリン、メタアルデヒド、デルタメトリン、ダイアジノン、ジメトエート、ジフルベンズロン、ピリプロキシフェン、ローズマリー油、ペパーミント油、ゲラニオール、アザジラクチン、ピペロニルブトキシド、シアントラニリプロール、アルファ シペルメトリン、テフルトリン、ピメトロジン、マラチオン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ジコホル、ブロモプロピレート、ベンゾキシメート、アザジラクチン、フロニカミド、ダイズ油、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ菌株ＰＲＡＡ４－１、ゼータシペルメトリン、ホスメット、メトキシフェノジド（Ｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎｏｚｉｄｅ）、パラフィン系油、スピロテトラマト、メソミル、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ菌株Ｆ５２、エトプロプ（ｅｔｈｏｐｒｏｐ）、テトラジホン、プロパルギット、酸化フェンブタスズ、アゾシクロチン、シヘキサチン、ジアフェンチウロン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、エトキサゾール、フルピラジフロン、アザジラクチン、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ、シフルメトフェン、アザジラクチン、キノメチオナート、アセフェート、Ｉｓａｒｉａ ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅａ Ａｐｏｐｋａ株９７、ナトリウムテトラボロハイドレート（ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）十水和物、エマメクチン安息香酸塩、氷晶石、スピネトラム、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ抽出物、ノバルロン、ジノテフラン、カルバリル、アセキノシル、フルピラジフロン、リン酸鉄、カオリン、ブプロフェジン、シロマジン、クロマフェノジド（Ｃｈｒｏｍａｆｅｎｏｚｉｄｅ）、ハロフェノジド（ｈａｌｏｆｅｎｏｚｉｄｅ）、メトキシフェノジド（Ｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎｏｚｉｄｅ）、テブフェノジド、ビストリフルロン、クロルフルアズロン、ジフルベンズロン、フルシクロクスロン（ｆｌｕｃｙｃｌｏｘｕｒｏｎ）、フルフェノクスロン（ｆｌｕｆｅｎｏｘｕｒｏｎ）、ヘキサフルムロン（ｈｅｘａｆｌｕｍｕｒｏｎ）、ルフェヌロン、ノカルロン（ｎｏｃａｌｕｒｏｎ）、ノビフルムロン（ｎｏｖｉｆｌｕｍｕｒｏｎ）、テフルベンズロン、トリフルムロン、ベンスルタップ、カルタップ塩酸塩、チオシクラム、チオスルタップナトリウム（ｔｈｉｏｓｕｌｔａｐ－ｓｏｄｉｕｍ）、ＤＮＯＣ、クロルフェナピル、スルフルラミド（ｓｕｌｆｕｒａｍｉｄ）、ホレート、トルフェンピラド、スルホキサフロル、ニーム油、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ菌株Ａ－１０、シロマジン、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ加熱死菌種、シアントラニリプロール、シエノピラフェン、シフルメトフェン、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化カルシウム、リン化アルミニウム、リン化カルシウム、ホスフィン、亜鉛 リン化物、スピロジクロフェン（ｓｐｒｉｏｄｉｃｌｏｆｅｎ）、スピロメシフェン、スピロテトラマト、メタフルミゾン、フルベンジアミド、ピフルブミド、オキサミル、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種ａｉｚａｗａｉ、エトキサゾール、及びエスフェンバレレート（Ｅｓｆｅｎｖａｌｅｒａｔｅ）が含まれる。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【表9-5】

【表9-6】

【表9-7】

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【表10-4】

【表10-5】

【表10-6】

【表10-7】

【表10-8】

【表10-9】

【表10-10】

【表10-11】

【表10-12】

【表10-13】

【表10-14】

【表10-15】

【表10-16】

【表10-17】

【表10-18】

【表10-19】

【表10-20】

【表10-21】

【表10-22】

【0280】

殺虫剤はまた、それ自体では毒性または殺虫性とみなされないが、殺虫剤と共に使用されて殺虫剤との相乗作用を生み出すかまたは殺虫剤の活性を強化する材料である、相乗剤または活性化剤を含む。相乗剤または活性化剤は、ピペロニルブトキシドを含む。

【0281】

バイオラショナル（Ｂｉｏｒａｔｉｏｎａｌ）農薬
殺虫剤は、バイオラショナルであり得るか、または、バイオ農薬もしくは生物学的農薬としても知られ得る。バイオラショナルとは、特定の標的有害生物（複数可）、例えば、昆虫、雑草、植物病害（線虫を含む）、及び脊椎動物有害生物に対して有害または致死的効果を有し、固有の作用様式を持ち、人間、栽培植物及び飼育動物に対して非毒性であり、野生生物及び環境に悪影響をほとんどまたは全く有しない、天然起源の任意の物質（または天然起源の物質に類似した人為的物質）を指す。

【0282】

バイオラショナル殺虫剤（またはバイオ農薬もしくは生物学的農薬）は、（１）生化学物質（ホルモン、酵素、フェロモン、及び天然作用物質、例えば、昆虫及び植物成長調節剤）、（２）微生物（ウイルス、細菌、真菌、原生動物、及び線虫）、または（３）植物導入保護剤（Ｐｌａｎｔ－Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（ＰＩＰ）（主としてトランスジェニック植物、例えば、Ｂｔトウモロコシ）として群分けされ得る。

【0283】

バイオ農薬、または生物学的農薬は、生存微小生物または天然産物から製造され、植物の有害生物の防除用に販売される薬剤を広義に含み得る。バイオ農薬は、微小生物、生化学物質、及び情報化学物質であり得る。バイオ農薬はまた、ペプチド、タンパク質、及び核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、及びヘアピンＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。

【0284】

細菌、真菌、卵菌、ウイルス、及び原生動物は全て、昆虫有害生物の生物学的防除に使用される。最も広く使用される微生物バイオ農薬は、昆虫病原性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）であり、この細菌は、細菌胞子形成中に、感受性のある昆虫によって消費されると腸細胞の溶解を引き起こすことが可能なタンパク質結晶（Ｂｔδ－エンドトキシン）を産生する。微生物Ｂｔバイオ農薬は、発酵槽中で大量生産され、噴霧可能な製品として製剤化される細菌胞子及びδ－エンドトキシン結晶からなる。Ｂｔは、野菜を害せず、人間、有益な生物、及び環境に対して安全である。故に、Ｂｔ噴霧剤は、それらの高レベルの選択性及び安全性が望ましいとみなされる、また合成化学殺虫剤に対する耐性が問題である、果実及び野菜作物における有害生物管理のために成長している戦術である。Ｂｔ噴霧剤はまた、メイズ、ダイズ、及び綿等の商品作物にも使用されてきたが、植物の遺伝子組換えの出現に伴い、農業従事者は、次第にＢｔトランスジェニック作物品種を栽培するようになっている。

【0285】

他の微生物殺虫剤には、昆虫病原性のバキュロウイルスに基づく製品が含まれる。節足動物に対して病原性であるバキュロウイルスは、ウイルスファミリーに属し、ヌクレオカプシドへとパッケージングされる大きな共有結合閉環状の二本鎖ＤＮＡゲノムを持つ。目鱗翅目、膜翅目、及び双翅目の昆虫から７００種超のバキュロウイルスが同定されている。バキュロウイルスは通常、それらの宿主昆虫に高度に特異的であり、故に、環境、ヒト、他の植物、及び有益な生物に対して安全である。５０種超のバキュロウイルス産物が、世界中の異なる昆虫有害生物を防除するために使用されてきた。米国及び欧州では、Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ顆粒ウイルス（ＣｐＧＶ）が、リンゴにおけるシンクイガに対する大量のバイオ農薬として使用されている。米国の最大のリンゴ生産州であるワシントン州では、リンゴ作物の１３％にＣｐＧＶが使用されている。ブラジルでは、１９９０年代中期に最大４００万ヘクタール（およそ３５％）のダイズ作物に対してダイズの毛虫Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓの核多角体病ウイルスが使用された。Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ及びＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種の幼虫を防除するために、Ｇｅｍｓｔａｒ（登録商標）（Ｃｅｒｔｉｓ ＵＳＡ）等のウイルスが利用可能である。

【0286】

温室作物、果実及び圃場野菜ならびに商品作物における少なくとも５種の昆虫及びダニ目に対して使用するために、昆虫病原性真菌に基づく少なくとも１７０種の異なるバイオ農薬製品が開発されてきた。製品の大部分は、子嚢菌Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａまたはＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅに基づく。Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅはまた、アフリカ及びオーストラリアにおけるイナゴ及びバッタ有害生物の防除のためにも開発されており、イナゴ管理に対して国連食糧農業機関（ＦＡＯ）によって推奨される。

【0287】

米国に登録されたいくつかの微生物農薬が、Ｋａｂａｌｕｋ ｅｔ ａｌ．２０１０（Ｋａｂａｌｕｋ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）．２０１０．Ｔｈｅ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｊｕｒｉｓｄｉｃｔｉｏｎｓ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．ＩＯＢＣ Ｇｌｏｂａｌ．９９ｐｐ．）の表１６に列挙されており、また選択される国に登録された微生物農薬が、Ｈｏｅｓｃｈｌｅ－Ｚｅｌｅｄｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１３（Ｈｏｅｓｃｈｌｅ－Ｚｅｌｅｄｏｎ，Ｉ．，Ｐ．Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｋｕｍａｒ．（２０１３）．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ．ＳＰ－ＩＰＭ Ｓｅｃｒｅｔａｒｉａｔ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＩＴＡ），Ｉｂａｄａｎ，Ｎｉｇｅｒｉａ．４３ ｐｐ．）の付録４に列挙されており、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0288】

植物は、草食動物によるそれらの摂食を阻止する多種多様な二次代謝物を産生する。これらのうちの一部をバイオ農薬として使用することができる。それらには、例えば、ピレトリンが含まれ、これはＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉａｅｆｏｌｉｕｍによって産生される速効性の殺虫性化合物である。それらは、哺乳類に対する毒性は低いが、施用後に迅速に分解する。この短い持続性が合成ピレトリン（ピレスロイド）の開発を駆り立てた。最も広く使用される植物性化合物は、Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａの種子から抽出される殺虫性化学物質である、ニーム油である。土壌放線菌によって合成される二次代謝物に基づく２種の高活性の農薬が利用可能であるが、それらは、あたかもそれらが合成化学農薬であるかのごとく規制当局によって評価された。スピノサドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ由来の２つのマクロライド化合物の混合物である。それは、哺乳類に対する毒性が非常に低く、残留物は、圃場で迅速に分解する。農業従事者及び栽培者は、１９９７年のその導入に次いで、それを広く使用していたが、ミカンキイロアザミウマ等の一部の重要な有害生物で耐性がすでに発達している。アバメクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓによって産生される大環状ラクトン系化合物である。それは、幅広い有害生物種に対して活性であるが、これもまた、例えば、ハダニで耐性が発達している。

【0289】

いくつかの生物由来のペプチド及びタンパク質は、殺有害生物特性を持つことが見出されている。恐らく最も顕著なものは、クモ毒由来のペプチドである（Ｋｉｎｇ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｃ．（２０１３）Ｓｐｉｄｅｒ－ｖｅｎｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．５８：４７５－４９６）。クモ毒ペプチドにおけるジスルフィド結合の固有の配置が、それらをプロテアーゼに極度に耐性にしている。結果として、これらのペプチドは、昆虫の腸及び血リンパ中で高度に安定であり、それらのうちの多くは、経口的に活性である。このペプチドは、昆虫神経系における広範囲の受容体及びイオンチャネルを標的とする。殺虫性ペプチドの他の例としては、電位開口型Ｎａ＋チャネルに作用するイソギンチャク毒（Ｂｏｓｍａｎｓ，Ｆ．ａｎｄ Ｔｙｔｇａｔ，Ｊ．（２００７）Ｓｅａ ａｎｅｍｏｎｅ ｖｅｎｏｍ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ Ｎａ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｎ．４９（４）：５５０－５６０）、カ、一部のアブラムシ、及び穀類ゾウムシ（ｃｅｒｅａｌ ｗｅｅｖｉｌ）等のいくつかの昆虫有害生物に対して致死的活性を有するマメ科植物種子由来のＰＡ１ｂ（エンドウマメアルブミン１、サブユニットｂ）ペプチド（Ｅｙｒａｕｄ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｙｓｔｉｎｅ Ｋｎｏｔ Ｂｉｏｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ ＰＡ１ｂ（Ｐｅａ Ａｌｂｕｍｉｎ １ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｂ）．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（１２）：ｅ８１６１９）、ならびに、感受性のある昆虫内でＣａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）ウレアーゼの酵素的加水分解によって生成される１０ｋＤａの内部ペプチド（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｊａｂｕｒｅｔｏｘ，ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｊａｃｋ ｂｅａｎ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）ｕｒｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８４０：９３５－９４４）が挙げられる。市販のペプチド殺虫剤の例としては、温室内の野菜及び観賞植物におけるアザミウマの処理用のＳｐｅａｒ（商標）－Ｔ、コロラドハムシを防除するためのＳｐｅａｒ（商標）－Ｐ、及び作物を鱗翅目の有害生物から保護するためのＳｐｅａｒ（商標）－Ｃ（Ｖｅｓｔａｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）が挙げられる。副胞子結晶毒素（ＰＣ）と呼ばれる、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｃｕｓ由来の新規の殺虫性タンパク質は、カイコ及びＣｒｙ１Ａｃ耐性Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ株に対して経口病原性活性及び致死性を示す（Ｌｉｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＣ，ａ ｎｏｖｅｌ ｏｒａｌ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｃｕｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｏｓｔ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｖｉａ ＡＰＮ ａｎｄ ＢｔＲ－１７５．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１１１０１）。

【0290】

情報化学物質は、同じ種または異なる種の個体において挙動変化を引き起こす、１つの生物によってもたらされる化学シグナルである。作物保護のために最も広く使用される情報化学物質は、昆虫性フェロモンであり、これらのうちの一部は、今では合成することができ、大量捕獲、おびき寄せて殺傷する（ｌｕｒｅ－ａｎｄ－ｋｉｌｌ）システム、及び交信撹乱による監視または有害生物防除に使用される。世界的に、６６０，０００ヘクタール超で交信撹乱が使用され、果樹園作物において特に有用となっている。

【0291】

本明細書で使用されるとき、「トランスジェニック殺虫性形質」とは、１つまたは複数の有害生物に有害な核酸またはポリペプチドを発現するように遺伝子操作された植物が呈する形質を指す。一実施形態では、本開示の植物は、本開示の有害生物のうちのいずれか１つまたは複数による付着及び／または侵入に耐性である。一実施形態では、形質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の植物性殺虫性タンパク質（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＶＩＰ）、植物由来のレクチン及びプロテイナーゼ阻害剤、テルペノイド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種由来のコレステロールオキシダーゼ、昆虫キチナーゼ及び真菌キチン分解酵素、細菌性殺虫性タンパク質、ならびに早期認識耐性遺伝子の発現を含む。別の実施形態では、形質は、有害生物に対して毒性であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓタンパク質の発現を含む。一実施形態では、Ｂｔタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質（結晶タンパク質）である。Ｂｔ作物には、Ｂｔトウモロコシ、Ｂｔ綿、及びＢｔダイズが含まれる。Ｂｔ毒素は、Ｃｒｙファミリー由来であり得（例えば、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７－８１２を参照されたい）、これは鱗翅目、鞘翅目、及び双翅目に対して特に有効である。

【0292】

Ｂｔ Ｃｒｙ及びＣｙｔ毒素は、それらの宿主の細胞膜に入り込むために、またはそれを通過して移行するために立体構造変化を経る水溶性タンパク質として分泌される、膜孔形成毒素（ＰＦＴ）として知られる細菌毒素のクラスに属する。ＰＦＴの以下の２つの主要な群、すなわち、（ｉ）α－ヘリックス領域が膜貫通孔を形成するα－ヘリックス状毒素、及び（ｉｉ）各モノマーからのβシートヘアピンから構成されるβ－バレルを形成することによって膜に入り込むβ－バレル毒素が存在する。Ｐａｒｋｅｒ ＭＷ，Ｆｅｉｌ ＳＣ，“Ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ；８８（１）：９１－１４２を参照されたい。ＰＦＴの第１のクラスには、コリシン、外毒素Ａ、ジフテリア毒素、及び再び３ドメインＣｒｙ毒素等の毒素が含まれる。一方で、エロリジン、α－溶血毒、炭疽防御抗原、パーフリンゴリジンＯとしてのコレステロール依存性毒素、及びＣｙｔ毒素は、β－バレル毒素に属する（同文献より）。一般に、ＰＦＴ産生細菌は、それらの毒素を分泌し、これらの毒素は、宿主細胞表面上に位置する特定の受容体と相互作用する。ほとんどの場合、ＰＦＴは、受容体結合後に宿主プロテアーゼによって活性化されて、挿入能力のあるオリゴマー構造の形成を誘導する。最後に、膜挿入は、ほとんどの場合、タンパク質のモルテングロビュール状態（ｍｏｌｔｅｎ ｇｌｏｂｕｌｅ ｓｔａｔｅ）を誘導する、ｐＨの減少によって誘発される（同文献より）。

【0293】

Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質を産生するトランスジェニック作物の開発は、環境に優しい代替物による化学殺虫剤の置換を可能にしてきた。トランスジェニック植物において、Ｃｒｙ毒素は、継続的に産生されるため、この毒素は分解から保護され、咀嚼性昆虫及び穿孔性昆虫に到達可能となる。植物におけるＣｒｙタンパク質産生は、植物に偏らせたコドン使用頻度を用いたｃｒｙ遺伝子の操作、プロトキシンの推定上のスプライシングシグナル配列の除去及びカルボキシ末端領域の欠失によって改善されてきた。Ｓｃｈｕｌｅｒ ＴＨ，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｓｅｃｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；１６：１６８－１７５を参照されたい。昆虫耐性作物の使用は、これらのトランスジェニック作物が植栽される地帯において化学農薬の使用を大幅に削減してきた。Ｑａｉｍ Ｍ，Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ Ｄ，“Ｙｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｒｏｐｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３ Ｆｅｂ ７；２９９（５６０８）：９００－２を参照されたい。

【0294】

既知のＣｒｙタンパク質には、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ４、Ｃｒｙ５、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１０、Ｃｒｙ１１、Ｃｒｙ１２、Ｃｒｙ１３、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ１６、Ｃｒｙ１７、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ１９、Ｃｒｙ２０、Ｃｒｙ２１、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ２４、Ｃｒｙ２５、Ｃｒｙ２６、Ｃｒｙ２７、Ｃｒｙ２８、Ｃｒｙ２９、Ｃｒｙ３０、Ｃｒｙ３１、Ｃｒｙ３２、Ｃｒｙ３３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ３８、Ｃｒｙ３９、Ｃｒｙ４０、Ｃｒｙ４１、Ｃｒｙ４２、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ４４、Ｃｒｙ４５、Ｃｒｙ４６、Ｃｒｙ４７、Ｃｒｙ４９、Ｃｒｙ５１、Ｃｒｙ５２、Ｃｒｙ５３、Ｃｒｙ５４、Ｃｒｙ５５、Ｃｒｙ５６、Ｃｒｙ５７、Ｃｒｙ５８、Ｃｒｙ５９、Ｃｒｙ６０、Ｃｒｙ６１、Ｃｒｙ６２、Ｃｒｙ６３、Ｃｒｙ６４、Ｃｒｙ６５、Ｃｒｙ６６、Ｃｒｙ６７、Ｃｒｙ６８、Ｃｒｙ６９、Ｃｒｙ７０、及びＣｒｙ７１クラスのδ－エンドトキシン遺伝子を含むがこれらに限定されないδ－エンドトキシン、ならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞溶解性ｃｙｔ１及びｃｙｔ２遺伝子が含まれる。

【0295】

これらのクラスのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫性タンパク質のメンバーには、ＣｒｙｌＡａ１（受託番号ＡＡＡ２２３５３）、Ｃｒｙ１Ａａ２（受託番号ＡＡＡ２２５５２）、Ｃｒｙ１Ａａ３（受託番号ＢＡＡ００２５７）、Ｃｒｙ１Ａａ４（受託番号ＣＡＡ３１８８６）、Ｃｒｙ１Ａａ５（受託番号ＢＡＡ０４４６８）、Ｃｒｙ１Ａａ６（受託番号ＡＡＡ８６２６５）、Ｃｒｙ１Ａａ７（受託番号ＡＡＤ４６１３９）、Ｃｒｙ１Ａａ８（受託番号１２６１４９）、Ｃｒｙ１Ａａ９（受託番号ＢＡＡ７７２１３）、ＣｒｙｌＡａ１０（受託番号ＡＡＤ５５３８２）、ＣｒｙｌＡａ１１（受託番号ＣＡＡ７０８５６）、Ｃｒｙ１Ａａ１２（受託番号ＡＡＰ８０１４６）、Ｃｒｙ１Ａａ１３（受託番号ＡＡＭ４４３０５）、Ｃｒｙ１Ａａ１４（受託番号ＡＡＰ４０６３９）、Ｃｒｙ１Ａａ１５（受託番号ＡＡＹ６６９９３）、Ｃｒｙ１Ａａ１６（受託番号ＨＱ４３９７７６）、Ｃｒｙ１Ａａ１７（受託番号ＨＱ４３９７８８）、Ｃｒｙ１Ａａ１８（受託番号ＨＱ４３９７９０）、Ｃｒｙ１Ａａ１９（受託番号ＨＱ６８５１２１）、Ｃｒｙ１Ａａ２０（受託番号ＪＦ３４０１５６）、Ｃｒｙ１Ａａ２１（受託番号ＪＮ６５１４９６）、Ｃｒｙ１Ａａ２２（受託番号ＫＣ１５８２２３）、Ｃｒｙ１Ａｂｌ（受託番号ＡＡＡ２２３３０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２（受託番号ＡＡＡ２２６１３）、Ｃｒｙ１Ａｂ３（受託番号ＡＡＡ２２５６１）、Ｃｒｙ１Ａｂ４（受託番号ＢＡＡ０００７１）、Ｃｒｙ１Ａｂ５（受託番号ＣＡＡ２８４０５）、Ｃｒｙ１Ａｂ６（受託番号ＡＡＡ２２４２０）、Ｃｒｙ１Ａｂ７（受託番号ＣＡＡ３１６２０）、Ｃｒｙ１Ａｂ８（受託番号ＡＡＡ２２５５１）、Ｃｒｙ１Ａｂ９（受託番号ＣＡＡ３８７０１）、Ｃｒｙ１Ａｂ１０（受託番号Ａ２９１２５）、ＣｒｙｌＡｂ１１（受託番号Ｉｌ２４１９）、Ｃｒｙ１Ａｂ１２（受託番号ＡＡＣ６４００３）、Ｃｒｙ１Ａｂ１３（受託番号ＡＡＮ７６４９４）、Ｃｒｙ１Ａｂ１４（受託番号ＡＡＧ１６８７７）、Ｃｒｙ１Ａｂ１５（受託番号ＡＡ０１３３０２）、Ｃｒｙ１Ａｂ１６（受託番号ＡＡＫ５５５４６）、Ｃｒｙ１Ａｂ１７（受託番号ＡＡＴ４６４１５）、Ｃｒｙ１Ａｂ１８（受託番号ＡＡＱ８８２５９）、Ｃｒｙ１Ａｂ１９（受託番号ＡＡＷ３１７６１）、Ｃｒｙ１Ａｂ２０（受託番号ＡＢＢ７２４６０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２１（受託番号ＡＢＳ１８３８４）、Ｃｒｙ１Ａｂ２２（受託番号ＡＢＷ８７３２０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２３（受託番号ＨＱ４３９７７７）、Ｃｒｙ１Ａｂ２４（受託番号ＨＱ４３９７７８）、Ｃｒｙ１Ａｂ２５（受託番号ＨＱ６８５１２２）、Ｃｒｙ１Ａｂ２６（受託番号ＨＱ８４７７２９）、Ｃｒｙ１Ａｂ２７（受託番号ＪＮ１３５２４９）、Ｃｒｙ１Ａｂ２８（受託番号ＪＮ１３５２５０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２９（受託番号ＪＮ１３５２５１）、Ｃｒｙ１Ａｂ３０（受託番号ＪＮ１３５２５２）、Ｃｒｙ１Ａｂ３１（受託番号ＪＮ１３５２５３）、Ｃｒｙ１Ａｂ３２（受託番号ＪＮ１３５２５４）、Ｃｒｙ１Ａｂ３３（受託番号ＡＡＳ９３７９８）、Ｃｒｙ１Ａｂ３４（受託番号ＫＣ１５６６６８）、Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＡＫ１４３３６）、Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＡＫ１４３３７）、Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＡＫ１４３３８）、Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＢＧ８８８５８）、Ｃｒｙ１Ａｃ１（受託番号ＡＡＡ２２３３１）、Ｃｒｙ１Ａｃ２（受託番号ＡＡＡ２２３３８）、Ｃｒｙ１Ａｃ３（受託番号ＣＡＡ３８０９８）、Ｃｒｙ１Ａｃ４（受託番号ＡＡＡ７３０７７）、Ｃｒｙ１Ａｃ５（受託番号ＡＡＡ２２３３９）、Ｃｒｙ１Ａｃ６（受託番号ＡＡＡ８６２６６）、Ｃｒｙ１Ａｃ７（受託番号ＡＡＢ４６９８９）、Ｃｒｙ１Ａｃ８（受託番号ＡＡＣ４４８４１）、Ｃｒｙ１Ａｃ９（受託番号ＡＡＢ４９７６８）、ＣｒｙｌＡｃ１０（受託番号ＣＡＡ０５５０５）、ＣｒｙｌＡｃ１１（受託番号ＣＡＡ１０２７０）、Ｃｒｙ１Ａｃ１２（受託番号Ｉｌ２４１８）、Ｃｒｙ１Ａｃ１３（受託番号ＡＡＤ３８７０１）、Ｃｒｙ１Ａｃ１４（受託番号ＡＡＱ０６６０７）、Ｃｒｙ１Ａｃ１５（受託番号ＡＡＮ０７７８８）、Ｃｒｙ１Ａｃ１６（受託番号ＡＡＵ８７０３７）、ＣｒｙｌＡｃ１７（受託番号ＡＡＸ１８７０４）、Ｃｒｙ１Ａｃ１８（受託番号ＡＡＹ８８３４７）、Ｃｒｙ１Ａｃ１９（受託番号ＡＢＤ３７０５３）、Ｃｒｙ１Ａｃ２０（受託番号ＡＢＢ８９０４６）、Ｃｒｙ１Ａｃ２１（受託番号ＡＡＹ６６９９２）、Ｃｒｙ１Ａｃ２２（受託番号ＡＢＺ０１８３６）、Ｃｒｙ１Ａｃ２３（受託番号ＣＡＱ３０４３１）、Ｃｒｙ１Ａｃ２４（受託番号ＡＢＬ０１５３５）、Ｃｒｙ１Ａｃ２５（受託番号ＦＪ５１３３２４）、Ｃｒｙ１Ａｃ２６（受託番号ＦＪ６１７４４６）、Ｃｒｙ１Ａｃ２７（受託番号ＦＪ６１７４４７）、Ｃｒｙ１Ａｃ２８（受託番号ＡＣＭ９０３１９）、Ｃｒｙ１Ａｃ２９（受託番号ＤＱ４３８９４１）、Ｃｒｙ１Ａｃ３０（受託番号ＧＱ２２７５０７）、Ｃｒｙ１Ａｃ３１（受託番号ＧＵ４４６６７４）、Ｃｒｙ１Ａｃ３２（受託番号ＨＭ０６１０８１）、Ｃｒｙ１Ａｃ３３（受託番号ＧＱ８６６９１３）、Ｃｒｙ１Ａｃ３４（受託番号ＨＱ２３０３６４）、Ｃｒｙ１Ａｃ３５（受託番号ＪＦ３４０１５７）、Ｃｒｙ１Ａｃ３６（受託番号ＪＮ３８７１３７）、Ｃｒｙ１Ａｃ３７（受託番号ＪＱ３１７６８５）、ＣｒｙｌＡｄ１（受託番号ＡＡＡ２２３４０）、Ｃｒｙ１Ａｄ２（受託番号ＣＡＡ０１８８０）、ＣｒｙｌＡｅ１（受託番号ＡＡＡ２２４１０）、ＣｒｙｌＡｆ１（受託番号ＡＡＢ８２７４９）、ＣｒｙｌＡｇ１（受託番号ＡＡＤ４６１３７）、ＣｒｙｌＡｈ１（受託番号ＡＡＱ１４３２６）、Ｃｒｙ１Ａｈ２（受託番号ＡＢＢ７６６６４）、Ｃｒｙ１Ａｈ３（受託番号ＨＱ４３９７７９）、ＣｒｙｌＡｉ１（受託番号ＡＡ０３９７１９）、Ｃｒｙ１Ａｉ２（受託番号ＨＱ４３９７８０）、Ｃｒｙ１Ａ様（受託番号ＡＡＫ１４３３９）、Ｃｒｙ１Ｂａｌ（受託番号ＣＡＡ２９８９８）、Ｃｒｙ１Ｂａ２（受託番号ＣＡＡ６５００３）、Ｃｒｙ１Ｂａ３（受託番号ＡＡＫ６３２５１）、Ｃｒｙ１Ｂａ４（受託番号ＡＡＫ５１０８４）、Ｃｒｙ１Ｂａ５（受託番号ＡＢ０２０８９４）、Ｃｒｙ１Ｂａ６（受託番号ＡＢＬ６０９２１）、Ｃｒｙ１Ｂａ７（受託番号ＨＱ４３９７８１）、ＣｒｙｌＢｂ１（受託番号ＡＡＡ２２３４４）、Ｃｒｙ１Ｂｂ２（受託番号ＨＱ４３９７８２）、Ｃｒｙ１Ｂｃｌ（受託番号ＣＡＡ８６５６８）、Ｃｒｙ１Ｂｄｌ（受託番号ＡＡＤ１０２９２）、Ｃｒｙ１Ｂｄ２（受託番号ＡＡＭ９３４９６）、ＣｒｙｌＢｅ１（受託番号ＡＡＣ３２８５０）、Ｃｒｙ１Ｂｅ２（受託番号ＡＡＱ５２３８７）、Ｃｒｙ１Ｂｅ３（受託番号ＡＣＶ９６７２０）、Ｃｒｙ１Ｂｅ４（受託番号ＨＭ０７００２６）、ＣｒｙｌＢｆ１（受託番号ＣＡＣ５０７７８）、Ｃｒｙ１Ｂｆ２（受託番号ＡＡＱ５２３８０）、Ｃｒｙ１Ｂｇｌ（受託番号ＡＡ０３９７２０）、Ｃｒｙ１Ｂｈｌ（受託番号ＨＱ５８９３３１）、Ｃｒｙ１Ｂｉｌ（受託番号ＫＣ１５６７００）、Ｃｒｙ１Ｃａｌ（受託番号ＣＡＡ３０３９６）、Ｃｒｙ１Ｃａ２（受託番号ＣＡＡ３１９５１）、Ｃｒｙ１Ｃａ３（受託番号ＡＡＡ２２３４３）、Ｃｒｙ１Ｃａ４（受託番号ＣＡＡ０１８８６）、Ｃｒｙ１Ｃａ５（受託番号ＣＡＡ６５４５７）、Ｃｒｙ１Ｃａ６［１］（受託番号ＡＡＦ３７２２４）、Ｃｒｙ１Ｃａ７（受託番号ＡＡＧ５０４３８）、Ｃｒｙ１Ｃａ８（受託番号ＡＡＭ００２６４）、Ｃｒｙ１Ｃａ９（受託番号ＡＡＬ７９３６２）、ＣｒｙｌＣａ１０（受託番号ＡＡＮ１６４６２）、Ｃｒｙ１Ｃａ１１（受託番号ＡＡＸ５３０９４）、Ｃｒｙ１Ｃａ１２（受託番号ＨＭ０７００２７）、Ｃｒｙ１Ｃａ１３（受託番号ＨＱ４１２６２１）、Ｃｒｙ１Ｃａ１４（受託番号ＪＮ６５１４９３）、ＣｒｙｌＣｂ１（受託番号Ｍ９７８８０）、Ｃｒｙ１Ｃｂ２（受託番号ＡＡＧ３５４０９）、Ｃｒｙ１Ｃｂ３（受託番号ＡＣＤ５０８９４）、Ｃｒｙ１Ｃｂ様（受託番号ＡＡＸ６３９０１）、Ｃｒｙ１Ｄａｌ（受託番号ＣＡＡ３８０９９）、Ｃｒｙ１Ｄａ２（受託番号Ｉ７６４１５）、Ｃｒｙ１Ｄａ３（受託番号ＨＱ４３９７８４）、Ｃｒｙ１Ｄｂｌ（受託番号ＣＡＡ８０２３４）、Ｃｒｙ１Ｄｂ２（受託番号ＡＡＫ４８９３７）、Ｃｒｙ１Ｄｃｌ（受託番号ＡＢＫ３５０７４）、Ｃｒｙ１Ｅａｌ（受託番号ＣＡＡ３７９３３）、Ｃｒｙ１Ｅａ２（受託番号ＣＡＡ３９６０９）、Ｃｒｙ１Ｅａ３（受託番号ＡＡＡ２２３４５）、Ｃｒｙ１Ｅａ４（受託番号ＡＡＤ０４７３２）、Ｃｒｙ１Ｅａ５（受託番号Ａ１５５３５）、Ｃｒｙ１Ｅａ６（受託番号ＡＡＬ５０３３０）、Ｃｒｙ１Ｅａ７（受託番号ＡＡＷ７２９３６）、Ｃｒｙ１Ｅａ８（受託番号ＡＢＸ１１２５８）、Ｃｒｙ１Ｅａ９（受託番号ＨＱ４３９７８５）、ＣｒｙｌＥａ１０（受託番号ＡＤＲ００３９８）、ＣｒｙｌＥａ１１（受託番号ＪＱ６５２４５６）、Ｃｒｙ１Ｅｂｌ（受託番号ＡＡＡ２２３４６）、Ｃｒｙ１Ｆａｌ（受託番号ＡＡＡ２２３４８）、Ｃｒｙ１Ｆａ２（受託番号ＡＡＡ２２３４７）、Ｃｒｙ１Ｆａ３（受託番号ＨＭ０７００２８）、Ｃｒｙ１Ｆａ４（受託番号ＨＭ４３９６３８）、ＣｒｙｌＦｂｌ（受託番号ＣＡＡ８０２３５）、Ｃｒｙ１Ｆｂ２（受託番号ＢＡＡ２５２９８）、Ｃｒｙ１Ｆｂ３（受託番号ＡＡＦ２１７６７）、Ｃｒｙ１Ｆｂ４（受託番号ＡＡＣ１０６４１）、Ｃｒｙ１Ｆｂ５（受託番号ＡＡ０１３２９５）、Ｃｒｙ１Ｆｂ６（受託番号ＡＣＤ５０８９２）、Ｃｒｙ１Ｆｂ７（受託番号ＡＣＤ５０８９３）、ＣｒｙｌＧａｌ（受託番号ＣＡＡ８０２３３）、Ｃｒｙ１Ｇａ２（受託番号ＣＡＡ７０５０６）、ＣｒｙｌＧｂｌ（受託番号ＡＡＤ１０２９１）、Ｃｒｙ１Ｇｂ２（受託番号ＡＡ０１３７５６）、ＣｒｙｌＧｃｌ（受託番号ＡＡＱ５２３８１）、ＣｒｙｌＨａ１（受託番号ＣＡＡ８０２３６）、ＣｒｙｌＨｂｌ（受託番号ＡＡＡ７９６９４）、Ｃｒｙ１Ｈｂ２（受託番号ＨＱ４３９７８６）、ＣｒｙｌＨ様（受託番号ＡＡＦ０１２１３）、ＣｒｙｌＩａｌ（受託番号ＣＡＡ４４６３３）、Ｃｒｙ１Ｉａ２（受託番号ＡＡＡ２２３５４）、Ｃｒｙ１Ｉａ３（受託番号ＡＡＣ３６９９９）、Ｃｒｙ１Ｉａ４（受託番号ＡＡＢ００９５８）、Ｃｒｙ１Ｉａ５（受託番号ＣＡＡ７０１２４）、Ｃｒｙ１Ｉａ６（受託番号ＡＡＣ２６９１０）、Ｃｒｙ１Ｉａ７（受託番号ＡＡＭ７３５１６）、Ｃｒｙ１Ｉａ８（受託番号ＡＡＫ６６７４２）、Ｃｒｙ１Ｉａ９（受託番号ＡＡＱ０８６１６）、Ｃｒｙ１Ｉａ１０（受託番号ＡＡＰ８６７８２）、ＣｒｙｌＩａ１１（受託番号ＣＡＣ８５９６４）、Ｃｒｙ１Ｉａ１２（受託番号ＡＡＶ５３３９０）、Ｃｒｙ１Ｉａ１３（受託番号ＡＢＦ８３２０２）、Ｃｒｙ１Ｉａ１４（受託番号ＡＣＧ６３８７１）、Ｃｒｙ１Ｉａ１５（受託番号ＦＪ６１７４４５）、Ｃｒｙ１Ｉａ１６（受託番号ＦＪ６１７４４８）、ＣｒｙｌＩａｌ７（受託番号ＧＵ９８９１９９）、ＣｒｙｌＩａｌ８（受託番号ＡＤＫ２３８０１）、ＣｒｙｌＩａｌ９（受託番号ＨＱ４３９７８７）、Ｃｒｙ１Ｉａ２０（受託番号ＪＱ２２８４２６）、Ｃｒｙ１Ｉａ２１（受託番号ＪＱ２２８４２４）、Ｃｒｙ１Ｉａ２２（受託番号ＪＱ２２８４２７）、Ｃｒｙ１Ｉａ２３（受託番号ＪＱ２２８４２８）、Ｃｒｙ１Ｉａ２４（受託番号ＪＱ２２８４２９）、Ｃｒｙ１Ｉａ２５（受託番号ＪＱ２２８４３０）、Ｃｒｙ１Ｉａ２６（受託番号ＪＱ２２８４３１）、Ｃｒｙ１Ｉａ２７（受託番号ＪＱ２２８４３２）、Ｃｒｙ１Ｉａ２８（受託番号ＪＱ２２８４３３）、Ｃｒｙ１Ｉａ２９（受託番号ＪＱ２２８４３４）、Ｃｒｙ１Ｉａ３０（受託番号ＪＱ３１７６８６）、Ｃｒｙ１Ｉａ３１（受託番号ＪＸ９４４０３８）、Ｃｒｙ１Ｉａ３２（受託番号ＪＸ９４４０３９）、Ｃｒｙ１Ｉａ３３（受託番号ＪＸ９４４０４０）、ＣｒｙｌＩｂ１（受託番号ＡＡＡ８２１１４）、Ｃｒｙ１Ｉｂ２（受託番号ＡＢＷ８８０１９）、Ｃｒｙ１Ｉｂ３（受託番号ＡＣＤ７５５１５）、Ｃｒｙ１Ｉｂ４（受託番号ＨＭ０５１２２７）、Ｃｒｙ１Ｉｂ５（受託番号ＨＭ０７００２８）、Ｃｒｙ１Ｉｂ６（受託番号ＡＤＫ３８５７９）、Ｃｒｙ１Ｉｂ７（受託番号ＪＮ５７１７４０）、Ｃｒｙ１Ｉｂ８（受託番号ＪＮ６７５７１４）、Ｃｒｙ１Ｉｂ９（受託番号ＪＮ６７５７１５）、Ｃｒｙ

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受託番号ＡＣＵ２４７８２）、Ｃｒｙ６０Ａａ２（受託番号ＥＡ０５７２５４）、Ｃｒｙ６０Ａａ３（受託番号ＥＥＭ９９２７８）、Ｃｒｙ６０Ｂａｌ（受託番号ＧＵ８１０８１８）、Ｃｒｙ６０Ｂａ２（受託番号ＥＡ０５７２５３）、Ｃｒｙ６０Ｂａ３（受託番号ＥＥＭ９９２７９）、Ｃｒｙ６１Ａａｌ（受託番号ＨＭ０３５０８７）、Ｃｒｙ６１Ａａ２（受託番号ＨＭ１３２１２５）、Ｃｒｙ６１Ａａ３（受託番号ＥＥＭ１９３０８）、Ｃｒｙ６２Ａａｌ（受託番号ＨＭ０５４５０９）、Ｃｒｙ６３Ａａｌ（受託番号ＢＡ１４４０２８）、Ｃｒｙ６４Ａａｌ（受託番号ＢＡＪ０５３９７）、Ｃｒｙ６５Ａａｌ（受託番号ＨＭ４６１８６８）、Ｃｒｙ６５Ａａ２（受託番号ＺＰ＿０４１２３８３８）、Ｃｒｙ６６Ａａｌ（受託番号ＨＭ４８５５８１）、Ｃｒｙ６６Ａａ２（受託番号ＺＰ＿０４０９９９４５）、Ｃｒｙ６７Ａａｌ（受託番号ＨＭ４８５５８２）、Ｃｒｙ６７Ａａ２（受託番号ＺＰ＿０４１４８８８２）、Ｃｒｙ６８Ａａｌ（受託番号ＨＱ１１３１１４）、Ｃｒｙ６９Ａａｌ（受託番号ＨＱ４０１００６）、Ｃｒｙ６９Ａａ２（受託番号ＪＱ８２１３８８）、Ｃｒｙ６９Ａｂｌ（受託番号ＪＮ２０９９５７）、Ｃｒｙ７０Ａａｌ（受託番号ＪＮ６４６７８１）、Ｃｒｙ７０Ｂａｌ（受託番号ＡＤ０５１０７０）、Ｃｒｙ７０Ｂｂｌ（受託番号ＥＥＬ６７２７６）、Ｃｒｙ７１Ａａｌ（受託番号ＪＸ０２５５６８）、Ｃｒｙ７２Ａａｌ（受託番号ＪＸ０２５５６９）、Ｃｙｔ１Ａａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３１８２）、Ｃｙｔ１Ａｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９８７９３）、Ｃｙｔ１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３７１９６）、Ｃｙｔ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１４１４７）、及びＣｙｔ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５２０４３）が含まれるが、これらに限定されない。

【0296】

δ－エンドトキシンの例としてはまた、米国特許第５，８８０，２７５号、同第７，８５８，８４９号、同第８，５３０，４１１号、同第８，５７５，４３３号、及び同第８，６８６，２３３号のＣｒｙ１Ａタンパク質；米国特許第８，３０４，６０４号、同第８，３０４，６０５号、及び同第８，４７６，２２６号のＤＩＧ－３またはＤＩＧ－１１毒素（Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ３Ａ等のｃｒｙタンパク質のａ－ヘリックス１及び／またはａ－ヘリックス２のＮ末端欠失変種）；米国特許出願第１０／５２５，３１８号のＣｒｙ１Ｂ；米国特許第６，０３３，８７４号のＣｒｙ１Ｃ；米国特許第５，１８８，９６０号及び同第６，２１８，１８８号のＣｒｙ１Ｆ；米国特許第７，０７０，９８２号、同第６，９６２，７０５号、及び同第６，７１３，０６３号）のＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ；米国特許第７，０６４，２４９号）のＣｒｙ２Ａｂタンパク質等のＣｒｙ２タンパク質；可変領域の固有の組み合わせ及び少なくとも２つの異なるＣｒｙタンパク質の保存されたブロックを融合することによって作出される、操作されたハイブリッド殺虫性タンパク質（ｅＨＩＰ）を含むがこれらに限定されないＣｒｙ３Ａタンパク質（米国特許公開第２０１０／００１７９１４号）；Ｃｒｙ４タンパク質；Ｃｒｙ５タンパク質；Ｃｒｙ６タンパク質；米国特許第７，３２９，７３６号、同第７，４４９，５５２号、同第７，８０３，９４３号、同第７，４７６，７８１号、同第７，１０５，３３２号、同第７，３７８，４９９号、及び同第７，４６２，７６０号のＣｒｙ８タンパク質；米国特許第８，８０２，９３３号のＣｒｙ９Ｄタンパク質及び米国特許第８，８０２，９３４号のＣｒｙ９Ｂタンパク質を含むがこれらに限定されない、Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９Ｅ、及びＣｒｙ９Ｆファミリーの成員等のＣｒｙ９タンパク質；Ｎａｉｍｏｖ，ｅｔ ａｌ．，（２００８），“Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，”７４：７１４５－７１５１のＣｒｙ１５タンパク質；米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５号、及び同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ２２、Ｃｒｙ３４Ａｂｌタンパク質；米国特許第６，２４８，５３５号、同第６，３２６，３５１号、同第６，３９９，３３０号、同第６，９４９，６２６号、同第７，３８５，１０７号、及び同第７，５０４，２２９号のＣｒｙＥＴ３３及びｃｒｙＥＴ３４タンパク質；米国特許公開第２００６／０１９１０３４号、同第２０１２／０２７８９５４号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／１３９００４号のＣｒｙＥＴ３３及びＣｒｙＥＴ３４ホモログ；米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１号、及び同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ３５Ａｂｌタンパク質；Ｃｒｙ４６タンパク質、Ｃｒｙ５１タンパク質、Ｃｒｙ二成分毒素（ｂｉｎａｒｙ ｔｏｘｉｎ）；ＴＩＣ９０１または関連する毒素；米国特許出願公開第２００８／０２９５２０７号のＴＩＣ８０７；ＰＣＴ ＵＳ２００６／０３３８６７のＥＴ２９、ＥＴ３７、ＴＩＣ８０９、ＴＩＣ８１０、ＴＩＣ８１２、ＴＩＣ１２７、ＴＩＣ１２８；米国特許第８，５１３，４９４号のＴＩＣ８５３毒素、米国特許第８，２３６，７５７号のＡＸＭＩ－０２７、ＡＸＭＩ－０３６、及びＡＸＭＩ－０３８；米国特許第７，９２３，６０２号のＡＸＭＩ－０３１、ＡＸＭＩ－０３９、ＡＸＭＩ－０４０、ＡＸＭＩ－０４９；ＷＯ２００６／０８３８９１のＡＸＭＩ－０１８、ＡＸＭＩ－０２０、及びＡＸＭＩ－０２１；ＷＯ２００５／０３８０３２のＡＸＭＩ－０１０；ＷＯ２００５／０２１５８５のＡＸＭＩ－００３；米国特許出願公開第２００４／０２５０３１１号のＡＸＭＩ－００８；米国特許出願公開第２００４／０２１６１８６号のＡＸＭＩ－００６；米国特許出願公開第２００４／０２１０９６５号のＡＸＭＩ－００７；米国特許出願第２００４／０２１０９６４号のＡＸＭＩ－００９；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１７号のＡＸＭＩ－０１４；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１６号のＡＸＭＩ－００４；ＷＯ２００６／１１９４５７号のＡＸＭＩ－０２８及びＡＸＭＩ－０２９；ＷＯ２００４／０７４４６２号のＡＸＭＩ－００７、ＡＸＭＩ－００８、ＡＸＭＩ－００８０ｒｆ２、ＡＸＭＩ－００９、ＡＸＭＩ－０１４、及びＡＸＭＩ－００４；米国特許第８，０８４，４１６号のＡＸＭＩ－１５０；米国特許出願公開第２０１１／００２３１８４号のＡＸＭＩ－２０５；米国特許出願公開第２０１１／０２６３４８８号のＡＸＭＩ－０１１、ＡＸＭＩ－０１２、ＡＸＭＩ－０１３、ＡＸＭＩ－０１５、ＡＸＭＩ－０１９、ＡＸＭＩ－０４４、ＡＸＭＩ－０３７、ＡＸＭＩ－０４３、ＡＸＭＩ－０３３、ＡＸＭＩ－０３４、ＡＸＭＩ－０２２、ＡＸＭＩ－０２３、ＡＸＭＩ－０４１、ＡＸＭＩ－０６３、及びＡＸＭＩ－０６４；米国特許出願公開第２０１０／０１９７５９２号のＡＸＭＩ－Ｒｌ及び関連するタンパク質；ＷＯ２０１１／１０３２４８号のＡＸＭＩ２２１Ｚ、ＡＸＭＩ２２２ｚ、ＡＸＭＩ２２３ｚ、ＡＸＭＩ２２４ｚ、及びＡＸＭＩ２２５ｚ；ＷＯ２０１１／１０３２４７及び米国特許第８，７５９，６１９号のＡＸＭＩ２１８、ＡＸＭＩ２１９、ＡＸＭＩ２２０、ＡＸＭＩ２２６、ＡＸＭＩ２２７、ＡＸＭＩ２２８、ＡＸＭＩ２２９、ＡＸＭＩ２３０、及びＡＸＭＩ２３１；米国特許第８，３３４，４３１号のＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３、ＡＸＭＩ－００５、ＡＸＭＩ－１６３、及びＡＸＭＩ－１８４；米国特許出願公開第２０１０／０２９８２１１号のＡＸＭＩ－００１、ＡＸＭＩ－００２、ＡＸＭＩ－０３０、ＡＸＭＩ－０３５、及びＡＸＭＩ－０４５；米国特許出願公開第２００９／０１４４８５２号のＡＸＭＩ－０６６及びＡＸＭＩ－０７６；米国特許第８，３１８，９００号のＡＸＭＩ１２８、ＡＸＭＩ１３０、ＡＸＭＩ１３１、ＡＸＭＩ１３３、ＡＸＭＩ１４０、ＡＸＭＩ１４１、ＡＸＭＩ１４２、ＡＸＭＩ１４３、ＡＸＭＩ１４４、ＡＸＭＩ１４６、ＡＸＭＩ１４８、ＡＸＭＩ１４９、ＡＸＭＩ１５２、ＡＸＭＩ１５３、ＡＸＭＩ１５４、ＡＸＭＩ１５５、ＡＸＭＩ１５６、ＡＸＭＩ１５７、ＡＸＭＩ１５８、ＡＸＭＩ１６２、ＡＸＭＩ１６５、ＡＸＭＩ１６６、ＡＸＭＩ１６７、ＡＸＭＩ１６８、ＡＸＭＩ１６９、ＡＸＭＩ１７０、ＡＸＭＩ１７１、ＡＸＭＩ１７２、ＡＸＭＩ１７３、ＡＸＭＩ１７４、ＡＸＭＩ１７５、ＡＸＭＩ１７６、ＡＸＭＩ１７７、ＡＸＭＩ１７８、ＡＸＭＩ１７９、ＡＸＭＩ１８０、ＡＸＭＩ１８１、ＡＸＭＩ１８２、ＡＸＭＩ１８５、ＡＸＭＩ１８６、ＡＸＭＩ１８７、ＡＸＭＩ１８８、ＡＸＭＩ１８９；米国特許出願公開第２０１０／０００５５４３号のＡＸＭＩ０７９、ＡＸＭＩ０８０、ＡＸＭＩ０８１、ＡＸＭＩ０８２、ＡＸＭＩ０９１、ＡＸＭＩ０９２、ＡＸＭＩ０９６、ＡＸＭＩ０９７、ＡＸＭＩ０９８、ＡＸＭＩ０９９、ＡＸＭＩ１００、ＡＸＭＩ１０１、ＡＸＭＩ１０２、ＡＸＭＩ１０３、ＡＸＭＩ１０４、ＡＸＭＩ１０７、ＡＸＭＩ１０８、ＡＸＭＩ１０９、ＡＸＭＩ１１０、ＡＸＭＩ１１１、ＡＸＭＩ１１２、ＡＸＭＩ１１４、ＡＸＭＩ１１６、ＡＸＭＩ１１７、ＡＸＭＩ１１８、ＡＸＭＩ１１９、ＡＸＭＩ１２０、ＡＸＭＩ１２１、ＡＸＭＩ１２２、ＡＸＭＩ１２３、ＡＸＭＩ１２４、ＡＸＭＩ１２５７、ＡＸＭＩ１２６８、ＡＸＭＩ１２７、ＡＸＭＩ１２９、ＡＸＭＩ１６４、ＡＸＭＩ１５１、ＡＸＭＩ１６１、ＡＸＭＩ１８３、ＡＸＭＩ１３２、ＡＸＭＩ１３８、ＡＸＭＩ１３７、米国特許出願公開ＵＳ２０１４０２２３５９８号のＡＸＭＩ２７０、米国特許出願公開ＵＳ２０１４０２２３５９９号のＡＸＭＩ２７９、米国特許第８，３１９，０１９号の修飾されたタンパク質分解部位を有するＣｒｙ１Ａ及びＣｒｙ３Ａ等のｃｒｙタンパク質；米国特許出願公開第２０１１／００６４７１０号のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＶＢＴＳ ２５２８由来のＣｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａａ、及びＣｒｙ１Ｃａ毒素タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。他のＣｒｙタンパク質は、当業者に周知である。Ｎ．Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，”（１９９８）Ｖｏｌ ６２：８０７－８１３を参照されたい。また、：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ／にて、Ｎ．Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｏｘｉｎ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”（２０１６）も参照されたい。

【0297】

トランスジェニック植物形質としてのＣｒｙタンパク質の使用は、当業者に周知であり、ＣｒｙｌＡｃ、Ｃｒｙ１Ａｃ＋Ｃｒｙ２Ａｂ、ＣｒｙｌＡｂ、ＣｒｙｌＡ．１０５、ＣｒｙｌＦ、Ｃｒｙ１Ｆａ２、ＣｒｙｌＦ＋ＣｒｙｌＡｃ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂｂｌ、Ｃｒｙ３４Ａｂｌ、Ｃｒｙ３５Ａｂｌ、Ｖｉｐ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ９ｃ、及びＣＢＩ－Ｂｔを発現する植物を含むがこれらに限定されないＣｒｙトランスジェニック植物が、規制当局の承認を受けている。Ｓａｎａｈｕｊａ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ａ ｃｅｎｔｕｒｙ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”（２０１１）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｐｒｉｌ ９（３）：２８３－３００、及びｃｅｒａ－ｇｍｃ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ａｃｔｉｏｎ＝ｇｍ＿ｃｒｏｐ＿ｄａｔａｂａｓｅにて、ｔｈｅ ＣＥＲＡ（２０１０）ＧＭ Ｃｒｏｐ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＣＥＲＡ），ＩＬＳＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（これは「ｗｗｗ」のプレフィックスを使用してワールドワイドウェブでアクセスすることができる）を参照されたい。また、Ｖｉｐ３Ａｂ及びＣｒｙｌＦａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８２）、ＣｒｙｌＢＥ及びＣｒｙｌＦ（ＵＳ２０１２／０３１１７４６）、ＣｒｙｌＣＡ及びＣｒｙｌＡＢ（ＵＳ２０１２／０３１１７４５）、ＣｒｙｌＦ及びＣｒｙＣａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８１）、ＣｒｙｌＤＡ及びＣｒｙｌＢＥ（ＵＳ２０１２／０３３１５９０）、ＣｒｙｌＤＡ及びＣｒｙｌＦａ（ＵＳ２０１２／０３３１５８９）、ＣｒｙｌＡＢ及びＣｒｙｌＢＥ（ＵＳ２０１２／０３２４６０６）、ＣｒｙｌＦａ及びＣｒｙ２ＡａならびにＣｒｙｌｌ及びＣｒｙｌＥ（ＵＳ２０１２／０３２４６０５）、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ及びＣｒｙ６Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６９）、Ｃｒｙ３４Ａｂ／ＶＣｒｙ３５Ａｂ及びＣｒｙ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６８）、ＣｒｙｌＡｂ及びＣｒｙｌＦ（ＵＳ２０１４０１８２０１８）、ならびにＣｒｙ３Ａ及びＣｒｙｌＡｂまたはＶｉｐ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１１６１７０）等の、当業者に周知の１つよりも多くの殺有害生物性タンパク質を植物において発現させることができる。殺有害生物性タンパク質にはまた、米国特許第７，４９１，８６９号の脂質アシルヒドロラーゼを含む殺虫性リパーゼ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のもの等のコレステロールオキシダーゼ（Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５：１４０６－１４１３）が含まれる。

【0298】

殺有害生物性タンパク質にはまた、ＶＩＰ（植物性殺虫性タンパク質）毒素も含まれる。昆虫病原性細菌は、封入体または副胞子結晶に蓄積する殺虫性タンパク質（前述のＣｒｙ及びＣｙｔタンパク質等）、ならびに培養基中に分泌される殺虫性タンパク質を産生する。後者の中には、Ｖｉｐタンパク質があり、これは、それらのアミノ酸同一性に従って４つのファミリーに類別される。Ｖｉｐ１及びＶｉｐ２タンパク質は、二成分毒素として作用し、鞘翅目及び半翅目の一部の成員に対して毒性である。Ｖｉｐ１構成成分は、昆虫中腸の膜における受容体に結合すると考えられ、Ｖｉｐ２構成成分は細胞に侵入し、細胞内でアクチンに対してそのＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ活性を示すことにより、微小線維形成を阻止する。Ｖｉｐ３は、Ｖｉｐ１またはＶｉｐ２との配列類似性を何ら有せず、鱗翅目の多種多様な成員に対して毒性である。その作用様式は、タンパク質分解活性化、中腸上皮膜への結合、及び孔形成の点でＣｒｙタンパク質のそれに類似することが示されているが、Ｖｉｐ３Ａタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質と結合部位を共有しない。後者の特性により、それらは、トランスジェニック植物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ処理作物［Ｂｔ作物］）においてＣｒｙタンパク質と組み合わせて、昆虫耐性を阻止または遅延させると共に殺虫スペクトルを広げるための良好な候補となっている。Ｃｒｙタンパク質と組み合わせてＶｉｐ３Ａａタンパク質を発現する、商業的に栽培されるＢｔ綿及びＢｔメイズの品種が存在する。ごく最近報告されたＶｉｐ４ファミリーについては、標的昆虫は未だ見出されていない。Ｃｈａｋｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｖｉｐ）ｆｒｏｍ Ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２０１６ Ｍａｒ ２；８０（２）：３２９－５０を参照されたい。ＶＩＰについては、米国特許第５，８７７，０１２号、同第６，１０７，２７９号、同第６，１３７，０３３号、同第７，２４４，８２０号、同第７，６１５，６８６号、及び同第８，２３７，０２０号等に見出すことができる。他のＶＩＰタンパク質は、当業者に周知である（ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｖｉｐ．ｈｔｍｌを参照されたく、これは「ｗｗｗ」のプレフィックスを使用してワールドワイドウェブでアクセスすることができる）。

【0299】

殺有害生物性タンパク質にはまた、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ等の生物から得ることが可能な毒素複合体（ＴＣ）タンパク質も含まれる（米国特許第７，４９１，６９８号及び同第８，０８４，４１８号を参照されたい）。「独立型の（ｓｔａｎｄ ａｌｏｎｅ）」殺虫性活性を有するＴＣタンパク質もあれば、同じ所与の生物によって産生される独立型の毒素の活性を強化するＴＣタンパク質もある。「独立型の」ＴＣタンパク質（例えば、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、ＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓまたはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ由来）の毒性は、異なる属の供給源生物に由来する１つまたは複数のＴＣタンパク質「増強物質」によって強化され得る。３つの主要なタイプのＴＣタンパク質が存在する。本明細書で言及されるとき、クラスＡタンパク質（「タンパク質Ａ」）は、独立型の毒素である。クラスＢタンパク質（「タンパク質Ｂ」）及びクラスＣタンパク質（「タンパク質Ｃ」）は、クラスＡタンパク質の毒性を強化する。クラスＡタンパク質の例は、ＴｃｂＡ、ＴｃｄＡ、ＸｐｔＡｌ、及びＸｐｔＡ２である。クラスＢタンパク質の例は、ＴｃａＣ、ＴｃｄＢ、ＸｐｔＢｌＸｂ、及びＸｐｔＣｌ Ｗｉである。クラスＣタンパク質の例は、ＴｃｃＣ、ＸｐｔＣｌＸｂ、及びＸｐｔＢｌ Ｗｉである。殺有害生物性タンパク質にはまた、クモ、ヘビ、及びサソリ毒タンパク質も含まれる。クモ毒ペプチドの例としては、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）－１ペプチド及びその突然変異体（米国特許第８，３３４，３６６号）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0300】

一部の現在登録済みのＰＩＰが、表１１に列挙される。トランスジェニック植物はまた、昆虫遺伝子に指向されるｄｓＲＮＡを発現するように操作されている（Ｂａｕｍ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１３２２－１３２６、Ｍａｏ，Ｙ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａ ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｐｌａｎｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡｉ ｉｍｐａｉｒｓ ｌａｒｖａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｇｏｓｓｙｐｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１３０７－１３１３）。有害生物がトランスジェニック植物を摂食することによって、有害生物においてＲＮＡ干渉を誘発することができる。故に、有害生物の接触は、その有害生物の損傷または死を引き起こす。

【表11-1】

【表11-2】

【表11-3】

【表11-4】

【表11-5】

【表11-6】

【表11-7】

【表11-8】

【0301】

一部の実施形態では、本明細書に述べられる農薬のうちのいずれか１つまたは複数が、本開示の微生物のうちのいずれか１つまたは複数と共に利用されてもよく、種子を含めた植物またはその部位に施用され得る。

【0302】

除草剤
前述のように、本明細書で教示される任意の微生物を含み得る、本開示の農業組成物は、１つまたは複数の除草剤と組み合わされることがある。

【0303】

本明細書に記載の方法により生産される及び／または本明細書に記載されるような特性を有する細菌または細菌集団を含む組成物は、１つまたは複数の除草剤をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、除草組成物が、植物及び／または植物部位に施用される。一部の実施形態では、除草組成物が、本明細書に述べられる組成物に含まれてもよく、他の化合物と同時にまたは連続して、植物（複数可）またはその部位（複数可）に施用され得る。

【0304】

除草剤には、２，４－Ｄ、２，４－ＤＢ、アセトクロール、アシフルオルフェン、アラクロール、アメトリン、アトラジン、アミノピラリド、ベネフィン、ベンスルフロン、ベンスリド、ベンタゾン、ビシクロピロン、ブロマシル、ブロモキシニル、ブチラート、カルフェントラゾン、クロリムロン（ｃｈｌｏｒｉｍｕｒｏｎ）、クロルスルフロン（Ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、クレトジム、クロマゾン、クロピラリド、クロランスラム、シクロエート、ＤＣＰＡ、デスメディファム、ジカンバ、ジクロベニル、ジクロホップ、ジクロスラム（ｄｉｃｌｏｓｕｌａｍ）、ジフルフェンゾピル（ｄｉｆｌｕｆｅｎｚｏｐｙｒ）、ジメテナミド、ジクワット、ジウロン、ＤＳＭＡ、エンドタール、ＥＰＴＣ、エタルフルラリン、エトフメサート、フェノキサプロップ、フルアジホップ－Ｐ、フルカルバゾン（ｆｌｕｃａｒｂｚｏｎｅ）、フルフェナセット、フルメツラム、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルオメツロン、フルロキシピル、ホメサフェン（Ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）、ホラムスルフロン（Ｆｏｒａｍｓｕｌｆｕｒｏｎ）、グルホシネート、グリホサート、ハロスルフロン（Ｈａｌｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ヘキサジノン、イマザメタベンズ、イマザモックス（Ｉｍａｚａｍｏｘ）、イマザピック、イマザキン、イマゼタピル、イソキサフルトール、ラクトフェン、リニュロン、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、メソトリオン、メトラクロール－ｓ、メトリブジン、インダジフラム、メトスルフロン、モリネート、ＭＳＭＡ、ナプロパミド、ナプタラム、ニコスルフロン、ノルフルラゾン、オリザリン、オキサジアゾン、オキシフルオルフェン、パラコート、ペラルゴン酸、ペンディメタリン、フェンメディファム、ピクロラム、プリミスルフロン、プロジアミン、プロメトリン、プロナミド、プロパニル、プロスルフロン、ピラゾン、ピリチオバック（Ｐｙｒｉｔｈｉｏａｃ）、キンクロラック、キザロホップ、リムスルフロン、Ｓ－メトラクロール、セトキシジム、シデュロン、シマジン、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホスルフロン、テブチウロン、テンボトリオン、ターバシル、チアゾピル、チフェンスルフロン、チオベンカルブ、トプラメゾン、トラルコキシジム（Ｔｒａｌｋｏｘｙｄｉｍ）、トリアレート、トリアスルフロン（Ｔｒｉａｓｕｌｆｕｒｏｎ）、トリベヌロン、トリクロピル、トリフルラリン、及びトリフルスルフロンが含まれる。

【0305】

一部の実施形態では、本明細書に述べられる除草剤のうちのいずれか１つまたは複数が、本明細書に述べられる植物またはその部位のうちのいずれか１つまたは複数と共に利用されてもよい。

【0306】

除草製品には、ＣＯＲＶＵＳ、ＢＡＬＡＮＣＥ ＦＬＥＸＸ、ＣＡＰＲＥＮＯ、ＤＩＦＬＥＸＸ、ＬＩＢＥＲＴＹ、ＬＡＵＤＩＳ、ＡＵＴＵＭＮ ＳＵＰＥＲ、及びＤＩＦＬＥＸＸ ＤＵＯが含まれてもよい。

【0307】

一部の実施形態では、下記の表１２に述べられる除草剤のうちのいずれか１つまたは複数が、本明細書で教示される微生物のうちのいずれか１つまたは複数と共に利用されてもよく、本明細書に述べられる植物またはその部位のうちのいずれか１つまたは複数に施用され得る。

【表12-1】

【表12-2】

【表12-3】

【0308】

殺真菌剤
前述のように、本明細書で教示される任意の微生物を含み得る、本開示の農業組成物は、１つまたは複数の殺真菌剤と組み合わされることがある。

【0309】

本明細書に記載の方法により生産される及び／または本明細書に記載されるような特性を有する細菌または細菌集団を含む組成物は、１つまたは複数の殺真菌剤をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、殺真菌性組成物が、本明細書に述べられる組成物に含まれてもよく、他の化合物と同時にまたは連続して、植物（複数可）またはその部位（複数可）に施用され得る。殺真菌剤には、アゾキシストロビン、キャプタン、カルボキシン、エタボキサム、フルジオキソニル、メフェノキサム、フルジオキソニル、チアベンダゾール、チアベンダズ（ｔｈｉａｂｅｎｄａｚ）、イプコナゾール、マンコゼブ、シアゾファミド、ゾキサミド、メタラキシル、ＰＣＮＢ、メタコナゾール（ｍｅｔａｃｏｎａｚｏｌｅ）、ピラクロストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＱＳＴ ７１３、セダキサン、チアメトキサム、フルジオキソニル、チラム、トルクロホスメチル、トリフロキシストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＭＢＩ ６００、ピラクロストロビン、フルオキサストロビン（Ｆｌｕｏｘａｓｔｒｏｂｉｎ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株ＱＳＴ ２８０８、クロロタロニル、銅、フルトリアホール、フルキサピロキサド、マンコゼブ、グルジオキソニル（ｇｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ）、ペンチオピラド、トリアゾール、プロピコナゾール（ｐｒｏｐｉｃｏｎａｏｚｏｌｅ）、プロチオコナゾール、テブコナゾール、フルオキサストロビン（Ｆｌｕｏｘａｓｔｒｏｂｉｎ）、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、Ｑｏｌ、テトラコナゾール、トリフロキシストロビン、シプロコナゾール、フルトリアホール、ＳＤＨＩ、ＥＢＤＣ、セダキサン、ＭＡＸＩＭ ＱＵＡＴＴＲＯ（グルジオキソニル（ｇｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ）、メフェノキサム、アゾキシストロビン、及びチアベンダズ（ｔｈｉａｂｅｎｄａｚ））、ＲＡＸＩＬ（テブコナゾール、プロチオコナゾール、メタラキシル、及びエトキシ化タローアルキルアミン）、及びベンゾビンジフルピルが含まれる。

【0310】

一部の実施形態では、本明細書に述べられる殺真菌剤のうちのいずれか１つまたは複数が、本明細書に述べられる植物またはその部位のうちのいずれか１つまたは複数と共に利用されてもよい。

【0311】

殺線虫剤
前述のように、本明細書で教示される任意の微生物を含み得る、本開示の農業組成物は、１つまたは複数の殺線虫剤と組み合わされることがある。

【0312】

本明細書に記載の方法により生産される及び／または本明細書に記載されるような特性を有する細菌または細菌集団を含む組成物は、１つまたは複数の殺線虫剤をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、殺線虫性組成物が、本明細書に述べられる組成物に含まれてもよく、他の化合物と同時にまたは連続して、植物（複数可）またはその部位（複数可）に施用され得る。殺線虫剤は、Ｄ－Ｄ、１，３－ジクロロプロペン、二臭化エチレン、１，２－ジブロモ－３－クロロプロパン、臭化メチル、クロルピクリン、メタムナトリウム、ダゾメット、メチルイソチオシアネート、テトラチオ炭酸ナトリウム、アルジカルブ、アルドキシカルブ、カルボフラン、オキサミル、エトプロプ（ｅｔｈｏｐｒｏｐ）、フェナミホス、カズサホス、ホスチアゼート、テルブホス、フェンスルホチオン、ホレート、ＤｉＴｅｒａ、クランドサン（ｃｌａｎｄｏｓａｎ）、シンコシン（ｓｉｎｃｏｃｉｎ）、ヨウ化メチル、臭化プロパルギル、２，５－ジヒドロキシメチル－３，４－ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）、アベルメクチンのうちのいずれか１つまたは複数、アジ化ナトリウム、フルフラール、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ、アバメクトリン（ａｂａｍｅｃｔｒｉｎ）、チアメトキサム、フルジオキソニル、クロチアニジン（ｃｌｏｔｈｉａｎｄｉｎ）、サリチル酸、及びベンゾ－（１，２，３）－チアジアゾール－７－カルボチオ酸Ｓ－メチルエステルから選択されてもよい。

【0313】

一部の実施形態では、本明細書に述べられる殺線虫剤のうちのいずれか１つまたは複数が、本明細書に述べられる植物またはその部位のうちのいずれか１つまたは複数と共に利用されてもよい。

【0314】

一部の実施形態では、本明細書に述べられる殺線虫剤、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、及び／または農薬のうちのいずれか１つまたは複数が、本明細書に述べられる植物またはその部位のうちのいずれか１つまたは複数と共に利用されてもよい。

【0315】

肥料、窒素安定剤、及びウレアーゼ阻害剤
前述のように、本明細書で教示される任意の微生物を含み得る、本開示の農業組成物は、肥料、窒素安定剤、またはウレアーゼ阻害剤のうちの１つまたは複数と組み合わされることがある。

【0316】

一部の実施形態では、肥料が、本開示の方法及び細菌と組み合わせて使用される。肥料には、数ある中でも、無水アンモニア、尿素、硝酸アンモニウム、及び尿素硝安（ＵＡＮ）組成物が含まれる。一部の実施形態では、ポップアップ（ｐｏｐ－ｕｐ）施肥及び／またはスターター（ｓｔａｒｔｅｒ）施肥が、本開示の方法及び細菌と組み合わせて使用される。

【0317】

一部の実施形態では、窒素安定剤が、本開示の方法及び細菌と組み合わせて使用される。窒素安定剤には、ニトラピリン、２－クロロ－６－（トリクロロメチル）ピリジン、Ｎ－ＳＥＲＶＥ ２４、ＩＮＳＴＩＮＣＴ、ジシアンジアミド（ＤＣＤ）が含まれる。

【0318】

一部の実施形態では、ウレアーゼ阻害剤が、本開示の方法及び細菌と組み合わせて使用される。ウレアーゼ阻害剤には、Ｎ－（ｎ－ブチル）－チオリン酸トリアミド（ＮＢＰＴ）、ＡＧＲＯＴＡＩＮ、ＡＧＲＯＴＡＩＮ ＰＬＵＳ、及びＡＧＲＯＴＡＩＮ ＰＬＵＳ ＳＣが含まれる。さらに、本開示では、ＡＧＲＯＴＡＩＮ ＡＤＶＡＮＣＥＤ １．０、ＡＧＲＯＴＡＩＮ ＤＲＩ－ＭＡＸＸ、及びＡＧＲＯＴＡＩＮ ＵＬＴＲＡの利用が企図される。

【0319】

さらに、安定化された形態の肥料を使用することができる。例えば、安定化された形態の肥料は、安定化された尿素に基づく顆粒中に４６％の窒素を含有するＳＵＰＥＲ Ｕであり、ＳＵＰＥＲＵは、脱窒、浸出、及び揮発から保護するためのウレアーゼ及び硝化阻害剤を含有する。ＮＩＴＡＭＩＮ等の安定化及び標的化された葉面肥料もまた、本明細書で使用され得る。

【0320】

ポップアップ肥料が、トウモロコシ圃場で一般的に使用される。ポップアップ施肥は、植栽時に種子に数ポンドの栄養素を施用することを含む。ポップアップ施肥は、実生活力を増加させるために使用される。

【0321】

本明細書で使用され得る緩徐放出または制御放出肥料は、施用後に植物による取り込み及び使用のためのその利用可能性を遅延させる形態で植物栄養素を含有する肥料、または植物へのその利用可能性を、硝酸アンモニウムもしくは尿素、リン酸アンモニウム、または塩化カリウム等の参照の「迅速に利用可能な栄養素肥料」よりも顕著に長く延長する肥料を含意する。そのような最初の利用可能性の遅延または継続する利用可能性の延長時間は、様々な機構によって生じ得る。これらには、半透性コーティング、遮閉、タンパク質材料、もしくは他の化学形態による、水溶性低分子量化合物の緩徐な加水分解による、または他の未知の手段による材料の水溶解度の制御が含まれる。

【0322】

本明細書で使用され得る安定化された窒素肥料は、窒素安定剤が添加された肥料を含意する。窒素安定剤は、肥料の窒素成分が尿素－Ｎまたはアンモニア性－Ｎ形態で土壌に留まる時間を延長する、肥料に添加される物質である。

【0323】

本明細書で使用され得る硝化阻害剤は、アンモニア性－Ｎの硝酸性－Ｎへの生物学的酸化を阻害する物質を含意する。一部の例としては、（１）２－クロロ－６－（トリクロロメチル－ピリジン）、一般名Ｎｉｔｒａｐｙｒｉｎ、製造元Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、（２）４－アミノ－１，２，４－６－トリアゾール－ＨＣｌ、一般名ＡＴＣ、製造元Ｉｓｈｉｈａｄａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、（３）２，４－ジアミノ－６－トリクロロ－メチルトリアジン、一般名ＣＩ－１５８０、製造元Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ、（４）ジシアンジアミド、一般名ＤＣＤ、製造元Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ、（５）チオ尿素、一般名ＴＵ、製造元Ｎｉｔｔｏ Ｒｙｕｓｏ、（６）１－メルカプト－１，２，４－トリアゾール、一般名ＭＴ、製造元Ｎｉｐｐｏｎ、（７）２－アミノ－４－クロロ－６－メチル－ピラミジン、一般名ＡＭ、製造元Ｍｉｔｓｕｉ Ｔｏａｔｓｕ、（８）３，４－ジメチルピラゾールホスフェート（ＤＭＰＰ）、ＢＡＳＦより、（９）１－アミド－２－チオ尿素（ＡＳＵ）、Ｎｉｔｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄ．より、（１０）チオ硫酸アンモニウム（ＡＴＳ）、（１１）１Ｈ－１，２，４－トリアゾール（ＨＰＬＣ）、（１２）５－エチレンオキシド－３－トリクロロ－メチル１，２，４－チオジアゾール（Ｔｅｒｒａｚｏｌｅ）、Ｏｌｉｎ Ｍａｔｈｉｅｓｏｎより、（１３）３－メチルピラゾール（３－ＭＰ）、（１４）１－カルバモイル－３－メチル－ピラゾール（ＣＭＰ）、（１５）ニーム、及び（１６）ＤＭＰＰが挙げられる。

【0324】

本明細書で使用され得るウレアーゼ阻害剤は、酵素ウレアーゼによる尿素に対する加水分解作用を阻害する物質を含意する。何千もの化学物質が土壌ウレアーゼ阻害剤として評価されてきた（Ｋｉｓｓ及びＳｉｍｉｈａｉａｎ、２００２年）。しかしながら、試験された多くの化合物のうちの少数のみが、非毒性であり、低濃度で有効であり、安定であり、尿素（固体及び溶液）と適合性であり、土壌中で分解可能であり、かつ安価である、という必要な要件を満たす。それらは、それらの構造及び酵素ウレアーゼとのそれらの想定される相互作用に従って分類することができる（Ｗａｔｓｏｎ、２０００年、２００５年）。４つの主要なクラスのウレアーゼ阻害剤、すなわち、（ａ）スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基（スルフヒドリル試薬）と相互作用する試薬、（ｂ）ヒドロキサメート、（ｃ）農業作物保護化学物質、ならびに（ｄ）尿素の構造類似体及び関連する化合物が提案されている。Ｎ－（ｎ－ブチル）チオリン酸トリアミド（ＮＢＰＴ）、フェニルホスホロジアミデート（ＰＰＤ／ＰＰＤＡ）、及びヒドロキノンが恐らく最も徹底的に研究されているウレアーゼ阻害剤である（Ｋｉｓｓ及びＳｉｍｉｈａｉａｎ、２００２年）。研究及び実用試験がまた、Ｎ－（２－ニトロフェニル）リン酸トリアミド（２－ＮＰＴ）及びチオ硫酸アンモニウム（ＡＴＳ）で実施されている。有機リン化合物は、尿素の構造類似体であり、ウレアーゼ酵素の活性部位を遮断する、ウレアーゼ活性の最も有効な阻害剤のうちの一部である（Ｗａｔｓｏｎ、２００５年）。

【0325】

トウモロコシのための殺虫性種子処理剤（ＩＳＴ）
トウモロコシ種子処理剤は通常、３つの有害生物スペクトル、すなわち、線虫、真菌性実生病害、及び昆虫を標的とする。

【0326】

殺虫剤種子処理剤は通常、種子処理パッケージの主要な構成成分である。現在利用可能なほとんどのトウモロコシ種子は、殺真菌剤及び殺虫剤を含む基本パッケージを備える。一部の態様では、種子処理剤の殺虫剤選択肢には、Ｐｏｎｃｈｏ（クロチアニジン）、Ｃｒｕｉｓｅｒ／Ｃｒｕｉｓｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｅ（チアメトキサム）、及びＧａｕｃｈｏ（イミダクロプリド）が含まれる。これらの製品の３つ全ては、ネオニコチノイド系化学物質である。２５０（０．２５ｍｇ ＡＩ／種子）の量でのＣｒｕｉｓｅｒ及びＰｏｎｃｈｏが、トウモロコシに利用可能な最も一般的な基本選択肢のうちの一部である。一部の態様では、処理剤の殺虫剤選択肢には、ＣＲＵＩＳＥＲ ２５０チアメトキサム、ＣＲＵＩＳＥＲ ２５０（チアメトキサム）とＬＵＭＩＶＩＡ（クロラントラニリプロール）、ＣＲＵＩＳＥＲ ５００（チアメトキサム）、及びＰＯＮＣＨＯ ＶＯＴＩＶＯ １２５０（クロチアニジン及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ Ｉ－１５８２）が含まれる。

【0327】

Ｐｉｏｎｅｅｒの基本殺虫剤種子処理パッケージは、同じく利用可能なＰｏｎｃｈｏ／Ｖｏｔｉｖｏ １２５０とのＣｒｕｉｓｅｒ ２５０からなる。Ｖｏｔｉｖｏは、線虫に対して保護する生物学的薬剤である。

【0328】

トウモロコシ、ダイズ、及び綿を含むＭｏｎｓａｎｔｏの製品は、Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ処理剤の包括に該当する。Ｄｅｋａｌｂトウモロコシ種子は、Ｐｏｎｃｈｏ ２５０を標準で備える。生産業者はまた、Ｐｏｎｃｈｏ／Ｖｏｔｉｖｏにアップグレードする選択肢を有し、このうちＰｏｎｃｈｏは５００の量で施用される。

【0329】

Ａｇｒｉｓｕｒｅ、Ｇｏｌｄｅｎ Ｈａｒｖｅｓｔ、及びＧａｒｓｔは、殺真菌剤及びＣｒｕｉｓｅｒ ２５０を含む基本パッケージを有する。Ａｖｉｃｔａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｏｒｎもまた利用可能であり、これは、Ｃｒｕｉｓｅｒ ５００、殺真菌剤、及び線虫保護を含む。Ｃｒｕｉｓｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｅは、種子処理パッケージとして利用可能な別の選択肢であるが、Ｃｒｕｉｓｅｒの量は、従来のＣｒｕｉｓｅｒ種子処理剤と同じ、すなわち、２５０、５００、または１２５０である。

【0330】

別の選択肢は、利用可能な最低限の殺虫剤処理剤を購入し、販売業者に下流で種子を処理させることである。

【0331】

トウモロコシのための市販のＩＳＴが、下記の表１３に列挙され、１つまたは複数の本明細書で教示される微生物と組み合わせることができる。

【表13-1】

【表13-2】

【表13-3】

【表13-4】

【表13-5】

【0332】

作物への細菌集団の施用
本明細書に記載の細菌または細菌集団の組成物は、畦間で、タルク中で、または種子処理剤として施用することができる。組成物は、バルク、ミニバルクで、袋中で、またはタルク中で種子パッケージに施用することができる。

【0333】

プランターは、処理された種子を植栽し、従来の方式に従って２条で、または耕うんを必要としない方式で作物を栽培することができる。種子は、コントロールホッパーまたは個別のホッパーを使用して散布することができる。また、種子は、加圧空気を使用してまたは手作業で散布することができる。種子配置は、可変作業技術（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒａｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して実施することができる。加えて、本明細書に記載の細菌または細菌集団の施用は、可変作業技術を使用して施用されてもよい。一部の例では、細菌は、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、擬似穀類（ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｅａｌ）の種子、及び油糧種子に施用することができる。穀類の例としては、オオムギ、フォニオ、オートムギ、パルマーグラス（ｐａｌｍｅｒ’ｓ ｇｒａｓｓ）、ライムギ、トウジンビエ（ｐｅａｒｌ ｍｉｌｌｅｔ）、モロコシ、スペルトコムギ、テフ、ライコムギ、及びコムギが挙げられ得る。擬似穀類の例としては、ブレッドナッツ、ソバ、ガマ、チア、亜麻、アマランサス子実、ハンザ（ｈａｎｚａ）、キノア、及びゴマが挙げられ得る。一部の例では、種子は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機、または従来のものであり得る。

【0334】

マイクロ肥料、ＰＧＲ、除草剤、殺虫剤、及び殺真菌剤等の添加剤を追加で使用して、作物を処理することができる。添加剤の例としては、殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤等の作物保護剤、着色剤、ポリマー、ペレット化（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）、プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）、及び消毒剤等の強化剤、ならびに接種剤、ＰＧＲ、軟化剤、及び微量栄養素等の他の薬剤が挙げられる。ＰＧＲは、根成長、開花、または茎伸長に影響を及ぼす天然または合成の植物ホルモンであり得る。ＰＧＲには、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、及びアブシジン酸（ＡＢＡ）が含まれ得る。

【0335】

組成物は、液体肥料と組み合わせて畦間で施用することができる。一部の例では、液体肥料は、槽に保持されてもよい。ＮＰＫ肥料は、ナトリウム、亜リン酸、及びカリウムという多量栄養素を含有する。

【0336】

組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含量の維持、果実数または種子数の増加、及び果実単位重量または種子単位重量の増加等、植物形質を改善し得る。本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または改善するために用いられてもよい。導入または改善され得る形質の例としては、根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収量、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、低窒素ストレス耐性、窒素使用効率、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、代謝物のレベルの調整、プロテオーム発現が挙げられる。植物丈、全体的バイオマス、根及び／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数もしくは質量、植物穀物もしくは果実の収量、葉の葉緑素含量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組み合わせを含めた、望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された参照農業植物（例えば、導入及び／または改善された形質を有しない植物）の成長速度と比較することができる。一部の例では、植物丈、全体的バイオマス、根及び／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数もしくは質量、植物穀物もしくは果実の収量、葉の葉緑素含量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組み合わせを含めた、望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、類似の条件下で栽培された参照農業植物（例えば、導入及び／または改善された形質を有しない植物）の成長速度と比較することができる。

【0337】

宿主植物に対する農学的形質には、以下のもの、すなわち、油含量の改変、タンパク質含量の改変、種子炭水化物組成の改変、種子油組成の改変、及び種子タンパク質組成の改変、化学物質耐性、耐寒性、老化遅延、病害耐性、干ばつ耐性、穂重、成長改善、健康増進、耐熱性、除草剤耐性、草食動物耐性、窒素固定の改善、窒素利用の改善、根アーキテクチャの改善、水使用効率の改善、バイオマスの増加、根長の増加、種子重量の増加、苗条長さの増加、収量の増加、水制限条件下での収量の増加、穀粒質量、穀粒水分含量、金属耐性、穂数、１穂当たりの穀粒数、さや数、栄養強化、病原体耐性、有害生物耐性、光合成能力の改善、塩分耐性、緑維持（ｓｔａｙ－ｇｒｅｅｎ）、活力改善、成熟種子の乾燥重量の増加、成熟種子の生重量の増加、１植物当たりの成熟種子数の増加、葉緑素含量の増加、１植物当たりのさや数の増加、１植物当たりのさや長の増加、１植物当たりのしおれた葉の数の減少、１植物当たりの重度にしおれた葉の数の減少、及び１植物当たりのしおれていない葉の数の増加、該種子処理剤製剤を用いずに種子から成長させた同系統植物と比較した、代謝物レベルの検出可能な調節、転写物レベルの検出可能な調節、及びプロテオームの検出可能な調節が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0338】

一部の場合では、植物には、接種される植物の植物要素と同じ植物種から単離された細菌または細菌集団が接種される。例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）の１つの品種に通常見出される細菌または細菌集団が、その天然の状態では該細菌及び細菌集団を欠如するＺｅａ ｍａｙｓの別の品種の植物の植物要素に結び付けられる。一実施形態では、細菌及び細菌集団は、接種される植物の植物要素と関連する植物種に属する植物に由来する。例えば、Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ Ｉｌｔｉｓ等（ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｔｅｏｓｉｎｔｅ）に通常見出される細菌及び細菌集団が、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）に施用されるか、またはその逆である。一部の場合では、植物には、接種される植物の植物要素に対して異種である細菌及び細菌集団が接種される。一実施形態では、細菌及び細菌集団は、別の種の植物に由来する。例えば、通常は双子葉植物に見出される細菌及び細菌集団が、単子葉植物に施用されるか（例えば、ダイズ由来細菌及び細菌集団をトウモロコシに接種する）、またはその逆である。他の場合では、植物に接種されるべき細菌及び細菌集団は、接種されている植物の関連種に由来する。一実施形態では、細菌及び細菌集団は、関連分類群、例えば関連種に由来する。別の種の植物は、農業植物であり得る。別の実施形態では、細菌及び細菌集団は、任意の宿主植物要素に接種される設計された組成物の一部である。

【0339】

一部の例では、細菌または細菌集団は、外因性であり、細菌及び細菌集団が、接種される植物とは異なる植物から単離される。例えば、一実施形態では、細菌または細菌集団は、接種される植物と同じ種の異なる植物から単離することができる。一部の場合では、細菌または細菌集団は、接種される植物に関連する種から単離することができる。

【0340】

一部の例では、本明細書に記載の細菌及び細菌集団は、１つの組織タイプから別の組織タイプへと移動することが可能である。例えば、種子の外側にコーティングした後の植物の成熟組織内での細菌及び細菌集団の本発明の検出及び単離により、種子外側から成熟中の植物の栄養組織内へと移動するそれらの能力が実証される。したがって、一実施形態では、細菌の集団及び細菌集団は、種子外側から植物の栄養組織内へと移動することが可能である。一実施形態では、植物の種子にコーティングされた細菌及び細菌集団は、種子が植物状態へと発芽すると、植物の異なる組織に局在化することが可能である。例えば、細菌及び細菌集団は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、突起様構造、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、及び木部を含む、植物の組織のうちのいずれか１つに局在化することが可能であり得る。一実施形態では、細菌及び細菌集団は、植物の根及び／または根毛に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌及び細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉及び苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌及び細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部及び師部に局在化する。さらに別の実施形態では、細菌及び細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌及び細菌集団は、植物の根、苗条、葉、及び生殖組織に局在化することが可能である。さらに別の実施形態では、細菌及び細菌集団は、植物の果実または種子組織でコロニー形成する。さらに別の実施形態では、細菌及び細菌集団は、それが植物の表面に存在する（すなわち、その存在が、植物外側、または植物のエピスフィア（ｅｐｉｓｐｈｅｒｅ）に検出可能に存在する）ように、植物でコロニー形成することが可能である。さらに他の実施形態では、細菌及び細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌及び細菌集団は、植物の根には局在化しない。他の場合では、細菌及び細菌集団は、植物の光合成組織には局在化しない。

【0341】

また、組成物の有効性は、作物の相対的成熟度または作物発熱単位（ｃｒｏｐ ｈｅａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）（ＣＨＵ）を測定することによって評価することができる。例えば、細菌集団をトウモロコシに施用することができ、トウモロコシ成長を、トウモロコシ穀粒の相対的成熟度、またはトウモロコシ穀粒が最大重量になる時間に従って評価することができる。また、作物発熱単位（ＣＨＵ）を使用して、トウモロコシ作物の成熟度を予測することができる。ＣＨＵは、作物が成長する際の一日の最高温を測定することによって熱蓄積量を決定する。

【0342】

複数の例では、細菌は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、突起様構造、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、及び木部を含む、植物の組織のうちのいずれか１つに局在化し得る。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉及び苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌及び細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部及び師部に局在化する。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、または果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌及び細菌集団は、植物の根、苗条、葉、及び生殖組織に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の果実または種子組織でコロニー形成する。さらに別の実施形態では、細菌または細菌集団は、それが植物の表面に存在するように、植物でコロニー形成することが可能である。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の根には局在化しない。他の場合では、細菌及び細菌集団は、植物の光合成組織には局在化しない。

【0343】

作物に施用される細菌組成物の有効性は、植栽率、播種活力（ｓｅｅｄｉｎｇ ｖｉｇｏｒ）、根の強度、干ばつ耐性、植物丈、ドライダウン（ｄｒｙ ｄｏｗｎ）、及び検査重量を含むがこれらに限定されない、作物成長の種々の特徴を測定することによって評価することができる。

【0344】

植物種
本明細書に記載の方法及び細菌は、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、及びＴｒｉｔｉｃｅａｅ属の植物等の、様々な植物のうちのいずれにも好適である。好適な植物の他の非限定的な例としては、コケ類、地衣類、及び藻類が挙げられる。一部の場合では、植物は、食用作物、繊維作物、油糧作物、林業または紙パルプ産業の植物、バイオ燃料生産用の供給原料、及び／または観賞植物等、経済的、社会的、及び／または環境的な価値を有する。一部の例では、植物は、穀物、小麦粉、デンプン、シロップ、粗挽き粉、油、フィルム、パッケージング、栄養補給製品、パルプ、動物飼料、魚飼料、工業化学物質用のバルク材料、穀類製品、加工ヒト用食品、糖、アルコール、及び／またはタンパク質等の、経済的に価値のある製品を生産するために使用されてもよい。作物植物の非限定的な例としては、メイズ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、キビ、オートムギ、ライコムギ、ソバ、スイートコーン、サトウキビ、タマネギ、トマト、イチゴ、及びアスパラガスが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法及び細菌は、様々なトランスジェニック植物、非トランスジェニック植物、及びその雑種植物のうちのいずれにも好適である。

【0345】

一部の例では、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して得てもよいまたは改善されてもよい植物には、農業、園芸、バイオ燃料分子及び他の化学物質を生産するためのバイオマス、及び／または林業にとって重要であるかまたは関心対象となる植物が含まれ得る。これらの植物の一部の例としては、パイナップル、バナナ、ココナッツ、ユリ、グラスピー、及びイネ科草本；ならびに、例えば、エンドウマメ、アルファルファ、オオブドウホオズキ、メロン、ヒヨコマメ、チコリー、クローバ、ケール、レンズマメ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ダイコン、キャベツ、アブラナ、リンゴの木、ブドウ、綿、ヒマワリ、シロイヌナズナ、キャノーラ、柑橘類（オレンジ、マンダリン、キンカン、レモン、ライム、グレープフルーツ、タンジェリン、タンジェロ、シトロン、及びザボンを含む）、コショウ、マメ、レタス、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（モロコシ、スーダン）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種（エネルギーケーン（ｅｎｅｒｇｙｃａｎｅ））、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンビエ）、Ｐａｎｉｃｕｍ種Ｓｏｒｇｈｕｍ種、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ種、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ種、Ｐｏｐｕｌｕｓ種、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ（ライムギ）、Ｓａｌｉｘ種（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ種（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ種（ｔｒｉｔｉｃｕｍ－２５コムギ×ライムギ）、タケ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アブラヤシ）、Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ（ナツメヤシ）、Ａｒｃｈｏｎｔｏｐｈｏｅｎｉｘ ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｎａ（ユスラヤシ）、Ｓｙａｇｒｕｓ ｒｏｍａｎｚｏｆｆｉａｎａ（ジョウオウヤシ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ（ｃａｓｓａｙａ））、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｌｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ（トウガラシ及びアマトウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）、Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ、Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｌｉｖａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ、Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｉｃｈｉｃｕｍ ａｕｔｕｍｎａｌｅ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ種、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ、Ｄａｔｕｒａ ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ種、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ種、Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｉｎｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ種、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｃｏｃａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｗｏｒｎｏｒｉｉ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ種、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ ｓｅｒｒａｔｕｍ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ ｓｅｒｒａｔａ）、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ種、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ種、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ種、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、Ｈｅｖｅａ種（ゴム）、Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ（ミント）、Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ（ミント）、Ｂｉｘａ ｏｒｅｌｌａｎａ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ種、Ｒｏｓａ種（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ種（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オートムギ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、及びＬｏｌｉｕｍ種（ライムギ）等の双子葉植物が挙げられ得る。

【0346】

一部の例では、単子葉植物が使用されてもよい。単子葉植物は、Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｏｒｃｈｉｄａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、及びＺｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓの目に属する。Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅの綱に属する植物は、Ｃｙｃａｄａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、Ｇｎｅｔａｌｅｓ、及びＰｉｎａｌｅｓである。一部の例では、単子葉植物は、メイズ、イネ、コムギ、オオムギ、及びサトウキビからなる群から選択することができる。

【0347】

一部の例では、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ａｓｔｅｒａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｍｉｄｄｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂ ａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｓａｎｔａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、及びＶｉｏｌａｔｅｓの目に属する双子葉植物を含む、双子葉植物が使用され得る。一部の例では、単子葉植物は、綿、ダイズ、コショウ、及びトマトからなる群から選択することができる。

【0348】

一部の場合では、改善されることになる植物は、実験条件に容易に適合しない。例えば、作物植物は、改善された形質を複数回の反復にわたって連続して実際的に評価するのに十分に成長するまでに時間が長くかかり過ぎる場合がある。したがって、細菌が最初に単離される第１の植物及び／または遺伝子操作された細菌が施用される複数の植物は、所望の条件下での評価により適合する植物等のモデル植物であり得る。モデル植物の非限定的な例としては、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓが挙げられる。次いで、モデル植物を使用して本開示の方法により単離された細菌の能力を、別のタイプの植物（例えば、作物植物）に施用して、改善された形質の付与を確認してもよい。

【0349】

本明細書に開示される方法によって改善され得る形質には、例えば、成長速度、植物丈、重量、色、味、匂い、植物による１つまたは複数の化合物（例えば、代謝物、タンパク質、薬物、炭水化物、油、及び任意の他の化合物を含む）の産生の変化を含めた、植物の任意の観察可能な特性が含まれる。遺伝子型情報に基づいて植物を選択することもまた想定される（例えば、細菌に応答した植物遺伝子発現のパターンを含めること、または窒素固定の増加に関連する遺伝子マーカー等の遺伝子マーカーの存在を特定すること）。また、植物は、ある特定の特徴または形質（望ましい特徴または形質等）の存在ではなく、ある特定の特徴または形質（望ましくない特徴または形質等）の不在、抑制、または阻害に基づいて選択されてもよい。

【0350】

遺伝子組換えでないトウモロコシ
本明細書に記載の方法及び細菌は、様々な遺伝子組換えでないメイズ植物またはその部位のうちのいずれにも好適である。また一部の態様では、トウモロコシは、有機である。さらに、本明細書に記載の方法及び細菌は、以下の遺伝子組換えでない雑種、品種、系統等のうちのいずれにも好適である。一部の実施形態では、トウモロコシ品種は一般に、スイートコーン、フリントコーン、ポップコーン、デントコーン、ポッドコーン、及びフラワーコーン（ｆｌｏｕｒ ｃｏｒｎ）の６つのカテゴリーに該当する。

【0351】

スイートコーン
イエローｓｕ品種には、Ｅａｒｌｉｖｅｅ、Ｅａｒｌｙ Ｓｕｎｇｌｏｗ、Ｓｕｎｄａｎｃｅ、Ｅａｒｌｙ Ｇｏｌｄｅｎ Ｂａｎｔａｍ、Ｉｏｃｈｉｅｆ、Ｍｅｒｉｔ、Ｊｕｂｉｌｅｅ、及びＧｏｌｄｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｂａｎｔａｍが含まれる。ホワイトｓｕ品種には、Ｔｒｕｅ Ｐｌａｔｉｎｕｍ、Ｃｏｕｎｔｒｙ Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｑｕｅｅｎ、及びＳｔｏｗｅｌｌ’ｓ Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎが含まれる。バイカラーｓｕ品種には、Ｓｕｇａｒ＆Ｇｏｌｄ、Ｑｕｉｃｋｉｅ、Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｕｔｔｅｒ＆Ｓｕｇａｒ、Ｓｕｇａｒ Ｄｏｔｓ、Ｈｏｎｅｙ＆Ｃｒｅａｍが含まれる。マルチカラーｓｕ品種には、Ｈｏｏｋｅｒｓ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｌａｙ、Ｐａｉｎｔｅｄ Ｈｉｌｌ、Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ／Ａｚｔｅｃが含まれる。

【0352】

イエローｓｅ品種には、Ｂｕｔｔｅｒｇｏｌｄ、Ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ、Ｓｐｒｉｎｇ Ｔｒｅａｔ、Ｓｕｇａｒ Ｂｕｎｓ、Ｃｏｌｏｒｏｗ、Ｋａｎｄｙ Ｋｉｎｇ、Ｂｏｄａｃｉｏｕｓ Ｒ／Ｍ、Ｔｕｘｅｄｏ、Ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ、Ｍｅｒｌｉｎ、Ｍｉｒａｃｌｅ、及びＫａｎｄｙ Ｋｏｒｎ ＥＨが含まれる。ホワイトｓｅ品種には、Ｓｐｒｉｎｇ Ｓｎｏｗ、Ｓｕｇａｒ Ｐｅａｒｌ、Ｗｈｉｔｅｏｕｔ、Ｃｌｏｕｄ Ｎｉｎｅ、Ａｌｐｉｎｅ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｋｉｎｇ、及びＡｒｇｅｎｔが含まれる。バイカラーｓｅ品種には、Ｓｕｇａｒ Ｂａｂｙ、Ｆｌｅｅｔ、Ｂｏｎ Ｊｏｕｒ、Ｔｒｉｎｉｔｙ、Ｂｉ－Ｌｉｃｉｏｕｓ、Ｔｅｍｐｔａｔｉｏｎ、Ｌｕｓｃｉｏｕｓ、Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｃｃｏｒｄ、Ｂｒｏｃａｄｅ、Ｌａｎｃｅｌｏｔ、Ｐｒｅｃｉｏｕｓ Ｇｅｍ、Ｐｅａｃｈｅｓ Ａｎｄ Ｃｒｅａｍ Ｍｉｄ ＥＨ、及びＤｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｒ／Ｍが含まれる。マルチカラーｓｅ品種には、Ｒｕｂｙ Ｑｕｅｅｎが含まれる。

【0353】

イエローｓｈ２品種には、Ｅｘｔｒａ Ｅａｒｌｙ Ｓｕｐｅｒ Ｓｗｅｅｔ、Ｔａｋｅｏｆｆ、Ｅａｒｌｙ Ｘｔｒａ Ｓｗｅｅｔ、Ｒａｖｅｌｉｎｅ、Ｓｕｍｍｅｒ Ｓｗｅｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｋｒｉｓｐｙ Ｋｉｎｇ、Ｇａｒｒｉｓｏｎ、Ｉｌｌｉｎｉ Ｇｏｌｄ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、Ｐａｓｓｉｏｎ、Ｅｘｃｅｌ、Ｊｕｂｉｌｅｅ ＳｕｐｅｒＳｗｅｅｔ、Ｉｌｌｉｎｉ Ｘｔｒａ Ｓｗｅｅｔ、及びＣｒｉｓｐ‘Ｎ Ｓｗｅｅｔが含まれる。ホワイトｓｈ２品種には、Ｓｕｍｍｅｒ Ｓｗｅｅｔ Ｗｈｉｔｅ、Ｔａｈｏｅ、Ａｓｐｅｎ、Ｔｒｅａｓｕｒｅ、Ｈｏｗ Ｓｗｅｅｔ Ｉｔ Ｉｓ、及びＣａｍｅｌｏｔが含まれる。バイカラーｓｈ２品種には、Ｓｕｍｍｅｒ Ｓｗｅｅｔ Ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｒａｄｉａｎｃｅ、Ｈｏｎｅｙ‘Ｎ Ｐｅａｒｌ、Ａｌｏｈａ、Ｄａｚｚｌｅ、Ｈｕｄｓｏｎ、及びＰｈｅｎｏｍｅｎａｌが含まれる。

【0354】

イエローｓｙ品種には、Ａｐｐｌａｕｓｅ、Ｉｎｆｅｒｎｏ、Ｈｏｎｅｙｔｒｅａｔ、及びＨｏｎｅｙ Ｓｅｌｅｃｔが含まれる。ホワイトｓｙ品種には、Ｓｉｌｖｅｒ Ｄｕｃｈｅｓｓ、Ｃｉｎｄｅｒｅｌｌａ、Ｍａｔｔａｐｏｉｓｅｔｔ、Ａｖａｌｏｎ、及びＣａｐｔｉｖａｔｅが含まれる。バイカラーｓｙ品種には、Ｐａｙ Ｄｉｒｔ、Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、Ｃｈａｒｉｓｍａ、Ｓｙｎｅｒｇｙ、Ｍｏｎｔａｕｋ、Ｋｒｉｓｔｉｎｅ、Ｓｅｒｅｎｄｉｐｉｔｙ／Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、及びＣａｍｅｏが含まれる。

【0355】

イエロー増強スーパースイート（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｓｕｐｅｒｓｗｅｅｔ）品種には、Ｘｔｒａ－Ｔｅｎｄｅｒ １ｄｄＡ、Ｘｔｒａ－Ｔｅｎｄｅｒ １１ｄｄ、Ｍｉｒａｉ １３１Ｙ、Ｍｉｒａｉ １３０Ｙ、Ｖｉｓｉｏｎ、及びＭｉｒａｉ ００２が含まれる。ホワイト増強スーパースイート品種には、Ｘｔｒａ－Ｔｅｎｄｅｒ ３ｄｄａ、Ｘｔｒａ－Ｔｅｎｄｅｒ ３１ｄｄ、Ｍｉｒａｉ ４２１Ｗ、ＸＴＨ ３６７３、及びＤｅｖｏｔｉｏｎが含まれる。バイカラー増強スーパースイート品種には、Ｘｔｒａ－Ｔｅｎｄｅｒ ２ｄｄａ、Ｘｔｒａ－Ｔｅｎｄｅｒ ２１ｄｄ、Ｋｉｃｋｏｆｆ ＸＲ、Ｍｉｒａｉ ３０８ＢＣ、Ａｎｔｈｅｍ ＸＲ、Ｍｉｒａｉ ３３６ＢＣ、Ｆａｎｔａｓｔｉｃ ＸＲ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ｍｉｒａｉ ３０１ＢＣ、Ｓｔｅｌｌａｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｒｅａｍ、Ｍｉｒａｉ ３５０ＢＣ、及びＯｂｓｅｓｓｉｏｎが含まれる。

【0356】

フリントコーン
フリントコーン品種には、Ｂｒｏｎｚｅ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｃａｎｄｙ Ｒｅｄ Ｆｌｉｎｔ、Ｆｌｏｒｉａｎｉ Ｒｅｄ Ｆｌｉｎｔ、Ｇｌａｓｓ Ｇｅｍ、Ｉｎｄｉａｎ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ（Ｒａｉｎｂｏｗ）、Ｍａｎｄａｎ Ｒｅｄ Ｆｌｏｕｒ、Ｐａｉｎｔｅｄ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ｐｅｔｍｅｃｋｙ、Ｃｈｅｒｏｋｅｅ ｗｈｉｔｅ Ｆｌｏｕｒが含まれる。

【0357】

ポップコーン
ポップコーン品種には、Ｍｏｎａｒｃｈ Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ、Ｍｉｄｎｉｇｈｔ Ｂｌｕｅ、Ｒｕｂｙ Ｒｅｄ、Ｍｉｘｅｄ Ｂａｂｙ Ｒｉｃｅ、Ｑｕｅｅｎ Ｍａｕｖｅ、Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｆｌａｋｅ、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｈｕｌｌ－ｌｅｓｓ、Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｂｌｕｅ Ｓｈａｍａｎ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｃｏｌｏｒｅｄ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｐｉｎｋ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｄｕｔｃｈ Ｂｕｔｔｅｒ Ｆｌａｖｏｒ、及びＲｅｄ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙが含まれる。

【0358】

デントコーン
デントコーン品種には、Ｂｌｏｏｄｙ Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｂｌｕｅ Ｃｌａｒａｇｅ、Ｏｈｉｏ Ｂｌｕｅ Ｃｌａｒａｇｅ、Ｃｈｅｒｏｋｅｅ Ｗｈｉｔｅ Ｅａｇｌｅ、Ｈｉｃｋｏｒｙ Ｃａｎｅ、Ｈｉｃｋｏｒｙ Ｋｉｎｇ、Ｊｅｌｌｉｃｏｒｓｅ Ｔｗｉｎ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｒａｉｎｂｏｗ、Ｄａｙｍｏｎ Ｍｏｒｇａｎ’ｓ Ｋｎｔ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｌｅａｍｉｎｇ、Ｌｅａｍｉｎｇ’ｓ Ｙｅｌｌｏｗ、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ’ｓ Ｂｌｕｅ Ｇｉａｎｔ、Ｎｅａｌ Ｐａｙｍａｓｔｅｒ、Ｐｕｎｇｏ Ｃｒｅｅｋ Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｒｅｉｄ’ｓ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｅｎｔ、Ｒｏｔｔｅｎ Ｃｌａｒａｇｅ、及びＴｅｎｎｅｓｓｅｅ Ｒｅｄ Ｃｏｂが含まれる。

【0359】

一部の実施形態では、トウモロコシ品種には、Ｐ１６１８Ｗ、Ｐ１３０６Ｗ、Ｐ１３４５、Ｐ１１５１、Ｐ１１９７、Ｐ０５７４、Ｐ０５８９、及びＰ０１５７が含まれる。Ｗ＝ホワイトコーン。

【0360】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法及び細菌は、本明細書に述べられるメイズ品種のいずれの雑種にも好適である。

【0361】

遺伝子組換えトウモロコシ
本明細書に記載の方法及び細菌は、遺伝子組換えメイズ植物またはその部位の雑種、品種、系統等のうちのいずれにも好適である。

【0362】

さらに、本明細書に記載の方法及び細菌は、１つまたは複数の国で承認された、以下の遺伝子組換えメイズイベントのうちのいずれにも好適である：３２１３８（３２１３８ ＳＰＴ Ｍａｉｎｔａｉｎｅｒ）、３２７２（ＥＮＯＧＥＮ）、３２７２×Ｂｔ１１、３２７２×ｂｔ１１×ＧＡ２１、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、３２７２×ＧＡ２１、３２７２×ＭＩＲ６０４、３２７２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、４１１４、５３０７（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｄｕｒａｃａｄｅ）、５３０７×ＧＡ２１、５３０７×ＭＩＲ６０４×Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｄｕｒａｃａｄｅ ５１２２）、５３０７×ＭＩＲ６０４×Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１×ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｄｕｒａｃａｄｅ ５２２２）、５９１２２（ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＲＷ）、５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、５９１２２×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＯＮ８１０、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、５９１２２×ＮＫ６０３（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ ＲＷ ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ ２）、５９１２２×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、６７６、６７８、６８０、３７５１ ＩＲ、９８１４０、９８１４０×５９１２２、９８１４０×ＴＣ１５０７、９８１４０×ＴＣ１５０７×５９１２２、Ｂｔ１０（Ｂｔ１０）、Ｂｔ１１［Ｘ４３３４ＣＢＲ、Ｘ４７３４ＣＢＲ］（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＣＢ／ＬＬ）、Ｂｔ１１×５３０７、Ｂｔ１１×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４、Ｂｒ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｍ５３、Ｍ５６、ＤＡＳ－５９１２２－７、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＴＣ１５０７、ＴＣ１５０７×ＤＡＳ－５９１２２－７、Ｂｔ１１×５９１２２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＧＴ／ＣＢ／ＬＬ）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ２１００）、ＢＴ１１×ＭＩＲ１６２×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３１１０）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３１００）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３１１１／ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ４）、Ｂｔ１１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＭＯＮ８９０３４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９０３４、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９０３４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＲ１６２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ ３２２０）、ＢＴ１１×ＭＩＲ６０４（Ａｇｒｉｓｕｒｅ ＢＣ／ＬＬ／ＲＷ）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＯＮ８９０３４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１７６［１７６］（ＮａｔｕｒＧａｒｄ ＫｎｏｃｋＯｕｔ／Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ）、ＢＶＬＡ４３０１０１、ＣＢＨ－３５１（ＳＴＡＲＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、ＤＡＳ４０２７８（ＥＮＬＩＳＴ Ｍａｉｚｅ）、ＤＡＳ４０２７８×ＮＫ６０３、ＤＢＴ４１８（Ｂｔ Ｘｔｒａ Ｍａｉｚｅ）、ＤＬＬ２５［Ｂ１６］、ＧＡ２１（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｍａｉｚｅ／ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＧＴ）、ＧＡ２１×ＭＯＮ８１０（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｙｉｅｌｄｇａｒｄ Ｍａｉｚｅ）、ＧＡ２１×Ｔ２５、ＨＣＥＭ４８５、ＬＹ０３８（ＭＡＶＥＲＡ Ｍａｉｚｅ）、ＬＹ０３８×ＭＯＮ８１０（ＭＡＶＥＲＡ Ｙｉｅｌｄｇａｒｄ Ｍａｉｚｅ）、ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ Ｖｉｐｔｅｒａ）、ＭＩＲ１６２×５３０７、ＭＩＲ１６２×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９０３４、ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ６０４（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＲＷ）、ＭＩＲ６０４×５３０７、ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ ＧＴ／ＲＷ）、ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＯＮ８０１［ＭＯＮ８０１００］、ＭＯＮ８０２、ＭＯＮ８０９、ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ、ＭＡＩＺＥＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８１０×ＭＯＮ８８０１７（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ ＶＴ Ｔｒｉｐｌｅ）、ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８３２（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｍａｉｚｅ）、ＭＯＮ８６３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｒｏｏｔｗｏｒｍ ＲＷ、ＭＡＸＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８６３×ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｐｌｕｓ）、ＭＯＮ８６３×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｐｌｕｓ ｗｉｔｈ ＲＲ）、ＭＯＮ８６３×ＮＫ６０３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ ＲＷ＋ＲＲ）、ＭＯＮ８７４０３、ＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８７４１９、ＭＯＮ８７４２７（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｍａｉｚｅ）、ＭＯＮ８７４２７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８７４１１×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８７４１１×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４６０（ＧＥＮＵＩＴＹ ＤＲＯＵＧＨＴＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４６０×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８７４６０、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７（ＧＥＮＵＩＴＹ ＶＴ Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｒｏ）、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３（ＧＥＮＵＩＴＹ ＶＴ Ｄｏｕｂｌｅ Ｐｒｏ）、ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２（ＧＥＮＵＩＴＹ ＳＭＡＲＴＳＴＡＸ）、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３（ＰＯＷＥＲ ＣＯＲＥ）、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＭＩＲ１６２、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＭＩＲ１６２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＧＡ２１、ＭＳ３（ＩＮＶＩＧＯＲ Ｍａｉｚｅ）、ＭＳ６（ＩＮＶＩＧＯＲ Ｍａｉｚｅ）、ＭＺＨＧ０ＪＧ、ＭＺＩＲ０９８、ＮＫ６０３（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ ２ Ｍａｉｚｅ）、ＮＫ６０３×ＭＯＮ８１０×４１１４×ＭＩＲ６０４、ＮＫ６０３×ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ ＣＢ＋ＲＲ）、ＮＫ６０３×Ｔ２５（ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、Ｔ１４（ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、Ｔ２５（ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ Ｍａｉｚｅ）、Ｔ２５×ＭＯＮ８１０（ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｍａｉｚｅ）、ＴＣ１５０７（ＨＥＲＣＵＬＥＸ Ｉ、ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＣＢ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ ＸＴＲＥＭＥ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×５３０７、ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＴＣ１５０７×５９１２２（ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ ＸＴＲＡ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＮＫ６０３（ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡ ＲＲ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＴＣ１５０７×ＭＩＲ１６

２×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＴＲＩＳＥＣＴ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３（ＨＥＲＣＵＬＥＸ Ｉ ＲＲ）、ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ６２７５、及びＶＣＯ－０１９８１－５。

【0363】

追加の遺伝子組換え植物
本明細書に記載の方法及び細菌は、様々な遺伝子組換え植物またはその部位のうちのいずれにも好適である。

【0364】

さらに、本明細書に記載の方法及び細菌は、１つまたは複数の国で承認された、以下の遺伝子組換え植物イベントのうちのいずれにも好適である。

【表14】

【表15】

【表16】

【表17】

【表18-1】

【表18-2】

【表18-3】

【表19-1】

【表19-2】

【表19-3】

【表19-4】

【表19-5】

【表19-6】

【表19-7】

【表19-8】

【表19-9】

【表19-10】

【表19-11】

【表19-12】

【表19-13】

【0365】

以下は、表１９に見出される簡略表記の定義である。ＡＭ－ＹＧＣＢ、ＨＸ１、ＬＬ、ＲＲ２を備えるＯＰＴＩＭＵＭ ＡＣＲＥＭＡＸ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎシステム。ＡＭＴ－ＲＷ、ＹＧＣＢ、ＨＸ１、ＬＬ、ＲＲ２を備えるＯＰＴＩＭＵＭ ＡＣＲＥＭＡＸ ＴＲＩＳＥＣＴ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏシステム。ＡＭＸＴ－（ＯＰＴＩＭＵＭ ＡＣＲＥＭＡＸ ＸＴｒｅｍｅ）。ＨＸＸ－ＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ Ｉ及びＨｅｒｃｕｌｅｘ ＲＷ遺伝子を含有する。ＨＸ１－ヨーロッパマツマダラメイガ、サウスウェスタンマツマダラメイガ、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、ウエスタンビーンカットワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｅａｎ ｃｕｔｗｏｒｍ）、モロコシマダラメイガ、サザンコーンストークボーラー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、及びサトウキビボーラー（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）に対する保護を提供し、アメリカタバコガを抑制するＨＥＲＣＵＬＥＸ Ｉ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ遺伝子を含有する。ＬＬ－ＬＩＢＥＲＴＹ除草剤への耐性のためのＬＩＢＥＲＴＹＬＩＮＫ遺伝子を含有する。ＲＲ２－ラベルの指示に従って施用されたときにラベル表示されるグリホサート除草剤の出芽後（ｏｖｅｒ－ｔｈｅ－ｔｏｐ）施用に対する安全性を作物に提供するＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ Ｃｏｒｎ ２形質を含有する。ＹＧＣＢ－ヨーロッパマツマダラメイガ、サウスウェスタンマツマダラメイガ、及びサザンコーンストークボーラー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）への高レベルの耐性、アメリカタバコガ及びコモンストークボーラー（ｃｏｍｍｏｎ ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）へ中程度の耐性、ならびにツマジロクサヨトウへの平均を上回る耐性を提供するＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ遺伝子を含有する。ＲＷ－ＡＧＲＩＳＵＲＥルートワーム（ｒｏｏｔ ｗｏｒｍ）耐性形質を含有する。Ｑ－感受性のあるヨーロッパマツマダラメイガ、サウスウェスタンマツマダラメイガ、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、モロコシマダラメイガ、サザンコーンストークボーラー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、ストークボーラー（ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、サトウキビボーラー（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）、及びアメリカタバコガに対する保護または抑制を提供し、また、感受性のあるウェスタンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、及びメキシカンコーンルートワームによって引き起こされる幼虫による損傷からの保護を提供し、（１）Ｃｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ３４ａｂ１及びＣｒｙ３５ａｂ１タンパク質をもたらすＨＥＲＣＵＬＥＸ ＸＴＲＡ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ遺伝子、（２）ｍＣｒｙ３Ａタンパク質をもたらす遺伝子を含むＡＧＲＩＳＵＲＥ ＲＷ形質、ならびに（３）Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質をもたらすＹＩＥＬＤＧＡＲＤ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ遺伝子を含有する。

【0366】

農業組成物の施用濃度及び施用量
前述のように、教示される微生物を含む、本開示の農業組成物は、複数の方式で植物に施用することができる。２つの特定の態様では、本開示では、畦間処理剤または種子処理剤が企図される。

【0367】

種子処理剤の実施形態では、本開示の微生物は、様々な濃度で種子上に存在することができる。例えば、微生物は、１種子当たり１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、またはそれよりも高いｃｆｕ濃度で種子処理剤中に見出すことができる。特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０^４～約１×１０^８ｃｆｕを含む。他の特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０^５～約１×１０^７ｃｆｕを含む。他の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０^６ｃｆｕを含む。

【0368】

米国では、トウモロコシ作付面積の約１０％は、１エーカー当たり約３６，０００種子を超える種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３３，０００～３６，０００種子の種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３０，０００～３３，０００種子の種子密度で植栽され、残りの作付面積は、様々である。ｗｗｗ．ｐｉｏｎｅｅｒ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ａｇｒｏｎｏｍｙ／ｌｉｂｒａｒｙ／ｃｏｒｎ－ｓｅｅｄｉｎｇ－ｒａｔｅ－ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ／にて入手可能な、Ｓｔｅｖｅ Ｂｕｔｚｅｎ著、「Ｃｏｒｎ Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｒａｔｅ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」を参照されたい。

【0369】

下記の表２０では、企図される種子処理剤の実施形態における１種子当たりの種々のｃｆｕ濃度（行）及び種々の種子作付け植栽密度（第１の欄：１５Ｋ～４１Ｋ）を利用して、種々の農業シナリオで利用されよう１エーカー当たりのｃｆｕの総計量が算出されている（すなわち、１種子当たりの種子処理剤濃度×１エーカー当たりの植栽種子密度）。故に、１種子当たり１×１０^６ｃｆｕで種子処理剤を利用し、１エーカー当たり３０，０００種子を植栽したとすると、１エーカー当たりの総ｃｆｕ含量は、３×１０^１０（すなわち、３０Ｋ×１×１０^６）になろう。

【表20-1】

【表20-2】

【0370】

畦間の実施形態の場合、本開示の微生物は、１エーカー当たり１×１０^６、３．２０×１０^１０、１．６０×１０^１１、３．２０×１０^１１、８．０×１０^１１、１．６×１０^１２、３．２０×１０^１２、またはそれよりも高いｃｆｕ濃度で施用することができる。したがって、複数の態様では、液体畦間組成物は、１エーカー当たり約１×１０^６～約３×１０^１２ｃｆｕの濃度で施用することができる。

【0371】

一部の態様では、畦間組成物は、液体製剤に含まれる。液体畦間の実施形態では、微生物は、１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、またはそれよりも高い１ミリリットル当たりのｃｆｕ濃度で存在することができる。ある特定の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^６～約１×１０^１１ｃｆｕの濃度で微生物を含む。他の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^７～約１×１０^１０ｃｆｕの濃度で微生物を含む。他の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^８～約１×１０^９ｃｆｕの濃度で微生物を含む。他の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり最大約１×１０^１３ｃｆｕの濃度で微生物を含む。

【0372】

候補微生物のトランスクリプトームプロファイリング
発明者らによる以前の取り組みには、菌株ＣＩ０１０のトランスクリプトームプロファイリングを実施して、環境中の窒素の存在下で活性なプロモーターを特定することが伴っていた。菌株ＣＩ０１０を、１０ｍＭグルタミンを補充した規定の無窒素培地で培養した。これらの培養物から全ＲＮＡを抽出し（ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙキット）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）によるＲＮＡｓｅｑ配列決定に供した。配列決定リードを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓを使用してＣＩ０１０ゲノムデータにマッピングし、近位転写プロモーターの制御下で高度に発現された遺伝子を特定した。

【0373】

表２１～２３には、全ＲＮＡのＲＮＡＳｅｑ配列決定により測定された、遺伝子及びそれらの相対的発現レベルが列挙される。ｎｉｆ経路、窒素利用関連経路、または所望の発現レベルを有する他の遺伝子の突然変異誘発に使用するための近位プロモーターの配列が記録された。

【表21】

【表22】

【表23】

【表24-1】

【表24-2】

【表24-3】

【表24-4】

【表24-5】

【表24-6】

【0374】

ポリマー
一部の態様では、異なる温度で一定期間にわたって保管された細菌の安定性及び／または生存率を増加させるために本開示のポリマーが企図される。本開示では、合成ポリマー、天然に存在するポリマー、コポリマー、乾燥相ポリマー、湿潤相ポリマー、半乾燥ポリマー、ゲルポリマー、微孔性ポリマー、乳化ポリマー、フィルム形成ポリマー、アロスフェア（ａｌｌｏｓｐｈｅｒｅｓ）（ポリマーナノ材料）、電界紡糸ポリマー、架橋ポリマー、及びそれらの組み合わせを含めた多岐にわたるポリマーが企図される。

【0375】

一部の態様では、ポリマーは、天然に存在するポリマーである。一部の態様では、ポリマーは、植物または植物部位によって産生される。一部の態様では、ポリマーは、植物、植物部位、またはそれに由来する物質に由来する。一部の態様では、ポリマーは、動物または動物の部分によって産生される。一部の態様では、ポリマーは、動物、動物の部分、またはそれに由来する物質に由来する。一部の態様では、ポリマーは、藻類、原生生物、細菌、または真菌等の微生物によって産生される。一部の態様では、ポリマーは、微生物またはそれに由来する物質に由来する。一部の態様では、ポリマーは、エキソポリマーである。一部の態様では、ポリマーは、エンドポリマーである。

【0376】

一部の態様では、ポリマーは、１種類のモノマーの繰り返し単位のみを含有する。一部の態様では、ポリマーは、１つよりも多くのタイプのモノマーの繰り返し単位（コポリマー）を含有する。一部の態様では、ポリマー構造は、線状のポリマー、すなわち、線状ポリマーである。一部の態様では、ポリマー構造は、分岐したポリマー、すなわち、分岐ポリマーである。一部の態様では、ポリマー構造は、ネットワークポリマーである。一部の態様では、ポリマーは、相互侵入ネットワークポリマー（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋ ｐｏｌｙｍｅｒ）である。

【0377】

一部の態様では、ポリマーは、高電圧を使用してポリマー溶液からサブミクロン及びナノミクロンスケールの微細なポリマー繊維を生成する電界紡糸が行われる。

【0378】

一部の態様では、ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニルコポリマー（ＰＶＰ－ＶＡ）、２－ピロリジノン，１－エテニルヘキサデシル－，ホモポリマー、カラギーナン、ナトリウムアルギネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレングリコール、アラビアガム、マルトデキストリン、アルギン酸ナトリウム、アルギネート、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｎａ－ＣＭＣ）、デンプンＢＲ－０７、デンプンＢＲ－０８、デンプン、及びデンプン誘導体、プルラン、キトサン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ケラタン硫酸ＧＡＧ、ヒアルロン酸ＧＡＧ、ヘパリン硫酸ＧＡＧ、コンドロイチン硫酸ＧＡＧ、重合フィブリン、ポリアクリル酸メチル（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｃｒｙｌａｔｅ）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、スチレン－ブタジエン、アクリル系（ａｃｒｙｌｉｃ）、スチレン－アクリル系（ｓｔｙｒｅｎｅ－ａｃｒｙｌｉｃ）、酢酸ビニル、トコフェニルポリエチレングリコールコハク酸エステル（ＴＰＧＳ）系ポリマー、及び乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等から選択される。

【0379】

一部の態様では、ポリマーは、タンパク質である。一部の態様では、タンパク質は、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、乳清タンパク質、ヘンプタンパク質、及び乳タンパク質構成成分（脱脂乳等）から選択されてもよい。一部の態様では、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、乳清タンパク質、及びヘンプタンパク質は、名称に記載される植物または植物の特定の部分からの総タンパク質分離物である。

【0380】

一部の態様では、デンプン誘導体は、酸処理デンプン（ＩＮＳ １４０１）、デキストリン（ＩＮＳ １４００）、アルカリ加工デンプン（ＩＮＳ １４０２）、漂白デンプン（ＩＮＳ １４０３）、酸化デンプン（ＩＮＳ １４０４）、酵素処理デンプン（ＩＮＳ １４０５）、リン酸化デンプン（ＩＮＳ １４１０）、リン酸架橋デンプン（ＩＮＳ １４１２）、アセチル化デンプン（ＩＮＳ １４２０）、ヒドロキシプロピル化デンプン（ＩＮＳ １４４０）、エチレンオキシドによるヒドロキシエチルデンプン、オクテニルコハク酸デンプンナトリウム（ＩＮＳ １４５０）、オクテニルコハク酸デンプンアルミニウム（ＩＮＳ １４５２）、カチオン性デンプン、モノクロロ酢酸によるカルボキシメチル化デンプンから選択される。デンプン誘導体は、以下の修飾と組み合わされ得る：リン酸モノエステル化リン酸架橋デンプン（ＩＮＳ １４１３）、アセチル化リン酸架橋デンプン（ＩＮＳ １４１４）、アセチル化アジピン酸架橋デンプン（ＩＮＳ １４２２）、ヒドロキシプロピルリン酸架橋デンプン（ＩＮＳ １４２２）、アセチル化酸化デンプン（ＩＮＳ １４５１）。

【0381】

一部の態様では、ポリマーは、水不溶性でありかつ超吸水性であるポリマー鎖のネットワークである、ヒドロゲルを形成することが可能である（例えば、ヒドロゲルは、９９％超の水を含有し得る。ヒドロゲルは、それらの顕著な水含量に起因して、天然組織に類似する高い柔軟度を持つ。

【0382】

細菌は、ポリマーに保存されてもよい。Ｒｏｊａｓ－Ｔａｐｉａｓ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｒｙ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉａｒｕｍ．２０（２）：２０１－２０７、Ａｍａｌｒａｊ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，ａｄｊｕｖａｎｔｓ，ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ．Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．１（２）：１－５、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓ ｓｏｌｉｄ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ．ｅＸＰＲＥＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ．８（５）：３５２－３６１を参照されたい。

【0383】

ポリマー組成物
一部の態様では、ポリマー組成物は、１つまたはポリマーと、本開示のいずれか１つまたは複数の微生物との組み合わせである。一部の態様では、ポリマー組成物は、本開示のいずれか１つまたは複数の細菌を含む。一部の態様では、ポリマー組成物は、本開示のいずれか１つまたは複数の窒素固定微生物を含む。一部の態様では、ポリマー組成物は、いずれの微生物も含まない。一部の態様では、ポリマー組成物は、滅菌されている。

【0384】

一部の態様では、ポリマー組成物は、２つ以上のポリマーの組み合わせである。一部の態様では、ポリマー組成物は、単一の微生物種を含むことにより、純粋な培養物を形成する。一部の態様では、ポリマー組成物は、細菌のコンソーシアムを含む。一部の態様では、ポリマー組成物は、１つまたは複数の微生物種を含む。一部の態様では、ポリマー組成物は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、または少なくとも１０種の微生物種を含む。

【0385】

一部の態様では、ポリマー組成物は、液体である。一部の態様では、ポリマー組成物は、固体である。一部の態様では、ポリマー組成物は、固体要素及び液体要素の両方を含む。一部の態様では、ポリマー組成物は、半固体である。一部の態様では、ポリマー組成物は、ゲルである。一部の態様では、ポリマー組成物は、乾燥させられる。一部の態様では、ポリマー組成物は、砂または顆粒状材料の形態である。一部の態様では、ポリマー組成物は、粉末である。一部の態様では、ポリマー組成物は、本明細書に開示されるいずれか１つまたは複数の要素を含む。

【0386】

一部の態様では、ポリマー組成物は、１つまたは複数の微生物バイオフィルムを含んでもよい。一部の態様では、バイオフィルムは、ポリマー組成物の１つまたは複数の微生物に対して異種である。一部の態様では、ポリマー組成物は、１つまたは複数の微生物バイオフィルムを他のポリマーと組み合わせて含んでもよい。複数の態様では、ポリマー及びバイオフィルムの組み合わせは、相乗効果を示す。

【0387】

一部の実施形態では、本開示の少なくとも２つのポリマーの組み合わせは、互いに接触することになるポリマーのうちの１つまたは複数の存在下で、本明細書に記載の形質のうちの１つまたは複数に対して相乗効果を示す。教示される方法によって得られる相乗効果は、例えば、コルビーの式（すなわち、（Ｅ）＝Ｘ＋Ｙ－（Ｘ×Ｙ／１００））に従って定量することができる。Ｃｏｌｂｙ，Ｒ．Ｓ．，“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，”１９６７．Ｗｅｅｄｓ．Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２０－２２を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に援用される）。故に、「相乗的」とは、相加的量を超えて増加した成果／パラメータ／効果を反映することが意図される。

【0388】

一部の態様では、本開示の細菌は、複数の細胞が生存可能なままであるように乾燥（ｄｒｉｅｄ）／乾燥化（ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）している。一部の実施形態では、乾燥／乾燥化させた細菌細胞は、ポリマー組成物に導入される。一部の態様では、細菌は、ポリマーが形成されているときにポリマーに導入される。一部の態様では、細菌は、ポリマーが架橋されているときにポリマーに導入される。一部の実施形態では、細菌に、ポリマーが噴霧またはコーティングされる。一部の態様では、細菌は、ポリマー中に混合される。一部の実施形態では、細菌は、液体バイオマスの形態である。一部の態様では、細菌は、濃縮ペーストの形態である。一部の態様では、細菌は、ゲルの形態である。

【0389】

一部の態様では、ポリマー組成物は、固体である。一部の態様では、ポリマー組成物は、砂／顆粒を作出するように磨砕される。一部の態様では、ポリマー組成物は、約１０ミクロン、約２０ミクロン、約３０ミクロン、約４０ミクロン、約５０ミクロン、約６０ミクロン、約７０ミクロン、約８０ミクロン、約９０ミクロン、約１００ミクロン、約１５０ミクロン、約２００ミクロン、約２５０ミクロン、約３００ミクロン、約３５０ミクロン、約４００ミクロン、約４５０ミクロン、約５００ミクロン、約５５０ミクロン、約６００ミクロン、約６５０ミクロン、約７００ミクロン、約７５０ミクロン、約８００ミクロン、約８５０ミクロン、約９００ミクロン、約９５０ミクロン、または約１，０００ミクロンのサイズの粒子を作出するように磨砕される。

【0390】

一部の態様では、ポリマー組成物は、ろう、脂肪、油、脂肪酸、脂肪アルコール、または類似の物理化学特性を有する他の化合物と組み合わされ、約１０微生物、約２０ミクロン、約３０ミクロン、約４０ミクロン、約５０ミクロン、約６０ミクロン、約７０ミクロン、約８０ミクロン、約９０ミクロン、約１００ミクロン、約１５０ミクロン、約２００ミクロン、約２５０ミクロン、約３００ミクロン、約３５０ミクロン、約４００ミクロン、約４５０ミクロン、約５００ミクロン、約５５０ミクロン、約６００ミクロン、約６５０ミクロン、約７００ミクロン、約７５０ミクロン、約８００ミクロン、約８５０ミクロン、約９００ミクロン、約９５０ミクロン、または約１，０００ミクロンのビーズへと噴霧凝固される。

【0391】

一部の態様では、本開示のポリマー組成物は、微生物を封入する。一部の実施形態では、微生物は、本開示のポリマー組成物以外の１つまたは複数の化合物によって封入される。一部の態様では、微生物は、封入され、次いでポリマー組成物に添加／曝露される。一部の態様では、微生物は、ポリマー組成物に添加／曝露され、次いで追加の材料で封入される。

【0392】

本開示の封入組成物（複数可）は、微生物を温度、放射線等の外部ストレス因子から保護する。一部の態様では、外部ストレス因子には、熱及び物理的ストレス因子が含まれる。一部の態様では、外部ストレス因子には、組成物中に存在する化学物質が含まれる。封入組成物はさらに、嫌気性微生物に対する好気性環境の酸化ストレスを最小化する等、微生物に有益であり得る環境を作出する。微生物の封入組成物、及び微生物の封入方法については、Ｋａｌｓｔａら（ＵＳ５，１０４，６６２Ａ）、Ｆｏｒｄ（ＵＳ５，７３３，５６８Ａ）、ならびにＭｏｓｂａｃｈ及びＮｉｌｓｓｏｎ（ＵＳ４，６４７，５３６Ａ）を参照されたい。

【0393】

一部の態様では、本開示の組成物は、熱耐性を示し、これは耐熱性及び熱耐性と互換的に使用される。一部の態様では、本開示の組成物は、非冷蔵環境で熱耐性を示す。一部の態様では、本開示の組成物は、周囲温度で熱耐性を示す。一部の態様では、本開示の組成物は、約４℃、約６℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３６℃、約３８℃、約４０℃、または約４２℃の温度で熱耐性を示す。一部の態様では、本開示の組成物は、少なくとも４℃、少なくとも６℃、少なくとも１０℃、少なくとも１２℃、少なくとも１４℃、少なくとも１６℃、少なくとも１８℃、少なくとも２０℃、少なくとも２２℃、少なくとも２４℃、少なくとも２６℃、少なくとも２８℃、少なくとも３０℃、少なくとも３２℃、少なくとも３４℃、少なくとも３６℃、少なくとも３８℃、少なくとも４０℃、少なくとも４２℃、少なくとも４４℃、少なくとも４６℃、少なくとも４８℃、少なくとも５０℃、少なくとも５２℃、少なくとも５４℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、または少なくとも６０℃の温度で熱耐性を示す。

【0394】

一部の態様では、本開示の熱耐性組成物は、高熱環境等での保管に関連する高温に耐える。一部の態様では、本開示の熱耐性組成物は、細胞壁成分及び細胞内環境の熱殺菌及び変性に耐性である。

【0395】

一部の態様では、封入は、リザーバ型封入である。一部の態様では、封入は、マトリックス型封入である。一部の態様では、封入は、コーティングされたマトリックス型封入である。Ｂｕｒｇａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｅｎｇ．１０４：４６７－４８３）は、多数の封入実施形態及び技法について開示しており、これらの全てが参照により援用される。

【0396】

一部の態様では、本開示の組成物は、以下のもの、すなわち、ジェランガム、キサンタンガム、Ｋ－カラギーナン、フタル酸酢酸セルロース、キトサン、デンプン、デンプン誘導体、乳脂、乳清タンパク質、アルギネート、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、ラフチロース（ｒａｆｔｉｌｏｓｅ）、ラフチリン（ｒａｆｔｉｌｉｎ）、ペクチン、サッカライド、グルコース、マルトデキストリン、アラビアガム、グアー、種子粉、アルギネート、デキストリン、デキストラン、セルロース、ゼラチン、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、グルテン、アカシアゴム、トラガカント、ろう、パラフィン、ステアリン酸、シリケート、モノジグリセリド（ｍｏｎｏｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、及びジグリセリドのうちの１つまたは複数に封入される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、ポリマー、炭水化物、糖、プラスチック、ガラス、多糖、脂質、ろう、油、脂肪酸、またはグリセリドのうちの１つまたは複数によって封入される。

【0397】

一部の態様では、本開示の組成物の封入は、押出し、乳化、コーティング、凝集、凍結乾燥、ガラス化、泡沫乾燥、気化による保存、真空乾燥、電界紡糸、または噴霧乾燥によって実施される。

【0398】

一部の態様では、封入組成物は、固体シェル材料に封入された多数の液体コアを有するマイクロカプセルを含む。本開示の目的において、「多数の」コアは、２つ以上と定義される。一部の態様では、封入組成物は、多数の固体コアを含む。一部の態様では、封入組成物は、多数の２種類以上の固体コアを含む。一部の態様では、固体コアのタイプは、放出時間により異なる。一部の態様では、封入組成物は、多数の２種類以上の固体コアを含み、ここで、固体コアのうちの少なくとも１種類は、適用後に内容物の迅速放出を提供し、固体コアのうちの少なくとも１種類は、適用後に内容物の緩徐放出を提供し、故に、微生物の一定期間の持続接種を適用する組成物を生み出す。

【0399】

一部の態様では、本開示により単独でまたは他の材料と組み合わせて使用するための種々の補助的材料が企図される。一部の態様では、補助的材料は、酸化防止剤、光安定剤、色素及び顔料、精油、固結防止剤、充填剤、ｐＨ安定剤、分散剤、消泡剤、湿潤剤、カップリング剤、糖（単糖、二糖、三糖、及び多糖）等から選択されてもよく、本開示のためのその実用性を減少させない量で可融性材料に組み込まれ得る。

【0400】

一部の態様では、ポリマーは、本開示のいずれか１つまたは複数の細菌を含む液体培地に導入される。一部の態様では、ポリマーは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の重量％で本開示のいずれか１つまたは複数の細菌を含む液体培地に導入される。

【0401】

一部の態様では、ポリマーは、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：または１０：１の容量でいずれか１つまたは複数の細菌を含む液体培地に導入される。

【0402】

一部の態様では、ポリマー組成物は、エマルションを含んでもよい。一部の態様では、ポリマー組成物は、エマルションであってもよい。一部の態様では、ポリマー組成物は、ナノエマルションを含んでもよい。一部の態様では、ポリマー組成物は、ナノエマルションであってもよい。

【0403】

エマルションは、標準的な状況下で通常は非混和性である（混合不能またはブレンドすることができない）、２つ以上の液体の混合物を指す。エマルションの一例は、ビネグレットであろう。

【0404】

ナノエマルションは、液滴サイズが２５０ｎｍに等しいかまたはそれよりも小さいという点でエマルションとは異なる。ナノエマルションは、自発的には形成せず、より大きな液滴をより小さな液滴に破裂させるために外部からのせん断を適用しなければならない。ナノエマルション及びナノスケールエマルションは、本開示内で同じ用語の同義語として使用される。

【0405】

一部の実施形態では、エマルション及びナノエマルションは、乳化剤の存在下で作出される。一部の実施形態では、乳化剤は、限定されないが、対応するＣＡＳ登録番号が付随する以下のもの、すなわち、ステアリン酸アンモニウム、１００２－８９－７；パルミチン酸アスコルビル、１３７－６６－６；ステアリン酸ブチル、１２３－９５－５；ステアリン酸カルシウム、１５９２－２３－０；モノオレイン酸ジグリセリル、４９５５３－７６－６；モノステアリン酸ジグリセリル、１２６９４－２２－３；１，２，３－プロパントリオールとのドデカン酸、モノエステル、２７２１５－３８－９；モノオレイン酸グリセロール、１１１－０３－５；ジカプリル酸グリセリル、３６３５４－８０－０；ジミリスチン酸グリセリル、５３５６３－６３－６；ジオレイン酸グリセリル、２５６３７－８４－７；ジステアリン酸グリセリル、１３２３－８３－７；モノミリスチン酸グリセリル、２７２１４－３８－６；モノオクタノン酸グリセリル（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｍｏｎｏｏｃｔａｎｏａｔｅ）、２６４０２－２６－６；モノオレイン酸グリセリル、２５４９６－７２－４；モノステアリン酸グリセリル、３１５６６－３１－１；ステアリン酸グリセリル、１１０９９－０７－３；ミリスチン酸イソプロピル、１１０－２７－０；レシチン、８００２－４３－５；１－モノラウリン、１４２－１８－７；１－モノミリスチン、５８９－６８－４；モノパルミチン、２６６５７－９６－５；オクタン酸、カリウム塩、７６４－７１－６；オクタン酸、ナトリウム塩、１９８４－０６－１；オレイン酸、１１２－８０－１；パルミチン酸、５７－１０－３；オレイン酸ポリグリセリル、９００７－４８－１；ステアリン酸ポリグリセリル、９００９－３２－９；モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）、９００５－６４－５；ミリスチン酸カリウム、１３４２９－２７－１；オレイン酸カリウム、１４３－１８－０；ステアリン酸カリウム、５９３－２９－３；オレイン酸ナトリウム、１４３－１９－１；ステアリン酸ナトリウム、８２２－１６－２；ダイズレシチン、８０３０－７６－０；トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸エステル（ＴＰＧＳ）、９００２－９６－４；ビタミンＥ、１４０６－１８－４；５５７－０５－１、及びステアリン酸亜鉛、５５７－０５－１から選択されてもよい。

【0406】

一部の実施形態では、ナノエマルションは、約２５０ｎｍ、２４５ｎｍ、２４０ｎｍ、２３５ｎｍ、２３０ｎｍ、２２５ｎｍ、２２０ｎｍ、２１５ｎｍ、２１０ｎｍ、２０５ｎｍ、２００ｎｍ、１９５ｎｍ、１９０ｎｍ、１８５ｎｍ、１８０ｎｍ、１７５ｎｍ、１７０ｎｍ、１６５ｎｍ、１６０ｎｍ、１５５ｎｍ、１５０ｎｍ、１４５ｎｍ、１４０ｎｍ、１３５ｎｍ、１３０ｎｍ、１２５ｎｍ、１２０ｎｍ、１１５ｎｍ、１１０ｎｍ、１０５ｎｍ、１００ｎｍ、９５ｎｍ、９０ｎｍ、８５ｎｍ、８０ｎｍ、７５ｎｍ、７０ｎｍ、６５ｎｍ、６０ｎｍ、５５ｎｍ、５０ｎｍ、４５ｎｍ、４０ｎｍ、３５ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、もしくは１ｎｍまたはそれ未満の（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ａｔ ｏｒ ａｂｏｕｔ）液滴を含み、ここで、約～または～の（ａｔ ｏｒ ａｂｏｕｔ）という修飾語句は、上記で指定されるサイズの各々に適用される。

【0407】

一部の実施形態では、ナノエマルションは、サイズが約１ｎｍ～５ｎｍ、１ｎｍ～１０ｎｍ、１ｎｍ～５０ｎｍ、１ｎｍ～１００ｎｍ、１ｎｍ～１５０ｎｍ、１ｎｍ～２００ｎｍ、１ｎｍ～２５０ｎｍ、５ｎｍ～１０ｎｍ、５ｎｍ～５０ｎｍ、５ｎｍ～１００ｎｍ、５ｎｍ～１５０ｎｍ、５ｎｍ～２００ｎｍ、２ｎｍ～２５０ｎｍ、１０ｎｍ～５０ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、１０ｎｍ～１５０ｎｍ、１０～２００ｎｍ、１０ｎｍ～２５０ｎｍ、２５ｎｍ～５０ｎｍ、２５ｎｍ～１００ｎｍ、２５ｎｍ～１５０ｎｍ、２５ｎｍ～２００ｎｍ、２５ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、５０ｎｍ～１５０ｎｍ、５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０ｎｍ～２５０ｎｍ、１００ｎｍ～１５０ｎｍ、１００ｎｍ～２００ｎｍ、１００ｎｍ～２５０ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍ、１５０ｎｍ～２５０ｎｍ、及び２００ｎｍ～２５０ｎｍの範囲の液滴を含み、ここで、約という修飾語句は、上記の範囲の各々に適用される。

【0408】

水分含量は、組成物中の水の総量の測定値であり、通常は総重量のパーセンテージとして表される。水分含量は、組成物の乾燥重量を決定するのに有用な測定値であり、それを使用して、組成物の乾燥化／乾燥プロセスが完了しているかどうかを確認することができる。水分含量は、（組成物の湿重量－乾燥化／乾燥後の重量）を組成物の湿重量で除し、１００を乗じることによって算出される。

【0409】

水分含量は、組成物中の水の量を定義するものであるが、水分活性は、組成物中の水が微小生物とどのように反応するかにより大きく関係している。水分活性が大きいほど、微小生物はより速く増殖することができる。水分活性は、組成物中の蒸気圧対純水の蒸気圧の比を見出すことによって算出される。より具体的には、水分活性は、組成物中の水の蒸気の分圧を、標準状態の純水の蒸気の分圧で除したものである。純水の水分活性は１である。組成物の水分活性の決定は、組成物中の水の量ではなく、微生物の増殖のための水の利用可能性の尺度である。微小生物は、増殖のために最小かつ最適な水分活性を有する。

【0410】

一態様では、本開示のポリマー組成物は、乾燥化している。微生物組成物は、組成物の水分含量が０％～２０％である場合、乾燥化している。

【0411】

一態様では、本開示のポリマー組成物の水分含量は、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である。

【0412】

一態様では、本開示のポリマー組成物の水分含量は、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満、１５％未満、１６％未満、１７％未満、１８％未満、１９％未満、２０％未満、２１％未満、２２％未満、２３％未満、２４％未満、２５％未満、２６％未満、２７％未満、２８％未満、２９％未満、３０％未満、３１％未満、３２％未満、３３％未満、３４％未満、３５％未満、３６％未満、３７％未満、３８％未満、３９％未満、４０％未満、４１％未満、４２％未満、４３％未満、４４％未満、４５％未満、４６％未満、４７％未満、４８％未満、４９％未満、５０％未満、５１％未満、５２％未満、５３％未満、５４％未満、５５％未満、５６％未満、５７％未満、５８％未満、５９％未満、６０％未満、６１％未満、６２％未満、６３％未満、６４％未満、６５％未満、６６％未満、６７％未満、６８％未満、６９％未満、７０％未満、７１％未満、７２％未満、７３％未満、７４％未満、７５％未満、７６％未満、７７％未満、７８％未満、７９％未満、８０％未満、８１％未満、８２％未満、８３％未満、８４％未満、８５％未満、８６％未満、８７％未満、８８％未満、８９％未満、９０％未満、９１％未満、９２％未満、９３％未満、９４％未満、９５％未満、９６％未満、９７％未満、９８％未満、９９％未満、または１００％未満である。

【0413】

一態様では、本開示のポリマー組成物の水分含量は、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、約１０％未満、約１１％未満、約１２％未満、約１３％未満、約１４％未満、約１５％未満、約１６％未満、約１７％未満、約１８％未満、約１９％未満、約２０％未満、約２１％未満、約２２％未満、約２３％未満、約２４％未満、約２５％未満、約２６％未満、約２７％未満、約２８％未満、約２９％未満、約３０％未満、約３１％未満、約３２％未満、約３３％未満、約３４％未満、約３５％未満、約３６％未満、約３７％未満、約３８％未満、約３９％未満、約４０％未満、約４１％未満、約４２％未満、約４３％未満、約４４％未満、約４５％未満、約４６％未満、約４７％未満、約４８％未満、約４９％未満、約５０％未満、約５１％未満、約５２％未満、約５３％未満、約５４％未満、約５５％未満、約５６％未満、約５７％未満、約５８％未満、約５９％未満、約６０％未満、約６１％未満、約６２％未満、約６３％未満、約６４％未満、約６５％未満、約６６％未満、約６７％未満、約６８％未満、約６９％未満、約７０％未満、約７１％未満、約７２％未満、約７３％未満、約７４％未満、約７５％未満、約７６％未満、約７７％未満、約７８％未満、約７９％未満、約８０％未満、約８１％未満、約８２％未満、約８３％未満、約８４％未満、約８５％未満、約８６％未満、約８７％未満、約８８％未満、約８９％未満、約９０％未満、約９１％未満、約９２％未満、約９３％未満、約９４％未満、約９５％未満、約９６％未満、約９７％未満、約９８％未満、約９９％未満、または約１００％未満である。

【0414】

一態様では、本開示のポリマー組成物の水分含量は、１％～１００％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～５％、５％～１００％、５％～９５％、５％～９０％、５％～８５％、５％～８０％、５％～７５％、５％～７０％、５％～６５％、５％～６０％、５％～５５％、５％～５０％、５％～４５％、５％～４０％、５％～３５％、５％～３０％、５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％、５％～１０％、１０％～１００％、１０％～９５％、１０％～９０％、１０％～８５％、１０％～８０％、１０％～７５％、１０％～７０％、１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５５％、１０％～５０％、１０％～４５％、１０％～４０％、１０％～３５％、１０％～３０％、１０％～２５％、１０％～２０％、１０％～１５％、１５％～１００％、１５％～９５％、１５％～９０％、１５％～８５％、１５％～８０％、１５％～７５％、１５％～７０％、１５％～６５％、１５％～６０％、１５％～５５％、１５％～５０％、１５％～４５％、１５％～４０％、１５％～３５％、１５％～３０％、１５％～２５％、１５％～２０％、２０％～１００％、２０％～９５％、２０％～９０％、２０％～８５％、２０％～８０％、２０％～７５％、２０％～７０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５５％、２０％～５０％、２０％～４５％、２０％～４０％、２０％～３５％、２０％～３０％、２０％～２５％、２５％～１００％、２５％～９５％、２５％～９０％、２５％～８５％、２５％～８０％、２５％～７５％、２５％～７０％、２５％～６５％、２５％～６０％、２５％～５５％、２５％～５０％、２５％～４５％、２５％～４０％、２５％～３５％、２５％～３０％、３０％～１００％、３０％～９５％、３０％～９０％、３０％～８５％、３０％～８０％、３０％～７５％、３０％～７０％、３０％～６５％、３０％～６０％、３０％～５５％、３０％～５０％、３０％～４５％、３０％～４０％、３０％～３５％、３５％～１００％、３５％～９５％、３５％～９０％、３５％～８５％、３５％～８０％、３５％～７５％、３５％～７０％、３５％～６５％、３５％～６０％、３５％～５５％、３５％～５０％、３５％～４５％、３５％～４０％、４０％～１００％、４０％～９５％、４０％～９０％、４０％～８５％、４０％～８０％、４０％～７５％、４０％～７０％、４０％～６５％、４０％～６０％、４０％～５５％、４０％～５０％、４０％～４５％、４５％～１００％、４５％～９５％、４５％～９０％、４５％～８５％、４５％～８０％、４５％～７５％、４５％～７０％、４５％～６５％、４５％～６０％、４５％～５５％、４５％～５０％、５０％～１００％、５０％～９５％、５０％～９０％、５０％～８５％、５０％～８０％、５０％～７５％、５０％～７０％、５０％～６５％、５０％～６０％、５０％～５５％、５５％～１００％、５５％～９５％、５５％～９０％、５５％～８５％、５５％～８０％、５５％～７５％、５５％～７０％、５５％～６５％、５５％～６０％、６０％～１００％、６０％～９５％、６０％～９０％、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～１００％、６５％～９５％、６５％～９０％、６５％～８５％、６５％～８０％、６５％～７５％、６５％～７０％、７０％～１００％、７０％～９５％、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～１００％、７５％～９５％、７５％～９０％、７５％～８５％、７５％～８０％、８０％～１００％、８０％～９５％、８０％～９０％、８０％～８５％、８５％～１００％、８５％～９５％、８５％～９０％、９０％～１００％、９０％～９５％、または９５％～１００％である。

【0415】

一態様では、本開示のポリマー組成物は、乾燥している。一部の態様では、本開示のポリマー組成物は、液体である。一態様では、本開示のポリマー組成物の水分活性は、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４、約０．５、約０．５５、約０．６０、約０．６５、約０．７０、約０．７５、約０．８、約０．８５、約０．９０、または約０．９５である。

【0416】

一態様では、本開示のポリマー組成物の水分活性は、約０．１未満、約０．１５未満、約０．２未満、約０．２５未満、約０．３０未満、約０．３５未満、約０．４未満、約０．５未満、約０．５５未満、約０．６０未満、約０．６５未満、約０．７０未満、約０．７５未満、約０．８未満、約０．８５未満、約０．９０未満、または約０．９５未満である。

【0417】

一態様では、本開示のポリマー組成物の水分活性は、０．１未満、０．１５未満、０．２未満、０．２５未満、０．３０未満、０．３５未満、０．４未満、０．５未満、０．５５未満、０．６０未満、０．６５未満、０．７０未満、０．７５未満、０．８未満、０．８５未満、０．９０未満、または０．９５未満である。

【0418】

一態様では、本開示のポリマー組成物の水分活性は、０．１～０．９５、０．１～０．９０、０．１～０．８５、０．１～０．８、０．１～０．７５、０．１～０．７０、０．１～０．６５、０．１～０．５５、０．１～０．５０、０．１～０．４５、０．１～０．４０、０．１～０．３５、０．１～０．３、０．１～０．２５、０．１～０．２、０．１～０．１５、０．１５～０．９５、０．１５～０．９０、０．１５～０．８５、０．１５～０．８、０．１５～０．７５、０．１５～０．７０、０．１５～０．６５、０．１５～０．５５、０．１５～０．５０、０．１５～０．４５、０．１５～０．４０、０．１５～０．３５、０．１５～０．３、０．１５～０．２５、０．１５～０．２、０．２～０．９５、０．２～０．９０、０．２～０．８５、０．２～０．８、０．２～０．７５、０．２～０．７０、０．２～０．６５、０．２～０．５５、０．２～０．５０、０．２～０．４５、０．２～０．４０、０．２～０．３５、０．２～０．３、０．２～０．２５、０．２５～０．９５、０．２５～０．９０、０．２５～０．８５、０．２５～０．８、０．２５～０．７５、０．２５～０．７０、０．２５～０．６５、０．２５～０．５５、０．２５～０．５０、０．２５～０．４５、０．２５～０．４０、０．２５～０．３５、０．２５～０．３、０．３～０．９５、０．３～０．９０、０．３～０．８５、０．３～０．８、０．３～０．７５、０．３～０．７０、０．３～０．６５、０．３～０．５５、０．３～０．５０、０．３～０．４５、０．３～０．４０、０．３～０．３５、０．３５～０．９５、０．３５～０．９０、０．３５～０．８５、０．３５～０．８、０．３５～０．７５、０．３５～０．７０、０．３５～０．６５、０．３５～０．５５、０．３５～０．５０、０．３５～０．４５、０．３５～０．４０、０．４～０．９５、０．４～０．９０、０．４～０．８５、０．４～０．８、０．４～０．７５、０．４～０．７０、０．４～０．６５、０．４～０．５５、０．４～０．５０、０．４～０．４５、０．４５～０．９５、０．４５～０．９０、０．４５～０．８５、０．４５～０．８、０．４５～０．７５、０．４５～０．７０、０．４５～０．６５、０．４５～０．５５、０．４５～０．５０、０．５～０．９５、０．５～０．９０、０．５～０．８５、０．５～０．８、０．５～０．７５、０．５～０．７０、０．５～０．６５、０．５～０．５５、０．５５～０．９５、０．５５～０．９０、０．５５～０．８５、０．５５～０．８、０．５５～０．７５、０．５５～０．７０、０．５５～０．６５、０．６～０．９５、０．６～０．９０、０．６～０．８５、０．６～０．８、０．６～０．７５、０．６～０．７０、０．６５～０．９５、０．６５～０．９０、０．６５～０．８５、０．６５～０．８、０．６５～０．７５、０．７～０．９５、０．７～０．９０、０．７～０．８５、０．７～０．８、０．７５～０．９５、０．７５～０．９０、０．７５～０．８５、０．８～０．９５、０．８～０．９０、０．８～０．８５、０．８５～０．９５、０．８５～０．９０、または０．９～０．９５である。

【0419】

（ｉ）種子コーティング剤
本明細書に記載されるとき、「種子コーティング」及び「種子処理剤」は、互換的に使用される。本明細書に記載されるとき、「種子」には、植物種子、球茎、挿穂、鱗茎、塊茎、及び任意の植物繁殖材料が含まれる。一部の態様では、ポリマー組成物は、植物種子に施用される。一部の態様では、ポリマー組成物は、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、サトウキビ、擬似穀類、綿、及び油糧種子の種子及び／または他の植物繁殖材料に施用される。穀類の例としては、オオムギ、フォニオ、オートムギ、パルマーグラス（ｐａｌｍｅｒ’ｓ ｇｒａｓｓ）、ライムギ、トウジンビエ（ｐｅａｒｌ ｍｉｌｌｅｔ）、モロコシ、スペルトコムギ、テフ、ライコムギ、及びコムギが挙げられ得る。一部の態様では、その他の植物繁殖材料には、球茎及び挿穂、鱗茎、塊茎、及び任意の植物繁殖材料が含まれる。擬似穀類の例としては、ブレッドナッツ、ソバ、ガマ、チア、亜麻、アマランサス子実、ハンザ（ｈａｎｚａ）、キノア、及びゴマが挙げられ得る。一部の例では、種子は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機、新たな育種技法の産物、または従来のものであり得る。

【0420】

一部の態様では、ポリマー組成物は、ポリマー組成物を含む液体、スラリー、または粉末で種子をコーティングすることによって植物種子に施用される。一部の態様では、種子コーティング剤は、乾燥種子コーティング剤である。一部の態様では、種子コーティング剤は、液体種子コーティング剤である。

【0421】

ポリマー組成物の適用
一部の態様では、本明細書に記載のポリマー組成物は、畦間で、タルク中で、または種子処理剤として施用することができる。一部の態様では、ポリマー組成物は、農場に到着する前または農場に到着した後に種子に施用される。一部の態様では、ポリマー組成物は、連続または回分処理装置で種子に施用される。一部の態様では、ポリマー組成物は、オーガ処理装置で種子（ｓｅｅｎ）に施用される。一部の態様では、ポリマー組成物は、プランターで施用される。一部の態様では、ポリマーは、ペレット化、外被形成（ｅｎｃｒｕｓｔｉｎｇ）、及びフィルムコーティングのプロセスを使用して種子に施用される。一部の態様では、プランターは、乾燥物質としてポリマー組成物を受け入れ、これが現地でポリマー組成物中の１つまたは複数の細菌を増殖させるための接種剤として使用される。次いで、結果として得られる細菌が、種子処理剤または畦間処理剤として使用される。一部の態様では、ポリマー組成物は、最初に種子に施用され、次いで、ポリマー組成物をすでに含む種子と共に、より後に畦間で施用される。一部の態様では、種子に施用される第１のポリマー組成物は、第１のポリマー組成物を含む種子と共に畦間で施用される、より後のポリマー組成物とは異なる。一部の態様では、ポリマー組成物は、種子滑沢剤と共に種子に施用される。一部の態様では、ポリマー組成物は、タルク、黒鉛、またはポリエチレンろう等の滑沢剤と組み合わせてプランターボックス内で種子に施用される。一部の態様では、ポリマー組成物は、タルク、黒鉛、またはポリエチレンろう等の滑沢剤と組み合わせて種子に施用される。

【0422】

一部の態様では、プランターは、処理された種子を植栽し、従来の方式に従って２条で、または耕うんを必要としない方式で作物を栽培することができる。一部の態様では、種子は、コントロールホッパーまたは個別のホッパーを使用して散布することができる。また、種子は、加圧空気を使用して、真空プランターで、機械的に、または手作業で散布することができる。一部の態様では、種子配置は、可変作業技術を使用して実施することができる。加えて、本明細書に記載の細菌または細菌集団の施用は、可変作業技術を使用して施用されてもよい。一部の態様では、ポリマー組成物は、本開示の植物種子に施用することができる。

【0423】

マイクロ肥料、ＰＧＲ、除草剤、殺虫剤、及び殺真菌剤等の添加剤を追加で使用して、作物を処理することができる。添加剤の例としては、殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤等の作物保護剤、着色剤、ポリマー、ペレット化（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）、プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）、及び消毒剤等の強化剤、ならびに接種剤、ＰＧＲ、軟化剤、及び微量栄養素等の他の薬剤が挙げられる。ＰＧＲは、根成長、開花、または茎伸長に影響を及ぼす天然または合成の植物ホルモンであり得る。ＰＧＲには、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、及びアブシジン酸（ＡＢＡ）が含まれ得る。

【0424】

一部の態様では、本開示のいずれか１つまたは複数の添加剤または化学処理剤は、槽内混合、共施用、順次施用、または本開示の１つもしくは複数の添加剤もしくは化学処理剤で事前に処理された植物部位／種子の追加処理（ｏｖｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって、微生物（複数可）及びポリマー（複数可）と組み合わせて植物部位／種子に施用されてもよい。一部の態様では、微生物の最適な性能及び生存のために、ある特定の処理方法のみに施用を制限することが必要な場合がある。本明細書で使用されるとき、「槽内混合」とは、化学物質（複数可）／添加剤（複数可）／ポリマー（複数可）／微生物（複数可）が液体スラリーへとブレンドされ、次いで種子に施用されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「共施用」とは、種子が連続または回分処理装置内にあり、化学物質（複数可）／添加剤（複数可）／ポリマー（複数可）／微生物（複数可）が同時に施用されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「順次施用」または「順次に施用される」とは、種子が連続または回分処理装置内にあり、化学物質（複数可）／添加剤（複数可）／ポリマー（複数可）／微生物（複数可）のうちの１つまたは複数が種子に順次に施用されることを意味し、このうち、各施用間には短い遅延が伴い、微生物（複数可）／ポリマー（複数可）が最後に添加される。本明細書で使用されるとき、「追加処理」とは、種子が化学物質（複数可）／添加剤（複数可）で処理され、乾燥かつ完全に硬化させられ、次いで微生物（複数可）が添加されることを意味する。

【0425】

組成物は、液体肥料と組み合わせて畦間で施用することができる。一部の態様では、畦間施用のために製剤化される組成物は、液体肥料と適合性のものである。一部の例では、液体肥料は、槽に保持されてもよい。ＮＰＫ肥料は、窒素、亜リン酸、及びカリウムという多量栄養素を含有する。

【0426】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、適用の直前に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、適用の３０分未満、１時間未満、２時間未満、３時間未満、４時間未満、５時間未満、６時間未満、７時間未満、８時間未満、９時間未満、１０時間未満、１１時間未満、１２時間未満、１３時間未満、１４時間未満、１５時間未満、１６時間未満、１７時間未満、１８時間未満、１９時間未満、２０時間未満、２１時間未満、２２時間未満、２３時間未満、２４時間未満、２５時間未満、２６時間未満、２７時間未満、２８時間未満、２９時間未満、３０時間未満、３５未満、４０時間未満、４５時間未満、５０時間未満、５５時間未満、６０時間未満、６５時間未満、７０時間未満、７５時間未満、８０時間未満、８５時間未満、９０時間未満、９５時間未満、１００時間未満、１１０時間未満、１２０時間未満、１３０時間未満、１４０時間未満、１５０時間未満、１６０時間未満、１７０時間未満、１８０時間未満、１９０時間未満、または２００時間未満前に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。

【0427】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、適用の約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、約５０時間、約５５時間、約６０時間、約６５時間、約７０時間、約７５時間、約８０時間、約８５時間、約９０時間、約９５時間、約１００時間、約１１０時間、約１２０時間、約１３０時間、約１４０時間、約１５０時間、約１６０時間、約１７０時間、約１８０時間、約１９０時間、約２００時間、または約０時間前に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。

【0428】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、適用の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約３５日、約４０日、約４５日、約５０日、約５５日、約６０日、約６５日、約７０日、約７５日、約８０日、約８５日、約９０日、約９５日、約１００日、約１１０日、約１２０日、約１３０日、約１４０日、約１５０日、約１６０日、約１７０日、約１８０日、約１９０日、約２００日、約２１０日、約２２０日、約２３０日、約２４０日、約２５０日、約２６０日、約２７０日、約２８０日、約２９０日、約３００日、約３１０日、約３２０日、約３３０日、約３４０日、約３５０日、約３６０日、または約３７０日前に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。

【0429】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、適用の１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満、１０日未満、１１日未満、１２日未満、１３日未満、１４日未満、１５日未満、１６日未満、１７日未満、１８日未満、１９日未満、２０日未満、２１日未満、２２日未満、２３日未満、２４日未満、２５日未満、２６日未満、２７日未満、２８日未満、２９日未満、３０日未満、３５日未満、４０日未満、４５日未満、５０日未満、５５日未満、６０日未満、６５日未満、７０日未満、７５日未満、８０日未満、８５日未満、９０日未満、９５日未満、１００日未満、１１０日未満、１２０日未満、１３０日未満、１４０日未満、１５０日未満、１６０日未満、１７０日未満、１８０日未満、１９０日未満、２００日未満、２１０日未満、２２０日未満、２３０日未満、２４０日未満、２５０日未満、２６０日未満、２７０日未満、２８０日未満、２９０日未満、３００日未満、３１０日未満、３２０日未満、３３０日未満、３４０日未満、３５０日未満、３６０日未満、または３７０日未満前に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。

【0430】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、適用の約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２５ヶ月、約２６ヶ月、約２７ヶ月、約２８ヶ月、約２９ヶ月、約３０ヶ月、約３１ヶ月、約３２ヶ月、約３３ヶ月、約３４ヶ月、約３５ヶ月、約３６ヶ月、約３７ヶ月、約３８ヶ月、約３９ヶ月、約４０ヶ月、約４１ヶ月、約４２ヶ月、約４３ヶ月、約４４ヶ月、約４５ヶ月、約４６ヶ月、約４７ヶ月、約４８ヶ月、約４９ヶ月、約５０ヶ月、約５１ヶ月、約５２ヶ月、約５３ヶ月、約５４ヶ月、約５５ヶ月、約５６ヶ月、約５７ヶ月、約５８ヶ月、約５９ヶ月、または約６０ヶ月前に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。

【0431】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、適用の１ヶ月未満、２ヶ月未満、３ヶ月未満、４ヶ月未満、５ヶ月未満、６ヶ月未満、７ヶ月未満、８ヶ月未満、９ヶ月未満、１０ヶ月未満、１１ヶ月未満、１２ヶ月未満、１３ヶ月未満、１４ヶ月未満、１５ヶ月未満、１６ヶ月未満、１７ヶ月未満、１８ヶ月未満、１９ヶ月未満、２０ヶ月未満、２１ヶ月未満、２２ヶ月未満、２３ヶ月未満、２４ヶ月未満、２５ヶ月未満、２６ヶ月未満、２７ヶ月未満、２８ヶ月未満、２９ヶ月未満、３０ヶ月未満、３１ヶ月未満、３２ヶ月未満、３３ヶ月未満、３４ヶ月未満、３５ヶ月未満、３６ヶ月未満、３７ヶ月未満、３８ヶ月未満、３９ヶ月未満、４０ヶ月未満、４１ヶ月未満、４２ヶ月未満、４３ヶ月未満、４４ヶ月未満、４５ヶ月未満、４６ヶ月未満、４７ヶ月未満、４８ヶ月未満、４９ヶ月未満、５０ヶ月未満、５１ヶ月未満、５２ヶ月未満、５３ヶ月未満、５４ヶ月未満、５５ヶ月未満、５６ヶ月未満、５７ヶ月未満、５８ヶ月未満、５９ヶ月未満、または６０ヶ月未満前に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。

【0432】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、１つまたは複数の細菌または微生物組成物とは別個の混合物または溶液として適用される。一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、１つまたは複数の細菌または微生物組成物とは別個の混合物または溶液として、ただし１つまたは複数の細菌または微生物組成物と同時に適用される。一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、１つまたは複数の細菌または微生物組成物とは別個の混合物または溶液として、ただし１つまたは複数の細菌または微生物組成物の直前に適用される。一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、１つまたは複数の細菌または微生物組成物とは別個の混合物または溶液として、ただし１つまたは複数の細菌または微生物組成物の直後に適用される。

【0433】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、細菌の収集の直後に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、１つまたは複数の細菌または微生物組成物を乾燥化させた直後に１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合される。一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物は、１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合され、次いで、結果として得られる微生物ポリマー組成物が乾燥化させられる。

【0434】

一部の態様では、第１のポリマーまたはポリマー組成物が、１つまたは複数の細菌または微生物組成物と組み合わされ／混合されて、微生物ポリマー組成物が形成される。一部の態様では、第２のポリマーまたはポリマー組成物が、微生物ポリマー組成物と組み合わされ／混合される。一部の態様では、第３のポリマーまたはポリマー組成物が、第１及び第２のポリマーまたはポリマー組成物を含む微生物ポリマー組成物と組み合わされ／混合される。

【0435】

一部の態様では、第１のポリマーまたはポリマー組成物を含む微生物ポリマー組成物が、第２のポリマーまたはポリマー組成物と同時に適用される。さらなる態様では、第１のポリマーまたはポリマー組成物は、第２のポリマーまたはポリマー組成物とは異なる。さらなる態様では、第１のポリマーまたはポリマー組成物は、第２のポリマーまたはポリマー組成物と同じである。一部の態様では、第２のポリマーまたはポリマー組成物は、微生物ポリマー組成物の適用直前に適用される。一部の態様では、第２のポリマーまたはポリマー組成物は、微生物ポリマー組成物の適用直後に適用される。

【0436】

一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物と１つまたは複数の細菌または微生物組成物との混合の後に、ポリマーまたはポリマー組成物を一定期間硬化または乾燥させてから、後続のポリマーまたはポリマー組成物が施用される。一部の態様では、ポリマーまたはポリマー組成物と１つまたは複数の細菌または微生物組成物との混合の後に、ポリマーまたはポリマー組成物を一定期間硬化または乾燥させてから、微生物ポリマー組成物が適用される。

【0437】

ポリマーにより与えられる安定性／生存率
「生存率」、「微生物の生存率」、または「細胞生存率」という用語は一般に、固体または液体増殖培地上で増殖することが可能である細胞のパーセンテージを指す。「安定性」、「微生物安定性」、または「細胞安定性」という用語は一般に、一定期間にわたって固体または液体増殖培地上で増殖することが可能である細胞のパーセンテージを指し、経時的生存率と称されることがある。細胞の生存率の経時的変化は、細胞の安定性として知られる。微生物の生存率の維持は、その経時的低下の低減を指し、これは「安定性」と称される。

【0438】

一部の態様では、生存率は、試料中で生存可能なままである細胞の総数が、対応する参照／対照試料と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であることを指す。

【0439】

一部の態様では、安定性は、試料中で一定期間にわたって生存可能なままである細胞の総数が、対応する参照／対照試料と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であることを指す。

【0440】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、ポリマーが欠如した対照微生物組成物と比較してより長い一定期間、増加した細胞安定性を示す。

【0441】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、ポリマーが欠如した対照微生物組成物と比較して増加した細胞安定性を示す。一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、同じ一定期間にわたって、対応する参照／対照試料と比較して少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、７００％、８００％、または９００％の安定性の増加を示す。

【0442】

一部の態様では、当該一定期間は、ポリマーを含む微生物組成物または対応する参照／対照試料の製造後、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、６０日間、６５日間、７０日間、７５日間、８０日間、８５日間、９０日間、９５日間、１００日間、１０５日間、１１０日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、２１０日間、２２０日間、２３０日間、２４０日間、または２５０日間である。

【0443】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、冷蔵庫（３５～４０°Ｆ）で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0444】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、冷蔵庫（３５～４０°Ｆ）で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0445】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、室温（６８～７２°Ｆ）で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0446】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、室温（６８～７２°Ｆ）で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0447】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、７０～１００°Ｆで、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0448】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、７０～１００°Ｆで、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0449】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、－２０°Ｆ未満）の温度で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0450】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、－２０°Ｆ未満の温度で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照試料と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の安定性を示す。

【0451】

一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、乾燥条件に供したときに、対応する参照／対照試料と比較して増加した安定性を示す。一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、冷凍乾燥に供したときに、対応する参照／対照試料と比較して増加した安定性を示す。一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、噴霧乾燥に供したときに、対応する参照／対照試料と比較して増加した安定性を示す。一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、凍結乾燥に供したときに、対応する参照／対照試料と比較して増加した安定性を示す。一部の態様では、ポリマーを含む微生物組成物は、噴霧凝固に供したときに、対応する参照／対照試料と比較して増加した安定性を示す。

【0452】

バイオフィルム
ある特定の実施形態では、前述のポリマー組成物は、バイオフィルムと組み合わせることができる。代替として、本開示または、ポリマーを含まないバイオフィルムのみの組成物を提供する。

【0453】

ほとんどの微小生物は、バイオフィルム、フロック（プランクトンバイオフィルム）、及び汚泥等の集合した形態で生存及び増殖する。Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：７１１－７４５、Ｗｉｍｐｅｎｎｙ．２０００．Ｉｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｏ－ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｆｉｌｍｓ（ｅｄ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌａｐｐｉｎ－Ｓｃｏｔｔ，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ）．Ｐｐ．１－２４，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫを参照されたい。バイオフィルムは、多価陽イオン、無機粒子、及び生体物質、ならびにコロイド状化合物及び溶解化合物の蓄積である。これらの形態の増殖は、バイオフィルムと総称されることが多い。バイオフィルムは、水性環境で、植物の組織及び動物上で、ならびにフィルター、船体、医療機器等の表面上で遍在的に分布している。バイオフィルムは典型的には、相境界で発生し、固体－水界面で固体表面に接着して見出され得ることが多い。バイオフィルムはまた、固体－空気界面でも見出され得る。

【0454】

バイオフィルム形成は、多くの場合、細菌等の自由に浮動する微小生物が適切な表面に接触して、細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）を分泌し始めるときに開始する。ＥＰＳは、バイオフィルム中の微小生物が互いに接着することを可能にする、糖、タンパク質、及び核酸のネットワークである。適切な表面への接触及び付着に続いて、増殖期が生じる。微小生物及びＥＰＳのさらなる層が、第１の層の上に積み重なる。栄養素のチャネルがバイオフィルムを縦横に通って、栄養素及び老廃物の交換を可能にする。

【0455】

バイオフィルム形成は、多くの場合、バイオフィルムが少数の細胞層のみであるか、または顕著により多くのものであるかを定める１つまたは複数の環境条件によって決定される。例えば、大量のＥＰＳを産生する微小生物は、それらに多くの栄養素が利用可能でない場合であっても、かなり厚いバイオフィルムに増殖することができる。酸素に依存する微小生物は、バイオフィルムがどれほど密となり得るかによって制限され得る。バイオフィルム内の細胞は、バイオフィルムから離れて、新たな表面上に定着することができる。一塊の細胞が離脱し得るか、または個々の細胞が、播種散布（ｓｅｅｄｉｎｇ ｄｉｓｐｅｒｓａｌ）として知られるプロセスにおいてバイオフィルムから放出される。

【0456】

微生物の群落は、多くの場合、水不足、高ｐＨもしくは低ｐＨ、または抗生物質、抗微生物剤、もしくは重金属等の毒性物質の存在等のストレス因子に対してより回復力がある。バイオフィルムの耐久力は、脱水を防止する保護障壁として作用する、または紫外光に対する遮蔽物として作用するＥＰＳから生じると考えられている。抗微生物剤、漂白剤、または重金属等の有害な物質は、それらがＥＰＳに接触するときに結合されるかまたは中和される。これらの物質は、バイオフィルム内の種々の細胞層に到達する前に、致死量以下の濃度に希釈されるようになり得る。ある特定の抗生物質／抗微生物剤がＥＰＳを透過し、バイオフィルムの層を通過することが可能である。

【0457】

バイオフィルム内に見出される微小生物は、高細胞密度で密接に結び付いて存在し、ＥＰＳのマトリックスに埋まっている。ＥＰＳ産生は、ほとんどの環境で表される一般的な微生物特性である。ＥＰＳを形成する能力は、原核生物の間で広く行き渡っているが、藻類、酵母、カビ、及び真菌等の真核微小生物でも起こり得る。Ｇｈｏｓｌｅ．２００１．Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ．１７：１１７－１２７、及びＵＳ２００６００９６９１８Ａ１を参照されたい。ＥＰＳは細菌の必須の構造ではないが、天然条件下では、ほとんどの環境細菌がフロック及びバイオフィルム等の集合体で存在し、その集合体の構造的及び機能的完全性がＥＰＳマトリックスの存在に本質的に基づくことを考慮すると、ＥＰＳ産生は、生存の重要な機能である。

【0458】

ＥＰＳは、微生物集合体の形態、構成、結合性、物理化学特性、及び生化学活性を決定する主要な構成成分と見なされる。ＥＰＳは、微小生物が本質的に固定化されている、高度に水和し局所的に荷電した３次元のゲル様のバイオフィルムマトリックスである。一般に、バイオフィルム中のＥＰＳの割合は、総有機物質の約５０％～約９０％の間で様々であり得る。Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．３６：１１－１９を参照されたい。ＥＰＳは、活性化した汚泥フロック（バイオフロキュレーション）の形成及び固定バイオフィルムの発生に関与する。
ＥＰＳは、例えば、多糖（例えば、グリコシド結合によって連結された単糖（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ウロン酸、及びアミノ糖）、ポリペプチド、核酸、脂質／リン脂質（例えば、脂肪酸、グリセロールリン酸、エタノールアミン、セリン、及びコリン）、及び腐植物質（例えば、フェノール化合物、単糖（ｓｉｍｐｌｅ ｓｕｇａｒ）、及びアミノ酸）等の物質を含み得る。ＥＰＳ組成物は、微生物細胞から高分子を取り出した後に評価され得る。遠心分離、濾過、加熱、ブレンド、超音波処理、ならびに水酸化ナトリウム、または錯化剤、及びイオン交換樹脂での処理を含めた物理的方法及び化学的方法を使用して、微生物集合体からＥＰＳを抽出することができる。Ｊａｈｎ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ．１９９５．Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．３１：１５７－１６４、及びＮｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｊａｈｎ．１９９９．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（ｅｄ．Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ，ｎｅｕ，ａｎｄ Ｆｌｅｍｍｉｎｇ），ｐｐ．４９－７２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎを参照されたい。例えば、撹拌と組み合わせた陽イオン交換樹脂の使用を用いて、顕著な細胞溶解を引き起こすことなくバイオフィルムからＥＰＳを単離することができる。そのような方法は、カルシウムイオンの除去、ＥＰＳ構造の不安定化、及び細胞からのＥＰＳの分離の容易化に基づく。

【0459】

バイオフィルム産生微小生物
一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、土壌（例えば、根圏）、空気、水（例えば、海水、淡水、廃水汚泥）、堆積物、油、植物（例えば、根、葉、茎）、動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥等）、農業産物、及び極限環境（例えば、酸性鉱山排水または熱水系）から得られる微生物から選択されてもよい。さらなる態様では、海洋、川、または湖等の海水または淡水環境から得られる微生物。さらなる実施形態では、微生物は、水域の表面、または任意の深度の水域（例えば、深海試料）からのものであり得る。

【0460】

微生物が源となる材料（例えば、それらが天然に常在する材料）から単離される、本開示の態様では、当業者には容易に知られることになるいくつかの標準技法のうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせが使用されてもよい。しかしながら、例として、これらは一般に、通常は固体微生物増殖培地の表面上での物理的分離によって、または液体微生物増殖培地中への容量希釈分離（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｄｉｌｕｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）によって、単一の微小生物の固体または液体培養物を実質的に純粋な形態で得ることができるプロセスを用いる。これらのプロセスには、適切な固体ゲル増殖培地の上で材料が薄層に広げられる、乾燥材料、液体懸濁液、スラリー、もしくはホモジネートからの単離、または滅菌培地中への材料の段階希釈及び液体もしくは固体培養基への接種が含まれてもよい。

【0461】

バイオフィルムは、多数のタイプの微小生物から形成され得る。例えば、バイオフィルムは、プロテオバクテリアのα－サブクラス、β－サブクラス、もしくはγ－サブクラス由来の細菌；高ＧＣ含量を有するグラム陽性菌、及び／またはＣｙｔｏｐｈａｇａ－Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ群由来の細菌を含有し得る。真菌及び酵母の種々の種もまた、バイオフィルムを産生することが知られている。

【0462】

細菌に加えて、バイオフィルムは、無脊椎動物（例えば、線虫）、鞭毛虫、及び繊毛虫（例えば、輪虫）等の原生動物及び後生動物の生物を含有し得るか、またはそれによって産生され得る。

【0463】

一部の態様では、バイオフィルム産生微生物には、細菌、真菌、及び酵母が含まれる。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、細菌である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、真菌である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、酵母である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、鞭毛虫である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、繊毛虫である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、藻類である。

【0464】

一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、グラム陰性細菌である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、グラム陽性細菌である。

【0465】

一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、病原体である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、偏性病原体である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、日和見病原体である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、植物病原体である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、ヒト病原体である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、動物病原体である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、土壌微生物である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、植物コロニー形成微生物である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、根コロニー形成微生物である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、根圏コロニー形成微生物である。

【0466】

一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、以下の種、すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｌｉｎｅｎｓｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｈｎｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｙｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ ｍｕｒａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｗａｌｔｅｒｓｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｂｒｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのうちのいずれか１つまたは複数から選択される。

【0467】

一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、以下の属、すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａのうちのいずれか１つまたは複数の種である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種である。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、Ｋｏｓａｋｏｎｉａの種である。

【0468】

バイオフィルム産生
一部の態様では、増殖培地には、プランクトン微生物が接種される。一部の態様では、増殖培地には、すでにバイオフィルム中にある固着微生物が接種される。一部の態様では、増殖培地には、対数増殖期にある微生物が接種される。一部の態様では、増殖培地には、誘導増殖期にある微生物が接種される。一部の態様では、増殖培地には、静止期にある微生物が接種される。

【0469】

一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、対数期で増殖しているときにバイオフィルムを産生する。一部の態様では、バイオフィルム産生微生物は、対数期で増殖しているときにバイオフィルムを産生する。

【0470】

一部の態様では、バイオフィルムは、フラスコ中で振とうしながら培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、フラスコ中で振とうせずに培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、固体表面（担体）上で培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、バイオリアクタ中で培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、ケモスタット中で培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、連続フローシステム中で培養される。

【0471】

一部の態様では、バイオフィルムは、増殖培地で少なくとも１つの菌株を共接種することによって培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、増殖培地で少なくとも２つの菌株を共接種することによって培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、増殖培地で少なくとも３つの菌株を共接種することによって培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、増殖培地で少なくとも４つの菌株を共接種することによって培養される。一部の態様では、バイオフィルムは、増殖培地で少なくとも５つの菌株を共接種することによって培養される。

【0472】

一部の態様では、バイオフィルムは、ＥＰ２１８６８９０Ａ１、ＷＯ２０１７２０３４４０Ａ１、米国特許第５，１１６，５０６号、ＵＳ２００９０２５８４０４Ａ１、及びＵＳ２００９０１５２１９５Ａ１に記載されるようにバイオリアクタ中で産生させられる。

【0473】

一部の態様では、バイオフィルムは、本開示の細菌のうちの１つまたは複数を用いてインサイチュで培養される。一部の態様では、増殖培地は、１つまたは複数のバイオフィルム産生微生物及び１つまたは複数の非バイオフィルム産生微生物の対数増殖を支持することが可能である。１つまたは複数のバイオフィルム産生微生物及び１つまたは複数の非バイオフィルム産生微生物の共培養は、非バイオフィルム産生微生物が、バイオフィルム産生微生物によって産生されるバイオフィルムに包まれるように、２つ以上の微生物の十分な対数増殖をもたらす。

【0474】

（ｉ）バイオフィルムの単離／収集
一部の態様では、バイオフィルムは、増殖培地中で撹拌されて、バイオフィルムを、それらが接着している表面から放出する。一部の態様では、撹拌には、剥離、超音波処理、せん断（ｓｈｅｅｒ）力、振とう等が含まれる。

【0475】

一部の態様では、バイオフィルムは、増殖培地または増殖チャンバから単離され、フィルターの上に注がれ、これにより、バイオフィルム組成物を保留しながら上清及びプランクトン単細胞微生物が通過することを可能にする。一部の態様では、バイオフィルムは、反応チャンバ／増殖フラスコの全内容物を、直径５マイクロメートルの孔を含むフィルターに注ぐことによって、使用済み培地から単離される。一部の態様では、バイオフィルムは、反応チャンバ／増殖フラスコの全内容物を、直径１０マイクロメートルの孔を含むフィルターに注ぐことによって、使用済み培地から単離される。一部の態様では、バイオフィルムは、反応チャンバ／増殖フラスコの全内容物を、直径１５マイクロメートルの孔を含むフィルターに注ぐことによって、使用済み培地から単離される。一部の態様では、バイオフィルムは、反応チャンバ／増殖フラスコの全内容物を、直径２０マイクロメートルの孔を含むフィルターに注ぐことによって、使用済み培地から単離される。

【0476】

一部の態様では、濾過は、陰圧吸引器の補助により生じる。

【0477】

一部の態様では、フィルターに残っているバイオフィルム材料は、適切な緩衝液または培地で少なくとも１回洗浄される。一部の態様では、フィルターに残っているバイオフィルム材料は、適切な緩衝液または培地で少なくとも２回洗浄される。一部の態様では、フィルターに残っているバイオフィルム材料は、適切な緩衝液または培地で少なくとも３回洗浄される。一部の態様では、フィルターに残っているバイオフィルム材料は、適切な緩衝液または培地で少なくとも４回洗浄される。一部の態様では、フィルターに残っているバイオフィルム材料は、適切な緩衝液または培地で少なくとも５回洗浄される。

【0478】

一部の態様では、バイオフィルムは、超音波処理されて、バイオフィルムがわずかにより小さい薄切へと粉砕されることを可能にすると共に、回収及び精製されたバイオフィルムが単一の塊のまま残ることを防止する。

【0479】

一部の態様では、バイオフィルムは、緩衝液または培地中に再懸濁され、遠心分離または超遠心分離の使用により、より小さい容量に濃縮される。

【0480】

一部の態様では、バイオフィルムは、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍の容量で再懸濁される。

【0481】

（ｉｉ）バイオフィルムの処理
一部の態様では、バイオフィルムは、バイオフィルムを産生した残存する微生物を死滅させるように滅菌される。一部の態様では、滅菌は、加熱殺菌である。一部の態様では、加熱殺菌は、バイオフィルムのオートクレーブ処理である。一部の態様では、滅菌は、紫外線へのバイオフィルムの曝露である。一部の態様では、滅菌は、Ｘ線へのバイオフィルムの曝露である。一部の態様では、滅菌は、ガンマ線へのバイオフィルムの曝露である。

【0482】

一部の態様では、バイオフィルム滅菌は、バイオフィルムによって与えられるいずれか１つまたは複数の特性または形質を調整しない。

【0483】

バイオフィルム組成物
一部の態様では、バイオフィルム組成物は、本開示のいずれか１つまたは複数の微生物とのバイオフィルムの組み合わせである。一部の態様では、バイオフィルムは、本開示のいずれか１つまたは複数の細菌と混合される。一部の態様では、バイオフィルムは、本開示のいずれか１つまたは複数の空中窒素固定微生物と混合される。

【0484】

一部の態様では、バイオフィルム組成物は、異なる微小生物によって産生される２つ以上のバイオフィルムの組み合わせである。一部の態様では、本開示のバイオフィルムは、単一の微生物種で構成されるか、または単一の微生物種によって産生されて、純粋な培養物を形成してもよい。一部の態様では、バイオフィルムは、細菌のコンソーシアムで構成されるか、または細菌のコンソーシアムによって産生されてもよい。一部の態様では、バイオフィルムは、１つまたは複数の微生物種によって産生されてもよい。一部の態様では、バイオフィルムは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、または少なくとも１０種の微生物種によって産生されてもよい。

【0485】

一部の態様では、バイオフィルムは、それが添加される１つまたは複数の細菌に外因性である。一部の態様では、バイオフィルムは、それが添加される１つまたは複数の細菌に天然である。

【0486】

一部の態様では、バイオフィルム組成物は、液体である。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、固体である。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、固体要素及び液体要素の両方を含む。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、半固体である。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、乾燥させられる。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、砂である。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、粉末である。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、ゲルである。

【0487】

一部の態様では、バイオフィルム組成物は、本明細書に開示されるいずれか１つまたは複数の要素を含む。

【0488】

一部の実施形態では、本開示の少なくとも２つのバイオフィルムの組み合わせは、互いに接触することになるバイオフィルムのうちの１つまたは複数の存在下で、本明細書に記載の形質のうちの１つまたは複数に対して相乗効果を示す。教示される方法によって得られる相乗効果は、例えば、コルビーの式（すなわち、（Ｅ）＝Ｘ＋Ｙ－（Ｘ×Ｙ／１００））に従って定量することができる。Ｃｏｌｂｙ，Ｒ．Ｓ．，“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，”１９６７．Ｗｅｅｄｓ．Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２０－２２を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に援用される）。故に、「相乗的」とは、相加的量を超えて増加した成果／パラメータ／効果を反映することが意図される。

【0489】

一部の態様では、バイオフィルムは、本開示のいずれか１つまたは複数の細菌を含む液体培地に導入される。一部の態様では、バイオフィルムは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０の容量％で本開示のいずれか１つまたは複数の細菌を含む液体培地に導入される。

【0490】

一部の態様では、バイオフィルムは、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：または１０：１の容量でいずれか１つまたは複数の細菌を含む液体培地に導入される。

【0491】

水分含量は、組成物中の水の総量の測定値であり、通常は総重量のパーセンテージとして表される。水分含量は、組成物の乾燥重量を決定するのに有用な測定値であり、それを使用して、組成物の乾燥化／乾燥プロセスが完了しているかどうかを確認することができる。水分含量は、（組成物の湿重量－乾燥化／乾燥後の重量）を組成物の湿重量で除し、１００を乗じることによって算出される。

【0492】

水分含量は、組成物中の水の量を定義するものであるが、水分活性は、組成物中の水が微小生物とどのように反応するかを説明するものである。水分活性が大きいほど、微小生物はより速く増殖することができる。水分活性は、組成物中の蒸気圧対純水の蒸気圧の比を見出すことによって算出される。より具体的には、水分活性は、組成物中の水の蒸気の分圧を、標準状態の純水の蒸気の分圧で除したものである。純粋な蒸留水の水分活性は１である。組成物の水分活性の決定は、組成物中の水の量ではなく、微小生物が使用するために利用可能な過剰量の水の量である。微小生物は、増殖のために最小かつ最適な水分活性を有する。

【0493】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物は、乾燥化している。微生物組成物は、組成物の水分含量が０％～２０％である場合、乾燥化している。

【0494】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分含量は、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である。

【0495】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分含量は、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満、１５％未満、１６％未満、１７％未満、１８％未満、１９％未満、２０％未満、２１％未満、２２％未満、２３％未満、２４％未満、２５％未満、２６％未満、２７％未満、２８％未満、２９％未満、３０％未満、３１％未満、３２％未満、３３％未満、３４％未満、３５％未満、３６％未満、３７％未満、３８％未満、３９％未満、４０％未満、４１％未満、４２％未満、４３％未満、４４％未満、４５％未満、４６％未満、４７％未満、４８％未満、４９％未満、５０％未満、５１％未満、５２％未満、５３％未満、５４％未満、５５％未満、５６％未満、５７％未満、５８％未満、５９％未満、６０％未満、６１％未満、６２％未満、６３％未満、６４％未満、６５％未満、６６％未満、６７％未満、６８％未満、６９％未満、７０％未満、７１％未満、７２％未満、７３％未満、７４％未満、７５％未満、７６％未満、７７％未満、７８％未満、７９％未満、８０％未満、８１％未満、８２％未満、８３％未満、８４％未満、８５％未満、８６％未満、８７％未満、８８％未満、８９％未満、９０％未満、９１％未満、９２％未満、９３％未満、９４％未満、９５％未満、９６％未満、９７％未満、９８％未満、９９％未満、または１００％未満である。

【0496】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分含量は、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、約１０％未満、約１１％未満、約１２％未満、約１３％未満、約１４％未満、約１５％未満、約１６％未満、約１７％未満、約１８％未満、約１９％未満、約２０％未満、約２１％未満、約２２％未満、約２３％未満、約２４％未満、約２５％未満、約２６％未満、約２７％未満、約２８％未満、約２９％未満、約３０％未満、約３１％未満、約３２％未満、約３３％未満、約３４％未満、約３５％未満、約３６％未満、約３７％未満、約３８％未満、約３９％未満、約４０％未満、約４１％未満、約４２％未満、約４３％未満、約４４％未満、約４５％未満、約４６％未満、約４７％未満、約４８％未満、約４９％未満、約５０％未満、約５１％未満、約５２％未満、約５３％未満、約５４％未満、約５５％未満、約５６％未満、約５７％未満、約５８％未満、約５９％未満、約６０％未満、約６１％未満、約６２％未満、約６３％未満、約６４％未満、約６５％未満、約６６％未満、約６７％未満、約６８％未満、約６９％未満、約７０％未満、約７１％未満、約７２％未満、約７３％未満、約７４％未満、約７５％未満、約７６％未満、約７７％未満、約７８％未満、約７９％未満、約８０％未満、約８１％未満、約８２％未満、約８３％未満、約８４％未満、約８５％未満、約８６％未満、約８７％未満、約８８％未満、約８９％未満、約９０％未満、約９１％未満、約９２％未満、約９３％未満、約９４％未満、約９５％未満、約９６％未満、約９７％未満、約９８％未満、約９９％未満、または約１００％未満である。

【0497】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分含量は、１％～１００％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～５％、５％～１００％、５％～９５％、５％～９０％、５％～８５％、５％～８０％、５％～７５％、５％～７０％、５％～６５％、５％～６０％、５％～５５％、５％～５０％、５％～４５％、５％～４０％、５％～３５％、５％～３０％、５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％、５％～１０％、１０％～１００％、１０％～９５％、１０％～９０％、１０％～８５％、１０％～８０％、１０％～７５％、１０％～７０％、１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５５％、１０％～５０％、１０％～４５％、１０％～４０％、１０％～３５％、１０％～３０％、１０％～２５％、１０％～２０％、１０％～１５％、１５％～１００％、１５％～９５％、１５％～９０％、１５％～８５％、１５％～８０％、１５％～７５％、１５％～７０％、１５％～６５％、１５％～６０％、１５％～５５％、１５％～５０％、１５％～４５％、１５％～４０％、１５％～３５％、１５％～３０％、１５％～２５％、１５％～２０％、２０％～１００％、２０％～９５％、２０％～９０％、２０％～８５％、２０％～８０％、２０％～７５％、２０％～７０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５５％、２０％～５０％、２０％～４５％、２０％～４０％、２０％～３５％、２０％～３０％、２０％～２５％、２５％～１００％、２５％～９５％、２５％～９０％、２５％～８５％、２５％～８０％、２５％～７５％、２５％～７０％、２５％～６５％、２５％～６０％、２５％～５５％、２５％～５０％、２５％～４５％、２５％～４０％、２５％～３５％、２５％～３０％、３０％～１００％、３０％～９５％、３０％～９０％、３０％～８５％、３０％～８０％、３０％～７５％、３０％～７０％、３０％～６５％、３０％～６０％、３０％～５５％、３０％～５０％、３０％～４５％、３０％～４０％、３０％～３５％、３５％～１００％、３５％～９５％、３５％～９０％、３５％～８５％、３５％～８０％、３５％～７５％、３５％～７０％、３５％～６５％、３５％～６０％、３５％～５５％、３５％～５０％、３５％～４５％、３５％～４０％、４０％～１００％、４０％～９５％、４０％～９０％、４０％～８５％、４０％～８０％、４０％～７５％、４０％～７０％、４０％～６５％、４０％～６０％、４０％～５５％、４０％～５０％、４０％～４５％、４５％～１００％、４５％～９５％、４５％～９０％、４５％～８５％、４５％～８０％、４５％～７５％、４５％～７０％、４５％～６５％、４５％～６０％、４５％～５５％、４５％～５０％、５０％～１００％、５０％～９５％、５０％～９０％、５０％～８５％、５０％～８０％、５０％～７５％、５０％～７０％、５０％～６５％、５０％～６０％、５０％～５５％、５５％～１００％、５５％～９５％、５５％～９０％、５５％～８５％、５５％～８０％、５５％～７５％、５５％～７０％、５５％～６５％、５５％～６０％、６０％～１００％、６０％～９５％、６０％～９０％、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～１００％、６５％～９５％、６５％～９０％、６５％～８５％、６５％～８０％、６５％～７５％、６５％～７０％、７０％～１００％、７０％～９５％、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～１００％、７５％～９５％、７５％～９０％、７５％～８５％、７５％～８０％、８０％～１００％、８０％～９５％、８０％～９０％、８０％～８５％、８５％～１００％、８５％～９５％、８５％～９０％、９０％～１００％、９０％～９５％、または９５％～１００％である。

【0498】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分活性は、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４、約０．５、約０．５５、約０．６０、約０．６５、約０．７０、約０．７５、約０．８、約０．８５、約０．９０、または約０．９５である。

【0499】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分活性は、約０．１未満、約０．１５未満、約０．２未満、約０．２５未満、約０．３０未満、約０．３５未満、約０．４未満、約０．５未満、約０．５５未満、約０．６０未満、約０．６５未満、約０．７０未満、約０．７５未満、約０．８未満、約０．８５未満、約０．９０未満、または約０．９５未満である。

【0500】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分活性は、０．１未満、０．１５未満、０．２未満、０．２５未満、０．３０未満、０．３５未満、０．４未満、０．５未満、０．５５未満、０．６０未満、０．６５未満、０．７０未満、０．７５未満、０．８未満、０．８５未満、０．９０未満、または０．９５未満である。

【0501】

一態様では、本開示のバイオフィルム組成物の水分活性は、０．１～０．９５、０．１～０．９０、０．１～０．８５、０．１～０．８、０．１～０．７５、０．１～０．７０、０．１～０．６５、０．１～０．５５、０．１～０．５０、０．１～０．４５、０．１～０．４０、０．１～０．３５、０．１～０．３、０．１～０．２５、０．１～０．２、０．１～０．１５、０．１５～０．９５、０．１５～０．９０、０．１５～０．８５、０．１５～０．８、０．１５～０．７５、０．１５～０．７０、０．１５～０．６５、０．１５～０．５５、０．１５～０．５０、０．１５～０．４５、０．１５～０．４０、０．１５～０．３５、０．１５～０．３、０．１５～０．２５、０．１５～０．２、０．２～０．９５、０．２～０．９０、０．２～０．８５、０．２～０．８、０．２～０．７５、０．２～０．７０、０．２～０．６５、０．２～０．５５、０．２～０．５０、０．２～０．４５、０．２～０．４０、０．２～０．３５、０．２～０．３、０．２～０．２５、０．２５～０．９５、０．２５～０．９０、０．２５～０．８５、０．２５～０．８、０．２５～０．７５、０．２５～０．７０、０．２５～０．６５、０．２５～０．５５、０．２５～０．５０、０．２５～０．４５、０．２５～０．４０、０．２５～０．３５、０．２５～０．３、０．３～０．９５、０．３～０．９０、０．３～０．８５、０．３～０．８、０．３～０．７５、０．３～０．７０、０．３～０．６５、０．３～０．５５、０．３～０．５０、０．３～０．４５、０．３～０．４０、０．３～０．３５、０．３５～０．９５、０．３５～０．９０、０．３５～０．８５、０．３５～０．８、０．３５～０．７５、０．３５～０．７０、０．３５～０．６５、０．３５～０．５５、０．３５～０．５０、０．３５～０．４５、０．３５～０．４０、０．４～０．９５、０．４～０．９０、０．４～０．８５、０．４～０．８、０．４～０．７５、０．４～０．７０、０．４～０．６５、０．４～０．５５、０．４～０．５０、０．４～０．４５、０．４５～０．９５、０．４５～０．９０、０．４５～０．８５、０．４５～０．８、０．４５～０．７５、０．４５～０．７０、０．４５～０．６５、０．４５～０．５５、０．４５～０．５０、０．５～０．９５、０．５～０．９０、０．５～０．８５、０．５～０．８、０．５～０．７５、０．５～０．７０、０．５～０．６５、０．５～０．５５、０．５５～０．９５、０．５５～０．９０、０．５５～０．８５、０．５５～０．８、０．５５～０．７５、０．５５～０．７０、０．５５～０．６５、０．６～０．９５、０．６～０．９０、０．６～０．８５、０．６～０．８、０．６～０．７５、０．６～０．７０、０．６５～０．９５、０．６５～０．９０、０．６５～０．８５、０．６５～０．８、０．６５～０．７５、０．７～０．９５、０．７～０．９０、０．７～０．８５、０．７～０．８、０．７５～０．９５、０．７５～０．９０、０．７５～０．８５、０．８～０．９５、０．８～０．９０、０．８～０．８５、０．８５～０．９５、０．８５～０．９０、または０．９～０．９５である。

【0502】

（ｉ）種子コーティング剤
一部の態様では、バイオフィルム組成物は、植物種子に施用される。一部の態様では、バイオフィルム組成物は、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、擬似穀類、及び油糧種子の種子に施用される。穀類の例としては、オオムギ、フォニオ、オートムギ、パルマーグラス（ｐａｌｍｅｒ’ｓ ｇｒａｓｓ）、ライムギ、トウジンビエ（ｐｅａｒｌ ｍｉｌｌｅｔ）、モロコシ、スペルトコムギ、テフ、ライコムギ、及びコムギが挙げられ得る。擬似穀類の例としては、ブレッドナッツ、ソバ、ガマ、チア、亜麻、アマランサス子実、ハンザ（ｈａｎｚａ）、キノア、及びゴマが挙げられ得る。一部の例では、種子は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機、または従来のものであり得る。

【0503】

一部の態様では、バイオフィルム組成物は、バイオフィルム組成物を含む液体、スラリー、または粉末で種子をコーティングすることによって植物種子に施用される。一部の態様では、種子コーティング剤は、乾燥種子コーティング剤である。一部の態様では、種子コーティング剤は、湿潤した種子コーティング剤である。一部の態様では、種子コーティング剤は、湿潤状態で施用され、種子上で乾燥させられる。

【0504】

バイオフィルム組成物の適用
本明細書に記載のバイオフィルム組成物は、畦間で、タルク中で、または種子処理剤として施用することができる。バイオフィルム組成物は、バルク、ミニバルクで、袋中で、またはタルク中で種子パッケージに施用することができる。

【0505】

プランターは、処理された種子を植栽し、従来の方式に従って２条で、または耕うんを必要としない方式で作物を栽培することができる。種子は、コントロールホッパーまたは個別のホッパーを使用して散布することができる。また、種子は、加圧空気を使用してまたは手作業で散布することができる。種子配置は、可変作業技術（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒａｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して実施することができる。加えて、本明細書に記載の細菌または細菌集団の施用は、可変作業技術を使用して施用されてもよい。一部の例では、細菌は、本開示の植物種子に施用することができる。

【0506】

マイクロ肥料、ＰＧＲ、除草剤、殺虫剤、及び殺真菌剤等の添加剤を追加で使用して、作物を処理することができる。添加剤の例としては、殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤等の作物保護剤、着色剤、ポリマー、ペレット化（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）、プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）、及び消毒剤等の強化剤、ならびに接種剤、ＰＧＲ、軟化剤、及び微量栄養素等の他の薬剤が挙げられる。ＰＧＲは、根成長、開花、または茎伸長に影響を及ぼす天然または合成の植物ホルモンであり得る。ＰＧＲには、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、及びアブシジン酸（ＡＢＡ）が含まれ得る。

【0507】

組成物は、液体肥料と組み合わせて畦間で施用することができる。一部の例では、液体肥料は、槽に保持されてもよい。ＮＰＫ肥料は、ナトリウム、亜リン酸、及びカリウムという多量栄養素を含有する。

【0508】

バイオフィルムにより与えられる生存率
一部の態様では、「生存率」、「微生物の生存率」、または「細胞生存率」とは、固体または液体増殖培地上で増殖することが可能である細胞のパーセンテージを指す。一部の態様では、生存率は、試料中で生存可能なままである細胞の総数が、対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であることを指す。

【0509】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、バイオフィルムが欠如した対照微生物組成物と比較してより長い一定期間、増加した細胞生存率を示す。

【0510】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、バイオフィルムが欠如した対照微生物組成物と比較して増加した細胞生存率を示す。一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、同じ一定期間にわたって、対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、７００％、８００％、または９００％の生存率の増加を示す。

【0511】

一部の態様では、一定期間は、バイオフィルムを含む微生物組成物または対応する参照／対照組成物の製造後、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、６０日間、６５日間、７０日間、７５日間、８０日間、８５日間、９０日間、９５日間、１００日間、１０５日間、１１０日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、２１０日間、２２０日間、２３０日間、２４０日間、または２５０日間である。

【0512】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、冷蔵庫（３５～４０°Ｆ）で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0513】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、冷蔵庫（３５～４０°Ｆ）で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0514】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、室温（６８～７２°Ｆ）で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0515】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、室温（６８～７２°Ｆ）で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0516】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、７０～１００°Ｆで、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0517】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、７０～１００°Ｆで、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0518】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、－２０°Ｆ未満）の温度で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0519】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、－２０°Ｆ未満の温度で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ一定期間にわたる対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の生存率を示す。

【0520】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、バイオフィルムが欠如した対照微生物組成物と比較して増加したジャグ中（ｉｎ－ｊｕｇ）安定性、増加した種子上安定性、増加した畦間安定性、及び／または増加したタルク中安定性を示す。一部の態様では、安定性の増加は、生存率の点から測定される。

【0521】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、３０℃、３７℃、４５℃、または６０℃等のより高い温度で、バイオフィルムが欠如した対照微生物組成物と比較して、（例えば、増加した細胞生存率により反映されるような）安定性の増加、例えば、ジャグ中安定性、種子上安定性、畦間安定性、またはタルク中安定性を示す。

【0522】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、３０℃、３７℃、４５℃、または６０℃等のより高い温度で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間、同じ条件下で保管されたバイオフィルムが欠如した対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の、（例えば、増加した細胞生存率により反映されるような）ジャグ中安定性、種子上安定性、畦間安定性、またはタルク中安定性の増加等の安定性の増加を示す。

【0523】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、３０℃、３７℃、４５℃、または６０℃等のより高い温度で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、または６０日間の期間、同じ条件下で保管されたバイオフィルムが欠如した対応する参照／対照組成物と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の、（例えば、増加した細胞生存率により反映されるような）安定性の増加、例えば、ジャグ中安定性、種子上安定性、畦間安定性、またはタルク中安定性の増加を示す。

【0524】

一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、乾燥条件に供したときに、対応する参照／対照組成物と比較して増加した生存率を示す。一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、冷凍乾燥に供したときに、対応する参照／対照組成物と比較して増加した生存率を示す。一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、噴霧乾燥に供したときに、対応する参照／対照組成物と比較して増加した生存率を示す。一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、凍結乾燥に供したときに、対応する参照／対照組成物と比較して増加した生存率を示す。一部の態様では、バイオフィルムを含む微生物組成物は、噴霧凝固に供したときに、対応する参照／対照組成物と比較して増加した生存率を示す。

【実施例】

【0525】

以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を例示する目的で提供されるものであり、いかなる様式でも本開示を限定することは意図されていない。特許請求の範囲によって定義されるような、本開示の趣旨内に包含される本実施例の変更及び他の使用が、当業者には認識されよう。

【0526】

実施例１：誘導型微生物リモデリング－農業用の微生物種の合理的改善に向けたプラットフォーム
誘導型微生物リモデリング（ＧＭＲ）プラットフォームの実施形態の例となる概要は、図１Ａの概略図に要約することができる。

【0527】

図１Ａは、マイクロバイオームの組成が最初に特性評価され得、目的の種が特定される（例えば、適切なコロニー形成特性を有する微生物を見出すために）ことを例示する。

【0528】

目的の種の代謝をマッピングし、遺伝的特質に関連付けることができる。例えば、微生物の窒素固定経路を特性評価することができる。特性評価されている経路は、幅広い環境条件下で検査することができる。例えば、その環境中の種々のレベルの外因性窒素の存在下で空中窒素を固定する微生物の能力を検査することができる。窒素の代謝は、ＡｍｔＢトランスポーターを介した根圏から細菌のサイトゾルへのアンモニア（ＮＨ_４ ^＋）の侵入を伴い得る。アンモニア及びＬ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）が、グルタミン合成酵素及びＡＴＰによって触媒されてグルタミンとなる。グルタミンは、細菌バイオマスの形成につながり得、またそれはｎｉｆオペロンの発現を阻害し得、すなわち、微生物に空中窒素を固定させ、アンモニアを排泄させることを望む場合、それは競合する力であり得る。窒素固定経路は、本明細書の先の節でより詳細に特性評価されている。

【0529】

その後、接合及び組換え、化学的突然変異誘発、適応進化、ならびに遺伝子編集を含むがこれらに限定されない方法を使用して、標的化された非属間ゲノム改変を微生物のゲノムに導入することができる。標的化された非属間ゲノム改変には、ゲノムの挿入、破壊、欠失、改変、摂動、修飾等が含まれ得る。

【0530】

次いで、基盤となる遺伝子型のリモデリングからもたらされる所望の表現型を含む、リモデリングされた派生微生物を作物の接種に使用する。

【0531】

本開示は、ある特定の実施形態では、空中窒素を固定して、そのような窒素を植物に供給することができる、リモデリングされた非属間微生物を提供する。複数の態様では、これらのリモデリングされた非属間微生物は、外因性窒素が存在する場合であっても空中窒素を固定することができる。

【0532】

図１Ｂは、マイクロバイオームステップの測定値の拡大図を図示する。一部の実施形態では、本開示は、所望のコロニー形成特性を有する微生物種を見出し、次いで、それらの種を後続のリモデリングプロセスで利用する。

【0533】

これより、前述の誘導型微生物リモデリング（ＧＭＲ）プラットフォームをより具体的に記載する。

【0534】

複数の態様では、ＧＭＲプラットフォームは、以下のステップを含む。
Ａ．単離－目的の作物植物の土壌、根圏、表面等から微生物を得る。
Ｂ．特性評価－目的の遺伝子型／表現型（例えば、ゲノム配列、コロニー形成能力、窒素固定活性、Ｐ可溶化能力、目的の代謝物の排泄、植物促進化合物の排泄等）に関して、単離された微生物を特性評価することを伴う。
Ｃ．順化－微生物の非属間遺伝子組換えのための分子プロトコルの開発。
Ｄ．非属間操作計画及び最適化－主要な経路（例えば、コロニー形成関連遺伝子、窒素固定／同化遺伝子、Ｐ可溶化遺伝子）に遺伝子組換えを有する非属間派生微生物菌株の生成。
Ｅ．アナリティクス－インビトロ（例えば、ＡＲＡアッセイ）及び植物内（例えば、コロニー形成アッセイ）の両方での目的の表現型に関する誘導された非属間菌株の評価。
Ｆ．操作計画／アナリティクスの反復－微生物菌株のさらなる改善のためのステップＤ及びＥの反復

【0535】

これより、ＧＭＲプラットフォームプロセスステップの各々を下記で詳述する。

【0536】

Ａ．微生物の単離
１．土壌試料を得る

【0537】

微生物を植物の土壌及び／または根から単離する。一例では、植物を研究室または温室において小さな鉢で栽培する。種々の農業地帯から土壌試料を得る。例えば、ローム（例えば、泥炭質粘土ローム、砂質ローム）、粘土質土壌（例えば、重粘土、シルト質粘土）、砂質土壌、シルト質土壌、泥炭質土壌、白亜質土壌等を含めた、多様なテクスチャ特性を有する土壌を収集することができる。

【0538】

２．餌植物を栽培する

【0539】

餌植物（目的の植物）（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、キビ、ダイズ、野菜、果実等）の種子を各土壌タイプに植栽する。一例では、異なる品種の餌植物を種々の土壌タイプに植栽する。例えば、目的の植物がトウモロコシである場合、圃場トウモロコシ、スイートコーン、ヘリテージコーン（ｈｅｒｉｔａｇｅ ｃｏｒｎ）等といった異なる品種のトウモロコシの種子を、上述の種々の土壌タイプに植栽する。

【0540】

３．土壌及び／または根試料を収穫し、適切な培地にプレートする

【0541】

数週間（例えば、２～４週間）の成長後、植物を根ごと引き抜くことによって収穫する。植物を研究室／温室で栽培する代わりに、目的の植物の土壌及び／または根を、異なる土壌タイプを有する圃場から直接収集することができる。

【0542】

根圏微生物及び着生菌を単離するためには、根の損傷を回避するように土壌を蒸留水で浸すかまたは土壌を手で穏やかにほぐすことによって、植物を穏やかに取り出す。より大きな土壌粒子が存在する場合、静置された蒸留水のプールに根を浸漬することによって及び／または根を穏やかに振り動かすことによって、これらの粒子を除去する。根を切断し、根を少量の蒸留水と共にプレートまたは管に入れ、プレート／管をシェーカーで穏やかに振とうするかまたは管を低速で遠心分離することによって根に固着している土壌のスラリーを調製する。このスラリーを下記に記載されるように処理する。

【0543】

内部寄生菌を単離するためには、根表面上の余分の土壌を脱イオン水で除去する。土壌の除去後、植物を表面滅菌し、滅菌水で激しくすすぐ。清浄化した根の１ｃｍ薄片を植物から切除し、３ｍｍのスチールビーズを含有するリン酸緩衝食塩水液に入れる。Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩを含む溶液を激しく振とうすることによってスラリーを生成する。

【0544】

土壌及び／または根のスラリーは、単離されるべき微生物の植物に有益な所望の形質に応じて種々の方式で処理することができる。例えば、土壌及び根のスラリーを希釈し、種々のタイプのスクリーニング培地に接種して、根圏性、内部寄生性、着生性、及び他の植物付随性微生物を単離することができる。例えば、植物に有益な所望の形質が窒素固定である場合、土壌／根のスラリーを無窒素培地（例えば、Ｎｆｂ寒天培地）にプレートして、窒素固定微生物を単離する。同様に、リン酸可溶化細菌（ＰＳＢ）を単離するためには、リンの唯一の供給源としてリン酸カルシウムを含有する培地を使用することができる。ＰＳＢは、リン酸カルシウムを可溶化し、より高い量でリンを同化及び放出することができる。この反応は、プレート上のハローゾーンまたはクリアゾーンとして顕在化し、これをＰＳＢの単離のための最初のステップとして使用することができる。

【0545】

４．コロニーを採集し、培養物を精製し、目的の遺伝子の存在に関してスクリーニングする

【0546】

ステップＡ３で得られた微生物の集団を画線培養して、単一のコロニー（純粋な培養物）を得る。純粋な培養物の一部を好適な培地（例えば、Ｒ２Ａ及びグリセロールの混合物）中に再懸濁し、ＰＣＲ分析に供して、１つまたは複数の目的の遺伝子の存在に関してスクリーニングする。例えば、窒素固定細菌（ジアゾトロフ）を特定するためには、単離された微生物の精製培養物をＰＣＲ分析に供して、空中窒素を生存生物に利用可能な形態の窒素へと固定することに関与する酵素をコードするｎｉｆ遺伝子の存在を検出することができる。

【0547】

５．精製培養物を貯蔵する

【0548】

今後の参照及び分析のために、単離された菌株の精製培養物を、例えば－８０℃で保管する。

【0549】

Ｂ．単離された微生物の特性評価
１．系統学的特性評価及び全ゲノム配列決定

【0550】

単離された微生物を系統学的特性評価に関して分析し（属及び種の帰属）、微生物の全ゲノムを配列決定する。

【0551】

系統学的特性評価のために、縮重１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用して、単離された微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡを配列決定して、系統学的同一性を生成する。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列リードをデータベースにマッピングして、単離された微生物について属、種、及び菌株名を最初に帰属する。全ゲノム配列決定法を最終ステップとして使用して、系統学的属／種を微生物に帰属する。

【0552】

単離された微生物の全ゲノムを配列決定して、主要な経路を特定する。全ゲノム配列決定のために、ゲノムＤＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮからのＱＩＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ）を使用してゲノムＤＮＡを単離し、当該技術分野で既知の方法を使用して全ＤＮＡライブラリーを調製する。当該技術分野で既知のハイスループット配列決定（次世代配列決定法とも呼ばれる）法を使用して全ゲノムを配列決定する。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅ、及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより、全ＤＮＡライブラリーを調製し、全ゲノム配列決定を実施するために使用され得る全ゲノム配列決定ツールが提供される。

【0553】

各単離された菌株についての全ゲノム配列を組み立てる。目的の遺伝子を特定し、注釈し、リモデリングのための有望な標的として注記する。全ゲノム配列をデータベースに保管する。

【0554】

２．温室における宿主植物でのコロニー形成に関して微生物をアッセイする

【0555】

温室における宿主植物でのコロニー形成に関して単離された微生物を特性評価する。このために、所望の宿主植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、ダイズ）の種子に、単離された微生物の培養物を個々にまたは組み合わせて接種し、この種子を土壌に植栽する。代替として、根の上から直接土壌に接種することによって、単離された微生物の培養物を個々にまたは組み合わせて、宿主植物の根に施用することができる。例えば、下記により詳細に記載される定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を使用して、微生物のコロニー形成ポテンシャルをアッセイする。

【0556】

３．小規模圃場試験において宿主植物でのコロニー形成に関して微生物をアッセイし、コロニー形成された根試料からＲＮＡを単離する（ＣＡＴ試験）

【0557】

小規模圃場試験において所望の宿主植物でのコロニー形成に関して単離された微生物を評価する。加えて、コロニー形成された根試料からＲＮＡを単離して、圃場環境での菌株についてのトランスクリプトームデータを得る。これらの小規模圃場試験は、これらの試験が圃場環境での菌株についてのコロニー形成及び転写物データを提供することから、本明細書でＣＡＴ（コロニー形成及び転写物（Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ））試験と称される。

【0558】

これらの試験のために、宿主植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、ダイズ）の種子に、単離された微生物の培養物を個々にまたは組み合わせて使用して接種し、この種子を土壌に植栽する。代替として、根の上から直接土壌に接種することによって、単離された微生物の培養物を個々にまたは組み合わせて、宿主植物の根に施用することができる。ＣＡＴ試験を様々な土壌で及び／または種々の温度及び／または水分条件下で実施して、コロニー形成ポテンシャルを評価し、種々の土壌タイプ及び環境条件での微生物のトランスクリプトームプロファイルを得ることができる。

【0559】

例えば、下記に記載されるようなｑＰＣＲ法を使用して、接種された微生物（複数可）による宿主植物の根でのコロニー形成を評価する。

【0560】

１つのプロトコルでは、単離された微生物のコロニー形成ポテンシャルを以下のように評価した。トウモロコシ種子の植栽から１日後、１ｍｌの微生物の一晩培養物（ＳＯＢ培地）を、ちょうど種子が位置する箇所で灌注した。１ｍＬのこの一晩培養物は、どの菌株が使用されているかに応じて互いに３倍以内で変動しつつ、大まかに約１０＾９ｃｆｕと同等であった。各実生を、２．５ｍＭまたは０．２５ｍＭのいずれかの硝酸アンモニウムを補充した５０ｍＬの修正ホーグランド溶液で週３回施肥した。植栽から４週間後、ＤＮＡ抽出のために根試料を収集した。加圧水噴霧を使用して土壌残屑を洗い流した。次いで、ＱＩＡＧＥＮ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒを使用してこれらの組織試料をホモジナイズし、推奨されるプロトコルに従ってＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＤＮＡを抽出した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５Ｐ ＲＴ－ＰＣＲを使用して、微生物のゲノムの各々における遺伝子座に特異的であるように（ＮＣＢＩのプライマーＢＬＡＳＴを使用して）設計されたプライマーを使用して、これらのＤＮＡ抽出物に対してｑＰＣＲアッセイを実施した。

【0561】

微生物のコロニー形成ポテンシャルを反映する、微生物のゲノムコピーの存在を定量した。ＰＣＲ増幅産物を配列決定することによって微生物種の同一性を確認した。

【0562】

加えて、コロニー形成された根及び／または土壌試料からＲＮＡを単離し、配列決定した。

【0563】

ＤＮＡプロファイルとは異なり、ＲＮＡプロファイルは、環境条件に応じて様々である。したがって、コロニー形成された根及び／または土壌から単離されたＲＮＡの配列決定は、根圏における植物内での遺伝子の転写活性を反映することになる。

【0564】

ＲＮＡを、異なる時点で、コロニー形成された根及び／または土壌試料から単離して、これらの時点でのコロニー形成された微生物のＲＮＡプロファイルの変化を分析することができる。

【0565】

例えば、ＲＮＡを、圃場の施肥直後及び圃場の施肥から数週間後に、コロニー形成された根及び／または土壌試料から単離し、配列決定して、対応する転写プロファイルを生成することができる。

【0566】

同様に、ＲＮＡ配列決定を高リン酸及び低リン酸条件下で実施して、これらの条件下でどの遺伝子が、転写活性があるかまたは転写抑制されているかを理解することができる。

【0567】

トランスクリプトーム／ＲＮＡ配列決定のための方法は、当該技術分野で既知である。簡潔に述べると、単離された微生物の精製培養物から全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを調製し、上述のハイスループット配列決定ツールを使用してｃＤＮＡを配列決定する。

【0568】

トランスクリプトーム分析からの配列決定リードをゲノム配列にマッピングすることができ、目的の遺伝子の転写プロモーターを特定することができる。

【0569】

４．単離された微生物の植物に有益な活性をアッセイする

【0570】

単離された微生物の植物に有益な活性を評価する。

【0571】

例えば、アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）を使用して窒素固定活性に関して窒素固定微生物をアッセイするか、またはリン酸可溶化に関してリン酸可溶化微生物をアッセイする。目的の任意のパラメータを利用することができ、そのようなものに適切なアッセイを開発することができる。例えば、アッセイは、コロニー形成測定基準に関する成長曲線、及び植物ホルモン様インドール酢酸（ＩＡＡ）またはジベレリンの産生に関するアッセイを含むことが可能である。関心対象となる任意の植物に有益な活性に関するアッセイを開発することができる。

【0572】

このステップにより目的の表現型が確認され、任意の偽陽性が排除される。

【0573】

５．単離された微生物からの潜在的候補の選択

【0574】

上記のステップで生成されたデータを使用して、微生物をさらなる開発のために選択する。例えば、コロニー形成ポテンシャル、植物に有益な活性、及び／または関連性のあるＤＮＡ及びＲＮＡプロファイルの所望の組み合わせを示す微生物が、順化及びリモデリングのために選択されよう。

【0575】

Ｃ．選択された微生物の順化
選択された微生物を順化させる、すなわち、微生物を遺伝学的に扱いやすく、特定可能な形態に変換する。

【0576】

１．抗生物質感受性に関して試験する

【0577】

微生物を順化させるための１つの方式は、抗生物質耐性をそれらに導入操作することである。このために、種々の抗生物質に対する感受性に関して野生型微生物菌株を試験する。菌株が抗生物質に感受性がある場合、その抗生物質は、菌株のリモデリングのための遺伝的ツール／ベクターにおいて使用するのに良好な候補であり得る。

【0578】

２．ベクターを設計し、組み立てる

【0579】

それらの複製に条件のあるベクター（例えば、自殺プラスミド）を構築して、選択された微生物（宿主微生物）を順化させる。例えば、適切な抗生物質耐性マーカー、対抗選択可能マーカー、ドナー微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のための複製起点、蛍光により挿入に関してスクリーニングするための蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ等）をコードする遺伝子、宿主微生物中への接合のための移行起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、及び所望の遺伝的変異を有する宿主ゲノムに対する相同アームを含むポリヌクレオチド配列を含有する、自殺プラスミドを構築する。ベクターは、ＳｃｅＩ部位及び他の追加の要素を含んでもよい。

【0580】

例示的な抗生物質耐性マーカーには、アンピシリン耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー、エリスロマイシン耐性マーカー、ストレプトマイシン耐性マーカー、スペクチノマイシン耐性マーカー等が含まれる。例示的な対抗選択可能マーカーには、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｌａｃＹ、ｇａｔａ－１、ｃｃｄＢ等が含まれる。

【0581】

３．ドナー微生物の生成

【0582】

１つのプロトコルでは、適切な抗生物質耐性マーカー、対抗選択可能マーカー、ｐｉｒ複製開始遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＳＴ１８における維持のためのλｐｉｒ複製起点、蛍光により挿入に関してスクリーニングするための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、宿主微生物中への接合のための移行起点、及び所望の遺伝的変異（例えば、異種位置に挿入するための微生物の独自のゲノム内からのプロモーター）を有する宿主ゲノムに対する相同アームを含むポリヌクレオチド配列を含有する、自殺プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＳＴ１８（アミノレブリン酸、ＡＬＡの栄養要求株）の中へ形質転換させて、ドナー微生物を生成する。

【0583】

４．ドナー微生物を宿主微生物と混合する

【0584】

ドナー微生物を宿主微生物（ステップＢ５からの選択された候補微生物）と混合して、宿主ゲノムへのプラスミドの接合性の組み込みを可能にする。ドナー及び宿主微生物の混合物を、抗生物質を含有し、かつＡＬＡを含有しない培地にプレートする。自殺プラスミドは、ドナー微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ１８）において複製することができるが、宿主においては複製することができない。したがって、ドナー及び宿主微生物を含有する混合物を、抗生物質を含有し、かつＡＬＡを含有しない培地にプレートしたとき、そのゲノムにプラスミドを組み込んだ宿主細胞のみが培地上で増殖し、コロニーを形成することが可能となる。ドナー微生物は、ＡＬＡの不在に起因して増殖しない。

【0585】

５．ベクターの組み込みを確認する

【0586】

宿主微生物の意図される遺伝子座に蛍光タンパク質マーカー、抗生物質耐性マーカー、対抗選択可能マーカー等を含有する、自殺プラスミドの適正な組み込みを、プレート上でのコロニーの蛍光により、コロニーＰＣＲを使用して確認する。

【0587】

６．確認された組み込みコロニーを画線培養する

【0588】

宿主微生物における第２ラウンドの相同組換えにより、プラスミド骨格をループアウト（除去）して、ある特定のパーセンテージの宿主微生物の宿主ゲノムに組み込まれた所望の遺伝的変異（例えば、異種位置に挿入するための微生物の独自のゲノム内からのプロモーター）を残すと同時に、ある特定のパーセンテージを野生型に復帰させる。

【0589】

プラスミド骨格をループアウトした（したがって、対抗選択可能マーカーをループアウトした）宿主微生物のコロニーを、適切な培地上で増殖させることによって選択することができる。

【0590】

例えば、ｓａｃＢを対抗選択可能マーカーとして使用する場合、スクロースを含有する培地上でコロニーを増殖させることによって（ｓａｃＢは、スクロースに対する感受性を与える）、プラスミド骨格の喪失に起因するこのマーカーの喪失を試験する。この培地上で増殖するコロニーは、ｓａｃＢマーカー及びプラスミド骨格を喪失したものであり、所望の遺伝的変異を含有するか、または野生型に復帰しているかのいずれかであろう。また、これらのコロニーは、蛍光タンパク質マーカーの喪失に起因してプレート上で蛍光を発しないことになる。

【0591】

一部の単離株では、ｓａｃＢまたは他の対抗選択可能マーカーは、スクロースまたは他の対抗選択機構に対する完全な感受性を与えないため、多数のコロニーをスクリーニングして、成功裏のループアウトコロニーを単離することが必要となる。そのような場合、宿主細胞において独立して複製し、組み込まれた自殺プラスミド骨格内の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｃｅＩ）を発現する「ヘルパープラスミド」の使用によって、ループアウトを補助してもよい。組み込まれた自殺プラスミドを有する菌株を、抗生物質耐性マーカー、宿主菌株と適合性の複製起点、及び構成的または誘導性プロモーターによって制御される制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含有する、ヘルパープラスミドで形質転換する。組み込まれたプラスミド骨格において誘導される、制限エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断により、相同組換えを促進して、自殺プラスミドをループアウトする。これは、対抗選択プレート上でループアウト済みのコロニーの数を増加させると共に、所望の突然変異を含有するコロニーを見出すためにスクリーニングする必要があるコロニーの数を減少させる。次いで、ヘルパープラスミドを、抗生物質によるプラスミドの選択の不在下で培養及び連続継代によって菌株から除去する。継代された培養物を画線培養して単一のコロニーを得、コロニーを摘取し、ヘルパープラスミドの選択に使用される抗生物質に対する感受性、ならびにコロニーＰＣＲによって確認されるプラスミドの不在に関してスクリーニングする。最後に、ゲノムを配列決定し、ヘルパープラスミドＤＮＡの不在をＤ６に記載されるように確認する。

【0592】

７．コロニーＰＣＲにより遺伝的変異の組み込みを確認する

【0593】

スクロース含有培地（または使用される対抗選択可能マーカーに応じて他の適切な培地）上でより良好に増殖したコロニーを摘取し、意図される遺伝子座における遺伝的変異の存在を、コロニーＰＣＲを使用してコロニーをスクリーニングすることによって確認する。

【0594】

この実施例では、微生物を順化させ、微生物に遺伝的変異を導入するための１つのプロトコルについて記載しているが、当業者であれば、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、飽和突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発、相同組換え、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲ系（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１等）、化学的突然変異誘発、及びそれらの組み合わせ等の当該技術分野で既知の様々な他の技法を使用して、選択された微生物に遺伝的変異を導入することができることを理解しよう。

【0595】

８．ステップＣ２～Ｃ７を反復する

【0596】

ステップＣ２～Ｃ７のうちのいずれかが意図される成果を提供し損なう場合、これらのステップを繰り返して、宿主微生物への所望の遺伝的変異及びマーカーの組み込みを容易にするための異なる要素を含み得る代替のベクターを設計する。

【0597】

９．標準業務手順書（ＳＯＰ）を開発する

【0598】

ひとたびステップＣ２～Ｃ７が所与の株について一貫して再現できるようになると、これらのステップを使用して、その株及びベクターについての標準業務手順書（ＳＯＰ）を開発する。このＳＯＰを使用して、微生物の植物に有益な他の形質を改善することができる。

【0599】

Ｄ．非属間操作計画及び最適化
１．最適化のための遺伝子標的を特定する

【0600】

選択された微生物を、植物に有益な活性の性能を改善するように操作／リモデリングする。このために、植物に有益な活性を改善するための遺伝子標的を特定する。

【0601】

遺伝子標的は、種々の方式で特定することができる。例えば、単離された微生物の全ゲノム配列決定からの遺伝子に注釈を付けながら、目的の遺伝子を特定することができる。それらは、文献検索により特定することができる。例えば、窒素固定に関与する遺伝子は、文献で既知である。これらの既知の遺伝子を、遺伝的変異を導入するための標的として使用することができる。遺伝子標的はまた、ステップＢ３（コロニー形成に関する小規模圃場試験）で得られたＲＮＡ配列決定データに基づいて、または下記のステップに記載されるＲＮＡ配列決定を実施することによっても特定することができる。

【0602】

２．プロモーター交換のためのプロモーターを選択する

【0603】

植物に有益な活性を改善するための所望の遺伝的変異は、プロモーター交換を含み得、プロモーター交換では、標的遺伝子の天然プロモーターが、微生物のゲノム内からの（天然プロモーターと比較したときに）より強力なプロモーターもしくはより弱いプロモーター、または異なって調節されるプロモーター（例えば、Ｎ非依存性）と置換される。標的遺伝子の発現が、植物に有益な活性を増加させる場合（例えば、発現が微生物における窒素固定を強化するｎｉｆＡ）、プロモーター交換のための所望のプロモーターは、天然プロモーターと比較して標的遺伝子の発現レベルをさらに増加させるであろう、（標的遺伝子の天然プロモーターと比較して）より強力なプロモーターである。標的遺伝子の発現が、植物に有益な活性を減少させる場合（例えば、窒素固定を下方制御するｎｉｆＬ）、プロモーター交換のための所望のプロモーターは、天然プロモーターと比較して標的遺伝子の発現レベルを実質的に減少させるであろう、（標的遺伝子の天然プロモーターと比較して）弱いプロモーターである。プロモーターを遺伝子に挿入して、遺伝子の発現を「ノックアウト」しつつ、同時に下流遺伝子の発現を上方制御することができる。

【0604】

プロモーター交換のためのプロモーターは、ＲＮＡ配列決定データに基づいて選択することができる。例えば、ＲＮＡ配列決定データを使用して、強力なプロモーター及び弱いプロモーター、または誘導性プロモーターとは対照的に構成的に活性なプロモーターを特定することができる。

【0605】

例えば、窒素固定経路において、強力なプロモーター及び弱いプロモーター、または誘導性プロモーターとは対照的に構成的に活性なプロモーターを特定するためには、選択された微生物を窒素枯渇条件及び窒素充満条件下でインビトロで培養し、微生物のＲＮＡをこれらの培養物から単離し、配列決定する。

【0606】

１つのプロトコルでは、窒素枯渇条件及び窒素充満条件下での微生物のＲＮＡプロファイルを比較し、所望の転写レベルを有する活性プロモーターを特定する。これらのプロモーターは、弱いプロモーターを交換するように選択することができる。

【0607】

プロモーターはまた、宿主植物根圏における植物内での微生物のＲＮＡプロファイルを反映する、ステップＢ３で得られたＲＮＡ配列決定データを使用して選択することもできる。

【0608】

種々の条件下でのＲＮＡ配列決定は、ａ）施肥された圃場条件で宿主植物の成長周期中に根圏で活性である、かつｂ）関連性のあるインビトロ条件でも活性であるため迅速にスクリーニングされ得る、プロモーターの選択を可能にする。

【0609】

例示的なプロトコルでは、コロニー形成アッセイ（例えば、ステップＢ３）からの植物内ＲＮＡ配列決定データを使用して、単離された微生物における遺伝子の発現レベルを測定する。一実施形態では、遺伝子発現のレベルは、マッピングされたリード数１００万当たり１０００塩基当たりのリード数（ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）（ＲＰＫＭ）として算出される。種々の遺伝子の発現レベルを標的遺伝子の発現レベルと比較し、種々の遺伝子に関連する、標的遺伝子と比較して最も高いまたは最も低いレベルの発現を示す少なくとも上位１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０位のプロモーターを、プロモーター交換のための考えられる候補として選択する。故に、標的遺伝子と比べた種々の遺伝子の発現レベルを検査し、次いで、標的（または標準）遺伝子と比べて増加した発現を示す遺伝子を選択し、次いで、該遺伝子に関連するプロモーターを見出す。

【0610】

例えば、標的遺伝子がｎｉｆＡの上方制御である場合、ｎｉｆＡと比較して最も高いレベルの発現を示す遺伝子の最初の１０、２０、３０、４０、５０、または６０個のプロモーターを、プロモーター交換のための考えられる候補として選択する。

【0611】

これらの候補をインビトロＲＮＡ配列決定データに基づいてさらに絞り込むことができる。例えば、標的遺伝子としてのｎｉｆＡの場合、植物内ＲＮＡ配列決定データに基づいて選択された考えられるプロモーター候補を、インビトロ窒素枯渇条件対窒素充満条件下でｎｉｆＡと比較して類似のまたは増加した遺伝子発現レベルを有するプロモーターを選定することによってさらに選択する。

【0612】

このステップで選択されるプロモーターのセットを使用して、標的遺伝子（例えば、ｎｉｆＡ）の天然プロモーターを交換する。交換されたプロモーターを有するリモデリングされた菌株をインビトロアッセイで試験し、予想よりも低い活性を有する菌株を排除し、予想されたまたは予想よりも高い活性を有する菌株を圃場で試験する。プロモーター選択のサイクルをリモデリングされた菌株に対して繰り返して、植物に有益なそれらの活性をさらに改善してもよい。

【0613】

ここでは、窒素固定形質を改善するためにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７からの植物内及びインビトロＲＮＡ配列決定データに基づいて実施した例示的なプロモーター交換実験が記載される。ＣＩ１３７をＡＲＡアッセイにおいて０ｍＭ及び５ｍＭグルタミン濃度で分析し、ＲＮＡをこれらのＡＲＡ試料から抽出した。ＮｅｘｔＳｅｑを介してＲＮＡを配列決定し、１つの試料からのリードのサブセットをＣＩ１３７ゲノムにマッピングした（インビトロＲＮＡ配列決定データ）。ＣＩ１３７についてのコロニー形成及び活性アッセイ（例えば、ステップＢ３）においてＲＮＡをＶ５期のトウモロコシ植物の根から抽出した。６つの植物からの試料をプールし、ＮｅｘｔＳｅｑを使用してプールした試料からのＲＮＡを配列決定し、リードをＣＩ１３７ゲノムにマッピングした（植物内ＲＮＡ配列決定データ）。２×１０^８個の総リードのうち、７×１０^４個のリードをＣＩ１３７にマッピングした。植物内ＲＮＡ配列決定データを使用して、遺伝子を植物内発現レベルの順に順位付けし、発現レベルを天然ｎｉｆＡ発現レベルと比較した。天然ｎｉｆＡ発現レベルと比較して最も高い発現レベル（遺伝子発現に基づいて）を示した最初の４０個のプロモーターを選択した。これらの４０個のプロモーターをインビトロＲＮＡ配列決定データに基づいてさらに絞り込み、ｎｉｆＡと比較して増加したまたは類似のインビトロ発現レベルを有するプロモーターを選択した。プロモーターの最終リストは、１７個のプロモーターを含み、ほとんどのプロモーターの２つのバージョンを使用して、プロモーター交換突然変異体を生成し、故に、総計３０個のプロモーターを試験した。ｎｉｆＬを部分的または完全に欠失させ、３０個のプロモーターを挿入した（ΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ）、一揃いのＣＩ１３７突然変異体の生成を試みた。３０個の突然変異体のうち２８個が成功裏に生成された。ΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ突然変異体をＡＲＡアッセイにおいて０ｍＭ及び５ｍＭグルタミン濃度で分析し、ＲＮＡをこれらのＡＲＡ試料から抽出した。いくつかの突然変異体は、予想よりも低いかまたはＷＴ ＣＩ１３７株と比較して減少したＡＲＡ活性を示した。少数の突然変異体は、予想よりも高いＡＲＡ活性を示した。

【0614】

当業者であれば、上記の実施例から、植物内及び／またはインビトロＲＮＡ配列決定データを使用して、プロモーター交換のためのプロモーターを選択することができるが、プロモーター選択のステップが大いに予測不能であり、多くの難題を伴うことを理解しよう。

【0615】

例えば、植物内ＲＮＡ配列決定は主として、高発現している遺伝子を明らかにする。しかしながら、遺伝子発現の微妙な差異及び／または発現レベルの低い遺伝子を検出することは困難である。例えば、一部の植物内ＲＮＡ配列決定実験では、微生物ゲノムからの約５０００個の遺伝子のうち約４０個のみが検出された。故に、植物内ＲＮＡ配列決定技法は、豊富に発現している遺伝子及びそれらの対応するプロモーターを特定するために有用である。しかしながら、この技法により、低発現遺伝子及び対応するプロモーターならびに遺伝子発現の間の小さな差異を特定するのは困難である。

【0616】

さらに、植物内ＲＮＡプロファイルは、微生物が単離された時点での遺伝子のステータスを反映する。しかしながら、圃場条件のわずかな変化が、根圏性／着生性／内部寄生性微生物のＲＮＡプロファイルを実質的に変化させる場合がある。したがって、リモデリングされた菌株をインビトロ及び圃場で試験する際に、１つの圃場試験のＲＮＡ配列決定データに基づいて選択されたプロモーターが、標的遺伝子の望ましい発現レベルを提供するかどうかを前もって予測することは困難である。

【0617】

加えて、植物内評価は、時間及び資源を消費するものであるため、植物内実験は、頻繁に行う及び／または迅速にもしくは容易に繰り返すことができない。一方で、インビトロＲＮＡ配列決定は、比較的迅速かつ容易に行うことができるが、インビトロ条件は、圃場条件を模倣するものではなく、インビトロで高い活性を示し得るプロモーターは、植物内で同等の活性を示さない場合がある。

【0618】

その上、プロモーターは、多くの場合、新たな背景で予測通りに動かない。したがって、植物内及びインビトロＲＮＡ配列決定データは、よくてもプロモーター選択のステップにおける開始点としての役目を果たすことができるにすぎない。しかしながら、圃場で標的遺伝子の望ましい発現レベルを提供するであろう任意の特定のプロモーターに到達することは、一部の実例では、予測不能である。

【0619】

プロモーター選択のステップにおける別の制限は、利用可能なプロモーターの数である。本発明の目標のうちの１つは、非トランスジェニック微生物を提供することであるため、プロモーター交換のためのプロモーターは、微生物のゲノム、または属内から選択される必要がある。故に、トランスジェニック手法とは異なり、本プロセスは、単に文献を深く探り、異なる宿主生物からの特性がよく解明されているトランスジェニックプロモーターを見出す／使用することができるものではない。

【0620】

別の制約は、プロモーターが所望の成長相中に植物内で活性でなければならないということである。例えば、植物において窒素の必要量が最も高いのは一般に、成長季節の後期、例えば、後期栄養相及び初期生殖相である。例えば、トウモロコシにおいて、窒素取り込みは、Ｖ６（６枚葉）期からＲ１（生殖期１）期中に最も高い。したがって、トウモロコシのＶ６期からＲ１期中に窒素の利用可能性を増加させるためには、リモデリングされた微生物は、トウモロコシ生活環のこれらの段階中に最も高い窒素固定活性を示さなければならない。したがって、トウモロコシの後期栄養期及び初期生殖期中に植物内で活性であるプロモーターを選択する必要がある。この制約は、プロモーター交換において試験され得るプロモーターの数を低下させるだけでなく、プロモーター選択のステップを予測不能にもする。上記で考察したように、予測不能性は、部分的には、小規模圃場試験（例えば、ステップＢ３）からのＲＮＡ配列決定データを使用して、所望の成長期中に植物内で活性であるプロモーターを特定し得るものの、ＲＮＡデータが、試料収集時点での圃場条件（例えば、土壌のタイプ、土壌中の水のレベル、利用可能な窒素のレベル等）に基づいていることにより生じる。当業者であれば理解しようが、圃場条件は、同じ圃場内で一定期間にわたって変化し得、また、種々の圃場にわたって実質的に変化し得る。故に、１つの圃場条件下で選択されるプロモーターは、他の圃場条件下では予想通りに動かない場合がある。同様に、選択されたプロモーターは、交換後に予想通りに動かない場合がある。したがって、選択されたプロモーターが目的の植物の所望の成長相中に植物内で活性であるかどうかを前もって予期することは困難である。

【0621】

３．非属間遺伝的変異を設計する

【0622】

ステップＤ１（遺伝子標的の特定）及びＤ２（プロモーター交換のためのプロモーターの特定）に基づいて、非属間遺伝的変異を設計する。

【0623】

「非属間性」という用語は、宿主に導入されるべき遺伝的変異が、宿主属の外部からの核酸配列を含有しない（すなわち、トランスジェニックＤＮＡでない）ことを示す。ベクター及び／または他の遺伝的ツールを使用して、宿主微生物に遺伝的変異が導入されるものの、本開示の方法は、宿主微生物に導入された骨格ベクター配列または他の遺伝的ツールをループアウト（除去）して、宿主ゲノムへの所望の遺伝的変異のみを残すステップを含む。故に、結果として得られる微生物は、非トランスジェニックである。

【0624】

例示的な非属間遺伝的変異には、目的の遺伝子における、その遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を改善し得る突然変異；目的の遺伝子の内因性プロモーターを置換してその遺伝子の発現を増加させ得る、構成的に活性なプロモーター；目的の遺伝子を不活性化する突然変異；異種位置への宿主のゲノム内からのプロモーターの挿入、例えば、該遺伝子の不活性化及び下流遺伝子の上方制御をもたらす遺伝子へのプロモーターの挿入等が含まれる。突然変異は、点突然変異、挿入、及び／または欠失（遺伝子の完全または部分的な欠失）であり得る。例えば、１つのプロトコルでは、宿主微生物の窒素固定活性を改善するために、所望の遺伝的変異は、ｎｉｆＬ遺伝子（窒素固定経路の負の調節因子）の突然変異を不活性化することを含んでもよく、及び／またはｎｉｆＨ遺伝子（空中窒素を固定する主反応を触媒するニトロゲナーゼ鉄タンパク質）の内因性プロモーターを、ｎｉｆＨ遺伝子の発現を構成的に駆動する構成的に活性なプロモーターと置換することを含んでもよい。

【0625】

４．非属間派生菌株を生成する

【0626】

非属間遺伝的変異を設計した後、ステップＣ２～Ｃ７を実施して、非属間派生菌株（すなわち、リモデリングされた微生物）を生成する。

【0627】

５．リモデリングされた微生物の精製培養物を貯蔵する

【0628】

下記に記載される全ゲノム配列決定のためにｇＤＮＡを抽出することができるように、リモデリングされた微生物の精製培養物をバンクに保存する。

【0629】

６．所望の遺伝的変異の存在を確認する

【0630】

リモデリングされた微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、以前に記載された方法を使用してゲノムＤＮＡに対して全ゲノム配列決定を実施する。結果として得られるリードを、ＬＩＭＳに以前に保管されたリードにマッピングして、ａ）所望の遺伝的変異の存在、及びｂ）リモデリングされた微生物を生成するために使用したベクター配列（例えば、プラスミド骨格またはヘルパープラスミド配列）にマッピングするリードの完全な不在を確認する。

【0631】

このステップは、ベクター骨格（例えば、自殺プラスミド）のループアウト法の後に菌株に残っている場合がある非宿主属のＤＮＡ（トランスジェニックＤＮＡ）の高感度検出を可能にし、遺伝的変異の偶発的なオフターゲット挿入等に対する制御を提供することが可能である。

【0632】

Ｅ．リモデリングされた微生物に対するアナリティクス
１．植物に有益な活性の分析

【0633】

リモデリングされた微生物の植物に有益な活性及び増殖動態をインビトロで評価する。

【0634】

例えば、窒素固定機能を改善するためにリモデリングされた菌株を、アセチレン還元アッセイ、アンモニウム排泄アッセイ等により窒素固定活性及び適性に関して評価する。

【0635】

改善されたリン酸可溶化のためにリモデリングされた菌株を、リン酸可溶化活性に関して評価する。

【0636】

このステップは、目的の表現型についてのリモデリングされた菌株の迅速なミディアムスループットからハイスループットのスクリーニングを可能にする。

【0637】

２．コロニー形成及び改変遺伝子の転写の分析

【0638】

Ｂ３に記載されるステップを使用して、リモデリングされた菌株を、温室または圃場のいずれかで宿主植物でのコロニー形成に関して評価する。加えて、コロニー形成された根及び／または土壌試料からＲＮＡを単離し、配列決定して、標的遺伝子の転写活性を分析する。標的遺伝子は、導入された遺伝的変異を含有する遺伝子を含み、また、微生物の植物に有益な形質において役割を果たす他の遺伝子も含み得る。

【0639】

例えば、遺伝子のクラスターであるｎｉｆ遺伝子は、微生物の窒素固定活性を制御する。上述のプロトコルを使用して、遺伝的変異をｎｉｆ遺伝子のうちの１つに導入してもよいが（例えば、プロモーター挿入）、一方で、ｎｉｆクラスターにおけるその他の遺伝子は、それらの内因性形態である（すなわち、それらの遺伝子配列及び／またはプロモーター領域は、改変されていない）。ＲＮＡ配列決定データを、遺伝的変異を含有するｎｉｆ遺伝子の転写活性に関して分析し、また、挿入された遺伝的変化によって直接改変されてはいないが、それでもなお導入された遺伝的変化によって影響を受け得る、他のｎｉｆ遺伝子に関して分析してもよい。

【0640】

このステップは、根圏において上位のインビトロ性能を有する菌株の適性の決定を可能にし、植物内での改変遺伝子の転写活性の測定を可能にする。

【0641】

Ｆ．操作計画／アナリティクスを反復する
インビトロ及び植物内アナリティクス（ステップＥ１及びＥ２）からのデータを使用して、有益な突然変異を反復的に積み上げる。

【0642】

さらに、上述のステップＡ～Ｅを繰り返して、微生物の植物に有益な形質を微調整してもよい。例えば、第１ラウンドでリモデリングされた微生物菌株を使用して植物に接種し、数週間の成長後に収穫し、植物の土壌及び／または根からの微生物を単離する。植物に有益な活性及びコロニー形成ポテンシャルが改善された微生物を選択するために、単離された微生物の機能的活性（植物に有益な形質及びコロニー形成ポテンシャル）ならびにＤＮＡ及びＲＮＡプロファイルを特性評価する。選択された微生物を、植物に有益な活性をさらに改善するようにリモデリングする。リモデリングされた微生物を、インビトロ及び植物内での機能的活性（植物に有益な形質及びコロニー形成ポテンシャル）及びＲＮＡプロファイルに関してスクリーニングし、上位の性能を有する菌株を選択する。所望であれば、ステップＡ～Ｅを繰り返して、第２ラウンドからのリモデリングされた微生物の植物に有益な活性をさらに改善することができる。このプロセスを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ラウンド、またはそれよりも多く繰り返すことができる。

【0643】

上述の例示的なステップが、下記の表Ａに要約される。

【表A-1】

【表A-2】

【表A-3】

【表A-4】

【表A-5】

【表A-6】

【0644】

農業用の生物学的製剤を作出するための慣習的な手法は、それらの方法論に固有の欠点に悩まされる

【0645】

野生型（ＷＴ）微生物の純粋なバイオプロスペクティングまたはトランスジェニック手法とは異なり、ＧＭＲは、ＷＴ微生物よりも植物に有益な表現型を改善する、微生物内の主要な調節ネットワークの非属間遺伝的最適化を可能にするが、トランスジェニック手法に関連するリスク（例えば、予測不能な遺伝子機能、社会的及び規制上の懸念）を有しない。教示されるＧＭＲプラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題を含む「慣習的なバイオプロスペクティング」手法の図示について、図１Ｃを参照されたい。

【0646】

農業用の微生物を開発するための他の方法は、圃場規模では奏功しない場合が多い研究室での大規模な開発、または基盤となる機構／植物－微生物間相互作用の理解を伴わない大規模な温室もしくは「圃場第一の」試験のいずれかに注力している。教示されるＧＭＲプラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題を含む「バイオプロスペクティングに向けた圃場第一の手法」システムの図示について、図１Ｄを参照されたい。

【0647】

ＧＭＲプラットフォームは、これらの問題を多数の方式で解決する

【0648】

ＧＭＲプラットフォームの１つの強みは、標的作物にとって生理学的に重要な主要時期に活性であり、かつ特定の農業的に関連性のある環境条件下でも活性である、活性プロモーターの特定である。

【0649】

説明したように、窒素固定の背景内で、ＧＭＲプラットフォームは、外因性窒素が上昇した環境条件下で活性である微生物プロモーター配列を特定することができ、それによって、現代的な農業の条播作物条件下で、かつ植物が固定窒素を最も必要とする時期に、リモデリングされた微生物が空中窒素を固定すると共に、それを標的作物植物に送達することを可能にする。植物によって窒素が最も必要とされる、トウモロコシ成長周期における時間枠の図示について、図１Ｅを参照されたい。教示されるＧＭＲプラットフォームは、窒素が必要とされる時間枠でトウモロコシ植物に窒素を供給し、また土壌環境に外因性窒素が存在する場合であってもそのような窒素を送達する、リモデリングされた微生物を作出することができる。

【0650】

これらのプロモーターは、根圏ＲＮＡを配列決定し、リードを微生物のゲノム配列にマッピングすることによって特定することができ、植物の成長周期の主要な段階中に主要な経路をオンまたはオフにするよう「再プログラム」することができる。加えて、最適化された微生物の全ゲノム配列決定及び先で形質転換を行った配列へのマッピングにより、この方法は、プラスミドＤＮＡのオフターゲット挿入、ＰＣＲまたは抗生物質耐性により検出されないプラスミドの低レベルの滞留等によりトランスジェニック配列が圃場に偶発的に何ら放出されていないことを確実にする能力を有する。

【0651】

ＧＭＲプラットフォームは、微生物を研究室及び植物環境で反復的に評価することによってこれらの手法を組み合わせて、研究室条件だけでなく温室及び圃場条件で頑強である微生物をもたらす。

【0652】

教示されるＧＭＲプラットフォームの種々の態様及び実施形態は、図１Ｆ～１Ｉに見出すことができる。ＧＭＲプラットフォームは結果的に、植物に有益な特性（例えば窒素固定）を持つ、リモデリングされた微生物の誘導／作出／生産に達する。

【0653】

慣習的なバイオプロスペクティング法では、前述の特性を有する微生物を生産することはできない。

【0654】

窒素固定に向けてリモデリングされた微生物の特性

【0655】

窒素固定に向けてリモデリングされた微生物の背景において、リモデリングされた微生物が持つ可能性があるいくつかの特性が存在する。例えば、図１Ｊは、本開示のリモデリングされた微生物が持つことができる５つの特性を図示する。

【0656】

本発明者らは、ＧＭＲプラットフォームを利用して、外因性窒素が環境中に存在する条件下であっても空中窒素を固定すると共に、該窒素をトウモロコシ植物に送達することができる、リモデリングされた非属間細菌（すなわち、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ）を生産した。リモデリングプロセスが成功裏に、（１）ｎｉｆＡ発現を内因性窒素調節から切り離した、かつ（２）固定窒素の同化及び排泄を改善したことを例示する、図１Ｋ～Ｍを参照されたい。

【0657】

これらのリモデリングされた微生物は最終的に、トウモロコシ作物に施用されたときにトウモロコシ収量の改善をもたらす。図１Ｎを参照されたい。

【0658】

ＧＭＲプラットフォームは、差し迫った環境上の懸念を解決する窒素固定及び送達に向けた手法を提供する

【0659】

先で説明したように、工業的ハーバーボッシュ法によって生産される窒素肥料は、標的作物によって十分に利用されない。雨、流出、熱、揮発、及び土壌マイクロバイオームが、施用された化学肥料を劣化させる。これは、無駄金に等しいだけでなく、収穫高の代わりに汚染の増加も上乗せする。このために、国際連合は、８０％近い肥料が、作物がそれを利用することができる前に失われると算出している。結果として、現代的な農業用肥料の生産及び送達は、環境に有害なだけでなく、極めて非効率的でもある。施肥不足の圃場、過剰施肥された圃場、及び環境的に有害な窒素流出をもたらす、現行の窒素送達システムの非効率性を例示する、図１Ｏを参照されたい。

【0660】

現行のＧＭＲプラットフォーム、及び結果として得られるリモデリングされた微生物は、窒素固定及び植物への窒素送達に向けたより良好な手法を提供する。下記の実施例で見られるように、本開示のリモデリングされた非属間微生物は、外因性窒素が存在する場合であってもトウモロコシ植物の根でコロニー形成すると共に、該トウモロコシ植物を固定空中窒素で養うことができる。教示されるＧＭＲプラットフォームによって可能となる、この窒素固定及び送達システムは、現代的な農業をより環境的に持続可能なシステムに変革する一助となろう。
実施例２：ポリマーにより与えられる微生物安定性－所望の微生物にポリマーの保護能力を与える

【0661】

ポリマーであるポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）を、細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの液体保管または乾燥保管中の保護剤として使用した。

【0662】

微生物の液体保管
２０％ＰＶＰ－ＶＡ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの単離された培養物を含む溶液、ならびに種々の対照溶液を調製した。細菌を含む溶液を複数のバイアルに分取し、密封し、周囲温度で保管した。２００日及び２５０日後（表Ｂ）ならびに１１８日及び２００日後（表Ｃ）、分取した試料をコロニー形成単位に関して評価した。

【0663】

１１８日目に、ＰＶＰ－Ｖポリマーが欠如した対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、約１０．１０の対数損失を示した。同日、ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、２．７の対数損失を示した。２００日目に、ＰＶＰ－Ｖポリマーが欠如した対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、約１０．１０の対数損失を示した。同日、ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、２．７０の対数損失を示した。ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、１１８日及び２００日目に、ＰＶＰ－ＶＡポリマーが欠如した対照と比較して増加した安定性を示した。表Ｃを参照されたい。２００日目及び２５０日目の両方で、ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、トレハロース及びトリプトン処理試料よりも低い対数損失を示した。表Ｂを参照されたい。

【0664】

【表B】

【0665】

【表C】

【0666】

微生物の固体保管（種子上）
２０％ＰＶＰ－ＶＡ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの単離された培養物を含む溶液、ならびに種々の対照溶液を調製した。細菌を含む溶液をトウモロコシ種子にコーティングし、乾燥させ、周囲温度で保管した（周囲温度実験について、温度は保管期間中に流動的であったが、およそ２０～２５℃であった）。（周囲温度）で２１日目（４℃）及び１１８日目に、種子コーティング試料をコロニー形成単位に関して評価した。

【0667】

２１日目に（４℃）、ＰＶＰ－ＶＡが欠如した対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、０．８の対数損失を示した。同日（４℃）、実験的ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、０．７３の対数損失を示した。１１８日目に（周囲温度）、ＰＶＰ－ＶＡが欠如した対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、３．３の対数損失を示した。同日、実験的ＰＶＰ－ＶＡ含有種子コーティング試料は、１．９６の対数損失を示した。これらのデータは、ＰＶＰ－ＶＡが、ＰＶＰ－ＶＡが欠如した対照と比較して、液体中で保管された細菌の安定性を保護／延長することを示唆する。表Ｄ及び表Ｅを参照されたい。

【0668】

【表D】

【0669】

【表E】

【0670】

表Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥの各々の左欄に示される実験的組成物はまた、５％修正レベルでも評価したが、この量は、有益性を実証するには不十分と見なされた。

【0671】

実施例３：ポリマーにより与えられる微生物安定性－ポリマーを所望の微生物接種剤と混合することによって所望の微生物にポリマーの保護能力を与える
滅菌したＰＶＰ－ＶＡ組成物を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの接種培養物の増殖を維持するのに十分な培地（最終２０容量％）に添加する。ＰＶＰ－ＶＡが欠如した対照実験を並行して実施する。ＰＶＰ－ＶＡを含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物をコンフルエンスまで増殖させる。ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物を複数の密封バイアルに分取し、（１）４℃または（２）周囲温度で保管し、０日目、２１日目、及び１９０日目にコロニー形成単位に関して評価する。

【0672】

微生物の液体保管
ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物を複数の密封バイアルに分取し、４℃または周囲温度で保管し、０日目、２１日目、及び１９０日目にコロニー形成単位に関して評価する。

【0673】

ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、２１日目及び１９０日目に、４℃及び周囲温度の両方で、ＰＶＰ－ＶＡが欠如した対応する対照と比較してより高い安定性を示す。

【0674】

微生物の固体保管（種子上）
ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物をトウモロコシ種子にコーティングし、乾燥させ、４℃または周囲温度で保管する。０日目、２１日目、及び１９０日目に、種子コーティング試料をコロニー形成単位に関して評価する。

【0675】

ＰＶＰ－ＶＡ含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａコーティング種子は、２１日目及び１９０日目に、４℃及び周囲温度の両方で、ＰＶＰ－ＶＡが欠如した対応する対照と比較してより高い安定性を示す。

【0676】

実施例４：バイオフィルム養子移入－バイオフィルムを所望の微生物と混合することによって１つの種から別の種へバイオフィルムの保護能力を与える
本実施例は、微生物バイオフィルムを利用した窒素固定微生物の製剤化を実証する。

【0677】

窒素固定細菌の一部の菌株はバイオフィルムを作出せず、発酵条件を変化させて菌株にバイオフィルムの作出を強いることは、菌株の頑強性及び力価に対して悪影響を有し得る。

【0678】

バイオフィルムを、細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの液体保管または乾燥保管中に保護剤として使用した。細菌Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉは、バイオフィルム形成菌であり、また、ある程度の窒素固定も示す。Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉを増殖培地中で振とうしながら増殖させて、バイオフィルムを産生させ、これを濾過によって単離して、結果として得られた微生物バイオフィルム組成物を収集し、１回または複数回の洗浄に供して、流出し緩く付着したＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ細胞を除去した。次いで、バイオフィルムを、あらゆる残っているＫ．ｓａｃｃｈａｒｉを死滅させるのに十分な熱ショックに供した。

【0679】

微生物の液体保管
次いで、熱ショックを与えたバイオフィルム組成物をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの単離された培養物に１：１の比で添加した。バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物を複数の密封バイアルに分取し、周囲温度で保管し、０日目、２１日目、及び１９０日目にコロニー形成単位に関して評価した。

【0680】

２１日目に、Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉバイオフィルムが欠如した対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、１．０９の対数損失を示した。同日、バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、１．０８の対数損失を示した。バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、２１日目に、バイオフィルムが欠如した対照と比較して増加した生存率を示した。

【0681】

微生物の固体保管（種子上）
次いで、熱ショックを与えたバイオフィルム組成物をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの単離された培養物に１０容量％で添加した。バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物をトウモロコシ種子にコーティングし、乾燥させ、可変の温度で保管した（温度は保管期間中に流動的であった）。０日目、２日目、及び２１日目に、種子コーティング試料をコロニー形成単位に関して評価した。

【0682】

２日目に、Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉバイオフィルムが欠如した対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、２．２の対数損失を示した。同日、実験的バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、１．４の対数損失を示した。２１日目に、Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉバイオフィルムが欠如した対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、３．３の対数損失を示した。同日、実験的バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、２．７の対数損失を示した。２日目及び２１日目の両方で、バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ種子コーティング試料は、バイオフィルムが欠如した対照と比較して増加した生存率を示した。

【0683】

実施例５：バイオフィルム養子移入－バイオフィルムを所望の微生物接種剤と混合することによって１つの種から別の種へバイオフィルムの保護能力を与える
バイオフィルムを、細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの液体保管または乾燥保管中に保護剤として使用する。細菌Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉは、バイオフィルム形成菌であり、また、ある程度の窒素固定も示す。Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉを増殖培地中で振とうしながら増殖させて、バイオフィルムを産生させ、次いでこれを濾過によって単離して、結果として得られる微生物バイオフィルム組成物を収集し、１回または複数回の洗浄に供して、流出し緩く付着したＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ細胞を除去する。次いで、バイオフィルムを、あらゆる残っているＫ．ｓａｃｃｈａｒｉを死滅させるのに十分な熱ショックに供する。

【0684】

熱ショックを与えたバイオフィルム組成物を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの接種培養物の増殖を維持するのに十分な培地（１０容量％）に添加する。バイオフィルム組成物を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物をコンフルエンスまで増殖させる。バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物を複数の密封バイアルに分取し、周囲温度で保管し、０日目、２１日目、及び１９０日目にコロニー形成単位に関して評価する。

【0685】

微生物の液体保管
バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物を複数の密封バイアルに分取し、周囲温度で保管し、０日目、２１日目、及び１９０日目にコロニー形成単位に関して評価する。

【0686】

バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、２１日目及び１９０日目に、バイオフィルムが欠如した対応する対照と比較してより高い生存率を示す。

【0687】

微生物の固体保管（種子上）
バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物及び対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物をトウモロコシ種子にコーティングし、乾燥させ、可変の温度で保管する（温度は保管期間中に流動的である）。０日目、２日目、２１日目、及び１９０日目に、種子コーティング試料をコロニー形成単位に関して評価する。

【0688】

バイオフィルム含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物は、２日目、２１日目、及び１９０日目に、バイオフィルムが欠如した対応する対照と比較してより高い生存率を示す。

【0689】

実施例６：バイオフィルム保護－バイオフィルム産生菌及び非産生菌の共接種によって１つの種から別の種へバイオフィルムの保護能力を与える
バイオフィルムを、細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの液体保管または乾燥保管中に保護剤として使用する。細菌Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉは、バイオフィルム形成菌であり、また、ある程度の窒素固定も示す。Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａを、両方の細菌の増殖を支持することが可能な増殖培地に共接種する。結果として得られる培養物は、Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉによって生産されるバイオフィルムに接触したＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの両方を含むものである。微生物組成物を精製して、使用済み培地を除去する。

【0690】

微生物の液体保管
バイオフィルム含有Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ共培養物ならびに対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物を複数の密封バイアルに分取し、周囲温度で保管し、０日目、２１日目、及び１９０日目にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａのコロニー形成単位に関して評価する。

【0691】

バイオフィルム含有Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ共培養物は、２１日目及び１９０日目に、バイオフィルムが欠如した対応する対照と比較して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａのより高い生存率を示す。

【0692】

微生物の固体保管（種子上）
バイオフィルム含有Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ共培養物ならびに対照Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ培養物をトウモロコシ種子にコーティングし、乾燥させ、可変の温度で保管する（温度は保管期間中に流動的であった）。０日目、２日目、２１日目、及び１９０日目に、種子コーティング試料をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａのコロニー形成単位に関して評価する。

【0693】

バイオフィルム含有Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ共培養物は、２日目、２１日目、及び１９０日目に、バイオフィルムが欠如した対応する対照と比較して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａのより高い生存率を示す。

【0694】

実施例７：１つまたは複数の単離された細菌及び１つまたは複数の微生物によって産生されるバイオフィルムを含む組成物のジャグ中安定性
Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉを上述したようなバイオフィルム形成条件下で増殖させることによって、バイオフィルムを産生させた。次いで、バイオフィルムを熱ショックに供して、全ての生存可能なＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ細胞を除去した。バイオフィルムを３つの異なる濃度で使用して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの２つのリモデリングされた菌株１３７－１０３６及び１３７－１０３４のための発酵ブロスを製剤化した。

【0695】

製剤化した試料を２５℃及び３７℃で保管し、生存率をＴ＝０、Ｔ＝１週間、及びＴ＝２週間で測定した。

【0696】

リモデリングされた菌株は、２５℃及び高温（３７℃）で異なってバイオフィルムに応答した。３７℃では、バイオフィルムが製剤中にある場合、両方の菌株が、１週間及び２週間で、対照製剤と比較して顕著な安定性改善を示した（図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、及び５Ｂ）。

【0697】

２５℃で、１３７－１０３６は、２週間の保管で、バイオフィルム含有製剤について改善された安定性を示したが（図３Ａ）、一方で、１週間では、安定性はバイオフィルム含有製剤及び対照製剤について類似していた（図２Ａ）。

【0698】

２５℃で、１３７－１０３４は、安定性の変動を示したが（図４Ａ及び５Ａ）、一方で、３７℃では、それは一貫して改善された安定性を示した（図４Ｂ及び５Ｂ）。

【0699】

まとめると、これらのデータは、バイオフィルムの添加が、高温での両方の菌株の２週間の保管中に、対照（製剤化されていない菌株）と比較して生存率の低下を低減したことを実証する。また、生存率の改善は、バイオフィルムの濃度に正比例しており、すなわち、より高いバイオフィルムの濃度では、生存率の低下がより少なかった（製剤は、より高いバイオフィルムの濃度でより安定であった）。

【0700】

実施例８：改善された微生物製品安定性に向けたポリマー及びバイオフィルムの組み合わせ製剤
２つの微生物１３７－１０３６及び１３７－１０３４の発酵ブロスを作出した。発酵の終わりに、各微生物のための発酵ブロスを、５％ＰＶＰ－ＶＡを添加しつつ及び添加せずに、３つのレベルのバイオフィルムと共に製剤化した。バイオフィルムは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉを利用して、先に記載したように誘導した。

【0701】

製剤化した試料（ＰＶＰ－ＶＡ＋バイオフィルム）を２５Ｃ及び３７Ｃで保管し、製剤材料の生存率を最大１ヶ月間測定した。

【0702】

結果は、図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃに見出すことができる。

【0703】

これらの結果は、５％ＰＶＰ－ＶＡの添加が、バイオフィルムのみの組成物と比較して缶中（ジャグ中）の生存率低下を改善した（より低い対数損失）ことを実証する。

【0704】

実施例９：種々の商用トウモロコシ種子上の種子安定性の改善に対するＰＶＰ－ＶＡの影響
化学的に前処理された、４つの市販のトウモロコシ種子品種をＰＶＰ－ＶＡ製剤研究のために選択した。これら４つのトウモロコシ生殖質及び化学的前処理剤は、下記の表Ｆに見出すことができる。化学的前処理を伴うこれらの４つの商用種子品種の各々は、対応するＰＶＰ－ＶＡ処理対ＰＶＰ－ＶＡ非処理のものであった。故に、全ての種子が、２０％ＰＶＰ－ＶＡを含むまたは含まない製剤で処理された。

【0705】

種子の安定性を４Ｃ、１０Ｃ、及び２５Ｃで経時的に監視した。

【0706】

４Ｃ、１０Ｃ、及び２５Ｃについての結果は、それぞれ図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃに見出すことができる。ＰＶＰ－ＶＡは、４Ｃ及び１０Ｃの保管温度で全ての商用トウモロコシ生殖質にわたって好影響を有した。しかしながら、種子安定性に対する具体的な影響の程度はばらついており、基盤となるトウモロコシ生殖質に依存していた。しかしながら、２５Ｃの保管温度の場合、１週間以内に全ての細胞でそれらの生存率のほとんどが失われ、ＰＶＰ－ＶＡ処理による容易に明らかな差異はなかった。

【0707】

これらのデータから、種子が微生物細胞にとって「より不都合」であるほど（すなわち、微生物細胞に対する悪影響）、ＰＶＰ－ＶＡは安定性に対してより好影響を有すると要約することができる。

【0708】

【表F】

【0709】

表２５及び表２６には、微生物、それらの基盤となる遺伝的構造、及びそれらの対応する配列番号が記載される。これらの微生物は、実施例１に記載されるＧＭＲプラットフォームを利用して誘導された。これらの微生物が、本明細書に記載されるようなポリマー組成物製剤に含まれ得ることが企図される。

【表25】

【表26-1】

【表26-2】

【表26-3】

【表26-4】

【表26-5】

【表26-6】

【表26-7】

【表26-8】

【表26-9】

【表26-10】

【表26-11】

【表26-12】

【表26-13】

【表26-14】

【表26-15】

【表26-16】

【表26-17】

【表26-18】

【表26-19】

【表26-20】

【表26-21】

【表26-22】

【表26-23】

【表26-24】

【表26-25】

【表26-26】

【表26-27】

【表26-28】

【表27-1】

【表27-2】

【表27-3】

【表27-4】

【表27-5】

【表27-6】

【表27-7】

【0710】

本開示の番号付き実施形態Ｉ
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号付き実施形態を記載する。

【0711】

１．微生物組成物であって、１つまたは複数の単離された細菌と、１つまたは複数のポリマーを含むポリマー組成物とを含み、前記１つまたは複数のポリマーが、前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性であり、任意選択で、前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性の１つまたは複数のバイオフィルムを含む、前記微生物組成物。

【0712】

２．前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性の前記１つまたは複数のバイオフィルムが存在する、実施形態１に記載の微生物組成物。

【0713】

３．前記１つまたは複数のバイオフィルムが、以下の属、すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから選択される属内の種由来のバイオフィルムを含む、実施形態１または２に記載の微生物組成物。

【0714】

４．前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0715】

５．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属の微生物由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0716】

６．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａであり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0717】

７．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0718】

８．前記１つまたは複数のバイオフィルムが、２つの異なるバイオフィルム産生微生物によって産生される２つのバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0719】

９．前記１つまたは複数の単離された細菌が、以下の属、すなわち、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びそれらの組み合わせから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0720】

１０．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ菌種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｒａｌｅ、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、及びそれらの組み合わせから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0721】

１１．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0722】

１２．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａである、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0723】

１３．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0724】

１４．前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギネート、及びそれらの組み合わせから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0725】

１５．前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0726】

１６．前記１つまたは複数のポリマーが、電界紡糸ポリマーである、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0727】

１７．前記１つまたは複数のポリマーが、コポリマーを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0728】

１８．前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素を固定することができる、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0729】

１９．前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0730】

２０．前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、少なくとも３０日間保管された場合に、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0731】

２１．前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、液体培養中で保管された場合に増加を示す、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0732】

２２．前記組成物が固体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0733】

２３．前記組成物が液体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0734】

２４．前記組成物が半固体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0735】

２５．前記微生物組成物が、植物種子または他の植物繁殖材料上に存在する種子コーティングである、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0736】

２６．前記微生物組成物が、トウモロコシ種子上に存在する殺虫剤、除草剤、殺真菌剤、または殺線虫剤を有する、前記種子上に存在する種子コーティングである、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0737】

２７．前記微生物組成物が、畦間製剤中にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0738】

２８．前記１つまたは複数の単離された細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0739】

２９．前記１つまたは複数の単離された細菌が、野生型細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0740】

３０．前記１つまたは複数の単離された細菌が、トランスジェニック細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0741】

３１．前記１つまたは複数の単離された細菌が、リモデリングされた非属間細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0742】

３２．前記１つまたは複数の単離された細菌が、表１から選択されるリモデリングされた非属間細菌、またはその子孫もしくは派生物である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0743】

３３．前記１つまたは複数の単離された細菌が、空中窒素を固定することができる、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0744】

３４．前記１つまたは複数の単離された細菌が、外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができるリモデリングされた非属間細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0745】

３５．前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、リモデリングされた非属間細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0746】

３６．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入制御配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0747】

３７．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0748】

３８．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される成員に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0749】

３９．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの増加した発現もしくは活性；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの減少した発現もしくは活性；ＧｌｎＥの減少したアデニリル除去活性；またはＧｌｎＤの減少したウリジリル除去活性のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0750】

４０．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0751】

４１．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0752】

４２．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0753】

４３．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子；ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子；及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0754】

４４．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、及びアデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0755】

４５．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子、及びａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0756】

４６．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、エキソポリサッカライド産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、及びグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0757】

４７．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0758】

４８．前記１つまたは複数の単離された細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、及びそれらの組み合わせから選択される細菌を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0759】

４９．前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0760】

５０．前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の微生物組成物。

【0761】

本開示の番号付き実施形態ＩＩ
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号付き実施形態を記載する。

【0762】

１．細菌組成物の生存率を増加させるための方法であって、前記方法が、１つまたは複数の単離された細菌と、１つまたは複数のポリマーを含むポリマー組成物とを組み合わせることを含み、前記１つまたは複数のポリマーが、前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性であり、前記生存率の増加が、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比べてのものであり、任意選択で、前記単離された細菌及び前記ポリマー組成物と、前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性の１つまたは複数のバイオフィルムを組み合わせることを含む、前記方法。

【0763】

２．前記１つまたは複数の単離された細菌に外因性の前記１つまたは複数のバイオフィルムが、前記単離された細菌及び前記ポリマー組成物と組み合わされる、実施形態１に記載の方法。

【0764】

３．前記１つまたは複数のバイオフィルムが、以下の属、すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから選択される属内の種由来のバイオフィルムを含む、実施形態１または２に記載の方法。

【0765】

４．前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0766】

５．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0767】

６．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａであり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0768】

７．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株であり、前記１つまたは複数のバイオフィルムが、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ由来のバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0769】

８．前記１つまたは複数のバイオフィルムが、２つの異なるバイオフィルム産生微生物によって産生される２つのバイオフィルムを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0770】

９．前記１つまたは複数の単離された細菌が、以下の属、すなわち、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びそれらの組み合わせから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0771】

１０．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ菌種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｒａｌｅ、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、及びそれらの組み合わせから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0772】

１１．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0773】

１２．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0774】

１３．前記１つまたは複数の単離された細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ １３７－１０３６菌株である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0775】

１４．前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギネート、及びそれらの組み合わせから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0776】

１５．前記１つまたは複数のポリマーが、ポリビニルピロリドン－酢酸ビニル（ＰＶＰ－ＶＡ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0777】

１６．前記１つまたは複数のポリマーが、電界紡糸ポリマーである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0778】

１７．前記１つまたは複数のポリマーが、コポリマーを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0779】

１８．前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素を固定することができる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0780】

１９．前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0781】

２０．前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、少なくとも３０日間保管された場合に、前記１つまたは複数のポリマーが欠如した１つまたは複数の単離された細菌を含む対照組成物と比較して増加を示す、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0782】

２１．前記１つまたは複数の単離された細菌の生存率が、液体培養中で保管された場合に増加を示す、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0783】

２２．前記組成物が固体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0784】

２３．前記組成物が液体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0785】

２４．前記組成物が半固体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0786】

２５．前記微生物組成物が、植物種子または他の植物繁殖材料上に存在する種子コーティングである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0787】

２６．前記微生物組成物が、トウモロコシ種子上に存在する殺虫剤、除草剤、殺真菌剤、または殺線虫剤を有する、前記種子上に存在する種子コーティングである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0788】

２７．前記微生物組成物が、畦間製剤中にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0789】

２８．前記１つまたは複数の単離された細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0790】

２９．前記１つまたは複数の単離された細菌が、野生型細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0791】

３０．前記１つまたは複数の単離された細菌が、トランスジェニック細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0792】

３１．前記１つまたは複数の単離された細菌が、リモデリングされた非属間細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0793】

３２．前記１つまたは複数の単離された細菌が、表１から選択されるリモデリングされた非属間細菌、またはその子孫もしくは派生物である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0794】

３３．前記１つまたは複数の単離された細菌が、空中窒素を固定することができる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0795】

３４．前記１つまたは複数の単離された細菌が、外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができるリモデリングされた非属間細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0796】

３５．前記１つまたは複数の単離された細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、リモデリングされた非属間細菌である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0797】

３６．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入制御配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0798】

３７．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0799】

３８．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される成員に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0800】

３９．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの増加した発現もしくは活性；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの減少した発現もしくは活性；ＧｌｎＥの減少したアデニリル除去活性；またはＧｌｎＤの減少したウリジリル除去活性のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0801】

４０．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0802】

４１．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0803】

４２．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0804】

４３．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子；ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子；及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0805】

４４．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、及びアデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0806】

４５．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｎｉｆＬ遺伝子において異種プロモーターを含む変異型の前記ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインが欠如した短縮型ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異型のｇｌｎＥ遺伝子、及びａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす変異型の前記ａｍｔＢ遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0807】

４６．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、エキソポリサッカライド産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、及びグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0808】

４７．前記１つまたは複数の単離された細菌の各々が、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝的変異を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0809】

４８．前記１つまたは複数の単離された細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、及びそれらの組み合わせから選択される細菌を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0810】

４９．前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0811】

５０．前記１つまたは複数の単離された細菌が、配列番号１７７～２６０、２９６～３０３、及び４５８～４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0812】

本開示では、番号付き実施形態に含まれる前述の要素のありとあらゆる入れ替え及び組み合わせが企図される。

【0813】

参照による援用
本明細書に引用される全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願は、参照によりそれらの全体があらゆる目的で援用される。しかしながら、本明細書で引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願の言及は、世界のいずれの国でもそれらが有効な先行技術を構成するかまたは共通一般知識の一部を形成することを認めるものでも、または任意の形式で示唆するものでもなく、かつそのように解釈されるべきではない。さらに、２０１８年５月２２日に発行された、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｉｔｓと題される米国特許第９，９７５，８１７号が、参照により本明細書に援用される。さらに、２０１８年１月１２日に出願され、２０１８年７月１９日にＷＯ２０１８／１３２７７４ Ａ１として公開された、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｉｔｓと題されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３６７１が、参照により本明細書に援用される。さらに、２０１９年１１月１日に出願された、Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｆｉｘｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓと題されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５９４５０が、参照により本明細書に援用される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図1L】

【図1M】

【図1N】

【図1O】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【配列表】

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【国際調査報告】