特表 2022-513884 Ｂ型肝炎ウイルスワクチンおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルスワクチンおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/51 20060101AFI20220202BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220202BHJP

   A61K 39/29 20060101ALI20220202BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220202BHJP

【ＦＩ】

C12N15/51

C12N7/01 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/29

A61P31/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021534263

(86)(22)【出願日】2019-12-09

(85)【翻訳文提出日】2021-08-10

(86)【国際出願番号】 US2019065151

(87)【国際公開番号】W WO2020123341

(87)【国際公開日】2020-06-18

(31)【優先権主張番号】62/778,549

(32)【優先日】2018-12-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521258131

【氏名又は名称】ジェイアールエイチエス セラピューティクス インク．

【氏名又は名称原語表記】ＪＲＨＳ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】７ Ｆｅｎｇｘｉａｎ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ，Ｎｏ ２３１，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １，Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００９４，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】特許業務法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】スー，チョアン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，メイジィア

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA86X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA96X

4B065AA96Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA87

4C085GG03

(57)【要約】

組換えＨＢＶ表面抗原を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン粒子であって、Ｌ表面タンパク質；任意選択でＭ表面タンパク質；および任意選択でＳ表面タンパク質を含み、Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質の合計に対するＬ表面タンパク質のモルパーセンテージが、少なくとも約１モル％、８モル％、１０モル％、２０モル％、３０モル％、４０モル％、または５０モル％である、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン粒子が記載される。そのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン粒子を作製する方法、およびそれを使用して対象のＨＢＶ感染を処置または予防する方法もまた記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｌ表面タンパク質；
任意選択でＭ表面タンパク質；および
任意選択でＳ表面タンパク質
を含む組換えＨＢＶ表面抗原を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン粒子であって、前記Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージが、少なくとも約１モル％である、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン粒子。

【請求項2】

前記Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージが、少なくとも約２モル％、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、または８モル％である、請求項１に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項3】

前記Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージが、約８モル％を超える、請求項１に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項4】

前記Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージが、約９モル％、１０モル％、１１モル％、１２モル％、１３モル％、１４モル％、１５モル％、１６モル％、１７モル％、１８モル％、１９モル％、２０モル％、２１モル％、２２モル％、２３モル％、２４モル％、２５モル％、２６モル％、２７モル％、２８モル％、２９モル％、３０モル％、３１モル％、３２モル％、３３モル％、３４モル％、３５モル％、３６モル％、３７モル％、３８モル％、３９モル％、４０モル％、４１モル％、４２モル％、４３モル％、４４モル％、４５モル％、４６モル％、４７モル％、４８モル％、４９モル％、または５０モル％を超える、請求項１に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項5】

前記Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージが、少なくとも約６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、または１００モル％である、請求項１に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項6】

ＭまたはＳタンパク質を含まない、請求項１に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項7】

ウイルス様粒子である、請求項１に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項8】

前記Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージが、約１０モル％～約４０モル％、５～１５モル％、１５～２５モル％、２５～４０モル％、または４０～６０モル％である、請求項１に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項9】

前記Ｌ表面タンパク質が、内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる、請求項１から８のいずれか一項に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項10】

図９に示されるようにクローンＡ４または５１を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＨＢＶワクチン粒子。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のＨＢＶワクチン粒子およびアジュバントを含むＨＢＶワクチン。

【請求項12】

前記アジュバントが、ミョウバン、トール様受容体、およびコロイド金からなる群から選択される、請求項１１に記載のＨＢＶワクチン。

【請求項13】

それを必要とする対象におけるＨＢＶ感染を処置または予防する方法であって、有効量の請求項１１または１２に記載のＨＢＶワクチンを前記対象に投与するステップを含む方法。

【請求項14】

前記対象がヒトである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

Ｌ表面タンパク質をコードする組換え核酸配列であって、内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列。

【請求項16】

請求項１５に記載の組換え核酸配列を含む、Ｌ表面タンパク質を発現するための組換え発現ベクター。

【請求項17】

請求項１６に記載の組換え発現ベクターで形質転換された細胞。

【請求項18】

前記Ｓ表面タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列を含む第２の組換え発現ベクター、および
前記Ｍ表面タンパク質をコードする第３の組換え核酸配列を含む第３の組換え発現ベクター
によってさらに形質転換された、請求項１７に記載の細胞。

【請求項19】

１つまたは複数のさらなる組換え発現ベクターによってさらに形質転換された、請求項１７または１８に記載の細胞。

【請求項20】

ＨＢＶコア抗原をコードする第４の組換え核酸配列を含む第４の発現ベクターによってさらに形質転換された、請求項１７または１８に記載の細胞。

【請求項21】

大腸菌、真菌、昆虫または哺乳動物タンパク質発現宿主に由来する、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項22】

ＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞に由来する、請求項２１に記載の細胞。

【請求項23】

ＨＢＶワクチン粒子を調製するための方法であって、
ａ）Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質をそれぞれコードする第１、第２および第３の組換え核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供するステップであって、前記第１、第２および第３の組換え核酸配列は、内部シスエレメントを有さないステップと；
ｂ）前記組換え発現ベクターで細胞を形質転換するステップと；
ｃ）細胞がＬ、ＭおよびＳ表面タンパク質を共発現するように培養および選択するステップと
を含む方法。

【請求項24】

Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質のそれぞれが、別個の発現ベクター中にある、請求項２３記載の方法。

【請求項25】

細胞が前記Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質においてＬ表面タンパク質を少なくとも約１モル％、２モル％、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、８モル％、９モル％、１０モル％、１１モル％、１２モル％、１３モル％、１４モル％、１５モル％、１６モル％、１７モル％、１８モル％、１９モル％、２０モル％、２１モル％、２２モル％、２３モル％、２４モル％、２５モル％、２６モル％、２７モル％、２８モル％、２９モル％、３０モル％、３１モル％、３２モル％、３３モル％、３４モル％、３５モル％、３６モル％、３７モル％、３８モル％、３９モル％、４０モル％、４１モル％、４２モル％、４３モル％、４４モル％、４５モル％、４６モル％、４７モル％、４８モル％、４９モル％または５０モル％のパーセンテージで発現するように選択するステップをさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項26】

細胞が前記Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質においてＬ表面タンパク質を少なくとも約６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％または１００モル％のパーセンテージで発現するように選択するステップをさらに含む、請求項２３、２４または２５に記載の方法。

【請求項27】

前記組換え発現ベクターが、前記ＨＢＶコア抗原をコードする第４の組換え核酸配列をさらに含み、ステップｃ）が、Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質ならびにＨＢＶコア抗原を共発現する細胞を培養および選択することを含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記細胞が、昆虫または哺乳動物のタンパク質発現宿主に由来する、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記細胞が、ＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞に由来する、請求項２８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１２日に出願された米国仮出願第６２／７７８，５４９号の利益を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

参照による組み込み
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および論文の全内容は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

【0003】

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンに関する。

【背景技術】

【0004】

慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、依然として世界的な公衆衛生管理の課題である。世界中で３億５０００万人を超える患者が慢性Ｂ型肝炎感染に罹患しており、毎年１００万件を超える死亡をもたらしている。例えば、非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３を参照されたい。特に、中国等の発展途上国では、人口の１０％近くが罹患している（例えば、非特許文献４；非特許文献５を参照されたい）。さらに、慢性疾患のキャリア患者の大部分が肝細胞癌を発症する。例えば、非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８を参照されたい。

【0005】

ヌクレオシド阻害剤の使用等の現在の処置は、共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の転写を阻害せず、しばしば薬物耐性をもたらす。インターフェロンアルファ処置は、許容できない副作用をもたらし（非特許文献９）、処置された患者のせいぜい１０％しか抗体陽転を達成しない。したがって、この現在の健康管理の問題に対処するために、より効果的な処置オプションが依然として必要とされている。

【0006】

Ｂ型肝炎ウイルスの表面エンベロープは、Ｌ、Ｍ、およびＳと命名された３つのタンパク質を含む。３つのタンパク質は共通のＣ末端を共有するが、Ｍ形態はＳと比較して余分なＮ末端ＰｒｅＳ２配列を含み、Ｌ形態はＭおよびＳと比較して追加のＰｒｅＳ１配列を含む（非特許文献１０）。ＰｒｅＳ１配列は、受容体結合配列（ａａ２１～４７）を含み、肝細胞へのウイルスの特異的結合を担うと報告されている。例えば、非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；および非特許文献１４を参照されたい。最近、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドが、ヒトＢ型肝炎ウイルスの機能的受容体として同定された。例えば、非特許文献１５；非特許文献１６を参照されたい。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｋａｎｅ，Ｍ．，１９９５．Ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｅ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１３，ｐｐ．Ｓ４７－Ｓ４９

【非特許文献2】Ｌａｖａｎｃｈｙ，Ｄ．，２００４Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｄｉｓｅａｓｅ ｂｕｒｄｅｎ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，１１（２），ｐｐ．９７－１０７

【非特許文献3】Ｍａｄｄｒｅｙ，Ｗ．Ｃ．，２００１．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ－－ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｉｓｓｕｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，４７（１－２），ｐｐ．５１－５５

【非特許文献4】Ｙａｏ，Ｊ．Ｌ．，１９９６．Ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｇｕｔ，３８（Ｓｕｐｐｌ２），ｐｐ．Ｓ３７－Ｓ３８

【非特許文献5】Ｌｉａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｒｏｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｉｎ Ｃｈｉｎａ－ｄｅｃｌｉｎｉｎｇ ＨＢＶ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｄｕｅ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２７（４７），ｐｐ．６５５０－６５５７

【非特許文献6】Ｂｏｓｃｈ，Ｆ．Ｘ．，Ｒｉｂｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｂｏｒｒａｓ，Ｊ．，１９９９，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ，ｉｎ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．０３，ｐｐ．２７１－２８５，Ｔｈｉｅｍｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．

【非特許文献7】Ｂｏｓｃｈ，Ｆ．Ｘ．，Ｒｉｂｅｓ，Ｊ．，Ｃｌｅｒｉｅｓ，Ｒ．ａｎｄ Ｄｉａｚ，Ｍ．，２００５，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，９（２），ｐｐ．１９１－２１１

【非特許文献8】Ｒｉｂｅｓ，Ｊ．，Ｃｌｅｒｉｅｓ，Ｒ．，Ｒｕｂｉｏ，Ａ．，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａｚｚａｒａ，Ｒ．，Ｍａｄｏｚ，Ｐ．，Ｃａｓａｎｏｖａｓ，Ｔ．，Ｃａｓａｎｏｖａ，Ａ．，Ｇａｌｌｅｎ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃ．ａｎｄ Ｍｏｒｅｎｏ，Ｖ．，２００６，Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ａｎ ＨＢｓＡｇ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｏｈｏｒｔ：２０ｙｅａｒｓ ｏｆ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１１９（３），ｐｐ．６８７－６９４

【非特許文献9】Ｌｏｋ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＭａｈｏｎ，Ｂ．Ｊ．，２００７．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４５（２），ｐｐ．５０７－５３９）

【非特許文献10】Ｇａｎｅｍ，Ｄ．ａｎｄ Ｖａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．，１９８７．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６（１），ｐｐ．６５１－６９３

【非特許文献11】Ｂａｒｒｅｒａ，Ａ．，Ｇｕｅｒｒａ，Ｂ．，Ｎｏｔｖａｌｌ，Ｌ．ａｎｄ Ｌａｎｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．，２００５，Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅ－Ｓ１ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９（１５），ｐｐ．９７８６－９７９８

【非特許文献12】Ｎｅｕｒａｔｈ，Ａ．Ｒ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．，Ｓｔｒｉｃｋ，Ｎ．ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．，１９８６，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ，Ｃｅｌｌ，４６（３），ｐｐ．４２９－４３６

【非特許文献13】Ｎｅｕｒａｔｈ，Ａ．Ｒ．，Ｓｅｔｏ，Ｂ．ａｎｄ Ｓｔｒｉｃｋ，Ｎ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｅＳ１ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ）ｅｎｖｅｌｏｐｅ（ｅｎｖ）ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｅ ｖｉｒｕｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ，７（３），ｐｐ．２３４－２３６

【非特許文献14】Ｄａｓｈ，Ｓ．，Ｒａｏ，Ｋ．Ｖ．ａｎｄ Ｐａｎｄａ，Ｓ．Ｋ．，１９９２，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｐｒｅ－Ｓｌ（２１－４７）ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ：Ｒｏｌｅ ｉｎ ｖｉｒｕｓ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３７（２），ｐｐ．１１６－１２１

【非特許文献15】Ｙａｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ａｎｄ Ｄ ｖｉｒｕｓ．Ｅｌｉｆｅ，１，ｐ．ｅ０００４９

【非特許文献16】Ｎｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ａｎｄ Ｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｅｘｐｌｏｉｔ ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｃｏ－ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４６（４），ｐｐ．１０７０－１０８３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

有効なＨＢＶワクチンが依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

一態様において、
Ｌ表面タンパク質；
任意選択でＭ表面タンパク質；および
任意選択でＳ表面タンパク質
を含む組換えＨＢＶ表面抗原を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン粒子が開示され、Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、少なくとも約１モル％である。

【0010】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、少なくとも約２モル％、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、または８モル％である。

【0011】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約８モル％を超える。

【0012】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約９モル％、１０モル％、１１モル％、１２モル％、１３モル％、１４モル％、１５モル％、１６モル％、１７モル％、１８モル％、１９モル％、２０モル％、２１モル％、２２モル％、２３モル％、２４モル％、２５モル％、２６モル％、２７モル％、２８モル％、２９モル％、３０モル％、３１モル％、３２モル％、３３モル％、３４モル％、３５モル％、３６モル％、３７モル％、３８モル％、３９モル％、４０モル％、４１モル％、４２モル％、４３モル％、４４モル％、４５モル％、４６モル％、４７モル％、４８モル％、４９モル％、または５０モル％を超える。

【0013】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、少なくとも約６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、または１００モル％である。

【0014】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、ＨＢＶワクチン粒子は、ＭまたはＳタンパク質を含まない。

【0015】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、ＨＢＶワクチン粒子は、ウイルス様粒子である。

【0016】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約１０モル％～約４０モル％、５～１５モル％、１５～２５モル％、２５～４０モル％または４０～６０モル％である。

【0017】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、ＨＢＶワクチン粒子は、図９に示されるようにクローンＡ４または５１を含む。

【0018】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ表面タンパク質は、内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｌ表面タンパク質は、Ｓタンパク質発現を駆動する内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｌ表面タンパク質は、Ｍタンパク質発現を駆動する内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｌ表面タンパク質は、ＭまたはＳタンパク質発現を駆動する内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。

【0019】

別の態様において、実施形態のいずれか１つのＨＢＶワクチン粒子およびアジュバントを含むＨＢＶワクチンが開示される。

【0020】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、アジュバントは、ミョウバン、トール様受容体、およびコロイド金からなる群から選択される。

【0021】

さらに別の態様において、それを必要とする対象におけるＨＢＶ感染を処置または予防する方法であって、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの有効量のＨＢＶワクチンを対象に投与するステップを含む方法が開示される。

【0022】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、対象はヒトである。

【0023】

さらに別の態様において、Ｌ表面タンパク質をコードする組換え核酸配列が開示され、組換え核酸配列は、内部シスエレメントを有しない。

【0024】

さらに別の態様において、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え核酸配列を含む、Ｌ表面タンパク質を発現するための組換え発現ベクターが開示される。

【0025】

さらに別の態様において、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え発現ベクターで形質転換された細胞が説明される。

【0026】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、
Ｓ表面タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列を含む第２の組換え発現ベクター、および
Ｍ表面タンパク質をコードする第３の組換え核酸配列を含む第３の組換え発現ベクター
によってさらに形質転換される。

【0027】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、１つまたは複数のさらなる組換え発現ベクターによってさらに形質転換される。

【0028】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、ＨＢＶコア抗原をコードする第４の組換え核酸配列を含む第４の発現ベクターによってさらに形質転換される。

【0029】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、昆虫または哺乳動物のタンパク質発現宿主に由来する。本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、大腸菌または真菌に由来する。

【0030】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、ＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞に由来する。

【0031】

さらに別の態様において、ＨＢＶワクチン粒子を調製するための方法であって、
ａ）Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質をそれぞれコードする第１、第２および第３の組換え核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供するステップであって、第１、第２および第３の組換え核酸配列は、内部シスエレメントを有さないステップと；
ｂ）組換え発現ベクターで細胞を形質転換するステップと；
ｃ）細胞がＬ、ＭおよびＳ表面タンパク質を共発現するように培養および選択するステップと
を含む方法が説明される。

【0032】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ、Ｓ、およびＭ表面タンパク質のそれぞれは、別個の発現ベクター中にある。

【0033】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、方法は、細胞がＬ、ＭおよびＳ表面タンパク質においてＬ表面タンパク質を少なくとも約１モル％、２モル％、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、８モル％、９モル％、１０モル％、１１モル％、１２モル％、１３モル％、１４モル％、１５モル％、１６モル％、１７モル％、１８モル％、１９モル％、２０モル％、２１モル％、２２モル％、２３モル％、２４モル％、２５モル％、２６モル％、２７モル％、２８モル％、２９モル％、３０モル％、３１モル％、３２モル％、３３モル％、３４モル％、３５モル％、３６モル％、３７モル％、３８モル％、３９モル％、４０モル％、４１モル％、４２モル％、４３モル％、４４モル％、４５モル％、４６モル％、４７モル％、４８モル％、４９モル％または５０モル％のパーセンテージで発現するように選択するステップをさらに含む。

【0034】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、方法は、細胞がＬ、ＭおよびＳ表面タンパク質においてＬ表面タンパク質を少なくとも約６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％または１００モル％のパーセンテージで発現するように選択するステップをさらに含む。

【0035】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、組換え発現ベクターは、ＨＢＶコア抗原をコードする第４の組換え核酸配列をさらに含み、ステップｃ）は、Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質ならびにＨＢＶコア抗原を共発現する細胞を培養および選択することを含む。

【0036】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、昆虫または哺乳動物のタンパク質発現宿主に由来する。本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、大腸菌または真菌に由来する。本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、ＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞に由来する。

【0037】

本明細書に開示される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される別の態様または実施形態と組み合わせることができる。本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態と、本明細書に記載の他の１つまたは複数の実施形態との組み合わせが、明示的に企図される。

【0038】

別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を本発明の実践または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0039】

本発明は、例示のみを目的として提示され、限定することを意図するものではない以下の図を参照して説明される。

【0040】

【図1】Ｌタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す図である。レーン１．分子量ラダー；レーン２．モックトランスフェクション；レーン３．Ｌ形態；レーン４．追加のＮ末端シグナルペプチドを有するＬ形態。分泌されたＬタンパク質は、４９ＫＤａ～６０ＫＤａのタンパク質として可視化されることに留意されたい。

【図2】単独または組み合わせのいずれかでのＳ、ＭおよびＬタンパク質の一過性発現を示す図である（馴化培地中のＨＢｓＡｇ粒子の存在がＥＬＩＳＡ分析によって検出された；同時トランスフェクションＳ＋Ｍ＋Ｌは、低レベルのＨＢｓＡｇ粒子を示したが検出可能であり、Ｌタンパク質の高い発現がＭまたはＳタンパク質の分泌を阻害することが確認された）。

【図3】コアタンパク質の存在下でのＬ、ＭおよびＳタンパク質の一過性発現のＥＬＩＳＡ検出を示す図であり、コアタンパク質が粒子の分泌に影響しないことを示している。

【図4A】抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体Ｓ２６（左パネル）および抗Ｓポリクローナル抗体（右パネル）によって認識されるタンパク質を発現した２９３Ｆ安定クローン１６、２３、５０、５１および１２のウエスタンブロットスクリーニングを示す図である。馴化培地を７２時間後に回収し、Ｌ、ＭおよびＳ形態の存在を、ＰｒｅＳ２特異的モノクローナル抗体Ｓ２６（左パネル）およびＳに対するポリクローナル抗体（右パネル）を使用したウエスタン分析によってスクリーニングした。

【図4B】抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体Ｓ２６（左パネル）および抗Ｓポリクローナル抗体（右パネル）によって認識されるタンパク質を発現したＣＨＯ安定クローン７Ｃ８および１０Ｅ３のウエスタンブロットスクリーニングを示す図である。

【図5】抗Ｓポリクローナル抗体（左パネル）および抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体Ｓ２６（右パネル）によって認識されるタンパク質を発現した２９３Ｆ安定クローンＡ４および５１のウエスタンブロットスクリーニングを示す図である。馴化培地を７２時間後に回収し、Ｌ、ＭおよびＳ形態の存在をウエスタン分析によってスクリーニングした。

【図6】さらなる安定発現クローン２６、４３、８８をＬ、Ｍ、およびＳタンパク質の存在についてスクリーニングしたことを示す図である。個々のクローンを２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地で増殖させた。馴化培地を７２時間後に回収し、Ｌ、ＭおよびＳ形態の存在を、ＰｒｅＳ２特異的モノクローナル抗体Ｓ２６（左パネル）およびＳに対するポリクローナル抗体（右パネル）を使用したウエスタンブロット分析によってスクリーニングした。

【図7】クローン５１の最終ＳＥＣ精製の銀染色分析画分を示す図である。クローン５１の馴化培地を濃縮し、ヒドロキシアパタイトによって捕捉し、サイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。最後の２つのレーンは、参照タンパク質として分画されたＢＳＡタンパク質である。

【図8】クローンＡ４についての最終ＳＥＣ精製の銀染色分析画分を示す図である。クローンＡ４の馴化培地を濃縮し、ＨＢｓＡｇ粒子をヒドロキシアパタイトによって捕捉し、サイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。

【図9】クローンＡ４および５１由来の精製ＨＢｓＡｇタンパク質のクーマシー染色を示す図である。ＢＣＡ推定による約１０μｇのタンパク質を各レーンにロードした。タンパク質の同一性を、ゲルペプチド中でウエスタンブロットおよびその後質量分析法によって検証した。レーン１、２、３は、クローンＡ４の３つの異なる調製物である。レーン４は、クローン５１の代表的な調製物の一つである。

【図10】抗Ｓポリクローナル抗体（左パネル）および抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体Ｓ２６（中央パネル）および抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体ＡＰ１（右パネル）を使用した精製ＨＢｓＡｇ粒子のウエスタンブロット分析を示す図である。左側レーンおよび中央レーンは、クローンＡ４の２つの異なる調製物である。右側のレーンは、クローン５１からの精製タンパク質調製物である。

【図11】Ｌ、ＭおよびＳ形態が少なくとも部分的にグリコシル化されていることを示す図である。精製されたタンパク質をＰＮＧａｓｅで処理し、グリカンの除去をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって監視した。

【図12】クローン１６由来の精製ＨＢｓＡｇ粒子の電子顕微鏡写真を示す図である。

【図13】クローン５１由来の精製ＨＢｓＡｇ粒子の電子顕微鏡写真を示す図である。

【図14】精製ＬＭＳウイルス様粒子を用いて２匹のマウスが免疫化されたマウス血清力価を示す図である。酵母由来ＨＢｓＡｇを免疫対照として使用した。最初の免疫化の３５日後、ウイルス様粒子に対する抗体応答の力価を連続希釈によって決定した。ＨＢｓＡｇ－１、ＨＢｓＡｇ－２：酵母で産生されたＳ形態ＨＢｓＡｇを用いてマウスを免疫化した。＃１６－１、＃１６－２：マウスをクローン１６由来の精製ＬＭＳ ＨＢｓＡｇで免疫化した。＃５１－１、＃５１－２：マウスをクローン＃５１由来の精製ＬＭＳ ＨＢｓＡｇで免疫化した。

【図15】精製ＨＢｓＡｇ粒子を使用してアッセイされた抗体力価を示す。各バーは、Ｂａｌｂ Ｃ系統の１匹のマウスにおける抗体力価を表す。

【図16】精製された直鎖状のＰｒｅＳ２ペプチドを使用して、ＰｒｅＳ２領域に対する抗体応答を試験したことを示す図である。４匹全てのマウス由来の血清は、ＰｒｅＳ２ペプチドに対して反応性であったが、ＢＳＡ対照に対しては反応性でなかった。

【図17】４匹全ての免疫マウスから脾臓を取り出し、マウスからのＢ細胞を使用してハイブリドーマを生成したことを示す。精製されたＨＢｓＡｇ粒子に対して反応性であったクローンを、Ｓ、ＰｒｅＳ２、ＰｒｅＳ１、または未知のビンに群分けした。

【発明を実施するための形態】

【0041】

発明の詳細な説明

【0042】

ＨＢＶワクチン

【0043】

一態様において、
Ｌ表面タンパク質；
任意選択でＭ表面タンパク質；および
任意選択でＳ表面タンパク質
を含む組換えＨＢＶ表面抗原を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン粒子が開示され、Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、少なくとも約１モル％である。

【0044】

いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、少なくとも約２モル％、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、または８モル％である。

【0045】

いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約８モル％を超える。

【0046】

いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約９モル％または１０モル％を超える。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約９モル％、１０モル％、１１モル％、１２モル％、１３モル％、１４モル％、１５モル％、１６モル％、１７モル％、１８モル％、１９モル％、２０モル％、２１モル％、２２モル％、２３モル％、２４モル％、２５モル％、２６モル％、２７モル％、２８モル％、２９モル％、３０モル％、３１モル％、３２モル％、３３モル％、３４モル％、３５モル％、３６モル％、３７モル％、３８モル％、３９モル％、４０モル％、４１モル％、４２モル％、４３モル％、４４モル％、４５モル％、４６モル％、４７モル％、４８モル％、４９モル％、もしくは５０モル％を超える、または本明細書に開示される任意の２つの値で画定される範囲内である。

【0047】

いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、少なくとも約１５モル％、２０モル％、２５モル％、３０モル％、または４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、少なくとも約６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、または１００モル％である。いくつかの実施形態において、ＨＢＶワクチン粒子は、ＭまたはＳタンパク質を含まない。いくつかの実施形態において、ＨＢＶワクチン粒子は、ウイルス様粒子である。

【0048】

いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約１０モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約５～１５モル％、１５～２５モル％、２５～４０モル％、または４０～６０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約１モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約２モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約４モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約５モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約６モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約７モル％～約４０モル％である。

【0049】

いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約８モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約９モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約１０モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約１５モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約２０モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約２５モル％～約４０モル％である。いくつかの実施形態において、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質におけるＬ表面タンパク質のパーセンテージは、約３０モル％～約４０モル％である。

【0050】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ表面タンパク質は、内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。出願人らは、驚くべきことに、シスエレメントを除去することにより、ある特定の割合を超えるＬ表面タンパク質（例えば、８モル％超または１０モル％超）を発現させることができることを見出した。本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、内部シスエレメントは、Ｍおよび／またはＳ形態の転写開始のためのプロモーターを含む。したがって、いくつかの実施形態において、Ｌ表面タンパク質は、Ｓタンパク質発現を駆動する内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｌ表面タンパク質は、Ｍタンパク質発現を駆動する内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｌ表面タンパク質は、ＭまたはＳタンパク質発現を駆動する内部シスエレメントを有しない組換え核酸配列によってコードされる。

【0051】

別の態様において、実施形態のいずれか１つのＨＢＶワクチン粒子およびアジュバントを含むＨＢＶワクチンが開示される。免疫応答を刺激および／または増強することができる任意のアジュバントが企図される。アジュバントの非限定的な例は、ミョウバン、トール様受容体およびコロイド金を含む。

【0052】

さらに別の態様において、それを必要とする対象におけるＨＢＶ感染を処置または予防する方法であって、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの有効量のＨＢＶワクチンを対象に投与するステップを含む方法が開示される。対象の非限定的な例は、ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよび他の哺乳動物を含む。

【0053】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、対象はヒトである。

【0054】

さらに別の態様において、Ｌ表面タンパク質をコードする組換え核酸配列が開示され、組換え核酸配列は、内部シスエレメントを有しない。

【0055】

さらに別の態様において、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え核酸配列を含む、Ｌ表面タンパク質を発現するための組換え発現ベクターが開示される。

【0056】

さらに別の態様において、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え発現ベクターで形質転換された細胞が説明される。細胞の非限定的な例は、ＣＨＯおよびＨＥＫ－２９３細胞を含む。

【0057】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、
Ｓ表面タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列を含む第２の組換え発現ベクター、および
Ｍ表面タンパク質をコードする第３の組換え核酸配列を含む第３の組換え発現ベクター
によってさらに形質転換される。

【0058】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、ＨＢＶコア抗原をコードする第４の組換え核酸配列を含む第４の発現ベクターによってさらに形質転換される。本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、１つまたは複数のさらなる組換え発現ベクターによってさらに形質転換される。

【0059】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、昆虫または哺乳動物のタンパク質発現宿主に由来し、例えばＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、大腸菌または真菌に由来する。

【0060】

調製方法

【0061】

さらに別の態様において、ＨＢＶワクチン粒子を調製するための方法であって、
ａ）Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質をそれぞれコードする第１、第２および第３の組換え核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供するステップであって、第１、第２および第３の組換え核酸配列は、内部シスエレメントを有さないステップと；
ｂ）組換え発現ベクターで細胞を形質転換するステップと；
ｃ）細胞がＬ、ＭおよびＳ表面タンパク質を共発現するように培養および選択するステップと
を含む方法が説明される。

【0062】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、Ｌ、Ｍ、およびＳ表面タンパク質のそれぞれは、別個の発現ベクター中にある。

【0063】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、方法は、細胞がＬ、ＭおよびＳ表面タンパク質においてＬ表面タンパク質を少なくとも約１モル％、２モル％、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、８モル％、９モル％、１０モル％、１１モル％、１２モル％、１３モル％、１４モル％、１５モル％、１６モル％、１７モル％、１８モル％、１９モル％、２０モル％、２１モル％、２２モル％、２３モル％、２４モル％、２５モル％、２６モル％、２７モル％、２８モル％、２９モル％、３０モル％、３１モル％、３２モル％、３３モル％、３４モル％、３５モル％、３６モル％、３７モル％、３８モル％、３９モル％、４０モル％、４１モル％、４２モル％、４３モル％、４４モル％、４５モル％、４６モル％、４７モル％、４８モル％、４９モル％もしくは５０モル％、または本明細書に開示される任意の２つの値で画定される範囲内のパーセンテージで発現するように選択するステップをさらに含む。

【0064】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、方法は、細胞がＬ、ＭおよびＳ表面タンパク質においてＬ表面タンパク質を少なくとも約１５モル％、２０モル％、２５モル％、３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％または１００モル％のパーセンテージで発現するように選択するステップをさらに含む。

【0065】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、組換え発現ベクターは、ＨＢＶコア抗原をコードする第４の組換え核酸配列をさらに含み、ステップｃ）は、Ｌ、ＭおよびＳ表面タンパク質ならびにＨＢＶコア抗原を共発現する細胞を培養および選択することを含む。

【0066】

本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、昆虫または哺乳動物のタンパク質発現宿主に由来し、例えばＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。本明細書に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、細胞は、大腸菌または真菌に由来する。

【0067】

医薬組成物

【0068】

本発明はまた、本明細書に記載のＨＢＶワクチン粒子もしくはＨＢＶワクチンまたはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の少なくとも１つと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0069】

「アジュバント」という語句は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の任意のアジュバントを指す。

【0070】

「薬学的に許容される担体」という語句は、本明細書で使用される場合、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料等の薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルであって、１つの器官または身体の一部から別の器官または身体の一部への主題の医薬品の運搬または輸送に関与するものを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容され得る担体として機能し得る材料のいくつかの例は、糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤ワックス；油、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；グリコール、例えばブチレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質を含む。

【0071】

湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびポリエチレンオキシド－ポリブチレンオキシドコポリマーならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤も組成物中に存在し得る。

【0072】

本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣ならびに／または非経口投与に適したものを含む。製剤は、単位剤形で好都合に提供され得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に応じて変動する。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じるＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンの量である。一般に、１００％のうち、この量は、約１％～約９９％、好ましくは約５％～約７０％、最も好ましくは約１０％～約３０％の範囲の活性成分である。

【0073】

これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンを担体および任意選択で１つまたは複数の補助成分と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、本発明のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンを液体担体、または細かく分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて製品を成形することによって調製される。

【0074】

経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（フレーバーベース、通常はスクロースおよびアカシアもしくはトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形態であってもよく、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（ゼラチンおよびグリセリン、もしくはスクロースおよびアカシア等の不活性塩基を使用）として、ならびに／または洗口剤等としてであってもよく、それぞれが活性成分として本発明のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンの所定量を含有する。本発明のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンは、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与することもできる。

【0075】

経口投与用の本発明の固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒等）において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の１種もしくは複数種の薬学的に許容される担体、ならびに／または以下のいずれかと混合される：デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／もしくはケイ酸等の充填剤もしくは増量剤；例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／もしくはアカシア等の結合剤；グリセロール等の保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある特定のシリケート、炭酸ナトリウム、および澱粉グリコレートナトリウム等の崩壊剤；パラフィン等の溶液遅延剤；第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤；例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアレートおよびポリエチレンオキシド－ポリブチレンオキシドコポリマー等の湿潤剤；カオリンおよびベントナイト粘土等の吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物等の滑沢剤；ならびに着色剤。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬組成物はまた緩衝剤も含み得る。同様の種類の固体組成物もまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用され得る。

【0076】

錠剤は、任意選択で１種または複数種の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えばゼラチンもしくはヒドロキシブチルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えばデンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、または分散剤を使用して調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。

【0077】

錠剤、ならびに糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒等の本発明の医薬組成物の他の固体剤形は、任意選択で刻み目が付けられてもよく、または腸溶コーティングおよび薬学的製剤分野で周知の他のコーティング等のコーティングおよびシェルを用いて調製されてもよい。それらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための様々なブトーション（ｂｕｔｏｒｔｉｏｎ）でヒドロキシブチルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用して、その中の活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または使用直前に滅菌水もしくは他の何らかの滅菌注射用媒体に溶解され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。これらの組成物はまた、任意選択で乳白剤を含有してもよく、胃腸管のある特定の部分においてのみ、または優先的に、任意選択で遅延様式で活性成分を放出する組成物であってもよい。その例は包埋組成物であり、ポリマー物質およびワックスを含めて使用することができる。活性成分はまた、必要に応じて、上記の賦形剤の１つまたは複数と共にマイクロカプセル化された形態であってもよい。

【0078】

不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存剤等のアジュバントも含むことができる。

【0079】

懸濁液は、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物として懸濁化剤を含有し得る。

【0080】

直腸投与または膣投与のための本発明の医薬組成物の製剤は、本発明の１つまたは複数のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンを、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチレートを含む１種または複数種の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製することができ、室温では固体であるが体温では液体であるため、直腸または膣腔内で融解し、本発明の活性医薬剤を放出する坐剤として提供することができる。

【0081】

膣投与に適した本発明の製剤は、当技術分野においてアブトリエート（ａｐｂｕｔｒｉａｔｅ）であることが知られているような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤も含む。

【0082】

粉末およびスプレーは、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物等の賦形剤を含有し得る。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびブタン等の慣用的なブテラント（ｂｕｔｅｌｌａｎｔ）をさらに含有し得る。

【0083】

眼科用製剤、眼軟膏、粉末、溶液等も本発明の範囲内であることが企図される。

【0084】

非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、本発明の１つまたは複数のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンを、１種または複数種の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。

【0085】

いくつかの場合において、薬物の効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、一方溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。代替として、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。デポー注射のための１つの戦略は、ポリエチレンオキシド－ポリブチレンオキシドコポリマーの使用を含み、ビヒクルは室温で流動性であり、体温で固化する。

【0086】

注射可能なデポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に主題のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンのマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を含む。デポー注射用製剤はまた、体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することによって調製される。

【0087】

本発明のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンを医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、それらはそれ自体で、または例えば０．１％～９９．５％（より好ましくは０．５％～９０％）の活性成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物として投与され得る。

【0088】

本発明のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンおよび医薬組成物は、併用療法で使用することができ、すなわち、ＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンおよび医薬組成物は、１つまたは複数の他の所望の治療薬または医療処置と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。併用レジメンで使用する治療法（治療薬または手順）の特定の組み合わせは、所望の治療薬および／または手順の適合性ならびに達成される所望の治療効果を考慮に入れる。使用される療法は、同じ障害（例えば、本発明のＨＢＶワクチン粒子もしくはＨＢＶワクチンは、別の抗ＨＢＶ剤と同時に投与されてもよい）に対して所望の効果を達成し得るか、または異なる効果（例えば、任意の有害作用の制御）を達成し得ることも理解されよう。

【0089】

本発明のＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、局所、経口、または他の許容可能な手段によって投与され得る。いくつかの具体的な実施形態において、本明細書に開示されるＨＢＶワクチン粒子またはＨＢＶワクチンは、経鼻投与によって投与される。

【0090】

本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の１つまたは複数で充填された１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。任意選択で、そのような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知が関連付けられてもよく、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。

【0091】

均等物

【0092】

以下の代表的な実施例は、本発明の説明を補助することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、またそのように解釈されるべきではない。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な修正およびその多くのさらなる実施形態は、以下の実施例ならびに本明細書に引用された科学文献および特許文献への参照を含むこの文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。これらの引用された参考文献の内容は、最新技術を例示するのを補助するために参照により本明細書に組み込まれることがさらに理解されるべきである。以下の実施例は、その様々な実施形態およびその均等物において本発明の実践に適合させることができる重要な追加の情報、例示、および指針を含む。

【実施例】

【0093】

結果

【0094】

ＨＢｓＡｇ粒子を発現させるために、Ｂ型肝炎ウイルス分離株ＧＺ－ＤＹＨ（ａｄｗ２サブタイプ、遺伝子型Ｂ２、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＤＱ４４８６１９）を、遺伝子発現について同定した。タンパク質配列に基づいて、本発明者らは哺乳動物タンパク質発現のためにコードＤＮＡの配列を最適化した。ＳおよびＭタンパク質発現を駆動する内部シスエレメントを除去した。Ｌ、ＭおよびＳタンパク質のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を合成し、別々の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。

【0095】

Ｌタンパク質の野生型コード配列は、小胞体におけるＬの蓄積に応答する内部シスエレメントを含有し、このシスエレメントは、Ｌ、ＭおよびＳタンパク質の発現の厳密な調節に関与する。この制御機構は表面タンパク質の差次的発現をもたらし、Ｓはそれらの中で最も豊富であり、一方ＭおよびＬはそれぞれ約５～１５モル％および１～２モル％のはるかに低いレベルで発現される。Ｌタンパク質の発現率を別々の発現ベクターで分析している報告はない。Ｌ形態単独の発現は、従来報告されている４２ＤＫａ Ｌタンパク質よりも大きい分泌形態をもたらした（レーン２、図１）。Ｌ形態タンパク質の分泌を促進するために、分泌シグナルをＬタンパク質のＮ末端に付加し、分泌型（レーン３、図１）は天然タンパク質と同様のグリコシル化パターンを示し、Ｌタンパク質のみがゴルジ装置で複雑なグリコシル化を受けたことを示した。しかしながら、単独で発現したＬは馴化培地中にほとんど量を示さず、電子顕微鏡観察下では粒子を形成しなかった（図示せず）。

【0096】

Ｌ形態の発現は、Ｓ形態およびＭ形態の発現に依存するか、またはＳ形態もしくはＭ形態の存在下でのみ、Ｌ形態が分泌されることが見出された。また、Ｓ形態の発現は、Ｌ形態の存在により阻害される（図２、図３）。Ｌ形態分泌のＳ形態およびＭ形態への依存性は、ＬがＳまたはＭの折り畳みによって駆動された構造に集合することを示唆したが、正確な機構は理解されていない。しかしながら、この特徴は、ＳおよびＬ形態タンパク質を蓄積する発現クローンを同定するために利用することができる。

【0097】

３つ全ての形態を含むＨＢｓＡｇ粒子を製造するための以前の戦略は、ＳおよびＭの発現を駆動するためにＨＢｓＡｇコード配列内のシスエレメントを利用した。これらのシスエレメントのプロモーター強度が定義されていることを考えると、さまざまな比率でＬ、Ｍ、およびＳ形態を発現し得るクローンをスクリーニングすることはできない。発現ベクターの組み合わせを使用することによって生成されたＨＢＶ粒子は、Ｌ、Ｍ、およびＳの可変の組成を有し、Ｌ形態ＨＢＶ粒子を様々な比率で安定に発現し得るクローンを選択する可能性を開くことが見出された。

【0098】

ＨＢＶ粒子を陽性発現した２９３Ｆ由来の数百のクローンについてスクリーニングを行った。陽性クローンは、Ｓにおける三次元エピトープを認識する抗体に基づいて選択された。これらのクローンのほとんどはＳタンパク質のみを発現した。個々のクローンを、抗Ｌ形態抗体、続いて抗Ｓ抗体を使用するウエスタンブロッティングによってスクリーニングした。クローン１６およびクローン５１は、約２６ＫＤａでＳ形態の発現を示し、ＰｒｅＳ２抗体のエピトープを含む３０～３８ＫＤａおよび５１～６０ＫＤａの範囲のさらなるタンパク質の発現を示した（図４Ａ）。グリコシル化の不均一性は、ＰｒｅＳ２エピトープを含有するタンパク質がゴルジ装置において複雑なグリコシル化を受けたことを示唆していた。クローン１２およびクローンＡ４は、抗ＰｒｅＳ２抗体によって認識された４２ＫＤａおよび３９ＫＤａのタンパク質に加えて、２６ＫＤａおよび２２ＫＤａのＳ形態タンパク質に関する強いシグナルを含んでいた（図５）。また、ＣＨＯ発現宿主を使用して同じ発現戦略を適用した。同様に、ＣＨＯ細胞に由来するクローン７Ｃ８、１０Ｅ３は、２６ＫＤａおよび２２ＫＤａのＳタンパク質（図４Ｂ、右パネル）、ならびに抗ＰｒｅＳ２抗体によって認識される４２ＫＤａおよび３９ＫＤａのタンパク質（図４Ｂ、左パネル）を発現した。ＣＨＯ発現系では、上位４２ＫＤａのＬタンパク質も抗Ｓポリクローナル抗体によって認識される。両方の発現系において、Ｌ形態に対応する４２ＫＤａおよび３９ＫＤａのタンパク質バンドは、別個のより鋭いバンドを示し、これらのタンパク質がゴルジ装置において複雑なグリコシル化を受けなかったことを示唆していた。１つの追加のクローン４３も、クローンＡ４と同様に、４２ＫＤａおよび３９ＫＤａのタンパク質バンドの検出を示した（図６）。要約すると、クローン１６およびクローン５１は原形質膜での粒子の形成を表し得るが、クローン１２およびＡ４ ＨＢｓＡｇ粒子の分泌は、小胞体からの出芽を伴う固有の機構を示した（Ｐａｔｉｅｎｔ，Ｒ．，Ｈｏｕｒｉｏｕｘ，Ｃ．，Ｓｉｚａｒｅｔ，Ｐ．Ｙ．，Ｔｒａｓｓａｒｄ，Ｓ．，Ｓｕｒｅａｕ，Ｃ．ａｎｄ Ｒｏｉｎｇｅａｒｄ，Ｐ．，２００７．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１（８），ｐｐ．３８４２－３８５１）。クローン１６および５１の両方が、抗ＰｒｅＳ１抗体として認識された３０～３８ＫＤａの範囲内の有意な量のタンパク質を含んでおり（図４Ａ）、Ｌ形態タンパク質が有意な量で存在し得ることを示唆した。精製されたクローン５１粒子は、より多くの３０～３８ＫＤａタンパク質を含んでいた（図７）。

【0099】

まとめると、２９３ＦおよびＣＨＯ発現系の両方における組み合わせ発現戦略は、以前には特性評価されておらず、所望のＬ、ＭおよびＳ比を有するＨＢｓＡｇ粒子の製造に使用することができるＨＢｓＡｇ粒子を生成した。有意な量のＬおよびＳ発現を示したクローンを、スケールアップおよびさらなる特性評価に選択した。

【0100】

クローン１６、５１、Ａ４、製造スケールアップ、精製およびタンパク質特性評価

【0101】

安定な細胞株１６、５１およびＡ４は、Ｓ形態タンパク質を発現し、さらに、ＰｒｅＳ２特異的抗体Ｓ２６によって検出されたＬ形態タンパク質を発現した。細胞を、振盪フラスコ培養物中の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で増殖させた。７２時間または９６時間の増殖後、馴化培地を回収し、細胞残屑を遠心分離および濾過によって除去した。ウイルス様粒子を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ４００樹脂、またはヒドロキシアパタイト吸着とそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを使用する２回の連続サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。

【0102】

クローンＡ４精製タンパク質粒子は、それぞれ３８ＫＤａおよび４２ＫＤａの２つのＬタンパク質を含んでいた（図８、図９）。ＰＮＧａｓｅ処理すると、４２ＫＤａタンパク質は３８ＫＤａに減少し（図１１）、４２ＫＤａが３８ＫＤａのグリコシル化形態であることが確認された。Ｌタンパク質の同一性は、ＰｒｅＳ１抗体ＡＰ１に対して特異的に産生された抗体によって（図１０）、およびペプチド質量分析によって（表１）検証された。さらに、２７および２４ＫＤａタンパク質によって表されるように、２つのＳタンパク質を発現させた（図１０）。両方のＳタンパク質を、Ｎ末端配列決定（図示せず）およびペプチド質量分析（表１）によって検証した。クローン５１とは異なり、Ａ４Ｌタンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて別個のバンドとして移動し、タンパク質グリコシル化がゴルジ装置においてさらに修飾されず、小胞体において生じたインビボ粒子集合を模倣したことを示唆していた。

【0103】

クローン５１精製タンパク質粒子は、２８ＫＤａおよび３８ＫＤａの分子量マーカーの間にＬおよびＭタンパク質を含んでいた。ＰｒｅＳ１特異的抗体ＡＰ１によるこの範囲内のタンパク質の検出（図１０）は、この範囲内のタンパク質混合物の少なくとも一部が、予想よりも小さい分子量ではあるが、Ｌタンパク質であることを示唆していた。ＰＮＧａｓｅ処理すると、Ｌ／Ｍタンパク質混合物は、２８ＫＤａの分子量マーカーで別個のバンドに減少した。さらに、質量分析によるペプチドマッピングは、この範囲のタンパク質混合物の一部がＰｒｅＳ２配列を含むことを示した（表１）。クローン１６およびクローン５１からの精製タンパク質は粒子を形成した（図１２、図１３）が、粒子のＬおよびＭタンパク質を分解するためにはより詳細な分析が必要である。

【0104】

クローンＡ４および５１の両方が、２７ＫＤａおよび２４ＫＤａのＳタンパク質を含んでいた（図１０）。ＰＮＧａｓｅ処理により２７ＫＤａのＳタンパク質バンドが２４ＫＤａに減少し、２７ＫＤａが２４ＫＤａのＳタンパク質のグリコシル化形態であることが確認された（図１１）。

【0105】

ＳＤＳ ＰＡＧＥとそれに続くクーマシー染色（図１０）によって示されるように、Ａ４および５１の両方の精製ＨＢｓＡｇ粒子中のＬタンパク質が、総タンパク質の１０％を超えた。

【0106】

【表1】

【0107】

クローン１６および５１生成タンパク質の免疫化

【0108】

それぞれクローン１６およびクローン５１に由来する精製ＬＭＳウイルス様粒子を使用して、それぞれ２匹のマウスを免疫化した。酵母由来ＨＢｓＡｇを参照として２匹のマウスに注射して使用した。全ての実験について、マウス系統Ｂａｌｂ Ｃを使用した。１４日後、全てのマウスにブースト注射を行った。最初の免疫化の３５日後にマウスから血液を採取し、ウイルス様粒子に対する抗体応答の力価を連続希釈によって決定した（図１４）。バックグラウンドと比較して有意な応答を示した最終希釈液を力価として決定した。酵母由来ＨＢｓＡｇの抗体力価は２ｅ６であり、ＬＭＳ ＨＢｓＡｇの抗体力価は８ｅ６であった（図１４、図１５）。要約すると、クローン１６およびクローン５１ ＨＢｓＡｇ粒子を使用した免疫化は、酵母ベースの抗原を使用して得られたものと比較して約４倍高い抗体力価を生じた（図１５）。ＨＢｓＡｇタンパク質に対する免疫応答を特性評価するために、精製ＨＢｓＡｇタンパク質、酵母由来Ｓ抗原、および大腸菌由来ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２ペプチド配列を使用した。これらの抗原をポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングし、血清の連続希釈液をインキュベートした後、結合したマウスＩｇＧ１抗体を検出した。最も強い免疫応答はＳ抗原に対するものであり、続いてＰｒｅＳ２抗原およびＰｒｅＳ１抗原に対するものであった（図１６）。

【0109】

どのエピトープがマウスにおける免疫応答の誘発に関与しているかを理解するために、免疫化マウスからの脾臓細胞を使用してハイブリドーマを生成した。合計１０２個のハイブリドーマが精製ＨＢｓＡｇ粒子に対して反応することが分かった（図１７）。ハイブリドーマを分類するために様々な抗原を使用して、本発明者らは、３５個のハイブリドーマからの抗体がＳ抗原に対して反応し、２６個および１０個のハイブリドーマがそれぞれＰｒｅＳ２およびＰｒｅＳ１ペプチドに対して反応することを見出した（図１７）。さらに、３１個のハイブリドーマは、精製ＨＢｓＡｇ粒子に対して反応性であったが、Ｓ、またはＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２配列に由来する線状ペプチド抗原に対して反応性ではなく、これらの抗体が精製ＨＢｓＡｇ抗原のＰｒｅＳ領域に存在する非線状エピトープを認識し得ることを示唆していた。しかしながら、血清中の抗体力価を分析するために使用されるＰｒｅＳ２およびＰｒｅＳ１ペプチド抗原は、二次または三次構造を欠き、ＰｒｅＳ領域の三次元エピトープに対する応答を詳細に説明することができなかった。

【0110】

材料および方法

【0111】

クローニングおよび細胞株選択

【0112】

ＨＢＶ表面抗原のコード配列は、Ｂ型肝炎ウイルス分離株ＧＺ－ＤＹＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＤＱ４４８６１９、血清型ａｄｗ２）に基づいた。タンパク質発現のために、オープンリーディングフレームを哺乳動物発現系のためにコドン最適化した。ＭおよびＳ形態の転写開始のためのプロモーター等の内部シスエレメントは、サイレント置換によって無効にされた。Ｌ、ＭおよびＳ形態をコードする遺伝子をＧｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）で別々に合成し、ＤＮＡ断片をそれぞれ発現ベクターにサブクローニングした。発現プラスミド構築物を、予め無血清増殖に適合させたＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。安定な発現細胞株を、フローサイトメーターを使用して９６ウェル培養プレートでの単一細胞クローニングによって選択した。約１０％の単一細胞が細胞株を生じ、発現クローンを生成する。発現クローンを、ＥＬＩＳＡスクリーニング、続いてＰｒｅＳ２（ＮｏｖｕｓＢｉｏ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）、ＰｒｅＳ１（ＰｒｏｓｐｅｃＢｉｏ、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、およびＨＢｓＡｇ Ｓタンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）に特異的な抗体を使用したウエスタンブロット分析に基づいて選択した。

【0113】

ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を全ての細胞株クローニングおよびスケールアップ手順に使用した。組換えＨＢＶ表面抗原のウエスタンブロット分析を、抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体Ｓ２６、抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体ＡＰ１、ＡＰ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、およびウサギ抗ＨＢｓＡｇ Ｓポリクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡキットは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）から入手した。

【0114】

ＨＢｓＡｇ粒子の生成

【0115】

ＨＢｓＡｇ粒子の小規模生成には振盪フラスコ培養を使用した。安定にトランスフェクトされた細胞株の馴化培地を回収し、タンジェンシャルフロー濾過および濃縮、ヒドロキシアパタイト吸着サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに陰イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによってＨＢＶウイルス様粒子を精製した。精製された粒子の形態を、電子走査顕微鏡を使用して可視化した。精製されたＨＢｓＡｇ粒子のタンパク質組成物を、銀染色およびウエスタンブロット、またはクーマシーブルー染色に続くトリプシン消化およびペプチド質量分析によって分析した。タンパク質濃度をＢＣＡ法によって決定した。

【0116】

製造業者の仕様（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）に従って、ＰＮＧａｓｅ処理によるＨＢＶ表面抗原の脱グリコシル化を行った。

【0117】

Ｎ末端配列決定のために、タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロッティング手順によってＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜をクーマシーブルーで染色し、タンパク質バンドをスライスし、エドマン分解に供し、続いてＨＰＬＣ分析に供した。

【0118】

Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ Ｃ４カラム（１０ｕｍ、４．６×１５０ｍｍ）を使用して逆相ＨＰＬＣを行う。移動相は、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ ２０％～８０％勾配、流速１ｍｌ／分である。

【0119】

質量分析によるペプチドマッピング

【0120】

精製したタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、続いてクーマシーブルー染色を行った。タンパク質バンドをスライスし、ゲルスライスをゲル内トリプシン消化、続いてＬＣ－ＭＳ分析に使用した。ペプチド質量をデータベース中の既知のペプチド配列と比較し、同定を質量比較によって確認した。質量分析によって同定されたペプチドを表１に列挙する。

【0121】

マウスの免疫化および抗体応答の決定

【0122】

Ｂａｌｂ Ｃ系統のマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスを群あたり２匹に群分けした。１０μｇの酵母由来ＨＢｓＡｇ、またはクローン＃１６もしくは＃５１由来の１０μｇの精製タンパク質を、アルミニウムアジュバントと混合した後に注射し、続いて１４日後にブースト注射した。最初の免疫化の３５日後にマウスから血液を採取し、ウイルス様粒子に対する抗体応答の力価を連続希釈によって決定した（図１６）。抗体力価は、酵母由来Ｓ抗原、ＰｒｅＳ１ペプチド、ＰｒｅＳ２ペプチド、またはＨｉ－Ｂｉｎｄｉｎｇ ９６ウェルアッセイプレートにコーティングした精製ＬＭＳ ＨＢｓＡｇを使用することによって決定した。スチューデントｔ検定を使用して、抗体力価の有意性を決定した。

【0123】

ハイブリドーマおよびエピトープビニング

【0124】

免疫化マウスの脾臓を最終注射の１日後に取り出した。脾臓細胞を単離し、標準的な手順に従ってマウス骨髄腫細胞に融合した。ハイブリドーマクローンを、ＰｒｅＳ領域を含む精製ＨＢｓＡｇ粒子に対する反応性について試験した（図１７）。エピトープの領域を決定するために、酵母ベースのＨＢｓＡｇ Ｓ、ＰｒｅＳ１ペプチドおよびＰｒｅＳ２ペプチドをポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングした。ハイブリドーマの馴化培地を結合抗原と共にインキュベートし、続いて抗マウスＩｇＧ検出を行った。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【国際調査報告】