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特表2022-514088ハイブリッドプロモーターおよび療法における使用、特にＩＩ型コラーゲン異常症を治療するための使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(54)【発明の名称】ハイブリッドプロモーターおよび療法における使用、特にＩＩ型コラーゲン異常症を治療するための使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220202BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220202BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220202BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220202BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20220202BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220202BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220202BHJP
A61K 38/39 20060101ALI20220202BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220202BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20220202BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/12
A61K35/76
A61P19/00
A61P21/00
A61P43/00
A61K38/39
A61K48/00
C07K14/78
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021535582
(86)(22)【出願日】2019-12-18
(85)【翻訳文提出日】2021-07-19
(86)【国際出願番号】 EP2019086020
(87)【国際公開番号】W WO2020127533
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】18306740.4
(32)【優先日】2018-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】592236234
【氏名又は名称】アンスティテュー・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル・（イ・エヌ・エス・ウ・エール・エム）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ （Ｉ．Ｎ．Ｓ．Ｅ．Ｒ．Ｍ．）
(71)【出願人】
【識別番号】592236245
【氏名又は名称】サントル・ナシオナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(71)【出願人】
【識別番号】520100435
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・コート・ダジュール
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃｏｔｅ ｄ’Ａｚｕｒ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】グーズ，エルヴィール
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC50
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZC411
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZC41
4H045AA30
4H045BA10
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターのフラグメントおよびｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントを含む、特定の設計を有するハイブリッドプロモーターに関し、これは、療法、特に遺伝子療法において興味深いものであり得る。注目すべきことに、それらは、目的の核酸配列を発現するためのベクターに導入され得る。それらは、ＩＩ型コラーゲン異常症のような骨格異形成、または関節疾患の治療に特に有用であり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１の核酸配列を含むプロモーターであって、前記配列番号１の配列の位置Ａから始まり位置Ｂで終わるフラグメントが、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、位置Ａは配列番号１のヌクレオチド５２１から５５５の間に含まれ、位置Ｂは配列番号１のヌクレオチド５６０から５８７の間に含まれており、
配列番号１のヌクレオチド５９８から６０７からなるフラグメントは、存在していてもよく、または、存在していなくてもよい、プロモーター。
【請求項2】
前記少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントが配列番号２、３および４の配列から選択される、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項3】
配列番号１の配列のヌクレオチド５４１から始まり、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントが、配列番号２の配列の少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在しない、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロモーター。
【請求項4】
配列番号１の配列のヌクレオチド５４１から始まり、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントが、配列番号２の配列の少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在する、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロモーター。
【請求項5】
配列番号１の配列のヌクレオチド５５５から始まり、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントが、配列番号３の配列の少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在しない、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロモーター。
【請求項6】
配列番号１の配列のヌクレオチド５５５から始まり、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントが、配列番号３の配列の少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在する、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロモーター。
【請求項7】
配列番号１の配列のヌクレオチド５２１から始まり、ヌクレオチド５８７で終わるフラグメントが、配列番号４の配列の少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在しない、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロモーター。
【請求項8】
配列番号１の配列のヌクレオチド５２１から始まり、ヌクレオチド５８７で終わるフラグメントが、配列番号４の配列の少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在する、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロモーター。
【請求項9】
配列番号１７もしくは配列番号２９の核酸配列を含む、または配列番号５の核酸配列を含むプロモーターであって、配列番号５の前記配列のヌクレオチド８９と９０との間に配列番号７の配列が挿入されており、配列番号５の前記配列のヌクレオチド１０４から始まり、ヌクレオチド１５３で終わるフラグメントは、配列番号７によって置換されており、任意に、配列番号８の配列は、配列番号５のヌクレオチド２１７と２１８との間に挿入されているプロモーター。
【請求項10】
請求項１から９のいずれか一項に記載のプロモーターを含むベクター。
【請求項11】
前記プロモーターが、コラーゲン鎖、好ましくはＣＯＬ２Ａ１をコードする遺伝子またはそのフラグメントの発現を制御する、請求項１０に記載のベクター。
【請求項12】
治療に使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載のプロモーター、または請求項１０もしくは１１に記載のベクター。
【請求項13】
遺伝子治療に使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載のプロモーター、または請求項１０もしくは１１に記載のベクター。
【請求項14】
骨格異形成または筋骨格系の疾患を治療するための使用のための、請求項１から９のいずれか一項に記載のプロモーター、または請求項１０もしくは１１に記載のベクター。
【請求項15】
ＩＩ型コラーゲン異常症を治療するための使用のための、請求項１から９および１４のいずれか一項に記載のプロモーター、または請求項１０もしくは１１もしくは１４に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ハイブリッドプロモーターおよび療法における、特に遺伝子療法における、より具体的にはＩＩ型コラーゲン異常症を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＩＩ型コラーゲン異常症は、ＩＩ型コラーゲン遺伝子（ＣＯＬ２Ａ１）の突然変異に起因する骨格異形成の一種である。ＩＩ型コラーゲン異常症には様々なものがある（１～４）。軟骨低発生症と軟骨無発生症は致死的な症状を呈し、重度に低骨化した骨格を特徴とする。先天性脊椎骨端異形成症（ＳＥＤＣ）、ニースト異形成症またはスティックラー症候群などの他の疾患は、新生児期または小児期にあらわれる。
【0003】
先天性脊椎骨端異形成症は、最も厳しい非致死性のＩＩ型コラーゲン異常症である（５）。ＳＥＤＣの推定有病率は出生の１／１００，０００であり、常染色体優性遺伝である（６、７）。それは、ＩＩ型コラーゲン組織の発達の異常を特徴とし、非常に短い体幹を伴う低身長、骨端の異常、椎体の扁平化、口唇裂、網膜変性、および近視などの他の眼の異常をもたらす。難聴も報告されている。寿命を脅かす頸部の不安定性の危険が高い。
【0004】
ＣＯＬ２Ａ１遺伝子は、関節軟骨、眼の角膜および硝子体、内耳および脊椎の髄核を含む限られた数の組織で特異的に転写される（８）。それはプロコラーゲンＩＩ型のα１鎖をコードする。三つのα１鎖は三重らせん構造上に折りたたまれてプロコラーゲンホモ三量体を形成し、Ｇｌｙ‐Ｘ‐Ｙトリプレットリピートを特徴とする。プロコラーゲン鎖は、まずＮ－およびＣ－末端部位を含むプロペプチドとして合成される。細胞外マトリックスへの分泌後、末端部分は切断され、コラーゲン原線維を形成できる成熟したＩＩ型コラーゲンを形成する。ＩＩ型コラーゲンは硝子軟骨の主要な線維タンパク質であり、骨の伸長のための構造計画を提供する軟骨細胞の特異的配置を促進する（９）。ＣＯＬ２Ａ１遺伝子のいくつかの突然変異がＳＥＤＣ患者で同定されており、臨床的特徴の直接の原因となっている。最も一般的な突然変異は、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙトリプレットにおけるシステインまたはセリン中のグリシンの置換であり、その結果、軟骨マトリックスの早期分解をもたらす原線維の欠損または異常をもたらす（１０）。コラーゲンの複雑な成熟に必要な他の酵素はすべて正常であることに気づくことが重要である。
【0005】
ＩＩ型コラーゲン異常症の治療法は現在のところ存在せず、現在のケアは侵襲的手術を含む症状の管理と治療から成り立っている（１１）。
【0006】
該病理のメカニズムをよりよく理解するために、一部の著者は動物モデルまたは細胞モデルの開発を試みた。Ｏｋａｄａらは、軟骨無発生症患者由来の患者線維芽細胞を誘導された軟骨細胞に変換したり、ｉＰＳ細胞を作製したりすることで、新たな細胞モデルを作成している（１２）。本研究では、小胞体（ＥＲ）ストレスを減少させるか、ＢＭＰシグナル伝達などの他の軟骨シグナル伝達経路を増強することを試み、ある程度の潜在的利益を示したが、最も重要なことは、病態生理学的研究および薬物スクリーニングに有用となる細胞モデルを開発したことである。
【0007】
いずれにせよ、ＩＩ型コラーゲン異常症の治癒的治療に対する深刻で未充足なニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【0008】
発明者らは、特にＳＥＤＣにおいて、骨成長を回復するための遺伝子治療アプローチを驚くべきことに開発した。これは、正常なコラーゲンＩＩ型を有する改変された成長板軟骨を提供することにより、骨成長を可能にする軟骨マトリックスの再編成を可能にすることを目的とする。具体的には、この遺伝子治療アプローチは、ＩＩ型コラーゲンを自然に発現する組織に発現を制限するという点で特異的でありながら、骨細胞においてＩＩ型コラーゲンを有意に発現することができるハイブリッドプロモーターを設計したおかげで可能となる。
【0009】
したがって、第１の態様において、本発明は、配列番号１の核酸配列を含むプロモーターに関し、配列番号１の該配列の位置Ａから始まり位置Ｂで終わるフラグメントは、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、ここで、位置Ａは、配列番号１のヌクレオチド５２１から５５５の間に含まれ、位置Ｂは、配列番号１のヌクレオチド５６０から５８７の間に含まれ、ここで、配列番号１のヌクレオチド５９８から６０７からなるフラグメントは、存在していても存在していなくてもよい。
【0010】
このようなプロモーターは、ハイブリッドプロモーターであり、本発明に係るプロモーターである。
【0011】
第２の態様において、本発明は、本発明によるプロモーターを含むベクターに関する。
【0012】
第３の態様において、本発明は、療法における、本発明によるプロモーターまたは上記のベクターの使用に関する。特に、該使用は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療またはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のような遺伝子治療のためのものである。
【0013】
第４の態様において、本発明は、骨格異形成または筋骨格系の疾患を治療するための、本発明によるプロモーター、または上記のベクターの使用に関する。
【0014】
第５の態様において、本発明は、ＩＩ型コラーゲン異常症を治療するための、本発明によるプロモーターまたは上記のベクターの使用に関する。
【0015】
発明の詳細な説明
実施例に示されるように、本発明者らは、特に、ＳＥＤＣなどのＩＩ型コラーゲン異常症の場合に、骨成長を回復するための遺伝子治療を驚くべきことに開発した。このようなアプローチは非常に驚くべきことである。なぜなら、ＩＩ型コラーゲンの錯体合成は疾患の部位（すなわち軟骨細胞）で行われなければならないからである。一方、ウイルスは硝子軟骨マトリックスへの浸透が非常に限られていることが知られている。
実施例に示されるように、本発明者らは、特に、ＳＥＤＣなどのＩＩ型コラーゲン異常症の場合に、骨成長を回復するための遺伝子治療を驚くべきことに開発した。このようなアプローチは非常に驚くべきことである。なぜなら、ＩＩ型コラーゲンの錯体合成は疾患の部位（すなわち軟骨細胞）で行われなければならないからである。一方、ウイルスは硝子軟骨マトリックスへの浸透が非常に限られていることが知られている。
【0016】
驚くべきことに、本発明者らは、ＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によりコードされる）のプロ－α１（ＩＩ）鎖の発現を制御するベクターに組み込まれた特異的ハイブリッドプロモーターを調製することに成功し、該ベクターは、成長板に浸透することができる。これは予想されなかった：硝子軟骨と成長軟骨は２つの分離した異なる構造であり、ハイブリッドプロモーターを含むベクターは成長板に浸透することができるが、硝子軟骨に浸透することはできない。
【0017】
さらに、細胞内に注入されると、該ベクターは、Ｂリンパ球のような他の細胞と比較して、軟骨細胞によるＩＩ型コラーゲンの特異的発現を誘導し、したがって、それは組織特異的である（図７に示されるように）。さらに、該発現は軟骨細胞において高い。
【0018】
ＩＩ型コラーゲン異常症のマウスモデルに該ベクターをインビボ注射した後、生存の有意な増加が観察される。この生存率の増加は、治療後のリブケージ容積および大後頭孔面積の回復、並びに頭蓋骨の位置の修正と関連している。さらに、身体および長骨の成長増加が観察される。このように、開発されたベクターは、療法、特に遺伝子療法において有用な有望なツールを構成する。実際、該開発されたベクターは、長さの増加、長骨の増加、リブケージ体積の増加、大孔面積の増加、頸椎の位置の修正、および／または長骨の成長板の構造の再編成に有用であり得る。
【0019】
最後に、本発明者らは、ＳＥＤＣ突然変異を有する患者から多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導し、ＣＯＬ２Ａ１の喪失が、対照細胞と比較して、Ｓｅｄｃ ｉＰＳＣにおけるＭＳＣの特異的な細胞表面マーカーの発現の減少と関連して、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）分化を損なうことを実証することができた。本発明による、水素化プロモーターおよびＣＯＬ２Ａ１遺伝子を含むベクターでの治療は、対照細胞と同様のＭＳＣマーカー発現レベルを回復することができた。治療細胞のわずか１０％の存在は、適切な間葉分化を回復するのに十分であった。
【0020】
したがって、第一の態様では、本発明は、配列番号１の核酸配列を含むプロモーターに関し、配列番号１の該配列の位置Ａから始まり位置Ｂで終わるフラグメントは、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、ここで、位置Ａは、配列番号１のヌクレオチド５２１から５５５の間に含まれ、位置Ｂは、配列番号１のヌクレオチド５６０から５８７の間に含まれ、ここで、配列番号１のヌクレオチド５９８から６０７からなるフラグメントは、存在していても存在していなくてもよい。
【0021】
もちろん、本発明のプロモーターは配列番号１とは異なる。
【0022】
配列番号１は、ヒトＣＯＬ２Ａ１遺伝子（ｈＣＯＬ２Ａ１）のプロモーターの全配列である。
【0023】
ＣＯＬ２Ａ１は、ＩＩ型プロコラーゲンのα１鎖（ＩＩ型コラーゲンのプロ－α１（ＩＩ）鎖とも呼ばれる）をコードする遺伝子である。プロコラーゲンＩＩ型タンパク質の該ヒトα１鎖の配列は、受託番号Ｐ０２４５８の下でユニプロットに見出され得る。ＩＩ型コラーゲンを構築するために、３つのプロ－α１（ＩＩ）鎖が一緒にねじれ、三本鎖のロープ様プロコラーゲン分子を形成する。次に、プロコラーゲン分子は細胞内の酵素によって処理される。いったん処理されると、分子は細胞を離れ、細胞の周りの空間で互いに連結（架橋）する長くて薄い原線維になる。架橋は非常に強く成熟したＩＩ型コラーゲン線維をもたらす。
【0024】
「プロモーター」という用語は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（またはタンパク質コード領域）の翻訳開始コドンの上流または５’に位置し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび他のタンパク質（トランス作用性転写因子）の認識および結合に関与して転写を開始する核酸配列を指す。「ハイブリッドプロモーター」は、宿主細胞、特にヒト細胞などの哺乳動物細胞において機能する非天然プロモーターである。実際、本発明のハイブリッドプロモーターは、ｈＣＯＬ２Ａ１遺伝子のプロモーターの配列の一部を含むが、ｈＥＦ１αプロモーターの少なくともＴＡＴＡボックスも含む。
【0025】
本出願において列挙される異なる配列は、以下の通りである：
【表1】
【0026】
図４に示されるように、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターは、異なるエレメントを含み、これは、
－ＴＡＴＡボックス、
－ＳＰ１結合部位（Ｓ）、
－エンハンサーコアエレメント（Ｅ）、
－ピリミジンに富む配列（Ｐ）、
－軟骨に特異的なＡＰ２転写因子の固定に相当するＡＰ－２ε部位、
－Ｎ１配列。これらの配列は、軟骨細胞の核タンパク質に結合するシス調節エレメント（ＣＲＥ）である。これらのタンパク質は抑制因子である。天然のｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターには３つのＮ１配列がある。２つのＮ１配列はＡＰ－２ε部位を構成しており、最後のＮ１配列は３’にある。
－ＴＡＴＡボックス、
－ＳＰ１結合部位（Ｓ）、
－エンハンサーコアエレメント（Ｅ）、
－ピリミジンに富む配列（Ｐ）、
－軟骨に特異的なＡＰ２転写因子の固定に相当するＡＰ－２ε部位、
－Ｎ１配列。これらの配列は、軟骨細胞の核タンパク質に結合するシス調節エレメント（ＣＲＥ）である。これらのタンパク質は抑制因子である。天然のｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターには３つのＮ１配列がある。２つのＮ１配列はＡＰ－２ε部位を構成しており、最後のＮ１配列は３’にある。
【0027】
ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターのコア配列は配列番号６に対応する。ピリミジンに富む配列Ｐ、４つのＳＰ１結合部位（ＳＰ１）、２つのエンハンサーコアエレメント（Ｅ）、および２つのＮ１配列の中間にあるＡＰ－２ε部位を含む。該コア配列は、配列番号１のヌクレオチド２２６～５２０に対応する。
【0028】
ヌクレオチド１～５２０は、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの上流配列（５’）およびコア配列に対応する。
【0029】
配列番号１のヌクレオチド５２１～５５５は、３’における最後のエンハンサーコアエレメント（Ｅ）とＴＡＴＡボックスとの間にあるｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの配列に対応する。
【0030】
配列番号１のヌクレオチド５５６～５６０は、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーター（ＴＡＴＡＡ）のＴＡＴＡボックスに対応する。
【0031】
配列番号１のヌクレオチド５６１～５８７は、ＴＡＴＡボックスの下流側（３’内）および最後のＮ１配列の上流のｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの配列に対応する。
【0032】
配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７は、配列番号８の配列に対応し、すなわち配列番号１の３’における最後のＮ１配列を含む。
【0033】
配列番号５は、ヒトＥＦ１α遺伝子（ｈＥＦ１α）のプロモーターの全配列である。
【0034】
ＥＦ１αは、普遍的に発現する真核生物翻訳伸長因子－１α１をコードする遺伝子である。そのプロモーターは強力な正プロモーターである。
【0035】
図３に示すように、ｈＥＦ１αプロモーターは、以下を含む：
－ＴＡＴＡボックス（それは配列番号３である）、および
－ＥＦ１α発現を調節することが知られているＥＦＰ１およびＥＦＰ２エレメント（それぞれ配列番号９および１０）。
－ＴＡＴＡボックス（それは配列番号３である）、および
－ＥＦ１α発現を調節することが知られているＥＦＰ１およびＥＦＰ２エレメント（それぞれ配列番号９および１０）。
【0036】
図９に示されるように、本発明のハイブリッドプロモーターは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの核酸配列（配列番号１）を含み、ここで、そのフラグメントは、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されている。
【0037】
配列番号１から取られるｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターのフラグメントは、配列番号１におけるその位置（すなわち、位置ＡとＢの間）によって定義される。位置Ａから始まり、位置Ｂで終わる。したがって、もちろん、位置ＡおよびＢはフラグメントに含まれる。位置Ａは配列番号１のヌクレオチド５２１と５５５の間に含まれ、位置Ｂは配列番号１のヌクレオチド５６０と５８７の間に含まれる。
【0038】
好ましくは、位置Ａは配列番号１のヌクレオチド５２１、５４１または５５５にあり、位置Ｂは配列番号１のヌクレオチド５６０または５８７にある。
【0039】
換言すれば、本発明のハイブリッドプロモーターは、フラグメントＡ－Ｂが除去され、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換された配列番号１を含む。
【0040】
さらに、本発明のハイブリッドプロモーターにおいて、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在していても、存在していなくてもよい。上に示したように、該フラグメントは配列番号８であり、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの３’におけるＮ１配列を含む配列に対応する。
【0041】
配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなる該フラグメントが存在する場合、対応するプロモーターは、本出願においてバージョン「ｂ」と呼ばれる。
【0042】
配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなる該フラグメントが存在しない場合、対応するプロモーターは、本出願においてバージョン「ａ」と呼ばれる。
【0043】
本発明の実施形態によれば、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントは、以下から選択される：
－配列番号５のヌクレオチド１０４～１８０からなるフラグメント；
－配列番号５のヌクレオチド１７４～１８０からなるフラグメント；および
－配列番号５のヌクレオチド１５４～２１３からなるフラグメント。
－配列番号５のヌクレオチド１０４～１８０からなるフラグメント；
－配列番号５のヌクレオチド１７４～１８０からなるフラグメント；および
－配列番号５のヌクレオチド１５４～２１３からなるフラグメント。
【0044】
好ましくは、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントは、配列番号２、３および４の配列から選択される。
【0045】
本発明の好ましい実施形態によれば、配列番号１の配列のヌクレオチド５４１から出発し、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントは、配列番号２の配列のフラグメント（少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターの）によって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントは存在しない。図３に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター１３ａである。
【0046】
本発明によるハイブリッドプロモーター１３ａは配列番号１１の配列を有する。
【0047】
あるいは、本発明の好ましい実施形態によれば、配列番号１の配列のヌクレオチド５４１から出発し、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントは、配列番号２の配列のフラグメント（少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターの）によって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在する。図４および９に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター１３ｂである。
【0048】
本発明によるハイブリッドプロモーター１３ｂは配列番号１２の配列を有する。
【0049】
あるいは、本発明の好ましい実施形態によれば、配列番号１の配列のヌクレオチド５５５から出発し、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントは、配列番号３の配列の少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントは存在しない。図３に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター１４ａである。
【0050】
本発明によるハイブリッドプロモーター１４ａは配列番号１３の配列を有する。
【0051】
あるいは、本発明の好ましい実施形態によれば、配列番号１の配列のヌクレオチド５５５から出発し、ヌクレオチド５６０で終わるフラグメントは、配列番号３の配列のフラグメント（少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターの）によって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在する。図４および９に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター１４ｂである。
【0052】
本発明によるハイブリッドプロモーター１４ｂは配列番号１４の配列を有する。
【0053】
あるいは、本発明の好ましい実施形態によれば、配列番号１の配列のヌクレオチド５２１から出発し、ヌクレオチド５８７で終わるフラグメントは、配列番号４の配列のフラグメント（少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターの）によって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントは存在しない。図３に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター１５ａである。
【0054】
本発明によるハイブリッドプロモーター１５ａは配列番号１５の配列を有する。
【0055】
あるいは、本発明の好ましい実施形態によれば、配列番号１の配列のヌクレオチド５２１から出発し、ヌクレオチド５８７で終わるフラグメントは、配列番号４の配列のフラグメント（少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターの）によって置換されており、配列番号１のヌクレオチド５９８～６０７からなるフラグメントが存在する。図４および９に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター１５ｂである。
【0056】
本発明によるハイブリッドプロモーター１５ｂは配列番号１６の配列を有する。
【0057】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１７もしくは配列番号２９の核酸配列を含む、または配列番号５の核酸配列を含むプロモーターに関し、この場合、配列番号７の配列は、配列番号５の該配列のヌクレオチド８９と９０との間に挿入されており、配列番号５の該配列のヌクレオチド１０４から始まりヌクレオチド１５３で終わるフラグメントは、配列番号７の配列によって置換されており、任意に、配列番号８の配列は、配列番号５のヌクレオチド２１７と２１８との間に挿入されている。
【0058】
一態様によれば、本発明は、配列番号１７の核酸配列を含むプロモーターに関する。図５に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター２２ａである。
【0059】
別の態様によれば、本発明は、配列番号５の核酸配列を含むプロモーターに関し、配列番号７は、配列番号５の該配列のヌクレオチド８９と９０との間に挿入されており、配列番号５の該配列のヌクレオチド１０４から始まり、そしてヌクレオチド１５３で終わるフラグメントは、配列番号７の配列によって置換されている。図５に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター２３ａである。該プロモーターは、好ましくは配列番号２６の配列を有する。
【0060】
別の態様によれば、本発明は、配列番号５の配列の核酸配列を含むプロモーターに関し、
－配列番号７の配列は、配列番号５の該配列のヌクレオチド８９と９０との間に挿入され、
－配列番号５の該配列のヌクレオチド１０４から始まり、ヌクレオチド１５３で終わるフラグメントは、配列番号７によって置換され、
－配列番号８は、配列番号５のヌクレオチド２１７と２１８との間に挿入されている。
－配列番号７の配列は、配列番号５の該配列のヌクレオチド８９と９０との間に挿入され、
－配列番号５の該配列のヌクレオチド１０４から始まり、ヌクレオチド１５３で終わるフラグメントは、配列番号７によって置換され、
－配列番号８は、配列番号５のヌクレオチド２１７と２１８との間に挿入されている。
【0061】
図５に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター２３ｂである。該プロモーターは、好ましくは配列番号３０の配列を有する。
【0062】
別の態様によれば、本発明は、配列番号２９の核酸配列を含むプロモーターに関する。図５に示すように、対応するハイブリッドプロモーターはプロモーター２５ｂである。
【0063】
好ましくは、ハイブリッドプロモーターは、プロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、１５ｂおよび２２ａから選択される。より好ましくは、ハイブリッドプロモーターは、プロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａおよび１５ｂから選択される。より好ましくは、ハイブリッドプロモーターは、プロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａおよび１４ｂから選択される。
【0064】
一実施形態によると、本発明のハイブリッドプロモーターは、目的の核酸配列の発現を制御する。「目的の核酸配列」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列を含む）、好ましくは遺伝子であってもよい。目的の核酸配列は、本発明のハイブリッドプロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。「機能的に連結されている」という語句は、目的の核酸配列がプロモーターの下流側に連結され、その結果、該目的の核酸配列がプロモーター活性に従って転写されることを意味する。
【0065】
好ましくは、目的の核酸配列は、コラーゲン鎖をコードする遺伝子またはそのフラグメントである。好ましくは、コラーゲン鎖をコードするヒト遺伝子またはそのフラグメントである。該遺伝子またはそのフラグメントは、天然または組換え体であってもよい。コラーゲン鎖は、型Ｉ～ＸＸＶＩＩＩのいずれか１つであってもよい。好ましくは、コラーゲン鎖は、Ｉ型（すなわち、ＣＯＬ１Ａ１またはＣＯＬ１Ａ２遺伝子によってコードされる）、またはＩＩ型（すなわち、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコードされる）である。より好ましくは、コラーゲン鎖は型ＩＩである。より好ましくは、コラーゲン鎖はヒトコラーゲン鎖である。より好ましくは、コラーゲン鎖はＩＩ型コラーゲンのプロ－α１（ＩＩ）鎖であり、好ましくは（ｈＣＯＬ２Ａ１遺伝子によりコードされる）ヒトの鎖である。
【0066】
ＣＯＬ２Ａ１遺伝子は、関節軟骨、眼の角膜および硝子体、内耳および脊椎の髄核に発現している。
【0067】
本発明はまた、本発明によるプロモーターを含むベクターに関する。
【0068】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、目的の核酸配列が導入され得る、または細胞に導入し得るポリヌクレオチドを指す。本発明の文脈において、目的の核酸配列は、ベクターの導入時に細胞内で発現されることが好ましい。ウイルスおよび非ウイルスベクター系の両方を使用することができる。適切なベクターは当技術分野で公知であり、例えば、プラスミド、人工染色体（例えば、細菌、哺乳動物、例えば、ヒト、または人工酵）、複製起点を備えたウイルスまたはファージベクター、および任意にプロモーターの調節因子を含む。ベクターは、宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために、例えば、ベクターによってコードされる対象核酸配列の産生のために使用され得る。ベクターはまた、インビボで、例えば、ワクチン接種または遺伝子治療の方法で使用されるように適合され得る。
【0069】
適切なウイルスベクターの実施例には、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純疱疹を含む疱疹、α－ウイルス、ポックスウイルス、例えばカナリア痘およびワクシニア－ウイルス系が含まれる。これらのウイルスを用いた遺伝子導入技術は当技術分野で公知である。例えば、レトロウイルスベクターを用いて、目的の核酸配列を宿主ゲノムに安定的に組み込むことができる。対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターはエピソームに留まるため、一過性の発現が可能である。昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスベクター）、ヒト細胞、酵母、または細菌における発現を駆動することができるベクターは、例えば、サブユニットワクチンまたはイムノアッセイにおける使用のために、対象の核酸配列の量を産生するために使用され得る。さらなる例では、複製欠損サルアデノウイルスベクターを生ベクターとして使用することができる。これらのウイルスはＥ１欠失を含み、Ｅ１遺伝子で形質転換された細胞株上で増殖することができる。これらのベクターは、コードされたタンパク質が発現され得るように、目的の核酸配列を挿入するように操作することができる。
【0070】
好ましい態様によれば、ベクターはウイルスベクターであり、より好ましくはレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【0071】
好ましくは、ベクターは、コラーゲン鎖、好ましくはＩＩ型コラーゲンのプロ－α１（ＩＩ）鎖をコードする遺伝子またはそのフラグメントの発現を制御する本発明のハイブリッドプロモーターを含む。
【0072】
治療的用途
本発明はまた、本発明のハイブリッドプロモーターの使用、または治療における本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターの使用に関する。好ましくは、治療は遺伝子治療である。該遺伝子治療は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療であり得る。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療は、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを単離細胞にトランスフェクトし、その後、トランスフェクトされた細胞を患者に移植することからなる。目的とし得る有用な細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞または患者自身から取り出された細胞である。あるいは、該遺伝子治療は、インビボ遺伝子治療であってもよい。インビボ遺伝子治療は、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを患者に直接注入することを含む。
本発明はまた、本発明のハイブリッドプロモーターの使用、または治療における本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターの使用に関する。好ましくは、治療は遺伝子治療である。該遺伝子治療は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療であり得る。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療は、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを単離細胞にトランスフェクトし、その後、トランスフェクトされた細胞を患者に移植することからなる。目的とし得る有用な細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞または患者自身から取り出された細胞である。あるいは、該遺伝子治療は、インビボ遺伝子治療であってもよい。インビボ遺伝子治療は、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを患者に直接注入することを含む。
【0073】
本発明はさらに、それを必要とする対象を治療するための方法であって、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを該対象に投与することを含む方法に関する。
【0074】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という語は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、ウマ、または霊長類を示す。好ましくは、対象は、人間であり、より好ましくは、子供（すなわち、本発明の観点から、特に背の高さにおいて、まだ成長している人間）である。実際、前述したように、本発明によるハイブリッドプロモーターおよびベクターは、成長板の軟骨マトリックス中、および／または軟骨膜などの軟骨に付属する細胞中に浸透することができる。
【0075】
一実施形態では、対象は、本明細書に記載される骨格異形成を患っていると診断されている。一実施形態では、対象は、本明細書に記載の窒息症候群を患っていると診断されている。
【0076】
別の実施形態では、対象は、本明細書に記載されるように、ＩＩ型コラーゲン異常症を患っていると診断されている。
【0077】
別の実施形態では、対象は、本明細書に記載される筋骨格系の疾患に罹患していると診断されている。
【0078】
本明細書で使用される場合、疾患または障害の「治療する」、「治療すること」、または「治療」とは、（ａ）障害の重症度を低下させること、（ｂ）治療されている障害の特徴的な症状の発現を制限または予防すること、（ｃ）治療されている障害の特徴的な症状の悪化を阻害すること、（ｄ）以前にその障害を有していた個人における障害の再発を制限または予防すること、および（ｅ）その障害に対して以前に症候的であった個人における症状の再発を制限または予防すること、のうちの１つまたは複数を達成することを意味する。
【0079】
本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターは、好ましくは遺伝子治療を通して送達され、そこで目的の組織に送達され、インビボで発現される。遺伝子治療法は、例えば、Ｖｅｒｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９－２４２、１９９７）、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １ ７：Ｓ６７－Ｓ６８、２００９）、およびＹａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２６：１３５－１４２、２０１１）に記載されている。
【0080】
発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞と適合するように選択され得る。
【0081】
導入された目的核酸配列は、宿主細胞中で安定的または一時的に維持され得る。安定な維持は、典型的には、導入された目的核酸配列が、宿主細胞と適合する複製起点を含むか、または染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）もしくは核またはミトコンドリア染色体のような宿主細胞のレプリコンに組み込まれることを必要とする。
【0082】
一実施形態によれば、本発明はさらに、骨格異形成または筋骨格系の疾患を治療するための、本発明のハイブリッドプロモーターの使用、または本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターの使用に関する。
【0083】
一実施形態によると、本発明はさらに、ＩＩ型コラーゲン異常症を治療するための、本発明のハイブリッドプロモーターの使用、または本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターの使用に関する。
【0084】
本明細書で使用する「骨格異形成」または「骨軟骨異形成」という用語は、主として骨および軟骨に影響を及ぼすが、筋肉、腱および靭帯にも重大な影響を及ぼし得る、４５０以上の十分に描写された障害の遺伝性群を指す。定義上、骨格異形成は、軟骨および骨に全身的な異常を有する遺伝性疾患である。
【0085】
骨格異形成の例には、先天性脊椎骨端異形成症（ＳＥＤＣ）、ニースト異形成、スティックラー症候群、ジューン症候群（または窒息性胸部ジストロフィー）、軟骨無形成症、ホモ接合性軟骨無形成症、ヘテロ接合性軟骨無形成症、軟骨無発生症、アクロジソストーシス、アクロメソメリック異形成、骨発生不全症、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症、点状軟骨異形成症のリゾメリック型、鎖骨頭蓋異骨症、先天性短大腿骨、頭蓋骨癒合症（例、ムエンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン－ワイス症候群、ファイファー症候群、またはＣｒｏｕｚｏｎｏｄｅｒｍｏｓｋｅｌｅｔａｌ症候群）、指趾症、短指症、屈指症、多指症、合指症、ダイアストロフィー性骨異形成症、小人症、異常分節形成異常、軟骨腫症、線維軟骨形成、線維性骨異形成症、遺伝性多発性骨異形成症、低軟骨形成症、低ホスファターゼ症、低リン酸血症性くる病、ヤッフェ・リヒテンスタイン症候群、ランガー型メソメリック異形成、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、ミクロメリア、骨幹端異形成、ヤンセン型骨幹端異形成、骨幹端異形成、モルキオ症候群、ニーバーゲルト型メソメリック異形成、神経線維腫症（例えば、タイプ１、例えば、骨の症状がある、または骨の症状がない、タイプ２、シュワノマトーシス、または本明細書に記載されているもの）、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、周産期の致死型の骨形成不全症、大理石骨病、骨粗鬆症、末梢性骨異形成症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ロビノウ症候群、短肋多指症症候群、低身長、脊椎骨端異形成症、致死性骨異形成症、脊椎肋骨異骨症、偽リウマチ性異形成、すべてのアグリカノパシー、またはレリワイル軟骨異形成症が含まれる。
【0086】
したがって、本発明は、先天性脊椎骨端異形成症（ＳＥＤＣ）、ニースト異形成症、スティックラー症候群またはジューン症候群などの骨格異形成の治療を提供する。
【0087】
「ＩＩ型コラーゲン異常症」という用語は、本明細書で使用される場合、結合組織に影響を及ぼし、ＩＩ型コラーゲンの欠陥によって引き起こされる遺伝性障害のグループを指す。ＩＩ型コラーゲン異常症は骨格異形成の亜型である。例えば、ＩＩ型コラーゲン異常症には、先天性脊椎骨端異形成症（ＳＥＤＣ）、ニースト異形成症、スティックラー症候群、軟骨無発生症ＩＩ型、軟骨低発生症、チェコ異形成症、レッグ－カルベ－ペルテス病、トーランス型の扁平脊椎致死性骨異形成症またはストラウドイック型の脊椎骨端異形成症が含まれる。
【0088】
したがって、本発明は、ＩＩ型コラーゲン異常症、好ましくは先天性脊椎骨端異形成症（ＳＥＤＣ）、ニースト異形成症またはスティックラー症候群の治療を提供する。
【0089】
「筋骨格系の疾患」という用語は、本明細書で使用する場合、関節に影響を与える骨格疾患を指す。例えば、関節の病態には、関節炎、特に、変形性関節症、関節リウマチ、痛風、敗血症性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎またはスチル病が含まれる。
【0090】
先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症を有する患者（例えば、ヒト）のような、患者における骨格異形成を治療するための方法が、本明細書において特に提供される。特に、患者は、骨格異形成（例えば、先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症）の１つ以上の症状を示すか、または有する可能性があり得る。本方法は、コラーゲン鎖（例えば、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコードされるＩＩ型コラーゲンのプロ－α１（ＩＩ）鎖など）をコードする配列、またはそのフラグメントなどの目的の核酸配列に作動可能に連結された本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターを患者（例えば、ヒト）に投与することを含む。例えば、患者は、例えばベクターの投与前に、本明細書に記載されるもののような骨格異形成の徴候または症状（例えば、先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症）を示す。本発明のベクターによる治療は、患者（例えば、ヒト）が、本明細書に記載されるもののような骨格異形成（例えば、先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症）と診断された後、または患者が本明細書に記載されるもののような骨格異形成の徴候または症状（例えば、先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症）を示した後にも起こり得る。
【0091】
本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターによる治療は、骨格異形成の症状、例えば先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症の改善をもたらすことができる。この方法は、骨格異形成症、例えば、先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症の症状の反転または重症度の低下がみられるように、骨格異形成症に関連する症状、例えば、先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症の治療に用いることができる。
【0092】
ＩＩ型コラーゲン異常症である（例えば、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子の突然変異によって引き起こされるか、またはそれに関連する）任意の骨格異形成は、本明細書に記載されるように、コラーゲン鎖をコードする配列、例えば、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコードされるＩＩ型コラーゲンのプロ－α１（ＩＩ）鎖に操作可能に連結された本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターを、患者（例えば、ヒト）に投与することによって治療することができる。例えば、このようなベクターは、先天性脊椎骨端異形成症のようなＩＩ型コラーゲン異常症を治療するために投与することができる。
【0093】
このようなベクターの投与は、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコード化された型ＩＩコラーゲンのプロアルファー１（ＩＩ）鎖のＲ２７５Ｃ、Ｇ５４６Ｓ、Ｒ４３７Ｐ、Ｒ７４０Ｃ、Ｒ７８９Ｃ、Ｇ８９７Ｒ変異、並びにＣ５７Ｙ、Ｇ２１６Ｄ、Ｇ２１９Ｒ、Ｇ２２２Ｖ、Ｇ２４０Ｄ、Ｇ２６７Ｄ、Ｇ２７０Ｒ、Ｇ２８２Ｄ、ｄｅｌ３０２－３０８、Ｇ４５３Ａ、Ｇ４９２Ｄ、Ｇ５０１Ｒ、Ｒ５６５Ｃ、Ｒ９０４Ｃ、Ｇ１１３１ＡまたはＧ１１５８Ａ変異のような、スティックラー症候群を生じさせるＣＯＬ２Ａ１遺伝子の変異のうちのいずれか１つから生じるＩＩ型コラーゲン異常症を治療するために使用されてもよい。特にＩＩ型コラーゲン異常症は先天性脊椎骨端異形成症（ＳＥＤＣ）である可能性がある。好ましくは、ＩＩ型コラーゲン異常症はグリシン置換によるものであり得る。
【0094】
したがって、上記パラグラフに記載されたベクターで治療された患者は、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子に突然変異を有する可能性がある。
【0095】
ＣＯＬ２Ａ１遺伝子における前述の突然変異のいずれも、治療（例えば、本明細書に記載のベクターによる治療）の前または後に、患者由来の試料（例えば、先天性脊椎骨端異形成症などのＩＩ型コラーゲン異常症を有するヒト）において検出することができる。さらに、患者の親および／または胎児試料（例えば、母体血液、胎盤、または胎児試料から得られた胎児核酸）は、突然変異に関して当技術分野で公知の方法によって試験され得る。
【0096】
本明細書に開示されているベクターの投与は、成長遅延、頭蓋骨変形、矯正欠陥、頸髄圧迫（例えば、中枢性無呼吸または痙攣による死亡のリスクを伴う）、脊柱狭窄（例えば、下肢および腰痛）、水頭症（例えば、脳シャント手術を必要とする）、慢性耳炎による難聴、心血管疾患、神経疾患、呼吸障害、疲労、疲労、腰痛および／または脊椎の疼痛、および肥満を含むが、これらに限定されない症状の改善をもたらす可能性がある。
【0097】
本明細書に記載のベクターを用いて治療される患者は、例えば、筋骨格系の骨格異形成または疾患を有する乳児、小児、および成人を含むことができる。乳児は、出生時にＩＩ型コラーゲン異常症と診断されることが多く、したがって、本明細書に記載されるようなベクターによる治療は、患者の生涯においてできるだけ早く、例えば、出生直後、または出生前（子宮内）に開始され得る。
【0098】
患者（例えば、ヒト）における骨格異形成（例えば、ＩＩ型コラーゲン異常症）または筋骨格系の疾患の症状もまた、患者が本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターで治療される前または後にモニターされ得る。例えば、治療前に症状をモニターして、該方法を実施する前に、患者の疾患および状態の重症度を評価することができる。本発明の方法は、体重、体高、座高、頭蓋骨の形状、頭蓋骨の長さおよび／または頭蓋骨幅の変化のような、患者における疾患の診断および疾患の症状の変化のモニタリングを含み得るが、例えば、１ヶ月当たり１、２、３、４回以上、１年当たりまたはおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、１２、または１６週間毎に、本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターによる治療コースにわたってモニターされた変化に基づいて、患者の子宮頸不安定性、呼吸合併症および／または神経学的合併症も含む。患者の体重および／または頭蓋骨サイズまたはその変化は、治療特定事象、例えば、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターの投与前および／または投与後に決定することもできる。例えば、体重および／または頭蓋骨サイズは、本発明のベクターの投与に応答して測定される。
【0099】
体重は、好ましくは標準化された方法、例えば、同じ衣類（特にヒトの場合）または衣類を使用せず、またはある時点、好ましくは絶食状態（例えば、朝食が摂取される前の朝、または少なくとも１、２、３、４、５時間もしくはそれ以上の絶食後）で、スケールで対象を単純に秤量することができる。
【0100】
頭蓋骨サイズは、好ましくは、長さ、高さ、幅および／または円周によって表される。
【0101】
測定は、既知のまたは自己考案された標準化された方法で行うことができる。ヒトの対象では、頭蓋周囲径の計測が好ましい。通常、テープなどの柔軟性で伸縮しにくい素材を使用して、頭の可能な限り広い周囲に巻きつけ（耳の周囲や、まゆを含む下の顔の部分には巻きつけない）、例えば、前頭の最も目立つ部分から頭の後ろの最も広い部分にかけて巻きつける。ヒトの対象のための別の好ましい測定は、例えば、顎の下側から頭部の最上部までの頭蓋の高さを決定することができる。げっ歯類の対象では、頭蓋骨の長さ（例えば、鼻骨の先端から後頭骨の後ろまで）の計測が好ましい。
【0102】
あるいは、頭蓋骨の幅（例えば、頭頂骨の最も広い点）、頭蓋骨の高さ（例えば、下顎の前頭骨への角度処理の最も低い点）、または頭蓋骨の体積も好ましい。好ましくは、任意の測定は、２回以上、例えば、少なくとも３回採取され、最大数は、長さ、高さ、幅および／または円周として採取される。
【0103】
好ましくは、ヒトの対象の場合、考慮すべき疾病の症状は、典型的には、体重、身長、座高、頭蓋の形状、長い骨長（脛骨長、上腕骨長および／または大腿骨長など）、子宮頸不安定性、呼吸器合併症および／または神経学的合併症における変化である。
【0104】
医薬組成物および製剤
本発明の組成物（例えば、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを含む）は、当技術分野で公知の種々の方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。投与経路は、環境および治療目標のような種々の因子に依存する。特に、本発明の少なくとも１つのハイブリッドプロモーターを含むベクターは、当該技術分野で公知の任意の経路により、例えば、皮下（例えば、皮下注射により）、静脈内、経口、鼻腔内、筋肉内、舌下、くも膜下腔のまたは皮内に投与することができる。例として、本発明の医薬組成物は、液剤、溶剤、懸濁剤、丸剤、カプセル剤、タブレット剤、ゲルキャップ剤、粉末剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、噴霧剤、ミスト、気相剤、エアロゾルまたはフィトソーム剤の形態であり得る。
本発明の組成物（例えば、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを含む）は、当技術分野で公知の種々の方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。投与経路は、環境および治療目標のような種々の因子に依存する。特に、本発明の少なくとも１つのハイブリッドプロモーターを含むベクターは、当該技術分野で公知の任意の経路により、例えば、皮下（例えば、皮下注射により）、静脈内、経口、鼻腔内、筋肉内、舌下、くも膜下腔のまたは皮内に投与することができる。例として、本発明の医薬組成物は、液剤、溶剤、懸濁剤、丸剤、カプセル剤、タブレット剤、ゲルキャップ剤、粉末剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、噴霧剤、ミスト、気相剤、エアロゾルまたはフィトソーム剤の形態であり得る。
【0105】
任意の量の医薬組成物（本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを含む）を、骨格異形成を有する患者（例えば、先天性脊椎骨端異形成症などのＩＩ型コラーゲン異常症を有する患者）などの患者に投与することができる。投与量は、投与様式および患者の年齢を含む多くの要因に依存する。典型的には、組成物の量（例えば、本発明によるベクターを含む）は、本明細書に記載されるような状態（例えば、先天性脊椎骨端異形成症などのＩＩ型コラーゲン異常症）を、有意な毒性を誘発することなく治療するのに有効な量であり得る。
【0106】
例えば、本明細書に記載の本発明によるベクターは、例えば、０．０００２ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．００２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇの範囲の個々の用量で患者（例えば、ＩＩ型コラーゲン異常症患者）に投与することができる。特に、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターは、例えば０．００１ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇの個々の用量で投与することができる。これらの用量は、日、週、月、または年に１回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２回以上）投与することができる。
【0107】
好ましくは、本発明のベクターを含む組成物の少なくとも１回の投与量、好ましくは少なくとも２回の投与量、好ましくは少なくとも３回の投与量は、本明細書に記載されるような状態（例えば、先天性脊椎骨端異形成症などのＩＩ型コラーゲン異常症）を治療するのに有効な量とすることができる。好ましくは、本発明のベクターを含む組成物は、週１回投与することができる。
【0108】
本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを含む組成物の例示的用量は、例えば、０．０００２、０．０００５、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０ｍｇ／ｋｇを含む。本明細書に列挙されたすべての用量または範囲について、用語「約」は、列挙された値または範囲エンドポイントの±１０％だけこれらの用量を改変するために使用され得る。特に、本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを含む組成物は、約０．０００２ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０２ｍｇ／ｋｇ／日～約１５ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．２ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日（例えば０．７５ｍｇ／ｋｇ／日）の範囲の用量で患者に投与することができる。例えば、本発明のベクターを含む組成物は、例えば、約０．００１４ｍｇ／ｋｇ／週間～約１４０ｍｇ／ｋｇ／週間、例えば、約０．１４ｍｇ／ｋｇ／週間～約１０５ｍｇ／ｋｇ／週間、または例えば、約１．４ｍｇ／ｋｇ／週間～約７０ｍｇ／ｋｇ／週間（例えば、５ｍｇ／ｋｇ／週間）の範囲の週間用量で患者に投与することができる。投与量は、疾患の程度および患者とは異なるパラメータのような従来の因子に従って、臨床医によって適応される。
【0109】
本発明によるハイブリッドプロモーターを含むベクターを含む組成物の投与量は、単一または複数の投与計画のいずれかで提供することができる。用量は、例えば、時間毎、２時間毎、毎日、２日毎、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、週１回、隔週、月毎、隔月毎、または年１回投与することができる。
【0110】
あるいは、用量は、例えば、１日２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回または１２回投与することができる。
【0111】
投与量、頻度、および時間は、疾患の程度および患者とは異なるパラメータのような従来の因子に従って、臨床医によって適応されるであろう。
【0112】
担体／ビヒクル
本発明のベクターを含む組成物は、薬学的に許容される無菌の水性または非水溶媒、懸濁液または乳濁液と組み合わせて患者に提供することができる。非水性溶媒の実施例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注入用有機エステルである。水性担体には、水、水－アルコール溶液、生理食塩水および塩化ナトリウム溶液を含む緩衝化医療非経口ビヒクル、リンゲルデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラクトースを含むリンゲル溶液、または固定油などの、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。
本発明のベクターを含む組成物は、薬学的に許容される無菌の水性または非水溶媒、懸濁液または乳濁液と組み合わせて患者に提供することができる。非水性溶媒の実施例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注入用有機エステルである。水性担体には、水、水－アルコール溶液、生理食塩水および塩化ナトリウム溶液を含む緩衝化医療非経口ビヒクル、リンゲルデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラクトースを含むリンゲル溶液、または固定油などの、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。
【0113】
静脈内ビヒクル物は、液体および栄養補充剤、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補充剤などを含むことができる。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、ベンゾエートなどの有機酸の塩をその中に含むことができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助物質が、上記ビヒクル物中に存在してもよい。薬学的に許容される担体の完全な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
【0114】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に等張、無菌、生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこれらの塩の混合物）、または乾燥、特に、場合に応じて、滅菌水もしくは生理食塩水を加えることによって、注射用溶液の構成を可能にする凍結乾燥組成物であり得る。投与に使用される用量は、様々なパラメータの機能として、特に使用される投与様式の機能として、関連する病理学の機能として、または代替的に所望の治療期間の機能として適合させることができる。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当業者の十分な範囲内である。ただし、産生物の１日の服用量は、大人１人当たり０．０１～１０００ｍｇ／日と幅広く設定することができる。好ましくは、組成物は、治療される対象への投薬量の症候的調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、１０、１５、２５、５０、１００、２５０および５００ｍｇの活性成分を含有する。薬剤は、典型的には、約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇの活性成分、好ましくは１ｍｇ～約１００ｍｇの活性成分を含有する。薬物の有効量は通常、０．０００２ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、特に約０．００１ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量レベルで供給される。薬学的組成物を調製するために、有効量の本発明のポリペプチドを薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散させることができる。
【0115】
注射液用途に適切な薬学的形態は、滅菌水溶液または分散物；ゴマ油、ピーナツ油、または水性プロピレングリコールを含む処方物；および注射可能な溶液または懸濁物の即時調製のための無菌の粉末を含む。すべての場合、形状は殺菌性でなければならずそして容易に注射できる程度の流体性でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保持されなければならない。遊離塩基または製薬上許容できる塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合される水で調製することができる。分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物中およびオイル中で調製することもできる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含む。
【0116】
本発明のハイブリッドプロモーターを含むベクターは、中性または塩の形態の組成物に処方することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が挙げられ、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基と形成した塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄などの無機の塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機の塩基からも誘導することもできる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、各種抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により実施できる。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。
【0117】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を適当な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した他の成分のいくつかと共に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌活性成分を、上記に列挙したものからの塩基性分散媒および必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これは、活性成分の粉末と、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意のさらなる所望の成分とを生じる。溶媒としてのＤＭＳＯの使用が極めて急速な浸透をもたらし、高濃度の活性剤を小さな腫瘍領域に送達すると考えられる場合、直接注入のためのより多くの、または高度に濃縮された溶液の調製も企図される。処方に際して、溶液は投与処方に適合した様式で、かつ治療的に効果的であるような量で投与されるであろう。製剤は、上述の注射可能な溶液の型のような種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
【0118】
水溶液中での非経口投与の場合、例えば、溶液を適切に緩衝し、液体希釈剤をまず十分な生理食塩水またはグルコースで等張にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この関係で、使用できる滅菌水性媒体は本開示に徴して当業者に知られているであろう。例えば、１用量を１ｍｌの等張ＮａＣＩ溶液に溶解し、１０００ｍｌの特定の流体に添加するか、または提案された注入部位に注入することができる。投与量には、治療を受ける対象の状態によって多少のばらつきが生じることがある。いずれにせよ、投与責任者は対象の適切な投与量を決定する。
【0119】
本発明は、単なる例示として解釈されるべき以下の実施例によって記載され、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0120】
【図1】図１は、Ｃｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／＋から単離したＭＳＣｓの軟骨形成分化の迅速性の検討。細胞を、軟骨形成分化培地の存在下で、対照として使用したＭＭＬＶ‐Ｃｏｌ２またはＭＭＬＶ‐ＧＦＰを用いて遺伝子改変した。３Ｄ楕円体で６日間培養した後、軟骨マトリックス形成を、プロテオグリカン含量または成熟肥大軟骨細胞のマーカーであるＸ型コラーゲン（赤）に対するアルシアンブルー染色により評価した。
【図2】図２は、Ｃｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／ｓｅｄｃマウスから骨増殖を回復させるためのｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法の使用に関するｅｘ ｖｉｖｏの概念実証。ホモ接合型ＳＥＤＣ由来の胎児大腿骨を、Ｃｏｌ２またはＧＦＰを過剰発現するＭＳＣと５日間共培養した。骨を測定し（ａ）、成熟を偏光下で可視化したシリウスレッド染色により評価した。矢印はコラーゲン線維の存在を示す。
【図3】図３から６は、本研究で評価した種々のハイブリッドプロモーター構築物の模式図。 試験したすべてのハイブリッドプロモーター（２４）を図示する。 本発明のプロモーター（プロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、１５ｂおよび２２ａなど）は、ＩＩ型コラーゲンを天然に発現する組織に限定するように設計された。 約２４の構築物を設計し、細胞系における式の量および特異性についてスクリーニングした。 これらの図では、ｈＥＦ１αプロモーターの一部が点線であり、ＥＦＰ１、ＡＦＰ２、ＴＡＴＡボックスは点線で囲まれたボックスである。 ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの一部は連続的に並んでおり、異なるエレメント（Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｎ１、ＡＰ－２ε、ＴＡＴＡボックス）はハッチ状である。 ハイブリッドプロモーター１ａおよび１ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの「Ｐ－Ｅ－Ｓ－Ｓ－Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ－Ｓ－Ｅ」配列のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター５ａおよび５ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの「Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ」配列のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター１１ａおよび１１ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターのＰエレメントおよび「ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ－Ｅ」配列のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター１２ａおよび１２ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターのＡＰ－２ε配列のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター１３ａおよび１３ｂは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターバックボーンを有し、ｈＥＦ１αプロモーターの「ＥＦＰ１－リンカー－ＥＦＰ２－ＴＡＴＡボックス」配列のみを含む（ａバージョンは、３’におけるｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントを含まない）。 ハイブリッドプロモーター１４ａおよび１４ｂはｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターバックボーンを有し、ｈＥＦ１αプロモーターのＴＡＴＡボックス配列のみを含む（ａバージョンはｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補助的なＮ１エレメントを３’に含まない）。 ハイブリッドプロモーター１５ａおよび１５ｂはｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターバックボーンを有し、ＴＡＴＡボックスの上流５’配列、ＴＡＴＡボックスおよびｈＥＦ１αプロモーターの３’配列の一部を含むのみである（このａバージョンは３’におけるｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補助的なＮ１エレメントを含まない）。 ハイブリッドプロモーター２１ａおよび２１ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの「Ｐ－Ｅ－Ｓ－Ｓ－Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ－Ｓ－Ｅ」配列を２倍のみ含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター２２ａおよび２２ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの「Ｐ－Ｅ－Ｓ－Ｓ－Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ－Ｅ」配列および「Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ」配列のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター２３ａおよび２３ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの「Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ」配列の２倍のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター２４ａおよび２４ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの「Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ」配列の５倍のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。 ハイブリッドプロモーター２５ａおよび２５ｂは、ｈＥＦ１αプロモーターバックボーンを有し、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの「Ｐ－Ｅ－Ｓ－Ｓ－Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ－Ｅ」および「Ｎ１－ＡＰ－２ε－Ｎ１－Ｓ」の混合配列のみを含む（ｂバージョンは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの補足的Ｎ１エレメントをさらに含む）。
【図4】同上。
【図5】同上。
【図6】同上。
【図7】軟骨細胞（ＡＴＤＣ５）または対照Ｂａｆ３細胞における異なるプロモーターコンストラクトの発現レベルの比較。発現は、ＥＦ１αプロモーターで得られた発現レベルの割合で表される。
【図8】処置または対照接合性（ＨＯ）マウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ ｍｅｙｅｒ曲線。
【図9】本発明によるｈＣＯＬ２Ａ１（配列番号１）のハイブリッドプロモーターのスキーム。該プロモーターは、配列番号１に由来する。図では位置Ａ、Ｂを示している。フラグメントＡ－Ｂは、少なくともＴＡＴＡボックスを含むｈＥＦ１αプロモーターのフラグメントによって置換される。フラグメントＡ～Ｂの位置は、ハイブリッドプロモーター１３ｂ、１４ｂおよび１５ｂ（これらはすべてＮ１配列、すなわちヌクレオチド５９８～６０７を含む）の例示として与えられる。
【図10】異なる実験で得られた全身長、尾長、上腕骨長、大腿骨長および脛骨長の結果。 成長期（１日目から２１日目まで）にウイルスを３回注射して処置したマウスは、体長および尾長並びに異なる長骨によって見られるように、全体的な骨格成長の用量依存的な増加を示した（未処置ＨＯマウスと比較して＊ｐ＜０．０５）。低用量は１ｍｌ当たり２×１０５の感染性粒子に相当し、中用量は６×１０６の感染性粒子／ｍｌに相当する。
【図12】大後頭孔の位置と胸郭体積に対する治療効果。ウイルスの３回の注射により成長期間（１日目から２１日目まで）中に処置したマウスは、大後頭孔と頭蓋骨の端との距離および胸郭体積の用量依存的な増加を示した（未処置ＨＯマウスと比較して＊ｐ＜０．０５）。
【図13】処置動物および未処置動物から採取した脛骨成長板の組織切片の代表的画像。 ２型コラーゲンに対する免疫組織化学は示されていないが、代表的な画像は、対照と比較して処置されたマウスにおいて発現の増加を示す。
【図14】ＣＯＬ２＋／＋、Ｇ８９７Ｒ ｉＰＳＣの生成。（Ａ）多能性マーカーＳＳＥＡ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＴＲＡ－１－６０に対する代表的な免疫蛍光汚染は、ＣＯＬ２＋／＋およびＧ８９７Ｒ ｉＰＳＣがこれらのマーカーに対して陽性であることを示した。生成したｉＰＳＣｓも強いアルカリホスファターゼ活性を示した。最後に、両遺伝子型のｉＰＳＣはＥＢを形成することができる。それぞれの遺伝子型について１つのｉＰＳＣクローン化を提示する。（Ｂ）多能性（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ）、内胚葉（Ｅｎｄｏ．、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２）、外胚葉（Ｅｃｔｏ．、ＮＥＳＴＩＮ、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ１）および中胚葉（Ｍｅｓｏ．、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＲＵＮＸ１、ＣＤ３４）遺伝子マーカーのＣＯＬ２＋／＋（黒四角）、Ｇ８９７Ｒ（プレーングレー）ｉＰＳＣを非分化細胞（ＵＮＤ）と比較した発現。データは、各遺伝子型からの３つのクローンについての３つの実験のプール平均±ＳＥＭとして表される。
【図15】Ｓｅｄｃ ｉＰＳＣからの間葉系幹細胞への分化に対する処理効果。間葉系幹細胞は、対照または患者由来のｉＰＳＣから得られ、レンチウイルスベクターにより遺伝子改変された。細胞を光学顕微鏡（Ａ）下で可視化するか、または特定の細胞表面マーカー（Ｂ）についてフローサイトメトリーにより分析した。
【図16】Ｓｅｄｃ患者から単離した間葉系幹細胞は、遺伝子療法により回復した分化軟骨細胞の細胞外マトリックスの産生の有意な減少を示した。
【実施例】
【0121】
実施例
材料と方法
１－ レンチウイルス粒子の産生と特性解析
レンチウイルス粒子はＭｉｌｌｉｃｚｌｌ ＨＹ Ｔ－６００フラスコ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の２９３Ｔ細胞を用いた３プラスミドの一時的トランフェクトにより作製される。７０％コンフルエントに達すると、細胞は、ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミド、ヒトＰＡＸ２発現ベクター、およびハイブリッドプロモーターおよび目的遺伝子を含むプラスミド（ｈＣＯＬ２Ａ１）を用いてトランスフェクトされる。実験は、ヒトＣＯＬ２Ａ１遺伝子を含有する発現カセット、続いてＩＲＥＳエレメントおよびＧＦＰ遺伝子を用いて行った。トランスフェクションは古典的ＣａＣｌ２トランスフェクション法により行った。７２時間後、レンチウイルス粒子を回収し、４０μｍ細胞ストレーナーで濾過し、超遠心分離により濃縮する。
材料と方法
１－ レンチウイルス粒子の産生と特性解析
レンチウイルス粒子はＭｉｌｌｉｃｚｌｌ ＨＹ Ｔ－６００フラスコ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の２９３Ｔ細胞を用いた３プラスミドの一時的トランフェクトにより作製される。７０％コンフルエントに達すると、細胞は、ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミド、ヒトＰＡＸ２発現ベクター、およびハイブリッドプロモーターおよび目的遺伝子を含むプラスミド（ｈＣＯＬ２Ａ１）を用いてトランスフェクトされる。実験は、ヒトＣＯＬ２Ａ１遺伝子を含有する発現カセット、続いてＩＲＥＳエレメントおよびＧＦＰ遺伝子を用いて行った。トランスフェクションは古典的ＣａＣｌ２トランスフェクション法により行った。７２時間後、レンチウイルス粒子を回収し、４０μｍ細胞ストレーナーで濾過し、超遠心分離により濃縮する。
【0122】
次いで、ウイルス調製物をｐ２４ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析により特徴付け、感染性粒子含有量を決定する。
【0123】
２－ 液体オーバーレイ細胞培養
６週齢マウスから大腿フラッシングにより単離した後、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、液体オーバーレイ細胞培養法を用いて３Ｄ環境で培養した。このために、２００００細胞を、１０００ｇで１０分間の低グレード遠心分離により９６ウェルＶ底板のウェルに播種した。スフェロイドは培養２４時間後に形成した。播種時にウイルス粒子で細胞を処理した。培養２～３週間後、スフェロイドを組織学的に分析した。
６週齢マウスから大腿フラッシングにより単離した後、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、液体オーバーレイ細胞培養法を用いて３Ｄ環境で培養した。このために、２００００細胞を、１０００ｇで１０分間の低グレード遠心分離により９６ウェルＶ底板のウェルに播種した。スフェロイドは培養２４時間後に形成した。播種時にウイルス粒子で細胞を処理した。培養２～３週間後、スフェロイドを組織学的に分析した。
【0124】
３－ アニマルハウジング
この研究では、ＩＩ型コラーゲン異常症のマウスの自然発生モデルを用いた（Ｊａｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで市販されている）。マウス、Ｂ６（Ｃｇ）‐Ｃｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／ＧｒｓｒＪはＣＯＬ２Ａ１遺伝子のエクソン４８染色体１５上に変異を有する。それらは本質的にヒトの表現型を再開し、胴体部と長管骨が短縮し、内耳欠陥と聴覚障害がある。すべての動物を温湿度管理室で飼育し、１２時間の明暗サイクルに曝露し、標準的な研究所食品および水を自由に摂取させた。新生児は常に親と一緒に飼育された。実験動物ケアの原理（米国国立衛生研究所発行第８５－２３号、１９８５年改訂；ｈｔｔｐ：／／ｇｒａｎｔｓ１．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｒａｎｔｓ／ｏｌａｗ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｐｈｓｐｏｌ．ｈｔｍ）および科学的目的に使用される動物の保護のための欧州委員会の指針（ｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ／ｃｈｅｍｉｃａｌｓ／ｌａｂ＿ａｎｉｍａｌｓ／ｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎ＿ｅｎ．ｈｔｍ）に常に従った。本試験は、実験動物（ＣＩＥＰＡＬ Ａｚｕｒ）の使用に関して、地域の施設倫理委員会により承認された（承認ＡＰＡＦＩＳ＃１３６０４－２０１８０４０５１５５５４８８９ ｖ３）。
この研究では、ＩＩ型コラーゲン異常症のマウスの自然発生モデルを用いた（Ｊａｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで市販されている）。マウス、Ｂ６（Ｃｇ）‐Ｃｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／ＧｒｓｒＪはＣＯＬ２Ａ１遺伝子のエクソン４８染色体１５上に変異を有する。それらは本質的にヒトの表現型を再開し、胴体部と長管骨が短縮し、内耳欠陥と聴覚障害がある。すべての動物を温湿度管理室で飼育し、１２時間の明暗サイクルに曝露し、標準的な研究所食品および水を自由に摂取させた。新生児は常に親と一緒に飼育された。実験動物ケアの原理（米国国立衛生研究所発行第８５－２３号、１９８５年改訂；ｈｔｔｐ：／／ｇｒａｎｔｓ１．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｒａｎｔｓ／ｏｌａｗ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｐｈｓｐｏｌ．ｈｔｍ）および科学的目的に使用される動物の保護のための欧州委員会の指針（ｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ／ｃｈｅｍｉｃａｌｓ／ｌａｂ＿ａｎｉｍａｌｓ／ｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎ＿ｅｎ．ｈｔｍ）に常に従った。本試験は、実験動物（ＣＩＥＰＡＬ Ａｚｕｒ）の使用に関して、地域の施設倫理委員会により承認された（承認ＡＰＡＦＩＳ＃１３６０４－２０１８０４０５１５５５４８８９ ｖ３）。
【0125】
実験の偏りを避け、結果分析のために盲検化された状態のままにするために、ゲノムＤＮＡ抽出のために耳の小片を用いて実験の終わりに遺伝子型タイピングを行う。
【0126】
４－ 処理
Ｃｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／＋のメスマウスをＣｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／＋またはＣｏｌ１ａ１ｓｅｄｃ／ｓｅｄｃマウスとかけ合わせて、ＷＴ、ヘテロ接合性（ＨＥ）、ホモ接合性（ＨＯ）の生物を生成した。同腹児全体を無作為に投与群に割り付けた。１日目および７日目に、１３ａ構築またはＰＢＳの１０μｌ中に低用量の１．８×１０６感染性微粒子を腹腔内注射した。死亡率および合併症（呼吸器合併症、麻痺、尾変形、漏斗胸）の発生を追跡するため、動物を毎日注意深く観察した。体重は２日毎に２１日間測定した。２１日目に、ドーレタールの致死的射出により動物を安楽死させた。動物は慎重に解剖する。組織学的解析のために、臓器（脾臓、腎臓、肝臓、肺、心臓）を計量し、網膜、大腿骨頭蓋、膝および胸骨と共に１０％ホルマリンで２４時間固定した。その後、全身長、尾長、頭蓋比を、デジタルノギス（３００ｍｍ以内）を用いて測定する。次いで、マウス骨格を、２６ｋｖ露光を用いて、１９秒間、ファキシトロンＸ線を用いてＸ線撮影する。その後、全長骨、椎骨、胸骨の特性、大孔を測定し、ＨＯＲＯＳソフトウェアを用いて解析する。
Ｃｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／＋のメスマウスをＣｏｌ２ａ１ｓｅｄｃ／＋またはＣｏｌ１ａ１ｓｅｄｃ／ｓｅｄｃマウスとかけ合わせて、ＷＴ、ヘテロ接合性（ＨＥ）、ホモ接合性（ＨＯ）の生物を生成した。同腹児全体を無作為に投与群に割り付けた。１日目および７日目に、１３ａ構築またはＰＢＳの１０μｌ中に低用量の１．８×１０６感染性微粒子を腹腔内注射した。死亡率および合併症（呼吸器合併症、麻痺、尾変形、漏斗胸）の発生を追跡するため、動物を毎日注意深く観察した。体重は２日毎に２１日間測定した。２１日目に、ドーレタールの致死的射出により動物を安楽死させた。動物は慎重に解剖する。組織学的解析のために、臓器（脾臓、腎臓、肝臓、肺、心臓）を計量し、網膜、大腿骨頭蓋、膝および胸骨と共に１０％ホルマリンで２４時間固定した。その後、全身長、尾長、頭蓋比を、デジタルノギス（３００ｍｍ以内）を用いて測定する。次いで、マウス骨格を、２６ｋｖ露光を用いて、１９秒間、ファキシトロンＸ線を用いてＸ線撮影する。その後、全長骨、椎骨、胸骨の特性、大孔を測定し、ＨＯＲＯＳソフトウェアを用いて解析する。
【0127】
５－ 組織像と免疫染色
ホルマリン固定後、組織（３Ｄ培養、臓器、軟骨、骨）をパラフィンに包埋した。骨は１０％ＥＤＴＡ ｐＨ７．４で以前に脱灰された。
ホルマリン固定後、組織（３Ｄ培養、臓器、軟骨、骨）をパラフィンに包埋した。骨は１０％ＥＤＴＡ ｐＨ７．４で以前に脱灰された。
【0128】
次いで、５μｍ切片をアルシアンブルーで染色するか、またはＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲンまたはアグリカンの免疫組織化学のために処理した。このために、プロテイナーゼＫ中で１０分間インキュベートを用いたエピトープ回収の後、組織を１０％血清および３％ＢＳＡを含む溶液でブロックした。次いで、一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ４８８二次抗体と共に１時間インキュベートした。Ｄａｐｉを用いて細胞核を標識した。
【0129】
６－ ヒト対象および試料調製
検体採取前に患者の両親からインフォームドコンセントを得た。患者のＰＢＭＣ移入およびｉＰＳＣ導出はいずれも、高等教育・研究・イノベーション省によって承認された（移入承認＃ＩＥ－２０１９－１０７１およびｉＰＳＣ生成承認＃ＤＣ－２０１９－３５５１）。
検体採取前に患者の両親からインフォームドコンセントを得た。患者のＰＢＭＣ移入およびｉＰＳＣ導出はいずれも、高等教育・研究・イノベーション省によって承認された（移入承認＃ＩＥ－２０１９－１０７１およびｉＰＳＣ生成承認＃ＤＣ－２０１９－３５５１）。
【0130】
７－ 誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製と特徴付け
Ｇ８９７Ｒ変異を運んでいる１つのＳＥＤＣ患者と古典的ＦＩＣＯＬＬグラジエント法を用いた２つの非関連個々（ＣＯＬ２＋／＋）からの全血を用いて、周辺血球単細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。１００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌ Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３配位子（Ｆｌｔ３Ｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－３（ＩＬ－３、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中回収２４時間後、５０万個のＰＢＭＣを、ｉＰＳＣ導出のために、製造業者の指示に従って、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０ Ｓｅｎｄａｉリプログラミングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて処理した。
Ｇ８９７Ｒ変異を運んでいる１つのＳＥＤＣ患者と古典的ＦＩＣＯＬＬグラジエント法を用いた２つの非関連個々（ＣＯＬ２＋／＋）からの全血を用いて、周辺血球単細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。１００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌ Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３配位子（Ｆｌｔ３Ｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－３（ＩＬ－３、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中回収２４時間後、５０万個のＰＢＭＣを、ｉＰＳＣ導出のために、製造業者の指示に従って、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０ Ｓｅｎｄａｉリプログラミングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて処理した。
【0131】
ｉＰＳＣのキャラクタリゼーションは、前述の（１３）のように行われている。ＣＯＬ２＋／＋およびＧ８９７Ｒ ｉＰＳＣを、幹細胞マーカーＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０の免疫組織化学によるそれらの発現に関して評価した。パラホルムアルデヒドで固着し、サポニンで透過処理した後、細胞を一次抗体と共に室温で３時間インキュベートした。二次抗体はＡｌｅｘａ５９４およびＡｌｅｘａ４８８であった。ＮｕｃＢｌｕｅ Ｆｉｘｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｔａｉｎ（Ｄａｐｉ）で核を染色した。
【0132】
胚様体（ＥＢ）は、前述の（１３）のように形成された。ｉＰＳＣを回収し、凝集体を、８０％ＤＭＥＭ－Ｆ１２、２０％ノックアウト血清置換器（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ペニシリン／ストレプトマイシン、および１００μＭ ２－メルカプトエタノールを含有する分化培地中入りの低接着性６ウェルプレートに移した。培地は毎日交換した。１４日間の分化後、細胞を回収し、ＲＮＡ抽出およびその後の外胚葉、内胚葉、および中胚葉のマーカーのｑＰＣＲ分析を行った。
【0133】
８－ 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の分化および特徴付け
ｉＰＳＣは、以前に記載したようにＭＳＣに直接分化した（１３）。簡単に述べると、培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭ非必須アミノ酸、１１０μＭの２－メルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）を含有するＭＳＣ誘導培地で置き換えられた。培地は２日毎に交換した。１週間後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、さらに１週間の間に組織培養皿に移した。この時点で、細胞を回収し、表現型的に、ＭＳＣマーカーの発現についてフローサイトメトリーによって特徴付け、それらの分化能についてアッセイした。
ｉＰＳＣは、以前に記載したようにＭＳＣに直接分化した（１３）。簡単に述べると、培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭ非必須アミノ酸、１１０μＭの２－メルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）を含有するＭＳＣ誘導培地で置き換えられた。培地は２日毎に交換した。１週間後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、さらに１週間の間に組織培養皿に移した。この時点で、細胞を回収し、表現型的に、ＭＳＣマーカーの発現についてフローサイトメトリーによって特徴付け、それらの分化能についてアッセイした。
【0134】
９－ 脂肪細胞、骨芽細胞と軟骨細胞の分化
脂肪生成はＳｔｅｍＰｒｏ脂肪生成分化キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて調べた。ＭＳＣを５×１０４／ウェル、２４ウェルプレートに播種し、完全脂肪形成分化培地中で２～３週間培養した。脂質沈着物は、製造業者の指示に従って、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）での染色後に観察された。細胞を４％ ＰＦＡ中で、室温で１０分間固定し、６０％イソプロパノール中で５分間インキュベートし、最後にＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ．溶液に５分間移した。洗浄後、細胞をマイヤーのヘマトキシリン中で対比染色した。
脂肪生成はＳｔｅｍＰｒｏ脂肪生成分化キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて調べた。ＭＳＣを５×１０４／ウェル、２４ウェルプレートに播種し、完全脂肪形成分化培地中で２～３週間培養した。脂質沈着物は、製造業者の指示に従って、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）での染色後に観察された。細胞を４％ ＰＦＡ中で、室温で１０分間固定し、６０％イソプロパノール中で５分間インキュベートし、最後にＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ．溶液に５分間移した。洗浄後、細胞をマイヤーのヘマトキシリン中で対比染色した。
【0135】
軟骨分化はＳｔｅｍＰｒｏ軟骨形成分化キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。最初に１２ウェルプレートに、８×１０４細胞を含む集合体中に、５μＬのＭＳＣ培地中に細胞を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター中に１時間置いた。次いで、完成軟骨形成培地を添加し、細胞を２０日間培養した。培地は週１回交換した。軟骨形成マトリックス形成は、アルシアンブルー、サフラニンＯおよびトルイジンブルー染色後に観察された。
【0136】
骨芽細胞分化のために、ＭＳＣを組織培養１２ウェルプレート（５×１０５細胞／ウェル）中に、完成ＳｔｅｍＰｒｏ骨形成分化キット（ライフテクノロジーズ）中で１４日間プレートした。分化の終わりに、アリザリンレッドＳ．、フォンコッサ（硝酸銀）およびアルカリホスファターゼ染色を用いて、無機化結節の存在を評価した。
【0137】
アリザリンレッドＳ．、フォンコッサ、アルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色は、先に記載したように行った（１３）。最初に、細胞を４％ ＰＦＡ中で、室温で１５分間固定した。洗浄後、細胞を１％アリザリンレッドＳ．、１％硝酸銀、０．１％トルイジンブルー、０．０２％アルシアンブルーまたは０．１％サフラニンＯ溶液のいずれかでインキュベートした。フォンコッサ汚染では、細胞は暗汚染が現れるまで光にさらされた。
【0138】
アルカリホスファターゼ活性は、白血球アルカリホスファターゼ染色キット（ＳＩＧＭＡ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。最初に細胞を４％ＰＦＡ中で、室温で１０分間固定し、洗浄し、そして１５分間、室温、暗所で、ファストバイオレットで染色し、そして画像化した。
【0139】
１０－ フローサイトメトリー分析
ＭＳＣの細胞懸濁液を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理により調製し、ＰＢＳ、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。約２×１０個の５細胞を、所望の細胞表面マーカー抗体またはアイソタイプ対照と共に、４℃で１５分間インキュベートした。ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびアイソタイプコントロール免疫グロブリンＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する特異的抗体を標識に使用した。抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。ＦＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄した後、試料を０．４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次にＡｃｃｕｒｉ Ｃ６＋サイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて進行させ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を用いて分析した。
ＭＳＣの細胞懸濁液を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理により調製し、ＰＢＳ、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。約２×１０個の５細胞を、所望の細胞表面マーカー抗体またはアイソタイプ対照と共に、４℃で１５分間インキュベートした。ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびアイソタイプコントロール免疫グロブリンＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する特異的抗体を標識に使用した。抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。ＦＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄した後、試料を０．４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次にＡｃｃｕｒｉ Ｃ６＋サイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて進行させ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を用いて分析した。
【0140】
１１－統計
各パラメータのサンプルサイズとパワー計算は、データが正規性に従い、有意水準αが０．０５に等しく、Ｆ検定が等分散であるという仮定を用いて、オンライン演算ｐｏｗｅｒａｎｄｓａｍｐｌｅｓｉｚｅ．ｃｏｍを用いて決定した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアを用いて行った。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎ正規性試験を行い、正常性を確認した。正規性と等分散要件を満たした骨格測定については、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による一元配置分散分析（すべての異なる群を比較するための９５％信頼区間）を実施した。正規性と等分散要件を満たさない骨格測定データセットについて、Ｋｒｕｓｋａｌｌ‐Ｗａｌｌｉｓ試験を行った。２つの独立した群の比較には、両側スチューデント検定を用いて各群の平均値を比較した。
各パラメータのサンプルサイズとパワー計算は、データが正規性に従い、有意水準αが０．０５に等しく、Ｆ検定が等分散であるという仮定を用いて、オンライン演算ｐｏｗｅｒａｎｄｓａｍｐｌｅｓｉｚｅ．ｃｏｍを用いて決定した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアを用いて行った。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎ正規性試験を行い、正常性を確認した。正規性と等分散要件を満たした骨格測定については、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による一元配置分散分析（すべての異なる群を比較するための９５％信頼区間）を実施した。正規性と等分散要件を満たさない骨格測定データセットについて、Ｋｒｕｓｋａｌｌ‐Ｗａｌｌｉｓ試験を行った。２つの独立した群の比較には、両側スチューデント検定を用いて各群の平均値を比較した。
【0141】
結果
コラーゲンＩＩ型単独の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの軟骨形成を誘導するのに十分である
ＩＩ型コラーゲン異常症を治療するための導入遺伝子としてヒトＩＩ型コラーゲンを使用する可能性を決定するために、本発明者らはまず間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた実験を行った。このために、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＩＩ型コラーゲンを過剰発現するように細胞を遺伝子改変した。このプロモーターは強陽性プロモーターとして用いられる。次いで、３週間の液体オーバーレイ技術を用いて３Ｄ培養物を作製した。ＭＳＣは通常、軟骨細胞に分化するために軟骨形成培地を必要とする。興味深いことに、通常の非軟骨形成培地で、ＩＩ型コラーゲンを過剰発現するように遺伝子改変した場合、ＭＳＣは、軟骨細胞末端分化のマーカーであるＸ型コラーゲンの発現により、軟骨細胞に分化する可能性を有した（データは示していない）。
コラーゲンＩＩ型単独の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの軟骨形成を誘導するのに十分である
ＩＩ型コラーゲン異常症を治療するための導入遺伝子としてヒトＩＩ型コラーゲンを使用する可能性を決定するために、本発明者らはまず間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた実験を行った。このために、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＩＩ型コラーゲンを過剰発現するように細胞を遺伝子改変した。このプロモーターは強陽性プロモーターとして用いられる。次いで、３週間の液体オーバーレイ技術を用いて３Ｄ培養物を作製した。ＭＳＣは通常、軟骨細胞に分化するために軟骨形成培地を必要とする。興味深いことに、通常の非軟骨形成培地で、ＩＩ型コラーゲンを過剰発現するように遺伝子改変した場合、ＭＳＣは、軟骨細胞末端分化のマーカーであるＸ型コラーゲンの発現により、軟骨細胞に分化する可能性を有した（データは示していない）。
【0142】
これらのデータから、ＩＩ型コラーゲンの過剰発現のみでｉｎ ｖｉｔｒｏ軟骨形成を誘導するには十分であることが示唆された。
【0143】
コラーゲンＩＩ型の過剰発現はｉｎ ｖｉｔｒｏ軟骨形成分化過程を加速する
軟骨形成培地条件下で培養すると、ＭＳＣは通常、約２～３週間で軟骨細胞に分化する。ＩＩ型コラーゲンを過剰発現するように遺伝子改変した場合、ＭＳＣは、マトリックス中のプロテオグリカンの存在および誘導後６日目の速やかなＸ型コラーゲンの発現によって見られるように、軟骨細胞への分化が速かった（図１）。
軟骨形成培地条件下で培養すると、ＭＳＣは通常、約２～３週間で軟骨細胞に分化する。ＩＩ型コラーゲンを過剰発現するように遺伝子改変した場合、ＭＳＣは、マトリックス中のプロテオグリカンの存在および誘導後６日目の速やかなＸ型コラーゲンの発現によって見られるように、軟骨細胞への分化が速かった（図１）。
【0144】
コラーゲンＩＩ型の過剰発現は、接合性ＳＥＤＣ胎児マウスからの大腿骨外植片における骨成長を復元させる。ＩＩ型コラーゲン異常症のポテンシャル治療としてＩＩ型コラーゲン過剰発現を用いる可能性を決定するために、１６．５ｄｐｃ胎児接合性Ｃｏｌ１ａ１ｓｅｄｃ／ｓｅｄｃマウスからの大腿骨外植片を、Ｃｏｌ２または対照としてＧＦＰを過剰発現するＭＳＣと共培養した。培養５日後、外植片をＸ線撮影し、長さと幅を測定した。図２に見られるように、ＩＩ型コラーゲンを発現するＭＳＣとの共培養は、大腿骨の長さと幅の両方の回復をもたらした。処理されたホモ接合性骨の骨幹におけるコラーゲン繊維の存在によって見られるように、適切な骨の石灰化も観察された。
【0145】
４つの構築物は軟骨細胞で高い特異的な発現を示す
正常なＩＩ型コラーゲンの過剰発現がＳＥＤＣマウスから単離したＭＳＣの正常な軟骨形成分化を誘導することを示すこれらの予備的結果は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でレトロウイルスベクターを用いて行われた。ＥＦ１αプロモーターは、治療効果の迅速なスクリーニングを可能にする高レベルの導入遺伝子発現を駆動するため、最初に選択された。異所性ＩＩ型コラーゲン発現によって引き起こされる望ましくない副作用を制限するために、本発明者らは、強力な発現および組織特異的な発現の両方を可能にするいくつかのキメラプロモーターを作製した。そのために、本発明者らは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの調節エレメントを有するＥＦ１αバックボーンを用いて、またはその逆を用いて、ＥＦ１αおよびｈＣＯＬ２Ａ１プロモーター配列の両方の転写因子結合配列間の２４のハイブリッド配列を創製した（図３～６）。
正常なＩＩ型コラーゲンの過剰発現がＳＥＤＣマウスから単離したＭＳＣの正常な軟骨形成分化を誘導することを示すこれらの予備的結果は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でレトロウイルスベクターを用いて行われた。ＥＦ１αプロモーターは、治療効果の迅速なスクリーニングを可能にする高レベルの導入遺伝子発現を駆動するため、最初に選択された。異所性ＩＩ型コラーゲン発現によって引き起こされる望ましくない副作用を制限するために、本発明者らは、強力な発現および組織特異的な発現の両方を可能にするいくつかのキメラプロモーターを作製した。そのために、本発明者らは、ｈＣＯＬ２Ａ１プロモーターの調節エレメントを有するＥＦ１αバックボーンを用いて、またはその逆を用いて、ＥＦ１αおよびｈＣＯＬ２Ａ１プロモーター配列の両方の転写因子結合配列間の２４のハイブリッド配列を創製した（図３～６）。
【0146】
２４の構築物を設計する際、コアプロモーター配列は上流エンハンサーとＴＡＴＡボックスの間にある（転写開始に対応する）。
【0147】
従って、ｈＥＦ１αコアプロモーターの使用はより高い発現レベルを導き、逆にｈＣＯＬ２Ａ１コアプロモーターの使用はより低い発現レベルを導くことが期待された。同様に、ＡＰ２ε部位の使用は特異性を与え、これは特に複数のタンデム（プロモーター２３ａ、２３ｂおよび２５ｂなど）を含むプロモーターの場合にも当てはまることが予想された。
【0148】
最後に、それらの「ａ」バージョンと比較して追加のＮ１エレメントを含有する「ｂ」プロモーター配列は、より低い発現レベルを示すと予想された。
【0149】
したがって、想定された２４個のプロモーター構築物は、以下の通りであった：
－それぞれ、配列番号１８および１９のプロモーター１ａおよび１ｂ；
－それぞれ、配列番号２０および２１のプロモーター５ａおよび５ｂ；
－それぞれ、それぞれ、配列番号２２および２３のプロモーター１１ａおよび１１ｂ；
－それぞれ、配列番号２４および２５のプロモーター１２ａおよび１２ｂ；
－それぞれ、配列番号１１および１２のプロモーター１３ａおよび１３ｂ（両方とも本発明によるハイブリッドプロモーター）；
－それぞれ、配列番号１３および１４のプロモーター１４ａおよび１４ｂ（両方とも本発明によるハイブリッドプロモーター）；
－それぞれ、配列番号１５および１６のプロモーター１５ａおよび１５ｂ（両方とも本発明によるハイブリッドプロモーター）；
－プロモーター２１ａおよび２１ｂ；
－プロモーター２２ａおよび２２ｂ（２２ａのみが本発明によるハイブリッドプロモーターであり；配列番号１７を有する）；
－プロモーター２３ａ（配列番号２６の）および２３ｂ（配列番号３０である）；
－プロモーター２４ａ（配列番号２７の）および２４ｂ；並びに
－それぞれ、配列番号２８および２９の－プロモーター２５ａおよび２５ｂ。
－それぞれ、配列番号１８および１９のプロモーター１ａおよび１ｂ；
－それぞれ、配列番号２０および２１のプロモーター５ａおよび５ｂ；
－それぞれ、それぞれ、配列番号２２および２３のプロモーター１１ａおよび１１ｂ；
－それぞれ、配列番号２４および２５のプロモーター１２ａおよび１２ｂ；
－それぞれ、配列番号１１および１２のプロモーター１３ａおよび１３ｂ（両方とも本発明によるハイブリッドプロモーター）；
－それぞれ、配列番号１３および１４のプロモーター１４ａおよび１４ｂ（両方とも本発明によるハイブリッドプロモーター）；
－それぞれ、配列番号１５および１６のプロモーター１５ａおよび１５ｂ（両方とも本発明によるハイブリッドプロモーター）；
－プロモーター２１ａおよび２１ｂ；
－プロモーター２２ａおよび２２ｂ（２２ａのみが本発明によるハイブリッドプロモーターであり；配列番号１７を有する）；
－プロモーター２３ａ（配列番号２６の）および２３ｂ（配列番号３０である）；
－プロモーター２４ａ（配列番号２７の）および２４ｂ；並びに
－それぞれ、配列番号２８および２９の－プロモーター２５ａおよび２５ｂ。
【0150】
これらの２４個の仮説構築物のうち、７個のプロモーター１ａ、２１ａ、２４ａ、２５ａ、２１ｂ、２２ｂおよび２４ｂは、高度に反復する配列のために生成することができなかった（図３－６、点を有する構築物を参照）。
【0151】
各構築物で得られた発現レベルは、軟骨細胞様細胞（ＡＴＤＣ５、マウス軟骨細胞株）における伝達後のＦＡＣＳ分析により評価した。Ｂａｆ３細胞（マウスＢ細胞株）における発現を用いて特異性を検証した。構築物は、コラーゲンＩＩ型およびＧＦＰを共発現するためのＩＲＥＳエレメントを含んでいた。
【0152】
以下の結果が得られた：
・４種類の構築物（１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ）はＢ型リンパ球に発現せず、軟骨細胞で高発現していた（図７）；
・「ｂ」プロモーター配列は、それらの「ａ」バージョンよりも低いレベルの発現を示した；
・驚くべきことに、ｈＣＯＬ２Ａ１コアプロモーターに基づくプロモーター配列が最も高い特異性を示した。特に、ＥＦ１αプロモーター（ＥＦＰ１およびＥＦＰ２エレメント）の調節エレメントを含むハイブリッドプロモーター１３ａおよび１３ｂで非常に良好な結果が得られた。逆に、プロモーター１５ａおよび１５ｂが、ハイブリッドプロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａおよび１４ｂとは異なる挙動を示すことは驚くべきことであったが、これらのプロモーター１５ａおよび１５ｂは、Ｂリンパ球において発現を示した；
・ハイブリッドプロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａおよび１４ｂは、驚くべきことに、最も高い発現レベルを与えたが、一方、それらは主にｈＣＯＬ２Ａ１プロモーター配列に基づく；
・最後に、ｈＣＯＬ２Ａ１コアプロモーターのタンデムリピートを含むプロモーター２２～２５（それらの「ａ」および「ｂ」バージョン）が高レベルの発現を与えると予想され、反対の結果が得られた。
・４種類の構築物（１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ）はＢ型リンパ球に発現せず、軟骨細胞で高発現していた（図７）；
・「ｂ」プロモーター配列は、それらの「ａ」バージョンよりも低いレベルの発現を示した；
・驚くべきことに、ｈＣＯＬ２Ａ１コアプロモーターに基づくプロモーター配列が最も高い特異性を示した。特に、ＥＦ１αプロモーター（ＥＦＰ１およびＥＦＰ２エレメント）の調節エレメントを含むハイブリッドプロモーター１３ａおよび１３ｂで非常に良好な結果が得られた。逆に、プロモーター１５ａおよび１５ｂが、ハイブリッドプロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａおよび１４ｂとは異なる挙動を示すことは驚くべきことであったが、これらのプロモーター１５ａおよび１５ｂは、Ｂリンパ球において発現を示した；
・ハイブリッドプロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａおよび１４ｂは、驚くべきことに、最も高い発現レベルを与えたが、一方、それらは主にｈＣＯＬ２Ａ１プロモーター配列に基づく；
・最後に、ｈＣＯＬ２Ａ１コアプロモーターのタンデムリピートを含むプロモーター２２～２５（それらの「ａ」および「ｂ」バージョン）が高レベルの発現を与えると予想され、反対の結果が得られた。
【0153】
これらの結果を考慮して、ハイブリッドプロモーター１３ａを、マウスにおけるその後の評価のために選択した。新生ＷＴ動物を用いて実施した体内分布試験では、積分レベルに標準化した場合、構築１３ａによって駆動される発現レベルは内因性コラーゲンＩＩ型発現レベルと相関しており、成長板軟骨における相対レベルがより高くなることが示された（図１１）。
【0154】
Ｃｏｌ２ｓｅｄｃ／ｓｅｄｃマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ概念実証
試験に組み入れた動物数は以下のとおりであった：
試験に組み入れた動物数は以下のとおりであった：
【表2】
【0155】
本発明によるハイブリッドプロモーター１３ａの低用量レンチウイルス粒子の注入後、１日目および７日目に、最初の観察は、ビヒクル処理したマウスと比較して、処理したホモ接合性動物における生存の有意な補正であった（図８）。
【0156】
この増加した生存は、以下の表および図１２に示すように、リブケージ容積および大後頭孔面積の回復と関連している。孔と頭蓋骨の端の間の距離も回復された。頭蓋骨の位置は治療後に修正され、頸部の不安定性から患者を保護することができるため、これらの所見は重要である。
【0157】
【表3】
【0158】
【表4】
【0159】
体長および尾長並びに上腕骨、脛骨および大腿骨を含む、主長骨に用量反応効果が認められた（図１０）。これは、軸骨格と四肢骨格の両方を回復させる治療の均一な効果を確認する。さらに、組織学的分析では、処理したＨＯマウスと未処置のＨＯマウスでは増殖板の構造が回復し（図１３）、処理した動物ではコラーゲン２型の含有量が増加することが示された（データは示されていない）。
【0160】
Ｓｅｄｃ患者からのｉＰＳＣの生成
レンチウイルスベクターベースの治療法をヒトの状況で試験するために、本発明者らは、患者のＰＢＭＣを用いてｉＰＳＣを作製した。ゲノム解析により、患者はＳｅｄｃに関連するＣＯＬ２Ａ１ Ｇ８９７Ｒ変形例を有していたことが明らかになった。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、Ｓｅｄｃ患者および２つの無関係な野生型個体からの全血試料から得たＰＢＭＣから作製した。単離後、細胞を再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含むセンダイウイルスに感染させた。感染から２１日後、胚性幹細胞形態を有する細胞を個別に拾い上げ、拡大してクローンｉＰＳＣ集団を得た。
レンチウイルスベクターベースの治療法をヒトの状況で試験するために、本発明者らは、患者のＰＢＭＣを用いてｉＰＳＣを作製した。ゲノム解析により、患者はＳｅｄｃに関連するＣＯＬ２Ａ１ Ｇ８９７Ｒ変形例を有していたことが明らかになった。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、Ｓｅｄｃ患者および２つの無関係な野生型個体からの全血試料から得たＰＢＭＣから作製した。単離後、細胞を再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含むセンダイウイルスに感染させた。感染から２１日後、胚性幹細胞形態を有する細胞を個別に拾い上げ、拡大してクローンｉＰＳＣ集団を得た。
【0161】
培養にいくつかの継代を経た後、対照（以下ＣＯＬ２＋／＋）とＳｅｄｃ（以下Ｇ８９７Ｒ）ｉＰＳＣは、幹細胞の形態を示し、細胞が自己更新可能であることを示した。これは胚マーカーの発現により確認された。対照および患者由来のｉＰＳＣはいずれも、免疫蛍光法により測定されるように、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０を発現する（図１４Ａ）。それらの多能性は、分化した内胚葉、中胚葉および外胚葉層を有する胚様体（ＥＢ）を形成する能力によって評価した。１４日間の浮遊培養により、ＣＯＬ２＋／＋およびＧ８９７Ｒ ｉＰＳＣからＥＢを作製した。形態学的には、ＣＯＬ２＋／＋とＧ８９７Ｒ ｉＰＳＣクローン間のＥＢ形成に差は見られなかった（図１４Ａ）。
【0162】
すべてのクローンについて、未分化ｉＰＳＣと比較すると、ＣＯＬ２＋／＋およびＧ８９７Ｒ ｉＰＳＣから誘導したＥＢにおいて、多能性マーカーＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの発現は有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図１４Ｂ）。内胚葉遺伝子である、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）、およびヘパトサイト核因子３－ベータ（ＨＮＦ－３Ｂ、ＦＯＸＡ２）の発現は、未分化ｉＰＳＣと比較して、ＣＯＬ２＋／＋およびＧ８９７Ｒ ｉＰＳＣにおいて、分化後に増加した（ｐ＜０．０５）（図１４Ｂ）。中胚葉遺伝子である、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（ＲＵＮＸ１）およびＣＤ３４の発現も、分化１４日後に有意なアップレギュレーション（ｐ＜０．０５）を示した（図１４Ｂ）。最後に、外胚葉マーカーである、ＮＥＳＴＩＮ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、性決定領域Ｙ－ｂｏｘ１（ＳＯＸ１）の発現は、未分化ｉＰＳＣと比較して、ＣＯＬ２＋／＋およびＧ８９７Ｒ ｉＰＳＣにおいて類似した発現の増加（ｐ＜０．０５）を示した（図１４Ｂ）。また、胚性幹細胞に特徴的な強いアルカリホスファターゼ活性も示した（図１４Ａ）。
【0163】
結論として、すべての遺伝子型のｉＰＳＣに由来するＥＢ間で、これらのマーカーの発現レベルに差は認められなかった。これらの結果は、ＣＯＬ２Ａ１が３つの機能的な原始胚葉の形成に遺伝的に必要ではないことを示している。
【0164】
Ｓｅｄｃ患者細胞に対する治療効果
患者細胞に対する治療効果を評価するために、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を以前に作成したｉＰＳＣから分化させた。実際、胚発生の間、骨および軟骨を含む骨格要素は間葉系列に由来する。
患者細胞に対する治療効果を評価するために、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を以前に作成したｉＰＳＣから分化させた。実際、胚発生の間、骨および軟骨を含む骨格要素は間葉系列に由来する。
【0165】
分化過程において、両遺伝子型由来の細胞は、細胞が分化していることを示す形態学的変化を受けることができた。ＣＯＬ２＋／＋細胞が典型的なＭＳＣ機構を示すのに対し（図１５Ａ）、発明者は、Ｇ８９７Ｒ細胞が適正ＭＳＣ機構を持たないことを観察した（図１５Ａ）。これは、図１５Ａに見られるように、これは遺伝子治療によって修正された。分化の終わりに、典型的なＭＳＣ表面マーカーの発現をＦＡＣＳ分析により評価した。ＣＯＬ２＋／＋細胞は予想通りＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ７３陽性であった。未治療患者ではフローサイトメトリーピークのシフトが認められ、すべての細胞表面マーカーが有意に減少していた（図１５Ｂ）。わずか１０～１５％の細胞の遺伝子改変に続いて、本発明者らは、ほぼ完全な集団について間葉細胞表面マーカーの回復を観察し、正常な２型コラーゲンを過剰発現する細胞の数パーセントのみが間葉ネットワークの組織を回復するのに十分であることを示唆した。
【0166】
さらに、本発明者はＣＯＬ２＋／＋、Ｇ８９７Ｒを評価し、Ｇ８９７Ｒ ＭＳＣの脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への分化ポテンシャルを処理した。すべての群において、細胞は脂肪細胞（オイルレッドＯ．染色で示される）と骨芽細胞（データは示されていないが、アリザリンレッドＳ、フォンコッサ、および強いアルカリホスファターゼ活性の陽性で示される）に分化する同じ能力を示した。しかしながら、軟骨分化に提出されると、Ｇ８９７Ｒ ＭＳＣは、低減されたアルシアンブルー、トルイジンブルーおよびサフラニンＯ．染色（図１６）で示されるように、ＣＯＬ２＋／＋ＭＳＣと比較して、より低い軟骨分化能力を示し、ＣＯＬ２Ａ１機能の喪失が軟骨細胞外マトリックス形成に影響を及ぼすことを示唆した。遺伝子導入後、脂肪細胞および骨芽細胞分化能は影響を受けなかった。しかしながら、処置患者細胞は、非処置患者細胞と比較して、アルシアンブルー、トルイジンブルーおよびサフラニンＯ．染色の増加によって示されるように、軟骨形成分化能の増加を示した（図１６）。
【0167】
結論
・本発明のハイブリッドプロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａおよび１４ｂは、軟骨細胞における発現レベルの増加を示す一方で、組織特異的である；
・ＩＩ型コラーゲンの過剰発現は、ＳＥＤＣ接合性胎児の大腿骨外植片の骨成長を回復させる；
・ＳＥＤＣの治療のための直接的遺伝子治療、および多数の軟骨疾患を治療するためのツールを開発する可能性がある；
・また、患者細胞から得られたｉＰＳＣ由来間葉系幹細胞の分化に対しても治療効果が認められた。興味深いことに、正常な２型コラーゲンを発現する細胞のほんの数％が、ほぼ正常な分化を回復するのに十分であった。
・本発明のハイブリッドプロモーター１３ａ、１３ｂ、１４ａおよび１４ｂは、軟骨細胞における発現レベルの増加を示す一方で、組織特異的である；
・ＩＩ型コラーゲンの過剰発現は、ＳＥＤＣ接合性胎児の大腿骨外植片の骨成長を回復させる；
・ＳＥＤＣの治療のための直接的遺伝子治療、および多数の軟骨疾患を治療するためのツールを開発する可能性がある；
・また、患者細胞から得られたｉＰＳＣ由来間葉系幹細胞の分化に対しても治療効果が認められた。興味深いことに、正常な２型コラーゲンを発現する細胞のほんの数％が、ほぼ正常な分化を回復するのに十分であった。
【0168】
参考文献
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2. Bonafe L,Cormier-Daire V,Hall C,Lachman R,Mortier G,Mundlos S,et al.Nosology and classification of genetic skeletal disorders:2015 revision.Am J Med Genet A.2015;167A(12):2869-92.
3. Jobling R,D’Souza R,Baker N,Lara-Corrales I,Mendoza-Londono R,Dupuis L,et al.The collagenopathies:review of clinical phenotypes and molecular correlations.Curr Rheumatol Rep.2014;16(1):394.
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6. Terhal PA,Nievelstein RJ,Verver EJ,Topsakal V,van Dommelen P,Hoornaert K,et al.A study of the clinical and radiological features in a cohort of 93 patients with a COL2A1 mutation causing spondyloepiphyseal dysplasia congenita or a related phenotype.Am J Med Genet A.2015;167A(3):461-75.
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12. Okada M,Ikegawa S,Morioka M,Yamashita A,Saito A,Sawai H,et al.Modeling type II collagenopathy skeletal dysplasia by directed conversion and induced pluripotent stem cells.Hum Mol Genet.2015;24(2):299-313.
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】