▶ シグネット バイオテック インコーポレイテッドの特許一覧
特表2022-514125ＦＡＳ信号伝達抑制用ペプチドを含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(54)【発明の名称】ＦＡＳ信号伝達抑制用ペプチドを含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20220202BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220202BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220202BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220202BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220202BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220202BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20220202BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20220202BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
A61P43/00 111
A61P3/04
A61P3/06
A61P1/16
A61K9/08
A61K9/10
C07K7/06 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021553754
(86)(22)【出願日】2019-11-14
(85)【翻訳文提出日】2021-06-02
(86)【国際出願番号】 KR2019015585
(87)【国際公開番号】W WO2020116810
(87)【国際公開日】2020-06-11
(31)【優先権主張番号】10-2018-0154274
(32)【優先日】2018-12-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521240354
【氏名又は名称】シグネット バイオテック インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＧＮＥＴ ＢＩＯＴＥＣＨ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イ、サン－ギョン
(72)【発明者】
【氏名】チョン、コンホ
(72)【発明者】
【氏名】ウッラ、イルファン
(72)【発明者】
【氏名】ペ、ス ミン
(72)【発明者】
【氏名】イム、ジェ ヨン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA16
4C076AA22
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB16
4C076CC16
4C076CC21
4C076CC29
4C076FF12
4C076FF14
4C076FF15
4C076FF36
4C076FF39
4C076FF61
4C076FF63
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA701
4C084ZA702
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZC021
4C084ZC022
4C084ZC331
4C084ZC332
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045EA20
4H045FA10
(57)【要約】
本発明は、Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチドを有効成分として含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物に関し、前記Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチドは、肥満時、肝臓と脂肪組織において多く発現するＦａｓに特異的に結合するため、肥満による炎症部位に対する伝達効率が高く、炎症の主要な信号伝達体系であるＦａｓ信号伝達を直接的に抑制して炎症反応を抑制できるため、肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の改善、治療用途として有用に使用されてもよい。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドを有効成分として含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。[一般式Ｉ]
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｘａａ２－Ｘａａ３
前記一般式において、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、存在しないか、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選ばれる。
【請求項2】
前記Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチドは、下記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。[一般式Ｉ]
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｘａａ２－Ｘａａ３
前記一般式において、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、またはＴｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐからなる群から選ばれ、
Ｘａａ２は、存在しないか、またはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓからなる群から選ばれる。
【請求項3】
前記Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチドは、下記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。[一般式Ｉ]
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｘａａ２－Ｘａａ３
前記一般式において、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立してＴｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐからなる群から選ばれ、
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓからなる群から選ばれる。
【請求項4】
前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝であるものである、請求項１に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記薬学的組成物は、静脈内、皮下及び経口からなる群から選ばれる経路を介して投与されるものである、請求項１に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項6】
前記薬学的組成物は、注射剤の形態で投与されるものである、請求項１に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項7】
前記一般式Ｉのアミノ酸配列は、配列番号１～１２からなる群から選ばれる配列を含むものである、請求項１に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項8】
前記一般式Ｉのアミノ酸配列は、配列番号７～１２からなる群から選ばれる配列を含むものである、請求項６に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項9】
前記一般式Ｉのアミノ酸配列は、配列番号１０～１２からなる群から選ばれる配列を含むものである、請求項７に記載の肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項10】
下記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドを有効成分として含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。[一般式Ｉ]
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｘａａ２－Ｘａａ３
前記一般式において、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、存在しないか、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選ばれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチドを有効成分として含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
肥満は、世界的に非常に急速に広がっており、現在では、世界人口の２５％に当たる１７億人が過体重（ＢＭＩ２５以上）であり、西欧地域では、ＢＭＩ３０以上の肥満患者が約３億人に達している。また、子供５人のうち１人が小児肥満に該当し、その数が急激に上昇しており、小児肥満が深刻な社会問題として浮上している。特に小児肥満の場合には、脂肪が多いほど性ホルモンの分泌が刺激され、思春期早発症のような成長障害を引き起こし、血液循環と栄養バランスに影響を及ぼし、成長阻害の原因となる。肥満は、主な成人病の危険要素として、高血圧、糖尿病、動脈硬化症、脳卒中、心臓麻痺及び各種の腫瘍などのような成人病の発生に関与し（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１２：３０６６－３０７２）、病気の進行を促進させることもあるが、肥満によって成人病にかかるリスクは、健常者よりも３倍ないし６倍高いと知られている。したがって、肥満は、単に外見上の問題だけではなく、健康に直結する重大な問題に違いない。
【0003】
特に肥満人口が増加しつつ、体内に残るエネルギーが肝臓に中性脂肪の形で蓄積される非アルコール性脂肪肝患者も増加している。非アルコール性脂肪肝が長く続くと、炎症反応が誘発されて脂肪肝炎に進み、結局、肝硬変、肝がんまで悪化するおそれがあるため、予防と効果的な治療が必要である。
【0004】
現在、肥満治療剤として使用されているノボノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）のサクセンダ（Ｓａｘｅｎｄａ、一般名リラグルチド）は、ＧＬＰ－１類似体であって人体ホルモンであるＧＬＰ－１と９７％ほど類似し、１日１回皮下に投与する。臨床研究においてサクセンダは、最初の体重に関係なく、肥満人の体重を５～１０％減らし、その体重を維持すれば、血糖値と血圧、コレステロール数値、閉塞性睡眠時無呼吸症の改善だけではなく、健康上の多くの利点を得ることができることが分かった。しかし、悪心、嘔吐、下痢、便秘などの副作用があり、減量に成功した人も薬の投与を中断する場合、ヨーヨー現象（体重が元に戻る現象）が現われるため、生活習慣を改善しない限り、肥満を根本的に治療できないのが実情である。
【0005】
本発明者らは、肥満及び脂肪肝の根本的な治療のために研究した結果、脂肪組織以外の肝臓においてもＦａｓ受容体が多く発現することを発見し、前記Ｆａｓ受容体の信号伝達を遮断して炎症反応を抑制することにより、肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎を改善できることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチド、前記ペプチドを有効成分として含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記目的を達成するため、本発明の一態様は、下記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドを有効成分として含む肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【0008】
[一般式Ｉ]
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｘａａ２－Ｘａａ３
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｘａａ２－Ｘａａ３
【0009】
前記一般式において、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、存在しないか、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選ばれる。
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、存在しないか、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選ばれる。
【0010】
本明細書において用いられた用語の「Ｆａｓ」は、Ｆａｓ、ＦａｓＲ（Ｆａｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＡＰＯ－１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ １）、又はＣＤ９５（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）とも呼ばれ、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を調節する腫瘍壊死因子受容体（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）の一種である。Ｆａｓがリガンドと結合すると、多重化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を介して活性化され、その結果として、複数のアダプター（ａｄａｐｔｏｒ）タンパク質がＦａｓに結合する。結合したアダプタータンパク質は、様々な細胞死滅の信号伝達体系を活性化させ、代表的な信号伝達調節因子としては、カスパーゼ、ＮＦ－κＢ、ＳＡＰＫ（ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）、Ｂｃｌ－２ファミリーなどがある。
【0011】
本明細書において用いられる用語の「Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチド」は、前述のＦａｓに結合して、通常のＦａｓリガンドと逆にＦａｓの下位信号伝達体系を抑制する活性、細胞死滅抑制活性を有するペプチドを意味する。
【0012】
本発明の一具体例において、前記一般式ＩにおいてＸａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸であってもよく、好ましくは、それぞれ独立してＴｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐからなる群から選ばれてもよい。
【0013】
また、前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ２は、存在しないか、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選ばれてもよく、好ましくは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓからなる群から選ばれてもよい。
【0014】
例えば、１）Ｘａａ１及びＸａａ３はすべて存在せず、Ｘａａ２のみ存在してもよく、２）Ｘａａ１及びＸａａ３のうちいずれかが存在するとともにＸａａ２が存在してもよく、３）Ｘａａ１～Ｘａａ３がすべて存在しないなど、様々な組み合わせが可能である。
【0015】
本発明の一具体例において、前記一般式Ｉのアミノ酸配列は、配列番号１～１２からなる群から選ばれる配列であってもよく、好ましくは、配列番号７～１２からなる群から選ばれてもよく、より好ましくは、配列番号１０～１２からなる群から選ばれる配列であってもよい。
【0016】
一方、本発明において用いられるＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドは、ペプチドの向上した安定性、強化された薬理特性（半減期、吸収性、力価、効能など）、変更された特異性（例えば、広範な生物学的活性スペクトル）、減少した抗原性を得るため、ペプチドのＮ－及び／又はＣ－末端が修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。前記数式は、前記ペプチドのＮ－及び／又はＣ－末端にアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、アミド基、ホルミル基、ミリスチル基、ステアリル基、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合された形態であってもよいが、ペプチドの改質、特にペプチドの安定性を向上させることができる成分であれば、制限なく含んでもよい。本明細書において用いられる用語の「安定性」は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から、本発明のペプチドを保護するインビボ安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。
【0017】
本発明において、前記肥満は、肥満の他に、糖尿病、脂肪肝、高脂血症、動脈硬化症、及びこれらの合併症のような肥満関連疾患を含み、前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝であってもよい。
【0018】
非アルコール性脂肪肝は、運動不足、高熱量食事などの悪い生活習慣によって過剰なエネルギーが肝に中性脂肪の形でたまって発生する疾患をいう。放置する場合、肝炎、肝硬変から肝がんまで進行することがあるが、現在までは、適当な治療薬がなく、運動及び食生活の改善による治療が主に行われている。本発明において、前記非アルコール性脂肪肝は、単に脂肪がたまっているだけであり肝細胞の損傷はほとんどない単純非アルコール性脂肪肝、肝細胞の損傷が激しく、持続する慢性非アルコール性脂肪肝炎、肝硬変症に至る多様な形態の肝疾患を含む。
【0019】
本発明者らは、肥満時に脂肪組織にとともに肝組織においてもＦａｓが多く発現し、特に肝臓では、肥満レベルが増加するにつれて、Ｆａｓの発現も比例的に増加することを確認した（図８）。そこで、Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチドを生体内に投与すると、肥満モデルマウスの肝臓と脂肪組織に特異的に伝達されて（図１０）Ｆａｓと結合することが分かった（図９）。すなわち、本発明は、脂肪組織及び肝組織に直接的に薬物（Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチド）を伝達してＦａｓ信号伝達による炎症反応、細胞死滅、脂肪蓄積などを抑制し、結果として肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の症状を改善できることを確認したものである（図１４～図４４）。
【0020】
本明細書において用いられる用語の「治療」は、本発明によるＦａｓ信号伝達抑制用ペプチド又はこれを含む薬学的組成物の投与により肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎関連疾患の症状が好転するか、または有利に変更されるすべての行為を意味する。
【0021】
本明細書において用いられる用語の「投与」は、任意の適切な方法で対象に所定の物質、すなわち、本発明によるＦａｓ信号伝達抑制用ペプチド又はこれを含む薬学的組成物を導入することを意味する。これにより、本発明の薬学的組成物は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、肺内投与、直腸内投与などの方式で投与されてもよいが、静脈内、皮下又は経口を介して投与されることが好ましい。具体的には、本発明の薬学的組成物が肥満の予防又は治療用途として用いられる場合には、静脈内投与が好ましく、脂肪肝又は脂肪肝炎の予防又は治療用途として用いられる場合には、皮下投与が好ましい。
【0022】
本発明の一具体例によると、本発明のＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドは、静脈注射時（全身伝達時）肝臓と脂肪組織に特異的に伝達され、皮下注射時には、肝臓に特異的に伝達されて（図１０）、炎症反応を抑制する特徴がある。また、肥満モデルマウスにＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドを静脈注射で投与した場合には、体重が増加するが（図２４のＡ）、皮下注射時には、体重が維持される傾向を示した（図３７）。これにより、同量のＦａｓ信号伝達抑制用ペプチド又はこれを含む薬学的組成物を使用しても、投与経路に応じて肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の治療／改善効果のレベルが異なり得ることが分かる。
【0023】
一方、本発明の薬学的組成物は、静脈内又は皮下投与が容易なように注射剤の形態で投与されてもよい。注射剤として製造される場合、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定剤などが混合されてもよく、単位投薬アンプル又は多重投与形態で製造されてもよい。
【0024】
本発明において、「有効成分として含有」という用語は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野においてよく知られている要素によって決定されてもよい。本発明によるペプチド又はこれを含む薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤と順次又は同時に投与されてもよく、単一又は多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されてもよい。本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重、及び疾患の重症度などの様々な関連因子とともに、活性成分の種類に応じて決定される。
【0025】
したがって、本発明の薬学的組成物は、有効成分としてＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドを含むことに加えて、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロス、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。適切な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．， １９９５）に詳細に記載されている。
【0026】
本発明の薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々に処方されてもよい。一方、本発明の薬学的組成物の投与量は、好ましくは、１日当たり０.００１－１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【0027】
本発明の薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野において、通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、またはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。
【0028】
本発明の他の態様は、下記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドを提供する。
【0029】
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｘａａ２－Ｘａａ３
【0030】
前記一般式において、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ２は存在しないか、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選ばれる。
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ２は存在しないか、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選ばれる。
【0031】
前記Ｆａｓ信号伝達抑制用ペプチドは、肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の治療又は改善用薬学的組成物に含まれるＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドと同一であるため、重複内容は、記載を省略する。
【発明の効果】
【0032】
本発明のＦａｓ信号伝達抑制用ペプチドは、肥満時、肝臓と脂肪組織において多く発現するＦａｓに特異的に結合するため、肥満による炎症部位に対する伝達効率が高く、炎症の主要な信号伝達体系であるＦａｓ信号伝達を直接的に抑制して炎症反応を抑制できるため、肥満、脂肪肝又は脂肪肝炎の改善、治療用途として有用に使用しうる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】図１は、Ｆａｓが常に発現するＪｕｒｋａｔ細胞株に信号伝達抑制ペプチドであるＦＢＰ－８、ＦＢＰ－Ａ及びＦＢＰ－７を処理してＦａｓとの結合の有無を確認した結果である。 Ｍｏｃｋ＝非処理群（いかなるペプチドも処理しない実験群）； ＣｔｒＦＢＰ＝陰性対照群（対照ペプチド処理群）；ＦＢＰ－８＝ＹＣＤＥＨＦＣＹペプチド処理群； ＦＢＰ－Ａ＝ＹＣＤＥＨＦＡＹ処理群及びＦＢＰ－７＝ＹＣＤＥＨＦＹ処理群。
【図2】図２は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株にＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とＦａｓ信号伝達抑制ペプチドであるＦＢＰ－８、ＦＢＰ－Ａ又はＦＢＰ－７を同時に処理した後、細胞死滅レベルを確認した結果（Ａ）及び血清においてＦＢＰ－８とＦＢＰ－７の安定性を確認した結果（Ｂ）である。
【図8】図８は、正常体重マウス（ＮＣＤ）と肥満モデルマウス（ＨＦＤ）の白色脂肪組織及び肝組織においてＦａｓ発現レベル（Ａ及びＢ）、肥満モデルマウス（ＨＦＤ）の肝組織において体重によるＦａｓ発現の変化（Ｃ）及びＦａｓ発現細胞の割合（Ｄ）を確認した結果である。ＮＣＤ＝正常飼料給与群（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｅｔ）；ＨＦＤ＝高脂肪飼料給与群（ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ）；ＷＡＴ＝白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）；及びＬｉｖｅｒ＝肝組織。
【図10】図１０は、肥満モデルマウス（ＨＦＤ）に蛍光標識されたＦＢＰ－８を皮下注射（Ａ）又は静脈注射（Ｂ）で注入し、２４時間及び４８時間後に各臓器の蛍光分布を確認した結果である。Ｍｏｃｋ＝非投与群（ペプチド非投与）；ＣｔｒＦＢＰ＝陰性対照群（対照ペプチド投与）；及びＦＢＰ－８＝ＦＢＰ－８投与群。
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0035】
実験方法
１．ペプチド
ペプチドは、下記配列をＰＥＰＴＲＯＮ社（大田、大韓民国）で合成した後、凍結乾燥状態でｐＨ７.４のＰＢＳに溶解させて使用した。最初のペプチドは、先行文献（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００４ Ａｐｒ ２７；１０１（１７）：６５９９－６０４）に開示されている。
１．ペプチド
ペプチドは、下記配列をＰＥＰＴＲＯＮ社（大田、大韓民国）で合成した後、凍結乾燥状態でｐＨ７.４のＰＢＳに溶解させて使用した。最初のペプチドは、先行文献（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００４ Ａｐｒ ２７；１０１（１７）：６５９９－６０４）に開示されている。
【0036】
Ｆａｓ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＦＢＰ又はＦＢＰ－８）：ＹＣＤＥＨＦＣＹ（配列番号１１）
Ｆａｓ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ７（ＦＢＰ７）：ＹＣＤＥＨＦ－Ｙ（配列番号１０）
Ｆａｓ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ（ＦＢＰＡ）：ＹＣＤＥＨＦＡＹ（配列番号１２）
Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＴＲＰ）：ＹＣＮＳＴＶＣＹ（配列番号１３）
Ｆａｓ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ７（ＦＢＰ７）：ＹＣＤＥＨＦ－Ｙ（配列番号１０）
Ｆａｓ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ（ＦＢＰＡ）：ＹＣＤＥＨＦＡＹ（配列番号１２）
Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＴＲＰ）：ＹＣＮＳＴＶＣＹ（配列番号１３）
【0037】
２．細胞培養
ヒト血液がん細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞株とマウス脂肪細胞である３Ｔ３Ｌ１細胞株は、ＡＴＣＣ（米国）から購入し、Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン及び２５ｍＭブドウ糖が含まれたＲＰＭＩ培養液で培養した。
ヒト血液がん細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞株とマウス脂肪細胞である３Ｔ３Ｌ１細胞株は、ＡＴＣＣ（米国）から購入し、Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン及び２５ｍＭブドウ糖が含まれたＲＰＭＩ培養液で培養した。
【0038】
３Ｔ３Ｌ１細胞株は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン及び２５ｍＭブドウ糖が含まれたＤＭＥＭ培養液で培養した。３Ｔ３Ｌ１細胞株は、２ｘ１０５細胞／ｍｌ濃度で前記ＤＭＥＭ培養液に分注して３日間、脂肪細胞成熟化を誘導し、その後、インスリンが含まれた培養液に交換し、さらに３日間、脂肪細胞成熟化を誘導した。その後、前記ＤＭＥＭ培養液で２日間さらに培養して脂肪細胞の完全な成熟化を達成した。
【0039】
３．細胞毒性及び細胞死滅実験
前記１．に記載されたペプチドの細胞毒性実験は、ＣＣＫ－８分析キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本）で行った。３Ｔ３Ｌ１細胞株に様々な濃度（ｕＭ）のペプチドを処理し、２４時間後に細胞毒性を分析した。
前記１．に記載されたペプチドの細胞毒性実験は、ＣＣＫ－８分析キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本）で行った。３Ｔ３Ｌ１細胞株に様々な濃度（ｕＭ）のペプチドを処理し、２４時間後に細胞毒性を分析した。
【0040】
３Ｔ３Ｌ１細胞株にＦａｓＬ（Ｆａｓ Ｌｉｇａｎｄ）を５００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理して細胞死滅を誘導し、Ａｌｅｘａ ６４７と結合されたＦＢＰ信号遮断ペプチド（ＦＢＰ－８、ＦＢＰ－Ａ及びＦＢＰ－７）及びＣｔｒＦＢＰをそれぞれ処理した。ペプチド処理４時間後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ－結合アネキシンＶ（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を処理してフローサイトメトリーで細胞死滅抑制効果を分析した。
【0041】
４．動物実験
本発明のために行われたすべての動物実験は、漢陽大学校の動物実験倫理委員会の承認を受けた。肥満モデルマウスを作製するため、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに８週間高脂肪飼料を給与し、マウスの体重が４２～４４ｇの範囲になったとき、無作為に実験群によって分類した。その後、実験群によってＦＢＰ８ ６０μｇ／１回を静脈注射で１週間に２回ずつ、計５週間投与するか(図１３）、またはＦＢＰ７を毎日２回ずつ皮下注射で投与した。
本発明のために行われたすべての動物実験は、漢陽大学校の動物実験倫理委員会の承認を受けた。肥満モデルマウスを作製するため、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに８週間高脂肪飼料を給与し、マウスの体重が４２～４４ｇの範囲になったとき、無作為に実験群によって分類した。その後、実験群によってＦＢＰ８ ６０μｇ／１回を静脈注射で１週間に２回ずつ、計５週間投与するか(図１３）、またはＦＢＰ７を毎日２回ずつ皮下注射で投与した。
【0042】
５．組織免疫学的分析
動物実験終了後、マウスを犠牲にして肝組織と白色脂肪組織を分離し、組織切片を作製した。作製した肝組織及び白色脂肪組織切片に９５℃の抗原暴露バッファ（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｂｕｆｆｅｒ）を２５分間処理した後、室温で冷却させた。その後、組織切片に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％ヤギ血清及び０.０５％ツイン２０を含むＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅｄ Ｓａｌｉｎｅ＋Ｔｗｅｅｎ２０）を処理してブロッキング過程を経て、Ｆａｓ受容体特異的１次抗体と４℃で１８時間反応させた。その後、ＴＢＳＴで組織切片を洗浄し、ＦＩＴＣ－結合２次抗体と２時間室温で反応させた。
動物実験終了後、マウスを犠牲にして肝組織と白色脂肪組織を分離し、組織切片を作製した。作製した肝組織及び白色脂肪組織切片に９５℃の抗原暴露バッファ（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｂｕｆｆｅｒ）を２５分間処理した後、室温で冷却させた。その後、組織切片に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％ヤギ血清及び０.０５％ツイン２０を含むＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅｄ Ｓａｌｉｎｅ＋Ｔｗｅｅｎ２０）を処理してブロッキング過程を経て、Ｆａｓ受容体特異的１次抗体と４℃で１８時間反応させた。その後、ＴＢＳＴで組織切片を洗浄し、ＦＩＴＣ－結合２次抗体と２時間室温で反応させた。
【0043】
また、ペプチドの組織結合能力を調べるため、Ａｌｅｘａ ４８８が結合されたペプチドと、１次抗体を４℃で１８時間反応させた。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で染色してＴＢＳＴで洗浄した後、確認した。
【0044】
各組織切片の蛍光信号は、ＴＣＳ－ＳＰ５共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で分析した。
【0045】
６．ペプチドの組織伝達有無の分析
肥満モデルマウスに１００μｇのＡｌｅｘａ６４７－結合ペプチドを静脈注射で投与し、１２時間、２４時間及び４８時間後に組織を分離してＩｍａｇｅ ｓｔａｔｉｏｎ蛍光分析器（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ）で、各組織における蛍光信号を分析した。蛍光信号分析後、各組織間の相対的な蛍光強度は、ＮＩＨから提供されるＩｍａｇｅＪプログラムで比較した。
肥満モデルマウスに１００μｇのＡｌｅｘａ６４７－結合ペプチドを静脈注射で投与し、１２時間、２４時間及び４８時間後に組織を分離してＩｍａｇｅ ｓｔａｔｉｏｎ蛍光分析器（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ）で、各組織における蛍光信号を分析した。蛍光信号分析後、各組織間の相対的な蛍光強度は、ＮＩＨから提供されるＩｍａｇｅＪプログラムで比較した。
【0046】
また、肝組織において細胞単位のペプチド伝達の有無を確認するため、肥満モデルマウスに１００μｇのＡｌｅｘａ ４８８－結合ＦＢＰを静脈注射で投与し、１２時間、２４時間及び４８時間後に肝組織を分離して凍結組織切片を作製した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で核を染色し、ＴＣＳ－ＳＰ５共焦点顕微鏡で蛍光信号を分析した。
【0047】
７．組織学的分析及びＴＵＮＥＬ分析
肝組織及び白色脂肪組織切片をヘマトキシリン＆エオジンで染色した後、光学顕微鏡で組織学的分析を行った。
肝組織及び白色脂肪組織切片をヘマトキシリン＆エオジンで染色した後、光学顕微鏡で組織学的分析を行った。
【0048】
また、各組織に対するＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）分析は、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）で行った。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で核を染色してＴＣＳ－ＳＰ５共焦点顕微鏡で蛍光信号を分析し、Ｉｍａｇｅ Ｊプログラムで細胞それぞれの蛍光信号を分析した。
【0049】
８．遺伝子発現レベルの分析
肝組織及び白色脂肪組織からＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ、日本）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ｉｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）でｃＤＮＡを合成した。その後、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）で遺伝子発現レベルを分析した。各遺伝子の発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルで標準化した後、対照群に対する相対的な遺伝子発現量で計算した。
肝組織及び白色脂肪組織からＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ、日本）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ｉｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）でｃＤＮＡを合成した。その後、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）で遺伝子発現レベルを分析した。各遺伝子の発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルで標準化した後、対照群に対する相対的な遺伝子発現量で計算した。
【0050】
９．ブドウ糖過敏症及びインスリン抵抗性の分析
ブドウ糖過敏症の分析のため、１２時間空腹状態を維持した各実験群に２ｇ／ｋｇ容量のブドウ糖を腹腔注射で注入し、３０分、６０分及び１２０分後の血中ブドウ糖の濃度をＡｃｃｕ－ｃｈｅｃｋ（Ｒｏｃｈｅ、米国）で測定した。
ブドウ糖過敏症の分析のため、１２時間空腹状態を維持した各実験群に２ｇ／ｋｇ容量のブドウ糖を腹腔注射で注入し、３０分、６０分及び１２０分後の血中ブドウ糖の濃度をＡｃｃｕ－ｃｈｅｃｋ（Ｒｏｃｈｅ、米国）で測定した。
【0051】
インスリン抵抗性は、４時間空腹状態を維持した各実験群に０.７５Ｕ／ｋｇ容量のインスリンを腹腔注射で注入した後、３０分、６０分及び１２０分後、血中ブドウ糖の濃度を測定して分析した。
【0052】
１０．その他の分析
血清及び組織のサイトカインレベルは、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）で分析し、肝組織のトリグリセリドレベルは、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ、アメリカ）で確認した。
血清及び組織のサイトカインレベルは、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）で分析し、肝組織のトリグリセリドレベルは、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ、アメリカ）で確認した。
【0053】
１１．統計解析
実験結果に対して互いに異なる実験群が２つである場合、ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ分析を用い、実験群が３つ以上の場合、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析で統計的有意性を確認した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５プログラムを用いた。Ｐ値が０.０５以下である場合、統計的有意性があると判断した。
実験結果に対して互いに異なる実験群が２つである場合、ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ分析を用い、実験群が３つ以上の場合、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析で統計的有意性を確認した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５プログラムを用いた。Ｐ値が０.０５以下である場合、統計的有意性があると判断した。
【0054】
実験結果
１．Ｆａｓ遮断ペプチドのＦａｓ発現細胞株に対する結合力及びＦａｓ信号制御効果の確認
既に明らかなＦａｓ信号伝達抑制ペプチド（ＹＣＤＥＨＦＣＹ、ＦＢＰ－８）以外に、配列を変更した２種のペプチドＦＢＰ－Ａ（ＹＣＤＥＨＦＡＹ）及びＦＢＰ－７（ＹＣＤＥＨＦＹ）に対してＦａｓ発現細胞株に対する特異的結合力及び信号制御効果を確認した。
１．Ｆａｓ遮断ペプチドのＦａｓ発現細胞株に対する結合力及びＦａｓ信号制御効果の確認
既に明らかなＦａｓ信号伝達抑制ペプチド（ＹＣＤＥＨＦＣＹ、ＦＢＰ－８）以外に、配列を変更した２種のペプチドＦＢＰ－Ａ（ＹＣＤＥＨＦＡＹ）及びＦＢＰ－７（ＹＣＤＥＨＦＹ）に対してＦａｓ発現細胞株に対する特異的結合力及び信号制御効果を確認した。
【0055】
Ｆａｓが常に発現するＪｕｒｋａｔ細胞株にＦＩＴＣ－標識Ｆａｓ抗体を処理し、Ａｌｅｘａ６４７で標識されたＦＢＰ－８、ＦＢＰ－Ａ、ＦＢＰ－７又は対照ペプチド（ＹＣＮＳＴＶＣＹ；ＣｔｒＦＢＰ）を処理した。その後、蛍光信号を分析した結果、対照群（ＣｔｒＦＢＰ；対照ペプチド処理群）では、Ａｌｅｘａ６４７信号をほとんど確認できず、対照ペプチドは、Ｊｕｒｋａｔ細胞にほとんど結合しないことが分かり、ＦＢＰ－８、ＦＢＰ－Ａ及びＦＢＰ－７処理群の場合、互いに類似したレベルでＪｕｒｋａｔ細胞に結合することが確認できた（図１）。
【0056】
また、Ｊｕｒｋａｔ細胞株にＦａｓリガンド（Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ、ＦａｓＬ）及び信号伝達抑制ペプチドを処理した後、細胞死滅レベルを確認した結果、ＦＢＰ－８、ＦＢＰ－Ａ及びＦＢＰ－７が全て類似したレベルのＦａｓ信号伝達の抑制効果を示した。具体的には、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）は、非処理群（Ｍｏｃｋ；いかなるペプチドも処理しない実験群）と細胞死滅レベルが類似したが（それぞれ３１±２.３２％及び２９±３.２４％）、ＦＢＰ－８、ＦＢＰ－Ａ及びＦＢＰ－７処理群は、細胞死滅レベルがそれぞれ１７±４.１１％、１５±５.２６％及び１４±３.２２％となっており、非処理群（Ｍｏｃｋ）と比較して細胞死が効果的に抑制されたことが確認できた（図２のＡ）。併せて、環状のＦＢＰ－８、線状のＦＢＰ－８及びＦＢＰ－７の血清安定性を確認した結果、ＦＢＰ－７が最も優れていることが分かった（図２のＢ）。
【0057】
また、Ｊｕｒｋａｔ細胞株と異なるＦａｓ信号体系を有する３Ｔ３Ｌ１細胞株において同じ実験を行った。分化した３Ｔ３Ｌ１細胞株にＦＢＰ－８を１００μＭから１０００μＭまで様々な濃度で処理したとき、細胞毒性は、ほとんどなく（図３）、ＦａｓリガンドとＦＢＰ－８を同時に処理した場合、非処理群（Ｍｏｃｋ＋）及び陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較して細胞死滅が顕著に抑制されたことが確認できた。各実験群の細胞死滅レベルは、それぞれ２５±３.３１％、２３±５.１２％及び１４±２.９８％である（図４）。
【0058】
ＦＢＰ－８において優れたＦａｓ信号伝達抑制効果は、炎症関連遺伝子の発現レベルによっても確認できた。分化した３Ｔ３Ｌ１細胞株にＦａｓリガンドとＦＢＰ－８を同時に処理した場合、炎症関連遺伝子であるＦａｓ、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）、Ｆ４／８０、ＩＬ－６及びｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現が著しく減少したことが観察できた（図５）。
【0059】
このような炎症関連遺伝子の発現抑制は、炎症関連サイトカインの生成減少につながり、ＦＢＰ－８処理によって細胞培養液内のＩＬ－６及びＭＣＰ－１の濃度が減少することが分かった（図６）。これらの結果は、ＦＢＰ－８処理がＦａｓ由来の炎症関連信号伝達体系を効果的に抑制できることを意味する。
【0060】
また、脂肪細胞の炎症は、細胞死滅につながり、最終的には、細胞内に貯蔵された脂肪酸（ＦＦＡ）が細胞外に放出されるが、ＦＢＰ－８の処理は、このような細胞外への脂肪酸の放出も有意に抑制した（図７）。
【0061】
２．非アルコール性脂肪肝炎の動物モデルにおいてＦａｓ結合ペプチドの肝組織及び白色脂肪組織への特異的結合能力の評価
正常体重のマウスに高脂肪飼料を給与すると、肥満モデルマウスになり、このとき、肝組織又は白色脂肪組織においてＦａｓの発現量が増加する。具体的には、高脂肪飼料給与群（ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ、ＨＦＤ）の白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ、ＷＡＴ）と肝組織（ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ）においてＦａｓ発現量を確認した結果、正常飼料給与群（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｅｔ、ＮＣＤ）と比較して、それぞれ４倍及び３倍増加することが分かった（図８のＡ及びＢ）。特に、高脂肪飼料給与群（ＨＦＤ）の場合、体重が増加するにつれてＦａｓの発現量も比例して増加することが分かった（図８のＣ）。このような発現増加は、実際の組織においてＦａｓ発現細胞の割合が増加したことによりさらに確認でき、正常飼料給与群（ＮＣＤ）と比較して高脂肪飼料給与群（ＨＦＤ）の白色脂肪組織及び肝組織においてＦａｓ発現細胞の割合がそれぞれ７０％及び７５％にまで増加した（図８のＤ）。
正常体重のマウスに高脂肪飼料を給与すると、肥満モデルマウスになり、このとき、肝組織又は白色脂肪組織においてＦａｓの発現量が増加する。具体的には、高脂肪飼料給与群（ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ、ＨＦＤ）の白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ、ＷＡＴ）と肝組織（ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ）においてＦａｓ発現量を確認した結果、正常飼料給与群（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｅｔ、ＮＣＤ）と比較して、それぞれ４倍及び３倍増加することが分かった（図８のＡ及びＢ）。特に、高脂肪飼料給与群（ＨＦＤ）の場合、体重が増加するにつれてＦａｓの発現量も比例して増加することが分かった（図８のＣ）。このような発現増加は、実際の組織においてＦａｓ発現細胞の割合が増加したことによりさらに確認でき、正常飼料給与群（ＮＣＤ）と比較して高脂肪飼料給与群（ＨＦＤ）の白色脂肪組織及び肝組織においてＦａｓ発現細胞の割合がそれぞれ７０％及び７５％にまで増加した（図８のＤ）。
【0062】
また、高脂肪飼料給与群（ＨＦＤ）から分離した肝組織切片及び白色脂肪組織切片にＦａｓ特異的抗体と蛍光標識されたＦＢＰ－８を処理した場合、染色部位が一致し（図９）、これは肥満によって過発現したＦａｓにＦＢＰ－８が効果的に結合することを意味する。
【0063】
実験によって確認したＦＢＰ－８のＦａｓ特異的結合能力に基づいてＦＢＰ－８を静脈注射又は皮下注射で全身伝達したとき、肝組織又は脂肪組織に特異的に伝達され得るか確認した。高脂肪飼料給与群の肥満モデルマウスに蛍光標識されたＦＢＰ－８を静脈注射又は皮下注射を介して注入し、２４時間及び４８時間後に各臓器を分離し、蛍光分布を調査した。
【0064】
その結果、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較して皮下注射で注入されたＦＢＰ－８は、肝組織に特異的に伝達され、４８時間以降まで肝組織に残っていることが分かった（図１０のＡ）。静脈注射で注入されたＦＢＰ－８は、肝組織と白色脂肪組織に特異的に伝達された（図１０のＢ）。肝組織切片の観察結果、静脈注射で注入されたＦＢＰ－８は、注射後１２時間後から肝組織に効果的に伝達され、注入後４８時間までも肝組織に残っていることが分かった（図１１）。
【0065】
正常マウスに静脈注射（ＩＶ）又は皮下注射（ＳＣ）を介してＦＢＰ－８を注入した場合、肝組織において有意な蛍光信号を観察できず、ＦＢＰ－８が肝臓に伝達されないことが確認できた（図１２）。
【0066】
【0067】
３．全身伝達されたＦＢＰによる非アルコール性脂肪肝炎、インスリン抵抗性及び代謝疾患治療の効能評価
静脈注射で注入されたＦＢＰ－８が肥満モデルマウスの肝組織と白色脂肪組織に伝達されることを図１０及び図１１で確認したため、ＦＢＰの全身伝達によるＦａｓ信号伝達制御によって肝組織及び白色脂肪組織において炎症の緩和、細胞死滅抑制効果が得られるのか確認した。
静脈注射で注入されたＦＢＰ－８が肥満モデルマウスの肝組織と白色脂肪組織に伝達されることを図１０及び図１１で確認したため、ＦＢＰの全身伝達によるＦａｓ信号伝達制御によって肝組織及び白色脂肪組織において炎症の緩和、細胞死滅抑制効果が得られるのか確認した。
【0068】
正常マウスに高脂肪飼料を８週間給与して肥満モデルマウスを作製し、１週間に２回ずつＦＢＰ－８を静脈注射で計５週間投与した（図１３）。５週間後、肥満モデルマウスを犠牲にして白色脂肪組織と肝組織を分離し、ＴＵＮＥＬ染色で死滅細胞の割合を分析した。
【0069】
分析結果、肝組織の場合、非投与群（Ｍｏｃｋ）と陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）の死滅細胞の割合は、それぞれ１９±５.２８％と１７±７.９８％であるが、ＦＢＰ－８処理群は、９±２.３７％となり、死滅細胞の比率が有意に減少したことが確認できた（図１４）。
【0070】
白色脂肪組織の場合、非投与群（Ｍｏｃｋ）と陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）の死滅細胞の割合は、それぞれ５５±３.４２％と５１±２.９８％であるが、ＦＢＰ－８処理群では、３１±１.９８％となり、死滅細胞の割合が著しく減少したことが分かった（図１５）。
【0071】
ＦＢＰ－８によるＦａｓ信号伝達制御の効果は、細胞死滅だけでなく、炎症反応も抑制し、白色脂肪組織において炎症誘発マクロファージ標識であるＦ４／８０、ＣＤ１１ｃの発現レベルを確認した結果、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－８処理群で有意に減少して白色脂肪組織において炎症反応が抑制されたことが分かった（図１６）。
【0072】
また、白色脂肪組織の脂肪細胞の周辺にマクロファージが集まって形成されるＣＬＳ(ｃｒｏｗｎ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）も陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－８処理群において顕著に減少し（図１７）、白色脂肪組織においてＦａｓ、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６などの炎症関連遺伝子の発現も陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－８処理群で減少した（図１８）。
【0073】
肥満状態では、白色脂肪組織で生成された炎症誘発サイトカインが血液を介して肝組織に伝達されて炎症を誘発するが、ＦＢＰ－８処理群において血液中のＩＬ－６及びＭＣＰ－１の濃度が減少したことが確認できた（図１９）。
【0074】
肝組織においても白色脂肪組織に類似した炎症抑制効果を確認でき、炎症誘発マクロファージ標識であるＦ４／８０及びＣＤ１１ｃの発現レベルが陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－８処理群で減少し、炎症防止マクロファージ標識であるＣＤ２０６の発現レベルは、有意な変化はなかった（図２０）。Ｆａｓ、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６などの炎症関連遺伝子の発現レベルも陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－８処理群で有意に減少した（図２１）。
【0075】
ＦＢＰ－８の全身伝達は、肥満モデルマウスにおいてインスリン抵抗性の増加によるブドウ糖代謝障害も改善した。具体的には、ブドウ糖抵抗性の評価（Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ、ＧＴＴ）及びインスリン感度の評価（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ、ＩＴＴ）において陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）は、非投与群（Ｍｏｃｋ）と類似した血糖の変化を示したが、ＦＢＰ－８処理群は、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してブドウ糖代謝が改善されたことを観察できた（図２２及び図２３）。
【0076】
【0077】
ＦＢＰ－８の全身伝達による肝組織及び白色脂肪組織における炎症の緩和、細胞死滅抑制、ブドウ糖代謝障害の改善は、結果的に肥満によって発生した非アルコール性脂肪肝炎も改善した。
【0078】
具体的には、肥満モデルマウスの肝組織で確認した結果、ＦＢＰ－８処理群において脂肪生成遺伝子であるＳＣＤ－１（ｓｔｅａｒｏｙｌ－ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）の発現レベルが陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較して３０±５.３２％程度減少し（図２５）、血液中の脂肪酸及びインスリンの濃度も陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較して２０％程度減少した（図２６）。中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＴＧ）の濃度は、ＦＢＰ－８処理群の場合、肝組織で５０％、血液で２５％程度減少した（図２７）。
【0079】
また、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－８処理群では、肝組織のサイズが小さく、重量も軽く（図２８）、肝組織切片の組織学的分析により、ＦＢＰ－８処理群において肝組織の損傷が抑制されたことが観察できた（図２９）。肝組織の機能を評価する主要な標識である血中ＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レベル測定結果からも、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－８処理群において３０％以上減少したことが確認できた（図３０）。
【0080】
４．皮下注射で全身伝達されたＦＢＰ－７による非アルコール性脂肪肝炎、インスリン抵抗性及び代謝疾患治療効能の評価
正常マウスに高脂肪飼料を８週間給与して肥満モデルマウスを作製し、毎日２回ずつＦＢＰ－７を皮下注射で計３週間投与した。陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）としては、対照ペプチド、陽性対照群としては、肥満治療剤として市販されているリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ；商品名サクセンダ（Ｓａｘｅｎｄａ））を投与した。
正常マウスに高脂肪飼料を８週間給与して肥満モデルマウスを作製し、毎日２回ずつＦＢＰ－７を皮下注射で計３週間投与した。陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）としては、対照ペプチド、陽性対照群としては、肥満治療剤として市販されているリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ；商品名サクセンダ（Ｓａｘｅｎｄａ））を投与した。
【0081】
３週間後、マウスを犠牲にして肝組織を分離し、ＴＵＮＥＬ染色で死滅細胞の割合を分析した。その結果、ＦＢＰ－７投与群の死滅細胞の割合は、１０±２.４５％となり、非投与群（Ｍｏｃｋ）及び陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）より著しく低く、陽性対照群であるリラグルチド投与群（１１±４.８９％）と類似したレベルを示した（図３１）。
【0082】
ＦＢＰ－７投与により肝組織において炎症反応も抑制された。陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－７投与群で炎症誘発マクロファージ標識遺伝子であるＦ４／８０及びＣＤ１１ｃの発現レベルが減少し、炎症抑制マクロファージ標識であるＣＤ２０６の発現レベルは、著しく増加した（図３２）。特異的に、リラグルチド投与群と比較してＦＢＰ－７投与群においてＣＤ２０６の発現レベルがより多く増加し、Ｆ４／８０の発現レベルは、有意に減少した。
【0083】
炎症関連遺伝子であるＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１及びＩＬ－６の発現レベルも陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－７投与群において減少し（図３３）、炎症の主要な標識であるＦａｓの発現もＦＢＰ－７投与群の肝組織において著しく減少した（図３４）。このような肝組織における炎症反応の抑制により炎症誘発サイトカインであるＩＬ－６及びＭＣＰ－１の血中濃度も減少した（図３５）。
【0084】
ＦＢＰ－７の全身伝達による炎症反応の抑制効果は、ブドウ糖代謝障害の改善効果にもつながった。ブドウ糖抵抗性評価実験において、ＦＢＰ－７投与群は、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較して優れた血糖量増加の鈍化効果及び正常血糖回復症を示し、ブドウ糖代謝障害を改善させ、リラグルチドと類似したレベルの改善効果を示した（図３６）。
【0085】
【0086】
ＦＢＰ－７投与による肝組織における炎症改善、細胞死滅抑制効果は、最終的に肥満によって誘発される非アルコール性脂肪肝炎を改善した。
【0087】
ＦＢＰ－７投与群の肝臓は、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較して、組織の重量が減少し（図３９）、肝組織切片の組織学的分析においてもリラグルチド投与群と類似したレベルの組織損傷抑制効果を示した（図４０）。
【0088】
また、陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較して肝臓において脂肪の蓄積に関与する遺伝子であるＰＰＡＲ－γの発現レベルがＦＢＰ－７投与群において減少し、このような発現の減少効果は、陽性対照群であるリラグルチド投与群と比較しても著しく優れたレベルであった（図４１）。肝組織内の中性脂肪レベル、血中脂肪酸濃度も陰性対照群（ＣｔｒＦＢＰ）と比較してＦＢＰ－７投与群において有意に減少し（図４２及び図４３）、肝機能回復指標である血中ＡＬＴＦＢＰ－７投与群において有意に減少することが確認できた（図４４）。
【0089】
本発明のＦａｓ信号伝達抑制ペプチドは、肥満モデルマウスに静脈注射で注入時、肝組織と白色脂肪組織に特異的に伝達され、皮下注射で注入時、肝組織に特異的に伝達される。注入後に、肥満時に肝臓と脂肪組織において多く発現するＦａｓに結合し、その後、下位信号伝達を遮断して炎症反応、細胞死滅を抑制し、結果として体重増加、脂肪蓄積などを抑制できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【配列表】
【国際調査報告】