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▶ バイオインベント インターナショナル アクティエボラーグの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-10
(54)【発明の名称】新規アゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220203BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220203BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220203BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220203BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220203BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20220203BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220203BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220203BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220203BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220203BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220203BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220203BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220203BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20220203BHJP
C12N 15/73 20060101ALN20220203BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N7/01
C12N15/10 200Z
C12N1/15
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P29/00
C12N15/12
C07K7/06
C12N15/73 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021523958
(86)(22)【出願日】2019-11-01
(85)【翻訳文提出日】2021-04-30
(86)【国際出願番号】 EP2019080003
(87)【国際公開番号】W WO2020089473
(87)【国際公開日】2020-05-07
(31)【優先権主張番号】18203996.6
(32)【優先日】2018-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520031025
【氏名又は名称】バイオインベント インターナショナル アクティエボラーグ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100185856
【弁理士】
【氏名又は名称】朝倉 栄二
(72)【発明者】
【氏名】ビョルン フレンデウス
(72)【発明者】
【氏名】イングリッド テイゲ
(72)【発明者】
【氏名】リンダ モルテンソン
(72)【発明者】
【氏名】ペトラ ホルムコビスト
(72)【発明者】
【氏名】モニカ センリヒ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AA94Y
4B065AA98X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045FA74
(57)【要約】
標的細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合し、それによってＴＮＦＲ２を作動させる（ａｇｏｎｉｚｅ）が、リガンドＴＮＦ－αがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断しない新規抗体分子が記載される。また、医薬、特に、癌または慢性炎症性疾患の治療における、そのような抗体分子の使用も記載される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合するアゴニスト抗体分子であって、前記抗体分子がＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－αリガンド結合を遮断しない、アゴニスト抗体分子。
【請求項2】
前記抗体分子が固有のアゴニスト活性を有する、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項3】
前記抗体分子がＦｃγ受容体にも結合する、請求項１または２に記載の抗体分子。
【請求項4】
前記抗体分子が、活性化Ｆｃγ受容体よりも抑制性Ｆｃγ受容体に対してより高い親和性で結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項5】
前記抗体分子のＴＮＦＲ２への前記結合が、病変組織におけるＴＮＦＲ２発現細胞の数および／または頻度の変化をもたらす、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項6】
前記抗体分子のＴＮＦＲ２への前記結合が、病変組織へのＴ細胞および／もしくは骨髄性細胞の浸潤ならびに／または病変組織におけるＴ細胞および／もしくは骨髄性細胞の組成の変化をもたらす、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項7】
前記抗体分子が、フルサイズ抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体を含む二価もしくは多価抗体分子、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’および／または（Ｆａｂ’）２、ならびにそれらの抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項8】
ヒトＴＮＦＲ２（ｈＴＮＦＲ２）に、および／またはカニクイザルＴＮＦＲ２（ｃｍＴＮＦＲ２）に、結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項9】
前記抗体分子が、ヒトＩｇＧ抗体分子、ヒト化ＩｇＧ抗体分子およびヒト由来のＩｇＧ抗体分子からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項10】
前記抗体分子がヒトＩｇＧ２抗体である、請求項９に記載の抗体分子。
【請求項11】
前記抗体分子がモノクローナル抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項12】
前記抗体分子が、配列ＫＣＳＰＧを含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合しない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項13】
前記抗体分子が、ＣＤＲであるＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３のうちの１～６個を含む抗体分子からなる群から選択され、存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９および９７からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号２、１０、１８、２６、３４、４２、５０、５８、６６、７４、８２、９０および９８からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号３、１１、１９、２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５、８３、９１および９９からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号４、１２、２０、２８、３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４、９２および１００からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３および１０１からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号６、１４、２２、３０、３８、４６、５４、６２、７０、７８、８６、９４および１０２からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項14】
前記抗体分子が、以下のＣＤＲ：（ｉ）配列番号１、配列番号２および配列番号３、もしくは
（ｉｉ）配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、もしくは
（ｉｖ）配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、もしくは
（ｖ）配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５、もしくは
（ｖｉ）配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３を含む可変重鎖（ＶＨ）を含み、
かつ／または、前記抗体分子が、以下のＣＤＲ：
（ｉ）配列番号４、配列番号５および配列番号６、もしくは
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、もしくは
（ｉｖ）配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０、もしくは
（ｖ）配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８、もしくは
（ｖｉ）配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項15】
前記抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、７９、８７、９５および１０３からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列を含み、かつ／または、前記抗体分子が、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、８８、９６および１０４からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項16】
前記抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９および４７からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列、ならびに配列番号８、１６、２４、３２、４０および４８からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項17】
前記抗体分子が、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の抗体分子と、ＴＮＦＲ２への結合について競合することができる抗体分子である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項19】
請求項１８に記載のヌクレオチド配列を含む、プラスミド。
【請求項20】
請求項１８に記載のヌクレオチド配列または請求項１９に記載のプラスミドを含む、ウイルス。
【請求項21】
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２０に記載のウイルス。
【請求項22】
請求項１８に記載のヌクレオチド配列、または請求項１９に記載のプラスミド、または請求項２０もしくは２１に記載のウイルスを含む、細胞。
【請求項23】
医薬において使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８に記載のヌクレオチド配列、請求項１９に記載のプラスミド、請求項２０もしくは２１に記載のウイルス、および／または請求項２２に記載の細胞。
【請求項24】
癌または慢性炎症性疾患の治療において使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８に記載のヌクレオチド配列、請求項１９に記載のプラスミド、請求項２０もしくは２１に記載のウイルス、および／または請求項２２に記載の細胞。
【請求項25】
治療される患者が、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者である、請求項２４に記載の使用のための抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞。
【請求項26】
癌の治療において、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、と組み合わせて使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８に記載のヌクレオチド配列、請求項１９に記載のプラスミド、請求項２０に記載のウイルス、および／または請求項２２に記載の細胞。
【請求項27】
癌もしくは慢性炎症性疾患の治療において使用するための薬学的組成物を製造するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８に記載のヌクレオチド配列、請求項１９に記載のプラスミド、請求項２０に記載のウイルス、および／または請求項２２に記載の細胞の使用。
【請求項28】
前記薬学的組成物が、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者における癌または慢性炎症性疾患の治療に使用するためのものである、請求項２７に記載の使用。
【請求項29】
前記薬学的組成物が、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、と組み合わせて投与される、請求項２７もしくは２８に記載の癌の治療に使用するための薬学的組成物を製造するための使用。
【請求項30】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８に記載のヌクレオチド配列、請求項１９に記載のプラスミド、請求項２０に記載のウイルス、および／または請求項２２に記載の細胞、ならびに、任意選択的に、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクルおよび／または賦形剤を含むかまたはそれらからなる薬学的組成物。
【請求項31】
癌または慢性炎症性疾患の治療において使用するための、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項32】
癌の治療において、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、を含む薬学的組成物と組み合わせて使用するための、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項33】
対象における癌または慢性炎症性疾患の治療方法であって、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８に記載のヌクレオチド配列、請求項１９に記載のプラスミド、請求項２０に記載のウイルス、請求項２２に記載の細胞、または請求項２７に記載の薬学的組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項34】
前記患者が、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
治療有効量のチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列；
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド；および／または
チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、もしくはチェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス、
が前記対象に投与される、請求項３３または３４に記載の癌を治療するための方法。
【請求項36】
前記チェックポイント抑制剤がＰＤ－１である、請求項２６に記載の使用のための抗体分子、請求項２６に記載の使用のためのヌクレオチド配列、請求項２６に記載の使用のためのプラスミド、請求項２１に記載のウイルス、請求項２６に記載の使用のためのウイルス、請求項２６に記載の使用のための細胞、請求項２９に記載の使用、請求項３２に記載の薬学的組成物、または請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記チェックポイント抑制剤がＰＤ－Ｌ１である、請求項２６に記載の使用のための抗体分子、請求項２６に記載の使用のためのヌクレオチド配列、請求項２６に記載の使用のためのプラスミド、請求項２１に記載のウイルス、請求項２６に記載の使用のためのウイルス、請求項２６に記載の使用のための細胞、請求項２９に記載の使用、請求項３２に記載の薬学的組成物、または請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
前記癌が固形癌である、請求項２４、２５、２６、３６もしくは３７に記載の使用のための抗体分子、請求項２４、２５、２６、３６もしくは３７に記載の使用のためのヌクレオチド配列、請求項２４、２５、２６、３６もしくは３７に記載の使用のためのプラスミド、請求項２４、２５、２６、３６もしくは３７に記載の使用のためのウイルス、請求項２４、２５、２６、３６もしくは３７に記載の使用のための細胞、請求項２７、２８、２９、３６もしくは３７に記載の使用、請求項３１、３２、３６もしくは３７に記載の薬学的組成物、または請求項３３、３４、３５、３６もしくは３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）に特異的に結合するが、リガンドＴＮＦ－αがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断しない新規アゴニスト抗体に関する。本発明はまた、癌または慢性炎症性疾患の治療などの医薬におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）およびＣＤ１２０ｂとしても既知である、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体２（ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ－２またはＴＮＦＲＩＩ）は、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－αまたはＴＮＦα）に結合する膜受容体である。すなわち、Ｔ細胞、単球およびマクロファージの表面に見られ、核因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）を介してＴＮＦＲ２受容体発現細胞の増殖を活性化することができる。特に、ＴＮＦＲ２は、癌、特に腫瘍浸潤免疫細胞（制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋細胞傷害性エフェクターＴ細胞など）およびさまざまな骨髄性細胞亜集団において高度に上方制御される。
【0003】
ＴＮＦＲ２は、癌免疫療法の有望な標的として論じられており、特に腫瘍内Ｔｒｅｇおよび多くのヒト腫瘍細胞の表面で高度に発現していると記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＳ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７（４２）：６８２７８－６８２９１；Ｖａｎａｍｅｅ ＥＳ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７，ｖｏｌ．２３，ｉｓｓｕｅ １１，１０３７－１０４６；Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１７｜Ｖｏｌｕｍｅ ８｜Ａｒｔｉｃｌｅ １４８２，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１８ Ｊａｎ ２；１１（５１１））。
【0004】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞、ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇと呼ばれることもあり、以前は抑制性（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）Ｔ細胞または抑制性制御性Ｔ細胞として既知であった）は、通常の免疫環境下および病理学的な免疫環境下で他の免疫細胞を抑制することが可能であるＴ細胞の亜集団を構成する。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４陽性細胞（ＣＤ４＋細胞）である。Ｔｒｅｇではない他のＣＤ４＋Ｔ細胞があるが、非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞は、ＦＯＸＰ３陰性（ＦＯＸＰ３－）であるのに対し、ＴｒｅｇはまたＦＯＸＰ３陽性（ＦＯＸＰ３＋）であるという点で、Ｔｒｅｇは非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞から分離できる。また、非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋またはＣＤ２５＋ＣＤ１２７＋のいずれかであるのに対し、ＴｒｅｇはまたＣＤ２５＋ＣＤ１２７陰性／低であるという点で、Ｔｒｅｇは非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞から分離できる。
【0005】
ＴＮＦＲ２はまた、自己免疫疾患（Ｆａｕｓｔｍａｎ ＤＬ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：４７８，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６ Ｊａｎ ８；５（１）：Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６ Ｍａｙ ４；３６（１８）：５１２８－４３）および炎症性疾患（Ａｉｔ－Ａｌｉ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００８ Ｊｕｎ；１４９（６）：２８４０－５２，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６ Ｓｅｐ ７；６：３２８３４）に関連して論じられている。
【0006】
さまざまな特性を有する異なるタイプの抗ＴＮＦＲ２抗体も以前に記載されている。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｏｃｔ １８；７（４２）：６８２７８－６８２９１）は、リガンド遮断およびリガンド非遮断アゴニスト抗体の両方について記載している。
【0007】
ＷＯ２０１４／１２４１３４は、ＣＤ４＋ＣＤ２５高Ｔｒｅｇに富む組成物のインビトロ産生のためのアゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体および／またはＮＦ－κＢアクチベーターなどのＴＮＦＲ２アゴニストの使用を開示している。この組成物は、患者の免疫障害または感染症の治療に有用であると言われている。
【0008】
ＷＯ２０１７／０４０３１２は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を促進し、Ｔｒｅｇの増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に影響を与えることができる抗ＴＮＦＲ２抗体、特にアゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体を開示している。ＷＯ２０１７／０４０３１２は、配列ＫＣＳＰＧを含むエピトープに特異的に結合するが、配列ＫＣＲＰＧを含むエピトープには結合しない（したがって上記ＵＳ９，８２１，０１０の抗体は除外される）、あるいは別のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーには結合しない抗体を開示している。アゴニスト抗体は免疫疾患の治療に有用であると言われている。ＷＯ２０１７／０４０３１２はさらに、ヒトＴＮＦＲ２の完全な配列を提示している。
【0009】
ＷＯ２０１７／０８３５２５は、抗ＴＮＦＲ２抗体を含む薬理学的組成物、および癌などのＴＮＦ－αおよび／またはＴＮＦＲ２に関連する障害の治療におけるそれらの使用について論じている。ＷＯ２０１７／０８３５２５は、Ｆｃγ受容体への結合がヌルであるヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体、およびＴｒｅｇの増殖の抑制についてさらに論じている。
【0010】
加えて、ＴＮＦＲ２アゴニストとして作用することができる抗ＴＮＦＲ２抗体が、Ｇａｌｌｏｗａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３０４５－３０４８，１９９２）、Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８５４２－１８５４８，１９９３）、Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４６３７－４６４１，１９９３）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９８９８－９９０５，１９９４）およびＡｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５５－６３，１９９６）に記載されている。
【0011】
しかしながら、これらの文書はいずれも、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、リガンドＴＮＦ－αが同じＴＮＦＲ２に結合するのを遮断しないアゴニストＴＮＦＲ２抗体を教示も示唆もしていない。
【0012】
Ｆｃ受容体は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、およびナチュラルキラー細胞、およびＢリンパ球などの免疫エフェクター細胞の細胞表面に見られる膜タンパク質である。この名称は、抗体のＦｃ領域へのそれらの結合特異性に由来する。Ｆｃ受容体は細胞膜に見られ、原形質膜または細胞質膜としても既知である。Ｆｃ受容体は、活性化ＦｃγＲと抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）ＦｃγＲに細分することができ、これらは、凝集した免疫グロブリンＧ Ｆｃの結合により細胞の活性化を協調的に制御し、細胞内ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭモチーフを介して活性化または抑制性シグナルを細胞に伝達することが知られている。凝集した免疫グロブリンまたは免疫複合体のＦｃＲ結合は、細胞への抗体の内在化を介在し、抗体介在性食作用、抗体依存性細胞介在性細胞傷害、または抗原提示もしくは交差提示をもたらす可能性がある。ＦｃＲは、抗体に結合した細胞表面受容体の架橋を介在または増強することも知られている。このような架橋は、標的細胞におけるシグナル伝達を活性化する、いくつかの（Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１１．‘Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１０３０－４．；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７：１７５４－６３）、しかしすべてではない（Ｒｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０１４．‘Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｓ ｐｏｔｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ＦｃＲ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ’，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３：ｅ２８６１０）抗体の能力に必要であることが知られており、治療効果を達成するために必要な場合と必要でない場合がある。
【0013】
Ｆｃ受容体のサブグループは、ＩｇＧ抗体に特異的なＦｃγ受容体（Ｆｃ－ガンマ受容体、ＦｃガンマＲ、ＦｃγＲ）である。Ｆｃγ受容体には、活性化Ｆｃγ受容体（活性化Ｆｃγ受容体とも表される）、および抑制性Ｆｃγ受容体の２種類がある。活性化受容体および抑制性受容体は、それぞれ、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）または免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を介して、それらのシグナルを伝達する。ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）は、抑制性Ｆｃγ受容体であり、一方ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、活性化Ｆｃγ受容体である。ＦｃγｇＲＩＩＩｂは、好中球上で発現するＧＰＩ結合受容体であり、ＩＴＡＭモチーフが欠如しているが、脂質ラフトを架橋し、他の受容体と結合するその能力によっても活性化とみなされる。マウスにおいて、活性化受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶである。
【0014】
抗体がＦｃγ受容体との相互作用を介して免疫細胞活性を調節し得ることは、公知である。具体的には、抗体免疫複合体が免疫細胞の活性化をどのように調節するかは、活性化Ｆｃγ受容体および抑制性Ｆｃγ受容体の相対的な結合によって判定される。異なる抗体アイソタイプは、異なる親和性で活性化Ｆｃγ受容体および抑制性Ｆｃγ受容体に結合し、異なるＡ：Ｉ比率（活性化：抑制の比率）をもたらす（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５ Ｄｅｃ ２；３１０（５７５３）：１５１０～２）。
【0015】
抑制性Ｆｃγ受容体に結合することにより、抗体は、エフェクター細胞機能を抑制、遮断、および／または下方調節することができる。抑制性ＦｃγＲに結合することにより、抗体は、標的細胞上の抗体標的シグナル伝達受容体の凝集により細胞の活性化をさらに刺激することができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１０３０－４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１１．‘Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７：１７５４－６３；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１４．‘Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ ｃａｎ ｂｅ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９３：１８２８－３５）。
【0016】
活性化Ｆｃγ受容体に結合することにより、抗体は、エフェクター細胞の機能を活性化し、それによって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン放出、および／または抗体依存性エンドサイトーシス、ならびに好中球の場合、ネトーシス（すなわち、ＮＥＴ（好中球細胞外トラップ）の活性化および放出）などの機構を誘発することができる。活性化Ｆｃγ受容体に結合する抗体も、ＣＤ４０、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ３８、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６などの特定の活性化マーカーの増加を引き起こすことができる。
【0017】
特に、本発明者らによって発表された最近のデータは、治療効果のために、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲにそれぞれ結合するためのＣＤ８ Ｔ細胞アゴニスト抗体およびＴｒｅｇ枯渇抗４－１ＢＢ抗体の重要かつ特異的な依存性を示している（Ｂｕｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，‘Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４－１ＢＢ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ Ｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ’，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１８ ４９（５）：９５８－９７０）。さらに、そして決定的に、ＣＤ８ Ｔ細胞アゴニスト抗体およびＴｒｅｇ枯渇抗４－１ＢＢ抗体の同時投与は、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲそれぞれへの結合に最適化され、治療活性を低下させた。これらのデータは、別個の作用機序を有する抗体の治療活性を最大化するために、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲの適切かつ調整された結合を伴う抗体を開発することが決定的に重要であることを示している。同時に、これらのデータは、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲの結合が最適でないと、治療効果を著しく低減させる可能性があることを示している。
【0018】
これらのデータは、他のＴＮＦＳＲメンバーに対する抗体、特に免疫刺激性抗ＣＤ４０抗体に関する所見とは対照的であり、活性化ＦｃγＲではなく、抑制性ＦｃγＲの結合が絶対的に必要であることを示していたために、驚くべきものであった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．‘Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１０３０－４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． ２０１１．‘Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ４０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ’，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７：１７５４－６３）。まとめると、これらの結果は、ＦｃγＲ依存性が、同じ受容体スーパーファミリーの異なる標的に対する抗体間で、さらには同じ標的に対する異なるタイプの抗体間でさえ、容易には予測できない様式で変化する可能性があるが、治療的使用の抗体を開発する際に理解して利用することが重要である場合があることを示している。
【発明の概要】
【0019】
本発明および並行する発明に至る研究において、強力な治療効果、ならびに異なる特徴および作用機序を有する抗ＴＮＦＲ２抗体の２つの主要な異なるグループが同定された。
【0020】
本発明者らは、ＴＮＦ－αのＴＮＦＲ２受容体への結合を遮断するアンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体の強力な治療活性を最初に同定した。そのような抗体の活性は、インビボ治療活性について、ＦｃγＲ相互作用、特に活性化ＦｃγＲへの結合に依存することが示された。強力な抗ＴＮＦＲ２治療試薬のこのグループまたはカテゴリーは、１）ＴＮＦ－α誘導性ＴＮＦＲ２シグナル伝達の顕著な遮断および抑制、ならびに２）ＦｃγＲ結合に依存する活性を特徴とし、抑制性ＦｃγＲよりも活性化ＦｃγＲに結合することから最も強く恩恵を受けることが見出された。
【0021】
次に、本発明者らは、インビボで同等に強力な治療活性を有するが、多くの点でその特徴が第１のグループを構成するアンタゴニスト遮断型のＴＮＦＲ２抗体の特徴と反対である抗ＴＮＦＲ２抗体の別個のグループを同定した。この第２のグループの抗ＴＮＦＲ抗体は、治療活性について、ＴＮＦ－α遮断またはＴＮＦＲ２シグナル伝達の抑制に依存せず、むしろＴＮＦＲ２シグナル伝達の強力な活性化を特徴とする。第１のグループの遮断抗体とはさらに対照的に、第２のグループのアゴニスト抗体は、それらの活性がＦｃγＲ：結合抗体変異体で改善されるとしても、抗体：ＦｃγＲ結合への絶対的な依存を示さない。第１のグループのアンタゴニスト遮断抗体とはさらに対照的に、第２のグループのアゴニスト抗体は、抑制性ＦｃγＲ対活性化ＦｃγＲへの結合が改善された抗体変異体において最大の活性を示す。
【0022】
本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体の第２のグループ、すなわち、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、リガンドＴＮＦ－αがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断しないアゴニスト抗体分子に関する。このような抗体は強力な治療試薬であり、医薬に有用である。
【0023】
第１のグループに属するアンタゴニスト遮断抗体は、本発明のアゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子と比較するために、以下の実施例において使用される。実施例では、以下でさらに説明するように、第１または第２のグループのいずれかまたは両方のものと同様のいくつかの特徴を有する他の抗体も比較のために使用される。
【0024】
したがって、本発明は、標的細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合し、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－αリガンド結合を遮断しない、アゴニスト抗体分子に関する。
【0025】
本発明はまた、そのような新規アゴニストＴＮＦＲ２抗体分子の特定の例に関する。
【0026】
本発明はまた、上記抗体分子のうちの少なくとも１つをコードする単離されたヌクレオチド配列に関する。
【0027】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むプラスミドに関する。
【0028】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列またはプラスミドのうちの少なくとも１つを含むウイルスに関する。
【0029】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、または上記プラスミドのうちの少なくとも１つ、または上記ウイルスのうちの少なくとも１つを含む細胞に関する。
【0030】
本発明はまた、医薬において使用するための上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞に関する。
【0031】
本発明はまた、癌もしくは慢性炎症性疾患の治療において使用するための、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞に関する。
【0032】
本発明はまた、癌もしくは慢性炎症性疾患の治療において使用するための、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞の使用に関する。
【0033】
本発明はまた、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞のうちの少なくとも１つ、ならびに、任意選択的に、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクルおよび／または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。そのような薬学的組成物は、癌または慢性炎症性疾患の治療に使用することができる。
【0034】
本発明はまた、対象における癌または慢性炎症性疾患の治療方法であって、上記抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物のうちの少なくとも１つの治療有効量を対象に投与することを含む、方法に関する。
【0035】
本発明はまた、添付の説明、実施例および／または図を参照して本明細書に記載される、抗体分子、使用のための抗体分子、単離されたヌクレオチド配列、使用のための単離されたヌクレオチド配列、プラスミド、使用のためのプラスミド、ウイルス、使用のためのウイルス、細胞、使用のための細胞、使用、薬学的組成物および治療方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0036】
したがって、本発明は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、リガンドＴＮＦ－αが同じＴＮＦＲ２に結合するのを遮断しないアゴニストＴＮＦＲ２抗体分子に関する。好ましくは、抗体分子は固有のアゴニスト活性を有する。
【0037】
本明細書に開示されるアゴニスト抗体分子は、ＴＮＦ－αがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断せず、さらに、ＴＮＦＲ２シグナル伝達も遮断しない。ＴＮＦＲ２を介したＴＮＦ－α介在性シグナル伝達は、核転写因子ＮＦκＢの活性化で終わるシグナル伝達カスケードを開始することが明確に示されている（Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １－ａｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦｋａｐｐａＢ”．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ ３１；３８（３）：２８１－９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＮＦ－ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ Ｓｉｇｎａｌ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ａｐｒ １９；９：７８４）。これにより、細胞が活性化され、いくつかの炎症誘発性因子が合成される。そのうちの１つは、ＮＫ細胞のＩＦＮ－γである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．“ＮＦ－κＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒ．２０１７；２．ｐｉｉ：１７０２３；Ｔａｔｏ ｅｔ ａｌ．“Ｏｐｐｏｓｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ”．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ａｐｒ；１８（４）：５０５－１３）。本明細書では、ＴＮＦＲ２シグナル伝達およびＴＮＦＲ２活性化という用語は交換可能に使用される。抗体分子は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する。抗体が定義された標的分子または抗原に特異的に結合するか、またはそれと相互作用すること、および、これは、抗体が、標的ではない分子ではなく、その標的に優先的かつ選択的に結合することを意味することはよく知られている。「ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子」または「ＴＮＦＲ２特異的抗体分子」とは、用量依存的にＴＮＦＲ２タンパク質に結合するが、無関係のタンパク質には結合しない抗体を意味する。加えて、同じ抗体はＴＮＦＲ２を内因的に発現する細胞に結合し、この結合は同じ細胞を市販のポリクローナルＴＮＦＲ２抗体試薬とプレインキュベーションすることによって遮断することができる。これは、ＴＮＦＲ２がポリクローナル試薬でマスクされている際に非特異性結合を検出できることを示している。これを実施例２に示す。
【0038】
ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子（または抗ＴＮＦＲ２抗体分子）は、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体分子を指す。細胞表面抗原およびエピトープは、免疫学または細胞生物学の当業者によって容易に理解される用語である。
【0039】
タンパク質の結合を評価する方法は、生化学および免疫学の当業者には既知である。当業者であれば、それらの方法を使用して、抗体の標的への結合および／または抗体のＦｃ領域のＦｃ受容体への結合、ならびにそれらの相互作用の相対的な強度、もしくは特異性、もしくは抑制、もしくは防止、もしくは低減を評価することができることを理解するであろう。タンパク質結合を評価するために使用できる方法の例は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）である。抗体の特異性に関する議論については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｔ ｐａｇｅｓ ３３２－３３６（１９８９）を参照のこと。
【0040】
本発明に従ってアゴニスト抗体が結合するＴＮＦＲ２を発現する標的細胞は、ＣＤ８陽性細胞および骨髄性細胞などの任意のＴＮＦＲ２発現免疫細胞であり得る。
【0041】
本発明によるアゴニスト抗体分子のＴＮＦＲ２への結合の効果は、Ｔ細胞および／もしくは骨髄性細胞の活性化、ならびに／またはＴ細胞および／もしくは骨髄性細胞の病変組織への浸潤、ならびに／または病変組織におけるＴ細胞および／もしくは骨髄性細胞の組成の変化であり得る。Ｔ細胞および／または骨髄性細胞の組成の変化は、本明細書においては、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８陽性細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）（それらの異なる亜集団を含む）、骨髄性由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および／または炎症誘発性マクロファージなどのさまざまな細胞亜集団の異なる絶対数または相対数を意味する。
【0042】
この文脈において、病変組織とは、腫瘍組織（すなわち、腫瘍細胞、免疫細胞、内皮細胞および間質細胞を含む、腫瘍微小環境内のすべての細胞）または慢性炎症性疾患に罹患した組織のいずれかを意味する。
【0043】
抗体分子がＴＮＦＲ２へのリガンド結合を遮断するか否か、むしろ本発明の文脈では遮断しないかどうかを判定するために、ＴＮＦＲ２特異的抗体の存在下で固定化されたＴＮＦＲ２受容体に結合したＴＮＦ－αリガンドの量を決定するＥＬＩＳＡアッセイを使用することが可能である。非遮断抗体は、リガンドであるＴＮＦ－αが固定化された受容体ＴＮＦＲ２に結合するのを妨げない。これは、以下の実施例３においてより詳細に示され、説明されている。より具体的には、本発明による非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を５０％未満低減する抗体分子である。いくつかの実施形態において、これは、実施例３および図６および７に示されるように、高用量のワンポイントＥＬＩＳＡまたは用量漸増（ｄｏｓｅ－ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡにおいて決定される。
【0044】
逆に、遮断アンタゴニスト抗体分子は完全遮断剤であり、さらにＴＮＦＲ２シグナル伝達に拮抗することができる。このような抗体分子は、以下の実施例において比較のために使用される。完全遮断剤は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を９８％超、すなわち最大１００％低減する抗体分子として本明細書で定義される。アイソタイプ対照抗体は、研究中のアッセイにおいていかなる形態でも存在しないタンパク質または他の構造に対して産生された抗体である。アイソタイプ対照は、理想的には、比較する抗体と同じフレームワークであるが、少なくとも同じＦｃ部分を有する。これは当業者には公知である。本明細書で説明する例では、アイソタイプ対照は同じフレームワーク、同じＦｃ部分を有し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に特異的であった。いくつかの実施形態において、完全遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を９９．５％超低減する。他のタイプの遮断剤は、部分遮断剤および弱い遮断剤である。本明細書で使用される場合、部分遮断剤は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を６０～９８％低減する抗体分子であり、弱い遮断剤は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－α結合を６０％未満、例えば５０～５９．９％低減する抗体分子である。
【0045】
本発明のアゴニスト非遮断抗体分子と比較するために、実施例では、完全遮断アンタゴニスト抗体分子、部分遮断抗体分子および弱い遮断抗体分子を使用する。
【0046】
いくつかの特性および特徴が、抗体の生物学的活性の根底にあり、それを（共）決定することができる。リガンドが受容体に結合するのを遮断するまたは遮断しない能力に加えて、そのような重要な特性としては、受容体シグナル伝達を調節する、すなわち受容体シグナル伝達を作動させる（ａｇｏｎｉｚｅ）かまたはそれに拮抗する抗体分子の能力、および治療活性を与えるためのＦｃγＲ相互作用への抗体依存性が含まれる。
【0047】
最初に、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を調節する完全遮断抗体、部分遮断抗体および非遮断抗体の能力を特徴付けた。２つの極端な例（ｅｘｔｒｅｍｅｓ）が同定された。
【0048】
最初の極端な例として、ＴＮＦＲ２へのリガンド結合を完全に遮断し、ＴＮＦ－αが誘導するＴＮＦＲ２シグナル伝達を遮断し、細胞内因的に発現するＴＮＦＲ２に結合してもそれら自体はシグナル伝達を誘導しない抗体を同定した。リガンド遮断アンタゴニスト抗体のこのグループは、別個の発明を構成し、比較のために本明細書に含まれる。
【0049】
もう一方の極端な例として、ＴＮＦＲ２へのリガンド結合を遮断しないが、ＴＮＦＲ２に結合すると、内因的に発現する細胞が受容体を作動させる抗体を同定した。この第２のグループの抗体は、本発明の基礎を形成する。
【0050】
本明細書で使用される場合、非遮断抗体は、アイソタイプ対照抗体分子のみの存在下でのＴＮＦ－α結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－αの結合を０～５０％（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％、すべての整数およびその間のすべての小数を含む）低減する抗体分子である。
【0051】
部分遮断アゴニスト、部分遮断非アゴニスト、および完全遮断非アンタゴニストによって定義される抗体およびカテゴリーがさらに同定され、抗ＴＮＦＲ２抗体の複雑な生物学および大きな不均一性を示し、本発明の抗体が特有のグループを形成することを明確に示している。
【0052】
抗体がアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するか否かを決定するために、実施例４に記載されるようにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞アッセイを使用することが可能である。簡潔に言うと、ＮＫ細胞はＩＬ－２およびＩＬ－１２刺激に応答してＩＦＮ－γを分泌することが報告されている。可溶性ＴＮＦ－αは内因的に産生され、ＴＮＦＲ２シグナル伝達に対して堅牢であるが最適以下の濃度（約１００ｐｇ／ｍｌ）で存在する。これは、ＩＦＮ－γがＴＮＦＲ２シグナル伝達の調節によって増減する可能性があることを意味する。結果として、ＴＮＦＲ２シグナル伝達の最適濃度でのＴＮＦ－αの外因的添加は、アゴニスト抗ＴＮＦＲ２抗体とのインキュベーションと同様、このアッセイにおけるＩＦＮ－γ濃度を高める。逆に、比較のために本明細書に記載される抗ＴＮＦ－α抗体またはリガンド遮断アンタゴニスト抗体との共インキュベーションは、このアッセイにおけるＩＦＮ－γ放出を減少させる。したがって、このアッセイを使用して、抗ＴＮＦＲ２抗体のアゴニストもしくはアンタゴニスト活性、またはそれらの欠如を同定することができる。（ＴＮＦα Ａｕｇｍｅｎｔｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ ＩＦＮγ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＮＦＲ２．Ａｌｍｉｓｈｒｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．２０１６；８：６１７－６２９）
【0053】
結果として、抗体がＴＮＦＲ２シグナル伝達を作動させる、すなわち誘導する能力は、この実験装置を使用して監視することができる。同じナチュラルキラー（ＮＫ）細胞アッセイでＴＮＦＲ２に結合するとシグナル伝達を誘導する抗体の能力は、ＩＦＮ－γ放出の増加を監視し、実施例４に記載されるように、シグナル伝達の最適濃度で添加した外因性ＴＮＦ－αの存在下または非存在下での培養後に観察されたものと比較することで評価できる。したがって、アゴニストＴＮＦＲ２抗体は、このアッセイでＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ放出を増強する抗体として定義できる。固有のアゴニスト能力を有する抗体は、抗体の架橋またはＦｃガンマ受容体との相互作用に依存せず、可溶性ＴＮＦ－αリガンドの存在にも依存しない様式で、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ放出を増強する。したがって、固有のアゴニスト活性は、ＦｃγＲと生産的に結合しない抗体形式、例えばＦｃドメインにＮ２９７Ａ突然変異を有する非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を使用して、またはＦｃγＲを欠くアッセイシステム／細胞において、評価することができる。ＮＫ細胞は当業者に公知である（Ｂｉｎｙａｍｉｎ， Ｌ．，ｅｔ ａｌ（２００８）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８０，６３９２－６４０１；Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｅｌｆ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｔｉ－ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ．）。このアッセイを使用すると、アゴニスト抗体は、ＩＦＮ－γ放出の＞１００％（＞２倍）の増加をもたらす抗体として定義される。このアッセイはＰＢＭＣドナーからの一次細胞を使用するため、少なくとも４体のドナーを含める必要があり、平均値はすべてのドナーから計算すべきである。平均の計算に含まれる各ドナーからの細胞は、アイソタイプ対照での治療と比較して＞１００％（＞２倍）増加したＩＦＮ－γレベルで陽性対照（可溶性ＴＮＦ－α）治療に応答したはずである。
【0054】
本明細書に記載されるアゴニスト抗体分子は、上で説明したように、固有のアゴニスト活性を有する。
【0055】
本発明のいくつかの実施形態において、抗体は、上記アッセイにおいて、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ放出を少なくとも１００％増強することが好ましい。
【0056】
いくつかの実施形態において、アゴニスト活性は、ＴＮＦＲ２への結合に加えて、Ｆｃγ受容体に結合する抗体分子によって改善され得る。いくつかのそのような実施形態において、アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、活性化Ｆｃγ受容体よりも抑制性Ｆｃγ受容体に対してより高い親和性で結合する。活性化Ｆｃγ受容体よりも抑制性Ｆｃγ受容体への親和性が高いため、個々の活性化Ｆｃγ受容体と比較して、例えばＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩのいずれかと比較して、抑制性Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合する変異体という意味を含む。
【0057】
マウスＦｃγＲシステムとヒトＦｃγＲシステムとの間の比較的高い相同性は、種間の保存されたＦｃγＲ介在性メカニズムの一般的な側面の多くを説明している。しかしながら、マウスおよびヒトのＩｇＧサブクラスは、それらの同種のＦｃγＲに対する親和性が異なるため、マウスシステムでのＦｃγＲを介した観察をヒトＩｇＧベースの治療法に変換する際には、抗体、抗体サブクラスおよび／または操作されたサブクラスの変異体を選択することが重要であり、これは、ヒト活性化ＦｃγＲ対抑制性ＦｃγＲへの適切な結合を示している。個々のヒトＦｃγＲに対するヒト抗体分子の親和性および／または結合力は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定することができる。
【0058】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体への結合は、アゴニスト抗体分子のＦｃ領域とＦｃ受容体との間の通常の相互作用を介して起こる。いくつかのそのような実施形態において、抗体分子は、Ｆｃγ受容体に結合するＦｃ領域を有するＩｇＧである。いくつかのそのような実施形態において、抗ＴＮＦＲＩＩ抗体は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプのものであり、これは、ヒト抑制性ＦｃγＲＩＩＢならびにヒト活性化ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡに対して同様の中間親和性を有するが、ヒト活性化ＦｃγＲＩとは生産的に結合しない。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲＩＩ抗体は、ＩｇＧ２と比較してより高い親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合するが、より高い親和性で活性化ヒト活性化ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡにも結合し、さらに、高い親和性で活性化ＦｃγＲＩに結合するヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の実施形態において、抗ＴＮＦＲＩＩ抗体は、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増強するように操作された（例えば、「ＳＥＬＦ」突然変異）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ１９ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂ ｗｉｔｈ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６－３３）、および／または活性化ＦｃγＲと比較してＦｃγＲＩＩＢへの結合が比較的増強されるように操作された（例えば、Ｖ９またはＶ１１突然変異）（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＦｃγＲＩＩｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｖｅｒ ｂｏｔｈ ＦｃγＲＩＩａＲ１３１ ａｎｄ ＦｃγＲＩＩａＨ１３１”．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１３ Ｏｃｔ；２６（１０）：５８９－５９８．｝、ヒトＩｇＧである。抑制性ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増強するため、または活性化ＦｃγＲＩＩＡではなく抑制性ＦｃγＲＩＩＢへの特異的な結合親和性を特異的に増強するために操作されたそのようなＩｇＧ変異体は、活性化ＦｃγＲおよび抑制性ＦｃγＲがヒト化された動物におけるＣＤ４０アゴニスト抗体ＣＰ－８７０，８９３のインビボアゴニスト活性および治療活性を増大させることが示されている（Ｄａｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６．‘Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＦｃｇａｍｍａＲ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ’，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２９：８２０－３１）。
【0059】
ＴＮＦＲ２に加えてアゴニスト抗体分子が結合する可能性のあるＦｃ受容体は、マクロファージ、単球、ＭＤＣＳ、好中球、肥満細胞、好塩基球もしくは樹状細胞などの骨髄由来細胞の表面、またはＮＫ細胞、Ｂ細胞もしくは特定のＴ細胞などのリンパ球の表面に見られる受容体である。
【0060】
上で言及されるように、抗体分子は、しばしばそれらのＦｃ領域を介してＦｃ受容体に結合する。本明細書に開示されるアゴニスト抗体分子は固有のアゴニスト活性を有するため、ＴＮＦＲ２を作動させるためにＦｃ受容体に結合する必要はない。これは、本発明のいくつかの実施形態において、そのＦｃ領域を介したＦｃ受容体結合に依存しない抗体分子を使用することが可能であり、かつ、実際に、Ｆｃ領域を有しない抗体分子を使用することが可能であることを意味する。いくつかのそのような実施形態において、抗体分子は、Ｆａｂ’２またはそのＰＥＧ化バージョンであり得る。いくつかの実施形態において、抗体分子は、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’および／または（Ｆａｂ’）２を含む二価または多価抗体分子であり得る。他の実施形態において、抗体分子は、ＩｇＧ１抗体分子の非グリコシル化変異体などの修飾Ｆｃ領域を含み得る。そのような非グリコシル化は、例えば、抗体鎖の２９７位（Ｎ２９７Ｘ）におけるアスパラギンのアミノ酸置換によって達成され得る。置換は、グルタミン（Ｎ２９７Ｑ）、もしくはアラニン（Ｎ２９７Ａ）、もしくはグリシン（Ｎ２９７Ｇ）、もしくはアスパラギン（Ｎ２９７Ｄ）で、またはセリン（Ｎ２９７Ｓ）によって行われてもよい。他の置換は、例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎ ＦＷ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２０１７，２９２，１８６５－１８７５によって記載されている（例えば、表１を参照）。このような追加の置換としては、Ｌ２４２Ｃ、Ｖ２５９Ｃ、Ａ２８７Ｃ、Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ、Ｌ３０６Ｃ、Ｖ３２３Ｃ、Ｉ３３２Ｃおよび／またはＫ３３４Ｃが含まれる。
【0061】
いくつかの実施形態において、アゴニストＴＮＦＲ２抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体分子である。
【0062】
いくつかの実施形態において、アゴニストＴＮＦＲ２抗体分子は、１つまたはいくつかの活性化Ｆｃ受容体への結合の改善を示す、および／または１つまたはいくつかの活性化Ｆｃγ受容体への結合を改善するために操作された、および／または抑制性Ｆｃγ受容体に対する活性化Ｆｃγ受容体への相対的結合を改善するために操作された、ＩｇＧ抗体分子である。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、Ｆｃ操作されたヒトＩｇＧ１抗体である。そのような操作された抗体変異体の例としては、ＦｃγＲＩＩＩＡへの選択的に改善された抗体結合を有する非フコシル化抗体、および抑制性ＦｃγＲＩＩＢと比較して、１つまたはいくつかの活性化Ｆｃγ受容体への結合の改善をもたらす、指向性、突然変異性、または他の手段のアミノ酸置換によって操作された抗体が含まれる（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．２００８．‘Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ’，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，７：２５１７－２７；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．２００６．‘Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ’，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０３：４００５－１０）。
【0063】
いくつかの実施形態において、活性化Ｆｃガンマ受容体への結合を改善するために操作されたヒトＩｇＧ抗体は、そのＦｃ部分に、２つの突然変異Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ、または３つの突然変異Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌ、ならびに／またはＧ２３６Ａ突然変異を有するヒトＩｇＧ抗体であり得る。いくつかの実施形態において、活性化Ｆｃガンマ受容体への結合を改善するために操作されたヒトＩｇＧ抗体は、非フコシル化されたヒトＩｇＧ抗体であり得る。
【0064】
上で説明したように、抗体分子が固有のアゴニストであるということは、それらがＴＮＦ－αの非存在下および存在下の両方でアゴニストであることを意味する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＴＮＦ－αの非存在下でアゴニストである。いくつかの実施形態において、抗体は、ＴＮＦ－αの存在下でアゴニストである。
【0065】
本発明に従ってアゴニスト抗体が結合するＴＮＦＲ２を発現する標的細胞は、ＴＮＦＲ２を発現する免疫細胞または癌細胞からなる群から選択することができる。
【0066】
抗体は、免疫学および分子生物学分野の当業者には公知である。通常は、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）と、２つの軽鎖（Ｌ）と、を含む。本明細書では、時には、この完全な抗体分子をフルサイズ抗体または完全長抗体と称する。抗体の重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含み、抗体分子の軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含む。可変ドメイン（時にＦＶ領域と総称される）は、抗体の標的、または抗原に結合する。各可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つのループを含み、これらのループが標的の結合に関与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、ヒトでは、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分割される。
【0067】
抗体の別の部分は、Ｆｃ領域（あるいはフラグメント結晶化可能ドメインとしても既知である）であり、抗体の重鎖の各々に２つの定常ドメインを含む。上で言及されるように、Ｆｃ領域は抗体とＦｃ受容体との間の相互作用に関与する。
【0068】
本明細書で用いる場合、抗体分子という用語は、完全長抗体またはフルサイズ抗体、ならびに完全長抗体の機能的フラグメントおよびこのような抗体分子の誘導体を包含する。
【0069】
フルサイズ抗体の機能的フラグメントは、対応するフルサイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有し、対応するフルサイズ抗体と同じ可変ドメイン（すなわち、ＶＨ配列およびＶＬ配列）および／または同じＣＤＲ配列のいずれかを含む。機能的フラグメントは、対応するフルサイズ抗体の６個のＣＤＲのすべてを常に含有するわけではない。３つ以下のＣＤＲ領域（場合によっては、単一のＣＤＲだけまたはその一部）を含有する分子は、そのＣＤＲ（複数可）に由来する抗体の抗原結合活性を保持することが可能であることが理解される。例えば、全ＶＬ鎖（３個のＣＤＲをすべて含む）がその基質に対して高い親和性を有することが、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２３８９～９３に記載されている。
【0070】
２つのＣＤＲ領域を含有する分子については、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏ ２００１，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４：４１７～４３０に記載されている。４１８頁（右欄－３（Ｏｕｒ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ））に、フレームワーク領域内に散在するＨ１およびＨ２ ＣＤＲ超可変領域のみを含むミニボディについて記載されている。ミニボディは、標的に結合することが可能であると記載されている。Ｐｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３６７～９、およびＢｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３６：６４９～５９は、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏによって参照され、Ｈ１およびＨ２ミニボディ、ならびにその特性についてより詳細に記載している。Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：９２１～９では、２つの結合されたＣＤＲからなる分子が抗原に結合することが可能であることが示されている。Ｑｕｉｏｃｈｏ １９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２９３～４は、「ミニボディ」技術の概要を提供している。Ｌａｄｎｅｒ ２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：８７５～７は、２個のＣＤＲを含有する分子が抗原結合活性を保持することが可能であると見解を述べている。
【0071】
単一のＣＤＲ領域を含有する抗体分子については、例えば、Ｌａｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＪＢＣ，２７２：３０９３７～４４に記載されており、ここでは、ＣＤＲに由来するさまざまなヘキサペプチドが抗原結合活性を表すことが示され、完全な単一のＣＤＲの合成ペプチドが強力な結合活性を示すことに言及している。Ｍｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＪＢＣ，２７４：３７８９～９６では、さまざまな１２量体ペプチドおよび関連するフレームワーク領域が、抗原結合活性を有することが示されており、ＣＤＲ３様ペプチド単独で抗原に結合することが可能であると見解を述べている。Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６：１７９１～１８００では、「マイクロ抗体」（単一のＣＤＲを含有する分子）は抗原に結合することが可能であることが報告されており、抗ＨＩＶ抗体からの環状ペプチドが、抗原結合活性および機能を有することが示されている。Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３：１８８２～９１では、単一のＣＤＲが、そのリゾチーム抗原に対する抗原結合活性および親和性を付与し得ることが示されている。
【0072】
したがって、５個、４個、３個またはそれ以下のＣＤＲを有する抗体分子は、それらが由来する完全長抗体の抗原結合特性を保持することが可能である。
【0073】
抗体分子は、完全長抗体の誘導体またはそのような抗体のフラグメントであってもよい。誘導体が、対応するフルサイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有するということは、フルサイズ抗体と同じ標的上のエピトープに結合することを意味する。
【0074】
したがって、本明細書で用いる場合、「抗体分子」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、組換えで産生された抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト由来抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖のホモ二量体、抗体軽鎖のホモ二量体、抗体重鎖のヘテロ二量体、抗体軽鎖のヘテロ二量体、そのようなホモ二量体およびヘテロ二量体の抗原結合機能的フラグメントを含む、すべてのタイプの抗体分子、ならびにそれらの機能的フラグメントおよびそれらの誘導体を含む。
【0075】
さらに、本明細書で用いる場合、「抗体分子」という用語は、特に明記しない限り、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む、すべてのクラスの抗体分子および機能的フラグメントを含む。
【0076】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、ヒト抗体分子、ヒト化抗体分子またはヒト由来の抗体分子である。いくつかのそのような実施形態において、抗体分子は、ＩｇＧ抗体である。ＴＮＦＲスーパーファミリーのアゴニスト受容体、例えばＴＮＦＲ２の最適な共刺激は、抑制性ＦｃγＲＩＩの抗体結合に依存することが知られている。マウスでは、抑制性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）に優先的に結合し、活性化Ｆｃガンマ受容体に弱くのみ結合するＩｇＧ１アイソタイプは、ＴＮＦＲスーパーファミリーを標的とするモノクローナル抗体の共刺激活性に最適であることが知られている。ヒトでのマウスＩｇＧ１アイソタイプの直接的な同等物については記載されていないが、活性化ヒトＦｃガンマ受容体を上回る抑制性ヒトＦｃガンマ受容体への同様に向上した結合を示すように抗体を操作することができる。そのような操作されたＴＮＦＲスーパーファミリー標的化抗体はまた、ヒト活性化および抑制性Ｆｃガンマ受容体を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて、インビボでの共刺激活性を改善している（Ｄａｈａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＦｃγＲ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２９（６）：８２０－３１）。したがって、いくつかの実施形態において、抗体分子は、最適な方法で抑制性Ｆｃ受容体に結合するアイソタイプのものである。いくつかの実施形態において、抗体分子は、ＩｇＧ２抗体である。
【0077】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するアゴニスト抗体分子は、ラマ抗体、特にラマｈｃＩｇＧであってよい。すべての哺乳類と同様に、ラクダ科動物は、２つの重鎖と２つの軽鎖がジスルフィド結合でＹ字型に結合した従来の抗体を産生する（ＩｇＧ１）。しかしながら、それらはまた、重鎖ＩｇＧ（ｈｃＩｇＧ）としても既知である、免疫グロブリンＧの２つの特有のサブクラスであるＩｇＧ２およびＩｇＧ３を産生する。これらの抗体は、ＣＨ１領域が欠如する２つの重鎖のみで構成されているが、それらのＮ末端にＶＨＨと呼ばれる抗原結合ドメインを保持している。従来のＩｇは、抗原抗体相互作用の高度な多様性を可能にするように、重鎖と軽鎖の両方からの可変領域の結合を必要とする。単離された重鎖と軽鎖は依然としてこの能力を示すが、重鎖と軽鎖の対と比較すると、それらは極めて低い親和性を呈する。ｈｃＩｇＧの特有の特徴は、別の領域と対形成する必要がなく、従来の抗体に相当する特異性、親和性、特に多様性と共に抗原に結合するそれらの単量体抗原結合領域の能力である。
【0078】
上記の概略のように、抗体分子の異なるタイプおよび形態は本発明に包含され、免疫学分野の当業者には既知であろう。治療目的に使用される抗体は、多くの場合、抗体分子の特性を改変する追加の構成成分を用いて改変されることが公知である。
【0079】
したがって、本明細書に記載される抗体分子または本明細書に記載されるように使用される抗体分子（例えば、モノクローナル抗体分子、および／またはポリクローナル抗体分子、および／または二重特異性抗体分子）は、検出可能な部分および／または細胞傷害性部分を備える場合を含む。
【0080】
「検出可能な部分」とは、酵素、放射性原子、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分で構成される群からの１つ以上を含む。検出可能な部分により、抗体分子をインビトロ、および／またはインビボ、および／またはエクスビボで視覚化することが可能になる。
【0081】
「細胞傷害性部分」とは、放射性部分および／または酵素が挙げられ、例えば、酵素はカスパーゼおよび／または毒素であり、例えば毒素は細菌毒素または毒液であり、細胞傷害性部分は細胞溶解を誘導することが可能である。
【0082】
さらに、抗体分子は、単離された形態および／または精製された形態であってよく、ならびに／またはＰＥＧ化されてもよいことを含む。ＰＥＧ化は、その挙動を改変する、例えば、その流体力学的サイズを増加させ、腎クリアランスを予防することでその半減期を延ばすように、ポリエチレングリコールポリマーを抗体分子または誘導体などの分子に付加する方法である。
【0083】
上述のように、抗体のＣＤＲは、抗体標的に結合する。本明細書に記載の各ＣＤＲへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．１９９１、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２，ｐｐ ｘｖ－ｘｖｉｉによる定義に従う。
【0084】
当業者が認識するように、アミノ酸を各ＣＤＲに割り当てるための他の方法も存在する。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ（商標））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／およびＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１により出版のＬｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ”ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ）。
【0085】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒト抗体である。
【0086】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒト由来の抗体、すなわち、本明細書に記載されるように改変されたヒト由来の抗体である。
【0087】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒト化抗体、すなわち、ヒト抗体に対する類似性を高めるように改変された非ヒト由来の抗体である。ヒト化抗体は、例えば、マウス抗体またはラマ抗体であってよい。
【0088】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、ヒトＩｇＧ２抗体分子である。
【0089】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体はまた、１つまたはいくつかの抑制性Ｆｃ受容体への結合の改善を示す、かつ／あるいは１つまたはいくつかの抑制性Ｆｃ受容体への結合の改善のために操作されたヒトＩｇＧ２抗体の形態の抗体であり、したがって、いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、Ｆｃ操作されたヒトＩｇＧ２抗体である。
【0090】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、マウスまたはヒト化マウスＩｇＧ３抗体である。
【0091】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、モノクローナル抗体である。
【0092】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、ポリクローナル抗体である。
【0093】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、マウスＩｇＧ２ａに対応するまたはヒトＩｇＧ１抗体分子である。
【0094】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＨ－ＣＤＲ１配列のうちの１つを含む。
【0095】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＨ－ＣＤＲ２配列のうちの１つを含む。
【0096】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＨ－ＣＤＲ３配列のうちの１つを含む。
【0097】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＬ－ＣＤＲ１配列のうちの１つを含む。
【0098】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＬ－ＣＤＲ２配列のうちの１つを含む。
【0099】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子は、以下の表１に列挙されたＶＬ－ＣＤＲ３配列のうちの１つを含む。
【0100】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、
配列番号１、２、３、４、５および６、
配列番号９、１０、１１、１２、１３および１４、
配列番号１７、１８、１９、２０、２１および２２、
配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０、
配列番号３３、３４、３５、３６、３７および３８、
配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４６、
配列番号４９、５０、５１、５２、５３および５４、
配列番号５７、５８、５９、６０、６１および６２、
配列番号６５、６６、６７、６８、６９および７０、
配列番号７３、７４、７５、７６、７７および７８、
配列番号８１、８２、８３、８４、８５および８６、
配列番号８９、９０、９１、９２、９３および９４、ならびに
配列番号９７、９８、９９、１００、１０１および１０２からなる群から選択される６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
配列番号１、２、３、４、５および６、
配列番号９、１０、１１、１２、１３および１４、
配列番号１７、１８、１９、２０、２１および２２、
配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０、
配列番号３３、３４、３５、３６、３７および３８、
配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４６、
配列番号４９、５０、５１、５２、５３および５４、
配列番号５７、５８、５９、６０、６１および６２、
配列番号６５、６６、６７、６８、６９および７０、
配列番号７３、７４、７５、７６、７７および７８、
配列番号８１、８２、８３、８４、８５および８６、
配列番号８９、９０、９１、９２、９３および９４、ならびに
配列番号９７、９８、９９、１００、１０１および１０２からなる群から選択される６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0101】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号１、２、３、４、５および６を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子、または配列番号９、１０、１１、１２、１３および１４を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子、または配列番号１７、１８、１９、２０、２１および２２を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子、または配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子、または配列番号３３、３４、３５、３６、３７および３８を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子、または配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４６を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子である。
【0102】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号１、２、３、４、５および６を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子である。
【0103】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、７９、８７、９５および１０３からなる群から選択されるＶＨを含む抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0104】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、８８、９６および１０４からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0105】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７、１５、２３、３１、３９または４７を有するＶＨを含む抗体分子である。
【0106】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７を有するＶＨを含む抗体分子である。
【0107】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号８、１６、２４、３２、４０または４８を有するＶＬを含む抗体分子であることが好ましい。
【0108】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号８を有するＶＬを含む抗体分子であることがより好ましい。
【0109】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７を有するＶＨおよび配列番号８を有するＶＨを含むことが好ましい。
【0110】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号２１７を有するＣＨを含む。
【0111】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号２１８を有するＣＬを含む。
【0112】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体分子は、配列番号７を有するＶＨ、配列番号８を有するＶＨ、配列番号２１７を有するＣＨ、および配列番号２１８を有するＣＬを含む。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【0113】
本発明の抗体分子の特徴を決定するかまたは示すために、ＴＮＦ－αがＴＮＦＲ２に結合するのを遮断する抗体分子とそれらを比較した。このような抗体を表２に示す。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【0114】
上記表１および２の配列はすべてヒト由来であり、実施例１で詳細に説明されているように、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ライブラリに由来する。
【0115】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体分子はまた、以下の表３に示される定常領域（ＣＨおよび／またはＣＬ）の一方または両方を含み得る。
【表3】
【0116】
上記表３の最初のＣＨ（配列番号２１７）および最初のＣＬ（配列番号２１８）配列は、ヒト由来のものである。表３の２番目のＣＨ（配列番号２１９）および３番目のＣＨ（配列番号２２０）は両方ともマウスＩｇＧ２ａに由来し、その違いは、３番目のＣＨ配列（配列番号２２０）にＮ２９７Ａ突然変異が含まれている点である。２番目のＣＬ配列（配列番号２２１）は、マウスラムダ軽鎖定常領域に由来する。これらのマウス配列は、代理抗体の例で使用されている。
【0117】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、ヒトＴＮＦＲ２（ｈＴＮＦＲ２）に結合する。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体分子は、ヒトＴＮＦＲ２に強く結合すること、すなわち、それらが低いＥＣ５０値を有することが好ましい。これは、実施例２においてさらに示されている。
【0118】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、ｈＴＮＦＲ２およびカニクイザルＴＮＦＲ２（ｃｍＴＮＦＲ２またはｃｙｎｏＴＮＦＲ２）の両方に結合することが有利である。カニクイザル（ｃｒａｂ－ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅまたはＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）とも呼ばれるカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の細胞に発現するＴＮＦＲ２との交差反応性は、特に忍容性に焦点を当てた代理抗体を使用せずに抗体分子の動物試験を可能にするため、有利である可能性がある。
【0119】
いくつかの実施形態において、マウスの関連するインビボモデルにおいて抗体分子の機能的活性を試験するには、代理抗体を使用する必要がある。ヒトにおける抗体分子の効果とマウスにおける代理抗体のインビボ結果との間の比較可能性を確実にするために、ヒト抗体分子と同じインビトロ特性を有する機能的に同等の代理抗体を選択することが不可欠である。いくつかの実施形態において、抗体分子は、配列ＫＣＳＰＧを含むか、またはそれからなるＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合しない。
【0120】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子または本発明に従って使用される抗体分子は、ＴＮＦＲ２への結合について、本明細書で提供される特定の抗体と競合することができる、例えば、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、７９、８７、９５および１０３からなる群から選択されるＶＨ、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、８８、９６および１０４からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子と競合することができる抗体分子である。
【0121】
「競合することができる」とは、競合する抗体が、本明細書で定義される抗体分子の特定の標的ＴＮＦＲ２への結合を少なくとも部分的に抑制またはその他の方法で妨害する能力があることを意味する。
【0122】
例えば、そのような競合する抗体分子は、本明細書に記載される抗体分子のＴＮＲＦ２への結合を少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％抑制することができる場合がある。
【0123】
競合結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの当業者に公知の方法によって決定することができる。
【0124】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、エピトープ修飾抗体または遮断抗体を評価することができる。競合抗体を同定するために好適な追加の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅに開示されている（例えば、５６７～５６９頁、５７４～５７６頁、５８３頁、および５９０～６１２頁、１９８８，ＣＳＨＬ，ＮＹ，ＩＳＢＮ０－８７９６９－３１４－２を参照されたい）。
【0125】
いくつかの実施形態において、抗体分子自体ではなく、そのような抗体分子をコードするヌクレオチド配列を使用することを目的とする。したがって、本発明は、上記アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ－２抗体分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【0126】
上記アゴニスト非遮断抗体分子およびヌクレオチド配列は、医薬において使用することができ、そして、そのような抗体分子および／またはヌクレオチド配列は、以下でさらに論じられるように、薬学的組成物に含まれ得る。
【0127】
上記アゴニスト非遮断抗体分子、ヌクレオチド配列および／または薬学的組成物は、以下でさらに論じられるように、癌の治療に使用することができる。
【0128】
上記アゴニスト非遮断抗体分子、ヌクレオチド配列および／または薬学的組成物は、以下でさらに論じられるように、慢性炎症性疾患の治療に使用することができる。
【0129】
上記アゴニスト非遮断抗体分子および／またはヌクレオチド配列は、癌の治療に使用するための薬学的組成物の製造に使用することができる。
【0130】
上記アゴニスト、非遮断抗体分子および／またはヌクレオチド配列は、慢性炎症性疾患の治療に使用するための薬学的組成物の製造に使用することができる。
【0131】
上記アゴニスト非遮断抗体分子および／または薬学的組成物は、治療有効量の抗体分子または薬学的組成物が対象に投与される、患者における癌の治療方法で使用することができる。
【0132】
上記アゴニスト非遮断抗体分子および／または薬学的組成物は、治療有効量の抗体分子または薬学的組成物が患者に投与される、患者における慢性炎症性疾患の治療方法で使用することができる。
【0133】
癌の治療に関連するいくつかの実施形態において、癌は、固形癌または白血病癌である。固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない異常な組織の塊である。固形腫瘍は良性（癌ではない）または悪性（癌である）の場合がある。悪性固形腫瘍は、本明細書では固形癌と呼ばれる。さまざまなタイプの固形腫瘍または癌は、それらを形成する細胞のタイプにちなんで名付けられている。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫およびリンパ腫である。
【0134】
固形癌のより具体的な例は、肺癌、頭頸部癌、胃癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、脳癌、中枢神経系癌、黒色腫、神経芽腫、リンパ腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫および骨癌である。
【0135】
白血病性癌のより具体的な例は、急性リンパ性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、急性非リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ増殖性疾患である。いくつかの実施形態において、上記アゴニスト非遮断抗体分子は、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子と組み合わせて使用することができる。あるいは、アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子をコードする上記ヌクレオチド配列は、チェックポイント抑制剤または共刺激アゴニスト抗体に特異的に結合する抗体分子と組み合わせて使用することができる。チェックポイント抑制剤に対する抗体の例は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ７を標的とする抗体である。共刺激アゴニスト抗体の例は、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＲＡＮＫ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴおよびＢ７－Ｈ６を標的とする抗体である。あるいは、上記アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、チェックポイント抑制剤または共刺激アゴニストに特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列と組み合わせて使用することができる。あるいは、アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子をコードする上記ヌクレオチド配列は、チェックポイント抑制剤または共刺激アゴニストに特異的に結合する抗体分子をコードするヌクレオチド配列と組み合わせて使用することができる。いくつかのそのような実施形態において、チェックポイント抑制剤に特異的に結合する抗体分子は、抗ＰＤ－１抗体である。ＰＤ１抗体は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞においてＰＤ－Ｌ１を介した抑制性シグナルを遮断すると考えられている。これにより、Ｔ細胞介在性抗腫瘍応答の増加が可能になる。これらの治療は互いに相乗効果を発揮する可能性がある。同じことが他のチェックポイント抑制剤およびアゴニスト共刺激抗体にも当てはまる。
【0136】
さらに、上記アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２抗体分子は、化学療法（ドキソルビシン、パラプラチン、シクロホスファミド、パクリタキセル、ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ムタマイシン、エピルビシンおよびメトトレキサートなどであるが、これらに限定されない）、小分子チロシンキナーゼまたはセリン／スレオニンキナーゼ抑制剤（イブルチニブ、イマチニブ、スンチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、バンデタニブ、ミドスタウリン、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、トラメチニブまたはアレクチニブなどであるが、これらに限定されない）、成長因子受容体を標的とする抑制剤（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲ２／ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ３／ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ ＨＧＦＲ、ＲＥＴ、インスリン様成長因子受容体ＩＧＦＲ、ＦＧＦＲを標的とする薬剤などであるが、これらに限定されない）、抗血管新生薬（ベバシズマブ、エベロリムス、レナリドマイド、サリドマイド、ジブアフリベルセプトなどであるが、これらに限定されない）または照射などの他の抗癌治療と組み合わせて使用することができる。通常、上記抗癌剤はすべて癌細胞死を引き起こし、これがネオ抗原の露出と炎症につながる。ネオ抗原が露出し、腫瘍に炎症細胞が流入すると、抗癌剤の相乗効果が生じる可能性がある。
【0137】
例えば、薬剤が体に吸収される速度を変更するように、薬剤は、異なる添加物で改変することができ、例えば身体への特定の投与経路を可能にするように異なる形態で改変することができることは、医薬当業者には既知であろう。
【0138】
したがって、本明細書に記載されるアゴニスト非遮断抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞を、薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントと組み合わせて薬学的組成物にすることができることを含む。この文脈において、薬学的組成物という用語は、薬学的調製物、薬学的製剤、治療組成物、治療調製物、治療製剤、および治療実体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｔｉｔｙ）という用語と交換可能に使用することができる。
【0139】
本明細書に記載の薬学的組成物は、抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスまたは細胞を含み得るか、またはいくつかの実施形態ではそれらからなる。
【0140】
本明細書に記載の薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、上記の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むかまたは上記のヌクレオチド配列を含む、プラスミドからなるか、またはそれを含み得る。
【0141】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、細胞またはウイルスゲノムまたはビリオーム（ｖｉｒｉｏｍｅ）に組み込まれた、本明細書に記載の抗体分子の一部または完全な抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。そして、薬学的組成物は、本発明の抗体の送達ビヒクル（または本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列の送達ビヒクル）としての細胞またはウイルスを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ウイルスは、本明細書に記載される抗体分子のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む治療的腫瘍溶解性ウイルスの形態であってよい。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、完全長ヒトＩｇＧ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0142】
添付の特許請求の範囲に記載されているように、本発明は、いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド配列または本発明のプラスミドを含むウイルスに関する。好ましくは、ウイルスは、治療的腫瘍溶解性ウイルスなどの腫瘍溶解性ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスは、医薬およびウイルス学の当業者に既知である。
【0143】
いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0144】
いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号７および配列番号８をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号１５および配列番号１６をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号２３および配列番号２４をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号３１および配列番号３２をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号３９および配列番号４０をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４７および配列番号４８をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号５５および配列番号５６をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号６３および配列番号６４をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号７１および配列番号７２をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号７９および配列番号８０をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８７および配列番号８８をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号９５および配列番号９６をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号１０３および配列番号１０４をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0145】
いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記表１に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記表１に示される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記表１に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記表１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0146】
一例として、抗体００１－Ｆ０２をコードするヌクレオチド配列は、表４に示されている通りである可能性がある。
【表4-1】
【表4-2】
【0147】
一部の腫瘍溶解性ウイルスは、完全長のヒト抗体配列の統合に対応するのに十分な大きさのＤＮＡ挿入を受け入れる能力を持っている。弱毒化ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスは、完全長のＩｇＧ抗体配列の組み込みを可能にする程ゲノムが十分に大きい治療用腫瘍溶解性ウイルスの例である（Ｃｈａｎ，Ｗ． Ｍ． ｅｔ ａｌ ２０１４ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ １（１）：１１９－１４１；Ｂｏｍｍａｒｅｄｄｙ，Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（８）：４９８－５１３）。完全長ＩｇＧ抗体は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにうまく組み込まれ、ウイルス感受性宿主細胞、例えば癌細胞の感染時に完全長ＩｇＧ抗体の発現と細胞外放出（産生）をもたらす。（Ｋｌｅｉｎｐｅｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（１０）：ｅ１２２０４６７）。アデノウイルスはまた、細胞感染時に機能的に産生および分泌される完全長ＩｇＧ抗体をコードするように操作することもできる（Ｍａｒｉｎｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３（６）：２４４７－２４６３）。
【0148】
本発明はまた、上記の腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、ならびに薬学的に許容される希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントを含む薬学的組成物を包含する。
【0149】
薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、そのキメラ抗原Ｔ細胞受容体をコードする配列の一部として本明細書に記載の部分または完全な抗体配列を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の形態であり得る。
【0150】
本発明はまた、上記のＣＡＲ－Ｔ細胞ならびに薬学的に許容される希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントを含む薬学的組成物を包含する。
【0151】
本発明はまた、抗体薬物コンジュゲート、融合タンパク質などの他の治療法、または薬物の「形状」、およびそのような治療法を含む薬学的組成物を含む。
【0152】
本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物は、抗酸化剤、および／もしくはバッファー、および／もしくは静菌剤、および／もしくは、意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有し得る水性および／もしくは非水性滅菌注射溶液；ならびに／または懸濁剤および／もしくは増粘剤を含み得る水性および／もしくは非水性滅菌懸濁液を含み、非経口投与に好適であり得る。本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、細胞および／または薬学的組成物は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル内に存在させてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。
【0153】
即時注射液および懸濁液剤は、前述の種類の滅菌散剤、および／または顆粒剤、および／または錠剤から調製され得る。
【0154】
ヒト患者への非経口投与では、抗ＴＮＦＲ２抗体分子の１日投与量レベルは通常、患者の体重で１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、あるいは場合によっては、最大１００ｍｇ／ｋｇを単回または分割用量で投与するであろう。特別な状況下、例えば長期投与と組み合わせて、より低い用量を使用してもよい。いずれにしても、医師は個々の患者に最も好適であろう実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重、および応答によって変動するであろう。上述の投与量は平均的な場合の例示である。当然ながら、より高いかまたはより低い投与量範囲が妥当である個々の症例があり得、それらも本発明の範囲内に含まれる。
【0155】
典型的には、抗体分子を含む本明細書に記載される薬学的組成物（または医薬品）は、約２ｍｇ／ｍｌ～１５０ｍｇ／ｍｌまたは約２ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＴＮＦＲ２抗体分子を含有するであろう。
【0156】
一般に、ヒトでは、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物の経口または非経口投与が好ましい経路であり、最も便利である。獣医学的使用のために、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物は、通常の獣医学的診療に従って適宜許容される薬剤処方として投与され、獣医師は、ある特定の動物にとって最も適切であろう投与計画および投与経路を決定するであろう。したがって、本発明は、（上述および以下でさらに説明する）さまざまな状態を治療するのに有効な、本発明の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞の量を含む薬学的製剤を提供する。好ましくは、本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物は、静脈内（ＩＶまたはｉ．ｖ．）、筋肉内（ＩＭまたはｉ．ｍ．）、皮下（ＳＣまたはｓ．ｃ．）を含む群から選択される経路による送達に適合される。
【0157】
本発明はまた、本発明の標的結合分子または部分の薬学的に許容される酸または塩基付加塩を含む、本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物を含む。本発明で有用な前述の塩基化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用される酸は、とりわけ、非毒性の酸付加塩、すなわち塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、およびパモエート［すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３ナフトエート）］塩などの薬理学的に許容可能なアニオンを含有する塩を形成するものである。また、薬学的に許容される塩基付加塩を使用して、本発明による薬剤の薬学的に許容される塩の形態を産生してもよい。本質的に酸性である本薬剤の薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と非毒性塩基塩を形成するものである。そのような非毒性塩基塩には、これらに限定されないが、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えばカリウムおよびナトリウム）およびアルカリ土類金属カチオン（例えばカルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えばＮ－メチルグルカミン－（メグルミン）、および低級アルカノールアンモニウム、ならびに他の薬学的に許容される有機アミンの塩基塩などのそのような薬理学的に許容されるカチオンに由来するものが挙げられる。本明細書に記載される抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞は、保存のために凍結乾燥され、使用前に適切な担体中で再構成することができる。任意の好適な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）、および／または再構成技法を用いてもよい。凍結乾燥および再構成によって、抗体活性低下の程度の変動に至る場合があり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性が大きく低下する傾向を有する）、使用レベルを上方調整して補う必要があり得ることを当業者は理解するであろう。一実施形態において、凍結乾燥（フリーズドライ）ポリペプチド結合部分は、再水和されるとき、（凍結乾燥前の）その活性のうちの約２０％未満、または約２５％未満、または約３０％未満、または約３５％未満、または約４０％未満、または約４５％未満、または約５０％未満を損失する。
【0158】
本明細書に記載される抗ＴＮＦＲ２抗体分子、ヌクレオチド配列および薬学的組成物は、対象または患者における癌の治療での使用に、使用することができる。本明細書では、対象および患者という用語は交換可能に使用される。
【0159】
「患者」（または対象）という用語は、本明細書で使用される場合、癌を有すると診断された、および／または特定の疾患の症状を呈する、ヒトを含む動物を指す。
【0160】
いくつかの実施形態において、患者（または対象）は、癌を有すると診断された、ヒトを含む動物である。
【0161】
いくつかの実施形態において、患者（または対象）は、慢性炎症性疾患を有すると診断された、および／または慢性炎症性疾患の症状を呈する、ヒトを含む動物である。本明細書で使用される場合、慢性炎症性疾患には、自己免疫疾患が含まれる。上記のように、いくつかの異なる免疫細胞がＴＮＦＲ２を発現する可能性があり、疾患および状況に応じて、発現の相対レベルが変化する可能性がある。例えば、制御性Ｔ細胞が高レベルのＴＮＦＲ２を発現できること、およびこれらがＴＮＦＲ２アゴニストによって増殖できることは公知である。制御性Ｔ細胞は、正常免疫設定および病理学的免疫設定で他の免疫細胞を抑制することができるＴ細胞の亜集団を構成し、自己組織への自己免疫攻撃を防ぐのに役立つと考えられている。したがって、制御性Ｔ細胞の活性を刺激することは、自己免疫障害の治療において非常に重要である可能性がある（Ｓｈａｒａｂｉ ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８ Ｏｃｔ １２）。自己免疫障害以外の慢性炎症性疾患の例は、変形性関節症およびセリアック病である。自己免疫障害の例は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または重症筋無力症（ＭＧ）である。
【0162】
いくつかの実施形態において、患者（または対象）は、病変組織で高いＴＮＦＲ２発現を有する患者である。この文脈において、高（い）発現は、対応する健康な組織と比較して、より高いレベルのＴＮＦＲ２発現を意味する。通常、このような比較に使用される健康な組織は、１または数体の健康な個体の健康な組織から収集された参照組織（または標準参照）である。発現レベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）またはｍＲＮＡ発現測定などの標準的な技法で測定できる。
【0163】
患者は、哺乳類または非哺乳類であり得る場合を含む。好ましくは、哺乳類患者は、ヒト、馬、牛、羊、豚、ラクダ、犬または猫である。最も好ましくは、哺乳類患者はヒトである。
【0164】
「癌の症状を呈する」とは、対象が、癌症状および／もしくは癌診断マーカーを表すこと、ならびに／または癌症状および／もしくは癌診断マーカーを測定、および／または評価、および／または定量化できる場合を含む。
【0165】
医薬当業者であれば、癌症状および癌診断マーカーがどのようなものであるか、ならびに癌症状の重症度に低減または増加があるかどうか、または癌診断マーカーに低減もしくは増加があるかどうかを測定および／もしくは評価および／もしくは定量化する方法、ならびに癌症状および／もしくは癌診断マーカーを使用して、癌に関する予後診断を形成することができる方法は、容易に明らかであろう。
【0166】
癌治療は、多くの場合、一連の治療として投与される、すなわち治療剤は、ある期間にわたって投与される。一連の治療の時間の長さは、他の理由のなかでもとりわけ、投与される治療剤のタイプ、治療される癌のタイプ、治療される癌の重症度、ならびに患者の年齢および健康状態を含むいくつかの要因に依存する。
【0167】
「治療中」とは、患者が現在、一連の治療を受けていること、および／または治療剤を受けていること、および／または一連の治療剤を受けている場合を含む。
【0168】
いくつかの実施形態において、本発明に従って治療される癌は、固形腫瘍である。
【0169】
上述の癌のいずれもが公知であり、症状および癌診断マーカーは、それらの癌を治療するのに使用される治療剤であるため、十分に説明されている。したがって、上記のタイプの癌を治療するために使用される症状、癌診断マーカーおよび治療剤は、医薬当業者には既知であろう。
【0170】
大多数の癌の診断、予後診断、進行の臨床的定義は、ステージ分類として既知である、ある特定の分類による。それらのステージ分類システムは、多くの異なる癌診断マーカーおよび癌症状を照合して、癌の診断、および／または予後診断、および／または進行の概要を提供するように機能する。ステージ分類システムを使用して、癌の診断、および／または予後診断、および／または進行を評価する方法、ならびにそのためにどの癌診断マーカーおよび癌症状を使用すべきかということは、腫瘍学当業者には既知であろう。
【0171】
「癌のステージ分類」とは、ステージ０、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含む、Ｒａｉステージ分類、ならびに／またはステージＡ、ステージＢ、およびステージＣを含むＢｉｎｅｔステージ分類、ならびに／またはステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含む、Ａｎｎ Ａｒｂｏｕｒステージ分類が挙げられる。
【0172】
癌は、細胞の形態に異常を引き起こし得ることが既知である。これらの異常は、多くの場合、ある特定の癌で再現性よく生じ、これは形態におけるこれらの変化の検査（あるいは組織学的検査としても既知である）が、癌の診断または予後診断に使用することができることを意味する。細胞の形態を検査するために試料を視覚化し、視覚化用に試料を準備するための技法は、例えば、光学顕微鏡法または共焦点顕微鏡法など、当技術分野で公知である。
【0173】
「組織学的検査」とは、小さな成熟リンパ球の存在、および／または細胞質の境界が狭い小さな成熟リンパ球の存在、識別可能な核小体が欠如する密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、および／または細胞質の境界が狭く、識別可能な核小体が欠如する密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、および／または異型細胞、および／もしくは切断細胞、および／もしくは前リンパ球の存在が挙げられる。
【0174】
癌は、細胞のＤＮＡの変異の結果であり、これによって細胞の細胞死回避、または制御不能な増殖に至り得ることは公知である。したがって、これらの変異の検査（細胞遺伝学的検査としても既知である）は、癌の診断および／または予後診断を評価するための有用なツールであり得る。この例は、慢性リンパ球性白血病の特徴である染色体上の位置１３ｑ１４．１の欠失である。細胞内の変異を検査するための技法は、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）など、当技術分野で公知である。
【0175】
「細胞遺伝学的検査」とは、細胞内のＤＮＡ、具体的には染色体の検査を含む。細胞遺伝学的検査を使用して、難治性癌および／または再発した癌の存在に関連し得る、ＤＮＡの変化を同定することができる。そのようなものとしては、１３番染色体の長腕の欠失、および／または染色体位置１３ｑ１４．１の欠失、ならびに／または１２番染色体のトリソミー、および／または１２番染色体の長腕の欠失、ならびに／または１１番染色体の長腕の欠失、および／または１１ｑの欠失、ならびに／または６番染色体の長腕の欠失、および／または６ｑの欠失、ならびに／または１７番染色体の短腕の欠失、および／または１７ｐの欠失、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または抗原遺伝子受容体再配列、ならびに／またはＢＣＬ２再配列、ならびに／またはＢＣＬ６再配列、ならびに／またはｔ（１４：１８）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または（３：ｖ）転座、ならびに／または（８：１４）転座、ならびに／または（８：ｖ）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）および（ｑ１３：ｑ３２）転座を挙げることができる。
【0176】
癌患者は、ある特定の身体症状を呈することが既知であり、これは多くの場合、癌が身体に負担をかけている結果である。これらの症状は、多くの場合、同じ癌で再発するため、疾患の診断、および／または予後診断、および／または進行の特徴であり得る。医薬当業者であれば、どの身体症状がどの癌に関連しているか、ならびにそれらの身体系の評価が疾患の診断、および／または予後診断、および／または進行とどのように相関し得るかを理解するであろう。「身体的症状」としては、肝腫大および／または脾腫が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0177】
以下の実施例では、次の図を参照している。
【0178】
【図1】本発明の抗体がＴＮＦＲ２に結合することを示している。図１Ａ～Ｄ：ヒト抗体が用量依存的にヒトＴＮＦＲ２タンパク質に結合し、異なるＥＣ５０値を生成することが、ＥＬＩＳＡにより示された。図１Ｅ：マウス抗体３－Ｆ１０および５－Ａ０５は同様の親和性でｍＴＮＦＲ２に結合する。
【図2】ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示している。ヒト血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ａ～Ｄ）およびマウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ｅ）は、ＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で活性化された。活性化細胞に対するＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の親和性を、０．００２～２６７ｎＭ（ヒト）および０．００００３～１３３ｎＭ（マウス）の範囲の濃度でＦＡＣＳによって分析した。曲線は、アイソタイプ対照バックグラウンドを差し引いた後のＭＦＩを示している（図２Ａ（完全遮断剤および部分遮断剤）、図２Ｂ（部分遮断剤）、図２ＣおよびＤ（非遮断剤）、図２Ｅ（マウス代理完全遮断剤（３－Ｆ１０）および非遮断剤（５－Ａ０５））。 ヒトＴＮＦＲ２抗体はインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞に異なる親和性で結合するが（ＥＣ５０値は０．５９～５３ｎＭの範囲）、マウスＴＮＦＲ２抗体は同様の親和性で結合する（ＥＣ５０値は０．０７２～０．１１ｎＭの範囲）。
【図3】ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がＴＮＦＲ２に特異的に結合することを示している。ヒト血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（図３Ａ）およびマウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（図３Ｂ）は、組換えＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズで３日間活性化された。インビトロで活性化された細胞を、ポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（灰色の線）で遮断するか、ＰＢＳ（黒色の線）に３０分間放置した後、最適以下の濃度の異なるＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照（破線）で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、ＡＰＣ結合二次抗体（ＡＰＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と３０分間インキュベートした後、フローサイトメトリーで分析した。 すべての抗体の結合はポリクローナルＴＮＦＲ２抗体によって遮断される可能性があるため、ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体（ヒトおよびマウス）がＴＮＦＲ２に特異的であることを示している。
【図4】カニクイザルに対するヒトＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の交差反応性を示している ＣＤ４＋Ｔ細胞をカニクイザルの血液から単離し、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激した。２日後、細胞を０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照で標識した後、ＡＰＣ結合二次α－ヒト抗体とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。この図は、アイソタイプ対照に対する個々の抗体のＴＮＦＲ２＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している。結果は、２～３回の個別実験から得られた平均値とＳＤである。 ほとんどのＴＮＦＲ２抗体は、カニクイザル細胞への交差反応性結合を示す。
【図5】活性化細胞を４０μｇ／ｍｌＭＲ２－１抗体（図５Ａ、黒いバー）で遮断するか、ＰＢＳ（図５Ａ、灰色のバー）を使用して３０分放置した後、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ポリクローナルＴＮＦＲ２（ｐＴＮＦＲ２）を添加し、細胞を１５分間インキュベートした。結合したＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の割合を、ＡＰＣ結合二次抗体とのインキュベーション後にＦＡＣＳで分析した。図５Ｂでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を４０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ｐＴＮＦＲ２（黒いバー）で遮断するか、ＰＢＳ（灰色のバー）を使用して放置した後、ＰＥ結合ＭＲ２－１抗体と１５分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳで分析した。 ＭＲ２－１抗体はＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の結合を妨害せず、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は活性化細胞へのＭＲ２－１の結合に影響を与えず、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がすべて、ＭＲ２－１抗体以外のＴＮＦＲ２タンパク質の他のドメインに結合することを示している。これは、ＴＮＦｒ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がすべて、ＴＮＦＲ２クローンＭＲ２－１以外のＴＮＦＲ２タンパク質上の他のエピトープに結合することを示している。 ヒト血液由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｒｈＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズで２～３日刺激した。活性化細胞を４０μｇ／ｍｌＭＲ２－１抗体（図５Ａ、黒いバー）で遮断するか、ＰＢＳ（図５Ａ、灰色のバー）を使用して３０分放置した後、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ポリクローナルＴＮＦＲ２（ｐＴＮＦＲ２）を添加し、細胞を１５分間インキュベートした。結合したＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の割合（％）を、ＡＰＣ結合二次抗体とのインキュベーション後にＦＡＣＳで分析した。図５Ｂでは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を４０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ｐＴＮＦＲ２（黒いバー）で遮断するか、ＰＢＳ（灰色のバー）を使用して放置した後、ＰＥ結合ＭＲ２－１抗体と１５分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳで分析した。 ＭＲ２－１抗体はＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の結合を妨害せず、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は活性化細胞へのＭＲ２－１の結合に影響を与えず、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がすべて、ＭＲ２－１抗体以外のＴＮＦＲ２タンパク質の他のドメインに結合することを示している。
【図6】リガンド遮断抗体のデータを示している。ｈＴＮＦＲＩＩに特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂを用いて遮断ＥＬＩＳＡを実施して、リガンド遮断特性を評価した。図６Ａ）すべての抗体を１０μｇ／ｍｌでインキュベートした。続いて、アイソタイプ対照を用いて達成されたシグナルを５０％超（点線で示されている）低減するすべての抗体を投与して、リガンド遮断の可能性をさらに調査した。図６Ｂ）は完全遮断ｍＡｂを示し、図６Ｃ）およびＤ）は部分遮断ｍＡｂを示し、図６Ｅ）は弱い遮断ｍＡｂを示す。他のすべてのｍＡｂは、非遮断ｍＡｂとみなされる
【図7】リガンド遮断抗体のデータを示している。ｍＴＮＦＲＩＩに特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂを用いて遮断ＥＬＩＳＡを実施して、リガンド遮断特性を評価した。図７Ａ）すべての抗体を１０μｇ／ｍｌでインキュベートした。続いて、アイソタイプ対照を用いて達成されたシグナルを５０％超（点線で示されている）低減するすべての抗体を投与して、リガンド遮断の可能性をさらに調査した。図７Ｂ）は完全遮断ｍＡｂを示し、図７Ｃ）およびＤ）は部分遮断ｍＡｂを示し、図７Ｅ）は弱い遮断ｍＡｂを示す。他のすべてのｍＡｂは、非遮断ｍＡｂとみなされる。
【図8】アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は、ＩＬ－２およびＩＬ－１２で刺激されたＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γ産生を増強するが、アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は増強しないことを示している。図８Ａ：ヒト血液由来ＮＫ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２および２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－１２で刺激し、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体、アイソタイプ対照または１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦ－αを２４時間添加した。培養上清中のＩＦＮ－γの量を、ＭＳＤを使用して測定した。ＩＦＮ－γの量はアイソタイプ対照に対して正規化され、図８Ａに示されている。インビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞に対して２５ｎＭよりも高いＥＣ５０値を示したヒト抗体は分析に含まれていない。ヒトＮＫ細胞も、これらの培養物でＴＮＦ－αを産生する（下の図８Ｄを参照）。ＩＦＮ－γの結果は、２回の独立した実験における３体のドナーの平均値である。結果は、非遮断ＴＮＦＲ２抗体がアンタゴニスト性であり、サイトカイン刺激ＮＫ細胞からのＩＦＮ－γ産生を増強する一方で、遮断抗体はかなりアゴニスト性であり、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ産生を減少させることを示している。加えて、図８Ｂ～Ｄは、測定可能なＴＮＦ－αリガンドがない場合でも、アゴニスト抗体が固有のアゴニスト活性を有することを示している。図８Ｂに示すように、遮断ＴＮＦ－α抗体を加えるとＩＦＮ－γ放出量が減少するが、上清中に測定可能なＴＮＦ－αが完全に存在しない場合でも、アイソタイプ対照（図８Ｃ）に対する比率は維持される（図８Ｄ）。図８Ｄは、ＴＮＦ－α中和抗体の存在下または非存在下での２体のドナーにおける平均ＴＮＦ－αレベルを示している。
【図9】アゴニスト非遮断ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞集団を活性化する（ＣＤ２５＋細胞の割合の増加によって示される）が、アンタゴニスト遮断ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は活性化しないことを示している。ヒト血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞（図９Ａ）およびマウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（図９Ｂ）は、組換えＩＬ－２およびＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体、アイソタイプ対照または組換えＴＮＦ－αで活性化された。培養の３日後、細胞をＣＤ２５およびＣＤ４５ＲＯ（ヒト）／ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ（マウス）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。結果は、アイソタイプ対照を用いた培養物において回収されたＣＤ２５＋細胞のパーセンテージに対する、メモリー上のＣＤ２５発現細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋細胞（ヒト）／ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－（マウス））集団のパーセンテージを示す。結果は、７体のドナー（図９Ａ、ヒト）と３匹のマウス（２回の独立した実験）（図９Ｂ）の平均値とＳＥＭである。ヒトおよびマウスの両方の培養物において、非遮断ＴＮＦＲ２抗体はＣＤ２５＋メモリー細胞のパーセンテージを誘導したが、遮断抗体はメモリー集団にそのような影響を与えなかった。ヒト培養物（図９Ａ）とマウス（図９Ｂ）の両方について、外因性ＴＮＦ－αの添加は、ＣＤ２５＋メモリーＴ細胞集団を増加させる。＊＝ｐ＜０．０５（一元配置分散分析により計算）。
【図10】抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂが骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の抑制機能を調節することを示している。図１０ＡおよびＢの場合、ＭＤＳＣをヒト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂと３０分間プレインキュベートした。次に、細胞を洗浄せずに、滴定数のＭＤＳＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下でＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋Ｔ細胞とインキュベートした。図１０Ａ：活性化ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合（％）を、３日後にＦＡＣＳによって決定した。異なるアッセイ間で正規化するために、アイソタイプ対照のバックグラウンドをすべてのデータ点から差し引いた。図は、ＭＤＳＣとＴ細胞の比率が１：４の３つの独立した実験における６体の異なるドナーの要約を示している。図１０Ｂ：上清中の分泌されたサイトカインの量をＭＳＤによって評価し、ＩＦＮ－γとＩＬ－１０との放出の比率をアイソタイプ対照との関係で計算した。データは、５体の異なるドナーでの実験から得られた培養上清の分析からプールした。 図１０Ｃの場合、マウスＣＴ２６腫瘍からのＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞を単離し、マウス抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂと３０分間プレインキュベートした。滴定数の骨髄性細胞を、ナイーブＢａｌｂ／Ｃ脾臓から精製したＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で３日間刺激し、増殖中のＣＦＳＥ低細胞の割合（％）をＦＡＣＳで分析した。（ｎ＝４回の独立した実験）。アゴニスト／非遮断抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのみが、Ｔ細胞／ＭＤＳＣ共培養アッセイでＭＤＳＣの抑制機能を逆転させることが示された。 図１０Ｄの場合、ＭＤＳＣを、２つの異なるヒト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ（１つの遮断＝１Ｈ１０）と１つの非遮断（＝１Ｆ０２）の３つの異なるアイソタイプ（Ｆｃ欠損形式を含む）と共に３０分間プレインキュベートした。アミノ酸位置２９７が置換されると、グリコシル化が失われ、ＦｃγＲ（ここではＮ２９７Ｑと呼ばれる）への結合が減少した。次に、細胞を洗浄せずに、滴定数のＭＤＳＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下でＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋Ｔ細胞とインキュベートし、３日後にＦＡＣＳによって活性化ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合（％）を測定した。異なるアッセイ間で正規化するために、アイソタイプ対照のバックグラウンドをすべてのデータ点から差し引いた。この図は、非遮断１－Ｆ０２抗体のアゴニスト活性が抗体アイソタイプおよびＦｃγＲ結合とは無関係であることを示している。この図は、ＭＤＳＣとＴ細胞の比率が１：４の２つの独立した実験における４体の異なるドナーの要約を示している。
【図11】図１１Ａの場合、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１×１０６ＣＴ２６細胞を皮下注射した。８日後、３ｘ３ｍｍの平均腫瘍サイズで、図に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇ抗体で週２回、腹腔内処置した。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。上の図はアイソタイプ対照で処置されたマウスの腫瘍成長を示し、下の２つの図は、左のパネルにおいて、ＦｃγＲ欠損Ｉｇ形式のアンタゴニストリガンド遮断剤抗体（中央の図）およびアゴニスト非リガンド遮断抗体（下の図）を示している。中央のパネルは、主に活性化ＦｃγＲに結合するマウスＩｇＧ２ａ形式の同じ抗体を示し、右のパネルは、主に抑制性ＦｃγＲＩＩｂに結合するマウスＩｇＧ１形式の抗体を示している。図１１Ｂの場合、生存マウスを７０日間追跡した。図に見られるように、非遮断アゴニスト抗体は、主に抑制性ＦｃγＲに結合するＩｇＧ１形式での腫瘍治療として最も効果的である。加えて、アゴニスト抗体は、Ｎ２９７Ａ形式を使用して見られるように、ＦｃγＲに依存しない抗腫瘍効果を有する。他方、遮断アンタゴニスト抗体は、主に活性化ＦｃγＲに結合するＩｇＧ２ａ形式での腫瘍治療として最も効果的であり、ＦｃγＲ結合が欠損した形式では効果がない。＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ログランクマンテル・コックス検定によって計算されたアイソタイプ対照と比較）。
【図12】Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１×１０６ＭＣ３８細胞を皮下注射した。３ｘ３ｍｍの平均腫瘍サイズで、図に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇ抗体で週２回、腹腔内処置した。この図は、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。図１２Ａ：アイソタイプ対照、図１２Ｂ：ＰＤ－１標的抗体、図１２Ｃ：５Ａ０５抗体（代理抗体、リガンド非遮断剤、アゴニスト）、図１２Ｄ：５Ａ０５とＰＤ１との組み合わせ。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。図１２Ｅは、４つの異なる処置群の生存曲線を示している。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ログランクマンテル・コックス検定によって計算されたアイソタイプ対照と比較）。
【図13】リガンド遮断アゴニスト抗体が抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせて抗腫瘍治療として有効であることを示している。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１ｘ１０６のＭＣ３８細胞を皮下注射した。５ｘ５ｍｍの平均腫瘍サイズで、マウスを、アイソタイプ対照抗体もしくは５Ａ０５で２回（１日目および４日目）処置するか、抗ＰＤ－Ｌ１で４日連続処置し、２日後に５回目の注射を行う（１、２、３、４、および７日目の合計５回の注射）か、または両方を組み合わせて行った。すべての抗体を、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。図１３は、平均腫瘍成長＋／－ＳＥＭ、ｎ＝１０／群を示している。＊＝＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（一元配置分散分析を使用して計算）。
【図14】Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１×１０６Ｂ１６細胞を皮下注射した。３日後、マウスに週２回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内処置した。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。図１４Ａ：アイソタイプ対照、図１４Ｂ：５Ａ０５抗体（代理抗体、リガンド非遮断剤、アゴニスト）。図１４Ｃは、２つの異なる処置群の生存曲線を示している。＊＝ｐ＜０．，０５（ログランクマンテル・コックス検定によって計算されたアイソタイプ対照と比較）。
【図15】リガンド非遮断アゴニスト代理抗体５Ａ０５は、腫瘍の免疫細胞組成を変化させる。記載されているようにマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、腫瘍が約７ｘ７ｍｍのサイズに達したら、示されたように抗体を注射した。３回の注射後、処置開始後８日目にマウスを犠牲にし、腫瘍を採取した。腫瘍単一細胞懸濁液をＦＡＣＳによって免疫細胞含有量について分析した。Ａ）リガンド非遮断アゴニスト代理抗体５Ａ０５はＴｒｅｇの枯渇を引き起こし、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の流入または増殖を引き起こす。これにより、Ｃ）に示すようにＴｒｅｇ／ＣＤ８＋Ｔ細胞比がシフトする。図Ｄ）は、Ｔ細胞だけでなく骨髄性細胞も示している。ここでは、腫瘍関連マクロファージの数（ＴＡＭ、ＣＤ１１ｂ＋と定義されているが、Ｌｙ６ＧとＬｙ６Ｃについてはいずれも陰性）が非常に大幅に低減する。リガンド遮断アンタゴニスト代理抗体３Ｆ１０もＴＡＭ数を調節するが、それでも５Ａ０５とは大きく異なる。
【図16】ＮＯＧマウスに、１５～２０ｘ１０６個のＰＢＭＣ細胞を静脈内注射した。１０～１２日後、脾臓をマウスから取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、ＴＮＦＲ２発現をＦＡＣＳで評価した。かつて、ＴＮＦＲ２の発現は、それぞれ３または９体の癌患者の血液および腫瘍サンプルから回収されたＴ細胞で評価されていた。図に示すように、ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＮＦＲ２発現は、ＮＯＧマウスにおけるインビボで成長および活性化されたヒトＴ細胞と、ヒト腫瘍由来のＴ細胞との間で非常に類似している。
【図17】ＮＯＧマウスに、１５～２０×１０６個のＰＢＭＣ細胞を静脈内注射した。１０～１２日後、脾臓をマウスから取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、ＦＡＣＳを使用して細胞を分析した。図１７Ａは、脾臓の細胞総数のうち、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／陰性として定義された染色Ｔｒｅｇの平均パーセンテージを示している。図１７Ｂは、脾臓の細胞総数のうちのＴ細胞（ＣＤ３＋）の平均パーセンテージを示している。図１７に示すように、リガンド非遮断アゴニスト抗体１Ｆ０２は、このモデルにおけるＴ細胞の総数だけでなく（最高レベルのＴＮＦＲ２を発現する）Ｔｒｅｇの数を増加させる。比較として、リガンド遮断剤アンタゴニスト抗体１Ｈ１０にはこの効果がない。
【図18】さまざまなＴＮＦＲ２特異的抗体によって誘導されるＩＦＮ－γ放出を、３つの異なるインビトロシステムで測定した。陽性対照として、抗ＣＤ３抗体－ＯＫＴ３またはムロモナブ－ＣＤ３、抗ＣＤ５２抗体－アレムツズマブ、および抗ＣＤ２８抗体を使用した。アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。各ドットは、１体のヒトドナーからのＰＢＭＣを表す。図１８Ａは、高密度細胞培養物からの結果を示す。ＰＢＭＣを１×１０７細胞／ｍｌで培養した。４８時間後、１０μｇ／ｍｌの抗体を加え、２４時間インキュベートした。図に見られるように、アレムツズマブおよびＯＫＴ３の両方が有意なＩＦＮ－γ放出を誘導したが、ＴＮＦＲ２特異的抗体はいずれも誘導しなかった。図１８Ｂは、ＰＢＭＣを添加する前に９６ウェルプレートのウェルを抗体でコーティングすることによって行われた固相インビトロ培養を示している。この場合も、アレムツズマブおよびＯＫＴ３の両方が、特にドナーのうちの１体で、いくつかのＴＮＦＲ２特異的抗体と共に有意なＩＦＮ－γ放出を誘導した。図１８Ｃは、抗体による全血の刺激を示している。ここでは、アレムツズマブは有意なＩＦＮ－γ放出を誘導したが、ＴＮＦＲ２特異的抗体はいずれも誘導しなかった。
【図19】ＮＯＧマウスに、２５×１０６個のＰＢＭＣ細胞を静脈内注射した。１４日後、マウスの血液が約４０％のヒトＴ細胞からなることが示されたら、マウスを１０μｇの抗体で処置した。注射の１時間後に体温を測定した（図１９Ａ）。注射の５時間後に実験を終了し、ＩＦＮ－γ（図１９Ｂ）またはＴＮＦ－α（図１９Ｃ）の含有量について血液を分析した。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１および＊＊＝ｐ＜０．０１（一元配置分散分析で計算）
【図20】個々のドメインを欠くＴＮＦＲ２変異体への結合を示している。ＨＥＫ細胞で発現したＴＮＦＲ２変異体への抗体結合を、フローサイトメトリーアプローチで試験した。ドメイン１および２の欠如は結合に有意な影響を与えないが（図２０ＡおよびＢ）、３および部分的に４は、抗体とＴＮＦＲ２との間の相互作用を完全に無効にする（図２０ＣおよびＤ）。同様に、ドメイン１＋３の欠如は、すべての抗体（１Ｆ０６を除く）の結合を完全に防ぎ（図２０Ｅ）、ドメイン２＋４の欠如は、アゴニスト抗体（１Ｆ０２、１Ｆ０６、４Ｅ０８）への結合を完全に無効にし、アンタゴニスト（１Ｈ１０、４Ｈ０２、５Ｂ０８）への結合も大幅に低減する（図２０Ｆ）。濃い灰色は陽性対照を示し、白色は陰性対照抗体を示す。
【図21】ＴＮＦＲ２のヒト（Ｈ－Ｄ３）およびマウス（Ｍ－Ｄ３）のドメイン３のアミノ酸配列の比較を示している。類似のアミノ酸は白色で示され、差異は灰色で示されている。以下の５つの配列は、抗体が試験される５つの異なるコンストラクトを表している。ヒトからマウスへの配列の交換には下線が引かれているが、下線が引かれていない配列は完全にヒトである。ドメイン１、２および４はヒトであり、置換も突然変異も含有していない。
【図22】野生型ヒトおよびマウスＴＮＦＲ２への結合を左のパネルに示す。突然変異したｈＴＮＦＲ２コンストラクト（ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４）を使用して、さまざまな抗ｈＴＮＦＲ２抗体に対する結合部位を絞り込んだ。フローサイトメトリー分析により、ａａ１１９～１３２の突然変異は抗体結合に影響を与えないが、ａａ１５１～１６０の突然変異はすべての抗体の結合を完全に無効にすることが明らかになった。１３４～１４４の突然変異は、遮断アンタゴニスト抗体への結合のみを破壊し、アゴニスト抗体には大きな影響を与えない。濃い灰色のバーは、陽性対照の抗体を示し、白色は陰性対照の抗体を示す。破線は、陰性対照抗体のレベルである。
【実施例】
【0179】
ここで、本発明のいくつかの態様を具体的に示す、特定の非限定的な実施例を記載する。
【0180】
多くの例、特にインビボの例では、抗体５－Ａ０５が使用されている。これは、本明細書に開示されるヒト抗体の代理抗体であるマウス抗体である。それは、ＥＣ５０値が良好なリガンド非遮断アゴニスト抗体と同様の特性に基づいて、代理抗体として選択されている。
【0181】
いくつかの例および図では、抗体クローンのわずかに異なる名称が使用されている。例えば、クローン００１－Ｆ０２は１－Ｆ０２または１Ｆ０２に短縮される場合があり、００５－Ｂ０８は５－Ｂ０８または５Ｂ０８に短縮される場合がある。
【0182】
実施例１－ＴＮＦＲ２特異的抗体の生成
（図１およびこの図の上記説明も参照のこと。）
ｓｃＦｖ抗体フラグメントの単離
ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリ（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ Ｅ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８（８）：８５２－６）を使用して、ヒトＴＮＦＲ２を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントを単離した。
（図１およびこの図の上記説明も参照のこと。）
ｓｃＦｖ抗体フラグメントの単離
ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリ（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ Ｅ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８（８）：８５２－６）を使用して、ヒトＴＮＦＲ２を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントを単離した。
【0183】
ファージライブラリは、組換えヒトまたはマウスタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対する３回の連続パニングで使用された。ファージのインキュベーション後、細胞を洗浄して未結合のファージを除去した。結合ファージをトリプシンで溶出し、Ｅ．ｃｏｌｉで増幅した。得られたファージストックをｓｃＦｖ形式に変換した。Ｅ．ｃｏｌｉをｓｃＦｖ保有プラスミドで形質転換し、個々のｓｃＦｖクローンを発現させた。
【0184】
特有のＴＮＦＲ２結合ｓｃＦｖの同定
３回目のパニングからの変換されたｓｃＦｖを、ホモジニアスＦＭＡＴ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ヒトもしくはマウスＴＮＦＲ２または非関連タンパク質を発現するトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞への結合についてアッセイした。
３回目のパニングからの変換されたｓｃＦｖを、ホモジニアスＦＭＡＴ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ヒトもしくはマウスＴＮＦＲ２または非関連タンパク質を発現するトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞への結合についてアッセイした。
【0185】
簡単に説明すると、トランスフェクトされた細胞を、発現プレートからのｓｃＦｖ含有上清（１：７に希釈）、マウス抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体（０．４μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＡＰＣ結合ヤギ抗マウス抗体（０．２μｇ／ｍｌ、カタログ番号１１５－１３６－１４６、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に透明底プレートに添加した。ＦＭＡＴプレートを室温で９時間インキュベートした後、読み取った。ＴＮＦＲ２でトランスフェクトされた細胞に結合するが、非関連タンパク質でトランスフェクトされた細胞には結合しない細菌クローンは、活性物質として分類し、９６ウェルプレートにチェリーピックした。
【0186】
ＥＬＩＳＡにおけるＴＮＦＲ２へのＩｇＧの結合
９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、１ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトまたはマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で一晩４℃でコーティングした。洗浄後、２０μｇ／ｍｌ～０．１ｎｇ／ｍｌ（１３３ｎＭ～１ｐＭ）の漸増させた用量（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ）の抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂを１時間結合させた。次にプレートを再度洗浄し、結合した抗体を５０ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＦ（ａｂ）－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、１ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトまたはマウスＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で一晩４℃でコーティングした。洗浄後、２０μｇ／ｍｌ～０．１ｎｇ／ｍｌ（１３３ｎＭ～１ｐＭ）の漸増させた用量（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ）の抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂを１時間結合させた。次にプレートを再度洗浄し、結合した抗体を５０ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＦ（ａｂ）－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
【0187】
表５および図１Ａ～Ｄに示されているデータは、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体がすべてヒトＴＮＦＲ２タンパク質に結合することを示している。ＥＣ５０値は、１－Ｃ０８の０．０８２ｎＭから１－Ａ０９の４．４ｎＭまでの範囲である。
【0188】
【0189】
実施例２－抗体の特異性
（図２～５およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
ヒトバフィーコートおよびカニクイザル（Ｍ． ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）全血由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントを使用して単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ヒト）またはＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、非ヒト霊長類（カニクイザル）（いずれもＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用した磁気セルソーティングによってＰＢＭＣから単離した。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（マウス）を用いて脾臓から単離した。
（図２～５およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
ヒトバフィーコートおよびカニクイザル（Ｍ． ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）全血由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントを使用して単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ヒト）またはＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、非ヒト霊長類（カニクイザル）（いずれもＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用した磁気セルソーティングによってＰＢＭＣから単離した。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（マウス）を用いて脾臓から単離した。
【0190】
ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の滴定
細胞上に発現したＴＮＦＲ２に結合するＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の能力および親和性は、インビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して得られた。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７度で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００２～２６７ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－ヒトＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。得られた滴定曲線を図３Ａ～Ｄに示す。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７度で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００００３～１３３ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－マウスＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。滴定曲線を図３Ｅに示す。滴定曲線のＥＣ５０値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで計算され、表６に示されている。ヒト抗体の場合、ＥＣ５０値は０．６ｎ Ｍ（４－Ｈ０２）から５２．７ｎＭ（１－Ｃ０３）まで異なっていた。マウス抗体は、同様の親和性（０．０７２ｎＭ（３－Ｆ１０）および０．１１ｎＭ（５－Ａ０５））でインビトロで活性化された細胞に結合した。
細胞上に発現したＴＮＦＲ２に結合するＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の能力および親和性は、インビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して得られた。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７度で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００２～２６７ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－ヒトＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。得られた滴定曲線を図３Ａ～Ｄに示す。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を３７度で２～３日行った。インビトロで活性化された細胞を、０．００００３～１３３ｎＭの範囲のＴＮＦＲ２またはアイソタイプ対照に特異的なｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の量を増やして標識した。次に、細胞をＡＰＣ結合ａ－マウスＩｇＧ二次ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した。滴定曲線を図３Ｅに示す。滴定曲線のＥＣ５０値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで計算され、表６に示されている。ヒト抗体の場合、ＥＣ５０値は０．６ｎ Ｍ（４－Ｈ０２）から５２．７ｎＭ（１－Ｃ０３）まで異なっていた。マウス抗体は、同様の親和性（０．０７２ｎＭ（３－Ｆ１０）および０．１１ｎＭ（５－Ａ０５））でインビトロで活性化された細胞に結合した。
【0191】
ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の特異性
ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦＲ２抗体の特異性は、市販のポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄシステム）を用いたＦＡＣＳ遮断実験で得られた。ＣＤ４＋Ｔ細胞（マウスおよびヒト）を、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（ヒト）／１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（マウス）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８で２～３日間刺激して、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を行い、４０μｇ／ｍｌポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で３０分間遮断し、直後にＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照と１５分間インキュベートした。使用したｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の濃度は、個々のＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の滴定曲線に基づいており、各抗体の最適以下の濃度を選択した。次に、細胞を洗浄し、ＡＰＣ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と３０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）。図４に示すように、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体（ヒトとマウスの両方）のすべての結合は、ポリクローナルＴＮＦＲ２抗体によって遮断され得た。これらの結果は、ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合することを確認している。
ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦＲ２抗体の特異性は、市販のポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄシステム）を用いたＦＡＣＳ遮断実験で得られた。ＣＤ４＋Ｔ細胞（マウスおよびヒト）を、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（ヒト）／１３５Ｕ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（マウス）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８で２～３日間刺激して、Ｔ細胞の増殖と活性化（Ｇｉｂｃｏ）を行い、４０μｇ／ｍｌポリクローナルＴＮＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で３０分間遮断し、直後にＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体またはアイソタイプ対照と１５分間インキュベートした。使用したｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の濃度は、個々のＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の滴定曲線に基づいており、各抗体の最適以下の濃度を選択した。次に、細胞を洗浄し、ＡＰＣ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と３０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）。図４に示すように、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体（ヒトとマウスの両方）のすべての結合は、ポリクローナルＴＮＦＲ２抗体によって遮断され得た。これらの結果は、ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴＮＦＲ２に特異的に結合することを確認している。
【0192】
ＴＮＦＲ２抗体クローンＭＲ２－１に対するＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のエピトープマッピング
ＴＮＦＲ２抗体クローンＭＲ２－１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＴＮＦＲ２タンパク質の特定のドメインに結合する。ＭＲ２－１と同じドメインに結合したＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がＦＡＣＳ遮断実験によって試験された場合。
ＴＮＦＲ２抗体クローンＭＲ２－１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＴＮＦＲ２タンパク質の特定のドメインに結合する。ＭＲ２－１と同じドメインに結合したＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体がＦＡＣＳ遮断実験によって試験された場合。
【0193】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）で２～３日間刺激し、Ｔ細胞の増殖と活性化を行った。活性化された細胞を、４０μｇ／ｍｌのＭＲ２－１（図５Ａの黒いバー）、ＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ポリクローナルＴＮＦＲ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（図６Ｂの黒いバー）またはＰＢＳ（図５の灰色のバー）で遮断した。３０分間のインキュベーション後、細胞をＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体／ｐＴＮＦＲ２（図５Ａ）またはＭＲ２－１（図５Ｂ）で１５分間直ちに染色した。また、図５Ａの細胞は、ＡＰＣ結合二次ａ－ヒトＩｇＧ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）。ＭＲ２－１＋細胞のパーセンテージは、遮断されていない細胞と遮断されたｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）で同じであり（図５Ｂ）、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体の結合はＭＲ２－１遮断の有無にかかわらず同じであった（図５Ａ）。これらのｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体は、おそらくＭＲ２－１抗体以外のＴＮＦＲ２タンパク質の他のエピトープに結合する。
【0194】
ＴＮＦＲ２ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のカニクイザルへの結合
カニクイザルに対するＴＮＦＲ２抗体の交差反応性を検証するために、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および１００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で２日間刺激した。細胞を３つの異なる濃度（０．１、１、および１０μｇ／ｍｌ）のＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体とインキュベートし、次にＡＰＣ結合二次ａ－ヒトＩｇＧ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した結果、ヒトＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のほとんどがカニクイザルＴＮＦＲ２に結合できることが示された。個々の抗体の結果を図４に示す。
カニクイザルに対するＴＮＦＲ２抗体の交差反応性を検証するために、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および１００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で２日間刺激した。細胞を３つの異なる濃度（０．１、１、および１０μｇ／ｍｌ）のＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体とインキュベートし、次にＡＰＣ結合二次ａ－ヒトＩｇＧ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ）で分析した結果、ヒトＴＮＦＲ２特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体のほとんどがカニクイザルＴＮＦＲ２に結合できることが示された。個々の抗体の結果を図４に示す。
【0195】
要約すると、実施例２のデータは、ヒト抗体が、ヒト免疫細胞上で内因的に発現されるＴＮＦＲ２に特異的に結合することを示している。さらに、データは、ＴＮＦＲ２に対するポリクローナル市販抗体を添加することによってこの結合を遮断できることを示している。これは、ＴＮＦＲ２に対する非常に高い特異性を示している。同じことが、マウスＴＮＦＲ２を発現するマウス細胞に関する代理クローン３Ｆ１０および５Ａ０５にも当てはまる。また、ヒトクローンの結合は、ＭＲ２－１と比較して異なるエピトープ特異性を示すＭＲ２－１抗体の影響を受けない。Ｔ
【表6】
【0196】
実施例３－リガンド遮断特性の試験
（図６～７およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＥＬＩＳＡ法
９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡコーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中２．５ｐｍｏｌ／ウェルのｈＴＮＦＲＩＩ（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号１０４１４－Ｈ０８Ｈ）またはｍＴＮＦＲＩＩ（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０１２８ Ｍ０８Ｈ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した後、プレートをゆっくりと撹拌しながら室温で１時間、１０μｇ／ｍｌ（１回投与ＥＬＩＳＡ）または３３ｎＭのｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂとインキュベートし、その後、０．４５％フィッシュゼラチンを含有する遮断バッファーで１：２希釈（滴定ＥＬＩＳＡ）した。続いて、組換えｈＴＮＦ－α－ｂｉｏ（Ｒ＆Ｄカタログ番号ＢＴ２１０）またはｍＴＮＦ－α（Ｇｉｂｃｏカタログ番号ＰＭＣ３０１４）をそれぞれ５ｎＭおよび２ｎＭの最終濃度で添加し、さらに１５分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄した。ヒトＥＬＩＳＡの場合、遮断バッファーで１：２０００に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号０１６－０３０－０８４）を添加し、室温で１時間再度インキュベートした後、最初にＥＬＩＳＡバッファーで、次にＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９．８）で洗浄した。次いで、基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（カタログ番号３７０６９））を製造元の指示に従って希釈し、ウェルに加え、暗所で１０分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａで読み取った。マウスＥＬＩＳＡの場合、ウサギ抗ｍＴＮＦ－α（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０３４９－ＲＰ０２）を１μｇ／ｍｌに希釈したものを加え、室温で１時間インキュベートさせた。洗浄後、遮断バッファーで１：１００００に希釈した抗ウサギ－ＨＲＰを添加し、再び室温で１時間インキュベートした。基質の添加および読み取りを上記のように行った。
（図６～７およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＥＬＩＳＡ法
９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡコーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中２．５ｐｍｏｌ／ウェルのｈＴＮＦＲＩＩ（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号１０４１４－Ｈ０８Ｈ）またはｍＴＮＦＲＩＩ（Ｓｉｎｏｂｉｏｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０１２８ Ｍ０８Ｈ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した後、プレートをゆっくりと撹拌しながら室温で１時間、１０μｇ／ｍｌ（１回投与ＥＬＩＳＡ）または３３ｎＭのｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｍＡｂとインキュベートし、その後、０．４５％フィッシュゼラチンを含有する遮断バッファーで１：２希釈（滴定ＥＬＩＳＡ）した。続いて、組換えｈＴＮＦ－α－ｂｉｏ（Ｒ＆Ｄカタログ番号ＢＴ２１０）またはｍＴＮＦ－α（Ｇｉｂｃｏカタログ番号ＰＭＣ３０１４）をそれぞれ５ｎＭおよび２ｎＭの最終濃度で添加し、さらに１５分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄した。ヒトＥＬＩＳＡの場合、遮断バッファーで１：２０００に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号０１６－０３０－０８４）を添加し、室温で１時間再度インキュベートした後、最初にＥＬＩＳＡバッファーで、次にＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９．８）で洗浄した。次いで、基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（カタログ番号３７０６９））を製造元の指示に従って希釈し、ウェルに加え、暗所で１０分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａで読み取った。マウスＥＬＩＳＡの場合、ウサギ抗ｍＴＮＦ－α（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号５０３４９－ＲＰ０２）を１μｇ／ｍｌに希釈したものを加え、室温で１時間インキュベートさせた。洗浄後、遮断バッファーで１：１００００に希釈した抗ウサギ－ＨＲＰを添加し、再び室温で１時間インキュベートした。基質の添加および読み取りを上記のように行った。
【0197】
【0198】
遮断の定義
●完全遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を９８％超低減するものと定義されている
●部分遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０～９８％低減するものと定義されている
●弱い遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０％未満低減するものと定義されている
●非遮断抗体は、図６Ａおよび７Ａに示すように、高用量のワンポイントＥＬＩＳＡで５０％遮断を超えないものとして定義されている
●完全遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を９８％超低減するものと定義されている
●部分遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０～９８％低減するものと定義されている
●弱い遮断剤は、ＴＮＦ－α結合を６０％未満低減するものと定義されている
●非遮断抗体は、図６Ａおよび７Ａに示すように、高用量のワンポイントＥＬＩＳＡで５０％遮断を超えないものとして定義されている
【0199】
この例に示されているデータは、リガンドＴＮＦ－αの結合を完全に抑制する抗体から、リガンドの遮断をまったく抑制しない抗体まで、さまざまな抗体が生成されていることを示している。これは、ヒト抗体とマウス代理抗体の両方に当てはまる。
【0200】
実施例４－抗体のインビトロ機能性
（図８～１０およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＴＮＦ－α非遮断ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ－α遮断ＴＮＦＲ２抗体とは対照的に、サイトカイン刺激ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生を増強する。
ＴＮＦＲ２特異的抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性は、Ａｌｍｉｓｈｒｉらによって記載されたＮＫ細胞アッセイを使用して評価された（ＴＮＦα Ａｕｇｍｅｎｔｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ ＩＦＮγ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＮＦＲ２．Ａｌｍｉｓｈｒｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．２０１６；８：６１７－６２９）。
（図８～１０およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
ＴＮＦ－α非遮断ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ－α遮断ＴＮＦＲ２抗体とは対照的に、サイトカイン刺激ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生を増強する。
ＴＮＦＲ２特異的抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性は、Ａｌｍｉｓｈｒｉらによって記載されたＮＫ細胞アッセイを使用して評価された（ＴＮＦα Ａｕｇｍｅｎｔｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ ＩＦＮγ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＮＦＲ２．Ａｌｍｉｓｈｒｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．２０１６；８：６１７－６２９）。
【0201】
手短に言えば、ヒトＮＫ細胞を、「ＮＫ単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したＭＡＣＳによってヒトＰＢＭＣから単離した。Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェルＴＣ処理マイクロプレート、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）において、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的抗体、１０μｇ／ｍｌアイソタイプ対照または１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒に、１００μｌのＮＫ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－１２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に培養した。２４時間後に上清を回収し、産生されたＩＦＮ－γの量をＭＳＤで評価した。対照として、ＴＮＦ－αを中和する抗ＴＮＦ－α抗体（カタログ番号ＡＦ－２１０－ＮＡ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれていた。図８Ｄに見られるように、１μｇ／ｍｌの用量は可溶性ＴＮＦ－αを完全に中和し、この用量はまたＩＦＮ－γ放出を低下させた。
【0202】
ヒトの非遮断ＴＮＦＲ２抗体は、ＩＬ－２およびＩＬ－１２で刺激されたＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生を明確に増強したが（アイソタイプ対照の２～３倍のＩＦＮ－γ）、一方、アンタゴニスト抗体（ここでは完全遮断剤で示されている）は、ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生に対するアンタゴニスト効果を示した（図８Ａ）。
【0203】
この試験は、マウス培養物で内因的に産生されたＴＮＦ－αがなく、マウスＮＫ細胞では抑制性ＦｃγＲが発現し、ヒト対応物では活性化ＦｃγＲのみが発現するため、マウス代理抗体で実施するのは代表的ではないと考えられた。代わりに、メモリーＴ細胞活性化アッセイ（ＣＤ２５の誘導）、および骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）抑制アッセイ（いずれも以下に説明）を使用して、マウス代理抗体のアゴニストまたはアンタゴニスト特性に対処した。
【0204】
リガンド非遮断ＴＮＦＲ２抗体は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞でＣＤ２５発現を誘導するが、リガンド遮断ＴＮＦＲ２抗体は誘導しない。
ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性をさらに理解するために、ＣＤ２５発現メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を増強するそれらの能力を評価した。
ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト／アンタゴニスト特性をさらに理解するために、ＣＤ２５発現メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を増強するそれらの能力を評価した。
【0205】
簡単に説明すると、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製の「ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット」を使用して、ＭＡＣＳによってＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的抗体または指定量のｒｈＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に培養した。３日後、メモリー細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）でのＣＤ２５の発現をＦＡＣＳで分析した（図９Ａ）。
【0206】
同様に、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を、「ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＭＡＣＳによって脾臓から単離し、１０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ２特異的抗体または指定量のｒｍＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に培養した。メモリー細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－細胞）上のＣＤ２５の発現を、３日後にＦＡＣＳによって分析した（図９Ｂ）。
【0207】
ＣＤ２５発現細胞のパーセンテージが、非遮断ＴＮＦＲ２で刺激されたメモリー細胞培養物において増強され、これもまた、ヒトとマウスの両方でのアゴニスト活性を示した。しかしながら、遮断抗体による刺激はこれらの培養物でＣＤ２５発現を増大させなかった。
【0208】
Ｔ細胞／ＭＤＳＣ共培養アッセイにおけるリガンド非遮断抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂは、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の抑制機能を無効にする（ｒｅｖｅｒｓｅ）が、リガンド遮断抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂは無効にしない
ＭＤＳＣの抑制機能に対するヒト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂの影響を、Ｔ細胞／ＭＤＳＣ共培養アッセイで評価した。簡単に説明すると、ＭＡＣＳで単離されたヒトＣＤ１４＋単球を、癌患者から単離された５０％腹水、および５０％Ｒ－１０で３日間培養することによってＭＤＳＣを生成した。次に、ＭＤＳＣを洗浄し、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂと共に３０分間プレインキュベートした。細胞を洗浄せずに、滴定数のＭＤＳＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下でＭＡＣＳで単離されたＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。７２時間後、活性化されたＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージをＦＡＣＳで評価した。ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０分泌を、製造元の指示に従ってＭＳＤにより測定した。
ＭＤＳＣの抑制機能に対するヒト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂの影響を、Ｔ細胞／ＭＤＳＣ共培養アッセイで評価した。簡単に説明すると、ＭＡＣＳで単離されたヒトＣＤ１４＋単球を、癌患者から単離された５０％腹水、および５０％Ｒ－１０で３日間培養することによってＭＤＳＣを生成した。次に、ＭＤＳＣを洗浄し、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂと共に３０分間プレインキュベートした。細胞を洗浄せずに、滴定数のＭＤＳＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下でＭＡＣＳで単離されたＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。７２時間後、活性化されたＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージをＦＡＣＳで評価した。ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０分泌を、製造元の指示に従ってＭＳＤにより測定した。
【0209】
遮断抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ（濃い灰色のバー）とは対照的に、非遮断抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ（薄い灰色のバー）は、共培養において活性化されたＣＤ２５＋のパーセンテージを増加させることが示された（図１０Ａ）。上清中の分泌されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）とインターロイキン－１０の量を測定することにより、２つのサイトカインの比率を使用してＴｈ１／Ｔｈ２バランスを推定した。図１０Ｂに示すように、ＩＦＮ－γとＩＬ－１０との比率は、遮断アンタゴニスト抗体と比較して、非遮断抗ＴＮＦＲ２抗体によって有意に上昇しており、非遮断抗体がＴｈ１経路へのシフトを誘導することを示す。
【0210】
ヒト抗体に関しては、マウス抗ＴＮＦＲ２抗体の効果が同様の抑制アッセイで試験されている。ここでは、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞をＣＴ２６マウス腫瘍から直接ＭＡＣＳ単離し、抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂと３０分間プレインキュベートした。ＣＤ３＋レスポンダーＴ細胞を、ナイーブＢａｌｂ／Ｃ脾臓から精製した。骨髄抑制細胞とＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を異なる比率で３日間共培養した。増殖しているＣＦＳＥ低Ｔ細胞の割合（％）をＦＡＣＳによって決定した。ヒトアッセイの結果と同様に、増殖するレスポンダー細胞の割合は、非遮断抗体よりも遮断抗体とのインキュベーション後に有意に低くなる（図１０Ｃ）。
【0211】
ＭＤＣＳ抑制培養において、骨髄性細胞は高レベルのさまざまなＦｃγＲを発現する。観察されたアゴニストおよびアンタゴニスト効果がＦｃ依存性であるか否かを試験するために、リガンド非遮断アゴニスト抗体１Ｆ０２をいくつかの形式で試験した。ｈＩｇＧ１は活性化ＦｃγＲに良好に結合し、ｈＩｇＧ２は抑制性ＦｃγＲＩＩＢにも良好に結合し、Ｆｃ欠損形式ではすべてのＦｃγＲへの結合が著しく減少した。図１０Ｄの結果は、非遮断１－Ｆ０２抗体のアゴニスト活性が、抗体アイソタイプおよびＦｃγＲ結合とは無関係であることを示している。
【0212】
要約すると、実施例４のデータは、いくつかの方法によってインビトロで測定されるように、リガンド非遮断抗体がアゴニストであることを示している：ＮＫ細胞介在ＩＦＮ－γ放出、ＣＤ２５発現およびＴ細胞増殖によって測定されるＣＤ４＋メモリー細胞の活性化、およびＭＤＣＳ共培養アッセイでのＣＤ２５発現。さらに、データは、これがリガンドの存在に依存せず、抗体アイソタイプにも依存しない固有の特性であることを示している。また、代理マウス抗体５Ａ０５が同様のアゴニズムの特徴を有することも示している。Ｔ細胞またはＮＫ細胞刺激抗体は、癌の治療に使用でき、内因性免疫応答を誘導して、最終的に悪性細胞を破壊する可能性がある。
【0213】
アゴニストリガンド非遮断抗体が本発明に従って示され、アンタゴニストリガンド遮断抗体が比較のために含まれている。
【0214】
実施例５－代理リガンド非遮断、アゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂはインビボ抗腫瘍効果を有する
（図１１～１７およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
さまざまな腫瘍モデルにおける治療効果
リガンド非遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果を評価するために、５－Ａ０５と呼ばれるマウス代理を、異なるアイソタイプ形式を使用して、単独で、または以下に説明する抗ＰＤ－１と組み合わせて、異なる腫瘍モデルでインビボで調査した。
（図１１～１７およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
さまざまな腫瘍モデルにおける治療効果
リガンド非遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果を評価するために、５－Ａ０５と呼ばれるマウス代理を、異なるアイソタイプ形式を使用して、単独で、または以下に説明する抗ＰＤ－１と組み合わせて、異なる腫瘍モデルでインビボで調査した。
【0215】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。６～８週齢の雌のＢａｌｂＣおよびＣ５７／ＢＬ６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で維持した。ＣＴ２６、ＭＣ３８およびＢ１６細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳを添加したグルタマックス緩衝ＲＰＭＩで成長させた。細胞が半コンフルエントになったとき、それらをトリプシンで剥離させ、１０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。マウスに１×１０６細胞／マウスに相当する１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射した。モデルに応じて注射の３～８日後、マウスを、図に示されているように週２回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内処置した（アイソタイプ対照、３－Ｆ１０または５－Ａ０５）。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。
【0216】
リガンド非遮断アゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ５－Ａ０５は、３つの異なる腫瘍モデルで治療的抗腫瘍効果を示し（図１１～１４）、より治療感受性の高いＣＴ２６では治療効果を示し（図１１）、かつ、より治療抵抗性の高いＭＣ３８およびＢ１６では腫瘍成長抑制効果を示す（図１２～１４）。
【0217】
リガンド非遮断アゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂの抗腫瘍効果は、ＦｃγＲ結合を必要としないが、そのような結合によって強化される
リガンド非遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２マウス代理ｍＡｂ５Ａ０５のインビボ抗腫瘍効果に対するＦｃ－ＦｃγＲ相互作用の重要性を評価するために、この抗体のさまざまなＦｃ形式を、以下に記載するようにＣＴ２６腫瘍モデルにおいてインビボで調査した。
リガンド非遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２マウス代理ｍＡｂ５Ａ０５のインビボ抗腫瘍効果に対するＦｃ－ＦｃγＲ相互作用の重要性を評価するために、この抗体のさまざまなＦｃ形式を、以下に記載するようにＣＴ２６腫瘍モデルにおいてインビボで調査した。
【0218】
マウスは、上記のように飼育され維持された。ＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）を上記のように成長させ、注射した。腫瘍が３ｘ３ｍｍに達したら、マウスを週２回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内処置した（アイソタイプ対照、５Ａ０５ ＩｇＧ１、５Ａ０５ ＩｇＧ２ａまたは５－Ａ０５－Ｎ２９７Ａ（Ｆｃ欠損）。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。
【0219】
Ｆｃ欠損５－Ａ０５－Ｎ２９７Ａは、アイソタイプ対照と比較して明確な治療活性を示し、Ｆｃ結合が、このリガンド非遮断アゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂの治療効果に完全に必須ではないことを示している（図１１ＡおよびＢ）。加えて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方の形式が、増強された治療効果を示す。しかしながら、Ｆｃγ受容体の抑制に優先的に結合するＩｇＧ１形式は、この抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂの重要な作用機序の１つであるアゴニズムを示す優れた治療効果を示す（図１１Ａ～Ｂ）。これは、Ｆｃ欠損形式では活性を示さず、活性化ＦｃγＲに優先的に結合することが知られているマウスＩｇＧ２ａ形式で最高の活性を示すリガンド遮断アンタゴニスト代理抗体３－Ｆ１０とは対照的である。
【0220】
リガンド非遮断アゴニスト抗体（５－Ａ０５）は本発明によるものであり、リガンド遮断アンタゴニスト抗体（３－Ｆ１０）は参考のために含まれている。
【0221】
抗ＰＤ－１ｍＡｂとの併用効果
リガンド非遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ、抗ＰＤ－１を用いたマウス代理（５－Ａ０５）のインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するようにＭＣ３８腫瘍モデルにおいて治療の組み合わせをインビボで調査した。
リガンド非遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ、抗ＰＤ－１を用いたマウス代理（５－Ａ０５）のインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するようにＭＣ３８腫瘍モデルにおいて治療の組み合わせをインビボで調査した。
【0222】
マウスは、上記のように飼育され維持された。ＭＣ３８細胞（ＡＴＣＣ）を上記のように成長させ、注射した。注射の８日後、マウスを、図１２Ａ～Ｅに示されているように週２回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内処置した（アイソタイプ対照、抗マウスＰＤ－１、５－Ａ０５、または抗マウスＰＤ－１と５－Ａ０５との組み合わせ）。腫瘍は、直径が１５ｍｍに達するまで、週に２回測定し、その後、マウスを断命した。
【0223】
抗マウスＰＤ－１およびリガンド非遮断アゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ５－Ａ０５はいずれも、ＭＣ３８モデルで実際に腫瘍成長抑制治療効果を示す（図１２Ａ～Ｅ）。抗ＰＤ１と５－Ａ０５とを組み合わせると、治療抵抗性のＭＣ３８で腫瘍が治癒する（図１２Ｄ～Ｅ）。
【0224】
抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂとの併用効果
アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するように、ＭＣ３８腫瘍モデルでの治療のためにマウス代理（５Ａ０５）を抗ＰＤ－Ｌ１とさらに組み合わせた。
アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果の組み合わせを評価するために、以下に記載するように、ＭＣ３８腫瘍モデルでの治療のためにマウス代理（５Ａ０５）を抗ＰＤ－Ｌ１とさらに組み合わせた。
【0225】
マウスは、上記のように飼育され維持された。ＭＣ３８細胞（サウサンプトン大学のＭ．Ｃｒａｇｇ博士から入手）を上記のように成長させ、注射した。注射の６日後、マウスを、アイソタイプ対照抗体もしくは３Ｆ１０で２回（１日目および４日目）処置するか、抗ＰＤ－Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）で４日連続処置し、２日後に５回目の注射を行う（１、２、３、４、および７日目の合計５回の注射）か、または両方を組み合わせて行った。すべての抗体を、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。腫瘍は、２０００ｍｍ３の体積に達するまで、週２回ノギスで測定し、その後マウスを断命した。
【0226】
抗マウスＰＤ－Ｌ１とアゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ５Ａ０５はいずれも、ＭＣ３８モデルで実際に腫瘍成長抑制治療効果を示す（図１３）。抗ＰＤ－Ｌ１とアンタゴニスト抗マウスＴＮＦＲ２ｍＡｂ５Ａ０５を組み合わせると、抗腫瘍効果がさらに高まる（図１３）。
【0227】
インビボでの免疫細胞調節
インビボでの腫瘍における免疫細胞での効果を調査するために、ＢａｌｂＣマウスに上記のようにＣＴ２６細胞を接種した。腫瘍が約７ｘ７ｍｍに達した後、図１５に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内投与して治療した。マウスを１、４、７日目に処置し、８日目に断命した。腫瘍を解剖し、機械的に小片に分割し、コラゲナーゼ１００μｇ／ｍｌのリベラーゼおよび１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅの混合物を使用して、３７℃で２ｘ５分間、ボルテックスを間にいれて消化した。７０μｍのフィルタを通して濾過した後、細胞懸濁液を、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄した（４００ｇで１０分間）。その後、細胞をＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ２５またはＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇを染色する抗体パネルで染色した。染色する前に、１００μｇ／ｍｌのＩＶＩＧ（精製された静脈内免疫グロブリン）を使用して非特異的結合について細胞を遮断した。ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅを使用して細胞を分析した。マウスＴｒｅｇをＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋として定量化し、ＴＡＭをＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ－Ｆ４／８０＋ＭＨＣＩＩ＋として定量化した。
インビボでの腫瘍における免疫細胞での効果を調査するために、ＢａｌｂＣマウスに上記のようにＣＴ２６細胞を接種した。腫瘍が約７ｘ７ｍｍに達した後、図１５に示すように、マウスを１０ｍｇ／ｋｇの抗体で腹腔内投与して治療した。マウスを１、４、７日目に処置し、８日目に断命した。腫瘍を解剖し、機械的に小片に分割し、コラゲナーゼ１００μｇ／ｍｌのリベラーゼおよび１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅの混合物を使用して、３７℃で２ｘ５分間、ボルテックスを間にいれて消化した。７０μｍのフィルタを通して濾過した後、細胞懸濁液を、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄した（４００ｇで１０分間）。その後、細胞をＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ２５またはＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇを染色する抗体パネルで染色した。染色する前に、１００μｇ／ｍｌのＩＶＩＧ（精製された静脈内免疫グロブリン）を使用して非特異的結合について細胞を遮断した。ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅを使用して細胞を分析した。マウスＴｒｅｇをＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋として定量化し、ＴＡＭをＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ－Ｆ４／８０＋ＭＨＣＩＩ＋として定量化した。
【0228】
図１５に見られるように、アゴニストＴＮＦＲ２抗体による処置は、腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞流入の増加をもたらす。Ｔｒｅｇ枯渇への弱い傾向も見られる。同時に、これにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇとの比率が大幅に改善される（図１５Ｃ）。加えて、アゴニスト抗体は、腫瘍関連マクロファージの数を低減することによって骨髄性コンパートメントを調節する。
【0229】
ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデル
非リガンド遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｆ０２のアゴニスト／Ｔ細胞増殖活性のインビトロ所見を確認するために、以下に記載するようにインビボでＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルにＴ細胞の増殖を誘導するこのｍＡｂの能力を分析した。
非リガンド遮断アゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｆ０２のアゴニスト／Ｔ細胞増殖活性のインビトロ所見を確認するために、以下に記載するようにインビボでＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルにＴ細胞の増殖を誘導するこのｍＡｂの能力を分析した。
【0230】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。８週齢の雌のＮＯＧマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で維持した。ＰＢＭＣ－ＮＯＧ（初代ヒト異種移植）モデルの場合、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを用いて単離し、洗浄した後、細胞を７５ｘ１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＯＧマウスに、１５ｘ１０６細胞／マウスに相当する２００μｌの細胞懸濁液を静脈内注射した。注射の２週間後、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照、Ｙｅｒｖｏｙ、抗ＣＤ２５、Ｃａｍｐａｔｈ、１－Ｆ０２または１－Ｈ１０（リガンド遮断アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ２ｍＡｂ）で２回（２日間隔で）処置した。最後の注射の２日後にマウスの脾臓を採取した。ヒトＴ細胞サブセットは、以下のマーカー：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用するＦＡＣＳによって同定および定量化された。別の実験では、未処理のヒトＰＢＭＣからの脾臓を犠牲にして、ＦＡＣＳによってヒトＴ細胞上のＴＮＦＲ２の発現を測定した（図１６）。このＦＡＣＳデータは、ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＮＦＲ２発現が、ＮＯＧマウスにおけるインビボで成長および活性化されたヒトＴ細胞と、ヒト腫瘍由来のＴ細胞との間で非常に類似していることを示した。
【0231】
１－Ｆ０２は、非リガンド遮断アゴニスト抗マウス代理ＴＮＦＲ２ｍＡｂを用いて、インビトロおよびインビボで見られたものに従って、Ｔ細胞の増殖を誘導したが、アンタゴニスト１－Ｈ１０は増殖を誘導しなかった（図１７）。
【0232】
要約すると、実施例５は次のことを示している。
１．アゴニストリガンド非遮断抗体は、いくつかの腫瘍モデルにわたって強力な抗腫瘍効果を発揮する可能性がある。
２．この効果は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせることで高めることができる。
３．アゴニスト非リガンド遮断抗体は、抗腫瘍効果に対して絶対的なＦｃγＲ依存性を示さないが、その効果は、主に抑制性のＦｃγＲの結合によって増強される。
４．アゴニスト非リガンド遮断抗体は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の流入を増加させ、腫瘍のＴｒｅｇ数を減少させる。加えて、それらは腫瘍のＴＡＭ数を減少させ、したがって、腫瘍のＴ細胞および骨髄性細胞の両方の組成を変化させる。
５．ヒト腫瘍では、Ｔ細胞はＴＮＦＲ２を発現する。
６．腫瘍ＴＮＦＲ２発現がＴ細胞で模倣されるヒト異種移植モデルでは、アゴニストリガンド非遮断抗体１－Ｆ０２はＴ細胞の数を増加させる。
１．アゴニストリガンド非遮断抗体は、いくつかの腫瘍モデルにわたって強力な抗腫瘍効果を発揮する可能性がある。
２．この効果は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせることで高めることができる。
３．アゴニスト非リガンド遮断抗体は、抗腫瘍効果に対して絶対的なＦｃγＲ依存性を示さないが、その効果は、主に抑制性のＦｃγＲの結合によって増強される。
４．アゴニスト非リガンド遮断抗体は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の流入を増加させ、腫瘍のＴｒｅｇ数を減少させる。加えて、それらは腫瘍のＴＡＭ数を減少させ、したがって、腫瘍のＴ細胞および骨髄性細胞の両方の組成を変化させる。
５．ヒト腫瘍では、Ｔ細胞はＴＮＦＲ２を発現する。
６．腫瘍ＴＮＦＲ２発現がＴ細胞で模倣されるヒト異種移植モデルでは、アゴニストリガンド非遮断抗体１－Ｆ０２はＴ細胞の数を増加させる。
【0233】
実施例６－アゴニストリガンド非遮断抗体は大量の炎症誘発性サイトカインを誘導しない（図１８～１９およびこれらの図の上記説明も参照のこと。）
大量の炎症誘発性サイトカインの放出は、患者の治療に使用される免疫調節抗体の考えられる副作用の１つである。したがって、ここでは、２つの異なる方法を使用して、アゴニストリガンド非遮断抗体によって誘導されるサイトカイン放出を測定した。１つ目は、インビトロ培養での抗体刺激に基づいており、２つ目は、免疫不全マウスへのヒト免疫細胞の異種移植に基づいている。インビトロでは、培養設定がサイトカインの放出に大きな影響を与えることが示されている（Ｖｅｓｓｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｓｅｐ；４２４：４３－５２）。方法論の違いを説明するために、最近の出版物に従って、３つの異なるインビトロ培養設定が使用された。
大量の炎症誘発性サイトカインの放出は、患者の治療に使用される免疫調節抗体の考えられる副作用の１つである。したがって、ここでは、２つの異なる方法を使用して、アゴニストリガンド非遮断抗体によって誘導されるサイトカイン放出を測定した。１つ目は、インビトロ培養での抗体刺激に基づいており、２つ目は、免疫不全マウスへのヒト免疫細胞の異種移植に基づいている。インビトロでは、培養設定がサイトカインの放出に大きな影響を与えることが示されている（Ｖｅｓｓｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｓｅｐ；４２４：４３－５２）。方法論の違いを説明するために、最近の出版物に従って、３つの異なるインビトロ培養設定が使用された。
【0234】
高密度細胞培養（ＨＤＣ）サイトカイン放出アッセイ（ＣＲＡ）のために、ＰＢＭＣを２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシンを補充した無血清ＣＴＬ－試験培地（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に１×１０７細胞／ｍｌで培養した。２ｍｌの細胞培養物を１２ウェルプレートにプレーティングした。４８時間後、１０μｇ／ｍｌの抗体を９６ウェル平底プレート内の１ｘ１０５個のプレインキュベートしたＰＢＭＣに添加し、２４時間インキュベートした。
【0235】
ＰＢＭＣ固相（ＳＰ）ＣＲＡは、９６ウェルプレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗体で１時間コーティングすることにより実施した。プレートをＰＢＳで洗浄した後、２００μｌの完全培地中の１ｘ１０５個のＰＢＭＣをウェルごとに添加し、４８時間インキュベートした。
【0236】
サイトカイン放出は、２００μｌの全血を５μｇ／ｍｌの抗体で４８時間刺激した後にも測定された。
【0237】
インキュベーション期間の終わりに、プレートを遠心分離し、培養上清を採取して－２０℃で保存した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－８およびＴＮＦ－αの濃度は、カスタムメイドのＭＳＤプレートを使用して、製造元の指示（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＵＳＡ）に従って測定した。
【0238】
要約すると、リガンド非遮断アゴニスト抗体は、インビトロ設定のいずれかでＩＦＮ－γを超える有意なサイトカイン放出のみを誘導した（データは示さず）。陽性対照抗体であるアレムツズマブとＯＫＴ３はサイトカインを誘導し、最も顕著なのはＩＦＮ－γであった。図１８に見られるように、非遮断アゴニスト抗体は、３つのインビトロ設定のうちの２つでＩＦＮ－γを誘導しなかった。さらに、抗体１－Ｆ０２はどのインビトロ設定でもＩＦＮ－γを誘導しなかった。
【0239】
ＰＢＭＣ－ＮＯＧ忍容性モデル
リガンド非遮断アゴニスト抗ヒトＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｆ０２の忍容性を調査するために、以下に説明するように、ＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルでのインビボサイトカイン放出を分析した。
リガンド非遮断アゴニスト抗ヒトＴＮＦＲ２ｍＡｂ１－Ｆ０２の忍容性を調査するために、以下に説明するように、ＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルでのインビボサイトカイン放出を分析した。
【0240】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。８週齢の雌のＮＯＧマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で維持した。ＰＢＭＣ－ＮＯＧ（初代ヒト異種移植）モデルの場合、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを用いて単離し、洗浄した後、細胞を１２５ｘ１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＯＧマウスに、２５ｘ１０６細胞／マウスに相当する２００μｌの細胞懸濁液を静脈内注射した。注射の２週間後、血液サンプルを採取して、ＮＯＧマウスの血液中のヒト細胞の量を意味する「ヒト化」のレベルを分析した。血液が約４０％のヒトＴ細胞で構成されている場合、マウスはヒト化されているとみなした。次に、マウスを１０μｇのＹｅｒｖｏｙ、抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）、１－Ｆ０２またはアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかで処置した。抗体注射前と注射後１時間で体温を測定した（図１９Ａ）。図１９Ａに見られるように、陽性対照抗体ＯＫＴ３は、以前に発表されたように、そしてこの抗体を用いた臨床実習（ｃｌｉｎｉｃ）で見られた毒性に従って、体温の劇的な低下を誘導した。対照的に、１－Ｆ０２は体温に全く影響を与えなかった。抗体の注射の５時間後に実験を終了し、サイトカイン放出（ＭＳＤ）の分析のために血液を採取した。測定されたサイトカインは、ヒトＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ１βであった。これらのうち、ＩＦＮ－γとＴＮＦ－αは信頼できるほど高いレベルで定量化された。図１９ＢおよびＣに見られるように、陽性対照抗体ＯＫＴ３は有意なＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α放出の両方を誘導したが（この抗体を用いた臨床実習で見られた毒性に従って）、１－Ｆ０２処置マウスには有意なＩＦＮ－γ放出がなかった。しかしながら、ＯＫＴ３ほど有意ではなく劇的ではないが、ＴＮＦ－α放出が増大する傾向があった。
【0241】
要約すると、実施例６は、ここでは１－Ｆ０２と呼ばれる抗体で例示されるＴＮＦＲ２リガンド非遮断アゴニスト抗体が、以前に発表されたいくつかの方法によって測定されるように、実質的なレベルのサイトカイン放出を誘導しないことを示す。サイトカイン放出はいくつかの免疫調節抗体の制限要因であるため、これは、この点で許容できる安全性プロファイルを示している。
【0242】
実施例７－生成されたＴＮＦＲ２標的化抗体のエピトープ
ドメインコンストラクトのノックアウト
最初の一連の実験では、表９に記載されている４つの細胞外ドメインのうちの１つ以上が欠落しているＴＮＦＲ２のさまざまな変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。実験の第２のセットでは、表１０に記載されているように、ドメイン３の異なる部分が対応するマウス部分と交換されたＴＮＦＲ２の変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。いずれの抗体もマウスＴＮＦＲと交差反応しないため、後者が可能である。いずれの場合も、コンストラクトはＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から購入した。コンストラクトは、ＣＭＶプロモーターおよびプラスミド複製のＯｒｉＰ由来を含有する発現ベクターにクローン化され、懸濁液に適合されたＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞で一過性に発現された。
ドメインコンストラクトのノックアウト
最初の一連の実験では、表９に記載されている４つの細胞外ドメインのうちの１つ以上が欠落しているＴＮＦＲ２のさまざまな変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。実験の第２のセットでは、表１０に記載されているように、ドメイン３の異なる部分が対応するマウス部分と交換されたＴＮＦＲ２の変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを使用した。いずれの抗体もマウスＴＮＦＲと交差反応しないため、後者が可能である。いずれの場合も、コンストラクトはＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から購入した。コンストラクトは、ＣＭＶプロモーターおよびプラスミド複製のＯｒｉＰ由来を含有する発現ベクターにクローン化され、懸濁液に適合されたＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞で一過性に発現された。
【表9】
【表10】
【0243】
フローサイトメトリーベースの結合分析
ＨＥＫ－２９３－Ｅ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を使用してＴＮＦＲ２変異体のそれぞれのｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、示された抗体で３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、表面に結合した抗体をＡＰＣに結合した二次抗ＩｇＧで染色した。ＢＤ－Ｖｅｒｓｅフローサイトメーターでフローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を洗浄し、生／死を染色した。
ＨＥＫ－２９３－Ｅ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を使用してＴＮＦＲ２変異体のそれぞれのｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、示された抗体で３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、表面に結合した抗体をＡＰＣに結合した二次抗ＩｇＧで染色した。ＢＤ－Ｖｅｒｓｅフローサイトメーターでフローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を洗浄し、生／死を染色した。
【0244】
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリーベースの結合実験は、ドメイン１とドメイン２がこれらの細胞に対する抗体の結合に影響を与えない（ドメイン１）か、わずかに影響を与える（ドメイン２）ことを明確に示した。陽性対照として、ポリクローナル抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を使用した。陽性対照抗体は、試験したすべてのコンストラクトに対して高い結合を示したが、陰性抗体は結合を示さなかった（図２０）。試験したすべての抗体は、ドメイン３を欠くＴＮＦＲ２への結合の完全な欠如を示した。同様に、ドメイン４が欠落している場合、ほとんどの抗体はＴＮＦＲ２に結合できなかった。すべてのアンタゴニスト抗体（１Ｈ１０、４Ｈ０２および５Ｂ０８）は、ＴＮＦＲ２Δ１およびＴＮＦＲ２Δ２への結合と比較して、５０％を超えるＴＮＦＲ２Δ４への結合の劇的な低減を示した。同様に、ＴＮＦＲ２からの２つのドメインの除去は、ドメイン３または４がないと、アゴニスト抗体１Ｆ０６を除いて、試験したすべての抗体のＴＮＦＲ２への結合が大幅に無効になり、ドメイン４がないと、アゴニスト抗体の結合が無効になり、アンタゴニスト抗体の結合が大幅に低減することを明確に示した。（図２０ＥおよびＦ）。
【0245】
マウス－ヒトキメラＴＮＦＲ２への結合
結合部位をさらに絞り込み、エピトープを定義するために、ヒトＴＮＦＲ２ドメイン３の一部を対応するマウス配列に置き換えた。すべての抗体はマウスＴＮＦＲ２に対してほとんど交差反応性を示さないため、特定のコンストラクトへの結合が失われると、結合エピトープを精製することができる。図２１は、さまざまなマウス－ヒトキメラＴＮＦＲ２コンストラクトを示している。ヒト配列からの１４（ｍ１）、１２（ｍ２）、１０（ｍ３）または１６（ｍ４）アミノ酸のいずれかを、対応するマウス配列と交換する４つの異なる置換が行われた。他の３つのドメイン（１、２、４）には、ヒトの配列のみが含有されている。
結合部位をさらに絞り込み、エピトープを定義するために、ヒトＴＮＦＲ２ドメイン３の一部を対応するマウス配列に置き換えた。すべての抗体はマウスＴＮＦＲ２に対してほとんど交差反応性を示さないため、特定のコンストラクトへの結合が失われると、結合エピトープを精製することができる。図２１は、さまざまなマウス－ヒトキメラＴＮＦＲ２コンストラクトを示している。ヒト配列からの１４（ｍ１）、１２（ｍ２）、１０（ｍ３）または１６（ｍ４）アミノ酸のいずれかを、対応するマウス配列と交換する４つの異なる置換が行われた。他の３つのドメイン（１、２、４）には、ヒトの配列のみが含有されている。
【0246】
次に、これらのコンストラクト（３に変異があるＴＮＦＲ２ドメイン１～４）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、フローサイトメトリーアプローチを使用して抗体の結合を試験した。陽性対照として、マウスＴＮＦＲ２およびヒトＴＮＦＲ２に対するポリクローナル抗体を使用した。予想通り、配列の類似性により、両方のポリクローナル対照抗体は有意な交差反応性を示し、ヒトとマウスの両方のＴＮＦＲ２を認識した。明らかに、抗体を目的の標的に一致させると、最良のシグナルが得られた。
【0247】
我々のモノクローナル抗体は、ヒトＴＮＦＲ２に強い結合を示したが、マウスＴＮＦＲ２には結合しないか、ほとんど結合しなかった（図２２の左パネル）。低減がほとんどない同様の結合が、ａａ１１９～１３２に変異があるｈＴＮＦＲ２ｍ１コンストラクトへのすべてのクローンで観察された。これは、どの抗体もその領域内のエピトープに結合しないことを示している。しかしながら、ａａ１３４～１４４（ｈＴＮＦＲ２ｍ２コンストラクト）の変異は、アンタゴニスト抗体１－Ｈ１０、４－Ｈ０２、５－Ｂ０８に対応する、試験した抗体の半分の結合を完全に無効にし、これは、抗体がこの領域内で少なくとも部分的に結合することを示している。１－Ｇ１０は部分的な遮断剤であり、この置換の影響も強く受ける。注目すべきことに、アゴニスト抗体（１－Ｆ０２、１－Ｆ０６および４－Ｅ０８）は、コンストラクト２を使用して結合を保持し、アンタゴニスト抗体と比較して異なるエピトープを強く示唆している。興味深いことに、すべての抗体は、ａａ１５１～１６０に突然変異があるｈＴＮＦＲ２ｍ３コンストラクトへの結合を喪失した。これは、アゴニストとアンタゴニストの両方のすべての抗体が、その配列内に部分的なエピトープを有していることを示している。ａａ１３０～１４４に突然変異があるわずかに大きいコンストラクトｈＴＮＦＲ２ｍ４を試験すると、コンストラクトｈＴＮＦＲ２ｍ２と同様の結合が示された。
【0248】
エピトープ結合についての結論
抗体をそれらの機能的役割にグループ化すると、アゴニスト抗体（１－Ｆ０２、１－Ｆ０６および４－Ｅ０８）は、ａａ１５１～１６０を包含するドメイン３の非常に遠位のＣ末端部分に結合し、おそらくはドメイン４のより大きな部分に広がるようであるのに対し、アンタゴニスト（１－Ｈ１０、５－Ｂ０８、および４－Ｈ０２）のエピトープは、ａａ１３４～１６０を包含するドメイン３の中心に向かってシフトし、おそらくはドメイン４のより小さな部分をカバーする。しかしながら、それにもかかわらず、それらのエピトープはある程度重複しているようである。
抗体をそれらの機能的役割にグループ化すると、アゴニスト抗体（１－Ｆ０２、１－Ｆ０６および４－Ｅ０８）は、ａａ１５１～１６０を包含するドメイン３の非常に遠位のＣ末端部分に結合し、おそらくはドメイン４のより大きな部分に広がるようであるのに対し、アンタゴニスト（１－Ｈ１０、５－Ｂ０８、および４－Ｈ０２）のエピトープは、ａａ１３４～１６０を包含するドメイン３の中心に向かってシフトし、おそらくはドメイン４のより小さな部分をカバーする。しかしながら、それにもかかわらず、それらのエピトープはある程度重複しているようである。
【0249】
ドメイン３、ａａ１１９～１３４のＮ末端部分に結合する抗体はない。ドメイン４への結合部位はすべての抗体である可能性が高いが、完全には同定されていない。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】