特表 2022-514219 ＮＲＦ－２欠損細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-10

(54)【発明の名称】ＮＲＦ－２欠損細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20220203BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220203BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220203BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220203BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220203BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220203BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220203BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220203BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220203BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220203BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220203BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220203BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220203BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220203BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220203BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20220203BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17 Z

C12N5/10

C12N5/0783

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 121

A61P43/00 107

A61K35/15 Z

A61K47/68

A61K39/395 C

A61K39/395 L

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K39/395 G

A61K39/395 U

A61K45/00

A61K38/19

C12N15/12 ZNA

C12N15/113 Z

C12N15/62 Z

C12N15/09 100

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021532865

(86)(22)【出願日】2019-12-09

(85)【翻訳文提出日】2021-07-20

(86)【国際出願番号】 US2019065227

(87)【国際公開番号】W WO2020123377

(87)【国際公開日】2020-06-18

(31)【優先権主張番号】10-2018-0158428

(32)【優先日】2018-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521208309

【氏名又は名称】ネオイミューンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ホン， チャン ワン

(72)【発明者】

【氏名】リ， ビョン ハ

(72)【発明者】

【氏名】チェ， ドンフン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB24

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA44

4C084DA01

4C084MA02

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB021

4C084ZB022

4C084ZB091

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4C084ZB221

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

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4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

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4C085BB11

4C085BB12

4C085BB50

4C085CC05

4C085CC23

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG10

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA04

4C087DA32

4C087MA02

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB22

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

(57)【要約】

本開示は、Ｎｒｆ２発現の調節に基づくＴ細胞抗がん免疫療法、すなわち、Ｎｒｆ２標的化免疫細胞、例えば、Ｔ細胞による、抗がん療法に関する。本開示は、Ｔ細胞におけるＮｒｆ２発現に深く干渉することにより、Ｔ細胞に対してがん細胞が示す免疫寛容の問題を解決する。言い換えると、Ｎｒｆ２を標的とすることにより、抗がん免疫療法の効果が改善し得る。本開示は、Ｎｒｆ２を標的とする新たなＴ細胞抗がん免疫療法、及び第２世代抗がん免疫療法のためのＴ細胞を提供し得る。この技術は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、工学操作されたＴ細胞、及びＴＩＬ Ｔ細胞の調製、ならびにリンパ腫を含む様々な固形癌の治療に適用可能である。これは治療効能を効果的に改善する新たな抗がん療法であるといえる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する改変細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象の腫瘍を治療する方法。

【請求項2】

ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の前記発現レベルが、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記投与が、前記対象における腫瘍体積を、参照腫瘍体積（例えば、前記投与前の前記対象における腫瘍体積、及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して低減させる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記腫瘍体積が、前記投与後に、前記参照腫瘍体積と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記投与が、前記対象における腫瘍重量を、参照腫瘍重量（例えば、前記投与前の前記対象における腫瘍重量、及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して低減させる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記腫瘍重量が、前記投与後に、前記参照腫瘍重量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記投与が、前記対象における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の１以上の特性を改善する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＴＩＬが、同族抗原で刺激されると、参照ＴＩＬ（例えば、前記投与を受けなかった対象のＴＩＬ）と比較して増大した量のＩＦＮ－γを産生する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

産生されるＩＦＮ－γの前記量が、前記参照ＴＩＬと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＴＩＬがＣＤ８＋ＴＩＬである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＴＩＬがＣＤ４＋ＴＩＬである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記改変細胞が、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した酸化ストレス耐性を呈する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記酸化ストレス耐性が、前記参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記増大した酸化ストレス耐性が、高濃度の活性酸素種の存在下で増殖する、ＩＦＮ－γを産生する、及び／またはグランザイムＢを発現する能力を含む、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記活性酸素種が過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記改変細胞が免疫細胞である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記免疫細胞が、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記リンパ球が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記リンパ球がＴ細胞である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、工学操作されたＴＣＲを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記腫瘍が、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃の癌（胃癌）、胃腸癌、卵巣癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記がんが、大腸癌、皮膚癌、リンパ腫、肺癌、またはそれらの組み合わせである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

追加の治療剤を前記対象に投与することを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記追加の治療剤が、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害性薬剤、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科手技、放射線手技、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記追加の治療剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４または２５に記載の方法。

【請求項27】

前記追加の治療剤及び前記改変細胞が同時に投与される、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記追加の治療剤及び前記改変細胞が順次投与される、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記改変細胞が、補足的投与、筋肉内投与、皮下投与、点眼、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、眼窩内投与、脳内投与、頭蓋内投与、脊髄内投与、心室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、嚢内投与、腫瘍内投与、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の抗腫瘍免疫応答を改善する方法であって、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように前記細胞を改変することを含み、前記ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の前記比較的低い発現が、前記細胞の前記抗腫瘍免疫応答を改善する、前記方法。

【請求項31】

前記改変細胞における前記ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の前記発現レベルが、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記改変細胞が、同族抗原で刺激されると、参照細胞（例えば、比較的低いレベルの前記ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した量のＩＦＮ－γを産生する、請求項３０または３１に記載の方法。

【請求項33】

産生されるＩＦＮ－γの前記量が、前記参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記改変細胞が、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した酸化ストレス耐性を呈する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記酸化ストレス耐性が、前記参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記増大した酸化ストレス耐性が、高濃度の活性酸素種の存在下で増殖する、ＩＦＮ－γを産生する、及び／またはグランザイムＢを発現する能力を含む、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項37】

前記活性酸素種が過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞を改変することが、前記細胞における前記ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の前記発現レベルを低下させることができる遺伝子編集ツールと前記細胞を接触させることを含む、請求項３０～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記遺伝子編集ツールが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記遺伝子編集ツールがｓｈＲＮＡである、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

前記改変細胞が免疫細胞である、請求項３０～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記免疫細胞が、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記リンパ球が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記リンパ球がＴ細胞である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

キメラ抗原受容体の工学操作のための免疫細胞を調製する方法であって、遺伝子編集ツールと前記免疫細胞を接触させて、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルを低下させることを含む、前記方法。

【請求項46】

ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の前記発現レベルが、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記免疫細胞が、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項48】

前記リンパ球が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記リンパ球がＴ細胞である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記遺伝子編集ツールが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記遺伝子編集ツールがｓｈＲＮＡである、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記遺伝子編集ツールをコードする核酸が、発現ベクターから発現される、請求項４５～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように前記免疫細胞を改変することをさらに含む、請求項４５～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＣＡＲを発現するように前記免疫細胞を改変することが、前記ＣＡＲをコードする核酸配列と前記免疫細胞を接触させることを含む、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列が、発現ベクターから発現される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記遺伝子編集ツール及び前記ＣＡＲが、別々の発現ベクターでコードされる、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記遺伝子編集ツール及び前記ＣＡＲが、同じ発現ベクターでコードされる、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

Ｎｒｆ２発現が低減したＴ細胞を含む、がんを防止または治療するための医薬組成物。

【請求項59】

前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、工学操作されたＴＣＲを含む、請求項５８に記載の医薬組成物。

【請求項60】

請求項３０～５７のいずれか１項に記載の方法によって調製された細胞。

【請求項61】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、工学操作されたＴＣＲをさらに含む、請求項６０に記載の細胞。

【請求項62】

Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６０または６１に記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
このＰＣＴ出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１２月１０日出願の韓国特許出願第１０－２０１８－０１５８４２８号に基づく優先権の利益を主張するものである。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子提出された配列表の参照
本出願と共に提出された、ＡＳＣＩＩテキストファイルで電子提出された配列表（名称：４２４１＿０１０ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：２６，６８３バイト、作成日：２０１９年１２月９日）の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、Ｎｒｆ２発現に基づく細胞ベースの（例えば、Ｔ細胞）抗がん免疫療法に関する。特に、本明細書に提供される細胞は、低下したレベルのＮｒｆ２を発現するように改変されている。

【背景技術】

【0004】

固形腫瘍中の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、免疫抑制性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を生成し、次いで、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／または反応性窒素種（ＲＮＳ）の高産生によってエフェクターＴ細胞の抗腫瘍応答を阻害することができる。このような環境は、腫瘍細胞が抗がん免疫応答を逃れることを可能にし、腫瘍発生の特徴のうちの１つであるがん細胞の成長及び転移を促進する。このような環境は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の活性に影響を及ぼすことが知られているが、応答因子に関連性のある研究で、Ｔ細胞について行われたものはこれまでにない。核因子Ｅ２因子関連因子２（Ｎｒｆ２）は、酸化ストレス（ＯＳ）の原因となる典型的な因子のうちの１つである。がん細胞に対するＮｒｆ２の役割については盛んに評価され、蓄積されてきたが、ＴＩＬ、特に細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍応答におけるＯＳの影響及びＯＳの原因となるＮｒｆ２の役割については研究されていない。

【0005】

腫瘍発生におけるＮｒｆ２の役割は議論の的になっている。多くの先行研究は、Ｎｒｆ２が活性化されると癌化が防止され得ることを示唆したが、他の研究は、癌化が体内におけるＮｒｆ２の異常または連続的な活性化によって誘導され得ることを示している。実際、Ｎｒｆ２の過剰発現は、５年生存率の低下をもたらし、抗がん剤への耐性を誘導し得る。現在の問題は、ＴＩＬにおけるＮｒｆ２について研究が行われておらず、関連性のある研究を行う緊急の必要性があることである。特に、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＮｒｆ２発現の調節を伴う抗がん免疫療法を開発することが必要である。
がん免疫療法における進歩にもかかわらず、特定の悪性腫瘍（例えば、転移性または難治性の固形腫瘍）を有する患者は、依然として予後がきわめて不良である。そのような患者の中で実際にがんの長期寛解を経験するのはほんの一部であり、多くの患者は抗体に応答しないか、または最初は抗体に応答しても最終的には耐性を発現するかのいずれかである。Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６８（４）：７０７－７２３（２０１７）。したがって、がん患者において、許容できる安全性プロファイル及び高い効能を有する新たな治療選択肢が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６８（４）：７０７－７２３（２０１７）

【発明の概要】

【0007】

本開示の発明者らは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞における核因子Ｅ２因子関連因子２（Ｎｒｆ２）を調節する機構を同定し、Ｎｒｆ２発現を阻害し、細胞傷害性機能が免疫抑制性ＴＭＥにおいて持続するＴ細胞を開発した。さらに、Ｎｒｆ２欠損ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗腫瘍サイトカイン、ＩＦＮｇ、及びグランザイムＢの産生において、従来のＴ細胞よりも優れている。

【0008】

本開示の目的は、がんを防止及び治療するための医薬成分を提供することである。いくつかの態様において、本開示は、Ｎｒｆ２発現が低減または阻害されたＴ細胞を提供する。

【0009】

上述の問題は、本開示により、すなわち、Ｔ細胞におけるＮｒｆ２発現の低減または阻害などを伴う、癌化の防止及び治療のための医薬成分を提供することにより、解決することができる。

【0010】

本開示は、細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるＮｒｆ２発現の標的化に基づく抗がん免疫療法に関する。がん細胞は、免疫系による監視を逃れることができ、その主な機構のうちの１つは、Ｔ細胞を消耗状態にすることである。本開示は、Ｔ細胞におけるＮｒｆ２発現に深く干渉すること（すなわち、細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させること）により、がん細胞の示すＴ細胞消耗の問題を解決することを可能にする。言い換えると、本開示によれば、固形腫瘍に対する抗がん免疫療法の効果は、細胞におけるＮｒｆ２発現を標的とすること（例えば、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減または阻害すること）によって改善し得、これが本開示の最大の特徴である。本開示は、細胞におけるＮｒｆ２発現の調節に基づく新たなＴ細胞抗がん免疫療法、及び第２世代抗がん免疫療法のためのＴ細胞を提供し得る。この技術は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、工学操作されたＴ細胞、及びＴＩＬ Ｔ細胞の調製、ならびに白血病を含む様々な固形腫瘍の治療に適用可能である。これは治療効能を効果的に改善する新たな抗がん療法であるといえる。

【0011】

本明細書では、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する改変細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の腫瘍を治療する方法が提供される。いくつかの態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。

【0012】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）の投与は、対象における腫瘍体積を、参照腫瘍体積（例えば、投与前の対象における腫瘍体積、及び／または投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して低減させる。特定の態様において、腫瘍体積は、投与後に、参照腫瘍体積と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する。

【0013】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）の投与は、対象における腫瘍重量を、参照腫瘍重量（例えば、投与前の対象における腫瘍重量、及び／または投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して低減させる。特定の態様において、腫瘍重量は、投与後に、参照腫瘍重量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する。

【0014】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）の投与は、対象における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の１以上の特性を改善する。特定の態様において、ＴＩＬは、同族抗原で刺激されると、参照ＴＩＬ（例えば、投与を受けなかった対象のＴＩＬ）と比較して増大した量のＩＦＮ－γを産生する。いくつかの態様において、産生されるＩＦＮ－γの量は、参照ＴＩＬと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する。いくつかの態様において、ＴＩＬはＣＤ８＋ＴＩＬである。いくつかの態様において、ＴＩＬはＣＤ４＋ＴＩＬである。

【0015】

いくつかの態様において、改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した酸化ストレス耐性を呈する。特定の態様において、酸化ストレス耐性は、参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する。いくつかの態様において、増大した酸化ストレス耐性は、高濃度の活性酸素種の存在下で増殖する、ＩＦＮ－γを産生する、及び／またはグランザイムＢを発現する能力を含む。いくつかの態様において、活性酸素種は過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含む。

【0016】

いくつかの態様において、本明細書に開示される方法で投与され得る改変細胞は、免疫細胞である。特定の態様において、免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、リンパ球はＴ細胞である。さらなる態様では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、工学操作されたＴＣＲを含む。

【0017】

いくつかの態様において、本明細書に開示される方法で治療することのできる腫瘍は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃の癌（胃癌）、胃腸癌、卵巣癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する。特定の態様において、がんは、大腸癌、皮膚癌、リンパ腫、肺癌、またはそれらの組み合わせである。

【0018】

いくつかの態様において、本明細書に開示される腫瘍を治療する方法は、追加の治療剤を対象に投与することを含む。特定の態様において、追加の治療剤は、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害性薬剤、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科手技、放射線手技、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0019】

いくつかの態様において、追加の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。特定の態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0020】

いくつかの態様において、追加の治療剤及び改変細胞は同時に投与される。他の態様において、追加の治療剤及び改変細胞は順次投与される。

【0021】

いくつかの態様において、本明細書に開示される方法で腫瘍を治療するために使用することのできる改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、補足的投与、筋肉内投与、皮下投与、点眼、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、眼窩内投与、脳内投与、頭蓋内投与、脊髄内投与、心室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、嚢内投与、腫瘍内投与、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。

【0022】

本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の抗腫瘍免疫応答を改善する方法であって、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように細胞を改変することを含み、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の比較的低い発現が、細胞の抗腫瘍免疫応答を改善する、方法をさらに提供する。いくつかの態様において、改変細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。

【0023】

いくつかの態様において、改変細胞は、同族抗原で刺激されると、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した量のＩＦＮ－γを産生する。特定の態様において、産生されるＩＦＮ－γの量は、参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する。

【0024】

いくつかの態様において、改変細胞は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した酸化ストレス耐性を呈する。特定の態様において、酸化ストレス耐性は、参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する。いくつかの態様において、増大した酸化ストレス耐性は、高濃度の活性酸素種の存在下で増殖する、ＩＦＮ－γを産生する、及び／またはグランザイムＢを発現する能力を含む。特定の態様において、活性酸素種は過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含む。

【0025】

いくつかの態様において、本明細書に開示される方法における細胞を改変することは、細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルを低下させることができる遺伝子編集ツールと細胞を接触させることを含む。特定の態様において、遺伝子編集ツールは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールはｓｈＲＮＡである。

【0026】

いくつかの態様において、改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、免疫細胞である。特定の態様において、免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、リンパ球はＴ細胞である。

【0027】

また本明細書では、キメラ抗原受容体の工学操作のための免疫細胞を調製する方法であって、遺伝子編集ツールと免疫細胞を接触させて、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルを低下させることを含む、方法が提供される。いくつかの態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。

【0028】

いくつかの態様において、免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球はＴ細胞である。

【0029】

いくつかの態様において、キメラ抗原受容体の工学操作のための免疫細胞を調製する方法で使用することのできる遺伝子編集ツールは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様において、遺伝子編集ツールはｓｈＲＮＡである。

【0030】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるキメラ抗原受容体の工学操作のための免疫細胞を調製する方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように免疫細胞を改変することをさらに含む。特定の態様において、ＣＡＲを発現するように免疫細胞を改変することは、ＣＡＲをコードする核酸配列と免疫細胞を接触させることを含む。

【0031】

いくつかの態様において、遺伝子編集ツールをコードする核酸は、発現ベクターから発現される。特定の態様において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、発現ベクターから発現される。いくつかの態様において、遺伝子編集ツール及びＣＡＲは、別々の発現ベクターでコードされる。他の態様において、遺伝子編集ツール及びＣＡＲは、同じ発現ベクターでコードされる。

【0032】

本明細書では、Ｎｒｆ２発現が低減したＴ細胞を含む、がんを防止または治療するための医薬組成物が提供される。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、工学操作されたＴＣＲを含む。

【0033】

また本明細書では、本明細書に開示される方法によって調製された細胞が提供される。特定の態様において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、工学操作されたＴＣＲを含む。いくつかの態様において、細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞における、酸化ストレスの増大（Ｈ_２Ｏ_２濃度の上昇によって表される）に伴うＮｒｆ２ ｍＲＮＡ発現の変化を示す。

【図2】担腫瘍マウス及び無腫瘍マウスの組織から単離された様々な細胞集団におけるＮｒｆ２ ｍＲＮＡ発現を示す。図示の各細胞は（左から右に）、（ｉ）腫瘍浸潤Ｔ細胞（担腫瘍マウス由来）、（ｉｉ）腫瘍浸潤Ｂ細胞（担腫瘍マウス由来）、（ｉｉｉ）非Ｔ及び非Ｂ ＴＩＬ（ＤＮ）（担腫瘍マウス由来）、（ｉｖ）流入領域リンパ節のＴ細胞（「ｄＬＮ」）（担腫瘍マウス由来）、（ｖ）非流入領域リンパ節のＴ細胞（担腫瘍マウス由来）、（ｖｉ）非流入領域リンパ節のＴ細胞（無腫瘍マウス由来）を含む。

【図3】Ｎｒｆ２欠損マウス及び野生型（ＷＴ）マウスにおける黒色腫の成長速度を示す。具体的には、Ｎｒｆ２－／－マウス及び野生型マウス（すなわち、正常レベルのＮｒｆ２を発現するもの）における腫瘍（すなわち、黒色腫）播種後の様々な時点での腫瘍成長の比較を提示する。

【図4】Ｎｒｆ２発現と共に変化した黒色腫増殖（すなわち、成長）の画像を示す。具体的には、野生型マウス（左）及びＮｒｆ２－／－マウス（右）から単離された黒色腫腫瘍の画像を提示する。

【図5】Ｎｒｆ２発現と共に変化したリンパ腫増殖を示す。具体的には、Ｎｒｆ２－／－マウス及び野生型マウス（すなわち、正常レベルのＮｒｆ２を発現するもの）における腫瘍（すなわち、リンパ腫）播種後の様々な時点での腫瘍体積の比較を提示する。

【図6】Ｎｒｆ２発現と共に変化したリンパ腫増殖（すなわち、成長）の画像を示す。具体的には、野生型マウス（左）及びＮｒｆ２－／－マウス（右）から単離されたリンパ腫腫瘍の画像を提示する。

【図7】Ｎｒｆ２発現と共に変化した野生型マウス及びＮｒｆ２－／－マウスの肺におけるがん細胞転移の画像を示す。左側の画像は、代表的な野生型動物（上）及びＮｒｆ２－／－動物（下）から単離された肺組織の写真表示である。右側の画像は、野生型動物（上）及びＮｒｆ２－／－動物（下）の肺組織の免疫組織化学画像である。画像中、腫瘍は矢印で識別している。

【図8】Ａ及びＢは、Ｎｒｆ２発現と共に変化したＴ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を示す。具体的には、Ａ及びＢは、Ｎｒｆ２－／－動物で観察された抗腫瘍免疫応答の改善がＴ細胞媒介性であることを示す。次の群について、腫瘍成長（Ａ）及び腫瘍重量（Ｂ）の比較を提示している：（ｉ）対照ＩｇＧ抗体を与えた担腫瘍野生型動物（「ＷＴ＋ＩｇＧ」または「白抜きの円形」）、（ｉｉ）Ｔ細胞枯渇抗ＣＤ３抗体を投与した担腫瘍野生型動物（「ＷＴ＋α－ＣＤ３」または「網掛けの円形」）、（ｉｉｉ）対照ＩｇＧ抗体を与えた担腫瘍Ｎｒｆ２－／－動物（「Ｎｒｆ２－／－＋ＩｇＧ」または「白抜きの四角形」）、及び（ｉｖ）Ｔ細胞枯渇抗ＣＤ３抗体を投与した担腫瘍Ｎｒｆ２－／－動物（「Ｎｒｆ２－／－＋α－ＣＤ３」または「黒塗りの四角形」）。

【図9】Ａ及びＢは、Ｎｒｆ２－／－動物で観察された抗腫瘍免疫応答の改善がＢ細胞に依存しないことを提示する。次の群について、腫瘍成長（Ａ）及び腫瘍重量（Ｂ）の比較を提示している：（ｉ）対照ＩｇＧ抗体を与えた担腫瘍野生型動物（「ＷＴ＋ＩｇＧ」または「白抜きの円形」）、（ｉｉ）Ｂ細胞枯渇抗Ｂ２２０抗体を投与した担腫瘍野生型動物（「ＷＴ＋α－Ｂ２２０」または「網掛けの円形」）、（ｉｉｉ）対照ＩｇＧ抗体を与えた担腫瘍Ｎｒｆ２－／－動物（「Ｎｒｆ２－／－＋ＩｇＧ」または「白抜きの四角形」）、及び（ｉｖ）Ｂ細胞枯渇抗Ｂ２２０抗体を投与した担腫瘍Ｎｒｆ２－／－動物（「Ｎｒｆ２－／－＋α－Ｂ２２０」または「黒塗りの四角形」）。

【図10】Ｎｒｆ２発現と共に変化したＴ細胞活性を示す。具体的には、担腫瘍野生型動物（上）及びＮｒｆ２－／－動物（下）から単離された流入領域リンパ節Ｔ細胞（「流入領域ＬＮＴ」）及びＴＩＬによるＩＬ－１７（ｙ軸）及びＩＦＮ－γ（ｘ軸）の産生の比較を提示する。Ｔ細胞の２つの異なる分類を、それらのＣＤ４及びＣＤ８発現に基づいてさらに分割している。

【図11】養子移入モデルにおけるＮｒｆ２欠失毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗がん効能を示す。具体的には、野生型マウス、Ｎｒｆ２＋／－マウス、またはＮｒｆ２－／－マウスからＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＥＧ７－ＯＶＡ腫瘍細胞を播種した野生型動物に養子移入した。各処置群は次のとおりである：（１）ＷＴマウスにＷＴ細胞、（２）ＷＴマウスにＮｒｆ２＋／－細胞、及び（３）ＷＴマウスにＮｒｆ２－／－細胞。腫瘍播種後の様々な時点における各動物の腫瘍体積の比較を提示する。

【図12】本開示、すなわち、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＮｒｆ２発現の調節を伴う腫瘍免疫療法の流れの概略図である。

【図13】Ａ及びＢは、ＭＣ３８（大腸）腫瘍細胞を播種した野生型マウス（白抜きの円形）、Ｎｒｆ２－／－マウス（黒塗りの四角形）、及びＮｒｆ２トランスジェニックマウス（黒塗りの三角形）における抗腫瘍免疫応答の比較を提示する。Ａは、腫瘍播種後の様々な時点における各処置群の腫瘍体積を示す。Ｂは、腫瘍播種後２８日目の腫瘍体積の比較を提示する。

【図14A】野生型動物（左の縦列、「ＷＴ」）、Ｎｒｆ２トランスジェニック動物（中央の縦列、「Ｎｒｆ２Ｔｇ」）、及びＮｒｆ２－／－動物（右の縦列、「Ｎｒｆ２ＫＯ」）から単離されたＴ細胞が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在によってもたらされる酸化ストレス（ＯＳ）に抵抗する機能を示す。図１４Ａにおいて、ＯＳ耐性は、Ｈ２Ｏ２の存在下または非存在下でＴＣＲ刺激を受けた際に各動物のＴ細胞が産生したＩＦＮ－γの量によって測定されている。図１４Ｂは、図１４Ａに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ｃにおいて、ＯＳ耐性は、グランザイムＢの発現によって測定されている。図１４Ｄは、図１４Ｃに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ａと１４Ｃの両方において、（ｉ）最上部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激もＨ２Ｏ２曝露も行わず、（ｉｉ）中央の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激は行ったがＨ２Ｏ２には曝露せず、（ｉｉｉ）最下部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激とＨ２Ｏ２曝露の両方を行った。フロープロットの各々において、左側の枠内の領域は、活性化された（すなわち、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖した）Ｔ細胞を表し、右側の枠内の領域は、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖しなかったＴ細胞を表す。増殖はＣＦＳＥプロファイルに基づいて示している。

【図14B】野生型動物（左の縦列、「ＷＴ」）、Ｎｒｆ２トランスジェニック動物（中央の縦列、「Ｎｒｆ２Ｔｇ」）、及びＮｒｆ２－／－動物（右の縦列、「Ｎｒｆ２ＫＯ」）から単離されたＴ細胞が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在によってもたらされる酸化ストレス（ＯＳ）に抵抗する機能を示す。図１４Ａにおいて、ＯＳ耐性は、Ｈ２Ｏ２の存在下または非存在下でＴＣＲ刺激を受けた際に各動物のＴ細胞が産生したＩＦＮ－γの量によって測定されている。図１４Ｂは、図１４Ａに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ｃにおいて、ＯＳ耐性は、グランザイムＢの発現によって測定されている。図１４Ｄは、図１４Ｃに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ａと１４Ｃの両方において、（ｉ）最上部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激もＨ２Ｏ２曝露も行わず、（ｉｉ）中央の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激は行ったがＨ２Ｏ２には曝露せず、（ｉｉｉ）最下部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激とＨ２Ｏ２曝露の両方を行った。フロープロットの各々において、左側の枠内の領域は、活性化された（すなわち、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖した）Ｔ細胞を表し、右側の枠内の領域は、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖しなかったＴ細胞を表す。増殖はＣＦＳＥプロファイルに基づいて示している。

【図14C】野生型動物（左の縦列、「ＷＴ」）、Ｎｒｆ２トランスジェニック動物（中央の縦列、「Ｎｒｆ２Ｔｇ」）、及びＮｒｆ２－／－動物（右の縦列、「Ｎｒｆ２ＫＯ」）から単離されたＴ細胞が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在によってもたらされる酸化ストレス（ＯＳ）に抵抗する機能を示す。図１４Ａにおいて、ＯＳ耐性は、Ｈ２Ｏ２の存在下または非存在下でＴＣＲ刺激を受けた際に各動物のＴ細胞が産生したＩＦＮ－γの量によって測定されている。図１４Ｂは、図１４Ａに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ｃにおいて、ＯＳ耐性は、グランザイムＢの発現によって測定されている。図１４Ｄは、図１４Ｃに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ａと１４Ｃの両方において、（ｉ）最上部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激もＨ２Ｏ２曝露も行わず、（ｉｉ）中央の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激は行ったがＨ２Ｏ２には曝露せず、（ｉｉｉ）最下部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激とＨ２Ｏ２曝露の両方を行った。フロープロットの各々において、左側の枠内の領域は、活性化された（すなわち、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖した）Ｔ細胞を表し、右側の枠内の領域は、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖しなかったＴ細胞を表す。増殖はＣＦＳＥプロファイルに基づいて示している。

【図14D】野生型動物（左の縦列、「ＷＴ」）、Ｎｒｆ２トランスジェニック動物（中央の縦列、「Ｎｒｆ２Ｔｇ」）、及びＮｒｆ２－／－動物（右の縦列、「Ｎｒｆ２ＫＯ」）から単離されたＴ細胞が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在によってもたらされる酸化ストレス（ＯＳ）に抵抗する機能を示す。図１４Ａにおいて、ＯＳ耐性は、Ｈ２Ｏ２の存在下または非存在下でＴＣＲ刺激を受けた際に各動物のＴ細胞が産生したＩＦＮ－γの量によって測定されている。図１４Ｂは、図１４Ａに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ｃにおいて、ＯＳ耐性は、グランザイムＢの発現によって測定されている。図１４Ｄは、図１４Ｃに提示したフローサイトメトリーデータのグラフ表示である。図１４Ａと１４Ｃの両方において、（ｉ）最上部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激もＨ２Ｏ２曝露も行わず、（ｉｉ）中央の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激は行ったがＨ２Ｏ２には曝露せず、（ｉｉｉ）最下部の横列に示した細胞は、ＴＣＲ刺激とＨ２Ｏ２曝露の両方を行った。フロープロットの各々において、左側の枠内の領域は、活性化された（すなわち、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖した）Ｔ細胞を表し、右側の枠内の領域は、ＴＣＲ刺激を受けた際に増殖しなかったＴ細胞を表す。増殖はＣＦＳＥプロファイルに基づいて示している。

【図15A】Ｎｒｆ２発現が欠如しているＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物の概略図である。

【図15B】Ｎｒｆ２発現が欠如しているＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。Ｎｒｆ２ ｍＲＮＡに特異的なｓｈＲＮＡを使用した形質導入ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＮｒｆ２ ｍＲＮＡ発現のノックダウンを示す。

【図15C】Ｎｒｆ２発現が欠如しているＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。Ｈ２Ｏ２の存在下で抗ＣＤ３刺激後に産生されたＩＦＮ－γの量によって測定された、ＯＳに抵抗するＣＤ１９特異的Ｎｒｆ２欠損ＣＡＲ Ｔ細胞の活性を示す。上部に示したデータは、対照ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、正常レベルのＮｒｆ２を発現するもの）に関するものである。

【図16】Ａ、Ｂ、及びＣは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用したヒトＴ細胞におけるＮｒｆ２タンパク質発現の結果を示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｎｒｆ２遺伝子を標的とする３つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質を使用した結果を提示する。Ｔ７Ｅ１解析を使用して、Ｎｒｆ２遺伝子におけるオンターゲットＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集事象を検出した。示してある割合は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による改変後のＮｒｆ２遺伝子における個々のｇＲＮＡのインデル変異率を表す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

がん細胞は、免疫系による監視を逃れることができ、その主な機構のうちの１つは、Ｔ細胞を消耗状態にすることである。本開示は、Ｔ細胞におけるＮｒｆ２発現に深く干渉することにより、ＴＩＬに対してＴＭＥによって誘導される免疫消耗の問題を解決する。言い換えると、Ｎｒｆ２を標的とすることにより、抗がん免疫療法の効果が改善し得、これが本開示の最大の特徴である。したがって、本開示は、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現が低減している改変細胞を投与することを含む、それを必要とする対象の腫瘍を治療する方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、ＣＡＲまたはＴＣＲ工学操作細胞の抗腫瘍効能を改善する方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、腫瘍に対する免疫細胞の免疫寛容を防止または阻害する方法に関する。

【0036】

Ｉ．定義
本開示をより容易に理解することができるように、特定の用語をまず定義する。本出願で使用するとき、本明細書に別段に明記されない限り、次の用語の各々は、下記に示す意味を有するものとする。さらなる定義は本明細書の随所に示される。

【0037】

本開示の随所において、実体に付く「ａ」または「ａｎ」という用語は、１以上のその実体を意味する。例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１以上の抗体を表すものと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義に使用され得る。

【0038】

さらに、「及び／または」は、本明細書で使用する場合、２つの特定の特徴または構成要素の各々の具体的な開示として解釈され、他方の有無を問わないものとする。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、次の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含することが意図される。

【0039】

本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉で態様が説明されている場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で説明されている他の類似の態様も提供されることを理解されたい。

【0040】

別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示の関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

【0041】

単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められている各形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特記なき限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向で左から右に書かれている。本明細書において提供する見出しは、本明細書全体を参照することにより得ることができる本開示の様々な態様を限定するものではない。したがって、直下で定義する用語は、本明細書全体を参照することによって、より十分に定義される。

【0042】

「約」という用語は、本明細書では、およそ、大体、おおよそ、またはその範囲内の意味で使用される。「約」という用語が数値範囲と共に使用されるとき、それは、示された数値の上下に境界を広げることによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、ある数値を、例えば１０パーセント上または下の（より高いかまたはより低い）差異で、記載された値を上回るかまたは下回るように修飾することができる。

【0043】

本明細書で使用する場合、「投与すること」とは、当業者に知られている様々な方法及び送達系のいずれかを使用して、治療剤または治療剤を含む組成物を対象に物理的に導入することを意味する。本明細書に記載される治療剤の様々な投与経路には、例えば注射または注入による、静脈内投与経路、腹腔内投与経路、筋肉内投与経路、皮下投与経路、脊髄投与経路、または他の非経口投与経路が含まれる。「非経口投与」という語句は、本明細書で使用する場合、経腸投与及び局部投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、限定するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、気管内、肺内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、心室内、硝子体内、硬膜外、及び胸骨内の注射及び注入、ならびにｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される治療剤は、局部投与経路、表皮投与経路、または粘膜投与経路などの非経口的でない経路によって、例えば、鼻腔内投与、経口投与、膣内投与、直腸投与、舌下投与、または局部投与することができる。また、投与は、例えば１回、複数回、及び／または１以上の長い期間にわたって行うことができる。

【0044】

本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはハプテンなどの任意の天然または合成の免疫原性物質を意味する。本明細書で使用する場合、「同族抗原」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が認識することにより、免疫細胞の活性化を誘導する（例えば、サイトカイン産生などのエフェクター機能を誘導する、及び／または細胞の増殖のための細胞内シグナルを誘発する）、抗原を意味する。

【0045】

「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続的に連結したアミノ酸残基を含む鎖を意味し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１以上のアミノ酸残基は、限定するものではないが、グリコシル化、リン酸化、またはジスルフィド結合形成などの修飾を含み得る。「タンパク質」は、１以上のポリペプチドを含み得る。特記なき限り、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は同義に使用され得る。

【0046】

「核酸分子」という用語は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであってもよい。

【0047】

本明細書で使用する「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味することが意図される。ベクターの一種には「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターの場合、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、導入された宿主細胞において自律複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、動作可能に連結した遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるため、本明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は同義に使用され得る。しかしながら、均等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも含まれる。

【0048】

「がん」とは、体内の異常細胞の成長がコントロールされないことを特徴とする様々な疾患の広範な群を意味する。細胞の分裂及び成長が制御されないことによって悪性腫瘍が形成され、隣接組織に浸潤し、リンパ系または血流を通って身体の遠位部に転移する場合もある。本明細書で使用する「がん」は、原発性癌、転移癌、及び再発癌を意味する。

【0049】

本明細書で使用する場合、「免疫応答」という用語は、外来作用物質に対する脊椎動物における生物学的応答であり、これらの作用物質及びそれらに起因する疾患から生物を保護する応答を意味する。免疫応答は、免疫系細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）、及びこれらの細胞のいずれかまたは肝臓で産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用によって媒介され、脊椎動物の身体において、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞もしくは他の異常細胞、または、自己免疫もしくは病的炎症の場合は、正常なヒトの細胞もしくは組織の選択的標的化、結合、損傷、破壊、及び／または排除をもたらすものである。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋もしくはＣＤ８^＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞の活性化もしくは阻害、またはＴｒｅｇ細胞の阻害が含まれる。本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は同義であり、胸腺によって産生または処理されるあらゆるリンパ球を意味する。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。

【0050】

本明細書で使用する場合、「抗腫瘍免疫応答」という用語は、腫瘍抗原に対する免疫応答を意味する。

【0051】

本明細書で使用する場合、「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」という用語は、末梢から（例えば、血液から）腫瘍中に遊走したリンパ球（例えば、エフェクターＴ細胞）を意味する。いくつかの態様において、腫瘍浸潤リンパ球はＣＤ４＋ＴＩＬである。他の態様において、腫瘍浸潤リンパ球はＣＤ８＋ＴＩＬである。

【0052】

免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、Ｔ細胞共刺激受容体のアゴニスト活性の向上及び／または抑制性受容体のアンタゴニスト活性の向上に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカインの放出、細胞溶解活性（標的細胞で直接的に、またはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムを検出することによって間接的に決定される）、及び増殖の変化を測定するアッセイにおける、ＥＣ５０または最大活性レベルの増大倍率に反映され得る。免疫応答または免疫系の活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍、またはそれ以上向上し得る。

【0053】

「対象」には、あらゆるヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、限定するものではないが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ならびにマウス、ラット、及びモルモットなどのげっ歯類といった脊椎動物を含む。いくつかの態様において、対象はヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義に使用される。

【0054】

「治療有効量」または「治療上有効な投与量」という用語は、所望の生物学的結果、治療結果、及び／または予防結果をもたらす薬剤の量を意味する。その結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因のうちの１以上の低減、回復、緩和、減弱、遅延、及び／または軽減、または生物学的システムの任意の他の所望の変化であり得る。固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍を縮小させる及び／または腫瘍の成長速度を減少させる（例えば、腫瘍成長を抑制する）、または他の望ましくない細胞増殖を防止もしくは遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの態様において、有効量は、腫瘍の発達を遅延させるのに十分な量である。いくつかの態様において、有効量は、腫瘍の再発を防止または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。有効量の薬物または組成物は、（ｉ）がん細胞の数を低減させ、（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小し、（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害し、遅らせ、ある程度緩徐化し、停止する場合もあり、（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度緩徐化し、停止する場合もあり、（ｖ）腫瘍成長を阻害し、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／または再発を防止もしくは遅延させ、及び／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１以上をある程度軽減することができる。いくつかの態様において、「治療有効量」は、進行固形腫瘍などのがんの著しい減少またはがんの進行の緩徐化（退行）をもたらすことが臨床的に証明されている、本明細書における改変細胞の量である。疾患退行を促進する治療剤の能力は、熟練した医師に知られている様々な方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象で、ヒトにおける効能を予測する動物モデル系で、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで薬剤の活性をアッセイすることで評価することができる。

【0055】

本明細書で使用する場合、「標準治療」という用語は、特定の種類の疾患に適切な治療として医療専門家に認められており、医療従事者によって広く使用されている治療を意味する。この用語は、次の用語：「ベストプラクティス」、「標準的医療」、及び「標準療法」のいずれとも同義に使用され得る。

【0056】

例として、「抗がん剤」は、対象のがんの退行を促進するか、またはさらなる腫瘍成長を防止する。特定の態様において、治療有効量の薬物は、がんを消失させるまでに、がんの退行を促進する。「がんの退行を促進する」とは、有効量の薬物を単独で、または抗新生物剤と組み合わせて投与することにより、腫瘍の成長またはサイズの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度の低下、疾患の無症状期間の頻度増大及び期間延長、または疾患の罹患による機能障害もしくは能力障害の防止をもたらすことを意味する。さらに、治療に関する「有効」及び「有効性」という用語は、薬理学的有効性と生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性とは、患者のがんの退行を促進する薬物の能力を意味する。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、細胞、器官、及び／または生物のレベルでの毒性または他の有害な生理学的効果（有害作用）のレベルを意味する。

【0057】

本明細書で使用する場合、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、１以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減させる、阻害する、干渉する、または調節する分子を意味する。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化または機能を制御する。ＣＴＬＡ－４ならびにそのリガンドのＣＤ８０及びＣＤ８６、ならびにＰＤ－１とそのリガンドのＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２など、多数のチェックポイントタンパク質が公知である。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２（４）：２５２－６４（２０１２）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激性相互作用または阻害性相互作用の原因である。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容性、ならびに生理学的免疫応答の期間及び程度を制御し、維持する。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体を含むか、または抗体に由来する。

【0058】

本明細書で使用する場合、「酸化ストレス」という用語は、過剰な酸化剤及び／または抗酸化剤レベルの低下を特徴とする状態を意味する。細胞酸化剤は、限定するものではないが、酸素のラジカル（スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、及び／またはペルオキシラジカル）；例えば、過酸化水素及び一重項酸素などの反応性非活性酸素種；炭素ラジカル；窒素ラジカル；硫黄ラジカル；ならびにそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、酸化ストレスの状態は、例えば、細胞損傷、細胞の機能不全、及び／または細胞死をもたらし得る。

【0059】

本明細書で使用する場合、「改変細胞」という用語は、改変されていない対応する細胞と異なる細胞を意味する。本開示から明らかであるように、本明細書に開示される改変細胞は、参照細胞（例えば、改変されていない対応する細胞）と比較して低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する。いくつかの態様において、改変細胞は、外来または外因性の核酸を細胞に導入することによって生成される。特定の態様において、外来または外因性の核酸は、本明細書に開示される遺伝子編集ツールをコードし得る。他の態様において、外来または外因性の核酸は、キメラ抗原受容体（本明細書に記載されるものなど）をコードし得る。核酸は、例えば、電気穿孔（例えば、Ｈｅｉｓｅｒ Ｗ．Ｃ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（商標）２０００；１３０：１１７－１３４を参照されたい）、化学（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質）トランスフェクション（例えば、Ｌｅｗｉｓ Ｗ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．１９８０ Ｍａｙ；６（３）：３３３－４７、Ｃｈｅｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８７ Ａｕｇｕｓｔ；７（８）：２７４５－２７５２を参照されたい）、組換えプラスミドを含む細菌プロトプラストとの融合（例えば、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ Ｗ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８０ Ａｐｒｉｌ；７７（４）：２１６３－７を参照されたい）、または精製されたＤＮＡの細胞核への直接的な微量注入（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ Ｍ．Ｒ．Ｃｅｌｌ．１９８０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２２（２ Ｐｔ ２）：４７９－８８を参照されたい）のような、当該技術分野で公知の方法によって細胞に導入することができる。

【0060】

本明細書で使用する場合、「高濃度」という用語は、物質（例えば、反応性酸素種）の適切な対照（例えば、健康な組織または細胞）と比較して正常より高いレベルを意味する。

【0061】

本明細書で使用する場合、「反応性酸素種」という用語は、酸素を含む高反応性化学物質で、他の分子と容易に反応し、損傷を生じる可能性のある改変をもたらすものを意味する。反応性酸素種としては、例えば、酸素イオン、無機及び有機のフリーラジカル及び過酸化物、例えば過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、脂質ヒドロペルオキシダーゼ、及び一重項酸素が挙げられる。これらは通常きわめて小さい分子であり、不対原子価殻電子が存在するため反応性が高い。ほぼすべてのがんが、高濃度の反応性酸素種に関連している。Ｌｉｏｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ ４４（５）：１－３１（２０１０）。

【0062】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原が細胞外ドメインに結合すると特殊な機能を果たすよう細胞に指示する、細胞内ドメインに結合した抗原特異的細胞外ドメインを有する組換え融合タンパク質を意味する。「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、及び「キメラ免疫受容体」という用語は各々、本明細書では「キメラ抗原受容体」という用語と同義に使用され得る。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原に結合すると共に、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを伝達する能力により、他の抗原結合剤と区別される。

【0063】

キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原、典型的には悪性疾患の表面発現抗原を認識し、特異的に結合する。抗原特異的細胞外ドメインが抗原に特異的に結合するのは、例えば、約０．１ｐＭ～約１０μＭ、例えば、約０．１ｐＭ～約１μＭ、または約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの親和性定数または相互作用の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合するときである。相互作用の親和性を決定する方法は当該技術分野において公知である。本開示のＣＡＲで使用するのに好適な抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合性ポリペプチドであってよく、これは当該技術分野で広範な種類が知られている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの認識ドメイン（ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそのヒト化版、ｌｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化版、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）ならびに「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に好適である。いくつかの態様において、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶアルファＶベータを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインも使用に好適である。

【0064】

本明細書に開示されるキメラ抗原受容体は、抗原が抗原特異的細胞外ドメインに結合すると細胞内シグナルを細胞（ＣＡＲを発現するもの）に与える細胞内ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が発現されるＴ細胞のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の原因である。

【0065】

「細胞内ドメイン」という用語は、ＣＡＲのうち、抗原が細胞外ドメインに結合するとエフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすようＴ細胞に指示する部分を意味する。好適な細胞内ドメインの非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはその相同体のいずれか（例えば、イータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン）、ＭＢ １鎖、８２９、Ｆｃ ＲＩＩＩ、Ｆｃ ＲＩ、及びシグナル伝達分子の組み合わせ、例えばＣＤ３ゼータ及びＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ－１０、ＯＸ４０、及びそれらの組み合わせ、ならびに他の同様の分子及び断片が挙げられる。ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩのような、活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用してもよい。通常は細胞内ドメイン全体が用いられるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられ得る場合において、かかる切断部分は、依然としてエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。したがって、細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の切断部分を含むことが意図される。典型的に、抗原特異的細胞外ドメインは、膜貫通ドメインにより、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結している。膜貫通ドメインは、細胞膜を横断し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに接続し、したがってＴ細胞表面におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体は、１以上の共刺激ドメイン及び／または１以上のスペーサーをさらに含んでもよい。共刺激ドメインは、サイトカイン産生、増殖、細胞傷害性、及び／または持続性をｉｎ ｖｉｖｏで向上させる共刺激性タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。「ペプチドヒンジ」は、抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに接続する。膜貫通ドメインは共刺激ドメインに融合しており、任意選択で、共刺激ドメインは第２の共刺激ドメインに融合しており、共刺激ドメインは、ＣＤ３ζに限定されないシグナル伝達ドメインに融合している。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に、またタンデムＣＡＲの場合は複数のｓｃＦｖ間にスペーサードメインを含めると、抗原結合ドメイン（複数可）の柔軟性、ひいてはＣＡＲ機能に影響が及び得る。好適な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは当該技術分野において公知である。

【0066】

本明細書で使用する場合、「遺伝子編集」という用語は、細胞のゲノムに存在する遺伝情報を変化させるプロセスを意味する。この遺伝子編集は、ゲノムＤＮＡを操作し、遺伝情報の改変をもたらすことによって行われ得る。いくつかの態様において、かかる遺伝子編集は、編集されたＤＮＡの発現に影響を及ぼし得る。他の態様において、かかる遺伝子編集は、編集されたＤＮＡの発現に影響を及ぼさない。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞の遺伝子編集は、本明細書に記載される遺伝子編集ツールを使用して行うことができる。遺伝子編集ツールの非限定的な例としては、ＲＮＡ干渉分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0067】

本明細書で使用する場合、「ｕｇ」及び「ｕＭ」という用語は、それぞれ、「μｇ」及び「μΜ」と同義に使用される。

【0068】

本明細書に記載される様々な態様を、下記のサブセクションでさらに詳細に説明する。

【0069】

ＩＩ．本開示の方法
ＩＩａ．治療方法
本開示は、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する改変細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の腫瘍（またはがん）を治療する方法に関する。いくつかの態様において、「低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質」は、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現がないことを含む。

【0070】

「Ｎｒｆ２」または「核因子赤血球２関連因子２」という用語は、塩基性ロイシンジッパータンパク質転写因子のファミリーに属するタンパク質を意味する。Ｎｒｆ２は、「核因子赤血球２様２」、「核因子赤血球由来２様２」、「ＨＥＢＰ１」、及び「ＩＭＤＤＨＨ」としても知られている。

【0071】

ヒトにおいて、Ｎｒｆ２は、第２染色体に位置するＮＦＥ２Ｌ２遺伝子によってコードされる。ヒトＮｒｆ２アイソフォームは３種が知られている。アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１６２３６－１）は、６０５アミノ酸からなり、古典的配列に選ばれている。アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１６２３６－２）は、５８９アミノ酸からなり、アミノ酸１～１６の欠失により古典的配列とは異なる。アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１６２３６－３）は、５８２アミノ酸からなり、アミノ酸１～１６の欠失及びアミノ酸１３５～１４１の欠失により古典的配列とは異なる。表１（下記）は、３つの既知のＮｒｆ２アイソフォームのアミノ酸配列を提示する。

【表1-1】

【表1-2】

【0072】

本明細書で使用する場合、「Ｎｒｆ２」という用語は、細胞によって天然に発現されるＮｒｆ２のあらゆるバリアントまたはアイソフォームを含む。当該技術分野では、次のＮｒｆ２の天然バリアントが知られている：（ｉ）アミノ酸３１位：Ｇ→Ｒ；（ｉｉ）アミノ酸４３位：Ｒ→Ｑ；（ｉｉｉ）アミノ酸７９位：Ｅ→Ｋ；（ｉｖ）アミノ酸８０位：Ｔ→Ｋ；（ｖ）アミノ酸８１位：Ｇ→Ｓ；（ｖｉ）アミノ酸９９位：Ｓ→Ｐ；及び（ｖｉｉ）アミノ酸２６８位：Ｖ→Ｍ。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞は、アイソフォーム１に関連する低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する。特定の態様において、本明細書に開示される改変細胞は、アイソフォーム２に関連する低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する。さらなる態様では、本明細書に開示される改変細胞は、アイソフォーム３に関連する低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する。なおもさらなる態様では、本明細書に開示される改変細胞は、すべてのアイソフォームに関連する低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する。

【0073】

いくつかの態様において、Ｎｒｆ２、またはその任意のバリアント及びアイソフォームは、それらを天然に発現する細胞もしくは組織から単離されてもよいし、または組換え的に生成されてもよい。上記のヒトＮｒｆ２アイソフォームをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を表２（下記）に提示する。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【0074】

いくつかの態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子の発現レベルは、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。いくつかの態様において、Ｎｒｆ２タンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。特定の態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子とＮｒｆ２タンパク質の両方の発現レベルが、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。

【0075】

いくつかの態様において、腫瘍を治療することは、対象における腫瘍体積を低減させることを含む。したがって、特定の態様において、本開示の改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）を対象に投与すると、対象における腫瘍体積が参照腫瘍体積と比較して低減する。いくつかの態様において、参照腫瘍体積は、改変細胞の投与前の対象における腫瘍体積である。さらなる態様では、参照腫瘍体積は、投与を受けなかった対応する対象における腫瘍体積である。いくつかの態様において、対象における腫瘍体積は、投与後に、参照腫瘍体積と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する。

【0076】

いくつかの態様において、腫瘍を治療することは、対象における腫瘍重量を低減させることを含む。特定の態様において、本明細書に開示される改変細胞は、対象に投与すると、対象における腫瘍重量を低減させ得る。いくつかの態様において、腫瘍重量は、投与後に、参照腫瘍重量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する。いくつかの態様において、参照腫瘍重量は、改変細胞の投与前の対象における腫瘍重量である。さらなる態様では、参照腫瘍重量は、投与を受けなかった対応する対象における腫瘍重量である。

【0077】

いくつかの態様において、本開示の改変細胞の投与により、対象の腫瘍におけるＴＩＬ（例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋）の数及び／または割合が増大し得る。特定の態様において、腫瘍におけるＴＩＬの数及び／または割合は、参照（例えば、改変細胞を受けなかった対象または改変細胞の投与前の同じ対象における対応する値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0078】

いくつかの態様において、本開示の改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）の投与は、対象の腫瘍における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数及び／または割合を低減させ得る。いくつかの態様において、制御性Ｔ細胞はＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞である。いくつかの態様において、制御性Ｔ細胞はＦｏｘｐ３^＋である。特定の態様において、腫瘍における制御性Ｔ細胞の数及び／または割合は、参照（例えば、改変細胞の投与を受けなかった対象における対応する数及び／または割合）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％減少する。

【0079】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞の投与により、対象の腫瘍におけるＣＤ８^＋ＴＩＬのＴｒｅｇに対する比が増大し得る。特定の態様において、ＣＤ８^＋ＴＩＬのＴｒｅｇに対する比は、投与後に、参照（例えば、改変細胞の投与を受けなかった対象の腫瘍におけるＴＩＬの数及び／または割合）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％増大する。

【0080】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞の投与により、対象の腫瘍における骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数及び／または割合が減少し得る。本明細書で使用する場合、「骨髄系由来サプレッサー細胞」（ＭＤＳＣ）という用語は、骨髄起源、未成熟状態、及びＴ細胞応答を強力に抑制する能力によって定義される、不均一な免疫細胞集団を意味する。これらは、慢性感染及びがんなどの特定の病理学的状態で増殖することが知られている。特定の態様において、ＭＤＳＣは、単球性ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である。他の態様において、ＭＤＳＣは、多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様において、腫瘍におけるＭＤＳＣの数及び／または割合は、参照（例えば、改変細胞の投与を受けなかった対応する対象の値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％減少する。

【0081】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞の投与により、対象の腫瘍におけるＣＤ８^＋ＴＩＬのＭＤＳＣに対する比が増大し得る。特定の態様において、ＣＤ８^＋ＴＩＬのＭＤＳＣに対する比は、投与後に、参照（例えば、改変細胞の投与を受けなかった対応する対象の値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％増大する。

【0082】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、免疫細胞を含む。特定の態様において、免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる態様では、本明細書に開示される改変された免疫細胞はリンパ球である。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。さらなる態様では、改変された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含み得る。いくつかの態様において、改変された免疫細胞は、Ｔ細胞受容体、例えば、工学操作されたＴＣＲをさらに含み得る。したがって、特定の態様において、本明細書に開示される改変細胞はＴ細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞はＴＩＬである。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞はＮＫ細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞はリンホカイン活性化キラー細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＡＲを含む。他の態様において、本明細書に開示される改変細胞はＮＫ細胞である。特定の態様において、ＮＫ細胞はＣＡＲを含む。さらなる態様では、本開示の改変細胞は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方を含む。特定の態様において、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方がＣＡＲを含む。

【0083】

いくつかの態様において、本発明の方法は、あらゆる免疫細胞型を改変するために使用され得る。他の態様において、本発明の方法は、任意の養子細胞移入（ＡＣＴ）療法（別名、養子細胞療法）のために細胞を改変するために使用される。ＡＣＴ療法は、自家療法または同種療法であり得る。いくつかの態様において、ＡＣＴ療法は、限定するものではないが、ＣＡＲ Ｔ療法、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、ＮＫ細胞療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0084】

いくつかの態様において、本発明の方法は、ＴＩＬ療法のためにＴＩＬを改変するために使用され得る。がんを治療するための養子細胞移入療法としてのＴＩＬの使用は、黒色腫のＴＩＬ養子細胞療法を使用し、２０年以上にわたって研究されてきた。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ ２０１１）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７（１３）：４５５０－７（Ｊｕｌｙ ２０１１）。養子Ｔ細胞移入療法では、手術によって切除した腫瘍を小さな断片に切り分けたもの、または腫瘍断片から単離した単細胞懸濁液から、ＴＩＬをｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる。個々の培養物を複数確立し、別々に増殖させ、特異的腫瘍認識についてアッセイする。ＴＩＬは数週間にわたって増殖させる。次いで、最も良好な腫瘍反応性を示した特定のＴＩＬ株を、通常２週間にわたって抗ＣＤ３活性化を使用する「高速増殖プロトコール」（ＲＥＰ）でさらに増殖させる。培養物中で増殖したＴＩＬは、ｅｘ ｖｉｖｏプロセス中の任意の時点で、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現が低減するように改変され得る。ＲＥＰ後の最終的なＴＩＬを患者に注入し戻す。このプロセスは、養子移入されたＴＩＬが腫瘍部位に十分に接近して包囲できるようにするために、内因性リンパ球を枯渇させる予備的な化学療法レジメンを含む場合もある。

【0085】

いくつかの態様において、本発明の方法は、Ｔ細胞受容体、例えば、工学操作されたＴＣＲを含むＴ細胞を改変するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「工学操作されたＴＣＲ」または「工学操作されたＴ細胞受容体」という用語は、選択される、クローニングされる、及び／または後にＴ細胞集団に導入される主要組織適合抗原（ＭＨＣ）／ペプチド標的抗原に所望の親和性で特異的に結合するように工学操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を意味する。

【0086】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、１以上の改善された特性を有し得る。特定の態様において、細胞（例えば、免疫細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の１以上の特性を改善することは、腫瘍の治療（例えば、腫瘍体積及び／または腫瘍重量の低減）に役立ち得る。本開示で改善され得る１以上の特性には、がんの治療に有用であり得る細胞（例えば、ＴＩＬ）のあらゆる特性が含まれる。例えば、特定の態様において、かかる特性は、（ｉ）増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増大、（ｉｉ）持続性及び／または生存率の増大（例えば、消耗／アネルギー性の低下）、（ｉｉｉ）抗腫瘍活性（例えば、腫瘍細胞を標的とし殺傷する能力）の増大、ならびに（ｉｖ）それらの組み合わせを含む。

【0087】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、参照（例えば、改変細胞を受けなかった対象または改変細胞の投与前の同じ対象における対応する値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞の持続性及び／または生存率は、参照（例えば、改変細胞を受けなかった対象または改変細胞の投与前の同じ対象における対応する値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。さらなる態様では、本明細書に開示される改変細胞の抗腫瘍活性は、参照（例えば、改変細胞を受けなかった対象または改変細胞の投与前の同じ対象における対応する値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0088】

いくつかの態様において、１以上の特性は、腫瘍を治療するのに有用なエフェクター分子を産生する細胞（例えば、ＴＩＬ）の能力を含み得る。特定の態様において、エフェクター分子はサイトカインを含む。エフェクター分子の非限定的な例には、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、グランザイムＢ、パーフォリン、ＭＩＰ－１β、ＣＤ１０７ａまたはそれらの組み合わせが含まれる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞は、同族抗原（例えば、腫瘍抗原）などの抗原で刺激されると、増大した量のＩＦＮ－γを産生することができる。特定の態様において、産生されるＩＦＮ－γの量は、参照細胞（例えば、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0089】

本明細書に記載されるように、Ｎｒｆ２は、反応性酸素種及び反応性窒素種などの作用物質によって引き起こされ得る酸化ストレスから細胞を保護するのに重要であるとして、当該技術分野で報告されている。出願者は、本明細書に開示される改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）が、参照細胞と比較して増大した酸化ストレス耐性を呈することを発見した。いくつかの態様において、参照細胞は、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞である。特定の態様において、本明細書に開示される改変細胞の酸化ストレス耐性は、参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増大する。

【0090】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞は、遺伝子編集ツールを使用して改変されていてもよい。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞は、ＲＮＡｉを使用して改変されていてもよい。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して改変されていてもよい。本開示の有用な遺伝子編集ツールのさらなる説明は、本明細書の他の箇所で提供する。

【0091】

いくつかの態様において、本明細書に記載される改変細胞は、キメラ抗原受容体を発現するようにさらに改変されていてもよい。いくつかの態様において、改変されたＣＡＲ発現細胞は、改善した抗がん特性を有し得る。

【0092】

いかなる理論にも束縛されないが、本開示の改変細胞は、Ｔ細胞消耗を低減または防止することができる。

【0093】

細胞が増大した酸化ストレス耐性を呈するかどうかは、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって測定することができる。いくつかの態様において、細胞の酸化ストレス耐性が増大する結果、細胞が改善された機能を呈し得る。例えば、特定の態様において、本明細書に開示される改変細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下にあっても増殖し得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下にあっても細胞溶解性分子を発現し得る。特定の態様において、細胞溶解性分子はグランザイムＢを含む。さらなる態様では、本開示の改変細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下にあってもサイトカインを産生し得る。いくつかの態様において、サイトカインはＩＦＮ－γを含む。いくつかの態様において、活性酸素種は過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含む。特定の態様において、本明細書に開示される改変細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下にあっても、（ｉ）増殖し、（ｉｉ）細胞溶解性分子を発現し、かつ（ｉｉｉ）サイトカインを産生し得る。

【0094】

本明細書に記載されるように、本開示の改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、多様な種類のがんを治療するために使用され得る。本明細書に開示される方法で治療することのできるがん（または腫瘍）の非限定的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、胃腸癌、腎癌（例えば、明細胞癌）、卵巣癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、大腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃の癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、及び頭頸部癌（または癌腫）、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫、例えば皮膚または眼球内の悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域のがん、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌、膣癌、外陰部癌、食道癌（例えば、食道胃接合部癌）、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、尿管癌、腎盂癌、腫瘍血管新生、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘導されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源の癌（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶに関連または由来する腫瘍））、及び２つの主な血液細胞系、すなわち、骨髄細胞系（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、及びマスト細胞を産生）またはリンパ細胞系（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び形質細胞を産生）のいずれかに由来する血液悪性疾患、例えば、あらゆる種類の白血病、リンパ腫、及び骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ球性及び／または骨髄性の白血病、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍｌ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３バリアント［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加を伴うＭ４バリアント［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、孤立性顆粒球肉腫、及び緑色腫；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞血液悪性病変、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ１^＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；ならびにリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ系の造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる）、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；骨髄腫、例えば、ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（無症候性骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセルリンパ腫；骨髄系の造血性腫瘍、線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；精上皮腫、奇形腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉由来の腫瘍；ならびに他の腫瘍、例えば、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌及び奇形腫、リンパ系の造血性腫瘍、例えばＴ細胞腫瘍及びＢ細胞腫瘍、例えば、限定するものではないが、小細胞型及び大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）などのＴ細胞障害；Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性のサブタイプ）；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部癌、腎癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄性リンパ腫、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0095】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞で治療することのできるがん（または腫瘍）は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃の癌（胃癌）、胃腸癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、本開示の方法で治療することのできるがん（または腫瘍）は、乳癌である。いくつかの態様において、乳癌は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。いくつかの態様において、治療することのできるがん（または腫瘍）は、脳癌である。特定の態様において、脳癌は、グリア芽細胞腫である。いくつかの態様において、本開示の方法で治療することのできるがん（または腫瘍）は、皮膚癌である。いくつかの態様において、皮膚癌は、基底細胞癌（ＢＣＣ）、皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）、黒色腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、頭頸部癌は、頭頸部扁平上皮癌である。さらなる態様では、肺癌は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）である。いくつかの態様において、食道癌は、食道胃接合部癌である。特定の態様において、腎臓癌は、腎細胞癌である。いくつかの態様において、肝臓癌は、肝細胞癌である。特定の態様において、本開示で治療することのできるがんは、大腸癌、皮膚癌、リンパ腫、肺癌、またはそれらの組み合わせを含む。

【0096】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞は、他の治療剤（例えば、抗がん剤及び／または免疫調節剤）と組み合わせて使用することができる。したがって、特定の態様において、本明細書に開示される腫瘍を治療する方法は、本開示の改変細胞を１以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む。そのような薬剤は、例えば、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害性薬剤、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科手技、放射線手技、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、標準治療による治療（例えば、手術、放射線、及び化学療法）と組み合わせて使用され得る。本明細書に記載される方法は、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を防止することを目的とした療法として使用することもできる。

【0097】

いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、免疫経路の複数の要素を標的とすることができるように、１以上の抗がん剤と組み合わせて使用され得る。そのような組み合わせの非限定的なものとしては、腫瘍抗原提示を向上させる療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）；例えば、ＣＴＬＡ－４及び／またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路の阻害、及び／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞（例えば、骨髄系由来サプレッサー細胞）の枯渇もしくは遮断によって、負の免疫制御を阻害する療法；例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０、及び／またはＣＤ４０もしくはＧＩＴＲ経路を刺激する及び／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストにより、正の免疫制御を刺激する療法；抗腫瘍Ｔ細胞の発生頻度を全身的に増大させる療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を使用して、もしくはｅｘ ｖｉｖｏの抗ＣＤ２５ビーズによる枯渇により、腫瘍中のＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇させるもしくは阻害する療法；腫瘍中のサプレッサー骨髄細胞の機能に影響を及ぼす療法；腫瘍細胞の免疫原性を向上させる療法（例えば、アントラサイクリン）；遺伝子改変細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって改変された細胞（ＣＡＲ－Ｔ療法）を含む、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞の養子移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼ、もしくは一酸化窒素合成酵素などの代謝酵素を阻害する療法；Ｔ細胞のアネルギーもしくは消耗を逆転させる／防止する療法；自然免疫活性化及び／または腫瘍部位の炎症を誘発する療法；免疫刺激サイトカインの投与；免疫抑制サイトカインの遮断；またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0098】

いくつかの態様において、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路によるシグナル伝達を遮断する）。本発明の方法で使用することのできる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。かかる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）；ＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＰＤＲ００１、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＴＳＲ－０４２、ＲＥＧＮ２８１０、ＪＳ００１、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０）、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＩ ７５４０９１、ＳＨＲ－１２１０、及びそれらの組み合わせ）；抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）；ＲＧ７４４６；ＭＰＤＬ３２８０Ａ；ＲＯ５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５９、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、ＬＹ３３０００５４、ＣＸ－０７２（Ｐｒｏｃｌａｉｍ－ＣＸ－０７２）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、及びそれらの組み合わせ）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、トレメリムマブ（チシリムマブ；ＣＰ－６７５，２０６）、ＡＧＥＮ－１８８４、ＡＴＯＲ－１０１５、及びそれらの組み合わせ）が挙げられる。

【0099】

いくつかの態様において、抗がん剤は、免疫チェックポイント活性化因子を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路によるシグナル伝達を促進する）。特定の態様において、免疫チェックポイント活性化因子は、ＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）、ＬＡＧ－３アゴニスト（例えば抗ＬＡＧ－３抗体）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト（例えば、抗ＣＤ１３７抗体）、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。

【0100】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞は、追加の治療剤の投与前または投与後に対象に投与される。他の態様において、改変細胞は、追加の治療剤と同時に対象に投与される。特定の態様において、改変細胞及び追加の治療剤は、薬学的に許容できる担体中の単一の組成物として同時に投与され得る。他の態様において、改変細胞及び追加の治療剤は、別個の組成物として同時に投与される。

【0101】

いくつかの態様において、本開示で治療され得る対象は、ラットまたはマウスなどの非ヒト動物である。いくつかの態様において、治療され得る対象はヒトである。

【0102】

ＩＩｂ．免疫応答を改善する方法
いくつかの態様において、本開示は、対象の免疫応答を改善する方法に関する。特に、本明細書に開示される方法は、対象の、免疫応答の改善（例えば、増大）、例えば、免疫細胞療法、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞または工学操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現細胞の免疫寛容の防止、低減、または阻害のために使用され得る。特定の態様において、免疫応答は抗腫瘍免疫応答である。特定の態様において、免疫応答の改善は、免疫寛容の防止、低減、または阻害を含む。したがって、本明細書では、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答を改善する方法であって、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように細胞を改変することを含む、方法が提供される。いくつかの態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現低減は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答を改善する。いくつかの態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現低減は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の免疫寛容を低減または阻害する。

【0103】

いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞のＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。特定の態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現は、改変後に完全に阻害される。

【0104】

いくつかの態様において、改変された（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変された）ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答は、参照抗腫瘍免疫応答（例えば、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない細胞の抗腫瘍免疫応答）と比較して、少なくとも約少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0105】

ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して測定することができる。例えば、いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答は、同族抗原での刺激を受けた際に細胞が産生するエフェクター分子の量を測定することにより（例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーで）観察され得る。特定の態様において、エフェクター分子は、例えば、腫瘍を治療するのに有用なもののようなサイトカインを含む。エフェクター分子の非限定的な例には、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、グランザイムＢ、パーフォリン、ＭＩＰ－１β、ＣＤ１０７ａ、またはそれらの組み合わせが含まれる。特定の態様において、サイトカインはＩＦＮ－γである。したがって、いくつかの態様において、細胞の抗腫瘍応答の改善は、細胞によって産生されるＩＦＮ－γの量の増大を含む。いくつかの態様において、改変されたＣＡＲ発現細胞または改変されたＴＣＲ発現細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、同族抗原（例えば、腫瘍抗原）で刺激されると、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した量のＩＦＮ－γを産生する。特定の態様において、産生されるＩＦＮ－γの量は、参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0106】

いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答は、同族抗原（例えば、腫瘍抗原）での刺激を受けた際の細胞の増殖能力を評価することによって測定することができる。特定の態様において、改変されたＣＡＲ発現細胞または改変されたＴＣＲ発現細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、刺激を受けた際、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して増大した増殖を呈する。いくつかの態様において、改変されたＣＡＲ発現細胞または改変されたＴＣＲ発現細胞の増殖は、参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0107】

いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答は、細胞表面上の異なる表現型マーカーの発現を（例えば、フローサイトメトリーを使用して）観察することによって評価することができる。例えば、特定の態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答の（すなわち、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させることによる）改善は、細胞における１以上の免疫チェックポイント阻害剤分子（例えば、ＰＤ－１）の発現の低減を含む。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される改変されたＣＡＲ発現細胞または改変されたＴＣＲ発現細胞は、１以上の免疫チェックポイント阻害剤を低下したレベルで発現する。特定の態様において、１以上の免疫チェックポイント阻害剤分子の発現レベルは、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低下する。

【0108】

いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の抗腫瘍免疫応答の改善は、エフェクター活性（例えば、抗腫瘍活性）に関連するマーカーの発現の増大を含む。エフェクター活性に関連するマーカーの非限定的な例としては、Ｋｉ－６７、グランザイムＢ、Ｔ－ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＣＸＣＲ３、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当業者には明らかであるように、いくつかの態様において、エフェクター活性に関連するマーカーは、上述のもの（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２）などのサイトカインであってもよい。特定の態様において、エフェクター活性に関連するマーカーはグランザイムＢである。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変されたＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して高いレベルのグランザイムＢを発現する。特定の態様において、改変されたＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞におけるグランザイムＢの発現レベルは、参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上上昇する。

【0109】

いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させると、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／または反応性窒素種（ＲＮＳ）によって引き起こされるもののような酸化ストレスに対する、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の耐性が増大し得る。いくつかの態様において、酸化ストレス耐性は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0110】

本明細書に記載されるように、細胞の酸化ストレス耐性は、当該技術分野で公知の様々な方法によって測定することができる。いくつかの態様において、酸化ストレス耐性は、細胞が酸化ストレス（例えば、高濃度の活性酸素種）の存在下で機能性及び／または生存能を維持するかどうかを評価することによって観察され得る。特定の態様において、本明細書に開示される改変されたＣＡＲ発現細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下で増殖し得る。いくつかの態様において、本明細書に開示される改変されたＣＡＲ発現細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下で細胞溶解性分子を発現し得る。特定の態様において、細胞溶解性分子はグランザイムＢを含む。さらなる態様では、本開示の改変されたＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下でサイトカインを産生し得る。いくつかの態様において、サイトカインはＩＦＮ－γを含む。いくつかの態様において、活性酸素種は過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含む。特定の態様において、本明細書に開示される改変されたＣＡＲ発現細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下で、（ｉ）増殖し、（ｉｉ）細胞溶解性分子を発現し、かつ（ｉｉｉ）サイトカインを産生し得る。

【0111】

ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させるには、細胞における遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低減させる当該技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。例えば、いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞のＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及びそのコードされるＮｒｆ２タンパク質の発現は、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及びそのコードされるＮｒｆ２タンパク質の発現レベルを低減させることができる遺伝子編集ツールと細胞を接触させることによって低減し得る。遺伝子編集ツールの非限定的な例は本明細書の他の箇所に示す。

【0112】

ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させる上記の方法は、ＣＡＲ発現細胞との関連で提供したものであるが、当業者であれば、本明細書に開示される方法が、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させることが所望される任意の細胞に使用され得ることを認識するであろう。いくつかの態様において、改変され得る（すなわち、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させようとする）細胞は、免疫細胞である。特定の態様において、免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラル（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、リンパ球はＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらなる態様では、リンパ球は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。特定の態様において、ＴＩＬはＣＤ８＋ＴＩＬである。他の態様において、ＴＩＬはＣＤ４＋ＴＩＬである。したがって、いくつかの態様において、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変され得るＣＡＲ発現細胞は、免疫細胞である。特定の態様において、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変され得るＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞）である。いくつかの態様において、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変され得るＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、ＮＫ細胞（すなわち、ＣＡＲ ＮＫ細胞）である。

【0113】

いくつかの態様において、改変しようとする細胞と遺伝子編集ツールの接触は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはそれらの組み合わせで行うことができる。特定の態様において、接触はｉｎ ｖｉｖｏで行われる（例えば、遺伝子療法）。他の態様において、接触はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。さらなる態様では、接触はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。

【0114】

ＩＩｃ．低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を含む細胞
いくつかの態様において、本開示は、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を提供する。特定の態様において、本開示により生成される免疫細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞のＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する。いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現は、完全に阻害される。

【0115】

いくつかの態様において、本開示は、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体の工学操作のための細胞を調製する方法であって、遺伝子編集ツールと細胞を接触させて、細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルを低下させることを含む、方法に関する。本明細書に開示されるように、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現レベルは、様々な方法を使用して低減させることができる。特定の態様において、これらの方法は、本明細書の他の箇所に記載する１以上の遺伝子編集ツールを含む。いくつかの態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及びそのコードされるＮｒｆ２タンパク質の発現は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞において、細胞をｓｈＲＮＡ（例えば、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子に特異的なもの）と接触させることにより低減する。さらなる態様では、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及びそのコードされるＮｒｆ２タンパク質の発現は、細胞をＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）（例えば、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子に特異的なもの）と接触させることにより低減する。

【0116】

いくつかの態様において、遺伝子編集ツールと細胞の接触は、様々な送達経路を含む。一般的に、本明細書に開示される遺伝子編集ツールが、細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させるには、遺伝子編集ツールが細胞に進入し、目的の遺伝子に結合することができなければならない。いくつかの態様において、目的の分子を細胞に送達する当該技術分野で公知の任意の送達ビヒクルを使用することができる。全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０４７，３５５号Ｂ２を参照されたい。使用することのできるベクターに関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供する。

【0117】

いくつかの態様において、キメラ抗原受容体の工学操作のための細胞を調製する方法は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように細胞を改変することをさらに含む。特定の態様において、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように細胞を改変することは、ＣＡＲをコードする核酸配列と細胞を接触させることを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、ベクター（例えば、発現ベクター）から発現される。

【0118】

いくつかの態様において、本明細書に開示される改変細胞で発現され得るＣＡＲまたはＴＣＲは、悪性Ｂ細胞、悪性Ｔ細胞、または悪性形質細胞などの腫瘍細胞で発現される１以上の抗原を標的とする。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分、またはそれらの組み合わせから選択される抗原を標的とし得る。ＣＡＲが結合し得る抗原の他の非限定的な例は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転位限界点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。

【0119】

特定の態様において、本開示の改変細胞は、腫瘍抗原を標的とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。Ｔ細胞受容体は、α鎖及びβ鎖という２つの異なる膜貫通ポリペプチド鎖から構成されたヘテロ二量体であり、これらの鎖は各々、鎖をＴ細胞表面膜内に固定する定常領域と、ＭＨＣが提示する抗原を認識し結合する可変領域からなる。ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γε及びＣＤ３δεの２つのヘテロ二量体、ならびに１つのホモ二量体ＣＤ３ζを形成する６つのポリペプチドに関連しており、これらが一緒になってＣＤ３複合体を形成している。Ｔ細胞受容体工学操作Ｔ細胞療法は、これらの複合体を保持するＴ細胞の改変を利用して、特定の腫瘍細胞によって発現される抗原を特異的に標的とする。

【0120】

いくつかの態様において、改変されたＴＣＲ工学操作細胞は、共通の腫瘍関連抗原（共通ＴＡＡ）及びユニークな腫瘍関連抗原（ユニークＴＡＡ）、または腫瘍特異的抗原という主要なタイプを標的とし得る。前者には、限定するものではないが、がん精巣（ＣＴ）抗原、過剰発現抗原、及び分化抗原が含まれ得、後者には、限定するものではないが、新生抗原及びオンコウイルス抗原が含まれ得る。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６タンパク質及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質は、オンコウイルス抗原の分類に属する。

【0121】

いくつかの態様において、改変されたＴＣＲ工学操作細胞は、ＣＴ抗原、例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９．２３、ＭＡＧＥ－Ａ１０、及びＭＡＧＥ－Ａ１２を含むがこれらに限定されない黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）を標的とし得る。いくつかの態様において、改変されたＴＣＲ工学操作細胞は、黒色腫及び正常なメラノサイトに主に見出される糖タンパク質（ｇｐ１００）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ－１）、及び／またはチロシナーゼを標的とし得る。いくつかの態様において、改変されたＴＣＲ工学操作細胞は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、すなわち、ほとんどの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病、ほとんどすべての種類の固形腫瘍、及び数種の決定組織、例えば心臓組織で高発現する過剰発現抗原の１種を標的とし得る。いくつかの態様において、改変されたＴＣＲ工学操作細胞は、メソテリンを標的とし得、メソテリンは、中皮腫で高発現するが、気管を含む数種の組織の中皮細胞にも存在する別の種類の過剰発現抗原である。

【0122】

いくつかの態様において、改変されたＴＣＲ工学操作細胞は、個々の腫瘍に特異的なランダムな体細胞変異によって形成され得る任意の新生抗原を標的とし得る。

【0123】

いくつかの態様において、本開示の改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞またはＴＣＲ工学操作Ｔ細胞は、腫瘍抗原のうちのいずれの１つを標的としてもよい。改変されたＴＣＲ工学操作細胞が標的とし得る抗原の非限定的な例は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転位限界点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。

【0124】

いくつかの態様において、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように調製され得る細胞は、免疫細胞を含む。特定の態様において、免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、免疫細胞はリンパ球である。特定の態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲを発現するように調製され得る免疫細胞は、Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。特定の態様において、Ｔ細胞はナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）である。さらなる態様では、免疫細胞はＮＫ細胞（ＣＡＲ ＮＫ細胞）である。

【0125】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞はＣＡＲ Ｔ細胞である。特定の態様において、ＣＡＲ Ｔ細胞はモノＣＡＲ Ｔ細胞である。さらなる態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞はゲノム編集されたＣＡＲ Ｔ細胞である。特定の態様において、ＣＡＲ Ｔ細胞はデュアルＣＡＲ Ｔ細胞である。いくつかの態様において、ＣＡＲ Ｔ細胞はタンデムＣＡＲ Ｔ細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞はＣＡＲ ＮＫＴ細胞である。特定の態様において、ＣＡＲ ＮＫＴ細胞はモノＣＡＲ ＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、ＣＡＲ ＮＫＴ細胞はデュアルＣＡＲ ＮＫＴ細胞である。いくつかの態様において、ＣＡＲ ＮＫＴ細胞はタンデムＣＡＲ ＮＫＴ細胞である。かかるＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＡＲ ＮＫＴ細胞の例は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４４１９５号に提供されている。

【0126】

いくつかの態様において、本明細書に開示される遺伝子編集ツールは、遺伝子編集ツールをコードする核酸配列を含むベクターから発現される。特定の態様において、遺伝子編集ツールをコードする核酸配列と、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸配列とは、別々のベクター上にある。さらなる態様では、遺伝子編集ツールをコードする核酸配列と、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸配列とは、同じベクター上にある。

【0127】

本明細書に記載されるように、本明細書に開示される方法によって生成されたＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、改善した特性を呈し得る。例えば、特定の態様において、本明細書において生成されるＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていないＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞）と比較して高いエフェクター活性を呈し得る。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞（すなわち、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するもの）は、同族抗原（例えば、腫瘍抗原）などの抗原で刺激されると、増大した量のＩＦＮ－γを産生する。いくつかの態様において、産生されるＩＦＮ－γの量は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていないＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増大する。

【0128】

いくつかの態様において、本開示のＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、参照細胞（例えば、比較的低いレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されていないＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞）と比較して増大した酸化ストレス耐性を呈する。特定の態様において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下で増殖し得る。さらなる態様では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下で細胞溶解性分子を発現し得る。特定の態様において、細胞溶解性分子はグランザイムＢを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法によって生成されたＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、高濃度の活性酸素種の存在下でサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）を産生し得る。いくつかの態様において、活性酸素種は過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を含む。

【0129】

ＩＩｄ．遺伝子編集ツール
本開示の細胞を改変するには、１以上の遺伝子編集ツールを使用することができる。遺伝子編集ツールの非限定的な例を下記に開示する。

【0130】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
いくつかの態様において、本開示で使用することのできる遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。そのようなシステムは、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いることができ、これは場合により、それを発現させようとする所望の細胞型（例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞）に合わせてコドン最適化されている。そのようなシステムは、２つの別個の分子を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いることもできる。特定の態様において、２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化因子ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「スキャフォールド」）分子とを含む。

【0131】

ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖の半分を形成する一続きのヌクレオチドの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成する一続きのヌクレオチドを含む。したがって、ｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドに相補的であり、これとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡに対応するｔｒａｃｒＲＮＡがあるといえる。ｃｒＲＮＡはさらに、一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントをもたらす。したがって、ｇＲＮＡは、標的配列（例えば、Ｎｒｆ２ ｍＲＮＡ）とハイブリダイズする配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。したがって、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは（対応するペアとして）ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。細胞内での改変のために使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列及び／または長さは、ＲＮＡ分子が使用される種（例えば、ヒト）に特異的であるように設計され得る。

【0132】

３つの要素（Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡ）をコードする天然に存在する遺伝子は、典型的には、オペロン（複数可）として構築される。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、Ｃａｓ９システム及び生物によって異なるが、多くの場合、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つの直列反復配列（ＤＲ）が隣接する２１～７２ヌクレオチド長のターゲティングセグメントを含む（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、ターゲティングセグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、対応するｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、次いでＣａｓ９タンパク質に結合する。

【0133】

あるいは、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムはさらに、コドン最適化されたＣａｓ９と共に機能する融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物（すなわち、単一の転写物）を用いることができる。この１つのＲＮＡはしばしば、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと称される。ｇＲＮＡの中で、ｃｒＲＮＡ部分は所与の認識部位の「標的配列」と識別され、ｔｒａｃｒＲＮＡは多くの場合「スキャフォールド」と称される。簡潔に述べると、標的配列を含む短いＤＮＡ断片が、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（いくつかの態様ではおおよそ２０ヌクレオチド）、ある形態のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（スキャフォールド）、ならびに細胞内で活性な好適なプロモーター、及び真核細胞内での適切なプロセシングに必要な要素を含む。これらのシステムの多くは、アニールして二本鎖ＤＮＡを形成し、次いでｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングされる特別な相補的オリゴに依存する。

【0134】

次いで、ｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットが細胞に導入される。例えば、Ｍａｌｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８２３－６、Ｊｉｎｅｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－２１、Ｈｗａｎｇ Ｗ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２２７－９、Ｊｉａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２３３－９、及びＣｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８１９－２３を参照されたい。これらは各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１、ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１、ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１、ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２、ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２、及びＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１を参照されたい。これらは各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0135】

いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で提供され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡとの複合体の形態で提供され得る。他の態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で提供され得る。他の態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子、またはそれぞれｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子の形態で提供され得る。

【0136】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸配列を含む。特定の態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型Ｃａｓタンパク質である。さらなる態様では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。特定の態様において、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、ＩＩ型Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９は、ヒトコドン最適化Ｃａｓである。

【0137】

いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両鎖を切断することなく標的核酸配列内に一本鎖切断（すなわち「ニック」）を作ることができる「ニッカーゼ」である。例えばＣａｓ９は、反対のＤＮＡ鎖の切断を担う２つのヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン）を含む。これらのドメインのいずれかに変異があるとニッカーゼが生じ得る。ニッカーゼを生じる変異の例は、例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１及びＷＯ／２０１３／１４２５７８Ａ１に見出すことができ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。

【0138】

特定の態様において、ｄｓＤＮＡの各鎖の標的部位に特異的な２つの別個のＣａｓタンパク質（例えば、ニッカーゼ）は、別の核酸または同じ核酸上の別個の領域上のオーバーハンギング配列に相補的なオーバーハンギング配列を作ることができる。ｄｓＤＮＡの両鎖上の標的部位に特異的な２つのニッカーゼと核酸を接触させることによって作られるオーバーハンギング末端は、５’または３’のいずれのオーバーハンギング末端であってもよい。例えば、第１のニッカーゼが、ｄｓＤＮＡの第１の鎖に一本鎖切断を作り、第２のニッカーゼが、ｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を作ることにより、オーバーハンギング配列を作ることができる。一本鎖切断を作る各ニッカーゼの標的部位は、作られるオーバーハンギング末端配列が、異なる核酸分子上のオーバーハンギング末端配列に相補的となるように選択することができる。２つの異なる核酸分子の相補的なオーバーハンギング末端は、本明細書に開示される方法によってアニールすることができる。いくつかの態様において、第１の鎖上のニッカーゼの標的部位は、第２の鎖上のニッカーゼの標的部位とは異なる。

【0139】

ＴＡＬＥＮ
いくつかの態様において、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を編集する（例えば、低減または阻害する）ために使用することのできる遺伝子編集ツールは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのヌクレアーゼ剤である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノムの特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに、ネイティブ型もしくは工学操作型の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能性部分を融合することによって作られる。

【0140】

ユニークなモジュラー型ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、潜在的に任意のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように工学操作し、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３－１４８を参照されたい。これらはすべて、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0141】

好適なＴＡＬヌクレアーゼ、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製する方法の非限定的な例は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５号Ａ１、同第２０１１／０２６９２３４号Ａ１、同第２０１１／０１４５９４０号Ａ１、同第２００３／０２３２４１０号Ａ１、同第２００５／０２０８４８９号Ａ１、同第２００５／００２６１５７号Ａ１、同第２００５／００６４４７４号Ａ１、同第２００６／０１８８９８７号Ａ１、及び同第２００６／００６３２３１号Ａ１（各々参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0142】

様々な態様において、例えば、目的のゲノム遺伝子座にある標的核酸配列またはその近くを切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが工学操作され、ここで標的核酸配列は、ターゲティングベクターによって改変しようとする配列またはその近くにある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物で使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼとしては、本明細書に記載されるターゲティングベクターによって改変しようとする標的核酸配列またはその近くに結合するように特別に設計されたものが挙げられる。

【0143】

いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮの各単量体は、１２～２５個のＴＡＬリピートを含み、各ＴＡＬリピートは、１ｂｐサブサイトに結合する。特定の態様において、ヌクレアーゼ剤は、独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。さらなる態様では、独立したヌクレアーゼはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐ～約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、標的配列において二本鎖切断を行う。

【0144】

いくつかの態様において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、５ｂｐまたは６ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、二本鎖切断を行う。

【0145】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
いくつかの態様において、本開示において有用な遺伝子編集ツールは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムなどのヌクレアーゼ剤を含む。ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」、または「ＺＦＰ」は、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列（例えば、ＮＦＥ２Ｌ２）に結合することにより、酵素ドメインの活性を配列の近傍に指向し、したがって、標的配列近傍の内因性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にすべての所望の配列に結合するように工学操作することができる。本明細書に開示されるように、いくつかの態様において、ジンクフィンガードメインは、Ｎｒｆ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合する。したがって、切断または組換えが所望される標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表１に挙げた標的遺伝子中の標的遺伝子座）を同定した後、１以上のジンクフィンガー結合ドメインを、標的遺伝子座内の１以上の標的ＤＮＡ配列に結合するように工学操作することができる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質を細胞で発現させると、標的遺伝子座の改変がもたらされる。

【0146】

いくつかの態様において、ジンクフィンガー結合ドメインは、１以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂｒｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号。典型的には、１つのジンクフィンガードメインは約３０アミノ酸長である。個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１つのヌクレオチドが重複してもよい４ヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように工学操作される配列（例えば、標的配列）の長さが、工学操作されたジンクフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガーの数を決定する。例えば、重複するサブサイトにフィンガーモチーフが結合しないＺＦＰでは、６ヌクレオチド標的配列には２フィンガー結合ドメインが結合し、９ヌクレオチド標的配列には３フィンガー結合ドメインが結合する、などということである。標的部位における個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわち、サブサイト）は、隣接している必要はなく、複数フィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さ及び性質に応じて、１つまたは数個のヌクレオチドによって分離していてもよい。いくつかの態様において、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、３～６個の個々のジンクフィンガーリピートを含み、各々が９～１８個の塩基対を認識し得る。

【0147】

ジンクフィンガー結合ドメインは、最適な配列に結合するように工学操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照されたい。工学操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。工学操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。

【0148】

ジンクフィンガードメインが結合する標的ＤＮＡ配列の選択は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って行うことができる。当業者には、ヌクレオチド配列の単純な目視検査を標的ＤＮＡ配列の選択に使用してもよいことが明らかであろう。したがって、本明細書に記載される方法では、任意の手段を標的ＤＮＡ配列の選択に使用することができる。標的部位は通常少なくとも９ヌクレオチド長を有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインが結合する。しかしながら、例えば、４フィンガー結合ドメインの１２ヌクレオチド標的部位への結合、５フィンガー結合ドメインの１５ヌクレオチド標的部位への結合、または６フィンガー結合ドメインの１８ヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明らかであるように、より大きな結合ドメイン（例えば、７フィンガー、８フィンガー、９フィンガー及びそれ以上）の、より長い標的部位への結合も可能である。

【0149】

ジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。酵素ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１以上を切断ドメイン源として使用することができる。

【0150】

本明細書に記載されるＺＦＰの酵素ドメインとして使用するのに好適な例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合し、かつ結合部位またはその近くでＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９個目のヌクレオチド、かつ他方の鎖上のその認識部位から１３個目のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。したがって、いくつかの態様において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素の酵素ドメイン、及び１以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。

【0151】

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用して標的化された二本鎖ＤＮＡ切断を行うには、各々がＦｏｋＩ酵素ドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性のある切断ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む１つのポリペプチド分子を使用してもよい。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。

【0152】

メガヌクレアーゼ
いくつかの態様において、細胞におけるＮｒｆ２発現を制御するために使用することのできる遺伝子編集ツールは、メガヌクレアーゼシステムなどのヌクレアーゼ剤を含む。メガヌクレアーゼは、保存的配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、このファミリーは「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ－ＹＩＧ」、「Ｈ－Ｎ－Ｈ」、及び「Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス」の各ファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。

【0153】

ＨＥアーゼは、認識部位が長く、ＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型を許容することが注目に値する。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、及び機能は公知である。例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９－２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０－９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４－２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９－９５、及びＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照されたい。

【0154】

いくつかの例では、天然に存在するバリアント、及び／または工学操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／または認識部位特異性を改変する方法、ならびに活性のスクリーニングは公知である。例えば、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２－６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３－１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０－９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１－４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１－８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、ＷＯ２００５１０５９８９、ＷＯ２００３０７８６１９、ＷＯ２００６０９７８５４、ＷＯ２００６０９７８５３、ＷＯ２００６０９７７８４、及びＷＯ２００４０３１３４６を参照されたい。これらは各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0155】

本明細書では、限定するものではないが、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｅｃＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、またはそれらの任意の活性バリアントもしくは断片を含め、任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。

【0156】

いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、ゲノム内の１つの完全にマッチする標的配列を認識する。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ホーミングヌクレアーゼは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼである。いくつかの態様において、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－Ｄｍｏｌ、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0157】

制限エンドヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本開示において有用な遺伝子編集ツールには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型のエンドヌクレアーゼを含め、制限エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ剤が含まれる。Ｉ型及びＩＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識部位を認識するが、通常、ヌクレアーゼ結合部位からの様々な位置で切断し、これは、結合部位（認識部位）から数百塩基対離れている場合がある。ＩＩ型システムでは、制限活性はメチラーゼ活性とは無関係であり、通常、切断は結合部位内またはその近くの特定の部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素はパリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は非パリンドローム認識部位を認識し、認識部位の外側を切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両方の部位で二重に配列を切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称の認識部位を認識し、認識部位から約１～２０ヌクレオチドの定義された距離で一方の側で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えばＲＥＢＡＳＥデータベース（ウェブページはｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：４１８－２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：１８０５－１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１－７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）において、さらに記載及び分類されている。

【0158】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、当該技術分野で公知の任意の手段によって細胞に導入することができる。特定の態様において、特定の遺伝子編集ツールをコードするポリペプチドを細胞に直接導入してもよい。あるいは、遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入してもよい。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するとき、遺伝子編集ツールは、細胞内で一過性に、条件的に、または構成的に発現させてもよい。したがって、遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結していてもよい。あるいは、遺伝子編集ツールは、遺伝子編集ツールをコードする、または遺伝子編集ツールを含むｍＲＮＡとして、細胞に導入される。

【0159】

ＲＮＡｉ
いくつかの態様において、細胞におけるＮｒｆ２の発現を低減させるために使用することのできる遺伝子編集ツールは、ＲＮＡ干渉分子（「ＲＮＡｉ」）を含む。本明細書で使用する場合、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子サイレンシング経路による標的ｍＲＮＡの分解によって内因性標的遺伝子産物の発現減少を媒介するＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））である。ＲＮＡｉ剤の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」ともいう）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0160】

いくつかの態様において、本開示において有用な遺伝子編集ツールは、１以上のｍｉＲＮＡを含む。「ｍｉＲＮＡ」とは、約２１～２５ヌクレオチド長の天然に存在する小さな非コードＲＮＡ分子を意味する。いくつかの態様において、本開示において有用なｍｉＲＮＡは、Ｎｒｆ２ ｍＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制、ｍＲＮＡの切断、及び／または脱アデニル化によって、内因性標的遺伝子産物（すなわち、Ｎｒｆ２タンパク質）の発現を下方制御する（例えば減少させる）ことができる。

【0161】

いくつかの態様において、本開示で使用することのできる遺伝子編集ツールは、１以上のｓｈＲＮＡを含む。「ｓｈＲＮＡ」（または「低分子ヘアピンＲＮＡ」分子）とは、二本鎖領域及びループ領域を一端に含みヘアピンループを形成するＲＮＡ配列を意味し、これを使用して、遺伝子発現を低減させる及び／またはサイレンシングすることができる。二本鎖領域は通常、ステムの各側で約１９ヌクレオチド～約２９ヌクレオチド長であり、ループ領域は通常、約３～約１０ヌクレオチド長である（３’末端または５’末端の一本鎖オーバーハンギングヌクレオチドは任意選択による）。ｓｈＲＮＡをプラスミドまたは非複製的組換えウイルスベクターにクローニングして細胞内に導入すると、ｓｈＲＮＡコード配列をゲノムに組み込むことができる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内因性標的遺伝子（すなわち、Ｎｒｆ２）翻訳及び発現の安定かつ一貫した抑制をもたらし得る。

【0162】

いくつかの態様において、本明細書に開示される遺伝子編集ツールは、１以上のｓｉＲＮＡを含む。「ｓｉＲＮＡ」とは、通常約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多タンパク質複合体と会合し、その間に「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。次いで、活性化されたＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が配列相同性のためにＲＩＳＣを対応するｍＲＮＡに誘導し、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡ（すなわち、Ｎｒｆ２ ｍＲＮＡ）を切断して、特異的な遺伝子サイレンシングが生じる。特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長であり、２塩基のオーバーハングをその３’末端に有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞及び／または培養系に導入して標的ｍＲＮＡ配列（すなわち、Ｎｒｆ２ ｍＲＮＡ）を分解させることができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれるＦｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１９，１９９８ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，２０２，８４６号、及び同第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。

【0163】

アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、細胞におけるＮｒｆ２の発現を低減させるために使用することのできる遺伝子編集ツールは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用する場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」とは、標的核酸と、特に標的核酸上の連続配列とハイブリダイズすることにより、標的遺伝子（すなわち、Ｎｒｆ２）の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。

【0164】

いくつかの態様において、本開示において有用なＡＳＯは一本鎖である。本開示の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の度合いがオリゴヌクレオチドの全長にわたっておよそ５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができると理解される。いくつかの態様において、本開示において有用なＡＳＯは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを１以上含み得る。ＡＳＯに行うことのできる追加の修飾（例えば、Ｎｒｆ２発現を阻害または低減させるために使用することのできるもの）は、例えば、米国公開第２０１９／０２７５１４８号Ａ１に提示されている。

【0165】

いくつかの態様において、ＡＳＯがヌクレアーゼ、例えば、ＲＮアーゼＨ１などのＲＮアーゼＨを動員することができる場合、ＡＳＯは、Ｎｒｆ２転写物（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレアーゼによる分解を介して、Ｎｒｆ２タンパク質の発現を低減させることができる。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を加水分解する遍在性酵素である。したがって、特定の態様において、標的配列（例えば、Ｎｒｆ２ ｍＲＮＡ）に結合すると、ＡＳＯはＮｒｆ２ ｍＲＮＡの分解を誘導し、それによってＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させることができる。

【0166】

いくつかの態様において、ＡＳＯは、１以上のモルホリノを含む。本明細書で使用される「モルホリノ」とは、標準的な核酸塩基がモルホリン環に結合し、ホスホロジアミデート結合を介して連結している、改変された核酸オリゴマーを意味する。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは相補的ｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、相補的ｍＲＮＡ配列を標的として分解させるのではなく、ｍＲＮＡ翻訳の立体阻害及びｍＲＮＡスプライシングの変化によって機能する。

【0167】

本明細書に開示されるように、遺伝子編集ツールの上記の例は限定を意図するものではなく、当該技術分野で利用可能な任意の遺伝子編集ツールを使用して、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減または阻害することができる。

【0168】

ＩＩＩ．核酸及びベクター
本明細書に記載されるさらなる態様は、細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させる遺伝子編集ツールを含む、及び／または本開示の改変細胞で発現され得るキメラ抗原受容体もしくはＴ細胞受容体をコードする、１以上の核酸分子に関する。核酸は、全細胞に、細胞溶解物に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、天然に単離ＤＮＡに連結している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知の他の技術を含む標準的技術によって精製されている場合、「単離されている」または「実質的に純粋になっている」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本明細書に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。特定の態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。本明細書に記載される核酸は、当該技術分野で公知の標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。

【0169】

いくつかの態様において、本開示は、細胞におけるＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質の発現を低減させる遺伝子編集ツールを含む、及び／または本開示の改変細胞で発現され得るキメラ抗原受容体もしくはＴ細胞受容体をコードする、単離された核酸分子を含む、ベクターを提供する。本明細書に記載されるように、かかるベクターは、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を改変するために使用することができ、かかる改変細胞は、がんなどの疾患または障害を治療するために使用することができる。

【0170】

本開示で好適なベクターには、発現ベクター、ウイルスベクター、及びプラスミドベクターが含まれる。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。

【0171】

本明細書で使用する場合、発現ベクターとは、適切な宿主細胞に導入したときに、挿入されるコード配列の転写及び翻訳のために必要な要素、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製及び翻訳に必要な要素を含む、任意の核酸構築物を意味する。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの誘導体を含み得る。

【0172】

本明細書で使用する場合、ウイルスベクターは、限定するものではないが、次のウイルス：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；レンチウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来する核酸配列を含む。当該技術分野で周知の他のベクターも容易に用いることができる。特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子に置き換えられている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスにはレトロウイルスが含まれ、レトロウイルスのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含み、その後、宿主細胞ＤＮＡにプロウイルスが組込まれる。

【0173】

いくつかの態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルスに由来する。他の態様において、ベクターはレンチウイルスに由来する。レンチウイルスベクターの例は、ＷＯ９９３１２５１、ＷＯ９７１２６２２、ＷＯ９８１７８１５、ＷＯ９８１７８１６、及びＷＯ９８１８９３４に開示されており、これらは各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0174】

他のベクターにはプラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは当該技術分野で広く報告されており、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい。過去数年間において、プラスミドベクターは、宿主ゲノム内で複製して宿主ゲノム内に組み込まれることがないため、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を細胞に送達するのに特に有利であることが見出されている。しかしながら、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。商業的供給者から入手可能ないくつかの一般的に使用されているプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様々なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが含まれる。特定のプラスミドのさらなる例としては、ｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０；及びｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０が挙げられ、これらはすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）によるものである。他のプラスミドも当業者には周知である。さらに、プラスミドは、特定のＤＮＡ断片を除去及び／または付加するように、標準的な分子生物学技術を使用してカスタム設計することができる。

【0175】

ＩＶ．医薬組成物
本明細書では、低下したレベルのＮＦＥ２Ｌ２遺伝子及び／またはＮｒｆ２タンパク質を発現するように改変されている細胞（例えば、本明細書に記載される細胞など）、及び薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤を含む組成物がさらに提供される。本明細書に記載されるように、かかる医薬組成物は、がんを防止及び／または治療するために使用され得る。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、本明細書に開示される医薬組成物に存在する改変細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＴ細胞）またはＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＮＫ細胞）などの免疫細胞である。

【0176】

許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノールアルコール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、もしくはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

【0177】

医薬組成物は、対象に対するあらゆる投与経路用に配合され得る。投与経路の特定例としては、筋肉内、皮下、点眼、静脈内、腹腔内、皮内、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、心室内、髄腔内、大槽内、嚢内、または腫瘍内が挙げられる。皮下、筋肉内、または静脈内のいずれかの注射を特徴とする非経口投与も、本明細書では想定される。注射物は、液体の溶液もしくは懸濁液、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁液に好適な固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。注射物、溶液、及びエマルジョンはまた、１以上の賦形剤を含む。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。さらに、所望の場合、投与される医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度向上剤、及び他のかかる薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、及びシクロデキストリンなどを含んでもよい。

【0178】

非経口調製物で使用される薬学的に許容できる担体には、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、バッファー、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容できる物質が含まれる。水性ビヒクルの例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース、及び乳酸加リンゲル注射液が含まれる。非水性非経口ビヒクルとしては、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、及びピーナッツ油が挙げられる。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、ベンザルコニウムクロリド、及びベンゼトニウムクロリドを含む複数用量容器に包装される非経口調製物に、静菌性または静真菌性の濃度の抗微生物剤を加えてもよい。等張剤は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。バッファーは、リン酸塩及びクエン酸塩を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、塩酸プロカインを含む。懸濁剤及び分散剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を含む。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤は、ＥＤＴＡを含む。薬学的担体は、水混和性ビヒクル用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸も含む。

【0179】

非経口投与用の調製物は、そのまま注射できる無菌溶液、使用直前に溶媒と組み合わされる無菌の乾燥した可溶性製品、例えば凍結乾燥粉末を含み、皮下錠剤、そのまま注射できる無菌懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わされる無菌の乾燥した不溶性製品、及び無菌エマルジョンを含む。溶液は、水性または非水性のいずれであってもよい。

【0180】

静脈内投与される場合、好適な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤及び可溶化剤（グルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール、ならびにこれらの混合物など）を含む溶液が含まれる。

【0181】

本明細書に提供される医薬組成物は、特定の組織、受容体、または治療される対象の身体の他の領域を標的とするように配合されてもよい。そのような標的化方法の多くが当業者に周知である。本明細書では、そのような標的化方法のすべてが本発明の組成物の使用において想定される。標的化方法の非限定的な例については、例えば、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３１６，６５２号、同第６，２７４，５５２号、同第６，２７１，３５９号、同第６，２５３，８７２号、同第６，１３９，８６５号、同第６，１３１，５７０号、同第６，１２０，７５１号、同第６，０７１，４９５号、同第６，０６０，０８２号、同第６，０４８，７３６号、同第６，０３９，９７５号、同第６，００４，５３４号、同第５，９８５，３０７号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９００，２５２号、同第５，８４０，６７４号、同第５，７５９，５４２号、及び同第５，７０９，８７４号を参照されたい。

【0182】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される組成物は、滅菌されていてもよい。これは、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に行われる。

【0183】

本出願で引用されるすべての参考文献、特許、または出願は、米国か外国かを問わず、全体として本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。何らかの矛盾が生じた場合、本明細書に文章で開示される内容が優先する。

【実施例】

【0184】

以下、実施例を参照して本開示を詳細に説明する。記載される実施例は、本開示を単に例示することを目的とするものであり、限定するものではないことを理解されたい。

【0185】

実施例１。腫瘍浸潤Ｔ細胞におけるＮｒｆ２ ｍＲＮＡ発現レベルの決定
腫瘍浸潤Ｔ細胞における核因子Ｅ２因子関連因子２（Ｎｒｆ２）ｍＲＮＡ発現のレベルを決定した。Ｎｒｆ２は、酸化ストレスによる損傷から細胞を保護するのに重要な役割を果たす。Ｎｒｆ２と酸化ストレスとの間の関係をよりよく理解するために、既知の酸化ストレス誘導因子である過酸化水素を様々な濃度で用いてＴ細胞を処置した。図１に示すように、酸化ストレスが増大すると（すなわち、Ｈ２Ｏ２の濃度が高いと）、Ｔ細胞は、より高いレベルのＮｒｆ２ ｍＲＮＡを発現した。［００１８］ほぼすべてのがんが、高い酸化ストレスに関連している。この現象をよりよく理解するために、担腫瘍マウスの腫瘍及び／または異なるリンパ節からＴ細胞を単離した。対照として、健康なマウスのリンパ節からもＴ細胞を単離した。図２に示すように、腫瘍浸潤Ｔ細胞におけるＮｒｆ２ ｍＲＮＡ発現のレベルは、担腫瘍マウスの流入領域リンパ節（ｄＬＮ）またはいずれの他のリンパ節のＴ細胞の場合と比較しても、きわめて高かった。この結果は、腫瘍浸潤Ｔリンパ球におけるＮｒｆ２発現の選択性を示す。

【0186】

実施例２。Ｎｒｆ２発現の調節と共に変化した抗がん反応の決定
Ｎｒｆ２発現の調節が抗腫瘍免疫応答にどのように影響し得るかについて理解し始めるために、Ｎｒｆ２欠失マウスを調製し、Ｎｒｆ２発現の調節と共に変化したＴ細胞媒介性抗がん反応をｉｎ ｖｉｖｏで決定した。

【0187】

２－１。がん細胞増殖を阻害する能力の決定
がん細胞増殖を阻害する能力を、Ｎｒｆ２発現の調節における変化と併せて決定するために、がん細胞をＮｒｆ２欠失マウス及び野生型マウスに注射し、次いで腫瘍体積を測定した。具体的には、黒色腫（Ｂ１６）細胞をＮｒｆ２欠失マウス及び野生型マウスに注射し、次いで、腫瘍播種後の様々な時点で腫瘍体積を測定することにより、がん細胞の増殖を観察した。結果を図３及び４に示す。

【0188】

図３及び４に示すように、黒色腫細胞の注射後、がん細胞増殖を阻害する著しい効果がＮｒｆ２欠失マウスで観察された。例えば、腫瘍播種後約１９日目までに、野生型とＮｒｆ２－／－動物との間で腫瘍体積に有意差が認められた。

【0189】

観察された抗腫瘍効果が黒色腫に特有でないことを裏付けるために、リンパ腫細胞をＮｒｆ２欠失マウス及び野生型マウスに注射し、次いで、腫瘍播種後の様々な時点で腫瘍体積を測定することにより、がん細胞の増殖を再度観察した。結果を図５及び６に示す。

【0190】

図５及び６に示すように、リンパ腫細胞の注射後、がん細胞増殖を阻害する著しい効果がＮｒｆ２欠失マウスで観察され、腫瘍体積が大幅に減少していた。

【0191】

２－２。がん細胞転移を阻害する能力の決定
次に、がん細胞転移を阻害する能力を、Ｎｒｆ２発現の調節における変化と併せて決定するために、肺癌細胞をＮｒｆ２欠失マウス及び野生型マウスに（静脈内）注射し、次いで、がん細胞転移を観察した。結果を図７に示す。

【0192】

図７に示すように、肺癌細胞の注射後、野生型動物の肺では顕著な腫瘍成長が観察され、投与された腫瘍細胞が肺組織に広がったことが示された。これに対し、Ｎｒｆ２欠失マウスでは、がん細胞転移を阻害する著しい効果が観察された。

【0193】

上記の結果は、がんの治療においてＮｒｆ２発現を低減させることの潜在的利益を示唆している。

【0194】

実施例３。Ｎｒｆ２発現の調節と共に変化したＴ細胞媒介性抗がん反応の決定
３－１。Ｔ細胞媒介性抗がん反応の決定
Ｎｒｆ２欠失マウスは、様々ながん細胞に対して強い抗がん反応をもたらす。このことは、上述の実施例２において裏付けられた。上述の現象がＴ細胞媒介性抗がん反応かどうかを決定するために、Ｎｒｆ２欠失マウス及び野生型マウスがＴ細胞欠損状態になるような処置を行った。具体的には、抗ＣＤ３抗体を投与してＴ細胞を枯渇させた。担腫瘍の野生型動物及びＮｒｆ２欠失動物の両方の動物数体に、抗ＣＤ３抗体を与えた（対照動物にはＩｇＧ対照抗体を与えた）。次いで、腫瘍播種後の様々な時点で腫瘍体積と腫瘍重量の両方を測定することにより、がん細胞増殖を観察した。結果を図８Ａ及び８Ｂに示す。

【0195】

図８Ａ及び８Ｂに示すように、Ｎｒｆ２欠失マウスがＴ細胞欠損状態にあったとき、マウスにおけるがん細胞増殖を阻害する効果は消失していた。上述の結果は、Ｎｒｆ２欠損時の抗がん反応とＴ細胞との間の密接な関係を裏付けた。

【0196】

Ｎｒｆ２欠失動物において観察された抗腫瘍免疫応答の向上がＴ細胞媒介性であることをさらに裏付けるために、担腫瘍の野生型動物とＮｒｆ２欠失動物の両方において、抗Ｂ２２０抗体を使用してＢ細胞を枯渇させた。図９Ａ及び９Ｂに示すように、Ｂ細胞の枯渇は、抗腫瘍免疫応答に影響を及ぼさなかった。Ｎｒｆ２欠失動物では、腫瘍体積と腫瘍重量の両方が、抗Ｂ２２０抗体を与えた動物と対照ＩｇＧ抗体を与えた動物の両方で同等であった。

【0197】

上記の結果は、Ｎｒｆ２欠失動物で観察された抗腫瘍免疫応答が主にＴ細胞によって媒介されたことを裏付ける。

【0198】

３－２。Ｎｒｆ２発現の変化と併せたがん毒性ＣＤ８ Ｔ細胞活性化レベルの決定
Ｎｒｆ２の欠失がどのようにＴ細胞機能に影響するかを理解するために、Ｎｒｆ２発現の変化と併せて変化したがん毒性ＣＤ８ Ｔ細胞活性化レベルを観察し、それにより、がん毒性ＣＤ８ Ｔ細胞活性化レベルと抗がん反応との間の関係を裏付けた。具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、担腫瘍の野生型動物及びＮｒｆ２欠失動物から単離した。細胞は、腫瘍（すなわち、ＴＩＬ）または流入領域リンパ節のいずれかから単離した。次いで、Ｔ細胞のＴＣＲ刺激を行い、産生されたＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７の量を測定した。結果を図１０に示す。

【0199】

図１０に示すように、Ｎｒｆ２欠失マウスでは、がん細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮγの量の著しい増大が観察された。ＣＤ４＋Ｔ細胞において有意差は観察されなかった。ＩＦＮ－γ産生の増大は、流入領域リンパ節及び腫瘍から単離された両方のＣＤ８＋Ｔ細胞で観察された。しかしながら、この差はＣＤ８＋ＴＩＬではより一層劇的であった。上記の結果は、Ｔ細胞の応答性及び活性に逆方向に、かつ深く干渉するＮｒｆ２の能力を裏付けた。

【0200】

３－３。ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるがん毒性ＣＤ８ Ｔ細胞の抗がん効能の決定
上述の実施例で得られた３－１及び３－２の結果に基づき、ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおけるがん毒性ＣＤ８ Ｔ細胞の抗がん効能を決定した。具体的には、Ｎｒｆ２発現欠損処理を施したＯＶＡ抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ細胞）を、がん細胞が移植されたマウスに注射し（ＯＶＡ抗原を発現させるため）、次いで、がん細胞阻害の効果を観察した。対照として、野生型動物及びＮｒｆ２＋／－動物のＴ細胞を単離し、野生型の担腫瘍動物に投与した。結果を図１１に示す。

【0201】

図１１に示すように、Ｎｒｆ２欠失特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ細胞）を注射したマウスでは、著しいがん細胞阻害効果が観察された。Ｎｒｆ２＋／－動物のＴ細胞を養子移入に使用すると、中等度の効果が観察された。上述の結果は、Ｎｒｆ２発現が、がん細胞増殖の阻害における反作用（逆干渉）を行い、ＣＤ８ Ｔ細胞の応答性を減少させ得ることを裏付けた。

【0202】

実施例４：Ｎｒｆ２発現と抗腫瘍免疫応答との間の関係のさらなる解析
上記実施例で観察された結果をさらに裏付けるため、ＭＣ３８（大腸）腫瘍細胞を次の動物に投与した：（ｉ）野生型、（ｉｉ）Ｎｒｆ２欠失、及び（ｉｉｉ）Ｎｒｆ２を過剰発現するトランスジェニックマウス（「Ｎｒｆ２Ｔｇ」）。次いで、先行実施例に記載したように、腫瘍播種後の様々な時点で腫瘍体積を測定することにより、各群における抗腫瘍免疫応答を観察した。

【0203】

図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、Ｎｒｆ２発現の欠失は、大腸腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫応答も改善させた。この結果は、Ｎｒｆ２発現の低減には、多くの異なる種類のがんに対する治療的有用性があり得ることをさらに裏付ける。さらに、上記データは、腫瘍を治療するＴ細胞の能力がＮｒｆ２発現に反比例することを示唆している。例えば、Ｎｒｆ２トランスジェニック動物では、腫瘍体積が野生型動物と比べてさらに大きかった。

【0204】

実施例５：Ｎｒｆ２欠失Ｔ細胞の酸化ストレス耐性の解析
Ｎｒｆ２欠失動物のＴ細胞がより効果的な抗腫瘍免疫応答を開始し得る潜在的機構を同定するために、野生型動物、Ｎｒｆ２トランスジェニック動物、及びＮｒｆ２欠失動物のＴ細胞がＴＣＲ刺激を受けた際にＩＦＮ－γ及びグランザイムＢを産生する能力を、過酸化水素の存在下と非存在下の両方で測定した。

【0205】

図１４Ａ～１４Ｄに示すように、Ｎｒｆ２欠失動物のＴ細胞のみが、過酸化水素の存在下でＩＦＮ－γ及びグランザイムＢを産生することができた。この結果は、Ｎｒｆ２欠失動物のＴ細胞が多くの種類のがんにおいて機能性を維持し、誘導される酸化ストレスに対する耐性が高いことを示唆している。

【0206】

実施例６：Ｎｒｆ２発現が低減したＣＡＲ Ｔ細胞の構築
上記の結果は、がんを治療するためにＮｒｆ２欠失Ｔ細胞を使用することの潜在的利益を裏付ける。このような免疫療法の開発を追求して、Ｎｒｆ２発現が低減したＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を構築した。図１５Ａは、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために使用した構築物の概略図である。図１５Ｂは、図１５Ａに提示する構築物を使用してＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞が生成され、Ｎｒｆ２ ｍＲＮＡ発現が約５０％低減したことを提示する。図１５Ｃに示すように、５０％の低減だけでも、ＣＡＲ Ｔ細胞は酸化ストレス耐性の改善を呈した。正常レベルのＮｒｆ２を発現した対照ＣＡＲ Ｔ細胞と比較すると、Ｎｒｆ２発現が低減したＣＡＲ Ｔ細胞は、著しく高い割合で、過酸化水素の存在下でＩＦＮ－γを産生した。

【0207】

次に、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）においてＮｒｆ２発現を低減させる他の方法を同定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用した。図１６Ａ、１６Ｂ、及び１６Ｃは、Ｎｒｆ２を標的とする３つの異なるガイドＲＮＡを使用した結果を提示する。表３（下記）は、異なるガイドＲＮＡを使用して観察された変異、挿入、及び欠失の数を提示する。示したように、Ｎｒｆ２欠損ヒトＴ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（特に、「Ｓｇ３」と識別されたガイドＲＮＡ）を使用して、８３％の効能をもたらすことに成功した。

【表3】

【0208】

まとめると、上記の結果は、Ｎｒｆ２発現が低減したＣＡＲ Ｔ細胞などのＣＡＲ発現細胞が、多くの異なるがんのための実行可能な治療選択肢となり得ることを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】