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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-10
(54)【発明の名称】バイオチップ、その調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
G01N 35/02 20060101AFI20220203BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20220203BHJP
C07K 1/04 20060101ALN20220203BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20220203BHJP
【ＦＩ】
G01N35/02 C
G01N37/00 103
C07K1/04 ZNA
C12N15/10 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021533681
(86)(22)【出願日】2019-12-11
(85)【翻訳文提出日】2021-08-11
(86)【国際出願番号】 CN2019124473
(87)【国際公開番号】W WO2020119706
(87)【国際公開日】2020-06-18
(31)【優先権主張番号】201811514682.2
(32)【優先日】2018-12-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517110612
【氏名又は名称】ビージーアイ シェンチェン
(71)【出願人】
【識別番号】517135257
【氏名又は名称】ビージーアイ シェンヂェン カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＧＩ ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＣＯ．， ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ジェン
(72)【発明者】
【氏名】シュウ， シュン
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ジュン
(72)【発明者】
【氏名】シェン， ユエ
(72)【発明者】
【氏名】ニー， ミン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ウェンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， シャンアー
(72)【発明者】
【氏名】ファン， シャオルオ
【テーマコード（参考）】
2G058
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G058CC08
2G058GC02
2G058GC05
4H045AA10
4H045AA20
4H045FA33
(57)【要約】
本出願は、化学的に修飾された認識可能なバイオチップ、その調製方法及び使用を提供する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
化学物質及びコードを担持するバイオチップであって、前記コードが前記バイオチップと一意の対応関係を有するバイオチップ。
【請求項2】
前記化学物質が反応試薬と反応することができ、それによって前記反応試薬中のモノマーを前記化学物質の末端に連結する、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項3】
前記化学物質がＤＮＡ／ＲＮＡ合成反応を開始することができるリンカー分子であり、好ましくはアミノ基と反応する官能基を開始末端に有し、酸に不安定な保護基で保護されたヒドロキシを末端に有するリンカー分子であり、より好ましくはユニバーサルリンカーである、請求項２に記載のバイオチップ。
【請求項4】
前記化学物質がポリペプチド合成反応を開始することができるリンカー分子であり、好ましくはアミノ基と反応する官能基を開始末端に有し、アミノ酸モノマーのカルボキシとカップリングする官能基を末端に有し、最終的に前記ポリペプチド合成反応が終了した後に酸で処理すると解離することができるリンカー分子であり、より好ましくは４－ヒドロキシメチル安息香酸である、請求項２に記載のバイオチップ。
【請求項5】
抗体をスクリーニングするための特異的抗原を担持するか、又は抗原を検出するための特異的抗体を担持する、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項6】
前記コードが、数字、記号、グラフ及び／又は識別コードを含む、前記バイオチップの識別情報の特定の特性であり、好ましくは、前記コードが２次元バーコードである、請求項１～５のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項7】
前記バイオチップが、以下の特徴：（１）前記バイオチップが、非研磨片面２次元バーコードチップ、非研磨両面２次元バーコードチップ、片面研磨片面２次元バーコードチップ、片面研磨両面２次元バーコードチップ、両面研磨片面２次元バーコードチップ及び両面研磨両面２次元バーコードチップから選択されることと、
（２）前記バイオチップのサイズが２ｍｍ×２ｍｍ未満、好ましくは０．５ｍｍ×０．５ｍｍであることと、
（３）前記バイオチップが、シリコンウェハ（シリコン結晶）、ガラスシート（ビーズ）、セラミック、シートメタル、プラスチックシート（ビーズ）、ゲル、ナイロン膜、又はそれらの任意の組み合わせから選択される材料、好ましくはシリコンウェハで形成されていることと、
（４）前記バイオチップが多孔質ガラスで形成されており、前記多孔質ガラスの粒径が５μｍ～２０００μｍであり、前記多孔質ガラスの孔径が２００Å～５０００Åであることと、
（５）前記バイオチップが、フレーク、立方体、円柱、又は球状の形態であり、好ましくは前記バイオチップが方形のフレークの形態であることと、
（６）前記バイオチップが、１００ｎｍ酸化シリコンウェハ、３００ｎｍ酸化シリコンウェハ、つや消し石英チップ、又は透明石英チップから選択され、好ましくは、前記バイオチップが透明石英チップであることと、
（７）前記バイオチップが、シラン化試薬で処理された表面を有し、好ましくは前記シラン化試薬がＡＰＴＭＳ又はＡＰＴＥＳから選択され、より好ましくは前記シラン化試薬が５０％シラン化試薬であること
のうちの１つ又は複数を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオチップを調製する方法であって、以下のステップ：１）前記バイオチップをコード化するステップ、
２）前記バイオチップを前処理するステップ、
３）前記バイオチップの表面にシラン化処理を実施するステップ、
４）前記バイオチップの表面を化学修飾するステップ、及び
５）任意選択で、前記化学修飾を検出又は定量的に分析するステップ
を含む方法。
【請求項9】
前記前処理が、酸処理、アルカリ処理、超音波処理、プラズマ洗浄、アセトン洗浄、又はそれらの組み合わせを含み、前記酸が硫酸、塩酸、リン酸、及びピラニア液から選択され、前記アルカリが水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムから選択され、好ましくは前記前処理方法が酸処理に続くプラズマ洗浄であり、より好ましくは前記前処理方法が水酸化ナトリウム処理に続くプラズマ洗浄及びアセトン洗浄である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記バイオチップの表面の化学修飾が、前記バイオチップの表面での化学物質の連結によって実現される、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
２次元バーコードがレーザー印刷によって前記バイオチップに印刷されており、好ましくは、コード化が赤色レーザーを使用してドット２次元バーコード方式によって実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記バイオチップをシラン化試薬に浸漬し、超音波処理を実施することによって、シラン化処理を前記バイオチップの表面に実施し、好ましくは前記シラン化試薬がＡＰＴＥＳ及びＰＴＥＳを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
前記シラン化試薬が５０％シラン化試薬である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
生体高分子の合成における、請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオチップ又は請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法を使用することによって調製されたバイオチップの使用。
【請求項15】
前記生体高分子が核酸又はポリペプチドである、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
抗原又は抗体の検出における、請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオチップ又は請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法を使用することによって調製されたバイオチップの使用。
【請求項17】
核酸を合成する方法であって、以下のステップ：（１）請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオチップ又は請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法を使用することによって調製されたバイオチップを用意するステップであり、前記バイオチップに担持されたコードが合成する核酸の配列に対応しているステップ、
（２）デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧ又はリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、及びＧの付加のために、並びに反応タンクそれぞれにおける脱保護、キャッピング、酸化、及び洗浄のためにそれぞれ使用される４つの反応タンクを用意するステップ、
（３）前記バイオチップに担持された前記コードを認識し、前記コードに対応する配列に従って付加するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを決定し、付加するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドが同じであるバイオチップを同じ反応タンクに選別するステップ、
（４）前記反応タンクに脱保護試薬を添加し、脱保護のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記脱保護試薬を排出するステップ、
（５）前記反応タンクに対応するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのカップリング試薬を添加し、カップリング反応のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記カップリング試薬を排出するステップ、
（６）前記反応タンクにキャッピング試薬を添加し、キャッピング反応のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記キャッピング試薬を排出するステップ、
（７）前記反応タンクに酸化試薬を添加し、酸化反応のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記酸化試薬を排出し、それによって１ヌクレオチドの付加を完了するステップ、
（８）前記コードに対応して合成される核酸の配列に応じて、ステップ（３）～（７）を１回又は複数回繰り返し、それによって前記バイオチップ上に予め決定された配列を有する核酸を生成するステップ
を含み、任意選択で、以下のステップ：
（９）前記バイオチップから前記核酸を切断し、それによって前記核酸を入手するステップ
をさらに含む方法。
【請求項18】
前記核酸合成の前、及び前記バイオチップを前記反応タンクに選別した後で、前記反応タンクに前記キャッピング試薬を添加し、キャッピング反応のために前記バイオチップを前記反応タンクに浸漬する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
複数のチップを同時に使用して合成反応を実施する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
抗体のハイスループットスクリーニングのための方法であって、以下のステップ：（１）複数のチップを混合するステップであり、前記チップが請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオチップ又は請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法によって調製されたバイオチップであり、各チップが特異的抗原で修飾されており、一意のコードを担持するステップ、
（２）複数の前記チップを検出対象の試料溶液に浸漬して、十分に反応させるステップ、
（３）前記試料溶液を除去して前記チップを洗浄するステップ、
（４）前記チップのそれぞれに担持された前記コードを認識し、前記コードに従ってチップそれぞれを互いに分離するステップ、及び
（５）前記チップに結合している前記抗体を前記チップの前記抗原から脱離させ、得られた抗体を特定するステップ
を含む方法。
【請求項21】
抗原のハイスループット検出のための方法であって、以下のステップ：（１）複数のチップを混合するステップであり、前記チップが請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオチップ又は請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法によって調製されたバイオチップであり、各チップが特異的抗体で修飾されており、一意のコードを担持するステップ、
（２）前記チップを検出対象の試料溶液に浸漬して、十分に反応させるステップ、
（３）前記試料溶液を除去して前記チップを洗浄するステップ、
（４）前記チップのそれぞれに担持された前記コードを認識し、前記コードに従ってチップそれぞれを互いに分離するステップ、及び
（５）前記チップに結合している前記抗原を前記チップ上の前記抗原から脱離させ、得られた抗原を特定するステップ
を含む方法。
【請求項22】
ステップ（４）において、前記バイオチップが各バイオチップに担持された前記コードを認識することによって選別され、各チップが、前記チップの移動を駆動するように構成されている駆動装置によって異なる反応容器に移動させられる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
選別されたチップを含有する前記反応容器に脱離試薬を添加して、前記抗原及び前記抗体の脱離を引き起こす、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[0001]本出願は生化学の分野に関する。特に、本出願は、バイオチップ、その調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
[0002]生体高分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、多糖類などを主に含む。これらの生体高分子は、医薬、農業、食品、材料、環境などの分野で重要な用途があるため、これらの生体高分子のインビトロ合成は研究のホットスポットとなっており、巨大な市場が見込まれている。１９５０年代にＴｏｄｄ及びＫｈｏｒａｎａの研究グループがＤＮＡ合成を初めて報告して以来（Ｍｉｃｈｅｌｗｎ，Ａ．Ｍ．、Ｔｏｄｄ，Ａ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５５；Ｇｉｌｈａｍ，Ｐ．Ｔ．、Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．、Ｊ．Ａ．ｍ．Ｃｌｉｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５８）、ＤＮＡ合成の方法は長期間にわたって開発されてきた。現在、古典的な合成法には、１９８０年代に開発されたカラム型合成法及び１９９０年代に開発されたマイクロアレイをベースにしたハイスループット合成法が含まれる。これらの方法は基本的には固相合成法であり、１つのデオキシリボヌクレオチドを合成の単位として使用しており、合成方法のほとんどには、ホスホロアミダイト化学法に基づいた４ステップサイクル、すなわち脱保護、カップリング、キャッピング、及び酸化ステップが関与している。各ステップでの反応の不完全さ、それに伴う副作用（脱アデニル化など）の可能性、及び反応の進行に伴う反応物濃度の低下のため、ＤＮＡ一本鎖が延長するにつれて、ＤＮＡ合成のエラー率が急激に増加し、収量が激減する。さらに、カラム型合成法の欠点は、試薬の使用量が多く、スループットが低いという欠点を有し、この合成は費用が高く、時間及び労力がかかるという事実の原因となっている。マイクロアレイをベースにした合成法はスループットが高く、試薬の使用量も少ないが、比較的にエラー率が高く、収率が低く、安定性が低い。ＲＮＡ、ポリペプチド、及びポリリン酸などのその他の生体高分子の合成法は、固相担体上で１サイクルの化学反応を繰り返すＤＮＡの固相合成法と類似しており、その合成特性も類似している。カラム型合成法はエラー率が低いが、試薬の消費量が多く、スループットが低いため、費用削減にはつながっていない。マイクロアレイをベースにした合成法は、スループットが高く、材料の量も少ないが、比較的にエラー率が高く、安定性が低い。したがって、高スループット、低費用、及び低エラー率を実現することができる合成チップを見いだすことが非常に重要である。
【0003】
[0003]バイオチップは、タンパク質チップ、又は遺伝子チップとも呼ばれ、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ技術と半導体工業技術との組み合わせから作り出されたものである。この技術は、多数のプローブ分子を支持体上に固定し、次にＤＮＡ又は蛍光標識を有するその他の試料分子（例えば、タンパク質、因子若しくは低分子）とハイブリダイズさせ、各プローブ分子のハイブリダイゼーション信号強度を検出することによって、試料分子の量及び配列情報を得るというものである。バイオチップ技術は、核酸分子のハイブリダイゼーションから作り出された。いわゆるバイオチップとは、相互支持媒体上に高密度で固定された生体情報分子（例えば、遺伝子断片、ＤＮＡ断片、又はポリペプチド、タンパク質、糖鎖分子、及び組織）の、アレイ内の各分子の配列及び位置の両方が既知であり、予め設定された配列ポイントアレイであるマイクロアレイハイブリダイズチップ（マイクロアレイ）を一般的に意味する。生体分子間の特異的な相互作用原理に従って、生化学分析方法がチップの表面に統合されており、それによってＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、及びその他の生体成分のハイスループットで迅速な検出を実現する。バイオチップの狭義の概念は、生体分子（オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ポリペプチド、抗体、抗原など）をシリコンウェハ、ガラスシート（ビーズ）、プラスチックシート（ビーズ）、ゲル、及びナイロン膜などの固相マトリックスに様々な方法で固定することによって形成された生体分子ポイントアレイを意味する。したがって、バイオチップ技術は、マイクロアレイ技術とも呼ばれている。多くの生体情報を含有する固相マトリックスはマイクロアレイと呼ばれ、バイオチップとも呼ばれている。このようなチップをベースにして、バイオチップはマイクロ電子チップとも知られているマイクロ流体チップ、すなわちマイクロラボラトリーチップへと発達した。電子チップのように、バイオチップも統合されているが、バイオチップの統合は生体材料の統合である。実験室での検出と同様に、バイオチップでの血糖、タンパク質、酵素活性などの検出は、同じ生体反応の原理に基づいている。このように、バイオチップは担体プラットフォームである。バイオチップは、高集積度、ハイスループット、高感度、及び携帯性などの潜在的な利点を有するので、多くの場面で、特に生物学的合成及び検出の面で広く応用されており、応用の可能性は幅広い。
【0004】
[0004]現在、市販されている代表的なマイクロアレイ合成機、例えばＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ合成機では、合成反応はミクロンレベルの反応穴に縮小され、１つのチップに数万個の反応穴が存在している。このようにして、合成スループットは改善し、原材料の消費はある程度まで低減しているが、収率は低く、電気化学反応の制御は容易ではなく、エラー率は高い。さらに、温度及び湿度センサー、制御回路などもチップ上に統合されているため、製造方法が非常に複雑で、チップの価格も比較的に高価である。Ｔｗｉｓｔ合成機では、長いＤＮＡ分子断片を直接大量に得るために、高速マイクロスケールのインクジェットプリンティングヘッドをモノマーなどの試薬の伝達方法として使用することによって、特殊な処理を施したミクロンレベルのシリコンベースのチップ貫通ビア上でオリゴを合成し、次に合致した反応物を使用してこれらのマイクロ穴にドッキングさせ、インサイチュのＰＣＲ及びＰＣＡを実現している。このバイオチップは、特定の化学修飾を施した特殊なシリコンベースの材料から形成されている。スループットは高いが、物理的に隔離することが必要である。さらに、このバイオチップはサイズが大きく（サイズは従来の９６ウェルプレートと同等である）、商品化されていない。Ｅｖｏｎｅｔｉｘ回路によって制御されている合成機は、主に半導体の大規模な並列制御の特性を利用することによって、異なる部位の反応の独立した制御を実現している。しかし、実際の適用では、異なる部位での反応の相互作用をいかに回避し、生成物出力をいかに制御するかが重要な問題である。２０１８年の初めに、イギリスの企業Ｅｖｏｎｅｔｉｘが、半導体チップ制御に基づいた合成技術を発表した。Ｅｖｏｎｅｔｉｘの技術の重要な点は、理論上約１０億部位のオリゴ合成及びリアルタイムでモニターすることができる高忠実度ＤＮＡエラー修正アセンブリ技術にある。合成方法を制御する原理は以下の通りである：特別に設計された、大規模処理が可能な合成部位の密閉されたチャンバー内に、融点が低く繰り返し加熱することが可能なブロック材料（ｎ－テトラコサンなど）を添加し、合成機が回路信号を使用して各部位が帯電されるかどうかを制御し、その後その部位を加熱するかどうかを選択する。加熱する場合は、部位上の特殊な材料を部位に吸着させて、後から導入した試薬が部位上で反応するのを防ぐ。その後の合成をその部位で実施する必要がある場合は、材料を溶媒で洗い流し、合成反応のための部位を露出させる。このようにして、各部位における反応の個別制御を実現している。しかし、特殊な化学修飾に加えて、回路制御がチップ上に統合されているため、チップの製造方法は複雑である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
[0005]したがって、この分野での新たな技術的ブレークスルー、特に、製造方法が簡単で、低価格で、複数検出のスループットを有し、再利用可能で、認識機能を有するバイオチップの必要が迫られている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
[0006]本出願は、バイオチップ、バイオチップの調製方法及びその使用を提供する。本出願のバイオチップは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチドなどの生体高分子の合成及び検出、抗体スクリーニング、抗原認識などに適用することができ、応用の可能性は大きい。
【0007】
[0007]一態様において、本出願は、化学物質及びコードを担持するバイオチップを提供し、このコードはチップと一意の対応関係を有する。
【0008】
[0008]別の態様では、本出願は、本出願のバイオチップを調製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを含む：
[0009]１）バイオチップをコード化するステップ、
[0010]２）バイオチップを前処理するステップ、
[0011]３）バイオチップの表面にシラン化処理を実施するステップ、
[0012]４）バイオチップの表面を化学修飾するステップ、及び
[0013]５）任意選択で、化学修飾を検出又は定量的に分析するステップ。
[0009]１）バイオチップをコード化するステップ、
[0010]２）バイオチップを前処理するステップ、
[0011]３）バイオチップの表面にシラン化処理を実施するステップ、
[0012]４）バイオチップの表面を化学修飾するステップ、及び
[0013]５）任意選択で、化学修飾を検出又は定量的に分析するステップ。
【0009】
[0014]別の態様では、本出願は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチドなどの生体高分子の合成における本出願のバイオチップの使用を提供する。
【0010】
[0015]別の態様では、本出願は、生物学的検出における本出願のバイオチップの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
[0026]本出願では、特に定義されていない限り、本明細書で使用した技術的及び科学的用語は全て、本出願の技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本出願の実施形態では、本明細書で記載したものと類似又は同等な方法及び材料を使用することができ、例示的で適切な方法及び材料のみを以下に記載している。公開されている出版物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は全て、参照として本明細書に組み込まれている。さらに、材料、方法、及び実施形態は、例示に過ぎず、制限的なものではない。その一方で、本発明をよりよく理解するために、本出願は関連する用語の定義及び説明も提供する。本出願に記載されている用語の定義及び説明と、本出願の分野における当業者が一般的に理解している意味との間に矛盾がある場合、本出願に記載されている用語の定義及び説明が優先されるものとする。
【0013】
[0027]バイオチップ
[0028]一態様において、本出願は、化学物質及びコードを担持するバイオチップを提供し、このコードはチップと一意の対応関係を有する。
[0028]一態様において、本出願は、化学物質及びコードを担持するバイオチップを提供し、このコードはチップと一意の対応関係を有する。
【0014】
[0029]当業者に知られているように、チップの基板はチップに適した任意の材料で形成されており、その材料は、反応試薬の活性に悪影響を及ぼさず、又は反応試薬と望ましくない副反応をしない。好ましくは、チップは不活性材料で形成されている。一部の好ましい実施形態では、チップは、シリコンウェハ（シリコン結晶）、ガラスシート（ビーズ）、セラミック、シートメタル、プラスチックシート（ビーズ）、ゲル、ナイロン膜、又はそれらの任意の組み合わせから選択される材料で形成されており、好ましくはシリコンウェハである。一実施形態では、チップは多孔質ガラスで形成されており、粒径は５μｍ～２０００μｍのいずれか１つ、より好ましくは２５μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、及び５００μｍのいずれか１つであり、孔径は２００Å～５０００Åのいずれか１つ、より好ましくは５００Å、１０００Å、１５００Å、２０００Å、及び３０００Åのいずれか１つである。チップは所望の形状を有することができる。例えば、チップはフレーク、立方体、円柱、球などの形態であってもよく、好ましくはチップは方形のフレークの形態である。特定の実施形態では、バイオチップはＤＮＡ合成用のマイクロチップであり、サイズは２ｍｍ×２ｍｍ、さらに１ｍｍ×１ｍｍ、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以下である。一部の好ましい実施形態では、本出願のチップは再利用される。
【0015】
[0030]コード
[0031]本出願のチップは認識可能な特性を有する。このために、チップをコード化して、チップに特定の信号を設ける必要がある。チップ上の特定の信号は、磁気信号、電気信号、識別コードなどであってもよいが、好ましくは、特定の信号は２次元バーコードである。
[0031]本出願のチップは認識可能な特性を有する。このために、チップをコード化して、チップに特定の信号を設ける必要がある。チップ上の特定の信号は、磁気信号、電気信号、識別コードなどであってもよいが、好ましくは、特定の信号は２次元バーコードである。
【0016】
[0032]したがって、特定の実施形態では、本出願のバイオチップはコードを担持し、そのコードはチップと一意の対応関係を有する。本明細書の「コード」とは、チップの識別情報の区別及び識別に使用されるあらゆる特性を意味することを理解されたい。この特性には、数字、記号、グラフ、バーコード、及び２次元バーコードなどの識別コード、好ましくは２次元バーコードが挙げられるが、これらに限定はされない。
【0017】
[0033]好ましい実施形態では、チップに担持されたコードは２次元バーコードである。２次元バーコードは、ある特定の幾何学的グラフを一定の規則に従って平面上（２次元方向）に分配することによって形成された白黒のグラフを使用して、データ記号情報を記録するために使用され、言葉又は数値情報は、コンピュータの内部論理基盤を構成するビットストリーム「０」及び「１」の概念をコードシステム上で巧みに利用することによって２進法に対応したいくつかの幾何学図形を使用することによって表され、画像入力装置又は光電走査装置による自動読み取りによって自動情報処理が実現される。バーコード技術には、各コードシステムが特定の文字セットを有し、各文字が一定の幅を占め、一定の検証機能を有するなどのいくつかの一般原則が存在する。その一方で、異なる列の情報を自動的に認識し、グラフの回転変化点を処理する機能も有する。２次元バーコードにはエラー修正機能が内蔵されており、コードが破損又は汚損した場合にデータを復元することができる。データの復元には、数学的なエラー修正（リード・ソロモン）を採用することができる。
【0018】
[0034]一部の好ましい実施形態では、チップに担持されたコードは、少なくとも２つ又はそれ以上の特徴の組み合わせである。例えば、チップに担持されたコードは、識別コード（例えばバーコード又は２次元バーコード）と電気信号との組み合わせ、識別コード（例えばバーコード又は２次元バーコード）と光信号（例えば蛍光）との組み合わせ、識別コード（例えばバーコード又は２次元バーコード）と数字との組み合わせ、識別コード（例えばバーコード又は２次元バーコード）とＲＦＩＤタグとの組み合わせ、ＲＦＩＤタグと電気信号との組み合わせ、ＲＦＩＤタグと光信号（例えば、蛍光）との組み合わせ、ＲＦＩＤｌａｂ及び数字の組み合わせ、数字と光信号（例えば、蛍光）との組み合わせ、或いは数字、グラフと識別コード（例えば、バーコード又は２次元バーコード）との組み合わせなどであってもよい。
【0019】
[0035]コードの重要な１つの機能は、チップを区別及び識別することである。「コードはチップと一意の対応関係を有する」という表現は、各チップが１つの一意のコードに対応していることを意味している。言い換えると、チップに担持されたコードは、互いに異なっている。各チップは担持されたコードと一意の対応関係を有するので、そのコードを認識することによって、複数のチップを簡便に区別することができ、又は複数のチップから目的のチップを迅速に簡便に探して識別することができる。
【0020】
[0036]本出願の方法では、チップに担持されたコードを様々な方法で認識する。一部の好ましい実施形態では、チップに担持されたコードは、検出器（例えば、数字、記号、グラフ、識別コード（例えば、バーコード、２次元バーコード）、ＲＦＩＤタグ、光信号（例えば、蛍光、化学発光、ラマン分光法）、量子ドット、磁気信号、電気信号、又はそれらの組み合わせを認識することによる検出器）を使用することによって検出され、検出器によって検出された信号は、処理装置を使用して分析され、それによってチップの識別情報（コード）を認識する。数字、記号、グラフ、バーコード、２次元バーコード、ＲＦＩＤタグ、蛍光、発光、量子ドット、ラマン分光法などを検出／認識するための様々な方法及び機器が当業者には知られており、光信号認識装置、磁気信号認識装置、電気信号認識装置、画像認識装置、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定はされない。例えば、その機器は２次元バーコード検出器、バーコード検出器、又はＲＦＩＤタグ読取機などである。
【0021】
[0037]チップ表面の化学修飾
[0038]チップにコードを付加した後、チップが異なる機能要件を満たすという目的を実現するために、チップ表面に化学修飾を実施する。チップの表面に修飾される特定の種類の分子は、チップの実際の適用に左右される。例えば、生体高分子の合成に使用されるチップの表面は合成反応を開始することができる分子で修飾されており、抗原の検出に使用されるチップの表面は特異的抗体で修飾されており、抗体のスクリーニングに使用されるチップの表面は特異的抗原で修飾されている。
[0038]チップにコードを付加した後、チップが異なる機能要件を満たすという目的を実現するために、チップ表面に化学修飾を実施する。チップの表面に修飾される特定の種類の分子は、チップの実際の適用に左右される。例えば、生体高分子の合成に使用されるチップの表面は合成反応を開始することができる分子で修飾されており、抗原の検出に使用されるチップの表面は特異的抗体で修飾されており、抗体のスクリーニングに使用されるチップの表面は特異的抗原で修飾されている。
【0022】
[0039]Ａ．生体高分子合成用
[0040]チップの表面でＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチドなどの異なる種類の生体高分子を合成するために、各チップの対応する表面を化学的に修飾する必要があり、さらに、信号分配が不均一にならないようにするために、チップの表面に修飾された分子が均一に分配されていることを保証しながら、チップの表面に十分な修飾分子があることを確認することも必要である。
[0040]チップの表面でＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチドなどの異なる種類の生体高分子を合成するために、各チップの対応する表面を化学的に修飾する必要があり、さらに、信号分配が不均一にならないようにするために、チップの表面に修飾された分子が均一に分配されていることを保証しながら、チップの表面に十分な修飾分子があることを確認することも必要である。
【0023】
[0041]このために、特定の態様では、本出願は、化学物質及びコードを担持するバイオチップを提供し、この化学物質は反応試薬と反応して反応試薬中のモノマーを化学物質の末端に連結し、このコードはバイオチップと一意の対応関係を有する。
【0024】
[0042]本明細書で使用するように、本出願のバイオチップは化学的に修飾されており、すなわち、バイオチップの表面は化学物質を連結することによって修飾されている。特定の実施形態では、この化学物質はリンカー分子（接続分子）であり、これが反応試薬と反応（カップリング反応又は連結反応）することによって、反応試薬のモノマーがリンカー分子の末端に連結する。
【0025】
[0043]核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）合成用のバイオチップはリンカー分子で修飾されており、このリンカー分子は、好ましくは、開始末端にアミノ基と反応する官能基、末端に酸で処理すると保護基が除去されてヒドロキシを露出する、酸に不安定な保護基を有するヒドロキシ、中間にエステル基、脂質基、チオエステル基、ｏ－ニトロベンジル基、クマリン基、ヒドロキシ、メルカプト、メルカプトエーテル基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、アミド、アミド基、アルケニル、及びアルキニルから選択される任意の１つ又は複数の官能基を有する化合物であり、好ましくは、開始末端の官能基はカルボキシであり、末端のヒドロキシ保護基はトリフェニルメチル、例えば、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）であり、これは有機溶媒（ジクロロメタン及びアセトニトリルなど）に溶かしたジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、又はトリフルオロ酢酸の溶液で除去される。好ましい実施形態では、リンカー分子は、ＤＮＡ合成が完了した後、アンモノリシスで分解されて容易に放出される分子であり、好ましいリンカー分子はユニバーサルリンカーであり、このユニバーサルリンカーとはエキソ－Ｎ－フェニル－５－（スクシニルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド、エキソ－Ｎ－メチル－５－（スクシニルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド又はエキソ－Ｎ－メチル－５－（ジグリコルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミドである。ユニバーサルリンカーの化学構造式は以下の通りである：
[0044]（１）エキソ－Ｎ－フェニル－５－（スクシニルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド
[0045]（２）エキソ－Ｎ－メチル－５－（スクシニルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド
[0046]（３）エキソ－Ｎ－メチル－５－（ジグリコルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド
[0044]（１）エキソ－Ｎ－フェニル－５－（スクシニルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド
【化1】
[0045]（２）エキソ－Ｎ－メチル－５－（スクシニルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド
【化2】
[0046]（３）エキソ－Ｎ－メチル－５－（ジグリコルオキシ）－６－ジメチル－７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－３－ジカルビミド
【化3】
【0026】
[0047]ポリペプチド合成用のバイオチップは化学物質で修飾されており、この化学物質はポリペプチドの固相法での合成のためのポリマー担体（樹脂）である。この樹脂は、反応基が導入された場合にのみ、第１のアミノ酸（最初のアミノ酸）に直接連結する。導入された反応基によって、樹脂及び樹脂誘導体は、クロロメチル樹脂、カルボキシ樹脂、アミノ樹脂、又はヒドラジド樹脂に分けられる。ＢＯＣ合成法ではＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂などのクロロメチル樹脂が一般的に選択され、ＦＭＯＣ合成法ではＷａｎｇ樹脂及び２－Ｃｌ（Ｔｒｔ）－Ｃｌ樹脂などのカルボキシ樹脂が一般的に選択される。最初のアミノ酸の固定化は、アミノ酸を保護するカルボキシと樹脂の反応基との間に形成される共有結合によって主に実現する。共有結合の形成には多くの方法がある。クロロメチル樹脂の場合、アミノ酸を保護するテトラメチルアンモニウム塩若しくはナトリウム塩、カリウム塩若しくはセシウム塩をまず調製し、その後生成物を樹脂と直接反応させるか、又はジオキサン、ＤＭＦ若しくはＤＭＳＯなどの適切な有機溶媒中で適切な温度で反応させるのが一般的であるが、カルボキシ樹脂の場合、一般的にはＤＣＣ若しくはカルボキシジイミダゾールなどの適切な縮合剤を添加して、保護されたアミノ酸及び樹脂が混合エステルを形成してアミノ酸の固定化を完成させ、アミノ樹脂又はヒドラジド樹脂の場合、ＤＣＣなどの適切な縮合剤を添加した後、保護されたアミノ酸と樹脂との間に形成されるアミド結合によってアミノ酸の固定化を完成させる。
【0027】
[0048]ポリペプチド合成用のバイオチップの好ましい技術的解決では、チップを修飾するための化学物質（リンカー分子）はカルボキシ樹脂であり、これはＷａｎｇ樹脂及び２－Ｃｌ（Ｔｒｔ）－Ｃｌ樹脂などの、末端にカルボキシと縮合することができる基を有する分子、又は類似の化学構造を有する分子であり、好ましくは、開始末端にアミノと反応することができる官能基及び末端にアミノ酸モノマーのカルボキシとカップリングすることができ、酸で処理すると解離することができる官能基、中間にエステル基、脂質基、チオエステル基、ｏ－ニトロベンジル基、クマリン基、ヒドロキシ、メルカプト、メルカプトエーテル基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、アミド、アミド基、アルケニル、及びアルキニルのうちの任意の１つ又は複数の官能基を有する化合物を有するリンカー分子であり、例えば、４ーヒドロキシメチル安息香酸、４－クロロメチル安息香酸、又は置換された４ーヒドロキシメチル安息香酸若しくは４－クロロヒドロキシメチル安息香酸が挙げられ、好ましいリンカー分子は４ーヒドロキシメチル安息香酸である。
【0028】
[0049]Ｂ．バイオ検出
[0050]別の特定の態様では、本出願は、特異的抗原／抗体及びコードを担持するバイオチップを提供し、このコードはチップと一意の対応関係を有する。例えば、抗原検出用チップの表面を特異的な抗体で修飾し、抗体スクリーニング用チップの表面は特異的抗原で修飾する。
[0050]別の特定の態様では、本出願は、特異的抗原／抗体及びコードを担持するバイオチップを提供し、このコードはチップと一意の対応関係を有する。例えば、抗原検出用チップの表面を特異的な抗体で修飾し、抗体スクリーニング用チップの表面は特異的抗原で修飾する。
【0029】
[0051]バイオチップの調製
[0052]別の態様では、本出願はバイオチップを調製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを含む：
[0053]１）チップをコード化するステップ、
[0054]２）チップを前処理するステップ、
[0055]３）チップの表面にシラン化処理を実施するステップ、
[0056]４）チップの表面を化学修飾するステップ、
[0057]５）任意選択で、化学修飾を検出又は定量的に分析するステップ。
[0052]別の態様では、本出願はバイオチップを調製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを含む：
[0053]１）チップをコード化するステップ、
[0054]２）チップを前処理するステップ、
[0055]３）チップの表面にシラン化処理を実施するステップ、
[0056]４）チップの表面を化学修飾するステップ、
[0057]５）任意選択で、化学修飾を検出又は定量的に分析するステップ。
【0030】
[0058]本発明で使用するように、「チップをコード化する」とは、チップに一意的な識別タグを付加することを意味する。本明細書では「コード」とは、チップの識別情報を区別及び識別するためのあらゆる特徴を意味することを理解されたい。この特徴には、数字、記号、グラフ、バーコード、及び２次元バーコードなどの識別コードが挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい実施形態では、「チップをコード化する」ことは、チップに２次元バーコードを付加することを含み、この２次元バーコードはチップに一意に対応している。言い換えると、異なるチップに付加された２次元バーコードは、互いに異なっている。
【0031】
[0059]特定の実施形態では、本発明によれば、２次元バーコードは、認識可能な信号としてレーザー印刷を使用してチップ上に印刷されている。様々な適用状況に適応するためには、異なる種類の研磨及び２次元バーコードを有するチップ、すなわち、非研磨片面２次元バーコードチップ、非研磨両面２次元バーコードチップ、片面研磨片面２次元バーコードチップ、片面研磨両面２次元バーコードチップ、両面研磨片面２次元バーコードチップ及び両面研磨両面２次元バーコードチップを設計し製造することが必要である。チップの表面は、表面積を増大させ、２次元バーコードチップの迅速で正確で効率的な認識を確実にするために、フロスト処理又はナノポイントの位置修正など、特殊な要求を伴う適用状況では特殊な処理が施されている。
【0032】
[0060]ＤＮＡ合成用の２次元バーコードチップを例にとると、以下の技術が採用されており、本出願によって提案されたＤＮＡ合成用チップのサイズは、適用状況に応じて、例えば２ｍｍ×２ｍｍ、さらには１ｍｍ×１ｍｍ、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以下に調整することができ、最小はサブミリメートルレベルであってもよい（例えば、図１を参照）。チップのサイズが小さいので、ドット方式としてドット２次元バーコード方式を選択している。バリのない切断品質を確保するために、本出願で提案した２次元バーコードチップは、機械的に切断している。コード化の深さを確保するために、ポイントの位置が深く鮮明になるように赤色レーザーを選択しているので、その後の長期使用で多少の摩耗があっても、２次元バーコードの認識に影響はない。使用過程で大量のチップが付着してしまう問題を解決するために、振動する反応容器を使用して、チップ表面でのチップ反応の均一性に影響を与えることなく、使用過程における高い効率を確保する。チップの認識とは、チップを撮影し、拡大し、認識する過程のことある。チップをより良く認識するために、２次元バーコードのポイントはできる限り大きく深くする。
【0033】
[0061]特定の実施形態では、互いに異なる複数の２次元バーコードがシリコンウェハ全体に等間隔で印刷されており、例えば、２次元バーコードのサイズは１ｍｍ×１ｍｍであってもよい。次に、シリコンウェハを２ｍｍ×２ｍｍのチップに切断し、切断したときに２次元バーコードが各チップの中心に確実に位置するようにしている。
【0034】
[0062]本明細書で使用するように、「チップを前処理する」とは、チップの表面をきれいにし、一方で、表面反応の活性を向上させるためにより多くのヒドロキシを露出させるという目的を達成することである。前処理ステップには、酸処理、アルカリ処理、超音波処理、プラズマ洗浄、アセトン洗浄、又はそれらの組み合わせが含まれ、酸は硫酸、塩酸、リン酸、ピラニア液などから選択され、アルカリは水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムなどから選択することができる。好ましい実施形態では、前処理方法は、酸処理に続くプラズマ洗浄であり、より好ましくは、前処理方法は、水酸化ナトリウム処理に続くプラズマ洗浄及びアセトン洗浄である。
【0035】
[0063]本明細書で使用するように、「チップの表面にシラン化処理を実施する」とは、チップの表面でアミノ修飾を実施することを意味する。シラン化の過程では、化学蒸着法（ＣＶＤ）、溶液浸漬法、単純負圧蒸着法などのうちの１つ又は複数が採用され、シラン化試薬は、一端がアルコキシシリコン基、他端がアミノである試薬であり、ＡＰＴＭＳ、ＡＰＴＥＳなどから選択することができ、好ましくはＡＰＴＭＳをシラン化試薬として使用し、さらに好ましくは５０％のシラン化試薬を使用する。好ましい実施形態では、効率的なシラン化を確保する一方、簡便な操作性及び均一な表面修飾を確保するために、単純な負圧蒸着法を採用している。
【0036】
[0064]本明細書で使用するように、「チップの表面を化学的に修飾する」とは、チップの表面に化学物質を連結することを意味する。化学物質の具体的な種類は、チップの具体的な適用によって左右される。
【0037】
[0065]核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）合成のためにバイオチップを使用する場合、化学物質は好ましくは開始末端にアミノと反応することができる官能基及び末端に酸に不安定な保護基を有するヒドロキシを有し、この保護基は酸で処理すると除去されてヒドロキシを露出し、中間にエステル基、脂質基、チオエステル基、ｏ－ニトロベンジル基、クマリン基、ヒドロキシ、メルカプト、メルカプトエーテル基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、アミド、アミド基、アルケニル、及びアルキニルのうちの任意の１つ又は複数の官能基を有するリンカー分子であり、好ましくは、開始末端はカルボキシであり、末端の保護基はトリフェニルメチル、例えば、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）であり、これは有機溶媒（ジクロロメタン及びアセトニトリルなど）に溶かしたジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸又はトリフルオロ酢酸の溶液で処理すると除去される。
【0038】
[0066]バイオチップをポリペプチド合成のために使用する場合、リンカー分子は、好ましくは、カルボキシ樹脂であり、すなわち、Ｗａｎｇ樹脂及び２－Ｃｌ（Ｔｒｔ）－Ｃｌ樹脂などの、末端にカルボキシと縮合することができる基を有する分子、又は類似の化学構造を有する分子であり、好ましくは、開始末端にアミノと反応することができる官能基及び末端にアミノ酸モノマーのカルボキシとカップリングすることができ、酸で処理すると解離することができる官能基、中間にエステル基、脂質基、チオエステル基、ｏ－ニトロベンジル基、クマリン基、ヒドロキシ、メルカプト、メルカプトエーテル基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、アミド、アミド基、アルケニル、及びアルキニルのうちの任意の１つ又は複数の官能基を有する化合物を有するリンカー分子であり、例えば、４ーヒドロキシメチル安息香酸、４－クロロメチル安息香酸、又は置換された４ーヒドロキシメチル安息香酸若しくは４－クロロヒドロキシメチル安息香酸が挙げられ、好ましいリンカー分子は４ーヒドロキシメチル安息香酸である。
【0039】
[0067]バイオチップの調製のステップは、好ましくは以下の順序に従って実施されることに留意されたい：まずコード化を実施し、次に、バイオチップの修飾表面をより良く保護し、その後のバイオチップの適用を容易にするために表面の化学修飾を実施する。例えば、レーザー印刷を使用して２次元バーコードをチップに印刷した後に、チップに前処理及びシラン化処理を行い、最後にチップの表面を化学修飾するが、順序が逆の場合、例えば、チップに前処理及びシラン化処理を行った後にチップの表面を化学修飾し、最後に２次元バーコードをレーザー印刷を使用してチップに印刷する場合、レーザー印刷の過程でチップの表面に修飾された化学分子に損傷を与えやすく、その後のチップの適用に影響を与える。
【0040】
[0068]標的化合物を合成する場合、チップに担持された化学物質（リンカー分子）が毎回反応試薬と接触し、反応試薬のモノマーがリンカー分子の末端に連結してリンカー分子を延長させることはよく理解されるだろう。標的化合物が得られるまで、合成した化合物の長さを連続的に延長するために、接触及び反応を繰り返す。
【0041】
[0069]一部の好ましい実施形態では、チップ上での合成反応が完了した後に、合成された生成物（標的化合物）をチップから簡便に切断／分離することが必要である。
【0042】
[0070]例えば、標的化合物がＤＮＡの場合、標的化合物はアンモノリシス反応によってチップから切断する。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応の試薬は、アンモニア水、アンモニアガス、メチルアミン、又はそれらの任意の組み合わせから選択することができる。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応は、室温～１２０℃、例えば、室温～６０℃、６０～９０℃、及び９０～１２０℃から選択される温度で実施する。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応は０．５時間～４８時間、例えば、０．５～２時間、２～５時間、５～１０時間、１０～１８時間、及び１８～２４時間実施することができる。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応後に標的化合物（ＤＮＡ）を単離し精製する。例えば、ＭＯＰ、ＰＡＧＥ、Ｐａｇｅ Ｐｌｕｓ、ＨＰＬＣ、又はそれらの任意の組み合わせを使用して、標的化合物（ＤＮＡ）を単離し精製する。
【0043】
[0071]例えば、標的化合物がＲＮＡの場合、アンモノリシス反応によって標的化合物をチップから切断する。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応の試薬は、アンモニア水、アンモニアガス、メチルアミン、又はそれらの任意の組み合わせから選択する。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応は、室温～１２０℃、例えば、室温～６０℃、６０～９０℃、及び９０～１２０℃から選択される温度で実施する。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応は０．５時間～４８時間、例えば、０．５～２時間、２～５時間、５～１０時間、１０～１８時間、及び１８～２４時間実施する。一部の好ましい実施形態では、アンモノリシス反応後に標的化合物（ＲＮＡ）を単離し精製する。例えば、ＰＡＧＥ、Ｐａｇｅ Ｐｌｕｓ、ＨＰＬＣ、又はそれらの任意の組み合わせを使用して、標的化合物（ＲＮＡ）を単離し精製する。一部の好ましい実施形態では、分離及び精製は、ＲＮアーゼフリーの環境で実施する。例えば、一部の好ましい実施形態では、精製にＨＰＬＣを使用し、分離及び精製に使用する試薬及び装置にはいずれも、ＲＮアーゼ汚染を回避するためにＲＮアーゼを含有しない（すなわち、ＲＮアーゼフリーである）。
【0044】
[0072]例えば、標的化合物がポリペプチドの場合、溶出剤の添加によって標的化合物をチップから切断することができる。一部の好ましい実施形態では、溶出のための試薬（溶出剤）は、フッ化水素酸、トリフルオロ酢酸、テトラフルオロホウ酸、又はそれらの任意の組み合わせから選択することができる。一部の好ましい実施形態では、溶出反応は、室温～１２０℃、例えば、室温～６０℃、６０～９０℃、及び９０～１２０℃から選択される温度で実施することができる。一部の好ましい実施形態では、溶出反応は０．５時間～４８時間、例えば、０．５～２時間、２～５時間、５～１０時間、１０～１８時間、及び１８～２４時間実施することができる。一部の好ましい実施形態では、溶出反応後に標的化合物（ポリペプチド）を単離し精製する。例えば、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ、キャピラリー電気泳動、又はそれらの任意の組み合わせを用いて、標的化合物（ポリペプチド）を単離し精製する。
【0045】
[0073]任意選択で、修飾ステップの後、チップの修飾品質を特徴付けるために、複数の技術的手段を使用して化学修飾を検出又は定量的に分析することができる。例えば、まず酸を添加することによってリンカー分子の末端のＤＭＴ保護ヒドロキシを脱保護し、収集した溶液の色を定性的に観察すると、赤い溶液はリンカー接続が成功していることを示し、すなわち、チップの修飾が成功していることを示している。さらに、収集した赤い溶液を収集して定量し、すなわち、ＵＶ可視分光光度計によってＤＭＴ定量を実施し、修飾したチップの表面のリンカー分子の数を判定し、チップの表面の分子の負荷容量を判定する。最後に、ＤＭＴを含まないチップを６－ＦＡＭの蛍光モノマーとカップリングさせ、カップリングしたチップを洗浄した後、蛍光を観察するために蛍光顕微鏡の下に置くと、修飾したチップの品質は、蛍光の存在、強度、及び均質性によって判定することができ、すなわち、チップ表面の高い蛍光強度、同時に均質な蛍光信号は、修飾したチップの良好な品質を示している。
【0046】
[0074]核酸合成用のバイオチップ
[0075]本出願のチップは、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の合成に使用することができる。核酸の固相合成の一般的な方法及び原理は、当業者に知られている。一般的に、核酸の固相合成は、固相ホスホロアミダイトトリエステル法を採用しており、複数のヌクレオチドを複数回の循環反応によってチップに１つずつ順番に連結させて複数のヌクレオチドを含有する標的生成物を得るが、循環反応の各回は脱保護、活性化／カップリング、キャッピング、及び酸化の４つのステップを含む。
[0075]本出願のチップは、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の合成に使用することができる。核酸の固相合成の一般的な方法及び原理は、当業者に知られている。一般的に、核酸の固相合成は、固相ホスホロアミダイトトリエステル法を採用しており、複数のヌクレオチドを複数回の循環反応によってチップに１つずつ順番に連結させて複数のヌクレオチドを含有する標的生成物を得るが、循環反応の各回は脱保護、活性化／カップリング、キャッピング、及び酸化の４つのステップを含む。
【0047】
[0076]ＤＮＡ／ＲＮＡ合成の特定の実施形態では、まず、合成に必要なモノマーの種類及び合成スループットの要件に応じて、チップコード化の方式を選択し、スループットの異なるＤＮＡ／ＲＮＡ合成用バイオチップと、対応する認識装置、選別装置、並びにチップの移動及び試薬液導入及び排出を制御するための駆動装置を製造するために、認識及び選別方法を最初に定める。チップの特定の信号が認識装置によって認識され、チップが対応するカップリングモノマーを含有する「反応タンク」に選別された後、駆動装置が以下のことが実現するために制御される：脱保護のために脱保護試薬を反応タンクに導入して、反応が完了した後に脱保護試薬を排出し、その後カップリングのために反応タンクに対応するカップリングモノマーに応じてカップリング試薬を導入して、その後カップリング試薬を排出し、最後にキャッピング及び酸化それぞれのためにキャッピング試薬及び酸化試薬を順番に添加して、この時点で１サイクルが完了する。手順の設定に従って、このサイクルは合成が完了するまで連続的に繰り返され、チップを一緒に集めてＤＮＡ／ＲＮＡライブラリを得るか、又は認識選別技術を利用することによって個々のＤＮＡ／ＲＮＡ断片を得る（フローチャートを図２に示す）。
【0048】
[0077]ポリペプチド合成の特定の実施形態では、まず、ポリペプチド合成に必要なアミノ酸モノマーの種類及び合成スループットの要件に応じて、チップコード化の方式を選択し、スループットの異なるポリペプチド合成用バイオチップと、対応する認識装置、選別装置、並びにチップの移動及び試薬液導入及び排出を制御するための駆動装置を製造するために、認識及び選別方法を定める。チップの特定の信号が認識装置によって認識され、チップが対応するカップリングアミノ酸モノマーを含有する「反応タンク」に選別された後、駆動装置が以下のことを実現するために制御される：脱保護のために脱保護試薬を反応タンクに導入して、反応が終了した後に脱保護試薬を排出し、その後カップリングのために反応タンクに対応するカップリングアミノ酸モノマーに応じてカップリング試薬を導入して、その後カップリング試薬を排出し、この時点で１サイクルが完了する。手順の設定に従って、このサイクルは合成が完了するまで連続的に繰り返され、チップを一緒に集めてポリペプチドライブラリを得るか、又は認識選別技術を利用することによって個々のポリペプチド断片を得る（フローチャートを図３に示す）。
【0049】
[0078]生物学的検出用バイオチップ
[0079]本出願のバイオチップは、抗原及び抗体のスクリーニング並びに疾患の診断などの生物学的検出、特に多数の生体試料の同時検出のために使用することができる。抗原及び抗体が特異的な結合力を有し、すなわち、ある抗原は対応する抗体と特異的に親和性を持って結合することができ、この特異的な親和性を利用することによって、抗原－抗体の特異的なスクリーニングを実施することができる。従来の生物学的検出チップでは、同時に１つの生体試料しか検出することができず、すなわち、抗体Ａを選択する場合、スクリーニングするべき抗体ライブラリは特異的抗原Ａで修飾したチップを通過し、溶出及び脱離の後、標的抗体Ａが得られる。或いは、ハイスループットスクリーニングの目的を達成するために、複数の抗原部位を１つのチップ上で修飾するが、この種の修飾は複雑で区別が難しい。
[0079]本出願のバイオチップは、抗原及び抗体のスクリーニング並びに疾患の診断などの生物学的検出、特に多数の生体試料の同時検出のために使用することができる。抗原及び抗体が特異的な結合力を有し、すなわち、ある抗原は対応する抗体と特異的に親和性を持って結合することができ、この特異的な親和性を利用することによって、抗原－抗体の特異的なスクリーニングを実施することができる。従来の生物学的検出チップでは、同時に１つの生体試料しか検出することができず、すなわち、抗体Ａを選択する場合、スクリーニングするべき抗体ライブラリは特異的抗原Ａで修飾したチップを通過し、溶出及び脱離の後、標的抗体Ａが得られる。或いは、ハイスループットスクリーニングの目的を達成するために、複数の抗原部位を１つのチップ上で修飾するが、この種の修飾は複雑で区別が難しい。
【0050】
抗体のスクリーニング
[0080]本出願のバイオチップは、簡単なハイスループット抗体スクリーニングを実現することができる。その技術的適用の解決法を、１０００個の抗体をスクリーニングすることができる修飾チップを例にとって説明することとする。
[0080]本出願のバイオチップは、簡単なハイスループット抗体スクリーニングを実現することができる。その技術的適用の解決法を、１０００個の抗体をスクリーニングすることができる修飾チップを例にとって説明することとする。
【0051】
[0081]１０００個のチップ（チップのサイズは２ｍｍ×２ｍｍ、さらには１ｍｍ×１ｍｍ、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以下）を混合し、各チップを特異的抗原で修飾した後、抗体ライブラリの溶液を添加し、混合したチップを浸漬する。抗原及び抗体には特異的な結合効果があるので、一定期間の接触及び反応の後、特異的な抗体が対応するチップ上の抗原と結合し、その後抗体ライブラリを除去し、洗浄試薬を添加してチップを洗浄し、残存している未結合の抗体を確実に除去する。その後、チップに記された２次元バーコードに従って、１０００個のチップを１０００個の異なる反応ウェルに選別し、次にチップを含有する各反応ウェルに脱離試薬を添加して、チップに結合した抗体をチップ上の抗原から脱離して分離し、上記のステップを何度も繰り返して、抗体の完全な脱離を確実にする。その後、１０００個の反応ウェル中の溶液を別々に新しい１０００個の反応ウェルに移し、こうして対応する１０００個の特異的な抗体を同時にスクリーニングし、最終的に得られた抗体を分析して特徴づける。陽性の結果を有する抗体を精製して、高純度の抗体を得る。上記の技術的解決法によって、抗体のハイスループットスクリーニングを完了するために、多数の高純度の特異的抗体が迅速で効率的に得られる。
【0052】
[0082]本発明が提案する抗体スクリーニングの適用では、抗原修飾を行うチップは体積が小さく製造が簡単であり、大規模の生産が可能なので、チップに２次元バーコードを記すことと併せて、迅速で効率的な認識及び選別を実施し、抗体スクリーニングのための技術的適用のスループットは１万又は１００万レベルでさえも上回ることが可能である。
抗原の検出
[0083]本出願のバイオチップは、簡単なハイスループット抗原検出を実現する。その具体的な技術的適用の解決法を、１０００個の抗原を検出することができる修飾チップを例にとって説明することとする。
抗原の検出
[0083]本出願のバイオチップは、簡単なハイスループット抗原検出を実現する。その具体的な技術的適用の解決法を、１０００個の抗原を検出することができる修飾チップを例にとって説明することとする。
【0053】
[0084]１０００個のチップ（チップのサイズは２ｍｍ×２ｍｍ、さらには１ｍｍ×１ｍｍ、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以下）を混合し、各チップを特異的抗体で修飾した後、抗原ライブラリの溶液を添加し、混合したチップを浸漬する。抗原及び抗体には特異的な結合効果があるので、一定期間の接触及び反応の後、特異的抗原が対応するチップ上の抗体と結合し、その後抗原ライブラリを除去し、洗浄試薬を添加してチップを洗浄し、残存している未結合の抗体を確実に除去する。その後、チップに記された２次元バーコードに従って、１０００個のチップを１０００個の異なる反応ウェルに選別し、次にチップを含有する各反応ウェルに脱離試薬を添加して、チップに結合した抗原をチップ上の抗体から脱離して分離し、上記のステップを何度も繰り返して、抗体の完全な脱離を確実にする。その後、１０００個の反応ウェル中の溶液を別々に新しい１０００個の反応ウェルに移し、こうして対応する１０００個の特異的な抗原を同時にスクリーニングし、最終的に得られた抗原を分析して特徴づける。上記の技術的解決法によって、抗原のハイスループットな検出が完了する。
【0054】
[0085]本発明が提案する技術的適用では、チップは体積が小さく製造が簡単であり、大規模の生産が可能なので、チップに２次元バーコードを記すことと併せて、迅速で効率的な認識及び選別を実施し、抗原検出のための技術的適用のスループットは１万又は１００万レベルでさえも上回ることが可能である。
【実施例】
【0055】
[0086]以下の実施例によって本出願を詳細に説明するが、実施例で使用した主な試薬及び消耗品は以下の通りである。
【0056】
[0087]合成用固相担体：従来型チップ、１００ｎｍ酸化シリコンウェハ、３００ｎｍ酸化シリコンウェハ、つや消し石英チップ、透明石英チップ、サイズ：２×２×０．４５ｍｍ
[0088]ＡＣＮ（アセトニトリル）：Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0089]脱保護試薬：３％ ＴＣＡデブロック、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0090]活性化剤：０．２５Ｍ活性化剤、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0091]ホスホロアミダイトモノマーＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ
[0092]酸化剤：０．０５Ｍ酸化剤、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａｘｉｎｇｋｅ
[0093]ＣＡＰ Ａ：無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフラン１／１／８、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａｘｉｎｇｋｅ
[0094]ＣＡＰ Ｂ：１７．６％ｗ／ｖ ナイトロジェン－メチルイミダゾール／アセトニトリル、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0095]アンモニア水：Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ
[0096]Ｔ３０標準試料：Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ
[0097]ＴＡクローニングキット：ｐＭＤＴＭ１９－Ｔ、ＴａＫａＲａ
[0088]ＡＣＮ（アセトニトリル）：Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0089]脱保護試薬：３％ ＴＣＡデブロック、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0090]活性化剤：０．２５Ｍ活性化剤、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0091]ホスホロアミダイトモノマーＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ
[0092]酸化剤：０．０５Ｍ酸化剤、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａｘｉｎｇｋｅ
[0093]ＣＡＰ Ａ：無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフラン１／１／８、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａｘｉｎｇｋｅ
[0094]ＣＡＰ Ｂ：１７．６％ｗ／ｖ ナイトロジェン－メチルイミダゾール／アセトニトリル、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎａ Ｘｉｎｇｋｅ
[0095]アンモニア水：Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ
[0096]Ｔ３０標準試料：Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ
[0097]ＴＡクローニングキット：ｐＭＤＴＭ１９－Ｔ、ＴａＫａＲａ
【0057】
[0098]実施例１ 核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）合成用のチップの調製
[0099]まず、Ｇｕａｎｇｒｕｉｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓはカスタマイズされた２次元バーコードチップの印刷及び切断の実施を委託された。印刷には赤色レーザーを使用し、２次元バーコードのサイズは１ｍｍ×１ｍｍであり、２次元バーコードを印刷した裸のシリコンウェハは２ｍｍ×２ｍｍ×０．４５ｍｍのマイクロチップに切断し、各マイクロチップの中心には特定の２次元バーコードを印刷し、２次元バーコードを印刷し切断したチップをピラニア溶液で前処理した後、プラズマで洗浄した。その後、前処理したチップをＡＰＴＭＳを使用して簡単な負圧蒸着法でシラン化した。最後に、Ｗｕｈｕ Ｈｕａｒｅｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したユニバーサルリンカーをチップに連結させた。
[0099]まず、Ｇｕａｎｇｒｕｉｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓはカスタマイズされた２次元バーコードチップの印刷及び切断の実施を委託された。印刷には赤色レーザーを使用し、２次元バーコードのサイズは１ｍｍ×１ｍｍであり、２次元バーコードを印刷した裸のシリコンウェハは２ｍｍ×２ｍｍ×０．４５ｍｍのマイクロチップに切断し、各マイクロチップの中心には特定の２次元バーコードを印刷し、２次元バーコードを印刷し切断したチップをピラニア溶液で前処理した後、プラズマで洗浄した。その後、前処理したチップをＡＰＴＭＳを使用して簡単な負圧蒸着法でシラン化した。最後に、Ｗｕｈｕ Ｈｕａｒｅｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したユニバーサルリンカーをチップに連結させた。
【0058】
[00100]その後、酸を添加することによってリンカー分子の末端のＤＭＴ保護ヒドロキシを脱保護し、収集した溶液の色を定性的に観察した。溶液が赤の場合、リンカーの連結が成功したこと、すなわち、チップ修飾が成功したことを示していた。次に、収集した赤い溶液を定量し、すなわち、チップの表面の分子の負荷容量を判定するために、ＤＭＴをＵＶ可視分光光度計によって定量し、修飾したチップの表面のリンカーの分子数を判定した。或いは、ＤＭＴを含まないチップを６－ＦＡＭの蛍光モノマーとカップリングさせ、カップリングしたチップを洗浄した後、蛍光を観察するために蛍光顕微鏡の下に置くと、修飾したチップの品質は、蛍光の存在、強度、及び均質性によってさらに修飾したチップの品質を定性することができ、すなわち、チップ表面の高い蛍光強度及び均質な蛍光信号は、該チップの良好な品質を示す。
【0059】
[00101]具体的な修飾ステップは以下の通りである：
[00102]１．０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液１００ｍＬを調製し、２つの１００ｍＬビーカーに入れた。２次元バーコードの従来のチップ２０００個を各ビーカーに入れた。ビーカーを手で震盪することによってチップを３分間洗浄した。まず、チップを脱イオン水で３回、アセトンで３回洗浄し、空気中で乾燥させ、チップの表面をきれいにして、その後のシラン化修飾を容易にした。
[00102]１．０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液１００ｍＬを調製し、２つの１００ｍＬビーカーに入れた。２次元バーコードの従来のチップ２０００個を各ビーカーに入れた。ビーカーを手で震盪することによってチップを３分間洗浄した。まず、チップを脱イオン水で３回、アセトンで３回洗浄し、空気中で乾燥させ、チップの表面をきれいにして、その後のシラン化修飾を容易にした。
【0060】
[00103]２． ５０％シラン化試薬１００ｍＬを調製し、２つの１００ｍＬビーカーに入れた。きれいにした２次元バーコードチップ２０００個を各ビーカーに入れ、超音波機器で３０分間超音波処理し、アセトンで５回洗浄し、空気中で乾燥させた。
【0061】
[00104]５０％シラン化試薬は１％（ＡＰＴＥＳ：ＰＴＥＳ＝１：１）アセトン溶液であり、全量１００ｍＬを例にとると、成分はＡＰＴＥＳ５００μＬ、ＰＴＥＳ５００μＬ、及びアセトン９９ｍＬであった。
【0062】
[00105]３． このチップを乾燥オーブン中で８０℃で１０分間乾燥させ、その後の実験のために取り出した。
【0063】
[00106]４． リンカー１０００ｍｇ、ＨＡＴＵ８００ｍｇ、及びＤＩＰＥＡ２０００μＬを取り、アセトニトリル１００ｍＬに入れ、均一に震盪した後、５０ｍＬ遠心分離管２本に入れた。シラン化した２次元バーコードチップ２０００個を各遠心分離管に入れ、バーチカルミキサーで一晩攪拌した。反応が完了した後、チップを収集し、アセトニトリル及びアセトンでそれぞれ３回洗浄し、空気中で乾燥させた。
【0064】
[00107]その後、修飾した２次元バーコードチップ３０個を取り出し、チップ表面のＤＭＴをＴＣＡデブロックで溶出した。ＤＭＴの濃度をＵＶ－ｖｉｓ分光光度計で測定し、修飾した２次元バーコードチップ上のリンカーのグラフト密度を判定した。
【0065】
[00108]５． 修飾して乾燥させたチップは、後で使用するために５０ｍＬの遠心分離管に収集した。
【0066】
[00109]一方で、１％及び１００％のシラン化試薬がチップの修飾に与える影響を比較した。１％及び１００％のシラン化試薬それぞれを５０％シラン化試薬の代わりに使用した以外は、ステップは上記と同じであった。１％シラン化試薬は１％（ＡＰＴＥＳ：ＰＴＥＳ＝１：９９）のアセトン溶液であり、全量１００ｍＬを例にとると、その成分はＡＰＴＥＳ１０μＬ、ＰＴＥＳ９９０μＬ、及びアセトン９９ｍＬであった。１００％シラン化試薬は１％（ＡＰＴＥＳ：ＰＴＥＳ＝１：０）のアセトン溶液であり、全量１００ｍＬを例にとると、その成分はＡＰＴＥＳ１０００μＬ、ＰＴＥＳ０μＬ、及びアセトン９９ｍＬであった。最後に、３種類の異なるシラン化率で修飾したチップ上のリンカーのグラフト密度を得た。結果を表１に示す。
【0067】
[00110]チップ表面のリンカーのグラフト密度は、標的化合物の実際の合成効果とは正の関係がない、すなわち、分子クラウディングの問題が関与しているため、高いグラフト密度が必ずしもチップの良好な合成効果を生み出すとは限らないことを考えると、チップ表面に十分な数の分子を確保しながら、連結したオリゴデオキシヌクレオチド鎖が実用における最終的な合成品質及び長さに影響を与えるほど密集しないように配慮することが必要である。したがって、この実施例でシラン化試薬の最適な比率を探究する場合、リンカーのグラフト密度、１ステップ合成効率、生成物の純度、及びその他の要素を総合的に考慮する必要がある。この実施例では、異なるシラン化試薬率で修飾したチップを入手した後、そのチップを使用してＴ５ＤＮＡ配列（すなわち、ＴＴＴＴＴ（配列番号１５））を合成した。具体的な方法は実施例３に示し、最終生成物の純度及び１ステップ合成効率は表１に示す。表１の結果から、修飾に５０％シラン化試薬を使用した場合、リンカーのグラフト密度は１００％シラン化試薬ほど高くなかったが、最終生成物の純度及び得られた生成物の１ステップ合成効率は最も高かった。
【表1】
【0068】
[00111]実施例２ ポリペプチド合成用のチップの調製
[00112]最初に、Ｇｕａｎｇｒｕｉｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓはカスタマイズされた２次元バーコードチップの印刷及び切断の実施を委託された。印刷には赤色レーザーを使用し、２次元バーコードのサイズは１ｍｍ×１ｍｍであり、２次元バーコードを印刷した裸のシリコンウェハは２ｍｍ×２ｍｍ×０．４５ｍｍのマイクロチップに切断し、各マイクロチップの中心に特定の２次元バーコードを印刷し、２次元バーコードを印刷し切断したチップをピラニア溶液で前処理した後、プラズマで洗浄した。その後、前処理したチップをＡＰＴＭＳを使用することによって簡単な負圧蒸着法でシラン化した。最後に、Ａｎｎａｉｊｉから購入した４ーヒドロキシメチル安息香酸をユニバーサルリンカーとしてチップに連結させた。
[00112]最初に、Ｇｕａｎｇｒｕｉｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓはカスタマイズされた２次元バーコードチップの印刷及び切断の実施を委託された。印刷には赤色レーザーを使用し、２次元バーコードのサイズは１ｍｍ×１ｍｍであり、２次元バーコードを印刷した裸のシリコンウェハは２ｍｍ×２ｍｍ×０．４５ｍｍのマイクロチップに切断し、各マイクロチップの中心に特定の２次元バーコードを印刷し、２次元バーコードを印刷し切断したチップをピラニア溶液で前処理した後、プラズマで洗浄した。その後、前処理したチップをＡＰＴＭＳを使用することによって簡単な負圧蒸着法でシラン化した。最後に、Ａｎｎａｉｊｉから購入した４ーヒドロキシメチル安息香酸をユニバーサルリンカーとしてチップに連結させた。
【0069】
[00113]実施例３ ＤＮＡの合成
[00114]この実施例では、本発明者らは、図２に示したようなＤＮＡ合成方法及び４つの単一塩基反応タンクを使用してＤＮＡ分子を合成した。具体的なステップは以下の通りである：
[00115]Ｓ１． 合成モノマー、試薬、及び試薬タンクの調製
[00116]４つの反応タンク（第１、第２、第３、及び第４の反応タンク）は、デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧをそれぞれ添加するため、並びに各反応タンクにおいて脱保護、キャッピング、酸化、及び洗浄を行うために用意されており、
[00117]カップリングの場合、
[00118]ＤＭＴで保護された５’－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するアデニル酸並びにテトラゾールを第１の反応タンクに添加した。
[00114]この実施例では、本発明者らは、図２に示したようなＤＮＡ合成方法及び４つの単一塩基反応タンクを使用してＤＮＡ分子を合成した。具体的なステップは以下の通りである：
[00115]Ｓ１． 合成モノマー、試薬、及び試薬タンクの調製
[00116]４つの反応タンク（第１、第２、第３、及び第４の反応タンク）は、デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧをそれぞれ添加するため、並びに各反応タンクにおいて脱保護、キャッピング、酸化、及び洗浄を行うために用意されており、
[00117]カップリングの場合、
[00118]ＤＭＴで保護された５’－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するアデニル酸並びにテトラゾールを第１の反応タンクに添加した。
【0070】
[00119]ＤＭＴで保護された５’－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するグアノシン酸並びにテトラゾールを第２の反応タンクに添加した。
【0071】
[00120]ＤＭＴで保護された５’－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するシチジン酸並びにテトラゾールを第３の反応タンクに添加した。
【0072】
[00121]ＤＭＴで保護された５’－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するチミジン酸並びにテトラゾールを第４の反応タンクに添加した。
【0073】
[00122]脱保護の場合、トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液を脱保護試薬として４つの反応タンクに添加した。
【0074】
[00123]キャッピングの場合、無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフランのアセトニトリル溶液及びＮ－メチルイミダゾールをキャッピング試薬として４つの反応タンクの中に添加した。
【0075】
[00124]酸化の場合、０．０１Ｍヨウ素溶液を酸化剤として４つのタンクに添加した。
【0076】
[00125]洗浄の場合、アセトニトリルを洗浄液として４つのタンクに添加した。
【0077】
[00126]Ｓ２． チップの調製
[00127]実施例１の５０％シラン化試薬で修飾した５つの異なる種類のチップ（従来のチップ、１００ｎｍ酸化シリコンチップ、３００ｎｍ酸化シリコンチップ、つや消し石英チップ、及び透明石英チップ）を使用した。
[00127]実施例１の５０％シラン化試薬で修飾した５つの異なる種類のチップ（従来のチップ、１００ｎｍ酸化シリコンチップ、３００ｎｍ酸化シリコンチップ、つや消し石英チップ、及び透明石英チップ）を使用した。
【0078】
[00128]Ｓ３． 装置及びソフトウェアプログラムの調製
[00129]装置を用意したが、この装置には、
[00130]チップに担持された２次元バーコードを認識し、信号を生成した２次元バーコード認識装置、
[00131]チップを選別したチップ選別装置、
[00132]チップの移動を駆動した駆動装置、
[00133]試薬を様々な「タンク」に導入及び排出した試薬液駆動装置、
[00134]２次元バーコードが認識された後に２次元バーコード認識装置によって生成された信号を受信し、チップを選別するためにチップ選別装置を制御する、及び／又はチップを移動させる駆動装置を制御する命令を送信した中央処理装置、並びに
[00135]合成するＤＮＡ分子の配列、チップと２次元バーコードとの対応関係、合成するＤＮＡ分子の配列とチップとの対応関係、及び各固相マトリックスが経験した反応を保存するために使用された記憶装置が含まれる。
[00129]装置を用意したが、この装置には、
[00130]チップに担持された２次元バーコードを認識し、信号を生成した２次元バーコード認識装置、
[00131]チップを選別したチップ選別装置、
[00132]チップの移動を駆動した駆動装置、
[00133]試薬を様々な「タンク」に導入及び排出した試薬液駆動装置、
[00134]２次元バーコードが認識された後に２次元バーコード認識装置によって生成された信号を受信し、チップを選別するためにチップ選別装置を制御する、及び／又はチップを移動させる駆動装置を制御する命令を送信した中央処理装置、並びに
[00135]合成するＤＮＡ分子の配列、チップと２次元バーコードとの対応関係、合成するＤＮＡ分子の配列とチップとの対応関係、及び各固相マトリックスが経験した反応を保存するために使用された記憶装置が含まれる。
【0079】
[00136]さらに、合成する標的ＤＮＡの配列に応じて制御プログラムを設計し、予め決定されたＤＮＡ配列に応じてチップの選別方法を決定した。
【0080】
[00137]Ｓ４． ＤＮＡ合成
[00138]まず、全チップを混合し、チップに予め印刷された２次元バーコードを認識装置によって認識した。中央処理装置は、認識装置によって生成された認識信号に従ってチップを選別するためにチップ選別装置を制御し、予め設定された制御プログラムに従って各チップを所望の反応タンクに移動させるために駆動装置を制御し、次に以下のことを実現するために試薬液駆動装置を制御した：脱保護のために脱保護試薬を反応タンクに導入し、反応が完了した後に脱保護試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、その後カップリングのために反応タンクに対応するモノマーに応じてカップリング試薬を導入し、反応が完了した後にカップリング試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、最後にキャッピング、酸化、及び洗浄それぞれのためにキャッピング試薬、酸化試薬、及び洗浄液を再度順番に導入し、この時点で１サイクルが完了し、すなわち、１塩基の付加／カップリングが完了した。具体的な操作ステップ、使用した試薬、及び反応時間を表２に示す。
[00138]まず、全チップを混合し、チップに予め印刷された２次元バーコードを認識装置によって認識した。中央処理装置は、認識装置によって生成された認識信号に従ってチップを選別するためにチップ選別装置を制御し、予め設定された制御プログラムに従って各チップを所望の反応タンクに移動させるために駆動装置を制御し、次に以下のことを実現するために試薬液駆動装置を制御した：脱保護のために脱保護試薬を反応タンクに導入し、反応が完了した後に脱保護試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、その後カップリングのために反応タンクに対応するモノマーに応じてカップリング試薬を導入し、反応が完了した後にカップリング試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、最後にキャッピング、酸化、及び洗浄それぞれのためにキャッピング試薬、酸化試薬、及び洗浄液を再度順番に導入し、この時点で１サイクルが完了し、すなわち、１塩基の付加／カップリングが完了した。具体的な操作ステップ、使用した試薬、及び反応時間を表２に示す。
【0081】
[00139]１つの塩基のカップリングが完了した後、ＤＮＡ分子の合成が完了するまで、予め決定されたＤＮＡ合成の配列情報に従って、上記のステップを繰り返した。
【表2】
【0082】
[00140]Ｓ５． ＤＮＡの分離及び精製
[00141]ＤＮＡ合成が完了した後、アンモノリシスのために全チップを収集し、合成した全ＤＮＡ分子を分離し精製した。或いは、２次元バーコードを使用して全チップを認識することができ、標的チップを選別して収集してアンモノリシスを行い、それによって標的ＤＮＡ分子を分離し精製した。
[00141]ＤＮＡ合成が完了した後、アンモノリシスのために全チップを収集し、合成した全ＤＮＡ分子を分離し精製した。或いは、２次元バーコードを使用して全チップを認識することができ、標的チップを選別して収集してアンモノリシスを行い、それによって標的ＤＮＡ分子を分離し精製した。
【0083】
[00142]この実施例では、Ｔ３０ＤＮＡ（配列：ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１６））合成のために５種類の異なるチップを選択し、この５種類のチップは、従来のチップ、１００ｎｍ酸化チップ、３００ｎｍ酸化チップ、つや消し石英チップ、及び透明石英チップであった。具体的なステップは以下の通りである。
【0084】
[00143]（１）実験１－Ｔ３０
[00144]従来のチップ（仕様：２×２×０．４５ｍｍ、両面とも２次元バーコードを有する）４０個を取り出して混合し、合成の標的配列に従って、このサイクルで添加するモノマーを決定した。チップ選別装置で選別を実施した後、同じモノマーで合成するチップを同じ反応タンクに選別し、ＣａｐＡ７５μＬ及びＣａｐＢ７５μＬからなるキャッピング試薬を添加した。チップを反応タンクに１回浸漬し、キャッピング試薬を排出し、未使用のキャッピング試薬をもう１回添加した後にチップをもう１回反応させるために浸漬し、合計４０秒間キャッピング反応を実施し、その後キャッピング試薬を排出し、３回洗浄するためにアセトニトリルを添加した。使用したアセトニトリルを排出し、脱保護試薬ＴＣＡ１５０μＬを添加し、１５秒間脱保護反応を実施した。使用した脱保護試薬を排出した後、未使用の脱保護試薬を再度加えて１５秒間１回反応させた。脱保護ステップが完了した後、使用した脱保護試薬を排出し、３回洗浄するためにアセトニトリル２５０μＬを添加した。アセトニトリルを排出した後、ホスホロアミダイトモノマーＴ４０μＬ及び活性化剤ＡＣＴ６０μＬを添加し、カップリング反応を６０秒間実施した。使用した試薬を排出した後、未使用の試薬をもう１回添加して反応させ、２つの反応を合計１２０秒間実施した。カップリングステップを完了した。使用したカップリング試薬を排出し、１回洗浄するためにアセトニトリル２５０μＬを添加した。アセトニトリルを排出し、ｃａｐＡ７５μＬ及びｃａｐＢ７５μＬからなるキャッピング試薬を添加した。キャッピング反応を１回実施した。使用したキャッピング試薬を排出した後、未使用のキャッピング試薬をもう１回添加し、２回のキャッピング反応を合計４０秒間実施した。使用したキャッピング試薬を排出し、１回洗浄するためにアセトニトリル２５０μＬを添加した。アセトニトリルを排出し、酸化剤１５０μＬを添加し、酸化反応を２０秒間実施した。使用した試薬を排出した後、未使用の試薬をもう１回添加した。２回の酸化反応を合計４０秒間実施した。使用した酸化試薬を排出し、アセトニトリル２５０μＬを３回添加した。１サイクルはこの時点で完了した。上記のステップを３０回繰り返し、その後最後に脱保護を実施し、アンモノリシスをアンモニア水で実施し、処理後にＴ３０生成物を得た。１チップの合成量はＮａｎｏｄｒｏｐによって定量的に測定し、ＨＰＬＣ純度はＨＰＬＣ分析によって測定した。１ステップ合成効率を算出した（１ステップ合成効率はＨＰＬＣ純度分析によって得られた）。例えば、合成Ｔ１０のＨＰＬＣ純度が８０％だった場合、１ステップ合成効率は
であった。ＨＰＬＣの結果は図４Ａに示している。
[00144]従来のチップ（仕様：２×２×０．４５ｍｍ、両面とも２次元バーコードを有する）４０個を取り出して混合し、合成の標的配列に従って、このサイクルで添加するモノマーを決定した。チップ選別装置で選別を実施した後、同じモノマーで合成するチップを同じ反応タンクに選別し、ＣａｐＡ７５μＬ及びＣａｐＢ７５μＬからなるキャッピング試薬を添加した。チップを反応タンクに１回浸漬し、キャッピング試薬を排出し、未使用のキャッピング試薬をもう１回添加した後にチップをもう１回反応させるために浸漬し、合計４０秒間キャッピング反応を実施し、その後キャッピング試薬を排出し、３回洗浄するためにアセトニトリルを添加した。使用したアセトニトリルを排出し、脱保護試薬ＴＣＡ１５０μＬを添加し、１５秒間脱保護反応を実施した。使用した脱保護試薬を排出した後、未使用の脱保護試薬を再度加えて１５秒間１回反応させた。脱保護ステップが完了した後、使用した脱保護試薬を排出し、３回洗浄するためにアセトニトリル２５０μＬを添加した。アセトニトリルを排出した後、ホスホロアミダイトモノマーＴ４０μＬ及び活性化剤ＡＣＴ６０μＬを添加し、カップリング反応を６０秒間実施した。使用した試薬を排出した後、未使用の試薬をもう１回添加して反応させ、２つの反応を合計１２０秒間実施した。カップリングステップを完了した。使用したカップリング試薬を排出し、１回洗浄するためにアセトニトリル２５０μＬを添加した。アセトニトリルを排出し、ｃａｐＡ７５μＬ及びｃａｐＢ７５μＬからなるキャッピング試薬を添加した。キャッピング反応を１回実施した。使用したキャッピング試薬を排出した後、未使用のキャッピング試薬をもう１回添加し、２回のキャッピング反応を合計４０秒間実施した。使用したキャッピング試薬を排出し、１回洗浄するためにアセトニトリル２５０μＬを添加した。アセトニトリルを排出し、酸化剤１５０μＬを添加し、酸化反応を２０秒間実施した。使用した試薬を排出した後、未使用の試薬をもう１回添加した。２回の酸化反応を合計４０秒間実施した。使用した酸化試薬を排出し、アセトニトリル２５０μＬを３回添加した。１サイクルはこの時点で完了した。上記のステップを３０回繰り返し、その後最後に脱保護を実施し、アンモノリシスをアンモニア水で実施し、処理後にＴ３０生成物を得た。１チップの合成量はＮａｎｏｄｒｏｐによって定量的に測定し、ＨＰＬＣ純度はＨＰＬＣ分析によって測定した。１ステップ合成効率を算出した（１ステップ合成効率はＨＰＬＣ純度分析によって得られた）。例えば、合成Ｔ１０のＨＰＬＣ純度が８０％だった場合、１ステップ合成効率は
【数1】
であった。ＨＰＬＣの結果は図４Ａに示している。
【0085】
[00145]さらに、脱保護の１回目のサイクルの前にキャッピング処理を実施して末端基が完成していないチップ表面の領域を塞ぎ、こうして構築単位をカップリングできないようにして、合成効率を向上させることに注意されたい。２回目のサイクルからは、再度キャッピングを行う必要はないが、認識及び選別から「脱保護－カップリング－キャッピング－酸化」のステップを実施した。合成が完了するまでこのサイクルを実施した。
【0086】
[00146]（２）実験２－Ｔ３０
[00147]１００ｎｍの酸化チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｂに示している。
[00147]１００ｎｍの酸化チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｂに示している。
【0087】
[00148]（３）実験３－Ｔ３０
[00149]３００ｎｍの酸化チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｃに示している。
[00149]３００ｎｍの酸化チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｃに示している。
【0088】
[00150]（４）実験４－Ｔ３０
[00151]つや消し石英チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｄに示している。
[00151]つや消し石英チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｄに示している。
【0089】
[00152]（５）実験５－Ｔ３０
[00153]透明石英チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｅに示している。
[00153]透明石英チップ４０個を取り出して、Ｔ３０ＤＮＡを合成した。具体的なステップは、実験１と同じであった。ＨＰＬＣの結果は図４Ｅに示している。
【0090】
[00154]上記５つの実験のＤＮＡ合成結果をまとめ、結果は表３に示している。表３から、透明石英チップを使用して実施したＤＮＡ合成で、生成物の純度及び１ステップ合成効率が最も高かったことがわかる。１ステップ合成効率が最も低い１００ｎｍ酸化チップと比較して、１ステップ合成効率は２．５％増加しており、すなわち、各サイクルの合成効率は９６．８％から９９．３％に増加しており、全合成過程には３０サイクルが必要なため、全合成過程後の生成物の純度は３７．９％から８１．０％へと大幅に向上した。合成した配列が長く、反応サイクル数が多いほど、生成物の純度がより顕著に向上している。
【表3】
【0091】
[00155]（６）実験６：透明石英チップに基づいた５９ｎｔオリゴヌクレオチドの合成、遺伝子アセンブリ試験、及び配列決定結果の分析
[00156]合成に最適な担体をさらに特定するために、透明石英チップを使用して５９ｎｔのオリゴヌクレオチドを１４個合成し、その配列を表４に示している。１ステップのＰＣＡ／ＰＣＲ反応戦略に基いた小断片遺伝子アセンブリ及びゲル電気泳動像によって、標的バンドの正確さを確認した。最終的に、ゲル切断及び回収、ＴＡクローニングによる形質転換、並びにサンガー配列決定法の後、最適な固相合成担体を特定した。
[00156]合成に最適な担体をさらに特定するために、透明石英チップを使用して５９ｎｔのオリゴヌクレオチドを１４個合成し、その配列を表４に示している。１ステップのＰＣＡ／ＰＣＲ反応戦略に基いた小断片遺伝子アセンブリ及びゲル電気泳動像によって、標的バンドの正確さを確認した。最終的に、ゲル切断及び回収、ＴＡクローニングによる形質転換、並びにサンガー配列決定法の後、最適な固相合成担体を特定した。
【表4】
【0092】
[00157]具体的なステップは以下の通りである：
[00158]透明石英チップの４２個を取り出して、実施例３の実験１の方法に従ってオリゴヌクレオチドを合成した。脱保護を実施して上記の表に挙げた配列のオリゴヌクレオチド１４個を合成した。各オリゴヌクレオチドは、３個のチップを使用して並行して合成し（すなわち、各配列は並行試験の３群を使用して合成した）、合計で４２個のオリゴヌクレオチドを合成した。アンモノリシスのために４２個のプライマー３＊（５９ｎｔ－１～５９ｎｔ－１４）を３群（１４個／群）に分けた。処理後、５９ｎｔ混合生成物３群各５０μＬが得られた。試料１０μＬにｄＮＴＰ４μＬ、緩衝液５μＬ、ヘッドテールプライマー４μＬ、及びＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬそれぞれを添加した。水を補給して体積を５０μＬにし、１ステップＰＣＡ／ＰＣＲ反応のために混合物は均一に混合した。ＰＣＲ増幅３５サイクル後、生成物を１２℃で保存した。ＰＣＲ生成物２μＬをゲルウェルにスポットし、電圧を１８０Ｖに調整し、電気泳動時間は３０分とした。結果を図５に示す。図５から、透明石英チップで合成した５９ｎｔのプライマーによって組み立てられた５６０ｂｐ遺伝子バンドは、標準的な合成プライマーと比較して明確で正確あることがわかる。
[00158]透明石英チップの４２個を取り出して、実施例３の実験１の方法に従ってオリゴヌクレオチドを合成した。脱保護を実施して上記の表に挙げた配列のオリゴヌクレオチド１４個を合成した。各オリゴヌクレオチドは、３個のチップを使用して並行して合成し（すなわち、各配列は並行試験の３群を使用して合成した）、合計で４２個のオリゴヌクレオチドを合成した。アンモノリシスのために４２個のプライマー３＊（５９ｎｔ－１～５９ｎｔ－１４）を３群（１４個／群）に分けた。処理後、５９ｎｔ混合生成物３群各５０μＬが得られた。試料１０μＬにｄＮＴＰ４μＬ、緩衝液５μＬ、ヘッドテールプライマー４μＬ、及びＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬそれぞれを添加した。水を補給して体積を５０μＬにし、１ステップＰＣＡ／ＰＣＲ反応のために混合物は均一に混合した。ＰＣＲ増幅３５サイクル後、生成物を１２℃で保存した。ＰＣＲ生成物２μＬをゲルウェルにスポットし、電圧を１８０Ｖに調整し、電気泳動時間は３０分とした。結果を図５に示す。図５から、透明石英チップで合成した５９ｎｔのプライマーによって組み立てられた５６０ｂｐ遺伝子バンドは、標準的な合成プライマーと比較して明確で正確あることがわかる。
【0093】
[00159]さらに、正確なバンドを有するＰＣＲ産物を含むゲルを切断して回収し、その後ＴａＫａＲａ ＣｏｍｐａｎｙのＴＡクローニングキット（ＰＭＤＴＭ１９－Ｔ）をクローニング及び形質転換実験のために使用した。コロニーＰＣＲによって確認された正確なバンドを有するＴＡクローン形質転換体をサンガー配列決定法に送った。サンガー配列決定の結果を表５に示す。３群の並列実験の平均エラー率は０．３４％であった。
[00160]異なる種類の２次元バーコードチップの化学修飾及び修飾したチップでの浸漬－認識－選別に基づいた一連の５９ｎｔオリゴヌクレオチド合成及び遺伝子合成及び配列決定によって、並びに複数のチップの合成のＨＰＬＣ分析結果の比較によって、化学修飾によって修飾した２次元バーコードチップを使用してオリゴヌクレオチドを合成することができ、透明石英チップが最も優れた合成効果を有することが示されている。対応するＴ３０プライマーの１チップ合成量は２６．８ｐｍｏｌで、ＨＰＬＣ純度は８１．０％で、１ステップ合成効率は９９．３％に達した。最終的に、５９ｎｔプライマーの１４個の合成、小断片のアセンブリ、及びサンガー配列決定によって、透明石英チップが優れた効果を有し、混合群の配列決定結果のエラー率は０．３％に低下したことをさらに確認した。
【表5】
[00160]異なる種類の２次元バーコードチップの化学修飾及び修飾したチップでの浸漬－認識－選別に基づいた一連の５９ｎｔオリゴヌクレオチド合成及び遺伝子合成及び配列決定によって、並びに複数のチップの合成のＨＰＬＣ分析結果の比較によって、化学修飾によって修飾した２次元バーコードチップを使用してオリゴヌクレオチドを合成することができ、透明石英チップが最も優れた合成効果を有することが示されている。対応するＴ３０プライマーの１チップ合成量は２６．８ｐｍｏｌで、ＨＰＬＣ純度は８１．０％で、１ステップ合成効率は９９．３％に達した。最終的に、５９ｎｔプライマーの１４個の合成、小断片のアセンブリ、及びサンガー配列決定によって、透明石英チップが優れた効果を有し、混合群の配列決定結果のエラー率は０．３％に低下したことをさらに確認した。
【0094】
[00161]上記の実施例及び実験結果は、本発明が提案するバイオチップをＤＮＡ合成に使用することができることを示しており、最終的な試験結果は、透明石英チップが現在主流である商業的合成に匹敵する良好な合成効果を有することを示している。本発明が提案した化学修飾バイオチップは、実現可能であり、応用の見通しが良好であることをさらに示している。
【0095】
[00162]実施例４ ＲＮＡの合成
[00163]この実施例では、本発明者らは、浸漬－選別に基づくＲＮＡ合成方法及びＲＮＡ分子の合成のための４つの単一塩基反応タンクを使用した。具体的なステップは以下の通りである：
[00164]Ｓ１． 合成モノマー、反応試薬及び「タンク」の調製
[00165]４つのタンク（第１、第２、第３、及び第４の反応タンク）は、リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、及びＧをそれぞれ添加し、各反応タンクにおける脱保護、キャッピング、酸化、及び洗浄のために用意されており、
[00166]カップリングの場合、
[00167]ＤＭＴで保護された５'－ヒドロキシ及びＴＢＤＭＳで保護された２'－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するアデニル酸並びにテトラゾールを第１の反応タンクに添加した。
[00163]この実施例では、本発明者らは、浸漬－選別に基づくＲＮＡ合成方法及びＲＮＡ分子の合成のための４つの単一塩基反応タンクを使用した。具体的なステップは以下の通りである：
[00164]Ｓ１． 合成モノマー、反応試薬及び「タンク」の調製
[00165]４つのタンク（第１、第２、第３、及び第４の反応タンク）は、リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、及びＧをそれぞれ添加し、各反応タンクにおける脱保護、キャッピング、酸化、及び洗浄のために用意されており、
[00166]カップリングの場合、
[00167]ＤＭＴで保護された５'－ヒドロキシ及びＴＢＤＭＳで保護された２'－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するアデニル酸並びにテトラゾールを第１の反応タンクに添加した。
【0096】
[00168]ＤＭＴで保護された５'－ヒドロキシ及びＴＢＤＭＳで保護された２'－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するグアノシン酸並びにテトラゾールを第２の反応タンクに添加した。
【0097】
[00169]ＤＭＴで保護された５'－ヒドロキシ及びＴＢＤＭＳで保護された２'－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するシチジン酸並びにテトラゾールを第３の反応タンクに添加した。
【0098】
[00170]ＤＭＴで保護された５'－ヒドロキシ及びＴＢＤＭＳによって保護された２'－ヒドロキシ及びホスホロアミダイト基で保護された３’－ヒドロキシを有するチミジン酸並びにテトラゾールを第４の反応タンクに添加した。
【0099】
[00171]脱保護の場合、トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液を脱保護試薬として４つの反応タンクに添加した。
【0100】
[00172]キャッピングの場合、無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフランのアセトニトリル溶液及びＮ－メチルイミダゾールをキャッピング試薬として４つの反応タンクの中に添加した。
【0101】
[00173]酸化の場合、０．０１Ｍヨウ素溶液を酸化剤として４つのタンクに添加した。
【0102】
[00174]洗浄の場合、アセトニトリルを洗浄液として４つのタンクに添加した。
【0103】
[00175]Ｓ２． チップの調製
[00176]実施例１の５０％シラン化試薬で修飾したチップを使用した。
[00176]実施例１の５０％シラン化試薬で修飾したチップを使用した。
【0104】
[00177]Ｓ３． 装置及びソフトウェアプログラムの調製
[00178]装置を用意したが、この装置には
[00179] チップに担持された２次元バーコードを認識し、信号を生成した２次元バーコード認識装置、
[00180] チップを選別したチップ選別装置、
[00181] チップの移動を駆動した駆動装置、
[00182] 試薬を様々な「タンク」に導入及び排出した試薬液駆動装置、
[00183] ２次元バーコードが認識された後に２次元バーコード認識装置によって生成された信号を受信し、チップを選別するためにチップ選別装置を制御する、及び／又はチップを移動させる駆動装置を制御する命令を送信した中央処理装置、並びに
[00184] 合成するＲＮＡ分子の配列、チップと２次元バーコードとの対応関係、合成するＲＮＡ分子の配列とチップとの対応関係、及び各チップが経験した反応を保存するために使用された記憶装置が含まれる。
[00178]装置を用意したが、この装置には
[00179] チップに担持された２次元バーコードを認識し、信号を生成した２次元バーコード認識装置、
[00180] チップを選別したチップ選別装置、
[00181] チップの移動を駆動した駆動装置、
[00182] 試薬を様々な「タンク」に導入及び排出した試薬液駆動装置、
[00183] ２次元バーコードが認識された後に２次元バーコード認識装置によって生成された信号を受信し、チップを選別するためにチップ選別装置を制御する、及び／又はチップを移動させる駆動装置を制御する命令を送信した中央処理装置、並びに
[00184] 合成するＲＮＡ分子の配列、チップと２次元バーコードとの対応関係、合成するＲＮＡ分子の配列とチップとの対応関係、及び各チップが経験した反応を保存するために使用された記憶装置が含まれる。
【0105】
[00185]さらに、合成する標的ＲＮＡの配列に応じて制御プログラムを設計し、予め決定されたＲＮＡ配列に応じてチップ選別方法及び移動方法を決定した。
【0106】
[00186]Ｓ４． ＲＮＡ合成
[00187]まず、チップ１００個を混合し、チップに予め印刷された２次元バーコードを認識装置によって認識した。中央処理装置は、認識装置によって生成された認識信号に従ってチップを選別するためにチップ選別装置を制御し、予め決定された制御プログラムに従って各チップを所望の反応タンクに移動させるために駆動装置を制御し、次に以下のことを実現するために試薬液駆動装置を制御した：脱保護のために脱保護試薬を反応タンクに導入し、反応が完了した後に脱保護試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、その後カップリングのために反応タンクに対応するモノマーに応じてカップリング試薬を導入し、反応が完了した後にカップリング試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、最後にキャッピング、酸化、及び洗浄それぞれのためにキャッピング試薬、酸化試薬、及び洗浄液を再度順番に導入し、この時点で１サイクルが完了し、すなわち、１塩基の付加／結合が完了した。具体的な操作ステップ、使用した試薬、及び反応時間を表６に示す。
[00187]まず、チップ１００個を混合し、チップに予め印刷された２次元バーコードを認識装置によって認識した。中央処理装置は、認識装置によって生成された認識信号に従ってチップを選別するためにチップ選別装置を制御し、予め決定された制御プログラムに従って各チップを所望の反応タンクに移動させるために駆動装置を制御し、次に以下のことを実現するために試薬液駆動装置を制御した：脱保護のために脱保護試薬を反応タンクに導入し、反応が完了した後に脱保護試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、その後カップリングのために反応タンクに対応するモノマーに応じてカップリング試薬を導入し、反応が完了した後にカップリング試薬を排出し、洗浄液を導入してチップを洗浄し、最後にキャッピング、酸化、及び洗浄それぞれのためにキャッピング試薬、酸化試薬、及び洗浄液を再度順番に導入し、この時点で１サイクルが完了し、すなわち、１塩基の付加／結合が完了した。具体的な操作ステップ、使用した試薬、及び反応時間を表６に示す。
【0107】
[00188]１つの塩基カップリングが完了した後、１０００個のＲＮＡ分子の合成が完了するまで、予め決定されたＲＮＡ合成の配列情報に従って、上記のステップを繰り返した。
【表6】
【0108】
[00189]Ｓ５、ＲＮＡの分離及び精製
[00190]ＲＮＡ合成が終了した後、アンモノリシスのためにチップ１０００個を収集し、合成した全ＲＮＡ分子全てを分離し精製した。或いは、２次元バーコードを使用してチップ１０００個を認識することができ、標的チップを選別して収集してアンモノリシスを行い、それによって標的ＲＮＡ分子を分離し精製した。
[00190]ＲＮＡ合成が終了した後、アンモノリシスのためにチップ１０００個を収集し、合成した全ＲＮＡ分子全てを分離し精製した。或いは、２次元バーコードを使用してチップ１０００個を認識することができ、標的チップを選別して収集してアンモノリシスを行い、それによって標的ＲＮＡ分子を分離し精製した。
【0109】
[00191]各チップで合成されたＲＮＡ分子を分離、精製、及び配列決定した。合成された各ＲＮＡ分子が期待された標的配列を有することが、配列決定の結果から示された。
【0110】
[00192]実施例５ ポリペプチドの合成
[00193]この実施例では、本発明者らは、図３に示したような浸漬－選別に基づいたポリペプチド合成方法及びポリペプチド合成用の２１個のアミノ酸反応タンクを使用した。具体的なステップは以下の通りである：
[00194]Ｓ１． 合成モノマー、反応試薬及び「タンク」の調製
[00195]２３個のタンクであって、
[00196] それぞれ異なるアミノ酸モノマーを添加するために用意されており、各合成タンクが、Ｆｍｏｃで保護されたα－アミノ基、側鎖が保護された（側鎖が存在する場合）アミノ酸モノマー、並びにテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｎ－メチルモルホリン及びＤＭＦを含有する２１個の合成タンク（２１個の従来のアミノ酸モノマーに対応）、
[00197] ２０％ピペリジンを含有するＤＭＦ溶液を脱保護剤として使用した脱保護タンク、
[00198] 洗浄液としてＤＭＦ／ＤＣＭを含有した洗浄タンクを用意した。
[00193]この実施例では、本発明者らは、図３に示したような浸漬－選別に基づいたポリペプチド合成方法及びポリペプチド合成用の２１個のアミノ酸反応タンクを使用した。具体的なステップは以下の通りである：
[00194]Ｓ１． 合成モノマー、反応試薬及び「タンク」の調製
[00195]２３個のタンクであって、
[00196] それぞれ異なるアミノ酸モノマーを添加するために用意されており、各合成タンクが、Ｆｍｏｃで保護されたα－アミノ基、側鎖が保護された（側鎖が存在する場合）アミノ酸モノマー、並びにテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｎ－メチルモルホリン及びＤＭＦを含有する２１個の合成タンク（２１個の従来のアミノ酸モノマーに対応）、
[00197] ２０％ピペリジンを含有するＤＭＦ溶液を脱保護剤として使用した脱保護タンク、
[00198] 洗浄液としてＤＭＦ／ＤＣＭを含有した洗浄タンクを用意した。
【0111】
[00199]Ｓ２． チップの調製
[00200]実施例２で調製したチップを使用した。
[00200]実施例２で調製したチップを使用した。
【0112】
[00201]Ｓ３． 装置及びソフトウェアプログラムの調製
[00202]装置を用意したが、この装置には
[00203] チップに担持された２次元バーコードを認識し、信号を生成した２次元バーコード認識装置、
[00204] チップを選別したチップ選別装置、
[00205] チップの移動を駆動した駆動装置、
[00206] 試薬を様々な「タンク」に導入及び排出した試薬液駆動装置、
[00207] ２次元バーコードが認識された後に２次元バーコード認識装置によって生成された信号を受信し、チップを選別するためにチップ選別装置を制御する、及び／又はチップを移動する駆動装置を制御する命令を送信した中央処理装置、並びに
[00208] 合成するペプチドの配列、チップと２次元バーコードとの対応関係、合成するペプチドの配列とチップとの対応関係、及び各チップが経験する反応を保存するために使用された記憶装置が含まれる。
[00202]装置を用意したが、この装置には
[00203] チップに担持された２次元バーコードを認識し、信号を生成した２次元バーコード認識装置、
[00204] チップを選別したチップ選別装置、
[00205] チップの移動を駆動した駆動装置、
[00206] 試薬を様々な「タンク」に導入及び排出した試薬液駆動装置、
[00207] ２次元バーコードが認識された後に２次元バーコード認識装置によって生成された信号を受信し、チップを選別するためにチップ選別装置を制御する、及び／又はチップを移動する駆動装置を制御する命令を送信した中央処理装置、並びに
[00208] 合成するペプチドの配列、チップと２次元バーコードとの対応関係、合成するペプチドの配列とチップとの対応関係、及び各チップが経験する反応を保存するために使用された記憶装置が含まれる。
【0113】
[00209]さらに、合成する標的ペプチドの配列に応じて制御プログラムを設計し、予め決定されたペプチドの配列に応じてチップ選別方法及び移動方法を決定した。
【0114】
[00210]Ｓ４． ポリペプチド合成
[00211]まず、チップ１０００個を脱保護のために脱保護タンクに入れ、反応完了後、２回洗浄するために洗浄タンクに移動し、その後チップに予め印刷された２次元バーコードを認識装置によって認識した。中央処理装置は、認識装置によって生成された認識信号に従ってチップを選別するためにチップ選別装置を制御し、カップリング反応のために予め決定された制御プログラムに従って各チップを所望の反応タンクに移動するために駆動装置を制御した。カップリング反応が完了した後、チップ全てを２回洗浄するために洗浄タンクに移動し、こうして１アミノ酸の付加／結合が完了した。上記ステップの各反応では、試薬液駆動装置を使用することによって、反応開始前に対応する試薬をタンクに導入し、反応が完了した後にタンクから排出した。具体的な操作ステップ、使用した試薬、及び反応時間を表７に示す。
[00211]まず、チップ１０００個を脱保護のために脱保護タンクに入れ、反応完了後、２回洗浄するために洗浄タンクに移動し、その後チップに予め印刷された２次元バーコードを認識装置によって認識した。中央処理装置は、認識装置によって生成された認識信号に従ってチップを選別するためにチップ選別装置を制御し、カップリング反応のために予め決定された制御プログラムに従って各チップを所望の反応タンクに移動するために駆動装置を制御した。カップリング反応が完了した後、チップ全てを２回洗浄するために洗浄タンクに移動し、こうして１アミノ酸の付加／結合が完了した。上記ステップの各反応では、試薬液駆動装置を使用することによって、反応開始前に対応する試薬をタンクに導入し、反応が完了した後にタンクから排出した。具体的な操作ステップ、使用した試薬、及び反応時間を表７に示す。
【0115】
[00212]１アミノ酸のカップリングが完了した後、１０００個のポリペプチド分子が合成されるまで、ポリペプチドの予め決定された配列情報に従って、上記のステップを繰り返した。
【表7】
【0116】
[00213]Ｓ５．ポリペプチドの分離及び精製
[00214]ポリペプチド合成が終了した後、解離のためにチップ１０００個を収集し、合成したポリペプチド分子全てを分離し精製した。或いは、２次元バーコードを使用してチップ１０００個を認識し、標的チップを選別して収集して解離を行い、それによって標的ポリペプチド分子を分離し精製した。
[00214]ポリペプチド合成が終了した後、解離のためにチップ１０００個を収集し、合成したポリペプチド分子全てを分離し精製した。或いは、２次元バーコードを使用してチップ１０００個を認識し、標的チップを選別して収集して解離を行い、それによって標的ポリペプチド分子を分離し精製した。
【0117】
[00215]各チップによって合成されたポリペプチド分子を分離、精製、及び配列決定した。合成された各ポリペプチド分子が期待された標的配列を有することが、配列決定の結果から示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-08-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
化学物質及びコードを担持するバイオチップであって、前記コードが前記バイオチップと一意の対応関係を有するバイオチップ。
【請求項2】
前記化学物質が反応試薬と反応することができ、それによって前記反応試薬中のモノマーを前記化学物質の末端に連結する、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項3】
前記化学物質がＤＮＡ／ＲＮＡ合成反応を開始することができるリンカー分子であり、好ましくはアミノ基と反応する官能基を開始末端に有し、酸に不安定な保護基で保護されたヒドロキシを末端に有するリンカー分子であり、より好ましくはユニバーサルリンカーである、請求項２に記載のバイオチップ。
【請求項4】
前記化学物質がポリペプチド合成反応を開始することができるリンカー分子であり、好ましくはアミノ基と反応する官能基を開始末端に有し、アミノ酸モノマーのカルボキシとカップリングする官能基を末端に有し、最終的に前記ポリペプチド合成反応が終了した後に酸で処理すると解離することができるリンカー分子であり、より好ましくは４－ヒドロキシメチル安息香酸である、請求項２に記載のバイオチップ。
【請求項5】
前記コードが、数字、記号、グラフ及び／又は識別コードを含む、前記バイオチップの識別情報の特定の特性であり、好ましくは、前記コードが２次元バーコードである、請求項１～４のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項6】
前記バイオチップが、前記バイオチップが、非研磨片面２次元バーコードチップ、非研磨両面２次元バーコードチップ、片面研磨片面２次元バーコードチップ、片面研磨両面２次元バーコードチップ、両面研磨片面２次元バーコードチップ及び両面研磨両面２次元バーコードチップから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項7】
前記バイオチップのサイズが２ｍｍ×２ｍｍ未満、好ましくは０．５ｍｍ×０．５ｍｍである、請求項１～６のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項8】
前記バイオチップが、シリコンウェハ（シリコン結晶）、ガラスシート（ビーズ）、セラミック、シートメタル、プラスチックシート（ビーズ）、ゲル、ナイロン膜、又はそれらの任意の組み合わせから選択される材料、好ましくはシリコンウェハで形成されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項9】
（４）前記バイオチップが多孔質ガラスで形成されており、前記多孔質ガラスの粒径が５μｍ～２０００μｍであり、前記多孔質ガラスの孔径が２００Å～５０００Åである、請求項１～８のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項10】
（６）前記バイオチップが、１００ｎｍ酸化シリコンウェハ、３００ｎｍ酸化シリコンウェハ、つや消し石英チップ、又は透明石英チップから選択され、好ましくは、前記バイオチップが透明石英チップである、請求項１～９のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項11】
（７）前記バイオチップが、シラン化試薬で処理された表面を有し、好ましくは前記シラン化試薬がＡＰＴＭＳ又はＡＰＴＥＳから選択され、より好ましくは前記シラン化試薬が５０％シラン化試薬である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のバイオチップを調製する方法であって、以下のステップ：１）前記バイオチップをコード化するステップ、
２）前記バイオチップを前処理するステップ、
３）前記バイオチップの表面にシラン化処理を実施するステップ、
４）前記バイオチップの表面を化学修飾するステップ、及び
５）任意選択で、前記化学修飾を検出又は定量的に分析するステップ
を含む方法。
【請求項13】
前記前処理が、酸処理、アルカリ処理、超音波処理、プラズマ洗浄、アセトン洗浄、又はそれらの組み合わせを含み、前記酸が硫酸、塩酸、リン酸、及びピラニア液から選択され、前記アルカリが水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムから選択され、好ましくは前記前処理方法が酸処理に続くプラズマ洗浄であり、より好ましくは前記前処理方法が水酸化ナトリウム処理に続くプラズマ洗浄及びアセトン洗浄である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記バイオチップの表面の化学修飾が、前記バイオチップの表面での化学物質の連結によって実現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
２次元バーコードがレーザー印刷によって前記バイオチップに印刷されており、好ましくは、コード化が赤色レーザーを使用してドット２次元バーコード方式によって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記バイオチップをシラン化試薬に浸漬し、超音波処理を実施することによって、シラン化処理を前記バイオチップの表面に実施し、好ましくは前記シラン化試薬がＡＰＴＥＳ及びＰＴＥＳを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記シラン化試薬が５０％シラン化試薬である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
生体高分子の合成における、請求項１～１１のいずれか一項に記載のバイオチップ又は請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法を使用することによって調製されたバイオチップの使用。
【請求項19】
前記生体高分子が核酸又はポリペプチドである、請求項１８に記載の使用。
【請求項20】
核酸を合成する方法であって、以下のステップ：（１）請求項１～１１のいずれか一項に記載のバイオチップ又は請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法を使用することによって調製されたバイオチップを用意するステップであり、前記バイオチップに担持されたコードが合成する核酸の配列に対応しているステップ、
（２）デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧ又はリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、及びＧの付加のために、並びに反応タンクそれぞれにおける脱保護、キャッピング、酸化、及び洗浄のためにそれぞれ使用される４つの反応タンクを用意するステップ、
（３）前記バイオチップに担持された前記コードを認識し、前記コードに対応する配列に従って付加するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを決定し、付加するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドが同じであるバイオチップを同じ反応タンクに選別するステップ、
（４）前記反応タンクに脱保護試薬を添加し、脱保護のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記脱保護試薬を排出するステップ、
（５）前記反応タンクに対応するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのカップリング試薬を添加し、カップリング反応のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記カップリング試薬を排出するステップ、
（６）前記反応タンクにキャッピング試薬を添加し、キャッピング反応のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記キャッピング試薬を排出するステップ、
（７）前記反応タンクに酸化試薬を添加し、酸化反応のために前記反応タンクに前記バイオチップを浸漬し、反応が完了した後に前記酸化試薬を排出し、それによって１ヌクレオチドの付加を完了するステップ、
（８）前記コードに対応して合成される核酸の配列に応じて、ステップ（３）～（７）を１回又は複数回繰り返し、それによって前記バイオチップ上に予め決定された配列を有する核酸を生成するステップ
を含み、任意選択で、以下のステップ：
（９）前記バイオチップから前記核酸を切断し、それによって前記核酸を入手するステップ
をさらに含む方法。
【請求項21】
前記核酸合成の前、及び前記バイオチップを前記反応タンクに選別した後で、前記反応タンクに前記キャッピング試薬を添加し、キャッピング反応のために前記バイオチップを前記反応タンクに浸漬する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
複数のチップを同時に使用して合成反応を実施する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0011】
【国際調査報告】